ES2896053T3

ES2896053T3 - Biogel

Info

Publication number: ES2896053T3
Application number: ES16155589T
Authority: ES
Inventors: Greg Walker
Original assignee: Haemostatix Ltd
Current assignee: Haemostatix Ltd
Priority date: 2006-11-27
Filing date: 2007-11-27
Publication date: 2022-02-23
Anticipated expiration: 2027-11-27
Also published as: US9339584B2; CA2669738A1; EP3095468B1; WO2008065388A3; IL198699A; WO2008065388A2; DK2099505T3; US9913876B2; CN101687061A; IL198699A0; GB0623607D0; JP5801994B2; ES2896053T8; EP2099505A2; JP2010510818A; CN101687061B; AU2007327100A1; EP3095468A1; RU2009119257A; AU2007327100B2

Abstract

Un kit para la formación de un biogel, que comprende: a) una pluralidad de portadores solubles, teniendo cada portador una pluralidad de unidades estructurales de unión al fibrinógeno inmovilizadas en el portador; y, por separado, fibrinógeno, en el que cada molécula de fibrinógeno se puede unir a al menos dos unidades estructurales de unión al fibrinógeno; o b) una pluralidad de portadores solubles, teniendo cada portador una pluralidad de precursores de unión al fibrinógeno inmovilizados en el portador, en el que cada precursor de unión al fibrinógeno se puede convertir en una unidad estructural de unión al fibrinógeno; y fibrinógeno, en el que cada molécula de fibrinógeno se puede unir a al menos dos unidades estructurales de unión al fibrinógeno.

Description

DESCRIPCIÓN

Biogel

Esta invención se refiere a un biogel y a kits, agentes y métodos para la formación del biogel. En un aspecto preferido, el biogel es un adhesivo tisular. El biogel o adhesivo tisular se puede usar para una variedad de aplicaciones, que incluyen hemostasia, sellado de heridas, ingeniería tisular o administración localizada de fármacos.

Durante el procedimiento de coagulación, la trombina convierte el fibrinógeno en fibrina. El fibrinógeno comprende dos conjuntos de tres cadenas diferentes (a, p y y), unidas entre sí por enlaces disulfuro. Juntas, estas cadenas forman un dominio globular central (el dominio E) conectado a dos dominios globulares distales (los dominios D). La trombina escinde cuatro enlaces peptídicos de arginina-glicina en el dominio E central del fibrinógeno para liberar un péptido A de cada una de las dos cadenas a y un péptido B de cada una de las dos cadenas p. Los péptidos A y B se denominan fibrinopéptidos. Una molécula de fibrinógeno desprovista de estos fibrinopéptidos se denomina monómero de fibrina. Los monómeros de fibrina se ensamblan espontáneamente en matrices fibrosas ordenadas llamadas fibrina. La fibrina se estabiliza mediante la formación de enlaces cruzados covalentes entre las cadenas laterales de diferentes moléculas en la fibra de fibrina. Los enlaces peptídicos se forman entre cadenas laterales específicas de glutamina y lisina en una reacción de transamidación que se cataliza por el factor XIIIa.

Una vez activadas, las plaquetas también forman una parte esencial de un coágulo de sangre. Las plaquetas se adhieren a la superficie expuesta de una herida y se activan. La glicoproteína GPIIb/IIIa de la membrana plaquetaria sufre un cambio de conformación, lo que le permite unirse al fibrinógeno. El fibrinógeno se puede unir a más de una plaqueta, por lo que las plaquetas se agregan. Los agregados de plaquetas forman la arquitectura básica del coágulo, formado dentro de una malla de fibrina.

Adhesivo de tejido de fibrina (FTA) es el nombre que se le da a los productos formados imitando la última etapa de la cascada de coagulación para formar un coágulo de fibrina. Los kits de FTA disponibles en el mercado producen rápidamente geles fuertes y biodegradables que se usan para la hemostasia, la administración de fármacos y como pegamentos quirúrgicos y sellantes de tejidos. El fibrinógeno, el factor XIII, la trombina y los iones de calcio se administran por lo general a través de un dispositivo de jeringa que separa el fibrinógeno y el factor XIII de los iones de calcio y la trombina durante el almacenamiento. La mezcla de los componentes durante la descarga de la jeringa da como resultado la trombinólisis del fibrinógeno para crear fibrina, que se autoensambla en un gel que luego se reticula con el Factor XIII activado por iones de calcio. Sin embargo, muchos FTA usan trombina bovina, que puede inducir respuestas anafilácticas y autoinmunes en los pacientes.

Zhang et al. (Bioconjugate Chem. 2002 (13): 640-646) describen la formación de hidrogeles basados en fibrinógeno mediante la liberación fotoactivada de iones calcio de los liposomas y la activación posterior de la reticulación del fibrinógeno catalizada por transglutaminasa. Sin embargo, la formación de estos hidrogeles es complicada y se requiere una formulación especializada de liposomas y Factor XIII.

Hidas et al. (Urology 67(4), 2006: 697-700) describen el uso de adhesivo tisular de glutaraldehído de albúmina en cirugía de conservación de nefronas sin suturas. Se mezclaron albúmina de suero bovino y glutaraldehído. La exposición al glutaraldehído hace que las moléculas de lisina de la albúmina de suero bovino, las proteínas de la matriz extracelular y las superficies celulares se unen entre sí, creando un fuerte enlace covalente. Sin embargo, una desventaja de este adhesivo es que el glutaraldehído es tóxico y existe el riesgo de que la albúmina de suero bovino pueda inducir una reacción alérgica en los pacientes.

El documento WO 2005/035002 describe una composición inyectable para su uso como sustituto de plaquetas que comprende micropartículas de dirección de fibrinógeno en forma de un portador insoluble al que se unen péptidos de unión a fibrinógeno.

Por lo tanto, existe la necesidad de proporcionar un gel o adhesivo tisular que no requiera el uso de agentes tóxicos, que minimice el riesgo de reacción alérgica y que sea fácil de producir a partir de componentes que puedan almacenarse fácilmente en condiciones estables.

Según la invención, se proporciona un kit de biogel (es decir, un kit para la formación de un biogel), que comprende: una pluralidad de portadores solubles, una pluralidad de unidades estructurales de unión al fibrinógeno que se inmovilizan en cada portador; y, por separado, fibrinógeno, en el que cada molécula de fibrinógeno se puede unir a al menos dos unidades estructurales de unión al fibrinógeno.

El término "biogel" se usa en este documento para incluir un gel que comprende uno o más componentes que son moléculas biológicas naturales o recombinantes (o moléculas biológicas sintetizadas químicamente), o que se derivan de moléculas biológicas (por ejemplo, derivados que retienen una o más funciones de una molécula biológica).

Se puede formar un biogel poniendo en contacto el fibrinógeno y los portadores. Debido a que una pluralidad de unidades estructurales de unión al fibrinógeno está inmovilizada a cada portador, y debido a que cada molécula de fibrinógeno se puede unir a al menos dos de las unidades estructurales de unión al fibrinógeno, las moléculas de fibrinógeno se unen entre sí a través de los portadores. Se forman enlaces no covalentes entre las moléculas de fibrinógeno y las unidades estructurales de unión al fibrinógeno.

De acuerdo con lo anterior, también se proporciona según la invención un método de formación de un biogel, que comprende poner en contacto las moléculas de fibrinógeno con una pluralidad de portadores solubles, en el que cada portador tiene una pluralidad de unidades estructurales de unión al fibrinógeno inmovilizadas en el portador, y cada molécula de fibrinógeno se puede unir a al menos dos unidades estructurales de unión al fibrinógeno, de modo que las moléculas de fibrinógeno se unen entre sí a través de los portadores mediante la formación de enlaces no covalentes entre las unidades estructurales de unión al fibrinógeno y las moléculas de fibrinógeno.

Se proporciona además según la invención un biogel que comprende moléculas de fibrinógeno y una pluralidad de portadores solubles, en el que cada portador tiene una pluralidad de unidades estructurales de unión al fibrinógeno inmovilizadas en el portador, y cada molécula de fibrinógeno está unida a al menos dos unidades estructurales de unión al fibrinógeno, de modo que las moléculas de fibrinógeno se unen entre sí a través de los portadores mediante enlaces no covalentes entre las unidades estructurales de unión al fibrinógeno y las moléculas de fibrinógeno.

En lugar de unidades estructurales de unión al fibrinógeno, los portadores pueden tener una pluralidad de precursores de unión al fibrinógeno inmovilizados a cada portador, en la que cada precursor de unión al fibrinógeno se puede convertir en una unidad estructural de unión al fibrinógeno. Para formar un biogel usando tales portadores, es necesario convertir los precursores de unión al fibrinógeno en unidades estructurales de unión al fibrinógeno de modo que las unidades estructurales de unión al fibrinógeno se puedan unir a las moléculas de fibrinógeno.

De acuerdo con lo anterior, también se proporciona según la invención un kit de biogel (es decir, un kit para la formación de un biogel), que comprende: una pluralidad de portadores solubles, una pluralidad de precursores de unión al fibrinógeno que se inmovilizan en cada portador, en el que cada precursor de unión al fibrinógeno se puede convertir en una unidad estructural de unión al fibrinógeno; y fibrinógeno, en el que cada molécula de fibrinógeno se puede unir a al menos dos unidades estructurales de unión al fibrinógeno.

Se proporciona además según la invención un método de formación de un biogel, que comprende: proporcionar una pluralidad de portadores solubles, comprendiendo cada portador una pluralidad de precursores de unión al fibrinógeno inmovilizados en el portador; convertir los precursores de unión al fibrinógeno en unidades estructurales de unión al fibrinógeno; y poner en contacto las moléculas de fibrinógeno con las unidades estructurales de unión al fibrinógeno, en el que cada molécula de fibrinógeno se puede unir a al menos dos unidades estructurales de unión al fibrinógeno, de modo que las moléculas de fibrinógeno se unen entre sí a través de los portadores mediante la formación de enlaces no covalentes entre las unidades estructurales de unión al fibrinógeno y las moléculas de fibrinógeno.

No es necesario que un biogel de la invención sea capaz de adherirse a un sustrato de tejido. Sin embargo, en aspectos preferidos, un biogel de la invención es un adhesivo tisular. El término "adhesivo tisular" se usa en este documento para referirse a una sustancia que se puede adherir a un sustrato tisular, por ejemplo piel, o una superficie mucosa. Los biogeles o adhesivos tisulares de la invención se pueden usar en hemostasia, como sellantes, para ingeniería tisular (por ejemplo, como soporte) o para la administración localizada de fármacos.

El portador es un portador soluble y no es una plaqueta. El portador debe ser apropiado para la administración tópica en un sitio de tejido de un sujeto, por ejemplo, un sitio de herida sangrante o un sitio de mucosa. El portador soluble puede ser apropiado para administración intravenosa en lugar de tópica. El portador puede comprender una proteína soluble, un fármaco terapéutico, un polímero (por ejemplo, un polímero biocompatible, tal como polietilenglicol) o una combinación de cualquiera de estos.

Los ejemplos de portadores proteicos son una enzima o una proteína que no es una enzima, tal como la albúmina de suero humano.

También se describen portadores insolubles, que pueden ser una micropartícula (que incluye una micropartícula sólida, hueca o porosa, preferiblemente una micropartícula sustancialmente esférica). La micropartícula puede estar formada por cualquier sustancia apropiada, por ejemplo, proteína reticulada. Una proteína apropiada es la albúmina (derivada de suero o recombinante, humana o no humana en secuencia). Las micropartículas apropiadas para su uso como portadores insolubles en la presente invención se pueden formar mediante el secado por pulverización de la albúmina de suero humano usando una tecnología de secado por pulverización bien conocida, por ejemplo, como en el documento WO 92/18164.

También se describen alternativas al uso de micropartículas como portadores, que incluyen liposomas, partículas de polímero sintético (tales como ácido poliláctico, ácido poliglicólico y ácido poli(láctico/glicólico)) o fragmentos de membrana celular.

El término "fibrinógeno" se usa en este documento para incluir fibrinógeno natural, fibrinógeno recombinante o un derivado de fibrinógeno que se puede convertir mediante trombina para formar fibrina (por ejemplo, monómero de fibrina natural o recombinante, o un derivado de monómero de fibrina que puede o no ser capaz de ensamblarse espontáneamente). El fibrinógeno debería poder unirse al menos a dos unidades estructurales de unión al fibrinógeno.

El fibrinógeno se puede obtener de cualquier fuente y de cualquier especie (incluido el fibrinógeno bovino), pero preferiblemente es fibrinógeno humano. El fibrinógeno humano se puede obtener de sangre autóloga o de un donante. Se prefiere el fibrinógeno autólogo porque reduce el riesgo de infección cuando se administra biogel (o adhesivo) de la invención a un sujeto.

Preferiblemente, la unidad estructural de unión al fibrinógeno se une al fibrinógeno con una constante de disociación (K^d) de entre 10^{- 9}y 10^-6M, por ejemplo alrededor de 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 200, 250, 300, 350, 400, o más nM. Se prefiere una K^dde alrededor de 100 nM. La constante de disociación se puede medir en equilibrio. Por ejemplo, el fibrinógeno radiomarcado de concentración conocida se puede incubar con microesferas a las que se ha reticulado la unidad estructural de unión del fibrinógeno. Por lo general, el péptido 5 |iM se reticula con microesferas de 1 g, o 15-40 emoles de péptido se reticula con 1 g de microesferas. Las microesferas unidas a péptidos se diluyen a 0.5 mg/ml y se incuban en solución reguladora isotónica a pH 7.4 (por ejemplo, solución reguladora Hepes 0-01 M que contiene NaCl 0.15 M) con fibrinógeno radiomarcado a concentraciones de entre 0.05 y 0.5 mg/ml durante hasta 1 hora a 20 °C. El fibrinógeno unido a la unidad estructural de unión al fibrinógeno en las microesferas se puede separar del fibrinógeno libre mediante centrifugación y se mide la cantidad de fibrinógeno libre y unido. La constante de disociación se puede calcular luego mediante análisis de Scatchard representando gráficamente la concentración de fibrinógeno unido frente a la proporción de las concentraciones de fibrinógeno unido:libre, donde la pendiente de la curva representa K^d.

En algunas realizaciones de la invención, se prefiere que la unidad estructural de unión al fibrinógeno se una selectivamente al fibrinógeno. En otras realizaciones, se prefiere que la unidad estructural de unión al fibrinógeno se pueda unir al fibrinógeno y, por separado, al monómero de fibrina y/o a la fibrina. La unión a fibrinógeno y monómero de fibrina y/o fibrina es preferiblemente selectiva.

Preferiblemente, la unidad estructural de unión a fibrinógeno es un péptido de unión a fibrinógeno o un análogo de péptido. Se puede usar cualquier péptido de unión a fibrinógeno apropiado. Por ejemplo, el péptido puede ser capaz de unirse a una región de fibrinógeno que está naturalmente unida a fibrina o por las glicoproteínas de la membrana plaquetaria GPIIb-IIIa. La unión de fibrina al fibrinógeno se analiza en Mosesson et al. 2001, Ann. N.Y. Acad. Sci., 936, 11-30. La unión de GPIIb-IIIa al fibrinógeno se analiza en Bennett, 2001, Annals of NY Acad. Sci., 936, 340-354.

El péptido puede ser capaz de unirse al dominio carboxi y/o amino terminal de la a-cadena del fibrinógeno. En particular, el péptido puede ser capaz de unirse a un motivo que contiene RGD en uno o ambos de estos dominios (tal como RGDF (SEQ ID NO: 1) en los aminoácidos 95-98, o Rg DS (SEQ ID NO: 2) en los aminoácidos 572-575). El péptido puede ser capaz de unirse al dominio carboxi terminal de la cadena y del fibrinógeno, preferiblemente a los 12 aminoácidos finales de este dominio (secuencia HHLGGAKQAGDV (SEQ ID NO: 3)). El péptido puede ser capaz de unirse al dominio D de la cadena y del fibrinógeno, tal como el segmento de la cadena p del dominio D.

El péptido de unión a fibrinógeno puede comprender una secuencia derivada de una región de unión a fibrinógeno de GPIIb o GPIIIa. Por ejemplo, el péptido puede comprender la secuencia AVTDVNGDGRHDLLVGAPLYM (SEQ ID NO: 4) que corresponde a la secuencia de residuos de aminoácidos 294-314 de GPIIb, o un fragmento o derivado del mismo que retiene la actividad de unión al fibrinógeno. Los fragmentos que se sabe que retienen la actividad de unión al fibrinógeno son TDVNGDGRHDL (296-306) (SEQ ID NO: 5), GDGRHDLLVGAPL (300-312) (SEQ ID NO: 6), y GAPL (SEQ ID NO: 7). Los derivados apropiados de TDVNGDGRHDL incluyen: T(D,E)VNG(D,E)GRH(D,E)L (SEQ ID NO: 8); TD(V,L)NGDGRHDL (SEQ ID NO: 9); TDV(N, Q)GDGRHDL (SEQ ID NO: 10); TDVNGDG(R,K)HDL (SEQ ID NO: 11).

El péptido de unión al fibrinógeno puede comprender la secuencia de los residuos 95-223 de GPIIIa, o un fragmento o derivado del mismo que retiene la actividad de unión al fibrinógeno. Por ejemplo, se cree que los residuos 211-222, que comprenden la secuencia SVSRNRDAPEGG (SEQ ID NO: 12), son un importante dominio de unión al fibrinógeno en GPIIIa. Otras regiones apropiadas de GPIIIa incluyen los residuos 109-171 y 164-202.

El péptido de unión al fibrinógeno puede comprender la secuencia de residuos que quedan expuestos al fibrinógeno por la acción de la trombina y que se une al fibrinógeno como la primera etapa en la reacción de polimerización para producir fibrina. La trombina escinde péptidos (liberando fibrinopéptidos A y B) de los terminales N de las cadenas a y p del fibrinógeno para exponer las secuencias NH²-GPR-(SEQ ID NO: 13) y NH²-GHR-(SEQ ID NO: 14) respectivamente. Por lo tanto, un ejemplo preferido de un péptido de unión a fibrinógeno comprende la secuencia de aminoácidos NH²-G (P, H)RX-(SEQ ID NO: 15) en su extremo amino terminal, donde X es cualquier aminoácido y (P, H) significa que ya sea la prolina o la histidina están presentes en esa posición. Preferiblemente, el péptido comprende la secuencia NH²-GPRP-(SEQ ID NO: 16) en su extremo amino terminal.

Preferiblemente, el péptido de unión al fibrinógeno tiene una longitud de 4-30, más preferiblemente de 4-10, residuos de aminoácidos.

El precursor de unión al fibrinógeno no debería unirse al fibrinógeno de manera que las moléculas de fibrinógeno se unen entre sí a través de portadores que tienen precursores de unión al fibrinógeno inmovilizados cuando los portadores están en contacto con el fibrinógeno. Preferiblemente, la constante de disociación del precursor de unión del fibrinógeno para el fibrinógeno es superior a 1 x 10⁶M. El precursor de unión al fibrinógeno puede ser un péptido o un análogo de péptido, pero preferiblemente es un péptido. El precursor de unión al fibrinógeno no debe ser fibrinógeno ni comprender fibrinógeno.

En realizaciones preferidas de la invención, el precursor de unión al fibrinógeno comprende un péptido de unión al fibrinógeno unido en su extremo amino terminal a un componente de bloqueo (preferiblemente un péptido) que bloquea o inhibe (es decir, reduce) la unión de fibrinógeno al péptido de unión al fibrinógeno. La escisión del precursor de unión al fibrinógeno por un agente de conversión (preferiblemente un factor de coagulación tal como trombina) expone el péptido de unión a fibrinógeno unido al portador, convirtiendo así el precursor de unión al fibrinógeno en una unidad estructural de unión a fibrinógeno. En tales realizaciones, el componente de bloqueo bloquea o inhibe la capacidad del péptido de unión al fibrinógeno para unirse al fibrinógeno hasta que se produce la escisión. Preferiblemente, el componente de bloqueo es un péptido de 1-30 residuos de aminoácidos de longitud.

Se apreciará que en tales realizaciones el precursor de unión al fibrinógeno debería comprender un sitio de escisión que sea reconocido específicamente por el agente de conversión y que esté ubicado entre el péptido de unión al fibrinógeno y el componente de bloqueo. La trombina es un agente de conversión preferido. Sin embargo, se pueden usar otras serina proteasas o factores de coagulación para escindir el precursor de unión al fibrinógeno. Se sabe que la trombina escinde los enlaces peptídicos carboxi terminales con los residuos de arginina, y comúnmente entre los residuos de arginina y glicina.

En realizaciones particularmente preferidas de la invención, el precursor de unión al fibrinógeno es un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos NH²-ZYXR/GPRP-(SEQ ID NO: 17) en su extremo amino terminal, donde "/' representa un sitio de escisión de trombina, y X es cualquier aminoácido, pero es preferiblemente prolina, Y es cualquier aminoácido, pero es preferiblemente ácido aspártico o alanina, y Z es al menos un aminoácido que es preferiblemente leucina o prolina. Ejemplos son: NH²-LVPR/GPRP-(SEQ ID NO: 18), NH²-ADPR/GPRP-(SEQ ID NO: 19), NH²-LDPR/GPRP-(SEQ ID NO: 20), o NH²-LVPR/GPRV-(SEQ ID NO: 21).

Las unidades estructurales o precursores de unión al fibrinógeno se pueden unir al portador por cualquier medio apropiado, pero normalmente se unen covalentemente. Ejemplos de enlaces covalentes preferidos son un enlace disulfuro, un enlace tioéter o un enlace amida. Un enlace covalente apropiado se puede formar cuando las unidades estructurales o precursores de unión al fibrinógeno son péptidos que comprenden una cisteína y el portador comprende un grupo reactivo con tiol. Esto permite que el péptido se una al portador uniendo el grupo -SH de la cisteína al grupo reactivo con tiol en el portador. Preferiblemente, se incorpora un grupo cisteína terminal en el péptido de unión a fibrinógeno o péptido precursor para reticular el péptido con un grupo reactivo con tiol en el portador. Alternativamente, se puede formar un enlace covalente cuando la fracción de unión al fibrinógeno o precursor es un péptido que comprende un grupo maleimida (preferiblemente en su terminal carboxi, por ejemplo unido a una lisina carboxi-terminal del péptido), y el portador comprende un grupo sulfhidrilo. A continuación, el péptido se puede unir al portador haciendo reaccionar el grupo maleimida del péptido con el grupo sulfhidrilo del portador.

Por lo general, se requerirá un espaciador entre las unidades estructurales o precursores de unión al fibrinógeno y el portador para asegurar que la actividad de unión al fibrinógeno de las unidades estructurales de unión al fibrinógeno (si es necesario una vez convertidos a partir de los precursores de unión al fibrinógeno) no se vea afectada negativamente por el portador. Los espaciadores apropiados son péptidos o no péptidos tales como polietilenglicol.

Cuando las unidades estructurales o precursores de unión al fibrinógeno son péptidos que comprenden un péptido que se une al fibrinógeno, y las unidades estructurales o precursores se unen al portador insoluble mediante un residuo de aminoácido terminal, una secuencia espaciadora está presente preferiblemente entre el residuo de aminoácido terminal y el péptido de unión al fibrinógeno de las unidades estructurales o precursores. La secuencia espaciadora puede tener, por ejemplo, desde 1-20, preferiblemente 5-20, unidades estructurales de aminoácidos de longitud. Se prefiere la secuencia espaciadora GGGGGG (SEQ ID NO: 22) o GGGGG (SEQ ID NO: 23).

Se apreciará que el número de unidades estructurales o precursores de unión al fibrinógeno por portador y las cantidades relativas de portador (con una pluralidad de unidades estructurales o precursores de unión al fibrinógeno por portador) y fibrinógeno requeridos para la formación óptima de biogel (o adhesivo de tejido) pueden varían con diferentes preparaciones de portador y fibrinógeno. De acuerdo con lo anterior, puede ser necesario o deseable probar cada nuevo lote de portador o fibrinógeno para determinar las cantidades relativas óptimas de portador y fibrinógeno para usar para la formación de biogel.

Preferiblemente, cada portador tiene un promedio de al menos cinco unidades estructurales o precursores de unión al fibrinógeno por portador. En teoría, no existe un límite superior para el número de unidades estructurales o precursores de unión al fibrinógeno por portador. Es probable que el número óptimo dependa de muchos factores, tales como la naturaleza del portador y el número de grupos reactivos en cada portador para unir los precursores o unidades estructurales de unión al fibrinógeno. Sin embargo, se prefiere que cada portador tenga un promedio de hasta 100 unidades estructurales o precursores de unión al fibrinógeno por portador. Un intervalo preferido es 10-20 unidades estructurales o precursores de unión al fibrinógeno por portador.

Preferiblemente, la cantidad de fibrinógeno usada es tal que hay al menos una cuarta parte (preferiblemente al menos la mitad) del número de moles de fibrinógeno presentes en comparación con el número de moles de precursor o unidad estructural de unión al fibrinógeno. Preferiblemente, el número de moles de fibrinógeno en relación con el número de moles de precursor o unidad estructural de unión al fibrinógeno está en el intervalo de 1: 4 a 4: 1.

Se pueden usar medidas oscilatorias dinámicas para evaluar las propiedades viscoelásticas de un biogel formado según la invención. El módulo de almacenamiento (G') y el módulo de pérdida (G") en los sólidos viscoelásticos miden la energía almacenada, que representa la parte elástica, y la energía disipada como calor, que representa la porción viscosa. Tan delta es la proporción del módulo de pérdida (G") al módulo de almacenamiento (G'). Por lo tanto, es una cuantificación de las contribuciones elásticas y viscosas, donde un valor por encima de 1 es indicativo de un comportamiento viscoso similar a un líquido, y un valor por debajo de 1 significa un comportamiento elástico. Los biogeles de la invención tienen preferiblemente un valor tan delta de menos de 1. Esto proporciona una indicación de que los componentes del gel están reticulados. La tan delta puede determinarse a una frecuencia de 1 Hz y una deformación constante del 1%. Los métodos apropiados para medir la tan delta se describen con más detalle en los siguientes ejemplos.

Los componentes de un kit de la invención se pueden almacenar por separado entre sí, o algunos o todos los componentes del kit se pueden almacenar juntos siempre que los componentes almacenados juntos no reaccionen entre sí. Para las realizaciones de la invención en las que el kit comprende portadores con unidades estructurales de unión al fibrinógeno inmovilizadas, se apreciará que el fibrinógeno se debe almacenar por separado de los portadores para que no reaccione con los portadores. Una ventaja importante de los kits de la invención que comprenden fibrinógeno y portadores con precursores de unión al fibrinógeno inmovilizados que no se unen al fibrinógeno es que los portadores y el fibrinógeno se pueden almacenar juntos.

Los componentes de un kit de la invención se pueden almacenar por separado entre sí en un dispositivo (por ejemplo, una jeringa) para la administración de los componentes a un tejido u otro sitio. El dispositivo se puede disponer de modo que los componentes entren en contacto entre sí a medida que se administran en el tejido u otro sitio.

Un kit de la invención puede incluir instrucciones sobre cómo usar los componentes del kit para producir un biogel o adhesivo tisular.

Los kits de la invención tienen la ventaja de que no se requieren agentes tóxicos, el biogel (o adhesivo tisular) es sencillo de producir usando los componentes de los kits y los componentes se pueden almacenar fácilmente en una condición estable. También se apreciará que no es necesario que esté presente trombina (u otras enzimas) para la formación de un biogel o adhesivo tisular usando un kit de la invención. Los kits de la invención que no incluyen trombina son particularmente ventajosos porque el riesgo de reacción alérgica a un biogel o adhesivo tisular formado usando tales kits se reduce en comparación con el biogel o adhesivo tisular formado usando trombina exógena. Una ventaja adicional de los kits de la invención que no incluyen trombina (u otras enzimas) es que no es necesario almacenar los componentes del kit en condiciones que preserven la actividad enzimática.

Según algunas realizaciones de la invención, los precursores de unión al fibrinógeno se pueden convertir en unidades estructurales de unión al fibrinógeno mediante un agente de conversión que está presente en un sitio al que se administran portadores que tienen precursores de unión al fibrinógeno inmovilizados. Esto tiene la ventaja de que no es necesario que el agente de conversión forme parte del kit. En consecuencia, no es necesario almacenar los componentes del kit en condiciones que preserven la actividad del agente de conversión.

Preferiblemente, el agente de conversión es un agente para el sitio de la herida. El término "agente del sitio de la herida" se usa en este documento con el significado de un agente que está presente en el sitio de la herida. En una realización preferida, el agente del lugar de la herida es un factor de coagulación. Los ejemplos de factores de coagulación apropiados incluyen trombina, Factor Vila, Factor Xa o Factor Xla. Preferiblemente, el factor de coagulación es trombina.

Según otras realizaciones, un kit de la invención puede comprender además un agente de conversión para convertir los precursores de unión al fibrinógeno en unidades estructurales de unión al fibrinógeno. El agente de conversión debe estar separado del portador. En tales realizaciones, el agente de conversión puede ser un agente que no se espera que esté presente en un sitio al que se van a administrar los portadores. Alternativamente, el agente de conversión puede ser un agente que esté presente en un sitio en el que se administran los portadores. El agente de conversión puede ser un factor de coagulación, como trombina, Factor Vila, Factor Xa o Factor Xla.

Un kit de la invención que comprende portadores con unidades estructurales de unión al fibrinógeno inmovilizadas puede comprender además un factor de coagulación. Un kit de la invención que comprende precursores de unión al fibrinógeno que se pueden convertir en unidades estructurales de unión al fibrinógeno mediante un factor de coagulación puede comprender un factor de coagulación que no convierte los precursores de unión al fibrinógeno en unidades estructurales de unión al fibrinógeno. En tales realizaciones, el factor de coagulación (que no convierte los precursores de unión al fibrinógeno) se puede proporcionar como un componente separado del kit, o con el portador y/o fibrinógeno. El factor de coagulación se puede inmovilizar en el portador, por ejemplo acoplado a cada precursor de unión al fibrinógeno.

Cuando un kit de la invención comprende un factor de coagulación (por ejemplo, trombina), este es preferiblemente un factor de coagulación que es de secuencia humana, en lugar de no humano (tal como un factor de coagulación bovino) para reducir el riesgo de reacción alérgica al factor de coagulación.

Se puede formar un biogel o adhesivo tisular de la invención antes de ser administrado en un sitio de tejido, o in situ en un sitio de tejido, por ejemplo en un sitio de herida. El biogel o adhesivo tisular en un sitio de tejido comprende preferiblemente un portador administrado por vía tópica.

Se apreciará que la trombina puede estar presente en un sitio de tejido en el que se administra o forma un biogel o adhesivo de tejido de la invención. Por ejemplo, si el sitio del tejido es un sitio de herida sangrante, es probable que haya trombina del hospedador en el sitio de la herida. Por supuesto, la trombina puede estar presente de forma alternativa o adicional si se proporciona con un kit de la invención.

El uso de unidades estructurales de unión al fibrinógeno que se pueden unir al fibrinógeno y por separado al monómero de fibrina y/o fibrina puede ser ventajoso si el biogel o adhesivo de la invención se forma en presencia de trombina, o entra en contacto con la trombina una vez que se forma. Si la trombina está presente con fibrinógeno y portadores que tienen unidades estructurales de unión al fibrinógeno inmovilizadas, la trombina convertirá al menos parte del fibrinógeno en monómero de fibrina. Se apreciará que en estas condiciones, se prefiere que las unidades estructurales de unión al fibrinógeno también se unan a monómeros de fibrina de modo que los monómeros de fibrina formados por trombina se puedan unir entre sí a través de los portadores.

Si el biogel o adhesivo de la invención entra en contacto con la trombina una vez que se forma, puede ser ventajoso si el fibrinógeno unido a las unidades estructurales de unión al fibrinógeno se pueda convertir en monómero de fibrina y las unidades estructurales de unión al fibrinógeno permanezcan unidos al monómero de fibrina. En estas circunstancias, los enlaces no covalentes formados entre fibrinógeno y las unidades estructurales de unión al fibrinógeno no se romperán por la conversión de fibrinógeno en monómero de fibrina. También puede ser ventajoso si al menos algunos de los monómeros de fibrina unidos a las unidades estructurales de unión al fibrinógeno se pueden ensamblar para formar fibrina mientras permanecen unidos a las unidades estructurales de unión al fibrinógeno. En estas circunstancias, el biogel o adhesivo tisular se puede reforzar mediante la formación de fibrina.

Si hay trombina presente (por ejemplo, de un kit de la invención, o trombina del hospedador en el sitio de una herida), se prefiere que los portadores y el fibrinógeno se pongan en contacto entre sí antes de entrar en contacto con la trombina, o que los portadores, el fibrinógeno y la trombina se ponen en contacto entre sí sustancialmente al mismo tiempo.

Aunque es posible que se forme un biogel o adhesivo tisular si la trombina y el fibrinógeno entran en contacto entre sí antes del contacto con los portadores, se espera que esto sea de menor utilidad que un biogel o adhesivo tisular formado al poner en contacto los portadores y el fibrinógeno entre sí antes de la trombina, o al poner en contacto los portadores, fibrinógeno y trombina entre sí sustancialmente al mismo tiempo. Esto se debe a que se espera que la trombina convierta las moléculas de fibrinógeno en monómeros de fibrina que luego se agregarán para formar fibrina insoluble antes del contacto con los portadores. Sin embargo, en algunas circunstancias puede ser apropiado formar un biogel o adhesivo tisular al poner en contacto la trombina y el fibrinógeno antes que los portadores, por ejemplo si la trombina está inactiva hasta o después del contacto con los portadores.

También se proporciona según la invención un método de formación de un biogel, que comprende poner en contacto una pluralidad de portadores solubles con moléculas de fibrinógeno y trombina, en el que una pluralidad de unidades estructurales de unión al fibrinógeno se inmovilizan en cada portador, y cada molécula de fibrinógeno se puede unir a al menos dos unidades estructurales de unión al fibrinógeno, para formar un biogel en el que los monómeros de fibrina se unen entre sí a través de los portadores mediante enlaces no covalentes entre las unidades estructurales de unión al fibrinógeno y los monómeros de fibrina.

El biogel puede comprender o no fibrina. De acuerdo con lo anterior, los monómeros de fibrina pueden ser parte de la fibrina en el biogel, o los monómeros de fibrina pueden no ser parte de la fibrina en el biogel.

También se proporciona según la invención un biogel que comprende monómeros de fibrina y una pluralidad de portadores solubles, teniendo cada portador una pluralidad de unidades estructurales de unión al fibrinógeno inmovilizadas en el portador, en el que los monómeros de fibrina se unen entre sí a través de los portadores mediante enlaces no covalentes entre las unidades estructurales de unión al fibrinógeno y los monómeros de fibrina.

Se proporciona además según la invención un biogel que comprende fibrina y una pluralidad de portadores, teniendo cada portador una pluralidad de unidades estructurales de unión al fibrinógeno inmovilizadas en el portador, en el que los monómeros de fibrina de la fibrina se unen covalentemente entre sí mediante enlaces peptídicos y los monómeros de fibrina de la fibrina se unen entre sí a través de los portadores mediante enlaces no covalentes entre las unidades estructurales de unión al fibrinógeno y los monómeros de fibrina.

En un aspecto preferido, el biogel es un adhesivo tisular.

Un kit de la invención puede comprender Factor XIII y opcionalmente iones calcio y trombina para la activación del Factor XIII al Factor Xllla (si es así, los iones calcio y trombina deben estar separados del Factor XIII). Alternativa o adicionalmente, el Factor XIIIa puede estar presente en un sitio de tejido en el que se administra o forma un biogel o adhesivo de tejido de la invención. Por ejemplo, si el sitio del tejido es un sitio de herida sangrante, es probable que el factor XIIIa del hospedador esté presente en el sitio de la herida.

Si el factor XIIIa se pone en contacto con un biogel o adhesivo tisular de la invención que comprende fibrina, el biogel o adhesivo tisular se puede fortalecer más mediante la reacción del factor XIIIa con la fibrina para reticular covalentemente la fibrina.

También se proporciona según la invención un método de formación de un biogel, que comprende: poner en contacto una pluralidad de portadores solubles con moléculas de fibrinógeno y trombina, en el que una pluralidad de unidades estructurales de unión al fibrinógeno está inmovilizada en cada portador, y cada molécula de fibrinógeno se puede unir a al menos dos unidades estructurales de unión al fibrinógeno, para formar un biogel que comprende fibrina en el que los monómeros de fibrina de la fibrina se unen entre sí a través de los portadores mediante enlaces no covalentes entre las unidades estructurales de unión al fibrinógeno y los monómeros de fibrina; y poner en contacto el biogel con Factor XIIIa de modo que los monómeros de fibrina de la fibrina se unen covalentemente entre sí mediante enlaces peptídicos.

Se proporciona además según la invención un biogel que comprende fibrina y una pluralidad de portadores solubles, teniendo cada portador una pluralidad de unidades estructurales de unión al fibrinógeno inmovilizadas en el portador, en el que los monómeros de fibrina de la fibrina se unen covalentemente entre sí mediante enlaces peptídicos y los monómeros de fibrina de la fibrina se unen entre sí a través de los portadores mediante enlaces no covalentes entre las unidades estructurales de unión al fibrinógeno y los monómeros de fibrina.

En un aspecto preferido, el biogel es un adhesivo tisular.

Un kit de la invención puede comprender además un promotor de la cicatrización de heridas. Los ejemplos apropiados incluyen factores de crecimiento, tales como factor de crecimiento derivado de plaquetas. El promotor puede ser un componente separado del kit o inmovilizado en el portador. Un kit de la invención puede comprender además un agente antimicrobiano, por ejemplo, un antibiótico. El agente antimicrobiano puede ser un componente separado del kit o inmovilizado en el portador.

Se apreciará que si los portadores que tienen una pluralidad de unidades estructurales de unión al fibrinógeno inmovilizadas a cada portador se administran a un sitio de tejido en el que está presente el fibrinógeno del hospedador (por ejemplo, en el sitio de una herida sangrante), los portadores reaccionarán con el fibrinógeno del hospedador para formar un biogel o adhesivo tisular in situ en el sitio del tejido.

De manera similar, si los portadores que tienen una pluralidad de precursores de unión al fibrinógeno inmovilizados a cada portador se administran a un sitio de tejido en el que un agente de conversión para convertir los precursores de unión al fibrinógeno en unidades estructurales de unión al fibrinógeno, y el fibrinógeno del hospedador están presentes (por ejemplo, en un sitio de herida sangrante) los precursores de unión al fibrinógeno se convertirán en unidades estructurales de unión al fibrinógeno, y los portadores reaccionarán entonces con el fibrinógeno del hospedador para formar un biogel o adhesivo tisular in situ en el sitio del tejido. Por ejemplo, los precursores de unión al fibrinógeno se pueden convertir en unidades estructurales de unión al fibrinógeno mediante la trombina del hospedador u otro factor de coagulación.

De acuerdo con lo anterior, se proporciona además según la invención un biogel que comprende portadores administrados por vía tópica, teniendo cada portador una pluralidad de unidades estructurales de unión al fibrinógeno inmovilizadas en el portador, y fibrinógeno endógeno, en el que cada molécula de fibrinógeno endógeno está unida al menos a dos unidades estructurales de unión al fibrinógeno, de modo que las moléculas de fibrinógeno se unen entre sí a través de los portadores mediante enlaces no covalentes entre las unidades estructurales de unión al fibrinógeno y las moléculas de fibrinógeno endógeno.

El término "fibrinógeno endógeno" se usa en este documento para significar que el fibrinógeno es fibrinógeno hospedador, que está presente en un sitio en el que se administran los portadores. Por lo general, el fibrinógeno del hospedador estará presente porque la sangre del hospedador está presente en el sitio de la herida.

También se describe el uso de un portador para la formación de un biogel, teniendo el portador una pluralidad de unidades estructurales de unión al fibrinógeno o precursores de unión al fibrinógeno inmovilizados en el portador.

El biogel es preferiblemente un adhesivo tisular.

El portador se puede usar para la formación de un biogel o adhesivo tisular para hemostasia, como sellante, para administración localizada de fármacos o para ingeniería tisular.

La administración de un portador para formar un biogel o adhesivo tisular tiene la ventaja de que se minimiza el riesgo de reacción alérgica del hospedador porque no hay necesidad de fibrinógeno o trombina exógenos, no se requieren agentes tóxicos y el portador se puede almacenar fácilmente en una condición estable.

También se describe un método de control del sangrado en un sitio en el que está presente el fibrinógeno del hospedador, que comprende administrar por vía tópica una pluralidad de portadores en el sitio, en el que cada portador tiene una pluralidad de unidades estructurales de unión al fibrinógeno inmovilizadas en el portador y a las moléculas de fibrinógeno hospedador en el sitio se pueden unir al menos a dos de las unidades estructurales de unión al fibrinógeno.

También se describe un método de control del sangrado en un sitio en el que está presente el fibrinógeno del hospedador y el factor de coagulación, que comprende administrar por vía tópica una pluralidad de portadores en el sitio, en el que cada portador tiene una pluralidad de precursores de unión al fibrinógeno inmovilizados en el portador y los precursores de unión al fibrinógeno se pueden convertir en unidades estructurales de unión al fibrinógeno mediante el factor de coagulación del hospedador, y las moléculas de fibrinógeno del hospedador en el sitio se pueden unir al menos a dos de las unidades estructurales de unión al fibrinógeno.

Se proporciona además según la invención el uso de una pluralidad de portadores solubles en la fabricación de un biogel para controlar el sangrado, o para tratar o sellar una herida, en el que cada portador tiene una pluralidad de unidades estructurales de unión al fibrinógeno o precursores de unión al fibrinógeno inmovilizados en el portador.

También se proporciona según la invención el uso de una pluralidad de portadores solubles, teniendo cada portador una pluralidad de unidades estructurales de unión al fibrinógeno o precursores de unión al fibrinógeno inmovilizados en el portador, para la formación de un biogel.

Se proporciona además según la invención una pluralidad de portadores solubles para la formación de un biogel para controlar el sangrado, o para tratar o sellar una herida, en el que cada portador tiene una pluralidad de unidades estructurales de unión al fibrinógeno o precursores de unión al fibrinógeno inmovilizados en el portador.

Los portadores son solubles. Los portadores se pueden administrar por vía tópica.

Una formulación tópica preferida del portador que tiene unidades estructurales de unión al fibrinógeno o precursores de unión al fibrinógeno inmovilizados es una formulación líquida, preferiblemente en una solución reguladora isotónica a pH fisiológico.

También se describe una formulación tópica preferida del portador que tiene unidades estructurales de unión al fibrinógeno o precursores de unión al fibrinógeno inmovilizados en forma de un polvo que se puede pulverizar, por ejemplo, en un sitio de tejido.

El portador en polvo se puede formar usando cualquier método apropiado, incluidos los métodos que comprenden el secado por pulverización o la liofilización de una suspensión de portador que tiene una pluralidad de unidades estructurales de unión al fibrinógeno o precursores de unión al fibrinógeno inmovilizados en cada portador (por ejemplo, suspendido en una solución reguladora isotónica a pH fisiológico). Preferiblemente, se usa el secado por pulverización, ya que este puede ser un método de secado más rápido y fácil de escalar que la liofilización. En el documento WO 92/18164 se describen métodos de secado por pulverización apropiados.

Según la invención, se proporciona un agente para la formación de un biogel, comprendiendo el agente un portador soluble, en el que una pluralidad de unidades estructurales de unión al fibrinógeno o una pluralidad de precursores de unión al fibrinógeno, cada uno de los cuales se puede convertir en una unidad estructural de unión al fibrinógeno, están inmovilizados en cada portador.

También se describe un agente para la formación de un biogel, el agente que comprende un portador insoluble que tiene una pluralidad de unidades estructurales de unión al fibrinógeno o precursores de unión al fibrinógeno inmovilizados en cada portador, en el que el agente está en forma de polvo formado de otra manera que no sea por liofilización

También se proporciona según la invención un método de formación de un agente en polvo, comprendiendo el agente un portador insoluble que tiene una pluralidad de unidades estructurales de unión al fibrinógeno o precursores de unión al fibrinógeno inmovilizados en cada portador, en el que el método comprende secar por pulverización una suspensión del agente.

Preferiblemente, el agente es apropiado para administración tópica. Si el agente comprende un portador soluble con una pluralidad de precursores de unión al fibrinógeno inmovilizados en cada portador, el agente puede ser apropiado para la administración intravenosa.

El portador o agente se puede proporcionar como un componente de un kit. El kit puede comprender además un factor de coagulación, un promotor de la cicatrización de heridas o un agente antimicrobiano. El factor de coagulación, promotor de la cicatrización de heridas o agente antimicrobiano puede ser un componente separado del kit o inmovilizado en el portador. En algunas realizaciones preferidas, el factor de coagulación, el promotor de la cicatrización de heridas o el agente antimicrobiano pueden ser parte del precursor de unión al fibrinógeno de manera que se libera cuando el precursor de unión al fibrinógeno se convierte en una unidad estructural de unión al fibrinógeno. Un kit de la invención puede ser un kit compartimentado en el que los componentes del kit que se desean mantener separados entre sí están contenidos en compartimentos o recipientes separados. Un kit de la invención puede incluir instrucciones para usar los componentes del kit para llevar a cabo un método de la invención.

El biogel o adhesivo tisular de la invención se puede administrar por vía tópica en un sitio de tejido, por ejemplo, en la piel o en el tejido de las mucosas. El biogel o adhesivo tisular de la invención se puede usar para la hemostasia, como sellante, para la administración localizada de fármacos o para la ingeniería tisular.

El biogel o adhesivo tisular de la invención se puede administrar formando el gel o adhesivo antes de poner en contacto el gel o adhesivo con el sitio de administración, o formando el biogel o adhesivo tisular en el sitio de administración. También se ha apreciado que un agente que comprende un portador soluble, en el que una pluralidad de precursores de unión al fibrinógeno, cada uno de los cuales se puede convertir en una unidad estructural de unión al fibrinógeno, se inmoviliza en cada portador se puede administrar por vía intravenosa, por ejemplo, para controlar el sangrado o para la administración de fármacos. Una formulación intravenosa preferida es una solución isotónica acuosa al 20%. En una realización preferida, los precursores de unión al fibrinógeno se pueden convertir mediante trombina.

También se describe un método de control del sangrado, que comprende la administración intravenosa de un agente que comprende un portador soluble, en el que una pluralidad de precursores de unión al fibrinógeno, cada uno de los cuales se puede convertir en una unidad estructural de unión a fibrinógeno, se inmoviliza en cada portador.

También se describe un método de administración de un fármaco a un sujeto, que comprende administrar por vía intravenosa un agente que comprende un portador soluble al sujeto, en el que una pluralidad de precursores de unión al fibrinógeno, cada uno de los cuales se puede convertir en una unidad estructural de unión al fibrinógeno, se inmoviliza en cada portador, y en el que el portador comprende un fármaco o un fármaco está inmovilizado en el portador.

Por supuesto, las formulaciones tópicas o intravenosas deben ser estériles.

El biogel o adhesivo tisular de la invención puede comprender además un promotor de la cicatrización de heridas o un agente antimicrobiano.

También se describe un método de control del sangrado, que comprende la administración tópica de biogel o adhesivo tisular de la invención en un sitio de sangrado.

También se describe un método de tratamiento o sellado de una herida, que comprende administrar (preferiblemente por vía tópica) un biogel o adhesivo tisular de la invención en un sitio de la herida.

También se proporciona según la invención un biogel o adhesivo tisular de la invención para su uso como medicamento.

Se proporciona además según la invención el uso de un biogel o adhesivo tisular de la invención en la fabricación de un medicamento para controlar el sangrado o para tratar o sellar una herida.

También se proporciona según la invención un biogel o adhesivo tisular de la invención para controlar el sangrado o para tratar o sellar una herida.

El uso de un biogel o adhesivo tisular de la invención puede ser un uso tópico. Cuando el biogel o adhesivo tisular se forma con un portador soluble y unidades estructurales de unión al fibrinógeno convertidos a partir de precursores de unión al fibrinógeno, el uso puede ser intravenoso.

Las realizaciones preferidas de la invención se describen ahora solo a modo de ejemplo.

Según una primera realización preferida de la invención, una pluralidad de péptidos, cada uno de los cuales comprende una secuencia de unión al fibrinógeno en el extremo amino-terminal (por ejemplo, péptidos de secuencia GPRPGGGGGGC (SEQ ID NO: 24)) están unidos en sus extremos carboxi-terminales a un portador, que es una proteína soluble (tal como la albúmina). Se forma un biogel al poner en contacto el portador ligado a péptidos con fibrinógeno. A continuación, el biogel se puede administrar por vía tópica como un apósito para una herida.

Según una segunda realización preferida de la invención, el portador ligado a péptidos de la primera realización preferida y el fibrinógeno se mezclan en el sitio de la herida para formar un biogel in situ.

Según una tercera realización preferida de la invención, el portador ligado a péptidos de la primera realización preferida se administra a un sitio de la herida en el que está presente fibrinógeno de la sangre del hospedador para formar un biogel in situ.

Según una cuarta realización preferida de la invención, una pluralidad de péptidos, cada uno de los cuales comprende una secuencia de unión al fibrinógeno acoplada en su extremo amino terminal a una secuencia de péptido de bloqueo (por ejemplo, péptidos de secuencia LVPRGPRPGGGGGGC (SEQ ID NO: 25)), están unidos en sus extremos carboxiterminales a un portador, que es una proteína soluble (tal como la albúmina). El portador ligado a péptidos se puede combinar con fibrinógeno y luego aplicarse a una herida como una sola mezcla. La trombina del hospedador presente en el sitio de la herida escinde los péptidos para liberar los péptidos de bloqueo y exponer la secuencia de unión del fibrinógeno. El portador con la secuencia de unión al fibrinógeno expuesta reacciona con el fibrinógeno para formar un biogel in situ.

Alternativamente, el portador ligado a péptidos de la cuarta realización preferida se puede administrar por vía intravenosa. La trombina del hospedador en el sitio de una herida escinde los péptidos para liberar los péptidos de bloqueo y exponer la secuencia de unión del fibrinógeno. El portador con secuencias de unión al fibrinógeno expuestas reacciona con el fibrinógeno del hospedador para controlar el sangrado en el sitio de la herida.

El biogel de las cuatro realizaciones preferidas descritas anteriormente puede ser un adhesivo tisular.

Se puede usar polietilenglicol (PEG) ramificado o cualquier otro polímero biocompatible en lugar del portador de proteína soluble en cualquiera de las realizaciones preferidas anteriores.

Se puede inmovilizar un factor de coagulación al portador en cualquiera de las realizaciones preferidas anteriores, siempre que cuando los precursores de unión al fibrinógeno estén inmovilizados en el portador, el factor de coagulación no convertirá los precursores de unión al fibrinógeno en unidades estructurales de unión al fibrinógeno.

El portador puede comprender además un promotor de la cicatrización de heridas (por ejemplo, un factor de crecimiento tal como factor de crecimiento derivado de plaquetas) en cualquiera de las realizaciones preferidas anteriores.

Otras realizaciones preferidas de la invención se describen en los siguientes ejemplos con referencia a los dibujos adjuntos en los que:

Figura 1 que muestra esquemáticamente: (a) un portador de albúmina que tiene una pluralidad de péptidos de unión a fibrinógeno inmovilizados en el portador; (b) una molécula de fibrinógeno; y (c) un biogel en el que las moléculas de fibrinógeno se unen entre sí a través de los portadores mediante enlaces no covalentes entre los péptidos de unión al fibrinógeno y las moléculas de fibrinógeno;

La figura 2 muestra un gráfico del módulo de almacenamiento (cuadrados) y de pérdida (triángulos) frente al porcentaje de deformación en una mezcla de 25 ul de HSA modificada con péptidos y fibrinógeno a 32 mg/ml a 20 °C (A) y 37 °C (B);

La figura 3 muestra el módulo de almacenamiento (cuadrados) y la viscosidad compleja (triángulos) frente a la frecuencia a 20 °C (con una amplitud de deformación del 1%), para 25 ul de HSA modificada con péptidos mezclada con fibrinógeno a 32 mg/ml; y

La figura 4 muestra una fotografía de una solución de fibrinógeno antes (a) y después (b) de la adición de HSA modificada con péptido.

Ejemplo 1

Formación de un biogel o adhesivo tisular usando fibrinógeno y péptidos de unión a fibrinógeno inmovilizados en un portador que comprende albúmina de suero humano.

Se hizo reaccionar albúmina de suero humano (HSA) con un exceso molar de 40 veces del enlazante succinimidil-4-(N-maleimidometil) ciclohexano-1-carboxilato (SMCC) a pH 7.4. Se purificó la proteína modificada (HSA-SMCC) y se determinó que, en promedio, se modificó un mol de HSA con 18 moles de SMCC. Se agregó péptido ya sea GPRPGGGGGGC (B10; SEQ ID NO: 24) o LVPRGPRPGGGGGGC (TC-15; SEQ ID NO: 25) a HSA-SMCC en un exceso de 1.5 moles en relación con las unidades estructurales de maleimida. A continuación, la proteína HSA modificada con péptidos se purificó a partir del péptido sin reaccionar y se almacenó a -80 °C a 7 mg/ml. El fibrinógeno humano liofilizado se solubilizó en agua a 16 mg/ml como lo describe el proveedor (Scottish National Blood Transfusion service).

Se agregó HSA modificada con péptidos (5 |il) a 0.3 ml de solución de fibrinógeno, se observó un gel instantáneo para B10-HSA mientras que para TC-15 no se observó gel. Se sabe que la secuencia del péptido GPRP expuesta se une al bolsillo "a" dentro de la región carbonilo de los dos dominios distales (D) del fibrinógeno (Figura 1b). Se cree que la HSA modificada con múltiples secuencias de GPRP expuestas (B10) actúa como un punto de ramificación para la polimerización del fibrinógeno (Figura 1c). El gel se forma en ausencia de trombina.

Métodos para los ejemplos 2-5

Síntesis de HSA modificada con péptidos

Se hizo reaccionar albúmina de suero humano (HSA) a 10 mg/ml con un exceso molar de 5, 10, 20 o 40 veces del enlazante sulfosuccinimidil-4-(N-maleimidometil) ciclohexano-1-carboxilato (Sulfo-SMCC) a pH 7.4 con un volumen total de 0.7 ml. La proteína modificada (HSA-SMCC) se purificó mediante una columna Zebra™ Desalt Spin Column (Pierce, Rockford, IL) y se determinó que en promedio un mol de HSA se modificó con 5, 8, 16 o 18 moles de Sulfo-SMCC, respectivamente. Para determinar el número de grupos maleimida unidos por molécula de HSA, se incubó una muestra de 3 nmoles de HSA con una cantidad conocida de cisteína (100 nmoles) en solución reguladora a temperatura ambiente durante 30 min. La cisteína restante se hizo reaccionar luego con 1 mmol de 5, 5-ditiobis(2-nitrobenzoato) (DTNB) durante 20 min y se midió a A⁴¹². El nivel de maleimida se calculó comparando la absorbancia de las muestras de control y de proteína. Se agregó péptido ya sea GPRPGGGGGGC (B10; SEQ ID NO: 24) o LVPRGPRPGGGGGGC (TC-15; SEQ ID NO: 25) a HsA-SMCC en un exceso de 1.5 moles en relación con las unidades estructurales de maleimida. Después, la proteína HSA modificada con péptidos se purificó a partir del péptido sin reaccionar usando una columna Zebra™ Desalt Spin Column (Pierce, Rockford, IL) y se almacenó a -80 °C a 7 mg/ml. Se solubilizó fibrinógeno humano liofilizado (Scottish National Blood Transfusion Service, Edimburgo, Escocia) en agua a 8, 16, 32 y 64 mg/ml. La concentración de fibrinógeno y albúmina se determinó a partir de la absorbancia a 280 nm (A²⁸⁰) usando un factor de conversión de 1% de fibrinógeno E²⁸⁰= 15 y 1% de HSA E²⁸⁰= 13.8

Caracterización reológica

Se usaron medidas oscilatorias dinámicas para evaluar las propiedades viscoelásticas de los geles. La mezcla se dejó equilibrar a temperatura ambiente durante la noche y el gel se transfirió a la placa inferior de un reómetro Physica MCR-501 (Anton Paar, Alemania) con un cono y una placa de 25 mm de diámetro y un ángulo de cono de 1°. Las pruebas se realizaron a 20 o 37± °C en una atmósfera humidificada. Los barridos de frecuencia se realizaron entre 0.01 y 50 Hz con una amplitud de deformación constante del 1%. Los parámetros reológicos examinados se procesaron con el software dedicado Anton Paar que se proporciona con el reómetro.

Ejemplo 2 Influencia tanto de la cantidad de HSA modificada con péptidos como de la concentración de fibrinógeno en la formación de gel

La polimerización de fibrinógeno se controló inicialmente visualmente después de mezclar fibrinógeno con soluciones de HSA. Se conjugó HSA modificada con péptidos, modificada con 5, 8, 16 o 18 moles de péptido de unión a fibrinógeno con un mol de HSA. Se mezcló una muestra de 25 ul de HSA modificada con péptidos o HSA sin modificar con 0.2 ml de fibrinógeno a 8, 16, 32 o 64 mg/ml. La formación de un gel se determinó visualmente después de 0.5 horas a temperatura ambiente. Para HSA no modificada o HSA modificada con 5 u 8 moles de péptido no se observó formación de gel en todas las concentraciones de fibrinógeno probadas. La polimerización solo se observó a 32 o 64 mg/ml de fibrinógeno con HSA modificada con péptidos con 16 o 18 moles de péptido de unión.

La figura 4 muestra una fotografía de la solución de fibrinógeno (0.2 ml, 32 mg/ml de fibrinógeno) antes (a) y después (b) de la adición de HSA modificada con péptidos (25 |il, 18 moles de péptido). El biogel formado según la invención se muestra en (b).

Ejemplo 3 Influencia de la cantidad de HSA modificada con péptidos

Para determinar el efecto de la cantidad de HSA modificada con péptidos y fibrinógeno sobre las propiedades reológicas de las mezclas, se determinaron las medidas de resistencia al cizallamiento con 25 o 50 ul de HSA modificada con péptidos con fibrinógeno a 32 y 64 mg/ml. Para este experimento se usó HSA modificada con péptidos que se modificó con 16 moles de péptido de unión por mol de HSA. Para asegurar que los experimentos oscilatorios dinámicos se realizaron dentro del límite de deformación viscoelástica lineal del gel, se realizó un barrido de deformación. La figura 2 muestra los barridos de deformación a 20 y 37 °C para 25 ul de HSA modificada con péptidos mezclada con fibrinógeno a 32 mg/ml. Tanto el módulo de almacenamiento (G') como el módulo de pérdida (G") parecían estables en el intervalo y se seleccionó una deformación constante del 1% en este intervalo de deformación viscoelástica lineal. Los barridos de frecuencia demostraron un valor G' que era mayor que G", que es indicativo de una red reticulada (Tabla 1). Los valores que se muestran en esta tabla se toman a una frecuencia de 1 Hz. Tan delta es la proporción entre el módulo de pérdida y el módulo de almacenamiento. Por lo tanto, es una cuantificación de las contribuciones elásticas y viscosas, donde un valor por encima de 1 es indicativo de un comportamiento viscoso similar a un líquido y por debajo de 1 significa un comportamiento elástico. La viscosidad compleja r*, definida como el módulo complejo G* dividido por la frecuencia angular (o), se determinó en las mismas condiciones. En estas condiciones, parece que la cantidad tanto de HSA modificada con péptidos como de fibrinógeno no influye mucho en la resistencia mecánica del gel.

Tabla 1:

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un kit para la formación de un biogel, que comprende:

a) una pluralidad de portadores solubles, teniendo cada portador una pluralidad de unidades estructurales de unión al fibrinógeno inmovilizadas en el portador; y, por separado, fibrinógeno, en el que cada molécula de fibrinógeno se puede unir a al menos dos unidades estructurales de unión al fibrinógeno; o

b) una pluralidad de portadores solubles, teniendo cada portador una pluralidad de precursores de unión al fibrinógeno inmovilizados en el portador, en el que cada precursor de unión al fibrinógeno se puede convertir en una unidad estructural de unión al fibrinógeno; y fibrinógeno, en el que cada molécula de fibrinógeno se puede unir a al menos dos unidades estructurales de unión al fibrinógeno.

2. Un kit según la reivindicación 1, en el que el portador comprende un polímero biocompatible.

3. Un agente para la formación de un biogel, el agente que comprende portadores solubles, en el que una pluralidad de unidades estructurales de unión al fibrinógeno, o una pluralidad de precursores de unión al fibrinógeno, cada uno de los cuales se puede convertir en una unidad estructural de unión al fibrinógeno, se inmovilizan en cada portador.

4. Un biogel que comprende:

a) moléculas de fibrinógeno y una pluralidad de portadores solubles, en el que cada portador tiene una pluralidad de unidades estructurales de unión al fibrinógeno inmovilizadas en el portador, y cada molécula de fibrinógeno está unida a al menos dos unidades estructurales de unión al fibrinógeno, de modo que las moléculas de fibrinógeno se unen entre sí a través de los portadores mediante enlaces no covalentes entre las unidades estructurales de unión al fibrinógeno y las moléculas de fibrinógeno.

b) monómeros de fibrina y una pluralidad de portadores solubles, en los que cada portador tiene una pluralidad de unidades estructurales de unión al fibrinógeno inmovilizadas en el portador, y los monómeros de fibrina se unen entre sí a través de los portadores mediante enlaces no covalentes entre las unidades estructurales de unión al fibrinógeno y los monómeros de fibrina; o

c) fibrina y una pluralidad de portadores solubles, teniendo cada portador una pluralidad de unidades estructurales de unión al fibrinógeno inmovilizadas en el portador, en el que los monómeros de fibrina de la fibrina se unen covalentemente entre sí mediante enlaces peptídicos y los monómeros de fibrina de la fibrina se unen entre sí a través de los portadores mediante enlaces no covalentes entre las unidades estructurales de unión al fibrinógeno y los monómeros de fibrina.

5. Un método de formación de un biogel, que comprende:

a) poner en contacto las moléculas de fibrinógeno con una pluralidad de portadores solubles, en el que cada portador tiene una pluralidad de unidades estructurales de unión al fibrinógeno inmovilizadas en el portador, y cada molécula de fibrinógeno se puede unir a al menos dos unidades estructurales de unión al fibrinógeno, de modo que las moléculas de fibrinógeno se unen entre sí a través de los portadores mediante la formación de enlaces no covalentes entre las unidades estructurales de unión al fibrinógeno y las moléculas de fibrinógeno;

b) proporcionar una pluralidad de portadores solubles, comprendiendo cada portador una pluralidad de precursores de unión al fibrinógeno inmovilizados en el portador; convertir los precursores de unión al fibrinógeno en unidades estructurales de unión al fibrinógeno; y poner en contacto las moléculas de fibrinógeno con las unidades estructurales de unión al fibrinógeno, en el que cada molécula de fibrinógeno se puede unir a al menos dos unidades estructurales de unión al fibrinógeno, de modo que las moléculas de fibrinógeno se unen entre sí a través de los portadores mediante la formación de enlaces no covalentes entre las unidades estructurales de unión al fibrinógeno y las moléculas de fibrinógeno;

c) poner en contacto una pluralidad de portadores solubles con moléculas de fibrinógeno y trombina, en el que una pluralidad de unidades estructurales de unión al fibrinógeno se inmovilizan en cada portador, y cada molécula de fibrinógeno se puede unir a al menos dos unidades estructurales de unión al fibrinógeno, para formar un biogel en el que los monómeros de fibrina se unen entre sí a través de los portadores mediante enlaces no covalentes entre las unidades estructurales de unión al fibrinógeno y los monómeros de fibrina; o

d) poner en contacto una pluralidad de portadores solubles con moléculas de fibrinógeno y trombina, en el que una pluralidad de unidades estructurales de unión al fibrinógeno se inmovilizan en cada portador, y cada molécula de fibrinógeno se puede unir a al menos dos unidades estructurales de unión al fibrinógeno, para formar un biogel que comprende fibrina en el que los monómeros de fibrina de la fibrina se unen entre sí a través de los portadores mediante enlaces no covalentes entre las unidades estructurales de unión al fibrinógeno y los monómeros de fibrina; y poner en contacto el biogel con Factor XIIIa de modo que los monómeros de fibrina de la fibrina se unen covalentemente entre sí mediante enlaces peptídicos.

6. Un método de formación de un agente en polvo para su uso en la formación de un biogel, comprendiendo el agente un portador que tiene una pluralidad de unidades estructurales de unión al fibrinógeno o precursores de unión al fibrinógeno inmovilizados en cada portador, en el que el método comprende secar por pulverización una suspensión del agente.

7. Uso de una pluralidad de portadores solubles, teniendo cada portador una pluralidad de unidades estructurales de unión al fibrinógeno o precursores de unión al fibrinógeno inmovilizados en el portador, para la formación de un biogel.

8. Un biogel según la reivindicación 4, o un agente según la reivindicación 3, para su uso como medicamento.

9. Un biogel según la reivindicación 4, o un agente según la reivindicación 3, para su uso en el control del sangrado o para tratar o sellar una herida.

10. Uso de un biogel según la reivindicación 4, o un agente según la reivindicación 3, en la fabricación de un medicamento para controlar el sangrado o para tratar o sellar una herida.

11. Uso de una pluralidad de portadores solubles en la fabricación de un biogel para controlar el sangrado, o para tratar o sellar una herida, en el que cada portador tiene una pluralidad de unidades estructurales de unión al fibrinógeno o precursores de unión al fibrinógeno inmovilizados en el portador.

12. Una pluralidad de portadores solubles para la formación de un biogel para su uso en el control del sangrado o para tratar o sellar una herida, en el que cada portador tiene una pluralidad de unidades estructurales de unión al fibrinógeno o precursores de unión al fibrinógeno inmovilizados en el portador.