ES2868782T3 - Dispositivo de PCR digital - Google Patents

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Abstract

Un dispositivo de PCR digital (10) que comprende: un área de calentamiento discreta (20) hecha de oro dispuesta sobre una superficie (30) que no es eléctricamente conductora, comprendiendo el área de calentamiento discreta (20) una pluralidad de pocillos integrales (29) configurados para contener y dividir una muestra de ADN en su interior; y al menos una traza conductora (40) hecha de oro, configurada para ser conectada a una fuente de tensión de CC (50) y calentar la pluralidad de pocillos integrales (29) a una temperatura uniforme cuando está conectada a la fuente de tensión de CC (50), la al menos una traza conductora (40) dispuesta sobre la superficie (30) en una configuración ondulante al menos parcialmente alrededor del área de calentamiento discreta (20), caracterizado por que cada uno de la pluralidad de pocillos integrales (29) está definido por paredes de pocillo (27) que comprenden un grosor del área de calentamiento discreta (20), y en donde el área de calentamiento discreta (20) no está en contacto eléctricamente conductor con la traza conductora (40).

Description

DESCRIPCIÓN
Dispositivo de PCR digital
Campo de la invención
Esta invención se refiere a un dispositivo de PCR digital.
Antecedentes de la invención
La PCR es un método utilizado habitualmente para hacer múltiples copias de una secuencia de ADN para diversas aplicaciones, tales como la clonación de ADN para secuenciación, el diagnóstico de enfermedades, la identificación de personas a partir de muestras de ADN y la realización de análisis funcionales de genes. En la PCR, la replicación de la secuencia de ADN se produce en múltiples ciclos térmicos, teniendo cada ciclo normalmente tres etapas principales: desnaturalización, hibridización y extensión. En la etapa de desnaturalización, se calienta una plantilla de ADN bicatenario a aproximadamente 94-98 ° C durante 20-30 segundos para producir ADN monocatenario. En el paso de hibridización, se hibridan cebadores con el ADN monocatenario bajando la temperatura a aproximadamente 50-65 ° C durante 20-40 segundos. En la etapa de extensión, usando una ADN polimerasa (tal como Taq), se sintetiza un nuevo ADN bicatenario extendiendo el cebador que se ha hibridado con el ADN monocatenario a una temperatura de actividad óptima de la ADN polimerasa (75-80 ° C para Taq). Además de las tres etapas principales mencionadas anteriormente, es posible que se requiera una etapa de inicialización si la ADN polimerasa utilizada se activa por calor, y la etapa de extensión final del último ciclo se puede mantener durante un período de tiempo más largo (por ejemplo, 5-15 minutos) para garantizar que no queden fragmentos de ADN monocatenario.
Cualquier dispositivo para realizar PCR debe poder realizar los ciclos térmicos repetidos para que se produzcan las etapas de desnaturalización, hibridación y extensión. Esto implica calentar y enfriar la reacción a las temperaturas requeridas y mantener las temperaturas requeridas durante los períodos de tiempo necesarios. Dado que las temperaturas casi alcanzan y/o superan los 100 ° C, los dispositivos de PCR existentes de microfluidos o de laboratorio en chip suelen requerir un termociclador externo para suministrar el calor necesario, limitando así su portabilidad y su tamaño verdaderos durante el uso.
La replicación del ADN a través de la PCR es exponencial, ya que el nuevo ADN bicatenario formado en un ciclo experimenta desnaturalización, hibridación y extensión en el siguiente ciclo, de manera que cada ciclo duplica eficazmente el número de secuencias de ADN obtenidas. De ahí que el número de ciclos de amplificación por PCR dependa del número de copias del ADN al inicio de la reacción.
Por el contrario, la PCR digital es una forma de PCR donde se puede determinar la cantidad de ADN en la muestra inicial sin depender del número de ciclos de PCR, de modo que la cantidad inicial de ADN se puede cuantificar sin tener que depender de datos exponenciales inciertos. En la PCR digital, una muestra de ADN se divide en múltiples pocillos y la PCR se realiza simultáneamente en todos los pocillos. Se supone que la concentración de ADN dentro de los múltiples pocillos sigue una Distribución de Poisson. Una vez realizada la PCR, cada pocillo indicará ausencia (negativo) o presencia (positivo) de ADN amplificado en el mismo. De este modo, la cuantificación absoluta se puede lograr contando el número de pocillos que muestran un resultado final positivo.
En la actualidad, los sistemas de PCR digitales, como los sistemas de PCR convencionales, también dependen de termocicladores externos para suministrar el calor necesario a cada uno de los pocillos en los que está dividido el ADN, limitando así de manera similar su tamaño y portabilidad. Esto limita la capacidad de los trabajadores sanitarios en muchas partes del mundo para realizar con eficiencia diagnósticos de enfermedades infecciosas importantes para controlar las epidemias, particularmente donde la población está extendida en grandes áreas y el acceso a los equipos de prueba se ve obstaculizado por una infraestructura y redes de transporte deficientes.
Recientemente, se ha desarrollado un calentador de CC que se puede calentar hasta o más de 100 ° C utilizando una tensión de 9 voltios o menos y en donde el calentador de CC tiene una pulgada cuadrada (6,45 cm2) o menos. El calentador de CC comprende un área de calentamiento discreta hecha de un material conductor de calor dispuesto sobre una superficie que no es eléctricamente conductora y al menos una traza conductora configurada para conectarse a una fuente de tensión de CC y calentar el área de calentamiento discreta a una temperatura uniforme cuando se conecta a la fuente de tensión de CC. La al menos una traza conductora está dispuesta en una configuración ondulante sobre la superficie al menos parcialmente alrededor del área de calentamiento discreta. Un calentador tan pequeño alimentado por una fuente de baja tensión abre posibilidades para muchas aplicaciones en términos de ahorro de espacio y energía, en particular, para un uso portátil e incluso desechable. Sin embargo, el uso de un calentador de CC de este tipo para la PCR digital sigue siendo un desafío debido a las limitaciones de tamaño al proporcionar un número suficiente de divisiones o pocillos dentro de un área pequeña para contener la muestra de ADN en su interior para que se realice una reacción significativa cuando se calienta con un calentador de CC tan pequeño. El documento WO2009/019658 describe un dispositivo de microfluidos, los documentos US6255677 y DE102012219656 proponen dispositivos de análisis basados en chips.
Sumario de la invención
De acuerdo con un primer aspecto, se proporciona un dispositivo de PCR digital que comprende: un área de calentamiento discreta hecha de oro dispuesta sobre una superficie que no es eléctricamente conductora, comprendiendo el área de calentamiento discreta una pluralidad de pocillos integrales configurados para contener y dividir una muestra de ADN en su interior; y al menos una traza conductora hecha de oro configurada para conectarse a una fuente de tensión de CC y calentar la pluralidad de pocillos integrales a una temperatura uniforme cuando se conecta a la fuente de tensión de CC, la al menos una traza conductora dispuesta sobre la superficie en una configuración ondulante al menos parcialmente alrededor del área de calentamiento discreta. Cada uno de la pluralidad de pocillos integrales está definido por paredes de pocillo que comprenden un grosor del área de calentamiento discreta. El área de calentamiento discreta no está en contacto eléctricamente conductor con la traza conductora.
La pluralidad de pocillos integrales puede proporcionarse como una matriz regular en el área de calentamiento discreta y los pocillos en una misma fila de la matriz pueden estar en comunicación fluida entre sí a través de aberturas en las paredes de los pocillos.
Las aberturas pueden ser colineales a lo largo de cada fila de pocillos.
El dispositivo de PCR digital puede comprender además una capa superior proporcionada sobre la superficie, sobre el área de calentamiento discreta que comprende la pluralidad de pocillos integrales, y sobre la al menos una traza conductora.
La superficie y la capa superior pueden estar formadas por al menos un material laminar flexible.
Breve descripción de figuras
Con el fin de que la invención pueda entenderse completamente y ponerse en práctica fácilmente, ahora se describirán a modo de ejemplo no limitativo solo realizaciones ilustrativas de la presente invención, siendo la descripción con referencia a los dibujos ilustrativos adjuntos.
La Figura 1 es una ilustración esquemática de una primera realización ilustrativa de un dispositivo de PCR digital. La Figura 2 es una ilustración esquemática de diversas realizaciones de una configuración ondulante de una traza conductora del dispositivo de PCR digital.
La Figura 3 es una fotografía de una vista en planta de una pluralidad de pocillos integrales del dispositivo de PCR digital.
La Figura 4 es una captura de pantalla de dimensiones y el análisis térmico de un modelo de varios pocillos del dispositivo de PCR digital.
Descripción detallada
Las realizaciones ilustrativas del dispositivo de PCR digital 10 y sus diversas aplicaciones se describirán a continuación con referencia a las Figuras 1 a 4, en las que se usan los mismos números de referencia para indicar piezas idénticas o similares.
En una primera realización del dispositivo de PCR digital 10 mostrado en la Figura 1, el dispositivo de PCR digital 10 comprende un área de calentamiento discreta 20 que está hecha de un material conductor de calor biológicamente inerte dispuesto sobre una superficie 30 que no es eléctricamente conductora, tal como una película polimérica. El área de calentamiento discreta 20 está dispuesta como una capa del material que tiene un grosor sobre la superficie 30. La superficie 30 puede estar hecha de un material polimérico, por ejemplo, y puede ser relativamente rígida (por ejemplo, un laminado tal como los que se utilizan para placas de circuito impreso) o flexible (por ejemplo, una lámina de polipropileno flexible, película polimérica, cartulina, etc.).
El dispositivo de PCR digital 10 también comprende una traza conductora 40 configurada para conectarse a una fuente de tensión de CC 50 (indicada como (+) y (-) en la Figura 1) y calentar el área de calentamiento discreta 20 a una temperatura uniforme al conectarse la fuente de tensión de CC 50. El área de calentamiento discreta 20 no está en contacto eléctricamente conductor con la traza conductora 40. La traza conductora 40 y el área de calentamiento discreta 20 están hechas preferentemente del mismo material, tal como oro, que es tanto conductor como biológicamente inerte.
La traza conductora 40 está dispuesta en una configuración ondulante 60 sobre la superficie 30 al menos parcialmente alrededor del área de calentamiento discreta 20. En la Figura 1, la configuración ondulante 60 tiene una forma festoneada 41 como se muestra en la Figura 2, que comprende una serie de arcos circulares que se curvan en la misma dirección, reuniéndose en los ángulos, formando puntos hacia fuera y con los arcos convexos hacia el área de calentamiento discreta 20. En esta realización, el área de calentamiento discreta es de forma rectangular y la configuración ondulante 60 solo se proporciona sobre dos lados opuestos del área de calentamiento discreta 20.
En realizaciones alternativas, la configuración ondulante 60 puede ser en diente de sierra 42, ondas 43, ondas cuadradas 44, cola de milano 45, sello postal con bordes 46, o una forma modificada de cada una de las configuraciones ondulantes 60 mencionadas, como se muestra en la Figura 2. Se puede considerar que la configuración ondulante 60 comprende unidades repetidas de curvas o combas de la traza conductora 40 que pueden estar intercaladas o no con partes rectas. Se ha averiguado que un punto de temperatura más alta se da en un borde o vértice externo o convexo de dondequiera que la traza conductora 40 se curve o doble. Por lo tanto, proporcionar una correcta configuración ondulante 60 de la traza conductora 40 sobre la superficie 30 se traduce en que se pongan múltiples puntos de temperatura más alta cerca del área de calentamiento discreta 20. De este modo, se puede generar suficiente calor mediante la configuración ondulante 60 de la traza conductora 40 para calentar un área de calentamiento discreta 20 que tiene dimensiones de, por ejemplo, solo 3 mm por 10 mm a una temperatura alta deseada de, por ejemplo, 100 °C o más, utilizando una tensión de CC de solo 5 voltios que puede proporcionar un puerto USB de un ordenador portátil, por ejemplo.
La fuente de tensión de CC 50 puede ser cualquier fuente de alimentación adecuada que tenga una tensión de 9 voltios o menos, dependiendo de la aplicación para la que esté configurado el dispositivo de PCR digital 10. Por ejemplo, la fuente de tensión de CC 50 puede ser en forma de baterías o, como se ha mencionado anteriormente, un puerto USB de un ordenador portátil u otro dispositivo anfitrión que tenga su propia fuente de alimentación y una tensión de 5 voltios o menos. De este modo, el dispositivo de PCR digital 10 puede llevarse fácilmente ya que puede alimentarse con baterías u otros dispositivos portátiles que pueden suministrar la baja tensión de CC utilizada por el dispositivo de PCR digital 10.
Configurando el área de calentamiento discreta 20 para que no tenga contacto eléctrico con ninguna pieza de la traza conductora 40, se ha averiguado que toda el área de calentamiento discreta 20 tiene una temperatura uniforme cuando el dispositivo de PCR digital 10 alcanza el calentamiento en estado estable. Esta característica de calentamiento uniforme es particularmente importante ya que el área de calentamiento discreta 20 está configurada para calentar una pluralidad de pocillos integrales 29 del dispositivo de PCR digital 10 en el que se divide una muestra de ADN para realizar la PCR digital, y es importante que todos los pocillos se calienten uniformemente y ninguno de los pocillos esté expuesto a temperaturas excesivas o picos de temperatura que puedan dañar la muestra de ADN.
Especialmente, la pluralidad de pocillos 29 del dispositivo de PCR digital 10 forman parte del área de calentamiento discreta 20 como se muestra en la Figura 3. Esto se puede obtener grabando los pocillos 29 dentro del área de calentamiento discreta 20 o imprimiendo el área de calentamiento discreta 20 para incluir la pluralidad de pocillos integrales 29 o cualquier otro método adecuado para formar la pluralidad de pocillos 29 integralmente con el área de calentamiento discreta 20. En una realización ilustrativa como la mostrada en la Figura 3, cada uno de la pluralidad de pocillos integrales 29 tiene dimensiones internas de aproximadamente 420 pm de largo por 220 pm de ancho.
Cada pocillo 29 está definido por paredes de pocillo 27 que tienen una altura de pared de aproximadamente 60 pm que es el grosor del área de calentamiento discreta 20, como se muestra en la Figura 4. La pluralidad de pocillos integrales 29 se proporcionan preferentemente en una matriz regular como se puede ver en la Figura 3. Más preferentemente, los pocillos 29 en una misma fila de la matriz están configurados para estar en comunicación fluida entre sí a través de aberturas 28 en las paredes de los pocillos 27 para permitir hacer fluir una muestra de ADN al interior de todos los pocillos 29. En la realización mostrada en la Figura 3, las aberturas tienen aproximadamente 180 pm de ancho. Las aberturas 28 son preferentemente colineales a lo largo de cada fila de pocillos para facilitar el flujo de la muestra de ADN a través de la matriz. De este modo, cada pocillo 29 está configurado para funcionar como una división para retener una parte de la muestra de ADN que se hace fluir al interior de los pocillos 29.
Durante su uso, la muestra de ADN se hace fluir a través de la matriz de la pluralidad de pocillos integrales 29 de manera que cada pocillo 29 pueda retener una parte de la muestra de ADN. Un suministro y un ciclo adecuados de la tensión de CC a la traza conductora 40 hacen que el área de calentamiento discreta 20 se caliente uniformemente de acuerdo con el ciclo de la tensión de CC suministrada para que se produzca un mismo número de ciclos de PCR en cada una de la pluralidad de pocillos integrales 29. Cualquier ADN que se encuentre en cada pocillo 29 se amplifica un mismo número de veces para toda la pluralidad de pocillos integrales 29. Aplicando una etiqueta fluorescente o cualquier otra etiqueta adecuada a todos los pocillos 29, los pocillos en los que se encontraba una cantidad significativa de ADN al inicio de la PCR mostrarán un resultado positivo. El recuento de los pocillos que muestran un resultado positivo permite así cuantificar el ADN de la muestra, ajustándose por el número de ciclos de PCR de amplificación en los pocillos 29.
El dispositivo de PCR digital 10 tiene preferentemente una capa superior (no mostrada) proporcionada sobre la superficie 30, sobre la zona de calentamiento discreta 20 y sobre la traza conductora 40 con el fin de protegerlas del daño debido a la exposición al medio ambiente. La capa superior también proporciona preferentemente una función de aislamiento eléctrico para la seguridad del usuario. La superficie 30 y la capa superior pueden encerrar así la traza conductora 40 y el área de calentamiento discreta 20 que comprende la pluralidad de pocillos integrales 29 en un paquete que tiene menos de 3 mm de grosor.
La capa superior debe tener al menos una abertura de recogida de muestras para colocar una muestra de ADN en la pluralidad de pocillos integrales 29, y puede tener una o más aberturas distintas para añadir reactivos en la pluralidad de pocillos integrales 29. La capa superior también puede tener una parte transparente configurada como una ventana de resultado para visualizar la pluralidad de pocilios integrales 29.
Si el dispositivo de PCR digital 10 va a tener su fuente de tensión de CC suministrada por un dispositivo anfitrión USB, el dispositivo de PCR digital 10 puede estar provisto adicionalmente de una pestaña (no mostrada) donde la traza conductora 40 está configurada con una interfaz USB para la conexión con el dispositivo anfitrión USB.
En una realización ilustrativa, el dispositivo de PCR digital 10 comprende un área de calentamiento discreta 20 que tiene un área de aproximadamente 3 mm x 10 mm y que comprende ochocientos pocillos integrales 29 para realizar la PCR digital en una muestra de 4 pl. La capacidad del dispositivo de PCR digital 10 para permitir la cuantificación del ADN a partir de una muestra tan pequeña es particularmente ventajosa en aplicaciones forenses donde solo puede haber una pequeña muestra de ADN disponible. El dispositivo de PCR digital 10 proporciona así una solución que se puede llevar fácilmente e incluso desechable para diversas aplicaciones de amplificación de ADN para su uso con una pequeña muestra de ADN. Se contempla que el volumen de la muestra requerido por el dispositivo de PCR digital 10 pueda ser tan bajo como el rango de picolitros, haciendo posible una amplificación isotérmica o ciclos de PCR a temperatura constante. Esto hace que las amplificaciones de ADN sean más fáciles de realizar, lo cual es particularmente beneficioso para el diagnóstico de enfermedades infecciosas con la gran ventaja de que tienen un bajo coste que permite que los médicos realicen diagnósticos sin tener que invertir mucho en equipos costosos.
Si bien en la descripción anterior se han descrito realizaciones ilustrativas de la presente invención, los expertos en la tecnología en cuestión entenderán que pueden realizarse numerosas variaciones en los detalles del diseño, la construcción y/o el funcionamiento sin apartarse de la presente invención. Por ejemplo, se puede contemplar que se proporcionen configuraciones alternativas del área de calentamiento discreta 20 y la configuración ondulante 60 de acuerdo con la aplicación real del dispositivo de PCR digital, según las necesidades, sin límite a las formas y los tamaños posibles de estas características. El número y las dimensiones de los pocillos, la altura de pared y las dimensiones del área de calentamiento discreta pueden variarse respecto a los ejemplos descritos anteriormente y configurarse de acuerdo con un número y una dimensión deseados dependiendo de la aplicación específica y el tipo de PCR que se vaya a realizar con el dispositivo.

Claims (5)

REIVINDICACIONES
1. Un dispositivo de PCR digital (10) que comprende:
un área de calentamiento discreta (20) hecha de oro dispuesta sobre una superficie (30) que no es eléctricamente conductora, comprendiendo el área de calentamiento discreta (20) una pluralidad de pocillos integrales (29) configurados para contener y dividir una muestra de ADN en su interior; y
al menos una traza conductora (40) hecha de oro, configurada para ser conectada a una fuente de tensión de CC (50) y calentar la pluralidad de pocillos integrales (29) a una temperatura uniforme cuando está conectada a la fuente de tensión de CC (50), la al menos una traza conductora (40) dispuesta sobre la superficie (30) en una configuración ondulante al menos parcialmente alrededor del área de calentamiento discreta (20), caracterizado por que cada uno de la pluralidad de pocillos integrales (29) está definido por paredes de pocillo (27) que comprenden un grosor del área de calentamiento discreta (20), y en donde el área de calentamiento discreta (20) no está en contacto eléctricamente conductor con la traza conductora (40).
2. El dispositivo de PCR digital de la reivindicación 1, en donde la pluralidad de pocillos integrales se proporciona como una matriz regular en el área de calentamiento discreta y en donde los pocillos en una misma fila de la matriz están en comunicación fluida entre sí a través de aberturas en las paredes de los pocillos.
3. El dispositivo de PCR digital de la reivindicación 2, en donde las aberturas son colineales a lo largo de cada fila de pocillos.
4. El dispositivo de PCR digital de cualquier reivindicación anterior, que comprende además una capa superior proporcionada sobre la superficie, sobre el área de calentamiento discreta que comprende la pluralidad de pocillos integrales, y sobre la al menos una traza conductora.
5. El dispositivo de PCR digital de cualquier reivindicación anterior, en donde la superficie y la capa superior están formadas por al menos un material laminar flexible.
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