WO2019163785A1 - 膜小胞組成物の製造方法 - Google Patents

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fungi
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龍馬 中尾
由莉 吉益
池田　剛
智樹 生田
康平 室井
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株式会社山田養蜂場本社
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    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a membrane vesicle composition.
  • the present invention also relates to a method for producing a pharmaceutical product, quasi-drug, cosmetic product or food, a method for producing a vaccine, and a method for producing an immunity stimulating agent.
  • Non-patent Document 1 Bacteria and fungi are widely known to produce membrane vesicles.
  • Non-patent Document 2 membrane vesicles collected from pathogenic bacteria are used in the production of vaccines for diseases such as bacterial meningitis.
  • Non-patent Document 3 it has been reported that lactic acid bacteria produce membrane vesicles and the membrane vesicles have immunomodulating ability.
  • Membrane vesicles produced by bacteria or fungi are usually collected from a culture solution of bacteria or fungi by ultracentrifugation. However, since the amount of membrane vesicles produced by bacteria or fungi is very small and the amount obtained by the above method is small, a method for producing membrane vesicles more efficiently is demanded.
  • An object of the present invention is to provide a method capable of more efficiently obtaining bacterial and / or fungal membrane vesicles.
  • artepilin C has an action of promoting the production of membrane vesicles of bacteria and fungi.
  • the method for producing a membrane vesicle composition of the present invention includes a step of treating bacteria and / or fungi with Artepilin C to cause the bacteria and / or fungi to produce membrane vesicles. According to the above production method, bacterial and / or fungal membrane vesicles can be obtained efficiently.
  • the bacteria and / or fungi may be at least one selected from the group consisting of Gram-positive bacteria, Gram-negative bacteria, and yeast.
  • the present invention also provides a method for producing a pharmaceutical product, a quasi-drug, a cosmetic product, or a food product, which comprises the step of blending the membrane vesicle composition obtained by the above production method.
  • the pharmaceutical, quasi-drug, cosmetics, or foodstuff containing the useful component which bacteria and / or fungi produce in a membrane vesicle can be manufactured.
  • the present invention also provides a method for producing a vaccine containing the membrane vesicle composition obtained by the above production method.
  • the vaccine containing a membrane vesicle composition can be manufactured more efficiently and simply.
  • the present invention is also a method for producing an immune activator, wherein the immune activator comprises a membrane vesicle composition obtained by the above production method as an active ingredient, wherein the bacterium and / or fungus is The manufacturing method which has an immunity activation effect
  • the present invention also provides a bacterial and / or fungal membrane vesicle production promoter containing artepilin C as an active ingredient.
  • bacterial and / or fungal membrane vesicles can be obtained more efficiently.
  • HS-AFM image showing bacteria before and after artepilin C treatment. It is a graph which shows the amount of bacterial membrane vesicle production. It is a scanning electron microscope image which shows Escherichia coli Nissle 1917 microbial cells after artepilin C processing. It is a scanning electron microscope image which shows Lactobacillus kunkeei JCM 16173 microbial cells after the treatment with artepilin C. It is a scanning electron microscope image which shows Lactobacillus kunkeei BPS402 microbial cells after the treatment with artepilin C.
  • the method for producing a membrane vesicle composition according to this embodiment includes a step of treating bacteria and / or fungi with Artepilin C to cause the bacteria and / or fungi to produce membrane vesicles. Since Artepilin C has an action of promoting the production of bacterial and fungal membrane vesicles, membrane vesicles can be obtained more efficiently and simply by the production method.
  • ⁇ Treatment of bacteria / fungi with Artepilin C By treating bacteria and / or fungi with artepilin C, production of membrane vesicles on the membrane outside the body of the bacteria and / or fungi can be promoted.
  • the treatment of bacteria or fungi with Artepilin C can be performed by, for example, allowing bacteria and / or fungi and Artepilin C to coexist in a medium.
  • the medium may be, for example, liquid, semi-solid or solid.
  • the treatment of bacteria and / or fungi with Artepilin C can be performed, for example, by adding Artepilin C to a culture solution or solid medium containing viable cells.
  • the treatment time of bacteria and / or fungi with Artepilin C may be, for example, 1 minute or longer, and may be 5 minutes or longer, 10 minutes or longer, 15 minutes or longer, 20 minutes or longer, 30 minutes or longer.
  • the processing time may be, for example, 1 hour or less.
  • the concentration of artepilin C to be treated for bacteria and / or fungi may be, for example, 1 to 2000 ⁇ M, 10 to 1500 ⁇ M, 50 to 1200 ⁇ M, or 2 to 75 ⁇ M in a medium containing bacteria and / or fungi. It may be 5-50 ⁇ M or 7-30 ⁇ M.
  • the treatment of bacteria with artepilin C is preferably performed in a liquid.
  • the artepilin C used in the production method according to the present embodiment may be synthesized by a known method, for example, or may be derived from natural raw materials such as propolis.
  • artepillin C a product obtained by purifying propolis and increasing the artepilin C concentration in the propolis may be used.
  • artepilin C for example, artepilin C (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) can be used.
  • the concentration of ursolic acid in the medium containing bacteria and / or fungi is preferably 62.5 ⁇ M or less, more preferably not containing ursolic acid, More preferably, no propolis-derived component other than artepilin C coexists in the medium.
  • membrane vesicles can be confirmed, for example, by observing the cells with a microscope such as a transmission or manipulation electron microscope or an atomic force microscope.
  • the membrane vesicle composition obtained by the production method according to the present embodiment may consist only of membrane vesicles produced by bacteria and / or fungi, and contains a part of the membrane vesicles. In addition to the membrane vesicles or some components of the membrane vesicles, other components may be included.
  • the membrane vesicle composition may be in the form of a suspension, paste, powder or the like.
  • the membrane vesicle composition obtained by the production method of the present embodiment may contain, for example, 1 to 100% by mass of components derived from membrane vesicles, and 10% by mass or more of components derived from membrane vesicles 20 mass% or more, 30 mass% or more, 50 mass% or more, 70 mass% or more, 90 mass% or more, 95 mass% or more, or 99 mass% or more.
  • the membrane vesicle composition preferably includes a membrane vesicle that maintains a structure covered with the membrane without being decomposed. Moreover, it is preferable that a membrane vesicle composition does not contain crushed fragments of bacteria and / or fungal cells.
  • Bacteria and fungi are known to have the ability to produce membrane vesicles in a wide range of species. Bacteria used in the production method according to this embodiment are not particularly limited as long as they have membrane vesicle production ability.
  • the bacterium may be a gram negative bacterium or a gram positive bacterium.
  • the bacteria may be cocci, bacilli, spirals, and the like.
  • the bacterium may be an aerobic bacterium, an anaerobic bacterium, or a facultative anaerobic bacterium.
  • bacteria examples include meningococcus, periodontal disease, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Neisseria gonorrhoeae, Vibrio parahaemolyticus, Legionella, Shigella, Bordetella pertussis, Salmonella, Helicobacter pylori, Lyme (Lyre disease Borrelia), Streptococcus pneumoniae , Staphylococcus aureus, Streptococcus, Tuberculosis, Tetanus, Clostridium botulinum, Bacillus anthracis, Diphtheria, and other pathogenic bacteria, lactic acid bacteria, bifidobacteria, Bacillus subtilis, rhizobia (may be in the form of bacteroid), prebotella, It may be Clostridium or the like.
  • the fungus may be yeast, for example.
  • the membrane vesicle produced by the pathogenic bacterium or a component derived therefrom can be used as an immunogen for a vaccine targeting the pathogenic bacterium by a known method. Therefore, the membrane vesicle composition obtained by the method for producing a membrane vesicle composition according to this embodiment can be used for the production of a vaccine containing the composition.
  • the vaccine may be therapeutic or prophylactic.
  • the vaccine may be for humans and may be for animals such as fish, birds and mammals.
  • the vaccine may be in powder or liquid form.
  • the form of the vaccine is not particularly limited, and may be, for example, an uncoated tablet, a sugar-coated tablet, a granule, a powder, a tablet, or a capsule (hard capsule, soft capsule, seamless capsule).
  • the mode of administration is not particularly limited, and for example, it may be ingested by injection, percutaneously, orally or nasally.
  • membrane vesicles produced by the bacteria and / or fungi are also contained in membrane vesicles produced by the bacteria and / or fungi. Therefore, membrane vesicles obtained from bacteria and / or fungi can be used as components having the effects of the bacteria and / or fungi. Therefore, a membrane vesicle composition having an immunity activation effect can be obtained by producing a membrane vesicle using, for example, a bacterium or fungus having an immunity activation effect.
  • a membrane vesicle composition comprising a step of treating bacteria and / or fungi having an immunity stimulating action with artepilin C to cause the bacteria and / or fungi to produce membrane vesicles.
  • a method for producing an immunity stimulating agent contained as an active ingredient is provided.
  • the lactic acid bacteria may be, for example, Lactobacillus genus, Streptococcus genus, Pediococcus genus, Leuconostoc genus, Enterococcus genus, Lactococcus genus, Bifidobacterium genus and the like.
  • Lactobacillus genus Streptococcus genus
  • Pediococcus genus Pediococcus genus
  • Leuconostoc genus Enterococcus genus
  • Lactococcus genus Lactococcus genus
  • Bifidobacterium genus Bifidobacterium genus and the like.
  • the lactic acid bacterium may be, for example, Lactobacillus kunki, and is preferably Lactobacillus kunkee BPS402 (Accession number FERM BP-11439). Lactobacillus kunkee BPS402 has been found to have an immunity stimulating action based on a high IgA production promoting action. Therefore, in the method for producing a bacterial membrane vesicle composition according to this embodiment, for example, by using Lactobacillus kunkee BPS402 as a bacterium, a bacterial membrane vesicle composition having an effect of stimulating immunity can be obtained. .
  • an immunopotentiator or an immunoglobulin production promoter such as IgA, which contains a membrane vesicle composition derived from Lactobacillus kunkee BPS402 as an active ingredient.
  • Lactobacillus kunki BPS402 was incorporated by the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Biological Deposit Center (1st, 1st East, 1st Street, Tsukuba City, Ibaraki, Japan, 305-8566, currently independent) It is deposited under the accession number FERM P-22177 at the Patent Biological Depositary Center (Product Evaluation Technology Foundation) (2-5-8, Kazusa-Kamashita, Kisarazu, Chiba, Japan, Room No. 120, 292-0818, Japan). Is possible. The strain has been transferred to an international deposit and the deposit number is FERM BP-11439.
  • bacteria and / or fungi used in the method for producing the membrane vesicle composition according to this embodiment those prepared by culturing in advance under conditions suitable for each bacterium and / or fungus can be used.
  • the size of membrane vesicles produced by bacteria and / or fungi in the production method according to this embodiment may be, for example, 10 to 600 nm, 20 to 400 nm, or 40 to 300 nm.
  • a membrane vesicle has a structure covered with a cell membrane.
  • Membrane vesicles may contain, for example, nucleic acids such as DNA and RNA, proteins, signal substances, pathogens, immunomodulators, and other physiologically active substances, such as bacteria and / or lipopolysaccharides, lipoproteins, peptidoglycans, etc. Or the component derived from the cell membrane or cell wall of fungi may be included.
  • Membrane vesicles can be derived, for example, from the cell membrane or outer membrane of bacteria and / or fungi.
  • the method for producing a membrane vesicle composition according to this embodiment may further include a step of isolating the membrane vesicle composition.
  • Membrane vesicles produced on bacterial and / or fungal membranes or compositions containing such membrane vesicles can be isolated by known methods. Specifically, for example, the cells are removed from the culture solution containing the cells or the liquid in which the medium containing the cells is suspended or dissolved by a centrifuge, and the supernatant is filtered, purified, or the like as necessary. Can be obtained through The supernatant may be further subjected to ultracentrifuge to separate and purify membrane vesicles and other substances. The supernatant may be concentrated and then purified.
  • the membrane vesicle composition obtained by the production method according to this embodiment may be used together with the microbial cells without being isolated from the microbial cells.
  • the membrane vesicle composition obtained by the method for producing a membrane vesicle composition according to this embodiment can be used as a pharmaceutical, quasi-drug, cosmetic and / or food component for the production of these products.
  • one embodiment of the present invention is a method for producing a pharmaceutical product, quasi-drug, cosmetic product and / or food comprising the step of blending the membrane vesicle composition obtained by the method for producing the membrane vesicle composition. I will provide a.
  • the membrane vesicle composition may be used for the production of the above-mentioned product after treatment such as dilution, concentration, drying, and heating, if necessary.
  • the bacteria and / or fungi are useful bacteria or fungi such as lactic acid bacteria
  • the components derived from the obtained membrane vesicles are used as pharmaceuticals, quasi drugs, cosmetics and / or food components.
  • a pharmaceutical, a quasi-drug, a cosmetic and / or a food having the effects of the bacteria and / or fungi can be produced.
  • a component derived from membrane vesicles obtained from bacteria and / or fungi having an immunostimulatory effect into raw materials of pharmaceuticals, quasi drugs, cosmetics and / or foods.
  • An quasi-drug for immunostimulation, a cosmetic for immunostimulation, and a food for immunostimulation can be produced.
  • the membrane vesicle composition can be blended into a pharmaceutical product, quasi-drug, cosmetic product or food by mixing the membrane vesicle composition prepared in advance with the raw material of the pharmaceutical product, quasi-drug product, cosmetic product or food product.
  • Membrane vesicles in the product may be obtained by combining Artepilin C and bacteria and / or fungi that produce membrane vesicles in pharmaceuticals, quasi drugs, cosmetics or foods. This may be done by producing a composition.
  • the pharmaceuticals, quasi drugs, cosmetics, and foods may contain artepilin C and bacteria and / or fungi that produce membrane vesicles.
  • the content of the membrane vesicle composition in pharmaceuticals, quasi drugs, cosmetics and foods may be, for example, 0.001% by mass or more, 0.01% by mass or more, 0.1% by mass or more, 1 mass% or more, 5 mass% or more, or 10 mass% or more may be sufficient.
  • the content of the membrane vesicle composition in pharmaceuticals, quasi drugs, cosmetics and foods is, for example, 100% by mass or less, 99% by mass or less, 95% by mass or less, 90% by mass or less, 70% by mass or less, It may be 50% by mass or less, 30% by mass or less, 10% by mass or less, 5% by mass or less, and 1% by mass or less.
  • membrane vesicles or components derived from membrane vesicles may be used as they are, tablets (including uncoated tablets, sugar-coated tablets, effervescent tablets, film-coated tablets, chewable tablets, troches, etc.), capsules Pills, pills, powders (powder), fine granules, granules, solutions, suspensions, emulsions, syrups, pastes, injections (in use, such as distilled water, amino acid infusion or electrolyte infusion) (Including the case where it is mixed and prepared as a liquid preparation).
  • These various preparations can be prepared by, for example, mixing a membrane vesicle composition which is an active ingredient and other ingredients as necessary to form the above dosage form.
  • Examples of other components used in pharmaceuticals or quasi-drugs include pharmaceutically acceptable excipients, binders, lubricants, disintegrants, emulsifiers, surfactants, bases, and dissolution aids. Agents, suspending agents and the like.
  • the cosmetics according to the present embodiment include components usually used in cosmetics, such as whitening agents, moisturizers, antioxidants, oily components, ultraviolet absorbers, surfactants, thickeners. , Alcohols, powder components, coloring materials, aqueous components, water, various skin nutrients, and the like can be appropriately blended as necessary.
  • Cosmetic dosage forms according to this embodiment include, for example, a solubilizing system, an emulsifying system, a powder system, an oil liquid system, a gel system, an ointment system, an aerosol system, a water-oil two-layer system, and a water-oil-powder three-layer system. It may be a system or the like.
  • the cosmetics include, for example, face wash, lotion, milky lotion, cream, gel, essence, cosmetic liquid, pack, mask, mist, UV preventive cosmetics and other basic cosmetics, foundation, lipstick, blusher, eye shadow, eyeliner, mascara Makeup cosmetics such as face wash, massage agent, cleansing agent, after shave lotion, pre-shave lotion, shaving cream, body soap, soap, shampoo, rinse, hair treatment, hair conditioner, hair styling agent, hair mist, hair It may be foam, hair liquid, hair gel, hair spray, hair restorer, antiperspirant, bath preparation, mouth rinse, oral cosmetic, dentifrice and the like.
  • the food according to the present embodiment may be a food that emphasizes the tertiary function (physical condition adjustment function) of the food.
  • Examples of the food in which the tertiary function of the food is emphasized include health food, functional indication food, nutritional supplement, supplement, and food for specified health use.
  • the food may be in any shape such as solid, liquid, paste and the like.
  • Examples of food include the following: soft drinks such as coffee, tea drinks, juices, carbonated drinks, milk drinks, lactic acid bacteria drinks, yogurt drinks, and sakes such as sake, western liquor, fruit liquor and honey liquor Beverages; Spreads such as custard cream; Pastes such as fruit paste; Western confectionery such as chocolate, donut, pie, cream puff, gum, jelly, candy, cookie, cake and pudding; Daifuku, rice cake, buns, castella, anmitsu and sheep candy Japanese confectionery; ice cream, popsicles, sorbet and other ice confectionery; cooked foods such as curry, beef bowl, miso soup, miso soup, soup, meat sauce, pasta, pickles, jam, etc .; dressing, sprinkles, umami seasonings and soup ingredients Seasoning.
  • soft drinks such as coffee, tea drinks, juices, carbonated drinks, milk drinks, lactic acid bacteria drinks, yogurt drinks, and sakes such as sake, western liquor, fruit liquor and honey liquor Beverages
  • Spreads such as custard cream
  • Artepilin C has an action of promoting the production of membrane vesicles of bacteria and fungi. Therefore, one embodiment of the present invention provides a bacterial and / or fungal membrane vesicle production promoter containing artepilin C as an active ingredient.
  • the specific aspect of artepilin C, bacteria and fungi in the membrane vesicle production promoter can be applied to the above-described method for producing a membrane vesicle composition.
  • Artepilin C and baccharin are present in the ethanol-extracted propolis used at concentrations of 9.5% by mass and 3.5% by mass, respectively. Therefore, Artepilin C is present at a concentration of 9.5 ⁇ g / mL in 100 ⁇ g / mL ethanol-extracted propolis aqueous solution.
  • the amount of membrane vesicle production per 1 ⁇ g / mL of artepilin C calculated from the result of artepilin C alone is 7.5 as shown in Table 1, it is assumed that artepilin C in ethanol-extracted propolis is artepilin C alone.
  • E. coli Esscherichia coli Nissle 1917
  • Lactobacillus Lactobacillus kunkeei JCM 16173, Lactobacillus kunkeei BPS402
  • Bifidobacterium ross An experiment was conducted to confirm this.
  • Various prepared microbial cells were suspended in a PBS buffer, a liquid containing the microbial cells was added onto the substrate, and the cells were adhered to the substrate at room temperature for 10 to 30 minutes. After the substrate was washed with PBS buffer, each test substance was dropped on the substrate and reacted at room temperature for 2 hours.
  • a solution obtained by dissolving artepilin C in a DMSO 10% aqueous solution at a concentration of 100 ⁇ M or 1000 ⁇ M was used.
  • a DMSO 10% aqueous solution was used.
  • the treated cells were fixed with PBS containing 2.5% glutaraldehyde / 2% paraformaldehyde and observed with a scanning electron microscope. The results are shown in FIGS.
  • any bacteria and fungi the effect of promoting membrane vesicle production by artepilin C was confirmed at concentrations of 100 ⁇ M and 1000 ⁇ M.
  • lactic acid bacteria almost no morphological changes were observed with the treatment, and a tendency for uniform formation of vesicles on the outer membrane was observed.
  • Membrane vesicle production activity was observed in E.

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Abstract

細菌及び／又は菌類をアルテピリンＣで処理して当該細菌及び／又は菌類に膜小胞を産生させる工程を含む、膜小胞組成物の製造方法が開示される。

Description

膜小胞組成物の製造方法
　本発明は、膜小胞組成物の製造方法に関する。本発明はまた、医薬品、医薬部外品、化粧品又は食品の製造方法、ワクチンの製造方法、及び免疫力賦活化剤の製造方法に関する。
　細菌及び菌類は広く膜小胞を産生することが知られている（非特許文献１）。細菌性髄膜炎等の疾患のワクチンの製造に、病原菌から採取した膜小胞が用いられている例がある（非特許文献２）。また、乳酸菌が膜小胞を産生し、当該膜小胞が免疫調節能を有することが報告されている（非特許文献３）。
Brown et al., Nature Reviews Microbiology, 2015, Vol.13, No.10, p620-630 Acevedo et al., Frontiers in Immunology, 2014, Vol. 5, No.121, p1-7 Al-Nedawi et al., The FASEB Journal, 2015, Vol. 29, p684-695
　細菌又は菌類が産生した膜小胞は、通常、細菌又は菌類の培養液から超遠心法によって採取される。しかしながら、細菌又は菌類が産生する膜小胞は微量であり、上記方法で得られる量は少ないため、より効率よく膜小胞を産生する方法が求められている。
　本発明は、細菌及び／又は菌類の膜小胞をより効率よく得ることができる方法を提供することを目的とする。
　本願発明者らは、アルテピリンＣに細菌及び菌類の膜小胞産生促進作用があることを見出した。
　本発明の膜小胞組成物の製造方法は、細菌及び／又は菌類をアルテピリンＣで処理して当該細菌及び／又は菌類に膜小胞を産生させる工程を含む。上記製造方法により、細菌及び／又は菌類の膜小胞を効率よく得ることができる。
　上記製造方法において、細菌及び／又は菌類は、グラム陽性菌、グラム陰性菌及び酵母からなる群から選ばれる少なくとも１つであってよい。
　本発明はまた、上記製造方法で得られた膜小胞組成物を配合する工程を含む、医薬品、医薬部外品、化粧品又は食品の製造方法を提供する。上記方法により、細菌及び／又は菌類が膜小胞中に産生する有用成分を含む医薬品、医薬部外品、化粧品又は食品を製造することができる。
　本発明はまた、上記製造方法で得られた膜小胞組成物を含むワクチンの製造方法を提供する。当該製造方法により、膜小胞組成物を含むワクチンをより効率よく簡便に製造することができる。
　本発明はまた、免疫力賦活化剤の製造方法であって、該免疫力賦活化剤が、上記製造方法で得られた膜小胞組成物を有効成分として含み、上記細菌及び／又は菌類が、免疫力賦活化作用を有するものである製造方法を提供する。
　本発明はまた、アルテピリンＣを有効成分とする細菌及び／又は菌類の膜小胞産生促進剤を提供する。
　本発明の製造方法によれば、細菌及び／又は菌類の膜小胞をより効率よく得ることができる。
アルテピリンＣ処理前後の細菌を示すＨＳ－ＡＦＭ像である。 細菌膜小胞産生量を示すグラフである。 アルテピリンＣ処理後のＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　Ｎｉｓｓｌｅ　１９１７菌体を示す走査型電子顕微鏡像である。 アルテピリンＣ処理後のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｋｕｎｋｅｅｉ　ＪＣＭ　１６１７３菌体を示す走査型電子顕微鏡像である。 アルテピリンＣ処理後のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｋｕｎｋｅｅｉ　ＢＰＳ４０２菌体を示す走査型電子顕微鏡像である。 アルテピリンＣ処理後のＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｌｏｎｇｕｍ　ＢＢ５３６菌体を示す走査型電子顕微鏡像である。 アルテピリンＣ処理後のＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　ｄ３０１０菌体を示す走査型電子顕微鏡像である。
　以下、本発明を実施するための形態について詳細に説明する。ただし、本発明は以下の実施形態に限定されるものではない。
　本実施形態に係る膜小胞組成物の製造方法は、細菌及び／又は菌類をアルテピリンＣで処理して当該細菌及び／又は菌類に膜小胞を産生させる工程を含む。アルテピリンＣは細菌及び菌類の膜小胞の産生を促進する作用を有するため、当該製造方法により、膜小胞をより効率よく簡便に得ることができる。
＜アルテピリンＣによる細菌／菌類の処理＞
　細菌及び／又は菌類をアルテピリンＣで処理することにより、当該細菌及び／又は菌類の体外の膜上での膜小胞産生を促進することができる。アルテピリンＣによる細菌又は菌類の処理は、具体的には例えば、細菌及び／又は菌類とアルテピリンＣとを培地中に共存させることにより行うことができる。培地は、例えば、液状、半固形状又は固形状であってよい。アルテピリンＣによる細菌及び／又は菌類の処理は、具体的には例えば、生菌体を含む培養液又は固形培地に、アルテピリンＣを添加して行うことができる。アルテピリンＣによる細菌及び／又は菌類の処理時間は、例えば１分以上であってよく、５分以上、１０分以上、１５分以上、２０分以上、３０分以上であってよい。上記処理時間は例えば１時間以下であってよい。
　細菌及び／又は菌類に処理するアルテピリンＣの濃度は、例えば、細菌及び／又は菌類を含む培地中、１～２０００μＭであってよく、１０～１５００μＭ、５０～１２００μＭであってもよく、２～７５μＭ、５～５０μＭ又は７～３０μＭであってもよい。アルテピリンＣによる細菌の処理は液中で行われることが好ましい。
　本実施形態に係る製造方法において用いられるアルテピリンＣとしては、例えば、公知の方法で合成されたものであってよく、プロポリス等の天然原料由来のものであってもよい。アルテピリンＣとしては、プロポリスを精製してプロポリス中のアルテピリンＣ濃度が高められたものを用いてもよい。アルテピリンＣの市販品としては例えばアルテピリンＣ（和光純薬工業株式会社）等を用いることができる。
　アルテピリンＣを細菌及び／又は菌類に処理する際には、細菌及び／又は菌類を含む培地中、ウルソール酸の濃度が６２．５μＭ以下であることが好ましく、ウルソール酸を含まないことがより好ましく、培地中にアルテピリンＣ以外のプロポリス由来成分が共存していないことが更に好ましい。これにより、膜小胞の産生をより促進することができ、菌体の溶菌に伴う膜小胞の汚染を防ぐことができる。
　膜小胞の産生は、例えば、透過型又は操作型電子顕微鏡、原子間力顕微鏡等の顕微鏡により菌体を観察することにより確認することができる。
＜膜小胞組成物＞
　本実施形態に係る製造方法により得られる膜小胞組成物は、細菌及び／又は菌類が産生した膜小胞のみからなるものであってよく、膜小胞の一部の成分を含むものであってもよく、膜小胞又は膜小胞の一部の成分に加えてその他の成分が含まれるものであってもよい。膜小胞組成物は、懸濁液、ペースト、粉末等の形態であってよい。
　本実施形態の製造方法により得られる膜小胞組成物は、膜小胞に由来する成分を、例えば１～１００質量％含むものであってよく、膜小胞に由来する成分を１０質量％以上、２０質量％以上、３０質量％以上、５０質量％以上、７０質量％以上、９０質量％以上、９５質量％以上、又は９９質量％以上含むものであってもよい。膜小胞組成物は、分解せずに膜に覆われた構造を維持している膜小胞を含むことが好ましい。また、膜小胞組成物は、細菌及び／又は菌類菌体の破砕断片等を含まないことが好ましい。
　細菌及び菌類は広い範囲の種類において膜小胞産生能を有することが知られている。本実施形態に係る製造方法において用いられる細菌としては、膜小胞産生能を有するものであれば特に限定されない。細菌は、グラム陰性菌又はグラム陽性菌であってよい。細菌は、球菌、桿菌、らせん菌等であってよい。細菌は、好気性菌、嫌気性菌、通性嫌気性菌のいずれであってもよい。細菌は、例えば、髄膜炎菌、歯周病菌、大腸菌、緑膿菌、淋菌、腸炎ビブリオ菌、レジオネラ菌、赤痢菌、百日咳菌、サルモネラ菌、ピロリ菌、ライム菌（ライム病ボレリア）、肺炎球菌、黄色ブドウ球菌、連鎖球菌、結核菌、破傷風菌、ボツリヌス菌、炭疽菌、ジフテリア菌等の病原細菌、乳酸菌、ビフィズス菌、枯草菌、根粒菌（バクテロイドの形態であってもよい）、プレボテラ、クロストリジウム等であってよい。菌類は例えば酵母であってよい。
　細菌として病原細菌を用いる場合、当該病原細菌が産生した膜小胞又はそれに由来する成分は、公知の方法により、当該病原細菌を対象とするワクチン用の免疫原として用いることができる。したがって、本実施形態に係る膜小胞組成物の製造方法により得られた膜小胞組成物は、当該組成物を含むワクチンの製造に用いることができる。ワクチンは治療用であってもよく、予防用であってもよい。ワクチンは、ヒト用であってよく、魚類用、鳥類用、ほ乳類用等の動物用であってよい。ワクチンは、粉末状又は液状であってよい。ワクチンの形態は特に限定されず、例えば、素錠、糖衣錠、顆粒、粉末、タブレット、カプセル（ハードカプセル、ソフトカプセル、シームレスカプセル）であってよい。ワクチンがヒト用である場合、投与形態は特に限定されず、例えば、注射摂取、経皮摂取、経口摂取、経鼻摂取されてもよい。
　乳酸菌等の有用細菌及び／又は菌類が分泌する有用成分は、当該細菌及び／又は菌類が産生する膜小胞中にも含まれることが知られている。したがって細菌及び／又は菌類から得られた膜小胞は、当該細菌及び／又は菌類が有する効能を具備した成分として利用することができる。したがって、細菌又は菌類として例えば免疫力賦活化作用を有するものを用いて膜小胞を産生させることによって、免疫力賦活化作用を有する膜小胞組成物を得ることができる。本発明の一実施形態において、免疫力賦活化作用を有する細菌及び／又は菌類をアルテピリンＣで処理して当該細菌及び／又は菌類に膜小胞を産生させる工程を含む、膜小胞組成物を有効成分として含む免疫力賦活化剤の製造方法が提供される。
　乳酸菌は、例えば、ラクトバチルス属、ストレプトコッカス属、ペディオコッカス属、ロイコノストック属、エンテロコッカス属、ラクトコッカス属、ビフィドバクテリウム属等であってよい。乳酸菌を用いることにより、当該乳酸菌が有する生理活性を有する細菌膜小胞を得ることができる。
　乳酸菌は、例えば、ラクトバチルス・クンキーであってよく、ラクトバチルス・クンキーＢＰＳ４０２（受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ－１１４３９）であることが好ましい。ラクトバチルス・クンキーＢＰＳ４０２には高いＩｇＡ産生促進作用に基づく免疫力賦活化作用があることが分かっている。したがって本実施形態に係る細菌膜小胞組成物の製造方法において、例えば、細菌としてラクトバチルス・クンキーＢＰＳ４０２を用いることによって、免疫力賦活化の効果を有する細菌膜小胞組成物を得ることができる。一実施形態において、ラクトバチルス・クンキーＢＰＳ４０２由来の膜小胞組成物を有効成分として含む、免疫力賦活化剤、又はＩｇＡ等の免疫グロブリン産生促進剤の製造方法が提供される。ラクトバチルス・クンキーＢＰＳ４０２は、２０１１年１０月３日に、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６、〒３０５－８５６６、現独立行政法人製品評価技術基盤機構　特許生物寄託センター（日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８　１２０号室、〒２９２－０８１８））に、受託番号ＦＥＲＭ　Ｐ－２２１７７として寄託されており、入手可能である。また、当該菌株は、現在国際寄託に移管されており、受託番号はＦＥＲＭ　ＢＰ－１１４３９である。
　本実施形態に係る膜小胞組成物の製造方法において用いられる細菌及び／又は菌類は、各細菌及び／又は菌類において適した条件で予め培養して用意したものを用いることができる。
＜膜小胞＞
　本実施形態に係る製造方法において細菌及び／又は菌類により産生される膜小胞の大きさは、例えば、１０～６００ｎｍ、２０～４００ｎｍ、又は４０～３００ｎｍであってよい。膜小胞は、細胞膜により覆われた構造を有する。膜小胞は、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ等の核酸、タンパク質、シグナル物質、病原物質、免疫調節因子、その他の生理活性物質を含んでいてよく、リポ多糖、リポタンパク質、ペプチドグリカン等の、細菌及び／又は菌類の細胞膜又は細胞壁由来の成分を含んでいてもよい。膜小胞は、例えば細菌及び／又は菌類の細胞膜又は外膜由来のものであってよい。
　本実施形態に係る膜小胞組成物の製造方法は、膜小胞組成物を単離する工程を更に含んでもよい。細菌及び／又は菌類の膜上に産生された膜小胞又は当該膜小胞を含む組成物は、公知の方法により単離することができる。具体的には例えば、菌体を含む培養液、又は菌体を含む培地を懸濁又は溶解させた液から、遠心機により菌体を取り除き、必要に応じて上清をろ過、精製等の処理を経て得ることができる。上清を更に超遠心機にかけて、膜小胞とその他の物質とを分離して精製してもよい。上清は濃縮してから精製してもよい。本実施形態に係る製造方法により得られた膜小胞組成物は、菌体から単離せずに菌体とともに用いられてもよい。
＜医薬品、医薬部外品、化粧品、食品＞
　本実施形態に係る膜小胞組成物の製造方法により得られた膜小胞組成物は、医薬品、医薬部外品、化粧品及び／又は食品の成分として、これらの製品の製造に用いることができる。したがって、本発明の一実施形態は、上記膜小胞組成物の製造方法により得られた膜小胞組成物を配合する工程を含む、医薬品、医薬部外品、化粧品及び／又は食品の製造方法を提供する。膜小胞組成物は、必要に応じて、希釈、濃縮、乾燥、加熱等の処理をしたものを上記製品の製造に用いてもよい。
　特に細菌及び／又は菌類が乳酸菌等の有用細菌又は菌類である場合には、当該得られた膜小胞に由来する成分を医薬品、医薬部外品、化粧品及び／又は食品の成分として用いることにより、当該細菌及び／又は菌類が有する効能を具備する医薬品、医薬部外品、化粧品及び／又は食品を製造することができる。例えば免疫賦活化作用を有する細菌及び／又は菌類から得られた膜小胞由来の成分を、医薬品、医薬部外品、化粧品及び／又は食品の原料に配合することにより、免疫賦活化用医薬品、免疫賦活化用医薬部外品、免疫賦活化用化粧品、免疫賦活化用食品を製造することができる。
　膜小胞組成物の医薬品、医薬部外品、化粧品又は食品への配合は、例えば、予め用意した膜小胞組成物を、医薬品、医薬部外品、化粧品又は食品の原料と混合することによって行ってもよく、あるいは、医薬品、医薬部外品、化粧品又は食品中に、アルテピリンＣと、膜小胞を産生させる細菌及び／又は菌類とを配合しておくことにより、製品中で膜小胞組成物を産生させることによって行ってもよい。医薬品、医薬部外品、化粧品及び食品は、アルテピリンＣと、膜小胞を産生する細菌及び／又は菌類とを含んでいてもよい。
　医薬品、医薬部外品、化粧品及び食品中の、膜小胞組成物の含有量は、例えば、０．００１質量％以上であってよく、０．０１質量％以上、０．１質量％以上、１質量％以上、５質量％以上又は１０質量％以上であってもよい。医薬品、医薬部外品、化粧品及び食品中の、膜小胞組成物の含有量は、例えば、１００質量％以下、９９質量％以下、９５質量％以下、９０質量％以下、７０質量％以下、５０質量％以下、３０質量％以下、１０質量％以下、５質量％以下、１質量％以下であってよい。
　医薬品又は医薬部外品としては、膜小胞又は膜小胞由来成分をそのまま用いてもよく、タブレット（素錠、糖衣錠、発泡錠、フィルムコート錠、チュアブル錠、トローチ剤等を含む）、カプセル剤、丸剤、粉末剤（散剤）、細粒剤、顆粒剤、液剤、懸濁液、乳濁液、シロップ、ペースト、注射剤（使用時に、蒸留水又はアミノ酸輸液若しくは電解質輸液等の輸液に配合して液剤として調製する場合を含む）等の剤形としたものを用いてもよい。これらの各種製剤は、例えば、有効成分である膜小胞組成物と、必要に応じて他の成分とを混合して上記剤形に成形することによって調製することができる。
　医薬品又は医薬部外品に使用されるその他の成分としては、例えば、薬学的に許容される、賦形剤、結合材、滑沢剤、崩壊剤、乳化剤、界面活性剤、基剤、溶解補助剤、懸濁化剤等を挙げることができる。
　本実施形態に係る化粧品には、膜小胞組成物以外に、通常化粧品に用いられる成分、例えば、美白剤、保湿剤、酸化防止剤、油性成分、紫外線吸収剤、界面活性剤、増粘剤、アルコール類、粉末成分、色材、水性成分、水、各種皮膚栄養剤等を必要に応じて適宜配合することができる。
　本実施形態に係る化粧品の剤形は、例えば、可溶化系、乳化系、粉末系、油液系、ゲル系、軟膏系、エアゾール系、水－油２層系、水－油－粉末３層系等であってよい。上記化粧品は、例えば、洗顔料、化粧水、乳液、クリーム、ジェル、エッセンス、美容液、パック、マスク、ミスト、ＵＶ予防化粧品等の基礎化粧品、ファンデーション、口紅、頬紅、アイシャドウ、アイライナー、マスカラ等のメークアップ化粧品、洗顔料、マッサージ用剤、クレンジング用剤、アフターシェーブローション、プレシェーブローション、シェービングクリーム、ボディソープ、石けん、シャンプー、リンス、へアートリートメント、整髪料、へアートニック剤、ヘアミスト、ヘアフォーム、ヘアリキッド、ヘアジェル、ヘアスプレー、育毛剤、制汗剤、入浴剤、マウスリンス、口腔化粧品、歯磨剤などであってよい。
　本実施形態に係る食品は、食品の３次機能（体調調節機能）が強調された食品であってもよい。食品の３次機能が強調された食品としては、例えば、健康食品、機能性表示食品、栄養補助食品、サプリメント及び特定保健用食品を挙げることができる。
　食品には、必要に応じて、ミネラル類、ビタミン類、フラボノイド類、キノン類、ポリフェノール類、アミノ酸、核酸、必須脂肪酸、清涼剤、結合剤、甘昧料、崩壊剤、滑沢剤、着色料、香料、安定化剤、防腐剤、徐放調整剤、界面活性剤、溶解剤、湿潤剤等が配合されてもよい。食品は、固体、液体、ペースト等のいずれの形状であってもよい。
　食品としては例えば以下のものが挙げられる：コーヒー、茶飲料、ジュース、炭酸飲料等の清涼飲料、乳飲料、乳酸菌飲料、ヨーグルト飲料、並びに、日本酒、洋酒、果実酒及びハチミツ酒等の酒などの飲料；カスタードクリーム等のスプレッド；フルーツペースト等のペースト；チョコレート、ドーナツ、パイ、シュークリーム、ガム、ゼリー、キャンデー、クッキー、ケーキ及びプリン等の洋菓子；大福、餅、饅頭、カステラ、あんみつ及び羊羹等の和菓子；アイスクリーム、アイスキャンデー及びシャーベット等の氷菓；カレー、牛丼、雑炊、味噌汁、スープ、ミートソース、パスタ、漬物、ジャム等の調理済みの食品；ドレッシング、ふりかけ、旨味調味料及びスープの素等の調味料。
　アルテピリンＣは細菌及び菌類の膜小胞産生を促進する作用がある。したがって、本発明の一実施形態は、アルテピリンＣを有効成分とする細菌及び／又は菌類の膜小胞産生促進剤を提供する。膜小胞産生促進剤における、アルテピリンＣ、細菌及び菌類の具体的な態様は、上述の膜小胞組成物の製造方法における態様を適用できる。
　以下、本発明を実施例に基づいてより具体的に説明する。ただし、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
［試験例１］
　アルテピリンＣ（プロポリスからの精製品）をＤＭＳＯに溶解し、アルテピリンＣ２５μＭ（７．５μｇ／ｍＬ）溶液を調製した。歯周病原細菌Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ　ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ　ＡＴＣＣ　３３２７７（ＡＴＣＣより入手）を、ＨＳ－ＡＦＭ（高速原子間力顕微鏡）観察用にガラススライド上に固定化した。固定化した菌体上にアルテピリンＣ溶液を滴下することによりアルテピリンＣ処理を行った。ＨＳ－ＡＦＭ装置（オリンパス社製）を用いて、アルテピリンＣ処理前後のナノスケールでの細菌菌体の挙動を観察した。アルテピリンＣ処理前、処理後１０分毎（ｔ＝１０、２０、３０分）でのＨＳ－ＡＦＭ像を図１に示す。各像の大きさは、１５２０ｎｍ×１１４０ｎｍ（ｘ×ｙ）の範囲を示す。
　アルテピリンＣ処理３０分後の細菌菌体について、ＨＳ－ＡＦＭ観察により、１つの細菌菌体当たり３つの異なる領域をランダムに選択し、それぞれにおける膜小胞の数を目視で数え、３つの領域における膜小胞の総数を求めた。３個の細菌菌体について同様に膜小胞の総数を求め、細菌菌体１つ当たりの平均値を求めた。結果を表１及び図２に示す。アルテピリンＣ、エタノール抽出プロポリス１００μｇ／ｍＬ、バッカリン（プロポリスからの精製品）１００μＭ（５６．３μｇ／ｍＬ）をＤＭＳＯに溶解したものを用いて、上記と同様に細菌に処理し、膜小胞の産生量を数えた。エタノール抽出プロポリス水溶液としては、プロポリス原塊をエタノールで抽出し、ろ過した後、濃縮したものを１００μｇ／ｍＬに調節したものを用いた。結果を表１及び図２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　エタノール抽出プロポリス、アルテピリンＣ及びバッカリンによる処理において膜小胞の産生が確認された（表１、図２）。アルテピリンＣによる処理では、処理時間の経過とともに小胞数及び小胞直径が増大する傾向が見られた（図１）。１μｇ／ｍＬ当たりに換算すると、アルテピリンＣ処理による膜小胞産生作用は、エタノール抽出プロポリス処理の１８．７５倍と算出された。
　また、アルテピリンＣ及びバッカリンは、使用したエタノール抽出プロポリス中にそれぞれ９．５質量％、３．５質量％の濃度で存在することが分かっている。したがってアルテピリンＣはエタノール抽出プロポリス水溶液１００μｇ／ｍＬ中に９．５μｇ／ｍＬの濃度で存在している。ここで、アルテピリンＣ単独での結果から算出されたアルテピリンＣ１μｇ／ｍＬ当たりの膜小胞産生量は表１に示すとおり７．５個であるから、仮にエタノール抽出プロポリス中のアルテピリンＣがアルテピリンＣ単独と同等の効果を発揮するとすれば、エタノール抽出プロポリス１００μｇ／ｍＬの処理により、少なくとも７１．２５個の膜小胞産生が見られるはずである。しかしながら実際のエタノール抽出プロポリス処理による膜小胞産生の効果はこの約半分であり、アルテピリンＣ単独で処理することの優位性が示された。
［試験例２］
　大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　Ｎｉｓｓｌｅ　１９１７）、乳酸菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｋｕｎｋｅｅｉ　ＪＣＭ　１６１７３、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｋｕｎｋｅｅｉ　ＢＰＳ４０２）、ビフィズス菌（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｌｏｎｇｕｍ　ＢＢ５３６）及び酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　バラ蜂蜜由来　ｄ３０１０）を用いて、アルテピリンＣによる膜小胞産生促進作用を確認するための実験を行った。用意した各種菌体をＰＢＳバッファーに懸濁し、菌体を含む液を基板上に添加して室温で１０～３０分おき、基板上に菌体を接着させた。基板をＰＢＳバッファーで洗浄した後、各被験物質を基板上に滴下し、室温で２時間反応させた。被験物質としては、ＤＭＳＯ１０％水溶液にアルテピリンＣを１００μＭ又は１０００μＭの濃度で溶解した液を用いた。対照として、ＤＭＳＯ１０％水溶液を用いた。
　処理後の菌体を２．５％グルタルアルデヒド／２％パラホルムアルデヒドを含むＰＢＳで固定し、走査型電子顕微鏡にて観察した。結果を図３～７に示す。いずれの細菌及び菌類においても、１００μＭ及び１０００μＭの濃度でアルテピリンＣによる膜小胞産生促進の効果が確認された。乳酸菌では処理による菌体の形態変化はほぼ観察されず、外膜上に均一に小胞が形成されている傾向が観察された。原核生物でグラム陰性菌である大腸菌、グラム陽性菌である乳酸菌及びビフィズス菌、並びに真核生物である酵母において膜小胞産生活性が認められた。アルテピリンＣの膜小胞誘導効果が、様々な細菌及び菌類に対して有効であることが確認された。

Claims (6)

  1. 　細菌及び／又は菌類をアルテピリンＣで処理して当該細菌及び／又は菌類に膜小胞を産生させる工程を含む、膜小胞組成物の製造方法。
  2. 　前記細菌及び／又は菌類が、グラム陽性菌、グラム陰性菌及び酵母からなる群から選ばれる少なくとも１つである、請求項１に記載の製造方法。
  3. 　請求項１又は２に記載の製造方法で得られた膜小胞組成物を配合する工程を含む、医薬品、医薬部外品、化粧品又は食品の製造方法。
  4. 　請求項１又は２に記載の製造方法で得られた膜小胞組成物を含むワクチンの製造方法。
  5. 　免疫力賦活化剤の製造方法であって、
    　該免疫力賦活化剤が、請求項１又は２に記載の製造方法で得られた膜小胞組成物を有効成分として含み、前記細菌及び／又は菌類が免疫力賦活化作用を有するものである、製造方法。
  6. 　アルテピリンＣを有効成分とする、細菌及び／又は菌類の膜小胞産生促進剤。
     
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