BR112016026260A2 - nanocomplexo micelar, conjugado polímero-flavonoide e métodos para respectivas formações - Google Patents

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Yongvongsoontorn Nunnarpas
Jackie Y Ying
Joo Eun Chung
Ki Hyun Bae
Min-Han Tan
Esther Lee
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Abstract

NANOCOMPLEXO MICELAR, CONJUGADO POLÍMERO FLAVONOIDE E MÉTODOS PARA RESPECTIVAS FORMAÇÕES. A presente invenção se refere a nanocomplexos micelares e um método para sua formação. O nanocomplexo micelar compreende uma micela e um agente encapsulado dentro da referida micela, em que a micela compreende um conjugado polímero flavonoide, em que o referido polímero é ligado ao anel B do referido flavonoide. O nanocomplexo micelar pode ter aplicações úteis como um sistema de entrega de medicamento. A presente invenção também se refere a um conjugado polímero flavonoide que compreende um polímero ligado ao anel B de um flavonoide e um método para sua formação.

Description

1 / 36 “NANOCOMPLEXO MICELAR, CONJUGADO POLÍMERO‐FLAVONOIDE E MÉTODOS PARA RESPECTIVAS FORMAÇÕES”. CAMPO TÉCNICO
[001] A presente invenção geralmente se refere a nanocomplexos micelares para entrega de medicamento e método para sua formação. A presente invenção também se refere a um conjugado polímero‐flavonoide que compreende um polímero ligado ao anel B de um flavonoide e um método para sua formação. HISTÓRICO DA ARTE
[002] A quimioterapia, que é um dos tratamentos mais comuns para o câncer, usa medicamentos citotóxicos administrados por via peroral e parenteral. O principal desafio com a administração de medicamentos anticâncer convencionais é sua distribuição específica no corpo, levando a toxicidade com efeitos colaterais graves. Além disso, o efeito terapêutico de medicamentos orais é limitado por sua baixa biodisponibilidade porque os medicamentos devem passar pelos dutos digestivos. Nas últimas décadas, os pesquisadores focaram nos sistemas de entrega de medicamento para superar as limitações da administração de medicamentos convencionais aprimorando a farmacocinética e a biodistribuição de medicamentos.
[003] Nos últimos anos, catequinas de chá verde foram extensamente estudadas devido a seus benefícios de saúde, incluindo a prevenção de doenças e cânceres cardiovasculares. Entre as catequinas de chá, a epigalalocatequina‐3‐galato (EGCG) é a mais abundante e foi considerada como se tivesse uma função principal nos efeitos benéficos de chá verde. Diversos estudos demonstraram que EGCG possui efeitos antioxidantes, antidiabéticos, antibacterianos, anti‐inflamatórios e hipocolesterolêmicos. Além disso, demonstrou inibir efetivamente o crescimento de tumor e a metástase ao alvejar múltiplas vias de transdução de sinal essenciais para a sobrevivência das células de câncer.
[004] Apesar dessas atividades desejáveis, as aplicações clinicas de EGCG foram limitadas por sua estabilidade insatisfatória e baixa biodisponibilidade oral. Por exemplo, EGCG é instável e facilmente decomposto em um ambiente fisiológico. Foi relatado que EGCG teve uma meia‐vida curta de menos de 30 minutos em 0,05 M de
2 / 36 solução salina tamponada com fosfato (PBS) (pH 7,4) a 37 °C. Além disso, a maior parte do EGCG ingerido passa por hidrólise extensa no fluido gástrico e degradação metabólica no trato gastrintestinal. Como resultado, as concentrações plasmáticas de EGCG exigidas para se alcançar um efeito terapêutico desejado não podem ser alcançadas após a administração oral.
[005] Portanto, há uma necessidade de fornecer um sistema de entrega de medicamento que supera ou, pelo menos, aprimora, uma ou mais das desvantagens descritas acima. Há também a necessidade de fornecer um método de formação desse sistema de entrega de medicamento. RESUMO DA INVENÇÃO
[006] De acordo com um primeiro aspecto, é previsto um nanocomplexo micelar que compreende uma micela e um agente encapsulado dentro da referida micela, em que a referida micela compreende um conjugado polímero‐flavonoide, em que o referido polímero é ligado ao anel B do referido flavonoide.
[007] De forma vantajosa, os nanocomplexos micelares podem ser usados como sistemas de entrega de medicamento. Nanocomplexos micelares são pequenos em tamanho e têm alta capacidade de carregamento de medicamento favorável para entrega de medicamentos destinados a tumor. Ainda de forma vantajosa, a liberação sustentada do agente pode ser obtida usando‐se nanocomplexos micelares em condições fisiológicas. De forma ainda mais vantajosa, os nanocomplexos podem ser veículos de entrega promissores para uma variedade de agentes anticâncer insolúveis em água. Ainda de forma mais vantajosa, o nanocomplexo micelar pode suprimir o crescimento do tumor de forma significativa, com redução da toxicidade associada com a administração do agente. De forma ainda mais vantajosa, os nanocomplexos micelares podem representar um sistema de entrega de medicamento único e eficaz com efeitos terapêuticos sinérgicos a partir do sistema de entrega do medicamento ou do veículo de micela e o agente.
[008] O agente pode ser doxorrubicina. De forma vantajosa, nanocomplexos micelares que encapsulam doxorrubucina podem apresentar liberação sustentada do medicamento. A liberação sustentada do medicamento pode se dar devido à forte
3 / 36 interação entre EGCG e doxorrubicina dentro dos nanocomplexos micelares. Ainda de forma vantajosa, em algumas configurações, apenas uma liberação de rajada marginal foi observada na etapa inicial, sugerindo que as moléculas de doxorrubicina foram encapsuladas estavelmente nos nanocomplexos micelares. Esse baixo vazamento do medicamento pode ser essencial para garantir a máxima eficácia terapêutica com o mínimo de efeitos colaterais, visto que as moléculas do medicamento encapsuladas nos nanocomplexos não podem vazar prematuramente durante a circulação no fluxo sanguíneo. De forma ainda mais vantajosa, os nanocomplexos micelares podem ser aplicados para administração sistêmica de doxorrubicina para o tratamento de câncer.
[009] O agente pode ser Sunitinib (SU) e o flavonoide pode ser epigalalocatequina‐3‐ galato (EGCG). De forma vantajosa, os nanocomplexos micelares podem apresentar uma liberação sustentada de SU. Ainda de forma vantajosa, em algumas configurações, dificilmente qualquer liberação de rajada foi observada, sugerindo que as moléculas de SU foram encapsuladas estavelmente nos nanocomplexos micelares.
[010] Em uma configuração, o flavonoide pode ser um flavonoide monomérico. Em uma outra configuração, o flavonoide pode ser um flavonoide dimérico. De forma vantajosa, o nanocomplexo micelar que compreende o flavonoide monomérico pode apresentar uma liberação de SU maior e mais rápida em comparação com os nanocomplexos micelares que compreendem o flavonoide dimérico. De forma vantajosa, pode haver uma interação mais forte entre SU e o flavonoide dimérico.
[011] De forma vantajosa, os nanocomplexos micelares podem minimizar os efeitos colaterais adversos de agentes como SU encapsulando estavelmente o agente em seu interior, e os entregando ao local alvo. O nanocomplexo micelar pode, portanto, oferecer efeitos sinérgicos benéficos entre SU e EGCG.
[012] Ainda de forma vantajosa, o nanocomplexo micelar que compreende SU pode ter efeitos aprimorados sobre o tumor in vivo em comparação com SU livre. De forma mais vantajosa, o nanocomplexo micelar que compreende SU pode ter menos efeitos adversos sobre o tumor in vivo em comparação com SU livre. Ainda de forma vantajosa, menos dosagem do nanocomplexo micelar que compreende SU pode ser exigida em comparação com SU livre para se obter os mesmos efeitos. De forma ainda
4 / 36 mais vantajosa, o efeito inibidor do nanocomplexo micelar que compreende SU pode ser mantido por um período substancial mesmo quando a terapia é interrompida.
[013] Ainda de forma vantajosa, o nanocomplexo micelar que compreende SU pode levar a uma redução das concentrações de plasma de SU livre, resultando em menos efeitos adversos de SU. Ainda de forma vantajosa, essa redução na concentração plasmática pode se dever à interação entre o flavonoide e o SU, bem como o efeito de aprimoramento da permeabilidade e retenção (EPR) oferecido pelas nanopartículas micelares.
[014] De acordo com um segundo aspecto, é previsto um método de formação de um nanocomplexo micelar que compreende uma micela e um agente encapsulado dentro da referida micela, sendo que o método compreende as etapas de: (a) adicionar o referido agente em um solvente adequado a um conjugado polímero‐flavonoide, em que o referido polímero seja ligado ao anel B do referido flavonoide; e (b) permitir a automontagem de uma micela que compreenda o referido conjugado polímero‐ flavonoide e o encapsulamento do referido agente dentro da referida micela para, assim, formar o referido nanocomplexo micelar.
[015] De forma vantajosa, o nanocomplexo é automontado na presença do conjugado polímero‐flavonoide e o agente. Ainda de forma vantajosa, a formação do nanocomplexo foi obtida utilizando‐se a propriedade de ligação do flavonoide com os agentes.
[016] De acordo com um terceiro aspecto, é previsto um conjugado polímero‐ flavonoide que compreende um polímero ligado ao anel B de um flavonoide.
[017] De forma vantajosa, um flavonoide é conjugado a um polímero. Em uma configuração, o polímero pode ser polietileno glicol (PEG). De forma vantajosa, as nanopartículas baseadas em polímero evitam tanto a eliminação renal como ficar presas pelo sistema reticuloendotelial (RES), permitindo o acúmulo subsequente dentro dos tecidos tumorais devido ao efeito EPR. De forma mais vantajosa, as micelas estabilizadas por PEG apresentam uma meia‐vida plasmática prolongada maior do que micelas não modificadas, visto que as cadeias superficiais de PEG impedem o reconhecimento e a eliminação pelo RES no corpo. Ainda de forma vantajosa, PEG
5 / 36 pode ser usado para modificar a superfície das nanopartículas e micelas poliméricas para produzir superfícies antivegetativas.
[018] De acordo com um quarto aspecto, é previsto um método para formar o conjugado polímero‐flavonoide conforme definido acima, que compreende a etapa de conjugação do referido flavonoide com o referido polímero por meio de adição nucleofílica sob condições básicas, em que o referido polímero tem um grupo nucleofílico livre.
[019] De forma vantajosa, os conjugados polímero‐flavonoide podem ser sintetizados por adição nucleofílica em pH básico. De forma vantajosa, a conjugação pode ser realizada por adição nucleofílica de um grupo nucleofílico como um grupo tiol do polímero como um PEG na posição C2’ do anel B do flavonoide sob condições de pH controlado.
[020] Em uma configuração, o polímero é polietileno glicol (PEG) e o grupo nucleofílico livre é tiol. De forma vantajosa, a ortoquitona deficiente de elétron do flavonoide como EGCG pode reagir com um grupo nucleofílico como grupos de tiol. Grupos de tiol estão presentes em uma faixa diversa de biomoléculas, incluindo cisteína, glutationa e proteínas. EGCG pode ligar‐se covalentemente a resíduos de cisteína em proteínas de membrana eritrócita humama e gliceraldeído‐3‐fosfato desidrogenase (GAPDH). Além disso, os aductos covalentes de EGCG podem se formar quando oxidados na presença de cisteína e glutationa. Ainda de forma vantajosa, os conjugados de cisteína resultantes de EGCG podem apresentar atividades pró‐ oxidantes mais altas do que EGCG, enquanto retém suas atividades inibidoras do crescimento e anti‐inflamatórias. De forma mais vantajosa, o conjugado de N‐ acetilcisteína de EGCG pode aprimorar os efeitos inibidores de crescimento e indutores de apoptose do EGCG contra células de câncer de pulmão humanas e murinas.
[021] De acordo com um quinto aspecto, é previsto o uso de um nanocomplexo micelar que compreende uma micela e um agente encapsulado dentro da referida micela como um veículo de entrega de medicamento, em que a referida micela compreende um conjugado polímero‐flavonoide, e em que o referido polímero é ligado ao anel B do referido flavonoide.
6 / 36
[022] De acordo com um sexto aspecto, é previsto um método para tratar um tumor que compreende a etapa de administrar o nanocomplexo micelar conforme definido acima a um agente de câncer.
[023] De forma vantajosa, o nanocomplexo micelar pode ter um efeito anticâncer maior em comparação com um agente livre. De forma mais vantajosa, os nanocomplexos micelares podem minimizar os efeitos colaterais adversos de agentes como Suhitinib (SU) encapsulando estavelmente o agente em seu interior, e os entregando ao local alvo. Esses sistemas de entrega também preveem efeitos sinérgicos benéficos.
[024] De acordo com um sétimo aspecto, é previsto o nanocomplexo micelar conforme definido acima para tratar um tumor.
[025] De acordo com um oitavo aspecto, é previsto o uso do nanocomplexo micelar conforme definido acima na fabricação de um medicamento para o tratamento de um tumor. DEFINIÇÕES
[026] As seguintes palavras e termos usados no presente instrumento terão o significado indicado:
[027] O “anel B” de um flavonoide se refere a um fenil opcionalmente substituído que é ligado a uma estrutura bicíclica (a estrutura bicíclica composta de um anel de benzeno (A) condensado com um anel de seis membros (C)). O fenil opcionalmente substituído é ligado à posição 2 do anel C. Para fins da presente divulgação, os anéis são rotulados como segue: [Quím. 1]
[028] O termo “galato epigalocatequina” se refere a um éster de epigalocatequina e ácido gálico e pode ser usado de forma intercambiável com “epigalocatequina‐3‐ galato” ou EGCG.
[029] Para fins da presente aplicação, o termo “conjugados PEG‐EGCG” se refere
7 / 36 tanto a conjugados PEG‐ mEGCG (EGCG monomérico) como a conjugados PEG‐dEGCG (EGCG dimérico), a menos que especificado.
[030] O termo “substancialmente” não exclui “completamente”, por exemplo, uma composição que seja “substancialmente livre” de Y pode ser completamente livre de Y. Quando necessário, o termo “substancialmente” pode ser omitido da definição da invenção.
[031] A menos que especificado de outra forma, os termos “compreendendo” e “compreende” e suas variantes gramaticais se destinam a representar uma linguagem "aberta" ou "inclusiva" de forma a incluir elementos recitados, mas também permitem a inclusão de elementos adicionais, não recitados.
[032] Conforme usado no presente instrumento, o termo “sobre”, no contexto das concentrações de componentes das formulações, tipicamente significa +/‐ 5% do valor declarado, mais tipicamente +/‐ 4% do valor declarado, mais tipicamente +/‐ 3% do valor declarado, mais tipicamente, +/‐ 2% do valor declarado, ainda mais tipicamente +/‐ 1% do valor declarado, e ainda mais tipicamente +/‐ 0,5% do valor declarado.
[033] Ao longo da presente divulgação, determinadas configurações podem ser divulgadas em formato de faixa. Deve ser compreendido que a descrição no formato de faixa é meramente para fins de conveniência e brevidade e não deve ser interpretada como uma limitação inflexível no escopo das faixas divulgadas. De acordo, a descrição de uma faixa deve ser considerada como tendo especificamente divulgado todas as sub‐faixas possíveis, bem como valores numéricos individuais dentro dessa faixa. Por exemplo, a descrição de uma faixa como de 1 a 6 deve ser considerada como tendo especificamente divulgado sub‐faixas como de 1 a 3, de 1 a 4, de 1 a 5, de 2 a 4, de 2 a 6, de 3 a 6, etc., bem como números individuais dentro dessa faixa, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, e 6. Isso se aplica independentemente da amplitude da faixa.
[034] Determinadas configurações também podem ser descritas de forma abrangente e genérica no presente instrumento. Cada um dos agrupamentos subgenéricos e das espécies mais estreitas se encaixando dentro da divulgação genérica também fazem parte da divulgação. Isso inclui a descrição genérica das
8 / 36 configurações com uma previsão ou limitação negativa que remova qualquer assunto do gênero, independente de o material excisado ser ou não especificamente citado no presente instrumento. BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[035] Os desenhos inclusos ilustram uma configuração divulgada e servem para explicar os princípios da configuração divulgada. Deve‐se compreender, no entanto, que os desenhos são destinados apenas a fins ilustrativos, e não como uma definição dos limites da invenção: a figura 1 é um esquema sintético conjugado PEG‐mEGCG (108). O PEG (PEG‐SH) funcionalizado com tiol (102) foi conjugado a EGCG (104) em uma mistura a 1:3 (v/v) de DMSO e água em pH básico pH (106); a figura 2 é um espectro UV‐Vis do conjugado PEG‐EGCG (202) e PEG (204) dissolvido em água de‐ionizada em uma concentração de 0,5 mg mL‐1; a figura 3 se refere aos cromatogramas de HPLC de EGCG (302) e conjugado PEG‐ mEGCG (304). As setas indicam os picos de amostras monitorados a 280 nm; a figura 4 é o grau de conjugação de conjugados PEG‐mEGCG como uma função do tempo de reação; a figura 5 é um espectro H NMR do conjugado PEG‐mEGCG dissolvido em D20. a figura 6 é um esquema que apresenta a formação dos nanocomplexos micelares de doxorrubicina/PEG‐mEGCG; a figura 7 se refere aos gráficos que apresentam (A) Tamanho e (B) o potencial zeta dos nanocomplexos micelares doxorrubicina/PEG‐mEGCG preparados em diferentes proporções de PEG‐mEGCG:doxorrubicina por peso. O tamanho e o potencial zeta de nanocomplexos conforme preparados (barras pretas, 702) foram comparados àqueles dos nanocomplexos reconstituídos (barras cruzadas, 704); a figura 8 se refere aos gráficos que apresentam a (A) eficiência de carregamento do medicamento e o (B) teor de carregamento dos nanocomplexos micelares doxorrubicina/PEG‐mEGCG preparados com diferentes proporções de PEG‐ mEGCG:doxorrubicina por peso;
9 / 36 a figura 9 apresenta o perfil de liberação de medicamento in vitro dos nanocomplexos micelares doxorrubicina/PEG‐mEGCG em PBS (pH 7,3) a 37°C.
Proporção de peso PEG‐mEGCG:doxorrubicina =1:1; a figura 10 exibe uma ilustração esquemática da formação de nanocomplexos micelares de SU/PEG‐EGCG; a figura 11 se refere aos gráficos que apresentam (A) tamanho, (B) PDI e (C) o potencial zeta dos nanocomplexos micelares de SU/PEG‐EGCG em diferentes proporções de peso de PEG‐EGCG:SU; a figura 12 se refere aos gráficos que apresentam a (A) eficiência de carregamento do medicamento e o (B) teor de carregamento dos nanocomplexos micelares de SU/PEG‐EGCG preparados com diferentes proporções de PEG‐EGCG:SU por peso; a figura 13 se refere aos gráficos que apresentam o perfil de liberação de medicamento in vitro de (A) nanocomplexos micelares de SU/PEG‐mEGCG e (B) nanocomplexos micelares de SU/PEG‐dEGCG em diferentes proporções de peso de PEG‐ EGCG:SU em PBS (pH 7,3) a 37°C; a figura 14 é um gráfico que apresenta medições semanais de peso corporal em camundongos que recebem tratamento oral diário com SU (60 mg/kg) em comparação com aqueles que recebem nanocomplexos micelares de SU/PEG‐ EGCG (com as proporções de peso de PEG‐EGCG:SU especificadas) e o grupo de controle; a figura 15 se refere a imagens que mostram (A) o tamanho do tumor (conforme quantificado pelo sinal luminescente) e (B) a imagem luminescente de camundongos com o tratamento com o nanocomplexo micelar de SU/PEG‐EGCG (com a proporção de peso de PEG‐EGCG:SU especificada), tratamento com SU oral ou sem tratamento; a figura 16 é um gráfico que apresenta medições de peso corporal em camundongos que recebem tratamento oral diário com SU (40 e 15 mg/kg) em comparação com aqueles que recebem nanocomplexo micelar de SU/PEG‐ mEGCG 8:1 e o grupo de controle;
10 / 36 a figura 17 é um gráfico que exibe o tamanho do tumor de camundongos com tratamento oral com nanocomplexo micelar de SU/PEG‐mEGCG 8:1, tratamento oral com SU ou nenhum tratamento. DIVULGAÇÃO DETALHADA DAS CONFIGURAÇÕES
[036] Configurações exemplares, não limitantes, de um nanocomplexo micelar serão doravante divulgadas.
[037] Um nanocomplexo micelar pode compreender uma micela e um agente encapsulado dentro da referida micela, em que a referida micela compreende um conjugado polímero‐flavonoide, em que o referido polímero é ligado ao anel B do referido flavonoide.
[038] Pelo menos um flavonoide pode ser ligado ao referido polímero. Pelo menos dois flavonoides podem ser ligados ao referido polímero.
[039] O polímero pode ser ligado ao referido flavonoide por meio de um ligante. O ligante pode ser qualquer grupo químico que pode ligar o polímero e o flavonoide. O ligante pode ser selecionado do grupo que consiste de um grupo de tioéter, imina, amina, azo e 1,2,3‐triazol. O ligante pode ser um grupo de alcano. O ligante pode estar presente entre qualquer parte do polímero e qualquer parte do flavonoide. O ligante pode estar presente entre um término do polímero e qualquer parte do flavonoide.
[040] O flavonoide pode ser selecionado a partir do grupo que consiste de um flavonoide monomérico ou um flavonoide dimérico. Um flavonoide monomérico pode compreender uma molécula flavonoide. Um flavonoide dimérico pode compreender duas moléculas de flavonoide ligadas por um ligante. Uma das moléculas de flavonoide do flavonoide dimérico podem ser ligadas pelo polímero. Ambas as moléculas de flavonoide do flavonoide dimérico podem ser ligadas independentemente pelo polímero. Quando um flavonoide está presente no referido conjugado, o flavonoide é ligado ao referido polímero por meio do anel B. Quando um flavonoide está presente no referido conjugado, o flavonoide é ligado ao referido polímero por meio do anel D.
[041] Quando mais de um flavonoide está presente no referido conjugado, pelo menos um flavonoide é ligado ao referido polímero por meio do anel B. O outro do referido pelo menos um flavonoide é ligado ao referido polímero por meio do anel A.
11 / 36 Quando mais de um flavonoide está presente no referido conjugado, pelo menos um flavonoide é ligado ao referido polímero por meio do anel B. O outro do referido pelo menos um flavonoide é ligado ao referido polímero por meio do anel B. Quando mais de um flavonoide está presente no referido conjugado, pelo menos um flavonoide é ligado ao referido polímero por meio do anel B. O outro do referido pelo menos um flavonoide é ligado ao referido polímero por meio do anel D.
[042] Quando mais de um flavonoide está presente no referido conjugado, pelo menos um flavonoide é ligado ao referido polímero por meio do anel D. O outro do referido pelo menos um flavonoide é ligado ao referido polímero por meio do anel A. Quando mais de um flavonoide está presente no referido conjugado, pelo menos um flavonoide é ligado ao referido polímero por meio do anel D. O outro do referido pelo menos um flavonoide é ligado ao referido polímero por meio do anel B. Quando mais de um flavonoide está presente no referido conjugado, pelo menos um flavonoide é ligado ao referido polímero por meio do anel D. O outro do referido pelo menos um flavonoide é ligado ao referido polímero por meio do anel D.
[043] O polímero pode ser um polímero hidrofílico. O polímero hidrofílico pode compreender monômeros selecionados a partir do grupo que consiste de acrilamidas, alquis, oxazolinas, alquenis, iminas, ácidos acrílicos, metacrilatos, diois, oxiranos, álcoois, aminas, anidridos, ésteres, lactonas, carbonatos, ácidos carboxílicos, acrilatos, hidroxis, fosfatos, tereftalato, amidas e éteres.
[044] O polímero hidrofílico pode ser selecionado a partir do grupo que consiste de poliacrilamida, poli(N‐isopropilacrilamida), poli(oxazolina), polietilenimina, poli(ácido acrílico), polimetacrilato, poli(etileno glicol), poli(óxido de etileno), poli(álcool vinílico), poli(vinilpirrolidinona), poliéteres, poli(alilamina), polianidridos, poli(β‐amino éster), poli(butileno succinato), policaprolactona, policarbonato, polidioxanona, poli(glicerol), ácido poliglicólico, poli(3‐ácido hidroxipropiônico), poli(2‐hidroxietil metacrilato), poli(N‐(2‐ hidroxipropil)metacrilamida), ácido poliláctico, poli(ácido lático‐co‐glicólico), poli(orto ésteres), poli(2‐oxazolina), poli(ácido sebácico), poli(tereftalato‐co‐fosfato) e seus copolímeros.
[045] O polímero hidrofílico pode ser um polissacarídeo. O polímero pode ser um
12 / 36 polissacarídeo selecionado a partir do grupo que consiste de ácido hialurônico, dextrano, pululano, quitosana, celulose, amilose, amido, gelatina, carrageeenano, ciclodextrina, sulfato de dextrano, Fucoll, gelana, goma guar, pectina, polissacarose, pululano, escleroglucano, xantana, xiloglucano e alginato.
[046] O polímero hidrofílico pode ser polietileno glicol (PEG). PEG é um polímero sintético que foi usado em aplicações biomédicas devido a sua natureza hidrofílica, flexível e biocompatível. Especificamente, PEG foi utilizado para modificar a superfície de nanopartículas e micelas poliméricas para produzir superfícies antivegetativas.
[047] De forma vantajosa, o polietileno glicol (PEG) foi selecionado como o polímero a ser conjugado ao flavonoide. A conjugação foi realizada por adição nucleofílica de um grupo tiol de PEG na posição C2’ do anel B do flavonoide sob condições de pH controlado.
[048] O flavonoide pode ser selecionado a partir do grupo que consiste de flavonas, isoflavonas, flavano, proantocianidinas e antocianidinas.
[049] As flavonas podem ser selecionadas a partir do grupo que consiste de apigenina, luteolina, tangeritina, crisina, 6‐hidroxiflavona, baicaleína, escutelareína, wogonin, diosmina, flavoxato e 7,8‐diidroxiflavona.
[050] As isoflavonas podem ser selecionadas a partir do grupo que consiste de genisteína, daidzeina, gliciteina, genistina, daidzina, glicitina, acetil‐genistina, acetil‐ daidzina, acetil‐glicitina, malonil genistina, malonil‐daidzina e malonil‐glicitina.
[051] As flavanas podem ser selecionadas a partir do grupo que consiste de (‐)‐ epicatequina, (+)‐epicatequina, (‐)‐ catequina, (+)‐catequina, epicatequina galato, epigalocatequina, epigalocatequina galato, Fisetinidol, Galocatequina, Galocatequina galato, Mesquitol e Robinetinidol, elagitanina, galotanina, olongteanina, florotanina, tanina, teacitrina, teadibenzotropolona, teaflavina, teanadtoquinona, tearubiginas, teasinensinae e suas misturas.
[052] As antocianidinas podem ser selecionadas do grupo que consiste de aurantinidina, capensinidina, cianidina, delfinidina, europinidina, hirsutinidina, malvidina, pelargondina, peonidina, petunidina, pulquelidina e rosinidina.
[053] O agente pode ser um agente terapêutico. O agente terapêutico pode ser um
13 / 36 agente quimioterapêutico selecionado do grupo que consiste de agentes alquilantes, antraciclinas, ruptores ditoesqueletais, epotilonas, inibidores de histona deacetilase, inibidores de topoisomerase I, inibidores de topoisomerase II, inibidores de quinase, anticorpos monoclonais, conjugados anticorpo‐medicamento, análogos de nucleotida, análogos precursores, antibióticos de peptídeo, antibióticos de peptídeo, agentes baseados em platina, retinoides, alcaloides de vinca, citoquinas, antimetabólitos e derivados de alcaloides de vinca e outros citotóxicos.
[054] O agente quimioterapêutico pode ser selecionado do grupo que consiste de Actinomicina, Afatinib, ácido retinoico totalmente trans, Axitinib, Azacitidina, Azatioprina, Bevacizumab, Bleomicina, Bosutinib, Bortezomib, Carboplatina, Capecitabina, Cetuximab, Cisplatina, Clorambucil, Crizotinib, Ciclophosfamida, Citarabina, Dasatinib, Daunorrubicina, Docetaxel, Doxifluridina, Doxorrabicina, Epirrubicina, Epotilona A (C26H39NO6S), Epotilona B (C27H41NO6S), Epotilona C (C26H39NO5S), Epotilona D (C27H41NO5S), Epotilona E (C26H39NO7S), Epotilona F (C27H41NO7S), Erlotinib, Etoposida, Fluorouracil, Fostamatinib, Gefitinib, Gemcitabina, Hidroxiureia, Idarabicin, Imatinib, Irinotecan, Lapatinib, Lenvatinib, Mecloretamina, Mercaptopurina, Metotrexato, Mitoxantrona, Nilotinib, Oxaliplatina, Paclitaxel, Panitumumab, Pazopanib, Pegaptanib, Pemetrexed, Ranibizumab, Regorafenib, Ruxolitinib, Sorafenib, Sunitinib, Trastuzumab, Teniposida, Tioguanina, Tofacitinib, Topotecan, Valrrubicin, Vemurafenib, Vinblastina, Vincristina, Vindesina, Vinorrelbina.
[055] O agente quimioterapêutico pode ser doxorrabicina.
[056] O agente quimioterapêutico pode ser Sunitinib (SU). SU é um inibidor de tirosina quinase com alvos múltiplos e uma terapia de primeira linha para eliminar o carcinoma celular de células renais (ccRCC). Especificamente, SU tem como alvo os receptores de fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) e de fator de crescimento derivado de plaqueta (PDGF), que têm uma função na angiogênese e proliferação do tumor, levando a redução da vascularização do tumor, bem como morte das células cancerígenas. Foi aprovado para uso em RCC avançado, tomores estromais gastrintestinais (GIST) e tumores neuroendócrinos pancreáticos (pNET). Também demostrou ter potencial para curar câncer de mama metastásico, câncer de
14 / 36 pulmão de células não pequenas, carcinoma hepatocelular avançado, tumores neuroendócrinos e leucemia. No entanto, pode causar efeitos colaterais graves, como toxicidades hepáticas, cardíacas e gastrintestinais, hipertensão, problemas cutâneos e síndrome mão‐pé.
[057] O nanocomplexo micelar pode ter um tamanho na faixa de 30 a 300 nm, de 50 a 300 nm, de 100 a 300 nm, de 30 a 50 nm, de 30 a 100 nm, de 30 a 150 nm, de 150 a 300 nm, de 200 a 300 nm, de 250 a 300 nm, de 100 a 150 nm, de 100 a 200 nm, de 100 a 250 nm, de 130 a 180 nm, ou de 130 a 250 nm.
[058] O nanocomplexo micelar pode ter uma eficiência de carregamento do referido agente presente dentro da referida micela maior do que 30%, maior do que 35%, maior do que 40%, maior do que 45%, d maior do que 50%, maior do que 55%, maior do que 60%, maior do que 65%, maior do que 70%, maior do que 75%, ou 80%.
[059] O nanocomplexo micelar pode ter um teor de carregamento do referido agente presente dentro da referida micela na faixa de 1 a 10 p/p%, de 5 a 25 p/p%, de 20 a 45 p/p%, de 30 a 50 p/p%, de 35 a 50 p/p%, de 40 a 50 p/p%, de 45 a 50 p/p%, de 30 a 35 p/p%, de 30 a 40 p/p% ou de 30 a 45 p/p%.
[060] Um método de formação de um nanocomplexo micelar pode compreender uma micela e um agente encapsulado dentro da referida micela, sendo que o método compreende as etapas de: a. adicionar o referido agente em um solvente adequado a um conjugado polímero‐flavonoide, em que o referido polímero seja ligado ao anel B do referido flavonoide; e b. permitir a auto‐montagem de uma micela que compreende o referido conjugado polímero‐flavonoide e o encapsulamento do referido agente dentro da referida micela para assim formar o referido nanocomplexo micelar.
[061] A etapa (a) pode compreender ainda as etapas de: a. remover o referido solvente para formar um filme seco do referido agente e do referido conjugado polímero‐flavonoide; e b. hidratar o referido filme seco com um solvente aquoso.
[062] O método pode compreender ainda a etapa de isolar o nanocomplexo micelar
15 / 36 formado pela filtração ou diálise em um solvente adequado.
[063] Um conjugado polímero‐flavonoide pode compreender um polímero ligado ao anel B de um flavonoide.
[064] O polímero do conjugado polímero‐flavonoide pode ser selecionado a partir do grupo que consiste de um polissacarídeo, poliacrilamida, poli(N‐isopropilacrilamida), poli(oxazolina), polietilenimina, poli(ácido acrílico), polimetacrilato, poli(etileno glicol), poli(óxido de etileno), poli(álcool vinílico), poli(vinilpirrolidinona), poliéteres, poli(alilamina), polianidridos, poli(β‐amino éster), poli(butileno succinato), policaprolactona, policarbonato, polidioxanona, poli(glicerol), ácido poliglicólico, poli(3‐ácido hidroxipropiônico), poli(2‐hidroxietil metacrilato), poli(N‐(2‐ hidroxipropil)metacrilamida), ácido poliláctico, poli(ácido lático‐co‐glicólico), poli(orto ésteres), poli(2‐oxazolina), poli(ácido sebácico), poli(tereftalato‐co‐fosfato) e seus copolímeros.
[065] O flavonoide do conjugado polímero‐flavonoide pode ser selecionado a partir do grupo que consiste de (‐)‐epicatequina, (+)‐epicatequina, (‐)‐catequina, (+)‐ catequina, epicatequina galato, epigalocatequina, epigalocatequina galato, Fisetinidol, Galocatequina, Galocatequina galato, Mesquitol e Robinetinidol, elagitanina, galotanina, olongteanina, florotanina, tanina, teacitrina, teadibenzotropolona, teaflavina, teanadtoquinona, tearubiginas, teasinensinae e suas misturas.
[066] O polímero pode ser conjugado a um flavonoide no conjugado polímero‐ flavonoide por meio de um ligante selecionado do grupo que consiste de um grupo de tioéter, imina, amina, azo e 1,2,3‐triazol. O ligante pode ser um grupo de alcano. O ligante pode estar presente entre qualquer parte do polímero e qualquer parte do flavonoide. O ligante pode estar presente entre um término do polímero e qualquer parte do flavonoide.
[067] O polímero do conjugado polímero‐flavonoide pode ser poli(etileno‐glicol), podendo o referido flavonoide do conjugado polímero‐flavonoide ser epigalocatequina‐3‐galato e podendo o referido ligante do conjugado polímero‐ flavonoide ser tioéter.
[068] O polímero‐flavonoide pode ter a fórmula a seguir [Quím. 2]
16 / 36
[069] Em que n está na faixa de 20 a 910.
[070] Um método para formar o conjugado polímero‐flavonoide pode compreender a etapa de conjugação do referido flavonoide com o referido polímero por meio de adição nucleofílica sob condições básicas, em que o referido polímero tem um grupo nucleofílico livre.
[071] O grupo nucleofílico pode ser selecionado do grupo que consiste de um sulfidrill amina, carbonil, ácido carboxílico, azida, halogênio, alcalino e alqueno. O grupo nucleofílico pode ser selecionado do grupo que consiste de um tiol, uma amina, um diazoalcano e uma azida.
[072] O grupo nucleofílico pode ser um tiol. EGCG pode passar por oxidação na presença de oxigênio par formar uma orf/zo‐quinona por uma via que envolva radicais de semiquinona e espécies de oxigênio reativas. A orf/zo‐quinona de EGCG deficiente em elétron pode reagir com um grupo de tiol nucleofílico presente em diversas biomoléculas, incluindo cisteína, glutationa e proteínas. EGCG pode ligar‐se covalentemente a resíduos de cisteína em proteínas de membrana eritrócita humama e gliceraldeído‐3‐fosfato desidrogenase (GAPDH). Aductos covalentes de EGCG podem se formar quando oxidados na presença de cisteína e glutationa. Os conjugados de cisteína resultantes de EGCG podem apresentar atividades pró‐oxidantes mais altas do que EGCG, enquanto retém suas atividades inibidoras do crescimento e anti‐ inflamatórias. Além disso, o conjugado de N‐acetilcisteína de EGCG pode aprimorar os efeitos inibidores de crescimento e indutores de apoptose do EGCG contra células de câncer de pulmão humanas e murinas.
[073] A etapa de conjugação pode ser realizada em um tempo de reação de aproximadamente 1 hora a 24 horas, de aproximadamente 1 hora a 2 horas, de
17 / 36 aproximadamente 1 hora a 4 horas, de aproximadamente 1 hora a 8 hours, de aproximadamente 1 hora a 12 horas, de aproximadamente 2 horas a 4 horas, de aproximadamente 2 horas a 8 horas, de aproximadamente 2 horas a 12 horas, de aproximadamente 2 horas a 24 horas, de aproximadamente 4 horas a 8 hours, de aproximadamente 4 horas a 12 horas, de aproximadamente 4 horas a 24 horas, de aproximadamente 8 horas a 12 horas, de aproximadamente 8 horas a 24 horas ou de aproximadamente 12 horas a 24 horas.
[074] O método pode compreender ainda a etapa de conduzir a etapa de conjugação em um solvente que impeça substancialmente a agregação do referido flavonoide.
[075] O método pode compreender ainda a etapa de adicionar um agente de limpeza para impedir a oxidação mediada por H2O2 do referido grupo nucleofílico para aumentar assim a eficiência da referida etapa de conjugação.
[076] As condições básicas podem estar na faixa de pH de mais de 7 a 10, mais de 8 a 10, mais de 9 a 10, mais de 7 a 11, mais de 8 a 11, mais de 9 a 11, mais de 10 a 11, mais de 7, mais de 8, mais de 9, mais de 10 ou mais de 11.
[077] O uso de um nanocomplexo micelar pode compreender uma micela e um agente encapsulado dentro da referida micela como um veículo de entrega de medicamento, em que a referida micela compreende um conjugado polímero‐ flavonoide, e em que o referido polímero é ligado ao anel B do referido flavonoide.
[078] O nanocomplexo micelar pode entregar o agente encapsulado a um local de tumor alvo in vivo.
[079] Um método de tratamento de câncer pode compreender a etapa de administrar o nanocomplexo micelar a um paciente com câncer. Um método de tratamento de tumor pode compreender a etapa de administrar o nanocomplexo micelar a um paciente com câncer.
[080] O nanocomplexo micelar pode ser administrado parenteralmente, por administração de borrifo de inalação, tópica, retal, nasal, bucal, vaginal, por meio de um reservatório implantado, por injeção, subdérmica, intraperitoneal, transmucosal, oral ou em uma preparação oftálmica.
[081] A administração parenteral pode compreender as vias subcutânea,
18 / 36 intracutânea, intravenosa, intramuscular, intra‐articular, intra‐arterial, intrassinovial, intraesternal, intratecal, intralesional e injeção intracraniana ou técnicas de infusão.
[082] O agente presente no referido nanocomplexo micelar pode ser administrado em uma dose de aproximadamente 1 a aproximadamente 80 mg/kg por dia, de aproximadamente 1 a aproximadamente 2 mg/kg por dia, de aproximadamente 1 a aproximadamente 5 mg/kg por dia, de aproximadamente 1 a aproximadamente 10 mg/kg por dia, de aproximadamente 1 a aproximadamente 20 mg/kg por dia, de aproximadamente 1 a aproximadamente 50 mg/kg por dia, de aproximadamente 2 a aproximadamente 5 mg/kg por dia, de aproximadamente 2 a aproximadamente 10 mg/kg por dia, de aproximadamente 2 a aproximadamente 20 mg/kg por dia, de aproximadamente 2 a aproximadamente 50 mg/kg por dia, de aproximadamente 2 a aproximadamente 80 mg/kg por dia, de aproximadamente 5 a aproximadamente 10 mg/kg por dia, de aproximadamente 5 a aproximadamente 20 mg/kg por dia, de aproximadamente 5 a aproximadamente 50 mg/kg por dia, de aproximadamente 5 a aproximadamente 80 mg/kg por dia, de aproximadamente 10 a aproximadamente 20 mg/kg por dia, de aproximadamente 10 a aproximadamente 50 mg/kg por dia, de aproximadamente 10 a aproximadamente 80 mg/kg por dia, de aproximadamente 20 a aproximadamente 50 mg/kg por dia, de aproximadamente 20 a aproximadamente 80 mg/kg por dia ou de aproximadamente 50 a aproximadamente 80 mg/kg por dia .
[083] O paciente com câncer pode estar sofrendo de um câncer selecionado do grupo que consiste de carcinoma adrenocortical, linfoma relacionado a AIDS, câncer anal, câncer de apêndice, astrocitoma de grau I (anaplásico), astricutina de grau II, astricutina de grau III, astricutina de grau IV, tumor teratoide/rabdoide atípico do sistema nervoso central, carcinoma celular basal, câncer de bexiga, câncer bronquial, carcinoma bronquioalveolar, linfoma de Burkitt, câncer cervical, câncer de cólon, câncer colorretal, craniofaringioma, linfoma de célula T cutâneo, câncer endometrial, câncer endometrial uterino, ependimoblastoma, ependimoma, câncer esofageal, estesioneuroblastoma, sarcoma de Ewing, tumor de célula de germe extracraniano, tumor celular de germe extragonadal, câncer de duto biliar extra‐hepático, histiocitoma fibroso, câncer da vesícula biliar, câncer gástrico, tumor carcinoide
19 / 36 gastrintestinal, tumor estromal gastrintestinal, tumor trofoblástico gestacional, tumor trofoblástico gestacional, glioma, câncer de cabeça e epscoço, câncer cardíaco, câncer hepatocelular, colangiocarcinoma de Hilar, linfoma de Hodgkin, câncer hipofaringeal, melanoma intraocular, tumor de célula de ilhota, sarcoma de Kaposi, histocitose de célula de Langerhans, câncer da laringe, câncer labial, linfoma, macroglobulinemia, histiocitoma fibroso maligno, meduloblastoma, meduloepitelioma, melanoma, carcinoma de células de Merkel, mesotelioma, neoplasia endócrina, mieloma múltiplo, micose fungoide, mielodisplasia, neoplasias mielodisplásicas/mieloproliferativas, distúrbios mieloproliferativos, câncer da cavidade nasal, câncer nasofaringeal, neuroblastoma, linfoma não de Hodgkin, câncer oral, câncer orofaríngeo, osteossarcoma, carcinoma e eliminação de célula do ovário, câncer epitelial ovariano, tumor de células de germes ovarianas, papilomatose, câncer do seio paranasal, câncer da paratiróide, câncer peniano, câncer de faringe, tumor parenquimal pineal, pineoblastoma, tumor pituitário, neoplasia celular plasmática, blastoma pleuropulmonar, linfoma do sistema nervoso central primário, câncer de próstata, câncer retal, câncer de células renais, câncer do trato respiratório com alterações no cromossonmo 15, retinoblastoma, rabdomiossarcoma, câncer das glândulas salivares, síndrome de Sezary, câncer do intestino delgado, sarcoma de tecido macio, carcinoma de célula escamosa, câncer de pescoço escamoso, tumor neuroectodérmico primitivo supratentorial, tumor neuroectodérmico primitivo supratentorial, câncer testicular, câncer de garganta, carcinoma tímico, timoma, câncer de tiróide, câncer da pélvis renal, câncer uretral, sarcoma uterino, câncer vaginal, câncer vulvar, macroglobulinemia de Waldenstrom e tumor de Wilms.
[084] O paciente com tumor pode estar sofrendo de um câncer selecionado do grupo que consiste de carcinoma adrenocortical, câncer anal, câncer de apêndice, astrocitoma de grau I (anaplásico), astricutina de grau II, astricutina de grau III, astricutina de grau IV, tumor teratoide/rabdoide atípico do sistema nervoso central, carcinoma celular basal, câncer de bexiga, câncer bronquial, carcinoma bronquioalveolar, câncer cervical, câncer de cólon, câncer colorretal, craniofaringioma, câncer endometrial, câncer endometrial uterino, ependimoblastoma, ependimoma,
20 / 36 câncer esofageal, estesioneuroblastoma, sarcoma de Ewing, tumor de célula de germe extracraniano, tumor celular de germe extragonadal, câncer de duto biliar extra‐ hepático, histiocitoma fibroso, câncer da vesícula biliar, câncer gástrico, tumor carcinoide gastrintestinal, tumor estromal gastrintestinal, tumor trofoblástico gestacional, tumor trofoblástico gestacional, glioma, câncer de cabeça e epscoço, câncer cardíaco, câncer hepatocelular, colangiocarcinoma de Hilar, câncer hipofaringeal, melanoma intraocular, tumor de célula de ilhota, sarcoma de Kaposi, histocitose de célula de Langerhans, câncer da laringe, câncer labial, macroglobulinemia, histiocitoma fibroso maligno, meduloblastoma, meduloepitelioma, melanoma, carcinoma de células de Merkel, mesotelioma, neoplasia endócrina, mieloma múltiplo, micose fungoide, mielodisplasia, neoplasias mielodisplásicas/mieloproliferativas, distúrbios mieloproliferativos, câncer da cavidade nasal, câncer nasofaringeal, neuroblastoma, câncer oral, câncer orofaringeal, osteossarcoma, carcinoma e eliminação de célula do ovário, câncer epitelial ovariano, tumor de células de germes ovarianas, papilomatose, câncer do seio paranasal, câncer da paratiróide, câncer peniano, câncer de faringe, tumor parenquimal pineal, pineoblastoma, tumor pituitário, neoplasia celular plasmática, blastoma pleuropulmonar, câncer de próstata, câncer retal, câncer de células renais, câncer do trato respiratório com alterações no cromossonmo 15, retinoblastoma, rabdomiossarcoma, câncer das glândulas salivares, síndrome de Sezary, câncer do intestino delgado, sarcoma de tecido macio, carcinoma de célula escamosa, câncer de pescoço escamoso, tumor neuroectodérmico primitivo supratentorial, tumor neuroectodérmico primitivo supratentorial, câncer testicular, câncer de garganta, carcinoma tímico, timoma, câncer de tiróide, câncer da pélvis renal, câncer uretral, sarcoma uterino, câncer vaginal, câncer vulvar, macroglobulinemia de Waldenstrom e tumor de Wilms.
[085] O nanocomplexo micelar pode ser para o tratamento de câncer. O nanocomplexo micelar pode ser para o tratamento de um tumor.
[086] O uso do nanocomplexo micelar pode se dar na fabricação de um medicamento para o tratamento de câncer. O uso do nanocomplexo micelar pode se dar na
21 / 36 fabricação de um medicamento para o tratamento de um tumor. DIVULGAÇÃO DETALHADA DAS CONFIGURAÇÕES EXEMPLOS
[087] Exemplos não limitadores da invenção e um exemplo comparativo serão descrito em mais detalhes por referêncoa a Exemplos específicos, que não devem ser interpretados de forma a limitar o escopo da invenção. EXEMPLO 1: MATERIAIS E CULTURA CELULAR MATERIAIS
[088] Metoxi‐polietileno glicol com um terminal de extremidade tiol (PEG‐SH, Mw = 5000 Da) foi obtido da JenKem Technology (China). Metoxi‐polietileno glicol com um terminal de extremidade aldeído terminal (PEG‐CHO, Mw = 5000 Da) foi obtido da NOF Co., Japão. (‐)‐Epigalocatequina‐3‐galato (EGCG, pureza >95%) foi obtido da Kurita Water Industries (Tokyo, Japão). Solução de piruvato de sódio (100 mM) foi comprada da Invitrogen (Cingapura). Solução salina PBS sem Ca2+ e Mg2+ (150 mM, pH 7,3) foi fornecida pelas instalações de preparação de meio em Biopolis, Cingapura. DMSO e trietilamina (TEA) foram compradas da Sigma‐Aldrich (Cingapura). Cloridrato de doxorrubicina (DOX‐HCl) foi comprado da Boryung Pharm. Inc. (Coreia). SU (forma de base livre) foi comprado da BioVision (EUA). Todas as outras substâncias químicas foram de grau analítico. CULTURA CELULAR
[089] Células de carcinoma de células renais humanas A498 foram obtidas da American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, EUA), e cultuadas em Meio da Dulbecco’s Modified Eagle’s suplementado com 10% de soro bovino fetal, 1% de penicilina‐estreptomicina, 2 mM de glutamina e 0,1 mM de aminoácidos não essenciais. O clone de célula A498 estável que expressa o gene de luciferase (A498‐luc) foi gerado conforme descrito. Em resumo, células A498 foram semeadas em uma lâmina de seis posições em uma densidade de 5xl05 células/posição e transfectadas comd pRC‐CMV2‐luc de plasmídeo com o uso de Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA). Após 1 dia, as células transfectadas foram transferidas para um prato de cultura celular de 100 mm, q 1 mg ml‐1 de geneticina foi adicionado ao meio
22 / 36 para selecionar as células resistentes. Após 1 semana da seleção, as células resistentes foram semeadas em uma lâmina de 96 posições em uma densidade de 1 célula/posição para formar colônias. Um total de 10 colônias foram selecionados e expandidos, e a atividade de luciferase foi medida com um Kit Promega (Madison, WI, EUA) em um luminômetro de tubo único (Berthold Lumat LB 9507, Bad Wildbad, Alemanha). Um clone com a maior atividade de luciferase foi escolhido e mantido com 500 mg ml‐1 de geneticina. EXEMPLO 2: OS CONJUGADOS PEG‐EGCG
[090] No estudo, dois tipos de conjugados de PEG‐EGCG foram usados para formar nanocomplexos micelares, PEG‐mEGCG e PEG‐dEGCG, que têm um e dois meios de EGCG em uma extremidade do PEG, respectivamente. SÍNTESE DO CONJUGADO PEG‐mEGCG
[091] O conjugado PEG‐mEGCG foi sintetizado conjugando‐se EGCG a PEG com um terminal da extremidade de tiol. Tipicamente, EGCG (18,3 mg, 40 pmol) foi dissolvido em 20 mL de uma mistura 1:1 (v/v) de PBS e DMSO. PEG‐SH (Mw= 5000 Da, JenKem Technology, China) (100 mg, 20 pmol) foi dissolvido separadamente em 20 mL de PBS. A solução PEG‐SH foi adicionada em gotas a uma solução agitada de EGCG. Como um experimento de controle, a solução de PEG não modificada foi adicionada a uma solução de EGCG na mesma concentração. A mistura resultante tem pH de 8,4. A mistura foi agitada por 7 horas a 25 °C. A essa solução, 1,6 mL de ácido acético a 10% foi adicionado para ajustar o pH a 4 para parar a reação. A solução resultante foi transferida para tubos de diálise com corte de peso molecular (MWCO) de 1.000 Da. Os tubos foram dialisados contra água de‐ionizada. A solução purificada foi liofilizada para obter o conjugado PEG‐mEGCG. A estrutura do conjugado PEG‐mEGCG foi confirmado por espectroscopia 1H NMR. O conjugado PEG‐mEGCG foi dissolvido em D20 em uma concentração de 20 mg mL‐1 e então analisado com um espectrômetro Bruker AV‐400 NMR operando a 400 MHz. Rendimento: 89%. 1H NMR (D20): δ 2,9 (t, H‐α de PEG), 3,4 (s, H‐γ de PEG), 3,5‐3,8 (m, prótons de PEG), 5,5 (s, H‐2 do anel C), 5,85 (s, H‐3 do anel C), 6,15 (d, H‐6 e H‐8 do anel A), 6,9 (s, H‐6’ do anel B), 7,05 (s, H‐ 2” e H‐6” do anel D).
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[092] A Fig. 1 ilustra o esquema sintético de conjugados PEG‐mEGCG (108). PEG (PEG‐ SH) funcionalizado com Tiol (102) foi incubado com um excesso molar de 2 vezes de EGCG (PEG‐SH: EGCG = 1:2) (104) em uma mistura 1:3 (v/v) de DMSO e água em pH básico (106). Foi relatado que o pH influencia criticamente o processo de autooxidação de EGCG. Na faixa de pH básico de 7‐9,5, o meio de galil no anel B foi mais suscetível a autooxidação do que o meio galato no anel D. Como resultado, apenas o meio galil no anel B forma uma orf/zo‐quinona. Sob uma forte condição alcalina (pH > 10), o meio de galato no anel D também pode ser autooxidado para formar uma orf/zo‐quinona. No presente estudo, a reação foi conduzida a um pH 8,4 para permitir a formação de uma orf/zo‐quinona apenas no anel B de EGCG. A adição nucleofílica subsequente de PEG‐SH à orf/zo‐quinona produziu conjugados PEG‐mEGCG ligados por uma ligação tioéter covalente.
[093] Deve‐se notar que a reação de conjugação procedeu na presença de dimetil sulfóxido (DMSO). Como EGCG passaria por agregação mediante o contato com PEG em solução aquosa, deve evitar a agregação durante a conjugação de EGCG a PEG‐SH. Foi descoberto que DMSO impediu efetivamente a agregação. Com base nessa descoberta, a reação de conjugação foi realizada em uma mistura de DMSO e água. Além disso, piruvato de sódio foi usado como eliminador para H2O2 gerado durante a autooxidação de EGCG. Como o piruvato de sódio protege os grupos de tiol livre da oxidação mediada por H2O2, pode aumentar o número de moléculas de PEG‐SH disponíveis para uma reação de conjugação com EGCG. O conjugado PEG‐mEGCG obtido foi purificado por diálise sob uma atmosfera de nitrogênio e então liofilizado para obter um pó branco. CARACTERIZAÇÃO UV‐Vis DO CONJUGADO PEG‐mEGCG
[094] Os conjugados PEG‐mEGCG foram caracterizados usando‐se espectroscopia ultravioleta visível (UV‐Vis) (Fig. 2).
[095] Os espectros UV‐Vis dos conjugados PEG‐mEGCG foram medidos em um espectrofotômetro Hitachi U‐2810 (Japan). Para a espectroscopia UV‐Vis, o conjugado PEG‐mEGCG seco e PEG foram dissolvidos em água de‐ionizada em uma concentração de 0,5 mg mL‐1. Diferente do PEG não modificado (204), os conjugados PEG‐mEGCG
24 / 36 (202) demonstraram ter um pico de absorção de UV intenso a 280 nm, indicativi de uma conjugação bem‐sucedida de EGCG. Além disso, a faixa de absorção de UV a 425 nm correspondente a dímeros de EGCG e outros produtos oxidativos não foi observada. CARACTERIZAÇÃO DE HPLC DO CONJUGADO PEG‐mEGCG
[096] O conjugado PEG‐mEGCG também foi avaliado por cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC) de fase reversa. A HPLC de fase reversa foi realizada usando‐ se o módulo de separações Waters 2695 equipado com uma coluna orgânica Spirit™ C18 (5 pm, 4,6 x 250 mm i.d., AAPPTec). EGCG, a mistura PEG/EGCG e conjugados PEG‐ mEGCG foram dissolvidos em água de‐ionizada em uma concentração de 1 mg mL‐1. As amostras foram eluídas com uma mistura de solvente de ácido acético a 1% em acetonitrila e ácido acético a 1% em água a uma taxa de fluxo de 1 ml/minutos a 25°C. Para a fase móvel, a proporção de volume acetonitrila:água aumentou gradualmente de 3:7 a 0 minuto para 4:6 a 10 minutos. As amostras eluídas foram monitoradas a 280 nm. O grau de conjugação de EGCG foi determinado comparando‐se a área de pico integrado com aquelas obtidas de uma série de soluções padrão de EGCG para diversas concentrações. Conforme demonstrado na Fig. 3, EGCG (302) foi eluído em um tempo de retenção de 4,8 min, enquanto o conjugado PEG‐mEGCG (304) foi eluído a 8 min. Essa mudança dramática no tempo de retenção poderia ser explicada pela anexação de uma cadeia de PEG hidrofílico a EGCG. Além disso, nenhum pico de EGCG foi observado no cromatograma de HPLC dos conjugados PEG‐mEGCG, o que sugere que moléculas de EGCG não reagidas foram completamente removidas por diálise. O grau de conjugação de EGCG aumentou de ~ 63 para 98% conforme o tempo de reação aumentou de 6 para 7 horas (Fig. 4). No entanto, quando o tempo de reação foi de 8 h, o grau de conjugação foi levemente reduzido, presumivelmente porque os dímeros de EGCG e outros produtos oxidativos começaram a se formar. Portanto, o tempo de reação ideal foi de 7 h. CARACTERIZAÇÃO DE 1H NMR DO CONJUGADO PEG‐MEGCG
[097] A estrutura de conjugados PEG‐mEGCG foi determinada por espectroscopia de ressonância magnética nuclear (NMR) 1H. Conforme demonstrado na Fig. 5, os
25 / 36 conjugados PEG‐mEGCG exibiram sinais de próton para o anel A (H‐6 e H‐8 a δ = 6,15), anel C (H‐2 a δ = 5,5 e H‐3 a δ = 5,85), e anel D (H‐ 2” e H‐6” a δ = 7,1). Os sinais de próton que surgem dos anéis A, C e D foram semelhantes àqueles de EGCG não modificado, sugerindo que esses meios permaneceram inalterados durante a reação de conjugação. Em contraste, os sinais de próton para o anel B mudaram de 6,5 a 6,9 ppm após a reação de conjugação. A mudança significativa nos sinais de próton foi provavelmente atribuída à anexação de PEG‐SH à posição C2’ do anel B. Além disso, o pico de NMR para o anel B demonstrou ter metade da área sob o pico do anel D< indicando que um próton no anel B desapareceu após a reação de conjugação. O fenômeno observado foi de acordo com o relatório anterior, em que a formação de 2’‐ cisteinil EGCG causou o desaparecimento do átomo de H‐2’ do anel B. Os resultados acima revelaram que apenas uma molécula de PEG pôde ser conjugada especificamente para a posição C2’ do anel B de EGCG. SÍNTESE DO CONJUGADO PEG‐dEGCG
[098] Os conjugados PEG‐dEGCG foram sintetizados conjugando‐se EGCG a PEG com um grupo de extremidade aldeído (PEG‐CHO). O PEG‐CHO (Mw= 5000 Da, NOF Co., Japão) (1,75 g) e EGCG (3,25 g, 7,09 mmol) foram dissolvidos separadamente em uma mistura de ácido acético, água e DMSO. A reação foi iniciada com a adição em gotas da solução PEG‐CHO, e foi conduzida a 20 °C por 72 h. A solução resultante foi dialisada (MWCO = 3500 Da) contra água de‐ionizada. A solução purificada foi liofilizada para obter os conjugados PEG‐dEGCG. EXEMPLO 3: O CONJUGADO DOXORRUBICINA/PEG‐mEGCG
[099] Para aplicações de terapia de câncer, os conjugados PEG‐mEGCG foram projetados para formar nanocomplexos micelares capazes de transportar um grande número de medicamentos anti‐câncer em seu interior. No estudo, os nanocomplexos micelares PEG‐mEGCG foram utilizados como veículo de entrega para doxorrubicina. Doxorrubicina é um dos agentes quimioterapêuticos mais amplamente usados e apresenta uma forte atividade citotóxica contra diversos tipos de cânceres, como leucemia, de mama, de ovário e de pulmão. No entanto, pode causar cardiotoxicidade grave e aumentar o risco de insuficiência cardíaca congestiva, arritmias cardíacas,
26 / 36 hipotensão e outros efeitos colaterais. Prevê‐se que os nanocomplexos micelares PEG‐ mEGCG podem minimizar esses efeitos colaterais adversos encapsulando estavelmente as moléculas de medicamento em seu interior e liberando‐as de forma sustentada. FORMAÇÃO DE NANOCOMPLEXOS MICELARES DOXORRUBICINA/PEG‐ mEGCG
[100] Nanocomplexos micelares doxorrubicina/PEG‐mEGCG foram preparados usando‐se um método de diálise. Em resumo, 5 mg de DOX‐HCl foram dissolvidos em 4,5 mL de dimetilformamida. Para essa solução, TEA foi adicionado em uma proporção molar de TEA:DOX‐HCl de 5:1. Essa mistura foi misturada por 30 minutos para formar doxorrubicina deprotonada (DOX). A solução DOX resultante foi misturada com conjugados PEG‐mEGCG dissolvidos em 0,5 mL de dimetilformamida em proporções de peso variantes de PEG‐mEGCG/ DOX. Essa mistura foi misturada por 90 minutos e então transferida para tubos de diálise com MWCO de 2.000 Da. Os tubos foram dialisados contra água de‐ionizada por 24 horas para obter os nanocomplexos micelares doxorrubicina/PEG‐mEGCG. CARACTERIZAÇÃO DE NANOCOMPLEXOS MICELARES OXORRUBICINA/PEG‐ mEGCG
[101] Os diâmetros hidrodinâmicos, índices de polidispersão e potenciais zera de nanocomplexos micelares doxorrubicina/PEG‐mEGCG foram avaliados por difusão de luz dinâmica (Zetasizer Nano ZS, Malvern, RU). A medição foi realizada em triplicata em água a 25 °C. Para medir a quantidade de carregamento de doxorrubicina, 20 pL dos nanocomplexos dispersos em água foi misturado com 980 pL de dimetilformamida para extrair a doxorrubicina. A absorbância de doxorrubicina a 480 nm foi medida usando‐se um espectrofotômetro Hitachi U‐2810 (Japão). A eficiência de carregamento do medicamento e o teor de carregamento foram determinados comparando‐se os valores de absorbância com aqueles obtidos de umas érie de soluções padrão de doxorrubicina com concentrações variantes.
[102] A Fig. 6 ilustra a formação de nanocomplexos micelares doxorrubicina/PEG‐ mEGCG. Os conjugados PEG‐mEGCG (602) e doxorrubicina (604) foram dissolvidos em
27 / 36 conjunto em dimetilformamida (606). Essa mistura foi dialisada contra água destilada (608). Como o solvente orgânico foi removido dos tubos de diálise, os meios de EGCG hidrofóbicos nos conjugados começaram a se auto‐montar para formar um núcleo micelar circundado por um escudo das cadeias de PEG hidrofílicas (610). Simultaneamente, as moléculas de doxorrubicina também forma particionadas no núcleo micelar hidrofóbico. Também foi relatado que as moléculas de doxorrubicina foram facilmente empilhadas em solução aquosa devido à interação π‐π entre os anéis de antraciclina planar. Como EGCG tem uma estrutura de polifenol capaz de interagir com doxorrubicina por meio de empilhamento π‐π, foi previsto que EGCG enriquecido no núcleo de nanocomplexos micelares pode fornecer um ambiente favorável para prender doxorrubicina em seu interior. Além disso, as cadeias de PEG expostas superficialmente poderia formar uma proteção em volta dos nanocomplexos micelares para impedir a eliminação pelo sistema reticuloendotelial, permitindo assim a circulação prolongada no fluxo sanguíneo.
[103] O tamanho e a carga superficial dos nanocomplexos micelares doxorrubicina/PEG‐mEGCG foram caracterizados por análise de difusão de luz dinâmica (DLS). A Fig. 7 se refere a gráficos que apresentam (A) tamanho e (B) potencial zeta dos nanocomplexos micelares doxorrubicina/PEG‐mEGCG.
[104] A Fig. 7A apresenta o diâmetro hidrodinâmico dos nanocomplexos micelares preparados em diferentes proporções de peso diferentes de PEG‐mEGCG para doxorrubicina. Notavelmente, os nanocomplexos foram produzidos com uma variação de tamanho de 130‐180 nm. Esse tamanho pequeno é favorável no alcance da circulação prolongada na corrente sanguínea e alvo do tumor por meio do efeito aprimorado de permeabilidade e retenção (EPR).
[105] Os nanocomplexos micelares formados em uma proporção de peso de PEG‐ mEGCG:doxorrubicina de 0.5:1 têm diâmetro maior do que aqueles formados a 1:1. Prender quantidades mais altas de doxorrubicina foi responsável pela formação de maiores nanocomplexos micelares. Os nanocomplexos foram altamente monodispersos, conforme fica evidente a partir do valor do índice de pequena polidispersão (PDI) ficar dentro da faixa de 0,1‐0,2.
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[106] Conforme demonstrado na Fig. 7B, the nanocomplexos micelares tiveram potencial zeta positivo na faixa de + 15‐25 mV. Essa carga de superfície catiônica foi atribuída ao encapsulamento de moléculas de doxorrubicina de carga positiva dentro dos nanocomplexos. Também avaliamos se os nanocomplexos micelares mantiveram sua integridade estrutural durante o processo de secagem por congelamento. A secagem por congelamento é uma das técnicas mais populares usadas para o armazenamento de longo prazo de nanopartículas coloidais. Os nanocomplexos foram liofilizados e então redispersos em água de‐ionizada na mesma concentração. Descobriu‐se que os nanocomplexos reconstituídos retêm o tamanho de partícula original e carga superficial mesmo sem quaisquer lioprotetores. Essa alta estabilidade coloidal seria vantajosa na tradução clínica e comercialização dos nanocomplexos micelares.
[107] A Fig. 8 apresenta a eficiência de carregamento de medicamento e teor de carregamento de nanocomplexos micelares doxorrubicina/PEG‐mEGCG. A eficiência de carregamento de medicamento foi maior do que 75%, o que indica que a doxorrubicina foi incorporada de forma eficiente nos nanocomplexos PEG‐mEGCG. Conforme a proporção de peso de PEG‐mEGCG:doxorrubicina foi reduzida, tanto a eficiência de carregamento do medicamento e o teor do carregamento aumentaram. O teor de carregamento observado (35‐50 p/p%) foi significativamente mais alto do que aqueles obtidos com outros sistemas micelares poliméricos. O empilhamento π‐π e/ou interações hidrofóbicas entre EGCG e doxorrubicina podem ter tido uma função importante na alta capacidade de carregamento de medicamento dos nanocomplexos micelares PEG‐mEGCG. ESTUDO DE LIBERAÇÃO DE DOXORRUBICINA
[108] Para experimentos de liberação, 0,5 mL de nanocomplexos carregados com doxorrubicina (2 mg ml‐1) foram postos em tubos de diálise com MWCO de 2.000 Da. Os tubos foram imersos em 25 ml de PBS em uma incubadora em agitação a 37 °C. Em um determinado ponto, 1 ml do meio de liberação foi coletado e então substituído por um volume equivalente de PBS fresco. A quantidade de doxorrubicina liberada no meio foi determinada pela medição da absorbância de doxorrubicina a 480 nm
29 / 36 usando‐se um espectrofotômetro Hitachi U‐2810 (Japão).
[109] O perfil de liberação de medicamento de nanocomplexos micelares doxorrubicina/PEG‐mEGCG também foi investigado em temperatura fisiológica e pH. Conforme demonstrado na Fig. 9, os nanocomplexos micelares apresentaram uma liberação sustentada de doxorrubicina em PBS. Aproximadamente 11% da doxorrubicina carregada foi liberada dentro de 7 dias. A taxa de liberação observada é consideravelmente mais baixa do que a de outros sistemas de entrega de doxorrubicina relatados anteriormente. Essa liberação de medicamento sustentada foi provavelmente causada pela forte interação entre EGCG e doxorrubicina dentro dos nanocomplexos micelares. Além disso, apenas uma liberação de rajada marginal foi observada na etapa inicial, sugerindo que as moléculas de doxorrubicina foram encapsuladas estavelmente nos nanocomplexos micelares. Esse baixo vazamento do medicamento seria essencial para garantir a máxima eficácia terapêutica com o mínimo de efeitos colaterais, visto que as moléculas do medicamento encapsuladas nos nanocomplexos não vazariam prematuramente durante a circulação no fluxo sanguíneo. Tomados juntos, esses resultados demonstraram que os nanocomplexos micelares de PEG‐mEGCG poderiam ser aplicados para administração sistêmica de doxorrubicina para tratamento de câncer. EXEMPLO 4: OS CONJUGADOS SU/PEG‐EGCG FORMAÇÃO DOS NANOCOMPLEXOS MICELARES SU/PEG‐EGCG
[110] A Fig. 10 ilustra a formação dos conjugados SU/PEG‐EGCG usando o método de dispersão de sólidos. Em resumo, 2 mg de SU (1006) foram dissolvidos em 1 ml de clorofórmio. Então, solução de SU foi adicionada aos conjugados PEG‐EGCG (seja PEG‐ mEGCG (1002) ou PEG‐dEGCG (1004) em frascos de vidro em proporções de peso variantes de PEG‐EGCG: SU (1008) e misturados. Então, o clorofórmio da solução foi evaporado sob pressão reduzida (1010). O filme fino resultante da mistura de PEG‐ EGCG e SU (1012) foi hidratado adicionando‐se 2 ml de água à superfície (1014), e incubado em temperatura ambiente por 24 h. Como o filme sólido resultante foi hidratado, o PEG‐EGCG se auto‐montou para formar nanocomplexos micelares por isolamento de meios de SU e EGCG a partir das cadeias de PEG hidratadas. A solução
30 / 36 de nanocomplexos micelares de SU/PEG‐EGCG foi, então, filtrada (1016) através de um filtro de 0,8‐µm (Sartorius Stedim Biotech GmbH, Alemanha) para remover quaisquer medicamentos livres de resíduo que resultaram na solução transparente de nanocompleox micelar de SU/PEG‐EGCG (1018). Para estudos in vivos, a solução de nanocomplexos micelares de SU/PEG‐EGCG foi posteriormente filtrada usando‐se um filtro de 0,2‐µm (Sartorius Stedim Biotech GmbH, Alemanha).
[111] Deve‐se observar que os conjugados PEG‐EGCG se referem tanto a PEG‐mEGCG como a PEG‐dEGCG, a menos que seja especificado.
[112] Como EGCG tem uma estrutura de polifenol capaz de interagir com SU por meio de interação hidrofóbica e empilhamento π‐π, foi previsto que EGCG enriquecido no núcleo de nanocomplexos micelares forneceria um ambiente favorável para prender SU. Além disso, as cadeias de PEG expostas na superfície formariam uma proteção altamente hidratada em torno dos nanocomplexos micelares para impedir a eliminação pelo RES, permitindo assim a circulação prolongada na corrente sanguínea e redução de efeitos colaterais. CARACTERIZAÇÃO DOS NANOCOMPLEXOS MICELARES SU/PEG‐mEGCG
[113] Os diâmetros hidrodinâmicos, distribuição de tamanho e carga superficial dos nanocomplexos micelares SU/PEG‐mEGCG forma avaliados por difusão de luz dinâmica (DLS) (Zetasizer Nano ZS, Malvern, RU). As medições foram conduzidas em triplicata em água a 25°C. A Fig. 11A exibe o diâmetro hidrodinâmico dos nanocomplexos micelares preparados em diferentes proporções de peso de PEG‐ EGCG: SU. Notavelmente, os nanocomplexos micelares foram produzidos na variação de tamanho de 130‐250 nm. O tamanho do nanômetro seria favorável no prolongamento da circulação e no alvejamento do tumor por meio do efeito EPR. As características dos nanocomplexos micelares foram controladas variando‐se as proporções de peso de PEG‐EGCG: SU. A Fig. 11B demonstra que os nanocomplexos micelares formados em proporções de peso de PEG‐EGCG: SU de 8 e 16 foram altamente monodospersos. Os nanocomplexos micelares reduziram em carga positiva conforme a proporção de peso de PEG‐EGCG: SU aumentava (Fig. 11C). Sua carga superficial levemente positiva foi atribuída ao encapsulamento de moléculas de SU positivamente carregadas.
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[114] Para medir a eficiência de carregamento de medicamento e quantidade, 10 pL de nanocomplexos micelares em água foram dissolvidos em 990 pL de DMF, e a absorbância de SU foi medida a 431 nm usando‐se um espectrofotômetro ultravioleta visível Hitachi U‐2810 (UV‐Vis) (Japão). A curva de calibração obtida com as Soluções padrão de SU foi usada para determinar a eficiência e quantidade de carregamento.
[115] A Fig. 12 apresenta a eficiência de carregamento de medicamento e teor de carregamento de nanocomplexos micelares SU/PEG‐EGCG. Conforme a proporção de peso de PEG‐EGCG:SU aumentou de 1 para 16, a eficiência de carregamento de medicamento aumentou de ~ 30% para ~ 80%. A eficiência de carregamento dos nanocomplexos micelares SU/PEG‐dEGCG foi mais alta do que dos nanocomplexos micelares SU/PEG‐mEGCG, indicando maior interação de SU com PEG‐dEGCG em comparação com PEG‐mEGCG. Também foi descoberto que a eficiência de carregamento de nanocomplexos micelares estava relacionada à quantidade de precipitado de SU não carregado antes da filtração. Quando a proporção de peso de PEG‐EGCG:SU foi aumentada para 8, nenhum precipitado de SU foi encontrado. Como esperado, o teor de carregamento dos nanocomplexos micelares foi reduzido conforme a proporção de peso de PEG‐EGCG:SU aumentou devido ao teor mais alto de PEG‐ EGCG nos nanocomplexos micelares. ESTUDO DE LIBERAÇÃO DE SU
[116] O perfil de liberação de medicamento dos nanocomplexos micelares SU/PEG‐ EGCG foi ainda mais investigado em condição fisiológica (solução salina tamponada com fosfato (PBS), pH 7,3 a 37 °C). Para experimentos de liberação de SU, 0,5 mL de nanocomplexos micelares carregados com SU/PEG‐EGCG (0,4 mg ml‐1) foram postos em tubos de diálise (MWCO = 2.000 Da). Os tubos foram imersos em 25 ml de PBS em uma incubadora em agitação a 37 °C. Em um determinado ponto, 1 ml do meio de liberação foi coletado e então substituído por um volume equivalente de PBS fresco. A quantidade de SU liberada no meio foi determinada pela medição da absorbância a 431 nm usando‐se um espectrofotômetro Hitachi U‐2810.
[117] Conforme demonstrado na Fig. 13, os nanocomplexos micelares apresentaram uma liberação sustentada de SU em PBS, o que poderia ser atribuído à forte interação
32 / 36 entre EGCG e SU dentro dos nanocomplexos micelares. Além disso, dificilmente qualquer liberação de rajada foi observada, sugerindo que as moléculas de SU foram encapsuladas estavelmente nos nanocomplexos micelares. Os nanocomplexos micelares de SU/PEG‐mEGCG apresentaram liberação maior e mais rápida de SU em comparação com os nanocomplexos micelares de SU/PEG‐dEGCG devido à interação mais fraca entre os meios de SU e mEGCG. A taxa de liberação e quantidade também dependeram da proporção de peso de PEG‐EGCG:SU. Para os nanocomplexos micelares de SU/PEG‐mEGCG, tanto a taxa de liberação como a quantidade foram reduzidas conforme aumentou a proporção de peso de PEG‐EGCG:SU. A proporção de peso de PEG‐EGCG:SU não afetou de forma significativa e a taxa e quantidade de liberação nos nanocomplexos micelares de SU/PEG‐dEGCG, exceto que uma liberação mais lenta e menor foi associada com uma proporção de peso de PEG‐EGCG:SU de 8. ESTUDO TERAPÊUTICO IN VIVO
[118] Para estudar a toxicidade e o efeito terapêutico, estudos in vivo foram conduzidos nos nanocomplexos micelares. Um modelo de carcinoma de célula renal subcutâneo foi estabelecido. Camundongos nus fêmeas adultos atímicos Balb/c, imunoinconpetentes (peso médio = 19 g, idade = 6‐8 semanas) foram usados.
[119] Para estudar o efeito terapêutico dos nanocomplexos micelares de SU/PEG‐ EGCG por injeção intravenosa, um modelo de tumor de xenoenxerto foi estabelecido inoculando‐se 6xl06 de células A498‐luc subcutaneamene na raiz da coxa esquerda do camundongo. No dia 6 após a inoculação do tumor, os animais foram divididos em quatro grupos para injeção na veia da cauda de diversas Soluções (n = 8 por grupo) duas vezes por semana por 5 semanas, enquanto um grupo recebeu SU diariamente, com gavagem a 60 mg/kg. Para injeção na veia da cauda, um volume de 200 µl da solução de amostra foi usado.
[120] Para monitorar sinais bioluminescentes de células A498‐luc, animais anestesiados com gás isoflurano foram injetados intraperitonealmente com 200 µl de D‐luciferina (5 mg ml ‐1, Promega) em PBS, e colocados em um estágio aquecido (30°C) dentro da caixa da câmera do sistema de geração de imagem IVIS (Xenogen, Alameda, CA, EUA) com uma câmera CCD. Imagens luminescentes foram feitas 20 minutos após
33 / 36 a injeção de luciferina como uma aquisição de 30‐s. A luz emitida das células A498‐luc foi digitalizada e exibida eletronicamente como uma sobreposição pseudocolorida sobre uma imagem em escala de cinza do animal. As imagens e medições dos sinais luminescentes foram adquiridas e analisadas com o software de geração de imagens Xenogen v3.2 e quantificadas como fótons/s. O tamanho do tumor e peso corporal foram medidos semanalmente. Todo o gerenciamento e cuidado dos animais foram realizados de acordo com as Diretrizes sobre o Cuidado e Uso de Animais para Fins Científicos emitidas pelo Comitê de Aconselhamento Nacional de Pesquisa com Animais de Laboratório de Cingapura.
[121] Todos os dados foram representados como erro médio + padrão da média (SEM). A significatividade estatística de diferenças entre os valores médios foi determinada pelo teste t de Student. Múltiplas comparações foram avaliadas por ANOVA com múltiplos testes de comparação de Bonferroni usando SigmaStat 3.5. Um valor de P de < 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.
[122] Nanocomplexos micelares de SU/PEG‐mECGC (com proporções de peso de PEG‐EGCG:SU de 8 e 16) e nanocomplexos micelares de SU/PEG‐dEGCG (com proporções de peso de PEG‐EGCG:SU de 8) foram selecionados para os estudos in vivo com base no tamanho do nanocomplexo micelar, distribuição de tamanho e carga superficial. Os nanocomplexos micelares de SU/PEG‐mEGCG foram injetados intravenosamente duas vezes por semana por 5 semanas e um grupo recebeu gavagem de SU diária a 60 mg/kg. A dose do medicamento oral de 60 mg/kg por dia foi selecionada com base em relatórios anteriores que demonstraram a dose pré‐clínica ideal de SU para eficácia anti‐tumor em camundongos como 40‐80 mg/kg por dia. Para nossos estudos, a dose de 60 mg/kg por dia representou uma dose anti‐tumor eficaz, visto que outros estudos indicaram que uma dose de < 40 mg/kg por dia seria subeficaz e uma dose de 120 mg/kg por dia testaria os efeitos da administração ainda mais elevada do medicamento.
[123] A Fig. 14 apresenta perda de peso significativa no grupo que recebeu SU livre oral uma semana após o início do tratamento. Isso não foi observado nos outros grupos que receberam o tratamento com o nanocomplexo micelar de SU/PEG‐EGCG. O
34 / 36 efeito anti‐tumor foi aprimorado quando os nanocomplexos micelares de SU/PEG‐ EGCG foram administrados duas vezes por semana, em comparação com a terapia oral diária com SU (Fig. 15). Esse efeito anti‐tumor com os nanocomplexos micelares de SU/PEG‐EGCG foi obtido em aproximadamente um décimo da concentração da dose oral. O efeito inibitório do nanocomplexo micelar de SU/PEG‐EGCG foi mantido por um período substancial mesmo quando a terapia foi interrompida após 5 semanas. A taxa de novo crescimento do tumor foi muito mais rápida no grupo que recebeu tratamento oral, em comparação com os grupos que receberam tratamento com o nanocomplexo micelar.
[124] Para investigar o efeito terapêutico de SU/PEG‐mEGCG MNC por meio de administração oral, um modelo de tumor de xenoenxerto foi estabelecido inoculando‐ se g 4xl06 células ACHN suspensas em 100 µl de PBS e 100 µl de Matrigel (BD Bioscience) subcutaneamente na raiz da coxa direita do camundongo. Uma vez que os tumores alcançaram um volume de 200 mm3, os animais foram divididos em quatro grupos para gavagem oral de diversas soluções (n = 8 por grupo) diariamente por 5 semanas: controle (tampão de citrato a pH5), SU/PEG‐mEGCG 8:1 (SU a 15 mg/kg), SU a 15 e 40 mg/kg. Os tumores foram medidos duas vezes por semana com um compasso de calibre digital, e os volumes do tumor (mm3) foram calculados a partir da fórmula: volume = (comprimento x largura 2/2) (Figs. 16 e 17).
[125] Como foi demonstrado que a dose de SU oral de 60 mg/kg por dia é tóxica demais, a dose oral de SU foi reduzida para 40 mg/kg por dia na presente divulgação. Essa dose oral de 40 mg/kg por dia é a dose pré‐clínica ideal para eficácia anti‐tumor em camundongos (40‐80 mg/kg por dia) com base em relatos anteriores. A Fig. 16 apresenta perda de peso significativa no grupo que recebe SU a 40 mg/kg durante o tratamento. Isso não foi observado nos outros grupos que receberam o tratamento com SU/PEG‐mEGCG MNC 8:1 e SU a 15 mg/kg. Com a mesma dose de SU a 15 mg/kg, SU/PEG‐mEGCG MNC apresentou um efeito terapêutico significativamente mais alto em comparação com SU isolado (Fig. 17). Esse efeito anti‐tumor com o MNC de SU/PEG‐mEGCG foi obtido em menos da metade da concentração da dose oral ideal de SU a 40 mg/kg. O efeito inibitório do MNC de SU/PEG‐EGCG foi mantido por um
35 / 36 período substancial mesmo quando a terapia foi interrompida após 5 semanas.
[126] O efeito de EPR considera a natureza anatômica‐fisiológica dos vasos sanguíneos do tumor que facilita o transporte de macromoléculas de > 40 kDa que vazam seletivamente dos vasos de tumor e se acumulam no tecido do tumor. A maior parte dos tumores sólidos tem vasos sanguíneos com arquitetura defeituosa, que normalmente resulta em grandes quantidades de permeabilidade vascular. Isso não ocorre em tecidos normais. A presente invenção divulga o uso de nanocomplexos micelares de SU/PEG‐mEGCG por meio de administrações intravenosa e oral como uma terapia possível para ccRCC pela primeira vez. Foi observado que EGCG interagiu com SU e os estudos farmacocinéticos em ratos demonstraram que a administração de EGCG reduziu acentuadamente as concentrações plasmáticas de SU. A interação relatada de chá verde com SU e o efeito de EPR das nanopartículas micelares em diversos tumores sugeriu a possibilidade de usar PEG‐EGCG como um veículo de nanopartícula para entrega de SU. Em glioblastoma, um tumor altamente angiogênico, a terapia anti‐angiogênica demonstrou uma eficácia alta, mas transiente. Esse tumor estimula a formação de novos vasos sanguíneos por processos impulsionados principalmente por VEGF, mas os vasos resultantes são estruturalmente e funcionalmente anormais. O uso de nanocomplexos micelares de SU/PEG‐EGCG pode potencialmente aprimorar a atividade anti‐angiogência nesses casos. APLICABILIDADE INDUSTRIAL
[127] Os nanocomplexos micelares podem ser aplicados para uso em administração sistêmica de doxorrubicina para o tratamento de câncer.
[128] Os nanocomplexos micelares podem ser usados como um veículo de nanopartícula para entrega de SU. Em glioblastoma, um tumor altamente angiogênico, a terapia anti‐angiogênica demonstrou uma eficácia alta, mas transiente. Esse tumor estimula a formação de novos vasos sanguíneos por processos impulsionados principalmente por VEGF, mas os vasos resultantes são estruturalmente e funcionalmente anormais. O uso de nanocomplexos micelares que compreendem SU pode potencialmente aprimorar a atividade anti‐angiogência nesses casos.
[129] Os nanocomplexos micelares opdem ser usados para liberação sustentada de
36 / 36 agentes terapêuticos quando administrados sistemicamente, ou como um sistema de entrega para agentes terapêuticos em locais alvo.
[130] Os nanocomplexos micelares podem ser usados para encapsulamento de diversos agentes terapêuticos para diferentes tipos de tratamento de câncer.
[131] Os nanocomplexos micelares também podem ser usados para encapsulamento de diversos agentes terapêuticos para tratamento não canceroso. Isso pode incluir pequenas moléculas para antibióticos e outras aplicações médicas.
[132] Ficará aparente que diversas outras modificações e adaptações da invenção serão aparentes para uma pessoa habilidosa na arte após ler a divulgação acima sem se afastar do espírito e do escopo da invenção, e se pretende que todas essas modificações e adaptações se deem dentro do escopo das reivindicações anexas.

Claims (1)

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REIVINDICAÇÕES 1) “NANOCOMPLEXO MICELAR, CONJUGADO POLÍMERO‐FLAVONOIDE E MÉTODOS PARA RESPECTIVAS FORMAÇÕES”, caracterizado por compreender uma micela e um agente encapsulado dentro da referida micela, em que a referida micela compreende um conjugado polímero‐flavonoide, em que o referido polímero é ligado ao anel B do referido flavonoide. 2) “NANOCOMPLEXO MICELAR”, de acordo com a reivindicação 1 caracterizado por pelo menos um flavonoide ser ligado ao referido polímero. 3) “NANOCOMPLEXO MICELAR”, de acordo com a reivindicações 1 e 2 caracterizado por referido polímero ser ligado ao referido flavonoide por meio de um ligante. 4) “NANOCOMPLEXO MICELAR”, de acordo com a reivindicação 3 caracterizado por referido ligante ser selecionado do grupo que consiste de atioéter, imina, amina, azo e grupo 1,2,3‐triazol. 5) “NANOCOMPLEXO MICELAR”, de acordo com a reivindicação 3 caracterizado por referido flavonoide ser um flavonoide monomérico ou um flavonoide dimérico. 6) “NANOCOMPLEXO MICELAR”, de acordo com a reivindicações 2 a 5 caracterizado por mais de um flavonoide está presente no referido conjugado, pelo menos um flavonoide ser ligado ao referido polímero por meio do anel B. 7) “NANOCOMPLEXO MICELAR”, de acordo com a reivindicação 6 caracterizado por outro do referido pelo menos um flavonoide ser ligado ao referido polímero por meio do anel A. 8) “NANOCOMPLEXO MICELAR”, de acordo com a reivindicações anteriores caracterizado por referido polímero ser um polímero hidrofílico. 9) “NANOCOMPLEXO MICELAR”, de acordo com a reivindicação 8 caracterizado por referido polímero hidrofílico compreender monômeros selecionados a partir do grupo que consiste de acrilamidas, alquis, oxazolinas, alquenis, iminas, ácidos acrílicos, metacrilatos, diois, oxiranos, álcoois, aminas, anidridos, ésteres, lactonas, carbonatos, ácidos carboxílicos, acrilatos, hidroxis, fosfatos, tereftalato, amidas e éteres. 10) “NANOCOMPLEXO MICELAR”, de acordo com a reivindicação 8 caracterizado
2 / 9 por referido polímero hidrofílico ser selecionado a partir do grupo que consiste de poliacrilamida, poli(N‐isopropilacrilamida), poli(oxazolina), polietilenimina, poli(ácido acrílico), polimetacrilato, poli(etileno glicol), poli(óxido de etileno), poli(álcool vinílico), poli(vinilpirrolidinona), poliéteres, poli(alilamina), polianidridos, poli(β‐amino éster), poli(butileno succinato), policaprolactona, policarbonato, polidioxanona, poli(glicerol), ácido poliglicólico, poli(3‐ácido hidroxipropiônico), poli(2‐hidroxietil metacrilato), poli(N‐(2‐ hidroxipropil)metacrilamida), ácido poliláctico, poli(ácido lático‐co‐glicólico), poli(orto ésteres), poli(2‐oxazolina), poli(ácido sebácico), poli(tereftalato‐co‐fosfato) e seus copolímeros. 11) “NANOCOMPLEXO MICELAR”, de acordo com a reivindicação 8 caracterizado por referido polímero hidrofílico ser um polissacarídeo. 12) “NANOCOMPLEXO MICELAR”, de acordo com a reivindicação 8 caracterizado por referido polímero hidrofílico ser um polissacarídeo selecionado a partir do grupo que consiste de ácido hialurônico, dextrano, pululano, quitosana, celulose, amilose, amido, gelatina, carrageeenano, ciclodextrina, sulfato de dextrano, Fucoll, gelana, goma guar, pectina, polissacarose, pululano, escleroglucano, xantana, xiloglucano e alginato. 13) “NANOCOMPLEXO MICELAR”, de acordo com a reivindicações precedentes caracterizado por referido flavonoide ser selecionado do grupo que consiste de flavanas, isoflavonas, flavanos, proantocianidinas e antocianidinas. 14) “NANOCOMPLEXO MICELAR”, de acordo com a reivindicação 13 caracterizado por referidas flavanas serem selecionadas a partir do grupo que consiste de (‐)‐ epicatequina, (+)‐epicatequina, (‐)‐ catequina, (+)‐catequina, epicatequina galato, epigalocatequina, epigalocatequina galato, Fisetinidol, Galocatequina, Galocatequina galato, Mesquitol e Robinetinidol, elagitanina, galotanina, olongteanina, florotanina, tanina, teacitrina, teadibenzotropolona, teaflavina, teanadtoquinona, tearubiginas, teasinensinae e suas misturas. 15) “NANOCOMPLEXO MICELAR”, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes caracterizado por referido agente ser um agente terapêutico. 16) “NANOCOMPLEXO MICELAR”, de acordo com qualquer uma das reivindicações
3 / 9 precedentes caracterizado por referido agente terapêutico ser um agente quimioterapêutico selecionado do grupo que consiste de agentes alquilantes, antraciclinas, ruptores ditoesqueletais, epotilonas, inibidores de histona deacetilase, inibidores de topoisomerase I, inibidores de topoisomerase II, inibidores de quinase, anticorpos monoclonais, conjugados anticorpo‐medicamento, análogos de nucleotida, análogos precursores, antibióticos de peptídeo, antibióticos de peptídeo, agentes baseados em platina, retinoides, alcaloides de vinca, citoquinas, antimetabólitos e derivados de alcaloides de vinca e outros citotóxicos. 17) “NANOCOMPLEXO MICELAR”, de acordo com a reivindicação 16 caracterizado por referido agente quimioterapêutico ser selecionado do grupo que consiste de Actinomicina, Afatinib, ácido retinoico totalmente trans, Axitinib, Azacitidina, Azatioprina, Bevacizumab, Bleomicina, Bosutinib, Bortezomib, Carboplatina, Capecitabina, Cetuximab, Cisplatina, Clorambucil, Crizotinib, Ciclophosfamida, Citarabina, Dasatinib, Daunorrubicina, Docetaxel, Doxifluridina, Doxorrabicina, Epirrubicina, Epotilona A (C26H39NO6S), Epotilona B (C27H41NO6S), Epotilona C (C26H39NO5S), Epotilona D (C27H41NO5S), Epotilona E (C26H39NO7S), Epotilona F (C27H41NO7S), Erlotinib, Etoposida, Fluorouracil, Fostamatinib, Gefitinib, Gemcitabina, Hidroxiureia, Idarabicin, Imatinib, Irinotecan, Lapatinib, Lenvatinib, Mecloretamina, Mercaptopurina, Metotrexato, Mitoxantrona, Nilotinib, Oxaliplatina, Paclitaxel, Panitumumab, Pazopanib, Pegaptanib, Pemetrexed, Ranibizumab, Regorafenib, Ruxolitinib, Sorafenib, Sunitinib, Trastuzumab, Teniposida, Tioguanina, Tofacitinib, Topotecan, Valrrubicin, Vemurafenib, Vinblastina, Vincristina, Vindesina, Vinorrelbina. 18) “NANOCOMPLEXO MICELAR”, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes caracterizado por referido nanocomplexo micelar ter um tamanho na faixa de 30 a 300 nm, de 50 a 300 nm, de 100 a 300 nm, de 30 a 50 nm, de 30 a 100 nm, de 30 a 150 nm, de 150 a 300 nm, de 200 a 300 nm, de 250 a 300 nm, de 100 a 150 nm, de 100 a 200 nm, de 100 a 250 nm, de 130 a 180 nm, ou de 130 a 250 nm. 19) “NANOCOMPLEXO MICELAR”, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes caracterizado por eficiência de carregamento do referido agente presente
4 / 9 dentro da referida micela ser maior do que 30%, maior do que 35%, maior do que 40%, maior do que 45%, maior do que 50%, maior do que 55%, maior do que 60%, maior do que 65%, maior do que 70%, maior do que 75%, ou 80%. 20) “NANOCOMPLEXO MICELAR”, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes caracterizado por teor de carregamento do referido agente presente dentro da referida micela está na faixa de 1 a 10 p/p%, de 5 a 25 p/p%, de 20 a 45 p/p%, de 30 a 50 p/p%, de 35 a 50 p/p%, de 40 a 50 p/p%, de 45 a 50 p/p%, de 30 a 35 p/p%, de 30 a 40 p/p% ou de 30 a 45 p/p%. 21) “MÉTODO DE FORMAÇÃO DE UM NANOCOMPLEXO MICELAR”, caracterizado por compreender uma micela e um agente encapsulado dentro da referida micela, sendo que o método compreende as etapas de: a. adicionar o referido agente em um solvente adequado a um conjugado polímero‐ flavonoide, em que o referido polímero seja ligado ao anel B do referido flavonoide; e b. permitir a auto‐montagem de uma micela que compreende o referido conjugado polímero‐flavonoide e o encapsulamento do referido agente dentro da referida micela para assim formar o referido nanocomplexo micelar. 22) “MÉTODO DE FORMAÇÃO DE UM NANOCOMPLEXO MICELAR”, de acordo com a reivindicação 21 caracterizado por etapa (a) compreender ainda as etapas de: a. remover o referido solvente para formar um filme seco do referido agente e do referido conjugado polímero‐flavonoide; e b. hidratar o referido filme seco com um solvente aquoso. 23) “MÉTODO DE FORMAÇÃO DE UM NANOCOMPLEXO MICELAR”, de acordo com a reivindicação 21 ou 22 caracterizado compreender ainda a etapa de isolar o nanocomplexo micelar formado por filtração. 24) “MÉTODO DE FORMAÇÃO DE UM NANOCOMPLEXO MICELAR”, de acordo com a reivindicação 21 caracterizado por etapa (a) compreender ainda a etapa de diálise do agente em um solvente adequado. 25) “CONJUGADO POLÍMERO‐FLAVONOIDE”, caracterizado por compreender um polímero ligado ao anel B de um flavonoide. 26) “CONJUGADO POLÍMERO‐FLAVONOIDE”, de acordo com a reivindicação 25
5 / 9 caracterizado por referido polímero ser selecionado a partir do grupo que consiste de um polissacarídeo, poliacrilamida, poli(N‐isopropilacrilamida), poli(oxazolina), polietilenimina, poli(ácido acrílico), polimetacrilato, poli(etileno glicol), poli(óxido de etileno), poli(álcool vinílico), poli(vinilpirrolidinona), poliéteres, poli(alilamina), polianidridos, poli(β‐amino éster), poli(butileno succinato), policaprolactona, policarbonato, polidioxanona, poli(glicerol), ácido poliglicólico, poli(3‐ácido hidroxipropiônico), poli(2‐hidroxietil metacrilato), poli(N‐(2‐ hidroxipropil)metacrilamida), ácido poliláctico, poli(ácido lático‐co‐glicólico), poli(orto ésteres), poli(2‐oxazolina), poli(ácido sebácico), poli(tereftalato‐co‐fosfato) e seus copolímeros. 27) “CONJUGADO POLÍMERO‐FLAVONOIDE”, de acordo com a reivindicações 25 a 26 caracterizado por referido flavonoide ser selecionado a partir do grupo que consiste de (‐)‐epicatequina, (+)‐epicatequina, (‐)‐ catequina, (+)‐catequina, epicatequina galato, epigalocatequina, epigalocatequina galato, Fisetinidol, Galocatequina, Galocatequina galato, Mesquitol e Robinetinidol, elagitanina, galotanina, olongteanina, florotanina, tanina, teacitrina, teadibenzotropolona, teaflavina, teanadtoquinona, tearubiginas, teasinensinae e suas misturas. 28) “CONJUGADO POLÍMERO‐FLAVONOIDE”, de acordo com qualquer uma das reivindicações 25 a 27 caracterizado por referido polímero ser conjugado a um flavonoide no conjugado polímero‐flavonoide por meio de um ligante selecionado do grupo que consiste de um grupo de tioéter, imina, amina, azo e 1,2,3‐triazol. 29) “CONJUGADO POLÍMERO‐FLAVONOIDE”, de acordo com qualquer uma das reivindicações 25 a 28 caracterizado por referido polímero ser poli(etileno glicol), sendo o referido flavonoide epigalocatequina‐3‐galato e o sendo o referido ligante tioéter. 30) “CONJUGADO POLÍMERO‐FLAVONOIDE”, de acordo com a reivindicação 29 caracterizado por referido conjugado ter a fórmula a seguir [Quím. 2]
6 / 9
‐ Em que n está na faixa de 20 a 910. 31) “MÉTODO PARA FORMAR O CONJUGADO POLÍMERO‐FLAVONOIDE”, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 25 a 30 caracterizado por compreender a etapa de conjugação do referido flavonoide com o referido polímero por meio de adição nucleofílica sob condições básicas, em que o referido polímero tem um grupo nucleofílico livre. 32) “MÉTODO PARA FORMAR O CONJUGADO POLÍMERO‐FLAVONOIDE”, de acordo com reivindicação de 31 caracterizado por referida etapa de conjugação ser realizada em um tempo de reação entre 1 e 24 horas. 33) MÉTODO PARA FORMAR O CONJUGADO POLÍMERO‐FLAVONOIDE”, de acordo com reivindicações de 31 e 32 caracterizado por compreender ainda a etapa de conduzir a etapa de conjugação em um solvente que impeça substancialmente a agregação do referido flavonoide. 34) MÉTODO PARA FORMAR O CONJUGADO POLÍMERO‐FLAVONOIDE”, de acordo com reivindicação de 31 a 33 caracterizado por compreender ainda a etapa de adicionar um agente de limpeza para impedir a oxidação mediada por H2O2 do referido grupo nucleofílico para aumentar assim a eficiência da referida etapa de conjugação. 35) MÉTODO PARA FORMAR O CONJUGADO POLÍMERO‐FLAVONOIDE”, de acordo com reivindicação de 31 a 34 caracterizado por referidas condições básicas estar na faixa de pH de mais de 7 a 10. 36) MÉTODO PARA FORMAR O CONJUGADO POLÍMERO‐FLAVONOIDE”, de acordo com reivindicações de 28 a 31 caracterizado por referido grupo nucleofílico ser selecionado do grupo que consiste de um tiol, uma amina, um diazoalcano e uma azida. 37) “USO DE UM NANOCOMPLEXO MICELAR”, caracterizado por compreender uma micela e um agente encapsulado dentro da referida micela como um veículo de entrega de medicamento, em que a referida micela compreende um conjugado polímero‐flavonoide, e em que o referido polímero é ligado ao anel B do referido
7 / 9 flavonoide. 38) “USO DE UM NANOCOMPLEXO MICELAR”, de acordo com a reivindicação 37 caracterizado por nanocomplexo micelar entrega o agente encapsulado a um local de tumor alvo in vivo. 39) “MÉTODO DE TRATAMENTO DE UM TUMOR”, caracterizado por compreender a etapa de administrar o nanocomplexo micelar de qualquer uma das reivindicações de 1 a 24 a um paciente com câncer. 40) “MÉTODO DE TRATAMENTO DE UM TUMOR”, de acordo com a reivindicação 39 caracterizado por referido nanocomplexo micelar ser administrado parenteralmente, por administração de borrifo de inalação, tópica, retal, nasal, bucal, vaginal, por meio de um reservatório implantado, por injeção, subdérmica, intraperitoneal, transmucosal, oral ou em uma preparação oftálmica. 41) “MÉTODO DE TRATAMENTO DE UM TUMOR”, de acordo com a reivindicação 40 caracterizado por referida administração parenteral compreende as vias subcutânea, intracutânea, intravenosa, intramuscular, intra‐articular, intra‐arterial, intrassinovial, intraesternal, intratecal, intralesional e injeção intracraniana ou técnicas de infusão. 42) “MÉTODO DE TRATAMENTO DE UM TUMOR”, de acordo com a reivindicações de 39 a 41 caracterizado por agente presente no referido nanocomplexo micelar ser administrado a uma dose de 1 a 80 mg/kg por dia. 43) “MÉTODO DE TRATAMENTO DE UM TUMOR”, de acordo com a reivindicações de 39 a 41 caracterizado por referido paciente com câncer sofrer de um câncer selecionado do grupo que consiste de carcinoma adrenocortical, linfoma relacionado a AIDS, câncer anal, câncer de apêndice, astrocitoma de grau I (anaplásico), astricutina de grau II, astricutina de grau III, astricutina de grau IV, tumor teratoide/rabdoide atípico do sistema nervoso central, carcinoma celular basal, câncer de bexiga, câncer bronquial, carcinoma bronquioalveolar, linfoma de Burkitt, câncer cervical, câncer de cólon, câncer colorretal, craniofaringioma, linfoma de célula T cutâneo, câncer endometrial, câncer endometrial uterino, ependimoblastoma, ependimoma, câncer esofageal, estesioneuroblastoma, sarcoma de Ewing, tumor de célula de germe
8 / 9 extracraniano, tumor celular de germe extragonadal, câncer de duto biliar extra‐ hepático, histiocitoma fibroso, câncer da vesícula biliar, câncer gástrico, tumor carcinoide gastrintestinal, tumor estromal gastrintestinal, tumor trofoblástico gestacional, tumor trofoblástico gestacional, glioma, câncer de cabeça e epscoço, câncer cardíaco, câncer hepatocelular, colangiocarcinoma de Hilar, linfoma de Hodgkin, câncer hipofaringeal, melanoma intraocular, tumor de célula de ilhota, sarcoma de Kaposi, histocitose de célula de Langerhans, câncer da laringe, câncer labial, linfoma, macroglobulinemia, histiocitoma fibroso maligno, meduloblastoma, meduloepitelioma, melanoma, carcinoma de células de Merkel, mesotelioma, neoplasia endócrina, mieloma múltiplo, micose fungoide, mielodisplasia, neoplasias mielodisplásicas/mieloproliferativas, distúrbios mieloproliferativos, câncer da cavidade nasal, câncer nasofaringeal, neuroblastoma, linfoma não de Hodgkin, câncer oral, câncer orofaríngeo, osteossarcoma, carcinoma e eliminação de célula do ovário, câncer epitelial ovariano, tumor de células de germes ovarianas, papilomatose, câncer do seio paranasal, câncer da paratiróide, câncer peniano, câncer de faringe, tumor parenquimal pineal, pineoblastoma, tumor pituitário, neoplasia celular plasmática, blastoma pleuropulmonar, linfoma do sistema nervoso central primário, câncer de próstata, câncer retal, câncer de células renais, câncer do trato respiratório com alterações no cromossonmo 15, retinoblastoma, rabdomiossarcoma, câncer das glândulas salivares, síndrome de Sezary, câncer do intestino delgado, sarcoma de tecido macio, carcinoma de célula escamosa, câncer de pescoço escamoso, tumor neuroectodérmico primitivo supratentorial, tumor neuroectodérmico primitivo supratentorial, câncer testicular, câncer de garganta, carcinoma tímico, timoma, câncer de tiróide, câncer da pélvis renal, câncer uretral, sarcoma uterino, câncer vaginal, câncer vulvar, macroglobulinemia de Waldenstrom e tumor de Wilms. 44) “NANOCOMPLEXO MICELAR”, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 24 caracterizado por tratar um tumor. 45) “USO DO NANOCOMPLEXO MICELAR”, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 24 caracterizado por fabricação de um medicamento para o tratamento de um tumor.
FIG. 1 104 106 102 108 1/14
1.6
1.4 202 FIG. 2 1.2 204 1
0.8 Petição 870160066193, de 09/11/2016, pág. 142/164
0.6 Absorsância
0.4
0.2 0 200 250 300 350 400 450 500 Comprimento de onda [nm]
FIG. 3
302 2/14
Absorsância [a.u.]
Petição 870160066193, de 09/11/2016, pág. 143/164 304
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Tempo de retenção [min]
Tempo de reação [h] 7 6 100
80
60
40
20
0
Grau de conjugação [%] FIG. 4
Petição 870160066193, de 09/11/2016, pág. 145/164 FIG. 5
1.00
7.0
0.50
6.5
0.84
6.0
0.51
0.47
5.5
5.0
4.5
4.0
2.71
1.59
549.07
48.24
5.73
3.5
3.34
4.32
0.23
0.23
3.0
2.05
0.78 ppm 4/14
FIG. 6
FIG. 7A FIG. 7B
200 30
25 150 20 6/14
100 15
10
Tamanho [nm] 50
Potencial zeta [mV] 5
0 0 1:1 0,5:1 1:1 0,5:1
Petição 870160066193, de 09/11/2016, pág. 147/164 PEG-EGCG: Doxorrubicina (p/p) PEG-EGCG: Doxorrubicina (p/p)
702 704
FIG. 8A FIG. 8B Eficiência de carregamento [%]
Teor de carregamento [%] 100 60
80 50 40 60 30 40 20 20 10 0 0 1:1 0.5:1 1:1 0.5:1 PEG-EGCG: Doxorrubicina (p/p) PEG-EGCG: Doxorrubicina (p/p)
FIG. 9
14 Liberação cumulativa [%]
12 10 8 6 4 2 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8
Tempo [d]
FIG. 10
FIG. 11A FIG. 11B 300 0.6 250 0.5 200 0.4 150 0.3
PDI 100 0.2 Tamanho [nm] 50 0.1 0 0 9/14 0 2 4 6 8 10 12 14 16 0 2 4 6 8 10 12 14 16 PEG-EGCG:SU (p/p) PEG-EGCG:SU (p/p) FIG. 11C 10 8 SU/PEG-mEGCG MNCs 6 SU/PEG-dEGCG MNCs Petição 870160066193, de 09/11/2016, pág. 150/164 4 2 Potencial zeta [mV] 0 0 2 4 6 8 10 12 14 16 PEG-EGCG:SU (p/p)
FIG. 12A
100 Eficiência de carregamento [%]
80
60
40
20
0 0 2 4 6 8 10 12 14 16
PEG-EGCG:SU (p/p)
FIG. 12B 60 Teor de carregamento [%]
50
40
30
20
10
0 0 2 4 6 8 10 12 14 16 PEG-EGCG:SU (p/p)
SU/PEG-mEGCG MNCs SU/PEG-dEGCG MNCs
FIG. 13A FIG. 13B
120 120 Liberação de SU [%]
Liberação de SU [%] 100 100
80 80 PEG-EGCG:SU 1 60 60 2 4 40 40 8 16 20 20
0 0 2 4 6 0 2 4 6 Tempo [h] Tempo [h]
FIG. 14 Peso Corporal
22 SU/PEG-mEGCG 16:1 SU/PEG-mEGCG 8:1 SU/PEG-dEGCG 8:1 SU isolado (oral) 20 Sem tratamento Peso Corporal [g]
18
16 Fim do tratamento
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
Semanas após o Tratamento
FIG. 15A Tamanho do Tumor
1e+10 SU/PEG-mEGCG 16:1 SU/PEG-mEGCG 8:1 SU/PEG-dEGCG 8:1 1e+9 SU isolado (oral) Sem tratamento ** 1e+8 * 12/14
1e+7
1e+6
Sinal Luminescente [fótons/s] Fim do tratamento
Petição 870160066193, de 09/11/2016, pág. 153/164 1e+5 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
Semanas após o Tratamento
*P<0.01; **P < 0.005
SU/PEG- SU/PEG- SU/PEG- mEGCG mEGCG dEGCG 16:1 8:1 8:1 Oral Sem tratamento
FIG. 15B Dia 14
Alto Dia 28 5
4 13/14
Dia 42 3 6 x 10 2 Dia 56 1
Petição 870160066193, de 09/11/2016, pág. 154/164 Baixo Dia 70
Dia 84
Peso Corporal
FIG. 16 22
21
20 Peso Corporal [g]
19
18 SU/PEG-mEGCG 8:1 (SU 15mg/kg) 17 SU 15mg/kg SU 40mg/kg 16 Controle Fim do tratamento 15 0 10 20 30 40 50 60 70 Dias após o Tratamento
FIG. 17 Tamanho do Tumor
1600 SU/PEG-mEGCG 8:1 (SU 15mg/kg) 1400 SU 15mg/kg SU 40mg/kg Volume do tumor [mm³]
1200 Controle
1000
800
600
400
200 Fim do tratamento
0 0 10 20 30 40 50 60 70 Dias após o Tratamento
*P<0.05; **P < 0.001
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