ES2822084T3

ES2822084T3 - Anticuerpo antirreceptor alfa del factor de crecimiento derivado de plaquetas canino

Info

Publication number: ES2822084T3
Application number: ES17748985T
Authority: ES
Inventors: Douglas Bryan Burtrum; Dale Lincoln Ludwig; Juqun Shen; Cheng Wang
Original assignee: Elanco US Inc
Current assignee: Elanco US Inc
Priority date: 2016-07-28
Filing date: 2017-07-20
Publication date: 2021-04-29
Anticipated expiration: 2037-07-20
Also published as: WO2018022407A1; EP3491021A1; US20190300612A1; JP6374122B1; EP3491021B1; JP2018527294A; US10711066B2; CA3031724C; AU2017302460A1; NZ749159A; CA3031724A1; AU2017302460B2

Abstract

Un anticuerpo monoclonal que se une al receptor alfa del factor de crecimiento derivado de plaquetas canino (cPDGFRA) que comprende una región variable de cadena ligera (LCVR) y una región variable de cadena pesada (HCVR), en el que la LCVR comprende las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) LCDR1, LCDR2 y LCDR3, y la HCVR comprende las CDR HCDR1, HCDR2 y HCDR3, en el que la secuencia de aminoácidos de LCDR1 aparece en SEQ ID NO:16, la secuencia de aminoácidos de LCDR2 aparece en SEQ ID NO:18, la secuencia de aminoácidos de LCDR3 aparece en SEQ ID NO:20, la secuencia de aminoácidos de HCDR1 aparece en SEQ ID NO:6, la secuencia de aminoácidos de HCDR2 aparece en SEQ ID NO:8, y la secuencia de aminoácidos de HCDR3 aparece en SEQ ID NO:10.

Description

DESCRIPCIÓN

Anticuerpo antirreceptor alfa del factor de crecimiento derivado de plaquetas canino

La presente invención se dirige al campo de la inmunología y del tratamiento del cáncer. De modo más específico, la presente invención se refiere a anticuerpos antirreceptor alfa del factor de crecimiento derivado de plaquetas canino ("anti-canine platelet derived growth factor receptor alpha", cPDGFRA) contra el cPDGFRA y a métodos de uso para tratar ciertos trastornos, tales como el osteosarcoma (OSA) en perros.

Los sarcomas son un tipo diverso y relativamente poco frecuente de cáncer que habitualmente se desarrolla en el tejido conectivo del cuerpo, que incluye grasa, vasos sanguíneos, nervios, huesos, músculos, tejidos, capas profundas de la piel y cartílago. El OSA representa aproximadamente 5% de todos los cánceres en perros, pero es la forma más común de tumor de hueso canino. El OSA se produce, con mayor frecuencia, en perros de raza grandes y gigantes, generalmente en animales de mediana edad o ancianos. Se considera una forma muy agresiva de cáncer y más del 90% de los casos clínicamente significativos ya tienen micrometástasis en el momento del diagnóstico. En los perros, las opciones de tratamiento incluyen radiación y/o quimioterapia, y la amputación de la extremidad. La mediana del tiempo de supervivencia con diversos regímenes de quimioterapia es de aproximadamente un año, mientras que la supervivencia con solo amputación es de aproximadamente tres meses. Por desgracia, un tratamiento eficaz para el osteosarcoma canino sigue siendo difícil de conseguir y son necesarias más terapias diferentes que puedan ser eficaces en su tratamiento.

El PDGFRA es un receptor de tirosina quinasa que está sobreexpresado en 70-80% de OSA humanos y puede ser una diana adecuada para la terapia de anticuerpos monoclonales anti-PDGFRA. Debido a que el OSA canino muestra características histopatológicas y clínicas similares al OSA humano, el cPDGFRA también puede ser una diana terapéutica adecuada para el OSA en perros. Se ha demostrado, en estudios inmunohistoquímicos (IHC), que cPDGFRA se expresa en 78% de los casos evaluados. Además, se ha demostrado que su ligando, PDGFA canino, se expresa en 42% de los casos (Maniscalco, et al., Vet. J., 2013, 195:41).

El olaratumab (también denominado IMC-3G3) es un anticuerpo monoclonal de IgG1 totalmente humano dirigido contra PDGFRA humano con una actividad antineoplásica potencial. Pueden encontrarse tratamientos con éxito de sarcomas de tejidos blandos utilizando olaratumab en la publicación internacional n.° WO2016/003789, por ejemplo. El olaratumab se une selectivamente a PDGFRA humano, bloqueando la unión de su ligando, PDGF. Se inhibe la transducción de señales corriente abajo de PDGFR a través de las vías de MAPK y PI3K, lo cual puede dar como resultado la inhibición de la angiogénesis y de la proliferación de células tumorales.

Puesto que olaratumab es un anticuerpo monoclonal totalmente humano, la administración crónica de olaratumab, o de cualquier otro anticuerpo totalmente humano, a perros probablemente provocaría el desarrollo de anticuerpos antifármaco que conducirían a respuestas inmunológicas cada vez más potentes después de cada tratamiento posterior del paciente canino con olaratumab.

Por consiguiente, la presente invención proporciona un anticuerpo monoclonal que se une al receptor alfa del factor de crecimiento derivado de plaquetas canino (cPDGFRA) y que tiene una región variable de cadena ligera ("light chain variable region", LCVR) y una región variable de cadena pesada ("heavy chain variable region", HCVR), en el que la LCVR comprende las regiones determinantes de la complementariedad ("complementarity determining regions", CDR) LCDR1, LCDR2y LCDR3, y la HCVR comprende las CDR HCDR1, HCDR2 y HCDR3, en el que la secuencia de aminoácidos de LCDR1 aparece en SEQ ID NO:16, la secuencia de aminoácidos de LCDR2 aparece en SEQ ID NO:18, la secuencia de aminoácidos de LCDR3 aparece en SEQ ID NO:20, la secuencia de aminoácidos de HCDR1 aparece en SEQ ID NO:6, la secuencia de aminoácidos de HCDR2 aparece en SEQ ID NO:8, y la secuencia de aminoácidos de HCDR3 aparece en SEQ ID NO:10.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un anticuerpo monoclonal que tiene una región variable de cadena ligera (LCVR) y una región variable de cadena pesada (HCVR), en el que la secuencia de aminoácidos de la LCVR aparece en SEQ ID NO:14, y la secuencia de aminoácidos de la HCVR aparece en SEQ ID NO:4.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un anticuerpo monoclonal que tiene una cadena ligera ("light chain", LC) y una cadena pesada ("heavy chain", HC), en el que la secuencia de aminoácidos de la LC aparece en SEQ ID NO:12, y la secuencia de aminoácidos de la HC aparece en SEQ ID NO:1.

En un aspecto, la presente invención describe anticuerpos anti-cPDGFRA de la invención para su uso en terapia. En otro aspecto, la presente invención describe anticuerpos anti-cPDGFRA de la invención para su uso en el tratamiento del osteosarcoma en un paciente canino.

En otro aspecto, la presente invención se refiere además al uso de un anticuerpo de la invención en la fabricación de un medicamento para el tratamiento del osteosarcoma en un paciente canino.

A menos que se indique lo contrario, el término "anticuerpo" (Ab) se refiere a una molécula de inmunoglobulina que comprende dos cadenas pesadas (HC) y dos cadenas ligeras (LC) interconectadas por enlaces disulfuro. La porción amino-terminal de cada cadena incluye una región variable de aproximadamente 100 a aproximadamente 110 aminoácidos principalmente responsable del reconocimiento del antígeno a través de las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) contenidas en ella. La porción carboxi-terminal de cada cadena define una región constante principalmente responsable de la función efectora.

Tal como se emplean en la presente, la expresión "región determinante de la complementariedad" y el término "CDR" se refieren a sitios de combinación con el antígeno no contiguos que se encuentran dentro de la región variables de polipéptidos de LC y HC de un anticuerpo, o uno de sus fragmentos de unión al antígeno.

Tal como se emplea en la presente, la expresión "región variable de cadena ligera" (LCVR) se refiere a una porción de una LC de una molécula de anticuerpo que incluye secuencias de aminoácidos de regiones determinantes de la complementariedad (CDR; concretamente, LCDR1, LCDR2 y LCDR3), y regiones de marco ligeras ("Light Framework Regions", LFRW).

Tal como se emplea en la presente, la expresión "región variable de cadena pesada (HCVR)" se refiere a una porción de una HC de una molécula de anticuerpo que incluye secuencias de aminoácidos de regiones determinantes de la complementariedad (CDR; concretamente, HCDR1, HCDR2 y HCDR3), y regiones de marco pesadas ("Heavy Framework Regions", HFRW).

Las CDR están intercaladas con regiones que están más conservadas, denominadas regiones de marco ("framework regions", "FRW"). Cada LCVR y HCVR está compuesta por tres CDR y cuatro FRW, dispuestas desde el amino-terminal hasta el carboxi-terminal en el siguiente orden: FRW1, CDR1, FRW2, CDR2, FRW3, CDR3, FRW4. Las tres CDR de la cadena ligera se denominan "LCDR1, LCDR2 y LCDR3", y las tres CDR de la HC se denominan "HCDR1, HCDR2 y HCDR3". Las CDR contienen la mayoría de los restos que forman interacciones específicas con el antígeno. La numeración y la posición de los restos aminoácidos de las CDR dentro de las regiones LCVR y HCVR está de acuerdo con convenciones conocidas (por ejemplo, Kabat (1991), Chothia (1987) y/o North (2011)). En diferentes realizaciones de la descripción, las FRW del anticuerpo pueden ser idénticas a las secuencias de la línea germinal, o puede estar modificadas en la naturaleza o ser modificadas de modo artificial. En ciertas realizaciones, el Ab anti-cPDGFRA Ab de la presente descripción se altera para aumentar o disminuir el grado en que el anticuerpo está glicosilado. La adición o la deleción de sitios de glicosilación a un anticuerpo puede realizarse, de modo conveniente, alterando la secuencia de aminoácidos de modo que se crean o se retiran uno o más sitios de glicosilación.

Tal como se emplea en la presente, el término "olaratumab" se refiere a un anticuerpo monoclonal de IgG1 totalmente humano dirigido contra PDGFR humano, PDGFRA humano y/o heterodímeros de PDGRFA/PDGFRB humanos. El olaratumab también se puede denominar en la presente "olaratumab humano". Tal como se emplea en la presente, la secuencia de aminoácidos de la HC de olaratumab se representa en SEQ ID NO:26, y la secuencia de aminoácidos de la LC de olaratumab se representa en SEQ ID NO:28. Las secuencias de nucleótidos que codifican las secuencias de aminoácidos de HC y LC de olaratumab son SEQ ID NO:27 y SEQ ID NO:28, respectivamente.

Tal como se emplea en la presente, el término "kit" se refiere a un envase que comprende al menos dos recipientes distintos, en el que un primer recipiente contiene un Ab K9-6N6.2 y un segundo recipiente contiene vehículos, diluyentes o excipientes farmacéuticamente aceptables. Tal como se emplea en la presente, el término "kit" también se refiere a un envase que comprende al menos dos recipientes distintos, en el que un primer recipiente contiene el Ab K9-6N6.2, y otro anticuerpo preferiblemente para el tratamiento de cánceres distintos de linfomas. Un "kit" también puede incluir instrucciones para administrar todo o parte del contenido de estos primer y segundo recipientes a un paciente con cáncer. Opcionalmente, estos kits también incluyen un tercer recipiente que contiene una composición que comprende un agente quimioterapéutico conocido.

Tal como se emplea en la presente, los términos "tratar" o "tratamiento" se refieren a contener, frenar, detener, reducir o revertir el avance o la gravedad de un síntoma, trastorno, afección o enfermedad existente.

Tal como se emplea en la presente, la expresión "cantidad eficaz" se refiere a la cantidad o la dosis de un Ab anticPDGFRA que, tras la administración de una dosis individual o de múltiples dosis al paciente, proporciona una respuesta eficaz en el paciente que se está diagnosticando o tratando.

Una cantidad eficaz puede determinarse con facilidad mediante el uso de técnicas conocidos y mediante la observación de los resultados obtenidos bajo circunstancias análogas. Para determinar la cantidad eficaz para un paciente, se consideran una serie de factores que incluyen, pero no se limitan a: la especie o la raza del paciente; su tamaño, edad y salud general; la enfermedad o el trastorno específico implicado; el grado o la implicación o la gravedad de la enfermedad o el trastorno; la respuesta del paciente individual; el compuesto concreto administrado; el modo de administración; las características de biodisponibilidad de la preparación administrada; el régimen de dosis seleccionado; el uso de una medicación concomitante; y otras circunstancias pertinentes.

Un anticuerpo anti-cPDGFRA

Se creó un anticuerpo anti-cPDGFRA denominado K9-6N6.1 mediante la clonación de la HCVR completa de olaratumab (SEQ ID NO:31) dentro de marco de la región constante de cadena pesada de IgB canina (GENBANK: AAL35302) para generar una única secuencia de ADNc (SEQ ID NO:23). Además, la LCVR completa (SEQ ID NO:33) de olaratumab se clonó dentro de marco de la región constante de cadena ligera Kappa canina (GENBANK: E02906.1) para generar una única secuencia de ADNc (SEQ ID NO:25).

K9-6N6.1 contiene regiones variables idénticas a las del olaratumab totalmente humano. Tal como se muestra en la tabla 1, el olaratumab y K9-6N6.1 se unen a cPDGFRA con una afinidad que es aproximadamente 10 veces menor que la unión del olaratumab al PDGFRA humano.

Tabla 1. Afinidad de unión entre especies de los anticuerpos anti-cPDGFRA K9-6N6.1 de origen y humano

Mutagénesis de alta capacidad de procesamiento

Se realizaron experimentos de mutagénesis para generar anticuerpos derivados de K9-6N6.1. Se generaron oligonucleótidos mutagénicos usando un molde de diseño Excel (truncamiento 5') en un formato de 96 pocillos y adquirido en Integrated DNA Technologies. La mutagénesis se realizó usando un protocolo de reacción de Quick Change optimizado. Brevemente, cada pocillo (reacción de mutagénesis) de una placa de 96 pocillos contenía ADN de vector enzimáticamente digerido para la expresión de HC o LC de K9-6N6.1, KOD Hotstart polimerasa, MgSO4, dNTP y diferentes cebadores para la generación de mutaciones puntuales. La placa se colocó en una máquina de PCR con el siguiente programa: 95 °C durante 2 minutos, seguido de 20 ciclos a 95 °C, 20 s; 60 °C, 10 s; 68 °C, 4 min, y después una extensión final a 68 °C durante 5 minutos. Después de la PCR, se añadieron 2 pl de la enzima de restricción Dpnl y tampón de reacción a la reacción de PCR y se incubó a 37 °C durante 16 horas, seguido de una incubación a 70 °C durante 30 min para inactivar la Dpnl. Después se transformó 1 pl de ADN en 10G de células bacterianas químicamente competentes (Lucigen). El ADN procedente de la placa de 96 pocillos se preparó usando un kit de preparación de ADN de 96 pocillos de Qiagen y se sometió a un análisis de secuencia de ADN.

Se generó un total de 210 mutaciones puntuales individuales. La eficacia de la mutagénesis se controló mediante un análisis de la secuencia de ADN en pocillos seleccionados aleatoriamente. Entre los 23 pocillos seleccionados, 3 pocillos (13%) presentaban una tasa de incorporación de la mutación deseada menor que 75% (37-65%). El resto de los pocillos mostró unas tasas de incorporación de las mutaciones deseadas del 75 al 100%.

Expresión en pocillos profundos de mutantes individuales y agrupaciones

Se preparó ADN procedente de bacterias transformadas con reacciones de mutagénesis agrupadas o ADN procedente de clones individuales confirmados mediante análisis de secuencia. Se inocularon células bacterianas y se propagaron durante la noche. El ADN se preparó usando el kit DirectPrep 96 MiniPrep Kit (Qiagen, n.° de catálogo 27361) siguiendo las instrucciones del fabricante. Tras la confirmación de la secuencia, se usó el ADN de las agrupaciones o de los clones individuales para cotransfectar células Expi293 con la HC o LC del K9-6N6.1 de origen. Se realizó la expresión de las moléculas de IgG resultantes en placas de pocillos profundos.

Enriquecimiento con PhyNexus de columnas de puntas

Seis días después de la transfección y el posterior crecimiento de las células, se recogieron los sobrenadantes de los cultivos celulares. Los anticuerpos en los sobrenadantes del cultivo se enriquecieron con columnas PhyNexus ProA Phytip usando un sistema de manipulación de líquidos automático BioMek. Los sobrenadantes de los anticuerpos se cargaron en las columnas y se capturaron en una resina de proteína A. Después de lavar dos veces con PBS, los anticuerpos se eluyeron de la columna con 90 pl de glicina-HCl 0,1 M (pH 2,7), y se neutralizaron con 10 pl de tampón Tris-HCl (pH 8,0). Se determinaron las concentraciones de anticuerpo mediante Octet en un detector ProA usando un patrón de anticuerpo de concentración conocida.

Selección preliminar

Todos los 210 mutantes procedentes de la transfección agrupada y el K9-6N6.1 de origen se evaluaron para la unión y el bloqueo usando ELISA de puntos individuales. Algunos de los variantes enriquecidos procedentes de la mutagénesis agrupada mostraron una mayor unión y actividad de bloqueo, mientras que otros mostraron una unión reducida a cPDGFRA comparado con el K9-6N6.1 de origen. A partir de los variantes que muestran una interacción mejorada con el receptor de perro, se seleccionaron 54 clones para la posterior evaluación usando ensayos de titulación para la unión y el bloqueo.

Confirmación de la actividad de unión y bloqueo

En la evaluación de la unión, se añadieron variantes de K9-6N6.1 diluidos en serie (enriquecidos o purificados) y el anticuerpo de origen a placas revestidas con cPDGFRA-Fc (100 gl a 0,5 gg/ml), y se incubaron a temperatura ambiente durante 1 hora. Para evaluar el bloqueo de la interacción con el ligando, se mezclaron variantes diluidos en serie de K9-6N6.1 (enriquecidos o purificados) y el anticuerpo K9-6N6.1 de origen con una cantidad fijada de cPDGFRA biotinilado (0,0625 gg/ml) y se incubó a temperatura ambiente durante 1 hora. La mezcla se trasladó a placas de 96 pocillos prerrevestidas con PDGFAA canino (0,125 gg/ml) y se incubaron a temperatura ambiente durante 2 horas. Después las placas se lavaron, se añadieron anticuerpos de detección, y se determinó la cantidad de unión como se describió anteriormente.

Para la evaluación de la unión y el bloqueo usando olaratumab, se modificaron los anteriores métodos. En el ELISA de unión, las placas se revistieron con 100 gl de PDGFRA humano a 1 gg/ml, y se usó HRP-proteína L (GenScript) para la detección. En el ensayo de bloqueo, se usó PDGFRA humano 0,5 gg/ml y PDGFAA 0,5 gg/ml. Se detectó el PDGFRA humano unido a la placa con un anticuerpo anti-PDGFRA humano biotinilado (R&D).

Selección de los mutantes usando ensayos de unión y de bloqueo (ELISA de puntos individuales)

Los variantes procedentes de la mutagénesis se seleccionaron inicialmente usando un ELISA de puntos individuales. En el ensayo de unión, se añadieron 0,5 gg/ml de anticuerpo enriquecido, bien variantes de K9-6N6.1 o bien el anticuerpo K9-6N6.1 de origen, a placas revestidas con cPDGFRA (100 gl a 0,5 gg/ml) y se incubaron a temperatura ambiente durante 1 hora. Las placas se lavaron tres veces con disolución salina tamponada con fosfato con Tween® (PBST), y después se incubaron a temperatura ambiente durante una hora más con un conjugado de anticuerpo anti-Fab canino de cabra/peroxidasa de rábano (HRP) (Sigma). Después de lavar tres veces con PBST, se añadió sustrato de tetrametilbencidina (TMB) peroxidasa a la placa. Se leyó la absorbancia a 450 nm usando un lector de microplacas.

En el ensayo de bloqueo, primero se mezclaron 15 gg/ml de los variantes enriquecidos o el anticuerpo de origen con una cantidad fijada de cPDGFRA biotinilado (0,0625 gg/ml) y se incubó a temperatura ambiente durante 1 hora. La mezcla se trasladó a placas de 96 pocillos prerrevestidas con PDGFAA canino (0,125 gg/ml) y se incubaron a temperatura ambiente durante 2 horas. Después de lavar tres veces con PBST, las placas se incubaron con estreptavidina conjugada con HRP durante 1 hora. Después las placas se lavaron y se revelaron como se describió anteriormente.

Identificación de las mutaciones beneficiosas

Los resultados de la unión y del bloqueo se analizaron y se calcularon los valores de CE50 (unión) y CI50 (bloqueo). Para calcular la mejora de cada variante mutante frente a la molécula de K9-6N6.1 de origen, se calculó la mejora en número de veces como la CE50 o CI50 del origen dividida entre la CE50 o CI50 del variante.

Tal como se muestra en la tabla 2, entre los variantes, HC-Y100D (clon 1F12) mostró una mejora en casi 17 veces en el bloqueo de la unión de PDGF-AA canino a cPDGFRA, pero no se detectó unión a PDGFRA humano. Sin embargo, una mutación en la LC, S28A (2A2), mostró una mejora en 13 veces en la actividad de bloqueo, comparada con el anticuerpo de origen, al mismo tiempo que conserva la unión a PDGFRA humano y cPDGFRA. LC-S28A (clon 2A2) es una mutación que mejora la unión a PDGFRA. La mejora inesperada en las actividades de unión y de bloqueo de HC-Y100D (1F12) y LC-S28A (2A2) se confirmó usando clones individuales.

Tabla 2. Caracterización de variantes de afinidad seleccionados para la actividad de unión y bloqueo de PDGFRA

Combinación de HC-Y100D y LC-S28A

Las cadenas pesada y ligera de los variantes de K9-6N6.1 HC-Y100D y LC-S28A se coexpresaron para determinar el impacto sobre la unión y el bloqueo de la combinación de las dos mutaciones. Brevemente, el vector de expresión de HC con HC-Y100D (1F12) se cotransfectó en células HEK293 con el vector de expresión de LC que contiene la mutación S28A (2A2). La proteína se purificó usando una columna ProA y se evaluó en ensayos de unión y de bloqueo. La CI50 del anticuerpo de combinación de HC-Y100D y LC-S28A (clon 1F12-2A2) indicó una mejora adicional en dos veces frente a 1F12.

Evaluación de la afinidad

Se midió la cinética de unión de variantes de K9-6N6.1 seleccionados a cPDGFRA usando un instrumento BIAcore T200 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ). Brevemente, una proteína de fusión de Fc-dominio extracelular de cPDGFRA ("extracellular domain", ECD) se inmovilizó sobre un chip detector y el anticuerpo se inyectó a diversas concentraciones. Se obtuvieron sensogramas a cada concentración y se evaluaron usando el programa BIA Evaluation 3.0 para determinar las constantes de velocidad. La constante de afinidad (KD) se calculó a partir de la proporción de las constantes de velocidad Koff/Kon. La evaluación se realizó a 25 °C. Tal como se muestra en la tabla 3, la evaluación cinética demostró que las afinidades globales mejoran frente al K9-6N6.1 de origen, en 5 veces para 1F12 (Y100D) y en 12 veces para 1F12-2A2 (Y100D y S28A).

Tabla 3. Afinidad de unión por resonancia de plasmón de superficie ("Surface Plasmon Resonance", SPR) del K9-6N6.1 de origen y variantes de afinidad potenciada a PDGFRA canino

Eliminación del sitio de desamidación en K9-6N6.1

La secuencia de aminoácidos de la porción IgG-B de K9-6N6.1 contiene un resto asparagina en la posición 232 que está seguido de glicina, un resto pequeño y flexible (G233). El apareamiento de NG en regiones expuestas de proteínas a menudo produce unos niveles elevados de desamidación. La evaluación biofísica de K9-6N6.1 reveló que aproximadamente 20% del anticuerpo generado sufre la desamidación de N232 (asparagina 232) en la región bisagra del anticuerpo.

Para eliminar la aparición de una desamidación de K9-6N6.1, se usó la mutagénesis específica dirigida a sitio para reemplazar N232 por ácido aspártico (D), serina (S), o glutamina (Q). Las sustituciones se basan en la similitud de la cadena lateral con la de la asparagina, e incluyen consideraciones de tamaño, polaridad y tipo. Se usó un protocolo de mutagénesis convencional. Las mutaciones se confirmaron mediante secuenciación de ADN. Los anticuerpos mutados se expresaron usando células HEK293 transfectadas de modo transitorio y se purificaron con columnas de proteína A. Después las proteínas purificadas se evaluaron usando ensayos de unión y de bloqueo (ELISA) y los resultados se compararon con el K9-6N6.1 de origen como control.

Selección de N232S

Tal como se muestra en la tabla 4, los tres variantes de N232 conservan la actividad de unión y de bloqueo del K9-6N6.1 de origen, con unos valores de CE50 que varían de 0,19 a 0,21 nM y unos valores de CI50 que varían de 27 a 36 nM. Además, se usó una qPCR (reacción en cadena con polimerasa cuantitativa) para evaluar la termoestabilidad de los anticuerpos mutados. Los resultados demuestran que la termoestabilidad de los tres variantes no cambia con relación al K9-6N6.1 de origen. La serina es menos propensa a sufrir una modificación postraduccional que el ácido aspártico y la glutamina. Se seleccionó la serina como reemplazo para la asparagina en la posición 232.

Tabla 4. Caracterización de los variantes de desamidación de K9-6N6.1

Eliminación del sitio de glicosilación N-enlazado en K9-6N6.1

Las células de mamífero son capaces de generar modificaciones postraduccionales en anticuerpos, y estas incluyen la glicosilación, generalmente en sitios N- u O-enlazados. A menudo, la secuencia N-x-S/T es un sitio en que se produce glicosilación a través de una modificación postraduccional. Para anticuerpos monoclonales, generalmente solo existe un único sitio N-enlazado dentro de la región CH2 de la región constante de cadena pesada (generalmente en N297 para IgG humanas). Para anticuerpos monoclonales, la presencia y el contenido de esta glicosilación N-enlazada puede contribuir a su capacidad para unirse a receptores de Fc y mediar en la función efectora inmunológica. Como resultado del proceso de producción en células cultivadas, el grado y el contenido de glicanos añadidos a los sitios N-enlazados puede variar y contribuye a la heterogeneidad y la actividad potencial (si la función efectora es importante) del producto.

Dependiendo de su localización dentro de una secuencia de CDR y del grado de glicosilación, la presencia de otros sitios N-enlazados dentro de regiones variables de anticuerpos monoclonales puede afectar a su potencia y también puede contribuir a producir heterogeneidad durante la fabricación. Dependiendo de la célula hospedante usada para la producción (por ejemplo, células NS0 de ratón), estos sitios de glicosilación de región V o "Fab" pueden glicosilarse preferentemente con glicanos atípicos que pueden suscitar una respuesta de h i pe rse nsibilid ad inmunológica.

Para el reemplazo de los sitios N-enlazados, generalmente se usa Q (glutamina) como una sustitución de aminoácido conservadora que elimina la secuencia consenso para la glicosilación. Así, usando técnicas de mutagénesis convencionales, se realiza una sustitución del resto N30Q dentro de la HCDR1 de K9-6N6.1. La sustitución N30Q no afecta sustancialmente a la unión al receptor, comparado con el K9-6N6.1 de origen.

Secuencia de K9-6N6.2

K9-6N6.2 se deriva de K9-6N6.1. K9-6N6.2 contiene dos sustituciones con respecto a la molécula de origen K9-6N6.1, VH-Y100D y VL-S28A, que mejoran la afinidad, así como dos sustituciones, N30Q y N232S, que añaden estabilidad y producen menos modificaciones postraduccionales que en el anticuerpo de origen K9-6N6.1.

SEQ ID NO:1 es la secuencia de aminoácidos de la HC de K9-6N6.2.

SEQ ID NO:2 se corresponde con la secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos que se corresponde con SEQ ID NO:1 y también contiene una secuencia codificadora de ADN para un conductor de cadena pesada murina, así como secuencias codificadoras de ADN para las enzimas de restricción HindIII y EcoRI.

SEQ ID NO:3 es la secuencia de aminoácidos traducida de SEQ ID NO:2 y contiene la HC de K9-6N6.2.

SEQ ID NO:4 es la secuencia de aminoácidos de la HCVR de K9-6N6.2.

SEQ ID NO:5 es la secuencia de nucleótidos que codifica la HCVR de K9-6N6.2.

SEQ ID NO:6 es la secuencia de aminoácidos de la CDR1 de cadena pesada de K9-6N6.2.

SEQ ID NO:7 es la secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de la HCDR1 de K9-6N6.2. SEQ ID NO:8 es la secuencia de aminoácidos de la HCDR2 de K9-6N6.2.

SEQ ID NO:9 es la secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de la HCDR2 de K9-6N6.2. SEQ ID NO:10 es la secuencia de aminoácidos de la HCDR3 de K9-6N6.2.

SEQ ID NO:11 es la secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de la HCDR3 de K9-6N6.2. SEQ ID NO:12 es la secuencia de aminoácidos de la LC de K9-6N6.2.

SEQ ID NO:13 es la secuencia de nucleótidos que

codifica la LC de K9-6N6.2.

SEQ ID NO:14 es la secuencia de aminoácidos de

la LCVR de K9-6N6.2.

SEQ ID NO:15 es la secuencia de nucleótidos que

codifica la LCVR de K9-6N6.2.

SEQ ID NO:16 es la secuencia de aminoácidos de la LCDR1 de K9-6N6.2.

SEQ ID NO:17 es la secuencia de nucleótidos que

codifica la secuencia de aminoácidos de la LCDR1 de K9-6N SEQ ID NO:18 es la secuencia de aminoácidos de la LCDR2 de K9-6N6.2.

SEQ ID NO:19 es la secuencia de nucleótidos que

codifica la secuencia de aminoácidos de la LCDR2 de K9-6N SEQ ID NO:20 es la secuencia de aminoácidos de la LCDR3 de K9-6N6.2.

SEQ ID NO:21 es la secuencia de nucleótidos que

codifica la secuencia de aminoácidos de la LCDR3 de K9-6N SEQ ID NO:22 es la secuencia de aminoácidos de

e K9-6N6.1.

SEQ ID NO:23 es la secuencia de nucleótidos que

codifica la secuencia de ami

HC de K9-6N6.1. SEQ ID NO:24 es la secuencia de aminoácidos de

e K9-6N6.1.

SEQ ID NO:25 es la secuencia de nucleótidos que

codifica la secuencia de ami

C de K9-6N6.1. SEQ ID NO:26 es la secuencia de aminoácidos de la HC de olaratumab.

SEQ ID NO:27 es la secuencia de nucleótidos que

codifica la secuencia de aminoácidos de la HC de olaratumab. SEQ ID NO:28 es la secuencia de aminoácidos de la LC de olaratumab.

SEQ ID NO:29 es la secuencia de nucleótidos que

codifica la secuencia de aminoácidos de la LC de olaratumab. SEQ ID NO:30 es la secuencia de aminoácidos de

la HCVR de olaratumab.

SEQ ID NO:31 es la secuencia de nucleótidos que

codifica la secuencia de aminoácidos de la HCVR de olaratuma SEQ ID NO:32 es la secuencia de aminoácidos de

olaratumab.

SEQ ID NO:33 es la secuencia de nucleótidos que

codifica la secuencia de aminoácidos de la LCVR de olaratuma SEQ ID NO:34 es la secuencia de aminoácidos de la HCDR1 de olaratumab.

SEQ ID NO:35 es la secuencia de aminoácidos de la HCDR2 de olaratumab.

SEQ ID NO:36 es la secuencia de aminoácidos de la HCDR3 de olaratumab.

SEQ ID NO:37 es la secuencia de aminoácidos de la LCDR1 de olaratumab.

SEQ ID NO:38 es la secuencia de aminoácidos de la LCDR2 de olaratumab.

SEQ ID NO:39 es la secuencia de aminoácidos de la LCDR3 de olaratumab.

Método para fabricar K9-6N6.2

Se modificó K9-6N6.2 para la expresión utilizando plásmidos de expresión de glutamina sintetasa (GS) para su uso en células de mamífero. Los ADNc que codifican las cadenas pesada y ligera se clonaron en módulos de expresión regulados por el promotor de CMV vírico y el terminador transcripcional y UTR 3' de poliadenilación de SV40. Ambos módulos están contenidos en un único plásmido, junto con un módulo de expresión para el marcador GS seleccionable. Para K9-6N6.2, el plásmido de expresión primero se evaluó con la expresión transitoria en células

CHO utilizando un proceso de transfección basado en lípidos (ExpiCHO; ThermoFisher). Para la generación de una línea celular, se electroporaron células CHO con el vector de expresión de K9-6N6.v2 y clones seleccionados en medio que carece de glutamina en presencia del inhibidor metionina sulfoximina. Después de la selección de los clones, las líneas celulares se evaluaron para la titulación de producción con clones que alcanzan 1 g/l o mayor seleccionados para la producción. La línea de producción seleccionada se expandió y se estableció un banco de células congeladas para la producción del anticuerpo monoclonal K9-6N6.2. Para el material producido a partir de una transfección transitoria o estable, K9-6N6.2 se purificó mediante una cromatografía de afinidad de Pro-A.

Secuencias

SEQ ID NO:1 es la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada de K9-6N6.2.

QLQLQES GPGLVKPS ETLS LTCT VS GGSIQS S S Y YW GWLRQS PGKGLEWIGS FF YTGS T Y YNPS LRS RLTIS VDTS KN QFS LMLS S VT A ADT A V Y Y C ARQS T Y YDGS GN Y Y GWF DRW DQGTLVT V S S AS TT APS VFPLAPS CGS TS GS TV A LA C L V S G YFPEP VT VS W N S G S LTS G VHTFPS VLQS S G LY S LS S M V T VPS S RWPS ETFT CN V AHP AS KTKVDKP VPKRE SGRVPRPPDCPKCPAPEMLGGPSVFIFPPKPKDTLLIARTPEVTCVVVDLDPEDPEVQI S W FVDGKQMQT AKTQPREEQFN GT YR VV S VLPIGHQDW LKGKQFTCKVNNKALPS PIERTIS KARGQ AHQPS V Y VLPPS REELS KNT V S LTCLIKDFFPPDID VEW QS N GQQEP ES KYRTTPPQLDEDGS YFLY S KLS VDKS RW QRGDTFI

SEQ ID NO:2 es la secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos que se corresponde con SEQ ID NO:1 y que también contiene una secuencia codificadora de ADN para un conductor de cadena pesada murino, así como secuencias codificadoras de ADN para las enzimas de restricción HindIII y EcoRI.

AAGCTTGCCGCCACCATGGGCTGGTCTTGCATCATTCTGTTCCTGGTCGCAACAG CCACTGGAGTGCACTCCCAGCTGCAGCTGCAGGAGAGCGGACCTGGACTGGTCA AGCCATCTGAAACCCTGAGTCTGACCTGTACAGTGAGCGGCGGATCTATCCAGT CCAGCTCTTACTATTGGGGCTGGCTGCGGCAGTCTCCAGGGAAAGGTCTGGAGT GGATTGGGAGCTTCTTTT AC AC AGGTTCT ACTT ACT ATAACCCC AGTCTGAGGTC ACG G CTGACCATCTCAGTGGACACATCCAAGAATCAGTTTTCCCTGATGCTGAGT TCAGTCACAGCCGCTGATACTGCCGTGTACTATTGCGCTCGACAGAGTACCTACT ATGACGGCTCAGGAAACTATTACGGGTGGTTCGACCGTTGGGATCAGGGTACCC TGGTCACAGTGTCCAGCGCAAGCACCACAGCACCATCCGTGTTCCCCCTGGCCCC TAGCTGCGGGAGTACCTCAGGTTCCACAGTCGCTCTGGCATGTCTGGTGAGTGGG TATTTCCCTGAGCCAGTCACCGTGTCATGGAATAGCGGCTCTCTGACTTCTGGAG TCCACACCTTTCCTAGTGTGCTGCAGTCTAGTGGCCTGTACTCTCTGTCATCCATG GTCACTGTGCCCAGCTCCAGGTGGCCTTCTGAAACTTTCACCTGCAACGTGGCCC ATCCAGCTAGTAAGACAAAAGTGGACAAGCCCGTGCCTAAACGCGAGAGTGGA AGAGTGCCACGCCCCCCTGATTGCCCCAAGTGTCCAGCTCCCGAAATGCTGGGG GGTCCTTCCGTGTTCATCTTTCCACCCAAGCCAAAAGACACCCTGCTGATTGCAA GAACTCCTGAGGTGACCTGCGTGGTCGTGGACCTGGACCCCGAGGACCCCGAAG TCCAGATTTCCTGGTTCGTGGATGGGAAGCAGATGCAGACTGCCAAAACCCAGC CCAGAGAGGAACAGTTTAACGGTACATATCGCGTCGTGAGCGTGCTGCCTATCG GCC ACC AGGACTGGCTGAAGGGAAAAC AGTTT AC ATGCAAGGTGAACAAT A A A GCTCTGCCTTCACCAATCGAGAGGACTATTTCCAAGGCTCGGGGACAGGCACAT CAGCCCAGCGTCTATGTGCTGCCTCCAAGTCGAGAGGAACTGTCAAAGAACACA GTGTCCCTGACTTGTCTGATCAAAGATTTCTTTCCCCCTGACATTGATGTGGAGTG GCAGAGCAATGGCCAGCAGGAGCCTGAATCTAAGTACCGCACTACCCCACCCCA GCTGGACGAAGATGGCAGCTATTTCCTGTACTCCAAGCTGAGCGTGGACAAATC TCGATGGCAGCGTGGAGATACCTTTATCTGTGCAGTGATGCACGAGGCCCTGCAC AATCATTACACACAAGAAAGTCTGTCACATTCCCCCGGCAAGTGAGAATTC SEQ ID NO:3 es la secuencia de aminoácidos traducida de SEQ ID NO:2 y que contiene la cadena pesada de K9-6N6.2.

QLQLQES GPGLVKPSETLSLTCT VS GGSIQS S S Y YW GWLRQS PGKGLEWIGS FF YTGS T Y YNPS LRSRLTIS YD T S KN QFS LMLS S VT A ADT A V Y Y C ARQST Y YDGS GN Y Y GWF DRW DQGTLVT V S S AS TT APS VFPL APS C GS TS GS TV A LA C L V S G YFPEP VT VS W N S G S LTS G YHTFPS VLQS S GL Y S LS S M VT VPS S RWPS ETFT CN Y AHP AS K T K VDKP VPKRE SGRVPRPPDCPKCPAPEMLGGPSVFIFPPKPKDTLLIARTPEVTCVVVDLDPEDPEVQI S WF VDGKQM QT AKTQPREEQFN GT YRV V S VLPIGHQDW LKGKQFTCKVNNKALPS PIERTIS K ARGQ AHQPS V Y VLPPS REELS KNT V S LTCLIKDFFPPDID VEW QS N GQQEP ESKYRTTPPQLDEDGSYFLYSKLSVDKSRW QRGDTFICAVMHEALHNHYTQESLSH SPGK

SEQ ID NO:4 es la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada de K9-6N6.2.

QLQLQES GPGL VKPS ETLS LTCT VS GGSIQS S S Y YW GWLRQS PGKGLEWIGS FF YTGS T Y YNPS LRSRLTIS VD T S KN QFS LMLS SVT A ADT A V Y Y C ARQS T Y YDGS GN Y Y GWF DRW DQGTLVT VSS

SEQ ID NO:5 es la secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de cadena pesada de K9-6N6.2.

CAGCTGCAGCTGCAGGAGAGCGGACCTGGACTGGTCAAGCCATCTGAAACCCTG

AGTCTGACCTGTACAGTGAGCGGCGGATCTATCCAGTCCAGCTCTTACTATTGGG GCTGGCTGCGGCAGTCTCCAGGGAAAGGTCTGGAGTGGATTGGGAGCTTCTTTTA CACAGGTTCTACTTACTATAACCCCAGTCTGAGGTCACGGCTGACCATCTCAGTG GACACATCCAAGAATCAGTTTTCCCTGATGCTGAGTTCAGTCACAGCCGCTGATA CTGCCGTGTACTATTGCGCTCGACAGAGTACCTACTATGACGGCTCAGGAAACTA TTACGGGTGGTTCGACCGTTGGGATCAGGGTACCCTGGTCACAGTGTCCAGC

TVSGGSIQSSSYYWG SEQ ID NO:7 es la secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de la CDR1 de cadena pesada de K9-6N6.2.

ACAGTGAGCGGCGGATCTATCCAGTCCAGCTCTTACTATTGGGGC SEQ ID NO:8 es la secuencia de aminoácidos de la CDR2 de cadena pesada de K9-6N6.2.

SFFYTGSTYYNPSLRS SEQ ID NO:9 es la secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de la CDR2 de cadena pesada de K9-6N6.2.

AGCTT CTTTT ACACAGGTT CT ACTT ACT AT AACCCCAGT CT GAGGT CA SEQ ID NO:10 es la secuencia de aminoácidos de la CDR3 de cadena pesada de K9-6N6.2.

ARQSTYYDGSGNYYGWFDR SEQ ID NO:11 es la secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de la CDR3 de cadena pesada de K9-6N6.2.

G C TC G A C A G AG TAC C TAC TATG AC G G C TC AG G AAAC TATTAC G G G TG G TTC G AC CGT

SEQ ID NO:12 es la secuencia de aminoácidos de cadena ligera de K9-6N6.2.

E IVLTQ SPATLSLSPG ER ATLSC R ASQ AVSSYLAW YQ Q KPG Q APR LLIYD ASN R ATG I PARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNW PPAFGQGTKVEIKRNDAQPAV YLFQ PSPD Q LH TG SASVVC LLN SFYPKD IN VKW KVD G VIQ D TG IQ ESVTEQ D KD STY S LS S TLTM S S TE YLS H E L Y S CEITHKS LPS TLIK S F QRS ECQR V D

SEQ ID NO:13 es la secuencia de nucleótidos que codifica la cadena ligera de K9-6N6.2.

AAGCTTGCCGCCACCATGGGTTGGTCCTGCATCATTCTGTTCCTGGTGGCCACCG CTACAGGCGTGCACAGCGAAATCGTCCTGACCCAGTCTCCCGCCACACTGAGTCT GTCACCTGGCGAGAGAGCCACCCTGTCTTGTCGCGCTTCCCAGGCCGTGTCCAGC TACCTGGCATGGTATCAGCAGAAGCCTGGACAGGCCCCAAGACTGCTGATCTAC GACGCTTCCAACCGAGCAACAGGGATTCCAGCTCGTTTCTCTGGCAGTGGATCA GGGACTGACTTTACTCTGACCATCTCTAGTCTGGAGCCCGAAGATTTCGCCGTGT ACTATTGCCAGCAGCGGAGCAACTGGCCCCCTGCATTTGGTCAGGGCACCAAGG TGGAAATTAAACGCAATGACGCACAGCCTGCCGTCTACCTGTTCCAGCCAAGTC CCGATCAGCTGCATACAGGCTCCGCCAGCGTGGTCTGTCTGCTGAACAGCTTTTA TCCAAAGGACATCAATGTGAAGTGGAAAGTGGACGGAGTCATCCAGGATACTGG GATTCAGGAGTCCGTC ACCGAAC AGGACA AAGATTCT AC AT AT AGTCTGTC ATCC ACACTGACTATGAGCTCTACCGAGTACCTGAGTCACGAACTGTATTCATGCGAGA TCACTCATAAGTCACTGCCCTCCACCCTGATTAAGTCCTTCCAGAGGTCTGAGTG TCAGCGGGTGGATTGAGAATTC

SEQ ID NO:14 es la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera de K9-6N6.2.

EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQAVSSYLAW YQQKPGQAPRLLIYDASNRATGI P ARF S GS GS GTDFTLTIS S LEPEDF A V Y Y C QQRS NWPP AFGQGTK Y E IK

SEQ ID NO:15 es la secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de cadena ligera de K9-6N6.2.

GAAATCGTCCTGACCCAGTCTCCCGCCACACTGAGTCTGTCACCTGGCGAGAGA GCCACCCTGTCTTGTCGCGCTTCCCAGGCCGTGTCCAGCTACCTGGCATGGTATC AGCAGAAGCCTGGACAGGCCCCAAGACTGCTGATCTACGACGCTTCCAACCGAG CAACAGGGATTCCAGCTCGTTTCTCTGGCAGTGGATCAGGGACTGACTTTACTCT GACCATCTCTAGTCTGGAGCCCGAAGATTTCGCCGTGTACTATTGCCAGCAGCGG AGCAACTGGCCCCCTGCATTTGGTCAGGGCACCAAGGTGGAAATTAAA

SEQ ID NO:16 es la secuencia de aminoácidos de la CDR1 de cadena ligera de K9-6N6.2.

RASQAVSSYLA SEQ ID NO:17 es la secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de la CDR1 de cadena ligera de K9-6N6.2.

CGCGCTTCCCAGGCCGTGTCCAGCTACCTGGCA SEQ ID NO:18 es la secuencia de aminoácidos de la CDR2 de cadena ligera de K9-6N6.2.

YDASNRAT SEQ ID NO:19 es la secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de la CDR2 de cadena ligera de K9-6N6.2.

TACGACGCTTCCAACCGAGCAACA SEQ ID NO:20 es la secuencia de aminoácidos de la CDR3 de cadena ligera de K9-6N6.2.

QQRSNWPPA

SEQ ID NO:21 es la secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de la CDR3 de cadena ligera de K9-6N6.2.

CAGCAGCGGAGCAACTGGCCCCCTGCA SEQ ID NO:22 es la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada de K9-6N6.1.

QLQLQES GPGL VKPS ETLS LTCT VS GGSINS S S Y YW GWLRQS PGKGLEWIGS FF YTGS T Y YNPS LRS RLTIS VDTS KN QFS LMLS S VT A ADT A V Y Y C ARQS T Y Y Y GS GN Y Y GWF DRWDQGTLVT V S S AS TT APS VFPLAPS CGS TS GS TV ALAC LV S G YFPEP VT V S WN S G S LTS G VHTFPS VLQS S GLY S LS S M VT VPS S RWPS ETFT CN V AHP AS KTKVDKP VPKRE N GRVPRPPDCPKCP APEMLGGPS VFIFPPKPKDTLLIARTPE VT C V V VDLDPEDPE V QI S WFVDGKQMQT AKTQPREEQFN GT YRVV S VLPIGHQDWLKGKQFTCKVNNKALPS PIERTIS KARGQ AHQPS V Y VLPPS REELS KNT V S LTCLIKDFFPPDID VEW QS N GQQEP ES KYRTTPPQLDEDGS YFLY S KLS VDKS RW QRGDTFIC A VMHE ALHNH YT QES LS H SPGK

SEQ ID NO:23 es la secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada de K9-6N6.1.

CAGCTGCAGCTGCAGGAGAGCGGACCTGGACTGGTCAAGCCATCTGAAACCCTG AGTCTGACCTGTACAGTGAGCGGCGGATCTATCAACTCCAGCTCTTACTATTGGG GCTGGCTGCGGCAGTCTCCAGGGAAAGGTCTGGAGTGGATTGGGAGCTTCTTTTA CACAGGTTCTACTTACTATAACCCCAGTCTGAGGTCACGGCTGACCATCTCAGTG GACACATCCAAGAATCAGTTTTCCCTGATGCTGAGTTCAGTCACAGCCGCTGATA CTGCCGTGT ACT ATTGCGCTCGAC AGAGT ACCT ACT ATT ACGGCTC AGGAAACT A TTACGGGTGGTTCGACCGTTGGGATCAGGGTACCCTGGTCACAGTGTCCAGCGCA AGCACCACAGCACCATCCGTGTTCCCCCTGGCCCCTAGCTGCGGGAGTACCTCAG GTTCCACAGTCGCTCTGGCATGTCTGGTGAGTGGGTATTTCCCTGAGCCAGTCAC CGTGTCATGGAATAGCGGCTCTCTGACTTCTGGAGTCCACACCTTTCCTAGTGTG CTGCAGTCTAGTGGCCTGTACTCTCTGTCATCCATGGTCACTGTGCCCAGCTCCA GGTGGCCTTCTGAAACTTTCACCTGCAACGTGGCCCATCCAGCTAGTAAGACAA AAGTGGACAAGCCCGTGCCTAAACGCGAGAATGGAAGAGTGCCACGCCCCCCTG ATTGCCCCAAGTGTCCAGCTCCCGAAATGCTGGGGGGTCCTTCCGTGTTCATCTT TCCACCCAAGCCAAAAGACACCCTGCTGATTGCAAGAACTCCTGAGGTGACCTG CGTGGTCGTGGACCTGGACCCCGAGGACCCCGAAGTCCAGATTTCCTGGTTCGTG GATGGGAAGCAGATGCAGACTGCCAAAACCCAGCCCAGAGAGGAACAGTTTAA CGGTACATATCGCGTCGTGAGCGTGCTGCCTATCGGCCACCAGGACTGGCTGAA GGGAAAACAGTTTACATGCAAGGTGAACAATAAAGCTCTGCCTTCACCAATCGA GAGGACTATTTCCAAGGCTCGGGGACAGGCACATCAGCCCAGCGTCTATGTGCT GCCTCCAAGTCGAGAGGAACTGTCAAAGAACACAGTGTCCCTGACTTGTCTGAT CAAAGATTTCTTTCCCCCTGACATTGATGTGGAGTGGCAGAGCAATGGCCAGCA GGAGCCTGAATCTAAGTACCGCACTACCCCACCCCAGCTGGACGAAGATGGCAG CTATTTCCTGTACTCCAAGCTGAGCGTGGACAAATCTCGATGGCAGCGTGGAGAT ACCTTTATCTGTGCAGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCATTACACACAAGAA AGTCTGTCACATTCCCCCGGCAAG SEQ ID NO:24 es la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de K9-6N6.1.

E l VLTQS P ATLS LSPGERATLSCR AS QS V S S Y L A W Y QQKPGQ A P R LLIY D AS NR A TG I

P ARF S GS GS GTDFTLTIS S LEPEDF A V Y Y C QQRS NWPP AFGQGTK V E IK R N D AQP A V YLFQ PSPDQ LHTG SASVVCLLNSFYPKDINVKW KVDG VIQ DTG IQ ESVTEQ DKDSTY S LS S TLTM S S TE YLS H E L Y S CEITHKS LPS TLIKS FQRS ECQR VD

SEQ ID NO:25 es la secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de K9-6N6.1.

GAAATCGTCCTGACCCAGTCTCCCGCCACACTGAGTCTGTCACCTGGCGAGAGA GCCACCCTGTCTTGTCGCGCTTCCCAGAGCGTGTCCAGCTACCTGGCATGGTATC AGCAGAAGCCTGGACAGGCCCCAAGACTGCTGATCTACGACGCTTCCAACCGAG

CAACAGGGATTCCAGCTCGTTTCTCTGGCAGTGGATCAGGGACTGACTTTACTCT GACCATCTCTAGTCTGGAGCCCGAAGATTTCGCCGTGTACTATTGCCAGCAGCGG AGCAACTGGCCCCCTGCATTTGGTCAGGGCACCAAGGTGGAAATTAAACGCAAT GACGCACAGCCTGCCGTCTACCTGTTCCAGCCAAGTCCCGATCAGCTGCATACAG GCTCCGCCAGCGTGGTCTGTCTGCTGAACAGCTTTTATCCAAAGGACATCAATGT GAAGTGGAAAGTGGACGGAGTCATCCAGGATACTGGGATTCAGGAGTCCGTCAC CGAACAGGACAAAGATTCTACATATAGTCTGTCATCCACACTGACTATGAGCTCT ACCGAGTACCTGAGTCACGAACTGTATTCATGCGAGATCACTCATAAGTCACTGC CCTCCACCCTGATTAAGTCCTTCCAGAGGTCTGAGTGTCAGCGGGTGGAT SEQ ID NO:26 es la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada de olaratumab.

QLQLQES GPGL VKPS ETLS LTCT VS GGSINS S S Y YW GWLRQS PGKGLE WIGS FF YTGS T Y YNPS LRS RLTIS VDTS KN QFS LMLS S VT A ADT A V Y Y C ARQS T Y Y Y GS GN Y Y GWF DRW DQGTLVT V S S AS TKGPS VFPLAPS S KS TS GGT A ALG CLVKD YFPEP VT V S WNS G ALTS GVHTFP A VLQS S GLYSLS S V VT VPS S SLGTQT Y ICN VNHKPS NTKVDKRVEPKS CDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFN W Y VD G VE VHN AKTKPREEQ YN S T YR V V S VLT VLHQD W LN GKE YKC K V S N K ALP A PIEKTIS K AKGQPREPQV YTLPPSREEMTKN QV S LTCLVKGF YPSDIA VEWES N GQPE NN YKTTPP VLDS D GS FFL Y S KLT VDKS RW QQGN VF S CS VM HE ALH N H YTQKS LS LS PGK SEQ ID NO:27 es la secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada de olaratumab.

CAGCTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCGGAGACCCTG TCCCTCACCTGCACTGTCTCTGGTGGCTCCATCAACAGTAGTAGTTACTACTGGG GCTGGCTCCGCCAGTCCCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGATTGGGAGTTTCTTTTA TACTGGGAGC ACCT ACT AC AACCCGTCCCTC AGGAGTCGACTC ACC A T ATCCGT A GACACGTCCAAGAACCAGTTCTCCCTGATGCTGAGTTCTGTGACCGCCGCAGAC ACGGCTGTATATTACTGTGCGAGACAGTCCACGTATTACTATGGTTCGGGGAATT

ATTATGGCTGGTTCGACCGCTGGGACCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGC TAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCT GGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTG ACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCT GTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCA GCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACA CCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCC CACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCC AAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGT GGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGG CGTGGAGGTGC AT AATGCC AAGACAAAGCCGCGGGAGGAGC AGT ACAAC AGCA CGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCA AGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAA CCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCC CATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAG GCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGA ACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTA TAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATG CTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCT GTCCCCGGGTAAA

SEQ ID NO:28 es la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de olaratumab.

E l VLTQS P ATLS LS PGER ATLS CR AS QS VS S Y L A W Y QQKPGQ APRLLIYD AS NR ATG I

P ARF S GS GS GTDFTLTIS S LEPEDF A V Y Y C QQRS NWPP AFGQGTK VEIKRT V A APS VF IFPPSDEQLKSGTASVVCFLNNFYPREAKVQWKVDNAFQSGNSQESVTEQDSKDST YS LS S TLTLS K AD Y E K H K V Y ACE VTHQGLS S P VTKS FNRGEC

SEQ ID NO:29 es la secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de olaratumab.

GAAATTGTGTTGACACAGTCTCCAGCCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAG CCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCTACTTAGCCTGGTACCA ACAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGATGCATCCAACAGGGC CACTGGCATCCCAGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTC ACCATCAGCAGCCTAGAGCCTGAAGATTTTGCAGTTTATTACTGTCAGCAGCGTA GCAACTGGCCTCCGGCGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGTACGG TGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGG AACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTA CAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACA GAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAG CAAAGC AGACT ACGAGAAAC AC AAAGTCT ACGCCTGCGAAGTCACCC ATC AGGG CCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT SEQ ID NO:30 es la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada de olaratumab.

QLQLQES GPGL VKPS ETLS LTCT VS GGSINS S S Y YW GWLRQS PGKGLEWIGS FF YTGS T Y YNPS LRS RLTIS VD T S KN QFS LMLS S VT A AD T A V Y Y C ARQST Y Y Y GS GN Y Y GWF DRWDQGTLVTVSS

SEQ ID NO:31 es la secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada de olaratumab.

CAGCTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCGGAGACCCTG TCCCTCACCTGCACTGTCTCTGGTGGCTCCATCAACAGTAGTAGTTACTACTGGG GCTGGCTCCGCCAGTCCCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGATTGGGAGTTTCTTTTA TACTGGGAGCACCTACTACAACCCGTCCCTCAGGAGTCGACTCACCATATCCGTA GACACGTCCAAGAACCAGTTCTCCCTGATGCTGAGTTCTGTGACCGCCGCAGAC ACGGCTGTATATTACTGTGCGAGACAGTCCACGTATTACTATGGTTCGGGGAATT ATTATGGCTGGTTCGACCGCTGGGACCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA

SEQ ID NO:32 es la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera de olaratumab.

E IVLTQ SPATLSLSPG ERATLSC R ASQ SYSSYLAW YQ Q KPG Q APR LLIYD ASN R ATG I P ARF S GS GS GTDFTLTIS SLEPEDF A V Y Y C QQRS NWPP A FG Q G TK V E IK

SEQ ID NO:33 es la secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera de olaratumab.

GAAATTGTGTTGACACAGTCTCCAGCCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAG CCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCTACTTAGCCTGGTACCA ACAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGATGCATCCAACAGGGC CACTGGCATCCCAGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTC ACCATCAGCAGCCTAGAGCCTGAAGATTTTGCAGTTTATTACTGTCAGCAGCGTA GCAACTGGCCTCCGGCGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAA

SEQ ID NO:34 es la secuencia de aminoácidos de la CDR1 de cadena pesada de olaratumab.

TVSGGSINSSSYYWG SEQ ID NO:35 es la secuencia de aminoácidos de la CDR2 de cadena pesada de olaratumab.

SFFYTGSTYYNPSLRS SEQ ID NO:36 es la secuencia de aminoácidos de la CDR3 de cadena pesada de olaratumab.

ARQSTYYYGSGNYYGWFDR SEQ ID NO:37 es la secuencia de aminoácidos de la CDR1 de cadena ligera de olaratumab.

RASQSVSSYLA SEQ ID NO:38 es la secuencia de aminoácidos de la CDR2 de cadena ligera de olaratumab.

YDASNRAT SEQ ID NO:39 es la secuencia de aminoácidos de la CDR3 de cadena ligera de olaratumab.

QQRSNWPPA

Claims

REIVINDICACIONES

1 Un anticuerpo monoclonal que se une al receptor alfa del factor de crecimiento derivado de plaquetas canino (cPDGFRA) que comprende una región variable de cadena ligera (LCVR) y una región variable de cadena pesada (HCVR), en el que la LCVR comprende las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) LCDR1, LCDR2 y LCDR3, y la HCVR comprende las CDR HCDR1, HCDR2 y HCDR3, en el que la secuencia de aminoácidos de LCDR1 aparece en SEQ ID NO:16, la secuencia de aminoácidos de LCDR2 aparece en SEQ ID NO:18, la secuencia de aminoácidos de LCDR3 aparece en SEQ ID NO:20, la secuencia de aminoácidos de HCDR1 aparece en SEQ ID NO:6, la secuencia de aminoácidos de HCDR2 aparece en SEQ ID NO:8, y la secuencia de aminoácidos de HCDR3 aparece en SEQ ID NO:10.
2.- El anticuerpo monoclonal de la reivindicación 1, que comprende una región variable de cadena ligera (LCVR) y una región variable de cadena pesada (HCVR), en el que la secuencia de aminoácidos de la LCVR aparece en SEQ ID NO:14, y la secuencia de aminoácidos de la HCVR aparece en SEQ ID NO:4.
3. - El anticuerpo monoclonal de cualquiera de las reivindicaciones 1-2, que comprende una cadena ligera (LC) y una cadena pesada (HC), en el que la secuencia de aminoácidos de la LC aparece en SEQ ID NO:12, y la secuencia de aminoácidos de la HC aparece en SEQ ID NO:1.
4. - Un anticuerpo según las reivindicaciones 1-3 para su uso en terapia.
5. - Un anticuerpo según las reivindicaciones 1-3 para su uso en el tratamiento del osteosarcoma en un paciente canino.