ES2847602T3 - Nanocomplejo micelar - Google Patents

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ES2847602T3 ES15789009T ES15789009T ES2847602T3 ES 2847602 T3 ES2847602 T3 ES 2847602T3 ES 15789009 T ES15789009 T ES 15789009T ES 15789009 T ES15789009 T ES 15789009T ES 2847602 T3 ES2847602 T3 ES 2847602T3
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Spain
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poly
polymer
flavonoid
micellar
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Kurisawa Motoichi
Yongvongsoontorn Nunnarpas
Jackie Y Ying
Joo Eun Chung
Ki Hyun Bae
Min-Han Tan
Esther Lee
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Agency for Science Technology and Research Singapore
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Abstract

Nanocomplejo micelar que comprende una micela y un agente encapsulado dentro de dicha micela, comprendiendo dicha micela un conjugado polimero-flavonoide, en el que dicho polimero es un polimero hidrofilo unido al anillo B de dicho flavonoide.

Description

DESCRIPCIÓN
Nanocomplejo micelar
Campo técnico
[0001] La presente invención se refiere en general a nanocomplejos micelares para la administración de fármacos y a un método de formación de los mismos. La presente invención también se refiere a un conjugado polímeroflavonoide que comprende un polímero unido al anillo B de un flavonoide y a un método de formación del mismo.
Estado de la técnica
[0002] La quimioterapia, que es uno de los tratamientos contra el cáncer más comunes, utiliza fármacos citotóxicos administrados por vía oral y parenteral. El principal desafío de la administración de fármacos contra el cáncer convencionales es su distribución no específica en el organismo, lo que provoca toxicidad con efectos secundarios graves. Además, el efecto terapéutico de los fármacos orales está limitado por su baja biodisponibilidad, ya que los fármacos deben atravesar los conductos digestivos. Durante las últimas décadas, los investigadores se han centrado en desarrollar sistemas de administración de fármacos para superar las limitaciones de la administración de fármacos convencional mejorando la farmacocinética y la biodistribución de los fármacos.
[0003] En los últimos años, las catequinas del té verde han sido ampliamente estudiadas debido a sus beneficios para la salud, incluyendo la prevención de enfermedades cardiovasculares y cánceres. Entre las catequinas del té, la (-)-epigalocatequina-3-galato (EGCG) es la más abundante y se considera que desempeña un papel importante en los efectos beneficiosos del té verde. Numerosos estudios han demostrado que la EGCG posee efectos antioxidantes, antidiabéticos, antibacterianos, antiinflamatorios e hipocolesterolémicos. Además, se ha demostrado que inhibe eficazmente el crecimiento tumoral y la metástasis al dirigirse a múltiples vías de transducción de señales esenciales para la supervivencia de las células cancerosas.
[0004] A pesar de estas actividades deseables, las aplicaciones clínicas de la EGCG se han visto limitadas por su escasa estabilidad y baja biodisponibilidad oral. Por ejemplo, la EGCG es inestable y se descompone fácilmente en un entorno fisiológico. Se ha informado de que la EGCG tenía una semivida corta de menos de 30 minutos en solución salina tamponada con fosfato (PBS) 0,05 M (pH 7,4) a 37 °C. Además, la mayor parte de la EGCG ingerida experimenta una hidrólisis extensa en el jugo gástrico y una degradación metabólica en el tracto gastrointestinal. Como resultado, las concentraciones plasmáticas de EGCG necesarias para lograr un efecto terapéutico deseado no se pueden alcanzar después de la administración oral. En el documento WO2011112156 se describe un conjugado de un agente de administración que contiene una porción química y al menos un flavonoide. El flavonoide existe en forma monomérica o dimérica antes de la conjugación y permanece en forma monomérica o dimérica tras la conjugación. Preferiblemente, el conjugado comprende dos flavonoides. El agente de administración se conjuga en la posición C6 y/o C8 del anillo A del flavonoide. También se proporciona un vehículo de administración de agente anticanceroso que comprende un agente anticanceroso y el conjugado.
[0005] Por lo tanto, se advierte la necesidad de proporcionar un sistema de administración de fármacos que supere o al menos mejore una o más de los inconvenientes anteriormente descritos. También es necesario proporcionar un método para formar tal sistema de administración de fármacos.
Resumen de la invención
[0006] Según un primer aspecto, se proporciona un nanocomplejo micelar que comprende una micela y un agente encapsulado dentro de dicha micela, comprendiendo dicha micela un conjugado polímero-flavonoide, en el que dicho polímero está unido al anillo B de dicho flavonoide.
[0007] Ventajosamente, los nanocomplejos micelares se pueden utilizar como sistemas de administración de fármacos. Los nanocomplejos micelares tienen un tamaño pequeño y una alta capacidad de carga de fármacos, lo que favorece la administración de fármacos dirigidos a tumores. Además, de forma ventajosa, la liberación sostenida del agente se puede lograr usando nanocomplejos micelares en condiciones fisiológicas. Más ventajosamente, los nanocomplejos pueden ser vehículos de administración prometedores para una variedad de agentes anticancerosos insolubles en agua. Además, de forma ventajosa, el nanocomplejo micelar puede suprimir significativamente el crecimiento tumoral, con una toxicidad reducida asociada a la administración del agente. Más ventajosamente, los nanocomplejos micelares pueden representar un sistema de administración de fármacos único y eficaz con efectos terapéuticos sinérgicos del sistema de administración de fármacos o del vehículo de micela y el agente.
[0008] El agente puede ser doxorrubicina. Ventajosamente, los nanocomplejos micelares que encapsulan la doxorrubicina pueden mostrar una liberación sostenida del fármaco. Esta liberación sostenida del fármaco puede deberse a la fuerte interacción entre la EGCG y la doxorrubicina dentro de los nanocomplejos micelares. Más ventajosamente, en algunas formas de realización, solo se observó una liberación de ráfaga marginal en la etapa inicial, lo que sugiere que las moléculas de doxorrubicina estaban encapsuladas de manera estable en los nanocomplejos micelares. Una fuga de fármaco tan baja puede ser esencial para asegurar la máxima eficacia terapéutica con efectos secundarios mínimos, ya que las moléculas de fármaco encapsuladas en los nanocomplejos pueden no tener fugas prematuras durante la circulación en el torrente sanguíneo. Incluso más ventajosamente, los nanocomplejos micelares se pueden aplicar en la administración sistémica de doxorrubicina para el tratamiento del cáncer.
[0009] El agente puede ser sunitinib (SU) y el flavonoide puede ser epigalocatequina-3-galato (EGCG). Ventajosamente, los nanocomplejos micelares pueden mostrar una liberación sostenida de SU. Además, de forma ventajosa, en algunas formas de realización, apenas se observó liberación de ráfaga, lo que sugiere que las moléculas de SU estaban encapsuladas de forma estable en los nanocomplejos micelares.
[0010] En una forma de realización, el flavonoide puede ser un flavonoide monomérico. En otra forma de realización, el flavonoide puede ser un flavonoide dimérico. De manera ventajosa, el nanocomplejo micelar que comprende el flavonoide monomérico puede mostrar una liberación de SU más rápida y mayor en comparación con los nanocomplejos micelares que comprenden el flavonoide dimérico. Ventajosamente, puede haber una interacción más fuerte entre SU y el flavonoide dimérico.
[0011] Ventajosamente, los nanocomplejos micelares pueden minimizar los efectos secundarios adversos de agentes tales como SU encapsulando de forma estable el agente en su interior y administrándolos al sitio de interés. Por tanto, el nanocomplejo micelar puede proporcionar efectos sinérgicos beneficiosos entre SU y EGCG.
[0012] Además, ventajosamente, el nanocomplejo micelar que comprende SU puede tener efectos tumorales potenciados in vivo en comparación con el SU libre. Más ventajosamente, el nanocomplejo micelar que comprende SU puede tener menos efectos adversos in vivo en comparación con el SU libre. Además, de manera ventajosa, puede requerirse menos dosis del nanocomplejo micelar que comprende SU en comparación con el SU libre para lograr los mismos efectos. Más ventajosamente, el efecto inhibidor del nanocomplejo micelar que comprende SU puede mantenerse durante un período sustancial incluso cuando se ha puesto fin a la terapia.
[0013] Además, de forma ventajosa, el nanocomplejo micelar que comprende SU puede derivar en concentraciones plasmáticas reducidas de SU libre, lo que da como resultado menos efectos adversos de SU. Además, ventajosamente, esta reducción en la concentración plasmática puede deberse a la interacción entre el flavonoide y el Su , así como al efecto mejorado de permeabilidad y retención (EPR) que ofrecen las nanopartículas micelares.
[0014] Según un segundo aspecto, se proporciona un método para formar un nanocomplejo micelar que comprende una micela y un agente encapsulado dentro de dicha micela, comprendiendo el método las etapas de: (a) añadir dicho agente en un disolvente adecuado a un conjugado polímero-flavonoide, en el que dicho polímero está unido al anillo B de dicho flavonoide; y (b) permitir el autoensamblaje de una micela que comprende dicho conjugado polímero-flavonoide y la encapsulación de dicho agente dentro de dicha micela para formar así dicho nanocomplejo micelar.
[0015] Ventajosamente, el nanocomplejo se autoensambla en presencia del conjugado polímero-flavonoide y el agente. Además, de manera ventajosa, la formación del nanocomplejo se logró utilizando la propiedad de unión del flavonoide con los agentes.
[0016] Según un tercer aspecto, se proporciona un conjugado polímero-flavonoide que comprende un polímero unido al anillo B de un flavonoide.
[0017] Ventajosamente, un flavonoide se conjuga con un polímero. En una forma de realización, el polímero puede ser polietilenglicol (PEG). Ventajosamente, las nanopartículas a base de polímero evitan tanto la eliminación renal como el atrapamiento por parte del sistema reticuloendotelial (RES), permitiendo su acumulación posterior dentro de los tejidos tumorales por el efecto EPR. Más ventajosamente, las micelas estabilizadas con p Eg exhiben una semivida plasmática mayor que las micelas no modificadas debido a que las cadenas superficiales de PEG impiden el reconocimiento y la eliminación por el RES en el cuerpo. Además, ventajosamente, el PEG puede usarse para modificar la superficie de micelas y nanopartículas poliméricas para producir superficies antiincrustantes.
[0018] Según un cuarto aspecto, se proporciona un método para formar el conjugado polímero-flavonoide según lo definido anteriormente que comprende la etapa de conjugar dicho flavonoide con dicho polímero mediante adición nucleofílica en condiciones básicas, en el que dicho polímero tiene un grupo nucleófilo libre.
[0019] Ventajosamente, los conjugados polímero-flavonoide se pueden sintetizar mediante adición nucleofílica a pH básico. De manera ventajosa, la conjugación puede realizarse mediante la adición nucleofílica de un grupo nucleófilo tal como un grupo tiol del polímero tal como PEG en la posición C2' del anillo B del flavonoide en condiciones de pH controlado.
[0020] En una forma de realización, el polímero es polietilenglicol (PEG) y el grupo nucleófilo libre es tiol. Ventajosamente, la ortoquinona pobre en electrones del flavonoide tal como la EGCG puede reaccionar con un grupo nucleófilo, como los grupos tiol. Los grupos tiol están presentes en una amplia gama de biomoléculas que incluyen cisteína, glutatión y proteínas. La EGCG puede unirse covalentemente a residuos de cisteína en proteínas de membrana de eritrocitos humanos y gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH). Además, pueden formarse aductos covalentes de EGCG cuando se oxidan en presencia de cisteína y glutatión. Además, ventajosamente, los conjugados de cisteína resultantes de EGCG pueden exhibir actividades prooxidantes más altas que la EGCG, al tiempo que conservan sus actividades inhibidoras del crecimiento y antiinflamatorias.
Además, ventajosamente, la EGCG conjugada con N-acetilcisteína puede potenciar los efectos inhibidores del crecimiento e inductores de la apoptosis de la EGCG contra las células cancerosas de pulmón murinas y humanas.
[0021] Según un quinto aspecto, se da a conocer el uso de un nanocomplejo micelar que comprende una micela y un agente encapsulado dentro de dicha micela como vehículo de administración de fármacos, en el que dicha micela comprende un conjugado polímero-flavonoide, y en el que dicho polímero está unido al B anillo de dicho flavonoide.
[0022] Ventajosamente, el nanocomplejo micelar puede tener un mayor efecto anticancerígeno en comparación con el agente libre. Además, de manera ventajosa, los nanocomplejos micelares pueden minimizar los efectos secundarios adversos de agentes tales como el sunitinib (SU) encapsulando de manera estable el agente en su interior y administrándolos al sitio de interés. Dichos sistemas de administración también pueden proporcionar efectos sinérgicos beneficiosos.
[0023] Según un séptimo aspecto, se proporciona el nanocomplejo micelar según se ha definido anteriormente para su uso en el tratamiento de un tumor.
[0024] Según un octavo aspecto, se proporciona el nanocomplejo micelar según se ha definido anteriormente para su uso en el tratamiento de un tumor.
Definiciones
[0025] Las siguientes palabras y términos utilizados en este documento tendrán el significado que se indica:
El "anillo B" de un flavonoide se refiere a un fenilo opcionalmente sustituido que está unido a una estructura bicíclica (la estructura bicíclica está compuesta por un anillo de benceno (A) condensado con un anillo de seis miembros (C)). El fenilo opcionalmente sustituido está unido a la posición 2 del anillo C. Para los propósitos de esta divulgación, los anillos se denominan de la siguiente manera:
[Comp. 1]
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[0026] El término "epigalocatequina galato" se refiere a un éster de epigalocatequina y ácido gálico, y puede usarse indistintamente con "epigalocatequina-3-galato" o EGCG.
[0027] Para los fines de la presente solicitud, la expresión "conjugados de PEG-EGCG" se refiere tanto a conjugados de PEG-mEGCG (EGCG monomérica) como a conjugados de PEG-dEGCG (EGCG dimérica), a menos que se especifique.
[0028] La palabra "sustancialmente" no excluye "completamente"; p. ej., una composición que está "sustancialmente libre" de Y puede estar completamente libre de Y. Cuando sea necesario, la palabra "sustancialmente" puede omitirse de la definición de la invención.
[0029] A menos que se especifique lo contrario, los términos "comprendiendo" y "comprende", y las variantes gramaticales de los mismos, pretenden representar un lenguaje "abierto" o "inclusivo", de manera que incluyan elementos citados, pero también permitan la inclusión de elementos adicionales no citados.
[0030] Según se emplea en el presente documento, el término "aproximadamente", en el contexto de concentraciones de componentes de las formulaciones, normalmente significa /- 5 % del valor establecido, más típicamente /- 4 % del valor establecido, más típicamente /- 3 % del valor establecido, más típicamente, /- 2 % del valor establecido, incluso más típicamente /- 1 % del valor establecido, e incluso más típicamente /- 0,5 % del valor establecido.
[0031] A lo largo de esta memoria descriptiva, se pueden divulgar ciertas formas de realización en un formato de intervalo. Debe entenderse que la descripción en formato de intervalo se realiza simplemente por conveniencia y brevedad y no debe interpretarse como una limitación inflexible del alcance de los intervalos descritos. Por consiguiente, debe considerarse que la descripción de un intervalo ha divulgado específicamente todos los posibles subintervalos, así como los valores numéricos individuales dentro de ese intervalo. Por ejemplo, se debe considerar que la descripción de un intervalo como de 1 a 6 tiene subintervalos específicamente divulgados, como de 1 a 3, de 1 a 4, de 1 a 5, de 2 a 4, de 2 a 6, de 3 a 6, etc., así como números individuales dentro de ese intervalo, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5 y 6. Esto se aplica independientemente de la amplitud del intervalo.
[0032] Ciertas formas de realización también se pueden describir en el presente documento de manera amplia y genérica. Cada una de las especies más limitadas y agrupaciones subgenéricas que se encuentran dentro de la divulgación genérica también forma parte de la divulgación. Esto incluye la descripción genérica de las formas de realización con una condición o limitación negativa que elimina cualquier materia objeto del género, independientemente de si el material escindido se menciona específicamente en el presente documento.
Divulgación detallada de formas de realización
[0033] A continuación se darán a conocer ejemplos no limitativos de formas de realización de un nanocomplejo micelar.
[0034] Un nanocomplejo micelar puede comprender una micela y un agente encapsulado dentro de dicha micela, comprendiendo dicha micela un conjugado polímero-flavonoide, en el que dicho polímero está unido al anillo B de dicho flavonoide.
[0035] Puede unirse al menos un flavonoide a dicho polímero. Se pueden unir al menos dos flavonoides a dicho polímero.
[0036] El polímero puede unirse a dicho flavonoide mediante un enlazador. El enlazador puede ser cualquier grupo químico que pueda enlazar el polímero y el flavonoide. El enlazador puede seleccionarse del grupo que consiste en un grupo tioéter, imina, amina, azo y 1,2,3-triazol. El enlazador puede ser un grupo alcano. El enlazador puede estar presente entre cualquier parte del polímero y cualquier parte del flavonoide. El enlazador puede estar presente entre un extremo del polímero y cualquier parte del flavonoide.
[0037] El flavonoide puede seleccionarse del grupo que consiste en un flavonoide monomérico o un flavonoide dimérico. Un flavonoide monomérico puede comprender una molécula de flavonoide. Un flavonoide dimérico puede comprender dos moléculas de flavonoide unidas entre sí por un enlazador. Una de las moléculas de flavonoide del flavonoide dimérico puede estar unida al polímero. Ambas moléculas de flavonoide del flavonoide dimérico pueden unirse independientemente al polímero. Cuando un flavonoide está presente en dicho conjugado, el flavonoide se une a dicho polímero a través del anillo B. Cuando un flavonoide se une a dicho conjugado, el flavonoide se une a dicho polímero a través del anillo D.
[0038] Cuando hay más de un flavonoide presente en dicho conjugado, al menos uno de los flavonoides está unido a dicho polímero a través del anillo B. El otro de dicho al menos un flavonoide está unido a dicho polímero a través del anillo A. Cuando hay más de un flavonoide presente en dicho conjugado, al menos uno de los flavonoides está unido a dicho polímero a través del anillo B. El otro de dicho al menos un flavonoide está unido a dicho polímero a través del anillo B. Cuando hay más de un flavonoide presente en dicho conjugado, al menos uno de los flavonoides está unido a dicho polímero a través del anillo B. El otro de dicho al menos un flavonoide está unido a dicho polímero a través del anillo D.
[0039] Cuando hay más de un flavonoide presente en dicho conjugado, al menos uno de los flavonoides está unido a dicho polímero a través del anillo D. El otro de dicho al menos un flavonoide está unido a dicho polímero a través del anillo A. Cuando hay más de un flavonoide presente en dicho conjugado, al menos uno de los flavonoides está unido a dicho polímero a través del anillo D. El otro de dicho al menos un flavonoide está unido a dicho polímero a través del anillo B. Cuando hay más de un flavonoide presente en dicho conjugado, al menos uno de los flavonoides está unido a dicho polímero a través del anillo D. El otro de dicho al menos un flavonoide está unido a dicho polímero a través del anillo D.
[0040] El polímero es un polímero hidrófilo. El polímero hidrófilo puede comprender monómeros seleccionados del grupo que consiste en acrilamidas, alquilos, oxazolinas, alquenilos, iminas, ácidos acrílicos, metacrilatos, dioles, oxiranos, alcoholes, aminas, anhídridos, ésteres, lactonas, carbonatos, ácidos carboxílicos, acrilatos, hidroxilos, fosfatos, tereftalato, amidas y éteres.
[0041] El polímero hidrófilo puede seleccionarse del grupo que consiste en poliacrilamida, poli(N-isopropilacrilamida), poli (oxazolina), polietilenimina, poli(ácido acrílico), polimetacrilato, poli(etilenglicol), poli(óxido de etileno), poli(alcohol vinílico), poli(vinilpirrolidinona), poliéteres, poli(alilamina), polianhídridos, poli(S-aminoéster), poli(succinato de butileno), policaprolactona, policarbonato, polidioxanona, poli(glicerol), ácido poliglicólico, poli(ácido 3-hidroxipropiónico), poli(metacrilato de 2-hidroxietilo), poli(W-(2-hidroxipropil)metacrilamida), ácido poliláctico, poli(ácido láctico-coglicólico), poli(ortoésteres), poli(2-oxazolina), poli(ácido sebácico), poli(tereftalato-cofosfato) y copolímeros de los mismos.
[0042] El polímero hidrófilo puede ser un polisacárido. El polímero puede ser un polisacárido seleccionado del grupo que consiste en ácido hialurónico, dextrano, pululano, quitosano, celulosa, amilosa, almidón, gelatina, carragenano, ciclodextrina, sulfato de dextrano, ficol, goma gellan, goma guar, pectina, polisacarosa, pululano, escleroglucano, goma xantana, xiloglucano y alginato.
[0043] El polímero hidrófilo puede ser polietilenglicol (PEG). El PEG es un polímero sintético que se ha utilizado en aplicaciones biomédicas debido a su naturaleza hidrófila, flexible y biocompatible. Específicamente, se ha utilizado PEG para modificar la superficie de micelas y nanopartículas poliméricas para producir superficies antiincrustantes.
[0044] Ventajosamente, se seleccionó polietilenglicol (PEG) como polímero que se va a conjugar con el flavonoide. La conjugación se logró mediante la adición nucleofílica de un grupo tiol de PEG en la posición C2' del anillo B del flavonoide en condiciones de pH controlado.
[0045] El flavonoide puede seleccionarse del grupo que consiste en flavonas, isoflavonas, flavanos, proantocianidinas y antocianidinas.
[0046] Las flavonas se pueden seleccionar del grupo que consiste en apigenina, luteolina, tangeritina, crisina, 6-hidroxiflavona, baicaleína, scutellareina, wogonina, diosmina, flavoxato y 7,8-dihidroxiflavona.
[0047] Las isoflavonas pueden seleccionarse del grupo que consiste en genisteína, daidzeína, gliciteína, genistina, daidzina, glicitina, acetil-genistina, acetil-daidzina, acetil-glicitina, malonil genistina, malonil-daidzina y malonilglicitina.
[0048] Los flavanos pueden seleccionarse del grupo que consiste en (-)-epicatequina, (+)-epicatequina, (-)-catequina, (+)-catequina, epicatequina galato, epigalocatequina, epigalocatequina galato, fisetinidol, galocatequina, galocatequina galato, mesquitol y robinetinidol, elagitanino, galotanino, oolongteanina, florotanino, tanino, teacitrina, teadibenzotropolona, teoflavina, teanaftoquinona, tearubiginas, teasinensina y mezclas de los mismos.
[0049] Las antocianidinas se pueden seleccionar del grupo que consiste en aurantinidina, capensinidina, cianidina, delfinidina, europinidina, hirsutinidina, malvidina, pelargondina, peonidina, petunidina, pulquelidina y rosinidina.
[0050] El agente puede ser un agente terapéutico. El agente terapéutico puede ser un agente quimioterapéutico seleccionado del grupo que consiste en agentes alquilantes, antraciclinas, disruptores del citoesqueleto, epotilonas, inhibidores de histona desacetilasa, inhibidores de topoisomerasa I, inhibidores de topoisomerasa II, inhibidores de quinasa, anticuerpos monoclonales, conjugados anticuerpo-fármaco, análogos de nucleótidos, análogos de precursores, antibióticos peptídicos, agentes a base de platino, retinoides, alcaloides de la vinca, citocinas, antimetabolitos y derivados de los alcaloides de la vinca, y otros citotóxicos.
[0051] El agente quimioterapéutico puede seleccionarse del grupo que consiste en Actinomicina, Afatinib, Ácido retinoico todo-trans, Axitinib, Azacitidina, Azatioprina, Bevacizumab, Bleomicina, Bosutinib, Bortezomib, Carboplatino, Capecitabina, Cetuximab, Cisplatino, Clorambucil, Crizotinib, Ciclofosfamida, Citarabina, Dasatinib, Daunorrubicina, Docetaxel, Doxifluridina, Doxorrubicina, Epirrubicina, Epotilona A (C26H39NO6S), Epotilona B (C27H41NO6S), Epotilona C (C26H39NO5S), Epotilona D (C27H41NO5S), Epotilona E (C26H39NO7S), Epotilona F (C27H41NO7S), Erlotinib, Etopósido, Fluorouracilo, Fostamatinib, Gefitinib, Gemcitabina, Hidroxiurea, Idarrubicina, Imatinib, Irinotecán, Lapatinib, Lenvatinib, Mecloretamina, Mercaptopurina, Metotrexato, Mitoxantrona, Nilotinib, Oxaliplatino, Paclitaxel, Panitumumab, Pazopanib, Pegaptanib, Pemetrexed, Ranibizumab, Regorafenib, Ruxolitinib, Sorafenib, Sunitinib, Trastuzumab, Tenipósido, Tioguanina, Tofacitinib, Topotecán, Valrrubicina, Vemurafenib, Vinblastina, Vincristina, Vindesina, Vinorelbina.
[0052] El agente quimioterapéutico puede ser doxorrubicina.
[0053] El agente quimioterapéutico puede ser sunitinib (SU). SU es un inhibidor de la tirosina quinasa multidireccional y una terapia de primera línea para el carcinoma de células renales de células claras (ccRCC). Específicamente, el SU se dirige a los receptores del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) y del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), que desempeñan un papel en la angiogénesis y proliferación tumoral, lo que lleva a la reducción de la vascularización del tumor y a la muerte de las células cancerosas. Ha sido aprobado para su uso en RCC avanzado, tumores del estroma gastrointestinal (GIST) y tumores neuroendocrinos pancreáticos (pNET). También se ha demostrado que tiene potencial para curar el cáncer de mama metastásico, el cáncer de pulmón de células no pequeñas avanzado, el carcinoma hepatocelular avanzado, los tumores neuroendocrinos y la leucemia. Sin embargo, puede causar efectos secundarios graves, como toxicidades hepáticas, cardíacas y gastrointestinales, hipertensión, problemas cutáneos y síndrome mano-pie.
[0054] El nanocomplejo micelar puede tener un tamaño en el intervalo de 30 a 300 nm, de 50 a 300 nm, de 100 a 300 nm, de 30 a 50 nm, de 30 a 100 nm, de 30 a 150 nm, de 150 a 300 nm, de 200 a 300 nm, de 250 a 300 nm, de 100 a 150 nm, de 100 a 200 nm, de 100 a 250 nm, de 130 a 180 nm o de 130 a 250 nm.
[0055] El nanocomplejo micelar puede tener una eficiencia de carga de dicho agente presente dentro de dicha micela que sea más del 30 %, más del 35 %, más del 40 %, más del 45 %, más del 50%, más del 55 %, más del 60 %, más del 65 %, más del 70 %, más del 75 % u 80 %.
[0056] El nanocomplejo micelar puede tener un contenido de carga de dicho agente presente dentro de dicha micela en el intervalo de 1 a 10 % p/p, de 5 a 25 % p/p, de 20 a 45 % p/p, de 30 a 50 % p/p, de 35 a 50 % p/p, de 40 a 50 % p/p, de 45 a 50 % p/p, de 30 a 35 % p/p, de 30 a 40 % p/p o de 30 a 45 % p/p.
[0057] Un método para formar un nanocomplejo micelar puede comprender una micela y un agente encapsulado dentro de dicha micela, comprendiendo el método las etapas de: a. añadir dicho agente en un disolvente adecuado a un conjugado polímero-flavonoide, en el que dicho polímero está unido al anillo B de dicho flavonoide; y b. permitir el autoensamblaje de una micela que comprende dicho conjugado polímero-flavonoide y la encapsulación de dicho agente dentro de dicha micela para formar así dicho nanocomplejo micelar.
[0058] La etapa (a) puede comprender, además, las etapas de: a. eliminar dicho disolvente para formar una película seca de dicho agente y dicho conjugado polímero-flavonoide; y b. hidratar dicha película seca con un disolvente acuoso.
[0059] El método puede comprender, además, la etapa de aislar el nanocomplejo micelar formado mediante filtración o diálisis en un disolvente adecuado.
[0060] Un conjugado polímero-flavonoide puede comprender un polímero unido al anillo B de un flavonoide.
[0061] El polímero del conjugado polímero-flavonoide se puede seleccionar del grupo que consiste en un polisacárido, poliacrilamida, poli(N-isopropilacrilamida), poli(oxazolina), polietilenimina, poli(ácido acrílico), polimetacrilato, poli(etilenglicol), poli(óxido de etileno), poli(alcohol vinílico), poli(vinilpirrolidinona), poliéteres, poli(alilamina), polianhídridos, poli(jS-aminoéster), poli(succinato de butileno), policaprolactona, policarbonato, polidioxanona, poli(glicerol), ácido poliglicólico, poli(ácido 3-hidroxipropiónico), poli(metacrilato de 2-hidroxietilo), poli(W-(2-hidroxipropil) metacrilamida), ácido poliláctico, poli(ácido láctico-coglicólico), poli(ortoésteres), poli(2-oxazolina), poli(ácido sebácico), poli(tereftalato-cofosfato) y copolímeros de los mismos.
[0062] El flavonoide del conjugado polímero-flavonoide puede seleccionarse del grupo que consiste en (-)-epicatequina, (+)-epicatequina, (-)-catequina, (+)-catequina, epicatequina galato, epigalocatequina, epigalocatequina galato, fisetinidol, galocatequina, galocatequina galato, mesquitol y robinetinidol, elagitanino, galotanino, oolongteanina, florotanino, tanino, teacitrina, teadibenzotropolona, teoflavina, teanaftoquinona, tearubiginas, teasinensina y mezclas de los mismos.
[0063] El polímero puede conjugarse con un flavonoide en el conjugado polímero-flavonoide mediante un enlazador seleccionado del grupo que consiste en un grupo tioéter, imina, amina, azo y 1,2,3-triazol. El enlazador puede ser un grupo alcano. El enlazador puede estar presente entre cualquier parte del polímero y cualquier parte del flavonoide. El enlazador puede estar presente entre un extremo del polímero y cualquier parte del flavonoide.
[0064] El polímero del conjugado polímero-flavonoide puede ser poli(etilenglicol), dicho flavonoide del conjugado polímero-flavonoide puede ser epigalocatequina-3-galato y dicho enlazador del conjugado polímero-flavonoide puede ser tioéter.
[0065] El polímero-flavonoide puede presentar la siguiente fórmula
[Comp. 2]
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donde n está en el intervalo de 20 a 910.
[0066] Un método para formar el conjugado polímero-flavonoide puede comprender la etapa de conjugar dicho flavonoide con dicho polímero mediante adición nucleofílica en condiciones básicas, donde dicho polímero tiene un grupo nucleófilo libre.
[0067] El grupo nucleófilo puede seleccionarse del grupo que consiste en un sulfhidrilo, amina, carbonilo, ácido carboxílico, azida, halógeno, alquino y alqueno. El grupo nucleófilo se puede seleccionar del grupo que consiste en un tiol, una amina, un diazoalcano y una azida.
[0068] El grupo nucleófilo puede ser un tiol. La EGCG puede experimentar oxidación en presencia de oxígeno para formar una ortoquinona a través de una vía que involucra radicales semiquinona y especies reactivas de oxígeno. La ortoquinona pobre en electrones de la EGCG puede reaccionar con un grupo tiol nucleófilo presente en diversas biomoléculas que incluyen cisteína, glutatión y proteínas. La EGCG puede unirse covalentemente a residuos de cisteína en proteínas de membrana de eritrocitos humanos y gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH). Pueden formarse aductos covalentes de EGCG cuando se oxidan en presencia de cisteína y glutatión. Los conjugados de cisteína resultantes de EGCG pueden exhibir actividades prooxidantes más altas que la EGCG, al tiempo que conservan sus actividades inhibidoras del crecimiento y antiinflamatorias. Además, la EGCG conjugada con W-acetilcisteína puede mejorar los efectos inhibidores del crecimiento e inductores de la apoptosis de la EGCG contra las células cancerosas de pulmón humanas y murinas.
[0069] La etapa de conjugación puede realizarse en un tiempo de reacción de entre aproximadamente 1 hora y 24 horas, entre aproximadamente 1 hora y 2 horas, entre aproximadamente 1 hora y 4 horas, entre aproximadamente 1 hora y 8 horas, entre aproximadamente 1 hora y 12 horas, entre aproximadamente 2 horas y 4 horas, entre aproximadamente 2 horas y 8 horas, entre aproximadamente 2 horas y 12 horas, entre aproximadamente 2 horas y 24 horas, entre aproximadamente 4 horas y 8 horas, entre aproximadamente 4 horas y 12 horas, entre aproximadamente 4 horas y 24 horas, entre aproximadamente 8 horas y 12 horas, entre aproximadamente 8 horas y 24 horas o entre aproximadamente 12 horas y 24 horas.
[0070] El método puede comprender, además, la etapa de realizar la etapa de conjugación en un disolvente que previene sustancialmente la agregación de dicho flavonoide.
[0071] El método puede comprender, además, la etapa de añadir un agente eliminador para prevenir la oxidación mediada por H2O2 de dicho grupo nucleófilo para aumentar así la eficiencia de dicha etapa de conjugación.
[0072] Las condiciones básicas pueden estar en el intervalo de pH de más de 7 a 10, más de 8 a 10, más de 9 a 10, más de 7 a 11, más de 8 a 11, más de 9 a 11, más de 10 a 11, más de 7, más de 8, más de 9, más de 10 o más de 11.
[0073] El uso de un nanocomplejo micelar puede comprender una micela y un agente encapsulado dentro de dicha micela como vehículo de administración de fármaco, en el que dicha micela comprende un conjugado polímeroflavonoide y en el que dicho polímero está unido al anillo B de dicho flavonoide.
[0074] El nanocomplejo micelar se puede administrar por vía parenteral, en aerosol para inhalación, por vía tópica, rectal, nasal, bucal, vaginal, mediante un depósito implantado, por inyección, por vía subdérmica, intraperitoneal, transmucosa, oral o en una preparación oftálmica.
[0075] La administración parenteral puede comprender por vía subcutánea, intracutánea, intravenosa, intramuscular, intraarticular, intraarterial, intrasinovial, intraesternal, intratecal, intralesional y por técnicas de infusión o inyección intracraneal.
[0076] El agente presente en dicho nanocomplejo micelar se puede administrar en una dosis de aproximadamente 1 a aproximadamente 80 mg/kg por día, de aproximadamente 1 a aproximadamente 2 mg/kg por día, de aproximadamente 1 a aproximadamente 5 mg/kg por día, de aproximadamente 1 a aproximadamente 10 mg/kg por día, de aproximadamente 1 a aproximadamente 20 mg/kg por día, de aproximadamente 1 a aproximadamente 50 mg/kg por día, de aproximadamente 2 a aproximadamente 5 mg/kg por día, de aproximadamente 2 a aproximadamente 10 mg/kg por día, de aproximadamente 2 a aproximadamente 20 mg/kg por día, de aproximadamente 2 a aproximadamente 50 mg/kg por día, de aproximadamente 2 a aproximadamente 80 mg/kg por día, de aproximadamente 5 a aproximadamente 10 mg/kg por día, de aproximadamente 5 a aproximadamente 20 mg/kg por día, de aproximadamente 5 a aproximadamente 50 mg/kg por día, de aproximadamente 5 a aproximadamente 80 mg/kg por día, de aproximadamente 10 a aproximadamente 20 mg/kg por día, de aproximadamente 10 a aproximadamente 50 mg/kg por día, de aproximadamente 10 a aproximadamente 80 mg/kg por día, de aproximadamente 20 a aproximadamente 50 mg/kg por día, de aproximadamente 20 a aproximadamente 80 mg/kg por día o de aproximadamente 50 a aproximadamente 80 mg/kg por día.
[0077] El paciente con cáncer puede padecer un cáncer seleccionado del grupo que consiste en carcinoma adrenocortical, linfoma relacionado con el SIDA, cáncer anal, cáncer de apéndice, astrocitoma de grado I (anaplásico), astrocitoma de grado II, astrocitoma de grado III, astrocitoma de grado IV, tumor teratoide atípico/rabdoide del sistema nervioso central, carcinoma de células basales, cáncer de vejiga, cáncer de bronquio, carcinoma bronquioalveolar, linfoma de Burkitt, cáncer de cuello uterino, cáncer de colon, cáncer colorrectal, craneofaringioma, linfoma cutáneo de células T, cáncer de endometrio, cáncer de endometrio uterino, ependimoblastoma, ependimoma, cáncer de esófago, estesioneuroblastoma, sarcoma de Ewing, tumor extracraneal de células germinales, tumor extragonadal de células germinales, cáncer de vías biliares extrahepáticas, histiocitoma fibroso, cáncer de vesícula biliar, cáncer gástrico, tumor carcinoide gastrointestinal, tumor del estroma gastrointestinal, tumor gestacional trofoblástico, glioma, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de corazón, cáncer hepatocelular, colangiocarcinoma hiliar, linfoma de Hodgkin, cáncer de hipofaringe, melanoma intraocular, tumor de células de los islotes, sarcoma de Kaposi, histiocitosis de células de Langerhans, cáncer de laringe, cáncer de labio, linfoma, macroglobulinemia, histiocitoma fibroso maligno, meduloblastoma, meduloepitelioma, melanoma, carcinoma de células de Merkel, mesotelioma, neoplasia endocrina, mieloma múltiple, micosis fungoide, mielodisplasia, neoplasias mielodisplásicas/mieloproliferativas, trastornos mieloproliferativos, cáncer de cavidad nasal, cáncer nasofaríngeo, neuroblastoma, linfoma no Hodgkin, cáncer oral, cáncer orofaríngeo, osteosarcoma, carcinoma ovárico de células claras, cáncer epitelial ovárico, tumor de células germinativas de ovario, papilomatosis, cáncer de seno paranasal, cáncer de paratiroides, cáncer de pene, cáncer de faringe, tumor de parénquima pineal, pineoblastoma, tumor pituitario, neoplasia de células plasmáticas, blastoma pleuropulmonar, linfoma primario del sistema nervioso central, cáncer de próstata, cáncer rectal, cáncer de células renales, cáncer de vías respiratorias con cambios en el cromosoma 15, retinoblastoma, rabdomiosarcoma, cáncer de glándulas salivales, síndrome de Sezary, cáncer de intestino delgado, sarcoma de tejidos blandos, carcinoma de células escamosas, cáncer de cuello escamoso, tumor neuroectodérmico primitivo supratentorial, cáncer de testículo, cáncer de garganta, carcinoma tímico, timoma, cáncer de tiroides, cáncer de pelvis renal, cáncer de uretra, sarcoma uterino, cáncer de vagina, cáncer de vulva, macroglobulinemia de Waldenstrom y tumor de Wilms.
[0078] El paciente con tumor puede padecer un cáncer seleccionado del grupo que consiste en carcinoma adrenocortical, cáncer anal, cáncer de apéndice, astrocitoma de grado I (anaplásico), astrocitoma de grado II, astrocitoma de grado III, astrocitoma de grado IV, tumor teratoide atípico/rabdoide del sistema nervioso central, carcinoma de células basales, cáncer de vejiga, cáncer de bronquio, carcinoma bronquioalveolar, cáncer de cuello uterino, cáncer de colon, cáncer colorrectal, craneofaringioma, cáncer de endometrio, cáncer de endometrio uterino, ependimoblastoma, ependimoma, cáncer de esófago, estesioneuroblastoma, sarcoma de Ewing, tumor extracraneal de células germinales, tumor extragonadal de células germinales, cáncer de vías biliares extrahepáticas, histiocitoma fibroso, cáncer de vesícula biliar, cáncer gástrico, tumor carcinoide gastrointestinal, tumor del estroma gastrointestinal, tumor gestacional trofoblástico, glioma, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de corazón, cáncer hepatocelular, colangiocarcinoma hiliar, cáncer de hipofaringe, melanoma intraocular, tumor de células de los islotes, sarcoma de Kaposi, histiocitosis de células de Langerhans, cáncer de laringe, cáncer de labio, acroglobulinemia, histiocitoma fibroso maligno, meduloblastoma, meduloepitelioma, melanoma, carcinoma de células de Merkel, mesotelioma, neoplasia endocrina, mieloma múltiple, micosis fungoide, mielodisplasia, neoplasias mielodisplásicas/mieloproliferativas, trastornos mieloproliferativos, cáncer de cavidad nasal, cáncer nasofaríngeo, neuroblastoma, cáncer oral, cáncer orofaríngeo, osteosarcoma, carcinoma ovárico de células claras, cáncer epitelial ovárico, tumor de células germinativas de ovario, papilomatosis, cáncer de seno paranasal, cáncer de paratiroides, cáncer de pene, cáncer de faringe, tumor de parénquima pineal, pineoblastoma, tumor pituitario, neoplasia de células plasmáticas, blastoma pleuropulmonar, cáncer de próstata, cáncer rectal, cáncer de células renales, cáncer de vías respiratorias con cambios en el cromosoma 15, retinoblastoma, rabdomiosarcoma, cáncer de glándulas salivales, síndrome de Sezary, cáncer de intestino delgado, sarcoma de tejidos blandos, carcinoma de células escamosas, cáncer de cuello escamoso, tumor neuroectodérmico primitivo supratentorial, cáncer de testículo, cáncer de garganta, carcinoma tímico, timoma, cáncer de tiroides, cáncer de pelvis renal, cáncer de uretra, sarcoma uterino, cáncer de vagina, cáncer de vulva, macroglobulinemia de Waldenstrom y tumor de Wilms.
[0079] El nanocomplejo micelar puede usarse para tratar el cáncer. El nanocomplejo micelar puede usarse para tratar un tumor.
Breve descripción de los dibujos
[0080] Los dibujos adjuntos ilustran una forma de realización divulgada y sirven para explicar los principios de la forma de realización divulgada. Debe entenderse, sin embargo, que los dibujos están diseñados únicamente con fines ilustrativos y no como una definición de los límites de la invención.
Fig.1
[Fig. 1] es un esquema sintético del conjugado PEG-mEGCG (108). Se conjugó PEG funcionalizado con tiol (PEG-SH) (102) con EGCG (104) en una mezcla 1:3 (v/v) de d Ms O y agua a pH básico (106).
Fig.2
[Fig. 2] es un espectro UV-Vis del conjugado PEG-EGCG (202) y PEG (204) disuelto en agua desionizada a una concentración de 0,5 mg ml-1.
Fig.3
[Fig. 3] se refiere a cromatogramas de HPLC de EGCG (302) y conjugado de PEG-mEGCG (304). Las flechas indican los picos de las muestras monitoreadas a 280 nm.
Fig.4
[Fig. 4] es el grado de conjugación de los conjugados PEG-mEGCG en función del tiempo de reacción.
Fig.5
[Fig. 5] es un espectro de 1H-RMN del conjugado PEG-mEGCG disuelto en D2O.
Fig.6
[Fig. 6] es un esquema que muestra la formación de nanocomplejos micelares de doxorrubicina/PEG-mEGCG.
Fig.7
[Fig. 7] se refiere a gráficos que muestran (A) el tamaño y (B) el potencial zeta de nanocomplejos micelares de doxorrubicina/PEG-mEGCG preparados en diferentes proporciones en peso entre PEG-mEGCG y doxorrubicina. El tamaño y el potencial zeta de los nanocomplejos preparados (barras negras, 702) se compararon con los de los nanocomplejos reconstituidos (barras cruzadas, 704).
Fig.8
[Fig. 8] se refiere a gráficos que muestran (A) la eficiencia de carga del fármaco y (B) el contenido de carga de nanocomplejos micelares de doxorrubicina/PEG-mEGCG preparados con diferentes proporciones en peso entre PEG-mEGCG y doxorrubicina.
Fig.9
[Fig. 9] muestra el perfil de liberación de fármaco in vitro de nanocomplejos micelares de doxorrubicina/PEG-mEGCG en PBS (pH 7,3) a 37 °C. La relación de peso entre PEG-mEGCG y doxorrubicina = 1:1.
Fig.10
[Fig. 10] muestra una ilustración esquemática de la formación de nanocomplejos micelares SU/PEG-EGCG.
Fig.11
[Fig. 11] se refiere a gráficos que muestran (A) el tamaño, (B) PDI y (C) el potencial zeta de nanocomplejos micelares SU/PEG-EGCG en diferentes proporciones en peso entre PEG-EGCG y SU.
Fig.12
[Fig. 12] se refiere a gráficos que muestran (A) la eficiencia de carga del fármaco y (B) el contenido de carga del fármaco de nanocomplejos micelares SU/PEG-EGCG preparados a diferentes proporciones en peso entre PEG-EGCG y SU.
Fig.13
[Fig. 13] se refiere a gráficos que muestran el perfil de liberación de fármaco in vitro de (A) nanocomplejos micelares de SU/PEG-mEGCG y (B) nanocomplejos micelares SU/PEG-dEGCG a diferentes proporciones en peso entre PEG-EGCG y SU en PBS (pH 7,3) a 37 °C.
Fig.14
[Fig. 14] es un gráfico que muestra las mediciones semanales del peso corporal en ratones que reciben tratamiento oral diario con SU (60 mg/kg) en comparación con los que reciben nanocomplejos micelares SU/PEG-EGCG (con las proporciones en peso entre PEG-EGCG y SU especificadas) y el grupo de control.
Fig.15
[Fig. 15] se refiere a imágenes que muestran (A) el tamaño del tumor (cuantificado por la señal luminiscente) y (B) la imagen luminiscente de ratones con tratamiento de nanocomplejo micelar de SU/PEG-EGCG (con la relación de peso especificada entre PEG-EGCG y SU), tratamiento oral con SU, o ningún tratamiento.
Fig.16
[Fig. 16] es un gráfico que muestra las mediciones del peso corporal en ratones que recibieron tratamiento diario oral con SU (40 y 15 mg/kg) en comparación con los que recibieron nanocomplejo micelar de SU/PEG-mEGCG 8:1 y el grupo de control.
Fig.17
[Fig. 17] es un gráfico que muestra el tamaño del tumor de ratones con tratamiento oral de nanocomplejo micelar de SU/PEG-mEGCG 8:1, tratamiento oral con SU, o ningún tratamiento.
Ejemplos
[0081] Los ejemplos no limitantes de la invención y un ejemplo comparativo se describirán adicionalmente con mayor detalle haciendo referencia a Ejemplos específicos, que no deben interpretarse de ninguna manera como limitantes del alcance de la invención.
Ejemplo 1: Materiales y cultivo celular
Materiales
[0082] Se obtuvo metoxi-polietilenglicol con un extremo terminal de tiol (PEG-SH, Mw = 5000 Da) de JenKem Technology (China). Se obtuvo metoxi-polietilenglicol con un extremo terminal aldehido (PEG-CHO, Mw = 5000 Da) de n Of Co., Japón. Se obtuvo (-)-epigalocatequina-3-galato (EGCG, >95 % de pureza) de Kurita Water Industries (Tokio, Japón). La solución de piruvato de sodio (100 mM) se adquirió de Invitrogen (Singapur). La solución salina PBS sin Ca2+ y Mg2+ (150 mM, pH 7,3) fue suministrada por la instalación de preparación de medios en Biopolis, Singapur. Se adquirieron DMSO y trietilamina (TEA) de Sigma-Aldrich (Singapur). El clorhidrato de doxorrubicina (DOXHCl) se adquirió de Boryung Pharm. Inc. (Corea). El SU (forma de base libre) se adquirió de BioVision (EE.UU.). Todos los demás productos químicos eran de calidad analítica.
Cultivo celular
[0083] Se obtuvieron células de carcinoma de células renales humanas A498 de la American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, EE. UU.), y se cultivaron en medio de Eagle modificado de Dulbecco complementado con suero bovino fetal al 10 %, penicilina-estreptomicina al 1 %, 2 mM de glutamina y 0,1 mM de aminoácidos no esenciales. El clon de células A498 estable que expresa el gen de luciferasa (A498-/uc) se generó según lo descrito. Brevemente, se sembraron células A498 en una placa de seis pocilios a una densidad de 5x105 células/pocillo y se transfectaron con el plásmido pRC-CMV2-luc usando Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE. UU.). Tras 1 día, las células transfectadas se transfirieron a una placa de cultivo celular de 100 mm y se añadió 1 mg ml-1 de geneticina al medio para seleccionar las células resistentes. Después de 1 semana de selección, se sembraron células resistentes en una placa de 96 pocillos a una densidad de 1 célula/pocillo para formar colonias. Se seleccionaron y expandieron un total de 10 colonias y se midió la actividad luciferasa con un kit Promega (Madison, WI, EE. UU.) en un luminómetro de un solo tubo (Berthold Lumat LB 9507, Bad Wildbad, Alemania). Se eligió un clon con la mayor actividad luciferasa y se mantuvo con 500 mg ml-1 de geneticina.
Ejemplo 2: los conjugados de PEG-EGCG
[0084] En este estudio, se utilizaron dos tipos de conjugados PEG-EGCG para formar nanocomplejos micelares, PEG-mEGCG y PEG-dEGCG, que tienen uno y dos porciones de EGCG en un extremo del PEG, respectivamente.
Síntesis del conjugado de PEG-mEGCG
[0085] El conjugado de PEG-mEGCG se sintetizó conjugando EGCG con PEG que contenía un terminal de extremo de tiol. Normalmente, se disolvió EGCG (18,3 mg, 40 |_imol) en 20 ml de una mezcla 1:1 (v/v) de PBS y DMSO. Se disolvió por separado PEG-SH (Mw= 5000 Da, JenKem Technology, China) (100 mg, 20 |_imol) en 20 ml de PBS. La solución de PEG-SH se añadió gota a gota a una solución agitada de EGCG. Como experimento de control, se añadió una solución de PEG sin modificar a una solución agitada de EGCG a la misma concentración. La mezcla resultante tiene un pH de 8,4. La mezcla se agitó durante 7 horas a 25 °C. A esta solución, se le añadieron 1,6 ml de ácido acético al 10 % para ajustar el pH a 4 para detener la reacción. La solución resultante se transfirió a tubos de diálisis con un límite de peso molecular (MWCO) de 1.000 Da. Los tubos se dializaron contra agua desionizada. La solución purificada se liofilizó para obtener el conjugado de PEG-mEGCG. La estructura del conjugado de PEG-mEGCG fue confirmada mediante espectroscopia de 1H RMN. El conjugado PEG-mEGCG seco se disolvió en D2O a una concentración de 20 mg ml-1 y luego se analizó con un espectrómetro de RMN Bruker AV-400 funcionando a 400 MHz. Rendimiento: 89 %. 1H RMN (D2O): 52,9 (t, H-a de PEG), 3,4 (s, H-y de PEG), 3,5-3,8 (m, protones de PEG), 5,5 (s, H-2 del anillo C), 5,85 (s, H-3 del anillo C), 6,15 (d, H-6 y H-8 del anillo A), 6,9 (s, H-6' del anillo B), 7,05 (s, H-2'' y H -6'' del anillo D).
[0086] La Fig. 1 ilustra el esquema sintético de conjugados de PEG-mEGCG (108). Se incubó PEG funcionalizado con tiol (PEG-SH) (102) con un exceso molar del doble de EGCG (PEG-SH: EGCG = 1:2) (104) en una mezcla 1:3 (v/v) de DMSO y agua a pH básico (106). Se ha informado que el pH influye de manera crítica en el proceso de autooxidación de EGCG. En el intervalo de pH básico de 7-9,5, el grupo galilo del anillo B es más susceptible a la autooxidación que el grupo galato del anillo D. Como resultado, solo el grupo galilo en el anillo B forma una ortoquinona. En condiciones alcalinas fuertes (pH >10), el grupo galato en el anillo D también puede autooxidarse para formar una ortoquinona. En el presente estudio, la reacción se llevó a cabo en pH 8,4 para permitir la formación de una ortoquinona únicamente en el anillo B de la EGCG. La posterior adición nucleofílica de PEG-SH a la ortoquinona produjo conjugados de PEG-mEGCG unidos a través de un enlace tioéter covalente.
[0087] Cabe destacar que la reacción de conjugación se desarrolló en presencia de dimetilsulfóxido (DMSO). Dado que la EGCG experimentaría agregación al entrar en contacto con PEG en solución acuosa, debería evitar la agregación durante la conjugación de EGCG a PEG-SH. Se descubrió que el DMSO previno eficazmente la agregación. Basándose en este hallazgo, la reacción de conjugación se realizó en una mezcla de DMSO y agua. Además, se utilizó piruvato de sodio como eliminador de H2O2 generado durante la autooxidación de EGCG. Dado que el piruvato de sodio protege los grupos tiol libres contra la oxidación mediada por H2O2, puede aumentar el número de moléculas de PEG-SH disponibles para una reacción de conjugación con EGCG. El conjugado de PEG-mEGCG obtenido se purificó por diálisis en una atmósfera de nitrógeno y luego se liofilizó para obtener un polvo blanco.
Caracterización UV-Vis del conjugado de PEG-mEGCG
[0088] Los conjugados de PEG-mEGCG se caracterizaron usando espectroscopía ultravioleta-visible (UV-Vis) (Fig. 2).
[0089] Los espectros UV-Vis de los conjugados de PEG-mEGCG se midieron en un espectrofotómetro Hitachi U-2810 (Japón). Para la espectroscopía UV-Vis, se disolvieron el conjugado PEG-mEGCG seco y PEG en agua desionizada a una concentración de 0,5 mg ml-1. A diferencia del p Eg sin modificar (204), se demostró que los conjugados de PEG-mEGCG (202) presentaban un pico de absorción de UV intenso a 280 nm, indicativo de una conjugación exitosa de EGCG. Además, no se observó la banda de absorción de UV a 425 nm correspondiente a los dímeros de EGCG y a otros productos oxidativos.
Caracterización por HPLC del conjugado de PEG-mEGCG
[0090] El conjugado de PEG-mEGCG también se evaluó mediante cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) en fase inversa. Se realizó HPLC de fase inversa usando un módulo de separaciones Waters 2695 equipado con una columna orgánica Spirit™ C18 (5 |_im, 4,6 x 250 mm d.i., AAPPTec). La EGCG, la mezcla de PEG/EGCG y los conjugados de PEG-mEGCG se disolvieron en agua desionizada en una concentración de 1 mg ml-1. Las muestras se eluyeron con una mezcla de disolventes de ácido acético al 1 % en acetonitrilo y ácido acético al 1 % en agua con un caudal de 1 ml/minuto a 25 °C. Para la fase móvil, la relación de volumen entre acetonitrilo y agua aumentó gradualmente de 3:7 a 0 minutos a 4:6 a 10 minutos. Las muestras eluidas se controlaron a 280 nm. El grado de conjugación de EGCG se determinó comparando el área de pico integrada con las obtenidas de una serie de soluciones estándar de EGCG de diversas concentraciones. Como se muestra en la Fig. 3, se eluyó EGCG (302) en un tiempo de retención de 4,8 min, mientras que el conjugado de PEG-mEGCG (304) se eluyó a los 8 min. Este cambio dramático en el tiempo de retención podría explicarse por la unión de una cadena de PEG hidrófila a EGCG. Además, no se observó ningún pico de EGCG en el cromatograma de HPLC de los conjugados de PEG-mEGCG, lo que sugiere que las moléculas de EGCG que no reaccionaron se eliminaron por completo mediante diálisis. El grado de conjugación de EGCG aumentó de ~ 63 a 98 % a medida que el tiempo de reacción aumentó de 6 a 7 horas (Fig. 4). Sin embargo, cuando el tiempo de reacción fue de 8 h, el grado de conjugación disminuyó ligeramente, presumiblemente porque comenzaron a formarse dímeros de EGCG y otros productos oxidativos. Por lo tanto, el tiempo de reacción óptimo fue de 7 h.
Caracterización por 1H RMN del conjugado de PEG-mEGCG
[0091] La estructura de los conjugados de PEG-mEGCG se determinó mediante espectroscopía de resonancia magnética nuclear 1H (RMN). Como se muestra en la Fig.5, los conjugados de PEG-mEGCG mostraron señales de protones para el anillo A (h-6 y H-8 en 5 = 6,15), el anillo C (H-2 en 5 = 5,5 y H-3 en 5 = 5,85) y el anillo D (H-2” y H-6” en 5 = 7,1). Las señales de protones que surgen de los anillos A, C y D eran similares a las de la EGCG sin modificar, lo que sugiere que estas porciones permanecieron sin cambios durante la reacción de conjugación. En cambio, las señales de protones para el anillo B cambiaron de 6,5 a 6,9 ppm después de la reacción de conjugación. Este cambio significativo en las señales de protones probablemente se atribuyó a la unión de PEG-SH a la posición C2' del anillo B. Además, se demostró que el pico de RMN del anillo B tenía la mitad del área debajo del pico del anillo D, lo que indica que un protón del anillo B desapareció después de la reacción de conjugación. El fenómeno observado estaba de acuerdo con el informe anterior, según el cual la formación de 2'-cisteinil EGCG provocó la desaparición del átomo de H-2' del anillo B. Los resultados anteriores revelaron que solo una molécula de PEG podría conjugarse específicamente a la posición C2' del anillo B de EGCG.
Síntesis del conjugado de PEG-dEGCG
[0092] Los conjugados PEG-dEGCG se sintetizaron conjugando EGCG con PEG con un grupo terminal aldehído (PEG-CHO). El PEG-CHO (Mw= 5000 Da, NOF Co., Japón) (1,75 g) y EGCG (3,25 g, 7,09 mmol) se disolvieron por separado en una mezcla de ácido acético, agua y DMSO. La reacción se inició con la adición gota a gota de la solución de PEG-CHO, y se llevó a cabo a 20 °C durante 72 h. La solución resultante se dializó (MWCO = 3500 Da) contra agua desionizada. La solución purificada se liofilizó para obtener conjugados de PEG-dEGCG.
Ejemplo 3: El conjugado de doxorrubicina/PEG-mEGCG
[0093] Para las aplicaciones de la terapia contra el cáncer, los conjugados de PEG-mEGCG se diseñaron para formar nanocomplejos micelares capaces de transportar una gran cantidad de medicamentos contra el cáncer en el interior. En este estudio, se utilizaron nanocomplejos micelares de PEG-mEGCG como vehículo de administración de doxorrubicina. La doxorrubicina es uno de los agentes quimioterapéuticos más ampliamente utilizados y exhibe una fuerte actividad citotóxica contra varios tipos de cánceres, como leucemia, cáncer de mama, cáncer de ovario y cáncer de pulmón. Sin embargo, puede causar cardiotoxicidad grave y aumentar el riesgo de insuficiencia cardíaca congestiva, arritmias cardíacas, hipotensión y otros efectos secundarios. Se prevé que los nanocomplejos micelares de PEG-mEGCG pueden minimizar tales efectos secundarios adversos encapsulando de forma estable moléculas de fármaco en su interior y liberándolas de forma sostenida.
Formación de nanocomplejos micelares de doxorrubicina/PEG-mEGCG
[0094] Se prepararon nanocomplejos micelares de doxorrubicina/PEG-mEGCG usando un método de diálisis. Brevemente, se disolvieron 5 mg de DOXHCl en 4,5 ml de dimetilformamida. A esta solución, se añadió TEA en una relación molar TEA:DOXHCl de 5:1. Esta mezcla se agitó con vórtex durante 30 minutos para formar doxorrubicina desprotonada (DOX). La solución de DOX resultante se mezcló con conjugados de PEG-mEGCG disueltos en 0,5 ml de dimetilformamida en proporciones en peso variables de PEG-mEGCG/DOX. Esta mezcla se agitó con vórtex durante 90 minutos y luego se transfirió a tubos de diálisis con un MWCO de 2.000 Da. Los tubos se dializaron contra agua desionizada durante 24 horas para obtener los nanocomplejos micelares de doxorrubicina/PEG-mEGCG.
Caracterización de los nanocomplejos micelares de doxorrubicina / PEG-mEGCG
[0095] Los diámetros hidrodinámicos, los índices de polidispersidad y los potenciales zeta de los nanocomplejos micelares de doxorrubicina/PEG-mEGCG se evaluaron mediante dispersión de luz dinámica (Zetasizer Nano ZS, Malvern, Reino Unido). La medición se realizó por triplicado en agua a 25 °C. Para medir la cantidad de carga de doxorrubicina, se mezclaron 20 |_il de los nanocomplejos dispersos en agua con 980 |_il de dimetilformamida para extraer la doxorrubicina. La absorbancia de la doxorrubicina a 480 nm se midió usando un espectrofotómetro Hitachi U-2810 (Japón). La eficacia de la carga del fármaco y el contenido de carga se determinaron comparando los valores de absorbancia con los obtenidos a partir de una serie de soluciones estándar de doxorrubicina con concentraciones variables.
[0096] La Fig. 6 ilustra la formación de nanocomplejos micelares de doxorrubicina/PEG-mEGCG. Se codisolvieron conjugados de PEG-mEGCG (602) y doxorrubicina (604) en dimetilformamida (606). Esta mezcla se dializó frente a agua destilada (608). A medida que se eliminó el disolvente orgánico de los tubos de diálisis, las porciones de EGCG hidrófobas de los conjugados comenzaron a autoensamblarse para formar un núcleo micelar rodeado por una capa de las cadenas de PEG hidrófilas (610). Simultáneamente, las moléculas de doxorrubicina también se dividieron en el núcleo micelar hidrófobo. También se indicó que las moléculas de doxorrubicina se apilaban fácilmente juntas en una solución acuosa debido a la interacción n -n entre los anillos de antraciclina planos. Dado que la EGCG tiene una estructura polifenólica capaz de interactuar con la doxorrubicina a través del apilamiento n-n, se anticipó que la EGCG enriquecida en el núcleo de los nanocomplejos micelares podría proporcionar un entorno favorable para el atrapamiento de la doxorrubicina dentro de ellos. Además, las cadenas de PEG expuestas a la superficie podrían formar una capa protectora alrededor de los nanocomplejos micelares para evitar la eliminación por parte del sistema reticuloendotelial, lo que permite una circulación prolongada en el torrente sanguíneo.
[0097] El tamaño y la carga superficial de los nanocomplejos micelares de doxorrubicina/PEG-mEGCG se caracterizaron mediante análisis de dispersión dinámica de luz (DLS). La Fig. 7 se refiere a gráficos que muestran (A) el tamaño y (B) el potencial zeta de nanocomplejos micelares de doxorrubicina/PEG-mEGCG.
[0098] La Fig. 7A muestra el diámetro hidrodinámico de los nanocomplejos micelares preparados a diferentes relaciones en peso entre PEG-mEGCG y doxorrubicina. En particular, los nanocomplejos se produjeron con un intervalo de tamaño de 130-180 nm. Un tamaño tan pequeño es favorable para lograr una circulación prolongada en el torrente sanguíneo y el direccionamiento al tumor a través del efecto de permeabilidad y retención (EPR) mejorado.
[0099] Los nanocomplejos micelares formados en una relación en peso entre PEG-mEGCG y doxorrubicina de 0,5:1 tienen un diámetro mayor que los formados a 1:1. El atrapamiento de mayores cantidades de doxorrubicina probablemente fue responsable de la formación de nanocomplejos micelares más grandes. Los nanocomplejos eran altamente monodispersos, como demuestra el pequeño valor del índice de polidispersidad (PDI) que se encuentra dentro del intervalo de 0,1-0,2.
[0100] Como se muestra en la Fig. 7B, los nanocomplejos micelares tenían un potencial zeta positivo en el intervalo de 15-25 mV. Esta carga de superficie catiónica se atribuyó a la encapsulación de moléculas de doxorrubicina con carga positiva dentro de los nanocomplejos. También evaluamos si los nanocomplejos micelares mantuvieron su integridad estructural durante un proceso de liofilización. La liofilización es una de las técnicas más populares utilizadas para el almacenamiento a largo plazo de nanopartículas coloidales. Los nanocomplejos se liofilizaron y luego se redispersaron en agua desionizada con la misma concentración. Se descubrió que los nanocomplejos reconstituidos retienen el tamaño de partícula original y la carga superficial incluso sin lioprotectores. Esta alta estabilidad coloidal sería ventajosa en la traducción clínica y la comercialización de los nanocomplejos micelares.
[0101] La figura 8 muestra la eficiencia de carga del fármaco y el contenido de carga de los nanocomplejos micelares de doxorrubicina/PEG-mEGCG. La eficiencia de carga del fármaco fue superior al 75 %, lo que indica que la doxorrubicina se incorporó de forma eficaz en los nanocomplejos de PEG-mEGCG. A medida que disminuyó la relación en peso entre PEG-mEGCG y doxorrubicina, aumentaron tanto la eficiencia de carga del fármaco como el contenido de carga. El contenido de carga observado (35-50 % p/p) fue significativamente mayor que los logrados con otros sistemas micelares poliméricos. El apilamiento n -n y/o las interacciones hidrofóbicas entre EGCG y doxorrubicina podrían haber desempeñado un papel importante en la alta capacidad de carga de fármacos de los nanocomplejos micelares de PEG-mEGCG.
Estudio de liberación de doxorrubicina
[0102] Para los experimentos de liberación, se colocaron 0,5 ml de nanocomplejos cargados con doxorrubicina (2 mg ml-1) en tubos de diálisis con un MWCO de 2.000 Da. Los tubos se sumergieron en 25 ml de PBS en una incubadora con agitación a 37 °C. En un momento dado, se recogió 1 ml del medio de liberación y luego se reemplazó con un volumen equivalente de PBS reciente. La cantidad de doxorrubicina liberada en el medio se determinó midiendo la absorbancia de doxorrubicina a 480 nm usando un espectrofotómetro Hitachi U-2810 (Japón).
[0103] También se investigó el perfil de liberación de fármacos de nanocomplejos micelares de doxorrubicina/PEG-mEGCG con temperatura y pH fisiológicos. Como se muestra en la Fig. 9, los nanocomplejos micelares mostraron una liberación sostenida de doxorrubicina en PBS. Aproximadamente el 11 % de la doxorrubicina cargada se liberó en 7 días. La tasa de liberación observada es considerablemente menor que la de los otros sistemas de liberación de doxorrubicina anteriormente indicados. Esta liberación sostenida de fármaco probablemente se produjo por la fuerte interacción entre EGCG y doxorrubicina dentro de los nanocomplejos micelares. Además, solo se observó una liberación de ráfaga marginal en la etapa inicial, lo que sugiere que las moléculas de doxorrubicina estaban encapsuladas de manera estable en los nanocomplejos micelares. Una fuga de fármaco tan baja sería esencial para garantizar la máxima eficacia terapéutica con efectos secundarios mínimos, ya que las moléculas de fármaco encapsuladas en los nanocomplejos no se filtrarían prematuramente durante la circulación en el torrente sanguíneo. Tomados en conjunto, estos resultados demostraron que los nanocomplejos micelares de PEG-mEGCG podrían aplicarse para la administración sistémica de doxorrubicina para el tratamiento contra el cáncer.
Ejemplo 4: Los conjugados de SU/PEG-EGCG
Formación de nanocomplejos micelares de SU/PEG-EGCG
[0104] La Fig. 10 ilustra la formación de conjugados SU/PEG-EGCG usando el método de dispersión sólida. Brevemente, se disolvieron 2 mg de SU (1006) en 1 ml de cloroformo. A continuación, se añadió la solución de SU a los conjugados de PEG-EGCG (ya sea PEG-mEGCG (1002) o PEG-dEGCG (1004) en viales de vidrio con proporciones en peso variables de PEG-EGCG:SU (1008) y se agitó en vórtex. Luego se evaporó el cloroformo de la solución a presión reducida (1010). La película fina resultante de la mezcla de PEG-EGCG y SU (1012) se hidrató añadiendo 2 ml de agua a la superficie (1014) y se incubó a temperatura ambiente durante 24 h. Conforme se hidrató la película sólida resultante, el PEG-EGCG se autoensambló para formar nanocomplejos micelares mediante el aislamiento de porciones de SU y EGCG de las cadenas de PEG hidratadas. A continuación, la solución de nanocomplejos micelares de SU/p EG-EGCG se filtró (1016) a través de un filtro de 0,8 pm (Sartorius Stedim Biotech GmbH, Alemania) para eliminar cualquier fármaco libre residual produciendo la solución transparente de nanocomplejos micelares de SU/PEG-EGCG (1018). Para los estudios in vivo, la solución de nanocomplejos micelares de Su /PEG-EGCG se filtró adicionalmente utilizando un filtro de 0,2 pm (Sartorius Stedim Biotech GmbH, Alemania).
[0105] Cabe señalar que los conjugados de PEG-EGCG se refieren tanto a PEG-mEGCG como a PEG-dEGCG a menos que se especifique.
[0106] Puesto que la EGCG tiene una estructura de polifenoles capaz de interactuar con SU mediante interacción hidrofóbica y apilamiento n-n, se anticipó que la EGCG enriquecida en el núcleo de nanocomplejos micelares proporcionaría un entorno favorable para el atrapamiento de Su . Además, las cadenas de PEG expuestas a la superficie formarían una capa altamente hidratada alrededor de los nanocomplejos micelares para evitar la eliminación por parte del RES, permitiendo así una circulación prolongada en el torrente sanguíneo y una reducción de los efectos secundarios.
Caracterización de nanocomplejos micelares de SU/PEG-mEGCG
[0107] Los diámetros hidrodinámicos, la distribución de tamaño y la carga superficial de nanocomplejos micelares de SU/PEG-mEGCG se evaluaron mediante dispersión dinámica de luz (DLS) (Zetasizer Nano ZS, Malvern, Reino Unido). Las medidas se realizaron por triplicado en agua a 25 °C. La Fig. 11A muestra el diámetro hidrodinámico de los nanocomplejos micelares preparados con diferentes relaciones en peso entre PEG-EGCG y SU. En particular, los nanocomplejos micelares se produjeron en el intervalo de tamaño de 130-250 nm. El tamaño nanométrico sería favorable para prolongar la circulación y para atacar el tumor a través del efecto EPR. Las características de los nanocomplejos micelares se controlaron variando las relaciones en peso entre PEG-EGCG y SU. La Fig. 11B muestra que los nanocomplejos micelares formados con relaciones en peso entre PEG-EGCG y SU de 8 y 16 eran altamente monodispersos. Los nanocomplejos micelares disminuyeron su carga positiva a medida que aumentaba la relación en peso entre PEG-EGCG y SU (Fig. 11C). Su carga superficial ligeramente positiva se atribuyó a la encapsulación de moléculas SU con carga positiva.
[0108] Para medir la cantidad y la eficiencia de carga del fármaco, se disolvieron 10 pL de nanocomplejos micelares en agua en 990 pL de DMF y se midió la absorbancia de SU a 431 nm utilizando un espectrofotómetro Hitachi U-2810 visible en ultravioleta (UV-Vis) (Japón). La curva de calibración obtenida con las soluciones estándar de SU se utilizó para determinar la cantidad y la eficiencia de carga.
[0109] La Fig. 12 muestra la eficiencia de carga de fármaco y el contenido de carga de fármaco de nanocomplejos micelares de SU/PEG-EGCG. A medida que aumentó la relación en peso entre PEG-EGCG y SU de 1 a 16, la eficiencia de carga de fármaco aumentó de ~ 30 % a ~ 80 %. La eficiencia de carga de los nanocomplejos micelares de SU/PEG-dEGCG fue mayor que la de los nanocomplejos micelares de SU/PEG-mEGCG, lo que indica una mayor interacción de SU con PEG-dEGCG en comparación con PEG-mEGCG. También se descubrió que la eficiencia de carga de los nanocomplejos micelares estaba relacionada con la cantidad de precipitado de Su no depositado antes de la filtración. Cuando la relación en peso entre PEG-EGCG y SU aumentó a 8, no se encontraron precipitados de SU. Como se esperaba, el contenido de carga de los nanocomplejos micelares disminuyó a medida que aumentó la relación en peso entre PEG-EGCG y SU debido al mayor contenido de PEG-EGCG en los nanocomplejos micelares.
Estudio de liberación de SU
[0110] El perfil de liberación de fármaco de los nanocomplejos micelares SU/PEG-EGCG se investigó adicionalmente en condiciones fisiológicas (solución salina tamponada con fosfato (PBS), pH 7,3 a 37 °C). Para experimentos de liberación de SU, se colocaron 0,5 ml de nanocomplejos micelares de SU/PEG-EGCG (0,4 mg ml-1) en tubos de diálisis (MWCO = 2000 Da). Los tubos se sumergieron en 25 ml de PBS en una incubadora con agitación a 37 °C. En un momento dado, se recogió 1 ml del medio de liberación y luego se reemplazó con un volumen equivalente de PBS reciente. La cantidad de SU liberada en el medio se determinó midiendo la absorbancia a 431 nm usando un espectrofotómetro Hitachi U-2810.
[0111] Como se muestra en la Fig. 13, los nanocomplejos micelares mostraron una liberación sostenida de SU en PBS, lo que podría atribuirse a la fuerte interacción entre EGCG y SU dentro de los nanocomplejos micelares.
Además, casi no se observó ninguna liberación en ráfaga, lo que sugiere que las moléculas de SU estaban encapsuladas de manera estable en los nanocomplejos micelares. Los nanocomplejos micelares de SU/PEG-mEGCG mostraron una liberación más rápida y mayor de SU en comparación con los nanocomplejos micelares de SU/PEG-dEGCG debido a la interacción más débil entre las porciones de SU y mEGCG. La cantidad y la velocidad de liberación también dependían de la relación de peso entre PEG-EGCG y SU. Para los nanocomplejos micelares de SU/PEG-mEGCG, tanto la tasa de liberación como la cantidad disminuyeron a medida que aumentó la relación en peso entre PEG-EGCG y SU. La relación en peso entre PEG-EGCG y SU no afectó significativamente la velocidad de liberación y la cantidad en los nanocomplejos micelares de SU/PEG-dEGCG, salvo que una liberación más lenta y más baja se asoció con una relación de peso entre PEG-EGCG y SU de 8.
Estudio terapéutico in vivo
[0112] Para estudiar la toxicidad y el efecto terapéutico, se realizaron estudios in vivo sobre los nanocomplejos micelares. Se estableció un modelo de carcinoma de células renales subcutáneo. Se utilizaron hembras adultas de ratones desnudos Balb/c atímicos e inmunoincompetentes (peso medio = 19 g, edad = 6-8 semanas).
[0113] Para estudiar el efecto terapéutico de los nanocomplejos micelares de SU/PEG-EGCG mediante inyección intravenosa, se estableció un modelo de tumor de xenoinjerto inoculando 6x106 células A498-luc por vía subcutánea en la raíz del muslo izquierdo del ratón. El día 6 después de la inoculación del tumor, los animales se dividieron en cuatro grupos para la inyección en la vena de la cola de varias soluciones (n = 8 por grupo) dos veces por semana durante 5 semanas, mientras que un grupo recibió diariamente dosis de SU a 60 mg/kg. Para la inyección en la vena de la cola, se utilizó un volumen de 200 |_il de solución de muestra.
[0114] Para monitorizar señales bioluminiscentes de células A498-luc, a los animales anestesiados con gas isoflurano se les inyectaron intraperitonealmente 200 |_il de D-luciferina (5 mg ml-1, Promega) en PBS, y se colocaron en un escenario calentado (30 °C) dentro de la caja de la cámara del sistema de imágenes IVIS (Xenogen, Alameda, CA, EE. UU.) con una cámara CCD. Se tomaron imágenes luminiscentes 20 minutos después de la inyección de luciferina como una adquisición de 30 s. La luz emitida por las células A498-luc se digitalizaron y se visualizaron electrónicamente como una superposición de pseudocolor sobre una imagen en escala de grises del animal. Se adquirieron imágenes y mediciones de señales luminiscentes y se analizaron con el software de imágenes Xenogen v3.2, y se cuantificaron como fotón(es). El tamaño del tumor y el peso corporal se midieron semanalmente. Todo el manejo y cuidado de los animales se realizó de acuerdo con las Directrices sobre el cuidado y uso de animales con fines científicos emitidas por el Comité Asesor Nacional para la Investigación con Animales de Laboratorio (Singapur).
[0115] Todos los datos se representaron como media ± error estándar de la media (SEM). La significación estadística de las diferencias entre los valores medios se determinó mediante la prueba t de Student. Las comparaciones múltiples se evaluaron mediante ANOVA con las pruebas de comparación múltiple de Bonferroni utilizando SigmaStat 3.5. Se consideró estadísticamente significativo un valor de p <0,05.
[0116] Los nanocomplejos micelares de SU/PEG-mECGC (con relaciones de peso entre PEG-EGCG y SU de 8 y 16) y los nanocomplejos micelares SU/PEG-dEGCG (con relación de peso entre PEG-EGCG y SU de 8) fueron seleccionados para los estudios in vivo en función del tamaño del nanocomplejo micelar, la distribución de tamaño y la carga superficial. Se inyectaron por vía intravenosa nanocomplejos micelares SU/PEG-mEGCG dos veces por semana durante 5 semanas, y un grupo recibió dosis diarias de SU a 60 mg/kg. La dosis de fármaco oral de 60 mg/kg por día se seleccionó basándose en informes previos que demostraron que la dosis preclínica óptima de SU para la eficacia antitumoral en ratones era de 40-80 mg/kg por día. Para nuestros estudios, la dosis de 60 mg/kg por día representó una dosis antitumoral eficaz, ya que otros estudios indicaron que una dosis de <40 mg/kg por día sería subeficaz, y una dosis de 120 mg/kg por día probaría los efectos de una administración más elevada del fármaco.
[0117] La figura 14 muestra una pérdida de peso significativa en el grupo que recibió SU libre oral una semana después del comienzo del tratamiento. Esto no se observó en los otros grupos que recibieron tratamiento con nanocomplejos micelares de SU/PEG-EGCG. El efecto antitumoral se potenció cuando se administraron nanocomplejos micelares de SU/PEG-EGCG dos veces por semana, en comparación con la terapia oral diaria de SU (Fig. 15). Este efecto antitumoral con nanocomplejos micelares de SU/PEG-EGCG se logró a casi una décima parte de la concentración de la dosis oral. El efecto inhibidor del nanocomplejo micelar SU/PEG-EGCG se mantuvo durante un período sustancial incluso cuando se detuvo la terapia después de 5 semanas. La tasa de crecimiento tumoral fue mucho más rápida en el grupo que recibió tratamiento oral, en comparación con los grupos que recibieron tratamiento con nanocomplejos micelares.
[0118] Para investigar el efecto terapéutico de SU/PEG-mEGCG MNC mediante administración por vía oral, se estableció un modelo de tumor de xenoinjerto inoculando 4x106 células ACHN suspendidas en 100 |_il de PBS y 100 |_il de Matrigel (BD Bioscience) por vía subcutánea en la raíz del muslo derecho del ratón. Una vez que los tumores alcanzaron un volumen de 200 mm3, los animales se dividieron en cuatro grupos para la alimentación por sonda oral de varias soluciones (n = 8 por grupo) a diario durante 5 semanas: control (tampón citrato pH5), SU/PEG-mEGCG 8:1 (SU a 15 mg/kg), SU a 15 y 40 mg/kg. Los tumores se midieron dos veces por semana con un calibre digital y los volúmenes tumorales (mm3) se calcularon a partir de la siguiente fórmula: volumen = (largo x ancho2)/2 (Figs. 16 y 17).
[0119] Como se ha demostrado que la dosis de SU oral de 60 mg/kg por día es demasiado tóxica, la dosis de SU oral se redujo a 40 mg/kg por día en esta descripción. Esta dosis oral de 40 mg/kg por día es la dosis preclínica óptima para la eficacia antitumoral en ratones (40-80 mg/kg por día) según informes anteriores. La figura 16 muestra una pérdida de peso significativa en el grupo que recibió SU a 40 mg/kg durante el tratamiento. Esto no se observó en los otros grupos que recibieron SU/PEG-mEGCG MNC 8:1 y SU a 15 mg/kg de tratamiento. Con la misma dosis de SU a 15 mg/kg, SU/PEG-mEGCG MNC mostró un efecto terapéutico significativamente mayor en comparación con SU solo (Fig. 17). Este efecto antitumoral con SU/PEG-mEGCG MNC se logró a menos de la mitad de la concentración de la dosis oral óptima de SU a 40 mg/kg. El efecto inhibidor de SU/PEG-mEGCG MNC se mantuvo durante un período sustancial incluso cuando se puso fin a la terapia después de 5 semanas.
[0120] El efecto EPR considera la naturaleza anatómico-fisiológica de los vasos sanguíneos tumorales que facilitan el transporte de macromoléculas de > 40 kDa que se filtran selectivamente de los vasos tumorales y se acumulan en el tejido tumoral. La mayoría de los tumores sólidos tienen vasos sanguíneos con una arquitectura defectuosa, lo que suele dar lugar a grandes cantidades de permeabilidad vascular. Esto no ocurre en tejidos normales. La presente invención describe el uso de nanocomplejos micelares de SU/PEG-mEGCG mediante administraciones tanto intravenosas como orales, como una posible terapia para ccRCC por primera vez. Se ha observado que la EGCG interactuó con SU, y los estudios farmacocinéticos en ratas mostraron que la administración de EGCG redujo notablemente las concentraciones plasmáticas de SU. La interacción señalada del té verde con SU y el efecto EPR de las nanopartículas micelares en varios tumores sugirió la posibilidad de usar PEG-EGCG como un vehículo de nanopartículas para la administración de SU. En el glioblastoma, un tumor muy angiogénico, la terapia antiangiogénica ha mostrado una eficacia elevada, pero transitoria. Dicho tumor estimula la formación de nuevos vasos sanguíneos a través de procesos impulsados principalmente por VEGF, aunque los vasos resultantes son estructural y funcionalmente anormales. El uso de nanocomplejos micelares de SU/PEG-EGCG podría potenciar posiblemente la actividad antiangiogénica en tales casos.
Aplicabilidad industrial
[0121] Los nanocomplejos micelares se pueden aplicar para su uso en la administración sistémica de doxorrubicina para el tratamiento del cáncer.
[0122] Los nanocomplejos micelares se pueden usar como un vehículo de nanopartículas para el suministro de SU. En el glioblastoma, un tumor muy angiogénico, la terapia antiangiogénica ha mostrado una eficacia elevada, pero transitoria. Dicho tumor estimula la formación de nuevos vasos sanguíneos a través de procesos impulsados principalmente por VEGF, aunque los vasos resultantes son estructural y funcionalmente anormales. El uso de nanocomplejos micelares que comprenden SU puede potenciar posiblemente la actividad antiangiogénica en tales casos.
[0123] Los nanocomplejos micelares se pueden usar para la liberación sostenida de agentes terapéuticos cuando se administran sistémicamente, o como un sistema de liberación de agentes terapéuticos en sitios de interés.
[0124] Los nanocomplejos micelares pueden usarse para encapsular varios agentes terapéuticos para diferentes tipos de tratamientos contra el cáncer.
[0125] Los nanocomplejos micelares también pueden usarse para la encapsulación de varios agentes terapéuticos para el tratamiento no canceroso. Esto puede incluir pequeñas moléculas para antibióticos y otras aplicaciones médicas.

Claims (28)

REIVINDICACIONES
1. Nanocomplejo micelar que comprende una micela y un agente encapsulado dentro de dicha micela, comprendiendo dicha micela un conjugado polímero-flavonoide, en el que dicho polímero es un polímero hidrófilo unido al anillo B de dicho flavonoide.
2. Nanocomplejo micelar según la reivindicación 1, en el que dicho polímero está unido a dicho flavonoide mediante un enlazador, dicho enlazador se selecciona del grupo que consiste en un grupo tioéter, imina, amina, azo y 1,2,3-triazol.
3. Nanocomplejo micelar según la reivindicación 1 o 2, en el que dicho flavonoide es un flavonoide monomérico o un flavonoide dimérico.
4. Nanocomplejo micelar según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicho polímero hidrófilo comprende monómeros seleccionados del grupo que consiste en acrilamidas, alquilos, oxazolinas, alquenilos, iminas, ácidos acrílicos, metacrilatos, dioles, oxiranos, alcoholes, aminas, anhídridos, ésteres, lactonas, carbonatos, ácidos carboxílicos, acrilatos, hidroxilos, fosfatos, tereftalato, amidas y éteres.
5. Nanocomplejo micelar según la reivindicación 4 anterior, en el que dicho polímero hidrófilo se selecciona del grupo que consiste en poliacrilamida, poli(N-isopropilacrilamida), poli(oxazolina), polietilenimina, poli(ácido acrílico), polimetacrilato, poli(etilenglicol), poli(óxido de etileno), poli(alcohol vinílico), poli(vinilpirrolidinona), poliéteres, poli(alilamina), polianhídridos, poli(S-aminoéster), poli(succinato de butileno), policaprolactona, policarbonato, polidioxanona, poli(glicerol), ácido poliglicólico, poli(ácido 3-hidroxipropiónico), poli(metacrilato de 2-hidroxietilo), poli(W-(2-hidroxipropil)metacrilamida), ácido poliláctico, poli(ácido láctico-co-glicólico), poli(ortoésteres), poli(2-oxazolina), poli(ácido sebácico), poli(tereftalato-cofosfato) polisacárido y copolímeros de los mismos.
6. Nanocomplejo micelar según la reivindicación 5, en el que dicho polímero hidrófilo es un polisacárido seleccionado del grupo que consiste en ácido hialurónico, dextrano, pululano, quitosano, celulosa, amilosa, almidón, gelatina, carragenano, ciclodextrina, sulfato de dextrano, ficol, goma gellan, goma guar, pectina, polisacarosa, pululano, escleroglucano, goma xantana, xiloglucano y alginato.
7. Nanocomplejo micelar según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicho flavonoide se selecciona del grupo que consiste en flavonas, isoflavonas, flavanos, proantocianidinas y antocianidinas.
8. Nanocomplejo micelar según la reivindicación 7, en el que dichos flavanos se seleccionan del grupo que consiste en (-)-epicatequina, (+)-epicatequina, (-)-catequina, (+)-catequina, epicatequina galato, epigalocatequina, epigalocatequina galato, fisetinidol, galocatequina, galocatequina galato, mesquitol y robinetinidol, elagitanino, galotanino, oolongteanina, florotanino, tanino, teacitrina, teadibenzotropolona, teoflavina, teanaftoquinona, tearubiginas, teasinensina y mezclas de los mismos.
9. Nanocomplejo micelar según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicho agente es un agente terapéutico.
10. Complejo micelar según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicho agente terapéutico es un agente quimioterapéutico seleccionado del grupo que consiste en agentes alquilantes, antraciclinas, disruptores del citoesqueleto, epotilonas, inhibidores de histona desacetilasa, inhibidores de topoisomerasa I, inhibidores de topoisomerasa II, inhibidores de quinasa, anticuerpos monoclonales, conjugados anticuerpo-fármaco, análogos de nucleótidos, análogos de precursores, antibióticos peptídicos, agentes a base de platino, retinoides, alcaloides de la vinca, citocinas, antimetabolitos y derivados de los alcaloides de la vinca, y otros citotóxicos.
11. Complejo micelar según la reivindicación 10, en el que dicho agente quimioterapéutico se selecciona del grupo que consiste en Actinomicina, Afatinib, Ácido retinoico todo-trans, Axitinib, Azacitidina, Azatioprina, Bevacizumab, Bleomicina, Bosutinib, Bortezomib, Carboplatino, Capecitabina, Cetuximab, Cisplatino, Clorambucil, Crizotinib, Ciclofosfamida, Citarabina, Dasatinib, Daunorrubicina, Docetaxel, Doxifluridina, Doxorrubicina, Epirrubicina, Epotilona A (C26H39NO6S), Epotilona B (C27H41NO6S), Epotilona C (C26H39NO5S), Epotilona D (C27H41NO5S), Epotilona E (C26H39NO7S), Epotilona F (C27H41NO7S), Erlotinib, Etopósido, Fluorouracilo, Fostamatinib, Gefitinib, Gemcitabina, Hidroxiurea, Idarrubicina, Imatinib, Irinotecán, Lapatinib, Lenvatinib, Mecloretamina, Mercaptopurina, Metotrexato, Mitoxantrona, Nilotinib, Oxaliplatino, Paclitaxel, Panitumumab, Pazopanib, Pegaptanib, Pemetrexed, Ranibizumab, Regorafenib, Ruxolitinib, Sorafenib, Sunitinib, Trastuzumab, Tenipósido, Tioguanina, Tofacitinib, Topotecán, Valrrubicina, Vemurafenib, Vinblastina, Vincristina, Vindesina, Vinorelbina.
12. Nanocomplejo micelar según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicho nanocomplejo micelar tiene un tamaño en el intervalo de 30 a 300 nm, de 50 a 300 nm, de 100 a 300 nm, de 30 a 50 nm, de 30 a 100 nm, de 30 a 150 nm, de 150 a 300 nm, de 200 a 300 nm, de 250 a 300 nm, de 100 a 150 nm, de 100 a 200 nm, de 100 a 250 nm, de 130 a 180 nm o de 130 a 250 nm medido mediante análisis de dispersión dinámica de luz (DLS).
13. Nanocomplejo micelar según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el contenido de carga de dicho agente presente dentro de dicha micela está en el intervalo de 1 a 10 % p/p, de 5 a 25 % p/p, de 20 a 45 % p/p, de 30 a 50 % p/p, de 35 a 50 % p/p, de 40 a 50 % p/p, de 45 a 50 % p/p, de 30 a 35 % p/p, de 30 a 40 % p/p o de 30 a 45 % p/p en función del peso total del nanocomplejo micelar.
14. Nanocomplejo micelar según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicho nanocomplejo micelar comprende una micela y un agente encapsulado dentro de dicha micela como un vehículo de administración de fármaco, donde dicha micela comprende un conjugado polímero-flavonoide, y donde dicho polímero es un polímero hidrófilo unido al anillo B de dicho flavonoide.
15. Método para formar un nanocomplejo micelar que comprende una micela y un agente encapsulado dentro de dicha micela, comprendiendo el método las etapas de:
a. añadir dicho agente en un disolvente adecuado a un conjugado polímero-flavonoide, en el que dicho polímero es un polímero hidrófilo unido al anillo B de dicho flavonoide; y
b. permitir el autoensamblaje de una micela que comprende dicho conjugado polímero-flavonoide y la encapsulación de dicho agente dentro de dicha micela para formar así dicho nanocomplejo micelar.
16. Método según la reivindicación 15, en el que la etapa (a) comprende además las etapas de:
a. eliminar dicho disolvente para formar una película seca de dicho agente y dicho conjugado polímeroflavonoide; y
b. hidratar dicha película seca con un disolvente acuoso.
17. Conjugado polímero-flavonoide según cualquiera de las reivindicaciones 1-16, que comprende un polímero unido al anillo B de un flavonoide, en el que el polímero es un polímero hidrófilo.
18. Conjugado polímero-flavonoide según la reivindicación 17, en el que dicho polímero se selecciona del grupo que consiste en un polisacárido, poliacrilamida, poli(N-isopropilacrilamida), poli(oxazolina), polietilenimina, poli(ácido acrílico), polimetacrilato, poli(etilenglicol), poli(óxido de etileno), poli(alcohol vinílico), poli(vinilpirrolidinona), poliéteres, poli(alilamina), polianhídridos, poli(^-aminoéster), poli(succinato de butileno), policaprolactona, policarbonato, polidioxanona, poli(glicerol), ácido poliglicólico, poli(ácido 3-hidroxipropiónico), poli(metacrilato de 2-hidroxietilo), poli(W-(2-hidroxipropil)metacrilamida), ácido poliláctico, poli(ácido láctico-coglicólico), poli(ortoésteres), poli(2-oxazolina), poli(ácido sebácico), poli(tereftalato-cofosfato) y copolímeros de los mismos.
19. Conjugado polímero-flavonoide según cualquiera de las reivindicaciones 17 o 18, en el que dicho flavonoide se selecciona del grupo que consiste en (-)-epicatequina, (+)-epicatequina, (-)-catequina, (+)-catequina, epicatequina galato, epigalocatequina, epigalocatequina galato, epigalocatequina-3-galato, fisetinidol, galocatequina, galocatequina galato, mesquitol y robinetinidol, elagitanino, galotanino, oolongteanina, florotanino, tanino, teacitrina, teadibenzotropolona, teoflavina, teanaftoquinona, tearubiginas, teasinensina y mezclas de los mismos.
20. Conjugado polímero-flavonoide según cualquiera de las reivindicaciones 17 a 19, en el que dicho polímero se conjuga con un flavonoide mediante un enlazador seleccionado del grupo que consiste en un grupo tioéter, imina, amina, azo y 1,2,3-triazol.
21. Conjugado polímero-flavonoide según la reivindicación 17, en el que dicho conjugado presenta la siguiente fórmula
[Comp. 2]
Figure imgf000018_0001
donde n está en el intervalo de 20 a 910.
22. Método para formar el conjugado polímero-flavonoide según cualquiera de las reivindicaciones 17 a 21, que comprende la etapa de conjugar dicho flavonoide con dicho polímero mediante adición nucleofílica en condiciones básicas, en el que dicho polímero tiene un grupo nucleófilo libre.
23. Método según la reivindicación 22, en el que dicho grupo nucleófilo se selecciona del grupo que consiste en un tiol, una amina, un diazoalcano y una azida.
24. Nanocomplejo micelar según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18 para su uso en el tratamiento de un tumor.
25. Nanocomplejo micelar según la reivindicación 24, en el que dicho nanocomplejo micelar es adecuado para su administración por vía parenteral, en aerosol para inhalación, por vía tópica, rectal, nasal, bucal, vaginal, mediante un depósito implantado, por inyección, por vía subdérmica, intraperitoneal, transmucosa, oral o en una preparación oftálmica.
26. Nanocomplejo micelar según cualquiera de las reivindicaciones 24-25, en el que dicho nanocomplejo micelar se utiliza para administración parenteral, comprendiendo por vía subcutánea, intracutánea, intravenosa, intramuscular, intraarticular, intraarterial, intrasinovial, intraesternal, intratecal, intralesional y por técnicas de infusión o inyección intracraneal.
27. Nanocomplejo micelar según cualquiera de las reivindicaciones 24-26, en el que la cantidad administrada del agente presente en dicho nanocomplejo micelar es de 1 a 80 mg/kg por día.
28. Nanocomplejo micelar según cualquiera de las reivindicaciones 24-27, en el que el medicamento se utiliza para el tratamiento de un cáncer seleccionado del grupo que consiste en carcinoma adrenocortical, linfoma relacionado con el SIDA, cáncer anal, cáncer de apéndice, astrocitoma de grado I (anaplásico), astrocitoma de grado II, astrocitoma de grado III, astrocitoma de grado IV, tumor teratoide atípico/rabdoide del sistema nervioso central, carcinoma de células basales, cáncer de vejiga, cáncer de bronquio, carcinoma bronquioalveolar, linfoma de Burkitt, cáncer de cuello uterino, cáncer de colon, cáncer colorrectal, craneofaringioma, linfoma cutáneo de células T, cáncer de endometrio, cáncer de endometrio uterino, ependimoblastoma, ependimoma, cáncer de esófago, estesioneuroblastoma, sarcoma de Ewing, tumor extracraneal de células germinales, tumor extragonadal de células germinales, cáncer de vías biliares extrahepáticas, histiocitoma fibroso, cáncer de vesícula biliar, cáncer gástrico, tumor carcinoide gastrointestinal, tumor del estroma gastrointestinal, tumor gestacional trofoblástico, glioma, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de corazón, cáncer hepatocelular, colangiocarcinoma hiliar, linfoma de Hodgkin, cáncer de hipofaringe, melanoma intraocular, tumor de células de los islotes, sarcoma de Kaposi, histiocitosis de células de Langerhans, cáncer de laringe, cáncer de labio, linfoma, macroglobulinemia, histiocitoma fibroso maligno, meduloblastoma, meduloepitelioma, melanoma, carcinoma de células de Merkel, mesotelioma, neoplasia endocrina, mieloma múltiple, micosis fungoide, mielodisplasia, neoplasias mielodisplásicas/mieloproliferativas, trastornos mieloproliferativos, cáncer de cavidad nasal, cáncer nasofaríngeo, neuroblastoma, linfoma no Hodgkin, cáncer oral, cáncer orofaríngeo, osteosarcoma, carcinoma ovárico de células claras, cáncer epitelial ovárico, tumor de células germinativas de ovario, papilomatosis, cáncer de seno paranasal, cáncer de paratiroides, cáncer de pene, cáncer de faringe, tumor de parénquima pineal, pineoblastoma, tumor pituitario, neoplasia de células plasmáticas, blastoma pleuropulmonar, linfoma primario del sistema nervioso central, cáncer de próstata, cáncer rectal, cáncer de células renales, cáncer de vías respiratorias con cambios en el cromosoma 15, retinoblastoma, rabdomiosarcoma, cáncer de glándulas salivales, síndrome de Sezary, cáncer de intestino delgado, sarcoma de tejidos blandos, carcinoma de células escamosas, cáncer de cuello escamoso, tumor neuroectodérmico primitivo supratentorial, cáncer de testículo, cáncer de garganta, carcinoma tímico, timoma, cáncer de tiroides, cáncer de pelvis renal, cáncer de uretra, sarcoma uterino, cáncer de vagina, cáncer de vulva, macroglobulinemia de Waldenstrom y tumor de Wilms.
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