ES2692770T3 - Sistema y procedimiento de tratamiento de fluído en un cartucho fluídico - Google Patents

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Abstract

Un sistema de válvula en un cartucho fluídico para expulsar muestra líquida de una región de procesamiento de muestra, comprendiendo el aparato: una ruta de fluido (C310a) para hacer pasar una muestra de líquido a través de ella desde un extremo aguas arriba a un extremo aguas abajo; una válvula de salida (C303a) dentro de la vía de fluido, la válvula de salida configurada para moverse entre una posición cerrada en la que impide que la muestra líquida pase a través de la válvula de salida y una posición abierta en la que permite que la muestra pase por la válvula líquida; una región de procesamiento de muestra aguas abajo (C304a) dentro de la ruta de fluido aguas abajo de la válvula de salida; un canal de derivación (C305) acoplado a la vía de fluido en una unión entre la válvula de salida y la región de procesamiento de muestra aguas abajo, el sistema de válvula configurado de tal manera que la muestra líquida aguas abajo de la válvula de salida pueda ser expulsada en su posición cerrada; y al menos un elemento compresible (C306a) aguas abajo de la región de procesamiento de muestra aguas abajo, al menos un elemento compresible configurado para volverse cada vez más bloqueado contra el flujo aguas arriba del elemento compresible cuando la muestra líquida pase a través de la válvula de salida abierta, de modo que la muestra líquida aguas abajo de la válvula de salida pueda ser expulsada del conducto de fluido y dentro del canal de derivación por al menos un elemento compresible cuando la válvula de salida esté cerrada, donde al menos un elemento compresible (C306a) es un resorte de gas que comprende un orificio ciego lleno de un fluido compresible; en donde el sistema de válvula comprende además una válvula de derivación (C315) ubicada dentro del canal de derivación (C305), la válvula de derivación configurada para moverse entre una posición cerrada en la que evita que la muestra líquida pase a través de la válvula de derivación y una posición abierta en la que permite que la muestra de líquido pase a través de la válvula de derivación.

Description

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DESCRIPCION
Sistema y procedimiento de tratamiento de flmdo en un cartucho flmdico Campo
[0001] La presente invencion se refiere a sistemas de valvulas y los metodos correspondientes para el procesamiento de una muestra de lfquido en un cartucho flmdico. Mas espedficamente, la presente invencion se refiere a un sistema de medicion para suministrar un volumen de muestra de lfquido y a un sistema para expulsar una muestra de lfquido en exceso.
Antecedentes
[0002] La preparacion y el analisis de la muestra presenta muchos problemas logfsticos. Convencionalmente, muchas muestras medicas (como sangre, saliva, orina y elucion de hisopo) se proporcionan a un medico, por ejemplo, un medico generalista (GP) o un medico de atencion principal (PCP), en una cirugfa local sin el equipo necesario para analizar la muestra. Por lo tanto, la muestra debe enviarse a un laboratorio donde se analiza la muestra. Los resultados de la prueba se deben cotejar y devolver al medico de cabecera para analizar los resultados y hacer un diagnostico. Este enfoque es inadecuado. En primer lugar, existe un riesgo significativo de que una muestra se pierda en transito o se asigne con el paciente equivocado. Por otra parte, si bien los avances recientes en la tecnologfa han reducido el tiempo total empleado para llevar a cabo la prueba, la demora en el envfo de la muestra a un laboratorio no es satisfactoria.
[0003] Sin embargo, los sistemas de analisis de la clase que se encuentran en los laboratorios son complejos y a menudo es diffcil proporcionar cantidades suficientes de objetivos puros a partir de muestras de codigo para llevar a cabo de forma fiable ensayos analtticos aguas abajo. Por lo general, esto prohfoe que las cirugfas locales de medicos de cabecera puedan llevar a cabo dichas pruebas en el sitio.
[0004] Sin embargo, en los ultimos anos se han hecho esfuerzos para reducir la escala de los sistemas de analisis para hacer pruebas mas rapido y mas facil de ejecutar, y requieren menores cantidades de muestra. Por ejemplo, los dispositivos "laboratorio en un chip" (LOC) (un subconjunto de dispositivos microflmdicos) integran casi todas las pruebas medicas o operaciones de diagnostico realizadas en un hospital en un unico chip microflmdico. Los canales que forman tales dispositivos microflmdicos manejan pequenos volumenes de fluido y se conectan entre sf para lograr una funcion deseada, como mezclar una muestra, mover la muestra a traves del dispositivo, hacer reaccionar la muestra con diferentes reactivos, y asf sucesivamente. Estos chips pueden insertarse en maquinas para controlar el rendimiento de una prueba y medir los resultados.
[0005] Sin embargo, se ha encontrado que el manejo de una muestra en un dispositivo de microfluidos puede ser muy diffcil. En canales tan pequenos como los que se encuentran en un LOC convencional, es diffcil aplicar fuerzas externas para mover la muestra de un sitio a otro para realizar diferentes acciones en la muestra. Tambien existe un lfmite para la complejidad de un dispositivo LOC que opera puramente con accion capilar. Ademas, debido a los pequenos tamanos de muestra de LOC, los dispositivos tienen sensibilidad reducida y se reduce asf la probabilidad de que una diana este presente en la muestra.
[0006] Un enfoque alternativo consiste en utilizar un cartucho flmdico. La escala de los componentes de un cartucho flmdico es mayor que la de un dispositivo microflmdico, por lo que es posible mover una muestra a traves de diferentes sitios para realizar diferentes acciones sobre ella. Esto permite realizar pruebas mas complejas que las que se pueden realizar con los dispositivos LOC habituales, al tiempo que proporciona un sistema analftico de uso potencial en una cirugfa de GP local.
[0007] Los ensayos cientfficos utiles en diagnosticos medicos han implicado cada vez mas procedimientos bioqmmicos, tales como la reaccion en cadena de la polimerasa ("PCR"). El ensayo de PCR ha proporcionado un metodo poderoso para analizar la presencia de segmentos definidos de acidos nucleicos. Por lo tanto, es deseable realizar un ensayo de PCR en un cartucho flmdico.
[0008] La reduccion de la PCR al nivel de microchip es importante para tecnologfas de deteccion portatiles y sistemas analtticos de alto rendimiento. El metodo puede usarse para analizar fluidos corporales en busca de la presencia de acido nucleico espedfico para patogenos particulares, como la bacteria Chlamydia trachomatis, el VIH o cualquier otro microorganismo patogeno.
[0009] La introduccion de ensayos de amplificacion de ADN automatizados disponibles comercialmente ha permitido que mas laboratorios introduzcan estas tecnologfas para el ensayo rutinario de espedmenes. Sin embargo, existe la necesidad de mejorar los dispositivos flmdicos utilizados para este fin.
[0010] Un requisito de dispositivos que emplean la tecnologfa de PCR en el analisis y el procesamiento de muestras de fluidos es que un volumen bien definido de fluido procesado se pueda suministrar a las camaras de deteccion
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para el analisis de la muestra. Es particularmente importante en los cartuchos de tipo LOC donde se realizan multiples pasos de preparacion de muestras de fluidos dentro del cartucho para evitar que las tolerancias del canal y las camaras en la region de procesamiento de muestras se acumulen antes del procesamiento y el analisis del fluido ya que esto puede conducir a errores bastante grandes en la cantidad calculada de fluido requerida para llenar la camara de PCR y, posteriormente, entregarse a las camaras de deteccion.
[0011] En ciertos cartuchos de tipo LOC, los reactivos se pueden secar hacia abajo en la camara de PCR. Esto significa que llenar en exceso la camara de PCR y permitir que una cantidad excesiva de muestra de fluido fluya mas alla de la region de procesamiento de la muestra puede conducir a la falta de reactivos restantes en la camara de PCR. El llenado insuficiente de la camara de PCR incluso con una pequena cantidad puede conducir a bolsas de aire en la camara de PCR, lo que a su vez puede provocar un termociclado inestable. Para garantizar que la camara de PCR este completamente llena, se puede desear un ligero sobrellenado de la camara. Sin embargo, incluso un ligero sobrellenado de la camara de PCR conduce a un fluido no procesado aguas abajo de la camara de PCR que puede luego diluir la muestra de fluido procesado a medida que se mueve desde la camara de PCR a las camaras de deteccion.
[0012] El documento WO2009108260 divulga un metodo para administrar un volumen fijo de fluido a un dispositivo microflmdico que comprende la configuracion de un dispositivo con un circuito de muestra que comprende un volumen deseado, en el que el bucle de muestra es removible, usando una o mas valvulas accionadas neumaticamente en un dispositivo microflmdico para llenar el bucle de muestra con el volumen fijo del fluido y suministrar el fluido al dispositivo microflmdico. Por lo tanto, se puede inyectar un volumen espedfico de fluido en el circuito de muestra en el canal principal cerrando la valvula intermedia, abriendo el flujo a traves de las valvulas (606 y 608) y aplicando presion al canal principal. El bucle de muestra y un canal microflmdico pasante estan conectados de forma fluida en una primera union y una segunda union, y en donde al menos una union comprende una valvula en T.
[0013] El documento GB200711618 divulga un proceso para determinar la concentracion de acidos nucleicos en una muestra en un dispositivo microflmdico. El proceso incluye la introduccion de una muestra en una primera camara, llevando a cabo una serie de ciclos de una reaccion de amplificacion que se llevaran a cabo en ciclos para amplificar acidos nucleicos, transfiriendo un volumen definido que es una fraccion del volumen de la primera camara, y que tiene acidos nucleicos amplificados en una segunda camara y reemplaza el volumen definido transferido con reactivos nuevos para las reacciones de amplificacion. Los medios de transferencia de volumen pueden ser una bomba dosificadora controlable, una bomba redproca o un medio similar que se puede usar para mover un volumen definido desde la primera camara a la segunda camara.
[0014] Los documentos US4624928 y US2003/0008308 A1 describen redes flmdicas que comprenden canales y valvulas, entre otros, para medir los volumenes de lfquido. El documento US2007/0280859 A1 da a conocer muelles de gas formados en camaras de un disco centnfugo para cambiar la direccion de flujo de un lfquido dependiendo de la fuerza centnfuga aplicada.
Sumario de la invencion
[0015] La presente invencion se refiere a un sistema de valvula de acuerdo con la reivindicacion 1. De acuerdo con la presente invencion, se proporciona un sistema de valvula en un cartucho de fluido para expulsar la muestra de lfquido de una region de procesamiento de la muestra, que comprende el aparato: una via de fluido para el paso de una muestra de lfquido a su traves desde un extremo aguas arriba hasta un extremo aguas abajo; una valvula de salida dentro de la ruta del fluido, la valvula de salida configurada para moverse entre una posicion cerrada en la que impide que la muestra lfquida pase a traves de la valvula de salida y una posicion abierta en la que permite que la muestra lfquida pase a traves de la valvula de salida; una region de procesamiento de muestra aguas abajo dentro de la ruta de fluido aguas abajo de la valvula de salida; un canal de derivacion acoplado a la via de fluido en una union entre la valvula de salida y la region de procesamiento de muestra aguas abajo, el sistema de valvula configurado de modo que la muestra lfquida aguas abajo de la valvula de salida pueda expulsarse a traves del canal de derivacion cuando la valvula de salida este en la posicion cerrada; y al menos un elemento compresible aguas abajo de la region de procesamiento de muestra aguas abajo, al menos un elemento compresible configurado para volverse cada vez mas polarizado contra el flujo aguas arriba del elemento compresible cuando la muestra lfquida pasa a traves de la valvula de salida abierta, la muestra lfquida aguas abajo de la valvula de descarga puede ser expulsada de la via de fluido y dentro del canal de derivacion por al menos un elemento compresible cuando la valvula de salida esta cerrada. El elemento compresible utiliza la presion creada a medida que se avanza el fluido a lo largo de la ruta del fluido para expulsar el exceso de fluido en el canal de derivacion, eliminando la necesidad de componentes adicionales en el cartucho de fluido con el fin de expulsar el fluido superfluo.
[0016] El sistema de valvula puede comprender ademas una camara de procesamiento de la muestra aguas arriba dentro de la via de fluido y aguas arriba de la valvula de salida.
[0017] Al menos un elemento compresible es un resorte de gas que comprende un orificio ciego lleno de un fluido compresible. Al proporcionar un resorte de gas que comprende un orificio ciego, puede proporcionarse un elemento
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compresible sin complicar significativamente el proceso de fabricacion o aumentar los costes.
[0018] El sistema de valvula comprende una valvula de derivacion ubicado dentro del canal o cada canal de derivacion,
la valvula de derivacion puede configurarse para moverse entre una posicion cerrada en la que impide que la muestra de Kquido pase a traves de la valvula de derivacion y una posicion abierta en la que permite que la muestra de Kquido pase a traves de la valvula de derivacion. Esto permite controlar cuando se elimina el fluido del canal de derivacion.
[0019] Al menos una de las valvulas en el sistema de valvula puede ser una valvula accionada neumaticamente.
[0020] La al menos una valvula de accionamiento neumatico puede comprender una camara de valvula que tiene unas aberturas primera y segunda conectadas a la via o canal, respectivamente; y una membrana flexible movible entre una posicion cerrada, en la que la membrana flexible sella contra las aberturas primera y segunda para evitar que el fluido fluya a traves de la ruta o canal, y una posicion abierta, en la que la membrana flexible esta separada de las aberturas primera y segunda para permitir que el fluido fluya a traves de la via o canal.
[0021] El sistema de valvula puede comprender ademas una interfaz neumatica para la conexion a una fuente de presion de gas positiva y/o calibre, comprendiendo la interfaz neumatica una pluralidad de puertos.
[0022] El o cada valvula puede comprender ademas un paso de fluido que tiene una abertura en la camara de valvula, la abertura separada de las aberturas primera y segunda por la membrana flexible, en donde el paso de fluido esta acoplado a un puerto en el interfaz neumatico para aplicar una presion de gas positiva o negativa en la camara de la valvula para mover la membrana flexible entre las posiciones abierta y cerrada. Preferiblemente, la membrana de la valvula esta desviada en la posicion cerrada y se aplica una presion negativa o manometrica para mover la membrana de la valvula de la posicion cerrada a la posicion abierta. Al proporcionar valvulas que estan desviadas en la posicion cerrada, las valvulas estan predispuestas contra fugas y evitan fugas durante la perdida de potencia temporal.
[0023] Las valvulas de entrada y de salida pueden estar configuradas para ser actuadas simultaneamente. Esto evita la presurizacion inadvertida de la camara de procesamiento de muestra a medida que las valvulas de entrada y salida se cierran y se abren.
[0024] El o cada canal de derivacion puede estar conectado a la via de fluido inmediatamente aguas abajo de la valvula de salida para reducir al mmimo o erradicar un tramo muerto entre la valvula de salida y el canal de derivacion. Esto es ventajoso porque minimiza o erradica el excedente aguas abajo de la camara de procesamiento de muestra que puede diluir la muestra procesada a medida que se mueve a lo largo de la ruta del fluido.
[0025] La camara de procesamiento de la muestra puede ser una camara de amplificacion de acido nucleico; en donde la region de procesamiento de la muestra aguas abajo es una camara de deteccion; y en donde la relacion de camaras de deteccion a camaras de amplificacion de acido nucleico es 2:1. Proporcionar una relacion 2:1 facilita la amplificacion duplex de la muestra.
[0026] Cada region de procesamiento de muestras aguas abajo puede estar acoplada a un unico elemento compresible. Por lo tanto, cada camino de fluido esta provisto de medios para expulsar el exceso de fluido del canal de derivacion.
[0027] La camara de valvula puede estar formada en una primera capa polimerica, preferiblemente una capa de neumatico del cartucho flmdico. La interfaz neumatica puede formarse en la primera capa de polfmero. La ruta del fluido puede formarse en una segunda capa de polfmero, preferiblemente una capa flmdica del cartucho de fluido. El canal de derivacion puede formarse en la segunda capa de polfmero. La membrana de valvula puede comprender un elastomero termoplastico. La primera capa de polfmero puede comprender polipropileno. La segunda capa de polfmero puede comprender polipropileno. El polipropileno es un material inerte que no reaccionara con una muestra de fluido. Tambien se puede unir facilmente a otras capas para facilitar la fabricacion.
[0028] Tambien se proporciona un metodo de expulsion de muestra lfquida excedente desde un cartucho flmdico de acuerdo con la reivindicacion 16. En este aspecto adicional de la presente invencion, se proporciona un metodo de expulsion de muestra lfquida excedente desde un cartucho flmdico que comprende una via de fluido que tiene una region de procesamiento de muestra aguas abajo, una valvula de salida aguas arriba de la region de procesamiento de muestra aguas abajo, un canal de derivacion acoplado a la ruta de fluido en una union entre la valvula de salida y la region de procesamiento de muestra aguas abajo, y un elemento compresible aguas abajo de la region de procesamiento de muestra aguas abajo; comprendiendo el metodo: pasar una muestra de lfquido a traves de la valvula de salida, comprimiendo de ese modo el elemento compresible a medida que la muestra de lfquido pasa aguas abajo de la valvula de salida; y cerrar la valvula de salida y evacuar la muestra de lfquido sobrante aguas abajo de la valvula de salida a traves del canal de derivacion mediante el elemento compresible que ejerce una fuerza contra la muestra de lfquido sobrante para expulsarlo de la via de fluido y hacia el canal de derivacion.
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[0029] El cartucho de fluido comprende una valvula de derivacion en el canal de derivacion, y en el que el metodo comprende: el cierre de la valvula de derivacion antes de la etapa de hacer pasar una muestra lfquida a traves de la valvula de salida; y en donde la etapa de evacuar la muestra de excedente de lfquido aguas abajo de la valvula de salida comprende ademas la apertura de la valvula de derivacion.
Breve descripcion de las figuras
[0030]
La Figura 1 es un diagrama esquematico de un cartucho flmdico ejemplar en el que se puede proporcionar la invencion.
La Figura 2 es una vista superior de un cartucho flmdico a modo de ejemplo en el que se puede proporcionar la invencion.
La Figura 3 es una vista en despiece ordenado del cartucho flmdico a modo de ejemplo de la Figura 2.
La Figura 4 es una vista en perspectiva de la carcasa del cartucho flmdico a modo de ejemplo de la Figura 2.
La Figura 5 es una vista en perspectiva de la subunidad de ampolla del ejemplo de cartucho flmdico de la figura.
La Figura 6A es una vista desde arriba de la capa neumatica del cartucho flmdico a modo de ejemplo de la Figura 2.
La Figura 6B es una vista inferior de la capa neumatica del cartucho flmdico a modo de ejemplo de la Figura 2.
La Figura 7 es una vista superior de la lamina neumatica del cartucho flmdico a modo de ejemplo de la Figura 2.
La Figura 8A es una vista desde arriba de la capa flmdica del cartucho flmdico ilustrativo de la Figura 2.
La Figura 8B es una vista inferior de la capa flmdica del cartucho flmdico a modo de ejemplo de la Figura 2.
La Figura 9 es una vista superior de la lamina flmdica del cartucho flmdico ejemplar de la Figura 2.
La Figura 10 es una vista superior de la capa de electrodo del cartucho flmdico a modo de ejemplo de la Figura 2.
La Figura 11 es una vista en seccion de una disposicion de valvula ventajosa que puede formar un aspecto inventivo aislado.
La Figura 12 es una vista en seccion de otra disposicion de valvula ventajosa que puede formar un aspecto inventivo aislado.
La Figura 13a es una vista en seccion de una disposicion ventajosa de orificios de entrada que puede formar un aspecto inventivo aislado.
La Figura 13b es una vista en seccion en perspectiva de la disposicion de puerto de entrada de la Figura 13a.
La Figura 14a es una vista en seccion de una disposicion de columna de captura ventajosa que puede formar un aspecto de la invencion aislado.
La Figura 14b es una vista en seccion en perspectiva de una parte de la disposicion de columna de captura de la Figura 14a.
La Figura 15a es una vista en seccion de una disposicion de camara de residuos ventajosa que puede formar un aspecto inventivo aislado.
La Figura 15b es una vista en seccion en perspectiva de la disposicion de la camara de desechos de la Figura 15a.
La Figura 16 es un esquema de un sistema de valvula de acuerdo con una primera realizacion de la presente invencion.
La Figura 17a es una seccion transversal de una valvula adecuada para el sistema de valvula de la Figura 11 en una posicion cerrada.
La Figura 17b es una seccion transversal de la valvula de la Figura 17a en una posicion abierta.
La Figura 18 es un esquema del extremo posterior del cartucho ejemplar que incluye una segunda realizacion de un
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sistema de valvula de la presente invencion.
La Figura 19 es un diagrama de flujo de un metodo de acuerdo con la presente invencion.
La Figura 20 es un esquema de un sistema de valvula de acuerdo con una primera realizacion de la presente invencion.
La Figura 21 es una vista en seccion de una valvula ejemplar.
La Figura 22 es una vista en seccion de otra valvula ejemplar en una posicion abierta.
La Figura 23 es una vista en seccion de la valvula de la Figura 22 en una posicion intermedia.
La Figura 24 es una vista en seccion de la valvula de la Figura 22 en una posicion cerrada.
La Figura 25 es un diagrama esquematico de un sistema de valvula ejemplar.
Descripcion detallada
[0033] Las realizaciones de la invencion se describiran ahora en el contexto de un cartucho de fluido ejemplar en el que se implementa la invencion. Aunque no es necesario para comprender la presente invencion, es beneficioso proporcionar una descripcion general de los principios de la estructura, fabricacion, funcion y uso del cartucho flmdico y los metodos asociados para realizar una prueba.
[0032] El cartucho de fluido a modo de ejemplo y metodos asociados elegidos para ilustrar la presente invencion son para la deteccion de la bacteria Chlamydia trachomatis usando la amplificacion por PCR y la deteccion electroqmmica. Sin embargo, la persona experta entendera que la invencion no se limita al cartucho flmdico ejemplar y los metodos asociados, y es adecuada para su uso con diversos cartuchos diferentes para una amplia variedad de tecnicas de analisis de muestras o ensayos biologicos; por ejemplo, ensayos de secuencias de acido nucleico diana en una muestra lfquida.
[0033] Los expertos en la tecnica comprenderan que los dispositivos y metodos de la invencion aqm descrita e ilustrada en los dibujos adjuntos son ejemplos de realizacion no limitativos y que el alcance de la presente invencion se define unicamente por las reivindicaciones. Las caractensticas ilustradas o descritas en conexion con una realizacion ejemplar pueden combinarse con caractensticas de otras realizaciones. Tales modificaciones y variaciones estan incluidas dentro del alcance de las presentes divulgaciones.
[0034] El cartucho ejemplar comprende: una porcion de fluido a traves del cual los flujos de muestra y en el que amplificacion de acido nucleico y deteccion tiene lugar; una porcion neumatica que controla el flujo a traves de la porcion flmdica; y al menos dos electrodos que proporcionan una diferencia de potencial para la deteccion de un acido nucleico amplificado de interes. La porcion flmdica y la porcion neumatica pueden estar construidas con una capa flmdica, una lamina flmdica, una capa neumatica y una lamina neumatica tal como las descritas en relacion con el siguiente cartucho ilustrativo. Sin embargo, la porcion flmdica no consiste necesariamente en una capa flmdica y una lamina flmdica y la parte neumatica no consiste necesariamente en una capa neumatica y una lamina neumatica. Por el contrario, las capas pueden interactuar para producir la parte flmdica y la porcion neumatica de manera que partes de todas o algunas de las capas forman cada porcion. En lugar de referirse a las capas particulares del cartucho, la parte flmdica se refiere a las areas particulares del cartucho que proporcionan la funcion de permitir el flujo controlado de la muestra, y la porcion neumatica se refiere a las areas particulares del cartucho que proporcionan la funcion de controlar el flujo a traves de la porcion flmdica.
[0035] La carcasa, la porcion de fluido y la porcion de neumatico estan hechas de plastico. Por plastico se entiende un material organico sintetico o natural que puede ser modelado cuando esta blando y luego endurecido, incluyendo resinas, resinoides, polfmeros, derivados de celulosa, materiales de casema y plasticos proteicos. Ejemplos de plasticos a partir de los cuales se puede construir el cartucho incluyen, pero no se limitan a termoplasticos, por ejemplo, policarbonato, tereftalato de polietileno, copolfmeros de olefina dclica tales como topaz, acrilonitrilo butadieno estireno y elastomeros termoplasticos, por ejemplo polipropileno. Las carcasas de plastico, partes flmdicas y porciones neumaticas pueden incluir componentes que no estan hechos de plastico (por ejemplo, ampollas hechas de lamina de metal, insertos metalicos en la entrada de muestra), pero estan formados principalmente de plastico. El uso de materiales plasticos facilita la fabricacion economica de los cartuchos.
[0036] Mientras que las laminas de neumaticos y de fluidos pueden estar hechas de una lamina de metal, los materiales preferidos son de plastico, incluyendo los mencionados anteriormente. En particular, se prefiere que las laminas sean un compuesto de tereftalato de polietileno/polipropileno.
[0037] La secuencia de acido nucleico diana es cualquier acido nucleico a detectar en una muestra. El (los) acido(s) nucleico(s) diana para ser amplificado(s) y detectado(s) en el cartucho por lo general sera ADN, pero tambien es
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posible amplificar y detectar ARN.
[0038] En algunas formas de realizacion de un cartucho puede permitir amplificacion y/o la deteccion de ambas dianas de ADN y ARN.
[0039] La muestra lfquida es la composicion que se introduce en el cartucho para determinar si el acido o acidos nucleicos diana de interes esta/estan presentes. La muestra puede ser una composicion en la que se sospecha que esta presente el acido nucleico a detectar (por ejemplo, para el diagnostico clmico), o puede ser una composicion en la que el acido nucleico a detectar esta potencialmente presente (p. ej. para pruebas de contaminacion).
[0039] La muestra lfquida puede tener varias fuentes. Por ejemplo, puede ser material obtenido de un animal o de la planta (p. ej., para el diagnostico de infecciones o para el genotipado). Tales muestras se pueden obtener con minima invasividad o de forma no invasiva, p.ej., por ejemplo, la muestra puede obtenerse de un animal usando un hisopo, o puede ser un fluido corporal. Como alternativa, la muestra puede ser material obtenido de alimento o agua (p. ej., para las pruebas de contaminacion). La muestra generalmente incluira celulas, y el acido nucleico objetivo (si esta presente) se puede extraer de estas celulas dentro del cartucho. Un experto en la tecnica apreciara que las muestras pueden diluirse o tratarse de otro modo antes de ser introducidas en el cartucho, pero se prefiere que el cartucho pueda manipular material que no ha sido pretratado de esta manera.
[0040] Un animal del que se obtiene la muestra puede ser un animal vertebrado o no vertebrado. Los animales vertebrados pueden ser mairnferos. Ejemplos de marnfferos incluyen, pero no se limitan a, raton, rata, cerdo, perro, gato, conejo, primates o similares. El animal puede ser un primate y es preferiblemente un humano. Asf, el cartucho puede ser utilizado para el diagnostico clmico de muestras humanas.
[0041] Ademas de analizar una muestra, el cartucho puede analizar un control positivo y/o negativo para proporcionar la confirmacion de que el cartucho esta funcionando como se esperaba. El (los) control(es) se puede(n) introducir en el cartucho por un usuario, o puede ser incluido dentro de un cartucho antes de su uso.
[0042] La inclusion de un acido nucleico de control positivo interno permite a un usuario identificar si se ha obtenido un resultado negativo para la muestra debido a que la amplificacion de acido nucleico no ha tenido exito (negativa falsa). Si el acido nucleico de control positivo no se detecta en la camara de deteccion, a pesar de su presencia en una camara de amplificacion, el usuario podra identificar la prueba como un posible resultado falso negativo, y puede realizar otra prueba.
[0043] La inclusion de un control negativo mmimo interno permite al usuario identificar si un resultado positivo ha sido falsamente obtenido debido a la presencia de contaminacion. Un control negativo puede implicar la realizacion de PCR en una camara en la que no se proporciona acido nucleico, o en la que una muestra experimenta una reaccion de amplificacion sin componentes necesarios, por ejemplo, PCR sin cebadores. Sin embargo, si se detecta acido nucleico en la camara de deteccion, a pesar de su ausencia prevista en una camara de amplificacion, el usuario podra identificar la prueba como un posible resultado falso positivo, y puede realizar otra prueba.
[0044] Un acido nucleico de control positivo puede ser cualquier acido nucleico que no se encuentra en una muestra utilizada en el cartucho. El ADN de control interno puede tomarse de una bacteria que no es patogena para los animales y que contiene un acido nucleico que es altamente espedfico para la bacteria. Un ejemplo de una posible bacteria a partir de la cual puede tomarse el acido nucleico de control para una muestra animal es Pectobacterium atrosepticum, aunque puede usarse cualquier acido nucleico de control que no este presente en una muestra.
[0045] La porcion flrndica del cartucho comprende canales y las camaras a traves de las cuales fluye la muestra. El flujo de muestra a traves del cartucho se controla de dos maneras. En primer lugar, la parte flrndica tiene una entrada de gas. La entrada de gas esta conectada a un suministro de gas, y la inyeccion de gas en la parte flrndica a traves de esta entrada permite que la muestra sea empujada aguas abajo a traves del cartucho, hacia la camara de deteccion. El suministro de gas puede ser proporcionado por el lector. Como alternativa, el suministro de gas puede ser un suministro de gas a bordo. Preferiblemente, el suministro de gas es proporcionado por una fuente externa y la entrada de gas esta conectada a un circuito neumatico de manera que el suministro de gas se proporciona a traves de una entrada neumatica en el cartucho. En segundo lugar, al menos una valvula controlada neumaticamente controla el movimiento local de la muestra a traves de la porcion flrndica. La(s) valvula(s) controlada(s) neumaticamente puede(n) controlarse independientemente de otras valvulas controladas neumaticamente y pueden controlarse independientemente del suministro de gas que generalmente provoca el movimiento aguas abajo de la muestra a traves de la entrada de gas. La entrada de gas y la(s) valvula(s) controlada(s) neumaticamente tambien permiten que la muestra se vacfe a traves de la porcion fluida p.ej., para excluir el exceso de volumenes de material. La porcion de fluido tambien tiene un escape que permite que el aire y el material de desecho salgan de los canales y las camaras de la porcion de fluido sin que se produzca una acumulacion de presion en el cartucho. Preferiblemente, el escape comprende una camara de desechos y/o un respiradero de desechos.
[0046] La porcion de fluido del cartucho incluye reactivos y/o componentes ffsicos para la lisis celular y de separacion de acido nucleico. Estos pueden ser cualquier reactivo o componente ffsico que sea capaz de lisar las
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celulas y separar los acidos nucleicos de los desechos celulares y otros componentes celulares. Por ejemplo, pueden comprender (i) un tampon de lisis que es capaz de provocar la lisis de celulas diana que pueden estar presentes en la muestra, por ejemplo, tampones que incluyen un detergente como nonilfenoxipolietoxiletanol (disponible como NP-40) o t-octilfenoxipolietoxietanol (disponible como Triton X 100), o que incluye tiocianato de guanidina, y/o (ii) un soporte de captura o columna que se une espedficamente a acidos nucleicos pero que no se une a otros componentes celulares indeseados (por ejemplo, protemas y lfpidos). La columna de captura comprende un filtro de captura y puede comprender adicionalmente un filtro de profundidad. Los filtros pueden estar hechos de fibras de vidrio (disponibles como filtros Whatman), o pueden estar hechos de sflice, aunque puede usarse cualquier columna o soporte que sea capaz de separar acidos nucleicos de otros componentes celulares. La elucion usando un tampon de lavado para eliminar restos celulares y otros componentes celulares, seguido de elucion usando un tampon de elucion para eluir los acidos nucleicos separados del soporte del captador o columna puede realizarse de forma que la columna de captura pueda separar los acidos nucleicos de degradacion celular y otros componentes celulares.
[0047] Un canal a traves del cual la muestra de fluido conecta flmdamente la entrada de la muestra a al menos una camara de amplificacion donde puede tener lugar la amplificacion de acido nucleico. El objetivo de la(s) camara(s) de amplificacion es permitir la amplificacion de cualquier acido nucleico diana de interes que este presente en la muestra (y, cuando este presente, cualquier acido nucleico de control positivo). Puede usarse cualquier metodo de amplificacion de acido nucleico y estos se describen con mas detalle a continuacion en relacion con un cartucho ejemplar. Los diferentes reactivos de amplificacion de acido nucleico que se requieren para diferentes metodos de amplificacion de acido nucleico son bien conocidos en la tecnica. Estos reactivos se proporcionan en o arriba de la(s) camara(s) de amplificacion de manera que la muestra (y cualquier control positivo) incluye todos los agentes reactivos necesarios para la amplificacion de acido nucleico una vez que alcanza la camara de amplificacion. La adaptacion de un metodo de amplificacion de acido nucleico de acuerdo con el acido nucleico diana a detectar tambien se conoce bien en la tecnica (por ejemplo, diseno de cebadores). El experto en la materia podna, por lo tanto, adaptar los reactivos para la amplificacion de acidos nucleicos de forma correspondiente. El termino "camara" no denota ningun tamano o geometna particular, sino que en su lugar significa una region dentro de la porcion flmdica que esta disenada para permitir que se produzca la amplificacion de acido nucleico. Asf, por ejemplo, podna ser una region en la que la muestra se puede aislar de manera fluida (p. ej. a traves del uso de valvulas de control neumatico), mientras que los pasos necesarios para la amplificacion de acido nucleico (p. ej. ciclo termico, etc.) ocurren, y puede estar situado dentro del cartucho de modo que esta en la proximidad de cualesquiera recursos externos que sean necesarios (p. ej. junto a una fuente de calor dentro de un lector de cartucho, permitiendo de esta manera que se produzca el ciclo termico).
[0048] Multiples canales y/o camaras de amplificacion de prueba pueden ser incluidos en el cartucho. Los diferentes canales y/o camaras de amplificacion de prueba pueden incluir reactivos requeridos para amplificar diferentes acidos nucleicos de interes. Por lo tanto, el uso de multiples canales de prueba de amplificacion y/o camaras permite que se realicen multiples pruebas en un solo cartucho, simultaneamente (incluyendo cualquier control). Como alternativa, los reactivos para la amplificacion de multiples acidos nucleicos diferentes pueden estar presentes en una sola camara de amplificacion, y los diferentes acidos nucleicos (ya sean multiples acidos nucleicos diana, o un acido nucleico diana y un acido nucleico de control) pueden amplificarse simultaneamente en la misma camara de amplificacion.
[0049] Un canal adicional a traves del cual fluye la muestra despues de la amplificacion de acido nucleico de forma fluida conecta al menos una camara de amplificacion a al menos una camara deteccion donde se pueden detectar los resultados de la amplificacion de acido nucleico. En o aguas arriba de la camara de deteccion hay reactivos para la deteccion de acidos nucleicos de manera que la muestra incluye todos los reactivos necesarios para la deteccion una vez que alcanza la camara de deteccion. Los reactivos para la deteccion de acidos nucleicos pueden ser espedficos para el acido nucleico diana particular, es decir, pueden permitir la deteccion de la presencia de la secuencia espedfica de acido nucleico. Como alternativa, los reactivos para la deteccion de acidos nucleicos pueden ser reactivos genericos para detectar la presencia de cualquier acido nucleico. Dichos reactivos genericos pueden usarse si todos los acidos nucleicos distintos del acido nucleico diana se eliminan antes de la deteccion. Por ejemplo, esto puede lograrse proporcionando una nucleasa que sea capaz de hidrolizar todos los acidos nucleicos presentes en la muestra distintos del nucleico diana. El acido nucleico diana amplificado se puede proteger de la hidrolisis, por ejemplo, mediante la inclusion de modificaciones qmmicas en los cebadores que se incorporan en el producto amplificado y que no se pueden hidrolizar. Los reactivos para la deteccion de acidos nucleicos se describen a continuacion en relacion con un cartucho ilustrativo, pero habitualmente comprenden una sonda que incluye una etiqueta. La sonda es capaz de hibridarse con el acido nucleico amplificado que se ha amplificado en la(s) camara(s) de amplificacion. Despues de la hibridacion de la sonda con el acido nucleico amplificado, la deteccion del acido nucleico puede producirse a traves de un cambio detectable en la senal de la etiqueta. En algunas realizaciones, el cambio puede ser causado por la hidrolisis de la sonda. Cuando la sonda se hidroliza, la hidrolisis generalmente se logra usando una nucleasa espedfica de doble cadena, que puede ser una exonucleasa o una endonucleasa. Preferiblemente, la nucleasa es endonucleasa T7. La senal de la etiqueta es capaz de experimentar un cambio despues de la hidrolisis de la sonda. Esto se debe a un cambio en el entorno de la etiqueta cuando pasa de estar unido al resto de la sonda a estar libre del resto de la sonda o unido a un solo nucleotido o una parte corta de la sonda. Se pueden encontrar mas detalles de los tipos de sondas y los metodos de deteccion que se pueden usar en
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Hillier et al. Bioelectrochemistry, 63 (2004), 307-310. Como alternativa, se pueden usar metodos para provocar un cambio detectable en la senal de la etiqueta que no se basa en la hidrolisis de la sonda, por ejemplo, vease Ihara et al. Nucleic Acids Research, 1996, vol. 24, No. 21 4273-4280. Este cambio en el entorno de la etiqueta conduce a un cambio en la senal de la etiqueta. El cambio en la senal de la etiqueta puede detectarse para detectar la presencia del acido nucleico de interes.
[0050] Cuando se usa un acido nucleico de control positivo, los reactivos para la deteccion de acido nucleico tambien pueden incluir una sonda de control positivo que incluye una etiqueta. La sonda de control positivo es capaz de hibridarse con el acido nucleico de control modificado. La senal proporcionada por las etiquetas del control positivo y las sondas diana puede ser igual, pero presente en camaras de deteccion separadas de modo que se puedan distinguir las senales correspondientes a los acidos nucleicos de control y prueba. Como alternativa, la senal proporcionada por las etiquetas de las sondas de control y objetivo puede ser diferente, de modo que las senales son distinguibles entre sf, incluso si las sondas estan presentes en la misma camara de deteccion.
[0051] Canales de deteccion de ensayo multiple y/o fibras de cubetas pueden incluirse en el cartucho. Los diferentes canales y/o camaras de deteccion de prueba pueden incluir reactivos requeridos para detectar diferentes acidos nucleicos de interes. Por lo tanto, el uso de multiples canales de prueba de deteccion y/o camaras permite que se realicen multiples pruebas en un solo cartucho, simultaneamente. Como alternativa, los reactivos para la deteccion de multiples acidos nucleicos diferentes pueden estar presentes en una unica camara de deteccion, y los diferentes acidos nucleicos (ya sean acidos nucleicos diana o un acido nucleico diana y un acido nucleico de control) pueden detectarse simultaneamente en la misma camara de deteccion.
[0052] La etiqueta es detectable mediante el uso de electrodos del cartucho, y asf la etiqueta sera normalmente una etiqueta electroqmmica, tal como un ferroceno. Los ejemplos de etiquetas que pueden usarse pueden encontrarse en los documentos WO03/074731, WO2012/085591 y PCT/GB2013/051643. La senal emitida por la etiqueta puede detectarse mediante un lector de cartucho.
[0053] La porcion de neumatico del cartucho comprende al menos un circuito neumatico, controlando cada uno al menos una valvula controlada neumaticamente. La porcion neumatica controla el flujo de muestra a traves del cartucho mediante la apertura y el cierre de las valvulas controladas neumaticamente. La apertura y el cierre de las valvulas se controlan mediante cambios en la presion neumatica en el circuito neumatico que se aplica a traves de una entrada de presion neumatica. Usualmente, el cartucho contiene muchas valvulas neumaticamente controladas. Las valvulas controladas neumaticamente pueden controlarse por entradas de presion neumaticas separadas. Estas valvulas pueden usarse para evitar el movimiento aguas abajo de la muestra a traves de la porcion flmdica hasta que se hayan realizado los pasos necesarios y/o para prevenir el movimiento inverso no deseado de la muestra aguas arriba. Por ejemplo, puede proporcionarse una valvula aguas arriba de al menos una camara de amplificacion para evitar el movimiento aguas abajo en al menos una camara de amplificacion hasta que tenga lugar la lisis celular y la separacion de acidos nucleicos. Despues de la lisis celular y la separacion de acidos nucleicos, la valvula aguas arriba de al menos una camara de amplificacion puede abrirse para permitir el flujo descendente. Luego puede cerrarse de nuevo para evitar el reflujo fuera de la camara hacia la entrada de muestra.
[0054] El cartucho comprende al menos dos electrodos que pueden proporcionar una diferencia de potencial a traves de al menos una camara de deteccion. La diferencia de potencial hace que la corriente fluya a traves de al menos una camara de deteccion, permitiendo de ese modo la deteccion de senal desde etiquetas electroqmmicamente activas.
[0055] Un cartucho ejemplar que opera de acuerdo con la descripcion anterior se describira ahora con referencia a los dibujos adjuntos.
1. El cartucho ejemplar
1.1 Descripcion general
[0056] El cartucho ejemplar descrito a continuacion pretende ser de un solo uso, el cartucho desechable para realizar una prueba en una muestra introducida en el cartucho. El cartucho ejemplar es un cartucho flmdico con canales de una escala apropiada (como se detalla a continuacion). Sin embargo, la invencion puede realizarse en un dispositivo microflmdico o un LOC. Una vez que se ha ejecutado la prueba, se recomienda desechar el cartucho. Sin embargo, si se desea, el cartucho puede enviarse para volver a procesarlo para permitir que se vuelva a utilizar.
[0057] Se prefiere que el cartucho comprende todos los agentes biologicos necesarios para la realizacion de la prueba de eleccion. Por ejemplo, el cartucho ejemplar se usa para detectar la presencia, ausencia o cantidad de un patogeno de interes. Cualquier patogeno puede ser detectado. Los ejemplos de patogenos que pueden detectarse mediante el cartucho son Chlamydia trachomatis, Trichomonas vaginalis, Neisseria gonorrhea, Mycoplasma genitalium y Staphylococcus aureus resistente a la meticilina. Para ese fin, el cartucho comprende reactivos para la amplificacion de acidos nucleicos. La amplificacion de acidos nucleicos puede realizarse usando cualquier metodo de amplificacion de acidos nucleicos. El metodo de amplificacion de acido nucleico puede ser un metodo de
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termociclado en el que la temperature a la que se realiza el metodo vana de manera que diferentes etapas de la amplificacion pueden tener lugar a diferentes temperatures dentro del ciclo. Por ejemplo, la fusion, el recocido de los cebadores y la extension se pueden realizar a diferentes temperatures. Al recorrer las temperatures, se puede controlar el tiempo de cada uno de los pasos del metodo. Como alternativa, la amplificacion de acidos nucleicos puede ser un metodo iso-termico en el cual la temperatura se mantiene constante. Tanto en el termociclado como en los metodos de amplificacion de acido nucleico isotermico, la temperatura se controla durante la amplificacion de acido nucleico.
[0058] Los ejemplos de metodos de amplificacion de acidos nucleicos son la reaccion en cadena de la polimerasa (PCR), la reaccion en cadena de la ligasa (LCR), amplificacion por desplazamiento de cadena (SDA), amplificacion mediada por transcripcion, amplificacion basada en secuencia de acido nucleico (NASBA), amplificacion dependiente de la helicasa y amplificacion isotermica mediada por bucle. Los reactivos para la amplificacion de acidos nucleicos variaran dependiendo del metodo de amplificacion de acidos nucleicos utilizados, pero incluyen una polimerasa y trifosfatos de nucleotidos.
[0059] Como se explica a continuacion, el cartucho tambien comprende reactivos de deteccion que son capaces de detectar la presencia o ausencia de acidos nucleicos amplificados que son el producto del metodo de amplificacion de acido nucleico. Los reactivos para la deteccion de acidos nucleicos comprenden una sonda que es capaz de hibridarse con el acido nucleico amplificado. La sonda incluye una etiqueta de ferroceno. Despues de la hibridizacion de la sonda al acido nucleico amplificado, la deteccion del acido nucleico se produce a traves de un cambio detectable en la senal de la etiqueta. El cambio es causado por la hidrolisis de la sonda, que se logra usando una nucleasa espedfica de doble cadena. La nucleasa es una endonucleasa T7. El ferroceno da diferentes senales electroqmmicas cuando forma parte de una sonda o cuando esta unido solo a un solo nucleotido, por lo que la hidrolisis se detecta facilmente. Por lo tanto, el cambio en la senal de la etiqueta permite la deteccion de la presencia del acido nucleico de interes.
[0060] Los electrodos permiten que se detecte el cambio detectable en la senal de la etiqueta, que se produce en presencia del acido nucleico diana.
[0061] El cartucho esta configurado para uso con un lector de cartucho (no mostrado). El cartucho comprende una serie de interfaces neumaticas, mecanicas, termicas y electricas (descritas con mas detalle a continuacion) a traves de las cuales el lector interactua con el cartucho para realizar la prueba. Por lo tanto, en uso, el cartucho se insertana en el lector, y el lector se activana para comenzar a interactuar con el cartucho a traves de las interfaces para realizar la prueba. Para los fines de comprender la presente invencion, no es necesario describir exactamente como interactua el cartucho con el lector para realizar una prueba particular y proporcionar los resultados de la prueba, pero a continuacion se proporciona una descripcion general de una operacion ejemplar de un cartucho.
1.2 Diagrama esquematico del cartucho ejemplar
[0062] Antes de explicar la estructura y disposicion de los componentes de un cartucho de fluido a modo de ejemplo en detalle, es util describir el diseno del cartucho ejemplar en un nivel alto con referencia al esquema mostrado en la Figura 1.
[0063] Es conveniente considerar el diseno general del cartucho en terminos del flujo de lfquidos, incluyendo la muestra lfquida, a traves del cartucho. A menos que se especifique lo contrario a continuacion, el paso de lfquidos que incluye la muestra lfquida y los tampones lfquidos se denomina la "via del fluido" que tiene un extremo aguas arriba y un extremo aguas abajo. A menos que se especifique lo contrario en lo sucesivo, "aguas abajo" generalmente se refiere a la direccion del flujo de los lfquidos y "aguas arriba" se refiere a la direccion opuesta a la direccion del flujo. La ruta del fluido en el cartucho ejemplar puede tener diferentes ramificaciones (y asf formar diferentes vfas de fluido), pero todas las vfas tienen una direccion de flujo reconocible que permite a una persona experta identificar las direcciones aguas arriba y aguas abajo. Sin embargo, hay una excepcion a esta definicion general, que es cuando la muestra de lfquido se bombea entre la camara de mezclado 10 y el fuelle 20. En este caso, el fluido se bombea intermitentemente aguas arriba en la direccion opuesta a su direccion de flujo general del flujo de fluido, que esta aguas abajo. Esta mezcla sirve para mezclar la lisis y la muestra y rehidratar el control interno.
[0064] La muestra lfquida se introduce en el cartucho a una muestra de la camara de mezcla 10 a traves de un puerto de entrada. Una disposicion particular de un puerto de entrada preferido puede en sf misma formar un aspecto inventivo aislado del cartucho, como se describe adicionalmente en la seccion 3, a continuacion. Un indicador de muestra 12 esta acoplado de forma fluida a la camara de mezcla de muestra 10 de modo que una muestra introducida en la camara de mezcla de muestra 10 es visible en el indicador de muestra 12. Tambien esta conectada a la camara de mezcla de muestra 10 una ampolla 14 que contiene un tampon de lisis. El tampon de lisis comprende tiocianato de guanidina. Una vez que la muestra se ha introducido en la camara de mezcla de muestra 10, y se inicia una prueba, la ampolla de lisis 14 se colapsa para expulsar el tampon de lisis a la camara de mezcla de muestra 10 donde se mezcla con la muestra de lfquido introducida en la misma.
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[0065] Aguas abajo de la camara de mezcla de muestra 10, a lo largo de un canal principal 16, hay un filtro grueso 18. El filtro grueso 18 filtra cualquier residuo grande en la muestra lfquida, como la piel o el vello corporal, cuando la muestra lfquida pasa a traves del canal principal 16.
[0066] Aguas abajo del filtro grueso 18, a lo largo del canal principal 16, hay un fuelle 20 que tiene una valvula de fuelle aguas arriba 22a y una valvula de fuelle aguas abajo 22b. Como se describe con mas detalle a continuacion, el fuelle 20, junto con sus valvulas aguas arriba y aguas abajo 22a-b, es capaz de bombear la muestra lfquida desde el extremo aguas arriba de la via de fluido (es decir, desde la camara de mezcla de muestras 10) al extremo de aguas abajo. En resumen, esto se logra gracias a membranas flexibles dentro del fuelle 20 y las valvulas 22a-b de aguas arriba y aguas abajo que actuan para crear diferenciales de presion locales para, por un lado, extraer la muestra lfquida de la mezcla de muestra. la camara 10 en el fuelle 20 y, por otro lado, desde el fuelle 20 mas hacia abajo a traves del canal principal 16. Esto se consigue mediante un accionamiento neumatico cuidadosamente coreografiado de las membranas flexibles en las valvulas. Las disposiciones particulares de una valvula preferida pueden formar ellas mismas aspectos inventivos aislados del cartucho, como se describe adicionalmente en la seccion 3, a continuacion.
[0067] Aguas abajo de los fuelles a lo largo del canal principal 16 hay una columna de captura 24. El objetivo de la columna de captura 24 es separar los acidos nucleicos de los restos celulares y otros componentes celulares. La columna de captura comprende un filtro de captura y un filtro de profundidad ambos hechos de fibras de vidrio. Una disposicion particular de una columna de captura preferida puede en sf misma formar un aspecto inventivo aislado del cartucho, como se describe adicionalmente en la seccion 3, a continuacion.
[0068] Dos canales de derivacion 26, 28 se unen al canal principal 16 entre la valvula de fuelle aguas abajo 22b y la columna de la captura 24. El proposito de los canales de derivacion consiste en introducir tampones lfquidos necesarios para realizar la prueba deseada. Por ejemplo, con la prueba realizada por el cartucho ejemplar, es necesario introducir un tampon de elucion y un tampon de lavado en el canal principal una vez que ha pasado la muestra. El tampon de lavado esta contenido en una ampolla 30 de tampon de lavado y el tampon de elucion esta contenido en una ampolla 32 de tampon de elucion. La introduccion del tampon de lavado y el tampon de elucion en el canal principal 16 esta controlado por la valvula 34 de tampon de lavado y la valvula 36 de tampon de elucion, respectivamente. En el punto apropiado en la prueba, las ampollas de tampon de lavado y elucion 30, 32 se colapsan para expulsar los tampones de lavado y elucion a los canales de ramificacion 26, 28 y desde allf al canal principal 16 a traves del lavado y valvulas de tampon de elucion 34, 36.
[0069] Aguas abajo de la columna de captura 24, a lo largo de una bifurcacion residual 16a del canal principal 16, hay una camara de residuos 38. Una disposicion particular de una camara de residuos preferida puede formar un aspecto inventivo aislado del cartucho, como se describe mas adelante en la seccion 3, a continuacion. El objetivo de la camara de residuos 38 es recoger los residuos celulares y los componentes celulares distintos de los acidos nucleicos y contenerlos, impidiendo asf que entren en el canal de prueba 54a o en el canal de control 54b. La camara de desechos 38 se ventila a la atmosfera a traves de un respiradero de desechos 40, y se proporciona un impactador de aerosol 42 entre la camara de desechos 38 y el respiradero de desechos 40 para evitar que la materia particulada se escape de la camara de desechos 38 a la atmosfera. Una valvula de camara de desechos 44 en la ramificacion de desechos del canal principal 16a del canal principal 16 permite e impide que los fluidos pasen a la camara de desechos 38 en puntos apropiados durante la prueba.
[0070] Aguas abajo de la columna de captura 24, a lo largo de una rama de elucion 16b del canal principal 16, hay una camara de elucion 46. El objetivo de la camara de elucion 46 consiste en permitir que la preparacion de muestra se asiente y que las burbujas se dispersen antes de que la muestra entre en las camaras de amplificacion. Una valvula de camara de elucion 48 en la derivacion de elucion 16b del canal principal 16 permite e impide que los fluidos pasen a la camara de elucion 46 en puntos apropiados durante la prueba.
[0071] Aguas abajo de la camara de elucion 46 es un canal de mezclado introncado 52. Aqrn, la muestra preparada se mezcla antes de pasar por la valvula de aislamiento 50.
[0072] En la presente solicitud, los componentes aguas arriba de la valvula de aislamiento 50 se mencionan como comprendidos en el "extremo frontal" del cartucho, mientras que los componentes aguas abajo de la valvula de aislamiento 50 se mencionan como comprendidos en el "extremo posterior" del cartucho. En terminos generales, la muestra de lfquido esta preparada para analizar en el extremo frontal del cartucho, y el analisis se lleva a cabo en la muestra en el extremo posterior del cartucho.
[0073] La valvula de aislamiento 50 esta abierta para permitir que la muestra de lfquido preparada pase desde el extremo anterior hasta el extremo posterior del cartucho. En un punto apropiado de la prueba, despues de que la muestra lfquida se ha preparado y esta dentro del extremo posterior del cartucho para su analisis, la valvula de aislamiento 50 se cierra para evitar que cualquiera de las muestras vuelva a entrar en el extremo delantero. Una vez que la valvula de aislamiento 50 esta cerrada, no puede abrirse nuevamente. La valvula de aislamiento 50 tambien actua como una proteccion en caso de una falla de energfa, en donde el lector cierra la valvula de aislamiento 50 para evitar fugas.
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[0074] Aguas abajo de la valvula de aislamiento 50, la via de fluido se divide en un canal de prueba de amplificacion 54a y un canal de control de amplificacion 54b. Cada uno de los canales de amplificacion 54a-b comprende una camara de amplificacion 56a-b que tiene una valvula de entrada de la camara de amplificacion 58a-b y una valvula de salida de la camara de amplificacion 60a-b. Cualquier metodo de amplificacion de acido nucleico puede realizarse en la camara de amplificacion de acido nucleico. Si se usa PCR, las camaras de amplificacion de acido nucleico contienen una polimerasa de ADN termoestable, dNTPs, un par de cebadores que son capaces de hibridarse con el acido nucleico a amplificar. Opcionalmente, las camaras de amplificacion de acido nucleico pueden contener adicionalmente sales de tampon, MgCh, agentes de pasivacion, N-glicosilasa de uracilo y dUTP. Un ejemplo de una polimerasa de ADN termoestable que se puede usar es la polimerasa Taq de Thermus aquaticus.
[0075] Cada una de las camaras de amplificacion de acidos nucleicos en el cartucho ejemplar comprende caractensticas de contencion de reactivos en forma de pozos poco profundos primero y segundo formadps en la capa de fluido. Los reactivos que se utilizaran en el cartucho se detectan en los pocillos. En el cartucho ejemplar, los reactivos espedficos de la prueba y los reactivos genericos se afslan uno del otro al detectar cada uno en un pozo diferente. Por lo tanto, los reactivos espedficos de la prueba se detectan en un primer pozo en la camara y los reactivos genericos se detectan en un segundo pozo en la camara. Al detectar los reactivos por separado, es mas facil intercambiar los reactivos espedficos de la prueba durante la fabricacion por un conjunto diferente de reactivos espedficos para la prueba, a fin de realizar una prueba diferente, mientras se mantienen los reactivos genericos tal como estan.
[0076] En el cartucho de ejemplo, la relacion de camaras de amplificacion de acidos nucleicos para la deteccion de las camaras es de 1:2. La muestra preparada entra en el extremo posterior del cartucho en la valvula de aislamiento 50 y se divide en dos camaras de amplificacion de acido nucleico. Despues del procesamiento, cada una de las dos medidas procesadas de muestra de la camara de amplificacion de acido nucleico se divide en dos camaras de deteccion. Por lo tanto, para cada muestra introducida en el cartucho ejemplar, se pueden llenar cuatro camaras de deteccion desde dos camaras de amplificacion de acido nucleico, facilitando asf la amplificacion duplex y la deteccion de 4-plex.
[0077] Sin embargo, se apreciara que una o tres o mas camaras de amplificacion de acidos nucleicos se pueden proporcionar para proporcionar cualquier nivel de multiplexacion deseado, y que el numero de las camaras de deteccion proporcionadas puede ser ajustado en consecuencia para mantener una relacion 1:2 de camaras de amplificacion de acido nucleico a camaras de deteccion.
[0078] La relacion de 1:2 es preferido para el cartucho ejemplar porque una tal relacion permite que dos veces el numero de acidos nucleicos diana se ensayen en comparacion con el numero de diferentes etiquetas requeridas para la deteccion en las camaras de deteccion. Sin embargo, se apreciara que la relacion puede cambiar dependiendo del numero de etiquetas y los objetivos de PCR para la muestra lfquida. Por ejemplo, la relacion puede ser 1:1, 1:3 o 1:n, de modo que hay n camaras de deteccion que se ramifican desde el canal principal de cada via de fluido cuando hay n veces tantos objetivos de PCR multiplexados para el numero de etiquetas.
[0079] Los cebadores de PCR espedficos para Chlamydia trachomatis se secan en la camara de amplificacion en el canal de prueba de amplificacion junto con los otros reactivos requeridos para la amplificacion de acido nucleico. Cebadores de PCR espedficos para un acido nucleico de control positivo se secan en la camara de amplificacion en el canal de control de amplificacion junto con los otros reactivos requeridos para la amplificacion de acido nucleico. Tambien se proporciona un acido nucleico de control positivo en la camara de amplificacion en el canal de control de amplificacion, tomado de Pectobacterium atrosepticum. Los reactivos desecados se reconstituyen cuando la muestra lfquida los alcanza.
[0080] Abajo de las valvulas de salida de la camara de amplificacion 60a-b, cada uno de los canales de amplificacion 54a-b se divide en dos canales de deteccion adicionales, que conducen a dos camaras de deteccion para cada camara de amplificacion, dando un total de cuatro camaras de deteccion 62a-d en total. Los reactivos para la deteccion de acidos nucleicos, que incluyen la sonda diana, se secan en las camaras de deteccion 62a-d aguas abajo de la camara de amplificacion de prueba 56a o 56b. Los reactivos para la deteccion de acidos nucleicos que incluyen la sonda de control se secan en las camaras de deteccion aguas abajo de la camara de amplificacion de control 56a o 56b (cualquiera que no sea la camara de prueba mencionada anteriormente). Cada camara de deteccion 62a-d esta provista de su propio resorte de gas 64a-d que forma un extremo muerto en el extremo aguas abajo de la ruta de fluido.
[0081] Los reactivos para la deteccion de acidos nucleicos se proporcionan en camaras de deteccion. Los reactivos para la deteccion de acidos nucleicos incluyen sondas que tienen un marcador de ferroceno. Estas sondas son capaces de hibridarse con los acidos nucleicos amplificados. Despues de la hibridacion de las sondas con los acidos nucleicos amplificados, las sondas se hidrolizan mediante una nucleasa espedfica de doble cadena que hace que la etiqueta se libere del resto de la sonda. Como se explico anteriormente, la liberacion de la etiqueta del resto de la sonda provoca un cambio detectable en la senal de la etiqueta. La sonda de control se proporciona en camaras de deteccion separadas a la sonda diana y la deteccion del acido nucleico diana y el acido nucleico de control tienen lugar en diferentes camaras de deteccion, de modo que las senales se pueden distinguir entre sf.
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[0082] Aguas abajo de las valvulas de salida de amplificacion 60a-b, pero aguas arriba de las horquillas creando los cuatro canales de deteccion, dos canales de derivacion 66a-b unen respectivamente los dos canales de amplificacion 54a-b. El proposito de los canales de derivacion 66a-b es eliminar el exceso de muestra de lfquido dentro de los canales de amplificacion 54a-b antes de que la muestra de lfquido entre en las camaras de deteccion 62a-d. Los canales de derivacion 66a-b se conectan a una valvula de derivacion 68, que tambien esta acoplada de forma fluida a la rama de la camara de elucion 16b del canal principal 16, aguas abajo de la valvula de aislamiento 50, antes de que el canal se divida en los canales de amplificacion 54a y 54b.
[0083] Una disposicion particular de una camara preferida en el cartucho, tales como las camaras de amplificacion primera y segunda o la primera a la cuarta camara de deteccion, puede en sf formar un aspecto de la invencion aislado del cartucho, como se describe adicionalmente en la seccion 3, a continuacion.
[0084] Se apreciara que el numero de camaras de amplificacion, y el numero de camaras de deteccion en el cartucho ejemplar pueden variar dependiendo de la implementacion preferida. Ademas, otras configuraciones de canales, camaras, valvulas, etc. son posibles sin apartarse del alcance de la invencion, tal como se define en las reivindicaciones.
[0085] La estructura ffsica y la operacion de los varios componentes del cartucho ejemplar introducido anteriormente se explicara ahora con referencia a las Figuras 2 a 10.
1.3 Estructura fisica de un cartucho ejemplar
1.3.1 Vision general y caracteristicas externas del cartucho ejemplar
[0086] Un cartucho de ejemplo se muestra en la Figura 2. Como se describio anteriormente, el lector interactua con el cartucho a traves de una pluralidad de interfaces. Las interfaces mostradas en el cartucho ejemplar 100 son: una interfaz neumatica 101; una interfaz electrica 102; una interfaz de valvula de derivacion 103; y una interfaz de valvula de aislamiento 104. Cada una de estas interfaces se describe con mas detalle a continuacion. Se apreciara que se podnan proporcionar mas o menos interfaces, dependiendo de la implementacion preferida.
[0087] Tambien se proporciona en el cartucho, pero no se muestra, es una interfaz termica. La interfaz termica permite que la temperatura de las camaras de amplificacion se regule para permitir que tenga lugar la amplificacion de acidos nucleicos.
[0088] El cartucho ejemplar 100 mostrado en la Figura 2 comprende un extremo de insercion 105 para la insercion en el lector, y un extremo no de insercion 106. Cerca del extremo de no insercion 106 es una entrada de muestra 107 para introducir una muestra en la camara de mezcla de muestra 10. En el cartucho de ejemplo, la muestra generalmente incluira celulas, y el acido nucleico diana (si esta presente) se puede extraer de estas celulas, pero otras muestras de fluidos como elucion de un hisopo, orina, semen, la sangre, la saliva, el sudor de las heces y las lagrimas podnan usarse en otras implementaciones. La muestra puede introducirse en la camara de mezcla de muestra 10 a traves de la entrada de muestra 107 usando una pipeta, por ejemplo.
[0089] El cartucho ejemplar 100 y el lector estan configurados de manera que, cuando se inserta el cartucho en el lector, todas las interfaces mencionadas sean accionables por el lector. Por otro lado, la entrada de muestra 107 permanece externa al lector de modo que se puede introducir una muestra en la camara de mezcla de muestra 10 mientras que el cartucho se inserta en el lector.
[0090] El cartucho ejemplar 100 mostrado en la Figura 2 comprende ademas una ventana del indicador de muestra 109, a traves del cual el indicador de muestra 12 es visible para determinar si una muestra se ha introducido en la camara 10 de mezclado de la muestra.
[0091] Todo el neumatico, las interfaces mecanicas y electricas en el cartucho ejemplar 100 estan situadas en la misma cara del cartucho, en este caso se proporciona en la cara superior 110. La interfaz termica (no mostrada) se proporciona en la cara inferior del cartucho. Esto simplifica el diseno del lector, que puede proporcionar las partes neumaticas, mecanicas y electricas asociadas que interactuan con esas interfaces en la misma region del lector, aprovechando asf mejor el espacio. Tambien permite que la parte termica del lector se proporcione lejos de las partes neumaticas, mecanicas y electricas.
1.3.2 Componentes internos del cartucho
[0092] El cartucho ejemplar 100 mostrado en la Figura 2 se forma a partir de diversos componentes que se describiran ahora. La Figura 3 muestra una vista en despiece ordenado del cartucho de ejemplo 100 de la Figura 2. El cartucho 100 comprende, de arriba a abajo, una carcasa 111, un subconjunto de ampollas 112, una lamina neumatica 113, una capa neumatica 114, una capa fluida 115 y una lamina flmdica 116. Tambien se muestra en la Figura 3 una capa de electrodo 117, dos filtros 118 y una pluralidad de almohadillas absorbentes 119, que se describiran con mas detalle a continuacion.
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[0093] La carcasa 111 se fabrica a partir de estireno de butadieno de acrilonitrilo. Las laminas neumaticas y flmdicas
113, 116 estan fabricadas a partir de un material compuesto de tereftalato/polipropileno de polietileno. Las capas
114, 115 neumaticas y flmdicas se fabrican a partir de polipropileno.
[0094] Con la excepcion de la carcasa 111, los filtros 118 y las almohadillas 119, cada uno de los componentes mencionados en el parrafo anterior se adhiere a su componente o componentes adyacentes. Por lo tanto, el subconjunto de ampollas 112 se adhiere a la lamina neumatica 113, que esta adherida a la capa neumatica 114, que esta adherida a la capa flmdica 115, que esta adherida a la lamina flmdica 116. La capa de electrodo 117 esta adherida a la capa flmdica 115 tambien.
[0095] La adhesion de las capas entre sf proporciona una serie de canales de fluido estancos en el cartucho, junto con camaras asociadas, valvulas, bombas, los fuelles y otros componentes. Los canales que pasan una muestra de lfquido a su traves son estancos a los lfquidos y los canales que pasan un gas a su traves son hermeticos a los gases. Opcionalmente, todos los componentes son estancos a los lfquidos y estancos a los gases. Por ejemplo, los huecos y aberturas formadas en uno o ambos lados de las capas neumaticas y flmdicas crean, cuando se juntan y se adhieren a las laminas neumaticas y flmdicas, respectivamente, las formas necesarias para proporcionar los canales antes mencionados, camaras, valvulas, bombas, fuelles y otros componentes.
[0096] Cada uno de los componentes mencionados anteriormente en la Figura 3 se describira ahora en mas detalle.
1.3.3 Carcasa 111
[0097] La Figura 4 muestra la carcasa 111 con mas detalle. Como se muestra, la carcasa 111 comprende una superficie superior 120 generalmente rectangular y paredes 121 que dependen de la misma en los cuatro lados (dos de los cuales son visibles en la Figura 4). Un proposito principal de la carcasa 111 es proteger ciertos componentes del cartucho, mas notablemente el subconjunto de ampolla 112 y la interfaz 104 de la valvula de aislamiento. Por lo tanto, se observara que la carcasa 111 es mas corta que las capas 114, 115 neumaticas y flmdicas, de modo que solo recubre una parte de esas capas cuando el cartucho 100 esta ensamblado. En el cartucho ejemplar 100, la interfaz neumatica 101, la interfaz electronica 102 y la interfaz de la valvula de derivacion 103 no estan cubiertas por la carcasa 111 para proporcionar un facil acceso al lector.
[0098] La superficie superior 120 de la carcasa 111 tiene tres aberturas 122a-c en la misma, teniendo cada una paredes dependiendo de las periferias de las aberturas para formar tres rebajes, cuando el cartucho esta montado. El proposito de los rebajos es alojar las ampollas del subconjunto de ampolla 112 de manera que el lector pueda acceder y comprimir las ampollas, pero de lo contrario estan protegidas contra impactos accidentales. Naturalmente, dado que el cartucho ilustrativo comprende tres ampollas, la carcasa 111 comprende tres aberturas correspondientes 122a-c que forman tres rebajes correspondientes. Se apreciara que se pueden proporcionar mas o menos ampollas, aberturas y rebajes, dependiendo de la implementacion preferida. Alternativamente, la carcasa 111 podna comprender una unica abertura que forma un unico rebaje que aloja todas las ampollas disponibles.
[0099] Las paredes laterales 121 de la carcasa 111 que se extienden a lo largo de la longitud de la carcasa 111 entre el extremo de insercion 105 y el extremo no de insercion 106 del cartucho 100 comprenden bridas 123 a lo largo de al menos una porcion de sus bordes inferiores. El proposito de las bridas 123 es doble. En primer lugar, comprenden una o mas ventanas 124a-b para recibir un numero correspondiente de lenguetas formadas en la capa neumatica 114 para mantener unido el cartucho 100. En segundo lugar, las bridas 123 estan dimensionadas para sobresalir mas alla de la superficie inferior de la lamina flmdica 116 cuando el cartucho esta montado, de modo que la lamina flmdica 116 se suspende por encima de una superficie plana sobre la que se coloca el cartucho 100. Esto evita danos accidentales a la lamina flmdica 116 que podna resultar de lo contrario.
[0100] A pesar de que en el cartucho ejemplar representado en la Figura 4 las bridas 123 se proporcionan a lo largo de sustancialmente la longitud de dos lados opuestos del cartucho, se apreciara que las bridas se pueden proporcionar a lo largo de tres o cuatro bordes del cartucho y todavfa suspender la lamina sobre una superficie plana sobre la cual se coloca el cartucho. De manera similar, aunque el cartucho representado en la Figura 4 muestra bridas 123 que se extienden sustancialmente a lo largo de todo el borde, se puede proporcionar una brida que se extiende solo parcialmente a lo largo de un borde, o se pueden proporcionar multiples bridas a lo largo de cada borde.
[0101] La carcasa 111 comprende ademas, en el extremo 106 de no insercion, una empunadura 125 para facilitar la insercion del cartucho y la extraccion del cartucho 100 del lector a mano. La empunadura 125 comprende una serie de crestas y surcos formados en la carcasa 111, pero tambien son posibles estructuras alternativas para aumentar la friccion, tales como moletas.
[0102] La carcasa 111 comprende ademas una abertura de entrada de muestra 126 a traves de la cual una muestra se puede introducir en la camara 10 de mezclado del cartucho 100 con una pipeta, por ejemplo de muestra. Alrededor de la abertura de entrada 126 para un diametro dado esta una depresion 127 empotrada en la superficie superior 120 de la carcasa 111 para acomodar una cierta cantidad de derrame de la muestra de lfquido. Aunque la
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cubeta 127 de la realizacion a modo de ejemplo es sustancialmente plana, puede estar inclinada hacia la abertura de entrada 126, de manera que cualquier derrame drena a traves de la abertura de entrada 126.
[0103] La carcasa ejemplar 111 comprende ademas una pluralidad de escotaduras: un primer corte de salida 128 que forma la ventana de muestra 109, y un segundo recorte 129 para proporcionar acceso a la interfaz valvula de aislamiento 104. Como con los rebajes que protegen las ampollas, al proporcionar acceso a la interfaz 104 de la valvula de aislamiento solamente a traves de un corte 129 en la carcasa 111, la interfaz 104 de la valvula de aislamiento esta protegida en cierta medida del impacto accidental, que podna accionar la valvula de aislamiento y cartucho inoperable.
1.3.4 Subconjunto de ampolla 112
[0104] La Figura 5 muestra el subconjunto de ampollas 112 en mas detalle. El subconjunto de ampollas 112 se puede fabricar por separado, durante el cual las ampollas se llenan previamente con los reactivos lfquidos necesarios para realizar la prueba preferida, y se adhieren subsiguientemente a la lamina neumatica 113.
[0105] Los subconjuntos de ampolla (o "ampollas") son familiares para una persona experta. Una ampolla es una camara plegable para contener un lfquido, que puede expulsarse de la ampolla al presionar la ampolla y, por lo tanto, colapsarla. En las ampollas tfpicas, la camara de una ampolla se sella con una lamina u otra capa frangible que se rompe una vez que la presion dentro de la camara alcanza una magnitud particular a medida que se colapsa la ampolla.
[0106] En el cartucho ilustrativo, el subconjunto de ampollas 112 comprende tres ampollas 130a-c. Estas contienen, respectivamente, el tampon de lisis que comprende reactivos capaces de realizar la lisis celular, el tampon de lavado y el tampon de elucion.
[0107] Los ejemplos de subconjunto de ampollas 112 comprende un sustrato 131 sobre el cual las ampollas antes mencionadas 130a-c estan formadas por una capa polimerica deformable que esta conformada para proporcionar las camaras. Tres aberturas 132a-c, que corresponden a las tres ampollas 130a-c, pasan a traves del sustrato 132. Cada una de las aberturas esta cubierta por la capa polimerica deformable que forma la camara, que de este modo conecta la abertura con la camara pero para un sello 133a-c entre las respectivas aberturas 132a-c y camaras. Tras la aplicacion de una presion adecuada sobre la ampolla 130a-c, el sello 133a-c se rompe, provocando que los contenidos lfquidos de la ampolla sean expulsados de la ampolla y fluyan a traves de la abertura 132a-c en el sustrato 131 hacia fuera del subconjunto de ampolla.
[0108] Como se muestra, los sellos 133a-c, al menos parcialmente rodean la periferia de las camaras, donde se reunen el sustrato 131. En el punto en cada sello 133a-c que esta disenado para romper (formando de este modo el paso de lfquido entre la abertura 132a-c y la camara), la junta 133a-c puede ser mas debil que el resto de la periferia. Esto asegura que la parte correcta del sello 133a-c se rompe cuando se aplica la presion adecuada.
[0109] Las ampollas pueden colapsarse por el lector cuando el cartucho se inserta en el mismo. El lector puede aplicar uno o mas actuadores mecanicos (como un pie) en el rebaje para colapsar la ampolla.
[0110] El subconjunto de ampolla 112 comprende ademas dos agujeros de referencia 134a-b configurados para permitir que un aparato de montaje proporcione una referencia para facilitar el posicionamiento del conjunto durante la fabricacion.
1.3.5 Capa neumatica 114
[0111] Las Figuras 6A y 6B muestran la capa neumatica 114 con mas detalle. La Figura 6A es una vista superior de la capa neumatica y la Figura 6B es una vista inferior. La capa neumatica 114 esta compuesta por una capa de plastico ngido 135 que, en ciertos lugares, se sobremoldea con una pluralidad de membranas flexibles para formar ciertos componentes cuando se ensambla el cartucho. Las membranas flexibles se fabrican a partir de un elastomero termoplastico.
[0112] La capa de plastico ngido 135 tiene una pluralidad de huecos en forma diferente y aberturas a su traves. En combinacion con la capa flmdica 115, ciertos rebajes dentro de y/o aberturas a traves de la capa plastica ngida 135 forman una serie de componentes, que incluyen: la camara de mezcla de muestra 136; la camara de desechos 137; la columna de captura 138; la camara de elucion 139; la primera y la segunda camaras de amplificacion 140a-b; y las camaras de deteccion primera a cuarta 141a-d. Tambien se proporciona una abertura 142 para dar acceso a la capa de electrodo 117.
[0113] En combinacion con las membranas flexibles sobremoldeadas y la lamina neumatica 113, algunas otras realizaciones a traves de la capa de plastico ngido forman una serie de otros componentes, que incluyen: la valvula de fuelle aguas arriba 142; el fuelle 143; una interfaz neumatica 144; la valvula de fuelle aguas abajo 145; la valvula de entrada del tampon de lavado 146; la valvula de entrada de aire del regulador de lavado 146a; la valvula de
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entrada del tampon de elucion 147; la valvula de entrada de aire de tampon de elucion 147a; la valvula de la camara de desechos 148; la valvula 149 de la camara de elucion; la valvula de aislamiento 150; las valvulas de entrada primera y segunda de la camara de amplificacion 151a-b; y las valvulas de salida primera y segunda de la camara de amplificacion 152a-b. Una abertura adicional, en combinacion con una membrana flexible sobremoldeada (pero no la lamina neumatica) forma una valvula de derivacion 153.
[0114] Con la excepcion de la valvula de aislamiento 150 y la valvula de derivacion 153, las valvulas formadas en la capa neumatica son valvulas accionables neumaticamente. Es decir, cada valvula es operable para abrir y cerrar un canal de fluido en el que se encuentra la valvula, y esta valvula esta accionada aplicando una presion particular a una lmea de control neumatico acoplada a la valvula. Las lmeas de control neumaticas estan acopladas a la interfaz neumatica 144, a la que tiene acceso el lector cuando el cartucho 100 se inserta en el mismo. Por lo tanto, para accionar una valvula neumatica dada, el lector simplemente aplica una presion apropiada a la lmea de control neumatico asociada con esa valvula para abrir o cerrar la valvula.
[0115] La valvula de aislamiento 150 y la valvula de derivacion 153 tambien son accionadas por el lector, pero mecanicamente. De nuevo, cada valvula es operable para abrir y cerrar un canal de fluido en el que se encuentra la valvula, pero la valvula se acciona mediante la aplicacion de uno o mas actuadores mecanicos (como un pie) a la valvula.
[0116] La capa de neumatico comprende ademas dos agujeros de referencia 154a-b configurados para permitir que un aparato de montaje para proporcionar una referencia para facilitar el posicionamiento de la capa durante la fabricacion. Cuando el cartucho esta ensamblado, los agujeros de referencia 154a-b en la capa neumatica se alinean con los agujeros de referencia 134a-b en el subconjunto de ampolla.
[0117] La capa neumatica comprende ademas aberturas 155a-c que, cuando el cartucho esta montado, se alinea con las aberturas 132a-c que pasan a traves del sustrato 131 del subconjunto de ampolla (a traves de la lamina neumatica, como se describe abajo).
1.3.6 Lamina neumatica 113
[0118] La Figura 7 muestra la lamina neumatica 113 con mas detalle. Como se ha explicado anteriormente, la lamina neumatica 113 se adhiere a la superficie superior de la capa neumatica 114, sellando asf fluidamente canales, camaras, valvulas, bombas, fuelles y otros componentes formados en la misma. Por lo tanto, en su mayor parte, la lamina neumatica 113 es una hoja de lamina generalmente plana y rectangular para proporcionar un cierre eficaz. Beneficiosamente, la lamina neumatica 113 es inerte, de modo que no reacciona con los reactivos que se mueven a traves de la capa neumatica 114.
[0119] Sin embargo, la lamina neumatica 113 no se superpone a toda la capa de neumatico 114. En particular, la lamina neumatica 113 no recubre la camara de mezcla de muestra 136 o la camara de residuos 137 en el extremo no de insercion 106 del cartucho 100, o la valvula de derivacion 153 en el extremo de insercion 105. Ademas, la lamina neumatica 113 comprende recortes 156, 157, de manera que no se superpone a la valvula de aislamiento 150 o la interfaz neumatica 144, respectivamente.
[0120] La lamina neumatica 113 comprende ademas tres aberturas 158a-c que, cuando el cartucho 100 se ensambla, se alinean con las aberturas 132a-c que pasan a traves del sustrato 131 del subconjunto de ampolla y 155a- c que pasa por la capa neumatica 114. Las aberturas 158a-c permiten que los reactivos liquidos dentro de las ampollas pasen a la capa neumatica 114, y de allf a la capa flmdica 115 a traves de las aberturas 155a-c.
[0121] La lamina neumatica 113 comprende dos agujeros de referencia 159a-b configurados para permitir que un elemento de ensamblaje proporcione una referencia para facilitar el posicionamiento de la capa durante la fabricacion. Cuando el cartucho esta ensamblado, los agujeros de referencia 159a-b en la lamina neumatica se alinean con los agujeros de referencia en las otras capas.
[0122] La lamina neumatica es una lamina compuesta fabricada a partir de una capa de tereftalato de polietileno, para proporcionar resistencia, con una capa de polipropileno en la parte superior para proporcionar un material inerte para contactar la muestra lfquida y los tampones, y tambien para permitir que la lamina sea sellada termicamente a la capa neumatica (tambien fabricada de polipropileno).
1.3.7 Capa fluidica 115
[0123] Las Figuras 8A y 8B muestran la capa de fluido 115 en mas detalle. La Figura 8A es una vista superior de la capa neumatica y la Figura 8B es una vista inferior. La capa fluidica 115 esta compuesta de una capa ngida de plastico 160. Como se explico anteriormente, el lado superior de la capa fluidica 115 (no mostrada) esta adherido al lado inferior de la capa neumatica 113 (vease la Figura 5B) de manera que los diversos canales, las camaras, valvulas, bombas, fuelles y otros componentes formados por una combinacion de las capas neumatica y fluidica estan alineados.
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[0124] Al igual que con la capa de plastico ngido 135 de la capa neumatica 113, la capa de plastico ngido 160 de la capa de fluido 115 tiene una pluralidad de cavidades de diferentes formas en la misma y las aberturas a traves de la misma. En combinacion con la capa neumatica 113 y la lamina fluida 116, ciertos rebajes dentro y/o aberturas a traves de la capa ngida de plastico 160 forman ciertos componentes, que incluyen: la camara de entrada de muestra 136; la columna de captura 138; la camara de elucion 139; las camaras de amplificacion primera y segunda 140a-b; y las camaras de deteccion primera a cuarta 141a-d. la valvula de fuelle aguas arriba 142; el fuelle 143; la interfaz neumatica 144; la valvula de fuelle aguas abajo 145; la valvula de entrada del tampon de lavado 146; la valvula de entrada de aire del regulador de lavado 146a; la valvula de entrada del tampon de elucion 147; la valvula de entrada de aire de tampon de elucion 147a; la valvula de la camara de desechos 148; la valvula de la camara de elucion 149; la valvula de aislamiento 150; las valvulas de entrada primera y la segunda de la camara de amplificacion 151a-b; y valvulas de salida primera y segunda de la camara de amplificacion 152a-b. Una abertura 161 tambien se proporciona para dar acceso a la capa de electrodo 117.
[0125] Por otra parte, en combinacion con la lamina de fluido 116 (pero no la capa de neumatico 114), rebajes en la capa de fluido 115 tambien proporciona el filtro grueso 162, el canal de mezclado intrincado 163, y una pluralidad de canales que, cuando se ensambla el cartucho, conectan los componentes mencionados anteriormente para permitir el paso de la muestra lfquida y reactivos lfquidos a traves del cartucho, y facilitar el accionamiento neumatico de las valvulas, bombas, fuelles y otros componentes.
[0126] La capa de fluido comprende dos agujeros de referencia 164a-b configurados para permitir que un aparato de montaje proporcione una referencia para facilitar el posicionamiento de la capa durante la fabricacion. Cuando el cartucho esta montado, los agujeros de referencia 164a-b en la capa flmdica se alinean con los agujeros de referencia en las otras capas.
[0127] Como se menciona anteriormente, los canales se forman entre la interfaz neumatica y las diversas valvulas y fuelles descritos anteriormente. En el cartucho ejemplar, la interfaz neumatica comprende 11 puertos que estan conectados a los diversos componentes de la siguiente manera.
Puerto 1: fuelles
Puerto 2: valvulas de fuelle aguas arriba
valvulas de entrada primera y segunda de camara de amplificacion
valvula de salida primera y segunda de la camara de amplificacion
Puerto 3: valvula de fuelle aguas abajo
Puerto 4: valvula de entrada de tampon de lavado
Puerto 5: entrada de aire de tampon de lavado
Puerto 6: Valvula de entrada de aire de tampon de lavado
valvula de entrada de aire de tampon de elucion
Puerto 7: Entrada de aire de tampon de elucion
Puerto 8: Valvula de entrada de tampon de elucion
Puerto 9: Lmea de presion de referencia
Puerto 10: Valvula de la camara de elucion
Puerto 11: Valvula de la camara de residuos
[0128] Se entendera que, si bien los diversos aspectos inventivos del cartucho ejemplar pueden implementarse utilizando los espedficos de las conexiones mencionadas anteriormente (en particular, la entrada de camara de amplificacion primera y segunda y valvulas de salida estando conectadas a un solo puerto; y las entradas de aire de tampon de lavado y elucion estan conectadas a un solo puerto); la configuracion precisa enumerada anteriormente no es esencial.
1.3.8 Lamina Fluidica
[0129] La Figura 9 muestra la lamina fluidica 116 con mas detalle. Como se ha explicado anteriormente, la lamina fluidica 116 se adhiere a la superficie inferior de la capa fluidica 115, cerrando de ese modo los canales, camaras, valvulas, bombas, fuelles y otros componentes formados de manera fluida en los mismos. Por lo tanto, en su mayor parte, la lamina fluidica 116 es una hoja de lamina generalmente rectangular y plana para proporcionar un sellado eficaz. Beneficiosamente, la lamina 116 es inerte de manera que no reacciona con los reactivos que se mueven en la capa neumatica.
[0130] Sin embargo, la lamina fluidica 116 no cubre toda la capa fluidica 115. En particular, la lamina fluidica 116 no se superpone a las camaras de deteccion 141a-d en el extremo de insercion 105.
[0131] La lamina de fluido 116 comprende dos agujeros de referencia 165a-b configurado para permitir que un aparato de montaje proporcione una referencia para facilitar el posicionamiento de la capa durante la fabricacion. Cuando el cartucho esta montado, los agujeros de referencia 165a-b en la lamina fluidica se alinean con los agujeros de referencia en las otras capas.
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[0132] La lamina flmdica es una lamina compuesta fabricada a partir de una capa de tereftalato de polietileno, para proporcionar resistencia, con una capa de polipropileno en la parte superior para proporcionar un material inerte para contactar la muestra lfquida y los tampones, y tambien para activar la lamina para ser termosellado a la capa flmdica (tambien fabricada de polipropileno).
1.3.9 Capa de electrodo 117
[0133] Finalmente, la Figura 10 muestra la capa de electrodo 117 con mas detalle. Como se explico anteriormente, la capa de electrodo 117 se adhiere a la capa flmdica 115. La capa de electrodo 117 comprende cuatro conjuntos de electrodos de deteccion 166a-d. Cada conjunto de electrodos de deteccion 166a-d comprende primeros a terceros contactos electricos 168a-d que se complementan con contactos electricos correspondientes en el lector cuando el cartucho se inserta en el mismo. Preferiblemente, los contactos electricos estan hechos de plata para optimizar la conexion electrica. Preferentemente, los electrodos que estan plateados con cloruro de plata se utilizan para garantizar un comportamiento galvanico optimo.
[0134] Cada conjunto de electrodos de deteccion 166a-d comprende un electrodo de trabajo 169a-d; un contraelectrodo 170a-d y un electrodo de referencia 171a-d. Cada uno de los electrodos esta acoplado a un contacto electrico respectivo. Cada conjunto de electrodos de deteccion 166a-d tambien comprende un dielectrico 172a-d que cubre la interfaz entre los electrodos y los respectivos contactos electricos.
[0135] Una persona experta entiende que la senalizacion electroqmmica puede usarse para indicar la presencia de dianas geneticas o inmunologicas. En el cartucho ejemplar, este proceso se realiza en la primera a la cuarta camaras de deteccion 141a-d que estan optimizadas para proporcionar la interfaz de prueba electroqmmica.
[0136] Los electrodos 166a-d estan dispuestos de tal manera que una muestra de lfquido dentro de las camaras de deteccion primera a cuarta 141a-d se pone en contacto con los conjuntos de electrodos primer a cuarto 166a-d. En las camaras de deteccion, algunos compuestos en la muestra de fluido (denominados "electrolito") tienen una tendencia natural a migrar a electrodos e intercambiar electrones. Este efecto galvanico es como funcionan las batenas.
[0137] Todas las combinaciones de compuestos solubles tienen alguna actividad electroqmmica, y la velocidad a la que se produce esta actividad (es decir, la cantidad de carga intercambiada) se determina exactamente por lo que son esos compuestos. Por lo tanto, es posible medir la presencia de diferentes analitos en la muestra lfquida, buscando las caractensticas caractensticas de su electroqmmica redox.
[0138] En el cartucho ilustrativo, la corriente requerida para mantener un estado redox dado en las camaras de deteccion 141a-d se controla en diferentes estados redox. La corriente se suministra a traves del electrolito desde los electrodos de trabajo 169a-d a los contraelectrodos 170a-d.
[0139] Los electrodos de referencia 171a-d tambien entran en contacto con el electrolito. Los voltajes se declaran con respecto a este electrodo de referencia porque su voltaje es en gran medida independiente de las condiciones redox y, por lo tanto, esto significa que solo se esta midiendo el estado redox de la qmmica en el electrodo de control.
[0140] Se aplica un barrido de tension entre los electrodos de trabajo 169a-d y los contraelectrodos 170a-d por el lector, lo que genera el rango caractenstico de condiciones redox. La corriente que pasa entre los electrodos de trabajo 169a-d y los contraelectrodos 170a-d luego se midio para obtener los resultados de la prueba. El barrido de tension es un conjunto de tensiones que se incrementa lentamente y se aplica entre los electrodos. Preferiblemente, el barrido es de aproximadamente -0,7 voltios a aproximadamente +1 voltios con respecto al electrodo de referencia. El voltaje se aplica en impulsos incrementales consecutivos que tienen una amplitud de modulacion de pulso de entre 30 y 80 milivoltios (preferiblemente entre 40 y 60 milivoltios, mas preferiblemente 50 milivoltios). Preferiblemente, el incremento del paso de un pulso al siguiente esta entre 1 y 5 milivoltios (preferiblemente entre 2 y 4 milivoltios, mas preferiblemente 3 milivoltios). Al aplicar estos voltajes a traves de los electrodos, se pueden obtener mediciones de corriente en la escala de 100s de nano amperios.
[0141] La disposicion particular de los electrodos de deteccion ilustrados en la Figura 10 puede en sf misma formar un aspecto inventivo aislado del cartucho. Convencionalmente, el contraelectrodo en un potenciostato es mas grande que el electrodo de trabajo para proporcionar un amplio suministro de electrones sobrantes. Sin embargo, se ha encontrado que invertir esta convencion sorprendentemente ofrece mejores resultados para el cartucho ejemplar. Para la electroqmmica realizada en la muestra lfquida descrita anteriormente en el cartucho ejemplar, se encuentra que tener un electrodo de trabajo que es mas grande que el contraelectrodo proporciona senales mas grandes y mejores resultados por medio de una sensibilidad incrementada. En otras palabras, tener un flujo de corriente desde un electrodo de trabajo relativamente grande hasta un contraelectrodo relativamente pequeno ofrece mejoras con respecto a la disposicion convencional.
[0142] Preferiblemente, cada electrodo de trabajo 169a-d se forma en una forma de U y cada electrodo contador
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170a-d se forma en una forma alargada recta entre los dos dientes del respectivo electrodo de trabajo en forma de U.
[0143] Ahora se explicara brevemente el funcionamiento del metodo del cartucho ejemplar presentado anteriormente.
1.4 Metodo de operacion del cartucho ejemplar
1.4.1 El extremo delantero
[0144] Como se describio anteriormente, una muestra de fluido (tal como una muestra de orina) se introduce en la camara de mezcla de muestra 10 utilizando una pipeta de muestra. Una porcion de la muestra pasa al indicador de muestra 12 para mostrar que hay una muestra presente en la camara de mezcla de muestra.
[0145] Una vez que el cartucho 100 con una muestra en la camara de mezcla 10 se inserta en un lector, y el lector se activa, la prueba puede comenzar. En primer lugar, el lector aplicara un accionador mecanico (tal como un pie) para colapsar la ampolla 14 de tampon de lisis. Al hacerlo, el tampon de lisis sera expulsado a la camara 10 de mezcla de muestras donde se mezclara con la muestra.
[0146] El fuelle 20 y sus valvulas 22a-b mueven entonces el tampon de muestra y la lisis de lfquido hacia atras y adelante en la muestra de la camara de mezcla 10 a fin de mezclar la lisis y la muestra y para rehidratar el control interno. Despues de la etapa de mezcla, se produce la incubacion de la muestra y el tampon de lisis para permitir que tenga lugar la lisis celular.
[0147] El fuelle 20 y sus valvulas 22a-b entonces empezaran la operacion para bombear la muestra desde la camara 10 de mezcla de muestras, al canal 16 principal, a traves del filtro grueso 18 y hacia la columna de captura 24. Dentro de la columna de captura 24, acidos nucleicos estan espedficamente unidos a un filtro en la columna de captura en funcion de su tamano y carga. La muestra de lfquido no deseado pasa a la camara de residuos 38.
[0148] Una vez que la muestra de lfquido no deseado ha pasado a la camara de residuos 38, dejando los acidos nucleicos unidos a la columna de captura 24, el lector aplica un accionador mecanico (tal como un pie) para contraer la ampolla de tampon de lavado 30. Al hacerlo, el tampon de lavado sera expulsado al primer canal de ramificacion 26, y desde allf al canal principal 16. De nuevo, el fuelle 20 y sus valvulas 22a-b comenzaran a funcionar para bombear el tampon de lavado a traves del canal principal 16 y a traves de la columna de captura 24 para lavar restos celulares no deseados restantes y otros componentes celulares fuera de la columna de captura con el tampon de lavado a traves de la camara de residuos 38, o bien el tampon de lavado se descargara a las camaras de residuos utilizando aire del lavado y/o entradas de aire de tampon de elucion.
[0149] Una vez que la muestra de lavado ha pasado a la camara de residuos 38, dejando solo los acidos nucleicos unidos y purificados en la columna de la captura 24, el lector aplica un accionador mecanico (tal como un pie) para contraer la ampolla de tampon de elucion 32. Al hacerlo, el tampon de elucion se expulsara al segundo canal de bifurcacion 28, y desde allf al canal principal 16. De nuevo, el fuelle 20 y sus valvulas 22a-b comenzaran a funcionar para bombear el tampon de elucion a traves del canal principal 16 y a traves de la columna de captura 24 para eluir los acidos nucleicos de la columna de captura, o bien el tampon de elucion se enjuagara en la columna de captura usando aire de las entradas de aire del tampon de lavado y/o elucion. La muestra lfquida preparada pasa luego a la camara de elucion 46; de nuevo, ya sea por bombeo o enjuague como se describe anteriormente.
[0150] La muestra se instala en la camara de elucion 46 permitiendo que las burbujas se dispersen antes de entrar en las camaras de amplificacion.
1.4.2 El extremo trasero
[0151] El fuelle 20 y sus valvulas 22a-b comenzaran entonces la operacion de bombear la muestra de lfquido de la camara de elucion 46, a traves de la valvula de aislamiento 59, a traves del canal de mezcla 52 y en las camaras de amplificacion 56a-b, o bien la muestra se descargara a las camaras de amplificacion utilizando aire de las entradas de aire del tampon de lavado y/o elucion. En las camaras de amplificacion de acido nucleico 56a-d, el acido nucleico de interes, si esta presente, se amplifica de modo que esta presente a un nivel detectable. El acido nucleico de control tambien se amplifica de modo que esta presente a un nivel detectable. Como se menciona anteriormente, se puede usar cualquier metodo de amplificacion de acido nucleico. Cuando se usa PCR, los cebadores hibridan espedficamente con el acido nucleico de interes y se extienden mediante una polimerasa termoestable tal como la polimerasa Taq mediante la adicion de dNTPs al extremo 3' de cada uno de los cebadores. Cualquier muestra de ifquido en exceso puede ser eliminado de la via de fluido a traves de los canales de derivacion 68.
[0152] El fuelle 20 y sus valvulas 22a-b comenzaran entonces la operacion de bombear la muestra de lfquido desde las camaras de amplificacion 56a-b y en las camaras de deteccion 62a-d, o de lo contrario la muestra se enjuagara en las camaras de deteccion usando aire de las entradas de aire del tampon de lavado y/o elucion. En las camaras
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de deteccion, la sonda diana se hibrida espedficamente con el acido nucleico amplificado diana de interes y la sonda de control hibrida espedficamente con el acido nucleico de control amplificado. La nucleasa hidroliza las sondas diana y de control despues de la hibridacion de las sondas con el acido nucleico amplificado. La hidrolisis de las sondas de control y objetivo libera las etiquetas de las sondas provocando un cambio detectable en la senal de las etiquetas.
[0153] Una vez que la muestra de lfquido ocupa las camaras de deteccion, el lector aplica un accionador mecanico a la valvula de aislamiento 50 para cerrar la valvula y aislar la muestra de lfquido en el extremo posterior del dispositivo.
[0154] Los electrodos proporcionan una diferencia de potencial a traves de al menos una camara de deteccion. Dependiendo del estado de la etiqueta (es decir, si esta unida a la sonda de longitud completa o si la sonda se hidrolizo y esta libre o unida a un solo nucleotido o una parte corta de la sonda), la corriente que puede fluir a traves de ella la camara de deteccion sera diferente. Por lo tanto, los electrodos permiten la deteccion por el lector del cambio en la senal de la etiqueta que resulta de la hidrolisis de la sonda hibridada.
[0155] La presente invencion se describira ahora con referencia a las Figuras 16 a 20.
2. Manejo de la muestra liquida en el extremo trasero
[0156] La siguiente seccion describe la presente invencion con mas detalle con referencia a las Figuras 16 a 20. La invencion puede ser implementada en el cartucho flrndico ejemplar descrita anteriormente, espedficamente en el extremo posterior del cartucho, aguas abajo de la valvula de aislamiento. Sin embargo, se apreciara que la presente invencion tiene una serie de ventajas que pueden ser aplicables en circunstancias distintas del cartucho de fluidos a modo de ejemplo descrito anteriormente.
2.1 Medicion de la muestra liquida
[0157] La Figura 16 muestra una primera realizacion de un sistema de valvula segun la invencion para dosificar una muestra liquida. El sistema de valvula C100 comprende una via de fluido C110 para pasar fluido desde un extremo aguas arriba a un extremo aguas abajo, una camara de procesamiento de muestras C102 dentro de la via de fluido, que tiene una valvula de entrada C101 aguas arriba de la camara de procesamiento de muestras C102 y una valvula de salida C103 aguas abajo de la camara de procesamiento de muestras C102. La camara de procesamiento de muestras puede ser, por ejemplo, una camara de amplificacion de acidos nucleicos 58a-b descrita anteriormente con respecto al cartucho ejemplar, aunque tambien son posibles otras camaras. Puede proporcionarse una region de procesamiento de muestra aguas abajo en el extremo aguas abajo de la ruta de fluido. En el cartucho ejemplar, la region de procesamiento de muestra aguas abajo puede ser la camara diana C104, que esta situada a lo largo de la via de fluido aguas abajo de la valvula de salida C103. De nuevo, la camara diana puede ser, por ejemplo, una camara de deteccion 64a-d descrita anteriormente con respecto al cartucho ejemplar, aunque tambien son posibles otras camaras. Independientemente de los fines para los que se colocan la camara de procesamiento de muestra y la camara diana, la camara diana es una camara a la que se debe suministrar el volumen de una muestra liquida, una vez que la muestra ha pasado a traves de la camara de procesamiento.
[0158] Un canal de derivacion C105 esta acoplado a la ruta del fluido en una union entre la valvula de salida C103 y la camara diana C104. El objetivo del canal de derivacion C105 consiste en permitir que el exceso de muestra de lfquido, que se debe evitar que entre en la camara diana, se elimine de la via de fluido, como se describe con mas detalle a continuacion.
[0159] La valvula de entrada C101 y la valvula de salida C103 pueden ser valvulas accionadas neumaticamente formadas en las capas neumaticas y flmdicas del cartucho ejemplar, por ejemplo. En la Figura 17 se muestra un diagrama de una valvula ejemplar accionada neumaticamente. Se puede formar una cavidad de valvula C201 en una sola capa de polfmero o en una pluralidad de capas, tales como la capa de carcasa 111, la capa neumatica 114 y la capa flmdica 115 del cartucho ilustrativo descrito anteriormente. Se forma una membrana de valvula flexible C202 dentro de la cavidad de valvula C201 para definir una camara de valvula C203 entre la membrana de valvula C202 y la cavidad de valvula C201. La membrana puede sobremoldearse sobre la capa neumatica, como se explico anteriormente.
[0160] La camara de valvula C203 tiene una primera abertura C204 y una segunda abertura C205, cada una conectada a un canal; bien el canal de derivacion C105, un canal que forma parte de la via principal C110, o cualquier otro canal. La membrana flexible C202 es movible entre una posicion cerrada (Figura 17a), en la que la membrana flexible C202 sella contra las aberturas primera y segunda C204, C205 para evitar el flujo de fluido a traves del canal o camino, y una posicion abierta (Figura 17b), en donde la membrana flexible C202 esta separada de las aberturas primera y segunda C204, C205 para permitir que el fluido fluya a traves del canal o via.
[0161] La valvula C200 comprende ademas un paso C206 que tiene una abertura en la cavidad de la valvula C201. La abertura del pasaje C206 esta separada de las aberturas primera y segunda C204, C205 por la membrana
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flexible C202. El pasaje C206 sirve como un canal de actuacion para mover la membrana flexible entre sus posiciones abierta y cerrada para accionar la valvula. Preferiblemente, a presion atmosferica, la membrana de valvula C202 esta sellada contra las aberturas primera y segunda C204, C205 y la valvula esta cerrada. Por el contrario, cuando se aplica una presion de vado o manometrica a traves del paso de fluido C206, la presion dentro de la cavidad de la valvula C201 se reduce por debajo de la del canal de la via de fluido C110 y la membrana flexible C202 se lleva a la posicion abierta. El paso de actuacion C206 se puede conectar a un puerto en la interfaz neumatica a traves del cual se puede aplicar la presion del vacfo o del manometro.
[0162] Con referencia a la Figura 16, se entendera que las valvulas de entrada y salida C101, C103 pueden configurarse cada una de acuerdo con la valvula mostrada en las Figuras 17a-b. Preferiblemente, los pasos de actuacion de las valvulas de entrada y de salida C101, C103 estan acoplados a un unico puerto en la interfaz neumatica para permitir el accionamiento sustancialmente simultaneo de las valvulas de entrada y salida C101, C103. Para mejorar la precision de la actuacion simultanea, los pasos de actuacion de la valvula a la interfaz neumatica pueden tener la misma longitud y el volumen total de los pasos y las cavidades de la valvula son iguales. Esto asegura que al aplicar una presion manometrica a los pasos de actuacion a traves del puerto en la interfaz neumatica (no mostrada), las valvulas de entrada y salida C101, C103 se abriran y cerraran simultaneamente. Para mejorar la velocidad de actuacion, la valvula de entrada y las valvulas de salida C101, C103 pueden estar provistas de topes, como se describe con mas detalle a continuacion.
[0163] La disposicion descrita anteriormente permite un volumen preciso de la muestra de lfquido que se suministra desde el camara de procesamiento de muestra C102 a la camara diana C104, como se explicara ahora. Primero se introduce una muestra de lfquido a traves de la via de fluido C110. La muestra pasa aguas abajo, a traves de la valvula de entrada abierta C101 y hacia la camara de procesamiento de muestras C102. Cuando la camara de procesamiento de muestras esta llena, la muestra lfquida pasa mas aguas abajo, a traves de la valvula de salida abierta C103 de manera que al menos una porcion de la muestra de lfquido esta aguas abajo de la valvula de salida C103.
[0164] En este punto, al menos la valvula de salida C103 (pero preferiblemente tanto la valvula de entrada C101 como la valvula de salida C103) esta cerrada. Esto asegura que un volumen fijo y predeterminado de muestra de lfquido esta contenido entre la valvula de entrada C101 y la valvula de salida C103.
[0165] Una vez que la valvula de salida C103 (o la valvula de entrada C101 y la valvula de salida C103) esta cerrada, el exceso de muestra de lfquido aguas abajo de la valvula de salida puede ser retirado de la via de fluido a traves del canal de derivacion C105. A continuacion se describe una disposicion preferida para eliminar el exceso de muestra de lfquido, pero cualquier medio servira para describir la presente realizacion de la invencion. Por ejemplo, se puede aplicar un vacfo al canal de derivacion C105 para eliminar la muestra de lfquido y un sistema de re- presurizacion apropiado provisto para asegurar que la ruta del fluido vuelva a su presion operativa normal.
[0166] Una vez que la muestra excedente lfquida se ha retirado de la via de fluido aguas abajo de la Valvula de salida C103 a traves del canal de derivacion C105, existe un volumen fijo y predeterminado de la muestra de lfquido entre la valvula de entrada C101 y la camara diana C104. Por lo tanto, el volumen fijo y predeterminado de muestra lfquida puede ser administrado a la camara diana C104 simplemente abriendo la valvula de salida C103 y pasando el lfquido desde la camara de procesamiento de muestra a la camara diana por cualquier proceso conveniente, tal como se describe anteriormente.
[0167] Como se explicara ahora, cuando se utiliza el sistema de valvula descrito anteriormente en relacion con la Figura 16 en el cartucho flrndico ejemplar, se establece un sistema de medicion C300 para la entrega de un volumen bien definido de muestra procesada a las camaras de deteccion C306.
[0168] Con referencia ahora a la Figura 18, en el cartucho ejemplar descrito anteriormente, se proporcionan dos vfas de fluido. Por supuesto, se pueden proporcionar mas o menos vfas dependiendo de la implementacion preferida.
[0169] La primera via de fluido C310a comprende una primera camara de procesamiento de muestras C302a, una primera valvula de entrada C301a aguas arriba de la primera camara de procesamiento de muestras C302a, una primera valvula de salida C303a aguas abajo de la primera camara de procesamiento de muestras C302a y camaras de deteccion primera y segunda C304a1, C304a2 que se ramifican desde el canal principal de la primera via de fluido, aguas abajo de la primera valvula de salida C303a. Nuevamente, se pueden proporcionar mas o menos camaras de deteccion por via de fluido, dependiendo de la implementacion preferida.
[0170] Del mismo modo, la segunda via de fluido C310b comprende una segunda camara de procesamiento de la muestra C302b, una segunda valvula de entrada C301b aguas arriba de la segunda camara de procesamiento de la muestra C302b, una segunda valvula de salida C303b aguas abajo de la segunda camara de procesamiento de la muestra C302b y camaras de deteccion tercera y cuarta C304b1, C304b2, que se ramifican desde el canal principal de la segunda via de fluido C310b, aguas abajo de la segunda valvula de salida C303b.
[0171] Los canales de derivacion primero y segundo C305a C305b estan acoplados a las vfas de fluido primera y
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segunda C310a, C310b respectivamente entre las valvulas de salida C303 y las camaras de deteccion C304. Si se proporcionaron mas o menos v^as de fluido, se apreciara que un numero correspondiente de canales de derivacion se puede conectar a ellas en un numero correspondiente de uniones.
[0172] Aunque en la realizacion ilustrada en la Figura 18, la relacion entre las camaras de procesamiento de muestra y las camaras diana es 1:2, se apreciara que la relacion puede ser 1:1, 1:3 o 1:n tal que hay n camaras diana que se ramifican desde el canal principal de cada via de fluido.
[0173] Con referencia a la Figura 18, en una realizacion ejemplar del sistema de valvula de la presente invencion, se proporciona ademas una valvula de control (o valvula de derivacion) C315 a la que estan acoplados los canales de derivacion primero y segundo, las vfas de fluido primera y segunda que provienen de la valvula de aislamiento 50, y los resortes de gas primero, segundo, tercero y cuarto C306, aguas abajo de las camaras diana primera, segunda, tercera y cuarta C304, respectivamente. La valvula de derivacion C315 es una valvula que se usa para controlar el movimiento de una muestra de lfquido dentro del extremo posterior, como se describe con mas detalle a continuacion. La muestra de lfquido entra en el extremo posterior del cartucho de fluido a traves de la valvula de aislamiento 50 y luego entra en las camaras de amplificacion C302a, C302b. Los muelles de gas 306a1-2 y 306b1-2 son orificios ciegos (es decir, extremos muertos en los canales) que contienen un gas compresible. El gas comprimible se comprime cuando se introduce un fluido en el canal en el que se encuentra el resorte de gas, y el gas compresible ejerce asf una fuerza contra el fluido en el canal en una direccion opuesta a la del lugar desde donde se introduce.
[0174] Una implementacion del sistema de valvula C300 se explicara ahora con referencia a las Figuras 18 y 19. Una muestra lfquida se introduce en el extremo posterior del cartucho ejemplar a traves de la valvula de aislamiento 50 como se describe anteriormente. A medida que se introduce la muestra de lfquido, las valvulas de entrada primera y segunda C301a-b y las valvulas de salida primera y segunda C303a-b estan abiertas, y la valvula de derivacion C305 esta cerrada. A medida que la muestra de lfquido pasa a lo largo de las vfas de fluido primera y segunda C310a-b, se reduce el volumen entre el punto muerto de los resortes de gas C306a1-2, C306b1-2 y la muestra de fluido en las vfas de fluido. Cuando la valvula de derivacion C315 este cerrada, no puede escapar aire aguas abajo de la muestra de fluido que avanza, y los resortes de gas C306a1-2, C306b1-2 se presurizan. La muestra de lfquido continua avanzando a lo largo de las vfas de fluido primera y segunda C310a-b hasta que pasa por las valvulas de salida C303a-b, momento en el cual se sabe que se ha entregado un excedente de fluido a las camaras de procesamiento de muestras C302a-b. Una vez que se ha entregado un excedente de muestra lfquida y las camaras de procesamiento de muestra C302a-b estan llenas, las valvulas de entrada y salida C301a-b y C302a- b estan cerradas.
[0175] Una vez que las valvulas de entrada y salida C301a-b y C302a-b estan cerradas, la muestra se procesa en las camaras de procesamiento de muestra C302a-b. En el cartucho ejemplar descrito anteriormente, se preve que la amplificacion por PCR se realizara en la muestra. Una vez que las valvulas de entrada y salida C301a-b y C302a-b estan cerradas, y mientras que se procesa la muestra lfquida en las camaras de procesamiento de muestras C302a- b, se abre la valvula de derivacion C315, mientras que las valvulas primera y segunda de entrada y salida C301a-b y C302a-b permanecen cerradas. La valvula de derivacion se puede abrir mientras se esta procesando la muestra de lfquido, o despues o antes de procesar la muestra de lfquido. Cuando se abre la valvula de derivacion C315, se permite que los canales de derivacion primero y segundo C305a-b vuelvan a la presion atmosferica debido a que la valvula de derivacion se ventila a la atmosfera de cualquier manera conveniente. Dado que la presion en los canales de derivacion C305a-b es ahora menor que la presion en los resortes de gas presurizados C306a1-2, C306b1-2, el exceso de fluido en las vfas de fluido C310a-b es forzado a salir de las vfas y hacia los canales de derivacion C305a- b por la fuerza ejercida desde los resortes de gas C306a1-2, C306b1-2. Para garantizar que sustancialmente toda la muestra de lfquido sobrante se fuerce fuera de las vfas, los canales de derivacion C305a-b se ubican inmediatamente por debajo de las valvulas de salida 303a-b para evitar que se formen patas muertas entre las valvulas de salida 303a-b y las uniones en las que los canales de derivacion 306a-b se unen a las vfas de fluido.
[0176] Una vez que la muestra de fluido sobrante ha sido llevada a los canales de derivacion C305a-b, las valvulas primera y segunda de entrada y de salida C301a-b y C302a-b se abren y la muestra procesada se hace avanzar a lo largo de las vfas de fluido primera y segunda y se lleva a las camaras de deteccion C304a1-2, C304b1-2.
[0177] Los pasos del metodo descrito anteriormente se establecen en la Figura 19.
2.2. Evacuacion del exceso de muestra liquida
[0178] En la discusion anterior de un sistema de valvula para dosificar una muestra de lfquido en una camara de muestra, se dio un ejemplo de un mecanismo para expulsar una muestra de lfquido sobrante usando muelles de gas. Este nuevo mecanismo para expulsar una muestra lfquida sobrante no solo debe usarse junto con una camara de procesamiento de muestras limitada por valvulas de entrada y salida, sino que podna usarse para expulsar una muestra de lfquido sobrante de una via de fluido principal aguas abajo de una valvula de salida de cualquier subsistema o region de procesamiento de muestra en un cartucho flmdico, para garantizar que solo los contenidos que quedan aguas arriba de la valvula de salida pasen a la camara diana.
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[0179] Por lo tanto, la Figura 20 muestra una segunda realizacion de un sistema de valvula de acuerdo con la invencion para expulsar una muestra de lfquido del subsistema, tal como una region de procesamiento de muestra (no mostrada). El sistema de valvula C500 comprende una v^a de fluido C510 para pasar fluido desde un extremo aguas arriba hasta un extremo aguas abajo, una valvula de salida C503 aguas abajo de la region de procesamiento de muestra (no mostrada) y una camara diana C504 ubicada a lo largo de la via de fluido aguas abajo de la valvula de salida C503. La camara diana puede ser, por ejemplo, una camara de deteccion 64a-d descrita anteriormente con respecto al cartucho ejemplar, aunque tambien son posibles otras camaras, dependiendo de la region de procesamiento de muestra particular. Independientemente de la finalidad para la cual se coloca la camara diana, la camara diana es una camara a la que se debe suministrar el volumen de una muestra lfquida, una vez que la muestra ha salido de la region de procesamiento de la muestra.
[0180] Un canal de derivacion C505 esta acoplado a la ruta de fluido entre la valvula de salida C503 y la camara diana C504. El objetivo del canal de derivacion C505 es permitir que el exceso de muestra de lfquido, que se debe evitar que entre en la camara diana C504, se retire de la via del fluido, como se describe con mas detalle a continuacion.
[0181] Un muelle de gas C506 se proporciona aguas abajo de la camara diana C504. Como se explico anteriormente, el muelle de gas C506 es un orificio ciego (es decir, un paso sin salida en el canal) que contiene un gas compresible. El gas compresible se comprime cuando se introduce un fluido en el canal en el que se encuentra el resorte de gas, y el gas compresible ejerce asf una fuerza contra el fluido en el canal. Una valvula de derivacion C515 tambien se proporciona dentro del canal de derivacion. La valvula de derivacion es una valvula que se usa para controlar el movimiento de una muestra lfquida, como se describe a continuacion.
[0182] Una muestra lfquida pasa desde la region de procesamiento de muestra (no mostrada) y aguas abajo de la valvula de salida abierta C503. A medida que el lfquido sale de la region de procesamiento de muestras, la valvula de salida C503 esta abierta y la valvula de derivacion C515 esta cerrada. A medida que la muestra de lfquido pasa a lo largo de la via del fluido C510, se reduce el volumen entre el extremo sin salida del resorte de gas C506 y la muestra de fluido. Al estar la valvula de derivacion C515 cerrada, no puede escapar aire aguas abajo de la muestra de fluido que avanza, y se presuriza el resorte de gas C506. La muestra de lfquido continua avanzando a lo largo de la via de fluido C510 hasta que pasa por la valvula de salida C503. Una vez que esto sucede, esta cerrada la valvula de salida C503.
[0183] Una vez que se cierra la valvula de salida, se abre la valvula de derivacion C515, mientras que la valvula de salida permanece cerrada. Cuando se abre la valvula de derivacion C515, se permite que el canal de derivacion C505 regrese a la presion atmosferica, nuevamente en virtud de que la valvula de derivacion se ventila a la atmosfera de cualquier manera conveniente. Dado que la presion en el canal de derivacion C505 es ahora menor que la presion en los resortes de gas presurizados, el fluido sobrante en la ruta de fluido se fuerza fuera del camino y hacia el canal de derivacion C505 por la fuerza ejercida desde el muelle de gas 506. Para asegurar que sustancialmente toda la muestra de lfquido sobrante se expulse, el canal de derivacion se ubica inmediatamente adyacente a la valvula de salida C503 para evitar que se forme un tramo muerto entre la valvula de salida 503 y la union a la que se une el canal de derivacion C506 se une al camino del fluido
[0184] Una vez que la muestra de fluido excedente ha sido expulsada en el canal de derivacion C505, C503 la valvula de salida se abre y se muestra procesada se hace avanzar a lo largo de la via de fluido y se administra a la camara de deteccion C504.
[0185] Se reconocera que la forma de realizacion discutida en conexion con la Figura 20 puede implementarse con cualquier numero de vfas de fluido, cualquier numero de camaras diana, y cualquier numero de resortes de gas. Tambien se reconocera que la realizacion discutida en la Figura 20 puede implementarse en el cartucho flmdico ejemplar de la manera descrita anteriormente en conexion con las Figuras 18 y 19.
[0186] Una vez que la muestra de lfquido en exceso se ha retirado de la ruta del fluido y se ha pasado a la valvula de derivacion, se puede evitar que regrese a la via del fluido por cualquier medio conveniente. Por ejemplo, en el cartucho de fluido ejemplar, la valvula de aislamiento y la valvula de derivacion pueden configurarse para reducir la presion en el extremo posterior del cartucho, y preferiblemente desarrollar una presion negativa de fluido en el extremo posterior del cartucho, por lo tanto succionando el exceso de muestra de lfquido hacia la valvula de derivacion y evitando que regrese hacia la via del fluido.
[0187] El uso de resortes de gas en las realizaciones descritas anteriormente en relacion con las Figuras 18 a 20 es particularmente ventajoso porque permite que cantidades iguales de muestra procesada se administen a las camaras diana incluso cuando los desequilibrios locales en presiones (tales como los causados por ciclos termicos en un proceso de amplificacion de acidos nucleicos, por ejemplo) pueden hacer que la administracion exacta sea diffcil. Al ventilar los resortes de gas C306 y las camaras diana c304 a traves de los canales de derivacion C305 cuando la valvula de derivacion esta abierta y permitir que las camaras diana se igualen, la presion dentro de las camaras diana puede permanecer igual y garantizar la administracion de cantidades iguales de muestra lfquida.
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[0188] Con referencia a la implementacion de los sistemas de valvula de la presente invencion en el cartucho ilustrativo (veanse las Figuras 18 y 19), se prefiere que el volumen combinado de la pluralidad de camaras de deteccion que se ramifican desde cada camara de procesamiento de muestras sea aproximadamente la mitad del volumen de la propia camara de procesamiento de muestras. Esto es porque a medida que se avanza la muestra procesada desde la camara de procesamiento de muestra C302, la muestra no procesada aguas arriba de la camara de procesamiento de muestra tambien pasa a lo largo de cada via de fluido C310 y se mezcla con el fluido procesado aguas abajo de la camara de procesamiento de muestra C302. Al asegurar que hay disponible el doble de fluido procesado que la capacidad combinada de la pluralidad de camaras de deteccion, solo el fluido procesado no diluido avanzara a las camaras de deteccion C306. Por supuesto, esta relacion es meramente preferida, y en realidad funcionana cualquier relacion en la que el volumen de la camara de procesamiento de muestras sea mayor que los volumenes combinados de las camaras diana.
2.3 La valvula de derivacion y el sistema de valvulas
[0189] La presente invencion puede ser implementada junto con una valvula de derivacion preferido, que se describira a continuacion, para conseguir una region de extremo mejorado de nuevo en un cartucho flmdico, tal como el cartucho flmdico ejemplar descrito anteriormente. La valvula de derivacion puede ser la valvula de derivacion 68 del cartucho flmdico ejemplar descrito anteriormente. Sin embargo, se apreciara que la valvula de la presente invencion tiene varias ventajas, que pueden ser aplicables en circunstancias distintas al cartucho flmdico ilustrativo.
[0190] La Figura 21 muestra una primera realizacion de una valvula D100. La valvula D100 comprende una cavidad de valvula D101 y una membrana de valvula flexible D105 provista dentro de la cavidad de valvula D101. La cavidad de valvula D101 puede estar formada en una unica capa de polfmero o puede estar compuesta por una pluralidad de capas, tales como la carcasa 111, la capa neumatica 114 y la capa flmdica 115 del cartucho ejemplar 100. La membrana de la valvula D105 esta formada dentro de la cavidad de la valvula D101 y puede sobremoldearse sobre la capa neumatica, como se explico anteriormente.
[0191] La cavidad de valvula D101 tiene paredes laterales D130, un suelo D132 y esta abierta en la parte superior. La cavidad D101 de la valvula comprende aberturas primera y segunda D102, D103 en el suelo D132 conectadas a los pasos primero y segundo, D112, D113 formados en la capa flmdica 115. Las aberturas primera y segunda D102, D103 pueden estar ubicadas en las porciones elevadas primera y segunda de la cavidad de la valvula D101 para formar los asientos de valvula primero y segundo.
[0192] Entre la membrana flexible D105 y el suelo D132 de la cavidad de la valvula D101, esta definida una camara de valvula D115. Por lo tanto, la camara de valvula esta conectada de forma fluida a las aberturas primera y segunda D102, D103.
[0193] La membrana de valvula D105 comprende una primera porcion de membrana de valvula D122 y una segunda porcion de membrana de valvula D123.
[0194] La primera parte de la membrana de valvula D122 se puede mover entre una posicion abierta, en la que esta separada de la primera apertura D102 y permite que el fluido fluya entre la primera via de paso D112 y la camara de valvula D115, y una posicion cerrada, en la que sella contra la primera abertura D102 e impide cualquier flujo de fluido entre el primer conducto D112 y la camara de valvula D115.
[0195] Del mismo modo, la segunda porcion de membrana de la valvula D123 es movil entre una posicion abierta en la que esta separada de la segunda apertura D103 y permite que el fluido fluya entre la segunda via de paso D113 y la camara de la valvula D115, y una posicion cerrada, en que sella contra la segunda abertura D102 e impide cualquier flujo de fluido entre el segundo conducto D113 y la camara de valvula D115.
[0196] Por lo tanto, se apreciara que la camara de valvula D115 tiene un primer volumen, V1, cuando las porciones de valvula primera y segunda estan en sus posiciones abiertas; un segundo volumen, V2, cuando una de las porciones de valvula primera y segunda esta en su posicion abierta y la otra esta en su posicion cerrada; y un tercer volumen, V3, cuando llas posiciones de valvula primera y segunda estan en sus posiciones cerradas. Se apreciara que V1 > V2 > V3. El volumen V3 es idealmente lo mas pequeno posible, y puede ser sustancialmente cero.
[0197] Las porciones de membrana de valvula primera y segunda D122, D123 son accionables independientemente una de otra. Por ejemplo, cuando la valvula se usa en el cartucho ejemplar y cuando el cartucho se inserta en un lector, el lector puede aplicar actuadores mecanicos primero y segundo, tales como pies, para accionar las porciones de membrana de valvula primera y segunda D122 y D123 independientemente. Esto es ventajoso en un sistema sellado, tal como el extremo posterior del cartucho ejemplar en el que hay una presion cntica que debe mantenerse en un lado de la valvula. En este caso, el asiento de valvula correspondiente a los canales primero y segundo puede accionarse primero mientras que se mantiene la camara de valvula abierta al canal de derivacion, para evitar la presurizacion de los canales primero y segundo o el desplazamiento del lfquido en los mismos.
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[0198] Con referencia ahora a la Figura 22, se ilustra una segunda realizacion de una valvula D200. La segunda realizacion es identica a la primera (y los numeros de referencia similares se refieren a caractensticas similares), excepto que se proporciona una tercera abertura D204 en el suelo de la cavidad de la valvula ademas de las aberturas primera y segunda D202, D203. La tercera abertura D204 esta conectada a un tercer paso D214 y esta adaptada para ser sellada por la segunda porcion de membrana de valvula D223, para evitar que el fluido se mueva entre el tercer paso D214 y la camara de valvula D250.
[0199] En la realizacion mostrada en la Figura 22, las aberturas segunda y tercera D203, D204 estan ubicadas en las partes elevadas segunda y tercera D243, D244. Sin embargo, se apreciara que las aperturas segunda y tercera pueden ubicarse en una sola porcion elevada D343 como se muestra en la Figura 23, o que pueden estar ubicadas en una region sustancialmente al ras con el resto del suelo de la cavidad de la valvula.
[0200] Como se muestra, las aberturas segunda y tercera D203, D204 estan separadas por la distancia b. La primera abertura D202 esta separada de la segunda abertura D203 por la distancia a. La distancia a entre las aberturas primera y segunda d202, D203 es mayor que la distancia b entre las aberturas segunda y tercera D203, D204. Esto es conveniente para permitir que las aberturas segunda y tercera D203, D204 sean selladas por la segunda porcion de membrana D223 y la primera abertura D202 a sellar por la primera porcion de membrana D222.
[0201] Aunque en las realizaciones primera y segunda ilustradas en las Figuras 21 y 22, se muestra que la valvula tiene dos o tres aberturas, se apreciara que pueden proporcionarse cuatro o mas aberturas. Las aberturas pueden agruparse de cualquier manera para ser selladas por la primera porcion de membrana o la segunda porcion de membrana, dependiendo de la implementacion preferida. Tambien se apreciara que, aunque en las realizaciones mostradas en los dibujos, se muestra que la membrana de valvula tiene partes de membrana de valvula primera y segunda, es posible que la membrana de valvula tenga tres o mas porciones, cada una adaptada para sellar una o mas aberturas y cada una adaptada para ser accionable independientemente.
[0202] Como se describio anteriormente, la primera porcion de membrana de valvula D222 y la segunda porcion de membrana de valvula D223 pueden ser accionadas mecanicamente por actuadores mecanicos primero y segundo D232, D233, que podnan, por ejemplo, ser proporcionados en un lector (no mostrado). El primer actuador mecanico D232 esta configurado para moverse desde una primera posicion en la que esta separada de la primera porcion de membrana de valvula D222 y una segunda posicion en la que presiona la primera porcion de membrana de valvula contra la abertura D202, sellando asf la abertura. De manera similar, el segundo accionador mecanico D232 esta configurado para moverse desde una primera posicion en la que esta separado de la segunda porcion de membrana de valvula D223, a una segunda posicion en la que presiona la segunda porcion de membrana de valvula D233 contra la segunda abertura y la tercera apertura D203, D204.
[0203] La valvula puede configurarse de forma que los actuadores mecanicos D232 y D233 puedan contactar sustancialmente con toda la membrana de valvula D205. Alternativamente, la valvula puede configurarse de manera que los actuadores mecanicos D232 y D233 solo puedan contactar una parte de la membrana de valvula D105.
[0204] Con referencia ahora a las Figuras 23 y 24, se puede ver que al colocar las aberturas segunda y tercera relativamente juntas, la segunda porcion de membrana de valvula D223 puede accionarse para sellar eficazmente las aberturas segunda y tercera D203, D204 sin requerir una gran area de superficie para contactar la membrana de la valvula D205. Por el contrario, la distancia relativamente grande entre las aberturas segunda y primera D202, D203 permite que la segunda porcion de la membrana de valvula D223 sea presionada por el segundo medio de desviacion sin presionar significativamente la primera porcion de membrana de valvula D222.
[0205] Preferiblemente, la membrana de valvula D205 esta formada por un polfmero elasticamente deformable de manera que la valvula se bifurca en la primera posicion. Preferiblemente, la membrana de valvula D205 tiene un espesor de al menos 0,25 mm, mas preferiblemente un espesor de alrededor de 1 mm. Esto asegura que la membrana de la valvula sea lo suficientemente gruesa para proporcionar la competencia de un sello efectivo sobre las aberturas. Moviendo los medios de desviacion D232, D233 desde la segunda posicion a la primera posicion, los medios de desviacion D232, D233 ya no presionan la membrana de valvula D105 contra las aberturas D202, D203, D204 y la valvula vuelve a la posicion abierta.
[0206] Se explicara una implementacion de la valvula D200 con referencia a la Figura 25. En particular, la valvula D200 se usa como una valvula de derivacion 68 en el extremo posterior del cartucho flmdico ejemplar 100 discutido anteriormente.
[0207] La Figura 25 muestra las siguientes caractensticas del cartucho ejemplar 100: la ramificacion de elucion 16b del canal principal 16; la valvula de aislamiento 50; el canal de mezcla 52; los canales de PCR primero y segundo 54a, 54b y los canales de derivacion primero y segundo 66a, 66b. Ciertas caractensticas presentes en el cartucho ejemplar 100 se omiten en la Figura 15 para mayor claridad.
[0208] La red de canales y valvulas a la que se hace referencia en el parrafo anterior forma un sistema de valvula D500; a saber, parte del extremo posterior del dispositivo flmdico ejemplar. Se apreciara que la invencion se puede
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implementar en otros sistemas de valvulas y con otras redes de canales, dependiendo de la implementacion preferida. En particular, se apreciara que el sistema en la Figura 25 se puede combinar con las caractensticas descritas en las secciones 2.1 y 2.2 anteriores.
[0209] Como se ilustra en la Figura 25, los canales de derivacion primero y segundo 66a, 66b estan conectados respectivamente a las aberturas segunda y tercera D203, D204 de la valvula de derivacion D200. La primera abertura 202 y el primer paso D212 estan acoplados a la rama de elucion 16b del canal principal 16 aguas abajo de la valvula de aislamiento.
[0210] Como se describio anteriormente, el extremo posterior del cartucho de lfquido ejemplar forma un sistema cerrado cuando esta cerrada la valvula de aislamiento 50. Por lo tanto, una primera ventaja del uso de la valvula de derivacion D200 en el sistema de valvula D500 que se muestra en la Figura 20 es que se puede usar para despresurizar el extremo posterior una vez que se completa la prueba. Esto puede ocurrir de la siguiente manera. Una vez que la muestra de lfquido ha sido bombeada a las camaras de deteccion (no mostradas) del cartucho ejemplar 100, la valvula de aislamiento puede cerrarse para formar un sistema cerrado en el extremo posterior. Sin embargo, en un punto adecuado antes de que se cierre la valvula de aislamiento 50, la primera, y preferiblemente la segunda porcion de membrana flexible D222, D223 pueden ser empujadas por actuadores mecanicos en sus posiciones cerradas, disminuyendo de este modo el volumen dentro de la camara de valvula D250.
[0211] Cuando el volumen de la camara de valvula D250 esta por debajo de su maximo (por ejemplo, cuando una o ambas porciones de membrana flexibles D222, D223 esta en su posicion cerrada), la valvula de aislamiento puede cerrarse, formando asf un sistema de sellado en el extremo trasero. Una vez que se cierra la valvula de aislamiento, las partes de membrana flexibles D222, D223 pueden retornar a sus posiciones abiertas, aumentando asf el volumen de la camara de valvula D250 a su maximo.
[0212] En un ejemplo, cuando la valvula D200 esta en la posicion abierta y la membrana de valvula D205 esta separada de las aberturas D203, D204, como se muestra en la Figura 22, el volumen de la camara de la valvula D250 es Vcamara (abierto). Cuando la valvula D200 esta en la posicion cerrada, como se muestra en la Figura 24, el volumen de la camara de la valvula D250 puede ser de aproximadamente 69 pl, pero podna ser de otros volumenes, incluido sustancialmente cero.
[0213] Por lo tanto, cuando la valvula D200 es la posicion abierta, el volumen del sistema de valvula D500 es:
Vabierto_ Vcamara (abierto)+Vred.
[0214] Cuando la valvula D200 esta en la posicion cerrada, el volumen del sistema de valvula D500 es:
Vcerrado_ Vcamara (cerrado)+Vred.
[0215] Se apreciara que cuando el volumen cerrado de la camara de valvula es sustancialmente cero:
Vcerrado_Vred.
[0216] Siempre que la valvula de aislamiento este abierta cuando esta cerrada la valvula D200, una cantidad de fluido igual a Vcamara (abierto)-Vcamara (cerrado) sera desplazado fuera de la red de canales (aguas arriba de la valvula de aislamiento) y habra una cantidad de fluido igual a Vred+Vcamara(cerrado) en la red de canales (aguas abajo de la valvula de aislamiento).
[0217] Cuando se cierra la valvula de aislamiento 50, el sistema se convierte en un sistema cerrado y la cantidad de fluido en ese sistema es fija. Cuando la valvula D200 se vuelve a abrir despues de que se ha cerrado la valvula de aislamiento, el volumen del sistema vuelve a abrirse. Ya que Vabierto > Vcerrado, se reduce la presion en el sistema y, preferiblemente, se crea una presion negativa en el sistema. Esta reduccion de la presion reduce el riesgo de fugas del cartucho. Se apreciara que si esta reduccion de presion es lo suficientemente grande, es posible crear una presion negativa en un sistema, incluso cuando el sistema esta inicialmente ligeramente presurizado.
[0218] Al cerrar la valvula D200 para reducir el volumen del sistema, cerrando la valvula de aislamiento para cerrar el sistema y luego abrir la valvula D200 para aumentar el volumen del sistema, es posible reducir la presion en el sistema, y preferiblemente alcanzar una presion negativa dentro del extremo posterior del cartucho ejemplar. Preferiblemente, el cambio en el volumen de la camara de valvula D250 es lo suficientemente grande como para efectuar un cambio de presion significativo en la red flrndica. Aunque en las realizaciones mostradas en los dibujos, se muestra que la camara de la valvula tiene dos o tres aberturas, se apreciara que este metodo de despresurizacion de un sistema funcionara con cualquier numero de aberturas.
[0219] Como se describio anteriormente, los canales de derivacion primero y segundo 66a, 66b se pueden usar para eliminar la muestra de fluido en exceso de las vfas de fluido primera y segunda a traves de los canales primero y segundo de PCR 54a, 54b. Por lo tanto, el primer canal de derivacion 66a esta acoplado a la primera via de fluido en
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el primer canal de PCR 54a y el segundo canal de derivacion 66b esta acoplado a la segunda via de fluido en el segundo canal de PCR 54b.
[0220] En un momento apropiado en la prueba, es necesario cerrar la valvula de derivacion D200. Sin embargo, cuando se cierra la valvula de derivacion, existe el riesgo de que el cambio de presion causado por el sellado de la membrana contra las aberturas segunda y tercera D203, D204 empuje el fluido en los canales de derivacion 66a, 66b hacia los canales de PCR 66a, 66b, particularmente si el fluido no puede escapar a otra parte del sistema. Esto es indeseable. Por lo tanto, una segunda ventaja del uso de la valvula de derivacion D200 en el sistema de valvula D500 que se muestra en la Figura 25 es que el cambio de presion que causa dicho reflujo puede mitigarse.
[0221] Al usar una valvula D200, se puede llevar a cabo una primera etapa de aplicar una fuerza a la segunda porcion de membrana de valvula para sellar la segunda porcion de membrana de valvula contra las aberturas segunda y tercera de la camara de valvula. La Figura 23 muestra la valvula D200 en una posicion intermedia en la que las aberturas segundas y terceras estan selladas por la segunda porcion de membrana de valvula D223 mientras que la primera abertura D202 permanece abierta. Entonces se realiza una segunda etapa que comprende aplicar una fuerza a la primera porcion de membrana de valvula D222 para sellar la primera porcion de membrana de valvula D222 contra la primera abertura D202 en la camara de valvula D250.
[0222] Cerrando las aberturas segunda y tercera antes de cerrar la primera abertura en la camara de valvula, es posible evitar la presurizacion excesiva de los pasos segundo y tercero, y de hecho minimizar el flujo de retorno hacia los canales de derivacion primero y segundo.
[0223] Aunque el metodo descrito anteriormente se refiere a una valvula que tiene aberturas primera, segunda y tercera, se apreciara que este metodo puede adaptarse para valvulas que tienen dos o cuatro o mas valvulas dispuestas en dos grupos, donde el primer grupo de valvulas esta sellado por la primera porcion de membrana de valvula, y el segundo grupo de valvulas puede ser sellado por la segunda porcion de membrana de valvula. En este contexto, se pretende que un grupo se refiera a una o mas valvulas.
[0224] Preferiblemente, en realizaciones que tienen cuatro o mas aberturas, la primera porcion de membrana de valvula esta configurada para sellar la primera abertura y la segunda parte de membrana de valvula esta adaptada para sellar cualquier abertura posterior. Ademas, la abertura de la camara de valvula puede estar situada en una parte elevada de la camara de valvula para crear un asiento de valvula elevado. Cada parte elevada puede comprender multiples aberturas, o cada abertura puede estar provista de su propia porcion elevada. Alternativamente, algunas o todas las aberturas pueden no ubicarse en una parte elevada.
[0225] Aunque las realizaciones preferidas de la presente invencion se ilustran en las figuras, se debe entender que varias alternativas a las realizaciones de la invencion descritas en este documento se pueden emplear en la practica de la invencion.
3. Aspectos inventivos aislados adicionales
[0226] La siguiente es una lista no exhaustiva de aspectos aislados del cartucho ejemplar descrito anteriormente que puede reivindicarse. Estos aspectos se describen con referencia a las Figuras 11 a 15. La inclusion de esta seccion no excluye que haya otros aspectos del cartucho ejemplar descrito anteriormente que tambien pueden reivindicarse.
3.1 Valvulas para minimizar el volumen muerto
[0227] A continuacion se describira una disposicion ventajosa para una valvula en un cartucho flmdico, que puede formar un aspecto de la invencion aislado.
[0228] Por lo tanto, en un aspecto, se proporciona una valvula para un cartucho flmdico, comprendiendo la valvula:
una cavidad de valvula que tiene aberturas primera y segunda conectadas a los pasos primero y segundo, respectivamente; y
una membrana flexible que se puede mover entre una posicion cerrada, en la que la membrana flexible sella contra las aberturas primera y segunda para evitar el flujo de fluido entre los pasos primero y segundo, y una posicion abierta, en la que la membrana flexible esta separada de las aberturas primera y segunda para permitir que el fluido fluya entre los pasos primero y segundo;
en donde la cavidad de una valvula comprende un techo y un suelo, comprendiendo el suelo dichas aberturas primera y segunda; y que comprende ademas:
un tope entre la membrana flexible y el techo de la cavidad de la valvula, de manera que el tope restringe el movimiento de la membrana en su posicion abierta.
[0229] Preferiblemente, el tope se proporciona en la membrana flexible, y comprende uno o mas de una protuberancia, una jaula, un labio o una estructura transversal.
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[0230] A veces es ventajoso limitar el grado en que la membrana flexible en una valvula descrita aqm puede viajar en su posicion abierta. Es decir, es deseable minimizar la distancia que la membrana de la valvula se mueve hacia su apertura, y asf minimizar la distancia que debe viajar para cerrarse. Al minimizar esta distancia, se reduce el volumen muerto dentro de la cavidad de la valvula, mejorando la reactividad de la valvula.
[0231] Por lo tanto, como se muestra con mas detalle en la Figura 11, las realizaciones preferidas de una valvula 300 comprenden ademas un tope 302. El tope del examen ilustrado es una estructura transversal, pero en diferentes realizaciones puede ser una protuberancia, jaula, labio o similar, unida a la superficie superior de la membrana flexible 304 para contactar el techo 306 de la cavidad de la valvula y asf limitar el movimiento de la membrana en su posicion abierta.
[0232] Se debe apreciar que los canales y aberturas de la valvula no se muestran en la Figura 11.
[0233] El tope es particularmente ventajoso cuando se llenan las camaras de amplificacion del cartucho ejemplar, ya que reduce el volumen muerto en la cavidad de valvula y, por lo tanto, limita la distancia entre la superficie inferior de la membrana flexible y las aberturas en la cavidad de la valvula, permitiendo de este modo que se dosifique un volumen de fluido mas preciso en las camaras de amplificacion.
3.2 Presion de ruptura en las valvulas
[0234] A continuacion se describira una disposicion ventajosa para una valvula en un cartucho flmdico, que puede formar un aspecto de la invencion aislado.
[0235] Por lo tanto, en un aspecto, se proporciona una valvula para un cartucho flmdico, comprendiendo la valvula:
una cavidad de valvula que tiene aberturas primera y segunda conectadas a los pasos primero y segundo, respectivamente;
una membrana flexible dentro de la cavidad de la valvula movil entre una posicion cerrada, en la que la membrana flexible sella contra las aberturas primera y segunda para evitar el flujo de fluido entre los pasos primero y segundo, y una posicion abierta, en la que la membrana flexible esta espaciada aparte de las aberturas primera y segunda para permitir que el fluido fluya entre los pasos primero y segundo; en donde la valvula esta configurada de modo que la presion requerida en el primer paso mueva la membrana flexible desde la posicion cerrada a la posicion abierta es mayor que la presion requerida en el segundo paso para mover la membrana flexible desde la posicion cerrada a la posicion abierta.
[0236] Se apreciara que dentro de la cavidad de la valvula hay una parte (conocida como la camara de la valvula) entre la membrana flexible y el suelo. Tambien hay una parte dentro de la cavidad de la valvula en el otro lado de la membrana flexible hacia la camara de la valvula. Esta parte tendra un volumen. La presion dentro de ese volumen puede cambiarse aplicando una presion positiva o manometrica al volumen a traves de un canal de actuacion, por ejemplo. El canal de actuacion se puede conectar a una fuente de presion positiva o manometrica a traves de una interfaz neumatica, por ejemplo. La presion dentro del volumen se conoce como la presion de accion. Esta operacion se describe mas detalladamente arriba.
[0237] En una disposicion preferida, las aberturas primera y segunda pueden estar dispuestas de manera que el fluido en el primer paso actua sobre la membrana flexible solo sobre un area de seccion transversal relativamente pequena, mientras que el fluido en el segundo conducto actua sobre la membrana flexible sobre un area de seccion transversal mas grande, preferiblemente sustancialmente toda la membrana.
[0238] El efecto de esto es que la valvula es capaz de soportar una presion mucho mayor en el primer conducto que en el segundo conducto.
[0239] Preferiblemente, la cavidad de la valvula tiene un suelo que comprende las aberturas primera y segunda y una o mas paredes entre las cuales se extiende la membrana flexible; y en donde la segunda abertura esta acoplada a un rebaje en el suelo entre la abertura y la membrana flexible, teniendo el rebaje un area en seccion transversal mayor que la abertura.
[0240] Preferiblemente, la primera abertura esta ubicada centralmente dentro del suelo y el rebaje se extiende alrededor de la primera abertura, de manera que la segunda abertura se ubica entre la primera abertura y una pared de la cavidad de la valvula. En una disposicion particularmente preferida, la cavidad de la valvula tiene una seccion transversal circular, y el rebaje es un rebaje anular que rodea la primera abertura.
[0241] Preferiblemente, la abertura del segundo conducto de fluido esta situada adyacente al penmetro de la camara de valvula. Preferiblemente, la camara de valvula tiene un diametro de entre 2 y 10 mm, preferiblemente entre 3 y 7 mm y mas preferiblemente de 4 y 6 mm. Mas preferiblemente, la segunda abertura esta separada por 2 mm desde la primera abertura.
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[0242] Una valvula ejemplar se muestra en la Figura 12 en su posicion cerrada. La valvula 310 se puede usar en lugar de cualquiera de las valvulas del cartucho flrndico ejemplar mostrado anteriormente. La valvula comprende una cavidad de valvula 312 que tiene una membrana flexible 314 que recubre un suelo de cavidad 316 en el que se proporcionan las primeras aberturas 318 y segundas primeras 320, que conducen a los pasos de fluido primero 322 y segundo 324, respectivamente.
[0243] La cavidad 312 se forma a partir de un vacfo en una primera capa de polfmero (preferiblemente la capa de fluido 114 del cartucho ejemplar) junto con una segunda capa de polfmero (preferiblemente la segunda capa de fluido 115 del cartucho ejemplar).
[0244] La membrana flexible 314 se muestra tendida sobre el suelo 316 de la cavidad de manera que la valvula se muestra en su posicion cerrada. La valvula se puede mover desde esta posicion a una posicion abierta (donde esta separada del suelo 316 y las aberturas 322, 324 para formar una camara de valvula), como se describe aquf
[0245] La primera abertura 318 de la valvula esta situada centralmente dentro del penmetro del vacfo formado en la primera capa de polfmero, y por lo tanto esta situada en la cavidad de la valvula 312. La segunda abertura 324 de la valvula esta desplazada desde la primera abertura 322. La segunda abertura esta acoplada a un rebaje anular 326 en el suelo, y asf el area de seccion transversal sobre la cual el fluido en el segundo conducto 324 actua sobre la membrana flexible 314 es mucho mas grande que el area de seccion transversal sobre la cual el fluido en el primer conducto 322 actua sobre la membrana flexible.
[0246] La presion de un fluido en el primer paso actua sobre la membrana flexible solo sobre un area de seccion transversal relativamente pequena de la membrana flexible. Por lo tanto, debido a que la presion de un fluido en la cavidad de la valvula en el otro lado de la membrana flexible actua sobre toda la membrana, puede ser mas baja sin permitir que la membrana se mueva a su posicion abierta.
[0247] En contraste, la presion de un fluido en el segundo conducto de paso actua sobre la membrana flexible sobre un area de la seccion transversal relativamente grande de la membrana flexible. Dado que las respectivas areas de la seccion transversal estan mas cerca, tambien lo esta la presion en el segundo paso que la membrana flexible puede soportar frente a la presion en la cavidad de la valvula.
[0248] Preferiblemente, las respectivas secciones transversales desde las aberturas de los conductos de fluido permiten a la membrana resistir presiones alrededor de 2,5 veces la presion de accion en el primer conducto de fluido central, pero solo presiones iguales a la presion de actuacion (es decir, la presion en la cavidad de la valvula) en la abertura del segundo paso de fluido compensado.
3.3 Diseno del puerto de entrada
[0249] Se describira ahora una disposicion ventajosa para un puerto de entrada en un cartucho flrndico, que puede formar un aspecto aislado de la invencion.
[0250] Por lo tanto, en un aspecto, se proporciona un cartucho flrndico para procesar una muestra lfquida, teniendo el cartucho una camara de mezcla de muestra que comprende:
una abertura de entrada de muestra para introducir una muestra de lfquido en la camara de mezcla de muestra; una jaula que rodea la abertura de entrada y que se extiende dentro de la camara de mezcla de muestra, comprendiendo ademas la jaula una o mas protuberancias que se extienden radialmente hacia dentro para apoyarse contra un dispositivo de entrega de muestra introducido a traves de la entrada de muestra.
[0251] El cuerpo de la jaula puede estar formado por una o mas barras alargadas, o una o mas paredes solidas, dependiendo del techo de la camara de mezcla de la muestra. Si se proporcionan paredes solidas, preferiblemente hay una abertura en la parte inferior de las paredes a traves de la cual puede pasar una muestra de lfquido introducida por el dispositivo de entrega de muestra. Preferiblemente, las barras o la pared que forman el cuerpo se estrechan para ajustarse a la punta de un dispositivo de entrega de muestra convencional introducido a traves de la entrada de muestra.
[0252] Las paredes solidas tienen la ventaja adicional de que proporcionan una barrera para evitar que el fluido introducido en la camara de mezcla se escape fuera de la abertura de entrada, que es particularmente util si el cartucho se gira boca abajo durante el uso.
[0253] Si la jaula se forma a partir de paredes solidas, la protusion puede ser una repisa que se extiende hacia dentro desde las paredes dejando una abertura. Preferiblemente, el saliente que se extiende desde los lados de la abertura de entrada esta posicionado por encima del suelo de la camara de mezcla de muestra; mas preferiblemente por encima de un nivel de llenado de lfquido de la camara de mezcla de muestra. Esto evita que la muestra de ifquido sea succionada nuevamente dentro del dispositivo de entrega de muestras una vez introducida en la camara de mezclado.
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[0254] Preferiblemente, se preve una camara de mezcla de muestra para permitir que el aire escape de la camara durante la introduccion de la muestra. Esto es particularmente util cuando la abertura de entrada esta sellada por el dispositivo de administracion de la muestra.
[0255] Preferiblemente, se proporciona un canal de grna dentro de la camara de mezcla de muestra (una parte de la cual esta preferiblemente directamente debajo de la abertura de entrada) para dirigir la muestra introducida por un dispositivo de administracion de muestra a una region de indicador visual. Un ejemplo de region de indicador visual se describe anteriormente en conexion con el cartucho ejemplar.
[0256] Preferiblemente, un cambio en el mdice de refraccion de la region indicadora visual descrita en el presente documento identifica cuando se ha introducido una muestra. La region del indicador visual puede comprender un estrecho paso de fluido, que se llena con la muestra de fluido por accion capilar. El llenado del conducto de fluido estrecho cambia el mdice de refraccion de la region del indicador visual y un cambio de color identifica cuando se ha introducido una muestra.
[0257] Ahora se describira una realizacion preferida de este aspecto con referencia al cartucho flrndico ejemplar. La carcasa 111 (vease la Figura 4) comprende una abertura de entrada de muestra 126 a traves de la cual puede introducirse una muestra en la camara de mezcla de muestra 10 del cartucho 100 utilizando una pipeta, por ejemplo. Como se muestra con mas detalle en la Figura 13a, la camara de mezcla de muestra 10 esta formada por la capa neumatica 114, que tiene un techo adyacente a la carcasa 111 en la region de la abertura de entrada, y una abertura de entrada correspondiente a traves de la cual puede introducirse una muestra en la camara de mezcla de muestra 10.
[0258] El techo de la camara de mezclado 10 comprende una estructura de jaula formada por las paredes 330 que rodean la abertura de entrada 126 que se extienden en la camara de mezcla 10 desde el techo de la muestra, y una repisa 332 que se extiende radialmente hacia dentro desde las paredes 330. La forma de la estructura de la jaula permite ubicar un dispositivo de administracion de muestras, tal como una pipeta, en la posicion correcta en la camara 10 de mezcla de muestras, y la repisa 332 impide que la pipeta entre en contacto con las superficies de la camara 10 de mezcla de muestras, reduciendo asf la riesgo de contaminacion. Las paredes 330 pueden estrecharse para aumentar aun mas el acoplamiento con la pipeta.
[0259] Una vez que el dispositivo de suministro de muestra se localiza a traves de la abertura, el usuario puede dispensar la muestra. El reborde 332 esta posicionado por encima de un nivel de llenado de lfquido nominal (no mostrado) de la camara de mezcla de muestra para evitar que el usuario succione accidentalmente la muestra hacia atras despues de dispensarla en la camara.
[0260] Se proporciona un respiradero 334 en la camara para permitir que escape el aire en el caso de que la abertura de entrada este sellada por el dispositivo de administracion de muestra.
[0261] Se proporciona una grna 336 dentro de la camara de mezcla de muestra 10, una parte de la cual esta directamente debajo de la abertura de entrada 126 para dirigir la muestra introducida por un dispositivo de administracion de muestra a una region indicadora visual 338. Una region ilustrativa de indicador visual se describe anteriormente en conexion con el cartucho ejemplar.
3.4 Bolsos de aislamiento termico
[0262] A continuacion se describira una disposicion ventajosa para los bolsos de aislamiento termico para una camara de amplificacion de acido nucleico en un cartucho flrndico, que puede formar un aspecto de la invencion aislado.
[0263] En la amplificacion de acido nucleico y la deteccion, es preferible aplicar el calor uniformemente en toda la muestra lfquida. Si bien es posible hacerlo sin dificultad en un laboratorio colocando fuentes de calor de forma equidistante alrededor de la muestra, es mucho mas diffcil de lograr en un cartucho.
[0264] Por lo tanto, en un aspecto, se proporciona un cartucho flrndico para realizar amplificacion de acido nucleico en una muestra lfquida, comprendiendo el cartucho al menos una camara de procesamiento de muestra y una region termicamente aislante adyacente a la camara para evitar la perdida de calor del la camara a traves de la region termicamente aislante. Preferiblemente, al menos una camara de procesamiento de muestra es una o ambas de una camara de amplificacion de acido nucleico y una camara de deteccion de acido nucleico (de aqrn en adelante la camara de procesamiento').
[0265] Preferiblemente, la camara de procesamiento de acido nucleico es adyacente a una superficie (preferiblemente una superficie inferior) del cartucho para aceptar calor de una fuente externa, la camara situada entre la region termicamente aislante y la superficie de manera que el calor pase desde la fuente exterior a traves de la superficie y desde allf la camara no se pierde del otro lado de la camara debido a la presencia de la region termicamente aislante. Se encuentra que esta disposicion hace que el cambio de temperatura dentro de la camara
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(por ejemplo, al encender y apagar la fuente de calor) sea lo mas rapido posible, lo que es beneficioso para realizar una PCR rapida, por ejemplo.
[0266] Esto es particularmente ventajoso porque una unica fuente de calor puede colocarse adyacente al cartucho para suministrar calor para el proceso de amplificacion desde un lado (el lado calentado) y, sin embargo, la muestra dentro del cartucho se calentara sustancialmente y se minimizara en lo posible la cantidad de calor perdido a traves del lado sin calefaccion.
[0267] Preferiblemente, el cartucho esta compuesto de al menos una capa flmdica y una capa neumatica en disposicion de contacto. La camara de procesamiento de acido nucleico se puede formar en la capa flmdica y la region termicamente aislante se puede formar en la capa neumatica. Preferiblemente, el cartucho flmdico comprende ademas una lamina flmdica debajo de la capa flmdica, formando la lamina la superficie antes mencionada para aceptar el calor. El uso de una lamina fina maximiza la transferencia de calor desde la fuente externa. El material de la lamina puede elegirse para optimizar la transferencia de calor. Por ejemplo, se puede usar una lamina de metal, pero se prefiere que se use un compuesto de tereftalato de polietileno/polipropileno debido a las ventajas de la facilidad de fabricacion del cartucho, junto con la resistencia del material y las propiedades de transferencia de calor aceptables.
[0268] Preferiblemente, la region termicamente aislante se forma a partir de uno o mas pozos de aislamiento termico sellados formados en la capa neumatica y sellados por una lamina neumatica. Los bolsos pueden llenarse con gas tal como aire o pueden ser evacuados durante el proceso de fabricacion de manera que proporcionen un vado.
[0269] Se describira ahora una realizacion preferida de este aspecto con referencia al cartucho flmdico ejemplar. Como se muestra en la Figura 3, el cartucho ejemplar 100 comprende, de arriba a abajo, una carcasa 111, un subconjunto de ampollas 112, una lamina neumatica 113, una capa neumatica 114, una capa de fluido 115 y una lamina flmdica 116.
[0270] Con referencia a las Figuras 6A y 6B, que muestran la capa neumatica, se proporcionan seis regiones termicamente aislantes 140a-b, 141a-d. Las regiones aislantes 140a-b estan situadas adyacentes a dos camaras de amplificacion correspondientes formadas en la capa flmdica 115, mientras que las regiones aislantes 141a-d estan situadas adyacentes a cuatro camaras de deteccion correspondientes formadas en la capa flmdica 115, cuando el cartucho esta ensamblado. Como se muestra, las regiones aislantes 140a-b consisten en una pluralidad de bolsos de aislamiento termico, mientras que las regiones aislantes 141a-d constan cada una de un bolso individual.
[0271] Durante la amplificacion y deteccion del acido nucleico, tiene lugar el termociclado de las camaras de amplificacion y deteccion. Las camaras en la capa flmdica pueden calentarse aplicando calor al fondo del cartucho 100, adyacente a la capa flmdica 115. Los bolsos de aislamiento termico retienen el calor dentro del cartucho, minimizando la perdida de calor de la capa flmdica 115 en la capa neumatica 114. Los bolsos de aislamiento termico tambien eliminan la necesidad de calentar el cartucho de fluidos desde las superficies superior e inferior, por ejemplo, calentando tanto la capa de fluidos como la capa neumatica, simplificando el diseno general del cartucho y el lector.
[0272] El bolso de aislamiento termico puede comprender un bolso grande o multiples bolsos mas pequenos. La ventaja de usar multiples bolsos mas pequenos es que se reduce el riesgo de que se configuren las corrientes de conveccion, lo que proporciona un aislamiento termico maximo.
3.5 Columna de captura
[0273] Se describira ahora una disposicion ventajosa para un dispositivo de filtracion en un cartucho de fluidos (preferiblemente una columna de captura'), que puede formar un aspecto inventivo aislado.
[0274] Por lo tanto, en un aspecto, se proporciona un cartucho flmdico que comprende un canal a traves del cual puede pasar una muestra lfquida, teniendo el canal un filtro para capturar componentes biologicos y que ademas comprende:
una parte aguas arriba y una parte aguas abajo; y una parte de captura entre las porciones aguas arriba y aguas abajo en las que esta dispuesto el filtro; en donde: el diametro de la parte de captura es mayor que el diametro de las porciones aguas arriba y aguas abajo.
[0275] Preferiblemente, la parte de captura es una camara dentro del canal, teniendo la camara una superficie de entrada que tiene una abertura acoplada a la parte aguas arriba del canal y una superficie de salida que tiene una abertura acoplada a la parte aguas abajo del canal.
[0276] Preferiblemente, el cartucho flmdico comprende al menos dos capas de polfmero, donde la parte aguas arriba y una parte aguas arriba de la parte de captura del canal estan formadas en una primera capa de polfmero y la parte aguas abajo y una parte aguas abajo de la parte de captura del canal esta formada en una segunda capa de
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poKmero; y en donde el filtro esta sujeto entre las capas de poKmero primera y segunda.
[0277] Preferiblemente, la superficie de entrada de la camara comprende conductos de distribucion que se dirigen radialmente hacia fuera desde la abertura para dirigir una muestra de lfquido que pasa a traves de la abertura en la superficie de entrada radialmente hacia fuera.
[0278] Preferiblemente, la superficie de salida de la camara comprende conductos de distribucion que conducen radialmente hacia dentro hacia la abertura para dirigir una muestra de lfquido que ha pasado a traves del filtro radialmente hacia dentro hacia la abertura en la superficie de salida.
[0279] Ahora se describira una realizacion preferida de este aspecto con referencia al cartucho de lfquido ejemplar. En el cartucho ejemplar descrito en este documento, se proporciona una columna de captura 24 a lo largo del canal principal (vease la Figura 1). Como se muestra en las Figuras 14a y 14b, la columna de captura 24 tiene un filtro 340 que se une al ADN del material lisado antes de liberarlo durante la elucion. Como se muestra en la Figura 14a, la columna de captura 24 comprende un canal de entrada 342 que conduce a una camara de captura 344 en un extremo aguas arriba 346, y un canal de salida 350 que sale de la camara de captura 344 en un extremo aguas abajo 348.
[0280] Se proporciona un filtro 340 en la camara 344, perpendicular a la direccion del flujo de fluido a traves del canal principal, de manera que el fluido debe pasar a traves del filtro 340 cuando pasa del extremo aguas arriba del canal principal 342 al extremo aguas abajo 350 del canal principal.
[0281] Haciendo referencia ahora a la Figura 14b, las paredes de entrada y salida (solo una se muestra) de la camara comprenden conductos de distribucion 352 configurados para dirigir el fluido radialmente hacia afuera en la camara 344 cuando entra en la camara, y radialmente hacia dentro hacia la abertura de salida despues de que haya pasado a traves del filtro 340.
3.6 Camara de desechos
[0282] Se describira ahora una disposicion ventajosa para la camara de desechos en un cartucho flmdico, que puede formar un aspecto aislado de la invencion.
[0283] Por lo tanto, en un aspecto, se proporciona un cartucho flmdico que comprende un canal a traves del cual puede pasar una muestra de lfquido y una camara de desechos para recibir fluido desde el canal, comprendiendo la camara de desechos:
una tubena, acoplada al canal, que se extiende desde una superficie inferior de la camara de desechos y que tiene una abertura elevada por encima de la superficie inferior para pasar fluido desde el canal a la camara; y una ventilacion dentro de la camara de desechos configurada para ventilar la camara de desechos a la atmosfera.
[0284] Preferiblemente, el respiradero comprende un segundo tubo, acoplado a un canal de ventilacion dentro del cartucho, que se extiende desde la superficie inferior de la camara de desechos y que tiene una abertura elevada por encima de la superficie inferior. Preferiblemente, el conducto de ventilacion comprende al menos un impactador Anderson.
[0285] Preferiblemente, se proporciona al menos una almohadilla absorbente dentro de la camara de desechos.
[0286] Ahora se describira una realizacion preferida de este aspecto con referencia al cartucho de fluido ejemplar. En el cartucho ejemplar descrito en este documento, se proporciona una camara de desechos para recoger y almacenar fluido residual que se produce durante el lavado, etc. La camara de desechos 10 se muestra con mas detalle en las Figuras 15a y 15b. La camara de desechos 38 comprende un tubo 360 que se extiende sustancialmente verticalmente desde una superficie inferior 362 de la camara de desechos 38. El tubo 38 define un canal que tiene un primer extremo 364 conectado a la superficie inferior de la camara de desechos 38 y conectado de manera fluida al canal principal 16 Un segundo extremo 366 del tubo de fluido 360 esta dispuesto dentro de la camara de residuos 38, y tiene una abertura a traves de la cual el fluido puede fluir dentro de la camara de residuos.
[0287] Preferiblemente, el tubo 360 es sustancialmente vertical y perpendicular a la superficie inferior de la camara de residuos 38. La abertura en el segundo extremo del tubo 360 esta situada cerca de la parte superior de la camara de residuos 38 como se muestra en la Figura 15b. Al proporcionar la primera abertura cerca de la parte superior de la camara de desechos, el riesgo de fuga se reduce al mmimo si el cartucho se pone boca abajo.
[0288] Las almohadillas absorbentes 368 tambien se proporcionan en la camara de desechos. Preferiblemente, la superficie superior de las almohadillas de absorcion 368 tambien debena estar cerca de la parte superior de la camara de desechos 38, incluso mas preferiblemente, la parte superior de las almohadillas absorbentes 368 debena estar sustancialmente nivelada con la abertura en el segundo extremo 366.
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[0289] En el cartucho ejemplar descrito en este documento, se proporciona una segunda abertura 370 en la camara de desechos 38 como se muestra en la Figura 15b. La segunda abertura 370 esta configurada para ventilar el canal principal 16 a traves de la camara de residuos 28 hasta la presion atmosferica. Esto evita aplicar una contrapresion a lo largo del canal principal a medida que el canal de desecho se llena de fluido. Preferiblemente, la segunda abertura 370 esta provista en el extremo de una segunda tubena 372 que sobresale de la superficie inferior de la camara de desechos 38. La segunda abertura 370 puede estar conectada de manera fluida a un paso de ventilacion (no mostrado) que tiene una abertura exterior a la carcasa del cartucho para permitir que la camara de residuos permanezca a presion atmosferica. Sin embargo, la ventilacion de la camara de desechos fuera del cartucho conlleva un pequeno riesgo de contaminacion por aerosol. Para reducir esto, el camino de ventilacion tiene trampas de impacto y respiraderos debajo de la cubierta del cartucho.
[0290] El experto en la materia sera capaz de modificar el cartucho ejemplar para implementar los aspectos inventivos descritos en el presente documento de varias maneras dependiendo de las circunstancias. Se pretende que el alcance de la presente invencion este definido por las siguientes reivindicaciones.

Claims (15)

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    REIVINDICACIONES
    1. Un sistema de valvula en un cartucho flmdico para expulsar muestra Ifquida de una region de procesamiento de muestra, comprendiendo el aparato:
    una ruta de fluido (C310a) para hacer pasar una muestra de lfquido a traves de ella desde un extremo aguas arriba a un extremo aguas abajo;
    una valvula de salida (C303a) dentro de la via de fluido, la valvula de salida configurada para moverse entre una posicion cerrada en la que impide que la muestra lfquida pase a traves de la valvula de salida y una posicion abierta en la que permite que la muestra pase por la valvula lfquida;
    una region de procesamiento de muestra aguas abajo (C304a) dentro de la ruta de fluido aguas abajo de la valvula de salida;
    un canal de derivacion (C305) acoplado a la via de fluido en una union entre la valvula de salida y la region de procesamiento de muestra aguas abajo, el sistema de valvula configurado de tal manera que la muestra lfquida aguas abajo de la valvula de salida pueda ser expulsada en su posicion cerrada; y
    al menos un elemento compresible (C306a) aguas abajo de la region de procesamiento de muestra aguas abajo, al menos un elemento compresible configurado para volverse cada vez mas bloqueado contra el flujo aguas arriba del elemento compresible cuando la muestra lfquida pase a traves de la valvula de salida abierta, de modo que la muestra lfquida aguas abajo de la valvula de salida pueda ser expulsada del conducto de fluido y dentro del canal de derivacion por al menos un elemento compresible cuando la valvula de salida este cerrada, donde al menos un elemento compresible (C306a) es un resorte de gas que comprende un orificio ciego lleno de un fluido compresible;
    en donde el sistema de valvula comprende ademas una valvula de derivacion (C315) ubicada dentro del canal de derivacion (C305), la valvula de derivacion configurada para moverse entre una posicion cerrada en la que evita que la muestra lfquida pase a traves de la valvula de derivacion y una posicion abierta en la que permite que la muestra de lfquido pase a traves de la valvula de derivacion.
  2. 2. El sistema de valvula de la reivindicacion 1, que comprende ademas una camara de procesamiento de muestra aguas arriba (C302a) dentro de la via de fluido y aguas arriba de la valvula de salida.
  3. 3. El sistema de valvula de la reivindicacion 2, que comprende ademas una valvula de entrada aguas arriba de la camara de procesamiento de muestras aguas arriba.
  4. 4. El sistema de valvula de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que al menos una de las valvulas en el sistema de valvula es una valvula accionada neumaticamente.
  5. 5. El sistema de valvula de la reivindicacion 4, en el que al menos una valvula accionada neumaticamente comprende una camara de valvula que tiene aberturas primera y segunda conectadas a la via o canal, respectivamente; y
    una membrana flexible que se puede mover entre una posicion cerrada, en la que la membrana flexible sella contra las aberturas primera y segunda para evitar que el fluido fluya a traves de la via o canal, y una posicion abierta, en la que la membrana flexible esta separada de las aberturas primera y segunda para permitir que el fluido fluya a traves del camino o canal.
  6. 6. El sistema de valvula de la reivindicacion 5, que comprende ademas una interfaz neumatica para conectarse a una fuente de presion de gas positiva y/o manometrica, comprendiendo la interfaz neumatica una pluralidad de puertos.
  7. 7. El sistema de valvula de la reivindicacion 6, donde la o cada valvula comprende ademas un paso de fluido que tiene una abertura en la camara de valvula, la abertura esta separada de las aberturas primera y segunda por la membrana flexible, en donde el conducto de fluido esta acoplado a un puerto en la interfaz neumatica para aplicar una presion de gas positiva o negativa en la camara de la valvula para mover la membrana flexible entre las posiciones abierta y cerrada.
  8. 8. El sistema de valvula de cualquier reivindicacion precedente, en el que el canal de derivacion (c305a) esta conectado a la via de fluido inmediatamente aguas abajo de la valvula de salida para minimizar o erradicar una perdida de carga entre la valvula de salida y el canal de derivacion.
  9. 9. El sistema de valvula de una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 7, en el que la camara de procesamiento de muestra aguas arriba (C302a) es una camara de amplificacion de acido nucleico en donde tiene lugar el proceso de amplificacion de acido nucleico en uso; en donde la region de procesamiento de muestra aguas abajo (C304a) es una camara de deteccion en la que tiene lugar el proceso de deteccion de acido nucleico en uso y la relacion de camaras de deteccion a camaras de amplificacion de acido nucleico es 2:1.
  10. 10. El sistema de valvula de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que la region de procesamiento de muestra aguas abajo (C304a, C304b) esta acoplada a un unico elemento compresible (C306a, C306b).
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  11. 11. El sistema de valvula de la reivindicacion 5, en el que al menos una de la camara de valvula y la interfaz neumatica esta formada en una primera capa de polfmero, preferiblemente una capa neumatica del cartucho de fluido, y/o en donde el miembro de valvula comprende un elastomero termoplastico.
  12. 12. El sistema de valvula de cualquier reivindicacion precedente, en el que al menos uno de la via de fluido (C310a, C310b) y el canal de derivacion (C305a, C305b) esta formado en una segunda capa de polfmero, preferiblemente una capa fluidica del cartucho de fluido.
  13. 13. El sistema de valvula de la reivindicacion 11 o 12, en el que al menos una de la primera capa de polfmero y la segunda capa de polfmero comprende polipropileno.
  14. 14. Un metodo para expulsar una muestra de lfquido excedente de un cartucho fluidico que comprende una ruta de fluido (C110) que tiene una region de procesamiento de muestra aguas abajo (C104), una valvula de salida (C103) aguas arriba de la region de procesamiento de muestra aguas abajo, un canal de derivacion (C105) acoplado a la via de fluido en una union entre la valvula de salida (C103) y la region de procesamiento de muestra aguas abajo (C104), una valvula de derivacion ubicada en el canal de derivacion y un elemento compresible aguas abajo de la region de procesamiento de muestra aguas abajo; comprendiendo el metodo:
    cerrando la valvula de derivacion;
    pasando una muestra de lfquido a traves de la valvula de salida y hacia la region de procesamiento aguas abajo, comprimiendo de este modo el elemento compresible a medida que la muestra de lfquido pasa aguas abajo de la valvula de salida; y
    cerrando la valvula de salida; y
    abriendo la valvula de derivacion, evacuando la muestra de lfquido superior aguas abajo de la valvula de salida a traves del canal de derivacion mediante el elemento compresible que ejerce una fuerza contra la muestra de lfquido excedente para expulsarlo de la via de fluido y hacia el canal de derivacion.
  15. 15. El metodo segun la reivindicacion 14, en el que la via de fluido comprende ademas una camara de procesamiento de muestras aguas arriba (C102) de la valvula de salida y una valvula de entrada (C201) aguas arriba de la camara de procesamiento de muestras aguas arriba, y en donde el metodo comprende:
    pasar la muestra de lfquido a traves de la valvula de entrada y hacia la region de procesamiento de muestra aguas arriba.
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