KR20190095510A - 미셀 나노복합체 - Google Patents

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용봉순턴 눈나르파스
재키 와이. 잉
주은 정
기현 배
민-한 탄
에스더 이
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Abstract

본 발명은 미셀 나노복합체 및 이를 형성시키는 방법에 관한 것이다. 미셀 나노복합체는 미셀 및 상기 미셀 내에 캡슐화된 제제를 포함하며, 여기서, 미셀은 폴리머-플라보노이드 컨주게이트를 포함하고, 여기서, 상기 폴리머는 상기 플라보노이드의 B 고리에 결합된다. 미셀 나노복합체는 약물-전달 시스템으로서 유용한 용도를 지닐 수 있다.

Description

미셀 나노복합체{A MICELLAR NANOCOMPLEX}
발명의 배경
본 발명은 일반적으로는 약물 전달을 위한 미셀 나노복합체 및 이를 형성시키는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 플라보노이드의 B 고리에 결합된 폴리머를 포함하는 폴리머-플라보노이드 컨주게이트 및 이를 형성시키는 방법에 관한 것이다.
배경 기술
가장 일반적인 암 치료 중 하나인 화학요법은 경구 및 비경구 투여를 통해서 주어지는 세포독성 약물을 사용한다. 통상적인 항암 약물의 투여와 관련된 주요 과제는 다양한 부작용과 함께 독성을 유도하는 신체에서의 이들의 비-특이적 분배이다. 또한, 경구 약물의 치료 효과는 이들의 낮은 생체이용성에 의해서 제한되는데, 그 이유는 약물이 소화관을 통과해야 하기 때문이다. 과거 수십년에 걸쳐서, 연구자들은 약물의 약동학 및 생물학적 분배(biodistribution)를 개선시킴으로써 통상적인 약물 투여의 한계를 극복하기 위한 약물 전달 시스템을 개발하는데 중점을 두었다.
최근 몇 년 동안에, 녹차 카테킨(green tea catechin)이 심혈관 질환 및 암의 방지를 포함한 이들의 유익성 때문에 광범위하게 연구되었다. 녹차 카테킨 중에, (-)-에피갈랄로카테킨-3-갈레이트((-)-epigallalocatechin-3-gallate: EGCG)가 가장 풍부하고, 녹차의 유익한 효과에서 중요 역할을 하는 것으로 여겨진다. 많은 연구에서 EGCG가 항산화, 항당뇨, 항균, 항염증 및 저콜레스테롤혈 효과를 지님이 입증되었다. 더욱이, 그것은 암 세포 생존에 필수적인 복수의 신호 전달 경로를 표적함으로써 종양 성장 및 전이를 효과적으로 억제하는 것으로 밝혀졌다.
이들 바람직한 활성에도 불구하고, EGCG의 임상 적용은 이들의 불량한 안정성 및 낮은 경구 생체이용성에 의해서 제한되었다. 예를 들어, EGCG는 생리학적 환경에서 불안정하고 용이하게 분해된다. EGCG는 37℃에서 0.05 M 포스페이트-완충된 염수(PBS)(pH 7.4)에서 30분 미만의 짧은 반감기를 지님이 보고되었다. 추가로, 대부분의 소화된 EGCG는 위액에서의 광범위한 가수분해 및 위장관에서의 대사성 분해를 진행한다. 그 결과, 요망되는 치료 효과를 달성하기에 필요한 EGCG의 혈장 농도는 경구 투여 후에 도달될 수 없다.
따라서, 상기 기재된 단점 중 하나 이상을 극복하거나 적어도 개선시키는 약물 전달 시스템을 제공할 필요가 있다. 또한, 그러한 약물 전달 시스템을 형성시키는 방법을 제공할 필요가 있다.
이하 개괄되는 가장 유사한 발명은 WO2011/112156호 및 WO2006/116532호이다.
WO2011/112156호는 본 출원인의 앞선 발명이며, 항암제를 함유하는 전달 비히클의 컨주게이트를 제공하고 있으며, 화학적 부분 및 적어도 하나의 플라보노이드를 함유한다. 항암제는 플라보노이드의 A 고리의 C6 및/또는 C8 부분에서 컨주게이트된다.
WO2006/116532호는 생체적합성의 수용성 올리고/폴리플라보노이드를 합성하기 위한 방법으로서, 임의로 치환된 플라보노이드를 생체적합성 중합 안정화제의 존재하에 중합제와 중합시켜서 생체적합성의 가용성 올리고/폴리플라보노이드를 생성시킴을 포함하는 방법을 제공하고 있다.
발명의 요약
제 1 양태에 따르면, 미셀 및 상기 미셀 내에 캡슐화된 제제를 포함하는 미셀 나노복합체로서, 상기 미셀이 폴리머-플라보노이드 컨주게이트를 포함하고, 상기 폴리머가 상기 플라보노이드의 B 고리에 결합되어 있는 미셀 나노복합체가 제공된다.
유리하게는, 미셀 나노복합체는 약물 전달 시스템으로서 사용될 수 있다. 미셀 나노복합체는 종양-표적 약물 전달에 유리한 작은 크기 및 높은 약물 적재 용량(drug loading capacity)을 지닌다. 추가로 유리하게는, 제제의 지속된 방출이 생리학적인 조건에서 미셀 나노복합체를 사용함으로써 달성될 수 있다. 더욱 유리하게는, 나노복합체는 다양한 수-불용성 항암제에 대한 유망한 전달 비히클(delivery vehicle)일 수 있다. 추가로 유리하게는, 미셀 나노복합체는 제제 투여와 관련된 감소된 독성을 지니면서 종양 성장을 현저하게 억제할 수 있다. 더욱 유리하게는, 미셀 나노복합체는 약물 전달 시스템 또는 미셀 담체(micelle carrier)와 제제로부터의 치료 상승 효과를 나타내는 특유의 효과적인 약물 전달 시스템에 해당할 수 있다.
제제는 독소루비신(doxorubicin)일 수 있다. 유리하게는, 독소루비신을 캡슐화하고 있는 미셀 나노복합체는 지속된 약물 방출을 나타낼 수 있다. 이러한 지속된 약물 방출은 미셀 나노복합체 내에서의 EGCG와 독소루비신 사이의 강한 상호작용에 기인될 수 있다. 추가로 유리하게는, 일부 구체예에서, 단지 한계 초기 파열 방출(marginal burst release)이 초기 단계에서 관찰되어, 독소루비신 분자가 미셀 나노복합체에 안정하게 캡슐화되었음을 시사했다. 그러한 낮은 약물 누출은, 나노복합체에 캡슐화된 약물 분자가 혈류에서의 순환 동안에 조기에 누출될 수 없음에 따라서, 최소의 부작용과 함께 최대의 치료 효능을 확실히 하기에 필수적일 수 있다. 또한 추가로 유리하게는, 미셀 나노복합체는 암 치료를 위한 독소루비신의 전신 투여에 적용될 수 있다.
제제는 수니티닙(Sunitinib: SU)일 수 있고, 플라보노이드는 에피갈랄로카테킨-3-갈레이트(EGCG)일 수 있다. 유리하게는, 미셀 나노복합체는 SU의 지속된 방출을 나타낼 수 있다. 추가로 유리하게는, 일부 구체예에서, 어떠한 초기 파열 방출은 거의 관찰되지 않아서, SU 분자가 미셀 나노복합체에서 안정되게 캡슐화되었음을 시사한다.
구체예에서, 플라보노이드는 모노머 플라보노이드일 수 있다. 또 다른 구체예에서, 플라보노이드는 디머 플라보노이드일 수 있다. 유리하게는, 모노머 플라보노이드를 포함하는 미셀 나노복합체는 디머 플라보노이드를 포함하는 미셀 나노복합체에 비해서 더 신속하고 더 많은 SU 방출을 나타낼 수 있다. 유리하게는, SU와 디머 플라보노이드 사이의 강한 상호작용이 있을 수 있다.
유리하게는, 미셀 나노복합체는 제제를 이들의 내부에 안정되게 캡슐화시키고 이들을 표적 부위로 전달함으로써 제제, 예컨대, SU의 역 부작용을 최소화시킬 수 있다. 따라서, 미셀 나노복합체는 SU와 EGCG 사이의 유익한 상승효과를 제공할 수 있다.
추가로 유리하게는, SU를 포함하는 미셀 나노복합체는 유리 SU와 비교할 때에 생체내에서 향상된 종양 효과를 지닐 수 있다. 더욱 유리하게는, SU를 포함하는 미셀 나노복합체는 유리 SU와 비교할 때에 생체내에서 부작용이 덜할 수 있다. 추가로 유리하게는, 동일한 효과를 달성시키기 위해서 유리 SU에 비해서 더 적은 용량의 SU를 포함하는 미셀 나노복합체가 요구될 수 있다. 더욱 유리하게는, SU를 포함하는 미셀 나노복합체의 억제 효과는 치료가 중단된 후에도 실질적인 기간 동안 유지될 수 있다.
추가로 유리하게는, SU를 포함하는 미셀 나노복합체가 유리 SU의 감소된 혈장 농도를 유도하여 SU의 더 적은 부작용을 발생시킬 수 있다. 추가로 유리하게는, 혈장 농도에서의 이러한 감소는 플라보노이드와 SU 사이의 상호작용뿐만 아니라 미셀 나노입자에 의해서 제공되는 향상된 투과성 및 체류(enhanced permeability and retention: EPR) 효과에 기인될 수 있다.
제 2 양태에서 따르면, 미셀 및 상기 미셀 내에 캡슐화된 제제를 포함하는 미셀 나노복합체를 형성시키는 방법으로서, (a) 적합한 용매 중의 상기 제제를 폴리머-플라보노이드 컨주게이트에 첨가하는데, 상기 폴리머가 상기 플라보노이드의 B 고리에 결합되어 있는 폴리머-플라보노이드 컨주게이트에 첨가하는 단계; 및 (b) 상기 폴리머-플라보노이드 컨주게이트를 포함하는 미셀을 자가-조립되게 하고 상기 미셀 내에 상기 제제를 캡슐화되게 하여 상기 미셀 나노복합체를 형성시키는 단계를 포함하는 방법이 제공된다.
유리하게는, 나노복합체는 폴리머-플라보노이드 컨주게이트와 제제의 존재하에 자가-조립된다. 추가로 유리하게는, 나노복합체의 형성은 제제와의 플라보노이드의 결합 성질을 이용함으로써 달성되었다.
제 3 양태에 따르면, 플라보노이드의 B 고리에 결합된 폴리머를 포함하는 폴리머-플라보노이드 컨주게이트가 제공된다.
유리하게는, 플라보노이드는 폴리머에 컨주게이트된다. 구체예에서, 폴리머는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)일 수 있다. 유리하게는, 폴리머-기반 나노입자가 망상내피계(reticuloendothelial system: RES)에 의한 신장 제거 및 포착(renal clearance and entrapment) 둘 모두를 피하여 EPR 효과에 의한 종양 조직내의 후속 축적을 가능하게 한다. 더욱 유리하게는, PEG-안정화된 미셀은 개질되지 않은 미셀보다 연장된 플라즈마 반감기를 나타내는데, 그 이유는 PEG 표면 사슬이 신체내의 RES에 의한 인식 및 제거를 방지하기 때문이다. 추가로 유리하게는, PEG는 폴리머 미셀 및 나노입자의 표면을 개질시켜 오염 방지 표면(anti-fouling surface)을 생성시키기 위해서 사용될 수 있다.
제 4 양태에 따르면, 상기 정의된 폴리머-플라보노이드 컨주게이트를 형성시키는 방법으로서, 염기성 조건하에 친핵성 첨가를 통해서 상기 플라보노이드를 상기 폴리머와 컨주게이션시키는 단계를 포함하고, 상기 폴리머가 유리 친핵성 기를 지니는 방법이 제공된다.
유리하게는, 폴리머-플라보노이드 컨주게이트는 염기성 pH에서 친핵성 첨가에 의해서 합성될 수 있다. 유리하게는, 컨주게이션(conjugation)은 조절된 pH 조건하에 플라보노이드의 B 고리의 C2' 위치에서 친핵성 기, 예컨대, PEG와 같은 폴리머의 티올 기의 친핵성 첨가에 의해서 달성될 수 있다.
구체예에서, 폴리머는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)이고 유리 친핵성 기는 티올이다. 유리하게는, 플라보노이드, 예컨대, EGCG의 전자-결핍 오르토-퀴논(electron-deficient ortho-quinone)은 친핵성 기, 예컨대, 티올 기와 반응할 수 있다. 티올 기는 시스테인, 글루타티온, 및 단백질을 포함한 다양한 범위의 생체분자에 존재한다. EGCG는 인간 적혈구 막 단백질 및 글리세르알데하이드-3-포스페이트 탈수소효소(GAPDH)에 있는 시스테인에 공유결합할 수 있다. 또한, 시스테인 및 글루타티온의 존재하에 산화되는 때에 EGCG의 공유 부가물이 형성될 수 있다. 추가로 유리하게는, EGCG의 생성되는 시스테인 컨주게이트는, 이의 성장 억제 및 항-염증 활성을 유지하면서, EGCG보다 더 높은 산화촉진(pro-oxidant) 활성을 나타낸다. 더욱 유리하게는, N-아세틸시스테인-컨주게이트된 EGCG는 쥐 및 인간 폐암 세포에 대항하는 EGCG의 성장 억제 및 아폽토시스-유도 효과(apoptosis-inducing effect)를 향상시킬 수 있다.
제 5 양태에 따르면, 미셀 및 약물 전달 비히클로서의 상기 미셀 내에 캡슐화된 제제를 포함하는 미셀 나노복합체의 용도로서, 상기 미셀이 폴리머-플라보노이드 컨주게이트이고, 상기 폴리머가 상기 플라보노이드의 B 고리에 결합되는 용도가 제공된다.
제 6 양태에 따르면, 상기 정의된 바와 같은 미셀 나노복합체를 암 환자에게 투여하는 단계를 포함하여 종양을 치료하는 방법이 제공된다.
유리하게는, 미셀 나노복합체는 유리 제제와 비교하여 더 큰 항암 효과를 지닐 수 있다. 추가로 유리하게는, 미셀 나노복합체는 제제를 그들의 내부에 안정하게 캡슐화시키고, 그들을 표적 부위에 전달함으로써 제제, 예컨대, 수니티닙(SU)의 역 부작용을 최소화시킬 수 있다. 그러한 전달 시스템은 또한 유익한 상승효과를 제공할 수 있다.
제 7 양태에 따르면, 종양을 치료하기 위한 상기 정의된 바와 같은 미셀 나노복합체가 제공된다.
제 8 양태에 따르면, 종양의 치료를 위한 약물의 제조에서 상기 정의된 바와 같은 미셀 나노복합체의 용도가 제공된다.
정의
본원에서 사용된 하기 단어 및 용어는 이하 나타낸 의미를 지닐 것이다:
플라보노이드의 "B 고리"는 바이사이클 구조에 결합되는 임의로 치환된 페닐을 나타낸다(바이사이클 구조는 6원 고리(C)와 축합된 벤젠 고리(A)로 구성되어 있다). 임의로 치환된 페닐은 C 고리의 2-위치에 결합된다. 본 개시내용의 목적을 위해서, 고리는 다음과 같이 표시된다:
[화학식 1]
Figure pat00001
용어 "에피갈로카테킨 갈레이트"은 에피갈로카테킨과 갈산의 에스테르를 나타내고, "에피갈로카테킨-3-갈레이트" 또는 EGCG와 상호 대체적으로 사용될 수 있다.
본 개시내용의 목적을 위해서, 구 "PEG-EGCG 컨주게이트"는, 달리 특정되지 않는 한, PEG-mEGCG 컨주게이트(모노머 EGCG) 및 PEG-dEGCG(디머 EGCG) 컨주게이트 둘 모두를 나타낸다.
단어 "실질적으로"는 "완전히"를 배제하지 않는다. 예를 들어, Y가 "실질적으로 없는" 조성물은 Y가 완전히 없을 수 있다. 필요한 경우에, 단어 "실질적으로"는 본 발명의 정의에서 생략될 수 있다.
달리 명시되지 않는 한, 용어 "포함하는" 및 포함한다", 및 이의 문법적 변형은 "개방" 또는 "포괄적인" 언어를 나타내어 이들이 나열된 요소를 포함할 뿐만 아니라 추가의 나열되지 않은 효소의 포함을 허용하는 것으로 의도된다.
본원에서 사용되는 용어 "약"은, 제형의 성분의 농도의 문맥에서, 전형적으로는 언급된 값의 +/- 5%, 더욱 전형적으로는, 언급된 값의 +/- 4%, 더욱 전형적으로는 언급된 값의 +/- 3%, 더욱 전형적으로는 언급된 값의 +/- 2%, 더욱더 전형적으는 언급된 값의 +/- 1%, 더욱더 전형적으로는 언급된 값의 +/- 0.5%를 의미한다.
본 개시내용 전체에 걸쳐서, 특정의 구체예는 범위 방식으로 개시될 수 있다. 범위 방식의 설명은 단지 편리성 및 간략성을 위한 것이고 개시된 범위에 대한 범위를 고정적으로 제한하는 것으로 해석되지 않아야 함이 이해될 것이다. 따라서, 범위의 설명은 특별히 그러한 범위 내의 모든 가능한 서브-범위뿐만 아니라 개별적인 수치값을 개시하는 것으로 여겨져야 한다. 예를 들어, 1 내지 6과 같은 범위의 설명은 특별히 1 내지 3, 1 내지 4, 1 내지 5, 2 내지 4, 2 내지 6, 3 내지 6 등뿐만 아니라, 그러한 범위 내의 개별적인 수치들, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 및 6을 개시하는 것으로 여겨져야 한다. 이는 범위의 크기와 무관하게 적용된다.
특정의 구체예가 또한 본원에서 광범위하게 그리고 일반적으로 기재될 수 있다. 속의 범위의 개시내용 내에 속하는 더 좁은 종 및 및 아속의 집단의 각각이 또한 개시내용의 일부를 형성한다. 이러한 개시내용의 일부는 구체예의 일반적인 설명을 포함하는데, 다만, 삭제된 물질이 본원에 특별히 열거되어 있든지 그렇지 않든지에 무관하게, 속(genus)으로부터의 어떠한 주재를 제거함을 제외한다.
구체예에 대한 상세한 개시
미셀 나노복합체의 예시적인 비-제한 구체예가 이제 개시될 것이다.
미셀 나노복합체는 미셀과 상기 미셀 내에 캡슐화된 제제를 포함할 수 있고, 상기 미셀은 폴리머-플라보노이드 컨주게이트를 포함하고, 여기서, 상기 폴리머는 상기 플라보노이드의 B 고리에 결합된다.
적어도 하나의 플라보노이드가 상기 폴리머에 결합될 수 있다. 적어도 두 개의 플라보노이드가 상기 폴리머에 결합될 수 있다.
폴리머는 링커(linker)를 통해서 상기 플라보노이드에 결합될 수 있다. 링커는 폴리머와 플라보노이드를 연결시킬 수 있는 어떠한 화학적 기일 수 있다. 링커는 티오에테르, 이민, 아민, 아조 및 1,2,3-트리아졸 기로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 링커는 알칸 기일 수 있다. 링커는 폴리머의 어떠한 부분과 플라보노이드의 어떠한 부분 사이에 존재할 수 있다. 링커는 폴리머의 말단과 플라보노이드의 어떠한 부분 사이에 존재할 수 있다.
플라보노이드는 모노머 플라보노이드 또는 디머 플라보노이드로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 모노머 플라보노이드는 하나의 플라보노이드 분자를 포함할 수 있다. 디머 플라보노이드는 링커에 의해서 함께 연결된 두 개의 플라보노이드 분자를 포함할 수 있다. 디머 플라보노이드의 플라보노이드 분자중 하나가 폴리머에 연결될 수 있다. 디머 플라보노이드의 플라보노이드 분자 둘 모두가 폴리머에 독립적으로 연결될 수 있다. 하나의 플라보노이드가 상기 컨주게이트에 존재하는 때에, 플라보노이드는 B 고리를 통해서 상기 폴리머에 결합된다. 하나의 플라보노이드가 상기 컨주게에트에 결합되는 때에, 플라보노이드가 D 고리를 통해서 상기 폴리머에 결합된다.
하나 초과의 플라보노이드가 상기 컨주게이트에 존재하는 때에, 플라보노이드 중 적어도 하나가 B 고리를 통해서 상기 폴리머에 결합된다. 상기 적어도 하나의 플라보노이드 중 다른 플라보노이드는 A 고리를 통해서 상기 폴리머에 결합된다. 하나 초과의 플라보노이드가 상기 컨주게이트에 존재하는 때에, 플라보노이드 중 적어도 하나가 B 고리를 통해서 상기 폴리머에 결합된다. 상기 적어도 하나의 플라보노이드 중 다른 플라보노이드는 B 고리를 통해서 상기 폴리머에 결합된다. 하나 초과의 플라보노이드가 상기 컨주게이트에 존재하는 때에, 플라보노이드 중 적어도 하나가 B 고리를 통해서 상기 폴리머에 결합된다. 상기 적어도 하나의 플라보노이드 중 다른 플라보노이드는 D 고리를 통해서 상기 폴리머에 결합된다.
하나 초과의 플라보노이드가 상기 컨주게이트에 존재하는 때에, 플라보노이드 중 적어도 하나가 D 고리를 통해서 상기 폴리머에 결합된다. 상기 적어도 하나의 플라보노이드 중 다른 플라보노이드는 A 고리를 통해서 상기 폴리머에 결합된다. 하나 초과의 플라보노이드가 상기 컨주게이트에 존재하는 때에, 플라보노이드 중 적어도 하나가 D 고리를 통해서 상기 폴리머에 결합된다. 상기 적어도 하나의 플라보노이드 중 다른 플라보노이드는 B 고리를 통해서 상기 폴리머에 결합된다. 하나 초과의 플라보노이드가 상기 컨주게이트에 존재하는 때에, 플라보노이드 중 적어도 하나가 D 고리를 통해서 상기 폴리머에 결합된다. 상기 적어도 하나의 플라보노이드 중 다른 플라보노이드는 D 고리를 통해서 상기 폴리머에 결합된다.
폴리머는 친수성 폴리머일 수 있다. 친수성 폴리머는 아크릴아미드, 알킬, 옥사졸린, 알케닐, 이민, 아크릴산, 메타크릴레이트, 디올, 옥시란, 알코올, 아민, 안하이드라이드(anhydride), 에스테르, 락톤, 카르보네이트, 카르복실산, 아크릴레이트, 하이드록실, 포스페이트, 테레프탈레이트, 아미드 및 에테르로 이루어진 군으로부터 선택된 모노머를 포함할 수 있다.
친수성 폴리머는 폴리아크릴아미드, 폴리(N-이소프로필아크릴아미드), 폴리(옥사졸린), 폴리에틸렌이민, 폴리(아크릴산), 폴리메타크릴레이트, 폴리(에틸렌 글리콜), 폴리(에틸렌 옥사이드), 폴리(비닐 알코올), 폴리(비닐피롤리디논), 폴리에테르, 폴리(알릴아민), 폴리안하이드라이드, 폴리(β-아미노 에스테르), 폴리(부틸렌 석시네이트), 폴리카프로락톤, 폴리카르보네이트, 폴리디옥사논, 폴리(글리세롤), 폴리글리콜산, 폴리(3-하이드록시프로피온산), 폴리(2-하이드록시에틸 메타크릴레이트), 폴리(N-(2-하이드록시프로필)메타크릴아미드), 폴리락트산, 폴리(락트산-코-글리콜산), 폴리(오르토 에스테르), 폴리(2-옥사졸린), 폴리(세박산), 폴리(테레프탈레이트-코-포스페이트) 및 이들의 코폴리머로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
친수성 폴리머는 폴리사카라이드일 수 있다. 폴리머는 히알루론산, 덱스트란, 풀룰란(pullulan), 키토산, 셀룰로오스, 아밀로오스, 전분, 젤라틴, 카라기난(carrageenan), 사이클로덱스트린, 덱스트란 설페이트, 피콜(Ficoll), 겔란(gellan), 구아검(guar gum), 펙틴, 폴리수크로오스, 풀룰란, 스클레로글루칸( scleroglucan), 잔탄(xanthan), 자일로글루칸(xyloglucan) 및 알기네이트로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리사카라이드일 수 있다.
친수성 폴리머는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)일 수 있다. PEG는 이의 친수성, 가요성 및 생체적합성 본질 때문에 생의학적 적용에 사용되는 합성 폴리머일 수 있다. 특히, PEG는 폴리머 미셀 및 나노입자의 표면을 개질시켜 오염 방지 표면을 생성시키기 위해서 사용된다.
유리하게는, 폴리에틸렌 글리콜(PEG)이 플라보노이드에 컨주게이트시키기 위한 폴리머로서 선택되었다. 컨주게이션은 조절된 pH 조건하에 플라보노이드의 B 고리의 C2' 위치에서 PEG의 티올 기의 친핵성 첨가에 의해서 달성되었다.
플라보노이드는 플라본(flavone), 이소플라본(isoflavone), 플라반(flavan), 프로안토시아니딘(proanthocyanidin) 및 안토시아니딘(anthocyanidin)으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
플라본은 아피게닌(apigenin), 루테올린(luteolin), 탄게리틴(tangeritin), 크리신(chrysin), 6-하이드록시플라본, 바이칼레인(baicalein), 스쿠텔라레인(scutellarein), 오고닌(wogonin), 디오스민(diosmin), 플라복세이트(flavoxate) 및 7,8-디하이드록시플라본으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
이소플라본은 게니스테인(genistein), 다이제인(daidzein), 글리시테인(glycitein), 게니스틴(genistin), 다이진(daidzin), 글리시틴(glycitin), 아세틸-게니스틴(acetyl-genistin), 아세틸-다이진(acetyl-daidzin), 아세틸-글리시틴(acetyl-glycitin), 말로닐 게니스틴(malonyl genistin), 말로닐-다이진(malonyl-daidzin) 및 말로닐-글리시틴(malonyl-glycitin)으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
플라반은 (-)-에피카테킨, (+)-에피카테킨, (-)-카테킨, (+)-카테킨, 에피카테킨 갈레이트, 에피갈로카테킨, 에피갈로카테킨 갈레이트, 피세티니돌(Fisetinidol), 갈로카테킨, 갈로카테킨 갈레이트, 메스퀴톨(Mesquitol) 및 로비네티니돌(Robinetinidol), 엘라기타닌(ellagitannin), 갈로타닌(gallotannin), 우롱테아닌(oolongtheanin), 플로로타닌(phlorotannin), 타닌(tannin), 테아시트린(theacitrin), 테아디벤조트로폴란(theadibenzotropolone), 테아플라빈(theaflavin), 테아나프토퀴논(theanaphthoquinone), 테아루비긴(thearubigin), 테아시넨신(theasinensin) 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
안토시아닌은 아우란티니딘(aurantinidin), 카펜시니딘(capensinidin), 시아니딘(cyaniding), 델피니딘(delphinidin), 유로피니딘(europinidin), 헤르수티니딘(hirsutinidin), 말비딘(malvidin), 펠라르곤딘(pelargondin), 페오니딘(peonidin), 페투니딘(petunidin), 풀첼리딘(pulchellidin) 및 로시니딘(rosinidin)으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
제제는 치료제일 수 있다. 치료제는 알킬화제(alkylating agent), 안트라사이클린(anthracycline), 세포골격 파괴제(cytoskeletal disruptor), 에포틸론(epothilone), 히스톤 데아세틸라제 억제제(histone deacetylase inhibitor), 토포이소머라제 I 억제제(topoisomerase I inhibitor), 토포이소머라제 II 억제제(topoisomerase II inhibitor), 모노클로날 항체(monoclonal antibody), 항체-약물 컨주게이트, 뉴클레오티드 유사체(nucleotide analog), 전구체 유사체(precursor analog), 펩티드 항생제(peptide antibiotics), 플라티넘-기반 제제(platinum-based agent), 레티노이드(retinoid), 빈카 알칼로이드(vinca alkaloid), 시토킨(cytokine), 항대사물질(anti-metabolite), 및 빈카 알칼로이드 유도체 및 그 밖의 세포독성물질로 이루어진 군으로부터 선택된 화학치료제일 수 있다.
화학치료제는 악티노마이신(Actinomycin), 아파티닙(Afatinib), 올-트랜스-레티노산(All-trans retinoic acid), 액시티닙(Axitinib), 아자시티딘(Azacitidine), 아자티오프린(Azathioprine), 베바시주맙(Bevacizumab), 블레오마이신(Bleomycin), 보수티닙(Bosutinib), 보르테조밉(Bortezomib), 카르보플라틴(Carboplatin), 카페시타빈(Capecitabine), 세툭시맙(Cetuximab), 시스플라틴(Cisplatin), 클로람부실(Chlorambucil), 크리조티닙(Crizotinib), 사이클로포스파미드(Cyclophosphamide), 시타라빈(Cytarabine), 다사티닙(Dasatinib), 다우노루비신(Daunorubicin), 도세탁셀(Docetaxel), 독시플루리딘(Doxifluridine), 독소루비신, 에피루비신(Epirubicin), 에포틸론 A(Epothilone A)(C26H39NO6S), 에포틸론 B(C27H41NO6S), 에포틸론 C(C26H39NO5S), 에포틸론 D(C27H41NO5S), 에포틸론 E(C26H39NO7S), 에포틸론 F(C27H41NO7S), 에를로티닙(Erlotinib), 에토포시드(Etoposide), 플루오로우라실(Fluorouracil), 포스타마티닙(Fostamatinib), 게피티닙(Gefitinib), 겜시타빈(Gemcitabine), 하이드록시우레아, 이다루비신(Idarubicin), 이마티닙(Imatinib), 이라노테칸(Irinotecan), 라파티닙(Lapatinib), 렌바티닙(Lenvatinib), 메클로레타민(Mechlorethamine), 메르캅토퓨란(Mercaptopurine), 메토트렉세이트(Methotrexate), 미토잔트론(Mitoxantrone), 닐로티닙(Nilotinib), 옥살리플라틴(Oxaliplatin), 파클리탁셀(Paclitaxel), 파니투무맙(Panitumumab), 파조파닙(Pazopanib), 페갑타닙(Pegaptanib), 페메트렉시드(Pemetrexed), 라니비주맙(Ranibizumab), 레고라페닙(Regorafenib), 록소리티닙(Ruxolitinib), 소라페닙(Sorafenib), 수니티닙(Sunitinib), 트라스투주맙(Trastuzumab), 테니포시드(Teniposide), 티오구아닌(Tioguanine), 토파시티닙(Tofacitinib), 토포테칸(Topotecan), 발루비신(Valrubicin), 베무라페닙(Vemurafenib), 빈블라스틴(Vinblastine), 빈크리스틴(Vincristine), 빈데신(Vindesine), 비노렐빈(Vinorelbine)으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
화학치료제는 독소루비신일 수 있다.
화학치료제는 수니티닙(SU)일 수 있다. SU는 멀티-표적 티로신 키나아제 억제제(multi-targeted tyrosine kinase inhibitor) 및 투명 세포 콩팥 세포 암종(clear cell renal cell carcinoma: ccRCC)의 1차 요법이다. 특히, SU는 종양 혈관 형성(angiogenesis) 및 증식에서 역할을 하는 혈관 내피세포 성장 인자(vascular endothelial growth factor: VEGF) 및 혈소판-유래 성장 인자(platelet-derived growth factor: PDGF) 수용체를 표적으로 하여 종양 혈관화 감소뿐만 아니라 암 세포 치사를 유도한다. 그것은 진행된 RCC, 위장관 기질 종양(위장 간질 종양(gastrointestinal stromal tumor: GIST)), 및 취장 신경내분비 종양(pancreatic neuroendocrine tumor: pNET)에서 사용이 승인되었다. 그것은 또한 전이성 유방암(metastatic breast cancer), 진행 비소세포 폐암(advanced non-small-cell lung cancer), 진행 간세포암종(advanced hepatocellular carcinoma), 신경내분비 종양, 및 백혈병을 치유하기에 효능이 있는 것으로 밝혀졌다. 그러나 그것은 심각한 부작용, 예컨대, 간 독성, 심장 독성 및 위장 독성, 고혈압, 피부 문제, 및 손발 증후군(hand-foot syndrome)을 유발시킬 수 있다.
미셀 나노복합체는 30 내지 300 nm, 50 내지 300 nm, 100 내지 300 nm, 30 내지 50 nm, 30 내지 100 nm, 30 내지 150 nm, 150 내지 300 nm, 200 내지 300 nm, 250 내지 300 nm, 100 내지 150 nm, 100 내지 200 nm, 100 내지 250 nm, 130 내지 180 nm, 또는 130 내지 250 nm의 범위의 크기를 지닐 수 있다.
미셀 나노복합체는, 30% 초과, 35% 초과, 40% 초과, 45% 초과, 50% 초과, 55% 초과, 60% 초과, 65% 초과, 70% 초과, 75% 초과, 또는 80%인, 상기 미셀 내에 존재하는 상기 제제의 적재 효율을 지닐 수 있다.
미셀 나노복합체는 1 내지 10 w/w%, 5 내지 25 w/w%, 20 내지 45 w/w%, 30 내지 50 w/w%, 35 내지 50 w/w%, 40 내지 50 w/w%, 45 내지 50 w/w%, 30 내지 35 w/w%, 30 내지 40 w/w% 또는 30 내지 45 w/w%의 범위로 상기 미셀 내에 존재하는 상기 제제의 적재 함량을 지닐 수 있다.
미셀 및 상기 미셀 내에 캡슐화된 제제를 포함하는 미셀 나노복합체를 형성시키는 방법은,
a. 적합한 용매 중의 상기 제제를 폴리머-플라보노이드 컨주게이트에 첨가하는데, 상기 폴리머가 상기 플라보노이드의 B 고리에 결합되어 있는 폴리머-플라보노이드 컨주게이트에 첨가하는 단계; 및
b. 상기 폴리머-플라보노이드 컨주게이트를 포함하는 미셀의 자가-조립 및 상기 미셀 내의 상기 제제의 캡슐화를 허용하여 상기 미셀 나노복합체를 형성시키는 단계를 포함할 수 있다.
단계(a)는
a. 상기 용매를 제거하여 상기 제제와 상기 폴리머-플라보노이드 컨주게이트의 건조 필름을 형성시키는 단계; 및
b. 상기 건조 필름을 수성 용매로 수화시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
방법은 적합한 용매 중의 여과 및 투석에 의해서 형성된 미셀 나노복합체를 분리하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
폴리머-플라보노이드 컨주게이트는 플라보노이드의 B 고리에 결합된 폴리머를 포함할 수 있다.
폴리머-플라보노이드 컨주게이트의 폴리머는 폴리사카라이드, 폴리아크릴아미드, 폴리(N-이소프로필아크릴아미드), 폴리(옥사졸린), 폴리에틸렌이민, 폴리(아크릴산), 폴리메타크릴레이트, 폴리(에틸렌 글리콜), 폴리(에틸렌 옥사이드), 폴리(비닐 알코올), 폴리(비닐피롤리디논), 폴리에테르, 폴리(알릴아민), 폴리안하이드라이드, 폴리(β-아미노 에스테르), 폴리(부틸렌 석시네이트), 폴리카프로락톤, 폴리카르보네이트, 폴리디옥사논, 폴리(글리세롤), 폴리글리콜산, 폴리(3-하이드록시프로피온산), 폴리(2-하이드록시에틸 메타크릴레이트), 폴리(N-(2-하이드록시프로필)메타크릴아미드), 폴리락트산, 폴리(락트산-코-글리콜산), 폴리(오르토 에스테르), 폴리(2-옥사졸린), 폴리(세박산), 폴리(테레프탈레이트-코-포스페이트) 및 이들의 코폴리머로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
폴리머-플라보노이드 컨주게이트의 플라보노이드는 (-)-에피카테킨, (+)-에피카테킨, (-)-카테킨, (+)-카테킨, 에피카테킨 갈레이트, 에피갈로카테킨, 에피갈로카테킨 갈레이트, 피세티니돌(Fisetinidol), 갈로카테킨, 갈로카테킨 갈레이트, 메스퀴톨(Mesquitol) 및 로비네티니돌(Robinetinidol), 엘라기타닌(ellagitannin), 갈로타닌(gallotannin), 우롱테아닌(oolongtheanin), 플로로타닌(phlorotannin), 타닌(tannin), 테아시트린(theacitrin), 테아디벤조트로폴란(theadibenzotropolone), 테아플라빈(theaflavin), 테아나프토퀴논(theanaphthoquinone), 테아루비긴(thearubigin), 테아시넨신(theasinensin) 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
폴리머는 티오에테르, 이민, 아민, 아조 및 1,2,3-트리아졸 기로 이루어진 군으로부터 선택된 링커를 통해서 폴리머-플라보노이드 컨주게이트에서 플라보노이드에 컨주게이션될 수 있다. 링커는 알칸 기일 수 있다. 링커는 폴리머의 어떠한 부분과 플라보노이드의 어떠한 부분 사이에 존재할 수 있다. 링커는 폴리머의 말단과 플라보노이드의 어떠한 부분 사이에 존재할 수 있다.
폴리머-플라보노이드 컨주게이트의 폴리머는 폴리(에틸렌 글리콜)일 수 있고, 폴리머-플라보노이드 컨주게이트의 상기 플라보노이드는 에피갈로카테킨-3-갈레이트일 수 있고, 폴리머-플라보노이드 컨주게이트의 상기 링커는 티오에테르일 수 있다.
폴리머-플라보노이드는 하기 화학식을 지닐 수 있다:
[화학식 2]
Figure pat00002
상기 식에서, n은 20 내지 910의 범위에 있다.
폴리머-플라보노이드 컨주게이트를 형성시키는 방법은 염기성 조건하에 친핵성 첨가를 통해서 상기 플라보노이드를 유리 친핵성 기를 지니는 상기 폴리머와 컨주게이션시키는 단계를 포함할 수 있다.
친핵성 기는 설프하이드릴, 아민, 카르보닐, 카르복실산, 아지드, 할로겐, 알킨 및 알켄으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 친핵성 기는 티올, 아민, 디아조알칸 및 아지드로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
친핵성 기는 티올일 수 있다. EGCG는 산소의 존재하에 산화를 진행하여 세미퀴논 라디칼 및 반응성 산소 종을 포함하는 경로를 통해서 오르토-퀴논을 형성시킬 수 있다. EGCG의 전자-결핍 오르토-퀴논은 시스테인, 글루타티온, 및 단백질을 포함하는 다양한 생체분자에 존재하는 친핵성 티올 기와 반응할 수 있다. EGCG는 인간 적혈구 막 단백질 및 글리세르알데하이드-3-포스페이트 데하이드로게나아제(GAPDH) 내의 시스테인 잔기에 공유결합할 수 있다. 시스테인과 글루타티온의 존재하에 산화되는 때에 EGCG의 공유 부가물이 형성될 수 있다. EGCG의 생성되는 시스테인 컨주게이트는, 이의 성장 억제 및 항-염증 활성을 유지하면서, EGCG보다 더 높은 산화촉진 활성을 나타낼 수 있다. 더욱이, N-아세틸시스테인-컨주게이트된 EGCG는 쥐 및 인간 폐암 세포에 대항하는 EGCG의 성장 억제 및 아폽토시스-유도 효과를 향상시킬 수 있다.
컨주게이션 단계는 약 1 시간 내지 24 시간, 약 1 시간 내지 2 시간, 약 1 시간 내지 4 시간, 약 1 시간 내지 8 시간, 약 1 시간 내지 12 시간, 약 2 시간 내지 4 시간, 약 2 시간 내지 8 시간, 약 2 시간 내지 12 시간, 약 2 시간 내지 24 시간, 약 4 시간 내지 8 시간, 약 4 시간 내지 12 시간, 약 4 시간 내지 24 시간, 약 8 시간 내지 12 시간, 약 8 시간 내지 24 시간 또는 약 12 시간 내지 24 시간의 반응 시간에서 수행될 수 있다.
방법은 상기 플라보노이드의 집합을 실질적으로 방지하는 용매 중에서 컨주게이션 단계를 수행하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
방법은 스캐빈징제(scavenging agent)를 첨가하여 상기 친핵성 기의 H2O2-매개된 산화를 방지해서 상기 컨주게이션 단계의 효율을 증가시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
염기성 조건은 7 초과 내지 10, 8 초과 내지 10, 9 초과 내지 10, 7 초과 내지 11, 8 초과 내지 11, 9 초과 내지 11, 10 초과 내지 11, 7 초과, 8 초과, 9 초과, 10 초과 또는 11 초과의 pH 범위에 있을 수 있다.
미셀 나노복합체의 용도는 미셀 및 약물 전달 비히클로서의 상기 미셀 내에 캡슐화된 제제를 포함할 수 있고, 여기서, 상기 미셀은 폴리머-플라보노이드 컨주게이트를 포함하고, 상기 폴리머는 상기 플라보노이드의 B 고리에 결합된다.
미셀 나노복합체는 캡슐화된 제제를 생체내에서 표적 종양 부위에 전달할 수 있다.
*암을 치료하는 방법은 미셀 나노복합체를 암 환자에게 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 종양을 치료하는 방법은 미셀 나노복합체를 암 환자에게 투여하는 단계를 포함할 수 있다.
미셀 나노복합체는 비경구로, 흡입 스프레이에 의해서, 국소적으로, 직장에, 비내로(nasally), 구강으로, 질내로, 이식된 저장소를 통해서, 주사에 의해서, 피하로, 복강내로, 경피적으로, 경구로 또는 안과 제제로 투여될 수 있다.
비경구 투여는 피하, 피내, 정맥내, 근육내, 관절내, 동맥내, 활막내(intrasynovially), 흉골내, 척추강내, 병소내(intralesionally), 및 두개내(intracranial) 주사 또는 주입 기술을 포함할 수 있다.
상기 미셀 나노복합체 내에 존재하는 제제는 일일 약 1 내지 약 80 mg/kg, 일일 약 1 내지 약 2 mg/kg, 일일 약 1 내지 약 5 mg/kg, 일일 약 1 내지 약 10 mg/kg, 일일 약 1 내지 약 20 mg/kg, 일일 약 1 내지 약 50 mg/kg, 일일 약 2 내지 약 5 mg/kg, 일일 약 2 내지 약 10 mg/kg, 일일 약 2 내지 약 20 mg/kg, 일일 약 2 내지 약 50 mg/kg, 일일 약 2 내지 약 80 mg/kg, 일일 약 5 내지 약 10 mg/kg, 일일 약 5 내지 약 20 mg/kg, 일일 약 5 내지 약 50 mg/kg, 일일 약 5 내지 약 80 mg/kg, 일일 약 10 내지 약 20 mg/kg, 일일 약 10 내지 약 50 mg/kg, 일일 약 10 내지 약 80 mg/kg, 일일 약 20 내지 약 50 mg/kg, 일일 약 20 내지 약 80 mg/kg 또는 일일 약 50 내지 약 80 mg/kg의 도즈(dose)로 투여될 수 있다.
암 환자는 부신피질 암종(adrenocortical carcinoma), AIDS-관련 림프종(AIDS-related lymphoma), 항문암(anal cancer), 맹장암(appendix cancer), 그레이드 I (역형성) 별아교세포종(grade I (anaplastic) astrocytoma), 그레이드 II 별아교세포종(grade II astrocytoma), 그레이드 III 별아교세포종(grade III astrocytoma), 그레이드 VI 별아교세포종(grade VI astrocytoma), 중추신경계의 비정형 기형/간상 종양(atypical teratoid/rhabdoid tumor), 기저 세포 암종(basal cell carcinoma), 방광암(bladder cancer), 기관지암(bronchial cancer), 세기관지폐포 암종(bronchioalveolar carcinoma), 버키트 림프종(Burkitt lymphoma), 자궁경부암(cervical cancer), 결장암(colon cancer), 결장직장암(colorectal cancer), 두개인두종(craniopharyngioma), 피부 T-세포 림프종(cutaneous T-cell lymphoma), 자궁 내막암(endometrial cancer), 자궁내막 자궁 암(endometrial uterine cancer), 뇌실막모세포종(ependymoblastoma), 뇌실막종(ependymoma), 식도암(esophageal cancer), 감각신경모세포종(esthesioneuroblastoma), 유잉 육종(Ewing's sarcoma), 두개외 배아세포 종양(extracranial germ cell tumor), 고환외 배세포 종양(extragonadal germ cell tumor), 간외 담도암(extrahepatic bile duct cancer), 섬유 조직구종(fibrous histiocytoma), 담낭암(gallbladder cancer), 위암(gastric cancer), 위장 카르시노이드 종양(gastrointestinal carcinoid tumor), 위장 간질 종양(gastrointestinal stromal tumor), 임신융모 종양(gestational trophoblastic tumor), 임신융모 종양(gestational trophoblastic tumor), 신경아교종(glioma), 구경부암(head and neck cancer), 심장암(heart cancer), 간세포암(hepatocellular cancer), 힐라 쓸개관암종(Hilar cholangiocarcinoma), 호지킨 림프종(Hodgkin's lymphoma), 하인두암(hypopharyngeal cancer), 안구내 흑색종(intraocular melanoma), 섬세포 종양(islet cell tumor), 카포시 육종(Kaposi sarcoma), 랑게르한스 세포 조직구증(Langerhans cell histiocytosis), 후두암(laryngeal cancer), 구순암(lip cancer), 림프종(lymphoma), 고분자글로불린혈증(macroglobulinemia), 악성 섬유 조직구종(malignant fibrous histiocytoma), 속질모세포종(medulloblastoma), 속질상피종(medulloepithelioma), 흑색종(melanoma), 메르켈 세포 암종(Merkel cell carcinoma), 중피종(mesothelioma), 내분비샘 종양(endocrine neoplasia), 다발 골수종(multiple myeloma), 균상 식육종(mycosis fungoides), 척수형성이상(myelodysplasia), 골수형성이상/골수증식성 신생물(myelodysplastic/myeloproliferative neoplasms), 골수증식성 질환(myeloproliferative disorders), 비강 암(nasal cavity cancer), 코인두암(nasopharyngeal cancer), 신경모세포종(neuroblastoma,) 비-호지킨 림프종(non-Hodgkin's lymphoma), 구강암(oral cancer), 입인두암(oropharyngeal cancer), 뼈육종(osteosarcoma), 난소 투명세포 암종(ovarian clear cell carcinoma), 난소 상피암(ovarian epithelial cancer), 난소 배세포 종양(ovarian germ cell tumor), 유두종증(papillomatosis), 부비동암(paranasal sinus cancer), 부갑상샘암(parathyroid cancer), 음경암(penile cancer), 인두암(pharyngeal cancer), 송과체 실질세포 종양(pineal parenchymal tumor), 송과체모세포종(pineoblastoma), 뇌하수체 종양(pituitary tumor), 혈장 세포 신생물(plasma cell neoplasm), 혈장 세포 신생물(plasma cell neoplasm), 흉막폐장 모세포종(pleuropulmonary blastoma), 원발성 중추신경계 림프종(primary central nervous system lymphoma), 전립선암(prostate cancer), 직장 암(rectal cancer), 신장 세포 암(renal cell cancer), 염색체 15번 변화를 지니는 기도암(respiratory tract cancer with chromosome 15 changes), 망막모세포종(retinoblastoma), 횡문근육종(rhabdomyosarcoma), 침샘암(salivary gland cancer), 세자리 증후군(Sezary syndrome), 소장암(small intestine cancer), 연조직 육종(soft tissue sarcoma), 편평 세포 암종(squamous cell carcinoma), 편평상피 경부암(squamous neck cancer), 천막위 원시 신경외배엽 종양(supratentorial primitive neuroectodermal tumor), 천막위 원시 신경외배엽 종양(supratentorial primitive neuroectodermal tumor), 고환암(testicular cancer), 인후암(throat cancer), 가슴샘 육종(thymic carcinoma), 가슴샘종(thymoma), 갑상샘암(thyroid cancer), 신우의 암(cancer of the renal pelvis), 요도암(urethral cancer), 자궁 육종(uterine sarcoma), 질암(vaginal cancer), 외음부암(vulvar cancer), 발덴스트롬 고분자글로불린혈증(Waldenstrom macroglobulinemia), 및 윌름즈 종양(Wilms tumor)로 이루어진 군으로부터 선택된 암을 앓고 있을 수 있다.
종양 환자는 부신피질 암종(adrenocortical carcinoma), 항문암(anal cancer), 맹장암(appendix cancer), 그레이드 I (역형성) 별아교세포종(grade I (anaplastic) astrocytoma), 그레이드 II 별아교세포종(grade II astrocytoma), 그레이드 III 별아교세포종(grade III astrocytoma), 그레이드 VI 별아교세포종(grade VI astrocytoma), 중추신경계의 비정형 기형/간상 종양(atypical teratoid/rhabdoid tumor), 기저 세포 암종(basal cell carcinoma), 방광암(bladder cancer), 기관지암(bronchial cancer), 세기관지폐포 암종(bronchioalveolar carcinoma), 자궁경부암(cervical cancer), 결장암(colon cancer), 결장직장암(colorectal cancer), 두개인두종(craniopharyngioma), 자궁 내막암(endometrial cancer), 자궁내막 자궁 암(endometrial uterine cancer), 뇌실막모세포종(ependymoblastoma), 뇌실막종(ependymoma), 식도암(esophageal cancer), 감각신경모세포종(esthesioneuroblastoma), 유잉 육종(Ewing's sarcoma), 두개외 배아세포 종양(extracranial germ cell tumor), 고환외 배세포 종양(extragonadal germ cell tumor), 간외 담도암(extrahepatic bile duct cancer), 섬유 조직구종(fibrous histiocytoma), 담낭암(gallbladder cancer), 위암(gastric cancer), 위장 카르시노이드 종양(gastrointestinal carcinoid tumor), 위장 간질 종양(gastrointestinal stromal tumor), 임신융모 종양(gestational trophoblastic tumor), 임신융모 종양(gestational trophoblastic tumor), 신경아교종(glioma), 구경부암(head and neck cancer), 심장암(heart cancer), 간세포암(hepatocellular cancer), 힐라 쓸개관암종(Hilar cholangiocarcinoma), 하인두암(hypopharyngeal cancer), 안구내 흑색종(intraocular melanoma), 섬세포 종양(islet cell tumor), 카포시 육종(Kaposi sarcoma), 랑게르한스 세포 조직구증(Langerhans cell histiocytosis), 후두암(laryngeal cancer), 구순암(lip cancer), 고분자글로불린혈증(macroglobulinemia), 악성 섬유 조직구종(malignant fibrous histiocytoma), 속질모세포종(medulloblastoma), 속질상피종(medulloepithelioma), 흑색종(melanoma), 메르켈 세포 암종(Merkel cell carcinoma), 중피종(mesothelioma), 내분비샘 종양(endocrine neoplasia), 다발 골수종(multiple myeloma), 균상 식육종(mycosis fungoides), 척수형성이상(myelodysplasia), 골수형성이상/골수증식성 신생물(myelodysplastic/myeloproliferative neoplasms), 골수증식성 질환(myeloproliferative disorders), 비강 암(nasal cavity cancer), 코인두암(nasopharyngeal cancer), 신경모세포종(neuroblastoma,) 구강암(oral cancer), 입인두암(oropharyngeal cancer), 뼈육종(osteosarcoma), 난소 투명세포 암종(ovarian clear cell carcinoma), 난소 상피암(ovarian epithelial cancer), 난소 배세포 종양(ovarian germ cell tumor), 유두종증(papillomatosis), 부비동암(paranasal sinus cancer), 부갑상샘암(parathyroid cancer), 음경암(penile cancer), 인두암(pharyngeal cancer), 송과체 실질세포 종양(pineal parenchymal tumor), 송과체모세포종(pineoblastoma), 뇌하수체 종양(pituitary tumor), 혈장 세포 신생물(plasma cell neoplasm), 혈장 세포 신생물(plasma cell neoplasm), 흉막폐장 모세포종(pleuropulmonary blastoma), 전립선암(prostate cancer), 직장 암(rectal cancer), 신장 세포 암(renal cell cancer), 염색체 15번 변화를 지니는 기도암(respiratory tract cancer with chromosome 15 changes), 망막모세포종(retinoblastoma), 횡문근육종(rhabdomyosarcoma), 침샘암(salivary gland cancer), 세자리 증후군(Sezary syndrome), 소장암(small intestine cancer), 연조직 육종(soft tissue sarcoma), 편평 세포 암종(squamous cell carcinoma), 편평상피 경부암(squamous neck cancer), 천막위 원시 신경외배엽 종양(supratentorial primitive neuroectodermal tumor), 천막위 원시 신경외배엽 종양(supratentorial primitive neuroectodermal tumor), 고환암(testicular cancer), 인후암(throat cancer), 가슴샘 육종(thymic carcinoma), 가슴샘종(thymoma), 갑상샘암(thyroid cancer), 신우의 암(cancer of the renal pelvis), 요도암(urethral cancer), 자궁 육종(uterine sarcoma), 질암(vaginal cancer), 외음부암(vulvar cancer), 발덴스트롬 고분자글로불린혈증(Waldenstrom macroglobulinemia), 및 윌름즈 종양(Wilms tumor)로 이루어진 군으로부터 선택된 암을 앓고 있을 수 있다.
미셀 나노복합체는 암 치료용일 수 있다. 미셀 나노복합체는 종양 치료용일 수 있다.
미셀 나노복합체의 용도는 암의 치료를 위한 약물의 제조에 있을 수 있다. 미셀 나노복합체의 용도는 종양의 치료를 위한 약물의 제조에 있을 수 있다.
첨부된 도면은 개시된 구체예를 예시하고 있으며 개시된 구체예의 원리를 설명하기 위해서 제공된다. 그러나 도면은 단지 예시 목적으로 설계되며 본 발명의 한계의 정의로서 설계되지 않음이 이해되어야 한다.
도 1은 PEG-mEGCG 컨주게이트(108)의 합성 도식이다. 티올-작용성화된 PEG (PEG-SH)(102)가 염기성 pH(106)에서 DMSO와 물의 1:3(v/v) 혼합물 중의 EGCG (104)에 컨주게이션되었다.
도 2는 0.5 mg mL-1의 농도로 탈이온수에 용해된 PEG-EGCG 컨주게이트(202) 및 PEG(204)의 UV-Vis 스펙트럼이다.
도 3은 EGCG(302)과 PEG-mEGCG 컨주게이트(304)의 HPLC 크로마토그램을 나타낸다. 화살표는 280 nm에서 모니터링된 샘플의 피크들을 나타낸다.
도 4는 반응 시간의 함수로서 PEG-mEGCG 컨주게이트의 컨주게이션의 정도이다.
도 5는 D2O에 용해된 PEG-mEGCG 컨주게이트의 1H NMR 스펙트럼이다.
도 6은 독소루비신/PEG-mEGCG 미셀 나노복합체의 형성을 나타내고 있는 도식이다.
도 7은 상이한 PEG-mEGCG:독소루비신 중량비로 제조된 독소루비신/PEG-mEGCG 미셀 나노복합체의 (a) 크기 및 (b) 제타 전위(zeta potential)를 나타내는 그래프를 나타낸다. 제조된 대로의 나노복합체(검정 막대, 702)의 크기 및 제타 전위를 재구성된 나노복합체(크로스 막대(crossed bar), 704)의 것들과 비교하였다.
도 8은 상이한 PEG-mEGCG:독소루비신 중량비로 제조된 독소루비신/PEG-mEGCG 미셀 나노복합체의 (a) 약물 적재 효율 및 (b) 적재 함량을 나타내는 그래프를 나타낸다.
도 9는 37℃에서의 PBS(pH 7.3) 중의 독소루비신/PEG-mEGCG 미셀 나노복합체의 시험관내 약물 방출 측성을 나타낸다. PEG-mEGCG:독소루비신 중량비=1:1.
도 10은 SU/PEG-EGCG 미셀 나노복합체의 형성의 개략적인 예시를 나타낸다.
도 11은 상이한 PEG-EGCG:SU 중량비에서의 SU/PEG-EGCG 미셀 나노복합체의 (a) 크기, (b) PDI 및 (c) 제타 전위를 나타내는 그래프를 나타낸다.
도 12는 상이한 PEG-EGCG:SU 중량비로 제조된 SU/PEG-EGCG 미셀 나노복합체의 (a) 약물 적재 효율 및 (b) 약물 적재 함량을 나타내는 그래프를 나타낸다.
도 13은 37℃에서의 PBS(pH 7.3) 중의 상이한 PEG-EGCG:SU 중량비에서 (a) SU/PEG-mEGCG 미셀 나노복합체 및 (b) SU/PEG-dEGCG 미셀 나노복합체의 시험관내 약물 방출 특성을 나타내는 그래프를 나타낸다.
도 14는 SU/PEG-EGCG 미셀 나노복합체(특정된 PEG-EGCG:SU 중량비를 지님)가 투여된 것들과 대조군과 비교한 매일 경구 SU 치료(60 mg/kg)를 받은 마우스에서의 주 단위 체중 측정을 나타내는 그래프이다.
도 15는 SU/PEG-EGCG 미셀 나노복합체(특정된 PEG-EGCG:SU 중량비를 지님) 치료, 경구 SU 치료 또는 미치료 마우스의 (a) 종양 크기(발광 신호에 의해서 정량화됨) 및 (b) 발광 이미지를 나타내는 이미지를 나타내고 있다.
도 16은 SU/PEG-mEGCG 8:1 미셀 나노복합체를 투여한 것들과 대조군과 비교한 매일 경구 SU 치료(40 및 15 mg/kg)를 받은 마우스에서의 체중 측정을 나타내는 그래프이다.
도 17은 경구 SU/PEG-mEGCG 8:1 미셀 나노복합체 치료, 경구 SU 치료 또는 미치료 마우스의 종양 크기를 나타내는 그래프이다.
실시예
본 발명의 비-제한 예 및 비교예가 특정의 실시예를 참조로 하여 더욱 상세히 추가로 기재될 것이며, 이는 본 발명의 범위를 제한하는 방식으로 해석되지 않아야 한다.
실시예 1: 물질 및 세포 배양
물질
티올 말단을 지니는 메톡시-폴리에틸렌 글리콜(PEG-SH, Mw = 5000 Da)을 JenKem Technology(China)로부터 얻었다. 알데하이드 말단을 지니는 메톡시-폴리에틸렌 글리콜(PEG-CHO, Mw = 5000 Da)를 NOF Co., Japan으로부터 얻었다. (-)-에피갈로카테킨-3-갈레이트(EGCG, > 95% 순도)를 Kurita Water Industries (Tokyo, Japan)로부터 얻었다. 소듐 피루베이트 용액(100 mM)을 Invitrogen (Singapore)로부터 구매하였다. Ca2+ 및 Mg2+가 없는 PBS 염수(150 mM, pH 7.3)를 싱가포르의 바이오폴리스(Biopolis)에 소재하는 배지 제조 공장에 의해서 공급받았다. DMSO 및 트리에틸아민(TEA)을 Sigma-Aldrich(Singapore)로부터 구매하였다. 독소루비신 하이드로클로라이드(DOX·HCl)를 Boryung Pharm. Inc. (Korea)으로부터 구매하였다. SU(유리 염기 형태)를 BioVision(US)으로부터 구매하였다. 모든 다른 화학약품은 분석 등급이었다.
세포 배양
인간 신장 세포 암종 세포 A498을 American Type Culture Collection(ATCC, Manassas, VA, USA)로부터 얻었고, 10% 소태아 혈청, 1% 페니실린-스트렙토마이신, 2 mM의 글루타민 및 0.1 mM의 비-필수 아미노산으로 보충된 둘베코 변형된 이글 배지(Dulbecco's Modified Eagle's Medium)에서 배양하였다. 안정한 A498 세포 클론 발현 루시페라제 유전자(A498-luc)를 기재된 바와 같이 생성시켰다. 요약하면, A498 세포를 6-웰 플레이트에 5x105 세포/웰의 밀도로 씨딩(seeding)하였고, Lipofectamine 2000(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)을 사용하여 pRC-CMV2-luc 플라스미드로 형질감염시켰다. 1일 후에, 형질감염된 세포를 100-mm 세포 배양 디쉬에 옮기고, 1 mg ml-1 게네티신(geneticin)을 배지에 첨가하여 내성 세포를 선택하였다. 1 주일 선택 후에, 내성 세포를 96-웰 플레이트에 1 세포/웰의 밀도로 씨딩하여 콜로니를 형성시켰다. 전체 10 개의 콜로니를 선택하고, 팽창시키고, 루시페라제 활성(luciferase activity)을 단일-튜브 광도계(single-tube luminometer)(Berthold Lumat LB 9507, Bad Wildbad, Germany) 중의 Promega Kit(Madison, WI, USA)로 측정하였다. 최고의 루시페라제 활성을 나타내는 클론을 선택하고 500 mg ml-1 게네티신과 함께 유지시켰다.
실시예 2: PEG-EGCG 컨주게이트
본 연구에서, 두 가지 유형의 PEG-EGCG 컨주게이트를 사용하여 미셀 나노복합체, 즉, PEG의 한 단부에 각각 하나 및 두 개의 EGCG 모이어티(moiety)를 지니는 PEG-mEGCG 및 PEG-dEGCG를 형성시켰다.
PEG-mEGCG 컨주게이트의 합성
PEG-mEGCG 컨주게이트는 EGCG를 티올 말단을 함유하는 PEG에 컨주게이션시킴으로써 합성되었다. 전형적으로는 EGCG(18.3 mg, 40 μmol)를 PBS와 DMSO의 20 mL의 1:1(v/v) 혼합물에 용해시켰다. PEG-SH (Mw = 5000 Da, JenKem Technology, China) (100 mg, 20 μmol)을 20 mL의 PBS에 별도로 용해시켰다. PEG-SH 용액을 EGCG의 교반 용액에 적가하였다. 대조 실험으로서, 미개질된 PEG 용액을 동일한 농도로 EGCG의 교반 용액에 첨가하였다. 생성되는 혼합물은 8.4의 pH를 지녔다. 혼합물을 25℃에서 7 시간 동안 교반시켰다. 이러한 용액에, 1.6 mL의 10% 아세트산을 첨가하여 pH를 4로 조정해서 반응을 정지시켰다. 생성되는 용액을 1,000Da의 분자량 컷오프(molecular weight cutoff: MWCO)를 지니는 투석 튜브에 옮겼다. 튜브를 탈이온수에 대항해서 투석시켰다. 정제된 용액을 동결건조시켜서 PEG-mEGCG 컨주게이트를 얻었다. PEG-mEGCG 컨주게이트의 구조를 1H NMR 분광분석에 의해서 확인하였다. 건조된 PEG-mEGCG 컨주게이트를 20 mg mL-1의 농도로 D2O에 용해시키고, 이어서, 400 MHz에서 작동하는 Bruker AV-400 NMR 분광계로 분석하였다. 수율: 89%. 1H NMR(D2O): δ 2.9 (t, PEG로부터의 H-α), 3.4 (s, PEG로부터의 H-γ), 3.5-3.8 (m, PEG로부터의 양성자), 5.5 (s, C 고리의 H-2), 5.85 (s, C 고리의 H-3), 6.15 (d, A 고리의 H-6 및 H-8), 6.9 (s, B 고리의 H-6'), 7.05 (s, D 고리의 H-2" 및 H-6").
도 1은 PEG-mEGCG 컨주게이트(108)의 합성 도식을 예시하고 있다. 티올 작용성화된 PEG(PEG-SH)(102)를 염기성 pH(106)에서 1:3 (v/v)의 DMSO 및 물 혼합물 중의 2-배 과량의 EGCG (PEG-SH:EGCG = 1:2)(104)와 함께 인큐베이션시켰다. pH가 EGCG의 자가 산화(autoxidation)에 중요하게 영향을 줌이 보고되었다. 7-9.5의 염기성 pH 범위에서, B 고리 상의 갈릴 모이어티는 D 고리 상의 갈레이트 모이어티보다 자가 산화에 더 민감하다. 그 결과, 단지 B 고리 상의 갈릴 모이어티가 오르토-퀴논을 형성한다. 강한 알칼리 조건(pH > 10)하에, D 고리 상의 갈레이트 모이어티가 또한 자가 산화되어 오르토-퀴논을 형성한다. 본 연구에서, 반응은 pH 8.4에서 수행되어 단지 EGCG의 B 고리에서의 오르토-퀴논의 형성을 허용하였다. 오르토-퀴논에의 PEG-SH의 후속 친핵성 첨가가 공유 티오에테르 결합을 통해서 연결된 PEG-mEGCG 컨주게이트를 생성시켰다.
컨주게이션 반응이 디메틸 설폭사이드(DMSO)의 존재하에 진행됨을 주목할 가치가 있다. EGCG는 수용액 중의 PEG와 접촉시에 집합을 진행할 것이기 때문에, PEG-SH에 대한 EGCG의 컨주게이션 동안에 집합을 피해야 한다. DMSO가 집합을 효과적으로 방지함이 밝혀졌다. 이러한 발견을 기초로 하여, 컨주게이션 반응은 DMSO와 물의 혼합물 중에서 수행되었다. 또한, 소듐 피루베이트가 EGCG의 자가 산화 동안에 생성되는 H2O2에 대한 스캐빈저(scavenger)로서 사용되었다. 소듐 피루베이트가 H2O2-매개된 산화에 대항하여 유리 티올 기를 보호하기 때문에, 그것이 EGCG와의 컨주게이션 반응에 이용 가능한 PEG-SH 분자의 수를 증가시킬 수 있다. 얻은 PEG-mEGCG 컨주게이트를 질소 대기 하에 투석에 의해서 정제하고, 이어서, 동결건조시켜 백색 분말을 얻었다.
PEG-mEGCG 컨주게이트의 UV-Vis 특성분석
PEG-mEGCG 컨주게이트를 자외선-가시광선(UV-Vis) 분광분석을 시용하여 특성을 분석하였다(도 2)
PEG-mEGCG 컨주게이트의 UV-Vis 스펙트럼을 Hitachi U-2810 분광 광도계(Japan)상에서 측정하였다. UV-Vis 분광분석을 위해서, 건조된 PEG-mEGCG 컨주게이트 및 PEG를 0.5 mg mL-1의 농도로 탈이온수에 용해시켰다. 미개질된 PEG(204)와는 달리, PEG-mEGCG 컨주게이트(202)는, EGCG의 성공적인 컨주게이션을 나타내는, 280 nm에서의 강한 UV 흡수 피크를 지니는 것으로 나타났다. 더욱이, EGCG 디머 및 다른 산화 생성물에 상응하는 425 nm에서의 UV 흡수 밴드는 관찰되지 않았다.
PEG-mEGCG 컨주게이트의 HPLC 특성분석
PEG-mEGCG 컨주게이트를 또한 역상 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)에 의해서 분석하였다. 역상 HPLC는 Spirit™ C18 organic column(5 μm, 4.6 × 250 mm i.d., AAPPTec)을 구비한 Waters 2695 분리 모듈을 사용하여 수행되었다. EGCG, PEG/EGCG 혼합물, 및 PEG-mEGCG 컨주게이트를 1 mg mL-1의 농도로 탈이온수에 용해시켰다. 샘플을 25℃에서 1 mL/분의 유속으로 아세토니트릴 중의 1% 아세트산과 물 중의 1% 아세트산의 용매 혼합물로 용리시켰다. 이동상의 경우에, 아세토니트릴:물의 체적 비율을 0분에서의 3:7로부터 10분에서의 4:6으로 점진적으로 증가시켰다. 용리된 샘플을 280 nm에서 모니터링하였다. EGCG 컨주게이션의 정도를 적분된 피크 면적을 다양한 농도의 일련의 EGCG 표준 용액으로부터 얻은 것들과 비교함으로써 측정하였다. 도 3에 도시된 바와 같이, EGCG(302)는 4.8분의 체류 시간에서 용리되는 반면에, PEG-mEGCG 컨주게이트(304)는 8분에서 용리되었다. 체류 시간에서의 이러한 극적인 이동은 EGCG에 대한 친수성 PEG 사슬의 결합에 의해서 설명될 수 있다. 또한, PEG-mEGCG 컨주게이트의 HPLC 크로마토그램에서 EGCG 피크가 관찰되지 않았고, 이는 미반응 EGCG 분자가 투석에 투석에 의해서 완전히 제거됨을 시사한다. 반응 시간이 6시간으로부터 7시간으로 증가함에 따라서 EGCG 컨주게이션의 정도가 약 63%로부터 98%로 증가하였다. 그러나 반응 시간이 8시간인 때에, 컨주게이션의 정도는 약간 증가하였는데, 아마도, 그 이유는 EGCG 디머 및 그 밖의 산화 생성물이 형성되기 시작했기 때문이다. 따라서, 최적의 반응 시간은 7시간이었다.
PEG-mEGCG 컨주게이트의 1 H NMR 특성분석
PEG-mEGCG 컨주게이트의 구조를 1H 핵자기공명(NMR) 분광분석에 의해서 측정하였다. 도 5에 도시된 바와 같이, PEG-mEGCG 컨주게이트는 A 고리(δ = 6.15에서의 H-6 및 H-8), C 고리(δ = 5.5에서의 H-2, 및 δ = 5.85에서의 H-3), 및 D 고리(δ = 7.1에서의 H-2" 및 H-6")에 대한 양성자 신호를 나타냈다. A, C 및 D 고리로부터 발생한 양성자 신호는 미개질된 EGCG의 것들과 유사하였고, 이는 이들 모이어티가 컨주게이션 반응 동안 변화없이 유지됨을 시사한다. 대조적으로, B 고리에 대한 양성자 신호는 컨주게이션 반응 후에 6.5로부터 6.9ppm으로 이동하였다. 양성자 신호에서의 이러한 상당한 이동은 B 고리의 C2' 위치에의 PEG-SH의 결합에 기인하는 듯했다. 또한, B 고리에 대한 NMR 피크는 D 고리에 대한 피크하의 면적의 절반을 지니는 것으로 나타났으며, 이는 B 고리 상의 한 양성자가 컨주게이션 반응 후에 사라졌음을 나타낸다. 관찰된 현상은 이전의 보고와 일치하고, 그에 의해서 2'-시스테이닐 EGCG의 형성이 B 고리로부터의 H-2' 원자의 사라짐을 유발시켰다. 상기 결과는 단지 하나의 PEG 분자가 EGCG의 B 고리의 C2' 위치에 특이적으로 컨주게이션될 수 있음을 밝혔다.
PEG-dEGCG 컨주게이트의 합성
PEG-dEGCG 컨주게이트는 EGCG를 알데하이드 달단 기를 지니는 PEG(PEG-CHO)에 컨주게이션시킴으로써 합성되었다. PEG-CHO(Mw = 5000 Da, NOF Co., Japan) (1.75 g) 및 EGCG(3.25 g, 7.09 mmol)를 아세트산, 물 및 DMSO의 혼합물에 별도로 용해시켰다. 반응은 PEG-CHO 용액의 적가에 의해서 개시시키고, 20℃에서 72시간 동안 수행시켰다. 생성되는 용액을 탈이온수에 대항하여 투석(MWCO = 3500 Da)시켰다. 정제된 용액을 동결건조시켜 PEG-dEGCG 컨주게이트를 얻었다.
실시예 3: 독소루비신/PEG-mEGCG 컨주게이트
암 치료요법 적용을 위해서, 내부에 매우 많은 수의 항암 약물을 담지할 수 있는 미셀 나노복합체를 형성시키기 위해서 PEG-mEGCG 컨주게이트를 설계하였다. 본 연구에서, PEG-mEGCG 미셀 나노복합체는 독소루비신에 대한 전달 비히클로서 사용되었다. 독소루비신은 가장 광범위하게 사용되는 화학치료제 중 하나이고, 다양한 유형의 암, 예컨대, 백혈병, 유방암, 난소암 및 폐암에 대항하는 강한 세포독성 활성을 나타낸다. 그러나 그것은 심각한 심장 독성을 유발시킬 수 있고, 울혈성 심장 기능상실(congestive heart failure), 심장 부정맥(heart arrhythmia), 저혈압 및 그 밖의 부작용의 위험을 증가시킨다. PEG-mEGCG 미셀 나노복합체는 약물 분자를 이들의 내부에 안정되게 캡슐화시키고, 이들을 지속된 방식으로 방출시킴으로써 그러한 부작용을 최소화시킬 수 있음이 예상된다.
독소루비신/PEG-mEGCG 미셀 나노복합체의 형성
독소루비신/PEG-mEGCG 미셀 나노복합체를 투석 방법을 이용하여 제조하였다. 요약하면, 5 mg의 DOX·HCl을 4.5 mL의 디메틸포름아미드에 용해시켰다. 이러한 용액에, TEA를 5:1 몰 비율의 TEA:DOX·HCl로 첨가하였다. 이러한 혼합물을 30분 동안 와동시켜 탈양성자화된 독소루비신(DOX)을 형성시켰다. 생성되는 DOX 용액을 다양한 PEG-mEGCG/DOX 중량 비율로 0.5 mL의 디메틸포름아미드에 용해된 PEG-mEGCG 컨주게이트와 혼합하였다. 이러한 혼합물을 90분 동안 와동시키고, 이어서, 2,000 Da의 MWCO를 지니는 투석 튜브에 옮겼다. 튜브를 24시간 동안 탈이온수에 대항하여 투석시켜서 독소루비신/PEG-mEGCG 미셀 나노복합체를 얻었다.
독소루비신/PEG-mEGCG 미셀 나노복합체의 특성분석
독소루비신/PEG-mEGCG 미셀 나노복합체의 유체역학적 직경(hydrodynamic diameter), 다분산 지수, 및 제타 전위를 동적 광 산란(dynamic light scattering)(Zetasizer Nano ZS, Malvern, UK)에 의해서 평가하였다. 측정은 25℃의 물 중에서 3중으로 수행되었다. 독소루비신의 적재량을 측정하기 위해서, 물 중에 분산된 20 μL의 나노복합체를 980 μL의 디메틸포름아미드와 혼합하여 독소루비신을 추출하였다. 480 nm에서의 독소루비신의 흡광도를 Hitachi U-2810 분광 광도계(Japan)를 사용하여 측정하였다. 약물 적재 효율 및 적재 함량은 흡광도 값을 다양한 농도의 일련의 독소루비신 표준 용액으로부터 얻은 것들과 비교함으로써 측정되었다.
도 6은 독소루비신/PEG-mEGCG 미셀 나노복합체의 형성을 예시하고 있다. PEG-mEGCG 컨주게이트(602) 및 독소루비신(604)을 디메틸포름아미드(606)에 공동-용해시켰다. 이러한 혼합물을 증류수(608)에 대항하여 투석시켰다. 유기 용매를 투석 튜브로부터 제거함에 따라서, 컨주게이트 내의 소수성 EGCG 모이어티가 자가-조립되기 시작하여 친수성 PEG 사슬(610)의 쉘에 의해서 둘러싸인 미셀 코어를 형성하였다. 동시에, 독소루비신 분자가 또한 소수성 미셀 코어내로 분배되었다. 독소루비신 분자는 평면 안트라사이클린 고리들 사이의 π-π 상호작용 때문에 수용액에서 용이하게 함께 적층되었음이 또한 보고되었다. EGCG는 π-π 적층을 통해서 독소루비신과 상호작용할 수 있는 폴리페놀 구조를 지니기 때문에, 미셀 나노복합체의 코어에 농화된(enriched) EGCG가 그들 내의 독소루비신의 포착에 유리한 환경을 제공할 수 있는 것으로 예상되었다. 더욱이, 표면-노출된 PEG 사슬은 미셀 나노복합체 둘레에 보호 쉘(protective shell)을 형성하여 망상내피계(reticuloendothelial system)에 의한 제거를 피할 수 있어서, 혈류 중의 연장된 순환을 가능하게 할 수 있다.
독소루비신/PEG-mEGCG 미셀 나노복합체의 크기 및 표면 전하는 동적 광 산란(DLS) 분석에 의해서 특성 분석되었다. 도 7은 독소루비신/PEG-mEGCG 미셀 나노복합체의 (A) 크기 및 (B) 제타 전위를 나타내는 그래프를 나타낸다.
도 7a는 상이한 중량비의 PEG-mEGCG 대 독소루비신으로 제조된 미셀 나노복합체의 유체역학적 직경을 나타내고 있다. 특히, 나노복합체는 130-180 nm의 크기 범위로 생산되었다. 그러한 작은 크기는 혈류 중의 연장된 순환을 달성하고 향상된 투과성 및 체류(EPR) 효과를 통해서 종양을 표적화하는데 유리하다. 0.5:1의 중량비의 PEG-mEGCG:독소루비신으로 형성된 미셀 나노복합체는 1:1로 형성된 것들보다 더 큰 직경을 지닌다. 더 높은 양의 독소루비신의 포착(entrapment)은 더 큰 미셀 나노복합체의 형성에 원인일 것이었다. 나노복합체는, 0.1-0.2 내에 속하는 작은 다분산 지수(PDI) 값으로부터 입증되는 바와 같이, 고도로 단분산이었다.
도 7b에 도시된 바와 같이, 미셀 나노복합체는 +15-25 mV 범위에서 양성 제타 전위를 지닌다. 이러한 양이온성 전하는 나노복합체 내의 양으로 하전된 독소루비신 분자의 캡슐화에 기인했다. 본 발명자들은 또한 미셀 나노복합체가 동결-건조 과정 동안에 이들의 구조적 일체성을 유지하였는지를 평가하였다. 동결-건조는 콜로이드성 나노입자의 장기간 저장에 사용되는 가장 일반적인 기술 중 하나이다. 나노복합체는 동결건조되고, 이어서, 동일한 농도로 탈이온수에 재분산되었다. 재구성된 나노복합체는 어떠한 동결건조보호제(lyoprotectant) 없이도 최초의 입자 크기 및 표면 전하를 보유하는 것으로 밝혀졌다. 그러한 높은 콜로이드성 안정성은 미셀 나노복합체의 임상 해독(clinical translation) 및 상업화에 유리할 것이다.
도 8은 독소루비신/PEG-mEGCG 미셀 나노복합체의 약물 적재 효율 및 적재 함량을 나타내고 있다. 약물 적재 효율은 75% 초과이어서, 독소루비신이 PEG-mEGCG 나노복합체에 효율적으로 통합됨을 나타냈다. PEG-mEGCG:독소루비신의 중량비가 감소함에 따라서, 약물 적재 효율 및 적재 함량 둘 모두가 증가하였다. 관찰된 적재 함량(35-50 w/w%)은 다른 폴리머 미셀 시스템으로 달성된 것들보다 현저하게 더 높았다. π-π 적층 및/또는 EGCG와 독소루비신 사이의 소수성 상호작용은 PEG-mEGCG 미셀 나노복합체의 높은 약물 적재 용량에서 중요한 역할을 한다.
독소루비신 방출 연구
방출실험을 위해서, 0.5 mL의 독소루비신-적재된 나노복합체(2 mg mL-1)를 2,000 Da의 MWCO를 지니는 투석 튜브에 넣었다. 튜브를 37℃에서 진탕 인큐베이터(shaking incubator) 내의 25 mL의 PBS에 침지시켰다. 주어진 시점에서, 1 mL의 방출 배지를 수거하고, 이어서, 균등한 용적의 신선한 PBS로 대체하였다. 배지내로 방출된 독소루비신의 양을 Hitachi U-2810 분광 광도계(Japan)를 사용하여 480 nm에서 독소루비신의 흡광도를 측정함으로써 측정하였다.
독소루비신/PEG-mEGCG 미셀 나노복합체의 약물 방출 특성을 또한 생리학적 온도 및 pH에서 조사하였다. 도 9에 도시된 바와 같이, 미셀 나노복합체는 PBS 중의 독소루비신의 지속된 방출을 나타냈다. 대략 11%의 적재된 독소루비신이 7일 이내에 방출되었다. 관찰된 방출 속도는 앞서 보고된 다른 독소루비신 전달 시스템보다 상당히 낮다. 이러한 지속된 약물 방출은 아마도 미셀 나노복합체 내의 EGCG와 독소루비신 사이의 강한 상호작용에 의해서 유발되었다. 또한, 단지 한계 초기 파열 방출(marginal burst release)이 초기 단계에서 관찰되어, 독소루비신 분자가 미셀 나노복합체에 안정하게 캡슐화되었음을 시사했다. 그러한 낮은 약물 누출은, 나노복합체에 캡슐화된 약물 분자가 혈류에서의 순환 동안에 조기에 누출될 수 없음에 따라서, 최소의 부작용과 함께 최대의 치료 효능을 확실히 하기에 필수적일 수 있다. 함께 고려해 보면, 이들 결과는 PEG-mEGCG 미셀 나노복합체가 암 치료를 위한 독소루비신의 전신 투여에 적용될 수 있음이 입증되었다.
실시예 4: SU/PEG-EGCG 컨주게이트
SU/PEG-EGCG 미셀 나노복합체의 형성
도 10은 고체 분산 방법을 이용한 SU/PEG-EGCG 컨주게이트의 형성을 예시하고 있다. 요약하면, 2 mg의 SU(1006)를 1 mL의 클로로포름에 용해시켰다. 이어서, SU 용액을 다양한 PEG-EGCG:SU 중량비(1008)로 유리 바이알 내의 PEG-EGCG 컨주게이트s (PEG-mEGCG (1002) 또는 PEG-dEGCG(1004)중 하나)에 첨가하고 와동시켰다. 이어서, 용액 중의 클로로포름을 감압(1010)하에 증발시켰다. PEG-EGCG과 SU의 혼합물(1012)의 생성되는 얇은 필름을 2 mL의 물을 표면(1014)에 첨가함으로써 수화시키고, 주위 온도에서 24시간 동안 인큐베이션시켰다. 생성되는 고체 필름이 수화됨에 따라서, 수화된 PEG 사슬로부터의 SU 및 EGCG 모이어티의 분리에 의해서 미셀 나노복합체를 형성시키기 위해서 PEG-EGCG를 자가-조립시켰다. 이어서, SU/PEG-EGCG 미셀 나노복합체 용액을 0.8-μm 필터(Sartorius Stedim Biotech GmbH, Germany)를 통해서 여과(1016)하여 어떠한 잔류 유리 약물을 제거해서, 투명한 SU/PEG-EGCG 미셀 나노복합체 용액(1018)을 생성시켰다. 생체내 연구를 위해서, SU/PEG-EGCG 미셀 나노복합체 용액을 0.2-μm 필터(Sartorius Stedim Biotech GmbH, Germany)를 사용하여 추가로 여과하였다.
PEG-EGCG 컨주게이트는 달리 명시되지 않는 한 PEG-mEGCG 및 PEG-dEGCG 둘 모두를 나타낸다는 것을 주지해야 한다.
EGCG는 소수성 상호작용 및 π-π 적층을 통해서 SU와 상호작용할 수 있는 폴리페놀 구조를 지니기 때문에, 미셀 나노복합체의 코어에 농화된(enriched) EGCG가 SU의 포착에 유리한 환경을 제공할 수 있는 것으로 예상되었다. 또한, 표면-노출된 PEG 사슬은 미셀 나노복합체 둘레에 고도로 수화된 보호 쉘을 형성하여 RES에 의한 제거를 피할 수 있어서, 혈류 중의 연장된 순환 및 부작용의 감소를 가능하게 할 수 있다.
SU/PEG-mEGCG 미셀 나노복합체의 특성 분석
SU/PEG-mEGCG 미셀 나노복합체의 유체역학적 직경, 크기 분포 및 표면 전하를 동적 광 산란(dynamic light scattering)(Zetasizer Nano ZS, Malvern, UK)에 의해서 평가하였다. 측정은 25℃의 물 중에서 3중으로 수행되었다. 도 11a는 상이한 PEG-EGCG:SU 중량비로 제조된 미셀 나노복합체의 유체역학적 직경을 나타내고 있다. 특히, 미셀 나노복합체는 130-250 nm의 크기 범위로 생산되었다. 나노미터 크기는 순환을 연장시키고 (EPR) 효과를 통해서 종양을 표적화하는데 유리하다. 미셀 나노복합체의 특성을 PEG-EGCG:SU 중량비를 변화시킴으로써 조절하였다. 도 11b는 8 및 16의 PEG-EGCG:SU 중량비율로 형성된 미셀 나노복합체가 고도로 단분산이었음을 나타내고 있다. PEG-EGCG:SU 중량비율이 증가함에 따라서 미셀 나노복합체는 이들의 양성 전하가 감소된다(도 11c). 이들의 약간의 양성 표면 전하는 양으로 하전된 SU 분자의 캡슐화에 기인되었다.
약물 적재 효율 및 양을 측정하기 위해서, 물 중의 0 μL의 미셀 나노복합체를 990 μL의 DMF에 용해시키고 SU의 흡광도를 Hitachi U-2810 자외선-가시광선(UV-Vis) 분광 광도계(Japan)를 사용하여 431 nm에서 측정하였다. SU 표준 용액으로 얻은 검정 곡선을 적재 효율 및 양을 측정하기 위해서 사용하였다.
도 12는 SU/PEG-EGCG 미셀 나노복합체의 약물 적재 효율 및 약물 적재 함량을 나타내고 있다. PEG-EGCG:SU 중량비가 1에서 16으로 증가함에 따라서, 약물 적재 효율은 약 30%에서 약 80%로 증가하였다. SU/PEG-dEGCG 미셀 나노복합체의 적재 효율은 SU/PEG-mEGCG 미셀 나노복합체보다 더 높아서, PEG-mEGCG와의 상호작용에 비해서 PEG-dEGCG와의 SU의 상호작용이 더 큼을 나타냈다. 미셀 나노복합체의 적재 효율이 여과 전의 미적재된 SU 침전물의 양과 관련되었음이 또한 밝혀졌다. PEG-EGCG:SU 중량비율이 8로 증가하는 때에, SU 침전물은 발견되지 않았다. 예상된 바와 같이, PEG-EGCG:SU 중량 비율이 미셀 나노복합체 내의 더 높은 함량의 PEG-EGCG로 인해서 증가함에 따라서 미셀 나노복합체의 적재 함량은 감소되었다.
SU 방출 연구
SU/PEG-EGCG 미셀 나노복합체의 약물 방출 특성을 생리학적 조건(37℃에서의 포스페이트-완충된 염수(PBS), pH 7.3)하에 추가로 조사하였다. SU 방출 실험을 위해서, 0.5 mL의 SU/PEG-EGCG 미셀 나노복합체(0.4 mg mL-1)를 투석 튜브(MWCO = 2,000 Da)에 넣었다. 37℃에서 진탕 인큐베이터(shaking incubator) 내의 25 mL의 PBS에 침지시켰다. 주어진 시점에서, 1 mL의 방출 배지를 수거하고, 이어서, 균등한 용적의 신선한 PBS로 대체하였다. 배지 내로 방출된 SU의 양을 Hitachi U-2810 분광 광도계를 사용하여 431 nm에서의 흡광도를 측정함으로써 측정하였다.
도 13에 도시된 바와 같이, 미셀 나노복합체는 PBS 중의 SU의 지속된 방출을 나타냈으며, 이는 미셀 나노복합체 내의 EGCG와 SU 사이의 강한 상호작용에 기인될 수 있다. 또한, 초기 파열 방출이 거의 관찰되지 않아서, SU 분자가 미셀 나노복합체에 안전하게 캡슐화되었음을 시사했다. SU/PEG-mEGCG 미셀 나노복합체는 SU과 mEGCG 모이어티 사이의 더 약한 상호작용에 기인하여 SU/PEG-dEGCG 미셀 나노복합체에 비해서 더 신속하고 더 많은 SU 방출을 나타냈다. 방출 속도 및 양이 또한 PEG-EGCG:SU 중량비율에 좌우된다. SU/PEG-mEGCG 미셀 나노복합체의 경우에, 방출 속도 및 양 둘 모두는 PEG-EGCG:SU 중량비율이 증가함에 따라서 감소한다. PEG-EGCG:SU 중량비율은, 더 느리거나 더 적은 방출이 8의 PEG-EGCG:SU 중량비율과 관련되었음을 제외하고는, SU/PEG-dEGCG 미셀 나노복합체에서의 방출속도 및 양에 크게 영향을 주지 않았다.
생체내 치료 연구
독성 및 치료 효과를 연구하기 위해서, 미셀 나노복합체에 대해서 생체내 연구를 수행하였다. 피하 신장세포 암종 모델을 확립시켰다. 성숙한 암컷 Balb/c 무흉선 면역무능 누드 마우스(Balb/c athymic, immunoincompetent nude mice)(평균 중량=19g, 주령=6-8주)를 사용하였다.
정맥내 주사에 의한 SU/PEG-EGCG 미셀 나노복합체의 치료 효과를 연구하기 위해서, 이종이식 종양 모델을 6x106 A498-luc 세포를 마우스의 왼쪽 넓적다리의 뿌리(root of the left thigh) 내로 피하 접종시킴으로써 확립시켰다. 종양 접종 6일째에, 동물을 5주 동안 주 2회의 다양한 용액의 꼬리 정맥 주사를 위한 4 그룹(그룹 당 n=8)으로 나눴고, 한 그룹은 60 mg/kg로 매일 SU를 위관주입하였다. 꼬리 정맥 주사의 경우에, 200㎕의 샘플 용액을 사용하였다.
A498-luc 세포로부터의 생물발광 신호를 모니터링하기 위해서, 이소플루란 가스-마취된 동물에 PBS 중의 200㎕의 D-루시페린(5 mg ml-1, Promega)를 복강내 주사하고, CCD 카메라를 구비한 IVIS 영상화 시스템(Xenogen, Alameda, CA, USA)의 카메라 박스 내의 가온된 스테이지(30℃)에 놓았다. 생물발광 영상을 30초 획득(30-s acquisition)으로서 루시페린 주사 후 20분에 취하였다. A498-luc 세포로부터 방출된 광을 디지털화하고 동물의 명도 영상(grayscale image) 상에 의사컬러 중첩(pseudocolor overlay)으로서 전자적으로 디스플레이하였다. 생물발광 신호의 영상 및 측정치를 Xenogen 영상화 소프트웨어 v3.2(Xenogen imaging software v3.2)로 획득하고 분석하여 광자/초로서 정량화하였다. 종양 크기 및 체중을 주 기준으로 측정하였다. 동물의 모든 취급 및 케어(care)는 싱가포르의 National Advisory Committee for Laboratory Animal Research에 의해서 발행된 Guidelines on the Care and Use of Animals for Scientific Purposes에 따라서 수행하였다.
모든 데이터는 평균 ± 평균의 표준편차(SEM)으로서 나타냈다. 평균 값들 사이의 차이의 통계적 유의성을 스튜던트 t-시험(Student's t-test)에 의해서 측정하였다. 다중 비교는 SigmaStat 3.5를 사용한 본페로니 다중 비교 시험(Bonferroni's multiple comparison test)으로 ANOVA에 의해서 평가되었다. < 0.05의 P-값이 통계학적으로 유의한 것으로 여겨졌다.
SU/PEG-mECGC 미셀 나노복합체(8 및 16의 PEG-EGCG:SU 중량비율) 및 SU/PEG-dEGCG 미셀 나노복합체(8의 PEG-EGCG:SU 중량비율)을 미셀 나노복합체 크기, 크기 분포 및 표면 전하를 기초로 한 생체내 연구를 위해서 선택하였다. SU/PEG-mEGCG 미셀 나노복합체를 5 주 동안 주 2회 정맥내 주사하였고, 한 그룹은 60 mg/kg으로 매일 SU 위관주입되었다. 일일 60 mg/kg의 경구 약물 도즈는, 마우스에서의 항종양 효율을 위한 최적으니 전임상 도즈가 일일 40-80 mg/kg인 것으로 입증된 종래의 보고에 근거하여 선택되었다. 본 발명자들의 연구이 경우에, 일일 60 mg/kg 도즈가 효과적인 항종양 도즈를 나타냈고, 다른 연구는 일일 < 40 mg/kg의 도즈가 그보다 적게 효과적임을 나타냈고, 일일 120 mg/kg의 도즈는 추가의 상승된 약물 투여의 효과를 시험할 것이다.
도 14는 치료 개시 후 1주에 경구 유리 SU가 투여된 그룹에서의 상당한 체중 감소를 나타내고 있다. 이는 SU/PEG-EGCG 미셀 나노복합체 치료를 받은 다른 그룹에서는 관찰되지 않았다. SU/PEG-EGCG 미셀 나노복합체가 주 2회 투여되었을 때에, 매일의 SU 경구 치료법에 비해서, 항종양 효과가 향상되었다(도 15). SU/PEG-EGCG 미셀 나노복합체에 의한 이러한 항종양 효과는 경구 투여 농도의 거의 1/10에서 달성되었다. SU/PEG-EGCG 미셀 나노복합체의 억제 효과는 치료가 5주 후에 중단되었을 때에도 실질적인 기간 동안 유지되었다. 미셀 나노복합체 치료를 받은 그룹과 비교하여, 경구 치료를 받은 그룹에서 종양 재성장의 속도가 훨씬 더 빨랐다.
경구 투여를 통한 SU/PEG-mEGCG MNC의 치료 효과를 조사하기 위해서, 이종이식 종양 모델을 100 μl의 PBS 및 100 μl의 Matrigel(BD Bioscience)에 현탁된 4x106 ACHN 세포를 마우스의 오른쪽 넓적다리의 뿌리 내로 피하 접종시킴으로써 확립시켰다. 종양이 200 mm3의 용적에 도달하면, 동물을 5주 동안 매일 다양한 용액의 경구 위관주입을 위한 4개의 그룹(그룹당 n=8)으로 분할하였다: 대조군(시트레이트 완충액 pH 5), SU/PEG-mEGCG 8:1(15 mg/kg에서의 SU), 15 및 40 mg/kg에서의 SU. 종양을 디지털 캘리퍼(digital caliper)로 주 2회 측정하였고, 종양 용적(mm3)을 하기 식으로부터 계산하였다: 용적=(길이 x 폭2)/2(도 16 및 17).
일일 60 mg/kg의 SU 도즈가 너무 독성인 것으로 밝혀짐에 따라서, 경구 SU 도즈를 본 발명에서는 일일 40 mg/kg으로 감소시켰다. 이러한 일일 40 mg/kg의 경구 도즈는 종래 보고서를 기초로 한 마우스에서의 항종양 효능을 위한 최적의 전임상 도즈이다. 도 16은 치료 동안 40 mg/kg로 SU 투여된 그룹에서의 유의한 체중 손실을 나타내고 있다. 이는 15 mg/kg 치료로 SU/PEG-mEGCG MNC 8:1 및 SU를 투여한 다른 그룹에서는 관찰되지 않았다. 15 mg/kg에서의 동일한 SU 드즈로, SU/PEG-mEGCG MNC는 SU 단독과 비교할 때에 유의하게 더 높은 치료 효과를 나타냈다(도 17). SU/PEG-mEGCG MNC에 의한 이러한 항종양 효과는 40 mg/kg에서의 최적의 경구 SU 도즈의 농도의 절반 미만에서 달성되었다. SU/PEG-mEGCG MNC의 억제 효과는 치료가 5주 후에 중단되었을 때에도 실질적인 기간 동안 유지되었다.
EPR 효과는 종양 혈관으로부터 선택적으로 누출되어 나오고 종양 조직에 축적되는 > 40 kDa의 거대분자의 수송을 용이하게 하는 종양 혈관의 해부학적-생리학적 본질을 고려한다. 대부분의 고형 종양은 일반적으로 많은 양의 혈관 투과성을 초래하는 결함 구조가 있는 혈관을 지닌다. 이러한 혈관 투과성은 정상 조직에서는 발생하지 않는다. 본 발명은 처음으로 ccRCC에 대한 가능한 치료법으로서 정맥내 및 경구 투여 둘 모두를 통한 SU/PEG-mEGCG 미셀 나노복합체의 사용을 개시하고 있다. EGCG는 SU와 상호작용함이 관찰되었고, 래트에서의 약동학적 연구는 EGCG의 투여가 SU의 혈장 농도를 현저하게 감소시켰음이 나타났다. SU와의 녹차의 보고된 상호작용 및 다양한 종양에서의 미셀 나노입자의 EPR 효과는 SU 전달을 위해서 나노입자 담체로서 사용할 가능성을 암시했다. 아교모세포종(glioblastoma), 즉, 고도의 혈관형성 종양에서, 항-혈관형성 치료법은 매우 높은 효능을 나타냈지만, 일시적인 효능이었다. 그러한 종양은 주로 VEGF에 의해서 유도된 과정을 통한 새로운 혈관의 형성을 자극하지만, 생성되는 혈관은 구조적으로 및 기능적으로 비정상이다. SU/PEG-EGCG 미셀 나노복합체의 사용이 그러한 경우에서의 항-혈관형성 활성을 효능적으로 향상시킬 수 있다.
산업상 이용성
미셀 나노복합체는 암 치료를 위한 독소루비신의 전신 투여에서의 사용에 적용될 수 있다.
미셀 나노복합체는 SU 전달을 위한 나노입자 담체로서 사용될 수 있다. 아교모세포종, 즉, 고도의 혈관형성 종양에서, 항-혈관형성 치료법은 매우 높은 효능을 나타냈지만, 일시적인 효능이었다. 그러한 종양은 주로 VEGF에 의해서 유도된 과정을 통한 새로운 혈관의 형성을 자극하지만, 생성되는 혈관은 구조적으로 및 기능적으로 비정상이다. SU를 포함하는 미셀 나노복합체의 사용은 그러한 경우에서의 항-혈관형성 활성을 효능적으로 향상시킬 수 있다.
미셀 나노복합체는 전신 투여되는 때의 치료제의 지속된 방출을 위해서 또는 표적 부위에서의 치료제를 위한 전달 시스템으로서 사용될 수 있다.
미셀 나노복합체는 상이한 종류의 암 치료를 위한 다양한 치료제의 캡슐화를 위해서 사용될 수 있다.
미셀 나노복합체는 또한 비-암성 치료를 위한 다양한 치료제의 캡슐화를 위해서 사용될 수 있다. 이는 항생제 및 다른 의학 적용을 위한 소분자를 포함할 수 있다.
본 발명의 사상 및 범위를 벗어나지 않은 본 발명의 다른 변화 및 조정이 상기 개시내용을 읽은 당업자에게는 자명할 것이며, 모든 그러한 변화 및 조정이 청구범위의 범위내에 있는 것으로 의도됨이 자명할 것이다.

Claims (45)

  1. 미셀(micelle) 및 상기 미셀 내에 캡슐화된 제제를 포함하는 미셀 나노복합체(micellar nanocomplex)로서, 상기 미셀이 폴리머-플라보노이드 컨주게이트(polymer-flavonoid conjugate)를 포함하고, 상기 폴리머가 상기 플라보노이드의 B 고리에 결합되는 미셀 나노복합체.
  2. 청구항 1에 있어서, 적어도 하나의 플라보노이드가 상기 폴리머에 결합되는 미셀 나노복합체.
  3. 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서, 상기 폴리머가 링커(linker)를 통해서 상기 플라보노이드에 결합되는 미셀 나노복합체.
  4. 청구항 3에 있어서, 상기 링커가 티오에테르, 이민, 아민, 아조 및 1,2,3-트리아졸 기로 이루어진 군으로부터 선택되는 미셀 나노복합체.
  5. 청구항 1 내지 청구항 4 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 플라보노이드가 모노머 플라보노이드 또는 디머 플라보노이드인 미셀 나노복합체.
  6. 청구항 2 내지 청구항 5 중 어느 한 항에 있어서, 하나 초과의 플라보노이드가 상기 컨주게이트에 존재하는 때에, 플라보노이드 중 적어도 하나가 B 고리를 통해서 상기 폴리머에 결합되는 미셀 나노복합체.
  7. 청구항 6에 있어서,
    상기 적어도 하나의 플라보노이드 중 다른 것이 A 고리를 통해서 상기 폴리머에 결합되는 미셀 나노복합체.
  8. 청구항 1 내지 청구항 7 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 폴리머가 친수성 폴리머인 미셀 나노복합체.
  9. 청구항 8에 있어서,
    상기 친수성 폴리머가 아크릴아미드, 알킬, 옥사졸린, 알케닐, 이민, 아크릴산, 메타크릴레이트, 디올, 옥시란, 알코올, 아민, 안하이드라이드(anhydride), 에스테르, 락톤, 카르보네이트, 카르복실산, 아크릴레이트, 하이드록실, 포스페이트, 테레프탈레이트, 아미드 및 에테르로 이루어진 군으로부터 선택된 모노머를 포함하는 미셀 나노복합체.
  10. 청구항 8에 있어서,
    친수성 폴리머가 폴리아크릴아미드, 폴리(N-이소프로필아크릴아미드), 폴리(옥사졸린), 폴리에틸렌이민, 폴리(아크릴산), 폴리메타크릴레이트, 폴리(에틸렌 글리콜), 폴리(에틸렌 옥사이드), 폴리(비닐 알코올), 폴리(비닐피롤리디논), 폴리에테르, 폴리(알릴아민), 폴리안하이드라이드, 폴리(β-아미노 에스테르), 폴리(부틸렌 석시네이트), 폴리카프로락톤, 폴리카르보네이트, 폴리디옥사논, 폴리(글리세롤), 폴리글리콜산, 폴리(3-하이드록시프로피온산), 폴리(2-하이드록시에틸 메타크릴레이트), 폴리(N-(2-하이드록시프로필)메타크릴아미드), 폴리락트산, 폴리(락트산-코-글리콜산), 폴리(오르토 에스테르), 폴리(2-옥사졸린), 폴리(세박산), 폴리(테레프탈레이트-코-포스페이트) 및 이들의 코폴리머로 이루어진 군으로부터 선택되는 미셀 나노복합체.
  11. 청구항 8에 있어서,
    상기 친수성 폴리머가 폴리사카라이드인 미셀 나노복합체.
  12. 청구항 8에 있어서,
    친수성 폴리머가 히알루론산, 덱스트란, 풀룰란(pullulan), 키토산, 셀룰로오스, 아밀로오스, 전분, 젤라틴, 카라기난(carrageenan), 사이클로덱스트린, 덱스트란 설페이트, 피콜(Ficoll), 겔란(gellan), 구아검(guar gum), 펙틴, 폴리수크로오스, 풀룰란, 스클레로글루칸( scleroglucan), 잔탄(xanthan), 자일로글루칸(xyloglucan) 및 알기네이트로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리사카라이드인 미셀 나노복합체.
  13. 청구항 1 내지 청구항 12 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 플라보노이드가 플라본(flavone), 이소플라본, 플라반(flavan), 프로안토시아니딘(proanthocyanidin) 및 안토시아니딘(anthocyanidin)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 미셀 나노복합체.
  14. 청구항 13에 있어서,
    상기 플라반이 (-)-에피카테킨, (+)-에피카테킨, (-)-카테킨, (+)-카테킨, 에피카테킨 갈레이트, 에피갈로카테킨, 에피갈로카테킨 갈레이트, 피세티니돌(Fisetinidol), 갈로카테킨, 갈로카테킨 갈레이트, 메스퀴톨(Mesquitol) 및 로비네티니돌(Robinetinidol), 엘라기타닌(ellagitannin), 갈로타닌(gallotannin), 우롱테아닌(oolongtheanin), 플로로타닌(phlorotannin), 타닌(tannin), 테아시트린(theacitrin), 테아디벤조트로폴란(theadibenzotropolone), 테아플라빈(theaflavin), 테아나프토퀴논(theanaphthoquinone), 테아루비긴(thearubigin), 테아시넨신(theasinensin) 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 미셀 나노복합체.
  15. 청구항 1 내지 청구항 14 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제제가 치료제인 미셀 나노복합체.
  16. 청구항 1 내지 청구항 15 중 어느 한 항에 있어서,
    치료제가 알킬화제(alkylating agent), 안트라사이클린(anthracycline), 세포골격 파괴제(cytoskeletal disruptor), 에포틸론(epothilone), 히스톤 데아세틸라제 억제제(histone deacetylase inhibitor), 토포이소머라제 I 억제제(topoisomerase I inhibitor), 토포이소머라제 II 억제제(topoisomerase II inhibitor), 모노클로날 항체(monoclonal antibody), 항체-약물 컨주게이트, 뉴클레오티드 유사체(nucleotide analog), 전구체 유사체(precursor analog), 펩티드 항생제(peptide antibiotics), 플라티넘-기반 제제(platinum-based agent), 레티노이드(retinoid), 빈카 알칼로이드(vinca alkaloid), 시토킨(cytokine), 항대사물질(anti-metabolite), 및 빈카 알칼로이드 유도체 및 그 밖의 세포독성물질로 이루어진 군으로부터 선택된 화학치료제인 미셀 나노복합체.
  17. 청구항 16에 있어서,
    화학치료제가 악티노마이신(Actinomycin), 아파티닙(Afatinib), 올-트랜스-레티노산(All-trans retinoic acid), 액시티닙(Axitinib), 아자시티딘(Azacitidine), 아자티오프린(Azathioprine), 베바시주맙(Bevacizumab), 블레오마이신(Bleomycin), 보수티닙(Bosutinib), 보르테조밉(Bortezomib), 카르보플라틴(Carboplatin), 카페시타빈(Capecitabine), 세툭시맙(Cetuximab), 시스플라틴(Cisplatin), 클로람부실(Chlorambucil), 크리조티닙(Crizotinib), 사이클로포스파미드(Cyclophosphamide), 시타라빈(Cytarabine), 다사티닙(Dasatinib), 다우노루비신(Daunorubicin), 도세탁셀(Docetaxel), 독시플루리딘(Doxifluridine), 독소루비신, 에피루비신(Epirubicin), 에포틸론 A(Epothilone A)(C26H39NO6S), 에포틸론 B(C27H41NO6S), 에포틸론 C(C26H39NO5S), 에포틸론 D(C27H41NO5S), 에포틸론 E(C26H39NO7S), 에포틸론 F(C27H41NO7S), 에를로티닙(Erlotinib), 에토포시드(Etoposide), 플루오로우라실(Fluorouracil), 포스타마티닙(Fostamatinib), 게피티닙(Gefitinib), 겜시타빈(Gemcitabine), 하이드록시우레아, 이다루비신(Idarubicin), 이마티닙(Imatinib), 이라노테칸(Irinotecan), 라파티닙(Lapatinib), 렌바티닙(Lenvatinib), 메클로레타민(Mechlorethamine), 메르캅토퓨란(Mercaptopurine), 메토트렉세이트(Methotrexate), 미토잔트론(Mitoxantrone), 닐로티닙(Nilotinib), 옥살리플라틴(Oxaliplatin), 파클리탁셀(Paclitaxel), 파니투무맙(Panitumumab), 파조파닙(Pazopanib), 페갑타닙(Pegaptanib), 페메트렉시드(Pemetrexed), 라니비주맙(Ranibizumab), 레고라페닙(Regorafenib), 록소리티닙(Ruxolitinib), 소라페닙(Sorafenib), 수니티닙(Sunitinib), 트라스투주맙(Trastuzumab), 테니포시드(Teniposide), 티오구아닌(Tioguanine), 토파시티닙(Tofacitinib), 토포테칸(Topotecan), 발루비신(Valrubicin), 베무라페닙(Vemurafenib), 빈블라스틴(Vinblastine), 빈크리스틴(Vincristine), 빈데신(Vindesine), 비노렐빈(Vinorelbine)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 미셀 나노복합체.
  18. 청구항 1 내지 청구항 17 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 미셀 나노복합체가 30 내지 300 nm, 50 내지 300 nm, 100 내지 300 nm, 30 내지 50 nm, 30 내지 100 nm, 30 내지 150 nm, 150 내지 300 nm, 200 내지 300 nm, 250 내지 300 nm, 100 내지 150 nm, 100 내지 200 nm, 100 내지 250 nm, 130 내지 180 nm, 또는 130 내지 250 nm의 범위의 크기를 지니는 미셀 나노복합체.
  19. 청구항 1 내지 청구항 18 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 미셀 내에 존재하는 상기 제제의 적재 효율이 30% 초과, 35% 초과, 40% 초과, 45% 초과, 50% 초과, 55% 초과, 60% 초과, 65% 초과, 70% 초과, 75% 초과, 또는 80%인 미셀 나노복합체.
  20. 청구항 1 내지 청구항 19 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 미셀 내에 존재하는 상기 제제의 적재 함량이 1 내지 10 w/w%, 5 내지 25 w/w%, 20 내지 45 w/w%, 30 내지 50 w/w%, 35 내지 50 w/w%, 40 내지 50 w/w%, 45 내지 50 w/w%, 30 내지 35 w/w%, 30 내지 40 w/w% 또는 30 내지 45 w/w%의 범위내에 있는 미셀 나노복합체.
  21. 미셀 및 상기 미셀 내에 캡슐화된 제제를 포함하는 미셀 나노복합체를 형성시키는 방법으로서,
    a. 적합한 용매 중의 상기 제제를 폴리머-플라보노이드 컨주게이트에 첨가하는데, 상기 폴리머가 상기 플라보노이드의 B 고리에 결합되는 폴리머-플라보노이드 컨주게이트에 첨가하는 단계; 및
    b. 상기 폴리머-플라보노이드 컨주게이트를 포함하는 미셀의 자가-조립(self-assembly) 및 상기 미셀 내의 상기 제제의 캡슐화를 허용하여 상기 미셀 나노복합체를 형성시키는 단계를 포함하는 방법.
  22. 청구항 21에 있어서,
    단계 (a)가
    a. 상기 용매를 제거하여 상기 제제와 상기 폴리머-플라보노이드 컨주게이트의 건조 필름을 형성시키는 단계; 및
    b. 상기 건조 필름을 수성 용매로 수화시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  23. 청구항 21 또는 청구항 22에 있어서,
    형성된 미셀 나노복합체를 여과에 의해서 분리하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  24. 청구항 21에 있어서,
    단계 (a)가 제제를 적합한 용매 중에서 투석시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  25. 플라보노이드의 B 고리에 결합된 폴리머를 포함하는 폴리머-플라보노이드 컨주게이트.
  26. 청구항 25에 있어서,
    상기 폴리머가 폴리사카라이드, 폴리아크릴아미드, 폴리(N-이소프로필아크릴아미드), 폴리(옥사졸린), 폴리에틸렌이민, 폴리(아크릴산), 폴리메타크릴레이트, 폴리(에틸렌 글리콜), 폴리(에틸렌 옥사이드), 폴리(비닐 알코올), 폴리(비닐피롤리디논), 폴리에테르, 폴리(알릴아민), 폴리안하이ㅡ라이드, 폴리(β-아미노 에스테르), 폴리(부틸렌 석시네이트), 폴리카프로락톤, 폴리카르보네이트, 폴리디옥사논, 폴리(글리세롤), 폴리글리콜산, 폴리(3-하이드록시프로피온산), 폴리(2-하이드록시에틸 메타크릴레이트), 폴리(N-(2-하이드록시프로필)메타크릴아미드), 폴리락트산, 폴리(락트산-코-글리콜산), 폴리(오르토 에스테르), 폴리(2-옥사졸린), 폴리(세박산), 폴리(테레프탈레이트-코-포스페이트) 및 이들의 코폴리머로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리머-플라보노이드 컨주게이트.
  27. 청구항 25 또는 청구항 26에 있어서,
    상기 플라보노이드가 (-)-에피카테킨, (+)-에피카테킨, (-)-카테킨, (+)-카테킨, 에피카테킨 갈레이트, 에피갈로카테킨, 에피갈로카테킨 갈레이트, 피세티니돌(Fisetinidol), 갈로카테킨, 갈로카테킨 갈레이트, 메스퀴톨(Mesquitol) 및 로비네티니돌(Robinetinidol), 엘라기타닌(ellagitannin), 갈로타닌(gallotannin), 우롱테아닌(oolongtheanin), 플로로타닌(phlorotannin), 타닌(tannin), 테아시트린(theacitrin), 테아디벤조트로폴란(theadibenzotropolone), 테아플라빈(theaflavin), 테아나프토퀴논(theanaphthoquinone), 테아루비긴(thearubigin), 테아시넨신(theasinensin) 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리머-플라보노이드 컨주게이트.
  28. 청구항 25 내지 청구항 27 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 폴리머가 티오에테르, 이민, 아민, 아조 및 1,2,3-트리아졸로 이루어진 군으로부터 선택되는 링커를 통해서 플라보노이드에 컨주게이션되는 폴리머-플라보노이드 컨주게이트.
  29. 청구항 25 내지 청구항 28 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 폴리머가 폴리(에틸렌 글리콜)이고, 상기 플라보노이드가 에피갈로카테킨-3-갈레이트이고, 상기 링커가 티오에테르인 폴리머-플라보노이드 컨주게이트.
  30. 청구항 29에 있어서,
    상기 컨주게이트가 하기 화학식을 지니는 폴리머-플라보노이드 컨주게이트:
    [화학식 2]
    Figure pat00003

    상기 식에서,
    n은 20 내지 910의 범위에 있다.
  31. 상기 플라보노이드를 염기성 조건하에 친핵성 첨가를 통해서 상기 폴리머와 컨주게이션시키는 단계를 포함하여 청구항 25 내지 청구항 30 중 어느 한 항의 폴리머-플라보노이드 컨주게이트를 형성시키는 방법으로서, 상기 폴리머가 유리 친핵성 기를 지니는 방법.
  32. 청구항 31에 있어서,
    상기 컨주게이션시키는 단계가 1 내지 24 시간의 반응 시간으로 수행되는 방법.
  33. 청구항 31 또는 청구항 32에 있어서,
    상기 플라보노이드의 집합(aggregation)을 실질적으로 방지하는 용매중에서 컨주게이션시키는 단계를 수행하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  34. 청구항 31 내지 청구항 33 중 어느 한 항에 있어서,
    스캐빈징 제제(scavenging agent)를 첨가하여 상기 친핵성 기의 H2O2-매개된 산화를 억제시켜서 상기 컨주게이션시키는 단계의 효율을 증가시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  35. 청구항 31 내지 청구항 34 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 염기성 조건이 7 초과 내지 10의 pH 범위에 있는 방법.
  36. 청구항 31 내지 청구항 28 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 친핵성 기가 티올, 아민, 디아조알칸 및 아지드로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  37. 미셀 및 약물 전달 비히클로서의 상기 미셀 내에 캡슐화된 제제를 포함하는 미셀 나노복합체의 용도로서, 상기 미셀이 폴리머-플라보노이드 컨주게이트를 포함하고, 상기 폴리머가 상기 플라보노이드의 B 고리에 결합되는 용도.
  38. 청구항 37에 있어서,
    미셀 나노복합체가 생체내에서 캡슐화된 제제를 표적 종양 부위로 전달하는 용도.
  39. 청구항 1 내지 청구항 24 중 어느 한 항의 미셀 나노복합체를 암 환자에게 투여하는 단계를 포함하여 종양을 치료하는 방법.
  40. 청구항 39에 있어서,
    상기 미셀 나노복합체가 비경구로, 흡입 스프레이(inhalation spray)에 의해서, 국소적으로, 직장에, 비내로(nasally), 구강으로, 질내로, 이식된 저장소를 통해서, 주사에 의해서, 피하로, 복강내로, 경피적으로, 경구로 또는 안과 제제로 투여되는 방법.
  41. 청구항 40에 있어서,
    비경구 투여가 피하, 피내(intracutaneously), 정맥내, 근육내, 관절내, 동맥내, 활막내(intrasynovially), 흉골내, 척추강내, 병소내(intralesionally), 및 두개내(intracranial) 주사 또는 주입 기술(infusion technique)을 포함하는 방법.
  42. 청구항 39 내지 청구항 41 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 미셀 나노복합체에 존재하는 제제가 일일 1 내지 80 mg/kg의 도즈(dose)로 투여되는 방법.
  43. 청구항 39 내지 청구항 42 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 암 환자가 부신피질 암종(adrenocortical carcinoma), AIDS-관련 림프종(AIDS-related lymphoma), 항문암(anal cancer), 맹장암(appendix cancer), 그레이드 I (역형성) 별아교세포종(grade I (anaplastic) astrocytoma), 그레이드 II 별아교세포종(grade II astrocytoma), 그레이드 III 별아교세포종(grade III astrocytoma), 그레이드 VI 별아교세포종(grade VI astrocytoma), 중추신경계의 비정형 기형/간상 종양(atypical teratoid/rhabdoid tumor), 기저 세포 암종(basal cell carcinoma), 방광암(bladder cancer), 기관지암(bronchial cancer), 세기관지폐포 암종(bronchioalveolar carcinoma), 버키트 림프종(Burkitt lymphoma), 자궁경부암(cervical cancer), 결장암(colon cancer), 결장직장암(colorectal cancer), 두개인두종(craniopharyngioma), 피부 T-세포 림프종(cutaneous T-cell lymphoma), 자궁내막 암(endometrial cancer), 자궁내막 자궁 암(endometrial uterine cancer), 뇌실막모세포종(ependymoblastoma), 뇌실막종(ependymoma), 식도암(esophageal cancer), 감각신경모세포종(esthesioneuroblastoma), 유잉 육종(Ewing's sarcoma), 두개외 배세포 종양(extracranial germ cell tumor), 고환외 배세포 종양(extragonadal germ cell tumor), 간외 담도암(extrahepatic bile duct cancer), 섬유 조직구종(fibrous histiocytoma), 담낭암(gallbladder cancer), 위암(gastric cancer), 위장 카르시노이드 종양(gastrointestinal carcinoid tumor), 위장 간질 종양(gastrointestinal stromal tumor), 임신융모 종양(gestational trophoblastic tumor), 임신융모 종양(gestational trophoblastic tumor), 신경아교종(glioma), 구경부암(head and neck cancer), 심장암(heart cancer), 간세포암(hepatocellular cancer), 힐라 쓸개관암종(Hilar cholangiocarcinoma), 호지킨 림프종(Hodgkin's lymphoma), 하인두암(hypopharyngeal cancer), 안구내 흑색종(intraocular melanoma), 섬세포 종양(islet cell tumor), 카포시 육종(Kaposi sarcoma), 랑게르한스 세포 조직구증(Langerhans cell histiocytosis), 후두암(laryngeal cancer), 구순암(lip cancer), 림프종(lymphoma), 고분자글로불린혈증(macroglobulinemia), 악성 섬유 조직구종(malignant fibrous histiocytoma), 속질모세포종(medulloblastoma), 속질상피종(medulloepithelioma), 흑색종(melanoma), 메르켈 세포 암종(Merkel cell carcinoma), 중피종(mesothelioma), 내분비샘 종양(endocrine neoplasia), 다발 골수종(multiple myeloma), 균상 식육종(mycosis fungoides), 척수형성이상(myelodysplasia), 골수형성이상/골수증식성 신생물(myelodysplastic/myeloproliferative neoplasms), 골수증식성 질환(myeloproliferative disorders), 비강 암(nasal cavity cancer), 코인두암(nasopharyngeal cancer), 신경모세포종(neuroblastoma,) 비-호지킨 림프종(non-Hodgkin's lymphoma), 구강암(oral cancer), 입인두암(oropharyngeal cancer), 뼈육종(osteosarcoma), 난소 투명세포 암종(ovarian clear cell carcinoma), 난소 상피암(ovarian epithelial cancer), 난소 배세포 종양(ovarian germ cell tumor), 유두종증(papillomatosis), 부비동암(paranasal sinus cancer), 부갑상샘암(parathyroid cancer), 음경암(penile cancer), 인두암(pharyngeal cancer), 송과체 실질세포 종양(pineal parenchymal tumor), 송과체모세포종(pineoblastoma), 뇌하수체 종양(pituitary tumor), 혈장 세포 신생물(plasma cell neoplasm), 혈장 세포 신생물(plasma cell neoplasm), 흉막폐장 모세포종(pleuropulmonary blastoma), 원발성 중추신경계 림프종(primary central nervous system lymphoma), 전립선암(prostate cancer), 직장 암(rectal cancer), 신장 세포 암(renal cell cancer), 염색체 15번 변화를 지니는 기도암(respiratory tract cancer with chromosome 15 changes), 망막모세포종(retinoblastoma), 횡문근육종(rhabdomyosarcoma), 침샘암(salivary gland cancer), 세자리 증후군(Sezary syndrome), 소장암(small intestine cancer), 연조직 육종(soft tissue sarcoma), 편평 세포 암종(squamous cell carcinoma), 편평상피 경부암(squamous neck cancer), 천막위 원시 신경외배엽 종양(supratentorial primitive neuroectodermal tumor), 천막위 원시 신경외배엽 종양(supratentorial primitive neuroectodermal tumor), 고환암(testicular cancer), 인후암(throat cancer), 가슴샘 육종(thymic carcinoma), 가슴샘종(thymoma), 갑상샘암(thyroid cancer), 신우의 암(cancer of the renal pelvis), 요도암(urethral cancer), 자궁 육종(uterine sarcoma), 질암(vaginal cancer), 외음부암(vulvar cancer), 발덴스트롬 고분자글로불린혈증(Waldenstrom macroglobulinemia), 및 윌름즈 종양(Wilms tumor)으로 이루어진 군으로부터 선택된 암을 앓고 있는 방법.
  44. 종양을 치료하기 위한 청구항 1 내지 청구항 24 중 어느 한 항의 미셀 나노복합체.
  45. 종양의 치료를 위한 약물의 제조에서의 청구항 1 내지 청구항 24 중 어느 한 항의 미셀 나노복합체의 용도.
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