ES2846901T3 - Cepas Shigella hipervesiculante - Google Patents

Abstract

Una cepa de Shigella que no expresa una enzima HtrB funcional, en la que la cepa de Shigella expresa no más de 4 proteínas entre TolA, TolB, TolQ, TolR y Pal.

Description

DESCRIPCIÓN

Cepas Shigella hipervesiculante

Campo de la invención

La presente invención se encuadra en el campo de la inmunización contra especies Shigella.

Antecedentes en la técnica

Shigella son bacilos anaerobios facultativos no motiles gram negativos que se clasifican en cuatro serogrupos: S. dysenteriae, S. flexneri, S. boydii y S. sonnei. Causan shigelosis (disentería bacilar).

La evidencia de shigelosis clínica es una rectocolitis aguda asociada a fiebre, náusea, anorexia, deshidratación, diarrea mucopurulenta y sanguinolenta, y tenesmo. La disentería causada por Shigella es endémica y provoca millones de episodios de enfermedad en los países en vías de desarrollo. Por ejemplo, según las estimaciones, existen 165 millones de casos de diarrea Shigella al año, 99 % de los cuales se producen en los países en desarrollo afectando a un 69 % de los casos a niños con edades inferiores a los cinco años. La morbilidad y la mortalidad causada por shigelosis son especialmente elevadas en niños en los países en desarrollo.

Los enfoques existentes para la obtención de vacunas contra Shigella han sido revisados en ref.1 y se basan en cepas atenuadas vivas para inmunización oral, sacáridos O conjugados para inyección, proteosomas (vesículas de membrana externa de meningococo con LPS de Shigella unidos) para uso intranasal, complejos invasivos (extractos subcelulares de Shigella que incluyen IpaB, IpaC y LPS) para uso intranasal y complejos proteína nuclear-ribosoma preparados a partir de cepas msbB~ve con LPS desintoxicados. Aunque algunas de estas vacunas han sido eficaces en ensayos de campo, ninguna de ellas protege contra múltiples serotipos de Shigella.

El Ejemplo 11 del documento WO 97/19688 A1 es un ejemplo profético que especula acerca de posibles enfoques para delecionar el gen htrB de cepas de Shigella.

El documento WO 01/25254 A2, las reivindicaciones 28 y 29 desvelan LPS preparados a partir de bacterias msbB o htrB para su uso como un “antagonista de LPS”. Sin embargo, no se muestran mutantes de Shigella htrB. Solo se demostró que eran posibles los mutantes de E. coli, Salmonella y Haemophilus influenzae.

Henry y col., 2001, Res. Microbiol., 155(6):437-446 describe (a) mutantes de Shigella que expresan dominios de traducción de colicinas y g3p que llevan a una mayor producción de OMV; (b) OMV de S. flexneri; (c) procedimientos de cultivo de Shigella.

El objeto de la presente divulgación es proporcionar otros componentes mejorados útiles en la preparación de vacunas contra Shigella, y en particular vacunas que pueden proteger contra múltiples serotipos.

Divulgación

Shigella libera espontáneamente vesículas de la membrana externa durante el crecimiento debido a la presión de turgor de la envoltura celular. Tal como se desvela en la referencia 2, la liberación de las vesículas depende en gran medida de la estructura de la envoltura bacteriana. Los autores de la invención han utilizado una cepa mutante de Shigella en la que se interrumpe un sistema Tol-Pal para alterar la estructura de envoltura. Durante el crecimiento normal, estas cepas mutantes liberan al medio de cultivo grandes cantidades de vesículas que son ricas en proteínas de membrana externa inmunogénica, y dichas vesículas se pueden utilizar por tanto como inmunógenos.

Por tanto, la divulgación proporciona una bacteria Shigella que expresa no más de 4 de las proteínas TolA, TolB, TolQ, TolR y Pal. Por lo tanto, está ausente al menos una proteína del sistema Tol-Pal de cinco proteínas natural, con el resultado de una bacteria que, durante el crecimiento en medio de cultivo, libera mayores cantidades de vesícula de membrana externa al medio que la misma bacteria que expresa las cinco proteínas Tol-Pal. Preferentemente, no se expresa TolR, pero las otras cuatro proteínas se pueden expresar.

La divulgación proporciona también una bacteria Shigella que no expresa una proteína TolR. La invención proporciona también una cepa AtolR de Shigella, como por ejemplo cepa AtolRAgalU.

La divulgación también proporciona una bacteria Shigella que expresa proteínas TolA, TolB, TolQ, TolR y Pal, en la que la proteína TolA, TolQ, ToIR y/o Pal (a) está localizada en la membrana externa o interna de la bacteria y (b) incluye una o más mutaciones en la secuencia de aminoácidos de manera que, en comparación con la misma bacteria sin dichas mutaciones, la bacteria libera una mayor cantidad de vesículas de membrana externa cuando se cultiva en medio de cultivo.

La divulgación también proporciona una bacteria Shigella en la que uno o más componentes de su sistema Tol-Pal tiene una modificación de modo que, durante el crecimiento en medio de cultivo, la bacteria libera una mayor cantidad de vesículas de membrana exterior al medio que la misma bacteria que carece de modificación y que no expresa: (i) un lipopolisacárido de Shigella nativo y/o (ii) una toxina entérica de Shigella.

La divulgación proporciona asimismo un procedimiento para preparar una bacteria Shigella hipervesiculante que comprende la etapa de modificar gen(es) que codifican uno o más componentes de un sistema Tol-Pal de la bacteria de partida, de manera que dicha modificación hace que la bacteria, al crecer en un medio de cultivo, libere mayores cantidades de vesículas de membrana externa al medio que la bacteria de partida, y en la que la modificación implica la mutación de uno o más de los genes tolA, tolB, tolQ, toIR y/o pal de la bacteria de partida. La etapa de mutación puede suprimir el gen. El procedimiento puede implicar también la modificación del gen(es) que codifica(n) una proteína necesaria para la síntesis del lipopolisacárido de la bacteria o una toxina entérica.

La divulgación proporciona asimismo una vesícula aislada o que se puede obtener desde una bacteria de la divulgación. Dichas vesículas son útiles como componentes de vacunas contra Shigella.

La divulgación proporciona asimismo un procedimiento para preparar vesículas de Shigella, que comprende una etapa de separación de las vesículas desde el medio de cultivo que comprende las bacterias de la divulgación, cultivadas en condiciones que permitan la liberación de vesículas al medio por las bacterias. Las vesículas preparadas a través de dicho procedimiento se pueden utilizar como componentes de vacunas contra Shigella.

La divulgación proporciona asimismo un medio de cultivo que comprende bacterias de la divulgación que han sido cultivadas en condiciones que permiten la liberación de vesículas al medio por las bacterias. Las vesículas se pueden purificar desde dicho medio de cultivo.

La divulgación proporciona asimismo una composición que comprende las vesículas que, durante el cultivo de las bacterias de la divulgación, se liberan al medio de cultivo. Dicha composición no comprende ninguna batería viva y/o entera. Dicha composición y/o sus componentes se puede utilizar para la preparación de una vacuna contra Shigella.

La divulgación proporciona asimismo una composición que comprende vesículas, en la que las vesículas están presentes en el filtrado que se puede obtener tras la filtración a través de un filtro de 0,22 pm de un medio de cultivo en el que se ha cultivado la bacteria de la divulgación. Dicha composición y/o sus componentes se puede utilizar para una preparación de vacuna contra Shigella.

La divulgación también proporciona una vesícula de Shigella que incluye una o más (es decir, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59 o 60) de: (a) una proteína que consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 8 a 67; (b) una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos j% de identidad con una de las SEQ ID NO: 8 a 67, en la que j es 50 o más (p.ej. 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99) y/o que comprende un fragmento de al menos n aminoácidos consecutivos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 8 a 67, en la que n es 7 o más (p.ej. 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 o más). Los fragmentos preferentes comprenden un epítopo de una de las SEQ ID NO: 8 a 67. Otros fragmentos preferentes carecen de uno o más aminoácidos (p.ej. 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) desde el término C- y/o uno o más aminoácidos (p.ej. 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) desde el término N de la SEQ ID NO: al mismo tiempo que retiene al menos un epítopo de la SEQ ID NO:. Otros fragmentos omiten uno o más dominios de proteína, p.ej. careciendo de péptido de señal, etc.

Se ha confirmado que 60 proteínas están presentes dentro de las vesículas de la divulgación y que son inmunorreactivas con sueros preparados contra las vesículas. Por tanto, las proteínas individuales se pueden usar como componentes inmunogénicos en forma purificada, separados de las vesículas. Por tanto, la divulgación también proporciona una composición inmunogénica libre de vesículas que comprende una proteína de vesícula que comprende: (a) una o más (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 , 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38 , 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59 o 60) de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO 8 a 67; (b) una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un j% de identidad con una de las SEQ ID NO: 8 a 67, donde j es 50 o más (por ejemplo, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99) y/o que comprende un fragmento de al menos n aminoácidos consecutivos de cualquiera de las SEQ ID NO: 8 a 67, donde n es 7 o más (por ejemplo, 8, 10 , 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 o más). Los fragmentos preferidos comprenden un epítopo de una de las SEQ ID NO: 8 a 67, y los fragmentos más preferidos son fragmentos inmunogénicos. Otros fragmentos preferidos carecen de uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo C-terminal y/o uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo N-terminal de una SEQ ID NO: mientras se conserva al menos un epítopo de la SEQ ID NO:. Otros fragmentos omiten uno o más dominios proteicos, por ejemplo, que carece de un dominio transmembrana, un péptido señal, etc.

La divulgación también proporciona una vesícula de Shigella que incluye uno o más (es decir, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128 o 129) de: (a) una proteína que consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada de las SEQ ID NO: 8 a 136; (b) una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un j% de identidad con una de las SEQ ID NO: 8 a 136, donde j es 50 o más (por ejemplo, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91 , 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99) y / o que comprende un fragmento de al menos n aminoácidos consecutivos de cualquiera de las SEQ ID NO: 8 a 136, donde n es 7 o más (por ejemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 o más). Los fragmentos preferidos comprenden un epítopo de una de las SEQ ID NO: 8 a 136. Otros fragmentos preferidos carecen de uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo C-terminal y / o uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del N-terminal de la SEQ ID NO: conservando al menos un epítopo de la SEQ ID NO:. Otros fragmentos omiten uno o más dominios proteicos, por ejemplo, que carecen de un péptido señal, etc.

Se ha confirmado que 129 proteínas están presentes dentro de las vesículas de la divulgación y que son inmunorreactivas con sueros preparados contra las vesículas. Por tanto, las proteínas individuales se pueden usar como componentes inmunogénicos en forma purificada, separados de las vesículas. Por tanto, la divulgación también proporciona una composición inmunogénica libre de vesículas que comprende una proteína de vesícula que comprende: (a) una o más (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 , 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38 , 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63 ,64 , 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88,89, 90, 91,92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113 , 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128 o 129) de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO 8 a 136; (b) una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un j% de identidad con una de las SEQ ID NO: 8 a 136, donde j es 50 o más (por ejemplo, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99) y/o que comprende un fragmento de al menos n aminoácidos consecutivos de cualquiera de las SEQ ID NO: 8 a 136, donde n es 7 o más (por ejemplo, 8, 10 , 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 o más). Los fragmentos preferidos comprenden un epítopo de una de las SEQ ID NO: 8 a 136, y los fragmentos más preferidos son fragmentos inmunogénicos. Otros fragmentos preferidos carecen de uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo C-terminal y/o uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo N-terminal de una SEQ ID NO: conservando al menos un epítopo de la SEQ ID NO:. Otros fragmentos omiten uno o más dominios proteicos, por ejemplo, que carecen de un dominio transmembrana, un péptido señal, etc.

Dentro de las SEQ ID NO: 8 a 136, un subgrupo preferente en relación con S.flexneri es el de las SEQ ID NO: enumeradas en "Subgrupo 1” en la Tabla 1. Dentro de las SEQ ID NO: 8 a 136, un subgrupo preferente en relación con sonnei es el de las SEQ ID NO: enumeradas en el “Subgrupo 2” en la Tabla 1.

El sistema Tol-Pal

Al igual que muchas bacterias gram-negativas, Shigella posee de forma natural un sistema Tol-Pal que se compone de las proteínas TolA, TolB, TolQ, TolR y Pal. De acuerdo con la divulgación, el sistema Tol-Pal natural se interrumpe causando así que la bacteria libere una mayor cantidad de vesículas de membrana externa en su medio de cultivo durante la replicación bacteriana. Se pueden realizar varias interrupciones.

En algunas divulgaciones, se retira al menos una de las cinco proteínas Tol-Pal, p.ej. por deleción o inactivación del gen que codifica la proteína. Por lo tanto, la bacteria puede expresar 0, 1, 2, 3 o 4 de las proteínas TolA, TolB, TolQ, TolR y Pal. La eliminación de una de las cinco proteínas puede ser suficiente, en cuyo caso la bacteria expresa solamente 4 de dichas proteínas. Preferentemente, se elimina la proteína TolR, p.ej. por inactivación del gen toIR de la cepa de partida. Por lo tanto, la bacteria puede ser toIA+ toIB+ toIQ+ TolR' Pal+.

En algunas divulgaciones, la bacteria expresa las cinco proteínas Tol-Pal, pero al menos una está mutada para causar hipervesiculación. Por ejemplo, se puede mutar la proteína TolA, TolQ, TolR y/o Pal, de modo que la proteína retenga su localización en la membrana, pero se interrumpen sus interacciones con otros miembros del sistema Tol-Pal. La bacteria retendrá pues TolA, TolQ y TolR como proteínas de transmembrana en la membrana interna, y la proteína Pal como lipoproteína periplásmica en la membrana externa, pero al menos una de las proteínas TolA, TolQ, TolR y/o Pal está mutada.

En el listado de secuencias SEQ ID NO: 1 a 5 se dan ejemplos de secuencias de aminoácidos de Shigella de tipo silvestre de las proteínas TolA, TolB, TolQ, TolR y Pal

La bacteria Shigella

La divulgación se puede utilizar con cualquiera de los serogrupos S.dysenteriae, S.flexneri, S.boydii and S.sonnei.

Además de tener un sistema Tol-Pal interrumpido, en virtud de lo cual se provoca que la bacteria libere mayores cantidades de vesículas de la membrana externa al medio de cultivo durante la replicación de la bacteria, una Shigella de la divulgación puede incluir ventajosamente uno o más cambios adicionales con respecto a la cepa de tipo silvestre. Dichos cambios se pueden utilizar en particular para eliminar componentes de la bacteria que podrían ser tóxicos o no deseables en una vacuna humana.

Por ejemplo, si una bacteria no expresa lipopolisacárido de Shigella (LPS) nativo, se reduce la actividad endotóxica. Se pueden introducir varias modificaciones para evitar la síntesis de LPS nativa, que pueden interrumpir la estructura de lípido A nativa, el núcleo de oligosacárido o el antígeno O externo. Por ejemplo, la referencia 3 notifica mutantes de LPS causados por la inactivación de los genes rfe y galU, y la referencia 4 notifica mutantes de LPS causados por inactivación de yihE, galE, galK, galM y galT. De manera similar, la referencia 5 notifica defecto en LPS como consecuencia de mutaciones en rfc, rfaL, o galU. La referencia 6 notifica mutantes de LPS causados por inactivación de msbBI y msbB2, reduciendo la acilación en lípido A. Tal como se muestra en el presente documento, se puede generar otro mutante de LPS con una menor acilación de lípido A mediante la inactivación de htrB [7,8].

Es de preferencia la ausencia de antígeno O en el LPS, en virtud de lo cual se evitan las respuestas específicas de serotipo. En S.sonnei está ausente el antígeno O cuando se elimina el plásmido de virulencia (véase más adelante). El gen galU codifica para uridin difosfoglucosa (UDP-glucosa) pirofosforilasa y su inactivación tiene como resultado la síntesis de LPS sin antígeno O unido. La inactivación de galU es útil para proporcionar una Shigella sin actividad uridin difosfoglucosa pirofosforilasa. Se puede utilizar la inactivación de los genes rfbF y/o rfbG para proporcionar una Shigella sin actividad ramnosil transferasa. Se puede utilizar la inactivación de rfc para proporcionar una Shigella sin actividad polimerasa de antígeno O. La inactivación de rbF, rfbG y rcf puede proporcionar una cepa útil.

Es de preferencia la ausencia de lípido A hexa-acilado en el LPS. La pérdida del plásmido de virulencia (véase más adelante) conduce automáticamente a la pérdida del gen msbB2, y se puede inactivar el gen cromosómico msbB1 eliminando así la actividad miristoíl transferasa y proporcionando un lípido A penta-acilado en el LPS. La inactivación de la HtrB lauroíl transferasa puede proporcionar Shigella con lípido A tetra-acilado principalmente. Las cepas de preferencia tienen LPS penta- o tetra-acilado.

Preferentemente, las cepas están inactivadas tanto para galU como msbB1 y también carecen de plásmido de virulencia, proporcionando así una cepa cuyo LPS está penta-acilado y carece de antígeno O unido.

Algunas cepas útiles tienen LPS penta- o tetra-acilado que incluye antígeno O unido. Más generalmente, no obstante, son de preferencia cepas que tienen LPS penta- o tetra-acilados que carecen de antígeno O unido. Es útil una cepa A S.flexneri con desactivaciones tolR, rfbG y htrB (y, opcionalmente, inactivación rfbF y/o rfc). Una cepa de S.sonnei útil tiene una mutación tolR y carece de plásmido de virulencia.

Es posible que una bacteria no exprese una toxina entérica. Por ejemplo, es posible que una cepa de S.flexneri (en particular una cepa 2a) no exprese todas las subunidades de enterotoxina 1 de Shigella (ShET-1) p.ej. pueden estar inactivados los genes set1A y/o set1B. Es posible que una cepa de S.dysenteriae no exprese las dos subunidades de toxina Shiga p.ej. pueden estar inactivados uno o ambos genes stxA y/o stxB. Es posible que una Shigella, en particular una S.sonnei o S.flexneri, no exprese enterotoxina 2 (ShET-2) p.ej. puede estar inactivado el gen ospD3, o puede estar ausente el plásmido de virulencia. Las cepas preferentes no codifican ShET-1, ShET-2 ni toxina Shiga.

La bacteria Shigella de la divulgación se puede preparar de manera conveniente a partir de la cepa de tipo silvestre u otra cepa de partida empleando técnicas convencionales de mutagénesis, p.ej. véase las referencias 9 a 11. El sistema de recombinación lambda red es particularmente útil con Shigella. La inactivación del gen se puede conseguir de diversas maneras, p.ej. por deleción o mutación en su promotor, por deleción o mutación de su codón de partida, por introducción de un codón de parada prematura, por deleción de la región de codificación completa, por inactivación, etc. Son preferentes los mutantes de inactivación isogénica. En la bacteria Shigella resultante, el ARNm que codifica el gen deseado está ausente y/o se inhibe su traducción (p.ej. a menos de un 1 % de los niveles de tipo silvestre).

Una bacteria Shigella de la divulgación puede contener un gen marcador en lugar del gen inactivado, p.ej. un marcador de resistencia a antibiótico. Esto se puede conseguir aplicando recombinación homóloga. No obstante, se emplean preferentemente deleciones sin marcar (es decir, deleción sin la introducción de un gen marcador).

Las cepas de Shigella virulentas poseen un plásmido de 220 kb mediador de las propiedades de virulencia. Se ha demostrado que dicho “plásmido de virulencia” codifica los genes para diversos aspectos de virulencia de Shigella, entre los que se incluyen adhesinas para células epiteliales diana, los antígenos de plásmido de invasión virF, virG, etc. Una Shigella de la divulgación puede poseer un plásmido de virulencia, pero preferentemente no posee un plásmido de virulencia. La ausencia del plásmido puede estabilizar la cepa durante el cultivo industrial, atenuar la cepa eliminando los factores de virulencia (en virtud de lo cual se aumenta la seguridad de fabricación), interrumpir el lipopolisacárido (los genes de biosíntesis para antígeno O están en el plásmido en S.sonnei), evitar la presencia de la endotoxina ShET-2 (codificada por el gen ospD3 o sen en el plásmido), y evitar la presencia de msbB2 que es una segunda copia del gen msbB responsable de la acilación de lípido A.

Una Shigella de la divulgación puede expresar una o más proteínas heterólogas, p.ej. proteínas que no se encuentran en Shigella de forma natural. Si la proteína heteróloga es una proteína de la membrana externa, entonces las vesículas de la cepa se pueden utilizar como sistema de entrega para presentar antígenos no Shigella al sistema inmune.

Las condiciones de cultivo para desarrollar Shigella son conocidas dentro de la técnica, p.ej., véase las referencias 12 a 14. Por ejemplo, se pueden cultivar utilizando una fuente de nitrógeno orgánico (por ejemplo se pueden utilizar mezclas de aminoácidos, p.ej. con contenido en casaminoácidos Ala, Arg, Asn, Asp), glicerol como fuente de carbono, etc. La inclusión de ácido L-aspártico en el medio es particularmente útil y pueden funcionar como fuente de nitrógeno y como fuente de carbono.

Ventajosamente, la Shigella de la divulgación se puede cultivar, en condiciones de limitación del hierro, ya que se ha demostrado que regula a la alza las proteínas reguladas con hierro que son inmunogénicas y altamente conservadas entre Shigella spp. Por ejemplo, se puede cultivar la bacteria en presencia de un compuesto como desferal o 2,2'-dipiridilo o 8-hidroxiquinolina. En estas condiciones, la bacteria puede aumentar la expresión de proteínas, como por ejemplo el receptor de membrana externa FepA, el receptor de colicina I (CirA) y/o el receptor de sideroforo férrico (FhuA).

Vesículas e hipervesiculación

Las bacterias Shigella de la divulgación son en relación con la cepa de tipo silvestre correspondiente, hipervesiculantes, es decir, liberan al medio de cultivo en el que están más cantidad de vesículas que la cepa de tipo silvestre. Estas vesículas son útiles como componentes de vacunas contra Shigella.

Las vesículas tienen normalmente un diámetro de 35-120 nm por microscopio electrónico, p.ej. 50 nm de diámetro.

Las vesículas se liberan espontáneamente durante el crecimiento bacteriano y se pueden cultivar desde el medio de cultivo. La purificación implica idealmente la separación de las vesículas desde las bacterias Shigella vivas y/o intactas, p.ej., por filtración según el tamaño utilizando un filtro, como pueda ser un filtro de 0,22 pm, que permita que pasen las vesículas pero impida que lo hagan las bacterias intactas, o por centrifugación a baja velocidad para aglomerar las células mientras que las vesículas quedan en suspensión.

Por lo tanto, a diferencia del medio de cultivo, las composiciones que contienen vesículas de la divulgación estarán generalmente sustancialmente desprovistas de bacterias enteras, ya sea vivas o muertas. El tamaño de las vesículas supone que se puedan separar fácilmente desde bacterias enteras por filtración, p.ej. tal como se realiza normalmente para esterilización por filtración. Aunque las vesículas pasen a través de filtros de 0,22 pm normales, éstos se pueden atascar enseguida por otros materiales, de manera que tal vez sea útil realizar sucesivas etapas de esterilización de filtro a través de una serie de filtros con un tamaño de poro decreciente antes de utilizar un filtro de 0,22 pm. Entre los ejemplos de los filtros precedentes se pueden mencionar los de un tamaño de poro de 0,8 pm, 0,45 pm, etc.

La separación de las vesículas liberadas espontáneamente desde el medio de cultivo es más conveniente que los procedimientos que implican la interrupción deliberada de la membrana externa (p.ej. por tratamiento con detergentes o sonicación) para provocar que se formen vesículas de membrana externa. Por otra parte, están sustancialmente desprovistas de membrana interna y contaminación citoplásmica.

Las vesículas de la divulgación contienen lípidos y proteínas. El contenido en proteínas de las vesículas ha sido analizado, e incluyen las proteínas que se enumeran en la Tabla 1, que se explica más adelante.

Proteínas de membrana externa de Shigella

En la Tabla 1 se indica el nombre del GenBank y el número GI para 129 proteínas que fueron detectadas en las vesículas de Shigella de la divulgación. Estas 127 proteínas se pueden utilizar como componentes inmunogénicos en forma purificada, separados de las vesículas. Un subgrupo preferente de las 129 es el de las 60 primeras de la lista (“Subgrupo 3”).

Los polipéptidos se pueden preparar por diversos medios, por ejemplo, por síntesis química (al menos en parte), mediante digestión de polipéptidos más largos usando proteasas, mediante traducción de ARN, por purificación de cultivo celular (por ejemplo, de expresión recombinante o de cultivo de Shigella). etc. La expresión heteróloga en un hospedador de E. coli es una vía de expresión preferida.

Los polipéptidos de la divulgación se pueden unir o inmovilizar a un soporte sólido. Los polipéptidos de la divulgación pueden comprender un marcador detectable, por ejemplo, un marcador radiactivo, un marcador fluorescente o un marcador de biotina. Esto es particularmente útil en técnicas de inmunoensayo.

Los polipéptidos pueden tomar varias formas (por ejemplo, nativos, fusiones, glicosilados, no glicosilados, lipidados, puentes disulfuro, etc.). Los polipéptidos son preferiblemente polipéptidos de Shigella.

Los polipéptidos se preparan preferentemente en forma sustancialmente pura o sustancialmente aislada (es decir, sustancialmente libres de otros polipéptidos de Shigella o de la célula hospedadora) o en forma sustancialmente aislada. En general, los polipéptidos se proporcionan en un entorno no natural, por ejemplo, están separados de su entorno natural. En ciertas divulgaciones, el polipéptido sujeto está presente en una composición que está enriquecida con el polipéptido en comparación con un control. Como tal, se proporciona polipéptido purificado, por lo que purificado significa que el polipéptido está presente en una composición que está sustancialmente libre de otros polipéptidos expresados, en la que sustancialmente libre significa que menos del 50%, normalmente menos del 30% y más normalmente menos del 10% de la composición está constituida por otros polipéptidos expresados.

El término "polipéptido" se refiere a polímeros de aminoácidos de cualquier longitud. El polímero puede ser lineal o ramificado, puede comprender aminoácidos modificados y puede estar interrumpido por no aminoácidos. Los términos también abarcan un polímero de aminoácidos que ha sido modificado de forma natural o por intervención; por ejemplo, formación de enlaces disulfuro, glucosilación, lipidación, acetilación, fosforilación o cualquier otra manipulación o modificación, como la conjugación con un componente de mareaje. También se incluyen dentro de la definición, por ejemplo, polipéptidos que contienen uno o más análogos de un aminoácido (incluidos, por ejemplo, aminoácidos no naturales, etc.), así como otras modificaciones conocidas en la técnica. Los polipéptidos pueden presentarse como cadenas simples o cadenas asociadas.

Composiciones farmacéuticas

La divulgación proporciona una composición farmacéutica que comprende (a) las vesículas de la divulgación y (b) un vehículo farmacéuticamente aceptable. La divulgación también proporciona un procedimiento para preparar dicha composición que comprende la etapa de mezclar las vesículas de la divulgación con un vehículo farmacéuticamente aceptable.

La divulgación también proporciona una composición farmacéutica que comprende (a) la composición inmunogénica sin vesículas y (b) un vehículo farmacéuticamente aceptable.

La composición inmunogénica puede incluir un vehículo farmacéuticamente aceptable, que puede ser cualquier sustancia que no induzca por sí misma la producción de anticuerpos nocivos para el paciente que recibe la composición, y que se pueda administrar sin una toxicidad indebida. Los vehículos farmacéuticamente aceptables pueden incluir líquidos, como agua, solución salina, glicerol y etanol. También pueden estar presentes en dichos vehículos sustancias auxiliares como agentes de humectación o emulsionantes, sustancias tampón del pH, y similares. En ref. 5 se incluye una explicación exhaustiva de vehículos adecuados.

Las infecciones por Shigella pueden afectar a diversas zonas del cuerpo y por tanto, las composiciones de la divulgación se pueden preparar de varias formas. Por ejemplo, se puede preparar la composición como inyectables, ya sea como soluciones líquidas o suspensiones. Se pueden preparar también formas sólidas adecuadas para solución o suspensión en vehículos líquidos antes de la inyección. Se puede preparar la composición para administración tópica, p.ej., como una pomada, crema o polvo. Se puede preparar la composición para administración oral, p.ej., como comprimido o cápsula, o como un jarabe (con aroma opcionalmente). Se puede preparar la composición para administración pulmonar, p.ej. como inhalador, utilizando un polvo fino o un spray. Se puede preparar la composición un supositorio o pesario. Se puede preparar la composición para administración nasal, ótica u ocular, p.ej. como gotas.

La composición es preferentemente estéril. Está desprovista de pirógenos preferentemente. Está preferentemente tamponada, p.ej. a un H comprendido entre 6 y 8, generalmente en torno a pH 7. Las composiciones de la divulgación pueden ser isotónicas con respecto a seres humanos.

Las composiciones inmunogénicas comprenden una cantidad inmunológicamente eficaz de inmunógeno, así como otro componente entre los demás especificados, según sea necesario. Por “cantidad inmunológicamente eficaz” se entiende que la administración de la cantidad a un individuo, ya sea en una sola dosis o como parte de una serie de dosis, es eficaz para tratamiento o prevención. La cantidad varía dependiendo de la salud y el estado físico del individuo tratado, así como la edad, el grupo taxonómico del individuo tratado (p.ej. primate no humano, primate, etc.), la capacidad del sistema inmune del individuo para sintetizar antibióticos, el grado de protección deseado, la formulación de la vacuna, la evaluación de la situación médica realizada por el médico encargado, y otros factores pertinentes. Es de esperar que la cantidad entre dentro de un amplio intervalo que se puede determinar a través de ensayos de rutina.

El trabajo anterior sobre vacunas de vesículas (p.ej. para meningococos) ofrece una guía sobre la posología y la formulación para la administración de vesículas. La concentración de las vesículas en las composiciones de la divulgación estará comprendida por lo general entre 10 y 500 pg/ml, preferentemente entre 25 y 200 pg/ml, y más preferentemente aproximadamente 50 pg/ml o aproximadamente 100 pg/ml (expresado en lo que se refiere al total de proteína en las vesículas). Un volumen de dosis de 0,5 ml es el normal para inyección.

La composición se puede administrar combinada con otros agentes inmnorreguladores.

Los adyuvantes que se pueden utilizar en las composiciones de la divulgación (en particular, en composiciones sin vesículas) incluyen, pero sin limitarse a ellos:

A. Composiciones que contienen mineral

Entre las composiciones que contienen mineral adecuadas para su uso como adyuvantes en la presente divulgación se incluyen sales minerales, como sales de aluminio y sales de calcio. La divulgación incluye sales minerales, como hidróxidos (p.ej. oxihidróxidos), fosfatos (p.ej., hidroxifosfatos, ortofosfatos), sulfatos, etc. [p.ej. véase los capítulos 8 y 9 de la ref. 19], o mezclas de diferentes compuestos minerales, con los compuestos que adoptan cualquier forma adecuada (p.ej., gel, cristalina, amorfa, etc.) y siendo de preferencia adsorción. Las composiciones que contienen mineral también se pueden formular como una partícula de sal metálica.

Los adyuvantes conocidos como “hidróxido de aluminio” son normalmente sales de oxih idróxido de aluminio, que suelen ser, al menos parcialmente, cristalinas. El oxihidroxido de aluminio, que se puede representar mediante la fórmula AIO(OH), se pueden distinguir de otros compuestos de aluminio, como por ejemplo hidróxido de aluminio, Al(OH)3, por espectroscopia de infrarrojo (IR), en particular, por la presencia de una banda de absorción a 1070 cm-1 y un hombro marcado a 3090-3100 cm-1 [capítulo 9 de ref. 19]. El grado de cristalinidad de un adyuvante de hidróxido de aluminio se refleja por el ancho de la banda de difracción a media altura (WHH), al tiempo que las partículas escasamente cristalinas presentan una amplitud de la línea mayor debido a los menores tamaños del cristalito. El área superficial aumenta a medida que aumenta el WHH, y se ha observado que los adyuvantes con valores WHH más altos tienen una mayor capacidad de adsorción de antígeno. La morfología fibrosa (p.ej. tal como se ve en micrografías de transmisión electrónica) es normal para adyuvantes de hidróxido de aluminio. El pI de los adyuvantes de hidróxido de aluminio es normalmente 11, es decir, el adyuvante tiene en sí mismo, una carga superficial positiva al pH fisiológico. Se han notificado capacidades de adsorción comprendidas entre 1,8 y 2,6 mg de proteína por mg Al+++ a pH 7,4 para adyuvantes de hidróxido de aluminio.

Los adyuvantes conocidos como “fosfato de aluminio” son normalmente hidroxifosfatos de aluminio, y también suelen contener una pequeña cantidad de sulfato (es decir, hidroxifosfato sulfato de aluminio). Se pueden obtener por precipitación y las condiciones de reacción y las concentraciones durante la precipitación influyen en el grado de sustitución de hidroxilo por fosfato en la sal. Los hidroxifosfatos tienen generalmente una relación molar PO4/Al comprendida entre 0,3 y 1,2. Los hidroxifosfatos se pueden distinguir de ALPO4 estrictamente por la presencia de grupos hidroxilo. Por ejemplo, una banda del espectro IR a 3164 cm-1 (p.ej. a 200 °C) indica la presencia de hidroxilos estructurales (capítulo 9 de ref. 19).

La relación molar PO4/Al3+ del adyuvante de fosfato de aluminio estará comprendida generalmente entre 0,3 y 1,2, preferentemente entre 0,8 y 1,2, y más preferentemente 0,95 ± 0,1. El fosfato de aluminio será generalmente amorfo, en particular para sales de hidroxifosfato. Un adyuvante normal es un hidroxifosfato de aluminio amorfo con una relación molar PO4/Al comprendida entre 0,84 y 0,92, incluyendo 0,6 mg Al3+/ml. El fosfato de aluminio estará generalmente en partículas (p.ej. morfología de tipo placa tal como se observa en las micrografías de transmisión electrónica). Los diámetros normales de las partículas se encuentran dentro del intervalo de 0,5-20 pm (p.ej. aproximadamente 5-10 pm) tras la adsorción del antígeno. Se han notificado capacidades de adsorción comprendidas entre 0,7-1,5 mg de proteína por mg Al+++ a pH 7,4 para adyuvantes de fosfato de aluminio.

El punto de carga cero (PZC) de fosfato de aluminio está inversamente relacionado con el grado de sustitución de hidroxilo por fosfato, y este grado de sustitución puede variar dependiendo de las condiciones de reacción y la concentración de los reactivos utilizados para preparar la sal por precipitación. PZC también se altera cambiando la concentración de los iones fosfato libres en la solución (más fosfato = más PZC ácido) o añadiendo un tampón como tampón histidina (hace más básico el PZC). Los fosfatos de aluminio usados de acuerdo con la divulgación tienen generalmente un PZC comprendido entre 4,0 y 7,0, más preferentemente entre 5,0 y 6,5, p.ej. aproximadamente 5,7.

Las suspensiones de sales de aluminio utilizadas para preparar las composiciones de la divulgación pueden contener un tampón (p.ej., un fosfato o una histidina o un tampón Tris), pero no siempre es necesario. Las suspensiones son preferentemente estériles y desprovistas de pirógenos. Una suspensión puede incluir iones fosfato acuoso libres, p.ej., presentes en una concentración comprendida entre 1,0 y 20 mM , preferentemente, entre 5 y 15 mM, y más preferentemente aproximadamente 10 mM . Las suspensiones pueden comprender también cloruro sódico.

En una divulgación, un componente adyuvante incluye una mezcla tanto de un hidróxido de aluminio como de un fosfato de aluminio. En tal caso, puede haber más fosfato de aluminio que hidróxido, p.ej., una relación en peso de al menos 2:1 p.ej. > 5:1, > 6:1, > 7:1, > 8:1, > 9:1, etc.

La concentración de Al+++ en una composición para su administración a un paciente es preferentemente menos de 10 mg/ml p.ej. <5 mg/ml, <4 mg/ml, <3 mg/ml, <2 mg/ml, <1 mg/ml, etc. Un intervalo de preferencia es el comprendido entre 0,3 y 1 mg/ml. Preferentemente, un máximo de <0,85 mg/dosis.

B. Emulsiones oleosas

Las composiciones en emulsión oleosa adecuadas para su uso como adyuvantes en la divulgación incluyen emulsiones escualeno-agua, como MF59 [Capítulo 10 de ref. 19; véase también ref. 16] (5% escualeno, 0,5% Tween 80, y 0,5% Span 85, formulado en partículas submicrométricas utilizando un microfluidizador). También se pueden utilizar adyuvante de Freund completo (CFA) y adyuvante de Freund incompleto (IFA).

Se conocen diversas emulsiones aceite en agua adecuadas, que incluyen normalmente al menos un aceite y al menos un tensioactivo, siendo el (los) aceite(s) y el (los) tensioactivo(s) biodegradables (metabolizables) y biocompatibles. Las gotitas de aceite en la emulsión tienen generalmente un tamaño inferior a 5 pm de diámetro y ventajosamente, la emulsión comprende gotitas de aceite con un diámetro submicrométrico, consiguiéndose dichos tamaños pequeños con un microfluidizador para proporcionar emulsiones estables. Son preferentes las gotitas que tienen un tamaño inferior a 220 nm ya que se pueden someter a esterilización por filtración.

La divulgación se puede utilizar con aceites, como puedan ser de origen animal (por ejemplo pescado) o de origen vegetal. Las fuentes para los aceites de origen vegetal incluyen nueces, semillas y granos. El aceite de cacahuete, el aceite de soja, el aceite de coco y el aceite de oliva son los aceites de nuez más comunes. Se puede utilizar aceite de yoyoba, p.ej. obtenido del grano de yoyoba. Entre los aceites de semilla se incluyen aceite de cártamo, aceite de semilla de algodón, aceite de girasol, aceite de sésamo y similares. En el grupo de los aceites de grano, el de maíz es el más asequible, si bien se puede utilizar igualmente aceite de otros granos de cereal como trigo, avena, centeno, arroz, cereal teff, triticalo y similares. Los ésteres de ácidos grasos de 6-10 carbonos de glicerol y 1,2-propanodiol, aunque no se dan de forma natural en aceites de semilla, se pueden preparar por hidrólisis, separación y esterificación de los materiales apropiados a partir de los aceites de nuez y de semilla. Las grasas y los aceites de la leche de mamífero se pueden metabolizar y por tanto se pueden utilizar en la práctica de la presente divulgación. Los procedimientos para la separación, purificación, saponificación y otros medios necesarios para obtener aceites puros de fuentes animales son conocidos dentro de la especialidad. La mayoría de los peces contienen aceites metabolizables que se pueden recuperar fácilmente. Por ejemplo, aceite de hígado de bacalao, aceites de hígado de tiburón y aceite de ballena, como por ejemplo espermaceti, son ejemplos de varios aceites de pescado que se pueden utilizar en este punto. Existe una serie de aceites de cadena ramificada que se sintetizan bioquímicamente en unidades de isopreno de 5-carbonos y que se denominan generalmente terpenoides. El aceite de hígado de tiburón contiene un terpenoide insaturado ramificado conocido como escualeno 2,6,10,15,19,23-hexametil-2,6,10,14,18,22-tetracosahexeno. Otros aceites preferentes son tocoferoles (véase más adelante). Las emulsiones aceite en agua que comprenden escualeno son particularmente preferentes. Se pueden emplear mezclas de aceites.

Los tensioactivos se pueden clasificar según su “HLB” (equilibrio hidrófilo/lipófilo). Los tensioactivos de preferencia de la divulgación tienen un HLB de al menos 10, preferentemente al menos 15, y más preferentemente al menos 16. La divulgación se puede usar con tensioactivos que incluyen, sin limitarse solo a ellos: tensioactivos de ésteres de polioxietilen sorbitano (denominados comúnmente Tween), especialmente polisorbato 20 y polisorbato 80; copolímeros de óxido de etileno (EO), óxido de propileno (PO) y/o óxido de butileno (BO), distribuidos con el nombre comercial DOWFAX™, como por ejemplo copolímeros de bloque EO/PO lineales; octoxinoles, que pueden variar en el número de grupos etoxi (oxi-1,2-etanodiilo) que se repiten, siendo y particular interés octoxinol-9 (T riton X-100, o toctilfenoxipolietoxietanol); (octilfenoxi)polietoxietanol (IGEPAL CA-630/NP-40); fosfolípidos como fosfatidilcolina (lecitina); éteres grasos de polioxietileno derivados de alcoholes láurico, cetílico, estearílico y oleico (conocidos como tensioactivos Brij), como por ejemplo éter mono-láurico de trietilen glicol (Brij 30); y ésteres de sorbitano (conocidos comúnmente como SPAN), como trioleato de sorbitano (Span 85) y monolaurato de sorbitano. Los tensioactivos preferentes para su inclusión en la emulsión son Tween 80 (monooleato de polioxietilen sorbitano), Span 85 (trioleato de sorbitano), lecitina y Triton X-100. Tal como se ha mencionado anteriormente, los detergentes como Tween 80 pueden contribuir a la estabilidad térmica, observada en los ejemplos a continuación.

Se pueden utilizar mezclas de tensioactivos, p.ej., mezclas de Tween 80/Span 85. También es adecuada una combinación de éster de polioxietilen sorbitano, como por ejemplo monooleato de polioxietilen sorbitano (Tween 80) y un octoxinol como t-octilfenoxipolietoxietanol (Triton X-100). Otra combinación útil comprende laureth 9 plus, un éster de polioxietilen sorbitano y/o un octoxinol.

Las cantidades (% en peso) de tensioactivos preferentes son: ésteres de polioxietilen sorbitano (como por ejemplo Tween 80) de 0,01 a 1%, in particular aproximadamente 0,1 %; octil- o nonilfenoxi polioxietanoles (como Triton X-100, u otros detergentes en la serie Triton) de 0,001 a 0,1 %, en particular de 0,005 a 0,02%; éteres de polioxietileno (como laureth 9) de 0,1 a 20 %, preferentemente de 0,1 a 10 % y en particular de 0,1 a 1% o aproximadamente 0,5%.

Los adyuvantes de emulsión aceite en agua específicos útiles con la divulgación incluyen, pero sin limitarse a ellos:

• una emulsión submicrométrica de escualeno, Tween 80, y Span 85. La composición de la emulsión en volumen puede ser aproximadamente 5 % de escualeno, aproximadamente 0,5 % de polisorbato 80 y aproximadamente 0,5 % de Span 85. En peso, estas relaciones pasan a ser 4,3% de escualeno, 0,5 % de polisorbato 80 y 0,48 % de Span 85. Este adyuvante se conoce como 'MF59' [16-18], tal como se describe con más detalle en el capítulo 10 de la ref. 19 y el capítulo 12 de la ref. 20. La emulsión MF59 incluye ventajosamente iones citrato, p.ej., tampón citrato sódico 10 mM.

• Una emulsión que comprende escualeno, un a-tocoferol, y polisorbato 80. Estas emulsiones pueden tener de 2 a 10% de escualeno, de 2 a 10 % de tocoferol y de 0,3 a 3 % de Tween 80, y la relación en peso de escualeno: tocoferol es preferentemente <1 (p.ej. 0,90), ya que proporciona una emulsión más estable. El escualeno y Tween 80 pueden estar presentes en una relación en volumen de aproximadamente 5:2, o en una relación en peso de of aproximadamente 11:5. Una de dichas emulsiones se puede fabricar disolviendo Tween 80 en PBS para dar una solución al 2 %, mezclando después 90 ml de esta solución con una mezcla de (5 g de DL-a-tocoferol y 5 ml de escualeno), microfluidizando después la mezcla. La emulsión resultante puede tener gotas de aceite submicrométricas p.ej. con un diámetro medio comprendido entre 100 y 250 nm, preferentemente aproximadamente 180 nm.

• Una emulsión de escualeno, un tocoferol y un detergente Triton (p.ej. Triton X-100). La emulsión puede incluir también un 3d-MPL (véase a continuación). La emulsión puede contener un tampón fosfato.

• Una emulsión que comprende un polisorbato (p.ej. polisorbato 80), un detergente Triton (p.ej. Triton X-100) y un tocoferol (p.ej. succinato de a-tocoferol). La emulsión puede incluir estos tres componentes en una relación en masa de aproximadamente 75:11:10 (p.ej. 750 mg/ml de polisorbato 80, 110 pg/ml de Triton X-100 y 100 pg/ml de succinato de a-tocoferol), y estas concentraciones deberán incluir cualquier contribución de estos componentes desde antígenos. La emulsión puede incluir también escualeno. La emulsión puede incluir también 3d-MPL (véase más adelante). La fase acuosa puede contener tampón fosfato.

• Una emulsión de escualeno, polisorbato 80 y poloxámero 401 ("Pluronic™ L121"). Se puede formular la emulsión en solución salina tamponada con fosfato, pH 7,4. Esta emulsión es un vehículo de entrega útil para dipéptidos de muramilo y se ha utilizado con treonil-MDP en el adyuvante "SAF-1" [21] (0,05-1% Thr-MDP, 5% de escualeno, 2.5% de Pluronic L121 y 0,2% de polisorbato 80). También se puede utilizar sin Thr-MDP, como en el adyuvante "AF" [22] (5% de escualeno, 1,25% de Pluronic L121 y 0,2% de polisorbato 80). Es preferente la microfluidización.

• Una emulsión que comprende escualeno, un disolvente acuoso, un tensioactivo no iónico hidrófilo de éter polioxietilen alquílico (p.ej. éter polioxietilen (12) cetoestearílico) y un tensioactivo no iónico hidrófobo (p.ej. éster de sorbitano, o éster de manida, como monooleato de sorbitano o Span 80'). La emulsión es preferentemente termorreversible y/o tiene al menos 90% de gotitas de aceite (en volumen) con un tamaño de menos de 200 nm [23]. La emulsión puede incluir también uno o más entre: alditol; un agente crioprotector (p.ej. un azúcar como dodecilmaltosida y/o sacarosa) y/o un alquilpoliglicosida. Dichas emulsiones se pueden liofilizar.

• Una emulsión que tiene de 0,5-50% de un aceite, 0,1-10% de un fosfolípido, y 0,05-5% de un tensioactivo no iónico. Tal como se describe en la referencia 24, los componentes de fosfolípido preferentes son fosfatidilcolina, fosfatidiletanolamina, fosfatidilserina, fosfatidilinositol, fosfatidilglicerol, ácido fosfatídico, sfingomielina y cardiolipina. Son ventajosos tamaños submicrométricos de la gota.

• Una emulsión aceite en agua submicrométrica de un aceite no metabolizable (como por ejemplo aceite mineral ligero) y al menos un agente tensioactivo (como lecitina, Tween 80 o Span 80). Se pueden incluir aditivos, como QuilA saponina, colesterol, un conjugado saponina-lipófilo (como GPI-0100, descrito en la referencia 25, producido por adición de una amina alifática a desacilsaponina a través del grupo carboxilo de ácido glucurónico), bromuro de dimetildioctadecilamonio y/o N,N-dioctadecil-N,N-bis (2-hidroxietil)propanodiamina.

• Una emulsión que comprende un aceite mineral, un alcohol graso etoxilado lipófilo no iónico, un tensioactivo hidrófilo no iónico (p.ej. un alcohol graso etoxilado y/o un copolímero de bloque polioxieitleno-polioxipropileno) [26].

• Una emulsión que comprende un aceite mineral, un alcohol graso etoxilado hidrófilo no iónico y un tensioactivo lipófilo no iónico (p.ej. un alcohol graso etoxilado y/o copolímero de bloque de polioxietileno-polioxipropileno) [26].

• Una emulsión en la que saponina (p.ej. QuilA o QS21) y un esterol (p.ej. un colesterol) están asociadas como micelas helicoidales. [27].

Normalmente, se mezclarán los antígenos y los adyuvantes de la composición en el momento de su administración a un paciente. Las emulsiones pueden mezclarse con el antígeno durante la fabricación, o de forma extemporánea, en el momento de la administración. Por lo tanto, el adyuvante y el antígeno se pueden guardar por separado en una vacuna empaquetada o distribuida, lista para su formulación final en el momento de su uso. El antígeno se presentará en general en forma acuosa, de manera que la vacuna se pueda preparar finalmente mezclando los dos líquidos. La relación de volumen de los dos líquidos para el mezclado puede variar (p.ej. entre 5:1 y 1:5) pero es generalmente aproximadamente 1:1.

C. Formulaciones de saponina [capítulo 22 de ref. 191

Se pueden utilizar asimismo como adyuvantes en la divulgación formulaciones de saponina. Las saponinas son un grupo heterogéneo de esterol glucosidos y glucosidos triterpenoides que se encuentran en la corteza, las hojas, los tallos, las raíces e incluso las flores de una amplia gama de especies vegetales. Se han estudiado exhaustivamente las saponinas de corteza del árbol Quillaia saponaria Molina como adyuvantes. Una saponina también se puede obtener en el mercado, de Smilax ornata (zarzaparrilla), Gypsophilla paniculata (velo de novia), y Saponaria officianalis (hierba jabonera). Las formulaciones de adyuvante de saponina incluyen formulaciones purificadas como QS21, así como formulaciones de lípidos como ISCOMs. QS21 está disponible en el mercado como Stimulon™.

Se han purificado composiciones de saponina por HPLC o RP-HPLC. Las fracciones purificadas específicas mediante el empleo de dichas técnicas han sido identificadas, incluyendo QS7, QS17, QS18, QS21, QH-A, QH-B y QH-C. Preferentemente, la saponina es QS21. En la ref. 28 se desvela un procedimiento de producción de QS21. Las formulaciones de saponina pueden comprender también un esterol, como por ejemplo colesterol [29].

Se pueden emplear combinaciones de saponinas y colesteroles para formar partículas únicas llamadas complejos inmunoestimulantes (ISCOM; véase el capítulo 23 de ref. 19; también refs. 30 y 31). Los ISCOM incluyen también típicamente un fosfolípido como fosfatidiletanolamina o fosfatidilcolina. Se puede emplear cualquier saponina conocida en los ISCOM. Preferentemente, un ISCOM incluye uno o más QuilA, QHA y QHC. Opcionalmente, los ISCOM pueden estar desprovistos de un detergente adicional [32].

En las refs. 33 y 34 se pueden encontrar una revisión del desarrollo de adyuvantes a base de saponina.

D. Derivados bacterianos o microbianos

Los adyuvantes adecuados para su uso en la divulgación incluyen derivados bacterianos o microbianos como derivados no tóxicos de lipopolisacáridos (LPS) entorobacterianos, derivados de lípido A, oligonucleótidos inmunoestimulantes y toxinas ADP-ribosilantes y derivados desintoxicados de las mismas.

Los derivados no tóxicos de LPS incluyen monofosforil lípido A (MPL) y MPL 3-O-deacilado (3dMPL). 3dMPL es una mezcla de monofosforil lípido A 3 de-O-acilado con 4, 5 o 6 cadenas aciladas. Una forma de “partícula pequeña” preferente de monofosforil lípido A 3 De-O-acilado se desvela en ref. 35. Dichas "partículas pequeñas" de 3dMPL son lo suficientemente pequeñas como para filtrarse para esterilización a través de una membrana de 0,22 pm [35]. Otros derivados de LPS no tóxicos incluyen miméticos de monofosforil lípido A, como derivados fosfato de aminoalquil glucosaminida, p.ej. RC-529 [36,37].

Los derivados de lípido A incluyen derivados de lípido A de Escherichia coli como OM-174. OM-174 se describe por ejemplo en refs. 38 & 39.

Los oligonucleótidos inmunoestimulantes adecuados para su uso como adyuvantes en la divulgación incluyen secuencias de nucleótidos que contienen un motivo CpG (una secuencia de dinucleótidos que contiene una citosina no metilada unida mediante un enlace fosfato a guanosina). Se ha demostrado que los ARN de doble cadena y los oligonucleótidos que contienen secuencias palindromicas o poli(dG) son también inmunoestimulantes.

Los CpG pueden incluir modificaciones/análogos de nucleótido, como por ejemplo modificaciones fosforotioato y pueden ser de doble cadena o monocatenarias. Las referencias 40, 41 y 42 desvelan posibles sustituciones de análogo, p.ej., sustitución de guanosina por 2'-desoxi-7-deazaguanosina. El efecto adyuvante de oligonucleótidos CpG se explica mejor en las refs. 43-48.

Se puede dirigir la secuencia de CpG a TLR9, como por ejemplo el motivo GTCGTT o TTCGTT [49]. La secuencia CpG puede ser específica al inducir una respuesta inmune Th1, como por ejemplo CpG-A ODN, o puede ser más específica al inducir una respuesta de linfocitos B, como por ejemplo una CpG-B ODN. CpG-A y CpG-B ODNs se explican en refs. 50-52. Preferentemente, la CpG es una CpG-A ODN.

Preferentemente, el oligonucleótido CpG se construye para que el extremo 5' se accesible para el reconocimiento de receptor. Opcionalmente, se pueden unir dos secuencias de oligonucleótido CpG en sus extremos 3' para formar “inmunómeros”. Véase por ejemplo refs. 53-55.

Un adyuvante particularmente útil a base de oligonucleótidos inmunoestimulantes es conocido como IC-31™ [56-58]. Por tanto, un adyuvante utilizado con la divulgación puede comprender una mezcla de (i) un oligonucleótido (p.ej. entre 15 -40 nucleótidos) incluyendo al menos uno (y preferentemente múltiples) motivos Cpl (es decir una citosina unida a una inosina para formar un dinucleótido) y (ii) un polímero policatiónico, como por ejemplo un oligopéptido (p.ej. entre 5-20 aminoácidos) incluyendo al menos (y preferiblemente múltiples) secuencia(s) tripéptido Lys-Arg-Lys. El oligonucleótido puede ser un desoxinucleótido que comprende una secuencia de 26-meros 5'-(IC)¹³-3' (SEQ ID NO: 7). El polímero policatiónico puede ser un péptido que comprende una secuencia de aminoácidos de 11 meros ^KLKLLLLLKLK (SeQ ^{ID NO: 6). Esta combinación de SEQ ID NO: 6 y 7 proporciona el adyuvante IC-31 ™.}

Pueden utilizarse como adyuvantes en la divulgación toxinas ADP-ribosilantes bacterianas y los derivados desintoxicados de las mismas. Preferentemente, la proteína se deriva de E.coli (Enterotoxina termo-lábil E.coli "LT"), cólera ("CT"), o pertussis ("PT"). El uso de toxinas ADN-ribosilantes desintoxicadas como adyuvantes mucosales se describe en ref. 59 y, como adyuvantes parentales en ref. 60. La toxina o toxoide está preferentemente en forma de holotoxina, que comprende subunidades tanto A como B. Preferentemente la subunidad A contiene una mutación desintoxicada; preferentemente la subunidad B no está mutada. Preferentemente, el adyuvante es un mutante LT desintoxicado como por ejemplo LT-K63, LT-R72, y LT-G192. El uso de toxinas ADP-ribosilantes y derivados desintoxicados de las mismas, en particular, LT-K63 and LT-R72, como adyuvantes se puede encontrar en refs. 61­ 68. Un mutante CT útil es CT-E29H [69]. La referencia numérica para las sustituciones de aminoácidos se basa preferentemente en las alineaciones de las subunidades A y B de las toxinas ADP-ribosilantes establecida en ref. 70.

E. Inmunomoduladores humanos

Los inmunomoduladores humanos adecuados para su uso como adyuvantes en la divulgación incluyen citoquinas, como interleuquinas (p.ej. IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-12 [71], etc.) [72], interferones (p.ej. interferón-Y), factor estimulante de colonia de macrófagos y factor de necrosis de tumor. Un inmunomodulador preferente es IL-12.

F. Bioadhesivos y Mucoadhesivos

También pueden utilizarse como adyuvantes en la divulgación bioadhesivos y mucoadhesivos. Entre los bioadhesivos adecuados se incluyen microesferas de ácido hialurónico esterificado [73] o mucoadhesivos como derivados reticulados de poli(ácido acrílico), polialcohol vinílico, polivinil pirrolidona, polisacáridos y carboxi metil celulosa. También se pueden utilizar como adyuvantes quitosano y derivados del mismo en la divulgación. [74].

G. Micropartículas

Se pueden utilizar también micropartículas como adyuvantes en la divulgación. Son preferentes micropartículas (es decir, una partícula de ~100 nm a —150 pm de diámetro, más preferentemente de ~200 nm a ~30 pm de diámetro, siendo lo más preferente de —500 nm a —10 pm de diámetro) formadas de materiales que son biodegradables y no tóxicos (p.ej. un poli(ácido a-hidroxi), un ácido polihidroxibutírico, un poliortoéster, un polianhídrido, una policaprolactona, etc.), con poli(lactida-co-glicolida), opcionalmente tratadas para tener una superficie de carga negativa (p.ej. con SDS) o una superficie de carga positiva (p.ej. con un detergente catiónico, como CTAB).

H. Liposomas (Capítulos 13 y 14 de ref. 19)

Los ejemplos de formulaciones de liposoma adecuados para su uso como adyuvantes se describen en refs. 75-77.

I. Compuestos de imidazoquinolona.

Los Ejemplos de compuestos de imidazoquinolona adecuados para su uso como adyuvantes en la divulgación se incluyen imiquamod y sus homólogos (p.ej. "Resiquimod 3M") mejor descritos en refs. 78 y 79.

La divulgación también puede comprender combinaciones de los aspectos de uno o más de los adyuvantes identificados. Por ejemplo, se puede utilizar la siguiente combinación de adyuvante en la divulgación: (1) una saponina y una emulsión aceite en agua [80]; (2) una saponina (p.ej. QS21) un derivado LPS no tóxico (p.ej. 3dMPL) [81]; (3) una saponina (p.ej. QS21) un derivado LPS no tóxico (p.ej. 3dMPL) un colesterol; (4) una saponina (p.ej. Qs 21 ) 3dMPL IL-12 (opcionalmente un esterol) [82]; (5) combinaciones de 3dMPL con, por ejemplo,, QS21 y/o emulsiones aceite en agua [83]; (6) SAF, con un contenido de 10% escualeno, 0,4% Tween 80™, 5% copolímero de bloque pluronic L121, y thr-MDP, ya sea microfluidizado en una emulsión submicrométrica o con agitación vorticial para generar una emulsión de tamaño de partícula más grande. (7) Sistema adyuvante Ribi™ (RAS), (Ribi Immunochem) con un contenido de 2% de escualeno, 0,2% Tween 80, y uno o más componentes de pared celular bacteriana del grupo que consiste en monofosforil lípido A (MPL), dimicolato de trehalosa (TDM) y esqueleto de la pared celular (CWS), preferentemente MPL CWS (Detox™); y (8) una o más sales minerales (como por ejemplo sal de aluminio) un derivado de LPS no tóxico (como 3dMPL).

Otras sustancias que actúan como agentes inmunoestimulantes se desvelan en el capítulo 7 de ref. 19.

Es útil un adyuvante de hidróxido de aluminio y generalmente los antígenos son absorbidos a su sal. Las emulsiones aceite en agua que comprenden escualeno, con gotas de aceite submicrométricas, también son preferentes, en particular en las personas de edad. Las combinaciones de adyuvantes útiles incluyen combinaciones de adyuvantes Th1 y Th2 como CpG y una sal de aluminio, o resiquimod y una sal de aluminio. Se puede utilizar una combinación de una sal de aluminio y 3dMPL.

Inmunización

Además de proporcionar composiciones inmunogénicas, tal como se ha descrito anteriormente, la divulgación también proporciona un procedimiento para estimular una respuesta de anticuerpo en un mamífero que comprende la administración de una composición inmunogénica de la divulgación a un mamífero. La respuesta de anticuerpo es preferentemente una respuesta de anticuerpo protector. La divulgación también proporciona composiciones de la divulgación para su uso en dichos procedimientos.

La divulgación también proporciona un procedimiento para proteger a un mamífero contra una infección y/o enfermedad por Shigella (por ejemplo, contra shigelosis, síndrome de Reiter y/o síndrome urémico hemolítico), que comprende administrar al mamífero una composición inmunogénica de la divulgación.

La divulgación proporciona composiciones de la divulgación para su uso como medicamentos (por ejemplo, como composiciones inmunogénicas o como vacunas). También proporciona el uso de vesículas de la divulgación en la fabricación de un medicamento para prevenir una infección por Shigella en un mamífero, por ejemplo, para prevenir la shigelosis, el síndrome de Reiter y/o el síndrome urémico hemolítico. También proporciona el uso de una proteína de vesícula (como se definió anteriormente) en la fabricación de un medicamento sin vesícula para prevenir una infección por Shigella en un mamífero, por ejemplo, para prevenir la shigelosis.

El mamífero es preferiblemente un ser humano. El ser humano puede ser un adulto o, preferiblemente, un niño. Cuando la vacuna es para uso profiláctico, el ser humano es preferiblemente un niño (por ejemplo, un niño pequeño o un bebé); cuando la vacuna es para uso terapéutico, el ser humano es preferiblemente un adulto. También se puede administrar una vacuna destinada a niños a adultos, por ejemplo, para evaluar la seguridad, dosis, inmunogenicidad, etc.

Los usos y procedimientos son particularmente útiles para prevenir/tratar enfermedades que incluyen, pero no se limitan a, shigelosis, síndrome de Reiter y/o síndrome urémico hemolítico. La eficacia del tratamiento terapéutico se puede probar controlando la infección por Shigella después de la administración de la composición de la divulgación. La eficacia del tratamiento profiláctico se puede probar controlando las respuestas inmunes contra las proteínas inmunogénicas en las vesículas u otros antígenos después de la administración de la composición. La inmunogenicidad de las composiciones de la divulgación se puede determinar administrándolas a sujetos de prueba (por ejemplo, niños de 12 a 16 meses de edad) y luego determinando los parámetros serológicos estándar. Estas respuestas inmunes se determinarán generalmente alrededor de 4 semanas después de la administración de la composición y se compararán con los valores determinados antes de la administración de la composición. Cuando se administra más de una dosis de la composición, se puede realizar más de una determinación posterior a la administración.

Las composiciones de la divulgación generalmente se administrarán directamente a un paciente. La administración directa puede realizarse mediante inyección parenteral (por ejemplo, subcutánea, intraperitoneal, intravenosa, intramuscular o al espacio intersticial de un tejido), o por vía rectal, oral, vaginal, tópica, transdérmica, intranasal, ocular, auditiva, pulmonar u otra mucosa. Se prefiere la administración intramuscular en el muslo o en la parte superior del brazo. La inyección puede ser a través de una aguja (por ejemplo, una aguja hipodérmica), pero como alternativa se puede usar una inyección sin aguja. Una dosis intramuscular típica es de aproximadamente 0,5 ml.

La divulgación se puede utilizar para provocar inmunidad sistémica y/o de la mucosa.

El tratamiento de dosificación puede ser un programa de dosis única o un programa de dosis múltiple. Pueden usarse múltiples dosis en un programa de inmunización primaria y/o en un programa de inmunización de refuerzo. Un programa de dosis principal puede ir seguido de un programa de dosis de refuerzo. El momento adecuado entre las dosis de sensibilización (por ejemplo, entre 4-16 semanas) y entre la sensibilización y el refuerzo, se puede determinar de forma rutinaria.

General

La expresión "que comprende" abarca "que incluye" así como "que consiste en" p.ej. una composición "que comprende" X puede consistir exclusivamente en X o puede incluir algo adicional p.ej. X Y.

El término “aproximadamente” en relación con un valor numérico x es opcional y significa, por ejemplo x ± 10%.

La palabra “sustancialmente” no excluye “completamente”, p.ej. una composición que está “sustancialmente desprovista” de Y puede estar completamente desprovista de Y. Cuando es necesario, la palabra “sustancialmente” se puede omitir de la definición de la divulgación.

Las referencias a un porcentaje de identidad de secuencia entre dos secuencias de aminoácidos significan que cuando se alinean, ese porcentaje de aminoácidos coincide al comparar las dos secuencias. Dicho alineamiento y el porcentaje de homología o identidad de secuencia se pueden determinar utilizando programas informáticos conocidos dentro de la especialidad, por ejemplo, los descritos en la sección 7.7.18 de la referencia 84. Un alineamiento preferente se determina según el algoritmo de búsqueda de homología de Smith-Waterman utilizando una búsqueda de hueco afín con una penalización de apertura de hueco de 12 y una penalización de extensión de hueco de 2, matriz BLOSUM de 62. El algoritmo de búsqueda de homología Smith-Waterman es muy conocido y se desvela en la referencia 85.

Se utiliza la numeración "GI". Un número GI "Identificador GenInfo", es una serie de dígitos asignado consecutivamente para cada registro de secuencia procesado por NCBI cuando se añaden las secuencias a su base de datos. El número GI no tiene nada que ver con el número de acceso del registro de la secuencia. Cuando se actualiza la secuencia (p.ej. para corrección o para añadir más anotaciones o información), recibe un nuevo número GI. Por lo tanto, la secuencia asociada con un número GI determinado no cambia nunca.

Cuando la divulgación se refiere a un “epítopo”, dicho epítopo puede ser un epítopo de linfocito B y/o un epítopo de linfocito T. Dichos epítopos se pueden identificar empíricamente (p.ej. utilizando PEPSCAN [86,87] o procedimientos similares) o se pueden predecir (p.ej. utilizando el índice antigénico de Jameson-Wolf [88], enfoques basados en matrices [89], MAPITOPE [90], TEPITOPE [91,92], redes neurológicas [93], OptiMer & EpiMer [94, 95], ADEPT [96], Tsites [97], hidrofilia [98], índice antigénico [99] o los procedimientos desvelados en las referencias 100-101, etc.). Los epítopos son las partes de un antígeno que son reconocidas y que se unen a los sitios de unión a antígeno de anticuerpos o receptores de linfocitos T y se pueden denominar también “determinantes antígenos”.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 muestra una micrografía de las vesículas de la divulgación purificadas desde cultivo.

La Figura 2 muestra 2D SDS-PAGE de vesículas de S. sonnei AtoiR AgaiU.

La Figura 3 muestra LPS de vesículas en varias cepas indicadas, manchadas con anticuerpo anti-núcleo.

La Figura 4 muestra un inmuno-manchado de dos proteínas 2D-separadas de vesículas utilizando suero de ratones inmunizados.

La Figura 5 muestra SDS-PAGE de bacterias cultivadas en diferentes condiciones.

La Figura 6 muestra proteínas adsorbidas en vesículas. Las calles de izquierda a derecha: 1) marcador de peso molecular de proteína, 2) Ss OMB 10 mg, 3) Ss OMB 2 mg, 4) Ss OMB 10 mg adsorbido sobre allum durante 1 mes.

La Figura 7 muestra los datos de FACS para las cepas indicadas.

Mejores modos de realización de la divulgación

Preparación de muíante de S.sonnei

Se suprimió el gen toIR de S.sonnei de tipo silvestre 53G utilizando el sistema A Red [11,102]. Se preparan las células competentes transformadas con los plásmidos A Red y se transforman después con un fragmento lineal diseñado para intercambiar el gen toIR por un gen de resistencia a antibiótico por recombinación homóloga. Se seleccionan los clones que han integrado el fragmento en el cromosoma según su resistencia al antibiótico y se verifica la supresión de toIR por PCR u otras técnicas. Los plásmidos A Red termo-sensibles se pueden eliminar después cultivando los nuevos clones a 37°C.

Se confirmó la ausencia de expresión TolR en este mutante AtoIR y comparado con el aislado de tipo silvestre original. Se confirmó la liberación de más vesículas al medio de cultivo durante el crecimiento.

Se suprimió también el gen galU de manera similar para proporcionar un mutante simple AgalU y un mutante doble AtoIRAgalU. Se confirma que las vesículas liberadas por los mutantes tienen un LPS defectuoso que carece de antígeno O.

Se prepara una cepa mutante doble AtoIRAmsbB con modificación de LPS de la misma manera.

Se ha eliminado también el plásmido de virulencia de las cepas AtoIR y AtoIRAmsbB.

Preparación del mutante de S.flexneri

Se suprimió el gen toIR de S. fIexneri utilizando el sistema A Red tal como se ha descrito antes para S. sonnei. Se anuló la biosíntesis de antígeno O en S. fIexneri por deleción de un fragmento cromosómico que comprendía el gen completo rfbG así como partes de rfbF y rfc, con el resultado de la activación de los tres genes. Se generó la deleción utilizando un sistema A Red, abreviado ArfbG.

Se ha generado de la misma forma un mutante doble AtoIRArfbG.

Se ha generado de la misma forma un mutante doble AtoIRAhtrB que contiene modificación de LPS.

También se ha eliminado el plásmido de virulencia de estas cepas.

Purificación de vesículas

Se puso en marcha la fermentación de la cepa doble mutante AtoIRAgalU en las siguientes condiciones: pH 7 ,1 ,37°C, oxígeno disuelto mantenido a un 30 % de saturación controlando la agitación y estableciendo ventilación máxima. Se controló el pH por adición de 4M pm de hidróxido de amonio. Se controló la formación de espuma por adición de 10% PPG durante el ciclo. El medio consistió en los siguientes componentes: KH²PO⁴5 g/l, K²HPO⁴20 g/l y extracto de levadura 30 g/l. Después de esterilizar el medio por autoclaveado, se añadieron glicerol 15 g/l y MgSO⁴2 mM antes de la inoculación. El inóculo de cultivo fue 5 % del volumen del fermentador. El proceso de fermentación tardó aproximadamente 13 horas y se midió la concentración celular según la densidad óptica a 600 nm.

Se llevó a cabo el proceso de fermentación de la cepa mutante doble AtoIRAmsbB de S.sonnei con un medio definido: glicerol 30 g/1, KH²PO⁴13,3 g/1, (NH⁴)²HPO⁴4 g/l, MgSO⁴ -7H²O (1 M) 2 ml, ácido cítrico 1,7 g/l, C o C h ^ O 2,5 mg/l, MnCl² -4H²O 15 mg/l, CuCL-2H²O 1,5 mg/l, H³BO³ 3 mg/l, Na²MoO⁴ -2H²O 2,5 mg/l, Zn(CH³COO)² -2H²O 13 mg/l, citrato férrico 2pM , tiamina 50 mg/l, ácido nicotínico 10 mg/l, ácido L-aspártico 2,5 g/l.

Se purificaron las vesículas producidas en el caldo de cultivo de fermentación aplicando dos etapas TFF consecutivas (filtración de flujo tangencial): micro-filtración a 0,22 pm y a continuación una segunda microfiltración a 0,1 pm. Durante la primera etapa de filtración, se separaron las vesículas de la biomasa por TFF a través de un casete de tamaño de poro de 0,22 pm. Se concentró primero la biomasa 4 veces y tras cinco etapas de diafiltración contra PBS, se recogieron las vesículas en el filtrado. En la segunda etapa, se siguió microfiltrando el filtrado de la TFF de 0,22 pm a través de un casete de límite 0,1 pm, para purificar las vesículas desde las proteínas solubles. Las vesículas no pudieron pasar por el casete de filtro. Después de cinco diafiltraciones, se recogió el material retenido que contenía las vesículas.

Se observó el producto purificado final con microscopio de trasferencia electrónica (Figura 1). Las vesículas tenían un tamaño homogéneo de aproximadamente 50 nm de diámetro.

Se purificaron las vesículas de mutantes de S.flexneri de la misma forma después de cultivar varias cepas en medio de extracto de levadura utilizado para AtoIRAgalU.

Caracterización de vesículas

Un enfoque proteómico confirmó que las vesículas eran membranas externas esencialmente puras. A diferencia de las vesículas de membrana externa convencionales (OMV) derivadas por interrupción de la membrana externa, las vesículas conservan proteínas lipófilas y están esencialmente desprovistas de componentes de membrana interna y citoplásmica.

Las vesículas de las cepas de S.sonnei y S.flexneri fueron desnaturalizadas con un detergente y se identificaron las proteínas con un enfoque CL-EM/EM. Alternativamente, se separaron las vesículas con s Ds PAGE o 2D gel electroforesis (Figura 2). Se eliminaron las bandas visibles y los puntos del gel y se identificaron las proteínas a través de la huella de masa de la proteína. Se estudió la cantidad relativa de diferentes proteínas por análisis de densitometría de bandas o puntos SDS-PAGE desde gel 2D.

En la Figura 3 se muestra un desplazamiento en la movilidad de LPS en la cepa mutante AgalU en comparación con Shigella y E. coli de tipo silvestre (todas las cepas están en un fondo AtolR).

Se recurrió a un segundo enfoque proteómico, basado en la digestión superficial, para caracterizar las porciones expuestas de proteínas de membrana. Se identificó un grupo de proteínas como reactivas con los sueros de ratones inmunizados con las vesículas, y se observó que muchas de ellas se conservaban en un gran panel de cepas. Se sabe muy poco sobre la estructura de la mayoría de las proteínas que integran la membrana externa. Se investigó el proteoma de la superficie de las vesículas por tratamiento con una proteasa y la recuperación e identificación a través de CL-EM/EM de los péptidos liberados. Dado que las vesículas deberían representar la superficie de toda la célula bacteriana viva, este mapa debería ser representativo de las proteínas expuestas en la superficie de S.sonnei.

Con estos y otros enfoques, se han observado las 129 proteínas enumeradas en la Tabla 1 en las vesículas.

Inmunogeneicidad de las vesículas

Ratones inmunizados con vesículas de cepa AtolRAgalU producen suero que reacciona con 2D gel de las vesículas, tal como se muestra en la Figura 4. Por tanto, las vesículas son inmunogénicas.

Los ratones recibieron 2 pg o 10 pg de vesículas AtolRAgalU de S.sonnei (medidas como el total de proteínas) con y sin adyuvante (hidróxido de aluminio o completo de Freund). Se llevó a cabo un procedimiento ELISA clásico para analizar la producción de IgG en los sueros obtenidos de los estudios de inmunización. Los sueros de todos los grupos de ratones demostraron un alto nivel de producción de IgG específica de vesícula. No se detectaron diferencias significativas en la producción de IgG cuando se utilizaron las vesículas en solitario o en combinación con un adyuvante. El grupo inmunizado con la dosis más baja de 2 pg presentaron el mismo nivel de IgG específico de vesícula que el grupo inmunizado con 10 pg, lo que demuestra que a una baja dosis la vacuna puede ser viable es decir, más dosis por dólar. Las vesículas de otras cepas de S.sonnei, así como S.flexneri fueron igualmente inmunogénicas.

Se sometieron a ensayo los sueros estimulados contra vesículas para determinar la reactividad con tres bacterias diferentes: S.sonnei g 53, S.flexneri 2a 2457T o S.flexneri 5 M90T. Se mancharon las muestras con una Ab secundaria marcada y se analizaron por citometría e flujo. Tal como se muestra en la Figura 7, las cepas S.sonnei y S.flexneri reaccionan con los sueros.

Por tanto, el enfoque de vesícula tiene un fuerte potencial para producir vacunas eficaces y a bajo coste y se puede extender a diferentes cepas de Shigella para una vacuna de amplio espectro.

Absorción de vesícula

Se combinaron las vesículas con hidróxido de aluminio (2 mg/ml) para determinar la adsorción. Se almacenó el material adsorbido a 4°C durante 1 día, 1 semana o 1 mes. Se adsorbieron totalmente las vesículas al cabo de 1 día y no hubo evidencia de desorpción incluso al cabo de 1 mes (Figura 6).

Crecimiento con lim itación del hierro

La Figure 5 muestra proteínas expresadas por Shigella cultivadas en varias condiciones. En la calle, se cultivaron las bacterias en presencia de 200 pM de FeSO4 mientras que en la calle 5 el cultivo tenía 200 pM de dipiridilo. El inserto muestra que tres proteínas se regulan a la alza en condiciones de limitación del hierro. Estas tres proteínas fueron identificadas como receptor de membrana externa FepA (GI 74311118), el receptor de colicina I (GI 74312677), y el receptor de sideroforo férrico putativo (GI 74313972). Estas proteínas se conservan bien entre Shigella spp. y las enterobacteriaceae y son potencialmente altamente inmunogénicas. Por lo tanto el cultivo de Shigella en condiciones de limitación de hierro puede suponer una liberación de vesículas que, en comparación con las condiciones de crecimiento normal, están enriquecidas para estas proteínas.

Se entenderá que la divulgación se ha descrito a modo de ejemplo únicamente y se pueden realizar modificaciones mientras permanecen dentro del alcance de la divulgación.

TABLA 1

(continuación)

(continuación)

(continuación)

(continuación)

Se identificaron las SEQ ID NO: 70, 71, 73, 74, 76, 111, 112, 114-129 y 131-135 desde vesículas de S.sonnei AtoiR. Se identificaron las SEQ ID NO: 8-15 y 17-58 desde vesículas de S.sonnei AtoiRAgaiU. Se identificaron las SEQ ID NO: 83, 94, 97 y 107 desde vesículas de S.fiexneri AtoiR. Se identificaron las SEQ ID NO: 68, 69, 72, 75, 77-82, 84­ 93, 95, 96, 98-106, 108-10, 113, 130 y 136 desde vesículas de S.fiexneri AtoiRArfbG. Se identificaron las SEQ ID NO: 60-67 desde digestión superficial de S.sonnei.

Subgrupo 1: SEQ ID NO: 68, 69, 72, 75, 77-110, 113, 130 y 136.

Subgrupo 2: SEQ ID NO: 8-15, 17-58, 60-67, 70, 71, 73, 74, 76, 111, 112, 114-129 y 131-135.

Subgrupo 3: SEQ ID NO: 1-60.

Nota: SEQ ID NO: 18 es igual que la SEQ ID NO: 5; SEQ ID NO: 33 es igual que la SEQ ID NO: 2; las SEQ ID NO: 9 y 16 están relacionadas (~97 % de identidad); las SEQ ID NO: 23 y 59 están relacionadas (~98 % de identidad). REFERENCIAS

[1] Kweon (2008) Curr Opin Infect Dis. 21(3):313-8.

[2] Henry y col. (2004) Res Microbiol 155:437-46.

[3] Sandlin y col. (1995) Infect. Immun., 63:229-37.

[4] Edwards-Jones y col. (2004) Microbiol 150:1079-84.

[5] Kohler y col. (2002) Infect Immun 70:1150-8.

[6] d'Hauteville y col. (2002) J Immunol. 168: 5240-51.

[7] Clementz y col. (1997) J. Biol. Chem. 16:10353-60.

[8] Nichols y col. (1997) J. Endotoxin Res. 4:163-72.

[9] Liu y col. (2005) Sci China C Life Sci. 48(3):228-40.

[10] Beloin y col. (2003) Mol Genet Genomics. 270(1):66-77.

[11] Day y col. (2001) Infect Immun 69:7471-80.

[12] Erlandson & Mackey (1958) J Bacteriol 75(3): 253-7.

[13] Patente estadounidense US-5681736.

[14] Uyttendaele y col. (2001) International journal of food microbiology 70(3):255-65.

[15] Gennaro (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy. 20a Edición, ISBN: 0683306472.

[16] Patente internacional WO90/14837.

[17] Podda & Del Giudice (2003) Expert Rev Vaccines 2:197-203.

[18] Podda (2001) Vaccine 19: 2673-2680.

[19] Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach (eds. Powell & Newman) Plenum Press 1995 (ISBN 0-306-44867-X).

[20] Vaccine Adjuvants: Preparation Methods and Research Protocols (Volumen 42 de Methods in Molecular Medicine series). ISBN: 1-59259-083-7. Ed. O'Hagan.

[21] Allison & Byars (1992) Res Immunol 143:519-25.

[22] Hariharan y col. (1995) Cancer Res 55:3486-9.

[23] Patente estadounidense US-2007/014805.

[24] Patente internacional WO95/11700.

[25] Patente estadounidense US-6.080.725.

[26] Patente internacional WO2006/113373.

[27] Patente internacional WO2005/097181.

[28] Patente estadounidense 5.057.540.

[29] Patente internacional WO96/33739.

[30] Patente europea EP-A-0109942.

[31] Patente internacional WO96/11711.

[32] Patente internacional WO00/07621.

[33] Barr y col. (1998) Advanced Drug Delivery Reviews 32:247-271.

[34] Sjolanderet y col. (1998) Advanced Drug Delivery Reviews 32:321-338.

[35] Patente europea EP-A-0689454.

[36] Johnson y col. (1999) Bioorg Med Chem Lett 9:2273-2278.

[37] Evans y col. (2003) Expert Rev Vaccines 2:219-229.

[38] Meraldi y col. (2003) Vaccine 21:2485-2491.

[39] Pajak y col. (2003) Vaccine 21:836-842.

[40] Kandimalla y col. (2003) Nucleic Acids Research 31:2393-2400.

[41] Patente internacional WO02/26757.

[42] Patente internacional WO99/62923.

[43] Krieg (2003) Nature Medicine 9:831-835.

[44] McCluskie y col. (2002) FEMS Immunology and Medical Microbiology 32:179-185.

[45] Patente internacional WO98/40100.

[46] Patente estadounidense US 6.207.646.

[47] Patente estadounidense US 6.239.116.

[48] Patente estadounidense US 6.429.199.

[49] Kandimalla y col. (2003) Biochemical Society Transactions 31 (parte 3):654-658.

[50] Blackwell y col. (2003) J Immunol 170:4061-4068.

[51] Krieg (2002) Trends Immunol 23:64-65.

[52] Patente internacional WO01/95935.

[53] Kandimalla y col. (2003) BBRC 306:948-953.

[54] Bhagat y col. (2003) BBRC 300:853-861.

[55] Patente internacional WO03/035836.

[56] Schellack y col. (2006) Vaccine 24:5461-72.

[57] Lingnau y col. (2007) Expert Rev Vaccines 6:741-6.

[58] Patente internacional WO2004/084938.

[59] Patente internacional WO95/17211.

[60] Patente internacional WO98/42375.

[61] Beignon y col. (2002) Infect Immun 70:3012-3019.

[62] Pizza y col. (2001) Vaccine 19:2534-2541.

[63] Pizza y col. (2000) Int J Med Microbial 290:455-461.

[64] Scharton-Kersten y col. (2000) Infect Immun 68:5306-5313.

[65] Ryan y col. (1999) Infect Immun 67:6270-6280.

[66] Partidos y col. (1999) Immunol Lett 67:209-216.

[67] Peppoloni y col. (2003) Expert Rev Vaccines 2:285-293.

[68] Pine y col. (2002) J Control Release 85:263-270.

[69] Tebbey y col. (2000) Vaccine 18:2723-34.

[70] Domenighini y col. (1995) Mol Microbiol 15:1165-1167.

[71] Patente internacional WO99/40936.

[72] Patente internacional WO99/44636.

[73] Singh y col] (2001) J Cont Release 70:267-276.

[74] Patente internacional WO99/27960.

[75] Patente estadounidense US 6.090.406.

[76] Patente estadounidense 5.916.588.

[77] Patente europea EP-A-0626169.

[78] Stanley (2002) Clin Exp Dermatol 27:571-577.

[79] Jones (2003) Curr Opin Investig Drugs 4:214-218.

[80] Patente internacional WO99/11241.

[81] Patente internacional WO94/00153.

[82] Patente internacional WO98/57659.

[83] Solicitudes de patente europea 0835318, 0735898 y 0761231.

[84] Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel y col., eds., 1987) Supplement 30.

[85] Smith & Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2:482-489.

Claims (1)

1. REIVINDICACIONES

   1. Una cepa de Shigella que no expresa una enzima HtrB funcional, en la que la cepa de Shigella expresa no más de 4 proteínas entre TolA, TolB, TolQ, TolR y Pal.

   2. La cepa de Shigella de la reivindicación 1, que es una inactivación de htrB.

   3. La cepa de Shigella de la reivindicación 1 o 2 que no expresa una proteína TolR.

   4. La cepa de Shigella de la reivindicación 2 o 3, en la que la bacteria expresa 4 de las proteínas, y no TolR.

   5. La cepa de Shigella de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, que es una cepa AtolR de Shigella. 6. La cepa de Shigella de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en la que la bacteria no expresa un lipopolisacárido nativo de Shigella.

   7. La cepa de Shigella de la reivindicación 6, en la que la bacteria no expresa un antígeno O de Shigella nativo. 8. La cepa de Shigella de la reivindicación 1-7, en la que la cepa es una cepa AtolRAgalU.

   9. La cepa de Shigella de cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en la que se inactiva un gen stxA y/o stxB.

   10. Un procedimiento de preparación de vesículas de Shigella que comprende una etapa de separación de las vesículas desde un medio de cultivo que comprende una bacteria de Shigella que no expresa una enzima HtrB funcional, que ha sido cultivada en condiciones que permiten la liberación de vesículas al medio por la bacteria. 11. El procedimiento de la reivindicación 10, en el que las bacterias se han cultivado en condiciones de limitación de hierro.

   12. Una vesícula aislada o que se puede obtener de una bacteria de Shigella que no expresa una enzima HtrB funcional.

   13. Una composición que comprende vesículas que, durante el cultivo de una cepa de Shigella de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 o que se puede obtener a través del procedimiento de la reivindicación 10 u 11, se liberan al medio de cultivo.

   14. La composición de la reivindicación 13, que no comprende ninguna bacteria viva y/o entera.

   15. Una composición que comprende vesículas, en la que las vesículas se pueden obtener mediante el procedimiento de las reivindicaciones 10 u 11 o en la que las vesículas están presentes en el filtrado que se puede obtener por filtración a través de un filtro de 0,22 micrómetros de un medio de cultivo en el que se ha desarrollado una cepa de Shigella de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9.

   16. Medios de cultivo que comprenden la cepa de Shigella de las reivindicaciones 1 a 9 o que se pueden obtener a través del procedimiento de la reivindicación 10, que han sido desarrollados en condiciones que permiten la liberación de vesículas al medio por las bacterias.