ES2823950T3

ES2823950T3 - Moléculas con especificidad para CD45 y CD79

Info

Publication number: ES2823950T3
Application number: ES15738655T
Authority: ES
Inventors: Helene Margaret Finney; Stephen Edward Rapecki; Michael John Wright; Kerry Tyson
Original assignee: UCB Biopharma SRL
Current assignee: UCB Biopharma SRL
Priority date: 2014-07-16
Filing date: 2015-07-16
Publication date: 2021-05-10
Anticipated expiration: 2035-07-16
Also published as: HUE052282T2; DK3169704T3; CO2017000300A2; IL249536A0; US10774152B2; CN106661112A; LT3169704T; CA2953275A1; RU2017104813A3; PL3169704T3; PT3169704T; MX2016017271A; KR20170035930A; RU2747980C2; EP3169704B1; US20190359713A1; WO2016009029A1; SI3169704T1; BR112016030908A2; CL2017000111A1

Abstract

La molécula multiespecífica que comprende un dominio de unión específico para el antígeno CD45 y un dominio de unión específico para el antígeno CD79a y/o CD79b.

Description

DESCRIPCIÓN

Moléculas con especificidad para CD45 y CD79

Campo de invención

La presente descripción se refiere a una molécula que es al menos biespecífica para los antígenos CD45 y CD79, una formulación que comprende dicha molécula y el uso de una cualquiera de las mismas en el tratamiento. La presente descripción también se extiende a métodos para preparar dichas moléculas y dichas formulaciones. En un aspecto independiente, la descripción también se extiende a nuevas secuencias de anticuerpos y fragmentos descritos en la presente memoria.

Antecedentes de la invención

Los mecanismos biológicos in vivo son cascadas de señales extremadamente complicadas, que son difíciles de deconvolucionar y comprender. Un ejemplo de dicha señalización es la necesaria para activar las células B. El receptor de antígeno de células B (BCR) está compuesto por moléculas de inmunoglobulina de membrana (mIg) y heterodímeros asociados Iga/Igp (CD79a/CD79b) (a/p). Las subunidades mIg se unen al antígeno, lo que da como resultado la agregación del receptor, mientras que las subunidades a/p transducen señales al interior de la célula. La agregación de BCR activa rápidamente las quinasas Lyn, Blk y Fyn de la familia Src, así como las tirosina quinasas Syk y Btk. Esto inicia la formación de un "signalosoma" compuesto por el BCR, las tirosina quinasas mencionadas anteriormente, proteínas adaptadoras tales como CD19 y BLNK y enzimas de señalización tales como PLCy2, PI3K y Vav.

Las señales que emanan del signalosoma activan múltiples cascadas de señalización que involucran quinasas, GTPasas y factores de transcripción. Esto da lugar a cambios en el metabolismo celular, la expresión génica y la organización citoesquelética. La complejidad de la señalización de BCR permite muchos resultados distintos, que incluyen supervivencia, tolerancia (anergia) o apoptosis, proliferación y diferenciación en células productoras de anticuerpos o células B de memoria. El resultado de la respuesta está determinado por el estado de maduración de la célula, la naturaleza del antígeno, la magnitud y duración de la señalización de BCR y las señales de otros receptores tales como CD40, el receptor de IL-21 y BAFF-R.

Muchas otras proteínas transmembrana, algunas de las cuales son receptores, modulan elementos específicos de la señalización de BCR. Algunos de estos, incluidos CD45, CD19, CD22, PIR-B y FcyRIIB1 (CD32). La magnitud y duración de la señalización de BCR están limitadas por bucles de retroalimentación negativa, incluidos los que involucran la vía Lyn/CD22/SHP-1, la vía Cbp/Csk, SHIP, Cbl, Dok-1, Dok-3, FcyRIIB1, PIR-B, e internalización del BCR.

In vivo, las células B a menudo son activadas por células presentadoras de antígenos que capturan antígenos y los exhiben en su superficie celular. La activación de células B por tales antígenos asociados a la membrana requiere una reorganización citoesquelética inducida por BCR.

Las células B autorreactivas son responsables de la producción de autoanticuerpos patógenos que pueden causar o exacerbar enfermedades autoinmunes directa o indirectamente. La depleción de las células B positivas para CD20 se ha utilizado para tratar con éxito una serie de afecciones autoinmunes y, por lo tanto, se ha establecido de manera concluyente que las células B desempeñan un papel importante en la causa o el mantenimiento de una serie de enfermedades autoinmunes. Aunque la depleción de las células B ha sido una opción terapéutica exitosa, también existe evidencia de que el control del crecimiento y el estado de activación de las células B también puede ser una forma eficaz de modular la función de las células B. Por tanto, serían deseables estrategias alternativas que no deplecionaran las células B y ofrecieran la flexibilidad de controlar las células B sin la supresión a largo plazo de la inmunidad de las células B, que se ha mostrado que está asociada con algunos efectos secundarios. Además, no todas las respuestas o actividades de las células B son dañinas y la evidencia sugiere que el mantenimiento de las poblaciones de células B reguladoras puede ser protector. Tal enfoque debería ser eficaz en enfermedades que tienen una función anormal de las células B causada por una señalización de BcR inapropiada o excesiva. Los ejemplos incluyen inflamación, autoinmunidad y cáncer. Son de particular interés las enfermedades que tienen un requerimiento directo para la señalización de BcR o requieren inhibición o estimulación de respuestas inmunes humorales.

Se espera que los anticuerpos biespecíficos jueguen un papel importante en la próxima generación de bioterapéuticos (D. Holmes, Nature Rev Drug Disc, noviembre de 2011: 10; 798). Tienen el potencial de ofrecer una eficacia superior, a largo plazo y amplia en una mayor proporción de pacientes. Esto se puede lograr combinando diferentes antígenos simultáneamente dentro de una vía de enfermedad común, reduciendo así la redundancia; o tomando como diana antígenos de rutas independientes para proporcionar un efecto aditivo o sinérgico.

Hasta la fecha, las estrategias para inhibir la función de las células B sin delecionar las células B se han centrado en explotar el mecanismo natural de regulación por CD32b (FcgRIIB). Estas incluyen anticuerpos biespecíficos contra CD79b/CD32b (Veri et al., Arthritis and Rheumatism 2010 62 1933-1943), CD19/CD32b (Karnell et al., J. Immunol 2014 192 1430-1490) y un anticuerpo contra CD19 con un Fc con unión mejorada de CD32b (Chu et al., Arthritis and Rheumatology 2014661153-1164).

Hasta la fecha, las estrategias para inhibir la función de las células B sin delecionar las células B se han centrado en explotar el mecanismo natural de regulación por CD32b (FcgRIIB). Estas incluyen anticuerpos biespecíficos contra CD79b/CD32b (Arthritis and Rheumatism 201062 1933-1943), CD19/CD32b (J. Immunol 2014 192 1430-1490) y un anticuerpo contra CD19 con un Fc con unión mejorada de CD32b (Arthritis and Rheumatology 201466 1153-1164).

La co-ligación del receptor IIb de Fc gamma (CD32b) con el receptor de células B se produce para regular de forma natural la señalización, en particular cuando el antígeno se une al anticuerpo en pequeños complejos inmunes. Luego, CD32b recluta las fosfatasas SHP-1 y SHIP-1 que antagonizan la activación de BcR. Aunque este mecanismo regulador natural puede controlar la función de las células B, la disrupción de la función de CD32b causada por la variación en la secuencia de proteínas de CD32b puede conducir a una enfermedad autoinmune y este receptor puede estar regulado a la baja en una enfermedad autoinmune - p. ej., como en el caso de LES. Por tanto, son deseables formas alternativas de bloquear la actividad de las células B, ya que ofrecen formas alternativas, no naturales, de regular la función de BcR. Es probable que estos mecanismos alternativos sean particularmente importantes cuando los mecanismos naturales son disfuncionales en la enfermedad determinada.

Los anticuerpos biespecíficos facilitan el acceso a una nueva biología como:

1) entrecruzamiento de recptores en una célula, si es apropiado,

2) inducción de efectos mediados por células,

3) localización de una citocina en una célula para regular la señalización o bloquear localmente la función de las citocinas,

4) conexión de múltiples epítopos simultáneamente para generar "nueva actividad", aumentar la función o la especificidad, que puede no ser exhibida por un solo anticuerpo monoclonal o incluso por mezclas de anticuerpos no ligados ('polimonoclonales'), incluidas mezclas dirigidas a diferentes antígenos.

En condiciones fisiológicas normales, tras la unión al antígeno, CD45 se excluye del complejo BcR. Los presentes inventores han descubierto sorprendentemente que usando un anticuerpo biespecífico para acoplar el BcR (CD79) a la molécula CD45, se puede inhibir la señalización de BCR. Por tanto, al unir físicamente el BcR con el CD45 mediante el uso de un anticuerpo biespecífico, los inventores han descubierto que se puede inhibir la activación en las células B.

Por lo tanto, los presentes inventores han identificado una función sinérgica para moléculas que son al menos biespecíficas para CD45 y CD79. Esta función parece ser detectable principalmente cuando las regiones de unión con la combinación de especificidades se proporcionan en un formato biespecífico (multiespecífico), en contraposición a que se proporcionen simplemente como una mezcla de, por ejemplo, anticuerpos monoclonales o fragmentos de unión de los mismos.

Por tanto, las moléculas multiespecíficas de la invención son útiles para controlar las funciones aberrantes de las células B asociadas con ciertas enfermedades tales como la autoinmunidad y el cáncer.

Resumen de la descripción

De este modo, se proporciona una molécula multiespecífica que comprende un dominio de unión específico para el antígeno CD45 y un dominio de unión específico para el antígeno CD79.

La combinación según la presente descripción en un formato biespecífico muestra una actividad biológica interesante en ensayos funcionales in vitro, por ejemplo, inhibición de la señalización de células B medida por uno cualquiera de los siguientes: inhibición de la fosforilación de Akt S473, inhibición de la fosforilación de P38 e inhibición por PLCy2 Y759 de IkB, además de la inhibición de la expresión de CD86, CD71 y/o CD40 en células B. El mismo nivel de actividad no es evidente para los componentes individuales solos o los componentes proporcionados en mezcla. Sin embargo, la actividad es evidente cuando se proporciona una construcción biespecífica con especificidad para CD45 y CD79.

La inhibición de ciertas funciones de las células B observada en estos ensayos es indicativa de que una molécula multiespecífica de la invención, que comprende un dominio de unión específico para CD45 y un dominio de unión específico para CD79, puede usarse para alterar la función de las células B y, por ejemplo, para proporcionar una alternativa terapéutica a la depleción de las células B.

La señalización del receptor de células B es una función crítica de las células B y un requisito para la activación específica de antígenos de las células B. La señalización de BcR es fundamental desde las primeras etapas del desarrollo de las células B hasta la activación y el desarrollo de las respuestas de las células B de memoria. El receptor de células B está compuesto por una molécula de inmunoglobulina (Ig) de superficie que se asocia con el complejo heterodimérico de CD79a y CD79b. Cuando la Ig de superficie reconoce el antígeno, se cree que esto da como resultado una agrupación del complejo CD79a/b que da como resultado la activación aguas abajo de la cascada de señalización inmediata, que incluye quinasas de la familia Src, así como las tirosina quinasas Syk y Btk. Este complejo de señalización puede entonces reclutar proteínas adaptadoras tales como CD19 y BLNK y da como resultado la activación de PLCy2 y PI3K que, a su vez, pueden activar otras vías aguas abajo, como las que controlan el crecimiento, la supervivencia y la diferenciación de las células B. Este complejo de señalización puede regularse adicionalmente por otras segundas señales mediante la señalización a través de BAFF-R, IL-21R y CD40 y también puede ser regulado por otras moléculas de señalización tales como CD19, CD21, CD83, CD22, CD32b y c D45, entre otras. Tras el reconocimiento del antígeno por el BcR, una de las primeras respuestas activadas es la regulación al alza de los receptores de superficie, tales como las moléculas coestimuladoras CD80 y CD86. Estas moléculas se unen a los receptores correspondientes en las células T que suministran más señales de supervivencia y activación que permiten la supervivencia y expansión de las células T que reconocen el antígeno en el contexto del MHC de clase II. Esta respuesta se amplifica aún más por la capacidad de las células B de presentar antígeno en el contexto del MHC de clase II de vuelta a la célula T, que libera factores tales como IL-2 e IL-21. Estas citocinas, a su vez, expanden enormemente el número de células B.

Además, la inhibición de la señalización del receptor de células B puede conducir a la inhibición de funciones aguas abajo. Uno de esos resultados sería la inhibición de moléculas coestimuladoras tales como CD86 (o expresión reducida de la misma) que conduciría a la inhibición de la función, supervivencia y diferenciación de las células T.

Por tanto, la inhibición de la señalización del receptor de células B puede ser beneficiosa para controlar las funciones aberrantes de las células B asociadas con la autoinmunidad y el cáncer. La señalización del receptor de células B es necesaria para la proliferación, diferenciación, presentación de antígenos y liberación de citocinas de las células B en las enfermedades autoinmunes. Por tanto, la inhibición de la actividad de BcR puede regular las funciones de las células B tales como la secreción de inmunoglobulina, la activación de las células T y el control de la actividad inapropiada de las células B asociada con, por ejemplo, afecciones autoinmunes. Además, hay algunas leucemias y linfomas de células B que requieren la señalización del receptor de células B para la supervivencia y el crecimiento que pueden ser controlados por inhibidores de la activación del receptor de células B.

En una realización, el dominio de unión o los dominios de unión de las moléculas multiespecíficas de la presente invención comprenden cada uno independientemente uno o dos (por ejemplo, dos) dominios variables de anticuerpos específicos para un antígeno relevante (tal como CD45 o CD79 o un antígeno adicional si la molécula es al menos triespecífica).

CD79, tal y como se usa en la presente memoria, se refiere al complejo compuesto por CD79a y CD79b. Por consiguiente, los anticuerpos que se unen a CD79 pueden unirse a CD79a y/o CD79b. Se une a CD79a y/o CD79b tal y como se emplea en la presente memoria se refiere a: específico para CD79a, específico para CD79b, específico para CD79a y b (es decir, reconoce un epítopo en CD79a y también reconoce un epítopo en CD79b, es decir, pan específico) o es específico del complejo de CD79a y CD79b (es decir, reconoce un epítopo formado a partir de la interacción de CD79a y CD79b en la forma de complejo).

En una realización, un anticuerpo o fragmento de unión del mismo empleado en las moléculas de la presente descripción es específico para CD79a.

En una realización, un anticuerpo o fragmento de unión del mismo empleado en las moléculas de la presente descripción es específico para CD79b.

En una realización, un anticuerpo o fragmento de unión del mismo empleado en las moléculas de la presente descripción es específico del complejo CD79, es decir, reconoce un epítopo presente en el complejo y es específico del mismo, por ejemplo, un epítopo que comprende una interacción entre CD79a y CD79b.

En una realización, incluso cuando el dominio de unión es específico para CD79a o CD79b, se apreciará que el dominio de unión todavía se unirá a CD79a o CD79b cuando esté en forma de complejo.

Cuando hay dos regiones variables en un dominio de unión o en cada dominio de unión, entonces las dos regiones variables generalmente trabajarán de manera cooperativa para proporcionar especificidad para el antígeno relevante, por ejemplo, son un par cognado o madurado por afinidad para proporcionar una afinidad adecuada tal que el dominio es específico para un antígeno particular. Típicamente, son un par de regiones variables de cadena ligera y pesada (par VH/VL).

En una realización, la molécula de la presente descripción es biespecífica.

En una realización, la molécula de la presente descripción es triespecífica, por ejemplo, cuando el tercer dominio de unión es específico para la albúmina de suero, por ejemplo, albúmina de suero humano.

En una realización, la molécula de la presente descripción es monoespecífica para CD79 y CD45, es decir, la molécula solo comprende un dominio de unión que se une a CD79 y un dominio de unión que se une a CD45.

En una realización, la molécula multiespecífica de la presente descripción es una cadena sencilla.

En una realización, la molécula multiespecífica de la presente descripción comprende una cadena pesada y también una cadena ligera. En un ejemplo, como se emplea en la presente memoria, un emparejamiento de cadena pesada y ligera no se denomina un dímero, particularmente cuando en una realización la molécula de la presente descripción no comprende multímeros, tales como dímeros del anticuerpo, unidad/fragmento o componentes.

En un aspecto, se proporciona una molécula de anticuerpo multiespecífica que comprende o consiste en:

a) una cadena polipeptídica de fórmula (I):

Vh-CHi-X-(Vi )p;

b) una cadena polipeptídica de fórmula (II):

Vl-Cl-Y-(V2)q;

en donde:

VH representa un dominio variable de cadena pesada;

CH1 representa un dominio de una región constante de cadena pesada, por ejemplo, el dominio 1 de la misma; X representa un enlace o enlazador, por ejemplo, un enlazador de aminoácidos;

Y representa un enlace o enlazador, por ejemplo, un enlazador de aminoácidos;

V1 representa un dab, scFv, dsscFv o dsFv;

Vl representa un dominio variable, por ejemplo, un dominio variable de cadena ligera;

Cl representa un dominio de una región constante, por ejemplo, un dominio de región constante de cadena ligera, tal como Ckappa;

V2 representa un dab, scFv, dsscFv o dsFv;

p es 0 o 1;

q es 0 o 1; y

cuando p es 1 q es 0 o 1 y cuando q es 1 p es 0 o 1, es decir, p y q no representan ambos 0.

En una realización, la molécula comprende no más de un sitio de unión para CD45 y no más de un sitio de unión para CD79. El formato anterior es particularmente útil para cribar combinaciones de regiones variables, por ejemplo, en ensayos a más largo plazo y para uso terapéutico.

En una realización, q es 0 y p es 1.

En una realización, q es 1 y p es 1.

En una realización V1 es un dab y V2 es un dab y juntos forman un solo dominio de unión de un par cooperativo de regiones variables, ral como un par cognado Vh/Vl.

En una realización Vh y Vl son específicos para CD79, por ejemplo, CD79a o CD79b.

En una realización, el V1 es específico para CD79, por ejemplo, CD79a.

En una realización, el V2 es específico para CD79, por ejemplo, CD79a.

En una realización, el V1 es específico para CD79, por ejemplo, CD79b.

En una realización, el V2 es específico para CD79, por ejemplo, CD79b.

En una realización, el V1 y V2 juntos (p. ej., como un dominio de unión) son específicos para CD79, por ejemplo, CD79a o CD79b.

En una realización Vh y Vl son específicos para CD45.

En una realización, el V1 es específico para CD45.

En una realización, el V2 es específico para CD45.

En una realización, el V1 y V2 juntos (p. ej., como un dominio de unión) son específicos para CD45.

En una realización, la molécula de la presente descripción es o comprende una proteína de fusión.

En una realización, se proporciona una molécula multiespecífica según la presente descripción, que es un complejo proteico biespecífico que tiene la fórmula A-X:Y-B en donde:

A-X es una primera proteína de fusión;

Y-B es una segunda proteína de fusión;

X:Y es una unión heterodimérica;

A comprende un primer dominio de unión específico para CD45, CD79a, CD79b o un complejo de CD79a y b;

B comprende un segundo dominio de unión específico para CD45, CD79a, CD79b o un complejo de CD79a y b;

X es un primer compañero de unión de un par de unión;

Y es un segundo compañero de unión de un par de unión; y

es una interacción (tal como una interacción de unión) entre X e Y, y

en donde al menos uno de A o B es específico para CD45 y el otro es específico para CD79a, CD79b o una forma en complejo de los mismos.

El formato anterior es conveniente porque proporciona una forma rápida y eficiente de ensamblar formatos biespecíficos que, por ejemplo, pueden ser sometidos a ensayo in vitro en ensayos funcionales. Esto puede facilitar la elección de un par preferido de regiones variables, que posteriormente se pueden incorporar en un formato de anticuerpo multiespecífico terapéutico alternativo.

Sin desear estar ligado por la teoría, diferentes permutaciones de regiones variables específicas de CD45 combinadas con una gama de regiones variables específicas de CD79 pueden dar acceso a diferentes matices en la función biológica.

La invención también proporciona nuevos anticuerpos CD45, por ejemplo, para su uso en las moléculas multiespecíficas de la presente invención o para su incorporación en cualquier otro formato de anticuerpo adecuado. La invención también proporciona nuevos anticuerpos CD79, por ejemplo, para su uso en las moléculas multiespecíficas de la presente invención o para su incorporación en cualquier otro formato de anticuerpo adecuado.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 es un gráfico de barras de la potencia relativa de inhibición de Akt fosforilado para combinaciones de anticuerpos biespecíficos y bivalentes con especificidad para CD45 y CD79b.

La Figura 2 es un gráfico de barras de la potencia relativa de inhibición de PLCg2 fosforilado para combinaciones de anticuerpos biespecíficos y bivalentes con especificidad para CD45 y CD79b.

La Figura 3 es un gráfico que muestra la titulación del efecto de la combinación biespecífica de CD45 y CD79b sobre la expresión de CD86 en células B estimuladas con anti-IgM.

La Figura 4 es un gráfico de inhibición de PLCg2 fosforilado para proteínas biespecíficas con especificidad para CD45 y CD79b con diferentes regiones V

La Figura 5 es un extracto de Chan y Carter Reviews Immunology vol 10, mayo de 2010, 301 que muestra ciertos formatos de anticuerpos.

La Figura 6 muestra datos para las especificidades cruzadas de la cuadrícula de antígenos. Antígeno 2 = CD79b y antígeno 4 = CD45. Los valores son el porcentaje de inhibición (valor negativo para la activación) de la fosforilación de Syk y representan la media de múltiples combinaciones de regiones V evaluadas.

La Figura 7 muestra datos para las especificidades cruzadas de la cuadrícula de antígenos. Antígeno 2 = CD79b y antígeno 4 = CD45. Los valores son el porcentaje de inhibición (valor negativo para la activación) de PLCy2 y representan la media de múltiples combinaciones de regiones V evaluadas.

La Figura 8 muestra datos para las especificidades cruzadas de la cuadrícula de antígenos. Antígeno 2 = CD79b y antígeno 4 = CD45. Los valores son el porcentaje de inhibición (valor negativo para la activación) de AKT y representan la media de múltiples combinaciones de regiones V evaluadas.

La Figura 9 muestra el porcentaje de inhibición de la fosforilación de Syk, PLCy2 y AKT para cada combinación de la región V para la especificidad de CD79b en Fab-X combinada con la especificidad de CD45 en Fab-Y.

La Figura 10 muestra el porcentaje de inhibición de la fosforilación de Syk, PLCy2 y AKT para cada combinación de región V para la especificidad de CD79b en Fab-Y combinada con la especificidad de CD45 en Fab-X

Las Figuras 11 y 12 muestran la inhibición de PLCy2 (+/- SD) por CD79b-CD45 purificado (expresado transitoriamente) en células B estimuladas con IgM del donante 129 y 130

Las Figuras 13 y 14 muestran la inhibición de p38 (+/- SD) por CD79b-CD45 purificado (expresado transitoriamente) en células B estimuladas con IgM del donante 129 y 130

Las Figuras 15 y 16 muestran la inhibición de Akt (+/- SD) por CD79b-CD45 purificado (expresado de forma transitoria) en células B estimuladas con IgM del donante 129 y 130

La Figura 17 muestra la inhibición de la producción de IgG de toxoide tetánico a partir de PBMC cultivadas con diferentes moléculas multiespecíficas

Descripción detallada de la descripción

"Molécula multiespecífica", como se emplea en la presente memoria, se refiere a una molécula con la capacidad de unirse específicamente al menos a dos antígenos distintos, por ejemplo, antígenos diferentes. En una realización, la molécula multiespecífica es una molécula biespecífica, triespecífica o tetraespecífica, en particular una molécula biespecífica o una molécula triespecífica.

Por tanto, en un aspecto, la descripción se extiende a una molécula de un formato adecuado específico para al menos CD45 y CD79a y al uso de anticuerpos/fragmentos o combinaciones de los mismos específicos para CD45 y CD79a en una molécula multiespecífica, tal como un formato biespecífico o un formato triespecífico.

Por tanto, en un aspecto, la descripción se extiende a una molécula de un formato adecuado específico para al menos CD45 y CD79b y al uso de anticuerpos/fragmentos o combinaciones de los mismos específicos para CD45 y CD79b en una molécula multiespecífica, tal como un formato biespecífico o un formato triespecífico.

Por tanto, en un aspecto, la descripción se extiende a una molécula de un formato adecuado específico para al menos CD45 y complejo CD79a/b y al uso de anticuerpos/fragmentos o combinaciones de los mismos específicos para CD45 y complejo CD79a/b en una molécula multiespecífica, tal como un formato biespecífico o formato triespecífico. En una realización, la molécula de la presente descripción es triespecífica, por ejemplo, donde el tercer dominio de unión es capaz de extender la semivida de la molécula, por ejemplo, uniendo una proteína vehicular del suero. Existe una variedad de proteínas en el plasma e incluyen proteína de unión a tiroxina, transtiretina, glicoproteína ácida a1, transferrina, fibrinógeno y albúmina, o un fragmento de cualquiera de las mismas (Bartalena y Robbins, 1993, Clinics in Lab. Med. 13: 583-598; Bree et al., 1986, Clin. Pharmacokin. 11: 336-342; Gitlin y et al. 1964, J. Clin. Invest.

10: 1938-1951; Peters, 1985, Adv Protein Chem. 37: 161-245; Waldeman y Strober, 1969, Progr. Allergy, 13: 1-110. En un ejemplo, el tercer dominio de unión es específico para la albúmina de suero, por ejemplo, albúmina de suero humano.

Formatos de moléculas multiespecíficas

Se conocen en la técnica ejemplos de moléculas multiespecíficas adecuadas, por ejemplo, como se describe en la revisión "The coming of Age of Engineered Multivalent Antibodies, Nunez-Prado et al Drug Discovery Today Vol 20, Número 5, marzo de 2015, páginas 588-594, D. Holmes, Nature Rev Drug Disc, noviembre de 2011: 10; 798, Chan y Carter, Nature Reviews Immunology vol 10, mayo de 2010, 301.

En una realización, los formatos multiespecíficos incluyen los conocidos en la técnica y los descritos en la presente memoria, tales como en los que el formato de la molécula se selecciona del grupo que comprende o consiste en: • tándem sdAb, tándem sdAb-sdAb (tres sdAb);

• (scFv)2 (también conocido como tándem scFv), scFv-dsFv, dsscFv-dsFv (dsFv)2;

• diacuerpo, dsdiacuerpo, didsdiacuerpo,

• scdiacuerpo, dsscdiacuerpo, didsscdiacuerpo;

• anticuerpo Dart, es decir, VL1 enlazador VH2 enlazador y VH1 enlazador VL2 en donde el extremo C de VH1 y VH2 están unidos por un enlace disulfuro;

• BiTE®, dsBiTE, didsBiTE;

Di-diacuerpo (véase, Nunez-Prado et al en particular, la molécula número 25 en la Fig. 1 del mismo), dsdidiacuerpo, didsdi-diacuerpo;

triacuerpo, dstriacuerpo, didstriacuerpo, tridstriacuerpo;

tetracuerpos, dstetracuerpo, didstetracuerpo, tridstetracuerpo, tetradstetracuerpo;

tandab (véase, Nunez-Prado et al en particular la molécula número 22 en la Fig. 1 del mismo); dstandab, didstandab, tridstandab, tetradstandab;

[sc (Fv)2]2, (véase, Nunez-Prado et al en particular la molécula número 22 en la Fig. 1 del mismo), ds[sc(Fv)2]2, dids[sc(Fv)2]2, trids[sc(Fv)2]2, tetrads[sc(Fv)2]2;

Pentacuerpo (véase, Nunez-Prado et al en particular la molécula número 27 en la Fig. 1 del mismo);

Fab-scFv (también denominado bicuerpo), Fab'scFv, FabdsscFv (o BYbe), Fab'dsscFv;

tricuerpo, dstricuerpo, didstricuerpo (también denominado FabdidsscFv o TrYbe o Fab-(dsscFv)2), Fab'didsscFv;

Fabdab, FabFv, Fab'dab, Fab'Fv;

Fab enlazador único Fv (también denominado en la presente memoria FabdsFv como se describe en WO2014/096390), Fab' enlazador único Fv (también denominado en la presente memoria Fab'dsFv);

FabscFv enlazador único Fv, Fab'scFv enlazador único Fv;

FabdsscFv enlazador único Fv, Fab'dsscFv enlazador único Fv;

FvFabFv, FvFab'Fv, dsFvFabFv, dsFvFab'Fv, FvFabdsFv, FvFab'dsFv, dsFvFabdsFv, dsFvFab'dsFv, FabFvFv, Fab'FvFv, FabdsFvFv, Fab'dsFvFv, FabFvdsFv, Fab'FvdsFv, FabdsFvdsFv, Fab'dsFvdsFv, diFab, diFab' que incluye un diFab' químicamente conjugado,

(FabscFv)2, (Fab)2scFvdsFv, (Fab)2dsscFvdsFv, (FabdscFv)2,

(Fab'scFv)2, (Fab')2scFvdsFv, (Fab')2dsscFvdsFv, (Fab'dscFv)2,

VhHCk (véase, Nunez-Prado et al en particular la molécula número 6 en la Fig. 1 del mismo); minicuerpo, dsminicuerpo, didsminicuerpo,

un minianticuerpo (ZIP) [véase, Nunez-Prado et al en particular, la molécula número 7 en la Fig. 1 del mismo], dsminianticuerpo (ZIP) y didsminianticuerpo (ZIP);

tribi-minicuerpo [véase, Nunez-Prado et al en particular la molécula número 15 en la Fig. 1 del mismo] dstribiminicuerpo, didstribi-minicuerpo, tridstribi-minicuerpo;

diacuerpo-CH³, dsdiacuerpo-CH³, didsdiacuerpo-CH³, scdiacuerpo-CH³, dsscdiacuerpo-CH³, didsscdiacuerpo-CH3,

tándemscFv-CH3, tándemdsscFv-CH3, tándemdidsscFv-CH3, tándemtridsscFv-CH3, tándemtetradsscFv-CH3, scFv-Fc (también denominado en la presente memoria un (scFvCH2CH3)2) como se describe en WO2008/012543 y una versión de cadena única del mismo, dsscFvscFv-Fc, dsscFv-Fc (también denominado en la presente memoria (dsscFvCH²CH³)²), scFv-dsFv-Fc, dsscFv-dsFv-Fc, dsFv-Fc (también denominado en la presente memoria un (dsFvCH²CH³)²),

molécula de escorpión (Trubion), es decir, un dominio de unión, enlazador -CH2CH3 dominio de unión como se describe en US8.409.577;

SMIP (Trubion) es decir (scFv-CH²CH³)²;

(dsFvCH²CH³)², tándem scFv-Fc, tándem dsscFvscFv-Fc, tándem dsscFv-Fc,

scFv-Fc-scFv, dsscFv-Fc-scFv, scFv-Fc-dsscFv,

• diacuerpo-Fc, dsdiacuerpo-Fc, didsdiacuerpo-Fc, triacuerpo-Fc, dstriacuerpo-Fc, didstriacuerpo-Fc, tridstriacuerpo-Fc, tetracuerpo-Fc, dstetracuerpo-Fc, didstetracuerpo-Fc, tridstetracuerpo-Fc, tetradstetracuerpo-Fc, dstetracuerpo-Fc, didstetracuerpo-Fc, tridstetracuerpo-Fc, tetradstetracuerpo-Fc, scdiacuerpo-Fc, dsscdiacuerpo, didsscdiacuerpo;

• anticuerpo bi o trifuncional, por ejemplo, con diferentes regiones variables de cadena pesada y cadenas ligeras comunes, por ejemplo, formato de anticuerpo biespecífico Merus (Biclonics®) con cadenas ligeras comunes de una secuencia fija y diferentes cadenas pesadas (incluidas diferentes CDR) y dominio CH3 preparado por ingeniería para dirigir la dimerización o las diferentes cadenas pesadas,

• Duocuerpo (es decir, en donde una cadena de longitud completa en el anticuerpo tiene una especificidad diferente a la otra cadena de longitud completa en el anticuerpo);

• un anticuerpo de longitud completa en donde se ha empleado el intercambio de brazos Fab para crear un formato biespecífico;

• anticuerpo bi o trifuncional, en donde un anticuerpo de longitud completa tiene una cadena pesada común y diferentes cadenas ligeras, también denominadas cuerpo kappa/lambda o cuerpo k/A, véase, por ejemplo, WO2012/023053;

• Ig-scFv uno, dos, tres o cuatro del extremo C de la cadena pesada o ligera, scFv-Ig uno, dos, tres o cuatro del extremo N de la cadena pesada o ligera, un solo enlazador Ig-Fv, Ig-dsscFv uno, dos, tres o cuatro del extremo C de la cadena pesada o ligera (con uno, dos, tres o cuatro enlaces disulfuro);

• Ig-dsscFv uno, dos, tres o cuatro del extremo N de la cadena pesada o ligera (con uno, dos, tres o cuatro enlaces disulfuro),

• Ig enlazador único Fv (véase, PCT/EP2015/064450),

• Ig-dab, dab-Ig, scFv-Ig, V-Ig, Ig-V,

• scFabFvFc, scFabdsFvFc (versión de enlazador único scFavFv), (FabFvFc)2, (FabdsFvFc)2, scFab'FvFc, scFab'dsFvFc, (Fab'FvFc)2, (Fab'dsFvFc)2 y

• DVDIg, que se describen con más detalle a continuación.

En una realización, los formatos de moléculas multiespecíficas incluyen los conocidos en la técnica y los descritos en la presente memoria, tales como aquellos en donde el formato de la molécula se selecciona del grupo que comprende o consiste en: diacuerpo, scdiacuerpo, triacuerpo, tricuerpo, tetracuerpos, tándem scFv, FabFv, Fab ' Fv, FabdsFv, Fab-scFv, Fab-dsscFv, Fab-(dsscFv)2, diFab, diFab', tándem scFv-Fc, scFv-Fc-scFv, scdiacuerpo-Fc, scdiacuerpo-CH3, Ig-scFv, scFv-Ig, V-Ig, Ig-V, Duocuerpo y DVDIg, que se describen con más detalle a continuación.

En una realización, la molécula de anticuerpo multiespecífico de la presente descripción no comprende un dominio Fc, es decir, no comprende un dominio CH2 y CH3, por ejemplo, la molécula se selecciona del grupo que comprende un tándem scFv, scFv-dsFv, dsscFv-dsFv didsFv, diacuerpo, dsdiacuerpo, didsdiacuerpo, scdiacuerpo (también conocido como un (scFv)2), dsscdiacuerpo,, triacuerpo, dstriacuerpo, didstriacuerpo, tridstriacuerpo,, tetracuerpos, dstetracuerpo, didstetracuerpo, tridstetracuerpo, tetradstetracuerpo, tricuerpo, dstricuerpo, Fabdab, FabFv, Fab'dab, Fab'Fv, Fab enlazador único Fv (como se describe en WO2014/096390), Fab' enlazador único Fv, FabdsFv, Fab'dsFv, Fab-scFv (también conocido como bicuerpo), Fab'scFv, FabdsscFv, Fab'dsscFv, FabdidsscFv, Fab'didsscFv, FabscFv enlazador único Fv, Fab'scFv enlazador único Fv, FabdsscFvs enlazador único Fv, Fab'dsscFv enlazador único Fv, FvFabFv, FvFab'Fv, dsFvFabFv, dsFvFab'Fv, FvFabdsFv, FvFab'dsFv, dsFvFabdsFv, dsFvFab'dsFv, FabFvFv, Fab'FvFv, FabdsFvFv, Fab'dsFvFv, FabFvdsFv, Fab'FvdsFv, FabdsFvdsFv, Fab'dsFvdsFv, diFab, diFab' incluyendo un diFab' químicamente conjugado, (FabscFv)2, (Fab)2scFvdsFv, (Fab)2dsscFvdsFv, (FabdscFv)2, minicuerpo, dsminicuerpo, didsminicuerpo, diacuerpo-CH3, dsdiacuerpo-CH3, didsdiacuerpo-CH3, scdiacuerpo-CH3, dsscdiacuerpo-CH3, didsscdiacuerpo-CH3, tándem scFv-CH3, tándem dsscFv-CH3, tándem didsscFv-CH3, tándem tridsscFv-CH3 y tándem tetradsscFv-CH3.

En una realización, la molécula de la presente descripción no comprende un dominio Fc. En una realización, la molécula de la presente descripción comprende un dominio Fc alterado como se describe a continuación en la presente memoria.

El dominio Fc como se emplea en la presente memoria generalmente se refiere a - (CH2CH3K a menos que el contexto indique claramente lo contrario.

En una realización, la molécula de la presente descripción no comprende un fragmento -CH2CH3.

En una realización, la molécula de la presente descripción no comprende un dominio CH2. En una realización, la molécula de la presente descripción no comprende un dominio CH3.

Molécula, como se emplea en la presente memoria, se usa en el sentido bioquímico para referirse a un grupo de átomos que forman una masa orgánica, en particular proteica, que incluye un complejo adecuado para manipular como una entidad única en condiciones apropiadas una vez que se ha formado el complejo, por ejemplo, un complejo formado por dos o más cadenas polipeptídicas.

La molécula y la construcción se usan indistintamente en la presente memoria, a menos que el contexto indique lo contrario. Sin embargo, la construcción puede emplearse más a menudo para referirse a una molécula de polinucleótido y la molécula puede emplearse más a menudo para referirse a una entidad que comprende principalmente una secuencia de aminoácidos.

La especificidad (o específico) como se emplea en la presente memoria se refiere a cuando los compañeros en la interacción solo se reconocen entre sí o tienen una afinidad significativamente mayor entre sí en comparación con los no compañeros, por ejemplo, al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 veces mayor afinidad que, por ejemplo, un nivel de fondo de unión o unión a otra proteína no relacionada.

Un "dominio de unión" como se emplea en la presente memoria se refiere a una región de unión, típicamente un polipéptido, capaz de unirse a un antígeno diana, por ejemplo, con una afinidad suficiente como para caracterizar el dominio como específico para el antígeno.

Se puede usar cualquier dominio de unión adecuado en las moléculas multiespecíficas de la presente invención. Estos pueden derivarse de cualquier fuente adecuada.

En una realización, se usa una estructura marco biocompatible en un dominio de unión de las moléculas de la presente descripción y tales estructuras se basan en armazones o esqueletos de proteínas distintos de los dominios de inmunoglobulina. Por ejemplo, se pueden usar los basados en fibronectina, anquirina, lipocalina, neocarzinostaína, citocromo b, dedo de zinc CP1, PST1, espiral en espiral, LACI-D1, dominio Z y dominios tendramisat (véase, por ejemplo, Nygren y Uhlen, 1997, Current Opinion in Structural Biology, 7, 463-469).

El término "moléculas multiespecíficas" como se usa en la presente memoria también puede incluir agentes de unión basados en armazones biológicos que incluyen adnectinas, aficuerpos, darpinas, filómeros, avímeros, aptámeros, anticalinas, tetranectinas, microcuerpos, afilinas y dominios de Kunitz.

La molécula multiespecífica de la presente invención es típicamente una molécula de anticuerpo multiespecífica, es decir, al menos uno o más de los dominios de unión de la molécula multiespecífica se derivan de un anticuerpo o fragmento del mismo.

Cuando el dominio de unión se deriva de un anticuerpo, un "dominio o sitio de unión" como se emplea en la presente memoria es la parte del anticuerpo que contacta con el antígeno. En una realización, el dominio de unión contiene al menos un dominio variable o un derivado del mismo, por ejemplo, un par de dominios variables o derivados del mismo, tal como un par cognado de dominios variables o un derivado del mismo. Típicamente, se trata de un par VH/VL.

Las regiones variables (también denominadas en la presente memoria dominios variables) generalmente comprenden 3 CDR y un marco adecuado. En una realización, el dominio de unión comprende dos regiones variables, una región variable de cadena ligera y una región variable de cadena pesada y juntos estos elementos contribuyen a la especificidad de la interacción de unión del anticuerpo o fragmento de unión.

Un "par cognado" como se emplea en la presente memoria se refiere a un par de dominios variables de cadena pesada y ligera (o un derivado de los mismos, tal como una versión humanizada de los mismos) aislado de un huésped como una pareja preformada. Esta definición no incluye dominios variables aislados de una biblioteca, en donde no se conserva el emparejamiento original de un huésped. Los pares cognados pueden ser ventajosos porque a menudo maduran por afinidad en el huésped y, por lo tanto, pueden tener una mayor afinidad por el antígeno frente al que son específicos, que una combinación de pares de dominios variables seleccionados de una biblioteca, tal como una biblioteca de fagos.

Un "derivado de un dominio de origen natural" como se emplea en la presente memoria pretende hacer referencia a donde uno, dos, tres, cuatro o cinco aminoácidos en una secuencia de origen natural han sido reemplazados o delecionados, por ejemplo, para optimizar las propiedades del dominio tal como mediante la eliminación de propiedades indeseables, pero en donde se conservan la o las características que caracterizan el dominio. Los ejemplos de modificaciones son aquellas para eliminar sitios de glicosilación, anclajes de GPI o lisinas expuestas a disolventes. Estas modificaciones se pueden lograr reemplazando los residuos de aminoácidos relevantes con una sustitución de aminoácidos conservativa.

Otra modificación en las CDR puede incluir, por ejemplo, reemplazar una o más cisteínas con, por ejemplo, un residuo de serina. Asn puede ser el sustrato para la desaminación y esta propensión puede reducirse reemplazando Asn y/o un aminoácido vecino con un aminoácido alternativo, tal como una sustitución conservativa. El aminoácido Asp en las CDR puede estar sujeto a isomerización. Esto último se puede minimizar reemplazando Asp y/o un aminoácido vecino con un aminoácido alternativo, por ejemplo, una sustitución conservativa.

Las versiones humanizadas de una región variable también son un derivado de la misma, en el contexto de la presente memoria descriptiva. La humanización puede incluir el reemplazo de un marco no humano por un marco humano y, opcionalmente, la mutación inversa de uno o más residuos a "residuos donantes". Los residuos donantes como se emplean en la presente memoria se refieren a residuos encontrados en la región variable original aislada del huésped, en particular reemplazando un aminoácido dado en el marco humano con el aminoácido en la ubicación correspondiente en el marco donante.

En una realización, el dominio de unión o cada dominio de unión es parte de (incluido o incorporado en) un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo.

En una realización, los dominios de unión en las moléculas de la presente descripción están en moléculas de inmunoglobulina/anticuerpo.

Tal y como se usa en la presente memoria, "molécula de anticuerpo" incluye anticuerpos y fragmentos de unión de los mismos.

En una realización, el término "anticuerpo", tal y como se usa en la presente memoria, se refiere a una molécula de inmunoglobulina capaz de unirse específicamente a un antígeno diana, tal como un carbohidrato, polinucleótido, lípido, polipéptido, péptido, etc., mediante al menos un sitio de reconocimiento de antígeno (también denominado como sitio de unión o dominio de unión en la presente memoria), ubicado en la región variable de la molécula de inmunoglobulina.

"Fragmentos de anticuerpo" como se emplea en la presente memoria se refiere a fragmentos de unión de anticuerpos que incluyen Fab, Fab modificado, Fab', Fab' modificado, F(ab')2, Fv, anticuerpos de dominio único, scFv, Fv, anticuerpos bi, tri o tetravalentes , Bis-scFv, diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos y fragmentos de unión a epítopo de cualquiera de los anteriores (véase, por ejemplo, Holliger y Hudson, 2005, Nature Biotech. 23(9): 1126-1136; Adair y Lawson, 2005, Drug Design Reviews - Online 2 (3), 209-217).

Un "fragmento de unión" como se emplea en la presente memoria se refiere a un fragmento capaz de unirse a un péptido o antígeno diana con una afinidad suficiente como para caracterizar el fragmento como específico del péptido o antígeno.

Los métodos para crear y fabricar estos fragmentos de anticuerpos son bien conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Verma et al., 1998, Journal of Immunological Methods, 216: 165-181.). Otros fragmentos de anticuerpos para usar en la presente descripción incluyen los fragmentos Fab y Fab' descritos en WO05/003169, WO05/003170 y WO05/003171. Los anticuerpos multivalentes pueden comprender múltiples especificidades, p. ej., biespecífica o puede ser monoespecíficos (véase, por ejemplo, WO92/22853, WO05/113605, WO2009/040562 y WO2010/035012).

El término "fragmento Fab" tal y como se usa en la presente memoria se refiere a un fragmento de anticuerpo que comprende un fragmento de cadena ligera que comprende un dominio Vl (ligero variable) y un dominio constante de una cadena ligera (Cl) y un dominio Vh (pesado variable) y un primer dominio constante (CH1) de una cadena pesada.

El Fv se refiere a dos dominios variables, por ejemplo, dominios variables cooperativos, tal como un par cognado o dominios variables madurados por afinidad, es decir, un par Vh y Vl.

Los dominios variables cooperativos, tal como se emplean en la presente memoria, son dominios variables que se complementan entre sí y/o ambos contribuyen a la unión del antígeno para producir el Fv (par Vh/ Vl) específico para el antígeno en cuestión.

"Anticuerpo de dominio único" (también denominado en la presente memoria dab y sdAb), tal y como se usa en la presente memoria, se refiere a un fragmento de anticuerpo que consiste en un dominio de anticuerpo variable monomérico único. Los ejemplos de anticuerpos de dominio único incluyen Vh o Vl o VhH.

Tándem-sdAb como se emplea en la presente memoria se refiere a dos anticuerpos de dominio conectados por un enlazador, por ejemplo, un enlazador peptídico, en particular cuando los anticuerpos de dominio tienen especificidad por diferentes antígenos.

Tándem-sdAb-sdAb como se emplea en la presente memoria se refiere a anticuerpos de tres dominios conectados en serie por dos enlazadores, por ejemplo, enlazadores peptídicos, en particular cuando los anticuerpos de dominio tienen especificidad por diferentes antígenos.

dsFv, como se emplea en la presente memoria, se refiere a un Fv con un enlace disulfuro intravariable. El dsFv puede ser un componente de una molécula más grande, por ejemplo, uno de los dominios variables puede estar unido, por ejemplo, mediante un enlazador de aminoácidos a otro fragmento/componente de anticuerpo.

(dsFv)2 como se emplea en la presente memoria se refiere a un dsFv con un dominio enlazado, por ejemplo, mediante un enlazador peptídico o un enlace disulfuro (por ejemplo, entre el extremo C de dos Vh) a un dominio en un segundo dsFv, el formato se asemeja a un (scFv)2 que se describe a continuación, pero cada par de regiones variables comprende un enlace disulfuro de región intravariable.

Componente como se emplea en la presente memoria se refiere a un bloque de construcción o porción de una molécula multiespecífica de la presente descripción, en particular donde el componente es un fragmento de anticuerpo tal como scFv, Fab u otro fragmento, en particular como se describe en la presente memoria.

Fv de cadena única o abreviado como "scFv", tal y como se usa en la presente memoria, se refiere a un fragmento de anticuerpo que comprende dominios de anticuerpos Vh y Vl unidos (por ejemplo, mediante un enlazador peptídico) para formar una única cadena polipeptídica. Las regiones constantes de la cadena pesada y ligera se omiten en este formato.

dsscFv, como se emplea en la presente memoria, se refiere a scFv con un enlace disulfuro de región intravariable.

Tándem scFv (también denominado en la presente memoria discFv o (scFv)2)) como se emplea en la presente memoria se refiere a dos scFv enlazados a través de un único enlazador de modo que hay un único enlazador entre Fv, por ejemplo, como se muestra en la Figura 5b.

Tándem dsscFv (también denominado en la presente memoria scFvdsscFv o dsscFvscFv) como se emplea en la presente memoria se refiere a dos scFv enlazados a través de un solo enlazador de modo que hay un único enlazador entre Fv, por ejemplo, como se muestra en la Figura 5b, y en donde uno de los scFv tiene un enlace disulfuro de región intravariable.

Tándem didsscFv (también denominado en la presente memoria como didsscFv), como se emplea en la presente memoria, se refiere a dos scFv unidos mediante un único enlazador de modo que hay un único enlazador entre Fv, por ejemplo, como se muestra en la Figura 5b, y donde cada scFv comprende un enlace disulfuro de región intravariable.

scFv-dsFv, como se emplea en la presente memoria, es un scFv unido, por ejemplo, mediante un enlazador peptídico, a un dominio Fv que está compuesto por dos dominios variables enlazados mediante un enlace disulfuro para formar un dsFv. En este formato, el VH o VL del scFv puede estar unido al VH o VL del dsFv.

dsscFv-dsFv, como se emplea en la presente memoria, es un dsscFv unido, por ejemplo, mediante un enlazador peptídico, a un dominio Fv que está compuesto por dos dominios variables unidos mediante un enlace disulfuro para formar un dsFv. En este formato, el VH o VL del dsscFv puede estar unido al VH o VL del dsFv.

Diacuerpo, como se emplea en la presente memoria, se refiere a dos pares Fv Vh/Vl y un par Vh/Vl más que tienen dos enlazadores entre Fv, de modo que el Vh de un primer Fv está unido al Vl de la segunda Fv y el Vl del primer Fv está unido al Vh del segundo Fv.

dsDiacuerpo, como se emplea en la presente memoria, se refiere a un diacuerpo que comprende un enlace disulfuro de región intravariable.

didsDiacuerpo, como se emplea en la presente memoria, se refiere a un diacuerpo que comprende dos enlaces disulfuro de región intravariable, es decir, un ds entre cada par de regiones variables.

Sc-diacuerpo, como se emplea en la presente memoria, se refiere a un diacuerpo que comprende un enlazador intra-Fv, de modo que la molécula comprende tres enlazadores y forma dos scFv normales, por ejemplo, VH1 enlazador VL1 enlazador VH2 enlazador VL2.

dssc-diacuerpo, como se emplea en la presente memoria, se refiere a un sc-diacuerpo con un enlace disulfuro de región intravariable.

didssc-diacuerpo como se emplea en la presente memoria se refiere a un sc-diacuerpo con un enlace disulfuro de región intravariable entre cada par de regiones variables.

Dart, como se emplea en la presente memoria, se refiere a VL1 enlazador VH2 enlazador y VH1 enlazador VL2 donde el extremo C de VH1 y VH2 están unidos por un enlace disulfuro Paul A. Moore et al Blood, 2011; 117(17): 4542-4551.

Bite® como se emplea en la presente memoria se refiere a una molécula que comprende dos pares de dominios variables en el siguiente formato; un dominio del par 1 (por ejemplo, VH1) conectado a través de un enlazador a un dominio del par 2 (por ejemplo, VH2 o VL2) dicho segundo dominio conectado por un enlazador al dominio adicional del par 1 (por ejemplo, VL1) a su vez conectado al dominio restante del par dos (es decir, VL2 o VH2).

Di-diacuerpo véase, Nunez-Prado et al en particular la molécula número 25 en la Fig. 1 de la misma.

Dsdi-diacuerpo, como se emplea en la presente memoria, es un di-diacuerpo con un enlace disulfuro de región intravariable.

Didsdi-diacuerpo como se emplea en la presente memoria es un di-diacuerpo con un enlace disulfuro de región intravariable entre cada par de regiones variables.

T riacuerpo, como se emplea en la presente memoria, se refiere a un formato similar al diacuerpo que comprende tres Fvs y tres enlazadores inter-Fv.

dstriacuerpo como se emplea en la presente memoria se refiere a un triacuerpo que comprende un enlace disulfuro de región intravariable entre uno de los pares de dominios variables.

Didstriacuerpo como se emplea en la presente memoria se refiere a un triacuerpo que comprende dos enlaces disulfuro de región intravariable, es decir, un ds entre cada uno de dos pares de dominios variables.

Tridstriacuerpo como se emplea en la presente memoria se refiere a un triacuerpo que comprende tres enlaces disulfuro de región intravariable, es decir, un ds entre cada par de regiones variables.

Tetracuerpo, como se emplea en la presente memoria, se refiere a un formato similar al diacuerpo que comprende cuatro Fv y cuatro enlazadores inter-Fv.

dstetracuerpo, como se emplea en la presente memoria, se refiere a un tetracuerpo que comprende un enlace disulfuro de región intravariable entre uno de los pares de dominios variables.

Didstetracuerpo como se emplea en la presente memoria se refiere a un tetracuerpo que comprende dos enlaces disulfuro de región intravariable, es decir, un ds entre cada uno de los dos pares de dominios variables.

Tridstetracuerpo como se emplea en la presente memoria se refiere a un tetracuerpo que comprende tres enlaces disulfuro de región intravariable, es decir, un ds entre cada uno de los tres pares de regiones variables.

Tetradstetracuerpo como se emplea en la presente memoria se refiere a un tetracuerpo que comprende cuatro enlaces disulfuro de región intravariable, es decir, un ds entre cada dominio variable.

Tricuerpo (también denominado Fab(scFv)2) como se emplea en la presente memoria se refiere a un fragmento Fab con un primer scFv unido al extremo C de la cadena ligera y un segundo scFv unido al extremo C de la cadena pesada. dstricuerpo como se emplea en la presente memoria se refiere a un tricuerpo que comprende un dsscFv en una de las dos posiciones.

didstricuerpo o TrYbe, como se emplea en la presente memoria, se refiere a un tricuerpo que comprende dos dsscFv. dsFab, como se emplea en la presente memoria, se refiere a un Fab con un enlace disulfuro de región intravariable. dsFab' como se emplea en la presente memoria se refiere a un Fab' con un enlace disulfuro de región intravariable. scFab es un fragmento Fab de cadena única.

scFab' es un fragmento Fab' de cadena única.

dsscFab es un dsFab como una cadena única.

dsscFab' es un dsFab' como una cadena única.

Fabdab, como se emplea en la presente memoria, se refiere a un fragmento Fab con un dominio de anticuerpo unido a la cadena pesada o ligera del mismo, opcionalmente mediante un enlazador.

Fab'dab, como se emplea en la presente memoria, se refiere a un fragmento Fab' con un dominio de anticuerpo unido a la cadena pesada o ligera del mismo, opcionalmente mediante un enlazador.

FabFv como se emplea en la presente memoria se refiere a un fragmento Fab con una región variable adicional unida extremo C de cada uno de los siguientes, el CH1 de la cadena pesada y CL de la cadena ligera véase, por ejemplo, WO2009/040562. El formato se puede proporcionar como una versión PEGilada del mismo véase, por ejemplo, WO2011/061492,

Fab'Fv, como se emplea en la presente memoria, es similar a FabFv, en donde la porción Fab se reemplaza por un Fab'. El formato se puede proporcionar como una versión PEGilada del mismo.

FabdsFv como se emplea en la presente memoria se refiere a un FabFv en donde un enlace disulfuro intra-Fv estabiliza las regiones variables C-terminales añadidas, véase, por ejemplo, WO2010/035012. El formato se puede proporcionar como una versión PEGilada del mismo.

Fab enlazador único Fv y Fab' enlazador único como se emplea en la presente memoria se refieren a un fragmento Fab o Fab' unido a un dominio variable, por ejemplo mediante un enlazador peptídico, y dicho dominio variable está unido a un segundo dominio variable a través de un enlace disulfuro de dominio variable formando así un dsFv, véase, por ejemplo, WO2014/096390.

Fab-scFv (también denominado un bicuerpo), como se emplea en la presente memoria, es una molécula Fab con un scFv añadido en el extremo C de la cadena ligera o pesada, opcionalmente mediante un enlazador.

Fab'-scFv, como se emplea en la presente memoria, es una molécula Fab' con un scFv añadido en el extremo C de la cadena ligera o pesada, opcionalmente mediante un enlazador.

FabdsscFv o BYbe, como se emplea en la presente memoria, es un FabscFv con un enlace disulfuro entre las regiones variables del Fv de cadena única.

Fab'dsscFv, como se emplea en la presente memoria, es un Fab'scFv con un enlace disulfuro entre las regiones variables del Fv de cadena única.

FabscFv-dab, como se emplea en la presente memoria, se refiere a un Fab con un scFv añadido al extremo C de una cadena y el dominio de anticuerpo añadido al extremo C de la otra cadena.

Fab'scFv-dab, como se emplea en la presente memoria, se refiere a un Fab' con un scFv añadido al extremo C de una cadena y un dominio de anticuerpo añadido al extremo C de la otra cadena.

FabdsscFv-dab, como se emplea en la presente memoria, se refiere a un Fab con un dsscFv añadido al extremo C de una cadena y un dominio de anticuerpo añadido al extremo C de la otra cadena.

Fab'dsscFv-dab como se emplea en la presente memoria se refiere a un Fab' con un dsscFv añadido al extremo C de una cadena y un dominio de anticuerpo añadido al extremo C de la otra cadena.

FabscFv enlazador único Fv como se emplea en la presente memoria se refiere a un Fab enlazador único Fv en donde un dominio del Fv está unido a la cadena pesada o ligera del Fab y un scFv está unido a la otra cadena de Fab y los dominios del Fv están conectados por un disulfuro de región intravariable.

FabdsscFv enlazador único Fv, como se emplea en la presente memoria, se refiere a un FabscFv enlazador único Fv en donde el scFv comprende un enlace disulfuro de región intravariable.

Fab'scFv enlazador único Fv, como se emplea en la presente memoria, se refiere a un Fab' enlazador único Fv en donde un dominio del Fv está unido a la cadena pesada o ligera del Fab y un scFv está unido a la otra cadena de Fab y a los dominios del Fv. están conectados por un disulfuro de región intravariable.

Fab'dsscFv enlazador único Fv, como se emplea en la presente memoria, se refiere a un Fab'scFv enlazador único Fv en donde el scFv comprende un enlace disulfuro de región intravariable.

FvFabFv, como se emplea en la presente memoria, se refiere a un Fab con los dominios de un primer Fv añadidos al extremo N de la cadena pesada y ligera del Fab y los dominios de un segundo Fv añadidos al extremo C de la cadena pesada y ligera.

FvFab'Fv, como se emplea en la presente memoria, se refiere a un Fab' con los dominios de un primer Fv añadidos al extremo N de la cadena pesada y ligera del Fab' y los dominios de un segundo Fv añadidos al extremo C de la cadena pesada y ligera.

dsFvFabFv, como se emplea en la presente memoria, se refiere a un Fab con los dominios de un primer Fv añadidos al extremo N de la cadena pesada y ligera del Fab, en donde el primer Fv comprende un enlace disulfuro de región intravariable y los dominios de un segundo Fv añadidos al extremo C de la cadena pesada y ligera.

FvFabdsFv, como se emplea en la presente memoria, se refiere a un Fab con los dominios de un primer Fv añadidos al extremo N de la cadena pesada y ligera del Fab y los dominios de un segundo Fv añadidos al extremo C de la cadena pesada y ligera y en donde el segundo Fv comprende un enlace disulfuro de región intravariable.

dsFvFab'Fv, como se emplea en la presente memoria, se refiere a un Fab' con los dominios de un primer Fv añadidos al extremo N de la cadena pesada y ligera del Fab', en donde el primer Fv comprende un enlace disulfuro de región intravariable y los dominios de un segundo Fv añadidos al extremo C de la cadena pesada y ligera.

FvFab'dsFv, como se emplea en la presente memoria, se refiere a un Fab' con los dominios de un primer Fv añadidos al extremo N de la cadena pesada y ligera del Fab' y los dominios de un segundo Fv añadidos al extremo C de la cadena pesada y ligera y en donde el segundo Fv comprende un enlace disulfuro de región intravariable.

dsFvFabdsFv, como se emplea en la presente memoria, se refiere a un Fab con los dominios de un primer Fv añadidos al extremo N de la cadena pesada y ligera del Fab, en donde el primer Fv comprende un enlace disulfuro de región intravariable y los dominios de un segundo Fv añadidos al extremo C de la cadena pesada y ligera y en donde el segundo Fv también comprende un enlace disulfuro de región intravariable.

dsFvFab'dsFv, como se emplea en la presente memoria, se refiere a un Fab' con los dominios de un primer Fv añadidos al extremo N de la cadena pesada y ligera del Fab' en donde el primer Fv comprende un enlace disulfuro de región intravariable y los dominios de un segundo Fv añadidos al extremo C de la cadena pesada y ligera y en donde el segundo Fv también comprende un enlace disulfuro de región intravariable.

FabFvFv como se emplea en la presente memoria se refiere a un fragmento Fab con dos pares de Fv añadidos en serie al extremo C de la cadena pesada y ligera, véase, por ejemplo, WO2011/086091.

Fab'FvFv, como se emplea en la presente memoria, se refiere a un fragmento Fab' con dos pares de Fv añadidos en serie al extremo C de la cadena pesada y ligera, véase, por ejemplo, WO2011/086091.

FabdsFvFv, como se emplea en la presente memoria, se refiere a un fragmento Fab con dos pares de Fv añadidos en serie al extremo C de la cadena pesada y ligera, véase, por ejemplo, WO2011/086091, en donde el primer par Fv unido directamente al extremo C comprende un enlace disulfuro de región intravariable.

Fab'dsFvFv, como se emplea en la presente memoria, se refiere a un fragmento Fab' con dos pares de Fv añadidos en serie al extremo C de la cadena pesada y ligera, véase, por ejemplo, WO2011/086091, en donde el primer par Fv unido directamente al extremo C comprende un enlace disulfuro de región intravariable.

FabFvdsFv, como se emplea en la presente memoria, se refiere a un fragmento Fab con dos pares de Fv añadidos en serie al extremo C de la cadena pesada y ligera, en donde el segundo par Fv en el extremo "C" de la molécula comprende un enlace disulfuro de región intravariable.

Fab'FvdsFv como se emplea en la presente memoria se refiere a un fragmento Fab' con dos pares de Fv añadidos en serie al extremo C de la cadena pesada y ligera, en donde el segundo par Fv en el extremo "C" de la molécula comprende un enlace disulfuro de región intravariable.

FabdsFvdsFv, como se emplea en la presente memoria, se refiere a un fragmento Fab con dos pares de Fv añadidos en serie al extremo C de la cadena pesada y ligera, en donde el primer y segundo par Fv comprenden un enlace disulfuro de región intravariable.

Fab'dsFvdsFv, como se emplea en la presente memoria, se refiere a un fragmento Fab' con dos pares de Fv añadidos en serie al extremo C de la cadena pesada y ligera, en donde el primer y segundo Fv comprenden un enlace disulfuro de región intravariable.

DiFab, como se emplea en la presente memoria, se refiere a dos moléculas Fab unidas a través de sus extremos C de las cadenas pesadas.

DiFab' como se emplea en la presente memoria se refiere a dos moléculas Fab' unidas mediante uno o más enlaces disulfuro en la región de bisagra de las mismas.

Las moléculas DiFab y DiFab' incluyen formas conjugadas químicamente de las mismas.

(FabscFv)2 como se emplea en la presente memoria, se refiere a una molécula diFab con dos scFv añadidos a la misma, por ejemplo, añadidos en el extremo C de la cadena pesada o ligera, tal como la cadena pesada.

(Fab'scFv)2 como se emplea en la presente memoria se refiere a una molécula diFab' con dos scFv añadidos a la misma, por ejemplo, añadidos en el extremo C de de la cadena pesada o ligera, tal como la cadena pesada.

(Fab)2scFvdsFv, como se emplea en la presente memoria, se refiere a un diFab con un scFv y un dsFv añadidos, por ejemplo, uno de cada uno de los extremos C de la cadena pesada.

(Fab')2scFvdsFv, como se emplea en la presente memoria, se refiere a un diFab' con un scFv y un dsFv añadidos, por ejemplo, uno de cada uno de los extremos C de la cadena pesada.

(Fab)2dsscFvdsFv, como se emplea en la presente memoria, se refiere a un diFab con un dsscFv y un dsFv añadidos, por ejemplo, del extremo C de la cadena pesada.

(Fab')2dsscFvdsFv, como se emplea en la presente memoria, se refiere a un diFab' con un dsscFv y dsFv añadidos, por ejemplo, del extremo C de la cadena pesada.

Minicuerpo, como se emplea en la presente memoria, se refiere a (VL/VH-CH3)2.

dsminicuerpo como se emplea en la presente memoria se refiere a (VL/VH-CH3)2 donde un VL/VH comprende un enlace disulfuro de región intravariable.

didsminicuerpo como se emplea en la presente memoria se refiere a un (dsFv-CH3)2

scFv-Fc, tal como se emplea en la presente memoria, se refiere a un scFv añadido al extremo N de un dominio CH2, por ejemplo, mediante una bisagra, del fragmento de región constante -(CH2CH3), de manera que la molécula tiene 2 dominios de unión.

dsscFv-Fc, como se emplea en la presente memoria, se refiere a un dsscFv añadido al extremo N de un dominio CH2 y un scFv añadido al extremo N de un segundo dominio CH2, por ejemplo, mediante una bisagra, del fragmento de región constante -(CH2CH3)2, de manera que la molécula tiene 2 dominios de unión.

didsscFv-Fc, como se emplea en la presente memoria, se refiere a un scFv añadido al extremo N de un dominio CH2, por ejemplo, mediante una bisagra, del fragmento de región constante -(CH2CH3)2, de manera que la molécula tiene 2 dominios de unión

Tándem scFv-Fc como se emplea en la presente memoria se refiere a dos tándems scFv, en donde cada uno se añade en serie al extremo N de un dominio CH2, por ejemplo a través de una bisagra, del fragmento de región constante -(CH2CH3), de manera que la molécula tiene 4 dominios de unión.

Scdiacuerpo-Fc como se emplea en la presente memoria son dos scdiacuerpos, en donde cada uno se añade al extremo N de un dominio CH2, por ejemplo, a través de una bisagra, del fragmento de región constante -CH2CH3. ScFv-Fc-scFv, como se emplea en la presente memoria, se refiere a cuatro scFv, en donde uno de cada uno se añade al extremo N y al extremo C tanto de la cadena pesada como ligera de un fragmento -CH2CH3.

Scdiacuerpo-CH³como se emplea en la presente memoria se refiere a dos moléculas scdiacuerpo cada una unida, por ejemplo, mediante una bisagra a un dominio CH3.

kappa/lambda cuerpo' o V/A-cuerpo tiene el formato de una IgG normal con dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras, en donde las dos cadenas ligeras son diferentes entre sí, una es una cadena ligera lambda (VL - CL) y la otra es una cadena ligera kappa (VK-CK). La cadena pesada es idéntica, incluso en las CDR como se describe en WO2012/023053.

IgG-scFv, como se emplea en la presente memoria, es un anticuerpo de longitud completa con un scFv en el extremo C de cada una de las cadenas pesadas o de cada una de las cadenas ligeras.

scFv-IgG, como se emplea en la presente memoria, es un anticuerpo de longitud completa con un scFv en el extremo N de cada una de las cadenas pesadas o de cada una de las cadenas ligeras.

V-IgG, como se emplea en la presente memoria, es un anticuerpo de longitud completa con un dominio variable en el extremo N de cada una de las cadenas pesadas o de cada una de las cadenas ligeras.

IgG-V, como se emplea en la presente memoria, es un anticuerpo de longitud completa con un dominio variable en el extremo C de cada una de las cadenas pesadas o de cada una de las cadenas ligeras.

DVD-Ig (también conocido como IgG de dominio V dual) es un anticuerpo de longitud completa con 4 dominios variables adicionales, uno en el extremo N de cada cadena pesada y cada cadena ligera.

Duocuerpo o "intercambio de brazo Fab", como se emplea en la presente memoria, es un anticuerpo de formato IgG biespecífico en el que los cambios de aminoácidos diseñados complementarios y emparejados en los dominios constantes (típicamente CH3) de dos anticuerpos monoclonales diferentes conducen, al mezclarse, a la formación de heterodímeros. Un par de cadena pesada:ligera del primer anticuerpo, como resultado de la ingeniería de residuos, preferirá asociarse con un par de cadena pesada:ligera de un segundo anticuerpo. Véase, por ejemplo, WO2008/119353, WO2011/131746 y WO2013/060867.

Cuando uno o más pares de regiones variables en la molécula multiespecífica de la presente invención comprenden un enlace disulfuro entre VH y VL, este puede estar en cualquier posición adecuada, tal como entre dos de los residuos enumerados a continuación (a menos que el contexto indique lo contrario, se emplea la numeración de Kabat en la lista siguiente). Siempre que se haga referencia a la numeración de Kabat, la referencia relevante es Kabat et al., 1987, en Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Department of Health and Human Services, NIH, EE. UU. En una realización, el enlace disulfuro está en una posición seleccionada del grupo que comprende:

• Vh37 Vl95C véase, por ejemplo, Protein Science 6, 781 -788 Zhu et al (1997);

• Vh44 Vl100 véase, por ejemplo; Biochemistry 33 5451-5459 Reiter et al (1994); o Journal of Biological Chemistry Vol. 269 No. 28 p. 18327-18331 Reiter et al (1994); o Protein Engineering, vol. 10, no. 12, p. 1453 1459 Rajagopal et al (1997);

• Vh44 Vl105 véase, por ejemplo, J Biochem. 118, 825-831 Luo et al (1995);

• Vh45 Vl87 véase, por ejemplo, Protein Science 6, 781-788 Zhu et al (1997);

• Vh55 Vl101 véase, por ejemplo, FEBS Letters 377135-139 Young et al (1995);

• Vh100 Vl50 véase, por ejemplo, Biochemistry 291362-1367 Glockshuber et al (1990);

• Vh100b Vl49;

• Vh98 Vl 46 véase, por ejemplo, Protein Science 6, 781-788 Zhu et al (1997);

• Vh101 Vl46;

• Vh105 Vl43 véase, por ejemplo; Proc. Natl. Acad. Sci. USA Vol. 90 p. 7538-7542 Brinkmann et al (1993); o Proteins 19, 35-47 Jung et al (1994),

• Vh106 Vl57 véase, por ejemplo, FEBS Letters 377135-139 Young et al (1995)

y una posición correspondiente a la misma en un par de regiones variables localizadas en la molécula.

En una realización, el enlace disulfuro se forma entre las posiciones Vh44 y Vl100.

"Monoespecífico", como se emplea en la presente memoria, se refiere a la capacidad de unirse a un antígeno diana solo una vez. Por lo tanto, es una realización las moléculas multiespecíficas de la presente invención son monoespecíficas para cada antígeno.

Por tanto, en una realización, los dominios de unión de las moléculas multiespecíficas según la presente descripción son monoespecíficos. Esto es ventajoso en algunas aplicaciones terapéuticas porque las moléculas de la descripción no son capaces de entrecruzar el antígeno mediante la unión del antígeno diana más de una vez. Por tanto, en una realización, las moléculas biespecíficas o multiespecíficas de la presente descripción no son capaces de entrecruzamiento mediante la unión a la misma diana dos veces en dos ubicaciones diferentes, por ejemplo, en la misma célula o en dos células diferentes.

El entrecruzamiento, en particular en relación con CD79b en la misma célula o en células diferentes, puede generar señales. in vivo, por ejemplo, que estimulan la actividad del antígeno diana.

En otra realización, por ejemplo, cuando las moléculas de la descripción comprenden al menos tres dominios de unión, entonces dos o tres dominios de unión (por ejemplo, anticuerpos, fragmentos o una combinación de un anticuerpo y un fragmento) pueden tener diferentes especificidades de antígeno, por ejemplo, unirse a dos o tres antígenos diana diferentes.

En un ejemplo, las moléculas multiespecíficas de la presente invención no contienen más de un dominio de unión para CD22 y no más de un dominio de unión para CD79. Cada dominio de unión es monoespecífico.

En una realización, cada anticuerpo o fragmento de anticuerpo empleado en las moléculas multiespecíficas de la presente descripción es monovalente.

Por tanto, en una realización, los dominios de unión de las moléculas multiespecíficas de la presente descripción son monovalentes.

Por tanto, en una realización, los dominios de unión de las moléculas multiespecíficas de la presente descripción son monovalentes y monoespecíficas.

En una realización, la molécula multiespecífica de la presente descripción está compuesta por dos o más dominios de unión monovalentes, monoespecíficos, tales como Fab, Fab ', scFv, VH, VL, VHH, Fv, dsFv, combinados o unidos de cualquier forma adecuada para construir una molécula multiespecífica, por ejemplo, como se describe anteriormente en la presente memoria.

Regiones constantes

Los dominios de la región constante de anticuerpo de una molécula multiespecífica de la presente descripción, si están presentes, pueden seleccionarse teniendo en cuenta la función propuesta de la molécula de anticuerpo multiespecífico y, en particular, las funciones efectoras que pueden ser necesarias. Por ejemplo, los dominios de la región constante pueden ser dominios de IgA, IgD, IgE, IgG o IgM humanas. En particular, pueden usarse dominios de región constante de IgG humana, especialmente de los isotipos IgG1 e IgG3 cuando la molécula de anticuerpo está destinada a usos terapéuticos y se requieren funciones efectoras del anticuerpo. Alternativamente, los isotipos IgG2 e IgG4 pueden usarse cuando la molécula de anticuerpo está destinada a fines terapéuticos y no se requieren funciones efectoras del anticuerpo.

Se apreciará que también se pueden usar variantes de secuencia de estos dominios de región constante. Por ejemplo, pueden usarse moléculas de IgG4 en las que la serina en la posición 241 se ha cambiado a prolina como se describe en Angal et al., 1993, Molecular Immunology, 1993, 30: 105-108. Por consiguiente, en la realización en la que el anticuerpo es un anticuerpo IgG4, el anticuerpo puede incluir la mutación S241P.

En una realización, la cadena pesada del anticuerpo comprende un dominio CH1 y la cadena ligera del anticuerpo comprende un dominio CL, ya sea kappa o lambda.

En una realización, la cadena pesada del anticuerpo comprende un dominio CHi , un dominio CH2 y un dominio CH3 y la cadena ligera del anticuerpo comprende un dominio CL, ya sea kappa o lambda.

Los cuatro isotipos de IgG humana se unen a los receptores Fcy activadores (FcyRI, FcYRIIa, FcyRIIIa), al receptor inhibidor FcYRIIb y al primer componente del complemento (Clq) con diferentes afinidades, produciendo funciones efectoras muy diferentes (Bruhns P. et al., 2009. Specificity and affinity of human Fcgamma receptors and their polymorphic variants for human IgG subclasses. Blood. 113 (16): 3716-25), ver también Jeffrey B. Stavenhagen et al. Cancer Research 15 de septiembre de 2007; 67 (18): 8882-90.

La unión de IgG a FcyR o C1q depende de los residuos ubicados en la región bisagra y el dominio CH2. Dos regiones del dominio CH2 son críticas para la unión de FcyR y C1q, y tienen secuencias únicas en IgG2 e IgG4. Se ha mostrado que las sustituciones en IgG1 humana de residuos de IgG2 en las posiciones 233-236 y residuos de IgG4 en las posiciones 327, 330 y 331 reducen en gran medida la ADCC y CDC (Armadura KL. et al., 1999. Recombinant human IgG molecules lacking Fcgamma receptor I binding and monocyte triggering activities. Eur J Immunol. 29 (8): 2613-24 y Shields R L. et al., 2001. High resolution mapping of the binding site on human IgG 1 for Fc gamma RI, Fc gamma RII, Fc gamma RIII, and FcRn and design of IgG1 variants with improved binding to the Fc gamma R. J Biol Chem.

276 (9): 6591-604). Además, Idusogie et al. demostraron que la sustitución de alanina en diferentes posiciones, incluido K322, redujo significativamente la activación del complemento (Idusogie EE. et al., 2000. Mapping of the C1q binding site on rituxan, a chimeric antibody with a human IgG 1 Fc. J Immunol. 164 (8): 4178-84). Del mismo modo, se mostró que las mutaciones en el dominio CH2 de IgG2A murina reducían la unión a FcyRI y C1q (Steurer W. et al., 1995. Ex vivo coating of islet cell allografts with murine CTLA4/Fc promotes graft tolerance. J Immunol. 155 (3): 1165-74).

En una realización, la región Fc empleada está mutada, en particular una mutación descrita en la presente memoria. En una realización, la mutación es para eliminar la función de unión y/o efectora.

En una realización, la mutación en Fc se selecciona del grupo que comprende una mutación para eliminar la unión de la región Fc, una mutación para aumentar o eliminar una función efectora, una mutación para aumentar la semivida y una combinación de las mismas.

Algunos anticuerpos que se unen selectivamente a FcRn a pH 6,0, pero no a pH 7,4, exhiben una semivida más alta en una variedad de modelos animales. Varias mutaciones ubicadas en la interfaz entre los dominios CH2 y CH3, tal como T250Q/M428L (Hinton PR. et al., 2004. Engineered human IgG antibodies with longer serum half-lives in primates. J Biol Chem. 279 (8): 6213-6) y M252Y/S254T/T256E H433K/N434F (Vaccaro C. et al., 2005. Engineering the Fc region of immunoglobulin G to modulate in vivo antibody levels. Nat Biotechnol. 23 (10): 1283-8), se ha mostrado que aumentan la afinidad de unión a FcRn y la semivida de IgG1 in vivo. Sin embargo, no siempre existe una relación directa entre el aumento de la unión de FcRn y la mejora de la semivida (Datta-Mannan A. et al., 2007. Humanized IgG1 Variants with Differential Binding Properties to the Neonatal Fc Receptor: Relationship to Pharmacokinetics in Mice and Primates. Drug Metab. Dispos. 35: 86 - 94).

La subclase IgG4 muestra una unión reducida al receptor Fc (FcYRIIIa), los anticuerpos de otras subclases de IgG generalmente muestran una unión fuerte. La unión reducida al receptor en estos otros subtipos de IgG se puede efectuar alterando, por ejemplo, reemplazando uno o más aminoácidos seleccionados del grupo que comprende Pro238, Aps265, Asp270, Asn270 (pérdida de carbohidrato Fc), Pro329, Leu234, Leu235, Gly236, Gly237, Ile253, Ser254, Lys288, Thr307, Gln311, Asn434 e His435.

En una realización, una molécula según la presente descripción tiene una Fc de la subclase de IgG, por ejemplo, IgG 1, IgG2 o IgG3, en donde Fc está mutado en una, dos o todas las posiciones siguientes S228, L234 y/o D265.

En una realización, las mutaciones en la región Fc se seleccionan independientemente de S228P, L234A, L235A, L235A, L235E y combinaciones de las mismas.

Puede desearse reducir o aumentar la función efectora de una región Fc. Se requieren anticuerpos que tomen como diana las moléculas de la superficie celular, especialmente las de las células inmunitarias, que anulen las funciones efectoras. En algunas realizaciones, por ejemplo, para el tratamiento de la autoinmunidad, puede ser deseable una unión de Fc mejorada en las células inmunes aumentando la unión negativa del receptor de Fc (FcgRIIb o CD32b), véase Stavenhagen JB, et al Advances in Enzyme Regulation 2007 3 de diciembre y Veri MC, et al. Arthritis Rheum, 30 de marzo de 2010; 62 (7): 1933-43. A la inversa, para los anticuerpos destinados a uso oncológico, el aumento de las funciones efectoras puede mejorar la actividad terapéutica.

Se han realizado numerosas mutaciones en el dominio CH2 de la IgG1 humana y su efecto en ADCC y CDC se ha ensayado in vitro (Idusogie EE. et al., 2001. Engineered antibodies with increased activity to recruit complement. J Immunol. 166 (4): 2571 -5). En particular, se informó que la sustitución de alanina en la posición 333 aumentaba tanto la ADCC como la CDC. Lázaro et al. describieron un triple mutante (S239D/I332E/A330L) con una mayor afinidad por FcyRIIIa y una menor afinidad por FcyRIIb que da como resultado una ADCC mejorada (Lazar GA. et al., 2006. Engineered antibody Fc variants with enhanced effector function. PNAS 103 (11): 4005-4010). Se utilizaron las mismas mutaciones para generar un anticuerpo con ADCC aumentada (Ryan MC. et al., 2007. Antibody targeting of B-cell maturation antigen on malignant plasma cells. Mol. Cancer Ther., 6 : 3009 - 3018). Richards et al. estudiaron un triple mutante ligeramente diferente (S239D/I332E/G236A) con una afinidad para FcyRIIIa mejorada y una relación FcyRIIa/FcyRIIb que media la fagocitosis mejorada de las células diana por los macrófagos (Richards JO et al 2008. Optimization of antibody binding to Fcgamma RIIa enhances macrophage phagocytosis of tumor cells. Mol Cancer Ther. 7 (8): 2517-27).

Debido a su falta de funciones efectoras, los anticuerpos IgG4 representan una subclase de IgG adecuada para el bloqueo de receptores sin depleción celular. Las moléculas de IgG4 pueden intercambiar semimoléculas en un proceso dinámico denominado intercambio de brazos Fab. Este fenómeno puede ocurrir entre anticuerpos terapéuticos e IgG4 endógena. Se ha mostrado que la mutación S228P previene este proceso de recombinación permitiendo el diseño de anticuerpos IgG4 terapéuticos menos impredecibles (Labrijn AF. et al., 2009. Therapeutic IgG4 antibodies engage in Fab-arm exchange with endogenous human IgG4 in vivo. Nat Biotechnol. 27 (8): 767-71). Esta tecnología se puede emplear para crear moléculas de anticuerpos biespecíficas.

Un experto en la técnica también entenderá que los anticuerpos pueden sufrir una variedad de modificaciones postraduccionales. El tipo y el alcance de estas modificaciones a menudo depende de la línea de células huésped utilizada para expresar el anticuerpo, así como de las condiciones de cultivo. Tales modificaciones pueden incluir variaciones en la glicosilación, oxidación de metionina, formación de dicetopiperazina, isomerización de aspartato y desamidación de asparagina. Una modificación frecuente es la pérdida de un residuo básico carboxi-terminal (tal como lisina o arginina) debido a la acción de las carboxipeptidasas (como se describe en Harris, RJ. Journal of Chromatography 705: 129-134, 1995). Por consiguiente, la lisina C-terminal de la cadena pesada del anticuerpo puede estar ausente.

Afinidad

Las moléculas multiespecíficas de la presente invención comprenden un dominio de unión específico para el antígeno CD45 y un dominio de unión específico para el antígeno CD79a y/o CD79b.

En una realización, un dominio de unión empleado en las moléculas de la presente descripción es específico para CD45.

En una realización, un dominio de unión empleado en las moléculas de la presente descripción es específico para CD79a.

En una realización, un dominio de unión empleado en las moléculas de la presente descripción es específico para CD79b.

En una realización, un dominio de unión empleado en las moléculas de la presente descripción es específico para el complejo CD79, es decir, reconoce un epítopo presente en el complejo y es específico del mismo, por ejemplo, un epítopo que comprende una interacción entre CD79a y CD79b. CD45 (también conocido como PTPRC) es una proteína conocida. CD45 es un miembro de la familia de la proteína tirosina fosfatasa (PTP). Se sabe que las PTP son moléculas de señalización que regulan una variedad de procesos celulares que incluyen el crecimiento celular, la diferenciación, el ciclo mitótico y la transformación oncogénica. Esta PTP contiene un dominio extracelular, un solo segmento transmembrana y dos dominios catalíticos intracitoplasmáticos en tándem y, por tanto, pertenece al tipo de receptor PTP. Existen varias isoformas de CD45: CD45RA, CD45RB, CD45RC, CD45RAB, CD45RAC, CD45RBC, CD45RO, CD45R (ABC). CD45RA está localizado en células T sin estimular y CD45RO está localizado en células T de memoria. Las isoformas A, B y C de la variante de corte y empalme de CD45 se expresan de forma diferencial en células B humanas. CD45 es un miembro de la familia de proteínas tirosina fosfatasa (PTP): su región intracelular (COOH-terminal) contiene dos dominios catalíticos de PTP, y la región extracelular es muy variable debido al corte y empalme alternativo de los exones 4, 5 y 6 (designados A, B y C, respectivamente), más diferentes niveles de glicosilación. Las isoformas de CD45 detectadas son específicas del tipo celular, del estado de maduración y de activación. En general, la forma larga de la proteína (A, B o C) se expresa en células B no estimuladas o inactivadas y la forma madura o truncada de CD45 (RO) se expresa en células B activadas o maduras/de memoria.

La secuencia humana está disponible en el número de entrada UniProt P08575 y se proporciona en la presente memoria en la SEQ ID NO:.143, o los aminoácidos 24-1304 de la SEQ ID NO: 143, que carecen del péptido señal. La versión murina en la entrada UniProt P06800. La presente descripción se refiere a todas las formas de CD45, de cualquier especie. En una realización, CD45 se refiere a la forma humana de la proteína y a las variantes e isoformas naturales de la misma.

En una realización, la afinidad del dominio de unión para CD45 en una molécula de la presente descripción es aproximadamente 100 nM o más fuerte tal como aproximadamente 50 nM, 20 nM, 10 nM, 1 nM, 500 pM, 250 pM, 200 pM, 100 pM o más fuerte, en particular una afinidad de unión de 50pM o más fuerte.

El dominio de unión para CD79 puede unirse a CD79a y/o CD79b.

CD79a (también conocida como inmunoglobulina alfa y cadena alfa de proteína asociada al complejo de receptor de antígeno de células B) es una proteína conocida. La expresión de CD79a está restringida a los linfocitos B. La secuencia humana está disponible en UniProt con la entrada P11912 (SEQ ID NO: y sin la secuencia señal de aminoácidos 33-226 de la SEQ ID NO: 141). La versión murina está disponible en UniProt con la entrada 11911. La presente descripción se refiere a todas las formas de CD79a de cualquier especie, en particular humana y a cualquier variante natural de la misma. En una realización, CD79a se refiere a la forma humana de la proteína.

CD79b (también conocida como beta asociada a inmunoglobulina y diferenciación de grupos 79B) es una proteína conocida. La expresión de CD79b está restringida a los linfocitos B. La secuencia humana está disponible en UniProt con la entrada P40259 (SEQ ID NO: 142 y sin la secuencia señal de aminoácidos 29-229 de SEQ ID NO: 142). La versión murina en UniProt con la entrada P15530. La presente descripción se refiere a todas las formas de CD79b, de cualquier especie, en particular humana y a cualquier variante natural de la misma. En una realización, CD79b se refiere a la forma humana de la proteína.

En una realización, el dominio de unión específico para CD79 se une a CD79a.

En una realización, el dominio de unión específico para CD79 se une a CD79b.

En una realización, el dominio de unión específico para CD79 se une a un complejo de CD79a y CD79b.

En una realización, la afinidad del dominio de unión para CD79 en una molécula de la presente descripción es aproximadamente 100 nM o más fuerte, tal como aproximadamente 50 nM, 20 nM, 10 nM, 1 nM, 500 pM, 250 pM, 200 pM, 100 pM o más fuerte, en particular una afinidad de unión de 50pM o más fuerte.

En una realización, la afinidad del dominio de unión para CD79a en una molécula de la presente descripción es aproximadamente 100 nM o más fuerte, tal como aproximadamente 50 nM, 20 nM, 10 nM, 1 nM, 500 pM, 250 pM, 200 pM, 100 pM o más fuerte, en particular una afinidad de unión de 50pM o más fuerte.

En una realización, la afinidad del dominio de unión para CD79b en una molécula de la presente descripción es aproximadamente 100 nM o más fuerte, tal como aproximadamente 50 nM, 20 nM, 10 nM, 1 nM, 500 pM, 250 pM, 200 pM, 100 pM o más fuerte, en particular una afinidad de unión de 50pM o más fuerte.

Se apreciará que la afinidad del dominio de unión para CD45 puede ser la misma o diferente de la afinidad del dominio de unión para CD79.

En una realización, las moléculas de anticuerpos multiespecíficas de la presente descripción o los componentes de anticuerpo/fragmento de las mismas se procesan para proporcionar una afinidad mejorada para un antígeno o antígenos diana. Dichas variantes pueden obtenerse mediante varios protocolos de maduración por afinidad, incluida la mutación de las CDR (Yang et al., J. Mol. Biol., 254, 392-403, 1995), mezcla de cadenas (Marks et al., Bio/Technology, 10, 779-783, 1992), el uso de cepas mutantes de E. co li(Low et al. J. Mol. Biol., 250, 359-368, 1996), mezcla de ADN (Patten et al. Curr. Opin. Biotechnol., 8, 724-733, 1997), presentación en fagos (Thompson et al., J. Mol. Biol., 256, 77-88, 1996) y PCR sexual (Crameri et al Nature, 391, 288-291, 1998). Vaughan et al (supra) analiza estos métodos de maduración por afinidad.

Anticuerpos y generación de los mismos

Los dominios de unión para su uso en la presente invención se pueden generar mediante cualquier método adecuado conocido en la técnica, por ejemplo, se pueden tomar las CDR de anticuerpos no humanos, incluidos los anticuerpos disponibles comercialmente, y se pueden injertar en marcos humanos o, alternativamente, se pueden preparar anticuerpos quiméricos con regiones variables no humanas y regiones constantes humanas, etc.

Típicamente, los dominios de unión para su uso en la presente invención son dominios de unión derivados de anticuerpos que se unen al antígeno seleccionado, tales como anticuerpos que se unen a CD45, CD79a y/o CD79b.

En la técnica se conocen ejemplos de anticuerpos frente a CD45 y CD79 y estos pueden emplearse directamente en las moléculas de la presente invención o cribarse para determinar su idoneidad usando los métodos descritos en la presente memoria, y posteriormente modificarse si es necesario, por ejemplo, humanizarse, usando los métodos descritos en la presente memoria. Se han descrito en la técnica anticuerpos terapéuticos anti-CD45 y anti-CD79, por ejemplo, anticuerpos anti-CD45 descritos en US2011/0076270, anticuerpos anti-CD79b descritos en WO2014/011521 y WO2015/021089.

Los ejemplos de anticuerpos frente a CD45 incluyen YTH54 monoclonal de rata, YTH25.4, monoclonal de ratón de Miltenyi clon 5B1 y clon 30F11, YAML568 monoclonal de rata, del clon monoclonal de ratón 2D1 de BD Bioscience No. de catálogo 347460, del anticuerpo monoclonal de ratón Novus 5D3A3, No. de catálogo NBP2-37293, HI30 monoclonal de ratón No. de catálogo NBP1-79127, 4A8A4C7A2 monoclonal de ratón No. de catálogo NBP1-47428, 2B11 monoclonal de ratón No. de catálogo NBP2-32934, YTH24.5 monoclonal de rata No. de catálogo NB100-63828, Y321 monoclonal de conejo No. de catálogo NB110-55701, PD7/26/16 monoclonal de ratón No. de catálogo NB120-875, de Santa Cruz monoclonal de ratón del clon B8 No. de catálogo sc-28369, monoclonal de ratón del clon F10-89-4 No. de catálogo sc-52490, monoclonal de conejo del clon H-230 No. de catálogo sc-25590, monoclonal de cabra del clon N-19 No. de catálogo sc-1123, monoclonal de ratón del clon OX1 No. de catálogo sc-53045, monoclonal de rata (T29/33) No. de catálogo sc-18901, monoclonal de rata (YAML 501.4) No. de catálogo sc65344, monoclonal de rata (YTH80.103) No. de catálogo sc-59071, monoclonal de ratón (351C5) No. de catálogo sc-53201, monoclonal de ratón (35-Z6) No. de catálogo sc-1178, monoclonal de ratón (158-4D3) No. de catálogo sc-52386, monoclonal de ratón para CD45RO (UCH-L1) No. de catálogo sc-1183, monoclonal de ratón para CD45RO (2Q1392) No. de catálogo sc-70712.

Los anticuerpos frente a CD45 también se describen en WO2005/026210, WO02/072832 y WO2003/048327.

Los anticuerpos anti-CD79a disponibles comercialmente incluyen LS-B4504 (LSBio) monoclonal de ratón del clon HM57, LS-B8330 monoclonal de ratón, LS-C44954 monoclonal de ratón, LS-B9093 monoclonal de conejo, LS-B8513 monoclonal de ratón del clon JCB117, LS-C210607 monoclonal de conejo del clon SP18, LS-C175441 monoclonal de ratón del clon 5E2, LS-C338670 monoclonal de ratón del clon 3D3, LS-C88120 monoclonal de ratón del clon HM47/A9, LS-C191714 monoclonal de ratón, LS-C87592 monoclonal de ratón, LS-C44955 monoclonal de ratón, monoclonal de ratón LS-C95934, monoclonal de ratón LS-C121584, monoclonal de ratón LS-C121585, LS-C204347 monoclonal de ratón, LS-C88122 monoclonal de ratón, Abcam ab3121 [HM47/A9] monoclonal de ratón, ab79414 monoclonal de conejo y ab133483 monoclonal de conejo.

Los anticuerpos frente a CD79b disponibles comercialmente incluyen el anticuerpo Abcam monoclonal de ratón ab33295, ab23826 monoclonal de rata, ab103422 monoclonal de ratón, ab134103 monoclonal de conejo, ab134147 monoclonal de conejo y ab183343 monoclonal de conejo.

Dichos anticuerpos disponibles comercialmente pueden ser herramientas útiles en el descubrimiento de anticuerpos terapéuticos.

El experto en la técnica puede generar anticuerpos para su uso en las moléculas multiespecíficas de la invención usando cualquier método adecuado conocido en la técnica.

Los polipéptidos antigénicos, para su uso en la generación de anticuerpos, por ejemplo, para inmunizar a un huésped o para su uso en el reconocimiento y selección, tal como en la presentación de fagos, pueden prepararse mediante procesos bien conocidos en la técnica a partir de células huésped manipuladas genéticamente que comprenden sistemas de expresión o pueden ser recuperados de fuentes biológicas naturales. En la presente solicitud, el término "polipéptidos" incluye péptidos, polipéptidos y proteínas. Estos se usan indistintamente a menos que se especifique lo contrario. En algunos casos, el polipéptido antigénico puede ser parte de una proteína más grande, tal como una proteína de fusión, por ejemplo, fusionada a una etiqueta de afinidad o similar. En una realización, el huésped puede inmunizarse con una célula transfectada con la proteína o polipéptido relevante, por ejemplo, cotransfectada con CD79a y CD79b.

Pueden obtenerse anticuerpos generados frente a un polipéptido antigénico, cuando sea necesaria la inmunización de un animal, administrando los polipéptidos a un animal, preferiblemente un animal no humano, usando protocolos bien conocidos y de rutina, véase, por ejemplo, Handbook of Experimental Immunology, D. M. Weir (ed.), Vol 4, Blackwell Scientific Publishers, Oxford, Inglaterra, 1986). Se pueden inmunizar muchos animales de sangre caliente, tales como conejos, ratones, ratas, ovejas, vacas, camellos o cerdos. Sin embargo, los ratones, conejos, cerdos y ratas son generalmente los más adecuados.

Los anticuerpos monoclonales se pueden preparar mediante cualquier método conocido en la técnica, tal como la técnica del hibridoma (Kohler y Milstein, 1975, Nature, 256: 495-497), la técnica del trioma, la técnica del hibridoma de células B humanas (Kozbor et al 1983, Immunology Today, 4:72) y la técnica de EBV-hibridoma (Cole et al. Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, p. 77-96, Alan R Liss, Inc., 1985).

Los anticuerpos también se pueden generar usando métodos de anticuerpos de linfocitos individuales clonando y expresando ADNc de región variable de inmunoglobulina generados a partir de linfocitos individuales seleccionados para la producción de anticuerpos específicos mediante, por ejemplo, los métodos descritos por Babcook, J. et al.

1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93 (15): 7843-78481; WO92/02551; WO2004/051268 y WO2004/106377.

Los anticuerpos para uso en la presente descripción también se pueden generar usando varios métodos de presentación en fagos conocidos en la técnica e incluyen los descritos por Brinkman et al. (en J. Immunol. Methods, 1995, 182: 41-50), Ames et al. (J. Immunol. Methods, 1995, 184: 177-186), Kettleborough et al. (Eur. J. Immunol. 1994, 24: 952-958), Persic et al. (Gene, 1997 187 9-18), Burton et al. (Advances in Immunology, 1994, 57: 191-280) y WO90/02809; WO91/10737; WO92/01047; WO92/18619; WO93/11236; WO95/15982; WO95/20401; y US 5.698.426; 5.223.409; 5.403.484; 5.580.717; 5.427.908; 5.750.753; 5.821.047; 5.571.698; 5.427.908; 5.516.637; 5.780.225; 5.658.727; 5.733.743; 5.969.108 y WO20011/30305.

En un ejemplo, las moléculas multiespecíficas de la presente descripción son completamente humanas, en particular uno o más de los dominios variables son completamente humanos.

Las moléculas completamente humanas son aquellas en las que las regiones variables y las regiones constantes (cuando están presentes) tanto de las cadenas pesada como ligera son todas de origen humano, o sustancialmente idénticas a secuencias de origen humano, no necesariamente del mismo anticuerpo. Los ejemplos de anticuerpos completamente humanos pueden incluir anticuerpos producidos, por ejemplo, mediante los métodos de presentación en fagos descritos anteriormente y anticuerpos producidos por ratones en los que los genes de la región variable de inmunoglobulina murina, y opcionalmente de la región constante, han sido reemplazados por sus contrapartes humanas, p. ej., como se describe en términos generales en EP0546073, US5.545.806, US5.569.825, US5.625.126, US5.633.425, US5.661.016, US5.770.429, EP 0438474 y EP0463151.

En un ejemplo, los dominios de unión de las moléculas multiespecíficas según la descripción están humanizados.

Humanizado (que incluye anticuerpos injertados con CDR) como se emplea en la presente memoria se refiere a moléculas que tienen una o más regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de una especie no humana y una región marco de una molécula de inmunoglobulina humana (véase, p. Ej. US 5.585.089; WO91/09967). Se apreciará que solo puede ser necesario transferir los residuos determinantes de la especificidad de las CDR en lugar de la CDR completa (véase, por ejemplo, Kashmiri et al., 2005, Methods, 36, 25-34). Los anticuerpos humanizados pueden comprender además opcionalmente uno o más residuos marco derivados de la especie no humana de la que se derivaron las CDR.

Tal y como se usa en la presente memoria, el término "molécula de anticuerpo humanizado" se refiere a una molécula de anticuerpo en la que la cadena pesada y/o ligera contiene una o más CDR (incluidas, si se desea, una o más CDR modificadas) de un anticuerpo donante (por ejemplo, un anticuerpo monoclonal murino) injertadas en un marco de región variable de cadena pesada y/o ligera de un anticuerpo aceptor (por ejemplo, un anticuerpo humano). Para una revisión, véase, Vaughan et al, Nature Biotechnology, 16, 535-539, 1998. En una realización, en lugar de transferir toda la CDR, solo uno o más de los residuos determinantes de la especificidad de una cualquiera de las CDR descritas en la presente memoria anteriormente se transfieren al marco del anticuerpo humano (véase, por ejemplo, Kashmiri et al., 2005, Methods, 36, 25-34). En una realización, solo los residuos determinantes de la especificidad de una o más de las CDR descritas en la presente memoria anteriormente se transfieren al marco del anticuerpo humano. En otra realización, solo los residuos determinantes de la especificidad de cada una de las CDR descritas en la presente memoria anteriormente se transfieren al marco del anticuerpo humano.

Cuando se injertan las CDR o los residuos determinantes de la especificidad, puede usarse cualquier secuencia marco de región variable aceptora apropiada teniendo en cuenta la clase/tipo del anticuerpo donante del que se derivan las CDR, incluidas las regiones marco de ratón, primate y ser humano. De manera adecuada, el anticuerpo humanizado según la presente invención tiene un dominio variable que comprende regiones marco aceptoras humanas, así como una o más de las CDR proporcionadas en la presente memoria.

Los ejemplos de marcos humanos que pueden usarse en la presente descripción son KOL, NEWM, REI, EU, TUR, TEI, LAY y POM (Kabat et al supra). Por ejemplo, KOL y NEWM se pueden utilizar para la cadena pesada, REI se puede utilizar para la cadena ligera y EU, LAY y POM se pueden utilizar tanto para la cadena pesada como para la cadena ligera. Alternativamente, pueden usarse secuencias de línea germinal humana; estas están disponibles en: http://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/vbase/list2.php.

En una molécula de anticuerpo humanizado de la presente descripción, las cadenas ligeras y pesadas del aceptor no necesitan derivar necesariamente del mismo anticuerpo y pueden, si se desea, comprender cadenas compuestas que tienen regiones marco derivadas de cadenas diferentes.

Las regiones marco no necesitan tener exactamente la misma secuencia que las del anticuerpo aceptor. Por ejemplo, los residuos inusuales se pueden cambiar por residuos que aparecen con más frecuencia para esa clase o tipo de cadena aceptora. Alternativamente, los residuos seleccionados en las regiones marco aceptoras se pueden cambiar para que correspondan al residuo que se encuentra en la misma posición en el anticuerpo donante (véase, Reichmann et al 1998, Nature, 332, 323-324). Dichos cambios deben mantenerse en el mínimo necesario para recuperar la afinidad del anticuerpo donante. Un protocolo para la selección de residuos en las regiones marco aceptoras que pueden necesitar cambiarse se establece en WO91/09967.

Los derivados de marcos pueden tener 1, 2, 3 o 4 aminoácidos reemplazados con un aminoácido alternativo, por ejemplo, con un residuo donante.

Los residuos donantes son residuos del anticuerpo donante, es decir, se adopta el anticuerpo del que se derivaron originalmente las CDR, en particular el residuo en una ubicación correspondiente de la secuencia donante. Los residuos donantes pueden reemplazarse por un residuo adecuado derivado de un marco receptor humano (residuos aceptores).

Los residuos en los dominios variables del anticuerpo se numeran convencionalmente de acuerdo con un sistema ideado por Kabat. et al. Este sistema se establece en Kabat et al., 1987, en Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Department of Health and Human Services, NIH, EE. UU. (de aquí en adelante "Kabat et al. (supra) "). Este sistema de numeración se utiliza en la presente memoria descriptiva, salvo que se indique lo contrario.

Las designaciones de residuos de Kabat no siempre se corresponden directamente con la numeración lineal de los residuos de aminoácidos. La secuencia de aminoácidos lineal real puede contener menos o más aminoácidos que en la numeración estricta de Kabat correspondiente a un acortamiento de, o inserción en, un componente estructural, ya sea una región marco o determinante de la complementariedad (CDR), de la estructura básica del dominio variable. La numeración correcta de residuos de Kabat se puede determinar para un anticuerpo dado mediante la alineación de residuos de homología en la secuencia del anticuerpo con una secuencia numerada de Kabat "estándar".

Las CDR del dominio variable de la cadena pesada están ubicadas en los residuos 31-35 (CDR-H1), residuos 50-65 (CDR-H2) y residuos 95-102 (CDR-H3) según el sistema de numeración de Kabat. Sin embargo, según Chothia (Chothia, C. y Lesk, A.M. J. Mol. Biol., 196, 901-917 (1987)), el bucle equivalente a CDR-H1 se extiende desde el residuo 26 al residuo 32. Por tanto, a menos que se indique lo contrario, 'CDR-H1', como se emplea en la presente memoria, pretende hacer referencia a los residuos 26 a 35, como se describe mediante una combinación del sistema de numeración de Kabat y la definición de bucle topológico de Chothia.

Las CDR del dominio variable de la cadena ligera están ubicadas en los residuos 24-34 (CDR-L1), residuos 50-56 (CDR-L2) y residuos 89-97 (CDR-L3) según el sistema de numeración de Kabat.

En un ejemplo, se proporciona un dominio de unión que comprende una región variable de cadena pesada (VH), específica para CD79 que comprende tres CDR, en donde la CDR H1 tiene la secuencia dada en la SEQ ID NO: 78, la CDR H2 tiene la secuencia dada en la SEQ ID. NO: 79, y la CDR H3 tiene la secuencia dada en la SEQ ID NO: 80.

En una realización, se proporciona un dominio de unión que comprende una región variable de cadena pesada (VH), específica para CD79 que comprende 3 CDR de cadena pesada SEQ ID NO: 88 para CDRH1, SEQ ID NO: 89 para CDRH2 y SEQ ID NO: 90 para CDRH3.

En una realización, se proporciona el dominio de unión que comprende una región variable de cadena ligera específica para CD79 que comprende 3 CDR de cadena ligera SEQ ID n O: 75 para CDRL1, SEQ ID NO: 76 para CDRL2 y SEQ ID NO: 77 para CDRL3.

En una realización, se proporciona un dominio de unión que comprende una región variable de cadena ligera específica para CD79 que comprende 3 CDR de cadena ligera SeQ ID NO: 85 para CDRL1, SEQ ID NO: 86 para CDRL2 y SEQ ID NO: 87 para CDRL3.

En un ejemplo, se proporciona un dominio de unión que comprende una región variable de cadena pesada (VH), específica para CD79 que comprende tres CDR, en donde la CDR H1 tiene la secuencia dada en la SEQ ID NO: 78, la CDR H2 tiene la secuencia dada en la SEQ iD. NO: 79, y la CDR H3 tiene la secuencia dada en la SEQ ID NO: 80 y una región variable de cadena ligera (VL) que comprende tres CDR, en donde la CDR L1 tiene la secuencia dada en la SEQ ID NO: 75, la CDR L2 tiene la secuencia dada en la SEQ iD NO: 76 y la CDR L3 tiene la secuencia dada en la SEQ ID NO: 77.

En un ejemplo, se proporciona un dominio de unión que comprende una región variable de cadena pesada (VH), específica para CD79 que comprende tres CDR, en donde la CDR H1 tiene la secuencia dada en la SEQ ID NO: 88, la CDR H2 tiene la secuencia dada en la SEQ iD NO: 89, y la CDR H3 tiene la secuencia dada en la SEQ ID NO: 90 y una región variable de cadena ligera (VL) que comprende tres CDR, en donde la CDR L1 tiene la secuencia dada en la SEQ ID NO: 85, la CDR L2 tiene la secuencia dada en la SEQ iD NO: 86 y la CDR L3 tiene la secuencia dada en la SEQ ID NO: 87.

En una realización, una molécula multiespecífica según la presente descripción comprende un dominio de unión específico para CD45 que comprende 3 CDR de cadena pesada seleccionadas del grupo que comprende las SEQ ID n O: 98, 99, 100, 108, 109, 110, 118, 119, 120, 128, 129 y 130. En una realización, una molécula multiespecífica según la presente descripción comprende un dominio de unión específico para CD45 que comprende 3 CDR de cadena ligera seleccionadas del grupo que comprende las SEQ ID NO: 95, 97, 97, 105, 106, 107, 115, 116, 117, 125, 126 y 127. En una realización, una molécula multiespecífica según la presente descripción comprende un dominio de unión específico para CD45 que comprende 3 CDR de cadena pesada seleccionadas del grupo que comprende las SEQ ID n O: 98, 99, 100, 108, 109, 110, 118, 119, 120, 128, 129, 130 y 3 CDR de cadena ligera seleccionadas del grupo que comprende las SEQ ID NO: 95, 97, 97, 105, 106, 107, 115, 116, 117, 125, 126 y 127.

En una realización, se proporciona un dominio de unión que comprende una región variable de cadena pesada (VH), específica para CD45 que comprende 3 CDR de cadena pesada SEQ ID NO: 98 para CDRH1, SEQ ID NO: 99 para CDRH2 y SEQ ID NO: 100 para CDRH3.

En una realización, se proporciona un dominio de unión que comprende una región variable de cadena pesada (VH), específica para CD45 que comprende 3 CDR de cadena pesada SeQ ID NO: 108 para CDRH1, SEQ ID NO: 109 para CDRH2 y SEQ ID NO: 110 para CDRH3.

En una realización, se proporciona un dominio de unión que comprende una región variable de cadena pesada (VH), específica para CD45 que comprende 3 CDR de cadena pesada SeQ ID NO: 118 para CDRH1, SEQ ID NO: 119 para CDRH2 y SEQ ID NO: 120 para CDRH3.

En una realización, se proporciona un dominio de unión que comprende una región variable de cadena pesada (VH), específica para CD45 que comprende 3 CDR de cadena pesada SeQ ID NO: 128 para CDRH1, SEQ ID NO: 129 para CDRH2 y SEQ ID NO: 130 para CDRH3.

En una realización, se proporciona un dominio de unión que comprende una región variable de cadena ligera específica para CD45 que comprende 3 CDR de cadena ligera SeQ ID NO: 95 para CDRL1, SEQ ID NO: 96 para CDRL2 y SEQ ID NO: 97 para CDRL3.

En una realización, se proporciona un dominio de unión que comprende una región variable de cadena ligera específica para CD45 que comprende 3 CDR de cadena ligera s Eq ID NO: 105 para CDRL1, SEQ ID NO: 106 para CDRL2 y SEQ ID NO: 107 para CDRL3.

En una realización, se proporciona un dominio de unión que comprende una región variable de cadena ligera específica para CD45 que comprende 3 CDR de cadena ligera s Eq ID NO: 115 para CDRL1, SEQ ID NO: 116 para CDRL2 y SEQ ID NO: 117 para CDRL3.

En una realización, se proporciona un dominio de unión que comprende una región variable de cadena ligera específica para CD45 que comprende 3 CDR de cadena ligera s Eq ID NO: 125 para CDRL1, SEQ ID NO: 126 para CDRL2 y SEQ ID NO: 127 para CDRL3.

En un ejemplo, se proporciona un dominio de unión específico para CD45 que comprende una región variable de cadena pesada (VH), que comprende tres CDR, en donde CDR H1 tiene la secuencia dada en la SEQ ID NO: 98, CDR H2 tiene la secuencia dada en la SEQ ID. NO: 99, y CDR H3 tiene la secuencia dada en la SEQ ID NO: 100 y una región variable de cadena ligera (VL) que comprende tres CDR, en donde la CDR L1 tiene la secuencia dada en la SEQ ID NO: 95, la CDR L2 tiene la secuencia dada en la SEQ ID NO: 96 y la CDR L3 tiene la secuencia dada en la SEQ ID NO: 97.

En un ejemplo, se proporciona un dominio de unión específico para CD45 que comprende una región variable de cadena pesada (VH), que comprende tres CDR, en donde la CDR H1 tiene la secuencia dada en la SEQ ID NO: 108, la CDR H2 tiene la secuencia dada en la SEQ ID NO: 109, y la CDR H3 tiene la secuencia dada en la SEQ ID NO: 110 y una región variable de cadena ligera (VL) que comprende tres CDR, en donde la CDR L1 tiene la secuencia dada en la SEQ ID NO: 105, la CDR L2 tiene la secuencia dada en la SEQ ID NO: 106 y la CDR L3 tiene la secuencia dada en la SEQ ID NO: 107.

En un ejemplo, se proporciona un dominio de unión específico para CD45 que comprende una región variable de cadena pesada (VH), que comprende tres CDR, en donde la CDR H1 tiene la secuencia dada en la SEQ ID NO: 118, la CDR H2 tiene la secuencia dada en la SEQ ID NO: 119, y la CDR H3 tiene la secuencia dada en la SEQ ID NO: 120 y una región variable de cadena ligera (VL) que comprende tres CDR, en donde la CDR L1 tiene la secuencia dada en la SEQ ID NO: 115, la CDR L2 tiene la secuencia dada en la SEQ ID NO: 116 y la CDR L3 tiene la secuencia dada en la SEQ ID NO: 117.

En un ejemplo, se proporciona un dominio de unión específico para CD45 que comprende una región variable de cadena pesada (VH), que comprende tres CDR, en donde la CDR H1 tiene la secuencia dada en la SEQ ID NO: 128, la CDR H2 tiene la secuencia dada en la SEQ ID. NO: 129, y la CDR H3 tiene la secuencia dada en la SEQ ID NO: 130 y una región variable de cadena ligera (VL) que comprende tres CDR, en donde la CDR L1 tiene la secuencia dada en la SEQ ID NO: 125, la CDR L2 tiene la secuencia dada en la SEQ ID NO: 126 y la CDR L3 tiene la secuencia dada en la SEQ ID NO: 127.

En un ejemplo, la presente invención proporciona una molécula multiespecífica que comprende un dominio de unión específico para el antígeno CD79 y un dominio de unión específico para el antígeno CD45 en donde estos pares de dominios de unión comprenden cada uno 6 CDR de un par de anticuerpos frente a CD79 y CD45, por ejemplo seleccionados de los siguientes pares de anticuerpos; 4447 y 4122, 4447 y 4129, 4447 y 4131,4447 y 4133, 4450 y 4122, 4450 y 4129, 4450 y 4131 y 4447 y 4133.

Las secuencias de estos anticuerpos frente a CD79 (anticuerpo 4447 y anticuerpo 4450), incluidas las secuencias VH, VL y CDR se proporcionan a continuación en la presente memoria. Las secuencias de estos anticuerpos frente a CD45 (anticuerpos 4122, 4129, 4131 y 4133) incluidas las secuencias VH, VL y CDR se proporcionan a continuación en la presente memoria y pueden combinarse como dominios de unión en moléculas de la presente invención.

En una realización, la descripción se extiende a una secuencia de anticuerpo descrita en la presente memoria.

En un ejemplo, se proporciona un dominio de unión específico para la albúmina que comprende una región variable de cadena pesada (VH), que comprende tres CDR, en donde la CDR H1 tiene la secuencia dada en la SEQ ID NO: 131, la CDR H2 tiene la secuencia dada en la SEQ ID. NO: 132, y la CDR H3 tiene la secuencia dada en la SEQ ID NO: 133 y una región variable de cadena ligera (VL) que comprende tres CDR, en donde la CDR L1 tiene la secuencia dada en la SEQ ID NO: 134, la CDR L2 tiene la secuencia dada en la SEQ ID NO: 135 y la CDR L3 tiene la secuencia dada en la SEQ ID NO: 136.

En un ejemplo, se proporciona un dominio de unión específico para la albúmina que comprende una región variable de cadena pesada (VH) que tiene la secuencia dada en la SEQ ID NO: 137 y una región variable de cadena ligera (VL) que tiene la secuencia dada en la SEQ ID NO: 139.

En un ejemplo, se proporciona un dominio de unión específico para la albúmina que comprende una región variable de cadena pesada (VH) que tiene la secuencia dada en la SEQ ID NO: 138 y una región variable de cadena ligera (VL) que tiene la secuencia dada en la SEQ ID NO: 140.

En un ejemplo, los dominios de unión están humanizados.

En un ejemplo, una o más CDR proporcionadas en la presente memoria pueden modificarse para eliminar residuos o sitios indeseables, tales como residuos de cisteína o sitios de isomerización de ácido aspártico (D) o sitios de desamidación de asparagina (N). En un ejemplo, un sitio de desamidación de asparagina puede eliminarse de una o más CDR mutando el residuo de asparagina (N) y/o un residuo vecino a cualquier otro aminoácido adecuado. En un ejemplo, un sitio de desamidación de asparagina tal como NG o NS puede mutarse, por ejemplo, en NA o NT.

En un ejemplo, un sitio de isomerización de ácido aspártico puede eliminarse de una o más CDR mutando el residuo de ácido aspártico (D) y/o un residuo vecino a cualquier otro aminoácido adecuado. En un ejemplo, un sitio de isomerización del ácido aspártico tal como DG o DS puede mutarse, por ejemplo, en EG, DA o DT.

Por ejemplo, uno o más residuos de cisteína en una cualquiera de las CDR se puede sustituir por otro aminoácido, tal como serina.

En un ejemplo, un sitio de N-glicosilación tal como NLS puede eliminarse mutando el residuo de asparagina (N) en cualquier otro aminoácido adecuado, por ejemplo, en SLS o QLS. En un ejemplo, un sitio de N-glicosilación tal como NLS puede eliminarse mutando el residuo de serina (S) en cualquier otro residuo con la excepción de treonina (T).

El experto en la técnica puede ensayar variantes de CDR o secuencias humanizadas en cualquier ensayo adecuado, tales como los descritos en la presente memoria, para confirmar que se mantiene la actividad.

La unión específica al antígeno se puede ensayar usando cualquier ensayo adecuado que incluye, por ejemplo, ELISA o métodos de resonancia de plasmón superficial como BIAcore donde se puede medir la unión al antígeno (CD45 y/o CD79). Dichos ensayos pueden usar CD45 o CD79 (a o b) natural o recombinante aislado o una proteína/polipéptido de fusión adecuado. En un ejemplo, la unión se mide usando CD45 recombinante (SEQ ID NO: 143 o los aminoácidos 23-1304 de la SEQ ID NO: 143) o CD79 tal como la secuencia proporcionada en la SEQ ID NO: 141 y la SEQ ID NO: 142 y los aminoácidos 33-226 de la SEQ ID NO: 141 y los aminoácidos 29-229 de la SEQ ID NO: 142) mediante, por ejemplo, resonancia de plasmón superficial, tal como BIAcore. Alternativamente, las proteínas se pueden expresar en una célula, tal como una célula HEK, y se puede medir la afinidad empleando una determinación de afinidad basada en citometría de flujo.

Las secuencias de anticuerpos proporcionadas por la presente invención se pueden usar para identificar anticuerpos adicionales y, por lo tanto, dominios de unión adecuados para uso en las moléculas multiespecíficas de la presente invención. Los anticuerpos que bloquean de forma cruzada la unión de una molécula de anticuerpo según la presente invención a CD79 en particular, una molécula de anticuerpo que comprende la secuencia de cadena pesada dada en la SEQ ID NO: 73 y la secuencia de cadena ligera dada en la SEQ ID NO: 71 o una molécula de anticuerpo que comprende la secuencia de cadena pesada dada en la SEQ ID NO: 83 y la secuencia de cadena ligera dada en la SEQ ID NO: 81 puede ser igualmente útil en la unión de CD79 y por lo tanto igualmente útil en las moléculas multiespecíficas de la presente invención. Por consiguiente, la presente invención también proporciona una molécula multiespecífica que comprende un dominio de unión específico para el antígeno CD45 y un dominio de unión específico para el antígeno CD79b en el que el dominio de unión para CD79b bloquea de forma cruzada la unión de una cualquiera de las moléculas de anticuerpo descritas anteriormente en la presente memoria a CD79 y/o está bloqueado de forma cruzada para que no se una a CD79 por uno cualquiera de esos anticuerpos. En una realización, dicho anticuerpo se une al mismo epítopo que un anticuerpo descrito anteriormente en la presente memoria.

De manera similar, los anticuerpos que bloquean de forma cruzada la unión de una molécula de anticuerpo según la presente invención a CD45, en particular, una molécula de anticuerpo que comprende la secuencia de cadena pesada dada en la SEQ ID NO: 93 y la secuencia de cadena ligera dada en la SEQ ID NO: 91 o una molécula de anticuerpo que comprende la secuencia de cadena pesada dada en la SEQ ID NO: 103 y la secuencia de cadena ligera dada en la SEQ ID NO: 101, o una molécula de anticuerpo que comprende la secuencia de cadena pesada dada en la SEQ ID NO: 113 y la secuencia de cadena ligera dada en la SEQ ID NO: 111, o una molécula de anticuerpo que comprende la secuencia de cadena pesada dada en la SEQ ID NO: 123 y la secuencia de cadena ligera dada en la SEQ ID NO: 121, o una molécula de anticuerpo que comprende la secuencia de cadena pesada dada en la SEQ ID NO: 133 y la secuencia de cadena ligera dada en la SEQ ID NO: 131 pueden ser igualmente útiles en la unión de CD45 y, por lo tanto, igualmente útiles en las moléculas multiespecíficas de la presente invención. Por consiguiente, la presente invención también proporciona una molécula multiespecífica que comprende un dominio de unión específico para el antígeno CD45 y un dominio de unión específico para el antígeno CD79 en el que el dominio de unión para CD45 bloquea de forma cruzada la unión de una cualquiera de las moléculas de anticuerpo descritas anteriormente en la presente memoria a CD45 y/o está bloqueado de forma cruzada para que no se una a CD45 por uno cualquiera de esos anticuerpos. En una realización, dicho anticuerpo se une al mismo epítopo que un anticuerpo descrito anteriormente en la presente memoria. En otra realización, el anticuerpo de bloqueo cruzado se une a un epítopo que limita y/o se solapa con el epítopo unido por un anticuerpo descrito anteriormente en la presente memoria.

En otra realización, el anticuerpo neutralizante de bloqueo cruzado se une a un epítopo que limita y/o se solapa con el epítopo unido por un anticuerpo descrito anteriormente en la presente memoria.

Los anticuerpos de bloqueo cruzado se pueden identificar usando cualquier método adecuado en la técnica, por ejemplo, usando ensayos ELISA de competición o BIAcore donde la unión del anticuerpo de bloqueo cruzado al antígeno (CD45 y/o CD79) previene la unión de un anticuerpo de la presente invención o viceversa. Dichos ensayos de bloqueo cruzado pueden usar CD45 o CD79 (a y/o b) naturales o recombinantes aislados o una proteína/polipéptido de fusión adecuados. En un ejemplo, la unión y el bloqueo cruzado se miden usando CD45 recombinante (SEQ ID NO: 143) o CD79. Alternativamente, o además, los anticuerpos según este aspecto de la invención pueden bloquearse de forma cruzada para que no se unan al antígeno (CD45 o CD79) mediante un dominio de unión descrito en la presente memoria, que comprende, por ejemplo, CDR derivadas de la secuencia variable de cadena pesada dada en y la secuencia de cadena ligera dada en las SeQ ID NO: 71 y 73, 81 y 83, 91 y 93, 101 y 103, 111 y 113, y 121 y 123. Por lo tanto, también se proporciona una molécula multiespecífica que comprende un dominio de unión específico para el antígeno CD45 y un dominio de unión específico para el antígeno CD79b en donde el dominio de unión para CD79b bloquea de forma cruzada la unión de una cualquiera de las moléculas de anticuerpo descritas anteriormente en la presente memoria a CD79b y/o se bloquea de manera cruzada para que no se una a CD79 por uno cualquiera de esos anticuerpos en más del 80 %, por ejemplo en más del 85 %, tal como en más del 90 %, en particular en más del 95 % y, opcionalmente, en donde el dominio de unión para CD45 bloquea de forma cruzada la unión de una cualquiera de las moléculas de anticuerpo descritas anteriormente en la presente memoria a CD45 y/o está bloqueado de forma cruzada para que no se una a CD45 por uno cualquiera de esos anticuerpos en más del 80 %, por ejemplo en más del 85 %, tal como en más del 90 %, en particular en más del 95 %.

En un aspecto, se proporciona una molécula de anticuerpo multiespecífico que comprende o consiste en:

a) una cadena polipeptídica de fórmula (I):

Vh-CHi-X-(Vi )p;

b) una cadena polipeptídica de fórmula (II):

Vl-Cl-Y-(V2)q;

en donde:

VH representa un dominio variable de cadena pesada;

Y representa un enlace o enlazador, por ejemplo, un enlazador de aminoácidos;

V1 representa un dab, scFv, dsscFv o dsFv;

V2 representa un dab, scFv, dsscFv o dsFv;

p es 0 o 1;

q es 0 o 1; y

En una realización, la molécula de anticuerpo multiespecífico comprende no más de un dominio de unión para CD45 y no más de un dominio de unión para CD79.

En una realización, q es 0 y p es 1.

En una realización, q es 1 y p es 1.

En una realización V1 es un dab y V2 es un dab y juntos forman un único dominio de unión de un par cooperativo de regiones variables, tal como un par VH/VL cognado, que están opcionalmente unidas por un enlace disulfuro.

En una realización, la V1 es específica para CD79, por ejemplo, CD79a o CD79b.

En una realización, la V2 es específica para CD79, por ejemplo, CD79a o CD79b.

En una realización, la V1 y V2 juntas (por ejemplo, como dominio de unión) son específicas para CD79, por ejemplo, CD79a o CD79b y Vh y Vl son específicas para CD45.

En una realización, la V1 es específica para CD45.

En una realización, la V2 es específica para CD45.

En una realización, la V1 y V2 juntas (por ejemplo, como un dominio de unión) son específicas para CD45 y Vh y Vl son específicas de CD79.

En una realización, la V1 es específica para CD45, V2 es específica para la albúmina y Vh y Vl son específicas para CD79. En una realización, la V1 es específica para la albúmina, V2 es específica para CD45 y Vh y Vl son específicas para CD79. En una realización, la V1 es específica para CD79, V2 es específica para la albúmina y Vh y Vl son específicas para CD45. En una realización, la V1 es específica para la albúmina, V2 es específica para CD79 y Vh y Vl son específicas para CD45. En una realización, la V1 es un dsscFv específico para CD45, V2 es un dsscFv específico para la albúmina y Vh y Vl son específicos para CD79.

En una realización, la V1 es un dsscFv específico para la albúmina, V2 es un dscFv específico para CD45 y Vh y Vl son específicas para CD79.

En una realización, la V1 es un dsscFv específico para CD79, V2 es un dsscFv específico para la albúmina y Vh y Vl son específicas para CD45.

En una realización, la V1 es un dsscFv específico para la albúmina, V2 es un dsscFv específico para CD79 y Vh y Vl son específicas para CD45.

V1, V2, VH y VL en las construcciones anteriores pueden representar cada uno un dominio de unión e incorporar cualquiera de las secuencias proporcionadas en la presente memoria.

X e Y representan cualquier enlazador adecuado, por ejemplo, X e Y pueden ser SGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 17). En una realización, cuando V1 y/o V2 son un dab, dsFv o dsscFv, el enlace disulfuro entre los dominios variables Vh y Vl de V1 y/o V2 se forma entre las posiciones Vh44 y Vl100.

La presente descripción también se extiende a nuevas secuencias de polipéptidos descritas en la presente memoria y secuencias al menos un 80 % similares o idénticas a las mismas, por ejemplo un 85 % o más, tal como un 90 % o más, en particular un 95 % o más de similitud o identidad.

"Identidad", tal y como se usa en la presente memoria, indica que, en cualquier posición particular en las secuencias alineadas, el residuo de aminoácido es idéntico entre las secuencias. "Similitud", tal y como se usa en la presente memoria, indica que, en cualquier posición particular de las secuencias alineadas, el residuo de aminoácido es de un tipo similar entre las secuencias. Por ejemplo, la leucina puede sustituirse por isoleucina o valina. Otros aminoácidos que a menudo pueden sustituirse entre sí incluyen:

- fenilalanina, tirosina y triptófano (aminoácidos que tienen cadenas laterales aromáticas);

- lisina, arginina e histidina (aminoácidos que tienen cadenas laterales básicas);

- aspartato y glutamato (aminoácidos que tienen cadenas laterales ácidas);

- asparagina y glutamina (aminoácidos que tienen cadenas laterales de amida); y

- cisteína y metionina (aminoácidos que tienen cadenas laterales que contienen azufre).

Los grados de identidad y similitud se pueden calcular fácilmente (Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., ed., Oxford University Press, Nueva York, 1988; Biocomputing. Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, Nueva York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Parte 1, Griffin, A. M., y Griffin, H. G., eds., Humana Press, Nueva Yersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987, Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. y Devereux, J., eds., M Stockton Press, Nueva York, 1991, el software BlAs T™ disponible en NCBI (Altschul, S. F. et al., 1990, J. Mol. Biol. 215:403-410; Gish, W. y States, D. J. 1993, Nature Genet. 3:266-272. Madden, T. L. et al., 1996, Meth. Enzymol. 266:131-141; Altschul, S. F. et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402; Zhang, J. y Madden, T. L. 1997, Genome Res. 7:649-656,).

En particular, en un aspecto, la presente invención proporciona los anticuerpos frente a CD45 y CD79 descritos en la presente memoria en cualquier formato de anticuerpo adecuado.

Por consiguiente, en un aspecto, la presente invención proporciona anticuerpos anti-CD45 o fragmentos de los mismos que contienen uno o más de los dominios de unión descritos anteriormente en la presente memoria que comprenden las CDR proporcionadas en la presente memoria y en las SEQ ID NO 95, 96, 97, 98, 99 y 100 (anticuerpo 4122 ) o 105, 106, 107, 108, 109 y 110 (anticuerpo 4129) o 115, 116, 117, 118, 119 y 120 (anticuerpo 4131) o 125, 126, 127, 128, 129 y 130 (anticuerpo 4133). También se proporcionan anticuerpos anti-CD79 o fragmentos de los mismos que contienen uno o más de los dominios de unión descritos anteriormente en la presente memoria que comprenden las CDR proporcionadas en la presente memoria y en las SEQ ID NO 75, 76, 77, 78, 79 y 80 (anticuerpo 4447) o SEQ ID NO. 85, 86, 87, 88, 89 y 90 (anticuerpo 4450).

Dichas CDR se pueden incorporar en cualquier marco de anticuerpo adecuado y en cualquier formato de anticuerpo adecuado. Dichos anticuerpos incluyen anticuerpos completos y fragmentos funcionalmente activos o derivados de los mismos que pueden ser anticuerpos monoclonales, humanizados, completamente humanos o quiméricos. Por consiguiente, dichos anticuerpos pueden comprender una molécula de anticuerpo completa que tiene cadenas ligeras y pesadas de longitud completa o un fragmento de las mismas y pueden ser Fab, Fab modificado, Fab', F(ab')2, Fv, anticuerpos de dominio único, scFv, anticuerpos bi, tri o tetravalentes, Bis-scFv, diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos y fragmentos de unión a epítopo de cualquiera de los anteriores (véase, por ejemplo, Holliger y Hudson, 2005, Nature Biotech. 23 (9): 1126-1136; Adair y Lawson, 2005, Drug Design Reviews - Online 2 (3), 209-217). Los métodos para crear y fabricar estos fragmentos de anticuerpos son bien conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Verma et al., 1998, Journal of Immunological Methods, 216, 165-181). Los anticuerpos multivalentes pueden comprender múltiples especificidades o pueden ser monoespecíficos (véase, por ejemplo, WO 92/22853 y WO05/113605). Se apreciará que este aspecto de la invención también se extiende a variantes de estos anticuerpos anti-CD45 y CD79 que incluyen versiones humanizadas y versiones modificadas, incluidas aquellas en las que se han mutado aminoácidos en las CDR para eliminar una o más isomerización, desamidación, sitio de glicosilación o residuo de cisteína como se ha descrito anteriormente en la presente memoria.

Enlazadores

La enseñanza en la presente memoria de enlazadores en un contexto se puede aplicar igualmente a enlazadores en diferentes contextos donde se emplea un enlazador, tal como en cualquier molécula multiespecífica de la presente invención.

En una realización, el enlazador empleado en una molécula de la descripción es un enlazador de aminoácidos de 50 residuos o menos de longitud, por ejemplo, seleccionado de una secuencia mostrada en la secuencia 5 a 70.

Tabla 1. Secuencias de enlazadores bisagra

Tabla 2. Secuencias de enlazadores flexibles

(S) es opcional en las secuencias 17 a 20.

Los ejemplos de enlazadores rígidos incluyen las secuencias peptídicas GAPAPAAPAPA (SEQ ID NO: 69), PPPP (SEQ ID NO: 70) y PPP.

Otros enlazadores se muestran en Tabla 3:

Moléculas efectoras

Si se desea, una molécula multiespecífica para uso en la presente invención se puede conjugar con una o más moléculas efectoras. Se apreciará que la molécula efectora puede comprender una única molécula efectora o dos o más de dichas moléculas unidas de modo que formen un único resto que pueda unirse a las moléculas multiespecíficas de la presente invención. Cuando se desee obtener un anticuerpo o una molécula multiespecífica según la presente descripción unida a una molécula efectora, esta se puede preparar mediante procedimientos químicos o de ADN recombinante estándar en los que el fragmento de anticuerpo se une directamente o mediante un agente de acoplamiento a la molécula efectora. Las técnicas para conjugar dichas moléculas efectoras con anticuerpos son bien conocidas en la técnica (véase, Hellstrom et al., Controlled Drug Delivery, 2a Ed., Robinson et al., eds., 1987, p. 623 53; Thorpe et al., 1982, Immunol. Rev. 62: 119-58 y Dubowchik et al., 1999, Pharmacology and Therapeutics, 83, 67 123). Los procedimientos químicos particulares incluyen, por ejemplo, los descritos en WO 93/06231, WO 92/22583, WO 89/00195, WO 89/01476 y w O 03/031581. Alternativamente, cuando la molécula efectora es una proteína o polipéptido, el enlace se puede lograr usando procedimientos de ADN recombinante, por ejemplo, como se describe en WO 86/01533 y EP0392745.

En una realización, las moléculas multiespecíficas de la presente descripción pueden comprender una molécula efectora.

El término molécula efectora tal y como se usa en la presente memoria incluye, por ejemplo, agentes antineoplásicos, fármacos, toxinas, proteínas biológicamente activas, por ejemplo enzimas, otros anticuerpos o fragmentos de anticuerpos, polímeros sintéticos o naturales, ácidos nucleicos y fragmentos de los mismos, p. ej., ADN, ARN y fragmentos de los mismos, radionúclidos, en particular radioyoduro, radioisótopos, metales quelados, nanopartículas y grupos informadores tales como compuestos fluorescentes o compuestos que pueden detectarse mediante espectroscopía RMN o ESR.

Los ejemplos de moléculas efectoras pueden incluir citotoxinas o agentes citotóxicos, incluido cualquier agente que sea perjudicial para (p.ej., mata) células. Los ejemplos incluyen combrestatinas, dolastatinas, epotilonas, estaurosporina, maitansinoides, espongistatinas, rizoxina, halicondrinas, roridinas, hemiasterlinas, taxol, citocalasina B, gramicidina D, bromuro de etidio, emetina, mitomicina, etopósido, tenopósido, vincristina, vinblastina, colchicina, doxorrubicina, daunorrubicina, dihidroxi antracin diona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1-deshidrotestosterona, glucocorticoides, procaína, tetracaína, lidocaína, propranolol y puromicina y análogos u homólogos de los mismos.

Las moléculas efectoras también incluyen antimetabolitos (p.ej., metotrexato, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina, 5-fluorouracil decarbazina), agentes alquilantes (p. ej., mecloretamina, tioepa clorambucilo, melfalán, carmustina (BSNU) y lomustina (CCNU), ciclotosfamida, busulfán, dibromomanitol, estreptozotocina, mitomicina C y cis-diclorodiamina platino (II) (DDP) cisplatino), antraciclinas (p. ej., daunorrubicina (antes daunomicina) y doxorrubicina), antibióticos (p. ej., dactinomicina (antes actinomicina), bleomicina, mitramicina, antramicina (AMC), caliqueamicinas o duocarmicinas) y agentes antimitóticos (p. ej., vincristina y vinblastina).

Otras moléculas efectoras pueden incluir radionúclidos quelados tales como 111ln y 90Y, Lu177, Bismuto213, Californio252, Iridio192 y Wolframio188/Renio188; o fármacos tales como alquilfosfocolinas, inhibidores de topoisomerasa I, taxoides y suramina.

Otras moléculas efectoras incluyen proteínas, péptidos y enzimas. Las enzimas de interés incluyen enzimas proteolíticas, hidrolasas, liasas, isomerasas, transferasas. Las proteínas, polipéptidos y péptidos de interés incluyen inmunoglobulinas, toxinas tales como abrina, ricina A, exotoxina de pseudomonas o toxina diftérica, una proteína tal como insulina, factor de necrosis tumoral, a-interferón, p-interferón, factor de crecimiento nervioso, factor de crecimiento derivado de plaquetas o activador del plasminógeno tisular, un agente trombótico o un agente antiangiogénico, p. ej. angiostatina o endostatina, o un modificador de la respuesta biológica tal como una linfocina, interleucina-1 (IL-1), interleucina-2 (IL-2), factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF), factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF), factor de crecimiento nervioso (NGF) u otro factor de crecimiento e inmunoglobulinas.

Otras moléculas efectoras pueden incluir sustancias detectables útiles, por ejemplo, en el diagnóstico. Los ejemplos de sustancias detectables incluyen varias enzimas, grupos prostéticos, materiales fluorescentes, materiales luminiscentes, materiales bioluminiscentes, núclidos radiactivos, metales emisores de positrones (para uso en tomografía por emisión de positrones) e iones metálicos paramagnéticos no radiactivos. Véase, generalmente la Patente de EE. UU. No. 4.741.900 para iones metálicos que pueden conjugarse con anticuerpos para su uso como diagnóstico. Las enzimas adecuadas incluyen peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina, beta-galactosidasa o acetilcolinesterasa; los grupos prostéticos adecuados incluyen estreptavidina, avidina y biotina; los materiales fluorescentes adecuados incluyen umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, diclorotriazinilamina, fluoresceína, cloruro de dansilo y ficoeritrina; los materiales luminiscentes adecuados incluyen luminol; los materiales bioluminiscentes adecuados incluyen luciferasa, luciferina y aequorina; y los núclidos radiactivos adecuados incluyen 125I, 131I, 111I y 99Tc.

En otro ejemplo, la molécula efectora puede aumentar la semivida del anticuerpo. in vivo, y/o reducir la inmunogenicidad del anticuerpo y/o potenciar la administración de un anticuerpo a través de una barrera epitelial al sistema inmune. Los ejemplos de moléculas efectoras adecuadas de este tipo incluyen polímeros, albúmina, proteínas de unión a albúmina o compuestos de unión a albúmina tales como los descritos en WO05/117984.

Cuando la molécula efectora es un polímero, puede ser, en general, un polímero sintético o natural, por ejemplo, un polímero de polialquileno, polialquenileno o polioxialquileno de cadena lineal o ramificada opcionalmente sustituido o un polisacárido ramificado o no ramificado, p. ej., un homo o heteropolisacárido.

Los sustituyentes opcionales específicos que pueden estar presentes en los polímeros sintéticos mencionados anteriormente incluyen uno o más grupos hidroxi, metilo o metoxi.

Los ejemplos específicos de polímeros sintéticos incluyen poli(etilenglicol) de cadena lineal o ramificada opcionalmente sustituido, poli(propilenglicol) poli(alcohol vinílico) o derivados de los mismos, especialmente poli(etilenglicol) opcionalmente sustituido tal como metoxipoli(etilenglicol) o derivados del mismo.

Ensayos funcionales y formatos de cribado

Típicamente, los dominios de unión adecuados para su uso en la presente invención pueden identificarse ensayando uno o más pares de dominios de unión en un ensayo funcional. Por ejemplo, una molécula multiespecífica que comprende un dominio de unión específico para el antígeno CD45 y un dominio de unión específico para el antígeno CD79a y/o CD79b puede ensayarse en uno o más ensayos funcionales. Un "ensayo funcional", tal y como se usa en la presente memoria, es un ensayo que puede usarse para determinar una o más propiedades o actividades deseadas de los complejos de proteínas, complejos de anticuerpos o la mezcla de anticuerpos sujetos a las condiciones del ensayo. Los ensayos funcionales adecuados pueden ser ensayos de unión, ensayos de apoptosis, ensayos de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC), ensayos de citotoxicidad dependiente del complemento (CDC), ensayos de inhibición del crecimiento o proliferación celular (efecto citostático), ensayos de muerte celular (efecto citotóxico), ensayos de señalización celular, ensayos de producción de citocinas, producción de anticuerpos y cambio de isotipo, y ensayos de diferenciación celular.

La eficacia de los anticuerpos multiespecíficos según la presente descripción se puede comparar con anticuerpos individuales o mezclas de anticuerpos (o fragmentos) en dichos modelos mediante métodos generalmente conocidos por un experto en la técnica.

Los ensayos funcionales pueden repetirse varias veces según sea necesario para mejorar la fiabilidad de los resultados. Pueden emplearse diversos ensayos estadísticos conocidos por el experto en la técnica para identificar resultados estadísticamente significativos y así identificar moléculas multiespecíficas con funciones biológicas.

Los ejemplos de ensayos funcionales adecuados se describen en los Ejemplos de la presente memoria e incluyen la medición de la capacidad de una molécula multiespecífica de la presente invención para inhibir la activación de células B después de la estimulación con anti-IgM, medida mediante la detección de la inhibición de marcadores de activación de células B tales como expresión de Akt fosforilado, expresión de P38 fosforilado, señalización de PLCy, expresión de CD40, expresión de CD71 y/o expresión de CD86. Cuando se establece un ensayo funcional para el cribado, el experto en la técnica puede establecer un umbral adecuado sobre el cual una actividad identificada se considera un "acierto". Cuando se utiliza más de un ensayo funcional, el umbral para cada ensayo puede establecerse en un nivel adecuado para establecer una tasa de aciertos manejable. En un ejemplo, la tasa de aciertos puede ser del 3-5 %. En un ejemplo, los criterios establecidos cuando se buscan pares de dominios de unión que inhiben la función de las células B pueden ser al menos un 30 % de inhibición de al menos dos lecturas de fosforilación en un ensayo de activación de células B.

En un ejemplo, una molécula multiespecífica de la presente invención tiene una CI50 de menos de 5 nM para la inhibición de la expresión de CD86 en células B estimuladas con anti-IgM.

En una realización, pueden emplearse ensayos in vivo, tales como modelos animales, que incluyen modelos de tumores de ratón, modelos de enfermedad autoinmune, modelos de roedores o primates infectados con virus o infectados con bacterias, para ensayar las moléculas de la presente descripción.

Un ejemplo de un formato adecuado para el cribado y descubrimiento de dominios de unión se describe a continuación en la presente memoria.

El cribado para identificar los dominios de unión para su uso en la presente invención puede emplear un complejo proteico biespecífico.

"Complejo proteico biespecífico", tal y como se usa en la presente memoria, se refiere a una molécula que comprende dos proteínas (A y B denominadas en la presente memoria componentes biespecíficos) que se retienen juntas mediante una unión heterodimérica. En una realización, una o ambas de las proteínas tienen un dominio de unión, por ejemplo, una o ambas de las proteínas son anticuerpos o fragmentos de los mismos.

Típicamente, el complejo proteico biespecífico tiene la fórmula A-X:Y-B en donde:

A-X es una primera proteína de fusión;

Y-B es una segunda proteína de fusión;

X:Y es una unión heterodimérica;

A comprende un primer dominio de unión;

B comprende un segundo dominio de unión;

X es un primer compañero de unión de un par de unión;

Y es un segundo compañero de unión de un par de unión; y

: es una interacción (tal como una interacción de unión) entre X e Y.

Las "proteínas de fusión" como se emplean en la presente memoria comprenden un componente proteico, por ejemplo, A o B fusionado con otra entidad, por ejemplo, un compañero de unión X o Y (según sea apropiado). En una realización, la proteína de fusión es una proteína de traducción expresada mediante técnicas recombinantes a partir de una construcción genética, por ejemplo, expresada en un huésped a partir de una construcción de ADN.

La función de la unión X:Y es retener las proteínas A y B próximas entre sí para que se pueda realizar la función sinérgica de A y B.

"Unión heterodimérica", tal y como se usa en la presente memoria, se refiere a una unión que comprende dos compañeros de unión diferentes X e Y que forman una interacción (tal como una unión) entre sí que tiene una afinidad global que es suficiente para retener los dos compañeros de unión juntos. En una realización, X y/o Y no son adecuados para formar homodímeros.

Unido heterodiméricamente y unión heterodimérica se usan indistintamente en la presente memoria.

En una realización, "inadecuado para formar homodímeros" como se emplea en la presente memoria se refiere a que la formación de los heterodímeros de X-Y son más preferibles, por ejemplo, estables, tal como termodinámicamente estables y/o físicamente estables (por ejemplo, evidenciado por ausencia de agregación), una vez formados.

En una realización, la interacción X-Y es más favorable que la interacción X-X o Y-Y. Esto reduce la formación de homodímeros X-X o Y-Y cuando se mezclan las proteínas de fusión A-X y B-Y. Esto también hace que la eliminación de los homodímeros sea relativamente simple, por ejemplo, una etapa de purificación, tal como la cromatografía en columna, proporciona proteínas de fusión sustancialmente puras y/o complejos proteicos biespecíficos según la presente descripción.

En una realización, se proporciona una etapa de purificación después de la expresión de la proteína de fusión. Así, en una realización, antes del mezclado in vitro, la o las proteínas de fusión se proporcionan en forma sustancialmente pura. La forma sustancialmente pura como se emplea en la presente memoria se refiere a cuando la proteína de fusión está en el intervalo del 85 a 100 %, por ejemplo 90, 91,92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 % de monómero.

En una realización, no se requiere purificación después de la formación del complejo proteico biespecífico.

En una realización, la relación de proteínas de fusión empleada en la etapa de mezclado in vitro del presente método es A-X a B-Y 0,8:1 a 3:1, tal como 1,5:1 o 2:1.

En una realización, la relación de proteínas de fusión empleada en la etapa de mezclado in vitro del presente método es de B-Y a A-X 0,8:1 a 3:1, tal como 1,5:1 o 2:1.

En una realización, la relación es 1:1.

En una realización, uno (o al menos uno) de los compañeros de unión es incapaz de formar un homodímero, por ejemplo, se muta una secuencia de aminoácidos del compañero de unión para eliminar o minimizar la formación de homodímeros.

En una realización, ambos compañeros de unión son incapaces de formar un homodímero, por ejemplo, uno de los compañeros de unión es un péptido y el otro compañero de unión es un Vhh específico para dicho péptido.

En una realización, un scFv empleado en las moléculas de la presente descripción es incapaz de formar un homodímero.

Incapaz de formar homodímeros como se emplea en la presente memoria, se refiere a una propensión baja o cero para formar homodímeros. Baja, como se emplea en la presente memoria, se refiere al 5 % o menos, tal como 4, 3, 2, 1,0,5 % o menos de agregado.

Las pequeñas cantidades de agregado en las proteínas de fusión o residuales en el complejo proteico biespecífico unido heterodiméricamente generalmente tienen un efecto mínimo sobre el método de la presente descripción. En una realización: es una interacción de unión, por ejemplo, basada en fuerzas de atracción tales como fuerzas de Van der Waals, tales como enlaces de hidrógeno e interacciones electrostáticas, por ejemplo, basadas en la especificidad del anticuerpo para un antígeno, tal como un péptido.

En una realización: es un enlace covalente formado a partir de una interacción química específica, como la química del clic.

En una realización: no es un enlace covalente.

"Formar el complejo", como se emplea en la presente memoria, se refiere a una interacción, que incluye interacciones de unión o una reacción química, que es suficientemente específica y fuerte cuando los componentes de la proteína de fusión A-X y B-Y se ponen en contacto en condiciones apropiadas para que el complejo se ensamble y las proteínas de fusión se retengan juntas.

"Retenidos juntos", como se emplea en la presente memoria, se refiere al mantenimiento de los componentes (las proteínas de fusión) en la proximidad uno de otro, de modo que después de unirse, el complejo se puede manipular como si fuera una molécula, y en muchos casos se comporta y actúa como una sola molécula. En una realización, la retención hace que el complejo sea adecuado para su uso en el método descrito en la presente memoria, es decir, adecuado para su uso en al menos un cribado funcional.

En una realización, la interacción de unión es reversible.

La especificidad cuando se relaciona con X e Y como se emplea en la presente memoria se refiere a cuando los compañeros de unión X e Y en la interacción solo se reconocen entre sí o tienen una afinidad significativamente mayor entre sí en comparación con los no compañeros, por ejemplo, al menos una afinidad 2, 3, 4 , 5, 6, 7, 8, 9, 10 veces mayor.

En una realización, la interacción de unión entre X e Y tiene una constante de disociación baja. Los ejemplos de una constante de disociación baja incluyen 1-9x10-2s-1 o menos, por ejemplo 1-9x10-3s-1, 1-9x10-4s-1, 1-9x10-5s-1, 1-9x 10-6s-1 o 1-9x10-7s-1. Las constantes de disociación particularmente adecuadas incluyen 1x10-4s-1 o menos, por ejemplo, 1x10-5s-1, 1x10-6s-1o 1x10-7s-1.

Sin desear estar ligado a ninguna teoría, se cree que la constante de disociación baja (también denominada velocidad de disociación) permite que las moléculas sean suficientemente estables para hacer que el complejo proteico biespecífico sea útil, en particular en ensayos de cribado funcionales.

En una realización, la afinidad de X e Y entre sí es 5 nM o más fuerte, por ejemplo 4 nM, 3 nM, 2 nM, 1 nM o más fuerte. En una realización, la afinidad de X e Y entre sí es de 900 pM o más fuerte, tal como 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200, 100 o 50 pM o más fuerte.

En otra realización, la afinidad de X e Y entre sí es de 10 pM o más fuerte, por ejemplo 9, 8, 7, 6 o 5 pM.

La afinidad es un valor calculado a partir de la tasa de asociación y disociación de una interacción. El término "afinidad" tal y como se usa en la presente memoria se refiere a la fuerza de la suma total de las interacciones no covalentes entre un único sitio de unión de una molécula (p. ej., un anticuerpo) y su compañero de unión (p. ej., un péptido). La afinidad de una molécula por su compañero de unión generalmente se puede representar mediante la constante de disociación en equilibrio (Kd). La afinidad se puede medir mediante métodos comunes conocidos en la técnica, incluidos los descritos en la presente memoria, tales como métodos de resonancia de plasmón superficial, en particular BIAcore.

En una realización, se ensayan múltiples complejos proteicos biespecíficos según la presente descripción en paralelo o esencialmente simultáneamente.

Simultáneamente, como se emplea en la presente memoria, se refiere a cuándo se analizan las muestras/moléculas/complejos en el mismo análisis, por ejemplo, en la misma "operación".

En una realización, simultáneamente se refiere a un análisis concomitante en el que el resultado de la señal se analiza por el instrumento esencialmente al mismo tiempo. Esta señal puede requerir deconvolución para interpretar los resultados obtenidos.

De manera ventajosa, el ensayo de múltiples complejos proteicos biespecíficos permite un cribado más eficaz de un gran número de complejos proteicos biespecíficos y la identificación de relaciones nuevas e interesantes. Las regiones variables claramente diferentes a los antígenos diana de interés CD45 y CD79 pueden dar acceso a matices sutiles en la función biológica.

En una realización, los múltiples complejos proteicos biespecíficos se ensayan usando un multiplex como se definió anteriormente y sometiéndolos a uno o más ensayos funcionales.

El término "función biológica" tal y como se usa en la presente memoria se refiere a una actividad que es natural para o el propósito de la entidad biológica que se está ensayando, por ejemplo, una actividad natural de una célula, proteína o similar. Idealmente, la presencia de la función se puede ensayar utilizando un ensayo funcional in vitro, que incluye ensayos que utilizan células de mamíferos vivas. La función natural tal como se emplea en la presente memoria incluye una función aberrante, tales como las funciones asociadas con los cánceres.

Un "comparador biológico" relevante como se emplea en la presente memoria se refiere a una entidad adecuada para evaluar la actividad, en el mismo ensayo que el empleado para el complejo proteico biespecífi

hay algún cambio o actividad o función novedosa. Los comparadores adecuados para AX:Y-B pueden incluir proteína purificada (incluidas las proteínas recombinantes) en forma natural o presentada en el mismo formato que el biespecífico, es decir, donde A y B son la misma entidad, tal como A-X:Y-A o B-X:Y-B. Alternativamente, la proteína de fusión A-X o B-Y en una forma que no está en complejo puede emplearse como comparador. Alternativamente, se pueden emplear múltiples comparadores de diferentes formatos (en particular, como se describe en la presente memoria). El experto en la técnica puede identificar e incluir un control/comparador adecuado basándose en el conocimiento general común o la información que se encuentra en la bibliografía.

El término "función sinérgica" tal y como se usa en la presente memoria se refiere a la actividad biológica que no se observa o es mayor que la observada cuando la primera y segunda proteínas de un complejo proteico biespecífico de la presente descripción no se emplean juntas, por ejemplo, la actividad que solo se observa en una forma biespecífica. Por tanto, "sinérgico" incluye una función biológica nueva.

La presente descripción proporciona una molécula con al menos especificidad para CD45 y CD79 con una función biológica nueva.

La función biológica nueva como se emplea en la presente memoria se refiere a una función que no es aparente o está ausente hasta que las dos o más entidades sinérgicas [proteína A y proteína B] se juntan (como una función biespecífica o de otro modo) o una función no identificada previamente.

Mayor, como se emplea en la presente memoria, se refiere a un aumento en la actividad que incluye un aumento desde cero, es decir, alguna actividad en el biespecífico donde el componente o los componentes biespecíficos individuales que no forman complejos no tienen actividad en el ensayo funcional relevante, también denominado en la presente memoria como actividad nueva o función biológica nueva. Mayor, como se emplea en la presente memoria, también incluye una función mayor que la aditiva en el biespecífico en un ensayo funcional relevante en comparación con los componentes biespecíficos individuales que no forman complejos o dominios de unión bivalentes, por ejemplo, un incremento del 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300 % o más en una actividad relevante.

En una realización, la función sinérgica nueva es una actividad inhibidora mayor.

En una realización, la molécula de anticuerpo multiespecífico de la presente invención tiene una actividad inhibidora mayor que la suma de la actividad de un dominio de unión bivalente a CD45 y un dominio de unión bivalente a CD79a proporcionada solo o en mezcla.

En una realización, al menos uno del primer compañero de unión, X, y el segundo compañero de unión, Y, del par de unión se seleccionan independientemente entre un péptido y una proteína; por ejemplo, el primer compañero de unión o el segundo compañero de unión es un péptido.

Los péptidos adecuados incluyen el grupo que comprende GCN4, Fos/Jun (los Fos humanos y murinos tienen un número Uniprot P01100 y P01101 respectivamente y los jun humanos y murinos tienen un número Uniprot P05412 y P05627 respectivamente), hemaglutinina (HA) de influenza humana, polihistidina (His), proteína verde fluorescente (GFP) y FLAG. También se contemplan otros péptidos como adecuados para su uso en la presente descripción y los péptidos particularmente adecuados son etiquetas de afinidad para la purificación de proteínas porque dichos péptidos tienen una tendencia a unirse con alta afinidad a sus respectivos compañeros de unión.

El término "péptido", tal y como se usa en la presente memoria, se refiere a un polímero corto de aminoácidos unidos por enlaces peptídicos, en donde el péptido contiene en el rango de 2 a 100 aminoácidos, por ejemplo, 5 a 99, tal como 6 a 98, 7 a 97. o 8 a 96. En una realización, un péptido empleado en la presente descripción es una secuencia de aminoácidos de 50 residuos de aminoácidos o menos, por ejemplo 40, 30, 10 o menos. Los péptidos usados en la presente descripción tienen una longitud suficiente como para adaptarse a su propósito, por ejemplo, si el péptido es un enlazador, debe ser lo suficientemente largo como para permitir que el fragmento que enlaza realice su función biológica; alternativamente, si el péptido es un compañero de unión, debe ser capaz de unirse específicamente a otra entidad, tal como un anticuerpo.

En una realización, el otro compañero de unión del par de unión (el primer o el segundo compañero de unión alternativo) es una proteína.

Proteína, como se emplea en la presente memoria, se refiere a una secuencia de aminoácidos de 100 aminoácidos o más. En una realización, una "proteína" como se emplea en la presente memoria se refiere a una secuencia de aminoácidos con una estructura secundaria o terciaria.

En una realización, la primera proteína, A, y/o la segunda proteína, B, del complejo proteico biespecífico es un anticuerpo o fragmento de anticuerpo. Dicho complejo proteico biespecífico puede denominarse complejo de anticuerpo biespecífico.

En una realización, cada anticuerpo o fragmento empleado en el complejo de anticuerpo biespecífico de la descripción comprende un sitio de unión.

El anticuerpo de longitud completa o el fragmento de anticuerpo empleado en las proteínas de fusión (A-X o B-Y) puede ser monoespecífico, multivalente o biespecífico.

Ventajosamente, el uso de dos anticuerpos biespecíficos o fragmentos de anticuerpos permite que las moléculas de la presente descripción, tales como el complejo de anticuerpo biespecífico descrito en la presente memoria, sean potencialmente específicas para hasta 4 antígenos diferentes (es decir, el complejo puede ser tetraespecífico). Esto permite investigar los efectos del tipo de avidez.

En una realización, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo empleado en las moléculas de la presente descripción o componentes de las mismas, tales como la primera proteína de fusión A-X, es un anticuerpo monoespecífico o fragmento de anticuerpo, por ejemplo, un Fab, Fab', scFv o similar, y en particular es específico para CD45.

En una realización, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo empleado en las moléculas de la presente descripción o componentes de las mismas, tales como la segunda proteína de fusión B-Y es un anticuerpo monoespecífico o fragmento de anticuerpo, por ejemplo, un Fab, Fab', scFv o similar, y en particular es específico para CD79a y/o CD79b.

En una realización, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo empleado en las moléculas de la presente descripción o componentes de las mismas, tales como la segunda proteína de fusión B-Y es multivalente, es decir, tiene dos o más dominios de unión.

En una realización, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo empleado en las moléculas de la presente descripción o componentes de las mismas, tales como la primera proteína de fusión A-X, es monovalente y el anticuerpo o fragmento de anticuerpo empleado en las moléculas de la presente descripción o componentes de la misma, tales como la segunda proteína de fusión B-X es monovalente.

En una realización, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo empleado en las moléculas de la presente descripción o componentes de las mismas, tales como la primera proteína de fusión A-X, es monovalente y el anticuerpo o fragmento de anticuerpo empleado en las moléculas de la presente descripción o componentes de la misma, tales como la segunda proteína de fusión B-Y es multivalente.

En una realización, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo empleado en las moléculas de la presente descripción o componentes de las mismas, tales como la primera proteína de fusión A-X, es multivalente y el anticuerpo o fragmento de anticuerpo empleado en las moléculas de la presente descripción o componentes de la misma, tales como la segunda proteína de fusión B-Y es monovalente.

En una realización, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo empleado en las moléculas de la presente descripción o componentes de las mismas, tales como la primera proteína de fusión A-X, es multivalente y el anticuerpo o fragmento de anticuerpo empleado en las moléculas de la presente descripción o componentes de la misma, tales como la segunda proteína de fusión B-Y es multivalente.

En una realización, un primer anticuerpo, un segundo anticuerpo o tanto el primer como el segundo anticuerpo de las moléculas de la presente descripción o componentes de las mismas, tales como un complejo de anticuerpos biespecíficos, pueden tener un formato de IgG, por ejemplo, se puede proporcionar un anticuerpo un anti-CD45 y/o anti-CD79 en un formato de IgG.

En una realización, un fragmento de anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en: un fragmento de fragmento de antígeno (Fab), un fragmento variable de cadena única (scFv) y un anticuerpo de dominio único (sdAb), tal como un scFv, se emplea en la primera (A-X) o segunda (B-Y) proteína de fusión. De manera ventajosa, el pequeño tamaño de un scFv puede facilitar el plegado correcto de los complejos de anticuerpos biespecíficos.

En una realización, el primer (A), segundo (B) anticuerpo/fragmento o tanto el primer como el segundo anticuerpo/fragmento del complejo de anticuerpos biespecífico de la presente descripción pueden ser un Fab. En una realización, el primer, segundo anticuerpo/fragmento o tanto el primer como el segundo anticuerpo/fragmento del complejo de anticuerpo biespecífico de la presente descripción es/son un Vhh.

"Proteína de fusión" como se emplea en el contexto de un complejo biespecífico de la presente descripción se refiere a una proteína, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de anticuerpo unido a un compañero de unión.

Por conveniencia, los complejos proteicos biespecíficos de la presente descripción se denominan en la presente memoria A-X:Y-B. Sin embargo, esta nomenclatura no pretende limitar cómo se diseñan las proteínas de fusión A-X y B-Y porque nuestros experimentos indican que los compañeros de unión X e Y pueden revertirse, es decir, A-Y y B-X sin afectar negativamente al método. Por tanto, A y B y X e Y son etiquetas nominales a las que se hace referencia para ayudar a la explicación de la presente tecnología.

"Unido", como se emplea en la presente memoria, se refiere a conectado o unido directa o indirectamente a través de un enlazador, tal como un enlazador peptídico cuyos ejemplos se describen a continuación. Conectado directamente incluye fusionado conjuntamente (por ejemplo, un enlace peptídico) o conjugado químicamente.

"Compañero de unión", como se emplea en la presente memoria, se refiere a una parte componente de un par de unión.

En una realización, la afinidad de los compañeros de unión es alta, 5 nM o más fuerte, tal como 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300 pM o más fuerte.

"Par de unión", como se emplea en la presente memoria, se refiere a dos compañeros de unión que se unen específicamente entre sí. Los ejemplos de un par de unión incluyen un péptido y un anticuerpo o fragmento de unión específico del mismo, o una enzima y ligando, o una enzima y un inhibidor de esa enzima.

En una realización, el primer compañero de unión (X) se selecciona del grupo que comprende: un anticuerpo de longitud completa, un Fab, un Fab', un scFv, un péptido y un sdAb, en donde los ejemplos de un sdAb incluyen VH o VL o VHH.

En una realización, el segundo compañero (Y) se selecciona del grupo que comprende: un anticuerpo de longitud completa, un Fab, un Fab', un scFv, un péptido y un sdAb, en donde los ejemplos de un sdAb incluyen VH o VL o VhH.

En una realización, cuando A es un anticuerpo o un fragmento del mismo, el primer compañero de unión (X) se une al extremo C de la cadena pesada o ligera del primer anticuerpo o fragmento de anticuerpo, por ejemplo, el primer compañero de unión se une al extremo C de la cadena pesada del primer anticuerpo o fragmento de anticuerpo.

En otra realización, cuando B es un anticuerpo o fragmento del mismo, el segundo compañero de unión (Y) se une al extremo C de la cadena pesada o ligera del segundo anticuerpo o fragmento de anticuerpo, por ejemplo, el segundo compañero de unión se une al extremo C de la cadena pesada del segundo anticuerpo o fragmento de anticuerpo.

En una realización, X se une al extremo C de la cadena pesada del anticuerpo o fragmento (proteína A) e Y se une al extremo C del anticuerpo o fragmento (proteína B).

En una realización, X se une mediante un enlazador (tal como ASGGGG o ASGGGGSG) al extremo C de la cadena pesada del anticuerpo o fragmento (proteína A) e Y se une mediante un enlazador (tal como ASGGGG o ASGGGGSG) al extremo C del anticuerpo o fragmento (proteína B).

En una realización, el primer o el segundo compañero de unión (X o Y) es un péptido.

Los ejemplos de un par de unión adecuado pueden incluir GCN4 (SEQ ID NO: 1) o una variante del mismo y 52SR4 (SEQ ID NO: 3) o una variante del mismo, que es un scFv específico para GCN4.

En una realización, el primer compañero de unión (nominalmente X) es GCN4 (por ejemplo, como se muestra en la SEQ ID NO: 1) o una variante del mismo (por ejemplo, sin la etiqueta His) y el segundo compañero de unión (nominalmente Y) es un scFv específico para GCN4 (por ejemplo, como se muestra en la SEQ ID NO: 3) o una variante del mismo.

En una realización, el primer compañero de unión (nominalmente X) es un sFv específico para GCN4 (por ejemplo, como se muestra en la SEQ ID NO: 3) o una variante del mismo y el segundo compañero de unión (nominalmente Y) es GCN4 (por ejemplo, como mostrado en la SEQ ID NO: 1) o una variante del mismo.

Las variantes de GCN4 incluyen una secuencia de aminoácidos con al menos un 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 % 95 %, 96 %, 97 %, o 98 %, o 99 % de identidad con la SEQ ID NO : 1. Las variantes de Gc N4 también incluyen un aminoácido que tiene al menos un 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % con una secuencia codificada por una secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 2, o una secuencia de nucleótidos que hibrida con la SEQ ID NO: 2 en condiciones astringentes.

Un scFv adecuado específico para GCN4 es 52SR4 (SEQ ID NO: 3) o una variante del mismo. Las variantes de 52SR4 incluyen una secuencia de aminoácidos con al menos un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 % o 99 % de identidad con la SEQ ID NO: 3. Las variantes de 52SR4 también incluyen una secuencia de aminoácidos que tiene al menos al menos un 80 %, o 85 %, o 90 %, o 95 %, o 98 % o 99 % con una secuencia codificada por una secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 4, o una secuencia de nucleótidos que hibrida con la SEQ ID NO : 2 en condiciones astringentes.

Los presentes inventores han descubierto que el anticuerpo de cadena única 52SR4 y el péptido GCN4 son un par de unión adecuado para su uso en los complejos proteicos biespecíficos de la presente descripción.

Alternativamente, cualquier anticuerpo/fragmento y antígeno adecuado (tal como un péptido) se puede emplear como X e Y.

En una realización, el primer compañero de unión (X) y el segundo compañero de unión (Y) son una proteína.

En una realización, el primer compañero de unión (X) es una enzima o un fragmento activo de la misma y el segundo compañero de unión (Y) es un ligando o viceversa.

En una realización, el primer compañero de unión (X) es una enzima o un fragmento activo de la misma y el segundo compañero de unión (Y) es un inhibidor de esa enzima o viceversa.

"Fragmento activo", como se emplea en la presente memoria, se refiere a un fragmento de aminoácido, que es menor que la secuencia de aminoácidos completa para la entidad y retiene esencialmente la misma actividad biológica o una actividad biológica relevante, por ejemplo, una actividad superior al 50 %, tal como el 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 %.

En otra realización, el primer compañero de unión X es glutatión (GSH) y el segundo compañero de unión Y es glutatión-S-transferasa (GST) o viceversa.

En otra realización, X es Fos e Y es Jun o viceversa.

En otra realización, X es His e Y es anti-His o viceversa.

En otra realización, el par de unión es el péptido de unión a calmodulina e Y es calmodulina o viceversa.

En otra realización, X es una proteína de unión a maltosa e Y es una proteína de unión anti-maltosa o un fragmento de la misma o viceversa.

También se contemplan otras combinaciones de enzima-ligando para su uso en compañeros de unión. También son adecuadas las etiquetas de afinidad conocidas en la técnica para la purificación de proteínas porque tienen tendencia a unirse con alta afinidad a sus respectivos compañeros de unión.

Los grados de identidad y similitud se pueden calcular fácilmente (Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., ed., Oxford University Press, Nueva York, 1988; Biocomputing. Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, Nueva York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Parte 1, Griffin, A. M., y Griffin, H. G., eds., Humana Press, Nueva Yersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987, Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. y Devereux, J., eds., M Stockton Press, Nueva York, 1991, el software BLAST™ disponible en NCBI (Altschul, S. F. et al., 1990, J. Mol. Biol. 215:403-410; Gish, W. y States, D. J. 1993, Nature Genet. 3:266-272. Madden, T. L. et al., 1996, Meth. Enzymol. 266:131-141; Altschul, S. F. et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402; Zhang, J. y Madden, T. L. 1997, Genome Res. 7:649-656,).

En una realización, el primer o el segundo compañero de unión (X o Y) es una proteína o péptido.

En una realización, la primera y segunda proteínas de fusión comprenden uno o más enlazadores peptídicos. Los enlazadores pueden incorporarse en varias localizaciones en las proteínas de fusión. Por ejemplo, se puede introducir un enlazador entre un compañero de unión y la proteína unida al mismo.

En una realización, el enlazador es un enlazador peptídico.

El término "enlazador peptídico" tal y como se usa en la presente memoria se refiere a un péptido con secuencias de aminoácidos. El experto en la técnica conocerá una gama de enlazadores peptídicos adecuados.

En una realización, el enlazador peptídico puede ser de origen sintético, es decir, preparado mediante técnicas de química sintética.

En una realización, los compañeros de unión de los complejos proteicos biespecíficos se unen a sus respectivas proteínas mediante enlazadores peptídicos.

En una realización, las proteínas de fusión son una fusión de traducción, es decir, una proteína de fusión expresada en una célula huésped que comprende una construcción genética a partir de la cual se expresa la proteína de fusión. En una realización, la proteína de fusión se prepara conjugando A con X o B con Y opcionalmente mediante un enlazador peptídico.

En una realización, el enlazador peptídico tiene 50 aminoácidos de longitud o menos, por ejemplo, 20 aminoácidos o menos. Generalmente, será más eficaz expresar la proteína de fusión de forma recombinante y, por lo tanto, puede ser ventajoso un enlace peptídico directo o un enlazador peptídico que pueda ser expresado por una célula huésped. En un aspecto, se proporciona un método para producir un complejo proteico biespecífico de la presente descripción, que comprende las etapas de:

(a) producir una primera proteína de fusión (A-X), que comprende un dominio de unión específico para CD45 o CD79a y/o CD79b (A), unido a un primer compañero de unión (X) de un par de unión;

(b) producir una segunda proteína de fusión (B-Y), que comprende un dominio de unión específico para CD45 o CD79a y/o CD79b (B), unido a un segundo compañero unión (Y) de un par de unión;

en donde al menos la primera proteína de fusión o la segunda proteína de fusión comprende un dominio de unión específico para CD45 y la proteína de fusión restante comprende un dominio de unión específico para CD79a y/o CD79b, y

(c) mezclar la primera (A-X) y la segunda (B-Y) proteína de fusión juntas preparadas en la etapa a) y b).

En particular, el complejo proteico biespecífico unido heterodiméricamente se prepara mezclando A-X y B-Y in vitro. Por tanto, en una realización, el método comprende una etapa de mezclado in vitro que pone en contacto A-X y B-Y. Por tanto, generalmente las proteínas de fusión A-X y B-Y no se coexpresan en la misma célula. Esto es ventajoso porque permite, por ejemplo, que 100 proteínas de fusión A-X y 100 proteínas de fusión A-Y se expresen por separado y se purifiquen opcionalmente, y mediante el posterior mezclado de las 200 proteínas de fusión en las diversas permutaciones puede proporcionar 10.000 complejos proteicos biespecíficos unidos heterodiméricamente.

Por el contrario, los métodos de la técnica anterior requieren la coexpresión de biespecíficos y, por lo tanto, para 10.000 complejos, se requieren 10.000 transfecciones, expresiones y purificaciones.

Los compañeros de unión X e Y tienen afinidad entre sí y actúan como equivalentes biológicos de velcro® o una barra y un imán y mantienen unido el complejo. Ventajosamente, esto significa que las proteínas de fusión A-X e Y-B pueden ensamblarse fácilmente en un complejo proteico biespecífico simplemente mezclando las proteínas de fusión entre sí. Por lo tanto, el complejo proteico biespecífico de la presente descripción tiene una estructura modular que permite que dos proteínas diferentes se ensamblen fácilmente con el fin de producir grandes paneles de permutaciones de complejos proteicos biespecíficos con diferentes combinaciones de especificidades de antígeno, por ejemplo, en una forma semejante a una cuadrícula. Esto permite el cribado eficaz y sistemático de un gran número de complejos proteicos biespecíficos con el fin de detectar una función biológica aditiva, sinérgica o nueva.

Dado que X e Y son específicos entre sí, esto reduce significativamente la capacidad de formar homodímeros. X e Y se denominan colectivamente en la presente memoria como un par de unión o compañeros de unión. En una realización, X no tiene una alta afinidad por otras X. En una realización, Y no tiene una alta afinidad por otras Y. De manera ventajosa, cuando X e Y no forman homodímeros, esto evita la formación de complejos proteicos monoespecíficos no deseados, aumenta el rendimiento de los complejos proteicos biespecíficos deseados y elimina la necesidad de etapas de purificación onerosas para eliminar los complejos proteicos monoespecíficos.

Este rápido ensamblaje de complejos proteicos biespecíficos, el nivel de rendimiento y/o pureza no pueden obtenerse de manera eficiente mediante métodos de la técnica anterior, en particular los métodos de la técnica anterior generalmente requieren etapas de purificación exhaustivas.

Ventajosamente, los componentes X e Y permiten ensamblar rápida y fácilmente un multiplex que comprende complejos proteicos biespecíficos constituidos por diferentes permutaciones de proteínas de fusión.

En una realización, las proteínas A y B son anticuerpos o fragmentos de anticuerpo. Cuando el anticuerpo o los fragmentos de anticuerpo se mantienen juntos como un complejo a través de X e Y, esto forma un complejo de anticuerpo biespecífico.

El mezclado se efectúa generalmente en condiciones en las que X e Y pueden interaccionar. En una realización, las proteínas de fusión se incuban en medios de cultivo celular en condiciones de cultivo celular, por ejemplo, las proteínas de fusión se incuban durante 90 minutos en un ambiente de 37 °C/CO2 al 5 %.

En una realización, las proteínas de fusión de la presente descripción se mezclan en un entorno acuoso, por ejemplo, una proteína de fusión se puede unir a una superficie sólida como una perla o una placa y la otra proteína de fusión se puede introducir en la misma en una disolución/suspensión acuosa. La fase sólida permite eliminar fácilmente por lavado el exceso de componentes y reactivos. En una realización, ninguna de las fusiones está unida a una fase sólida y simplemente se mezclan en un líquido/disolución/medio.

Ventajosamente, el método de la presente descripción se puede emplear para preparar complejos formados entre pares heterogéneos (es decir, entre la primera proteína de fusión [A-X] y la segunda proteína de fusión [B-Y]) en donde las interacciones entre pares homogéneos (es decir, entre dos primeras proteínas de fusión [A-X] o dos segundas proteínas de fusión [B-Y]) se minimizan. Por tanto, el presente método permite preparar un gran número de complejos proteicos biespecíficos, con una contaminación mínima o nula con complejos homodiméricos. Este nivel de pureza y rendimiento no es posible utilizando los métodos de la técnica anterior.

En una realización, los complejos formados no requieren más etapas de purificación.

En una realización, los complejos formados requieren una etapa de purificación, por ejemplo, cromatografía en columna.

En una realización, el método comprende además al menos una etapa de purificación, por ejemplo, después de la expresión de una proteína de fusión según la presente descripción.

Un "ensayo funcional", tal y como se usa en la presente memoria, es un ensayo que puede usarse para determinar una o más propiedades o actividades deseadas de los complejos proteicos, complejos de anticuerpos o la mezcla de anticuerpos sujetos a las condiciones del ensayo. Los ensayos funcionales adecuados pueden ser ensayos de unión, ensayos de apoptosis, ensayos de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC), ensayos de citotoxicidad dependiente del complemento (CDC), ensayos de inhibición del crecimiento o proliferación celular (efecto citostático), ensayos de muerte celular (efecto citotóxico) , ensayos de señalización celular, ensayos de producción de citocinas, producción de anticuerpos y cambio de isotipo, y ensayos de diferenciación celular. En una realización se pueden emplear ensayos in vivo, tales como modelos animales, que incluyen modelos de tumores de ratón, modelos de enfermedad autoinmune, modelos de roedores o primates infectados con virus o infectados con bacterias, para ensayar las moléculas de la presente descripción.

En el contexto de los complejos de anticuerpos biespecíficos, la eficacia de los complejos de anticuerpos biespecíficos según la presente descripción se puede comparar con anticuerpos individuales o mezclas de anticuerpos (o fragmentos) en dichos modelos mediante métodos generalmente conocidos por un experto en la técnica.

Los ensayos funcionales pueden repetirse varias veces según sea necesario con o sin diferentes muestras de un complejo de anticuerpos biespecífico particular para mejorar la fiabilidad de los resultados. Pueden emplearse diversos ensayos estadísticos conocidos por el experto para identificar resultados estadísticamente significativos y así identificar complejos de anticuerpos biespecíficos con funciones biológicas, y en particular para identificar pares óptimos de regiones variables para su uso en la molécula multiespecífica de la presente invención.

Composiciones y usos médicos

En un aspecto, se proporciona una molécula según la presente descripción o un componente, tal como una proteína de fusión, un complejo proteico biespecífico unido heterodiméricamente, una composición que comprende una molécula de la invención, que incluye una proteína de fusión o dicho complejo proteico biespecífico, un multiplex, matriz, biblioteca como se define en la presente memoria.

En una realización, las moléculas de la presente descripción, por ejemplo, un anticuerpo descrito en la presente memoria, una molécula multiespecífica y/o complejos proteicos biespecíficos, son adecuados para aplicaciones terapéuticas y pueden proporcionar terapias novedosas para tratar enfermedades. Por tanto, en un aspecto adicional, se proporciona una molécula de la presente descripción, por ejemplo, un complejo proteico biespecífico como se ha descrito anteriormente, para su uso en terapia. Las moléculas de la presente descripción, incluidas las moléculas multiespecíficas y los complejos proteicos biespecíficos descritos en la presente memoria, son adecuadas para tratar una variedad de enfermedades, tal como el cáncer.

Las moléculas de la presente descripción, incluidas las moléculas multiespecíficas y los complejos proteicos biespecíficos descritos en la presente memoria, también son particularmente adecuadas para inhibir la función de las células B con el fin de controlar las reacciones inmunes y autoinmunes en diversas enfermedades autoinmunes. Por tanto, la presente descripción se extiende a un método para tratar una enfermedad en un paciente, que comprende la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva de una molécula de la presente descripción, por ejemplo, una molécula multiespecífica o un complejo proteico biespecífico para la presente descripción. En un aspecto, se proporciona una composición farmacéutica que comprende una o más moléculas de la presente descripción, por ejemplo, una molécula multiespecífica de la presente descripción.

Se pueden incluir varios componentes diferentes en la composición, incluidos vehículos, excipientes y/o diluyentes farmacéuticamente aceptables. La composición puede comprender, opcionalmente, otras moléculas capaces de alterar las características de la población de moléculas multiespecíficas de la invención de ese modo, por ejemplo, reduciendo, estabilizando, retardando, modulando y/o activando la función de los anticuerpos. La composición puede estar en forma sólida o líquida y puede estar, inter alia, en la forma de un polvo, un comprimido, una disolución o un aerosol. La presente invención también proporciona una composición farmacéutica o de diagnóstico que comprende una molécula de anticuerpo o una molécula multiespecífica de la presente invención en combinación con uno o más de un excipiente, diluyente o vehículo farmacéuticamente aceptable. Por consiguiente, se proporciona el uso de una molécula multiespecífica de la invención para su uso en el tratamiento y para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una afección o trastorno patológico.

Afecciones patológicas

La afección o trastorno patológico puede, por ejemplo, seleccionarse del grupo que consiste en infecciones (víricas, bacterianas, fúngicas y parasitarias), choque endotóxico asociado con la infección, artritis tal como la artritis reumatoide, asma tal como el asma grave, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), enfermedad inflamatoria pélvica, enfermedad de Alzheimer, enfermedad inflamatoria intestinal, enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, enfermedad de Peyronie, enfermedad celíaca, enfermedad de la vesícula biliar, enfermedad pilonidal, peritonitis, psoriasis, vasculitis, adherencias quirúrgicas, accidente cerebrovascular, diabetes tipo I, enfermedad de Lyme, meningoencefalitis, uveítis autoinmune, trastornos inflamatorios mediados por inmunidad del sistema nervioso central y periférico tales como esclerosis múltiple, lupus (tal como lupus eritematoso sistémico) y síndrome de Guillain-Barr, dermatitis atópica, hepatitis autoinmune, alveolitis fibrosante, enfermedad de Grave, nefropatía por IgA, púrpura trombocitopénica idiopática, enfermedad de Meniere, pénfigo, cirrosis biliar primaria, sarcoidosis, esclerodermia, granulomatosis de Wegener, otros trastornos autoinmunes, pancreatitis, traumatismo (cirugía), enfermedad de injerto contra huésped, rechazo de trasplante, enfermedad cardíaca, incluidas las enfermedades isquémicas tales como infarto de miocardio, así como aterosclerosis, coagulación intravascular, resorción ósea, osteoporosis, osteoartritis, periodontitis, hipoclorhidria y cáncer, incluyendo cáncer de mama, cáncer de pulmón, cáncer gástrico, cáncer de ovario, cáncer hepatocelular, cáncer de colon, cáncer de páncreas, cáncer de esófago, cáncer de cabeza y cuello, riñón y cáncer, en particular carcinoma de células renales, cáncer de próstata, cáncer de hígado, melanoma, sarcoma, mieloma, neuroblastoma, coriocarcinoma placentario, cáncer de cuello uterino y cáncer de tiroides, y las formas metastásicas de los mismos.

En una realización, el trastorno es cáncer, por ejemplo, leucemia, que incluye leucemia linfocítica, tal como leucemia linfoblástica aguda o leucemia linfocítica crónica; o leucemia mielógena, tal como leucemia mielógena aguda o leucemia mielógena crónica.

En una realización, la enfermedad autoinmune incluye: encefalomielitis diseminada aguda (adem), leucoencefalitis hemorrágica necrotizante aguda, enfermedad de Addison, insuficiencia suprarrenal, hipocortisolismo, alopecia areata, amiloidosis, espondilitis anquilosante, espondiloartritis, enfermedad de Strumpell-marie, nefritis anti-GBM/anti-TBM, síndrome antifosfolípido (aps), angioedema autoinmune, anemia aplásica autoinmune, disautonomía autoinmune, hepatitis autoinmune, hiperlipidemia autoinmune, inmunodeficiencia autoinmune, enfermedad autoinmune del oído interno (AIED), síndrome linfoproliferativo autoinmune (ALPS), síndrome de Canale-Smith, miocarditis autoinmune, ooforitis autoinmune, pancreatitis autoinmune (AIP), síndromes poliglandulares autoinmunes (tipos I, II y III), retinopatía autoinmune (RA), púrpura trombocitopénica autoinmune (ATP), enfermedad tiroidea autoinmune, urticaria autoinmune, neuropatías axonales/neuronales, enfermedad de Balo, enfermedad de Behcet, penfigoide ampolloso, miocardiopatía, enfermedad de Castleman, enfermedad celíaca, enfermedad de Chagas, polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica (CIDP), ostomielitis multifocal crónica recurrente (CRMO), síndrome de Churg-Strauss, penfigoide cicatricial/penfigoide benigno de la mucosa (CP), enfermedad de Crohn, enfermedad inflamatoria intestinal, colitis, enteritis, ileítis, Síndrome de Cogans, enfermedad por crioaglutininas, bloqueo cardíaco congénito, miocarditis de Coxsackie, enfermedad de la cresta, crioglobulinemia, neuropatías desmielinizantes, dermatitis herpetiforme, enfermedad de Duhring, dermatomiositis, diabetes, tipo I, lupus eritematoso discoide (DLE), síndrome de Dressler, endometriosis, epidermolisis ampollosa (EB) y EB adquirida (EBA), gastroenteritis eosinofílica, esofagitis, fascitis eosinofílica, síndrome de Schulman, eritema nudoso, encefalomielitis alérgica experimental, síndrome de Evans, alveolitis fibrosante, arteritis de células gigantes (arteritis temporal), miocarditis de células gigantes, glomerulonefritis (no proliferativa: glomeruloesclerosis focal y segmentaria y glomerulonefritis membranosa. proliferativa: nefropatía por IgA), síndrome de Goodpasture, granulomatosis con poliangeítis (GPA) (anteriormente llamada granulomatosis de Wegener), enfermedad de Graves, síndrome de Guillain-Barré, síndrome de Miller Fisher, neuropatía axonal motora aguda, neuropatía axonal sensorial motora aguda, neuropatía panautonómica aguda, encefalitis del tronco encefálico de Bickerstaff, encefalitis de Hashimoto, tiroiditis de Hashimoto, anemia hemolítica, púrpura de Henoch-Schonlein, herpes gestacional, hipogammaglobulinemia, fibrosis pulmonar idiopática, púrpura trombocitopénica idiopática (ITP), nefropatía por IgA (IGAN), síndrome de Berger, glomerulonefritis sinfaringítica, pénfigo por IgA, enfermedad esclerosante relacionada con IgG4, infertilidad inmunorregulada, miositis por cuerpos de inclusión, diabetes mellitus dependiente de insulina, cistitis intersticial, síndrome de Isaac, neuromiotonía, artritis juvenil, miositis juvenil, síndrome de Kawasaki, síndrome de Lambert-Eaton, vasculitis leucocitoclástica, liquen plano, liquen escleroso, conjuntivitis leñosa, dermatosis lineal IgA (LAD), penfigoide, lupus (LES), enfermedad de Lyme, enfermedad de Meniere, poliangeítis microscópica (MPA), enfermedad mixta del tejido conectivo (MCTD), gammaopatía monoclonal, úlcera de Mooren, enfermedad de Mucha-Habermann, esclerosis múltiple, miastenia grave, miositis, narcolepsia, neuromielitis óptica (de devic), neuromiotonía, síndrome de Isaac (adquirido, paraneoplásico, hereditario), neutropenia, penfigoide cicatricial ocular, neuritis óptica, ooforitis, síndrome opsoclono-mioclono, orquitis, reumatismo palindrómico, pandas (trastornos neuropsiquiátricos pediátricos autoinmunes asociados con estreptococo), síndrome multiorgánico autoinmune paraneoplásico (PAMS), degeneración cerebelosa paraneoplásica, pénfigo paraneoplásico (PNP), hemoglobinuria paroxística nocturna (PNH), síndrome de Parry Romberg, síndrome de Parsonnage-Turner, pars plana, (uveitis periférica), penfigoide gestacional (PG), pénfigo vulgar (PV), pénfigo foliáceo (PF), neuropatía periférica, encefalomielitis perivenosa, anemia perniciosa, síndrome de Poems, poliarteritis nodosa (PAN), polimialgia reumática, polimiositis, síndrome postinfarto de miocardio, síndrome pospericardiotomía, dermatitis por progesterona, cirrosis biliar primaria, síndrome de Hanot, colangitis esclerosante primaria (CEP), colangitis esclerosante, psoriasis, artritis psoriásica, pioderma gangrenoso, aplasia pura de glóbulos rojos, encefalitis de Rasmussen, encefalitis focal crónica (EFC), fenómeno de Raynauds, artritis reactiva, síndrome de Reiter, retinopatía asociada a la recoverina (RAR), distrofia simpática refleja, síndrome de Reiter, policondritis recidivante, síndrome de piernas inquietas, fibrosis retroperitoneal, fiebre reumática, artritis reumatoide, sarcoidosis, síndrome de Schmidt, escleritis, esclerodermia, esclerosis sistémica, síndrome de Sjogren, autoinmunidad espermática y testicular, síndrome de persona/hombre rígido, endocarditis bacteriana subaguda (SBE), síndrome de Susac, oftalmia simpática, arteritis de Takay arteritis temporal/arteritis de células gigantes, tromboangitis obliterante, enfermedad de Buerger, púrpura trombocitopénica (TTP), síndrome de Tolosa-Hunt, mielitis transversa, colitis ulcerosa, enfermedad del tejido conectivo indiferenciado (UCTD), uveítis, polimialgia reumática, enfermedad de Takayasu, arteritis temporal, enfermedad de Buerger, vasculitis cutánea, enfermedad de Kawasaki, poliarteritis nodosa, síndrome de Behget, síndrome de Churg-Strauss, vasculitis cutánea, púrpura de Henoch-Schonlein, poliangeítis microscópica, granulomatosis de Wegener, vasculitis de golfista, dermatosis vesiculoampollosa, vitíligo, granulomatosis de Wegener (denominada ahora granulomatosis con poliangeítis (GPA).

En una realización, la enfermedad autoinmune se selecciona del grupo que comprende o consiste en: vasculitis ANCA, nefropatía por IgA (de Berger), pénfigo vulgar/penfigoide ampolloso, PTI, cirrosis biliar primaria, tiroiditis autoinmune (enfermedad de Grave), enfermedad de Hashimoto, nefritis por lupus, glomerulonefritis membranosa (o nefropatía membranosa), APS, miastenia grave, neuromielitis óptica, de Sjogren primario, neutropenia autoinmune, pancreatitis autoinmune, dermatosmiositis, uveítis autoinmune, retinopatía autoinmune, enfermedad de Behget, IPF, esclerosis sistémica, fibrosis hepática, hepatitis autoinmune, colangitis esclerosante primaria, vitíligo, síndrome de Goodpasture, proteinosis alveolar pulmonar, urticaria autoinmune crónica, psoriasis, artritis reumatoide, artritis psoriásica, espodiloartritis axial, trasplante (incluida GvHD), asma, EPOC, arteritis de células gigantes, síndrome autoinmune refractario, síndrome de Evans (anemia hemolítica autoinmune), diabetes tipo I, sarcoidosis, polimiositis, colitis ulcerosa, enfermedad de Crohn, enfermedad celíaca, macroglobulinemia de Waldenstrom, glomeruloesclerosis focal y segmentaria, enfermedad de Lyme crónica (borreliosis de Lyme), liquen plano, síndrome de la persona rígida, miocardiopatía dilatada, ooforitis autoinmune (linfocítica), epidermolisis ampollosa adquirida, gastritis atrófica autoinmune, anemia perniciosa, dermatitis atópica, aterosclerosis, esclerosis múltiple, encefalitis de Rasmussen, síndrome de Guillain-Barré y neuromiotonía adquirida, accidente cerebrovascular.

En una realización, el trastorno es cáncer, por ejemplo, leucemia, por ejemplo, leucemia linfocítica, tal como leucemia linfoblástica aguda o leucemia linfocítica crónica; o leucemia mielógena, tal como leucemia mielógena aguda o leucemia mielógena crónica; o linfoma, tal como linfoma difuso de células B grandes o linfoma de Hodgkin o no Hodgkin.

La presente invención también proporciona una composición farmacéutica o de diagnóstico que comprende una molécula de la presente descripción, tal como una molécula multiespecífica descrita en la presente memoria en combinación con uno o más de un excipiente, diluyente o vehículo farmacéuticamente aceptable. Por consiguiente, se proporciona el uso de una molécula de la presente descripción, tal como una molécula multiespecífica como se describe en la presente memoria para su uso en el tratamiento y en la fabricación de un medicamento.

La composición se suministrará habitualmente como parte de una composición farmacéutica estéril que normalmente incluirá un vehículo farmacéuticamente aceptable. Una composición farmacéutica de la presente invención puede comprender adicionalmente un adyuvante farmacéuticamente aceptable.

La presente invención también proporciona un proceso para la preparación de una composición farmacéutica o de diagnóstico que comprende añadir y mezclar la molécula multiespecífica de la presente invención junto con uno o más de un excipiente, diluyente o vehículo farmacéuticamente aceptable.

El término "excipiente farmacéuticamente aceptable" tal y como se usa en la presente memoria se refiere a un vehículo, disolución o aditivo de formulación farmacéuticamente aceptable para mejorar las características deseadas de las composiciones de la presente descripción. Los excipientes son bien conocidos en la técnica e incluyen tampones (p. ej., tampón citrato, tampón fosfato, tampón acetato y tampón bicarbonato), aminoácidos, urea, alcoholes, ácido ascórbico, fosfolípidos, proteínas (p. ej., albúmina sérica), EDTA, cloruro sódico, liposomas, manitol, sorbitol y glicerol. Las disoluciones o suspensiones pueden encapsularse en liposomas o microesferas biodegradables. La formulación se proporcionará generalmente en una forma sustancialmente estéril empleando procesos de fabricación estériles.

Esto puede incluir la producción y esterilización por filtración de la disolución de disolvente tamponada utilizada para la formulación, suspensión aséptica del anticuerpo en la disolución de disolvente tamponada estéril y dispensación de la formulación en receptáculos estériles por métodos familiares para los expertos en la técnica.

El vehículo farmacéuticamente aceptable no debe inducir por sí mismo la producción de anticuerpos dañinos para el individuo que recibe la composición y no debe ser tóxico. Los vehículos adecuados pueden ser macromoléculas grandes, de metabolización lenta, tales como proteínas, polipéptidos, liposomas, polisacáridos, ácidos polilácticos, ácidos poliglicólicos, aminoácidos poliméricos, copolímeros de aminoácidos y partículas virales inactivas.

Pueden usarse sales farmacéuticamente aceptables, por ejemplo, sales de ácidos minerales, tales como hidrocloruros, hidrobromuros, fosfatos y sulfatos, o sales de ácidos orgánicos, tales como acetatos, propionatos, malonatos y benzoatos.

Los vehículos farmacéuticamente aceptables en las composiciones terapéuticas pueden contener adicionalmente líquidos tales como agua, disolución salina, glicerol y etanol. Dichos vehículos permiten que las composiciones farmacéuticas se formulen como comprimidos, píldoras, grageas, cápsulas, líquidos, geles, jarabes, suspensiones de sólidos y suspensiones, para su ingestión por parte del paciente.

Las moléculas de la descripción, tales como una molécula multiespecífica descrita en la presente memoria, pueden administrarse dispersadas en un disolvente, p. ej., en la forma de una disolución o una suspensión. Puede suspenderse en una disolución fisiológica apropiada, p. ej., disolución salina fisiológica, un disolvente farmacológicamente aceptable o una disolución tamponada. Las disoluciones tamponadas conocidas en la técnica pueden contener de 0,05 mg a 0,15 mg de edetato de disodio, de 8,0 mg a 9,0 mg de NaCl, de 0,15 mg a 0,25 mg de polisorbato, de 0,25 mg a 0,30 mg de ácido cítrico anhidro y de 0,45 mg a 0,55 mg de citrato de sodio por 1 ml. de agua para lograr un pH de aproximadamente 4,0 a 5,0. Como se ha mencionado anteriormente, se puede preparar una suspensión, por ejemplo, a partir de un anticuerpo liofilizado.

Una discusión detallada de los vehículos farmacéuticamente aceptables está disponible en Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Company, N.J. 1991).

El término "cantidad terapéuticamente efectiva", tal y como se usa en la presente memoria, se refiere a una cantidad de un agente terapéutico necesaria para tratar, mejorar o prevenir una enfermedad o afección diana, o para exhibir un efecto terapéutico o preventivo detectable. Para cualquier anticuerpo, la cantidad terapéuticamente efectiva puede estimarse inicialmente bien en ensayos de cultivo celular o en modelos animales, normalmente en roedores, conejos, perros, cerdos o primates. El modelo animal también se puede utilizar para determinar el rango de concentración y la ruta de administración apropiados. Dicha información puede usarse entonces para determinar dosis y rutas útiles para la administración en seres humanos.

La cantidad terapéuticamente efectiva precisa para un sujeto humano dependerá de la gravedad del estado de la enfermedad, la salud general del sujeto, la edad, el peso y el sexo del sujeto, la dieta, el tiempo y la frecuencia de la administración, la combinación o combinaciones de fármacos, sensibilidades de reacción y tolerancia/respuesta a la terapia. Esta cantidad puede determinarse mediante experimentación de rutina y está dentro del criterio del médico. Generalmente, una cantidad terapéuticamente efectiva será de 0,01 mg/kg a 50 mg/kg, por ejemplo, de 0,1 mg/kg a 20 mg/kg. Alternativamente, la dosis puede ser de 1 a 500 mg por día, tal como de 10 a 100, 200, 300 o 400 mg por día. Las composiciones farmacéuticas se pueden presentar convenientemente en formas de dosis unitarias que contienen una cantidad predeterminada de un agente activo de la invención.

Las composiciones pueden administrarse individualmente a un paciente o pueden administrarse en combinación (p. ej., simultáneamente, secuencialmente o separadamente) con otros agentes, fármacos u hormonas.

La dosis a la que se administra la molécula multiespecífica de la presente descripción depende de la naturaleza de la afección que se va a tratar, del grado de inflamación presente y de si la molécula de anticuerpo se está utilizando profilácticamente o para tratar una afección existente.

La frecuencia de la dosis dependerá de la semivida de la molécula multiespecífica y de la duración de su efecto. Si la molécula multiespecífica tiene una semivida corta (p. ej., de 2 a 10 horas), puede ser necesario administrar una o más dosis al día. Alternativamente, si la molécula multiespecífica tiene una semivida prolongada (p. ej., de 2 a 15 días), puede que solo sea necesario administrar una dosificación una vez al día, una vez a la semana o incluso una vez cada 1 o 2 meses.

En la presente descripción, el pH de la formulación final no es similar al valor del punto isoeléctrico de la molécula multiespecífica, ya que, si el pH de la formulación es 7, entonces puede ser apropiado un pI de 8-9 o superior. Sin desear estar ligado por la teoría, se cree que esto puede proporcionar finalmente una formulación final con estabilidad mejorada, por ejemplo, el anticuerpo o fragmento permanece en disolución.

Las composiciones farmacéuticas de esta invención pueden administrarse por cualquier número de rutas que incluyen, pero no se limitan a, las rutas oral, intravenosa, intramuscular, intraarterial, intramedular, intratecal, intraventricular, transdérmica, transcutánea (por ejemplo, véase WO98/20734), subcutánea, intraperitoneal, intranasal, enteral, tópica, sublingual, intravaginal o rectal. También se pueden usar hipopulverizaciones para administrar las composiciones farmacéuticas de la invención.

La administración directa de las composiciones se realizará generalmente mediante inyección, subcutánea, intraperitoneal, intravenosa o intramuscular, o administrada al espacio intersticial de un tejido. Las composiciones también se pueden administrar en un tejido específico para interés. El tratamiento de dosificación puede ser un programa de dosis única o un programa de dosis múltiples. Cuando el producto sea para inyección o infusión, puede tomar la forma de una suspensión, disolución o emulsión en un vehículo aceitoso o acuoso y puede contener agentes de formulación, tales como agentes de suspensión, conservantes, estabilizantes y/o dispersantes. Alternativamente, la molécula multiespecífica puede estar en forma seca, para su reconstitución antes de su uso con un líquido estéril apropiado. Si la composición se va a administrar por una ruta que usa el tracto gastrointestinal, será necesario que la composición contenga agentes que protejan al anticuerpo de la degradación pero que liberen el complejo proteico biespecífico una vez que haya sido absorbido por el tracto gastrointestinal.

Se puede proporcionar una formulación nebulizable según la presente descripción, por ejemplo, como unidades de dosis única (p. ej., recipientes o viales de plástico sellados) envasadas en sobres de papel de aluminio. Cada vial contiene una dosis unitaria en un volumen, p. ej., 2 ml, de tampón de disolución/disolvente.

El término "variante" tal y como se usa en la presente memoria se refiere a un péptido o proteína que contiene al menos una alteración en la secuencia de aminoácidos o la secuencia de nucleótidos en comparación con la secuencia de aminoácidos o nucleótidos del péptido o proteína de tipo salvaje correspondiente. Una variante puede comprender al menos un 80 %, o 85 %, o 90 %, o 95 %, o 98 % o 99 % de identidad de secuencia con el péptido o proteína de tipo salvaje correspondiente. Sin embargo, es posible que una variante comprenda menos del 80 % de identidad de secuencia, siempre que la variante muestre una función sustancialmente similar con respecto a su péptido o proteína de tipo salvaje correspondiente.

En una realización, la construcción de la presente descripción es al menos triespecífica. En esta situación, la especificidad adicional puede dirigirse a cualquier antígeno de interés, por ejemplo, antígenos para prolongar la semivida tales como albúmina o receptor neonatal de Fc (FcRn); antígenos para la función efectora, tales como activar o inhibir receptores de Fc o moléculas coestimuladoras; antígenos dirigidos a tejidos o células; o antígenos para ayudar a la transferencia de la barrera hematoencefálica (BBB), tales como el receptor de transferrina o LRP1.

La descripción también se extiende a composiciones, tales como composiciones farmacéuticas, que comprenden dichos formatos novedosos con la especificidad de antígeno particular.

En un aspecto adicional, la descripción incluye el uso de los formatos y las composiciones en el tratamiento.

La presente invención también proporciona un proceso para la preparación de una composición farmacéutica o de diagnóstico que comprende añadir y mezclar la molécula de anticuerpo de la presente invención junto con uno o más de un excipiente, diluyente o vehículo farmacéuticamente aceptable.

La molécula de anticuerpo puede ser el único ingrediente activo en la composición farmacéutica o de diagnóstico o puede ir acompañada de otros ingredientes activos que incluyen otros ingredientes de anticuerpos o ingredientes que no son de anticuerpos, tales como esteroides u otras moléculas de fármacos.

Las composiciones farmacéuticas comprenden de forma adecuada una cantidad terapéuticamente efectiva del anticuerpo de la invención. El término "cantidad terapéuticamente efectiva", tal y como se usa en la presente memoria, se refiere a una cantidad de un agente terapéutico necesaria para tratar, mejorar o prevenir una enfermedad o afección diana, o para exhibir un efecto terapéutico o preventivo detectable. Para cualquier anticuerpo, la cantidad terapéuticamente efectiva puede estimarse inicialmente bien en ensayos de cultivo celular o en modelos animales, normalmente en roedores, conejos, perros, cerdos o primates. El modelo animal también se puede utilizar para determinar el rango de concentración y la ruta de administración apropiados. Dicha información puede usarse entonces para determinar dosis y rutas útiles para la administración en seres humanos.

La cantidad terapéuticamente efectiva precisa para un sujeto humano dependerá de la gravedad del estado de la enfermedad, la salud general del sujeto, la edad, el peso y el sexo del sujeto, la dieta, el tiempo y la frecuencia de la administración, la combinación o combinaciones de fármacos, sensibilidades de reacción y tolerancia/respuesta a la terapia. Esta cantidad puede determinarse mediante experimentación de rutina y está dentro del criterio del médico. Generalmente, una cantidad terapéuticamente efectiva será de 0,01 mg/kg a 500 mg/kg, por ejemplo, de 0,1 mg/kg a 200 mg/kg, tal como 100 mg/kg.

Las composiciones farmacéuticas se pueden presentar convenientemente en formas de dosis unitarias que contienen una cantidad predeterminada de un agente activo de la invención por dosis.

Las composiciones pueden administrarse individualmente a un paciente o pueden administrarse en combinación (p.ej. simultáneamente, secuencialmente o separadamente) con otros agentes, fármacos u hormonas.

Agentes, como se emplean en la presente memoria, se refieren a una entidad que cuando se administra tiene un efecto fisiológico.

Fármaco, como se emplea en la presente memoria, se refiere a una entidad química que a una dosis terapéutica tiene un efecto fisiológico apropiado.

En una realización, los anticuerpos o fragmentos según la presente descripción se emplean con una terapia inmunosupresora, tal como un esteroide, en particular prednisona.

En una realización, los anticuerpos o fragmentos según la presente descripción se emplean con rituximab u otras terapias de células B.

En una realización, los anticuerpos o fragmentos según la presente descripción se emplean con cualquier agente modulador de células B o células T o inmunomodulador. Los ejemplos incluyen metotrexato, microfeniolato y azatioprina.

La dosis a la que se administra la molécula de anticuerpo de la presente invención depende de la naturaleza de la afección que se va a tratar, del grado de inflamación presente y de si la molécula de anticuerpo se usa profilácticamente o para tratar una afección existente. La frecuencia de la dosis dependerá de la semivida de la molécula de anticuerpo y de la duración de su efecto. Si la molécula de anticuerpo tiene una semivida corta (p. ej., de 2 a 10 horas), puede ser necesario administrar una o más dosis al día. Alternativamente, si la molécula de anticuerpo tiene una semivida prolongada (p. ej., de 2 a 15 días) y/o un perfil farmacodinámico (PD) de larga duración, puede que solo sea necesario administrar una dosificación una vez al día, una vez a la semana o incluso una vez cada 1 o 2 meses.

En una realización, la dosis se administra quincenalmente, es decir, dos veces al mes.

En una realización, las dosis están espaciadas para permitir que las respuestas anti-fármaco (en este caso anti anticuerpo) desciendan antes de la administración de una dosis adicional.

Semivida, tal como se emplea en la presente memoria, pretende hacer referencia a la duración de la molécula en circulación, por ejemplo, en suero/plasma.

Farmacodinámica, tal como se emplea en la presente memoria, se refiere al perfil y, en particular, a la duración de la acción biológica de la molécula según la presente descripción.

Los vehículos farmacéuticamente aceptables en las composiciones terapéuticas pueden contener adicionalmente líquidos tales como agua, disolución salina, glicerol y etanol. Además, en dichas composiciones pueden estar presentes sustancias auxiliares, tales como agentes humectantes o emulsionantes o sustancias tamponantes del pH. Dichos vehículos permiten que las composiciones farmacéuticas se formulen como comprimidos, píldoras, grageas, cápsulas, líquidos, geles, jarabes, suspensiones de sólidos y suspensiones, para su ingestión por parte del paciente.

Las formas adecuadas para la administración incluyen formas adecuadas para la administración parenteral, p. ej., mediante inyección o infusión, por ejemplo, mediante inyección en bolo o infusión continua. Cuando el producto sea para inyección o infusión, puede tomar la forma de suspensión, disolución o emulsión en un vehículo aceitoso o acuoso y puede contener agentes de formulación, tales como agentes de suspensión, conservantes, estabilizantes y/o dispersantes. Alternativamente, la molécula de anticuerpo puede estar en forma seca, para su reconstitución antes de su uso con un líquido estéril apropiado.

Una vez formuladas, las composiciones de la invención se pueden administrar directamente al sujeto. Los sujetos a tratar pueden ser animales. Sin embargo, en una o más realizaciones, las composiciones están adaptadas para su administración a sujetos humanos.

De manera adecuada, en las formulaciones según la presente descripción, el pH de la formulación final no es similar al valor del punto isoeléctrico del anticuerpo o fragmento, por ejemplo, si el pI de la proteína está en el rango de 8-9 o superior, entonces puede ser apropiado un pH de 7 para la formulación. Sin desear estar ligado por la teoría, se cree que esto puede proporcionar finalmente una formulación final con estabilidad mejorada, por ejemplo, el anticuerpo o fragmento permanece en disolución.

En un ejemplo, la formulación farmacéutica a un pH en el rango de 4,0 a 7,0 comprende: 1 a 200 mg/mL de una molécula de anticuerpo según la presente descripción, 1 a 100 mM de un tampón, 0,001 a 1 % de un tensioactivo, a) 10 a 500 mM de un estabilizador, b) 10 a 500 mM de un estabilizador y 5 a 500 mM de un agente de tonicidad, o c) 5 a 500 mM de un agente de tonicidad.

Las composiciones farmacéuticas de esta invención se pueden administrar por cualquier número de rutas que incluyen las rutas oral, intravenosa, intramuscular, intraarterial, intramedular, intratecal, intraventricular, transdérmica, transcutánea (por ejemplo, véase WO98/20734), subcutánea, intraperitoneal, intranasal, enteral, tópica, sublingual, intravaginal o rectal. También se pueden usar hipopulverizaciones para administrar las composiciones farmacéuticas de la invención. Típicamente, las composiciones terapéuticas se pueden preparar como inyectables, ya sea como disoluciones o suspensiones líquidas. También se pueden preparar formas sólidas adecuadas para disolución en, o suspensión en, vehículos líquidos antes de la inyección.

La administración directa de las composiciones se realizará generalmente mediante inyección, subcutánea, intraperitoneal, intravenosa o intramuscular, o administrada al espacio intersticial de un tejido. Las composiciones también se pueden administrar en una lesión. El tratamiento de dosificación puede ser un programa de dosis única o un programa de dosis múltiples.

Se apreciará que el ingrediente activo en la composición será una molécula de anticuerpo. Como tal, será susceptible de degradación en el tracto gastrointestinal. Por tanto, si la composición se va a administrar por una ruta que usa el tracto gastrointestinal, será necesario que la composición contenga agentes que protejan al anticuerpo de la degradación pero que liberen el anticuerpo una vez que se haya absorbido desde el tracto gastrointestinal.

En una realización, la formulación se proporciona como una formulación para administraciones tópicas, incluida la inhalación.

Las preparaciones inhalables adecuadas incluyen polvos inhalables, aerosoles medidos que contienen gases propulsores o disoluciones inhalables libres de gases propulsores. Los polvos inhalables según la descripción, que contienen la sustancia activa, pueden consistir únicamente en las sustancias activas mencionadas anteriormente o en una mezcla de las sustancias activas mencionadas anteriormente con un excipiente fisiológicamente aceptable.

Estos polvos inhalables pueden incluir monosacáridos (p. ej., glucosa o arabinosa), disacáridos (p. ej., lactosa, sacarosa, maltosa), oligo y polisacáridos (p. ej., dextranos), polialcoholes (p. ej., sorbitol, manitol, xilitol), sales (p. ej., cloruro de sodio, carbonato de calcio) o mezclas de estos entre sí. Se utilizan adecuadamente mono o disacáridos, el uso de lactosa o glucosa, en particular, pero no exclusivamente, en la forma de sus hidratos.

Las partículas para la deposición en el pulmón requieren un tamaño de partícula inferior a 10 micrómetros, tal como 1-9 micrómetros, por ejemplo, de 1 a 5 pm. El tamaño de partícula del ingrediente activo (tal como el anticuerpo o fragmento) es de primordial importancia.

Los gases propulsores que pueden usarse para preparar los aerosoles inhalables son conocidos en la técnica. Los gases propulsores adecuados se seleccionan entre hidrocarburos tales como n-propano, n-butano o isobutano y halohidrocarburos tales como derivados clorados y/o fluorados de metano, etano, propano, butano, ciclopropano o ciclobutano. Los gases propulsores mencionados anteriormente se pueden utilizar solos o en mezclas de los mismos.

Los gases propulsores particularmente adecuados son los derivados de alcanos halogenados seleccionados entre TG 11, TG 12, TG 134a y TG227. De los hidrocarburos halogenados mencionados anteriormente, son particularmente adecuados TG134a (1,1,1,2-tetrafluoroetano) y TG227 (1,1,1,2,3,3,3-heptafluoropropano) y las mezclas de los mismos.

Los aerosoles inhalables que contienen gas propulsor también pueden contener otros ingredientes tales como codisolventes, estabilizadores, agentes tensioactivos (tensioactivos), antioxidantes, lubricantes y medios para ajustar el pH. Todos estos ingredientes son conocidos en la técnica.

Los aerosoles inhalables que contienen gas propulsor según la invención pueden contener hasta un 5 % en peso de sustancia activa. Los aerosoles según la invención contienen, por ejemplo, del 0,002 al 5 % en peso, 0,01 al 3 % en peso, 0,015 al 2 % en peso, 0,1 al 2 % en peso, 0,5 al 2 % en peso o 0,5 al 1 % en peso del ingrediente activo.

Alternativamente, las administraciones tópicas en el pulmón también pueden ser mediante la administración de una disolución líquida o formulación en suspensión, por ejemplo, empleando un dispositivo tal como un nebulizador, por ejemplo, un nebulizador conectado a un compresor (p. ej., el nebulizador Pari LC-Jet Plus(R) conectado a un compresor Pari Master(R) fabricado por Pari Respiratory Equipment, Inc., Richmond, Va.).

El anticuerpo o molécula multiespecífica de la invención puede administrarse dispersada en un disolvente, p. ej., en la forma de disolución o suspensión. Puede suspenderse en una disolución fisiológica apropiada, p. ej., disolución salina u otro disolvente farmacológicamente aceptable o una disolución tamponada. Las disoluciones tamponadas conocidas en la técnica pueden contener de 0,05 mg a 0,15 mg de edetato de disodio, de 8,0 mg a 9,0 mg de NaCl, de 0,15 mg a 0,25 mg de polisorbato, de 0,25 mg a 0,30 mg de ácido cítrico anhidro y de 0,45 mg a 0,55 mg de citrato de sodio por 1 mLl de agua para lograr un pH de aproximadamente 4,0 a 5,0. Una suspensión puede emplear, por ejemplo, un anticuerpo liofilizado.

Las suspensiones terapéuticas o formulaciones en disolución también pueden contener uno o más excipientes. Los excipientes son bien conocidos en la técnica e incluyen tampones (p. ej., tampón citrato, tampón fosfato, tampón acetato y tampón bicarbonato), aminoácidos, urea, alcoholes, ácido ascórbico, fosfolípidos, proteínas (p. ej., albúmina sérica), EDTA, cloruro sódico, liposomas, manitol, sorbitol y glicerol. Las disoluciones o suspensiones pueden encapsularse en liposomas o microesferas biodegradables. La formulación se proporcionará generalmente en una forma sustancialmente estéril empleando procesos de fabricación estériles.

Esto puede incluir la producción y esterilización por filtración del disolvente/disolución tamponado usado para la formulación, suspensión aséptica del anticuerpo en la disolución solvente tamponada estéril y dispensación de la formulación en receptáculos estériles por métodos familiares para los expertos en la técnica.

La formulación nebulizable según la presente descripción se puede proporcionar, por ejemplo, como unidades de dosis única (p. ej., envases o viales de plástico sellados) envasados en sobres de papel de aluminio. Cada vial contiene una dosis unitaria en un volumen, p. ej., de 2 ml, de disolvente/tampón de disolución.

Los anticuerpos descritos en la presente memoria pueden ser adecuados para su administración mediante nebulización.

También se prevé que el anticuerpo de la presente invención pueda administrarse mediante el uso de terapia génica. Con el fin de lograr esto, las secuencias de ADN que codifican las cadenas pesadas y ligeras de la molécula de anticuerpo bajo el control de componentes de ADN apropiados se introducen en un paciente de manera que las cadenas de anticuerpos se expresan a partir de las secuencias de ADN y se ensamblan in situ.

En una realización, la molécula de la presente descripción, tal como un complejo proteico biespecífico descrito en la presente memoria, se puede usar para alterar funcionalmente la actividad del antígeno o antígenos de interés. Por ejemplo, el complejo proteico biespecífico puede neutralizar, antagonizar o agonizar la actividad de dicho antígeno o antígenos, directa o indirectamente.

La presente descripción también se extiende a un kit, que comprende una molécula de la presente descripción o un componente de la misma. En una realización, el kit comprende:

a) una o más proteínas de fusión (A-X) que comprenden un primer anticuerpo o fragmento de anticuerpo (A) específico para CD45 o CD79a y/o CD79b unido a un primer compañero de unión de un par de unión (X); y

b) una o más proteínas de fusión (B-Y) que comprenden un segundo anticuerpo o fragmento de anticuerpo (B) específico para CD45 o CD79a y/o CD79b unido a un segundo compañero de unión del par de unión (Y), en donde este último es específico para el primer compañero de unión; por ejemplo, en donde el primer compañero de unión (X) es un péptido o polipéptido y el segundo compañero de unión (Y) es un anticuerpo o fragmento de anticuerpo específico para el mismo;

en donde Y el segundo compañero de unión es específico para el primer compañero de unión X y el segundo compañero de unión es, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de anticuerpo específico para el mismo; y la interacción específica (tal como una interacción de unión) de los dos compañeros de unión forma una unión de heterodímero que une físicamente las dos proteínas de fusión de a) y b) para formar un complejo proteico biespecífico; y

en donde al menos uno de A o B es específico para CD45 y el otro es específico para CD79a y/o CD79b, y

la o las proteínas de fusión están en forma de complejo o no complejo.

Ventajosamente, el kit puede comprender complejos proteicos biespecíficos de la presente descripción, o puede comprender proteínas de fusión que están en forma de complejo o no complejo. En el primer caso, los complejos proteicos biespecíficos están listos para usar "fuera de la caja", lo que proporciona conveniencia y facilidad de uso, mientras que, en el último caso, los complejos proteicos biespecíficos se pueden ensamblar según los requisitos del usuario mediante la combinación de diferentes proteínas de fusión.

En otra realización, el kit comprende además instrucciones de uso.

En otra realización más, el kit comprende además uno o más reactivos para realizar uno o más ensayos funcionales.

En una realización, las moléculas de la presente descripción que incluyen proteínas de fusión, complejos proteicos biespecíficos o composiciones que comprenden los mismos se proporcionan para su uso como reactivo de laboratorio.

Aspectos adicionales

En un aspecto adicional, se proporciona una secuencia de nucleótidos, por ejemplo, una secuencia de ADN que codifica una construcción como se describe en la presente memoria que incluye una molécula multiespecífica o una proteína de fusión como se ha definido anteriormente.

En una realización, se proporciona una secuencia de nucleótidos, por ejemplo, una secuencia de ADN que codifica una construcción como se describe en la presente memoria que incluye una molécula multiespecífica o un complejo proteico biespecífico o un anticuerpo según la presente descripción.

La descripción en la presente memoria también se extiende a un vector que comprende una secuencia de nucleótidos como se ha definido anteriormente.

El término "vector", tal y como se usa en la presente memoria, se refiere a una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al que se ha unido. Un ejemplo de un vector es un "plásmido", que es un bucle de ADN bicatenario circular en el que se pueden ligar segmentos de ADN adicionales. Otro tipo de vector es un vector viral, en el que se pueden ligar segmentos de ADN adicionales en el genoma viral. Ciertos vectores son capaces de replicación autónoma en una célula huésped en la que se introducen (p. ej., vectores bacterianos que tienen un origen de replicación bacteriano y vectores de mamíferos episomales). Otros vectores (p. ej., vectores de mamíferos no episomales) se pueden integrar en el genoma de una célula huésped, donde posteriormente se replican junto con el genoma del huésped. En la presente memoria descriptiva, los términos "plásmido" y "vector" pueden usarse indistintamente ya que un plásmido es la forma de vector más comúnmente usada.

Los expertos en la técnica conocen bien los métodos generales mediante los cuales se pueden construir los vectores, los métodos de transfección y los métodos de cultivo. A este respecto, se hace referencia a "Current Protocols in Molecular Biology", 1999, F. M. Ausubel (ed), Wiley Interscience, Nueva York y el Manual de Maniatis producido por Cold Spring Harbor Publishing.

El término "marcador seleccionable", tal y como se usa en la presente memoria, se refiere a una proteína cuya expresión permite identificar a las células que han sido transformadas o transfectadas con un vector que contiene el gen marcador. Se conoce en la técnica una amplia gama de marcadores de selección. Por ejemplo, típicamente el gen marcador seleccionable confiere resistencia a fármacos, tales como G418, higromicina o metotrexato, en una célula huésped en la que se ha introducido el vector. El marcador seleccionable también puede ser un marcador identificable visualmente tal como, por ejemplo, un marcador fluorescente. Los ejemplos de marcadores fluorescentes incluyen rodamina, FITC, TRITC, los Alexa Fluor y varios conjugados de los mismos.

También se proporciona una célula huésped que comprende uno o más vectores de clonación o expresión que comprenden una o más secuencias de ADN que codifican un anticuerpo de la presente descripción. Puede usarse cualquier sistema de célula huésped/vector adecuado para la expresión de las secuencias de ADN que codifican la molécula de anticuerpo de la presente descripción. Pueden usarse sistemas bacterianos, por ejemplo E. coli, y otros sistemas microbianos o también se pueden usar sistemas de expresión de células huésped eucariotas, por ejemplo, de mamíferos. Las células huésped de mamíferos adecuadas incluyen células CHO, mieloma o hibridoma.

La presente descripción también proporciona un proceso para la producción de una molécula según la presente descripción o un componente de la misma que comprende cultivar una célula huésped que contiene un vector de la presente descripción en condiciones adecuadas para conducir a la expresión de proteína a partir del ADN que codifica la molécula de la presente descripción y aislar la molécula.

Las moléculas de la presente descripción que incluyen los complejos proteicos biespecíficos descritos en la presente memoria pueden usarse en kits de diagnóstico/detección. Los kits pueden comprender, por ejemplo, complejos de anticuerpos biespecíficos que son específicos para dos antígenos, ambos presentes en el mismo tipo de célula, y en los que sólo se puede realizar un diagnóstico positivo si ambos antígenos se detectan con éxito. Utilizando una molécula de la presente descripción tal como un complejo de anticuerpos biespecíficos descrito en la presente memoria en lugar de dos anticuerpos separados o fragmentos de anticuerpos en una forma no en complejo, la especificidad de la detección se puede mejorar en gran medida. En una realización, las moléculas de la presente descripción, tales como los complejos de anticuerpos biespecíficos, se fijan sobre una superficie sólida. La superficie sólida puede ser, por ejemplo, un chip o una placa de ELISA.

Se proporciona además el uso de una molécula según la presente descripción, por ejemplo, un complejo proteico biespecífico descrito en la presente memoria para detectar en una muestra la presencia de un primer y un segundo péptido, por lo que dichas moléculas se usan como agentes de detección.

Las moléculas de la presente descripción, tales como los complejos de anticuerpos biespecíficos descritos en la presente memoria, pueden conjugarse, por ejemplo, con un marcador fluorescente que facilita la detección de los complejos de anticuerpo-antígeno unidos. Dichos complejos de anticuerpos biespecíficos pueden usarse para microscopía de inmunofluorescencia. Alternativamente, los complejos de anticuerpos biespecíficos también se pueden usar para transferencia Western o ELISA.

En una realización, se proporciona un proceso para purificar una molécula según la presente descripción o un componente de la misma.

En una realización, se proporciona un proceso para purificar una molécula según la presente descripción o un componente de la misma que comprende las etapas: realizar cromatografía de intercambio aniónico en modo sin unión de modo que las impurezas se retengan en la columna y el anticuerpo se mantenga en la fracción no unida. La etapa se puede realizar, por ejemplo, a un pH de aproximadamente 6-8.

El proceso puede comprender además una etapa de captura inicial que emplea cromatografía de intercambio catiónico, realizada, por ejemplo, a un pH de aproximadamente 4 a 5.

El proceso puede comprender además etapa(s) de cromatografía adicional(es) para asegurar que las impurezas relacionadas con el producto y el proceso se resuelvan apropiadamente de la corriente de producto.

El proceso de purificación también puede comprender una o más etapas de ultrafiltración, tal como una etapa de concentración y diafiltración.

"Forma purificada", como se usa anteriormente, pretende hacer referencia a al menos un 90 % de pureza, tal como 91,92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 % p/p o más pura.

En el contexto de esta memoria descriptiva, "que comprende" debe interpretarse como "que incluye".

Los aspectos de la descripción que comprenden ciertos elementos también pretenden extenderse a realizaciones alternativas "que consisten" o "que consisten esencialmente" en los elementos relevantes. Las realizaciones citadas positivamente pueden emplearse en la presente memoria como base para una exención de responsabilidad.

Los subtítulos de la presente memoria se emplean para ayudar a estructurar la memoria descriptiva y no están destinados a ser utilizados para construir el significado de los términos técnicos de la presente memoria.

Las secuencias de la descripción se proporcionan a continuación en la presente memoria.

Secuencias de GCN4(7P14P)

ASGGGRMKQLEPKVEELLPKNYHLENEVARLKKLVGERHHHHHH SEQ ID NO: 1 en la que los aminoácidos en negrita son opcionales GCTAGCGGAGGCGGAAGAATGAAACAACTTGAACCCAAGGTTGAAGAATTGCTTCCGAAAAA TTATCACTTGGAAAATGAGGTTGCCAGATTAAAGAAATTAGTTGGCGAACGCCATCACCATC ACCATCAC SEQ ID NO: 2

Secuencia de ds scFv de 52SR4 DAVVTQESALTSSPGETVTLTCRSSTGAVTTSNYASWVQEKPDHLFTGLIGGTNNRAPGV PARFSGSLIGDKAALTITGAQTEDEAIYFCVLWYSDHWVFGCGTKLTVLGGGGGSGGGGS GGGGSGGGGSDVQLQQSGPGLVAPSQSLSITCTVSGFLLTDYGVNWVRQSPGKCLEWLGV IWGDGITDYNSALKSRLSVTKDNSKSQVFLKMNSLQSGDSARYYCVTGLFDYWGQGTTLT VSSAAAHHHHHHEQKLISEEDL- SEQ ID NO: 3

GATGCGGTGGTGACCCAGGAAAGCGCGCTGACCAGCAGCCCGGGCGAAACCGTGACCCTGAC

CTGCCGCAGCAGCACCGGCGCGGTGACCACCAGCAACTATGCGAGCTGGGTGCAGGAAAAAC CGGATCATCTGTTTACCGGCCTGATTGGCGGCACCAACAACCGCGCGCCGGGCGTGCCGGCG CGCTTTAGCGGCAGCCTGATTGGCGATAAAGCGGCGCTGACCATTACCGGCGCGCAGACCGA AGATGAAGCGATTTATTTTTGCGTGCTGTGGTATAGCGACCATTGGGTGTTTGGCTGCGGCA CCAAACTGACCGTGCTGGGTGGAGGCGGTGGCTCAGGCGGAGGTGGCTCAGGCGGTGGCGGG TCTGGCGGCGGCGGCAGCGATGTGCAGCTGCAGCAGAGCGGCCCGGGCCTGGTGGCGCCGAG CCAGAGCCTGAGCATTACCTGCACCGTGAGCGGCTTTCTCCTGACCGATTATGGCGTGAACT GGGTGCGCCAGAGCCCGGGCAAATGCCTGGAATGGCTGGGCGTGATTTGGGGCGATGGCATT ACCGATTATAACAGCGCGCTGAAAAGCCGCCTGAGCGTGACCAAAGATAACAGCAAAAGCCA GGTGTTTCTGAAAATGAACAGCCTGCAGAGCGGCGATAGCGCGCGCTATTATTGCGTGACCG GCCTGTTTGATTATTGGGGCCAGGGCACCACCCTGACCGTGAGCAGCGCGGCCGCCCATCAC CATCACCATCACGAACAGAAACT GAT TAGCGAAGAAGATC TGTAATAG SEQ ID NO: 4

Anticuerpos frente a CD79b

Ab 4447

Región VL de Ab 4447 de conejo SEQ ID NO: 71

AQVLTQTPSP VSAPVGGTVT INCQASQSVV SGNYLAWLQQ KPGQPPKQLI HSASTLASGV SSRFSGSGS G TQFTLTISGV QCEDAATYYC LGEFSCSSHD CNAFGGGTEV VVK

Región VL de Ab 4447 de conejo SEQ ID NO: 72

gcccaagtgc tgacccagac tccgtcccct gtgtctgcac ctgtgggagg cacagtcacc

atcaattgcc aggccagtca gagtgttgtt agtggcaatt acctagcctg gcttcagcag

aaaccagggc agcctcccaa gcaactgatc cattctgcat ccactctggc atctggggtc

tcatcgcggt tcagcggcag tggatctggg acacaattca ctctcaccat cagcggcgtg

cagtgtgaag atgctgccac ttactactgt ctaggcgaat ttagttgtag tagtcatgat

tgtaatgctt tcggcggagg gaccgaggtg gtggtcaaa

Región VH de Ab 4447 de conejo SEQ ID NO: 73

QSLEESGGRL VTPGTPLTLT CTVSGFSLSN YAVSWVRQAP GEGLEWIGII YIETGTTWYA NWAKGRFTIS KTSTTVDLTI TSPSTEDTAT YFCAREPYEP YDDSNIYYGM DPWGPGTLVT VSS

Región VH de Ab 4447 de conejo SEQ ID NO: 74

cagtcgctgg aggagtccgg gggtcgcctg gtcacgcctg ggacacccct gacactcacc

tgcaccgtct ctggattctc cctcagtaac tatgcagtaa gctgggtccg ccaggctcca

ggggagggac tggaatggat cgggatcatt tatattgaaa ctggtaccac atggtacgcg

aactgggcga aaggccgatt caccatctcc aaaacctcga ccacggtgga tctgacaatc

accagtccgt caaccgagga cacggccacc tatttctgtg ccagagaacc ttatgaacct

tatgatgata gtaatattta ctacggcatg gacccctggg gcccaggcac cctcgtcacc gtctcgagt

La descripción también se extiende a un derivado de la SEQ ID NO: 77 en el que una o ambas cisteínas se reemplazan con otro aminoácido, por ejemplo, serina, en particular donde la primera cys se reemplaza por serina y la segunda cys permanece sin cambios, o la primera cisteína permanece sin cambios y la segunda cisteína se reemplaza por serina, o donde ambas cisteínas se reemplazan por serina.

Ab 4450

R eg ión V L de A b 4450 de co n e jo SEQ ID NO: 81

AIDMTQTPSP VSAAVGGTVT INCQSSQSIY NNNDLAWYQQ KPGQPPKLLI YEASKLASGV PSRFKGSGSG TQFTLTISGV QCDDAATYYC QGGGSGGDGI AFGGGTKVVV E

Región VL de Ab 4450 de conejo SEQ ID NO: 82

gccattgata tgacccagac tccatccccc gtgtctgcag ctgtgggagg cacagtcacc

atcaattgcc agtccagtca gagtatttat aataataatg acttagcctg gtatcagcag

aaaccagggc agcctcccaa gctcctgatc tacgaagcat ccaaactggc atctggggtc

ccatcgcggt tcaaaggcag tggatctggg acacagttca ctctcaccat cagtggcgtg

cagtgtgatg atgctgccac ttactactgt cagggcggtg gtagtggtgg tgatggcatt

gctttcggcg gagggaccaa ggtggtcgtc gaa

Región VH de Ab 4450 de conejo SEQ ID NO: 83

QSVEESGGRL VTPGAPLTLT CTVSGFSLNN YVMVWVRQAP GKGLEWIGII YVSGNAYYAS WAKGRFTISR TSTTVDLKVT SLTTEDTATY FCARDAGHSD VDVLDIWGPG TLVTVSS

Región VH de Ab 4450 de conejo SEQ ID NO: 84

cagtcggtgg aggagtccgg gggtcgcctg gtcacgcctg gggcacccct gacactcacc

tgcacagtct ctggattctc cctcaataac tatgtaatgg tctgggtccg ccaggctcca

gggaaggggc tggaatggat cggaatcatt tatgttagtg gtaatgcata ctacgcgagc

tgggcaaaag gccgattcac catctccaga acctcgacca cggtggatct gaaagtgacc

agtctgacaa ccgaggacac ggccacctat ttctgtgcca gagatgctgg tcatagtgat

gtcgatgttt tggatatttg gggcccgggc accctcgtca ccgtctcgag t

La descripción también se extiende a un derivado de la SEQ ID NO: 87 en el que al menos uno de los aminoácidos en el resto DG se reemplaza por otro aminoácido, por ejemplo, el resto está mutado a EG, DA o DS.

Anticuerpos frente a CD45

Ab 4122

Región VL de Ab 4122 de conejo SEQ ID NO: 91

DIVMTQTPAS VSEPVGGTVT IMCQASQSIS NWLAWYQQKP GQPPKLLIYQ ASKLASGVPS RFKGSGSGTE YTLTISDLEC ADAATYYCQS YYDSGSNVFF AFGGGTKVVV E

Región VL de Ab 4122 de conejo SEQ ID NO: 92

gacattgtga tgacccagac tccagcctccgtgtctgaac ctgtgggagg cacagtcacc

atcatgtgcc aggccagtca gagcattagc aattggttagcctggtatcaacagaaacca

gggcagcctc ccaagctcct gatctaccag gcatccaaactggcatctggggtcccatcg

cggttcaaag gcagtggatc tgggacagag tacactctcaccatcagcgacctggagtgt

gccgatgctg ccacttacta ctgtcaaagctattatgata gtggtagtaa tgtttttttt

gctttcggcg gagggaccaa ggtggtggtc gaa

Región VH de Ab 4122 de conejo SEQ ID NO: 93

LSLEESGGDL VKPGASLTLT CTASGFSFSA GYWICWVRQA PGKGLEWIAC TYAGRSGSTY YANWVNGRFT IPKTSSTTVT LQMTSLSGAD TASYFCARGN AGVAVGALWG PGTLVTVSS

R eg ión V H de A b 4122 de co n e jo SEQ ID NO: 94

ctgtcgttgg aggagtccgg gggagacctg gtcaagcctg gggcatccct gacactcacc

tgcacagcct ctggattctc cttcagtgcc ggctattgga tatgttgggt ccgccaggct

ccagggaagg ggctggagtg gatcgcatgc acttatgctg gtcgtagtgg tagcacttac

tacgcgaact gggtgaatgg ccgattcacc atccccaaaa cctcgtcgac cacggtgact

ctgcaaatga ccagtctgtc aggcgcggac acggccagct atttctgtgc gagaggtaat

gctggtgttg ctgttggtgc cttgtggggc ccaggcaccc tggtcaccgt ctcgagt

La descripción también se extiende a un derivado de la SEQ ID NO: 97 en el que al menos uno de los aminoácidos en el resto DS se reemplaza por otro aminoácido, por ejemplo, el resto está mutado a DA o DT

La descripción también se extiende a un derivado de la SEQ ID NO: 98 en el que la cisteína se reemplaza por otro aminoácido, por ejemplo, serina.

La descripción también se extiende a un derivado de la SEQ ID NO: 99 en el que la cisteína se reemplaza por otro aminoácido, por ejemplo, serina.

La descripción también se extiende a un derivado de la SEQ ID NO: 99 en el que al menos uno de los aminoácidos en el resto NG se reemplaza por otro aminoácido, por ejemplo, el resto está mutado a NA, NS o NT.

Ab 4129

Región VL de Ab 4129 de conejo SEQ ID NO: 101

DIVMTQTPAS VEAAVGGTVT INCQASQSIS SWLSWYQQKP GQPPKLLIYG ASNLASGVPS RFSGSGSGTQ FSLTISDLEC ADAATYYCQS YYDSGSSVFF NFGGGTKVVV K

Región VL de Ab 4129 de conejo SEQ ID NO: 102

gacattgtga tgacccagac tccagcctcc gtggaggcag ctgtgggagg cacagtcacc

atcaattgcc aagccagtca gagcattagc agttggttat cctggtatca gcagaaacca

gggcagcctc ccaagctcct gatctatggt gcatccaatc tggcatctgg ggtcccatca

cggttcagcg gcagtggatc tgggacacag ttcagtctca ccatcagcga cctggagtgt

gccgatgctg ccacttacta ctgtcaaagc tattatgata gtggtagtag tgtttttttt

aatttcggcg gagggaccaa ggtggtcgtc aaa

Región VH de Ab 4129 de conejo SEQ ID NO: 103

QSLEESGGDL VKPGASLTLT CTASGFSFSA GYWICWVRQA PGKGLEWIAC IYAGSSGSTY YASWAKGRFT IPKTSSTTVT LQMTSLTGAD TATYFCARGN AGVAVGALWG PGTLVTVSS

Región VH de Ab 4129 de conejo SEQ ID NO: 104

cagtcgttgg aggagtccgg gggagacctg gttaagcctg gggcatccct gacactcacc

tgcacagcct ctggattctc cttcagtgcc ggctattgga tatgttgggt ccgccaggct

ccagggaagg ggctggagtg gatcgcatgc atttatgctg gtagtagtgg tagcacttac

tacgcgagct gggcgaaagg ccgattcacc atccccaaaa cctcgtcgac cacggtgact

ctgcaaatga ccagtctgac aggcgcggac acggccacct atttctgtgc gagaggtaat

gctggtgttg ctgttggtgc cttgtggggc ccaggcaccc tcgtcaccgt ctcgagt

La descripción también se extiende a un derivado de la SEQ ID NO: 107 en el que al menos uno de los aminoácidos en el resto DS se reemplaza por otro aminoácido, por ejemplo, el resto está mutado a DA o DT.

La descripción también se extiende a un derivado de la SEQ ID NO: 108 en el que la cisteína se reemplaza por otro aminoácido, por ejemplo, serina.

La descripción también se extiende a un derivado de la SEQ ID NO: 109 en el que la cisteína se reemplaza por otro aminoácido, por ejemplo, serina.

Ab 4131

Región VL de Ab 4131 de conejo SEQ ID NO: 111

DIVMTQTPAS VSEPVGGSVT IKCQASQSFY NLLAWYQQKP GQPPKLLIYD ASDLASGVPS RFKGSGSGTD FTLTISDLEC ADAAAYYCQS ADGSSYAFGG GTEVVVK

Región VL de Ab 4131 de conejo SEQ ID NO: 112

gacattgtga tgacccagac tccagcctcc gtgtctgaac ctgtgggagg ctcagtcacc

atcaagtgcc aggccagtca gagcttttac aacctcttag cctggtatca gcagaaacca

gggcagcctc ccaaactcct gatctatgat gcatccgatc tggcatctgg ggtcccatcg

cggttcaaag gcagtggatc tgggactgat ttcactctca ccatcagcga cctggagtgt

gccgatgctg ccgcttacta ctgtcaaagt gctgatggta gtagttacgc tttcggcgga

gggaccgagg tggtcgtcaa a

Región VH de Ab 4131 de conejo SEQ ID NO: 113

QEQLEESGGG LVKPEGSLTL TCTASGVSFS SSYWIYWVRQ APGKGLEWIA CIYTGSSGST YYASWAKGRF TVSETSSTTV TLQMTSLTAA DTATYFCARA SAWTYGMDLW GPGTLVTVSS

Región VH de Ab 4131 de conejo SEQ ID NO: 114

caggagcaat tggaggagtc cgggggaggc ctggtcaagc ctgagggatc cctgacactc

acctgcacag cctctggagt ctccttcagt agcagctatt ggatatactg ggtccgccag

gctccaggga aggggctgga gtggatcgca tgcatttata ctggtagtag tggtagcact

tactacgcga gctgggcgaa aggccgattc accgtctccg aaacctcgtc gaccacggtg

actctgcaaa tgaccagtct gacagccgcg gacacggcca cctatttctg tgcgagagca

agcgcttgga cctacggcat ggacctctgg ggcccgggca ccctcgtcac cgtctcgagt

La descripción también se extiende a un derivado de la SEQ ID NO: 117 en el que al menos uno de los aminoácidos en el resto DS se reemplaza por otro aminoácido, por ejemplo, el resto está mutado a DA o DT.

La descripción también se extiende a un derivado de la SEQ ID NO: 119 en el que la cisteína se reemplaza por otro aminoácido, por ejemplo, serina.

Ab 4133

Región VL de Ab 4133 de conejo SEQ ID NO: 121

AQVLTQTPSP VSAVVGGTVS ISCQASQSVY NNNNLSWYQQ KPGQPPKLLI YDASKLASGV

PSRFKGSGSG TQFTLTISGV QCDDAATYYC LGGYYSSGWY FAFGGGTKVV VK

Región VL de Ab 4133 de conejo SEQ ID NO: 122

gcgcaagtgc tgacccagac tccatctccc gtgtctgcag ttgtgggagg cacagtcagc

atcagttgcc aggccagtca gagtgtttat aataacaaca acttatcctg gtatcagcag

aaaccagggc agcctcccaa gctcttgatc tacgatgcat ccaaattggc atctggggtc

ccatcccggt tcaaaggcag tggatctggg acacagttca ctctcaccat cagcggcgtg

cagtgtgacg atgctgccac ttactactgt ctaggcggtt attatagtag tggttggtat

tttgctttcg gcggagggac caaggtggtg gtcaaa

Región VH de Ab 4133 de conejo SEQ ID NO: 123

QEQLVESGGG LVQPEGSLTL TCTASGFSFS GNYYMCWVRQ APGKGLEWIG CLYTGSSGST YYASWAKGRF TISKTSSTTV TLQMTSLTAA DTATYFCARD LGYEIDGYGG LWGQGTLVTV SS

Región VH de Ab 4133 de conejo SEQ ID NO: 124

caggagcagc tggtggagtc cgggggaggc ctggtccagc ctgagggatc cctgacacta

acctgcacag cttctggatt ctccttcagt ggcaactact acatgtgctg ggtccgccag

gctccaggga aggggctgga gtggatcgga tgcctttata ctggtagtag tggtagcaca

tattacgcga gctgggcgaa aggccgattc accatctcca aaacctcgtc gaccacggtg

actctgcaaa tgaccagtct gacagccgcg gacacggcca cctatttctg tgcgagagat

ctaggttatg aaattgatgg ttatgggggc ttgtggggcc agggcaccct cgtcaccgtc tcgagt

La descripción también se extiende a un derivado de la SEQ ID NO: 125 en el que se elimina el sitio de glicosilación NLS, por ejemplo, se muta a SLS o QLS.

La descripción también se extiende a un derivado de la SEQ ID NO: 128 en el que la cisteína se reemplaza por otro aminoácido, por ejemplo, serina.

La descripción también se extiende a un derivado de la SEQ ID NO: 130 en el que al menos uno de los aminoácidos en el resto DG se reemplaza por otro aminoácido, por ejemplo, el resto está mutado a EG, DA o DS.

Anticuerpos de unión a la albúmina sérica

D o m in io v a r ia b le de c a d e n a p e sa d a de l a n ticu e rp o a n ti-a lb ú m in a (no ds ) SEQ ID NO: 137 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly lie Asp Leu Ser Asn Tyr Ala lie Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp lie Gly lie lie Trp Ala Ser Gly Thr Thr Phe Tyr Ala Thr Trp Ala Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Thr Val Pro Gly Tyr Ser Thr Ala Pro Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

Dominio variable de cadena pesada del anticuerpo anti-albúmina (ds) SEQ ID NO: 138

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly lie Asp Leu Ser Asn Tyr Ala lie Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp lie Gly lie lie Trp Ala Ser Gly Thr Thr Phe Tyr Ala Thr Trp Ala Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Thr Val Pro Gly Tyr Ser Thr Ala Pro Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

Dominio variable de cadena ligera del anticuerpo anti-albúmina (no ds) SEQ ID NO: 139 Asp lie Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Gln Ser Ser Pro Ser Val Trp Ser Asn Phe Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie Tyr Glu Ala Ser Lys Leu Thr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gly Gly Gly Tyr Ser Ser lie Ser Asp Thr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu lie Lys Arg Thr Dominio variable de cadena ligera del anticuerpo anti-albúmina (ds) SEQ ID NO: 140

Asp lieGln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr lieThr Cys Gln Ser Ser Pro Ser Val Trp Ser Asn Phe Leu Ser Trp Tyr Gln Gln LysPro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie Tyr Glu Ala Ser Lys Leu Thr Ser Gly ValPro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser SerLeu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gly Gly Gly Tyr Ser Ser lie SerAsp Thr Thr Phe Gly Cys Gly Thr Lys Val Glu lie Lys Arg Thr CD79a humano SEQ ID NO: 141

MPGGPGVLQA LPATIFLLFL LSAVYLGPGC QALWMHKVPA SLMVSLGEDA HFQCPHNSSN NANVTWWRVL HGNYTWPPEF LGPGEDPNGT LIIQNVNKSH GGIYVCRVQE GNESYQQSCG TYLRVRQPPP RPFLDMGEGT KNRIITAEGI ILLFCAVVPG TLLLFRKRWQ NEKLGLDAGD EYEDENLYEG LNLDDCSMYE DISRGLQGTY QDVGSLNIGD VQLEKP CD79b humano SEQ ID NO: 142

MARLALSPVP SHWMVALLLL LSAEPVPAAR SEDRYRNPKG SACSRIWQSP RFIARKRGFT VKMHCYMNSA SGNVSWLWKQ EMDENPQQLK LEKGRMEESQ NESLATLTIQ GIRFEDNGIY FCQQKCNNTS EVYQGCGTEL RVMGFSTLAQ LKQRNTLKDG IIMIQTLLII LFIIVPIFLL LDKDDSKAGM EEDHTYEGLD IDQTATYEDI VTLRTGEVKW SVGEHPGQE

CD45 humano SEQ ID NO: 143

MYLWLKLLAF GFAFLDTEVF VTGQSPTPSP TGLTTAKMPS VPLSSDPLPT HTTAFSPAST FERENDFSET TTSLSPDNTS TQVSPDSLDN ASAFNTTGVS SVQTPHLPTH ADSQTPSAGT DTQTFSGSAA NAKLNPTPGS NAISDVPGER STASTFPTDP VSPLTTTLSL AHHSSAALPA RTSNTTITAN TSDAYLNASE TTTLSPSGSA VISTTTIATT PSKPTCDEKY ANITVDYLYN KETKLFTAKL NVNENVECGN NTCTNNEVHN LTECKNASVS ISHNSCTAPD KTLILDVPPG VEKFQLHDCT QVEKADTTIC LKWKNIETFT CDTQNITYRF QCGNMIFDNK EIKLENLEPE HEYKCDSEIL YNNHKFTNAS KIIKTDFGSP GEPQIIFCRS EAAHQGVITW NPPQRSFHNF TLCYIKETEK DCLNLDKNLI KYDLQNLKPY TKYVLSLHAY IIAKVQRNGS AAMCHFTTKS APPSQVWNMT VSMTSDNSMH VKCRPPRDRN GPHERYHLEV EAGNTLVRNE SHKNCDFRVK DLQYSTDYTF KAYFHNGDYP GEPFILHHST SYNSKALIAF LAFLIIVTSI ALLVVLYKIY DLHKKRSCNL DEQQELVERD DEKQLMNVEP IHADILLETY KRKIADEGRL FLAEFQSIPR VFSKFPIKEA RKPFNQNKNR YVDILPYDYN RVELSEINGD AGSNYINASY IDGFKEPRKY IAAQGPRDET VDDFWRMIWE QKATVIVMVT RCEEGNRNKC AEYWPSMEEG TRAFGDVVVK INQHKRCPDY IIQKLNIVNK KEKATGREVT HIQFTSWPDH GVPEDPHLLL KLRRRVNAFS NFFSGPIVVH CSAGVGRTGT YIGIDAMLEG LEAENKVDVY GYVVKLRRQR CLMVQVEAQY ILIHQALVEY NQFGETEVNL SELHPYLHNM KKRDPPSEPS PLEAEFQRLP SYRSWRTQHI GNQEENKSKN RNSNVIPYDY NRVPLKHELE MSKESEHDSD ESSDDDSDSE EPSKYINASF IMSYWKPEVM IAAQGPLKET IGDFWQMIFQ RKVKVIVMLT ELKHGDQEIC AQYWGEGKQT YGDIEVDLKD TDKSSTYTLR VFELRHSKRK DSRTVYQYQY TNWSVEQLPA EPKELISMIQ VVKQKLPQKN SSEGNKHHKS TPLLIHCRDG SQQTGIFCAL LNLLESAETE EVVDIFQVVK ALRKARPGMV STFEQYQFLY DVIASTYPAQ NGQVKKNNHQ EDKIEFDNEV DKVKQDANCV NPLGAPEKLP EAKEQAEGSE PTSGTEGPEH SVNGPAS PAL NQGS

Referencias

1. Ribosome display efficiently selects and evolves high-affinity antibodies in vitro from immune librarles. Hanes J, Jermutus L, Weber-Bornhauser S, Bosshard H R, Plückthun A. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 14130-14135 2. Directed in Vitro Evolution and Crystallographic Analysis of a Peptide-binding Single Chain Antibody Fragment (scFv) with Low Picomolar Affinity. Zhand C, Spinelli S, Luginbuhl B, Amstutz P, Cambillau C, Pluckthun A. (2004) J. Biol. Chem. 279, 18870-18877

3. Antigen recognition by conformational selection. Berger C, Weber-Bornhauser S, Eggenberger Y, Hanes J, Pluckthun A, Bosshard H. R. (1999) F.E.B.S. Letters 450, 149-153

Ejemplos

El término Fab-Kd-Fab como se usa en los Ejemplos describe el complejo proteico biespecífico que tiene la fórmula A-X:Y-B en donde:

A-X es una primera proteína de fusión;

Y-B es una segunda proteína de fusión;

X:Y es una unión heterodimérica;

A comprende un fragmento Fab específico para un antígeno tal como CD45 o CD79;

B comprende un fragmento Fab específico para un antígeno tal como CD45 o CD79;

X es un primer compañero de unión de un par de unión tal como un scFv;

Y es un segundo compañero de unión del par de unión tal como un péptido; y

es una interacción (como una interacción de unión) entre X e Y.

Ejemplo 1 - Producción de Fab-A (Fab-scFv [A-X]) y Fab-B (Fab-péptido [B-Y) para ensayos funcionales

Estrategia de clonación

El ADN de la región variable del anticuerpo se generó mediante PCR o síntesis de genes que flanquean la secuencia de ADN de los sitios de enzimas de restricción. Estos sitios fueron HindIII y Xhol para cadenas pesadas variables y Hindlll y BsiWI para cadenas ligeras variables. Esto hace que la región variable pesada sea susceptible de ligarse en los dos vectores de cadena pesada (pNAFH con FabB-Y y pNAFH con FabA-Xds [estabilizado con disulfuro]) ya que tienen sitios de restricción complementarios. Esto liga la región variable aguas arriba (o 5') a las regiones constantes murinas y al péptido Y (GCN4) o scFv X (52SR4) creando un marco de lectura completo. Las cadenas ligeras se clonaron en vectores kappa constantes murinos estándar internos (pMmCK o pMmCK S171C) que de nuevo usan los mismos sitios de restricción complementarios. El vector pMmCK S171C se usa si la región variable se aísla de un conejo. Los eventos de clonación se confirmaron mediante secuenciación usando cebadores que flanquean el marco de lectura abierto completo.

Cultivo de CHOS

Las células CHOS en suspensión se preadaptaron al medio CDCHO (Invitrogen) suplementado con glutamx 2 mM (100X). Las células se mantuvieron en fase de crecimiento logarítmico agitadas a 140 rpm en un incubador agitador (Kuner AG, Birsfelden, Suiza) y se cultivaron a 37 °C suplementadas con CO2 al 8 %.

Transfección por electroporación

Antes de la transfección, el número de células y la viabilidad se determinaron utilizando un contador de células CEDEX (Innovatis AG. Bielefeld, Alemania) y la cantidad requerida de células (2X108 células/ml) se transfirió a tubos cónicos de centrífuga y se centrifugaron a 1.400 rpm durante 10 minutos. Las células sedimentadas se resuspendieron en disolución salina equilibrada de Earls estéril y se centrifugaron a 1.400 rpm durante 10 minutos más. Se descartó el sobrenadante y se resuspendieron los sedimentos hasta la densidad celular deseada.

ADN del vector a una concentración final de 400ug para 2X108 células/ml de mezcla y se pipetearon 800 gl en cubetas (Biorad) y se electroporaron usando un sistema de electroporación interno.

Las células transfectadas se transfirieron directamente a matraces Erlenmeyer de 1X3L que contenían medio ProCHO 5 enriquecido con glutamx 2 mM y una disolución de antibiótico antimitótico (100X) (1 en 500) y las células se cultivaron en un incubador agitado Kuhner ajustado a 37 °C, CO2 al 5 % y agitación a 140 rpm. Se añadió suplemento alimenticio 2 g/L ASF (AJINOMOTO) a las 24 horas posteriores a la transfección y la temperatura 0 descendió a 32 C durante 13 días más de cultivo. En el día cuatro, se añadió al cultivo butirato de sodio 3 mM (sal sódica del ácido n-butírico, Sigma B-5887).

En el día 14, los cultivos se transfirieron a tubos y el sobrenadante se separó de las células después de centrifugar durante 30 minutos a 4.000 rpm. Los sobrenadantes retenidos se filtraron adicionalmente a través de 0,22 gm SARTO BRAN P Millipore seguido de filtros de oro Gamma de 0,22 gm. Los niveles de expresión final se determinaron mediante Proteína G-HPLC.

Purificación a gran escala (1,0L)

El Fab-A y el Fab-B se purificaron mediante captura por afinidad utilizando los sistemas AKTA Xpress y columnas de níquel preempaquetadas HisTrap Excel (GE Healthcare). Los sobrenadantes del cultivo se filtraron de forma estéril a 0,22 gm y el pH se ajustó a neutro, si era necesario, con ácido o base débil antes de cargarlos en las columnas. Se usó una etapa de lavado secundaria, que contenía imidazol 15-25 mM, para desplazar cualquier proteína de la célula huésped débilmente unida/ligantes His no específicos de la resina de níquel. La elución se realizó con fosfato de sodio 10 mM, pH 7,4 NaCl 1 M Imidazol 250 mM y se recogieron fracciones de 2 ml. Un volumen de columna en la elución, el sistema se pausó durante 10 minutos para ajustar el pico de elución y, en consecuencia, disminuir el volumen de elución total. Se reunieron las fracciones más limpias y se intercambió el tampón en PBS (Sigma), pH 7,4 y se filtraron 0,22 gm. Las combinaciones finales se ensayaron mediante A280 Scan, SE-HPLC (método G3000), SDS-PAGE (reducido y no reducido) y para determinar endotoxinas usando el sistema PTS Endosafe.

Ejemplo 2 - El complejo biespecífico Fab de CD45/Fab de CD79, pero no una mezcla de Fab de CD45 y CD79 o el complejo Fab de CD79 bivalente inhibe la señalización de Akt

Las PBMC humanas derivadas de conos de aféresis plaquetaria se almacenaron como partes alícuotas congeladas. Antes de realizar un ensayo, las células se descongelaron, se lavaron en DMEM (Life Technologies) y se dejó que se aclimataran en un ambiente de 37 °C/CO2 al 5%. Durante este período, se crearon cuadrículas de anticuerpos biespecíficos o bivalentes diluyendo cantidades equimolares (200 nM) de Fab'-A (Fab-scFv) y Fab-B (Fab-péptido) o Fab-A (Fab-péptido) y Fab-B (Fab-péptido) con especificidad de antígeno para las proteínas de la superficie celular CD45 y CD79b en DMEM que contenía suero de ternera al 10 % y glutamina 2 mM. Esta cuadrícula se muestra en la Tabla 4.

Tabla 4: Cuadrícula de combinaciones biespecíficas y bivalentes de anticuerpos con especificidad para CD45 y CD79b.

donde X es un scFv (52SR4) e Y es un péptido (GCN4)

FabA-X y FabB-Y o Fab-A-Y y Fab-B-Y se incubaron juntos durante 90 minutos (en un ambiente de 37 °C/CO2 al 5%) antes del mezclado con 2,5x105 PBMC en placas de 96 pocillos con fondo en V. A continuación, se incubaron juntas PBMC más combinaciones biespecíficas o bivalentes durante 90 minutos más. Después de este tiempo, las células B se activaron mediante la adición de 200 nM de F(ab')2 anti-IgM humana de cabra (Southern Biotechnology) durante 8 minutos a 37 °C. A continuación, se detuvo la reacción de señalización añadiendo un volumen igual de tampón Cytofix (BD Biosciences). A continuación, las placas se dejaron a temperatura ambiente durante 15 minutos antes de la centrifugación a 500 g durante 5 minutos. El exceso de sobrenadante se descartó del sedimento celular que se resuspendió en tampón de flujo (PBS BSA al 1 % NaN3 al 0,01 %) y se lavó una vez más. A continuación, las células se resuspendieron en Tampón Perm III (BD Biosciences) enfriado con hielo durante 30 minutos antes de lavarlas dos veces en tampón de flujo. A continuación, las células se tiñeron con un anticuerpo anti-CD20 marcado con fluorescencia (BD Biosciences) y un anticuerpo anti-fosfo Akt marcado con fluorescencia que reconoce un residuo de serina modificado en la posición 473 de la proteína. A continuación, las placas se resuspendieron y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente en la oscuridad. Después de este tiempo, las placas se lavaron dos veces más y se resuspendieron en 25 pl de tampón de flujo. La expresión celular de CD20 y Akt se midió usando un citómetro de flujo Intellicyt HTFC™.

Usando el paquete de software de análisis de datos Forecyt™ (Intellicyt), las células B se identificaron como distintas de otras poblaciones de células y se calculó la media geométrica de los niveles de Akt para cada pocillo. A continuación, todos los datos se expresaron como el porcentaje de inhibición de la respuesta máxima (solo anti-IgM) menos el fondo (solo células). El efecto relativo de las combinaciones de CD45 y CD79b se muestra en la Tabla 5 (J = inhibición, f = estimulación y ^ = sin efecto general).

Tabla 5: Tabla de la potencia relativa de inhibición de Akt fosforilado para combinaciones de anticuerpos biespecíficas y bivalentes con especificidad para CD45 y CD79b.

donde X es un scFv (52SR4) e Y es un péptido (GCN4).

Estos datos también se muestran en forma de un gráfico de barras (Figura 1): los datos representan valores medios y las barras de error son intervalos de confianza del 95 %. Los datos muestran que la combinación biespecífica de CD45 con CD79b puede inhibir la expresión de fosfo-Akt en células B estimuladas con anti-IgM, mientras que la combinación de CD79b-Y con CD79b-Y, que es una mezcla que no puede formar un biespecífico, no lo hace.

Ejemplo 3 - El complejo biespecífico Fab de CD45/Fab de CD79, pero no una mezcla de Fab de CD45 y CD79 o el complejo Fab' de CD79 bivalente, inhibe la señalización de PLCy2

Las PBMC humanas derivadas de conos de aféresis plaquetaria se almacenaron como partes alícuotas congeladas. Antes de realizar un ensayo, las células se descongelaron, se lavaron en DMEM (Life Technologies) y se dejó que se aclimataran en un ambiente de 37° C/CO2 al 5%. Durante este período, se crearon cuadrículas de anticuerpos biespecíficos o bivalentes diluyendo cantidades equimolares (200 nM) de Fab-a (Fab-scFv [A-X]) y Fab'-B (Fab-péptido [B-Y]) o Fab-A (Fab-péptido) y Fab-B (Fab-péptido con especificidad de antígeno para las proteínas de la superficie celular CD45 y CD79b en DMEM que contenía suero de ternera al 10 % y glutamina 2 mM. Esta cuadrícula se muestra en la Tabla 4.

Fab'A-X y Fab'B-Y o Fab-A-Y y Fab-B-Y se incubaron juntos durante 90 minutos (en un ambiente de 37 °C/CÜ2 al 5%) antes del mezclado con 2,5x105 PBMC en placas de 96 pocillos con fondo en V. A continuación, se incubaron juntas las PBMC más combinaciones biespecíficas o bivalentes durante 90 minutos más. Después de este tiempo, las células B se activaron mediante la adición de 200 nM de F(ab')2 anti-IgM humana de cabra (Southern Biotechnology) durante 8 minutos a 37 °C. A continuación, se detuvo la reacción de señalización añadiendo un volumen igual de tampón Cytofix (BD Biosciences). A continuación, las placas se dejaron a temperatura ambiente durante 15 minutos antes de la centrifugación a 500 g durante 5 minutos. Se descartó el exceso de sobrenadante del sedimento celular que se resuspendió en tampón de flujo y se lavó una vez más. A continuación, las células se resuspendieron en tampón Perm III (BD Biosciences) enfriado con hielo durante 30 minutos antes de lavarlas dos veces en tampón de flujo.

A continuación, las células se tiñeron con un anticuerpo anti-CD20 marcado con fluorescencia (BD Biosciences) y un anticuerpo anti-fosfo PLCy2 marcado con fluorescencia que reconoce un residuo de tirosina modificado en la posición 759 de la proteína. A continuación, las placas se resuspendieron y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente en la oscuridad. Después de este tiempo, las placas se lavaron dos veces más y se resuspendieron en 25 |ul de tampón de flujo. La expresión celular de CD20 y PLCg2 se midió usando un citómetro de flujo Intellicyt HTFC™.

Usando el paquete de software de análisis de datos Forecyt™ (Intellicyt), las células B se identificaron como distintas de otras poblaciones de células y se calculó la media geométrica de los niveles de PLCy2 para cada pocillo. A continuación, todos los datos se expresaron como el porcentaje de inhibición de la respuesta máxima (solo anti-IgM) menos el fondo (solo células). El efecto relativo de la combinación de CD45 y CD79b se muestra en la Tabla 6 (J = inhibición, f = estimulación y ^ = sin efecto general).

Tabla 6: Tabla de la potencia relativa de inhibición de PLCg2 fosforilado para combinaciones de anticuerpos biespecíficas y bivalentes con especificidad para CD45 y CD79b.

donde X es un scFv e Y es un péptido

Estos datos también se pueden expresar como un gráfico de barras (Figura 2), los datos representan valores medios y las barras de error son intervalos de confianza del 95 %. Los datos muestran que la combinación biespecífica de CD45 con CD79b inhibe la expresión de fosfo-PLCY2 en células B estimuladas con anti-IgM, mientras que la combinación de CD79b-Y con CD79b-Y, que es una mezcla que no puede formar un biespecífico, no lo hace.

Ejemplo 4 El complejo biespecífico CD45 y CD79b puede inhibir de forma potente la expresión de CD86 en las células B.

Las PBMC humanas derivadas de conos de aféresis plaquetaria se almacenaron como partes alícuotas congeladas. Antes de realizar un ensayo, las células se descongelaron, se lavaron en DMEM (Life Technologies) y se dejó que se aclimataran en un ambiente de 37 grados C/CO2 al 5 %. Durante este período, se crearon combinaciones biespecíficas diluyendo cantidades equimolares (500 nM) de Fab-X (Fab-scFv) y Fab-Y (Fab-péptido) con especificidad antigénica para las proteínas de la superficie celular CD45 y CD79b en DMEM que contenía suero de ternera al 10 %. y glutamina 2 mM. A continuación, estas combinaciones se diluyeron en 8 diluciones escalonadas 1 en 2,5 para crear una titulación de la dosis para esta combinación. Se incubaron Fab-X y Fab-Y juntos durante 90 minutos (en un ambiente de 37 grados C/CO2 al 5 %) antes de añadir 2,5 x 105 PBMC a placas de 96 pocillos con fondo en V. A continuación, se añadieron las PBMC a las combinaciones Fab'-X y Fab'-Y y se incubaron juntas durante 90 minutos más. Después de este tiempo, las células B se activaron mediante la adición de 200 nM de F(ab')2 anti-IgM humana de cabra (Southern Biotechnology) durante 24 horas a 37 grados C. Para permitir la detección de los marcadores de activación de la superficie celular, se colocaron placas en hielo y se lavaron una vez en tampón de flujo enfriado con hielo (PBS BSA al 1 % NaN3 al 0,01 %). A continuación, las células se tiñeron con un anticuerpo anti-CD19 marcado con fluorescencia (BD Biosciences) y un anticuerpo anti-CD86 marcado con fluorescencia y se incubaron en hielo durante 1 hora en la oscuridad. Después de este tiempo, las placas se lavaron dos veces más y se resuspendieron en 25 ul de tampón de flujo. La expresión celular de CD19 y CD86 se midió usando un citómetro de flujo Intellicyt HTFC™. Usando el paquete de software de análisis de datos Forecyt™ (Intellicyt), las células B se identificaron como distintas de otras poblaciones de células y se calculó la media geométrica de los niveles de CD86 para cada pocillo. A continuación, todos los datos se expresaron como el porcentaje de inhibición de la respuesta máxima (solo anti-IgM) menos el fondo (solo células). Como puede verse en la figura 3 una titulación de la combinación de CD45-X/CD79b-Y fue capaz de inhibir la expresión de CD86 inducida por anti-IgM en las células B después de 24 horas. La CI50, extrapolada utilizando un ajuste de curva logístico de 4 parámetros utilizando Graphpad Prism 6, fue de 4,7 nM (los datos representan valores medios y las barras de error son desviaciones estándar).

Ejemplo 5 - El efecto inhibidor de la proteína biespecífica CD45 y CD79b se puede reproducir con diferentes regiones V de anticuerpos

Inmunización; El ADN que codifica los antígenos CD79a y CD79b y CD45 se obtuvo mediante síntesis de genes o fuentes comerciales y se clonó en un vector de expresión con un fuerte promotor constitutivo. Después, el ADN plasmídico se transfectó en células de fibroblastos de conejo Rab-9 (ATCC® CRL-1414™) usando un sistema de electroporación interno. Para las inmunizaciones de CD79, tanto CD79a como CD79b se cotransfectaron. Veinticuatro horas más tarde, se comprobó la expresión de antígeno en las células mediante citometría de flujo y se congelaron en partes alícuotas en nitrógeno líquido hasta su uso. Se inmunizaron hasta 6 antígenos por conejo mediante coexpresión en la misma célula o haciendo mezclas de células transfectadas en forma individual o múltiple. Se inmunizaron conejos con 3 dosis de células.

Descubrimiento de anticuerpos; Los cultivos de células B se prepararon utilizando un método similar al descrito por Zubler et al. (1985). Brevemente, se cultivaron células B derivadas de bazo o PBMC de conejos inmunizados a una densidad de aproximadamente 2.000-5.000 células por pocillo en placas de cultivo de tejidos de 96 pocillos con código de barras con 200 pl/pocillo de medio RPMI 1640 (Gibco BRL) suplementado con FCS al 10 % (PAA laboratories ltd), HEPES al 2 % (Sigma Aldrich), L-glutamina al 1 % (Gibco BRL), disolución de penicilina/estreptomicina al 1 % (Gibco BRL), p-mercaptoetanol al 0,1 % (Gibco BRL), sobrenadante del cultivo de esplenocitos activados al 3 % y células de timoma murino EL4 mutantes irradiadas con rayos gamma (5x104/ pocillo) durante siete días a 37 °C en una atmósfera de CO2 al 5 %.

La presencia de anticuerpos específicos de antígeno en los sobrenadantes del cultivo de células B se determinó usando un ensayo de unión homogéneo basado en fluorescencia usando células HEK293 cotransfectadas con CD79a y CD79b o CD45. El cribado implicó la transferencia de 10 ul de sobrenadante de placas de cultivo tisular de 96 pocillos con código de barras a placas de ensayo de pared negra de 384 pocillos con código de barras que contenían células HEK293 transfectadas con antígeno diana (aproximadamente 3.000 células/pocillo) utilizando un manipulador de líquidos Matrix Platemate. La unión se reveló con un conjugado de Cy-5 IgG anti-conejo específico para Fcy de cabra (Jackson). Las placas se leyeron en un sistema de detección celular Applied Biosystems 8200.

Después del cribado primario, los sobrenadantes positivos se consolidaron en placas maestras con códigos de barras de 96 pocillos utilizando un robot de reordenamiento de muestras Aviso Onyx y las células B en placas de cultivo celular se congelaron a -80 °C. Las placas maestras se cribaron entonces en un ensayo de unión homogéneo basado en fluorescencia en células HEK293 transfectadas con antígenos CD79a y CD79b o CD45 o perlas Superavidin™ (Bangs Laboratories) recubiertas con proteína CD45 recombinante como fuente de antígeno. Esto se hizo con el fin de determinar la especificidad del antígeno para cada pocillo.

Para permitir la recuperación de genes de la región variable del anticuerpo a partir de una selección de pocillos de interés, se realizó una etapa de deconvolución para permitir la identificación de las células B específicas de antígeno en un pocillo dado que contenía una población heterogénea de células B. Esto se logró utilizando el método de focos fluorescentes (Clargo et al., 2014, Mabs 1 de enero de 2014: 6 (1) 143-159; EP1570267B1). Brevemente, las células B secretoras de inmunoglobulina de un pocillo positivo se mezclaron bien con células HEK293 transfectadas con antígeno diana o perlas de estreptavidina (New England Biolabs) recubiertas con antígeno diana biotinilado y una dilución final 1:1.200 de un conjugado con FITC de anti-conejo específico del fragmento Fcy de cabra (Jackson). Después de la incubación estática a 37 °C durante 1 hora, las células B específicas de antígeno se pudieron identificar debido a la presencia de un halo fluorescente que rodeaba a esa célula B. Varios de estos clones de células B individuales, identificados usando un microscopio Olympus, se recogieron entonces con un micromanipulador Eppendorf y se depositaron en un tubo de PCR. El método de focos fluorescentes también se utilizó para identificar células B específicas de antígeno de una población heterogénea de células B directamente de la médula ósea de conejos inmunizados.

Los genes de la región variable del anticuerpo se recuperaron de células individuales mediante transcripción inversa (RT)-PCR utilizando cebadores específicos de región variable de cadena ligera y pesada. Se realizaron dos rondas de PCR, con la PCR secundaria anidada incorporando sitios de restricción en los extremos 3' y 5' permitiendo la clonación de la región variable en vectores de expresión de mamíferos Fab-X y Fab-Y (VH) de ratón o kappa (VL) de ratón. Las construcciones de cadena pesada y ligera para los vectores de expresión Fab-X y Fab-Y se cotransfectaron en células HEK-293 usando células Fectina 293 (Life Technologies) o células Expi293 usando Expifectamina (Life Technologies) y anticuerpo recombinante expresado en placas de cultivo tejidos de 6 pocillos en un volumen de 5 ml. Después de 5-7 días de expresión, se recogieron los sobrenadantes. Los sobrenadantes se ensayaron en un ensayo de unión homogéneo basado en fluorescencia en células HEK293 transfectadas con antígeno y perlas Superavidin™ (Bangs Laboratories) recubiertas con proteína recombinante o células HEK transfectadas con antígeno. Esto se hizo para confirmar la especificidad de los anticuerpos clonados.

Producción de Fab A-X y Fab B-Y a pequeña escala (transfección de Expi293 a pequeña escala (50 ml))

Las células Expi293 se subcultivaron de forma rutinaria en el medio de expresión Expi293™ hasta una concentración final de 0,5 x 106 células viables/mL y se incubaron en un incubador con agitación orbital (Multitron, Infors HT) a 120 rpm CO2 al 8 % y 37 °C.

El día de la transfección, se midieron la viabilidad y la concentración de las células usando un contador de células automatizado (Vi-CELL, Beckman Coulter). Para lograr una concentración celular final de 2,5x106 células viables/mL se añadió el volumen apropiado de suspensión celular a un matraz de agitación Erlenmeyer estéril de 250 mL y se llevó hasta el volumen de 42,5 mL mediante la adición de medio de expresión Expi293™ precalentado fresco por cada 50 mL de transfección.

Para preparar los complejos lípido-ADN para cada transfección, se diluyó un total de 50 qg de ADN plasmídico de cadena pesada y cadena ligera en medio Opti-MEM® I (LifeTechnologies) hasta un volumen total de 2,5 mL y 135 qL de reactivo ExpiFectamina™ 293 (LifeTechnologies) se diluyeron en medio Opti-MEM® I hasta un volumen total de 2,5 mL. Todas las diluciones se mezclaron suavemente y se incubaron durante no más de 5 minutos a temperatura ambiente antes de añadir cada disolución de ADN al respectivo reactivo ExpiFectamina™ 293 diluido para obtener un volumen total de 5 mL. Las mezclas de ADN-reactivo ExpiFectamina™ 293 se mezclaron suavemente y se incubaron durante 20-30 minutos a temperatura ambiente para permitir que se formaran los complejos de ADN-reactivo ExpiFectamina™ 293.

Después de que se completó la incubación del complejo de ADN-reactivo ExpiFectamina™ 293, se añadieron los 5 mL de complejo de ADN-reactivo ExpiFectamina™ 293 a cada matraz de agitación. Los matraces de agitación se incubaron en una incubador con agitación orbital (Multitron, Infors HT) a 120 rpm, CO2 al 8 % y 37 °C.

Aproximadamente 16-18 horas después de la transfección, se añadieron 250 qL de potenciador 1 de la transfección ExpiFectamina™ 293 (LifeTechnologies) y 2,5 mL de potenciador 2 de la transfección ExpiFectamina™ 293 (LifeTechnologies) a cada matraz de agitación.

Los cultivos celulares se recogieron 7 días después de la transfección. Las células se transfirieron a tubos de centrifugación de 50 mL (Falcon) y se centrifugaron durante 30 min a 4.000 rpm seguido de filtración estéril a través de un Stericup de 0,22 qm (Merck Millipore). Los sobrenadantes clarificados y filtrados estériles se almacenaron a 4 °C. Los niveles de expresión final se determinaron mediante Proteína G-HPLC.

Purificación a pequeña escala (50 ml); Tanto Fab-X como Fab-Y se purificaron por separado mediante captura por afinidad utilizando un sistema de purificación basado en vacío a pequeña escala. Brevemente, los 50 ml de sobrenadantes de cultivo se esterilizaron por filtración de 0,22 qm antes de que se añadieran 500 qL de perlas de Ni Sefarosa (GE Healthcare). La mezcla de perlas de sobrenadantes se agitó entonces durante aproximadamente una hora antes de eliminar el sobrenadante aplicando vacío. Después, las perlas se lavaron con el lavado 1 (fosfato de sodio 50 mM, NaCl 1 M, pH 6,2) y el lavado 2 (NaCl 0,5 M). La elución se realizó con acetato de sodio 50 mM, pH 4,0 NaCl 1M. El tampón de las fracciones eluidas se intercambió en PBS (Sigma), pH 7,4 y se filtró 0,22 qm. Las combinaciones finales se ensayaron por A280, SE-UPLC (método BEH200), SDS-PAGE (reducido y no reducido) y para determinar endotoxinas usando el sistema PTS Endosafe.

Las PBMC humanas derivadas de conos de aféresis plaquetaria se almacenaron como partes alícuotas congeladas. Antes de realizar un ensayo, las células se descongelaron, se lavaron en RPMI 1640 (Life Technologies) y se dejó que se aclimataran en un ambiente de 37 °C/CO2 al 5 %. Durante este período, se crearon combinaciones de anticuerpos biespecíficos, bivalentes o mezclas de anticuerpos diluyendo cantidades equimolares (200 nM) de Fab'-X (Fab-scFv) y Fab'-Y (Fab-péptido) con especificidad de antígeno para las proteínas de la superficie celular CD45 y CD79b en RPMI 1640 que contenía suero bovino fetal al 10 %, 50 unidades/mL de penicilina, 50 qg/mL de estreptomicina y L-glutamina 2 mM. Estas combinaciones de 3 CD79b Fab-Y diferentes y 2 CD45 Fab-X diferentes se muestran en la Tabla 7.

Tabla 7: Cuadrícula de proteínas biespecíficas con especificidad para CD45 y CD79b.

donde X es un scFv (52SR4) e Y es un péptido (GCN4)

FabA-X y FabB-Y se incubaron juntos durante 60 minutos (en un ambiente de 37 °C/CO2 al 5 %) antes del mezclado con 2,5x105 PBMC en placas de 96 pocillos con fondo en V. A continuación, se incubaron juntas PBMC más FabA-X y/o FabB-Y durante 90 minutos más. Después de este tiempo, las células B se activaron mediante la adición de 12,5 qg/ml de F(ab')2 anti-IgM humana de cabra (Southern Biotechnology) durante 10 minutos a 37 °C. A continuación, se detuvo la reacción de señalización añadiendo un volumen igual de tampón Cytofix (BD Biosciences). A continuación, las placas se dejaron a temperatura ambiente durante 15 minutos antes de la centrifugación a 500 x g durante 5 minutos. El exceso de sobrenadante se descartó del sedimento celular que se resuspendió en tampón de flujo (PBS BSA al 1 % NaN3 al 0,1 % EDTA 2 mM) y se lavó una vez más. A continuación, las células se resuspendieron en tampón Perm III (BD Biosciences) enfriado con hielo durante 30 minutos antes de lavarlas dos veces en tampón de flujo.

A continuación, las células se tiñeron con un anticuerpo anti-CD20 marcado con fluorescencia (BD Biosciences) y un anticuerpo anti-fosfo-PLCy2 que reconoce un residuo de tirosina modificado en la posición 759. A continuación, las placas se resuspendieron y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente en la oscuridad. Después de este tiempo, las placas se lavaron dos veces más y se resuspendieron en 40 pl de tampón de flujo. La expresión celular de CD20 y PlCy2 se midió usando un citómetro de flujo Intellicyt HTFC™.

Usando el paquete de software de análisis de datos Forecyt™ (Intellicyt), las células B se identificaron como distintas de otras poblaciones de células y se calculó la media geométrica de los niveles de PLCy2 para cada pocillo. A continuación, todos los datos se expresaron como el porcentaje de inhibición de la respuesta máxima (solo anti-IgM) menos el fondo (solo células).

Como se puede ver en la Figura 4, los datos muestran que la combinación de CD45 con CD79b con diferentes regiones V de anticuerpos puede inhibir la expresión de fosfo-PLCY2 en células B estimuladas con anti-IgM.

Ejemplo 6: Cribado de cuadrículas de grandes paneles de complejos proteicos unidos heterodiméricamente para identificar nuevas dianas de anticuerpos biespecíficos.

Introducción; Tras la validación satisfactoria del formato biespecífico y del método de cribado en los ejemplos anteriores, el cribado se amplió a un mayor número de pares de antígenos. Se generó un panel de pares de regiones variables (V) de anticuerpos frente a 23 antígenos diferentes expresados en células B. Usando el Fab-Kd-Fab [p. ej., A-X:Y-B en el que A y B son fragmentos Fab] se formó una cuadrícula de complejos proteicos unidos heterodiméricamente que representan múltiples combinaciones de regiones V de cada una de 315 combinaciones de pares de antígenos diferentes. Estas combinaciones se cribaron para determinar su capacidad para modular la señalización de BCR (receptor de células B) en un ensayo de citometría de flujo de alto rendimiento para seleccionar nuevos pares de diana para la intervención con un anticuerpo biespecífico.

Inmunización; El ADN que codifica antígenos seleccionados se obtuvo mediante síntesis de genes o fuentes comerciales y se clonó en un vector de expresión con un fuerte promotor constitutivo. Después, el ADN plasmídico se transfectó en células de fibroblastos de conejo Rab-9 (ATCC® CRL-1414™) usando un sistema de electroporación interno. Veinticuatro horas más tarde, se comprobó la expresión de antígeno en las células mediante citometría de flujo y se congelaron en partes alícuotas en nitrógeno líquido hasta su uso. Se inmunizaron hasta 6 antígenos por conejo mediante coexpresión en la misma célula o haciendo mezclas de células transfectadas de forma individual o múltiples. Se inmunizaron conejos con 3 dosis de células.

La presencia de anticuerpos específicos de antígeno en los sobrenadantes del cultivo de células B se determinó usando un ensayo de unión homogéneo basado en fluorescencia usando células HEK293 cotransfectadas con los antígenos con los que se inmunizaron los conejos. El cribado implicó la transferencia de 10 ul de sobrenadante de placas de cultivo de tejidos de 96 pocillos con código de barras a placas de ensayo de pared negra de 384 pocillos con código de barras que contenían células HEK293 transfectadas con antígeno diana (aproximadamente 3.000 células/pocillo) utilizando un manipulador de líquidos Matrix Platemate. La unión se reveló con un conjugado Cy-5 anti-IgG de conejo específico de Fcy de cabra (Jackson). Las placas se leyeron en un sistema de detección celular Applied Biosystems 8200.

Después del cribado primario, los sobrenadantes positivos se consolidaron en placas maestras con códigos de barras de 96 pocillos utilizando un robot de reordenamiento de muestras Aviso Onyx y las células B en placas de cultivo celular congeladas a -80 °C. Después, las placas maestras se cribaron en un ensayo de unión homogéneo basado en fluorescencia en células HEK293 transfectadas con antígenos por separado y perlas Superavidin™ (Bangs Laboratories) recubiertas con proteína recombinante como fuente de antígeno. Esto se hizo para determinar la especificidad del antígeno para cada pocillo.

Para permitir la recuperación de genes de la región variable del anticuerpo a partir de una selección de pocillos de interés, se realizó una etapa de deconvolución para permitir la identificación de las células B específicas de antígeno en un pocillo dado que contenía una población heterogénea de células B. Esto se logró utilizando el método de focos fluorescentes (Clargo et al., 2014, Mabs 1 de enero de 2014: 6 (1) 143-159; EP1570267B1). Brevemente, las células B secretoras de inmunoglobulina de un pocillo positivo se mezclaron bien con células HEK293 transfectadas con antígeno diana o perlas de estreptavidina (New England Biolabs) recubiertas con antígeno diana biotinilado y una dilución final 1:1.200 de un conjugado con FITC de anti-conejo específico del fragmento Fcy de cabra (Jackson). Después de la incubación estática a 37 °C durante 1 hora, las células B específicas de antígeno se pudieron identificar debido a la presencia de un halo fluorescente que rodeaba a esa célula B. Varios de estos clones de células B individuales, identificados usando un microscopio Olympus, se recogieron luego con un micromanipulador Eppendorf y se depositaron en un tubo de PCR. El método de focos fluorescentes también se utilizó para identificar células B específicas de antígeno de una población heterogénea de células B directamente de la médula ósea de conejos inmunizados.

Los genes de la región variable del anticuerpo se recuperaron de células individuales mediante transcripción inversa (RT)-PCR utilizando cebadores específicos de región variable de cadena ligera y pesada. Se realizaron dos rondas de PCR, con la PCR secundaria anidada incorporando sitios de restricción en los extremos 3' y 5' permitiendo la clonación de la región variable en vectores de expresión de mamíferos Fab-X y Fab-Y (VH) de ratón o kappa (VL) de ratón. Las construcciones de cadena pesada y ligera para los vectores de expresión Fab-X y Fab-Y se cotransfectaron en células HEK-293 usando Fectin 293 (Life Technologies) o células Expi293 usando Expifectamina (Life Technologies) y anticuerpo recombinante expresado en placas de cultivo de tejidos de 6 pocillos en un volumen de 5 ml. Después de 5-7 días de expresión, se recogieron los sobrenadantes. Los sobrenadantes se ensayaron en un ensayo de unión homogéneo basado en fluorescencia en células HEK293 transfectadas con antígeno y perlas Superavidin™ (Bangs Laboratories) recubiertas con proteína recombinante o células HEK transfectadas con antígeno. Esto se hizo para confirmar la especificidad de los anticuerpos clonados.

Producción de Fab A-X y Fab B-Y a pequeña escala (transfección Expi293 a pequeña escala (50 mL))

Para preparar los complejos lípido-ADN para cada transfección, se diluyó un total de 50 pg de ADN plasmídico de cadena pesada y cadena ligera en medio Opti-MEM® I (LifeTechnologies) hasta un volumen total de 2,5 ml y 135 pL de reactivo ExpiFectamina™ 293 (LifeTechnologies) se diluyeron en medio Opti-MEM® I hasta un volumen total de 2,5 mL. Todas las diluciones se mezclaron suavemente y se incubaron durante no más de 5 minutos a temperatura ambiente antes de añadir cada disolución de ADN al respectivo reactivo ExpiFectamina™ 293 diluido para obtener un volumen total de 5 mL. Las mezclas de ADN-reactivo ExpiFectamina™ 293 se mezclaron suavemente y se incubaron durante 20-30 minutos a temperatura ambiente para permitir que se formaran los complejos de ADN-reactivo ExpiFectamina™ 293.

Después de que se completó la incubación del complejo de ADN-reactivo ExpiFectamina™ 293, se añadieron los 5 mL de complejo de ADN-reactivo ExpiFectamina™ 293 a cada matraz de agitación. Los matraces de agitación se incubaron en un incubador con agitación orbital (Multitron, Infors HT) a 120 rpm, CO2 al 8 % y 37 °C.

Aproximadamente 16-18 horas después de la transfección, se añadieron 250 pL de potenciador 1 de la transfección ExpiFectamina™ 293 (LifeTechnologies) y 2,5 mL de potenciador 2 de la transfección ExpiFectamina™ 293 (LifeTechnologies) a cada matraz de agitación.

Los cultivos celulares se recogieron 7 días después de la transfección. Las células se transfirieron a tubos de centrifugación de 50 mL (Falcon) y se centrifugaron durante 30 min a 4.000 rpm seguido de filtración estéril a través de un Stericup de 0,22 pm (Merck Millipore). Los sobrenadantes clarificados y filtrados estériles se almacenaron a 4 °C. Los niveles de expresión final se determinaron mediante Proteína G-HPLC.

Purificación a pequeña escala (50 ml): Tanto Fab-X como Fab-Y se purificaron por separado mediante captura por afinidad utilizando un sistema de purificación basado en vacío a pequeña escala. Brevemente, los 50 ml de sobrenadantes de cultivo se esterilizaron por filtración de 0,22 pm antes de que se añadieran 500 pL de perlas de Ni Sefarosa (GE Healthcare). La mezcla de perlas sobrenadantes se agitó entonces durante aproximadamente una hora antes de eliminar el sobrenadante aplicando vacío. Después, las perlas se lavaron con el lavado 1 (fosfato de sodio 50 mM, NaCl 1 M, pH 6,2) y el lavado 2 (NaCl 0,5 M). La elución se realizó con acetato de sodio 50 mM, pH 4,0 NaCl 1M. El tampón de las fracciones eluidas se intercambió en PBS (Sigma), pH 7,4 y se filtró 0,22 pm. Las combinaciones finales se ensayaron por escaneo A280, SE-UPLC (método BEH200), SDS-PAGE (reducido y no reducido) y para determinar endotoxinas usando el sistema PTS Endosafe.

Ensayos de cribado

Las PBMC de donantes se descongelaron rápidamente usando un baño de agua ajustado a 37 °C y se transfirieron cuidadosamente a un tubo Falcon de 50 ml. Después, se diluyeron gota a gota a 5 ml en medio de ensayo para minimizar el choque osmótico. A continuación, las células se diluyeron cuidadosamente a 20 ml antes de añadir el diluyente de medio final para hacer un volumen de 50 ml. A continuación, las células se centrifugaron a 500 g durante 5 minutos antes de eliminar el sobrenadante y resuspender las células en 1 ml de medio. A continuación, las células se contaron y se diluyeron a 1,66 x 106 células/ml antes de dispensar 30 gl por pocillo en una placa TC con fondo en V, lo que da una concentración de ensayo final de 5,0x104 células/pocillo. A continuación, la placa de células se almacenó cubierta en un incubador a 37 °C, CO2 al 5 % hasta que se requirieron, dándoles un mínimo de 1 hora de reposo.

Los reactivos Fab-X y Fab-Y se mezclaron en una relación equimolar a 5x la concentración final del ensayo en el medio de ensayo y se incubaron durante 90 min a 37 °C, CO2 al 5 %. Las muestras se prepararon en una placa de polipropileno con fondo en U de 96 pocillos y se cubrieron durante la incubación. Se añadieron 10 gl de mezcla 5x de Fab-KD-Fab a los pocillos de ensayo apropiados que contenían células y se mezclaron agitando a 1.000 rpm durante 30 segundos antes de incubarlos durante 90 minutos a 37 °C, CO2 al 5 %.

A continuación, las células se estimularon con 10 gl de anti-IgM humana. La concentración de estímulo del ensayo final varió dependiendo de las lecturas del panel de ensayo, las tres mezclas de anticuerpos A, B y C (detallados a continuación) se estimularon a una concentración de ensayo final de 50 gg/ml (mezcla A y C) o 25 gg/ml (mezcla B). Las placas de ensayo se mezclaron luego suavemente a 1.000 rpm durante 30 segundos antes de la incubación a 37 °C, CO2 al 5 % durante 5 min (mezcla de anticuerpos A y C) o 2 min (mezcla de anticuerpos B). El ensayo se detuvo añadiendo 150 gl de BD CytoFix enfriado con hielo a todos los pocillos y se incubó durante 15 min a TA. A continuación, las células fijadas se centrifugaron a 500 g durante 5 min para sedimentar las células y permitir la eliminación del sobrenadante usando un lavador de placas BioTek ELx405. El sedimento se resuspendió agitando la placa con vórtex a 2.400 rpm durante 30 segundos. A continuación, las células se permeabilizaron a 4 °C mediante la adición de 100 gl de tampón de permeabilización celular BD III enfriado con hielo durante 30 min. Después, las células se lavaron en 100 gl de tampón FACS y se centrifugaron a 500 g durante 5 min. El sobrenadante se eliminó de nuevo por el ELx405 antes de usarlo para dispensar rápidamente 200 gl de tampón FACS para eliminar por lavado cualquier tampón de permeabilización residual. Las células se centrifugaron de nuevo a 500 g y el sobrenadante se eliminó por inversión. Durante la etapa de centrifugado anterior, se preparó la mezcla de anticuerpos en tampón FACS y se mantuvo protegida de la luz. Después, las células se resuspendieron agitando con vórtex (2.400 RPM, 30 segundos) antes de que se añadieran 20 gl de mezcla de anticuerpos a todos los pocillos y se agitara la placa durante 30 segundos a 1.000 rpm. A continuación, las células se incubaron durante 60 min a TA en la oscuridad.

Las células se lavaron entonces dos veces en 200 gl de tampón FACS con un centrifugado de 500 g y se eliminó el sobrenadante después de cada etapa. Finalmente, las células se resuspendieron agitando con vórtex durante 30 segundos a 2.400 rpm antes de añadir 20 gl finales de tampón FACS. A continuación, se leyeron las placas en el instrumento Intellicyt HTFC/iQue.

Tampón FACS = PBS BSA al 1 % NaN3 al 0,05 % EDTA 2mM

Mezcla de anticuerpos A = 1:2 CD20 PerCp-Cy5.5 (BD Biosciences) 1:5 PLCy2 AF88 1:10 Akt AF647 1:50 ERK1/2 PE (diluido en tampón FACS).

Mezcla de anticuerpos B = 1:2 CD20 PerCp-Cy5.5 (BD Biosciences) 1:5 Syk PE 1:5 BLNK AF647 (diluido en tampón FACS)

Mezcla de anticuerpos C = 1:5 CD20 PerCp-Cy5.5 (Biolegend) 1:5 PLCy2 AF488 1:10 Akt AF647 1:5 Syk PE (diluido en tampón FACS)

Las combinaciones de Fab-X Fab-Y se cribaron con la mezcla de anticuerpos A y B o C solo. Todos los cribados se realizaron en células de conos de 2 donantes de sangre diferentes. Los datos se capturaron y evaluaron utilizando herramientas de software disponibles comercialmente. Se cribó un total de 2.500 combinaciones de Fab-X Fab-Y para 315 combinaciones de antígenos diferentes.

Resultados

Se calculó el porcentaje de inhibición de la inducción de la fosforilación de las proteínas de la cascada de la señalización de BCR por cada combinación de Fab-Kd-Fab [es decir, A-X:Y-B donde A y B son fragmentos Fab], en este ejemplo buscando nuevas combinaciones de antígenos que inhiban la función de las células B, el criterio para una combinación positiva se estableció como al menos un 30 % de inhibición de al menos dos lecturas de fosforilación por al menos una combinación de regiones V. Según este umbral, 11 nuevas combinaciones de pares de antígenos de las 315 examinadas cumplieron los criterios requeridos. Esto representa una tasa de aciertos del 3,5 % que demuestra la importancia de cribar un gran número de combinaciones para encontrar las que presentan la actividad deseada y lo rara que es la actividad de la combinación de CD79b y CD45.

Las Figuras 6-8 muestran los datos para las especificidades cruzadas de la cuadrícula de antígenos. Los valores son el porcentaje de inhibición (valor negativo para la activación) de la fosforilación de Syk, PLCy2 y AKT respectivamente y representan la media de múltiples combinaciones de regiones V evaluadas. Se ensayaron 315 combinaciones de antígenos diferentes y, como puede verse, el efecto sobre la señalización de BCR de las diferentes combinaciones de anticuerpos varió significativamente de una inhibición fuerte, p. ej., antígeno 2 (CD79b) en Fab-X combinado con antígeno 4 (CD45) en Fab-Y (70,4 % de inhibición de fosfo Syk Figura 6) a la activación, p. ej., antígeno 6 en X y antígeno 11 en Y (menos 118,10 % de fosfo Syk Figura 6 ).

Cada punto de datos que representa los valores de % medio representados en las Figuras 6-8 se muestra para la combinación de antígeno 2 (CD79b) en Fab-X y el antígeno 4 (CD45) en Fab-Y en la figura 9. En este caso, se evaluaron 10 combinaciones diferentes de diferentes regiones V de anticuerpos. La misma combinación de antígenos, pero en orientación alternativa, es decir, el antígeno 2 (CD79b) en Fab-Y y el antígeno 4 (CD45) en Fab-X, se muestra en la Figura 10. En este caso, se evaluaron 6 combinaciones diferentes de diferentes regiones V de anticuerpos. De nuevo, todas las regiones V muestran inhibición, pero las combinaciones óptimas de regiones V pueden identificarse y seleccionarse usando el método.

Ejemplo 7 - Cribado de regiones V expresadas transitoriamente para el antígeno CD45 como Fab-X con Fab-Y anti-CD79b purificado en complejos proteicos unidos heterodiméricamente para seleccionar regiones V óptimas de anticuerpos anti-CD45

Introducción: Se identificaron nuevas regiones V para CD45 que inhiben la señalización de células B como un anticuerpo biespecífico en combinación con regiones V específicas de CD79b utilizando el cribado en cuadrícula de complejos proteicos unidos heterodiméricamente. Las regiones V de CD45 se expresaron transitoriamente como Fab-X y se combinaron con Fab-Y anti-CD79b purificado. Se midió la inhibición de la activación de la señalización de las células B para seleccionar las regiones V anti-CD45 y anti-CD79b más potentes.

La preparación de células que expresan antígenos y la inmunización de conejos se llevó a cabo de la misma forma como se describe en el Ejemplo 6.

Descubrimiento de anticuerpos: Los cultivos de células B se prepararon de la misma manera como se describe en el Ejemplo 6.

El cribado de anticuerpos específicos de antígeno en sobrenadantes de cultivos de células B y la etapa de deconvolución para la identificación de células B específicas de antígeno se determinaron de la misma manera como en el Ejemplo 6.

Los genes de la región variable del anticuerpo se recuperaron de células individuales mediante transcripción inversa (RT)-PCR utilizando cebadores específicos de región variable de cadena ligera y pesada. Se realizaron dos rondas de PCR, con la 2° PCR anidada incorporando sitios de restricción en los extremos 3' y 5' permitiendo la clonación de la región variable en el vector de expresión de mamífero Fab-X de ratón y kappa (VL) de ratón. A continuación, estos vectores se cotransfectaron en células HEK-293 usando 293Fectina (Life Technologies) o en células Expi293 usando Expifectamina (Life Technologies) y se dejaron expresar durante 6 días. Los sobrenadantes se ensayaron en un ensayo de unión homogéneo basado en fluorescencia en células HEK293 transfectadas con antígeno y perlas Superavidin™ (Bangs Laboratories) recubiertas con proteína recombinante o células HEK transfectadas con antígeno. Esto se hizo para confirmar la especificidad de los anticuerpos clonados.

Además de los sobrenadantes transitorios de Fab-X, se prepararon sobrenadantes simulados de control negativo de la misma manera utilizando un ADN de control irrelevante.

Los niveles de expresión de Fab-X se determinaron mediante Proteína G-HPLC.

Producción de Fab-X y Fab-Y purificados; Se prepararon Fab-X y Fab-Y purificados usando el mismo método descrito en el Ejemplo 6.

Ensayo PhosFlow; Se incubaron Fab-Y específico para CD79b y Fab-X específico para CD45, ya sea purificado o en sobrenadante transitorio, juntos durante 60 minutos (en un ambiente de 37 °C y CO2 al 5 %) a una concentración equimolar de 200 nM y 90 nM. También se incluyó un sobrenadante simulado puro. En placas de 96 pocillos con fondo en V, se añadieron 5,0 x 104 PBMC a los pocillos, a los que se añadieron combinaciones de Fab-X y Fab-Y tituladas o sobrenadante simulado. A continuación, las combinaciones y las células se incubaron juntas durante 90 minutos más. Pasado este tiempo, las células B se activaron mediante la adición de 25 pg/mL de F(ab')2 anti-IgM humana de cabra (Southern Biotechnology) durante 15 minutos a 37 °C más CO2 al 5 %. A continuación, se detuvo la reacción de señalización añadiendo un volumen igual de tampón Cytofix (BD Biosciences). A continuación, las placas se dejaron a temperatura ambiente durante 15 minutos antes de la centrifugación a 500 xg durante 5 minutos. El exceso de sobrenadante se descartó del sedimento celular que se resuspendió en tampón FACS (PBS BSA al 1 % NaN3 al 0,01 % EDTA 2 mM) y se lavó una vez más. A continuación, las células se resuspendieron en tampón Perm III (BD Biosciences) enfriado con hielo durante 30 minutos antes de lavarlas dos veces en tampón de flujo.

Después, las células se tiñeron como se describe en el Ejemplo 6, excepto que, en lugar de 3 mezclas de anticuerpos diferentes, solo se usó una mezcla con las mismas concentraciones de ensayo y condiciones de incubación que se describen para la mezcla A de anticuerpos en el Ejemplo 6.

Mezcla de anticuerpos = 1:3 CD20 PerCp-Cy5.5 1:5 PLCy2 AF88 1:10 Akt AF647 1:5 p38 MAPK PE (diluido en tampón FACS).

Resultados

Como se puede ver en las Figuras 11 a 16, los datos muestran que la combinación de diferentes regiones V de antígeno CD45 expresadas de forma transitoria en Fab-X con 2 regiones V diferentes de antígeno CD79b purificado (VR447 y VR4450) en Fab-Y puede inhibir la activación de células B (medido por inhibición de PLCy2, p38 y Akt) a diferentes niveles y el cribado en un formato biespecífico facilita por lo tanto la selección de combinaciones óptimas de la región V. Las combinaciones con Fab-X transitorio se comparan con una combinación de referencia con un Fab-X CD45 purificado (VR4122).

Ejemplo 8 -Efecto del codireccionamiento del antígeno CD79b más el antígeno CD45 sobre la función de las células B de memoria usando Bybes biespecíficos unidos molecularmente con o sin la adición adicional de un anti-albúmina.

Introducción; Para comprobar que el direccionamiento de CD79b/CD45 tiene un efecto funcional sobre las células B en un cultivo a largo plazo, se midió la producción de IgG de las células B en un cultivo mixto de PBMC. La medición de anticuerpos específicos para la memoria inmunológica del antígeno toxoide tetánico proporciona una lectura de la función de las células B de memoria.

La especificidad del antígeno CD79b (VR4447) y la especificidad del antígeno CD45 (VR4248 y VR4133) se generaron en un formato BYbe con o sin la adición de un fragmento anti-albúmina (VR0645). El fragmento de anticuerpo anti albúmina se fusionó con la cadena ligera del antígeno CD45 Fab del formato BYbe como se describe en el Ejemplo 8.

Descripción de las construcciones utilizadas en este experimento.

Claims

REIVINDICACIONES

1. La molécula multiespecífica que comprende un dominio de unión específico para el antígeno CD45 y un dominio de unión específico para el antígeno CD79a y/o CD79b.

2. La molécula multiespecífica según la reivindicación 1, en donde el dominio de unión o los dominios de unión comprenden una región variable de anticuerpo específica para el antígeno relevante.

3. La molécula multiespecífica según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde cada dominio de unión comprende dos dominios variables de anticuerpo, preferiblemente un par VH/VL.

4. La molécula multiespecífica según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde la molécula es biespecífica o triespecífica.

5. Una molécula multiespecífica según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde la molécula es (i) una proteína de fusión o

(ii) se selecciona de diacuerpo, scdiacuerpo, triacuerpo, tándem scFv, FabFv, Fab'Fv, FabdsFv, Fab-scFv, FabdsscFv, Fab-(dsscFv)2 diFab, diFab', tricuerpo, tándem scFv-Fc, scFv-Fc-scFv, scdiacuerpo-Fc, scdiacuerpo-CH3, IgscFv, scFv-Ig, V-Ig, Ig-V, Duocuerpo y DVD-Ig.

6. La molécula multiespecífica según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde

(i) cada dominio de unión es monoespecífico; y/o

(ii) la molécula multiespecífica comprende no más de un dominio de unión que es específico para CD45 y no más de un dominio de unión que es específico para CD79a y/o CD79b; o

(iii) el dominio de unión que es específico para CD45 y el dominio de unión que es específico para CD79a y/o CD79b se seleccionan independientemente de Fab, scFv, Fv, dsFv y dsscFv.

7. La molécula multiespecífica según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde el dominio de unión específico para CD79b comprende 3 CDR de cadena pesada que tienen la secuencia dada en

(i) SEQ ID NO: 78 para CDRH1, SEQ ID NO: 79 para CDRH2 y SEQ ID NO: 80 para CDRH3; o

(ii) SEQ ID NO: 88 para CDRH1, SEQ ID NO: 89 para CDRH2 y SEQ ID NO: 90 para CDRH3; y

en donde el dominio de unión específico para CD79b comprende 3 CDR de cadena ligera que tienen la secuencia dada en

(iii) SEQ ID NO: 75 para CDRL1, SEQ ID NO: 76 para CDRL2 y SEQ ID NO: 77 para CDRL3; o

(iv) SEQ ID NO: 85 para CDRL1, SEQ ID NO: 86 para CDRL2 y SEQ ID NO: 87 para CDRL3.

8. Una molécula multiespecífica según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde el dominio de unión específico para CD45 comprende 3 CDR de cadena pesada que tienen la secuencia dada en

(i) SEQ ID NO: 98 para CDRH1, SEQ ID NO: 99 para CDRH2 y SEQ ID NO: 100 para CDRH3; o

(ii) SEQ ID NO: 108 para CDRH1, SEQ ID NO: 109 para CDRH2 y SEQ ID NO: 110 para CDRH3; o

(iii) SEQ ID NO: 118 para CDRH1, SEQ ID NO: 119 para CDRH2 y SEQ ID NO: 120 para CDRH3; o

(iv) SEQ ID NO: 128 para CDRH1, SEQ ID NO: 129 para CDRH2 y SEQ ID NO: 130 para CDRH3; y

en donde el dominio de unión específico para CD45 comprende 3 CDR de cadena ligera que tienen la secuencia dada en

(v) SEQ ID NO: 95 para CDRL1, SEQ ID NO: 96 para CDRL2 y SEQ ID NO: 97 para CDRL3; o

(vi) SEQ ID NO: 105 para CDRL1, SEQ ID NO: 106 para CDRL2 y SEQ ID NO: 107 para CDRL3; o

(vii) SEQ ID NO: 115 para CDRL1, SEQ ID NO: 116 para CDRL2 y SEQ ID NO: 117 para CDRL3; o

(viii) SEQ ID NO: 125 para CDRL1, SEQ ID NO: 126 para CDRL2 y SEQ ID NO: 127 para CDRL3.

9. La molécula multiespecífica según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en la que los dominios de unión están humanizados.

10. La molécula multiespecífica según las reivindicaciones 8 o 9 en donde

(i) uno o más residuos de cisteína se han sustituido por otro aminoácido; y/o

(ii) uno o más sitios de isomerización del ácido aspártico y/o sitios de desamidación de asparagina y/o sitios de glicosilación se han eliminado sustituyendo uno o más aminoácidos en una o más CDR.

11. La molécula multiespecífica según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, que comprende además un dominio de unión específico para la albúmina de suero, tal como albúmina de suero humano.

12. Una composición que comprende una o más moléculas multiespecíficas como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11.

13. Una secuencia de nucleótidos que codifica una molécula multiespecífica o un componente de la misma como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11.

14. Un vector que comprende una secuencia de nucleótidos definida en la reivindicación 13.

15. Una molécula multiespecífica según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 o una composición según la reivindicación 12, para su uso en terapia.