CN113368080B - 稳定的、生物粘附的、扩散限制性团聚体 - Google Patents

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Abstract

本申请提供了纳米颗粒组装(NPA)团聚体，所述团聚体的纳米颗粒各自包含疏水性核心和从疏水性核心延伸的多个亲水性聚合物链。亲水性链包含在纳米颗粒组装到团聚体中时能够彼此非共价相互作用的末端官能团。本申请还提供了用于形成团聚体的方法，可逆地转换团聚体的生理学状态的方法，瞬时激活团聚体的大分子摄取的方法，以及将团聚体施用于个体的方法。

Description

稳定的、生物粘附的、扩散限制性团聚体
相关申请引用
本专利申请要求2020年2月25日提交的美国临时专利申请62/981,310号的优先权，通过援引加入方式将其内容并入本申请，用于所有目的。
背景技术
在设计者生物材料基质中细胞的三维(3D)培养提供了仿生细胞微环境，并且可以提供组织培养塑料上的常规二维培养无法获得的对于细胞行为的重要理解(Wade&Burdick,15Mater.Today 454(2012)；Hussey,Dziki,&Badylak,3Nat.Rev.Mater.159(2018))。水凝胶广泛用作支持3D细胞培养物的3D聚合物基质(Rosales&Anseth,1Nat.Rev.Mater.15012(2016)；Lutolf,8 Nat.Mater.451(2009)；Seliktar,336 Science1124(2012)；Zhang&Khademhosseini,356Science eaaf3627(2017))。然而，水凝胶的高度水合且可渗透网络不能建立通常存在于细胞内部和外部的集中的大分子空间异质性。细胞内空间特别是大分子高度拥挤，并且含有不同的无膜液体子隔室，它们基本上是液相分离的团聚体(图1)。同时，细胞外团聚体，例如在神经突触连接中发现的那些团聚体，对于细胞功能(例如神经元通讯)也是至关重要的(Zeng et al.,166 Cell 1163(2016)；Feng,Chen,Zeng,&Zhang,57 Curr.Opin.Neurobiol.1(2019))。这些团聚体隔室可形成异质多相结构，例如具有不同液相的多层核心-外壳亚结构(Feric et al.,165 Cell 1686(2016)；Jainet al.,164Cell 487(2016))和液泡化形态(Schmidt&Rohatgi,16 Cell reports 1228(2016)；Kistler et al.,7 elife e37949(2018))，因此潜在地定位和分离不同组的生物过程，而不依赖于膜边界来调节细胞功能(Shin&Brangwynne,357 Science eaaf4382(2017))。因此，体外开发合成型团聚体不仅可以为天然存在的团聚体的复杂性提供新的见解，而且有助于探索团聚体的潜在应用，例如定制分离的大分子环境，以时空控制的方式调节细胞行为。
大量先前工作已经证明了通过静电驱动的具有相反电荷的复合聚电解质的流体-流体相分离能体外制备合成的复合团聚体(图2)(Koga,Williams,Perriman,&Mann,3Nat.Chem.720(2011)；Aumiller&Keating,8 Nat.Chem.129(2016)；Mandla,Davenport,Huyer,&Radisic,2 APL bioengineering 021503(2018)；Martin et al.,58Angew.Chem.Int.Ed.14594(2019)；Lu&Spruijt,142 J.Am.Chem.Soc.2905(2020))。这些复合团聚体通常表现出同质形态，并且可用作简化的非生物相分离系统，以包封不同的大分子(Jeon,Wolfson,&Alsberg,27 Adv.Mater.2216(2015)；McTigue&Perry,15Soft matter3089(2019)；Blocher,McTigue,&Perry,Small 1907671(2020))，并增强生化反应(Love etal.,59Angew.Chem.Int.Ed.5950(2020)；Drobot et al.,9Nat.Commun.1(2018)；Gobbo etal.,11 Nat.Commun.1(2020))。然而，在这种合成团聚体中的大分子集中体会不可避免地经历与周围稀溶液的快速扩散交换，从而甚至在几个小时内不能分离团聚体相内的加载大分子(Jia,Hentrich,&Szostak,44 Orig.Life Evol.Biosph.1(2014)；Aumiller Jr.,Cakmak,Davis,&Keating,32 Langmuir 10042(2016)；Wei et al.,9 Nat.Chem.1118(2017)；Long,Johnson,Jeffries,Hara,&Wang,J.Control.Release 73(2017))。除了上述合成复合团聚体的简单同质形态之外，具有异质多相结构的团聚体(例如液泡化团聚体)可以提供大分子扩散屏障，并将大分子隔离到封闭的内部液泡中，从而更好地控制大分子的时空定位。因为团聚体中的液泡在接触时倾向于合并或直接从液体团聚体中排除(Yin etal.,7Nat.Commun.10658(2016)；Banerjee,Milin,Moosa,Onuchic,&Deniz,129Angew.Chem.11512(2017))，因此有研究展示了具有亚稳态液泡的合成复合团聚体，其在生理条件下可作为稳定的细胞3D微环境起作用。
发明概述
本申请大体上涉及纳米颗粒组装(NPA)团聚体，例如，液泡化纳米颗粒组装团聚体，这样的团聚体在使用时能提供多种有利的改进。例如，其有益于团聚体隔室(例如，团聚体内的团聚体微滴或液泡)具有高度的尺寸同质性和长期稳定性，并且在生理条件下具有很小的合并性。还有利于团聚体隔室限制大分子与周围液相的扩散交换，从而建立时空上的大分子异质性，并精确地控制液泡内包封的细胞的行为。还有助于团聚体隔室的大分子扩散屏障特性，能够通过外部刺激可逆地开启和关闭。通过带相反电荷的电解质的复合形成合成团聚体的常规方法通常不能产生具有上述以及其它重要属性的团聚体。
为了解决上述挑战，本申请的发明人现在已经发现了通过非共价键合驱动的具有不同组成的核心-外壳纳米颗粒的原位自组装来制造液泡化团聚体或团聚体微滴的不同方法。纳米颗粒组装的团聚体的液泡或微滴隔室在生理条件下表现出优异的抗合并性(图2)。与常规的复合团聚体隔室相比，稳定的NPA团聚体隔室进一步显示出显著更低的尺寸多分散性。此外，本申请提供的NPA团聚体可以通过机械搅拌将大分子隔离入液泡或微滴隔室，同时在静止条件下还能限制大分子与外部液相交换长达数天。然而，在转变为水凝胶状态时，对大分子扩散的这种限制几乎立即被消除。重要的是，NPA团聚体可以形成具有受控的大分子时空分布异质性的液体3D微隔室，可用于调节细胞行为，并且因此可以调节包封在这种大分子集中物中的细胞的不同功能。
在一个方面，本申请涉及团聚体群体，每个团聚体包含纳米颗粒的组装体。每个纳米颗粒包含疏水性核心和从疏水性核心延伸的多个亲水性链。每个亲水性链包含末端官能团。团聚体还包含至少一部分末端官能团之间的非共价相互作用。在一个相关的方面，本申请提供了一种组合物，其包含如上文和本申请其他部分所述的团聚体群体以及生理学上可接受的赋形剂。
在另一方面，本申请涉及形成团聚体群体的方法。该方法包括提供聚合物群体。每个聚合物包含亲水性聚合物链。每个亲水性聚合物链包含末端官能团。该方法还包括通过聚合物的自组装制造纳米颗粒群体。所制造的纳米颗粒中每个包含疏水性核心和从疏水性核心延伸的多个亲水性链。该方法还包括通过至少一部分末端官能团之间的非共价相互作用形成团聚体群体。
在另一个方面，本申请涉及可逆地切换团聚体群体的生理学状态的方法。该方法包括提供如本申请所公开的团聚体群体，其中团聚体具有第一生理学状态。该方法还包括将团聚体的温度改变到超过上限临界溶解温度，从而将团聚体的生理学状态从第一生理学状态转换到第二生理学状态。
在另一方面，本申请涉及将团聚体群体从隔室化状态(例如液泡化液体或微滴状态)转变为水凝胶状态的方法。所述方法包括提供如本申请所公开的团聚体群体，其中所述团聚体具有液泡化的液体状态。该方法还包括使团聚体与诸如Ti4+钛离子的金属离子接触，从而使团聚体转变成水凝胶状态。
在另一个方面，本申请涉及瞬时激活团聚体群体对大分子的摄取的方法。该方法包括提供如本申请所公开的团聚体群体。该方法还包括在包含大分子的溶液(例如缓冲液)中搅拌团聚体，从而增加团聚体的摄取效率并激活团聚体对大分子的摄取。该方法还包括停止对团聚体的搅拌，从而提高团聚体的屏障效率。
在另一个方面，本申请涉及将团聚体群体粘附在个体体内的方法。该方法包括提供如本申请所公开的团聚体群体，其中末端官能团包含儿茶酚。该方法还包括对个体施用团聚体，从而将团聚体粘附在个体体内。
在另一方面，本申请涉及向有需要的个体递送化合物的方法。所述方法包括提供如本申请所公开的团聚体群体，其中所述团聚体包封治疗有效量的化合物。该方法还包括对个体施用团聚体，从而递送化合物。
在另一方面，本申请涉及治疗炎性肠病的方法。所述方法包括提供如本申请所公开的团聚体群体，其中所述团聚体包封治疗有效量的用于治疗炎性肠病的化合物，并且其中所述末端官能团包含儿茶酚。该方法还包括将团聚体施用于个体，从而将团聚体的至少一部分粘附于个体并递送化合物。
附图简要说明
下面参考附图详细描述本申请的内容。
图1显示了在活细胞内部和外部存在的无膜团聚体，常常表现出多相亚结构，例如多层核和液泡化胚颗粒。
图2显示了通过聚合物物质复合的常规方法形成同质复合团聚体，以及通过本申请提供的聚合物纳米颗粒的自组装方法形成液泡化团聚体。
图3显示了带有表面儿茶酚基团的核心-外壳纳米颗粒的形成。
图4显示了DLS分析结果图，证实成功合成了所要制备的核心-外壳纳米颗粒。
图5显示了带有表面儿茶酚基团的核心-外壳纳米颗粒在室温下对去离子水透析24小时，从而诱导核心-外壳纳米颗粒的自组装并通过流体-流体相分离产生密相纳米颗粒组装(NPA)团聚体。
图6显示了没有表面儿茶酚基团的阴性对照纳米颗粒不能形成团聚体。
图7显示了NPA团聚体的热响应流变性质的图。
图8显示了通过调节温度可逆地形成液泡化NPA团聚体的照片，标尺：100μm。
图9显示了在生理缓冲条件下NPA团聚体中液泡随时间的直径变化。
图10显示了在酸性或生理缓冲条件下，在37℃，NPA团聚体中液泡随时间的直径变化的不同路径的图。
图11显示了图10的NPA团聚体中的稳定化液泡在210分钟(pH7.4)时具有46.2μm的平均直径和低尺寸多分散性。
图12显示了本申请提供的NPA团聚体的抗合并特性的照片，标尺：50μm。
图13显示了包含自组装核心-外壳纳米颗粒的液泡化NPA团聚体的结构的TEM和SAXS数据，标尺：100nm。
图14显示了液泡化NPA团聚体的抗合并特性的机制，包括由于在生理条件下儿茶酚-醌氧化引起的表面儿茶酚基团之间减少氢键结合并增加共价交联密度。
图15显示了在静止和机械搅拌条件下，NPA团聚体基质内大分子向液泡中不同的摄取。NPA团聚体基质可以通过短暂的机械搅拌被瞬时破坏，以在完全恢复原始液泡化结构之前将大分子加载到内部液泡中。机械搅拌诱导大分子摄取进入内部液泡，而NPA团聚体基质限制大分子扩散。
图16显示了具有不同pI的不同蛋白质在NPA团聚体中的分布的荧光图像，以及沿着穿过液泡绘制的虚线的相应荧光强度谱，标尺：50μm。
图17中的共焦荧光和显微图像显示非蛋白质大分子在液泡化NPA团聚体中的隔离。共焦图像的3D重建证实液泡完全封闭在用红色荧光标记的NPA(H1)团聚体基质中(xy和yz平面)。显微镜图像显示了在1天后不同分子量的预先加载葡聚糖-FITC在NPA(H1)团聚体中的分布，标尺：50μm。
图18显示了在本申请提供的团聚体隔室群体中BSA的三维空间分布的荧光图像。
图19显示了共焦荧光图像和相应的强度谱图，证实了在静态下BSA从稀溶液(BSA-德克萨斯红)和液泡(BSA-FITC)两者向团聚体基质的扩散受到限制。BSA-德克萨斯红从稀溶液通过NPA团聚体基质渗透到液泡中受到更大限制。将来自团聚体基质(C)与液泡(V)中渗入的BSA-德克萨斯红的平均荧光强度(MFI)之间的比率定量为屏障效率(BE)，其中BE＝[团聚体中的MFI(IC)]/[液泡中的MFI(IV)]。屏障效率(BE)表明，在第1天，渗入的BSA-德克萨斯红在NPA(H1)团聚体基质中的浓度是液泡内部的28倍以上。
图20显示不同葡聚糖-FITC和BSA的包封效率之间没有显著差异。
图21显示了1天后，在NPA团聚体外部检测到的葡聚糖释放分数，以及NPA团聚体的液泡、PEG二丙烯酸酯水凝胶和聚丙烯酰胺(PAAM)水凝胶中预先加载的BSA释放分数。
图22显示用十八烷基(C18)基团替换核心-外壳纳米颗粒的疏水性核心。
图23显示NPA(H2)团聚体的流变行为，表明团聚体表现出水凝胶-团聚体转变行为。
图24显示了在1×PBS中于37℃温育第1天后，具有不同分子量(10,20和40kDa)的葡聚糖-FITC可以成功地加载和隔离在NPA(H2)团聚体的内部液泡中。
图25示出了用热响应H3(PNIPAM)疏水性核心代替核心-外壳纳米颗粒的疏水性核心。
图26显示了在37℃下在1X PBS中孵育后，葡聚糖-FITC(10kDa)可以成功地加载和隔离在NPA(H3)团聚体的内部液泡中。
图27显示尽管在FBS培养基中培养1天，但是在包封过程中预先悬浮在PBS中的Hela细胞死亡，这是因为在培养过程中缺乏预先加载的营养物以及培养基FBS限制流入团聚体，标尺：25μm。
图28显示在包封过程中预先悬浮在FBS培养基中的Hela细胞的活力，这是由于在细胞包封过程中在团聚体中预先加载的FBS，标尺：25μm。
图29显示在轻轻混合细胞悬浮液后Hela细胞充分包封在液泡化NPA团聚体中，标尺：100μm。
图30显示通过在静态下产生LIF屏障或在机械搅拌状态下产生LIF富集环境，对ESC的多能性进行时间调节。
图31显示了证实小鼠ESC多能状态差异的免疫荧光染色图像，因此表明外层NPA团聚体在培养基中构建了对补充的LIF的完美屏障，并通过在机械搅拌下将LIF隔离入液泡来维持ESC的多能性，标尺：20μm。
图32显示在5天的细胞培养条件下，图28的NPA团聚体的流变性质。
图33显示证实小鼠ESC的多能状态差异的qRT-PCR结果，因此表明液泡化的NPA团聚体在静态下构建了对LIF的屏障，并通过在机械搅拌状态下集中LIF而保持ESC的多能性，**p<0.01(ANOVA)。
图34显示用于在相同的基础培养基池中诱导包封巨噬细胞的不同极化的团聚体介导的空间大分子异质性：分别用M1和M2诱导因子预先加载用字母模式“U”和“K”标记的团聚体，“C”和“H”团聚体没有任何诱导因子。
图35显示的免疫荧光染色图像揭示了在以不同团聚体字母模式包封的巨噬细胞中M1(iNOS)/M2(Arg-1)标志物的差异表达，标尺：20μm。
图36显示在以不同团聚体字母模式包封的巨噬细胞中M2(Arg-1)和M1(iNOS)标志物的差异表达的qPCR结果，***p<0.001(ANOVA)。
图37显示通过添加Ti4+的团聚体-水凝胶转变：在pH7.4下，液泡化的NPA团聚体转化成通过Ti4+-儿茶酚配位稳定的自愈合NPA/Ti水凝胶。
图38显示NPA/Ti水凝胶的频率依赖性存储(G’)和损耗(G”)模数。
图39显示证实NPA/Ti水凝胶的优异自愈合能力的剪切稀化测试的结果。
图40显示NPA/Ti水凝胶由于强儿茶酚-Ti4+配位键和组装纳米颗粒的疏水性烷基核心的组合而不可溶胀。
图41的图像证明团聚体-水凝胶转变破坏液泡化形态，以产生同质NPA/Ti水凝胶，证据体现为FITC和德克萨斯红标记的BSA两者的同质分布，标尺：20μm。
图42的荧光图像(IVIS)显示在口服灌胃后，NPA团聚体(用Cy7标签修饰)在胃肠道的停留时间大大长于NPA-苯基团聚体。
图43证明本申请提供的NPA团聚体在体外表现出预先加载的Dex-P的延长释放。相反，由于高度可渗透的结构，具有与NPA团聚体类似的固体内容物的常规PEG水凝胶在4小时后几乎释放80％的预先加载的Dex-P。
图44显示经口灌胃后大鼠血浆中Dex浓度。Dex-P/NPA团聚体组显示血浆Dex浓度的爆发增加比游离Dex-P组低。
图45显示与具有相似固体内容物的高渗透性PEG水凝胶相比，NPA团聚体的缩合疏水环境促进了宽范围的水溶性小分子药物的持续释放。
图46显示与通过聚阴离子和聚阳离子之间的静电相互作用稳定的常规pH和盐依赖性复合物团聚体相比，本申请提供的非复合NPA团聚体。
图47显示，在胃肠蠕动的驱动下，流体NPA团聚体可通过儿茶酚介导的湿生物粘附而有效地扩散以包被和粘附在肠表面大片区域。
图48显示液体样(G’<G”)NPA团聚体(用Fast Green FCF染色)可通过21G针注射并在2天后在宽pH范围的缓冲液中保持稳定的照片。
图49显示非复合NPA团聚体表现出盐析效应，证实NPA团聚体的形成应该归因于氢键结合诱导的纳米颗粒组装，而不是静电相互作用。
图50显示了NPA团聚体可以将两条猪皮肤组织粘合在一起并保持组织重量的照片。
图51的一系列照片显示流体NPA团聚体包被可以粘附到新鲜和湿润的粘膜上，缓慢向下流动，标尺：15mm。
图52显示了分别在37℃下、在模拟胃液(Ga)和模拟肠液(In)中浸润2小时后，流体NPA团聚体可以保持稳定的照片。
图53显示了使用DSS诱导性结肠炎的大鼠模型实验的大体程序，其中SD大鼠在饮用水中被给予4.5％DSS以诱导急性结肠炎。
图54显示了图53的实验的时间进程，其中，在第1、3和5天，结肠炎大鼠接受加载Dex-P的NPA团聚体(Dex-P/NPA)或等量的配制于PBS中的Dex-P(Dex-P/PBS)的口服灌胃。将未处理的结肠炎SD大鼠用作阴性对照(对照)。在第7天处死所有SD大鼠。
图55显示了来自图53和54的实验的照片结果，显示与未处理的结肠炎SD大鼠(对照)和接受配制于PBS中的Dex-P(Dex-P/PBS)的结肠炎SD大鼠的结肠水肿和腹泻相比，接受Dex-P/NPA的SD大鼠中由DSS诱导的结肠炎引起的结肠水肿和腹泻显著减轻，标尺：10mm。
图56是来自图53-55的实验结果图，进一步显示，与未处理的结肠炎SD大鼠(对照)和接受配制于PBS中的Dex-P(Dex-P/PBS)的结肠炎SD大鼠相比，接受Dex-P/NPA的SD大鼠中由DSS诱导的结肠炎引起的结肠水肿和腹泻显著减轻。
图57显示了H&E染色的代表性图像，表明在来自图53-56的实验中接受Dex-P/NPA的结肠炎SD大鼠中组织学炎症减轻，而在未处理的结肠炎SD大鼠(对照)或接受Dex-P/PBS的结肠炎SD大鼠中观察到组织学损伤，标尺：150μm。
图58显示了来自图53-57的实验的MPO活性，数据表示为平均值±SD，*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001(ANOVA)。
图59显示了来自图53-58的实验的紧密连接相关蛋白(包括ZO-1和occludin-1)的mRNA水平，数据表示为平均值±SD，*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001(ANOVA)。
图60显示Dex-P/NPA处理增加了粪便样品中的细菌丰度，粪便样品是在第5天从随机选择的结肠炎SD大鼠收集的并通过测序16S rRNA基因的V4区来分析肠道微生物群。
图61显示了Dex-P/PBS组、未处理的结肠炎大鼠(对照)、Dex-P/NPA组的结肠炎SD大鼠中的Chao多样性和香农多样性的比较。
图62显示了肠微生物β-多样性的聚类热图，说明接受Dex-P/NPA的结肠炎SD大鼠和健康SD大鼠更紧密地聚类，提示更相似的细菌组成。
图63显示了基于家族水平的肠道微生物群的相对丰度的分类学细菌分布。
图64表示图63的基于家族水平的肠道微生物群的相对丰度的聚类热图。上部纵向聚类表明个体SD大鼠中肠道微生物群的相似性。较近的距离和较短的分支长度表示SD大鼠之间较相似的肠道微生物群。数据表示为平均值±SD，*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001(ANOVA)。
图65显示了本申请的核心-外壳纳米颗粒的设计以及示例性的各种组分。
图66显示了本申请的示例性NPA团聚体实现的机械力触发的BSA释放。
发明详细描述
团聚体(Coacervate)
本申请的一个方面公开了团聚体群体。在本申请中，术语“团聚体”是指经由液-液相分离形成的富含有机物的聚合物集中的并且水不混溶性液相，并且由例如具有不同疏水性和亲水性或具有相反离子电荷的分子的结合产生。因此，团聚体可以在较大和较稀的液相中以更致密的基质、层或液滴的形式存在。这种致密的团聚体基质可以是例如水凝胶。另外，术语“团聚体隔室”是指在致密基质内的进一步的液-液细分区，其产生团聚体内部的隔室并且具有不同的(例如更为液体的)性质。因此，这种隔室的形成可导致被称为“液泡化团聚体”、“团聚体微滴”等的结构。所提供群体中的团聚体各自包含纳米颗粒的组装体。在本申请中，术语“纳米颗粒”是指尺寸在纳米范围内的任何颗粒。例如，纳米颗粒可具有小于1微米(1000nm)或大于1nm的直径。
团聚体的纳米颗粒(例如，至少一部分纳米颗粒、大部分纳米颗粒或所有纳米颗粒)中每个包含疏水性核心和多个亲水性聚合物链。在本申请中，术语“聚合性”和“聚合物”是指由彼此共价连接的多个重复结构单元(单体单元)组成的有机物质。
在一些实施方案中，每个纳米颗粒包含两亲性聚合物，其中每个纳米颗粒的疏水性核心包含两亲性聚合物的疏水区段，并且每个纳米颗粒的亲水聚合物链包含两亲性聚合物的亲水区段。在某些实施方案中，两亲性聚合物的疏水区段包含烷基基团，例如长链烷基基团。在本申请中，术语“烷基”是指直链或支链的饱和脂族基团。在某些实施方案中，两亲性聚合物的疏水区段包含丙烯酰胺基团。疏水区段可以包含例如聚(N-异丙基丙烯酰胺)。在一些实施方案中，纳米颗粒不包含两亲性聚合物，并且每个纳米颗粒的疏水性核心包含可包含例如烷基和/或丙烯酰胺区段的疏水聚合物。
在一些实施方案中，每个纳米颗粒的疏水性核心包含无机材料。在某些实施方案中，无机材料包含含金纳米颗粒。在某些实施方案中，无机材料包含含铁纳米颗粒，例如氧化铁纳米颗粒，例如磁铁矿纳米颗粒或磁赤铁矿纳米颗粒。在某些实施方案中，无机材料包含含二氧化硅的纳米颗粒。疏水性核心可以包含一种类型的无机材料。疏水性核心可包含两种或更多种无机材料。疏水性核心可以由一种、两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、十种或超过十种无机材料组成。
纳米颗粒的亲水性聚合物链形成围绕团聚体的每个纳米颗粒的疏水性核心的亲水性外壳。在一些实施方案中，每个纳米颗粒的亲水性聚合物链包含聚醚。在某些实施方案中，聚醚包含聚乙二醇。
亲水性聚合物链(例如，至少一部分亲水性聚合物链、大部分亲水性聚合物链或所有亲水性聚合物链)中的每个包含末端官能团。因此，末端官能团展示在每个团聚体的纳米颗粒的亲水性外壳的表面上。可以选择末端官能团以提供非共价相互作用，从而在团聚体的形成中驱动核心-外壳纳米颗粒的组装。
在一些实施方案中，末端官能团包含芳基。在本申请中，术语“芳基”是指具有任何合适数目的环原子和任何合适数目的环的芳族环体系。芳基可包含任何合适数目的环原子，例如6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16个环原子，以及6至10、6至12或6至14个环成员。芳基可以是单环的、或稠合以形成双环或三环基团，或通过键连接以形成联芳基。代表性的芳基包含苯基、萘基和联苯基。其它芳基包含具有亚甲基连接基团的苄基。一些芳基具有6至12个环成员，例如苯基、萘基或联苯基。其它芳基具有6至10个环成员，例如苯基或萘基。一些其它芳基具有6个环成员，例如苯基。芳基可以是取代的或未取代的。
芳基可任选地被任何合适数目和类型的取代基取代。代表性的取代基包含但不限于卤素、卤代烷基、卤代烷氧基，-OR’、＝O、-OC(O)R’、-(O)R’、-O2R’、-ONR’R”、-OC(O)NR’R”、＝NR’、＝N-OR’、-NR’R”、-NR”C(O)R’、-NR’-(O)NR”R”’、-NR”C(O)OR’、-NH-(NH2)＝NH、-NR’C(NH2)＝NH、-NH-(NH2)＝NR’、-SR’、-S(O)R’、-S(O)2R’、-S(O)2NR’R”、-NR’S(O)2R”、-N3和-NO2。R’、R”和R”’各自独立地是指氢或未取代的烷基，例如未取代的C1-6烷基。或者，R’和R”，或R”和R”’，当与同一个氮原子连接时，与它们所连接的氮原子结合形成杂环烷基或杂芳基环。
在某些实施方案中，末端官能团包含苯基。在一些实施方案中，末端官能团包含羟基化芳基。在某些实施方案中，羟基化芳基包含二羟基苯。二羟基苯可以包含例如儿茶酚。在一些实施方案中，亲水性聚合物链包含儿茶酚接枝的聚乙二醇。
团聚体还包含至少一部分末端官能团之间的非共价相互作用。非共价相互作用可负责将本申请公开的纳米颗粒的组装体形成团聚体。在某些实施方案中，非共价相互作用包含氢键。在某些实施方案中，非共价相互作用包含π-π相互作用。在某些实施方案中，非共价相互作用包含静电相互作用。在某些实施方案中，非共价相互作用包含阳离子-π相互作用。至少一部分末端官能团之间的非共价相互作用可包含一种类型的非共价相互作用或多种类型的非共价相互作用。在一些实施方案中，非共价相互作用包含亲水性聚合物链的苯基末端基团之间的π-π相互作用。在一些实施方案中，非共价相互作用包含亲水性聚合物链的儿茶酚末端基团之间的氢键。
团聚体的纳米颗粒的平均流体动力学半径可以是，例如1nm-900nm，例如1nm-59nm、2nm-117nm、4nm-231nm、8nm-456nm，或15nm-900nm。在一些实施方案中，平均纳米颗粒半径为30nm-300nm，例如30nm-192nm，57nm-219nm，84nm-246nm，111nm-273nm，或138nm-300nm。就上限而言，平均纳米颗粒半径可以小于900nm，例如小于456nm，小于273nm，小于246nm，小于219nm，小于192nm，小于165nm，小于138nm，小于111nm，小于84nm，小于57nm，小于30nm，小于15nm，小于8nm，小于4nm，或小于2nm。就下限而言，平均纳米颗粒半径可以大于1nm，例如大于2nm，大于4nm，大于8nm，大于15nm，大于30nm，大于57nm，大于84nm，大于111nm，大于138nm，大于165nm，大于192nm，大于219nm，大于246nm，大于273nm，或大于456nm。也考虑更大半径，例如大于900nm，以及更小半径，例如小于1nm。
在一些实施方案中，当团聚体的温度超过上限临界溶解温度时，团聚体在隔室化(例如液泡化液体或微滴)的状态和水凝胶状态之间可逆地转变。当温度降低到超过上限临界溶解温度时，团聚体可以从液泡化液体状态转变成水凝胶状态。当温度升高到超过上限临界溶解温度时，团聚体可以从水凝胶状态转变成液泡化液体状态。上限临界溶解温度可以是例如2℃至40℃，例如2℃至24.8℃，5.8℃至28.6℃，9.6℃至32.4℃，13.4℃至36.2℃，或17.2℃至40℃。上限临界溶解温度可以是例如，2℃至20℃，例如，2℃至12.8℃，3.8℃至14.6℃，5.6℃至16.4℃，7.4℃至18.2℃，或9.2℃至20℃。就上限而言，上限临界溶解温度可以小于40℃，例如，小于36.2℃，小于32.4℃，小于28.6℃，小于24.8℃，小于21℃，小于18.2℃，小于16.4℃，小于14.6℃，小于12.8℃，小于11℃，小于9.2℃，小于7.4℃。就下限而言，上限临界溶解温度可以大于2℃，例如大于3.8℃，大于5.6℃，大于7.4℃，大于9.2℃，大于11℃，大于12.8℃，大于14.6℃，大于16.4℃。大于18.2℃，大于21℃，大于24.8℃，大于28.6℃，大于32.4℃，或大于36.2℃。也考虑更高的温度，例如大于40℃，和更低的温度，例如小于2℃。
如上所述，本申请提供的团聚体和团聚体隔室可以证明在普通生理条件下增强的抗合并性的有利性质。这种抗合并性的证据可以在团聚体或液泡的维度中看到，它们的维度在这种条件下不会太显著地扩大。在37℃和pH7.4下储存6小时后，团聚体中所提供的液泡的平均直径可以是，例如，10μm至100μm，例如，10μm至64μm，19μm至73μm，28μm至82μm，37μm至91μm，或46μm至100μm。就上限而言，平均团聚体直径可小于100μm，例如小于91μm、小于82μm、小于73μm、小于64μm、小于55μm、小于46μm、小于37μm、小于28μm或小于19μm。就下限而言，平均团聚体直径可大于10μm，例如大于19μm、大于28μm、大于37μm、大于46μm、大于55μm、大于64μm、大于73μm、大于82μm或大于91μm。也考虑更大直径，例如大于100μm，和更小直径，例如小于10μm。
本申请提供的团聚体和团聚体隔室的另一相关有利性质是它们相对较小的多分散性程度，例如，在促进常规制备的团聚体发生合并的生理条件下储存时。在37℃和pH7.4下储存6小时后，本申请提供的团聚体的直径的标准偏差可以是，例如，4％至40％，例如，4％至25.6％，7.6％至29.2％，11.2％至32.8％，14.8％至36.4％，或18.4％至40％。就上限而言，团聚体直径标准偏差可小于40％，例如小于36.4％，小于32.8％，小于29.2％，小于25.6％，小于22％，小于18.4％，小于14.8％，小于11.2％或小于7.6％。就下限而言，团聚体直径标准偏差可大于4％，例如大于7.6％，大于11.2％，大于14.8％，大于18.4％，大于22％，大于25.6％，大于29.2％，大于32.8％或大于36.4％。还考虑更大的标准偏差，例如大于40％，和更小的标准偏差，例如小于4％。
本申请提供的团聚体的另一有益属性是它们能作为适于产生和/或保护材料(例如大分子)的时空异质性的微隔室。在本申请中，术语“大分子”是指具有高相对分子量的分子，其结构可包含衍生自具有低相对分子量的分子的单元(例如单体和/或低聚物)的多个重复。大分子可以是，例如但不限于，蛋白质，核酸，碳水化合物，脂质，大环或合成聚合物。团聚体的微隔室能力取决于具有足够高的屏障效率的团聚体基质，以最小化或防止液泡和团聚体外部的介质之间的物质交换。在本申请中，术语“屏障效率”是指团聚体外的介质中的分子浓度与团聚体内(例如，液泡化团聚体的液泡内)的分子浓度的比率。例如，可以通过荧光或荧光标记的分子的荧光强度测量容易地测量屏障效率，从而可以从团聚体或液泡外部和内部的体积中分子的平均荧光强度计算屏障效率。
在包含异硫氰酸荧光素缀合的牛血清白蛋白(FITC-BSA)的缓冲液中储存1天时，团聚体相对于FITC-BSA的屏障效率可以是例如5-50，例如5-32，9.5-36.5，14-41，18.5-45.5，或23-50。就上限而言，相对于FITC-BSA的团聚体屏障效率可以小于50，例如小于45.5，小于41，小于36.5，小于32，小于27.5，小于23，小于18.5，小于14或小于9.5。就下限而言，相对于FITC-BSA的团聚体屏障效率可以大于5，例如大于9.5，大于14，大于18.5，大于23，大于27.5，大于32，大于36.5，大于41，或大于45.5。还考虑了更高的屏障效率，例如大于50，和更低的屏障效率，例如小于5。
在包含德克萨斯红缀合的牛血清白蛋白(德克萨斯红-BSA)的缓冲液中储存1天后，团聚体相对于德克萨斯红-BSA的屏障效率可以是例如5至50，例如5至32，9.5至36.5，14至41，18.5至45.5，或23至50。就上限而言，相对于德克萨斯红-BSA的团聚体屏障效率可以小于50，例如小于45.5，小于41，小于36.5，小于32，小于27.5，小于23，小于18.5，小于14或小于9.5。就下限而言，相对于德克萨斯红-BSA的团聚体屏障效率可以大于5，例如大于9.5，大于14，大于18.5，大于23，大于27.5，大于32，大于36.5，大于41，或大于45.5。还考虑了更高的屏障效率，例如大于50，和更低的屏障效率，例如小于5。
在一些情况和应用中，有利的是，本申请提供的团聚体具有足够高的摄取效率，以允许或促进团聚体内部和外部的体积之间的物质交换。在本申请中，术语“摄取效率”是指团聚体内(例如，液泡化团聚体的液泡内)的分子浓度与团聚体外的介质中的分子浓度的比率。摄取效率可以容易地通过例如荧光或荧光标记的分子的荧光强度测量来测量，使得摄取效率可以从团聚体外部和内部的体积中的分子的平均荧光强度来计算。作为进一步的方式或替代方式，摄取效率可以通过观察与分子相关的紫外或可见光的吸光度来测量，使得摄取效率可以从例如在团聚体外部和内部的体积中的分子的(例如特定波长下)平均吸光度值来计算。
在一些实施方案中，本申请提供的团聚体表现出的有利特征在于，在扰动(例如机械搅拌)时具有可被激活(即增加)的摄取效率。在3000rpm下搅拌10秒后，团聚体相对于FITC-BSA的摄取效率可以是例如0.5-5，例如0.5-3.2，0.95-3.65，1.4-4.1，1.85-4.55，或2.3-5。就上限而言，相对于FITC-BSA的团聚体摄取效率可以小于5，例如小于4.55，小于4.1，小于3.65，小于3.2，小于2.75，小于2.3，小于1.85，小于1.4或小于0.95。就下限而言，相对于FITC-BSA的团聚体屏障效率可以大于0.5，例如大于0.95，大于1.4，大于1.85，大于2.3，大于2.75，大于3.2，大于3.65，大于4.1或大于4.55。也考虑了更高的摄取效率，例如大于5，和更低的屏障效率，例如小于0.5。
在3000rpm下搅拌10秒钟后，团聚体相对于BSA的摄取效率可以是例如5％-50％，例如5％-32％、9.5％-36.5％、14％-41％、18.5％-45.5％，或23％-50％。就上限而言，团聚体摄取效率可以小于50％，例如小于45.5％，小于41％，小于36.5％，小于32％，小于27.5％，小于23％，小于18.5％，小于14％或小于9.5％。就下限而言，团聚体摄取效率可以大于5％，例如大于9.5％，大于14％，大于18.5％，大于23％，大于27.5％，大于32％，大于36.5％，大于41％或大于45.5％。也考虑了更高的摄取效率，例如大于50％，和更低的摄取效率，例如小于5％。
团聚体形成方法
本申请的另一方面提供形成团聚体群体的方法。该方法包括提供聚合物群体。本申请提供的聚合物可以是本申请所公开的任意聚合物，并且包含亲水性聚合物链，每个亲水性聚合物链包含末端官能团。
该方法还包括通过聚合物的自组装制造纳米颗粒群体。所制造的纳米颗粒可以是本申请公开的任意纳米颗粒，并且包含疏水性核心和从疏水性核心延伸的多个亲水性聚合物链。在一些实施方案中，每个聚合物是两亲性聚合物，其中所述纳米颗粒的疏水性核心包含所述两亲性聚合物的疏水区段，并且所述纳米颗粒的亲水聚合物链包含所述两亲性聚合物的亲水区段。两亲性聚合物的疏水区段可以是本申请公开的任意疏水区段。在某些实施方案中，疏水区段包含烷基。在一些实施方案中，纳米颗粒的疏水性核心包含无机材料。无机材料可以是本申请公开的任意无机材料。在一些实施方案中，纳米颗粒的亲水性聚合物链包含聚醚。在某些实施方案中，聚醚包含聚乙二醇。在一些实施方案中，亲水性聚合物链的末端官能团包含羟基化芳基。在某些实施方案中，羟基化芳基包含二羟基苯。二羟基苯可以包含例如儿茶酚。在一些实施方案中，亲水性聚合物链包含儿茶酚接枝的聚乙二醇。
该方法还包括通过至少一部分末端官能团之间的非共价相互作用形成团聚体群体。非共价相互作用可以是本申请公开的任意非共价相互作用。在一些实施方案中，形成步骤包括使纳米颗粒群体的悬浮液对水进行透析。透析可以在例如15℃至30℃，例如15℃至24℃，16.5℃至25.5℃，18℃至27℃，19.5℃至28.5℃，或21℃至30℃的温度下进行。就上限而言，透析温度可以小于30℃。例如，小于28.5℃，小于27℃，小于25.5℃，小于24℃，小于22.5℃，小于21℃，小于19.5℃，小于18℃或小于16.5℃。就下限而言，透析温度可以大于15℃，例如大于16.5℃。大于18℃，大于19.5℃，大于21℃，大于22.5℃，大于24℃，大于25.5℃，大于27℃，或大于28.5℃。也考虑更高的温度，例如大于30℃，和更低的温度，例如小于15℃。
透析进行的时间可以为，例如24小时至72小时，例如24小时至52.8小时，例如28.8小时至57.6小时，33.6小时至62.4小时，38.4小时至67.2小时，或43.2小时至72小时。就上限而言，透析时间可以小于72小时，例如，小于67.2小时，小于62.4小时，小于57.6小时，小于52.8小时，小于48小时，小于43.2小时，小于38.4小时，小于33.6小时，或小于28.8小时。就下限而言，透析时间可以大于24小时，例如大于28.8小时，大于33.6小时，大于38.4小时，大于43.2小时，大于48小时，大于52.8小时，大于57.6小时，大于62.4小时或大于67.2小时。也考虑了更长的透析时间，例如大于72小时，和更短的透析时间，例如小于24小时。
使用团聚体控制大分子分布的方法
如上所述，本申请提供的团聚体(例如液泡化团聚体)的一项有益属性是它们能作为适于产生和/或保护材料(例如大分子)的时空异质性的微隔室。在一些实施方案中，液泡化团聚体可用于通过包封一种或多种类型的材料来产生这种异质性。在某些实施方案中，本申请提供的液泡化团聚体包封生物活性化合物或细胞群。在本申请中，术语“生物活性的”是指与未暴露于化合物的生物系统或个体相比，对生物系统或个体具有生理作用的化合物。被包封的细胞群可主要或完全包含一种或一株细胞。包封的细胞群可包含多种或多株细胞。
本申请提供的液泡化团聚体分隔材料的能力依赖于当团聚体处于具有清楚限定的内部和外部体积的液泡化生理学状态时产生的转运屏障。相反，如果团聚体失去它们的液泡化形式并转变成同质的水凝胶生理学状态，则完全或部分地失去这种转运屏障。这种水凝胶状态虽然在建立和保持局部材料浓度方面不太有效，但可用于产生例如能够支持细胞集落的生长和结构的更同质的基质。本申请公开的纳米颗粒组装的团聚体具有在不同外部刺激(例如与金属离子接触、温度变化和/或机械搅拌)存在下能够从这两种生理学状态中的一种转变为另一种的有利特征。
因此，本申请的另一方面提供通过使团聚体与金属离子接触而使团聚体群体从液泡化状态转变成水凝胶状态的方法。该方法可以包括，例如，使液泡化团聚体与钛离子，例如Ti4+，从而使团聚体转变成水凝胶状态。该方法可以包括使液泡化团聚体与铁离子(例如Fe3+)接触。该方法可以包括使液泡化团聚体与铝离子(例如Al3+)接触。该方法可以包括使液泡化团聚体与镍离子(例如Ni2+)接触。该方法可以包括使液泡化团聚体与铜离子(例如Cu2+)接触。该方法可以包括使液泡化团聚体与锌离子(例如Zn2+)接触。该方法可以包括使液泡化团聚体与一种金属离子接触。该方法可以包括使液泡化团聚体与两种或更多种金属离子顺序地或同时地接触。
本申请的另一个方面提供可逆地转换团聚体群体的生理学状态的方法。在某些实施方案中，该方法包括通过改变本申请所公开的团聚体的温度将团聚体物理状态从液泡化液体状态可逆地切换至水凝胶状态以及从水凝胶状态可逆地切换至液泡化液体状态。具体而言，该方法包括使团聚体的温度超过上限临界溶解温度。
本申请的另一个方面提供瞬时激活团聚体群体对大分子的摄取的方法。通过将团聚体生理学状态从具有相对高的屏障效率和低的摄取效率的液泡化液体状态暂时改变为具有相对高的摄取效率和低的屏障效率的水凝胶状态来实现这种摄取激活。通过使用这种方法，例如，当团聚体摄取效率较高时，团聚体可以加载材料，并且当团聚体回到具有较高屏障效率时，团聚体有效地将材料隔室化。该方法包括提供本申请所公开的团聚体群体。该方法还包括在包含大分子的溶液(例如缓冲液)中搅拌团聚体。搅拌增加了液泡化团聚体的摄取效率，并激活了液泡化团聚体对大分子的摄取。搅拌可以例如在3000rpm下进行10秒。该方法还包括停止液泡化团聚体的搅拌，从而提高液泡化团聚体的屏障效率。
例如，层状NPA团聚体基质，例如具有致密疏水性核心和PEG链的组装纳米颗粒的集合，可以充当高度分子聚集的屏障，以在接近平衡的条件下将内部液泡与环境隔离。然后，所施加的机械搅拌可瞬时破坏NPA团聚体基质，并产生大分子被包封到液泡中的机会窗口。
在搅拌时，团聚体相对于大分子的摄取效率增加可以为例如10倍至100倍，例如10倍至64倍，19倍至73倍，28倍至82倍，37倍至91倍，或46倍至100倍。就上限而言，摄取效率增加可小于100倍，例如小于91倍，小于82倍，小于73倍，小于64倍，小于55倍，小于46倍，小于37倍，小于28倍或小于19倍。就下限而言，摄取效率增加可大于10倍，例如大于19倍，大于28倍，大于37倍，大于46倍，大于55倍，大于64倍，大于73倍，大于82倍或大于91倍。也考虑更大的摄取效率增加，例如大于100倍，以及更小的摄取效率增加，例如小于10倍。
搅拌时团聚体相对于大分子的摄取效率增加可以为例如5％-50％，例如5％-32％，9.5％-36.5％，14％-41％，18.5％-45.5％，或23％-50％。就上限而言，摄取效率增加可以小于50％，例如小于45.5％，小于41％，小于36.5％，小于32％，小于27.5％，小于23％，小于18.5％，小于14％或小于9.5％。就下限而言，摄取效率增加可以大于5％，例如大于9.5％，大于14％，大于18.5％，大于23％，大于27.5％，大于32％，大于36.5％，大于41％或大于45.5％。还考虑了更大的摄取效率增加，例如大于50％，以及更小的摄取效率增加，例如小于5％。
递送团聚体的方法
本申请提供的纳米颗粒组装的团聚体在生理条件下的稳定性和多分散性的改善使得团聚体在涉及通过向个体给药来递送团聚体的方法中特别有用。递送可包含使用团聚体(例如液泡化团聚体)作为用于治疗或处理的一种或多种材料(例如治疗剂或检测剂)的递送载体。递送可包含使用团聚体本身作为治疗或处理的活性剂。在本申请中，术语“施用”是指口服施用、作为栓剂施用、局部接触、肠胃外、静脉内、腹膜内、肌内、病灶内、鼻内或皮下施用，或鞘内施用至个体。本申请的团聚体可以通过任何合适的方法递送，包括口服、肠胃外和局部方法。通过局部途径的透皮给药方法可以配制成涂药棒，溶液，悬浮液，乳液，凝胶，霜剂，软膏，糊剂，胶冻，涂剂，粉末和气雾剂。
本申请提供的团聚体可以以任何合适的量施用于个体，取决于多种因素，包含但不限于个体的体重和年龄。本申请团聚体的合适剂量范围包含约0.1mg至约10,000mg，或约1mg至约1000mg，或约10mg至约750mg，或约25mg至约500mg，或约50mg至约250mg。本申请化合物的合适剂量包含约1mg、5mg、10mg、20mg、30mg、40mg、50mg、60mg、70mg、80mg、90mg、100mg、200mg、300mg、400mg、500mg、600mg、700mg、800mg、900mg或1000mg。
本申请提供的团聚体可以以任何合适的频率、间隔和持续时间施用。例如，团聚体可每小时给药一次，或每小时给药两次，三次或更多次，每天给药一次，或每天给药两次，三次或更多次，或每2、3、4、5、6或7天给药一次，以提供优选的剂量水平。当团聚体以高于每天一次的频率给药时，代表性的间隔包含5、10、15、20、30、45和60分钟，以及1、2、4、6、8、10、12、16、20和24小时。团聚体可以施用一次，两次或三次或更多次，持续一小时，持续1至6小时，持续1至12小时，持续1至24小时，持续6至12小时，持续12至24小时，持续一天，持续1至7天，持续一周，持续1至4周，持续一个月，持续1至12个月，持续一年或多年，甚至无限期。
团聚体还可以含有其它相容的治疗剂。本申请提供的团聚体可与已知可用于例如肥胖治疗的其它活性剂组合使用，或与可能不单独有效但可有助于团聚体功效的活性剂组合使用。
本申请提供的团聚体可以与另一种活性剂共同给药。共同给药包含在彼此0.5、1、2、4、6、8、10、12、16、20或24小时内施用团聚体和活性剂。共同给药还包含同时、近似同时(例如，在彼此约1、5、10、15、20或30分钟内)或以任何顺序依次施用团聚体和活性剂。此外，团聚体和活性剂可各自每天给药一次，或每天给药两次，三次或更多次，以提供优选的每天剂量水平。
在一些实施方案中，共同给药可以通过共同配制来实现，即制备包含团聚体和活性剂两者的单一药物组合物。在其它实施方案中，团聚体和活性剂可以单独配制。
本申请提供的团聚体和活性剂可以以任何合适的重量比存在于本申请的组合物中，例如约1：100至约100：1(w/w)，或约1：50至约50：1，或约1：25至约25：1，或约1：10至约10：1，或约1：5至约5：1(w/w)。团聚体和其它活性剂可以以任何合适的重量比存在，例如约1：100(w/w)、1：50、1：25、1：10、1：5、1：4、1：3、1：2、1：1、2：1、3：1、4：1、5：1、10：1、25：1、50：1或100：1(w/w)。团聚体和活性剂的其它剂量和剂量比适用于本申请公开的组合物和方法。
在一些实施方案中，团聚体向个体的靶向递送通过团聚体对个体体内或个体上的一个或多个表面的生物粘附而增强。在本申请中，术语“个体”是指动物，例如哺乳动物，包含但不限于灵长类(例如人)、牛、绵羊、山羊、马、狗、猫、兔、大鼠、小鼠等。在某些实施方案中，个体是人。团聚体的生物粘附可以包含粘附到个体身体上的团聚体的受控的大分子分布。这样的功能难以或不可能通过使用通过带相反电荷的聚合物之间的常规复合方法形成的团聚体来实现。
相比之下，使用选定的化学物质(例如，儿茶酚基团)作为本申请提供的团聚体的纳米颗粒的亲水性聚合物链的末端官能团允许形成具有良好生物粘附性的团聚体。这是因为所选择的末端基团不仅具有纳米颗粒组装和团聚体形成所需要的彼此之间的非共价相互作用，而且还与生物表面结合以产生生物粘附。在某些实施方案中，选择用于提供纳米颗粒组装的团聚体形成和生物粘附的末端官能团包含儿茶酚。在某些实施方案中，选择用于提供纳米颗粒组装的团聚体形成和生物粘附的末端官能团包含一种或多种核碱基，例如腺嘌呤，胸腺嘧啶，胞嘧啶，鸟嘌呤，尿嘧啶，黄嘌呤，次黄嘌呤，嘌呤，2,6-二氨基嘌呤，6,8-二氨基嘌呤，5-甲基胞嘧啶，假尿苷，二氢尿苷，肌苷，7-甲基鸟苷，黄苷，7-甲基鸟苷，二氢尿嘧啶，羟甲基胞嘧啶，甲基胞苷，其它修饰或人工核碱基，或以上的组合。
因此，本申请的另一方面提供将团聚体群体粘附在个体体内的方法。所述方法包括提供本申请所公开的团聚体群体，其中所述团聚体的纳米颗粒的亲水性聚合物链的末端官能团包含儿茶酚。该方法还包括对个体施用团聚体，从而将团聚体粘附在个体体内。在某些实施方案中，施用的团聚体粘附于个体的胃肠道。在某些实施方案中，施用的团聚体包封生物活性化合物。生物活性化合物可以是本申请公开的任意生物活性化合物。
本申请的另一方面提供向有需要的个体递送化合物(例如治疗化合物)的方法。所述方法包括提供本申请所公开的团聚体群体，其中所述团聚体包封治疗有效量的所述化合物。在某些实施方案中，化合物是本申请所公开的生物活性化合物。该方法还包括对个体施用团聚体，从而递送化合物。
本申请的另一方面提供治疗肥胖的方法。在一些实施方案中，本申请提供的团聚体可粘附于个体(例如患有肥胖的个体)的消化道。一旦粘附，团聚体可以减少个体通过其消化道摄取营养素。因此，本申请提供的肥胖治疗方法包括向有需要的个体施用治疗有效量的本申请所公开的团聚体群体，其中所述团聚体的纳米颗粒的亲水性聚合物链的末端官能团包含儿茶酚。通过施用团聚体，至少一部分团聚体粘附于个体的胃肠道。
本申请的另一个方面提供治疗消化道病症的方法，所述消化道病症例如炎性肠病(IBD)，例如溃疡性结肠炎或克罗恩病。在一些实施方案中，本申请提供的团聚体可粘附于个体(例如患有炎性肠病的个体)的消化道。在一些实施方案中，本申请提供的团聚体可以包封在治疗炎性肠病中有效的一种或多种生物活性化合物，例如药物。因此，团聚体可粘附于个体的消化道，并将一种或多种生物活性化合物(例如以靶向方式)递送至消化道。因此，本申请提供的炎性肠病治疗方法包括提供本申请所公开的团聚体群体，其中所述团聚体包封治疗有效量的用于治疗炎性肠病的化合物，并且其中所述团聚体的纳米颗粒的亲水性聚合物链的末端官能团包含儿茶酚。所述方法还包括将所述团聚体群体施用于有需要的个体。通过施用团聚体，至少一部分团聚体粘附到个体的胃肠道，从而递送化合物。
包含团聚体的组合物
本申请的另一方面提供组合物，其包含本申请所公开的团聚体群体(例如液泡化团聚体)，以及生理学上或药学可接受的载体、稀释剂或赋形剂。在本申请中，术语“组合物”旨在涵盖包含规定量的规定成分的产品，以及直接或间接由规定量的规定成分的组合产生的任何产品。“生理学上/药学可接受的”是指载体、稀释剂或赋形剂必须与制剂组合物的其它成分相容，适于配制的组合物的预期用途，例如，用于施用于活的个体(如人或动物)，并且对接受者无害。
药学可接受的赋形剂是有助于向个体施用团聚体并被个体吸收的物质。适用于本申请的药物赋形剂包含但不限于粘合剂、填充剂、崩解剂、润滑剂、包衣剂、甜味剂、调味剂和着色剂。本领域技术人员能够理解，其它药物赋形剂在本申请中也是可用的。
本申请的组合物可以制备成多种口服、肠胃外和局部剂型。口服制剂包含片剂，丸剂，粉末，糖衣丸，胶囊，液体，锭剂，扁囊剂，凝胶剂，糖浆剂，浆液，混悬剂等，适于患者摄入。本申请的组合物也可以通过注射给药，即静脉内，肌内，皮内，皮下，十二指肠内或腹膜内给药。此外，本申请所述的组合物可以通过吸入给药，例如鼻内给药。另外，本申请的组合物可以透皮给药。本申请的组合物还可以通过眼内，阴道内和直肠内途径给药，包含栓剂，吹入剂，粉剂和气雾剂制剂(例如类固醇吸入剂，参见Rohatagi,35J.Clin.Pharmacol.1187(1995)；Tjwa,75 Ann.Allergy Asthma Immunol.107(1995))).
液体形式制剂包含溶液，悬浮液和乳液，例如水或水/丙二醇溶液。对于肠胃外注射，液体制剂可以配制在聚乙二醇水溶液中。
适于口服使用的水溶液可以通过将团聚体与合适的着色剂、调味剂、稳定剂和增稠剂按需要组合来制备。适于口服使用的水性悬浮液可以通过将团聚体分散在含有以下的水中：粘性材料(例如天然或合成树胶、树脂、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、羟丙基甲基纤维素、海藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、黄蓍胶和阿拉伯树胶)、分散剂或润湿剂(例如天然存在的磷脂(例如卵磷脂)、环氧烷与脂肪酸的缩合产物(例如，聚氧乙烯硬脂酸酯)，环氧乙烷与长链脂肪族酒精的缩合产物(例如十七亚乙基氧基鲸蜡醇)，环氧乙烷与衍生自脂肪酸和己糖醇的偏酯的缩合产物(例如聚氧乙烯山梨糖醇单油酸酯)，或环氧乙烷与衍生自脂肪酸和己糖醇酐的偏酯的缩合产物(例如聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯)。水性悬浮液还可以含有一种或多种防腐剂，例如对羟基苯甲酸乙酯或对羟基苯甲酸正丙酯，一种或多种着色剂，一种或多种调味剂和一种或多种甜味剂，例如蔗糖，阿斯巴甜或糖精。可以针对渗透压调节制剂。
在另一个实施方案中，本申请的组合物可以配制用于肠胃外施用，例如静脉内(IV)施用或施用至体腔或器官内腔中。用于施用的制剂通常包含溶解在药学可接受的载体中的本申请组合物的溶液。可以使用的可接受的介质和溶剂是水和林格氏溶液(一种等渗氯化钠)。此外，无菌不挥发性油可以常规地用作溶剂或悬浮介质。为此目的，可以使用任何温和的不挥发油，包含合成的甘油单酯或甘油二酯。此外，脂肪酸(如油酸)同样可用于注射剂的制备。这些溶液是无菌的并且通常没有不希望的物质。这些制剂可以通过常规熟知的灭菌技术进行灭菌。制剂可以含有近似生理条件所需的药学可接受的辅助物质，例如pH调节剂和缓冲剂，毒性调节剂，例如乙酸钠，氯化钠，氯化钾，氯化钙，乳酸钠等。本申请的组合物在这些制剂中的浓度可以广泛地变化，并且将主要基于流体体积、粘度、体重等，根据所选择的具体给药模式和患者的需要来选择。对于IV给药，制剂可以是无菌可注射制剂，例如无菌可注射水性或油性悬浮液。悬浮液可以根据已知技术使用合适的分散剂或湿润剂和悬浮剂配制。无菌可注射制剂还可以是在无毒的肠胃外可接受的稀释剂或溶剂(例如1,3-丁二醇的溶液)中的无菌可注射溶液或悬浮液。
实施方案
考虑以下实施方案以及各个实施方案和其中的技术特征的所有组合。
实施方案1：一种团聚体群体，每个团聚体包含纳米颗粒的组装体，其中每个纳米颗粒包含疏水性核心和从所述疏水性核心延伸的多个亲水性聚合物链，其中每个所述亲水性聚合物链包含末端官能团，并且其中所述团聚体还包含所述末端官能团的至少一部分之间的非共价相互作用。
实施方案2：根据实施方案1的实施方案，其中每个所述纳米颗粒包含两亲性聚合物，其中所述疏水性核心包含所述两亲性聚合物的疏水区段，并且其中所述亲水聚合物链包含所述两亲性聚合物的亲水区段。
实施方案3：根据实施方案2的实施方案，其中所述疏水区段包含烷基。
实施方案4：根据实施方案1的实施方案，其中所述疏水性核心包含无机材料。
实施方案5：实施方案1-4中任一项的实施方案，其中所述亲水性聚合物链包含聚醚。
实施方案6：根据实施方案5的实施方案，其中聚醚包含聚乙二醇。
实施方案7：实施方案1-6中任一项的实施方案，其中所述末端官能团包含羟基化芳基。
实施方案8：根据实施方案7的实施方案，其中羟基化芳基包含二羟基苯。
实施方案9：根据实施方案8的实施方案，其中二羟基苯包含儿茶酚。
实施方案10：根据实施方案1-9中任一实施方案的实施方案，其中所述亲水性聚合物链包含儿茶酚接枝的聚乙二醇。
实施方案11：根据实施方案1-10中任一实施方案的实施方案，其中所述纳米颗粒具有1nm至900nm的平均流体动力学半径。
实施方案12：根据实施方案1-11中任一实施方案的实施方案，其中当所述团聚体的温度降低到超过上限临界溶解温度时，所述团聚体可逆地从液泡化液体状态转变成水凝胶状态。
实施方案13：根据实施方案12的实施方案，其中所述上限临界溶解温度为2℃-40℃。
实施方案14：根据实施方案1-13中任一实施方案的实施方案，其中所述团聚体内的液泡在37℃和pH 7.4下储存6小时后具有小于100μm的平均直径。
实施方案15：根据实施方案14的实施方案，其中所述液泡在37℃和pH7.4下储存6小时后的直径的标准偏差小于40％。
实施方案16：根据实施方案1-15中任一实施方案的实施方案，其中所述团聚体在包含磺基罗丹明101酰氯缀合的牛血清白蛋白(德克萨斯红-BSA)的缓冲液中储存1天后，所述团聚体相对于德克萨斯红-BSA的屏障效率大于5。
实施方案17：根据实施方案16的实施方案，其中所述团聚体在含有牛血清白蛋白(BSA)的缓冲液中以3000rpm搅拌10秒后，所述团聚体相对于BSA的摄取效率大于5％。
实施方案18：一种形成团聚体群体的方法，所述方法包括：提供聚合物群体，其中每个聚合物包含亲水性聚合物链，并且其中每个亲水性聚合物链包含末端官能团；经由所述聚合物的自组装，装配纳米颗粒群体，其中每个纳米颗粒包含疏水性核心，并且其中每个纳米颗粒还包含从所述疏水性核心延伸的多个亲水性聚合物链；以及通过所述末端官能团中至少一部分之间的非共价相互作用，形成团聚体群体。
实施方案19：根据实施方案18的实施方案，其中每个聚合物是两亲性聚合物，其中疏水性核心包含两亲性聚合物的疏水区段，并且其中亲水聚合物链包含两亲性聚合物的亲水区段。
实施方案20：根据实施方案19的实施方案，其中所述疏水区段包含烷基。
实施方案21：根据实施方案18的实施方案，其中所述疏水性核心包含无机材料。
实施方案22：根据实施方案18-21中任一项的实施方案，其中所述亲水性聚合物链包含聚醚。
实施方案23：根据实施方案22的实施方案，其中聚醚包含聚乙二醇。
实施方案24：根据实施方案18-23中任一项的实施方案，其中所述末端官能团包含羟基化芳基。
实施方案25：根据实施方案24的实施方案，其中所述羟基化芳基包含二羟基苯。
实施方案26：根据实施方案25的实施方案，其中所述二羟基苯包含儿茶酚。
实施方案27：根据实施方案18-26中任一项的实施方案，其中所述亲水性聚合物链包含儿茶酚接枝的聚乙二醇。
实施方案28：根据实施方案18-27中任一实施方案的实施方案，其中所述形成步骤包括使所述纳米颗粒群体的悬浮液对水进行透析。
实施方案29：根据实施方案28的实施方案，其中所述透析在15℃至30℃的温度下进行。
实施方案30：根据实施方案28或29的实施方案，其中所述透析进行少于3天。
实施方案31：根据实施方案18-30中任一项的实施方案，其中所述纳米颗粒群体具有1nm至900nm的平均流体动力学半径。
实施方案32：一种可逆地切换团聚体群体的生理学状态的方法，所述方法包括：提供如实施方案1-17中任一项所述的团聚体群体，其中所述团聚体具有第一生理学状态；以及将所述团聚体的温度改变到超过上限临界溶解温度，从而将所述团聚体的生理学状态从第一生理学状态转换到第二生理学状态。
实施方案33：实施方案32的实施方案，还包括：在所述改变步骤之后，将所述团聚体的温度反向调节到超过上限临界溶解温度，从而使所述团聚体的生理学状态从第二生理学状态回到第一生理学状态。
实施方案34：根据实施方案32或33的实施方案，其中所述第一生理学状态是液泡化液体状态，其中所述改变步骤包括降低温度，并且其中所述第二生理学状态是水凝胶状态。
实施方案35：根据实施方案32或33的实施方案，其中所述第一生理学状态是水凝胶状态，其中所述改变步骤包括升高温度，并且其中所述第二生理学状态是液泡化液体状态。
实施方案36：根据实施方案32-35中任一项的实施方案，其中所述上限临界溶解温度为2℃至40℃。
实施方案37：一种将团聚体群体从液泡化液体状态转变为水凝胶状态的方法，所述方法包括：提供如实施方案1-17中任一项所述的团聚体群体，其中所述团聚体具有液泡化液体状态；和使所述团聚体与诸如Ti4+钛离子的金属离子接触，从而使所述团聚体转变为水凝胶状态。
实施方案38：根据实施方案37的实施方案，其中所提供的团聚体将生物活性化合物或细胞群包封到液泡中。
实施方案39：一种瞬时激活团聚体群体对大分子的摄取的方法，所述方法包括：提供如实施方案1-17中任一项所述的团聚体群体；在包含所述大分子的溶液(例如缓冲液)中搅拌所述团聚体，从而提高所述团聚体的摄取效率并激活所述团聚体对所述大分子的摄取；和停止所述团聚体的搅拌，从而提高所述团聚体的屏障效率。
实施方案40：根据实施方案39的实施方案，其中通过搅拌所述摄取效率增加值大于5％。
实施方案41：根据实施方案39或40的实施方案，所述方法还包括：
将细胞封装到所述团聚体中。
实施方案42：一种将团聚体群体粘附在个体体内的方法，所述方法包括：提供如实施方案1所述的团聚体群体，其中所述末端官能团包含儿茶酚；和对所述个体施用所述团聚体，从而将所述团聚体粘附在所述个体的体内。
实施方案43：根据实施方案42的实施方案，其中所述团聚体粘附于所述个体的胃肠道。
实施方案44：根据实施方案42或43的实施方案，其中所述团聚体包封生物活性化合物。
实施方案45：一种将化合物递送至有需要的个体的方法，所述方法包括：提供实施方案1-17中任一项所述的团聚体群体，其中所述团聚体包封治疗有效量的所述化合物；和将所述团聚体施用于所述个体，从而递送所述化合物。
实施方案46：一种治疗肥胖的方法，所述方法包括：向有需要的个体施用治疗有效量的实施方案1-17中任一项所述的团聚体群体，其中所述末端官能团包含儿茶酚，并且其中所述团聚体粘附于所述个体的胃肠道。
实施方案47：一种治疗炎性肠病的方法，所述方法包括：提供实施方案1-17中任一项所述的团聚体群体，其中所述团聚体包封治疗有效量的用于治疗炎性肠病的化合物，并且其中所述末端官能团包含儿茶酚；和
将所述团聚体施用于所述个体，从而将所述团聚体的至少一部分粘附于所述个体的胃肠道并递送所述化合物。
实施方案48：一种组合物，其包含：如实施方案1-17中任一项所述的团聚体群体；和药学可接受的赋形剂。
实施例
参考以下非限制性实施例，能更好地理解本申请各方面的内容。
实施例1.通过氢键结合形成具有低尺寸多分散性的纳米颗粒组装团聚体
首先通过包含儿茶酚接枝的亲水性PEG和疏水性烷基区段的合成两亲性聚合物的自组装来制造带有表面儿茶酚基团的核心-外壳纳米颗粒(图3和65)。动态光散射(DLS)分析证实了所制备的具有约100nm的流体动力学半径的核心-外壳纳米颗粒的形成(图4)。随后在室温下，核心-外壳纳米颗粒悬浮液相对于去离子(DI)水透析24小时，诱导纳米颗粒的原位组装，形成由流体-流体相分离导致的密相液泡化团聚体(后文称为纳米颗粒组装或NPA团聚体)(图5)。没有表面儿茶酚基团的阴性对照纳米颗粒不能经由流体-流体相分离形成团聚体(图6)。该发现表明，核心-外壳纳米颗粒的表面儿茶酚基团之间的氢键结合对于核心-外壳纳米颗粒的自组装和团聚体的形成是关键的(Ahn,Lee,Israelachvili,&Waite,13Nat.Mater.867(2014))。
流变分析显示NPA团聚体的热响应特性(图7)。在21.7℃下检测到NPA团聚体的最低储存模数(G’)和损耗模数(G”)。虽然储存模数(G’)随温度升高到40℃而增加，但NPA团聚体仍保持液态(G’<G”)。有趣的是，当温度从21.7℃降低到2℃时，液体团聚体变成水凝胶(G’>G”)，从而显示出约6.9℃的上限临界溶解温度(UCST)。与流变行为一致，通过简单地在4℃(水凝胶)和37℃(团聚体)之间调节温度，可以可逆地控制NPA团聚体的形成和团聚体-水凝胶转变(图8)。因此，所制备的NPA团聚体可以方便地在4℃下长时间储存而不会有显著的性能变化。
实施例2.在生理条件下稳定化液泡化纳米颗粒组装团聚体
接下来，发明人通过共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)在37℃下在磷酸盐缓冲盐水(PBS)缓冲液中在生理条件下评价NPA团聚体中的液泡的稳定性(图9)。pH7.4下，NPA团聚体内的液泡直径在最初210分钟内增加(第1和2阶段)，并且在随后的几个小时内几乎保持不变(第3阶段)，因此证明了优异的抗合并性能(图10和12)。稳定的液泡的平均直径为46.2μm，相对标准偏差(RSD)为23.9％(图11)。
发明人进一步研究了液泡的优异的抗合并性能的机理。透射电子显微镜(TEM)数据证实，在液泡化团聚体中存在核心-外壳纳米颗粒(图13)。据信，由圆圈标记的TEM图像中的黑点是组装的核心-外壳纳米颗粒的疏水性烷基核心，而通过儿茶酚介导的氢键结合，与表面儿茶酚基团缀合的亲水性PEG外壳连接疏水性烷基核心以形成稳定的NPA团聚体结构。团聚体的小角X射线散射(SAXS)光谱测量显示宽的相关峰，这应归因于疏水烷基核心的随机分布。以0.21nm-1为峰位，估算疏水烷基核心之间的间距为～30nm，与TEM数据一致。
不受特定理论的束缚，据信在生理条件下儿茶酚-醌氧化逐渐减少NPA团聚体的表面儿茶酚基团之间的氢键结合以限制它们的进一步生长，从而随着时间稳定液泡(Yang,M.Stuart,&Kamperman,43 Chem.Soc.Rev.8271(2014)；Barrett et al.,23Adv.Funct.Mater.1111(2013))(图10和14，第3阶段)。为了检验这一假设，将液泡化团聚体在pH 2缓冲液中孵育，结果能保护儿茶酚基团免于氧化。与发明人的假设一致，在pH 2缓冲液中，液泡继续彼此合并，甚至在几个小时后生长成的更大的液滴(图10和14)。这些发现强烈地表明团聚体的自组装由表面儿茶酚基团驱动。总之，这些结果表明液泡化散体NPA团聚体可以在生理环境下稳定而不膜化，从而提供稳定和隔室化的液体微环境，以模拟天然细胞团聚体来调节细胞功能。
实施例3.静态团聚体对大分子交换的选择性限制
常规复合团聚体的大分子摄取通常由大分子的静电参数控制(McTigue&Perry,15Soft Matter 3089(2019)；Tang,Antognozzi,Vicary,Perriman,&Mann,9 Soft Matter7647(2013))。在没有静电相互作用的情况下，在前述实施例中描述的液泡化NPA团聚体是通过氢键结合组装的核心-外壳纳米颗粒的集合，并且包含致密表面亲水性聚乙二醇(PEG)链的层。因此，发明人推测本申请的NPA团聚体可能具有显著不同的大分子摄取能力和机制(图15)。发明人使用具有在4.7至10.5范围内的增加的等电点(pI)的蛋白质来研究在机械搅拌下液泡化的NPA(H1)散体团聚体的大分子摄取行为(图16)。在pH值高于或低于pI时，蛋白质的表面电荷分别为负或正。与发明人的假设一致，共焦荧光图像证实了机械搅拌仅10秒即可显著增强在生理条件(PBS缓冲液，pH7.4)下所有测试蛋白至液泡中的隔离(图16)。
发明人接下来使用用德克萨斯红或FITC标记的BSA作为模型蛋白，进一步评价周围稀溶液、NPA(H1)团聚体基质(C)和液泡(V)之间的大分子交换(图19)。在静态条件下，周围稀溶液中的德克萨斯红标记的BSA在1天后几乎不渗入NPA团聚体基质中，并且通过机械搅拌预先加载在液泡中的FITC标记的BSA也是一样(图19)。基于荧光强度谱的半定量评价进一步证实了标记的BSA从稀溶液和液泡向团聚体基质的有限扩散(图19)。此外，德克萨斯红标记的BSA通过NPA团聚体基质(C)渗入液泡(V)的程度更为有限(图19)。甚至在1天后，团聚体基质(IC)中德克萨斯红标记的BSA的平均荧光强度(MFI)比液泡(IV)多约28倍。共焦图像的3D重建进一步证实了有限量的渗入BSA在液泡中的主要定位。这些发现表明，NPA团聚体基质在静态状态下可显著限制外部BSA向液泡的扩散。在第1天，BSA扩散的3D成像也证实了BSA的这种不同质空间分布(图18)。发明人接下来通过使用FITC标记的合成聚合物(PEG)或多糖(葡聚糖)作为货物分子来评价NPA团聚体隔离非蛋白质大分子的能力。共焦荧光图像显示，PEG-FITC(5kDa)和葡聚糖-FITC(20kDa)在机械搅拌后主要加载在NPA团聚体的液泡中(图17)。共焦图像的3D重建进一步证实，内部液泡中的葡聚糖-FITC溶液完全被周围的被红色荧光Cy3染料标记的NPA(H1)团聚体基质包围(yz平面，图17)。另外，改变PEG(5、10、20和40kDa)和葡聚糖(10、20和40kDa)的分子量不影响这两种聚合物在NPA团聚体的内部液泡化中的成功加载和大分子隔离(图17)。许多以前的研究报道了由两种水溶性但不相容的组分(如PEG和葡聚糖)组成的水性两相体系(ATPS)(Keating,45Acc.Chem.Res.2114(2012))。尽管本申请的NPA团聚体含有PEG作为亲水组分，但液泡化NPA团聚体隔离不同大分子(而不是仅能隔离葡聚糖)的能力表明NPA团聚体与ATPS不同的组装机理和结构性质。
发明人还评价了NPA(H1)团聚体基质限制预先加载在液泡中的大分子扩散释放的能力。孵育1天后，大多数具有不同分子量(10、20和40kDa)的预先加载葡聚糖-FITC保留在液泡中(图20)。不同葡聚糖-FITC和BSA的包封率之间没有显著差异，进一步表明外部货物大分子加载到NPA团聚体的液泡中是由机械搅拌产生的物理力驱动的，而不是由NPA团聚体基质和不同货物大分子之间的超分子相互作用驱动的。在周围的稀溶液中仅检测到小部分(1-3％)的葡聚糖(图21)。因此，NPA(H1)团聚体至少为大于10kDa葡聚糖的大分子提供了隔离环境。另外，在1天后，少于1％的预先加载BSA从NPA(H1)团聚体释放，而具有类似固体内容物的常规可渗透水凝胶在相同时期内释放10-20％的预先加载BSA(图21)。这些发现表明，液泡化NPA团聚体可以通过限制扩散释放来维持预先加载的大分子的隔离。此外，施加机械搅拌(在3000rpm下涡旋10秒)触发从新鲜缓冲液中孵育的NPA团聚体的预先加载的BSA的短暂爆发释放(12.12±3.316％)(图66)，这是因为当搅拌结束时，在液体NPA团聚体的自愈合再次关闭液泡之前，机械搅拌可以使液泡壁破裂。与来自NPA(H1)团聚体的发现一致，NPA(H2)和(H3)团聚体也可以加载和隔离内部液泡中的大分子(例如葡聚糖)。研究结果表明，基于核心-外壳纳米颗粒原位自组装制备液泡化NPA团聚体的策略可推广到具有不同化学组成的纳米颗粒。
实施例4.机械搅拌激活液泡化团聚体的大分子摄取
发明人接下来研究在机械搅拌下液泡化团聚体的大分子摄取(图15-17)。摄取效率(UE)可以计算为BE的倒数，即，通过将团聚体隔室(In)中的MFI除以周围的MFI(Out)。因此，较大的UE值意味着液泡化团聚体对大分子的更好的摄取效率。机械搅拌10秒显著增强了所有测试大分子向液泡化团聚体的扩散。这些结果表明，在静态条件下，通过机械搅拌可以破坏大分子向液泡化团聚体的受限扩散。在静止条件下，具有疏水性核心和致密PEG链(Keating,45 Acc.Chem.Res.2114(2012))的致密组装的纳米颗粒(Koga,Williams,Perriman,&Man,3 Nat.Chem.720(2011)；Yin et al.,7 Nat.Commun.10658(2016))在液泡化团聚体中产生高度分子拥挤的环境，因此有效地限制了大分子扩散(Zustiak,Nossal,&Sackett,101 Biophys.J.255(2011)；Clague&Phillips,8Phys.Fluids 1720(1996))。所施加的机械力可瞬时破坏液泡化团聚体的结构，并产生通过氢键结合和疏水相互作用由团聚体捕获和集中大分子的机会窗口。细胞产生的大分子的扩散和生物转运对于通过自分泌、旁分泌和内分泌机制调节各种细胞功能是必需的。液泡化NPA团聚体的独特的大分子屏障/富集能力使其成为具有时空分子异质性的理想的3D隔室化细胞微环境，可用于研究在这种受控环境中的细胞发育。
为了进一步验证发明人制备NPA团聚体的策略的机理和通用性，核心-外壳纳米颗粒的疏水性核心被商购十八烷基(C18，H2)基团(图22)或热响应聚(N-异丙基丙烯酰胺)(PNIPAM)代替(参见图65)。通过流体-流体相分离成功地形成了致密的NPA C18液泡化团聚体。NPA C18团聚体的流变分析显示出与NPA团聚体类似的水凝胶-团聚体转变行为(在18.16℃)(图23)。此外，在转换到高于PNIPAM的下限临界溶解温度(LCST,～32℃)的温度时，含有PNIPAM(H3)作为疏水性核心的纳米颗粒也组装成散体NPA(H3)团聚体。研究结果表明，基于核心-外壳纳米颗粒原位自组装制备NPA团聚体用于调节大分子转运的策略可推广到不同化学组成的纳米颗粒。图24-26展示了在对NPA(H1)团聚体进行的类似测试中，NPA(H2)团聚体和NPA(H3)团聚体的实验结果。
实施例5.通过分子异质性调控细胞行为
为了验证3D细胞培养的可行性，通过机械搅拌将液泡化的NPA团聚体与补充胎牛血清(FBS)的培养基混合，以将FBS预先加载到团聚体中。将HeLa细胞用活细胞染料钙黄绿素-AM标记，然后通过分别温和混合细胞悬浮液和团聚体，在有或没有FBS预先加载的情况下封装在液泡化团聚体中(图27和28)。共焦激光扫描显微镜(CLSM)图像证实，细胞被良好地封装在液泡化NPA团聚体中(图29)。随后在静止条件下，在补充有FBS的培养基中培养加载有细胞的液泡化团聚体1天，然后用碘化丙啶对死亡细胞进行红色荧光染色。没有预先加载FBS的液泡化团聚体中的细胞在团聚体中培养1天后几乎全部死亡，这是由于在培养期间培养基FBS被限制流入团聚体(图27)。相反，在具有预先加载FBS的液泡化团聚体中的大多数细胞在团聚体中保持显著存活(大于90％)，因为预先加载FBS阻止细胞饥饿(图28)。在细胞培养条件下长期监测NPA团聚体的流变性质显示团聚体状态(G”>G’)在长达5天内没有变化，尽管两个剪切模数略微增加(图32)。这些发现不仅进一步证实了NPA团聚体限制大分子与外界环境交换的能力，而且证实了NPA团聚体潜在地支持长期3D细胞培养的可行性。
发明人接下来评价NPA团聚体支持包封细胞的大分子补充物依赖性功能的功效。发明人将小鼠胚胎干细胞(mESSC)包封到液泡化NPA团聚体中，团聚体预先加载或不加载白血病抑制因子(LIF)，LIF是维持mESC多能性的必要补充物(Huang,Yan,Ye,Tong,&Ying,32Stem Cells 1149(2014)；Casanova et al.,29 Stem Cells 474(2011))(图30)。没有LIF预先加载的团聚体中的mESC在空白(内–/外–)和补充LIF的培养基(内–/外+)中培养36小时后表现出多能性标志物Oct4的核存在减少(图31)。符号-/+分别表示在团聚体(内)或培养基(外)中LIF的存在和不存在。相比之下，尽管在无LIF的培养基(内+/外-)中培养，但在具有LIF预先加载的团聚体中的mESC保持高水平的核Oct4(图31)。与免疫荧光染色结果一致，定量逆转录聚合酶链反应(qPCR)数据也揭示与两个对照组相比，内+/外-组中的mESC对Oct4和另一多能性标志物Nanog的表达显著较高(图33)。
发明人进一步评价了NPA团聚体在相同培养环境中支持差异性细胞分化的大分子屏障功能。可以分化成M1促炎症或M2促愈合表型的小鼠巨噬细胞被封装在液泡化团聚体中，其进一步图案化为字母“C、U、H和K”，并在基础培养基中培养24小时(图34)(Kang etal.,10Nat.Commun.1696(2019)；Murray&Wynn,11 Nat.Rev.Immunol.723(2011)；Lawrence&Natoli,11 Nat.Rev.Immunol.750(2011))。字母“U”和“K”分别预先加载有M1和M2诱导因子，而字母“C”和“H”没有加载任何因子。针对M1标志物(iNOS)或M2标志物(Arg-1)的免疫荧光染色揭示，“U”和“K”图案的巨噬细胞分别具有最高iNOS和Arg-1表达(图35)。相反，“C”和“H”图案的巨噬细胞既不极化成M1表型也不极化成M2表型。qPCR结果进一步证实，预先加载在“U”和“K”字母中的M1和M2诱导因子不诱导“C”和“H”字母中巨噬细胞的极化(图36)。这些发现表明，液泡化NPA团聚体限制M1/M2诱导因子从加载的字母向外扩散到未加载的字母，尽管它们共享相同的培养基池。换句话说，NPA团聚体可以建立和维持大分子空间异质性，可用于调节普通液体培养环境中的差异性补充物依赖性细胞功能。
实施例6.团聚体-水凝胶转变对大分子渗透性的改变
发明人已经证明了机械搅拌诱导的NPA团聚体对大分子的摄取。团聚体与外部环境的增强的大分子交换也可以通过将NPA团聚体转化成已知具有高渗透性3D网络的水凝胶来实现。团聚体-水凝胶转变在细胞中并不罕见(Shin&Brangwynne,357Science eaaf4382(2017))。例如，由RNA结合蛋白形成的团聚体表现出液体亚稳定性，并且可以转变为由淀粉样蛋白样纤维组成的水凝胶(M.Kato et al.,149 Cell 753(2012)；Murakami et al.,88Neuron 678(2015))。在pH7.4下，添加Ti4+将NPA团聚体转变成通过Ti4+-儿茶酚配位交联的自愈合NPA/Ti水凝胶(图37)。切割的NPA/Ti水凝胶片可以自我愈合成一个完整的水凝胶(中间的NPA/Ti水凝胶被染色以获得更好的可视化)(图37)。流变分析进一步证实成功的团聚体-水凝胶转变。由于Ti4+-儿茶酚配位的动态性质，NPA/Ti水凝胶显示出频率依赖性储存(G’)和损耗(G”)模数，其中G’高于G”(图38)。此外，作为替代方式的高/低剪切负荷揭示了NPA/Ti水凝胶在高剪切下的剪切稀化特性和在转换为低剪切时的立即自愈合(图39)。此外，在团聚体-水凝胶转变后，NPA/Ti水凝胶在PBS缓冲液(37℃)中孵育3天后不显示显著溶胀，这可能是由于强的儿茶酚-Ti4+配位键和组装的纳米颗粒的疏水性烷基核心的组合(图40)。非溶胀的NPA/Ti水凝胶为3D细胞培养提供了稳定的培养微环境(Kamata,Akagi,Kayasuga-Kariya,Chung,&Sakai,343Science 873(2014))。
为了评估团聚体-水凝胶转变之后的大分子扩散，发明人分别在液泡和团聚体基质中预先加载FITC-标记的BSA和德克萨斯红标记的BSA(图41)。在由Ti4+触发的团聚体-水凝胶转变之后，在NPA/Ti水凝胶网络内发现FITC和德克萨斯红标记的BSA蛋白两者的均匀分布。通过MTT测定(作为细胞活力的指标)分析细胞代谢活性证实了这种团聚体-水凝胶转变的细胞相容性。这些发现表明，团聚体-水凝胶转变可以根据需求以细胞相容性方式消除NPA团聚体对大分子扩散的限制。
实施例7.生物粘附性团聚体降低胃肠道营养素摄取
在验证NPA团聚体控制大分子时空分布的能力之后，发明人进一步评价了NPA团聚体介导药物持续释放的功效。灌胃后，NPA团聚体(用Cy7标签修饰)粘附至大鼠的胃肠道(GI)至少48小时，而对照NPA-苯基团聚体显示出更弱的粘附(图42)。因此，NPA团聚体在胃肠道中的延长驻留归因于儿茶酚基团，这增强了NPA团聚体的生物粘附。相反，不含儿茶酚基团的NPA-苯基团聚体显示出弱得多的生物粘附能力。
药物控制释放的缺乏可能导致显著的全身副作用。本申请的NPA团聚体在体外(图43)和体内(图44)条件下都显示了预先加载的地塞米松磷酸钠(Dex-P)(Dex的水溶性前药)的延长释放。在灌服Dex-P水溶液后1小时，大鼠中的Dex血浆浓度达到峰值并迅速降低(游离Dex-P)，而接受灌服加载Dex-P的NPA团聚体的大鼠中的Dex血浆浓度在较低水平保持持续超过24小时(图44)。在两组中施用的Dex-P的总剂量是相同的。因此，本申请提供的NPA团聚体可以介导预先加载的水溶性药物分子的控制和持续释放。
实施例8.使用NPA团聚体介导胃肠道中的持续药物释放
为了证明NPA团聚体介导持续药物释放的多功能性，将用于治疗IBD的其它一线小分子药物，包括抗生素甲硝唑(Metro)，抗炎药5-氨基水杨酸(5-ASA)和免疫调节剂甲氨蝶呤二钠盐(MTX)，封装到NPA团聚体中以研究释放动力学。NPA团聚体显示了这些药物的高包封效率和延长的释放动力学，特别是当与PEG水凝胶的爆发释放动力学相比时(图45)。此外，可以通过冻干制备口服给药所需的干燥的载有药物的NPA团聚体，并且简单地将干燥的载有药物的NPA团聚体加入到模拟胃液或水中可以实现再水合，以形成流体NPA团聚体，该流体NPA团聚体具有与冻干前新鲜制备的载有药物的NPA团聚体类似的各种药物的持续释放动力学。
实施例9.核心-外壳纳米颗粒组装成非复合团聚体以适应苛刻的胃肠道环境
考虑到胃肠道通常经历运动、液体含量和酸度(从胃中的pH 1.5到肠中的pH6.15-7.88)的显著变化(Vass et al.,296 J.Control.Release 162(2019)；Khutoryanskiy,14Nat.Mater.963(2015))，常规的复合团聚体可以容易地被pH/盐变化所破坏(图46)(Love et al.,132Angew.Chem.6006(2020)；Wang&Schlenoff,,47Macromolecules 3108(2014)；Chang et al.,8 Nat.Comm.1(2017))。相反，本申请提供的衍生自纳米颗粒的氢键驱动自组装的水不混溶性、生物粘附性和非复合液体团聚体可更有利地适合用作口服给药的肠包衣制剂(图46)。在胃肠蠕动的驱动下，NPA团聚体可以有效地扩散，包被并粘附在肠表面大片区域，停留时间延长超过2天，能够介导加载药物的持续释放(图47)。
在没有静电相互作用的情况下，本申请提供的NPA团聚体可以是不依赖于pH和盐的。与依赖于pH值的常规复合团聚体相比，NPA团聚体在2天后保持稳定，并且在宽范围的pH条件下不变成单相溶液(图48)。此外，NPA团聚体表现出盐析效应(Yang,Wang,Yang,Shen,&Wu,28 Adv.Matr.7178(2016)；He,Huang,&Wang,28Adv.Funct.Mater.1705069(2018))，剪切模数(G’和G”)和粘度随着盐浓度的增加而增加(图49)。应该注意的是，聚阴离子和聚阳离子之间的静电相互作用随着盐浓度的增加而减弱；因此，0.8-2.0M NaCl的临界盐浓度通常可导致复合团聚体的快速解离(Sing&Perry,16 Soft Matter 2885(2020)；Wang&Schlenoff,47 Macromolecules 3108(2014))。然而，本申请提供的NPA团聚体在5.0M NaCl中保持为粘性液体(G’<G”)，进一步证实非复合NPA团聚体应归因于氢键合诱导的纳米颗粒组装，而不是静电相互作用。
实施例10.生物相容性流体NPA团聚体的抗湿润和抗消化特性
儿茶酚介导的NPA团聚体的湿性生物粘附足够强，能够将两条猪皮肤组织粘合在一起并保持组织重量(图50)。NPA团聚体的粘合能(Gad)估计为～7.07J m-2，类似于先前报道的基于纳米颗粒(约2-10J m-2)(Rose et al.,505Nature 382(2014))和基于聚合物粘合剂的值(Zhao et al.,8 Nat.Comm.2218(2017)；Liu,Tan,&Scherman,130Angew.Chem.8992(2018))。发明人接下来通过使用模拟的离体实验研究胃肠道的物理蠕动和化学环境(胃酸和肠液)对NPA团聚体包被的影响。当沉积在直立的肠粘膜表面上时，流体NPA团聚体可以粘附到新鲜的和湿润的粘膜上，并且在重力的驱动下稳定地向下流动，留下蔓生的粘合剂包被(图51)。将NPA团聚体包被的肠粘膜组织分别在模拟胃液(Ga)或模拟肠液(In)中于37℃浸泡2小时后，粘附的团聚体包被仍然未稀释，并在粘膜表面保持粘附(图52)。
实施例11.加载Dex-P的NPA团聚体在DSS诱导的结肠炎大鼠模型中的增强的治疗 功效
发明人接下来评价了加载Dex-P的NPA团聚体在葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导的结肠炎的大鼠模型中的治疗功效(图53)。体重约250g的SD大鼠在饮用水中给予4.5％DSS持续7天以诱发急性结肠炎。7天后观察结肠炎的临床表现，如严重的直肠出血，水腹泻和结肠水肿。在大鼠中成功地建立结肠炎模型后，结肠炎SD大鼠在第1、3和5天接受加载Dex-P的NPA团聚体(Dex-P/NPA)或等量的配制于PBS中的Dex-P(Dex-P/PBS)的口服灌胃(图54)。将未处理的结肠炎SD大鼠用作阴性对照。在口服灌胃之前和之后，允许所有SD大鼠不受限制地摄取水和标准实验室饮食，并且在第7天处死，用于进一步评价远端结肠的结肠重量和长度、组织学严重性、IBD相关结肠髓过氧化物酶(MPO)活性、紧密连接相关蛋白(ZO-1和occludin-1)和促炎细胞因子(例如白细胞介素IL-1β和肿瘤坏死因子(TNF))的mRNA水平。
发明人的结果证明了Dex-P/NPA治疗DSS诱导的急性结肠炎具有显著治疗功效。加载Dex-P的NPA团聚体显著减轻由DSS诱导的急性结肠炎引起的结肠水肿和腹泻(图55)。较低的结肠重量/长度比进一步证实接受Dex-P/NPA的结肠炎SD大鼠中的减轻的水肿(图56)。与接受配制于PBS中的Dex-P溶液(Dex-P/PBS)的结肠炎SD大鼠相比，Dex-P/NPA处理有效地保护SD大鼠免受DSS诱导的结肠长度缩短。
苏木精和曙红(H&E)染色的代表性图像显示，在接受Dex-P/NPA的结肠炎SD大鼠中组织学炎症显著减少，而在未处理的结肠炎SD大鼠(对照)或用等量的配制于PBS中的Dex-P溶液(Dex-P)处理的大鼠(Dex-P/PBS)中观察到组织学损伤，例如粘膜上皮内衬的完整性受损、绒毛高度和隐窝深度降低、间质性水肿和炎性浸润(图57)。此外，H&E染色的组织切片的组织病理学评分被用于评估结肠组织学损伤的严重程度，由专业病理学人员以盲法进行。与Dex-P/PBS组(平均组织病理学评分1.917)和未处理对照组(平均组织病理学评分3.000)相比，接受Dex-P/NPA的结肠炎SD大鼠的疾病严重程度显著降低(平均组织病理学评分0.500)。Dex-P/PBS组中结肠炎SD大鼠的组织病理学评分与未处理对照组没有显著差异(p＝0.056，图58)。与未处理的对照组相比，接受Dex-P/NPA的结肠炎SD大鼠中的结肠MPO活性也显著降低(图59)(Wilson et al.,9 Nat.Mater.923(2010))。尽管发明人也观察到Dex-P/PBS组中MPO活性由于Dex-P对IBD的治疗活性而降低，但是与这种Dex-P水溶液给药有关的高血清Dex水平表明与严重全身药物暴露有关的并发症的风险增加(图58)。总之，与施用等量的Dex-P水溶液相比，将包封在NPA团聚体中的Dex-P口服递送至结肠炎SD大鼠显示出显著增强的治疗结果。
实施例12.Dex-P/NPA处理调节肠道微生物群的固有免疫应答和恢复
通过对16S核糖体核糖核酸(rRNA)基因的V4区进行测序，分析在第5天从随机选择的结肠炎SD大鼠收集的粪便样品，结果表明，Dex-P/NPA处理确实增加了结肠炎SD大鼠中的细菌丰度(观察到的操作分类单位，OTU)和多样性(Chao和香农指数)(图60和61)。此外，生成β-多样性距离分布的热图，并对具有相似β-多样性的样品进行聚类以反映肠道微生物的相似组成(图62)。与Dex-P/PBS组和未处理对照组中的结肠炎SD大鼠相比，接受Dex-P/NPA的结肠炎SD大鼠与健康SD大鼠的β-多样性更聚类，提示Dex-P/NPA处理可增强结肠炎SD大鼠肠道微生物群的恢复。这进一步通过分类细菌分布直方图和基于家族水平上的肠道微生物群的相对丰度的聚类热图来证实(图63和64)。
总之，本申请提供的实施例证明了对于生理上稳定的NPA团聚体隔室(例如液泡或微滴)的研发，其具有低多分散性以满足形成3D隔室化细胞微环境的严格要求。液泡化NPA团聚体在生理条件下表现出长期的抗合并性，并且可以限制大分子与周围液相的扩散交换。诱导性团聚体水凝胶立即消除NPA团聚体的扩散屏障属性。发明人进一步证明液泡化的NPA团聚体可以控制细胞培养环境中大分子的时空分布，从而调节被包封细胞的多种功能。发明人认为NPA团聚体可以成为细胞/类器官的3D培养和药物递送的新技术平台。
虽然已经详细描述了本申请的各方面内容，但是基于前文的描述、本领域的相关知识和上面结合背景技术和详细描述讨论的参考文献(在此通过援引加入的方式将其全部内容并入本申请)，本领域技术人员能够意识到本申请的实质和范围内的改动。此外，应当理解，本申请的方面和各种实施方案的部分以及所附权利要求中所述的各种特征可以全部或部分地组合或互换。在各种实施方案的前述描述中，本领域技术人员能理解，结合某一实施方案的实施方案可以适当地与其它实施方案结合。此外，本领域普通技术人员能理解，前面的描述仅仅是示例性的，而不以任何方式限制本申请的内容。

Claims (28)

1.一种团聚体(coacervate)群体，每个团聚体包含纳米颗粒的组装体，其中每个纳米颗粒包含疏水性核心和从所述疏水性核心延伸的多个亲水性聚合物链，其中每个所述亲水性聚合物链包含末端官能团，并且其中所述团聚体还包含所述末端官能团的至少一部分之间的非共价相互作用；
其中每个所述纳米颗粒包含两亲性聚合物，其中所述疏水性核心包含所述两亲性聚合物的疏水区段，并且其中所述亲水聚合物链包含所述两亲性聚合物的亲水区段；
其中所述疏水区段为H1、H2或H3，
其中H1为
H2为十八烷基，
H3为PNIPAM；并且
其中所述亲水性聚合物链为儿茶酚接枝的聚乙二醇。
2.如权利要求1所述的团聚体群体，其中所述纳米颗粒具有1nm至900nm的平均流体动力学半径。
3.如权利要求1所述的团聚体群体，其中当所述团聚体的温度降低到超过上限临界溶解温度时，所述团聚体可逆地从液泡化液体状态转变成水凝胶状态。
4.如权利要求3所述的团聚体群体，其中所述上限临界溶解温度为2℃-40℃。
5.如权利要求1所述的团聚体群体，其中所述团聚体内的液泡在37℃和pH 7.4下储存6小时后具有小于100μm的平均直径。
6.如权利要求5所述的团聚体群体，其中所述液泡在37℃和pH7.4下储存6小时后的直径的标准偏差小于40％。
7.如权利要求1所述的团聚体群体，其中所述团聚体在包含磺基罗丹明101酰氯缀合的牛血清白蛋白德克萨斯红-BSA的缓冲液中储存1天后，所述团聚体相对于德克萨斯红-BSA的屏障效率大于5。
8.如权利要求7所述的团聚体群体，其中所述团聚体在含有牛血清白蛋白BSA的缓冲液中以3000rpm搅拌10秒后，所述团聚体相对于BSA的摄取效率大于5％。
9.如权利要求1所述的团聚体群体，其中所述团聚体包封生物活性化合物或细胞群。
10.一种形成团聚体(coacervate)群体的方法，所述方法包括：
提供聚合物群体，其中每个聚合物包含亲水性聚合物链，并且其中每个亲水性聚合物链包含末端官能团；
经由所述聚合物的自组装，装配纳米颗粒群体，其中每个纳米颗粒包含疏水性核心，并且其中每个纳米颗粒还包含从所述疏水性核心延伸的多个亲水性聚合物链；和
通过所述末端官能团中至少一部分之间的非共价相互作用，形成团聚体群体；
其中每个聚合物是两亲性聚合物，其中疏水性核心包含两亲性聚合物的疏水区段，并且其中亲水聚合物链包含两亲性聚合物的亲水区段；
其中所述疏水区段为H1、H2或H3，
其中H1为
H2为十八烷基，
H3为PNIPAM；并且
其中所述亲水性聚合物链为儿茶酚接枝的聚乙二醇。
11.如权利要求10所述的方法，其中所述形成步骤包括使所述纳米颗粒群体的悬浮液对水进行透析。
12.如权利要求11所述的方法，其中所述透析在15℃至30℃的温度下进行。
13.如权利要求11所述的方法，其中所述透析进行少于3天。
14.如权利要求10所述的方法，其中所述纳米颗粒群体具有1nm至900nm的平均流体动力学半径。
15.一种可逆地切换团聚体群体的生理学状态的方法，所述方法包括：
提供权利要求1-9中任一项所述的团聚体群体，其中所述团聚体具有第一生理学状态；和
将所述团聚体的温度改变到超过上限临界溶解温度，从而将所述团聚体的生理学状态从第一生理学状态转换到第二生理学状态。
16.如权利要求15所述的方法，还包括：
在所述改变步骤之后，将所述团聚体的温度反向调节到超过所述上限临界溶解温度，从而使所述团聚体的生理学状态从第二生理学状态回到第一生理学状态。
17.如权利要求15所述的方法，其中所述第一生理学状态是液泡化液体状态，其中所述改变步骤包括降低温度，并且其中所述第二生理学状态是水凝胶状态。
18.如权利要求15所述的方法，其中所述第一生理学状态是水凝胶状态，其中所述改变步骤包括升高温度，并且其中所述第二生理学状态是液泡化液体状态。
19.如权利要求15所述的方法，其中所述上限临界溶解温度为2℃至40℃。
20.一种将团聚体群体从液泡化液体状态转变为水凝胶状态的方法，所述方法包括：
提供权利要求1-9中任一项所述的团聚体群体，其中所述团聚体具有液泡化液体状态；和
使所述团聚体与金属离子接触，从而使所述团聚体转变为水凝胶状态。
21.如权利要求20所述的方法，其中所述金属离子包括Ti4+钛离子。
22.如权利要求20所述的方法，其中所提供的团聚体将生物活性化合物或细胞群包封到液泡中。
23.一种瞬时激活团聚体群体对大分子的摄取的方法，所述方法包括：
提供权利要求1-9中任一项所述的团聚体群体；
在包含所述大分子的溶液中搅拌所述团聚体，从而提高所述团聚体的摄取效率并激活所述团聚体对所述大分子的摄取；和
停止所述团聚体的搅拌，从而提高所述团聚体的屏障效率。
24.如权利要求23所述的方法，其中通过搅拌所述摄取效率增加值大于5％。
25.如权利要求23所述的方法，所述方法还包括：
将细胞封装到所述团聚体中。
26.治疗有效量的权利要求1-9中任一项所述的团聚体群体在制备用于治疗肥胖的药物中的用途，其中所述末端官能团包含儿茶酚。
27.治疗有效量的权利要求1-9中任一项所述的团聚体群体在制备用于治疗炎性肠病的药物中的用途，其中所述团聚体包封治疗有效量的用于治疗炎性肠病的化合物，并且其中所述末端官能团包含儿茶酚。
28.一种组合物，其包含：
权利要求1-9中任一项所述的团聚体群体；和
药学可接受的赋形剂。
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