ES2898082T3

ES2898082T3 - Recipiente de cultivo celular

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Publication number: ES2898082T3
Application number: ES14843661T
Authority: ES
Original assignee: Dai Nippon Printing Co Ltd
Current assignee: Dai Nippon Printing Co Ltd
Priority date: 2013-09-11
Filing date: 2014-08-21
Publication date: 2022-03-03
Anticipated expiration: 2034-08-21
Also published as: US10557111B2; JP2015077121A; EP3045526B1; JP5920375B2; WO2015037407A1; EP3045526A4; US20160222335A1; EP3045526A1

Abstract

Un recipiente de cultivo celular (1) que comprende un fondo (3) y una pared lateral (2), donde el fondo tiene una sección que contiene la celda (5) en la que se disponen una pluralidad de micropocillos (4) para contener células, los identificadores (6) están dispuestos en las proximidades de la pluralidad de micropocillos (4) para formar pares en micropocillos individuales, y la posición relativa de cada uno de los identificadores (6) a un micropocillo asociado varía en cada par, donde, en la vista superior, cada uno de los identificadores (6) tiene un área más pequeña que una abertura de cada uno de los micropocillos (R), y donde el recipiente de cultivo celular comprende 8 o más micropocillos.

Description

DESCRIPCIÓN

Recipiente de cultivo celular

CAMPO TÉCNICO

La presente invención se refiere a un recipiente de cultivo celular para cultivar células tales como óvulos fertilizados que requieren un manejo individual.

ANTECEDENTES DE LA TÉCNICA

Los espermatozoides y los óvulos se fertilizan in vitro en un sistema de cultivo para preparar óvulos fertilizados (cigotos) y los óvulos fertilizados se pueden cultivar adicionalmente hasta que se desarrollan en etapas de escisión, mórula y blastocisto y se incuban desde la zona pelúcida hasta la etapa de blastocisto eclosionado. Se ha establecido una técnica de implantación de un óvulo fertilizado en la etapa de escisión a blastocisto en el útero para obtener una descendencia, es decir, tecnología de reproducción asistida (TAR) no solo en el sector ganadero sino también en el tratamiento médico de la infertilidad humana.

Sin embargo, la tasa de embarazo exitoso por fecundación in vitro no siempre es alta. Por ejemplo, en los seres humanos, la tasa de embarazo exitoso sigue siendo de aproximadamente el 25 al 35 %. Como causa de esto, se señala que la probabilidad de obtener un buen óvulo fertilizado adecuado para la implantación al útero por cultivo no es alta. Los óvulos fertilizados obtenidos por cultivo se someten individualmente a observación microscópica por un experto para determinar si los óvulos fertilizados de buena calidad son adecuados para la implantación uterina.

En la fertilización in vitro, se utiliza con frecuencia un procedimiento de microgotas, en el que se prepara una gota de medio de cultivo en un recipiente, y se introduce un óvulo fertilizado en la gota y se somete a cultivo in vitro. En el procedimiento de microgotas conocido en la técnica, se utiliza una placa de Petri de 30 a 60 mm de diámetro que tiene una superficie de fondo plano uniforme como recipiente de cultivo celular. En la superficie inferior de la placa de Petri, se preparan una pluralidad de gotas de medio de cultivo a intervalos y se cultivan células en las gotas. Se ha utilizado dicho procedimiento de cultivo celular.

Cuando se prepara una gota en una placa de Petri utilizada convencionalmente, la posición de un óvulo fertilizado cambia dependiendo del movimiento celular del propio óvulo fertilizado y la convección dentro de la gota. Por lo tanto, es difícil identificar el óvulo fertilizado cultivado en la gota y monitorearlo. Debido al problema, se ha deseado desarrollar medios para controlar la posición de un óvulo fertilizado.

Para obtener más eficientemente el efecto de cultivo de un óvulo fertilizado, es preferente usar la interacción de los óvulos fertilizados entre sí (efecto paracrino). Para controlar la posición de un óvulo fertilizado mientras se usa el efecto, se agrega un sistema en el que se forman micropocillos del mismo tamaño que el óvulo fertilizado en la superficie inferior de una placa de Petri y se añade una gota de medio de cultivo para cubrir los micropocillos, y a continuación los óvulos fertilizados se disponen en micropocillos llenos con el medio de cultivo y se conoce el cultivo. Debido al sistema, se puede cultivar una pluralidad de óvulos fertilizados en una pequeña cantidad de medio de cultivo mientras se controla con éxito las posiciones de una pluralidad de óvulos fertilizados para permitir la monitorización de óvulos individuales, y se puede utilizar el efecto paracrino.

Para distinguir los óvulos fertilizados individuales, se deben distinguir los micropocillos individuales. Dado que los micropocillos se observan con un microscopio, una gran cantidad de información debe ser estimada sólo a partir de un campo microscópico; sin embargo, a un aumento alto, no se puede determinar qué micropocillo se observa. Para distinguir los micropocillos, se colocan etiquetas de información numérica o literal en la periferia más externa de una matriz de micropocillos. De esta manera, se sabe que los micropocillos se distinguen con la ayuda de un sistema de matriz. Sin embargo, este procedimiento tenía un problema en la operabilidad porque cuando la observación se realiza bajo un microscopio con un aumento alto, es necesario leer la información de identificación desplazando la posición de visualización lejos del micropocillo. Además, cuando las células se fotografían con un microscopio, la información de identificación del micropocillo no está presente en la fotografía y, por lo tanto, la información debe proporcionarse manualmente a los datos fotográficos. Debido a esto, la operación era intrincada y existía el riesgo de que el operador asociara erróneamente la información.

El documento JP 2006 -280298 describe un recipiente de cultivo celular que comprende una pluralidad de pocillos dispuestos en una matriz o forma anular. Este documento propone disposiciones de identificadores y pocillos donde los identificadores se proporcionan por fila y por columna, en forma de números y letras, pero no utiliza la posición relativa del identificador al micropocillo emparejado para codificar la información.

LISTA DE REFERENCIAS

Bibliografía de patente

Bibliografía de patente 1: patente JP n.° 472485

Bibliografía de patente 2: Patente JP n.° 2006-280298

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

Problema técnico

El objeto de la presente invención es proporcionar un recipiente de cultivo celular que tenga una pluralidad de micropocillos, que permita la identificación de la posición de un micropocillo observándolo bajo un microscopio sin mover una posición de visualización, y que tenga identificadores para disponerlos fácilmente en los micropocillos.

Solución al problema

Los presentes inventores han descubierto que los problemas mencionados anteriormente se pueden resolver uniendo, en un recipiente de cultivo celular que tenga una pluralidad de micropocillos, identificadores a micropocillos individuales para formar pares y disponer micropocillos e identificadores de manera que las posiciones relativas de los identificadores a los micropocillos asociados varíen mutuamente o de manera que la longitud u orientación de los identificadores lineales varíe mutuamente en cada micropocillo asociado.

Más específicamente, la presente invención incluye las siguientes invenciones.

(1) Un recipiente de cultivo celular que comprende un fondo y una pared lateral, en el que

el fondo tiene una sección que contiene la celda en la que se disponen una pluralidad de micropocillos para contener células,

los identificadores están dispuestos en las proximidades de la pluralidad de micropocillos para formar pares en micropocillos individuales, y

la posición relativa de cada uno de los identificadores a un micropocillo asociado varía en cada par, donde, en la vista superior, cada uno de los identificadores tiene un área más pequeña que la abertura de cada uno de los micropocillos, y donde el recipiente de cultivo celular comprende 8 o más micropocillos.

(2) El recipiente de cultivo celular según (1), en el que los identificadores tienen una forma de punto o lineal. (3) El recipiente de cultivo celular según cualquiera de (1) a (2), en el que la pluralidad de identificadores, que se dispondrán en la pluralidad de micropocillos cuyos centroides están colocados en un mismo eje para formar pares con ellos, están dispuestos en un mismo eje.

(4) El recipiente de cultivo celular según cualquiera de (1) a (3), en el que todos los identificadores están dispuestos solo en los lados derechos, solo en los lados izquierdos, solo en los lados superiores o solo en los lados inferiores con respecto al centro de cada uno de los micropocillos.

(5) El recipiente de cultivo celular según cualquiera de (1) a (4), que comprende además un segundo identificador para especificar la orientación del recipiente de cultivo celular, en el que, en la vista superior, el segundo identificador tiene un área mayor que la abertura de cada uno de los micropocillos, para confirmarlos visualmente. (6) El recipiente de cultivo celular según cualquiera de (1) a (5), en el que está presente un micropocillo en el que están dispuestos la pluralidad de identificadores para formar pares.

(7) El recipiente de cultivo celular según (6), en el que la pluralidad de identificadores dispuestos en el micropocillo asociado para formar pares tienen una forma diferente.

(8) El recipiente de cultivo celular según cualquiera de (1) a (7), en el que está presente un micropocillo que no tiene identificadores dispuestos en el mismo.

(9) El recipiente de cultivo celular según cualquiera de (1) a (8), en el que la proximidad del micropocillo se divide en una pluralidad de regiones y la presencia o ausencia del identificador en las regiones varía en cada par micropocillo-identificador.

(10) Un recipiente de cultivo celular que comprende un fondo y una pared lateral, en el que

los identificadores que tienen una forma lineal están dispuestos en la proximidad de la pluralidad de micropocillos para formar pares, y

los identificadores que tienen una forma lineal varían mutuamente en longitud u orientación en cada par identificador-micropocillo,

donde, en la vista superior, cada uno de los identificadores tiene un área más pequeña que una abertura de cada uno de los micropocillos.

Efectos ventajosos de la invención

Debido a la presente invención, en un recipiente de cultivo celular que tiene una pluralidad de micropocillos, las posiciones de micropocillos individuales se pueden identificar fácilmente mediante observación microscópica.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

La figura 1 es una vista esquemática que muestra la vista superior de una realización del recipiente de cultivo celular según la presente invención.

La figura 2 es una vista esquemática que muestra una vista transversal vertical de una realización del recipiente de cultivo celular según la presente invención.

La figura 3 es una vista esquemática que muestra una vista superior ampliada de una sección que contiene la celda de una realización del recipiente de cultivo celular según la presente invención.

La figura 4 es una vista esquemática que muestra una vista superior ampliada de una sección que contiene la celda de una realización del recipiente de cultivo celular según la presente invención.

La figura 5 muestra un diagrama conceptual de una fotografía de microscopio de un par micropocillo-identificador. La figura 6 muestra un diagrama conceptual de una fotografía de microscopio de un par micropocillo-identificador. La figura 7 es una vista esquemática que muestra la vista superior de una realización del recipiente de cultivo celular según la presente invención.

La figura 8 es una vista esquemática que muestra una realización en la que una pluralidad de identificadores están dispuestos en el mismo eje.

La figura 9 es una vista esquemática que muestra una realización en la que una pluralidad de identificadores no están dispuestos en el mismo eje.

La figura 10 es una vista esquemática que muestra una vista superior ampliada de una sección que contiene la celda de una realización del recipiente de cultivo celular según la presente invención.

La figura 11 es una vista esquemática que muestra una vista superior ampliada de una sección que contiene la celda de una realización del recipiente de cultivo celular según la presente invención.

La figura 12 muestra un diagrama conceptual de una fotografía de microscopio de un par micropocillo-identificador. La figura 13 es una vista esquemática que muestra una vista superior ampliada de una sección que contiene la celda de una realización del recipiente de cultivo celular según la presente invención.

La figura 14 es una vista esquemática que muestra una vista superior ampliada de una sección que contiene la celda de una realización del recipiente de cultivo celular según la presente invención.

La figura 15 es una vista esquemática que muestra una vista superior ampliada de una sección que contiene la celda de una realización del recipiente de cultivo celular según la presente invención.

La figura 16 es una vista esquemática que muestra una vista transversal vertical de una realización de un procedimiento para cultivar células utilizando el recipiente de cultivo celular según la presente invención.

DESCRIPCIÓN DE LAS REALIZACIONES

A continuación, se describirá la presente invención.

Como se muestra, por ejemplo, en las figuras 1 a 3, un recipiente de cultivo celular 1 según una realización de la presente invención tiene un fondo 2 y una pared lateral 3, y el fondo tiene una sección que contiene la celda 5 que tiene una pluralidad de micropocillos 4 para contener una célula dispuesta. En las proximidades de estas microceldas, los identificadores 6 están dispuestos respectivamente para formar pares con las microceldas. La posición relativa de un identificador a un micropocillo para formar un par varía en cada par identificador-micropocillo. Debido a la diferencia en la posición relativa de un identificador con respecto a un micropocillo en cada par identificador-micropocillo, si solo se observa un único par identificador-micropocillo, se puede identificar la posición del micropocillo en la pluralidad de micropocillos. Dado que el identificador está dispuesto en la proximidad de cada micropocillo, no es necesario mover una posición de visualización lejos del micropocillo cuando la observación se realiza con un aumento alto y se puede realizar una observación rápida. Además, cuando se fotografía una célula con un aumento alto, se puede fotografiar un identificador junto con un micropocillo. Debido a esto, no es necesario adjuntar manualmente información a los datos de la foto. Como resultado, se puede evitar el trabajo intrincado y el riesgo de que el operador asocie erróneamente la información.

Los micropocillos forman preferentemente partes cóncavas adecuadas para contener individualmente células tales como óvulos fertilizados y el tamaño de los micropocillos es muy pequeño. La presente invención se caracteriza por unir un minúsculo identificador a cada minúsculo micropocillo. Para ser más específicos, el área de la abertura de cada micropocillo en una vista superior del recipiente de cultivo celular es preferentemente de 3 mm2 o menos, más preferentemente de 1 mm2 o menos, y además preferentemente de 0,5 mm2 o menos; y preferentemente de 0,03 mm2 o más.

El micropocillo forma una parte cóncava que tiene una superficie de pared y una abertura. La parte cóncava puede ser una recesión formada directamente en el fondo de un recipiente de cultivo celular o una parte cóncava formada por un miembro que se proyecta desde la parte inferior. Por consiguiente, el área de la abertura de un micropocillo en la vista superior es, en otras palabras, el área de una figura formada por la periferia externa de la abertura de un micropocillo. La figura formada por la periferia externa de la abertura de un micropocillo, que no está particularmente limitada, puede ser un polígono tal como un triángulo y un cuadrado o un círculo (que incluye un círculo, un círculo sustancial, una elipse y una elipse sustancial); sin embargo, es preferente un círculo.

Si la periferia externa de la abertura de un micropocillo es un círculo, el ancho de la abertura es igual al diámetro del círculo (indicado por R en la figura 3). El diámetro es mayor que el tamaño máximo de la célula a cultivar. En el cultivo de óvulos fertilizados mediante el recipiente de cultivo celular de la presente invención, dado que se cultivan deseablemente hasta la etapa de blastocisto, el diámetro de la abertura circular es deseablemente mayor que el tamaño máximo de una célula en la etapa de blastocisto. Además, cuando la periferia externa de la abertura de un micropocillo forma un círculo, el ancho de la abertura es menor que el paso entre los micropocillos. Por consiguiente, el ancho de abertura de la abertura (si la periferia externa de la abertura de un micropocillo es un círculo, se entiende el diámetro del círculo) de un micropocillo es preferentemente de 0,1 mm o más, más preferentemente de 0,15 mm o más y además preferentemente de 0,2 mm o más; y preferentemente inferior a 0,6 mm y además preferentemente inferior a 0,4 mm. Además, el ancho de abertura de la abertura de un micropocillo también se puede definir como X m (X en esta invención representa el diámetro máximo de una celda). En esta invención, m en esta invención es preferentemente 0,01 mm o más y además preferentemente 0,02 mm o más.

En el fondo del recipiente de cultivo celular de la presente invención, se disponen 8 o más micropocillos (por ejemplo, 10 o más); y preferentemente 50 o menos, y más preferentemente 30 o menos micropocillos. Por consiguiente, una pluralidad de células tales como óvulos fertilizados pueden disponerse una a una en un micropocillo y cultivarse. Dado que una pluralidad de células tales como óvulos fertilizados se disponen cerca una de la otra en el mismo sistema y se cultivan en este estado, se puede esperar un buen efecto paracrino y un efecto autocrino. El cultivo en el mismo sistema significa el cultivo realizado en un medio de cultivo fluido (transmisible) sin estar aislado, preferentemente en una gota del mismo medio de cultivo,

El paso entre micropocillos es preferentemente de 1 mm o menos, más preferentemente de 0,8 mm o menos y además preferentemente de 0,6 mm o menos. Como dispositivo de observación, el dispositivo equipado con un elemento CCD de 1/2 pulgada y una lente objetiva con aumentos de x 4, x 10 y x 20, se utiliza comúnmente. El campo observable con tal dispositivo de observación, cuando se selecciona una lente objetiva con un aumento de x 4, es de aproximadamente 1,6 mm x 1,2 mm, y es preferente diseñar de modo que se incluyan al menos cuatro micropocillos en el campo de observación.

El paso entre los micropocillos es una distancia entre los centros de los micropocillos adyacentes entre sí (por ejemplo, indicado por a en la figura 3). El centro del micropocillo es el centroide de una figura formada por la periferia externa de la abertura del micropocillo y, cuando la periferia externa es un círculo, se refiere al centro del círculo. El paso entre micropocillos típicamente significa un paso promedio, y el paso promedio para un determinado micropocillo significa el valor promedio calculado a partir de los pasos de todos los micropocillos adyacentes al determinado. El paso entre los micropocillos es mayor que el tamaño de la periferia externa de la abertura de un micropocillo. Si la periferia externa de la abertura forma un círculo, el tamaño de la periferia externa de la abertura de un micropocillo significa su diámetro. Si la periferia externa no forma un círculo, significa un diámetro mínimo de la figura formada por la periferia externa de la abertura de un micropocillo. Una pluralidad de micropocillos adyacentes entre sí se disponen preferentemente en forma de una retícula tetragonal o empaque cerrado. Por ejemplo, se puede mencionar el caso en el que 25 micropocillos están dispuestos en forma de una retícula cuadrada de 5 x 5. Debido a la disposición de la forma de retícula tetragonal o empaque cerrado, las posiciones de los micropocillos individuales en el fondo de un recipiente de cultivo se pueden especificar más fácilmente en combinación con un identificador y se pueden aplicar fácilmente al procesamiento de automatización.

La disposición de la pluralidad de micropocillos puede ser aceptable si faltan algunos de los micropocillos de una forma de retícula tetragonal o empaque cerrado. Por ejemplo, se puede mencionar el caso en el que una sección que contiene la celda se configura disponiendo 8 o más micropocillos a intervalos iguales en los lados y vértices de un paralelogramo. Los ejemplos del paralelogramo incluyen un cuadrangular, un rectangular, un rómbico y otros tipos de paralelogramos. Disponer micropocillos a intervalos iguales en los lados y vértices de un paralelogramo significa que los centroides de las figuras formadas por la periferia externa de los micropocillos están dispuestos en los lados y los vértices del paralelogramo. Por ejemplo, en la realización mostrada en la figura 3, 8 micropocillos están dispuestos en 4 vértices y en 4 puntos medios de los lados, uno a uno.

La posición de un identificador que se dispondrá en un micropocillo asociado para formar un par puede estar dentro o fuera del micropocillo; sin embargo, la posición preferentemente está fuera del micropocillo. Esto se debe a que si se proporciona un identificador dentro de un micropocillo, existe la posibilidad de inhibir la observación de un óvulo fertilizado y afectar la capacidad de cultivo de un óvulo fertilizado. Los identificadores se disponen preferentemente en los espacios entre la pluralidad de micropocillos dispuestos como se mencionó anteriormente. El identificador es lo suficientemente pequeño como para estar dispuesto en el espacio. El tamaño del identificador es preferentemente menor que el tamaño de un micropocillo. Por consiguiente, en la vista superior de un recipiente de cultivo celular, el tamaño del identificador es preferentemente lo suficientemente pequeño como para estar dentro de la figura formada por la abertura de un micropocillo. Más específicamente, el área del identificador en la vista superior de un recipiente de cultivo celular es de 30.000 m2 o menos, preferentemente de 15.000 m2 o menos, más preferentemente de 8.000 m2 o menos; y preferentemente de 100 m2 o más.

El identificador se dispone en un sitio cercano a un micropocillo asociado para indicar claramente con qué micropocillo forma un par el identificador. Por consiguiente, cada identificador se dispone preferentemente de manera que la distancia desde un micropocillo asociado sea la más corta de las distancias desde todos los micropocillos. La distancia entre un identificador y un micropocillo se define como la distancia entre el centroide de la figura formada por la abertura del micropocillo y el centroide de la figura formada por un identificador. Por consiguiente, la distancia entre un identificador y un micropocillo es preferentemente mayor que 1/2 del ancho de abertura del micropocillo y menor que el paso entre micropocillos. Para describir más específicamente, la distancia entre un identificador y un micropocillo es preferentemente de 500 pm o menos, más preferentemente de 400 pm o menos y además preferentemente de 300 |jm o menos.

Los identificadores se disponen preferentemente en todos los micropocillos dentro de la sección que contiene la celda; sin embargo, la presente invención incluye el caso en el que están presentes varios micropocillos que no tienen identificadores dispuestos en ellos (por ejemplo, el 10 % o menos de todos los micropocillos contenidos en la sección que contiene la celda). Esto se debe a que incluso si los micropocillos que no contienen células, que no son dianas de observación, están presentes, no es necesario unir un identificador a dichos micropocillos. Un único identificador se dispone preferentemente en un micropocillo asociado; sin embargo, se pueden disponer dos o más identificadores. La cantidad de información se puede aumentar variando el número de identificadores que se dispondrán en un micropocillo asociado para formar pares.

La forma de un identificador, más específicamente, la forma de la figura que forma un identificador no está particularmente limitada. Los ejemplos de la figura incluyen letras, caracteres numéricos, formas gráficas tales como un polígono, una flecha, una línea (barra) y un punto, códigos de barras tales como un código QR y combinaciones de los mismos. Dado que un identificador está dispuesto en la proximidad de un minúsculo micropocillo adecuado para contener una sola célula tal como un óvulo fertilizado y el identificador es preferentemente más pequeño que el tamaño del micropocillo, el identificador preferentemente tiene una forma simple que se puede moldear fácilmente. Esto se debe a que el recipiente de cultivo celular a menudo se fabrica mediante moldeo por inyección y, por lo tanto, es difícil formar una forma complicada en un tamaño pequeño. Incluso si la forma del identificador es simple, en otras palabras, incluso si la cantidad de información que el propio identificador tiene no es grande, ya que la posición relativa del identificador a un micropocillo se agrega como información, se puede identificar la posición de cada micropocillo. Si la forma del identificador es complicada, existe el riesgo de reducir el rendimiento de producción de un recipiente de cultivo celular; sin embargo, dado que el identificador tiene una forma simple en esta invención, se puede evitar la reducción en el rendimiento y se puede reducir el costo de fabricación. En el caso en el que dos o más de los identificadores están dispuestos en cada micropocillo, la forma de la pluralidad de identificadores que se dispondrán en un solo micropocillo puede ser igual o diferente. La cantidad de información se puede aumentar uniendo identificadores de diferente forma. Los identificadores de forma diferente significan que al menos un identificador de forma diferente está presente entre la pluralidad de identificadores.

El identificador tiene preferentemente una forma de punto o lineal (barra). Un identificador de punto y un identificador lineal se pueden usar en combinación por recipiente de cultivo de célula única y sección que contiene la celda única. La cantidad de información se puede aumentar mediante el uso combinado de ellos. La cantidad de información que tiene un identificador en sí se puede aumentar cambiando la longitud del identificador lineal. Además, la cantidad de información que tiene un identificador en sí se puede aumentar cambiando la orientación del identificador. La "orientación" en esta invención significa un ángulo de rotación, que difiere del ángulo a (descrito más adelante). Para describir más específicamente, en la realización mostrada en la figura 4, si el punto se reemplaza por una línea (barra), el ángulo de rotación (autorrotación) de la línea (en la posición del punto) con respecto a la línea recta X, en otras palabras, el ángulo formado entre la línea recta X y el identificador, se denomina ángulo de rotación(autorrotación). La cantidad de información dada por la orientación y el ángulo a se puede utilizar para especificar la orientación de un recipiente de cultivo. Por consiguiente, si los identificadores lineales, que son mutuamente diferentes en longitud u orientación, están dispuestos en cada micropocillo, incluso si la posición relativa de un identificador a un micropocillo asociado no se cambia, la posición de uno específico de los micropocillos se puede especificar entre la pluralidad de micropocillos. La cantidad de información se puede aumentar mediante el uso de la orientación y la longitud en combinación.

Los ejemplos del caso en el que la posición relativa de un identificador con respecto a su micropocillo asociado varía en cada par identificador-micropocillo incluyen un caso en el que la distancia entre un identificador y su micropocillo asociado varía en cada par y un caso en el que el ángulo del identificador con respecto a su micropocillo asociado varía. La distancia entre un identificador y un micropocillo es la misma que se definió anteriormente. El ángulo a del identificador a su micropocillo asociado se puede definir de la siguiente manera. Por ejemplo, en las realizaciones mostradas en las figuras 1 a 3, cuando la línea recta X se dibuja en el fondo de un recipiente de cultivo celular en la vista superior, el ángulo a puede definirse como el ángulo formado entre la línea recta paralela a la línea recta X y la línea recta Y que conecta el centroide de un micropocillo y el centroide de un identificador (figura 4). El centroide de un micropocillo significa un centroide de la figura formada por la periferia externa de la abertura del micropocillo; mientras que el centroide de un identificador significa un centroide de la figura formada por el identificador. Si cada identificador se dispone en un ángulo a diferente con su micropocillo asociado, la posición de un micropocillo específico se puede identificar entre la pluralidad de micropocillos. La cantidad de información se puede aumentar mediante el uso de la distancia y el ángulo en combinación.

Si la proximidad de un micropocillo se divide en una pluralidad de regiones y la presencia o ausencia de un identificador en regiones individuales varía en cada par identificador-micropocillo, la posición relativa de un identificador a un micropocillo puede variar en cada par. Por ejemplo, en la realización mostrada en la figura 13, la proximidad de cada uno de los micropocillos se divide en tres regiones. La presencia o ausencia de un identificador en regiones individuales es diferente en cada par identificador-micropocillo. En el micropocillo C, un identificador está presente solo en la región superior y está ausente en las otras regiones. Por el contrario, en el micropocillo B, un identificador está presente en todas las regiones. Asimismo, al cambiar la presencia o ausencia de un identificador en cada región, la posición de un micropocillo específico puede identificarse entre la pluralidad de micropocillos.

La presencia o ausencia de un identificador en cada región puede verificarse en función de la presencia o ausencia del centroide del identificador en cada región. Por consiguiente, en el caso en el que la pluralidad de identificadores estén dispuestos en cada micropocillo para formar pares, los identificadores pueden superponerse siempre que se puedan especificar las posiciones de los centroides de los identificadores individuales. Por ejemplo, en el caso de dividir la proximidad en tres regiones, se pueden concebir 23 patrones de disposición de identificadores y se pueden especificar las posiciones de al menos 8 micropocillos. Puede estar presente un micropocillo con las regiones en las que no hay identificadores, como el micropocillo G de la figura 13. Asimismo, se puede identificar la posición de un solo micropocillo. Sin embargo, con el fin de especificar un micropocillo, el número de micropocillos sin identificador dispuesto está limitada a solo uno. Las líneas fronterizas entre las regiones pueden ser imaginarias y no es necesario que existan realmente.

El número de regiones a dividir, que no está particularmente limitada, puede ser preferentemente de 3 a 10 y más preferentemente de 4 a 6. El procedimiento de división no está particularmente limitado. Puesto que la lectura es fácil, la región se divide preferentemente en una forma de retícula que consiste en filas y líneas. El número de filas es preferentemente de 1 a 3 y más preferentemente de 1 a 2. El número de líneas es preferentemente de 1 a 6 y más preferentemente de 3 a 5. Cuando los identificadores se disponen en el lado izquierdo o derecho de un micropocillo, si los números de filas y líneas están dentro de los intervalos anteriores, los identificadores se pueden disponer lo más cerca posible de la posición del micropocillo. Cuando los identificadores se disponen por encima o por debajo de un micropocillo, si los intervalos anteriores en número de líneas y filas se intercambian entre sí, los identificadores se pueden disponer lo más cerca posible de la posición del micropocillo.

Por ejemplo, la figura 14 muestra una realización en la que la proximidad de un micropocillo se divide en una forma de retícula constituida por dos filas y tres líneas. En la realización de la figura 14, los identificadores son diferentes en forma. Debido a esto, la cantidad de información se puede aumentar aún más.

Cuando la pluralidad de identificadores están dispuestos en cada micropocillo para formar pares, los identificadores están dispuestos de tal manera que la posición relativa de al menos un identificador a su micropocillo asociado difiere en cada par identificador-micropocillo. Más específicamente, cuando se comparan una pluralidad de micropocillos, siempre que al menos un identificador cuya posición relativa a su micropocillo asociado difiera pueda estar presente, los identificadores cuyas posiciones relativas (a su micropocillo asociado) son idénticas pueden estar presentes. Por ejemplo, en la realización mostrada en la figura 13, cuando se comparan dos identificadores dispuestos en el micropocillo A con dos identificadores dispuestos en el micropocillo D, el identificador a y el identificador a' están dispuestos en la misma posición con respecto a los micropocillos respectivos; mientras que el identificador b y el identificador c están dispuestos en diferentes posiciones con respecto a los micropocillos respectivos. Por lo tanto, se pueden identificar las posiciones de los micropocillos. Los centroides de la pluralidad de identificadores se disponen preferentemente no en la circunferencia sino en la línea recta, como micropocillos de, por ejemplo, A, B, D y F en la figura 13. Esto se debe a que, como se describe a continuación, se puede determinar si un recipiente de cultivo celular en sí mismo se hace girar o no, incluso si se fotografían pares micropocillo-identificador uno a uno con un aumento alto.

En una pluralidad de pares de micropocillo-identificador que se fotografían repitiendo un procedimiento de fotografiar un único par micropocillo-identificador con un aumento alto, varias veces, es necesario mantener siempre una orientación constante del recipiente de cultivo celular cuando se fotografía. Esto se debe a que, si no, el ángulo de inclinación del recipiente de cultivo celular en sí se agrega al ángulo a anterior, con el resultado de que, aunque las posiciones relativas de los identificadores difieren en un recipiente de cultivo celular, a menudo no se pueden distinguir en la fotografía. Por ejemplo, la fotografía (figura 5) de un par micropocillo 4-identificador 6, que se dispone en el vértice superior derecho en la vista ampliada de una sección que contiene la celda 5 mostrada en la figura 3, no se puede distinguir de la fotografía (figura 6) de un par micropocillo 4-identificador 6, que es una fotografía de un par micropocillo 4-identificador 6 dispuesto en el vértice inferior derecho en la figura 3, tomada después de que el recipiente de cultivo celular se hace girar 90° en dirección contraria a las agujas del reloj desde el estado de la figura 3. Con el fin de mantener siempre una orientación constante de un recipiente de cultivo celular cuando se fotografía, es preferente unir otro identificador, es decir, un segundo identificador, para especificar la orientación de un recipiente de cultivo celular. El segundo identificador, dado que se utiliza para la toma de fotografías, es preferentemente un identificador confirmado visualmente. Por consiguiente, en la vista superior de un recipiente de cultivo celular, el área de un segundo identificador es preferentemente mayor que el área de la abertura de un micropocillo. El segundo identificador se coloca preferentemente en la parte inferior y exterior de la sección que contiene la celda que tiene una pluralidad de micropocillos dispuestos en ella (por ejemplo, el símbolo de referencia 7 en la figura 1). El segundo identificador se puede disponer en la pared lateral de un recipiente de cultivo celular. Alternativamente, la orientación de un recipiente de cultivo celular puede mantenerse siempre constante por la forma del recipiente de cultivo celular en sí. Más específicamente, si una forma que puede especificar la orientación de un recipiente de cultivo celular, por ejemplo, un círculo al que le falta parcialmente una parte (figura 7), se emplea como la forma periférica externa de la pared lateral de un recipiente de cultivo celular, la orientación del recipiente de cultivo celular cuando se fotografía puede mantenerse siempre constante. La forma del recipiente de cultivo celular en esta invención no está particularmente limitada siempre que pueda especificar la orientación del recipiente de cultivo celular.

Si un identificador es lineal, a diferencia de un identificador de punto, el identificador tiene información bidimensional. Debido a esto, incluso si no se utiliza un segundo identificador, la orientación de un recipiente de cultivo celular se puede especificar hasta cierto punto en la fotografía de un par micropocillo-identificador tomada con un aumento alto. Más específicamente, incluso si se utilizan identificadores lineales todos orientados en la misma dirección como se ve desde la parte superior de un recipiente de cultivo celular, la orientación del recipiente de cultivo celular se puede especificar hasta cierto punto en función de la dirección de la línea (barra).

Si los identificadores están dispuestos solo en el lado derecho, solo en el lado izquierdo, solo en el lado superior o solo en el lado inferior de todos los micropocillos de la sección que contiene la celda, la orientación del recipiente de cultivo celular se puede especificar incluso en la fotografía de un par micropocillo-identificador tomada con un aumento alto. Dado que la posición de un identificador está aproximadamente predeterminada en cada micropocillo diana hasta cierto punto, es fácil determinar la posición de disparo cuando se fotografía un óvulo fertilizado con un aumento alto. Si los identificadores no se colocan en la misma dirección, como por ejemplo, un caso en el que un identificador se coloca en el lado ligeramente izquierdo del centro y otro identificador se coloca en el lado ligeramente inferior del centro, el investigador debe determinar una posición de disparo mientras busca la posición o posiciones del identificador o identificadores alrededor (360°) del campo de visión en cada pocillo.

Los lados derecho, izquierdo, superior e inferior de un micropocillo se definen respectivamente como las cuatro regiones obtenidas dividiendo la periferia alrededor del centroide de un micropocillo por 4. Por ejemplo, el intervalo especificado por un ángulo a de 45 a 135° que se muestra en la figura 4 se define como el lado superior. Incluso si un identificador se dispone solo en el lado superior de un micropocillo, la posición relativa del identificador al micropocillo se puede variar dentro del intervalo del lado superior.

A veces es preferente que la pluralidad de identificadores que se dispondrán en la pluralidad respectiva de micropocillos estén dispuestos en el mismo eje. La pluralidad de micropocillos en esta invención no se refiere necesariamente a todos los micropocillos dentro de una sección que contiene la celda y se refiere preferentemente a 2 o más micropocillos, más preferentemente 3 o más, más preferentemente 4 o más micropocillos cuyos centroides están dispuestos en un mismo eje. Si los identificadores que se dispondrán en la pluralidad de micropocillos cuyos centroides están dispuestos en un mismo eje, se disponen en un mismo eje, incluso si una diana de observación, es decir, un micropocillo, se cambia en observación con un aumento alto, se puede capturar un par micropocilloidentificador moviendo el recipiente de cultivo celular solo a lo largo del eje X o eje Y con respecto a la lente. Debido a esto, se puede hacer una observación rápida. En la observación microscópica, dado que el campo de visión es horizontalmente largo en general, se pueden observar una pluralidad de identificadores dispuestos a lo largo del eje horizontal a la vez (figura 8). Todos los identificadores se pueden observar incluso con un aumento mayor alineando el lado largo del campo de visión de un microscopio con la dirección del eje de los identificadores. Esto es particularmente ventajoso en el caso, por ejemplo, en el que la longitud del lado corto del campo de visión sea tan cercana como el diámetro de un micropocillo. Por el contrario, si los identificadores se disponen como se muestra en la figura 9, el identificador dispuesto en el lado inferior del micropocillo más a la derecha puede quedar fuera del campo de visión.

La disposición de una pluralidad de identificadores en un mismo eje no pretende significar la disposición de los centroides de identificadores con precisión en el mismo eje y puede estar más o menos desviada del eje siempre que se pueda realizar una observación rápida con un aumento alto. Por ejemplo, como se muestra en la figura 10, cuando se dibuja la línea recta X' que conecta los centroides de la pluralidad de micropocillos y se dibuja la línea recta Y' que conecta el centroide de un identificador y el centroide de un micropocillo asociado, es satisfactorio si el ángulo p entre X' e Y' está dentro del intervalo de 45° a 135°.

Ahora, las realizaciones específicas con respecto a la disposición de micropocillos e identificadores se describirán a continuación.

En la realización mostrada en las figuras 1 a 4, 8 micropocillos están dispuestos en 4 vértices de un cuadrado y los puntos medios de 4 lados del mismo uno a uno, constituyendo una sección que contiene la celda. Los identificadores de puntos están dispuestos uno a uno en la proximidad de cada uno de los micropocillos. En esta realización, dado que los ángulos a entre los identificadores y los micropocillos difieren mutuamente, si solo se observa un único par micropocillo-identificador, se puede especificar la posición de cada micropocillo.

En la realización mostrada en la figura 10, una sección que contiene la celda está constituida por micropocillos dispuestos en forma de retícula cuadrada, que se obtiene disponiendo 8 micropocillos en 4 vértices de un rectángulo uno a uno y en solo 2 de los 4 lados dos a dos en los mismos intervalos. Los identificadores de puntos están dispuestos uno a uno en la proximidad de cada uno de los micropocillos. En esta realización, dado que los ángulos a entre los identificadores y los micropocillos difieren mutuamente, si solo se observa un único par micropocíNo-identificador, se puede especificar la posición de cada micropocillo. Además, 4 identificadores, que están dispuestos respectivamente en los 4 micropocillos de etapa superior cuyos centroides están dispuestos en un mismo eje, se disponen en un mismo eje.

En la realización mostrada en la figura 11, similar a la figura 3, una sección que contiene la celda está constituida por la disposición de 8 micropocillos en 4 vértices de un cuadrado y los puntos medios de 4 lados del mismo uno a uno. Los identificadores lineales están dispuestos uno a uno en las proximidades de cada uno de los micropocillos. La figura 12 muestra micrografías respectivas de pares micropocillo-identificador en las posiciones A, E y H de la figura 11. En esta realización, la distancia entre un identificador y un micropocillo es casi igual en todos los pares; sin embargo, el ángulo a (entre un identificador y un micropocillo) y/o la longitud de una línea (barra) difieren de un par a otro. Por lo tanto, si se acaba de observar un único par micropocillo-identificador, se puede especificar la posición de cada micropocillo. Además, dado que los identificadores son todos líneas dispuestas en la misma dirección y dispuestas en el lado derecho de los micropocillos, incluso en una fotografía de un par micropocillo-identificador tomada con un aumento alto, la orientación de un recipiente de cultivo celular en el momento del disparo se puede especificar en función de la posición y orientación de una línea (barra) del identificador.

En la realización mostrada en la figura 13, similar a la figura 3, una sección que contiene la celda está constituida por la disposición de 8 micropocillos en 4 vértices de un cuadrado y los puntos medios de 4 lados del mismo uno a uno. Uno, dos o tres identificadores de punto están dispuestos como un grupo para cada micropocillo y la posición relativa de al menos un identificador a un micropocillo asociado difiere en cada par identificador-micropocillo. La proximidad de cada micropocillo se divide en tres regiones y la presencia o ausencia de un identificador en cada región difiere en cada par identificador-micropocillo. Por lo tanto, si se acaba de observar un único par micropocillo-identificador, se puede especificar la posición de cada micropocillo. Cabe señalar que las líneas de borde entre las regiones en la figura 13 son imaginarias y no necesitan existir realmente.

Como se describió anteriormente, si la proximidad de cada uno de 8 micropocillos se divide en tres regiones y se disponen un grupo de identificadores en el que la presencia o ausencia en regiones individuales difiere, se pueden concebir 23 patrones de disposición. Por lo tanto, los micropocillos se pueden identificar mediante un número mínimo de identificadores. Si el número de regiones en las que se dispone un identificador es pequeño, se puede aumentar el tamaño de un identificador. Esto es ventajoso en vista de la precisión de identificación y la precisión de producción.

Por el contrario, como se muestra en la figura 15, la proximidad de cada micropocillo se divide en 4 regiones y se puede disponer un grupo de identificadores de modo que la presencia o ausencia de punto en regiones individuales difiera mutuamente. En el caso de la figura 13, hay un micropocillo cuya posición se identifica por la ausencia de identificador en todas las regiones; sin embargo, en el caso de la figura 15 en la que la proximidad se divide en 4 regiones, es posible constituir 4 regiones de modo que un identificador esté definitivamente presente. Si es así, es posible reconocer la inclinación en el momento del disparo en función de la posición relativa del punto de 4a línea en cualquier micropocillo. Además, si el operador fotografía para introducir el punto de 4a línea en el campo de visión, es posible evitar que el operador elija un campo de tiro incorrecto. En el caso en el que el punto de 4a línea se use para un propósito específico como se mencionó anteriormente, la forma del punto de 4a línea solo puede cambiarse.

El recipiente de cultivo celular de la presente invención tiene un fondo y una pared lateral y el espacio definido por el fondo y la pared lateral puede llenarse con un líquido. La forma del fondo, que no está particularmente limitada, puede ser un polígono tal como un triángulo y un cuadrado o un círculo (que incluye un círculo, un círculo sustancial, una elipse y una elipse sustancial). La pared lateral está formada para rodear la periferia externa del fondo. Por lo general, el lado opuesto al fondo se abre. La forma de la abertura es preferentemente idéntica a la forma del fondo. La abertura tiene preferentemente una forma circular que tiene un ancho de abertura (por ejemplo, r en la figura 2 ) de preferentemente 30 a 60 mm y particularmente de 35 mm. Este es el mismo tamaño que el de una placa de Petri utilizada habitualmente en el cultivo celular. Debido a que el recipiente puede prepararse fácilmente a partir de una placa de Petri general, y adaptarse fácilmente a un aparato de cultivo existente y otros, es preferente que el recipiente tenga el tamaño mencionado anteriormente. Cabe señalar que el recipiente de cultivo celular puede tener una tapa de manera similar a una placa de Petri general.

La superficie de pared de una parte cóncava que forma un micropocillo preferentemente es un plano inclinado que se levanta desde la parte más profunda a la periferia externa. Como plano inclinado, por ejemplo, un perfil curvo que se levanta desde la posición más baja (más profunda) de una parte cóncava de un micropocillo hasta la periferia externa o un perfil escalonado se puede emplear adecuadamente. En particular, es preferente que el plano inclinado tenga una parte lineal, más específicamente, que el plano inclinado tenga total o parcialmente una parte que se levante linealmente desde la posición más baja (más profunda) de una parte cóncava hasta la periferia externa. Debido a la presencia de la parte lineal, la migración de una célula dispuesta en un micropocillo se suprime y la célula se puede fijar fácilmente en la parte más profunda del micropocillo. Con este mecanismo, se puede obtener una imagen clara cuando se observa una célula con un microscopio. Dicho plano inclinado se forma preferentemente de una superficie cónica o una superficie lateral de un cono truncado. En el caso de una superficie cónica, el micropocillo está constituido de tal manera que la parte más profunda de un micropocillo corresponde a la punta del cono. En este caso, la parte más profunda del micropocillo, en otras palabras, la punta de un cono, puede ser redondeada. En el caso en el que el plano inclinado está formado por el lado de un cono truncado, un cono truncado está dispuesto de tal manera que la superficie que tiene un área más estrecha de las superficies superior o inferior del cono truncado corresponde a la parte más profunda del micropocillo.

La profundidad de un micropocillo, que significa un valor de la profundidad vertical medida desde la abertura del micropocillo hasta la parte más profunda, es preferentemente de 0,05 a 0,5 mm. Si un micropocillo es demasiado poco profundo, una célula se mueve durante, por ejemplo, el transporte de un recipiente de cultivo y durante la división celular y puede salir del micropocillo. Debido al riesgo, la profundidad de un micropocillo se establece para mantener una célula dentro del micropocillo sin fallas. Por ejemplo, para mantener una célula dentro de un micropocillo, es preferente que la profundidad corresponda a 1/3 o más del diámetro máximo de la célula y además preferentemente 1/2 o más. Por el contrario, si un micropocillo es demasiado profundo, es difícil introducir medio de cultivo y una célula en el micropocillo. Por lo tanto, la profundidad se establece adecuadamente para mantener una célula dentro de un micropocillo y no para ser extremadamente profunda. Por ejemplo, el límite superior del valor de profundidad se puede establecer tres veces o menos del ancho de abertura de la abertura de un micropocillo. Con el fin de introducir fácilmente un medio de cultivo, la profundidad es preferentemente igual o menor que el ancho de abertura de un micropocillo y particularmente preferentemente 1/2 o menos.

Si el valor de rugosidad de la superficie de la superficie de la pared de un micropocillo, en particular, el plano inclinado, es grande, cuando una imagen obtenida mediante observación de transmisión por un microscopio se somete a un procedimiento de extracción de contorno, puede no obtenerse un contorno claro de la imagen obtenida debido a la irregularidad en el plano inclinado. Debido a esto, es preferente que el valor de rugosidad de la superficie sea lo más pequeño posible. Más específicamente, la altura máxima Ry (cuando una longitud de referencia en la dirección de la línea promedio se muestrea a partir de una curva de rugosidad, la distancia entre la línea de pico y la línea de fondo del valle en la parte muestreada se refiere a Ry) es preferentemente inferior a 1,0 pm y particularmente preferentemente inferior a 0,5 pm. Cabe señalar que el grado de rugosidad superficial del plano inclinado puede reducirse al mejorar la precisión de procesamiento de un molde mediante la aplicación, por ejemplo, de procesamiento de pulido, cuando se prepara el molde de un recipiente de cultivo.

Una pluralidad de micropocillos están dispuestos en el fondo de un recipiente de cultivo celular y constituyen una sección que contiene la celda. Una pluralidad de secciones que contienen celdas, cada una constituida por dicha pluralidad de grupos de micropocillos, puede disponerse en el fondo y puede no disponerse cerca una de la otra.

Una sección que contiene la celda en la que se disponen una pluralidad de micropocillos puede estar rodeada por una pared interna y dividida a partir de otras partes del recipiente de cultivo (por ejemplo, indicado por el símbolo de referencia 8 en la figura 1 y la figura 2). Si una pluralidad de grupos de micropocillos están presentes en el fondo de un recipiente de cultivo celular, es preferente que cada uno de los grupos individuales esté rodeado directamente por una pared interna. Por lo general, en el cultivo, por ejemplo, de óvulos fertilizados, se forma una gota de medio de cultivo que contiene óvulos fertilizados en un recipiente de cultivo y se cubre con aceite para evitar que se sequen. Si los grupos de micropocillos formados adyacentes entre sí están rodeados además por una pared interna, el medio de cultivo está contenido en este para formar una gota estable, evitando así la dispersión del medio de cultivo. Por la misma razón, el medio de cultivo se cubre con aceite tal como un aceite mineral.

El material de un recipiente de cultivo celular no está particularmente limitado. Los ejemplos específicos de estos incluyen materiales inorgánicos tales como metal, vidrio y silicio; y materiales orgánicos tales como plásticos (por ejemplo, una resina de poliestireno, una resina de polietileno, una resina de polipropileno, una resina de ABS, nailon, una resina acrílica, una resina de flúor, una resina de policarbonato, una resina de poliuretano, una resina de metilpenteno, una resina de fenol, una resina de melamina, una resina de epoxi y una resina de cloruro de vinilo). El recipiente de cultivo celular se puede producir mediante un procedimiento conocido por los expertos en la materia. Por ejemplo, un recipiente de cultivo se forma de un material plástico mediante un procedimiento de moldeo habitual, por ejemplo, moldeo por inyección.

El recipiente de cultivo celular se somete preferentemente a un tratamiento hidrofílico de superficie tal como un tratamiento de plasma con el fin de evitar la adhesión no específica de células cultivadas y la falta de homogeneidad del medio de cultivo por la caída por tensión superficial. El número de bacterias (número de carga biológica) unidas a un recipiente fabricado es preferentemente 100 ufc/recipiente o menos. Además, es preferente que se aplique un tratamiento de esterilización tal como esterilización y.

Al recipiente de cultivo celular, se le puede aplicar un tratamiento de superficie o recubrimiento de superficie que puede facilitar el crecimiento de óvulos fertilizados. Particularmente, cuando los óvulos fertilizados se cultivan conjuntamente con células de otros órganos (por ejemplo, células de membrana endometrial o células epiteliales de trompa de Falopio) para facilitar el crecimiento de los óvulos fertilizados, estas células deben estar previamente unidas a un recipiente de cultivo. En tal caso, es ventajoso que la superficie del recipiente de cultivo esté recubierta con un material adhesivo celular.

Los ejemplos de una célula deseada para cultivo incluyen, pero no se limitan particularmente a, un óvulo fertilizado, un óvulo, una célula ES (célula madre embrionaria) y una célula iPS (célula madre pluripotente inducida). El óvulo significa un óvulo no fertilizado, e incluye un ovocito inmaduro y un ovocito maduro. El óvulo fertilizado comienza la escisión después de la fertilización, aumenta en número de células, como una etapa de 2 células a una etapa de 4 células y una etapa de 8 células y se convierte en mórula y blastocisto. Los ejemplos del óvulo fertilizado incluyen los embriones tempranos tales como un embrión de 2 células, un embrión de 4 células y un embrión de 8 células, mórula y blastocisto (incluyendo blastocisto temprano, blastocisto expandido y blastocisto eclosionado). El blastocisto significa un embrión que consiste en células externas que tienen el potencial de formar la placenta y la masa celular interna que tiene el potencial de formar un embrión. La célula ES significa una célula pluripotente o totipotente indiferenciada obtenida de la masa celular interna del blastocisto. La célula iPS significa una célula somática (principalmente, fibroblasto) que tiene pluripotencia (como la célula ES), que se adquiere mediante la introducción de varios tipos de genes (factor de transcripción) en una célula somática. Más específicamente, los ejemplos de la célula incluyen un grupo de células tal como un óvulo fertilizado y un blastocisto.

El recipiente de cultivo celular de la presente invención es adecuado para cultivar preferentemente células de mamífero y células de ave y particularmente células de mamífero. El mamífero significa un vertebrado de sangre caliente. Los ejemplos de estos incluyen primates tales como un ser humano y un mono; roedores tales como un ratón, una rata y un conejo; animales de compañía tales como un perro y un gato; y animales de granja tales como una vaca, un caballo y un cerdo. El recipiente de cultivo celular de la presente invención es particularmente adecuado para cultivar un óvulo fertilizado humano.

Por lo general, se añade el medio de cultivo A para cubrir el micropocillo y se añade aceite B para cubrir el medio de cultivo y a continuación se añade la célula C al medio de cultivo. Estas operaciones se llevan a cabo generalmente mediante el uso de herramientas como una pipeta o un capilar de vidrio. Dado que el recipiente de cultivo celular de la presente invención tiene una abertura grande, estas operaciones pueden llevarse a cabo con relativa facilidad (figura 16).

El cultivo se realiza generalmente colocando el recipiente de cultivo celular en una incubadora que trae una atmósfera ambiente que contiene un gas requerido para el crecimiento y mantenimiento de una célula cultivada y temperatura ambiente constante. Los ejemplos del gas requerido incluyen vapor de agua, oxígeno libre (O²) y dióxido de carbono (CO²). El pH del medio de cultivo se puede estabilizar dentro de un determinado período de tiempo mediante el control de la temperatura ambiente y el contenido de CO². El pH estable se puede obtener estabilizando el contenido de CO²y la temperatura. Las condiciones de cultivo tales como temperatura, gas y medio de cultivo, se pueden controlar también comparando la imagen de una célula durante el cultivo con una imagen previamente almacenada mediante el uso de un programa de comparación de imágenes.

Por ejemplo, si se cultiva un óvulo fertilizado, generalmente se determina si el óvulo fertilizado cultivado es satisfactorio y adecuado o no para la implantación en el útero. La determinación se puede realizar automáticamente o manualmente, por ejemplo, mediante un microscopio. En la determinación automática de una célula cultivada, la imagen de una célula en un recipiente de cultivo es capturada por un microscopio, fotografiada por un aparato de detección tal como una cámara CCD y sometida a un procedimiento de extracción de contorno en el que se extrae de la imagen una parte correspondiente a la célula. El aparato de análisis de imágenes analiza la imagen celular extraída para determinar la calidad de la célula. Como procedimiento de extracción de contorno de imagen, por ejemplo, se puede usar un procedimiento descrito en la publicación de patente JP (Kokai) n.° 2006-337110.

Cuando un micropocillo tiene una superficie inferior paralela al fondo de un recipiente de cultivo celular y una superficie lateral perpendicular al fondo, una célula migra dentro del micropocillo y a veces entra en contacto con la superficie lateral. Si se fotografía una célula de este estado, es difícil extraer una imagen de célula de una imagen fotografiada en un procedimiento de extracción de contorno. Sin embargo, si la superficie de la pared de un micropocillo tiene un plano inclinado, preferentemente tiene una parte en forma de cono o truncada en forma de cono, la célula que se va a cultivar permanece naturalmente en la parte inferior del micropocillo. Por lo tanto, incluso si el micropocillo tiene una superficie lateral perpendicular al fondo del recipiente de cultivo celular en un sitio cercano a la abertura que el plano inclinado, la célula no permanecería en contacto con la superficie perpendicular. El procedimiento de extracción del contorno de la imagen fotográfica de una célula se puede llevar a cabo sin problema.

LISTA DE SIGNOS DE REFERENCIA

1: Recipiente de cultivo celular

2: Pared lateral

3: Fondo

4: Micropocillo

5: Sección que contiene la celda

6: Identificador

7: Segundo identificador

8: Pared interior

r: Ancho de abertura del recipiente de cultivo celular

R: Ancho de abertura de un micropocillo

a: Paso de un micropocillo

Medio de cultivo Aceite

Célula

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un recipiente de cultivo celular (1) que comprende un fondo (3) y una pared lateral (2), donde

el fondo tiene una sección que contiene la celda (5) en la que se disponen una pluralidad de micropocillos (4) para contener células,

los identificadores (6) están dispuestos en las proximidades de la pluralidad de micropocillos (4) para formar pares en micropocillos individuales, y

la posición relativa de cada uno de los identificadores (6) a un micropocillo asociado varía en cada par, donde, en la vista superior, cada uno de los identificadores (6) tiene un área más pequeña que una abertura de cada uno de los micropocillos (R), y

donde el recipiente de cultivo celular comprende 8 o más micropocillos.

2. El recipiente de cultivo celular (1) según la reivindicación 1, donde los identificadores (6) tienen una forma de punto o lineal.

3. El recipiente de cultivo celular (1) según la reivindicación 1 o 2, donde la pluralidad de identificadores (6) , que se dispondrán en la pluralidad de micropocillos (4) cuyos centroides están colocados en un mismo eje para formar pares con ellos, están dispuestos en un mismo eje.

4. El recipiente de cultivo celular (1) según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde todos los identificadores (6) están dispuestos solo en los lados derecho, solo en los lados izquierdo, solo en los lados superior o solo en los lados inferior con respecto al centro de cada uno de los micropocillos (4).

5. El recipiente de cultivo celular (1) según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que comprende además un segundo identificador (7) para especificar la orientación del recipiente de cultivo celular, donde, en la vista superior, el segundo identificador (7) tiene un área mayor que la abertura de cada uno de los micropocillos (R) para confirmarlos visualmente.

6. El recipiente de cultivo celular (1) según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, donde está presente un micropocillo (4) en el que están dispuestos la pluralidad de identificadores para formar pares.

7. El recipiente de cultivo celular (1) según la reivindicación 6, donde la pluralidad de identificadores (6), (7) dispuestos en el micropocillo asociado (4) para formar un par son de forma diferente.

8. El recipiente de cultivo celular (1) según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, donde está presente un micropocillo (4) que no tiene identificadores dispuestos en el mismo.

9. El recipiente de cultivo celular (1) según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, donde la proximidad del micropocillo (4) se divide en una pluralidad de regiones y la presencia o ausencia del identificador en las regiones varía en cada par micropocillo-identificador.

10. Un recipiente de cultivo celular (1) que comprende un fondo (3) y una pared lateral (2), donde

los identificadores (6) que tienen una forma lineal están dispuestos en la proximidad de la pluralidad de micropocillos (4) para formar pares, y

los identificadores (6) que tienen una forma lineal varían mutuamente en longitud u orientación en cada par identificador-micropocillo,

donde, en la vista superior, cada uno de los identificadores (6) tiene un área (R) más pequeña que una abertura de cada uno de los micropocillos.