CZ301758B6

CZ301758B6 - Zpusob pridávání, odstranování nebo výmeny kapalného média pri kultivaci biologických bunek a kultivacní zarízení

Info

Publication number: CZ301758B6
Application number: CZ20090264A
Authority: CZ
Inventors: Hlinka@Daniel
Original assignee: Synga, S. R. O.
Priority date: 2009-04-27
Filing date: 2009-04-27
Publication date: 2010-06-16
Also published as: CZ2009264A3; WO2010124663A3; WO2010124663A2

Abstract

Zpusob pridávání, odstranování nebo výmeny kapalného média pri kultivaci biologických bunek bez jakéhokoli kontaktu s temito bunkami a kultivacní zarízení (1) pro kultivaci biologických bunek a manipulaci s uvedenými bunkami, s výhodou embryonálními bunkami, obsahující alespon jednu protáhlou kultivacní jamku (6) s prurezem ve tvaru V a alespon jednu jamku (7) pro výmenu média, která umožnuje kultivaci embryí ve skupinách v tesné vzájemné blízkosti s využitím podpurných úcinku rustových faktoru uvolnovaných embryi, pricemž je zajištena plná identifikace každého jednotlivého embrya behem celého období kultivace, a které soucasne umožnuje nekontaktní výmenu živného média. Zarízení (1) muže být usporádáno na spolecné základne (11) v kombinaci s dalším zarízením (12), jako pro oplodnení in vitro, a prekryto víkem (10).

Description

Oblast techniky

Vynález se týká způsobu přidávání, odstraňování nebo výměna kapalného média při kultivaci biologických buněk a kultivačního zařízení pro kultivaci biologických buněk a manipulaci s těmito buňkami s výhodou embryonálními buňkami.

to

Dosavadní stav techniky

V současnosti se lidská embrya i embrya jiných živočichů kultivují in vitro v různých kultivač15 nich zařízení nebo vícejamkových destiček.

Takové typické uspořádání představuje běžné ploché zařízení, na jehož dně je umístěno vodné kultivační médium ve formě jednotlivých kapek. Kapky jsou v průběhu kultivace obvykle překryty minerálním olejem. Je třeba věnovat extrémní péči pro zabránění přemístění kapek při manipulaci se zařízeními.

V dokumentu US 5 891 712 se uvádí zlepšené zařízení pro mikrokapkovou kultivaci, v jehož plochém dně je zapuštěn větší počet kruhových jamek s otevřenými horními povrchy, kde jamky mohou mít značky pro identifikaci jednotlivých jamek pro účely sledování. Podle popisuje kulti25 vační zařízení společně s odnímatelným víkem schopno poskytnout stabilní prostředí pro vývoj gamet/embryí a tedy kratší dobu inkubace pro postupy, jasnou identifikaci vzorků v něm obsažených, a zabránit přemístění kapek během manipulace se zařízením.

Embrya se mohou pěstovat pět až šest dnů a během této doby je třeba obměňovat kultivační médium, aby se zabránilo hromadění toxických produktů a vyčerpání živých složek.

V kterémkoliv z používaných systémů se oocyty/embrya přenášejí do dalšího oddílu (komůrka, jamka atd.) nebo jednoduše do další kapky čerstvého média. V průběhu této manipulace se oddělují shluky embryí což snižuje podpůrný účinek autokrinních/parakrinních růstových fakto35 rú, které embrya uvolňují. Navíc s nimi musí manipulovat kvalifikovaný personál pomocí sklenéných/plastových zařízení, a takto jsou embrya vystavena možnosti poškození a/nebo ztráty. Pro kompenzaci úbytku embryí při manipulaci musí být výchozí počet embryí vždy vyšší než počet, který je nakonec ženě implátován. Tomuto přebytku embryí by se však mělo zabránit z etických důvodů.

Proto by bylo vysoce žádoucí mít k dispozici zlepšené kultivační zařízení stejně jako odpovídající zlepšený způsob vhodný pro nekontaktní výměnu živného média, při kterém se s kultivovanými embryi/buňkami ani nemanipuluje, ani nepřijdou do kontaktu se zařízením pro výměnu média (např. pipetami).

Rutinně se používá několik postupů pro kultivaci embryí. Při kterémkoliv z těchto použitelných postupů se na základě morfologických znaků posuzuje viabilita jednotlivého embrya pozorováním světelnou mikroskopií. To vyžaduje trvalou identifikaci každého embrya ze skupiny během celého období kultivace. Kultivace ve shlucích (clusterech) je nevhodná, protože embrya mohou být při manipulaci snadno poškozena. Aby se zabránilo této nevýhodě, jednotlivá embrya se umístí v kultivačních miskách v od sebe vzdálených miskách. Kultivace jednotlivých embryí však snižuje vliv růstových faktorů uvolňovaných embryí, které podporují jejich vývoj.

V průběhu kultivace prodloužené až na pět dnů je navíc zapotřebí výměna živného média, a v takovém případě je třeba embrya převádět do Čerstvého média a vedlejší produkty růstu jsou

-1CZ 301758 B6 ztraceny. Jestliže se embrya nepřenesou, může akumulace toxických metabolitů v kultivačním médiu poškodit další vývoj embryí.

US 6 448 069 popisuje zařízení pro kultivaci embryí obsahující alespoň jednu rozdělenou struk5 turu, kde každý jednotlivý oddíl má vhodnou velikost pro přijmutí jednoho embrya, a kde je umožněna migrace kapaliny mezi oddíly. Ve výhodném provedení je každý oddíl vymezen od sebe vzdálenými hroty směřujícími vzhůru ze dna jamky, nebo membránou propustnou kapalinu. Po umístění embryí do oddílů v každé struktuře se každá struktura překryje kapkou živného média a tak mohou embrya v každé rozdělené struktuře sdílet vedlejší produkty s jinými embryi i o ve stejné struktuře. Ale i v tomto zařízení stále existuje potřeba kontaktní manipulace s embryi při jejich přemístění do čerstvého média.

Stále je tedy zapotřebí jednoduché a nenákladné kultivační zařízení, které by umožnilo, bez vytváření komplikovanější mikrostruktur jako jsou od sebe vzdálené hroty nebo membrána pro15 pustna pro kapalinu, kultivaci embryí ve skupinách ve vzájemné těsné blízkosti s využitím podpůrných účinků růstových faktorů uvolňovaných embrya během celého období kultivace, a které by současně umožnilo nekontaktní výměnu živného média.

²⁰ Podstata vynálezu

Uvedené problémy řeší první předmět předkládaného vynálezu, kterým je způsob přidávání, odstraňování nebo výměnu kapalného média při kultivaci a/nebo jakékoli jiné manipulace s biologickými buňkami, s výhodou embryonálními buňkami, uloženými v jedné nebo více jamkách uspořádaných ve spodní stěně kultivačního zařízení, bez jakékoli manipulace s buňkami nebo kontaktu zařízení pro manipulaci s médii, jako je pipeta, s uvedenými buňkami.

Tento způsob umožňuje jakoukoli manipulaci s jakýmkoli kapalným vhodným nebo nevhodným médiem, jako jsou žívá média, stejně jako promývací, uchovávací, ošetřovací, pufřovací, ekvilib30 rační, ochranná nebo krycí média, která by měla být přivedena do kontaktu s buňkami.

Při tomto způsobu podle vynálezu je vyloučena jakákoli manipulace, jako například přenášení buněk nebo embryí do čerstvého média pipetou, a tak zle vyloučit porušení shluků embryí.

Způsob podle vynálezu zahrnuje dva základní kroky: krok přidávání média do kultivačního zařízení, kde v tomto kroku se hladina média v tomto kultivačním zařízení postupně zvyšuje nad úroveň otevřených konců uvedených jamek, čímž se vytvoří spojení přes kapalinu mezi přidaným médiem a vnitřní prostor uvedených jamek přes otevřené konce těchto jamek, a/nebo krok odstraňování média z kultivačního zařízení, kde v tomto kroku se hladina média v tomto kultivačním zařízení postupně snižuje pod úroveň otevřených konců uvedených jamek, čímž je přerušeno spojení přes kapalinu otevřenými konci těchto jamek mezi přidaným médie a vnitřním prostorem jekem.

Ačkoli způsob podle vynálezu umožňuje přidávání média nebo jeho odstraňování z jakéhokoli kultivačního zařízení, které má jamky pro kultivaci biologických buněk (kultivační jamky), například z jakéhokoli místa na spodní stěně kultivačního zařízení, ve kterém nedochází ke kontaktu zařízení pro manipulaci s médiem s buňkami, s výhodou z nej nižšího bodu horního povrchu spodní stěny kultivačního zařízení, výhodněji jamky uspořádané v nejnižším bodě horního povr50 chu spodní stěny kultivačního zařízení, která neobsahuje žádné buňky, ještě výhodněji z nejnižšího bodu horního povrchu spodní stěny kultivačního zařízení, ve kterém má spad horní povrch spodní stěny uvedeného kultivačního zařízení, nejvýhodněji se média speciálního kultivačního zařízení, které je dalším předmětem předkládaného vynálezu.

-2CZ JU1758 Bb

V tomto nejvýhodnějším provedení začíná způsob výměny média odsátím média, pokud je přítomno, z jamky pro výměnu média uspořádané v nej nižším bodě horního povrchu spodní stěny kultivačního zařízení.

Autoři vynálezu překvapivě zjistili, že po odstranění média uvedené jedna nebo více jamek, ve kterých jsou buňky/embrya uloženy(kultivační jamky), zůstávají nejen naplněny médiem, ale embrya nejsou narušena, ani uvedena do vznosu a udržují si své původní pořadí.

Při přidávání čerstvého média, ve výhodném provedení vytlačeného média do jamky pro výměnu io média uspořádané v nejnižším bodě horního povrchu spodní stěny kultivačního zařízení, hladina média postupně stoupá nad hladinu otevřených konců uvedených kultivačních jamek s kultivovanými embryi/buňkami, a původní médium je rozsáhle ředěno čerstvým médiem.

Operace se může dále provádět velmi snadno a současně v jednom kroku pro všechny jamky s kultivovanými embryi/buňkami, je méně náročná na čas a má menší požadavky na zkušený laboratorní personál než způsoby podle stavu techniky. Navíc nejsou nutné žádné jemné nástroje pro manipulaci s embryi/buňkami.

Ředicí poměr a tím možnost zachování růstových faktoru uvolněných embryi/buňkami v jejich těsném sousedství může být do určité míry ovlivněna množstvím přidaného čerstvého média a tedy hladinou čerstvého média nad otevřenými konci uvedených kultivačních jamek s kultivovanými embryi/buňkami a dobou inkubace pře odstraněním média.

V kroku odstraňování média z kultivačního zařízení se hladina média v uvedeném kultivačním zařízení postupně snižuje pod úroveň otevřených konců uvedených kultivačních jamek, Čímž se spojení přes kapalinu otevřenými konci kultivačních jamek mezí přidaným médiem a vnitřním prostorem uvedených jamek přeruší a například kultivace médií může být dále prováděna jako standardní kultivace v mikrokapkách.

Jestliže se požaduje nebo jestliže je nutné, vynecháním výše uvedeného kroku odstraňování média z kultivačního zařízení zůstává hladina média v uvedeném kultivačním zařízení nad hladinou otevřených konců jamek, a je zachováno spojení přes kapalinu mezi všemi jamkami kultivačního zařízení prostřednictvím média.

Jestliže se požaduje nebo jestliže je nutné, výše uvedené kroky odstraňování a přidávání média mohou být několikrát opakovány například pro dosažení promytí embryí/buněk.

Způsob podle vynálezu navíc umožňuje přidávání nebo odstraňování média pod vrstvou krycí nevhodné kapaliny, jako je minerální olej, jak se v oboru běžně používá.

Ve výhodném provedení se médium odstraňuje odsátím z jamky uspořádané v nejnižším bodě horního povrchu spodní stěny kultivačního zařízení, pod vrstvou krycí nevhodné kapaliny, takže v podstatě veškerá krycí kapalina zůstává v zařízení. Přidání čerstvého média se v tomto případě s výhodou provádí vytlačením média do stejné jamky, rovněž pod vrstvou krycí nevhodné kapa45 liny. Tímto způsobem může nevhodná kapalina zůstat během celé kultivace nezměněna.

S výhodou se způsob provádí na jakémkoli provedení kultivačního zařízení jak bude popsáno dále.

Další předmět vynálezu představuje kultivační zařízení obsahující spodní stěnu a boční stěnu definující vnitrní prostor tohoto kultivačního zařízení, přičemž ve spodní stěně je zapuštěna alespoň jedna protáhlá kultivační, v pohledu podél její delší osy s průřezem ve tvaru V, směřující svým horním otevřeným koncem do uvedeného vnitřního prostoru zařízení, a zapuštěna alespoň jedna jamka pro výměnu média směřující svým horním otevřeným koncem do vnitřního prostoru zařízení.

-3CZ 301758 B6

Bylo zjištěno, že embrya kultivovaná v řadě protáhlých kultivačních jamek, které mají průřez v podstatě ve tvaru V, a tak tvoří ve spodní stěně kultivačního zařízení strukturu podobnou drážce nebo kanálku, si zachovávají v průběhu celého kultivačního procesu své původní polohy.

Kultivační jamky jsou navrženy s vhodnou hloubkou ajejich stěny s vhodným úhlem pro minimalizaci flotace embryí během manipulace, se zachováním dobré přístupnosti k embryím při manipulaci.

i o Pro nekontaktní přidávání, odstraňování nebo výměnu média je ve spodní stěně kultivačního zařízení zapuštěna alespoň jedna jamka pro výměnu média, směřující svým horním otevřeným koncem do vnitřního prostoru kultivačního zařízení.

S výhodou má alespoň část horního povrchu spodní stěny kultivačního zařízení obsahující jednu nebo více kultivačních jamek spád směrem k jamce pro výměnu média pro snadné shromáždění média v této jamce pro výměnu média.

Dno kultivační jamky je v s výhodou vodorovné. Ve dvou nebo více kultivačních jamek jsou dna s výhodou na stejné vodorovné úrovni.

Okraj horního otevřeného konce kultivační jamky směřující do vnitřního prostoru kultivačního zařízení může být zvýšený nad horní povrch spodní stěny kultivačního zařízení pro vytvoření okraje s vodorovným horním koncem, kde uvedený okraj obklopuje horní otevřený konec kultivační jamky. Tento okraj zajišťuje konstantní hloubku protáhlé kultivační jamky podél její delší osy a navíc minimalizuje vznos embryí během výměny média a umožňuje pracovníkovi stále stejnou přístupnost ke všem embryím při manipulaci. V případě dvou nebo více kultivačních jamek jsou vodorovné horní koce těchto okrajů s výhodou na stejné horizontální úrovni,

Jedna jamka pro výměnu média může tedy tvořit jednotku“ s jednou nebo více okolními kulti30 vačními jamkami, kde část horního povrchu spodní stěny obsahující takovou jednotku“ může mít spát směrem k této jamce pro výměnu média. Jedno kultivační zařízení může obsahovat několik takových samostatných jednotek v jakémkoli místě spodní stěny, přičemž každá jednotka může být od jiných jednotek oddělena bočními stěnami, nebo kde dvě nebo více jednotek mohou být obklopeny jedinou společnou boční stěnou. Takové uspořádání je užitečné například při genetické analýze pro kultivaci jednotlivých embryí.

Delší osy kultivačních jamek obklopujících jednu jamku pro výměnu média jsou s výhodou vzájemně rovnoběžné, aby byl umožněn snadný přístup ke všem embryím pipetou drženou pod stejným úhlem vzhledem ke kultivačnímu zařízení u všech kultivačních jamek, stejně jako bezpečná identifikace embryí.

Tvar jamky pro výměnu média není kritický. Ve výhodném provedení má jamka pro výměnu média boční stěny s širším koncem směřujícím vzhůru, pro umožnění odstranění i nejmenšího množství zbylého média a pro snadné rozlišení hladiny nevhodné krycí kapaliny, pokud je pou45 žita. Jamka pro výměnu média může mít oblé nebo ploché dno.

Aby byly zajištěny stejné podmínky pro výměnu média v jednotlivých kultivačních jamkách, jsou kultivační jamky s výhodou uspořádány kolem centrální jamky pro výměnu média ve v podstatě stejné vzdálenosti od centrální jamky pro výměnu média.

Spodní stěna kultivačního zařízení s výhodou obsahuje značky, jako jsou číslice nebo písmena, pro identifikaci jednotlivých kultivačních jamek.

-4CZ 301758 B6

Kout v místě styku mezí horním povrchem spodní stěny a boční stěnou je s výhodou zaoblený nebo zkosený do vnitřního prostoru kultivačního zařízení pro minimalizaci množství ulpělé kapaliny.

Kultivační zařízení může dále obsahovat odnímatelně víko překrývající vnitřní prostor uvedeného kultivačního zařízení.

Je možné, aby kultivační zařízení bylo uspořádáno na společném základě s jedním nebo více identickými kultivačními zařízeními a/nebo jedním nebo více dalšími zařízeními nebo struktura10 mi, jako jsou zásobníky pro náhradní médium nebo jiné pomocné struktury, které mohou být vzájemně odděleny dalšími bočními stěnami.

Takovou další strukturou může být oddíl pro oplodnění oocytů in vitro známý v oboru, zatrhující oddělené jatnky/komůrky pro spermie, popřípadě vajíčka, propojené na jejich horních koncích úzkým kanálkem. Po vypalování mohou oplodněná vajíčka kontaktovat pouze živé a vysoce pohyblivé spermie.

Kterákoli taková struktura může obsahovat odnímatelně víko.

V případě uspořádání více zařízení a/nebo struktur stejného nebo odlišného druhu na společné základně může být výhodné, jestliže jsou jednotlivá víka překrývající vnitrní prostor každého kultivačního zařízení a/nebo vnitřní prostor kteréhokoliv dalšího zařízení přítomného na společné základně, nahrazena jediným společným víkem překrývajícím všechna zařízení anebo struktury na stejné společné základně.

Společné víko s výhodou ve své první poloze překrývá všechna kultivační zařízení a/nebo další zařízení uspořádaná na společné základně, a ve své druhé, vzhledem k první poloze vodorovně otočení poloze, umožňuje přístup do vnitřních prostorů uvedených zařízení uspořádaných na společné základně, například vhodnými otevřenými segmenty nebo výseky. Tento princip již byl v oboru použit, například v jamkové misce s krycí deskou podle FI884551.

Přehled obrázků na výkresech

Obr. I ilustruje boční řez jedním provedením kultivačního zařízení J podle vynálezu s jednou centrální jamkou 7 pro výměnu média a dvěma kultivačními jamkami 6;

obr. 2 ilustruje pohled shora na kultivační zařízení I podle obr. I s jednou centrální jamkou 7 pro výměnu média a čtyřmi kultivačními jamkami 6 uspořádanými kolem centrální jamky 7 pro výměnu média;

obr. 3 ilustruje pohled shora na kultivační zařízení 1 s jednou centrální jamkou 7 pro výměnu média a čtyřmi kultivačními jamkami 6 uspořádanými kolem centrální jamky 7 pro výměnu média obsahující označení A, B, C a D na spodní stěně 2, identifikující kultivační jamky 6;

obr. 4 ilustruje boční řez provedením z obr. 1, u kterého horní povrch 8 spodní stěny 2 kulti45 vačního zařízení I má spad k jamce 7 pro výměnu média, s případným víkem 4 překrývajícím vnitřní prostor 5;

obr. 5 A-C ilustrují boční řez několika provedeními kultivační jamky 6 v pohledu podél delší osy jamky 6, popřípadě ukazující embryo 9 přítomné v jamce 6;

obr. 5 D ilustruje boční řez kultivační jamky 6 v pohledu podél delší osy jamky 6, ukazující okraj J_3 obklopující horní otevřený konec kultivační jamky 6;

obr, 5 E ilustruje boční řez kultivační jamkou 6 v pohledu kolmo na delší osu jamky 6, ukazující okraj 13 obklopující horní otevřený konec kultivační jamky 6; obr. 5 F ilustruje detail pohledu shora na kultivační jamku 6;

-5CZ 301758 B6 obr. 5 G ilustruje stejný pohled jako obr. 5 F a ukazuje embryo 9 umístěná v kultivační jamce 6;

obr. 6 ilustruje boční rez jedním z provedení jamky 7 pro výměnu média;

obr. 7 ilustruje pohled shora na uspořádání dvou kultivačních zařízení L každé obsahující čtyři jamky 6 kolem jedné centrální jamky 7 pro výměnu média, na společné základně

11;

obr. 8A-B ilustrují dva různé šikmé pohledy na kultivační zařízení 1 uspořádaní na společné základně H v kombinaci s jedním zařízením Γ2 pro oplodnění in vitro, s jedním možným provedením jediného odnímatelného víka 10;

obr. 9A-B ilustrují dva různé šikmé pohledy na kultivační zařízení 1 uspořádané na společné io základné H v kombinaci s jedním zařízením 12 pro oplodnění in vitro, s víkem ]_0 v otevřené poloze (A) a otočeným do své uzavřené polohy (B).

Příklad provedení vynálezu

Některá výhodná provedení předkládaného vynálezu budou nyní podrobně popsána, přičemž se bude odkazovat na doprovodné výkresy.

Odborníkům v oboru by mělo být zřejmé, že i když se provedení předkládaného vynálezu ve 20 specifikaci popisuje na embryích, vynález není omezen pouze na embryonální buňky člověka nebo jiných živočichů, ale může být použitelný pro všechny citlivé a/nebo křehké biologické materiály jako jsou oocyty a jiné živočišné nebo rostlinné buňky nebo části buněk jako jsou protoplasty.

Termíny „kultivační jamka“ nebo „kultivace“ by navíc měly být interpretovány tak, aby zahrnuly všechny myslitelné způsoby jako jsou příjímání, udržování, uchovávání, promývání, očkování nebo zpracování biologických materiálů.

Bezkontaktní výměna média podle prvního provedení předkládaného vynálezu se mlže v podstatě použít pro přidávání nebo odstraňování média z jakéhokoli kultivačního zařízení, které má jamky pro kultivaci biologických buněk (kultivační jamky). Způsob se však s výhodou provádí v kultivačním zařízení podle vynálezu.

Při bezkontaktní výměně média podle vynálezu se kultivovanými embryi/buňkami ani nemani35 puluje, ani nepřicházejí do kontaktu se zařízeními pro výměnu média (například pipet), tj. živné médium se s výhodou vyměňuje jeho odstraněním z/přidáním do jamky 7 pro výměnu média. Při typickém postupu kultivace se provádějí následující kroky:

Krok 1 - zavedení živného média

V tomto kroku se jamka 7 pro výměnu média plní použitím například běžné pipety s vyměnitelnými hroty živným médiem. Hladina média v kultivačním zařízení I se tím postupně zvyšuje nad úroveň otevřených horních konců kultivačních jamek 6 a nakonec se médium převrství minerálním olejem.

Krok 2 - přidání embryí

V tomto kroku se embrya 9 pipetují do jedné nebo více kultivačních jamek 6 ve tvaru V. Tato manipulace může vyžadovat speciální manipulační nástroje a vyškolený personál.

Je možné kultivovat embrya/buňky v tomto uspořádání, tj. s hladinou média ponechanou nad úrovní otevřených horních konců kultivačních jamek 6, nebo podle potřeby dále pokračovat krokem 3.

-6CZ JWI75» B6

Krok 3-odstranění nadbytku média

V tomto kroku se odsávací zařízení (hrot pipety) vloží do jamky 7 pro výměnu média pouze kul5 tivační jamky 6 obsahující embrya a médium zůstává překryté minerálním olejem, aby se zabránilo odpařování média a změna jeho osmolarity.

Krok 4-výměna vyčerpaného média io V tomto kroku se odsávací zařízení (hrot pipety) vloží do jamky 7 pro výměnu média a nové médium se vytlačuje z pipety, dokud se hladina média v uvedením kultivačním zařízení i nezvýší nad úroveň horních konců jamek 6, čímž se vytváří spojení přes kapalinu mezi přidaným médiem a vnitřním prostorem jamek překrytých čerstvým médiem přes otevřený konec uvedených jamek 6 obsahující embrya 9. Vyčerpané médium v kultivačních jamkách 6 se rozsáhle ředí čerstvým médiem.

Médium může zůstat překryté stejným minerálním olejem během celého období kultivace, aby se zabránilo odpařování média a změnám jeho osmotického tlaku.

Jedno provedení jednoduchého kultivačního zařízení i, podle druhého provedení předkládaného vynálezu, které má spodní stěnu 2 a boční stěnu 3 definující vnitřní prostor 5 kultivačního zařízení i, obsahující jednu jamku 7 pro výměnu média a dvě kultivační jamky 6 zapuštěné ve spodní stěně 2 uvedeného zařízení I. Zařízení ukázané na obr. 1 je tvořeno dostatečně pevným a transparentním materiálem jako je polystyren.

Perspektivní pohled na podobné kultivační zařízení i je ukázán na obr. 2. V tomto uspořádání je reprezentováno jednou centrální jamkou 7 pro výměnu média obklopenou v podstatě ve stejných vzdálenostech čtyřmi kultivačními jamkami 6, přičemž delší osy všech čtyř kultivačních jamek 6 probíhají vzájemně paralelně,

Aby byl umožněn snadný přístup k buňkám zařízení pro manipulaci jako je pipeta, průměr vnitřního prostoru 5 kultivačního zařízení i vhodného pro kultivaci embryí in vitro (nebo průměr částí horního povrchu 8 spodní stěny 2 obklopujících jamky 7 pro výměnu média a obsahujících jednu nebo více kultivačních jamek 6) může být například 15 až 30 mm. Hloubka vnitřního prostoru 5 kultivačního zařízení 1 může být například 5 až 15 mm, bez omezení na tyto rozměry.

Pohled shora na podobné kultivační zařízení 1 s číslicemi identifikujícími každou z kultivačních jamek 6 je ukázán na obr. 3.

Provedení ukazující, že horní povrch 8 spodní stěny 2 kultivačního zařízení i má v oblasti obklopující jamku 7 pro výměnu média spád k jamce 7 pro výměnu média, je ukázáno na obr. 4. Úhel β spádu směrem k jamce 7 pro výměnu média je s výhodou 0,5 až 2°, což je dostatečné pro gravitační odvedení média do jamky 7 pro výměnu média, ale může se pohybovat od 0° (plochý horní povrch 8) až do například 10°.

Je třeba uvést, že jamka 7 pro výměnu média nemusí být nutné umístěna v centrální oblasti kultivačního zařízení. Toto provedení je ukázáno v obr. 7, na kterém kombinované kultivační zařízení obsahuje dvě jamky 7 pro výměnu média na společné základně 11. a tedy dvě oddělené Části horního povrchu 8 spodní stěny 2 obklopující uvedené jamky 7 pro výměnu média a obsahující jednu nebo více kultivačních jamek 6 mají spád ke dvěma příslušným jamkám 7 pro výměnu média. Pokud jsou navíc uvedené dvě části povrchu 8 spodní stěny 2 obklopeny bočními stěnami 3, jsou vytvořena na společné základně JJ. dvě samostatná kultivační zařízení J.

Protáhlá kultivační jamka 6 má v pohledu podél své delší osy v podstatě průřez ve tvaru V, jak je ukázáno na obr. 5, čímž vytvoří strukturu drážky nebo kanálku ve spodní části 2 kultivačního

-7CZ 301758 B6 zařízení 1, ve kterém si embrya 9 zachovávají původní polohy v průběhu celého procesu kultivace.

Termín „v podstatě průřez ve tvaru V“ znamená nejen provedení ukázané na obr. 5A, ale také průřez s plochým dnem ukázaný na obr. 5B, nebo jakýkoli jiný průřez s širším koncem směřujícím vzhůru, pokud udržuje embrya chráněná před vznosem a uspořádaná ve stabilním trvalém pořadí pro identifikaci embryí během celého období kultivace. Pro tento účel by případná plochá část dna „V“ neměla být širší než průměr embrya nebo popřípadě jakékoli jiné kultivované buňky, může být např. 0,02 až 0,08 mm. Objem kultivačních jamek 6 závisí na kultivovaných io embryích/buňkách a může být například přibližně 10 až 50 μΙ.

Vhodný úhel a, který svírají podélné stěny protáhlých kultivačních jamek 6 pro minimalizace vznosu embryí během manipulace, se zachováním dobré přístupnosti během manipulace ke kultivovaným embryím ze všech směrů, může být 40 až 60°, a délka jamky 6, s výhodou počítaná za i5 kultivaci 10 až 15 embryí v řadě, je například rovná 10 až 20 násobku průměru embrya (typicky

0,015 mm), tj. s výhodou přibližně 3 mm. Embrya umístěná v protáhlé kultivační jamce 6 jsou ukázaná na obr. 5G.

Vhodný úhel příčných stěn, ukazuje na obr 5E, protáhlých kultivačních jamek 6 není kritický a 20 s výhodou je stejný jako uhel a podélných stěn protáhlých kultivačních jamek 6.

Jak je také vidět na obr 5E, dno kultivační jamky 6 je s výhodou horizontální. U dvou nebo více kultivačních jamek jsou dna s výhodou na stejné vodorovné úrovni-viz obr 1 a 4.

Okraj horního otevřeného konce kultivační jamek 6 směřující do vnitřního prostoru 5 kultivačního zařízení 1 je s výhodou zvýšený nad homí povrch 8 spodní stěny 2 kultivačního zařízení za vytvoření okraje 13,jakje ukázán na obr. D-G, který má vodorovný homí konec, přičemž uvedený okraj 13 obklopuje homí otevřený konec kultivační jamky 6. Šířka okraje 13 stejně jako jeho výška nad horním povrchem 8 může být s výhodou např. 0,2 až 2 mm.

Je zřejmé, že v případě horního povrchu 8 spodní stěny 2 se spádem k centrální jamce 7 pro výměnu média není výška okraje 13 nad horním povrchem 8 stejná.

V případě dvou nebo více kultivačních jamek 6 jsou vodorovné homí konec uvedených okrajů 13 s výhodou ve stejné vodorovné úrovni.

Ve výhodném provedení na obr. 1 až 4 má jamka 7 pro výměnu média větší objem a větší hloubku ve srovnání s kultivačními jamkami 6 pro embrya. Objem jamky 7 pro výměnu média může být přibližně 50 až 150 μί. Jamka 7 pro výměnu média má s výhodou kuželovitý tvar s širším koncem směřující vzhůru, a může mít například oblé nebo ploché dno, aby bylo snadno dostupné pipetou a/nebo zařízením pro manipulaci s kapalinou v případě možné automatické výměny média.

Úhel γ bočních stěn jamky 7 pro výměnu média je ukázaný na obr. 6 a je zvolený tak, že na boč45 nich stěnách je jasně vidět hladina média nebo rozhraní mezi médiem a krycí nevodnou kapalinou, a s výhodou je stejný jako úhel γ podélných stěn protáhlých kultivačních jamek 6.

Zařízení 1 může být zakryto odnímatelným víkem 4 jak je ukázáno na obr. 4, umožňujícím výměnu plynu mezi vnitřní prostorem 5 zařízení a vnějším prostředím.

Pohled shora na uspořádání dvou kultivačních zařízení 1, z nichž každé obsahuje čtyři jamky 6 kolem jedné centrální jamky 7 pro výměnu média na společné základně Uje ukázán na obr. 7.

•8CZ 3111758 B6

Ve výhodném provedení předkládaného vynálezu je jedno kultivační zařízení 1 uspořádáno na společné základě li v kombinaci s jedním zařízením 12 pro oplodnění in vitro, jak je ilustrováno na obr. 8A-B. Na obr. 8A je navíc ukázáno výhodné provedení kultivačního zařízení i, které má kolem jedné jamky 7 pro výměnu média uspořádáno šest jamek 6, jejichž delší osy probíhají vzájemně paralelně.

Nejvýhodnější provedení předkládaného vynálezu obsahuje jedno odnímatelně víko 10, které je společné pro, a které v první poloze, jak je ukázáno na obr 9 A, umožňuje přístup k vnitřním prostorům 5 uvedených zařízení i a/nebo 12 uspořádaných na společné základně 11, a jak je ukázáno to na obr. 9B, ve své druhé, vzhledem k první poloze vodorovně otočené poloze, překrývá všechna kultivační zařízení I a/nebo další jedno nebo více zařízení 12, uspořádaná na společné základně li·

Speciálně navržený tvar víka tedy umožňuje přístup k embryím/buňkám pro rutinní manipulaci, 15 přičemž není nutné víko odkládat mimo. Víko překrývá uvedená zařízení 1 a/nebo 12 uspořádaná na společné základně 11, neboje odkrývá, jednoduchým vodorovným otáčením víka o 90°.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Způsob přidávání, odstraňování nebo výměny kapalného média při kultivaci a/nebo mani25 pulaci s biologickými buňkami jako jsou embryonální buňky, uloženými v jedné nebo více jamkách zapuštěných ve spodní stěně kultivačního zařízení, kde každá z jamek směřuje svým otevřeným horním koncem do vnitřního prostoru tohoto kultivačního zařízení, bez jakékoli manipulace sbuňkami nebo kontaktu zařízení pro manipulaci sbuňkami, vyznačující se tím, že zahrnuje

30 krok přidávání média do kultivačního zařízení, kde v tomto kroku se hladina média v kultivačním zařízení postupně zvyšuje nad úroveň otevřených konců jamek, čímž se vytvoří spojení prostřednictvím kapaliny mezi přidávaným médiem a vnitřním prostorem uvedených jamek prostřednictvím otevřených konců jamek, a/nebo krok odstraňování média z kultivačního zařízení, pří kterém se hladina média v kultivačním

35 zařízení postupně snižuje pod úroveň otevřených konců uvedených jamek, čímž se přeruší spojení prostřednictvím kapaliny přes otevřené konce jamek mezi přidávaným médiem a vnitřním prostorem jamek, a vnitřní prostor jamek zůstane naplněný médiem.
2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že médium se přidává k nebo odstra40 ňuje z jamky zapuštěné ve spodní stěně kultivačního zařízení.
3. Kultivační zařízení (1), které má spodní stěnu (2) a boční stěnu (3) definující vnitřní prostor (5) kultivačního zařízení (1), vyznačující se tím, že ve spodní stěně (2)je zapuštěna alespoň jedna protáhlá kultivační jamka (6) s průřezem v pohledu podél její delší osy v podstatě

45 ve tvaru V, směřující svým horním otevřeným koncem do vnitřního prostoru (5) zařízení (1), a alespoň jedna jamka (7) pro výměnu média, směřující svým horním otevřeným koncem do vnitrního prostoru (5) zařízení (1).
4. Kultivační zařízení podle nároku 3, vyznačující se tím, že podélné stěny kulti50 vační jamky (6) svírají úhel 40 až 60°.
5. Kultivační zařízení podle nároku 4, vyznačující se tím, že dno kultivační jamky (6) je horizontální.

-9CZ 301758 B6
6. Kultivační zařízení podle kteréhokoli z nároků 3 až 5, vyznačující se tím, že okraj horního otevřeného konce kultivační jamky (6) směřující do vnitřního prostoru (5) kultivačního zařízení (1) je zvýšený nad horní povrch (8) spodní stěny (2) kultivačního zařízení (l), čímž je vytvořen okraj (13) s vodorovným horním koncem, kde okraj (13) obklopuje horní ote5 vřený konec kultivační jamky (6).
7. Kultivační zařízení podle kteréhokoli z nároků 3 až 6, vyznačující se tím, že alespoň Část horního povrchu (8) spodní stěny (2) obklopující kteroukoli z jamek (7) pro výměnu média a obsahující jednu nebo více kultivačních jamek (6) má spád směrem k jamce (7) pro ío výměnu média.
8. Kultivační zařízení podle nároku 7, vyznačující se tím, že úhel β spádu horního povrchu (8) směrem k jamce (7) pro výměnu média je 0,5 až 2°.

15
9. Kultivační zařízení podle kteréhokoli z nároků 3 až 8, vyznačující se tím, že jamka (7) pro výměnu média má boční stěny kuželovitého tvaru s širším koncem jamky (7) směřujícím vzhůru.
10. Kultivační zařízení podle kteréhokoliv z nároků 3 až 9, vyznačující se tím, že

20 kultivační jamky (6) jsou uspořádány ve spodní stěně (2) kultivačního zařízení (1) s delšími osami kultivačních jamek (6) probíhajícími vzájemně paralelně.
11. Kultivační zařízení podle kteréhokoli z nároků 3 až 10, vyznačující se tím, že spodní stěna (2) kultivačního zařízení (1) obsahuje identifikační značky.
12. Kultivační zařízení podle kteréhokoli z nároků 3 až 11, vyznačující se tím, že kultivační zařízení (1) dále obsahuje odnímatelné víko (4) překrývající vnitřní prostor (5) kultivačního zařízení (1).

30
13. Kultivační zařízení podle kteréhokoli z nároků 3 až 11, vyznačující se tím, že kultivační zařízení (1) je uspořádáno na společné základně s jedním nebo více dalšími zařízeními zvolenými ze skupiny kultivační zařízení (1) a zařízení (12) pro oplodnění in vitro.
14. Kultivační zařízení podle nároku 13, vyznačující se tím, že obsahuje jediné

35 odnímatelné víko (10), které je společné pro všechna zařízení uspořádaná na společné základně (11), a ve své první poloze překrývá všechna zařízení uspořádaná na společné základně (11), a ve své druhé, vzhledem k první poloze vodorovně otočené poloze, umožňuje přístup k vnitřním prostorům zařízení uspořádaných na společné základně (11).

40 15. Kultivační zařízení podle kteréhokoli z nároků 3 až 14, vyznačující se tím, že kout v místě styku mezi horním povrchem (8) spodní stěny (2) a boční stěnou (3) je zaoblený nebo zkosený do vnitřního prostoru kultivačního zařízení (1).