JP2022549559A - 抗体およびその抗原結合フラグメントの機能的な親和性を高めるための修飾されたＦｃ領域 - Google Patents

Abstract

本発明は、分子間協同作用に寄与するマウスＩｇＧ３抗体（ｍＡｂ）の中の鍵となる残基の同定、ならびにＩｇＧ１抗体の機能的な親和性および直接的な細胞殺滅を高めるためのＩｇＧ１抗体へのそれらの移動に関する。【選択図】なし

Description

本発明は、分子間協同作用に寄与するマウスＩｇＧ３抗体（ｍＡｂ）の中の鍵となる残基の同定、ならびにＩｇＧ１抗体の機能的な親和性および直接的な細胞殺滅を高めるためのＩｇＧ１抗体へのそれらの移動に関する。

マウス（ｍ）ＩｇＧ３は、細菌感染症を著しく防ぎ、ｍＩｇＧの中で唯一非共有結合性オリゴマーを形成するアイソタイプであり、該オリゴマーは、ＩｇＧ３の生体活性に強く影響し（Ａｂｄｅｌｍｏｕｌａ ｅｔ ａｌ． １９８９）、多価抗原に対する機能的な親和性を増大させる。ｍＩｇＧ３オリゴマー化の傾向は、Ｇｒｅｙら（Ｇｒｅｙ， Ｈｉｒｓｔ， ａｎｄ Ｃｏｈｎ １９７１）により最初に同定されたが、彼らは、多価抗原に対する結合がｍＩｇＧ３の分子間相互作用を促進させ、抗原に対する機能的な親和性の増大をもたらしたこと（Ｇｒｅｅｎｓｐａｎ， Ｍｏｎａｆｏ， ａｎｄ Ｄａｖｉｅ １９８７； Ｇｒｅｅｎｓｐａｎ ａｎｄ Ｃｏｏｐｅｒ １９９３）を示した。この特徴は「分子間協同作用」（Ｇｒｅｅｎｓｐａｎ ａｎｄ Ｃｏｏｐｅｒ １９９３； Ｇｒｅｅｎｓｐａｎ， Ｄａｃｅｋ， ａｎｄ Ｃｏｏｐｅｒ １９８９； Ｇｒｅｅｎｓｐａｎ ａｎｄ Ｃｏｏｐｅｒ １９９２）と命名されている。この現象は、ＩｇＧ３ Ｆ（ａｂ’）２フラグメントが抗原に協同的に結合しなかったため、Ｆｃに依存していることが決定された（Ｇｒｅｅｎｓｐａｎ， Ｍｏｎａｆｏ， ａｎｄ Ｄａｖｉｅ １９８７）。ｍＩｇＧ３のアイソタイプは、反復抗原に分子間協同作用の性質を伴って結合し、よって、低い一価の親和性が、結合活性が介在する結合の亢進によりレスキュー（ｒｅｓｃｕｅ）される（Ｇｒｅｅｎｓｐａｎ ａｎｄ Ｃｏｏｐｅｒ １９９３， １９９２）。隣接するｍＩｇＧ３Ｆｃ領域間の非共有結合性の相互作用は、標的の専有の長期化および解離速度の低減を介して、この機能的な親和性の増大を支えると考えられる（Ｃｏｏｐｅｒ ｅｔ ａｌ． １９９１； Ｇｒｅｅｎｓｐａｎ， Ｄａｃｅｋ， ａｎｄ Ｃｏｏｐｅｒ １９８９）。

腫瘍のグライコームは、ｍＡｂの開発において、形質転換プロセスに関連する変質により、がんに特異的な標的の豊富であり調査中の供給源である（Ｐｉｎｈｏ ａｎｄ Ｒｅｉｓ ２０１５）。グリカン構造は、タンパク質および糖脂質の骨格の両方に存在し、グリコトランスフェラーゼ（ｇｌｙｃｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）の発現の変化により、がんにおいて大量に過剰発現され得る。グリカンは、がん細胞の生存、増殖、転移、および免疫回避にとって重要な共アクセサリー分子であることが示されており；これら抗原を架橋することは、免疫エフェクター細胞または補体を必要とすることなく直接的な細胞死をもたらし得る（Ｄａｌｚｉｅｌ ｅｔ ａｌ． ２０１４； ＲｏｄｒＩｇｕｅｚ， Ｓｃｈｅｔｔｅｒｓ， ａｎｄ ｖａｎ Ｋｏｏｙｋ ２０１８； Ｒａｂｕ ｅｔ ａｌ． ２０１２）。実際に、本発明者らは、それらの健常な組織と比較して強力な差次的な腫瘍の結合、高い機能的な親和性、および転移性結腸直腸がんのマウスを治癒するそれらの特性により、がんの治療薬にとって見込みのある適用を有する多くのグリカンを標的とするｍＡｂを作製しており（Ｃｈｕａ ｅｔ ａｌ． ２０１５； Ｄｕｒｒａｎｔ ｅｔ ａｌ． ２００６； Ｎｏｂｌｅ ｅｔ ａｌ． ２０１３）、多くの他のｍＡｂは、受動もしくは能動免疫療法として臨床開発中であるか、またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞へと再編成されている（Ｂｕｒｒｉｓ ｅｔ ａｌ． ２０１０； Ｌａｂｒａｄａ ｅｔ ａｌ． ２０１８； Ｈｅｇｅ ｅｔ ａｌ． ２０１７）が、一方で、抗ＧＤ２ｍＡｂであるジヌツキシマブβは、現在、神経芽細胞腫の処置に使用されている（Ｌａｄｅｎｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ． ２０１８）。

以前に本発明者らは、Ｌｅｗｉｓ^{ａ／ｃ／ｘ}、Ｌｅｗｉｓ^ｙおよびシアリル－ジ－Ｌｅｗｉｓ^ａの反応性を伴うがんのグリカンを標的とするｍＡｂのパネルを記載していた（国際特許公開公報第２０１７／０３３０２０号；同第２０１５／０６３５００号；Ｃｈｕａ ｅｔ ａｌ． ２０１５； Ｎｏｂｌｅ ｅｔ ａｌ． ２０１３）。興味深いことに、グリカン結合ｍＡｂがｍＩｇＧ３のアイソタイプである場合、これらは、補体または免疫エフェクター細胞の存在に関わらず、高密度で標的を発現するがん細胞に直接的な細胞傷害性作用を呈し、これは抗腫瘍適応免疫応答および長期間の腫瘍制御を開始する可能性がある。これは、ｍＩｇＧ３アイソタイプにより有効化される分子間協同作用が直接的な細胞殺滅に寄与していることを示唆していた。この直接的な細胞傷害能はまた、他の抗グリカンｍＡｂでも観察されており、通常、ｍＡｂ誘導性の同型の細胞接着、細胞骨格の再配置、その後の細胞腫脹、膜病変、および最終的な細胞の死滅に関与する（Ｌｏｏ ｅｔ ａｌ． ２００７； Ｆａｒａｊ ｅｔ ａｌ． ２０１７； Ｒｏｑｕｅ－Ｎａｖａｒｒｏ ｅｔ ａｌ． ２００８； Ｃｈｕａ ｅｔ ａｌ． ２０１５； Ｗｅｌｔ ｅｔ ａｌ． １９８７）。大部分の場合、細胞死は、恐らくは活性酸素種（ＲＯＳ）の産生を生じることに関与する、非古典的なアポトーシスの形態であり、膨張壊死（ｏｎｃｏｔｉｃ ｎｅｃｒｏｓｉｓ）に最も類似している（Ｚｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ． ２０１７； Ｈｅｒｎａｎｄｅｚ ｅｔ ａｌ． ２０１１）。重要なことに、免疫原性または炎症性細胞死（ＩＣＤ）と同様に、炎症性メディエーター－ダメージ関連分子パターン（ＤＡＭＰ）の同時に起こる放出は、ｍＡｂが介在するエフェクター機能をさらに増大し得る腫瘍部位に自然免疫細胞を動員する可能性を有する（Ｇａｌｌｕｚｚｉ ｅｔ ａｌ． ２０１７）。よって、これら抗グリカンｍＡｂは、他の状況では免疫抑制環境にある免疫系の完全なポテンシャルを再動員（ｒｅｍｏｂｉｌｉｓｅ）するための重要なツールであり得る。

ヒト抗体治療薬では、標的の特異性に寄与しない領域は、通常、臨床的に有用である抗体のヒト化バージョンを作製するために、それらのヒト等価物と置き換えられる。本発明者らが自身のマウスｍＡｂをＩｇＧ１（たとえばヒトＩｇＧ１、ｈＩｇＧ１）へとキメラ化した場合、分子間協同作用はヒトＩｇＧに存在しないため、これらは直接的な細胞殺滅を失い、機能的な親和性が低下した。マウスＩｇＧ３抗体は、それらの標的に結合した後に、他の抗体のサブクラスが行わない様式で共に組み合わさり、抗体の結合を安定させ、臨床効力を増幅させ得ることが以前に示唆されている。

米国特許公開公報第２０１１／０１２３４４０号は、変質した抗体のＦｃ領域およびその使用を記載している。変質したＦｃ領域は、１つ以上のアミノ酸の置換を有する。この特許は、多くの部位での何らかの置換を請求しているが、実施例そのものは、本発明者らの発明とは全てが異なる置換であり、これら置換が直接的な細胞殺滅に寄与しないことを例示する。

米国特許公開公報第２００８／００８９８９２号は、ＡＤＣＣを改善するための、２５１、２５６、２６８、２８０、３３２、３７８、および４４０位にアミノ酸の置換を有するポリペプチドＦｃ領域バリアントおよびこれらＦｃ領域バリアントを含む組成物を記載している。この特許で概説された修飾との類似性は、３７８位のみであるが、本発明者らは、これをアスパラギン酸ではなくセリンで置換しており、本発明者らはＡＤＣＣの減少を示している。

米国特許公開公報第２０１０／０１８４９５９号は、２つ以上のアミノ酸の置換およびＦｃリガンド（たとえばＦｃγＲまたはＣ１ｑ）の認識の変更ならびに／またはエフェクター機能（たとえばＡＤＣＣ）を伴うＦｃポリペプチドバリアントを提供する方法を記載している。対照的に、本発明者らの置換は、細胞殺滅の増大のみに関連している。本発明で開示される２６および２３のアミノ酸モチーフは、Ｖ３０５Ａ、Ｑ３４２Ｒ Ｒ３４４Ｑの置換を含み、１５のアミノ酸モチーフは、Ｑ３４２Ｒのみを含む。

米国特許公開公報第２０１０／０１５１３３号は、ポリペプチドの結合を調節することによりポリペプチドを産生する方法を記載している。彼らは、３５６／４３９位、３５７／３７０位、および３９９／４０９位で抗体のＣＨ３定常領域において、負の電荷から正の電荷へまたはその逆にて対形成されたアミノ酸の電荷を変えることを主張している。対照的に、本発明は、アミノ酸３５６を、アスパラギン酸（Ｄ）から電荷を変えないグルタミン酸（Ｅ）へ、およびアミノ酸３５７をグルタミン酸（Ｅ）から負の電荷を中性へと変えるグルタミン（Ｑ）へ、およびアミノ酸３７０をリジン（Ｋ）から負の電荷を中性へと変えるスレオニンへと変えることを記載していた。

国際特許公開公報第２０１８／１４６３１７号は、ＣＤＣ活性および／またはアゴニスティック活性が増大したポリペプチドまたは抗体を提供する、Ｆｃ領域がＦｃ－Ｆｃ増強変異およびＣ１ｑ結合増強変異を有するＦｃ領域および抗原結合領域を有するポリペプチドおよび抗体を記載している。このＦｃ領域は、（ａ）Ｅ４３０、Ｅ３４５、またはＳ４４０Ｙ、またはＳ４４０Ｗの置換からなる群から選択される位置での置換、および（ｂ）Ｇ２３６、Ｓ２３９、Ｓ２６７、Ｈ２６８、Ｓ３２４、Ｋ３２６、Ｉ３３２、Ｅ３３３、およびＰ３９６からなる群から選択される１つ以上の位置での置換を含むと言われている（ここでの位置は、ヒトＩｇＧ１に対応する）。ポリペプチドは、Ｅ４３０Ｇ、Ｅ３４５Ｋ、Ｅ４３０Ｓ、Ｅ４３０Ｆ、Ｅ４３０Ｔ、Ｅ３４５Ｑ、Ｅ３４５Ｒ、Ｅ３４５Ｙ、Ｓ４４０Ｙ、およびＳ４４０Ｗからなる群に由来する少なくとも１つの置換を含む。本発明は、これら置換のいずれをも含まない。

国際特許公開公報第２０１８／０８３１２６号は、バリアントＦｃ領域を含むポリペプチドおよび抗体を記載している。このＦｃ領域は、ポリペプチドまたは抗体が細胞表面上のその標的である抗原に結合する場合に、安定したＦｃ：Ｆｃ相互作用を提供するが、同時に補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）も減少しており、また、Ｆｃ領域での１つ以上のアミノ酸修飾からもたらされる他のエフェクター機能の活性化も減少している場合がある。Ｆｃ領域は、（ｉ）Ｅ４３０、Ｅ３４５、またはＳ４４０での第１の変異（ただし、Ｓ４４０での突然変異はＳ４４０ＹまたはＳ４４０Ｗである）および（ｉｉ）Ｋ３２２またはＰ３２９での第２の変異を含むと言われている。第１の変異は、Ｅ４３０Ｇ、Ｅ３４５Ｋ、Ｅ４３０Ｓ、Ｅ４３０Ｆ、Ｅ４３０Ｔ、Ｅ３４５Ｑ、Ｅ３４５Ｒ、Ｅ３４５Ｙ、Ｓ４４０Ｗ、およびＳ４４０Ｙからなる群から選択される。本発明は、これら置換のいずれをも含まない。

国際特許公開公報第２０１４／１０８１９８号は、補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）の増大をもたらす１つ以上のアミノ酸修飾を有するバリアントＦｃ領域を含む抗体などのポリペプチドを開示する。本発明は、これら置換のいずれをも含まない。

国際特許公開公報第２０１３／００４８４２号は、ポリペプチドまたは抗体が、ＣＤＣ応答などのエフェクター機能の改善のため細胞の表面上でその標的に結合する場合、Ｆｃ：Ｆｃ相互作用を安定化させるためのバリアントＦｃドメインを含むポリペプチドおよび関連する抗体を記載している。本発明は、これら置換のいずれをも含まない。

本発明は、その親のポリペプチド、抗体、それらのバリアントおよび抗原結合フラグメントと比較して高い機能的な親和性を有する、ポリペプチド、抗体、それらのバリアントおよび抗原結合フラグメントを提供する。また本発明は、その親のポリペプチド、抗体、それらのバリアントおよび抗原結合フラグメントと比較して高い細胞殺滅を有する、ポリペプチド、抗体、それらのバリアントおよび抗原結合フラグメントを提供する。理論により限定されるものではないが、このような修飾されたポリペプチド、抗体、それらのバリアントおよび抗原結合フラグメントは、２つの抗体のＦｃ領域間でより安定した結合相互作用を可能にでき、よって、高い抗体－抗原結合の機能的な親和性を提供すると考えられている。さらに本発明者らは、このアイソタイプに、反復するグリカン抗原の結合に関する機能的な親和性の増大および高結合がん細胞株に対する直接的な細胞傷害性を提供する、ｍＩｇＧ３のＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインの中の不連続な領域を開示する。関与する残基のＩｇＧ１アイソタイプへの移動は、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏでの抗腫瘍活性が増大した、改善された「ｉ」ＩｇＧ１をもたらす。

キメラｍＡｂを抗ヒトＩｇ抗血清と架橋するか、または１つの鍵となるアミノ酸残基を変えることにより、本発明者らは、直接的な細胞殺滅が機能的な親和性に直接関連することを示した。さらに本発明者らは、キメラコンストラクトに分子間協同作用を導入することにより本発明者らの新規のマウスｍＡｂの機能的な親和性を再現した。ｍＩｇＧ３の協同作用をマッピングしたものはなく、ＩｇＧ１とｍＩｇＧ３との間で異なる鍵となるアミノ酸は、以前には記載されていなかった。よって、本発明者らは、本発明者らの抗糖脂質ｍＡｂのシリーズの開発を行っただけではなく、全てのｍＡｂの治療指数を改善する有用性を有する技術を開発した。

ヒトＩｇＧ１の骨格上でのｍＩｇＧ３ ｍＡｂのキメラ化（Ｃｈｉｍｅｒｉｓａｔｉｏｎ）を行うと、直接的な細胞傷害性の顕著な低減が同時に起こることから、本発明者らは、この低減が分子間協同作用の減少の結果であるという仮説を立てた。そのため、本発明者らは、分子間協同作用に寄与するｍＩｇＧ３の中の鍵となる残基を同定すること、およびｍＩｇＧ３で観察される直接的な細胞傷害性活性の再現により、優れた臨床上の有用性を有するキメラＩｇＧ１をもたらすためにこれらをＩｇＧ１に移すことに注力した。

本発明者らは、選択されたｍＩｇＧ３定常領域の残基の移動を介した機能的な親和性および直接的な細胞傷害性活性が増大したＩｇＧ１抗グリカンｍＡｂの作製を、本発明者らのパネルまたは以前に作製したグリカンを標的とするｍＡｂを利用して行った。ｍＩｇＧ３の寄与領域は、ｍＩｇＧ３ ＣＨ１、ＣＨ２、またはＣＨ３ドメインを含むハイブリッドＩｇＧ１コンストラクトの作製を介して同定した。候補残基の同定は、ＩｇＧ１に導入される場合は直接的な細胞傷害性および機能的な親和性の増大に基づくスクリーニング（機能獲得（ｇａｉｎ－ｏｆ－ｆｕｎｃｔｉｏｎ））を介して行い、かつ／またはｍＩｇＧ３において各ＩｇＧ１残基で置き換えられる場合は直接的な細胞傷害性および機能的な親和性の減少に基づくスクリーニング（機能喪失（ｌｏｓｓ－ｏｆ－ｆｕｎｃｔｉｏｎ））を介して行った。予備分析は、ｍＩｇＧ３ ＣＨ１をＩｇＧ１に導入することが細胞傷害性の有意な増大をもたらさないため直接的な細胞傷害能に対するｍＩｇＧ３ ＣＨ１の寄与はごくわずかであることを解明した。逆に、同様にヒトＩｇＧ１（ｈＩｇＧ１）ＣＨ１をｍＩｇＧ３に導入することは、殺滅活性の有意な低減をもたらさなかった。次に、機能獲得の手法において、ｍＩｇＧ３のＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを、別々にＩｇＧ１に導入した。マウスＣＨ３を含むＩｇＧ１は、細胞傷害性の有意な増大を呈した。マウスＣＨ２をＩｇＧ１に導入することは、有意ではないが小さい殺滅活性の増大をもたらした。両方のドメインによりなされた寄与の確認として、逆の戦略を続けて行い、これにより、細胞傷害性活性の喪失が、ＩｇＧ１のＣＨ２ドメインまたはＣＨ３ドメインのｍＩｇＧ３への導入により評価された。このシナリオは、ＩｇＧ１ ＣＨ３を含むｍＩｇＧ３での細胞傷害性の有意な減少をもたらし、以前の機能獲得の結果を裏付けた。重要なことに、この戦略はまた、ヒトＣＨ２を含むｍＩｇＧ３が細胞傷害性活性の有意な減少を呈したため、マウスＣＨ２による小さな寄与を同定した。

本発明の一態様では、イムノグロブリンのＦｃ領域の１つ以上の残基および結合領域を含む修飾されたＩｇＧ１抗体またはその抗原結合フラグメントであって、Ｆｃ領域の１つ以上の残基が、マウスＩｇＧ３抗体由来の対応する残基へと修飾されており、修飾されたＩｇＧ１抗体またはその抗原結合フラグメントが、野生型のＦｃ領域残基を含む対応するＩｇＧ１抗体またはその抗原結合フラグメントと比較して高い機能的な親和性を有する、修飾されたＩｇＧ１抗体またはその抗原結合フラグメントが提供される。

本発明の一部の態様では、修飾されたＩｇＧ１抗体またはその抗原結合フラグメントの機能的な親和性が、野生型のＦｃ領域残基を含む対応するＩｇＧ１抗体またはその抗原結合フラグメントと比較して少なくとも約１０％高い、修飾されたＩｇＧ１抗体またはその抗原結合フラグメントが提供される。

本発明の一部の態様では、修飾されたＩｇＧ１抗体またはその抗原結合フラグメントの機能的な親和性は、野生型のＦｃ領域残基を含む対応するＩｇＧ１抗体またはその抗原結合フラグメントと比較して少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または少なくとも約１００％高い。

本発明の一部の態様では、修飾されたＩｇＧ１抗体またはその抗原結合フラグメントは、野生型のＦｃ領域残基を含む対応するＩｇＧ１抗体またはその抗原結合フラグメントと比較して高い直接的な細胞殺滅を有する。

本発明の一部の態様では、修飾されたＩｇＧ１抗体またはその抗原結合フラグメントの直接的な細胞殺滅は、野生型のＦｃ領域残基を含む対応するＩｇＧ１抗体またはその抗原結合フラグメントと比較して少なくとも約１０％高い。

本発明の一部の態様では、修飾されたＩｇＧ１抗体またはその抗原結合フラグメントの直接的な細胞殺滅は、野生型のＦｃ領域残基を含む対応するＩｇＧ１抗体またはその抗原結合フラグメントと比較して少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または少なくとも約１００％高い。

本発明の第１の態様では、ＣＨ２ドメインおよび／またはＣＨ３ドメインの１つ以上の残基が、マウスＩｇＧ３のＣＨ２ドメインおよび／またはＣＨ３ドメインの対応する残基と置き換えられている、修飾されたＩｇＧ１抗体またはその抗原結合フラグメントが提供される。

本発明の第２の態様では、ＣＨ２ドメインおよび／またはＣＨ３ドメインが、マウスＩｇＧ３のＣＨ２ドメインおよび／またはＣＨ３ドメインと置き換えられている、修飾されたＩｇＧ１抗体またはその抗原結合フラグメントが提供される。

サブドメイン分析を介した組み合わされたＣＨ２－ＣＨ３領域のさらなる精査は、ＣＨ２およびＣＨ３のエレメントを含む、残基２８６－３０６および３３９－３７８、合計で２６のｍＩｇＧ３の残基を含む不連続なセクションを移すことにより、ＩｇＧ１に対するｍＩｇＧ３の直接的な細胞傷害性の完全な復帰を明らかにした。２６の残基は、Ｎ２８６Ｔ、Ｋ２８８Ｗ、Ｋ２９０Ｑ、Ｅ２９４Ａ、Ｙ３００Ｆ、Ｖ３０５Ａ、Ａ３３９Ｐ、Ｑ３４２Ｒ、Ｐ３４３Ａ、Ｒ３４４Ｑ、Ｅ３４５Ｔ、Ｌ３５１Ｉ、Ｓ３５４Ｐ、Ｄ３５６Ｅ、Ｅ３５７Ｑ、Ｌ３５８Ｍ、Ｔ３５９Ｓ、Ｎ３６１Ｋ、Ｑ３６２Ｋ、Ｋ３７０Ｔ、Ｇ３７１Ｎ、Ｙ３７３Ｆ、Ｐ３７４Ｓ、Ｓ３７５Ｅ、Ｄ３７６Ａ、Ａ３７８Ｓである。これら残基は、直接相互作用する組み合わせられた作用および立体構造の残基による分子間協同作用を介した機能的な親和性の増大に必要であり、ここで後者は、恐らく許容されるフレームワークをもたらす。また、特にＣＨ２において、電荷分布パターンは、負に荷電した多価抗原に対するｍＩｇＧ３の結合を高めることが示されており、ＩｇＧ１とは異なることから、その役割を無視することはできない（Ｋｌａｕｓ ａｎｄ Ｂｅｒｅｔａ ２０１８； Ｈｏｖｅｎｄｅｎ ｅｔ ａｌ． ２０１３）。本発明者らの手法に関わるこれら残基の一部は、プロテインＡ、プロテインＧ、リウマトイド因子、および新生児ＦｃＲｎなどの多くの天然の結合パートナーに対する大きなコンセンサス結合部位の中にある（ＤｅＬａｎｏ ｅｔ ａｌ． ２０００）。しかしながら、本発明者らの残基は、ＦｃＲｎの結合に直接関与していない（Ｏｇａｎｅｓｙａｎ ｅｔ ａｌ． ２０１４）。

本発明の第３の態様では、Ｆｃ領域の以下の残基：Ｎ２８６、Ｋ２８８、Ｋ２９０、Ｅ２９４、Ｙ３００、Ｖ３０５、Ａ３３９、Ｑ３４２、Ｐ３４３、Ｒ３４４、Ｅ３４５、Ｌ３５１、Ｓ３５４、Ｄ３５６、Ｅ３５７、Ｌ３５８、Ｔ３５９、Ｎ３６１、Ｑ３６２、Ｋ３７０、Ｇ３７１、Ｙ３７３、Ｐ３７４、Ｓ３７５、Ｄ３７６、Ａ３７８のうちの１つ以上に対し修飾を有する、修飾されたＩｇＧ１抗体またはその抗原結合フラグメントが提供される。

本発明の第４の態様では、Ｆｃ領域に対する以下の修飾：Ｎ２８６Ｔ、Ｋ２８８Ｗ、Ｋ２９０Ｑ、Ｅ２９４Ａ、Ｙ３００Ｆ、Ｖ３０５Ａ、Ａ３３９Ｐ、Ｑ３４２Ｒ、Ｐ３４３Ａ、Ｒ３４４Ｑ、Ｅ３４５Ｔ、Ｌ３５１Ｉ、Ｓ３５４Ｐ、Ｄ３５６Ｅ、Ｅ３５７Ｑ、Ｌ３５８Ｍ、Ｔ３５９Ｓ、Ｎ３６１Ｋ、Ｑ３６２Ｋ、Ｋ３７０Ｔ、Ｇ３７１Ｎ、Ｙ３７３Ｆ、Ｐ３７４Ｓ、Ｓ３７５Ｅ、Ｄ３７６Ａ、Ａ３７８Ｓのうちの１つ以上を有する、修飾されたＩｇＧ１抗体またはその抗原結合フラグメントが提供される。

本発明の一部の態様では、修飾されたＩｇＧ１抗体またはその抗原結合フラグメントは、位置Ｎ２８６、Ｋ２８８、Ｋ２９０、Ｅ２９４、Ｙ３００、Ｖ３０５、Ａ３３９、Ｑ３４２、Ｐ３４３、Ｒ３４４、Ｅ３４５、Ｌ３５１、Ｓ３５４、Ｄ３５６、Ｅ３５７、Ｌ３５８、Ｔ３５９、Ｎ３６１、Ｑ３６２、Ｋ３７０、Ｇ３７１、Ｙ３７３、Ｐ３７４、Ｓ３７５、Ｄ３７６、Ａ３７８から選択される１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、または２６の残基での修飾を含む。本発明の好ましい態様では、修飾されたＩｇＧ１抗体またはその抗原結合フラグメントは、２６全ての残基での修飾を含む。

本発明の一部の態様では、修飾されたＩｇＧ１抗体またはその抗原結合フラグメントは、Ｎ２８６Ｔ、Ｋ２８８Ｗ、Ｋ２９０Ｑ、Ｅ２９４Ａ、Ｙ３００Ｆ、Ｖ３０５Ａ、Ａ３３９Ｐ、Ｑ３４２Ｒ、Ｐ３４３Ａ、Ｒ３４４Ｑ、Ｅ３４５Ｔ、Ｌ３５１Ｉ、Ｓ３５４Ｐ、Ｄ３５６Ｅ、Ｅ３５７Ｑ、Ｌ３５８Ｍ、Ｔ３５９Ｓ、Ｎ３６１Ｋ、Ｑ３６２Ｋ、Ｋ３７０Ｔ、Ｇ３７１Ｎ、Ｙ３７３Ｆ、Ｐ３７４Ｓ、Ｓ３７５Ｅ、Ｄ３７６Ａ、およびＡ３７８Ｓから選択される１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、または２６の修飾を含む。本発明の好ましい態様では、修飾されたＩｇＧ１抗体またはその抗原結合フラグメントは、２６全ての修飾を含む。

多くの場合ＦｃγＲまたはＣ１ｑ結合の修飾を介したｍＡｂのエフェクター機能（ＡＤＣＣおよびＣＤＣ）ならびにＦｃＲｎの係合を介したｍＡｂの半減期に及ぼす影響に対する、多くのＦｃ操作の戦略が、文献に記載されている（Ｗａｎｇ， Ｍａｔｈｉｅｕ， ａｎｄ Ｂｒｅｚｓｋｉ ２０１８； Ｃａｒｔｅｒ ２００６）。これら記載は、この特許の一部を形成するアミノ酸の変化を記載していない。さらに、多くのヒトｍＡｂアイソタイプにおけるＦｃ：Ｆｃ相互作用を介した結晶充填が誘導するｍＡｂのオリゴマー化（Ｓａｐｈｉｒｅ ｅｔ ａｌ． ２００１）は、補体の活性化の改善に関して近年記載された六量体ｍＡｂのプラットフォームの基礎を形成した（国際特許公開公報第２０１４／００６２１７号、同第２０１８／０８３１２６号、同第２０１８／１４６３１７号、Ｕｇｕｒｌａｒ ｅｔ ａｌ． ２０１８； ｄｅ Ｊｏｎｇ ｅｔ ａｌ． ２０１６； Ｄｉｅｂｏｌｄｅｒ ｅｔ ａｌ． ２０１４）。効率的な六量体の配置およびＣ１ｑの結合は、本特許の基礎を形成するアミノ酸の変化とは異なる個別の変異（Ｅ３４５ＫまたはＥ４３０Ｇ）に依存していた。実際に、強力なＣＤＣの特性を誘導したこれら変異を介して、ＩＩ型ＣＤ２０ ｍＡｂ １１Ｂ８によるプログラム細胞死（すなわち直接的な細胞傷害性）を誘導する特性は高められず、この位置は直接的な細胞殺滅に寄与しないことが示唆される。

ほとんどの承認された治療用ｍＡｂは、ヒト化されているかまたは完全にヒトのＩｇＧ抗体のいずれかであり、マウスまたはキメラ抗体は、患者における有害な抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）反応の高いリスクを担持する（Ｓｃｈｒｏｆｆ ｅｔ ａｌ． １９８５； Ａｚｉｎｏｖｉｃ ｅｔ ａｌ． ２００６； Ｍｉｏｔｔｉ ｅｔ ａｌ． １９９９； Ｄ’Ａｒｃｙ ａｎｄ Ｍａｎｎｉｋ ２００１）。ＩｇＧ１での２６のｍＩｇＧ３のみの導入は、ＨＡＭＡ応答を誘導しそうにはない。しかしながら、これらは、特定の患者においてＨＡＭＡ応答を駆動する可能性を有するＭＨＣＩＩ結合エピトープをもたらし得る。２６の残基を含むハイブリッド８８ＩｇＧ１の免疫エピトープデータベース（ＩＥＤＢ）分析は、いくつかの可能性のあるハイスコアのエピトープを含むクラスター（クラスター１、残基２９４－３１５）を明らかにした。２９４、３００、および３０５の位置でのクラスター１における３つのｍＩｇＧ３のＩｇＧ１残基への復帰は、機能的な親和性および直接的な細胞傷害性を維持した。重要なことに、この２３のａａモチーフ（Ｎ２８６、Ｋ２８８、Ｋ２９０、Ａ３３９、Ｑ３４２、Ｐ３４３、Ｒ３４４、Ｅ３４５、Ｌ３５１、Ｓ３５４、Ｄ３５６、Ｅ３５７、Ｌ３５８、Ｔ３５９、Ｎ３６１、Ｑ３６２、Ｋ３７０、Ｇ３７１、Ｙ３７３、Ｐ３７４、Ｓ３７５、Ｄ３７６、Ａ３７８）の修飾は、対応するマウスＩｇＧ３残基へと修飾される場合、（Ｎ２８６Ｔ、Ｋ２８８Ｗ、Ｋ２９０Ｑ、Ａ３３９Ｐ、Ｑ３４２Ｒ、Ｐ３４３Ａ、Ｒ３４４Ｑ、Ｅ３４５Ｔ、Ｌ３５１Ｉ、Ｓ３５４Ｐ、Ｄ３５６Ｅ、Ｅ３５７Ｑ、Ｌ３５８Ｍ、Ｔ３５９Ｓ、Ｎ３６１Ｋ、Ｑ３６２Ｋ、Ｋ３７０Ｔ、Ｇ３７１Ｎ、Ｙ３７３Ｆ、Ｐ３７４Ｓ、Ｓ３７５Ｅ、Ｄ３７６Ａ、Ａ３７８Ｓ）であり、直接的な細胞傷害性、細胞の凝集、ポア形成、および最終的な細胞の溶解を誘導した。ポア形成および最終的な細胞の溶解は、ネクロトーシスを伴う類似する細胞の分解の特性を共有するが、壊死または二次的な壊死とは区別できない（Ｖａｎｄｅｎ Ｂｅｒｇｈｅ ｅｔ ａｌ． ２０１０）。恒常的であるかまたは活性化されたストレス経路の結果として誘導される放出されたＤＡＭＰからの結果的なアウトカムは、細胞環境および根底にあるシグナリングカスケードに依存するが、集合的に、さらに放出された腫瘍抗原の交差提示を介して免疫エフェクター機能を高めかつ／または適応免疫応答をもたらし得る炎症性環境をもたらす可能性を有する（Ｙａｔｉｍ， Ｃｕｌｌｅｎ， ａｎｄ Ａｌｂｅｒｔ ２０１７； Ｇａｌｌｕｚｚｉ ｅｔ ａｌ． ２０１７）。

本発明の第５の実施形態では、Ｆｃ領域の以下の残基：Ｎ２８６、Ｋ２８８、Ｋ２９０、Ａ３３９、Ｑ３４２、Ｐ３４３、Ｒ３４４、Ｅ３４５、Ｌ３５１、Ｓ３５４、Ｄ３５６、Ｅ３５７、Ｌ３５８、Ｔ３５９、Ｎ３６１、Ｑ３６２、Ｋ３７０、Ｇ３７１、Ｙ３７３、Ｐ３７４、Ｓ３７５、Ｄ３７６、Ａ３７８のうちの１つ以上に対する修飾を有する、修飾されたＩｇＧ１抗体またはその抗原結合フラグメントが提供される。

本発明の第６の態様では、Ｆｃ領域に対する以下の修飾：Ｎ２８６Ｔ、Ｋ２８８Ｗ、Ｋ２９０Ｑ、Ａ３３９Ｐ、Ｑ３４２Ｒ、Ｐ３４３Ａ、Ｒ３４４Ｑ、Ｅ３４５Ｔ、Ｌ３５１Ｉ、Ｓ３５４Ｐ、Ｄ３５６Ｅ、Ｅ３５７Ｑ、Ｌ３５８Ｍ、Ｔ３５９Ｓ、Ｎ３６１Ｋ、Ｑ３６２Ｋ、Ｋ３７０Ｔ、Ｇ３７１Ｎ、Ｙ３７３Ｆ、Ｐ３７４Ｓ、Ｓ３７５Ｅ、Ｄ３７６Ａ、Ａ３７８Ｓのうちの１つ以上を有する、修飾されたＩｇＧ１抗体またはその抗原結合フラグメントが提供される。

本発明の一部の態様では、修飾されたＩｇＧ１抗体またはその抗原結合フラグメントは、位置Ｎ２８６、Ｋ２８８、Ｋ２９０、Ａ３３９、Ｑ３４２、Ｐ３４３、Ｒ３４４、Ｅ３４５、Ｌ３５１、Ｓ３５４、Ｄ３５６、Ｅ３５７、Ｌ３５８、Ｔ３５９、Ｎ３６１、Ｑ３６２、Ｋ３７０、Ｇ３７１、Ｙ３７３、Ｐ３７４、Ｓ３７５、Ｄ３７６、Ａ３７８から選択される１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、または２３の残基での修飾を含む。本発明の好ましい態様では、修飾されたＩｇＧ１抗体またはその抗原結合フラグメントは、２３全ての残基での修飾を含む。

本発明の一部の態様では、修飾されたＩｇＧ１抗体またはその抗原結合フラグメントは、Ｎ２８６Ｔ、Ｋ２８８Ｗ、Ｋ２９０Ｑ、Ａ３３９Ｐ、Ｑ３４２Ｒ、Ｐ３４３Ａ、Ｒ３４４Ｑ、Ｅ３４５Ｔ、Ｌ３５１Ｉ、Ｓ３５４Ｐ、Ｄ３５６Ｅ、Ｅ３５７Ｑ、Ｌ３５８Ｍ、Ｔ３５９Ｓ、Ｎ３６１Ｋ、Ｑ３６２Ｋ、Ｋ３７０Ｔ、Ｇ３７１Ｎ、Ｙ３７３Ｆ、Ｐ３７４Ｓ、Ｓ３７５Ｅ、Ｄ３７６Ａ、Ａ３７８Ｓから選択される１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、または２３の修飾を含む。本発明の好ましい態様では、修飾されたＩｇＧ１抗体またはその抗原結合フラグメントは、２３全ての修飾を含む。

この２３の修飾のセットは、図９Ａおよび９Ｂの８８抗体で例示されている。

幅広い範囲の腫瘍組織、特に膵臓腫瘍の７０％超、胃腸および結腸直腸の腫瘍の３０％超、ならびに卵巣腫瘍および非小細胞肺がんの腫瘍の２０％超を標的としながら、より好ましい正常組織の分布を有する、シアリル－ジ－Ｌｅｗｉｓ^ａを標的とする１２９ｍＡｂに選択した２３のｍＩｇＧ３残基を導入することによるさらなる検証が示された。興味深いことに、ハイブリドーマにより産生される親の１２９ｍＡｂは、直接的な細胞傷害能を欠如するｍＩｇＧ１である。よって、ＣＯＬＯ２０５に及ぼすナノモル濃度の直接的な細胞殺滅能と一致する、１２９ＩｇＧ１と比較して遅い解離速度を介し機能的な親和性が有意に向上したｉ１２９Ｇ１ ｍＡｂの作製は、本発明者らの手法が、幅広い適用可能性を有し得、結合活性作用に依存する免疫調節性ｍＡｂに関連し得ることを示唆している（Ｗａｎｇ， Ｍａｔｈｉｅｕ， ａｎｄ Ｂｒｅｚｓｋｉ ２０１８）。ｉ１２９Ｇ１により発揮される直接的な細胞殺滅は、ｉ８８Ｇ１と同様の手法：ｍＡｂ誘導性の細胞の凝集の後のポア形成および最終的な細胞の溶解で、自身を提示した。２３のｍＩｇＧ３残基のｉ１２９Ｇ１ ｍＡｂへの導入は、エフェクター機能に関する混合した作用を有し；ＡＤＣＣは有意に低減するが、ナノモル濃度のＥＣ_５０を維持し、ｉ１２９Ｇ１のＣＤＣ活性は有意に増大した。これは、ｉ１２９Ｇ１ではＡＤＣＣがより強力に低減したが、ｉ８８Ｇ１で得られた結果を反映しており、このことは、８８ｍＡｂは糖タンパク質および糖脂質を標的とするのに対し１２９ｍＡｂは糖タンパク質のみを標的とするというグリコ－標的の性質もまたＡＤＣＣの効力に影響することを示唆している。驚くべきことに、ｉ１２９Ｇ１は、効果的な腫瘍制御を呈し、ｉ１２９Ｇ１は、１２９ＩｇＧ１よりも有意に良好な有意な腫瘍体積の減少を呈し、後者は、有意な腫瘍の低減を呈さなかった。これは、１２９ＩｇＧ１の組み合わせたエフェクター機能が、このモデルで腫瘍増殖を制御できないことを表しており、直接的な細胞傷害能を有する価値をさらに強調している。

２３の選択されたｍＧ３残基それぞれの個別の寄与を評価するために、ｉ８８Ｇ１（実施例４）に基づく単一の復帰変異体の戦略を行った。ｉ８８Ｇ１の２３のｍＧ３残基はそれぞれ単独で、ｈＧ１残基に復帰し、この得られたコンストラクトを、直接的な細胞殺滅に関して分析して、２３の上述の残基が、直接的な細胞殺滅能の有意な喪失を伴うことなく１５の残基にさらに低減され得たことが確認された。特に、ｉ８８Ｇ１の６つのｍＩｇＧ３残基は、直接的な細胞殺滅能の有意な喪失を伴うことなくＩｇＧ１残基に復帰できた。これは、１２９ｍＡｂを使用してさらに例証され、ここで１５のｍＩｇＧ３残基の導入がＣＯＬＯ２０５でナノモル濃度の直接的な細胞殺滅を維持した。

免疫原性は、治療の成功に対する主な障壁であり得る。抗薬物抗体は、治療機能を中和し、薬物動態に影響し、恐らくは重篤な副作用をもたらし得る。Ｔ細胞のエピトープは、免疫原性のリスクに寄与しており、ｉｎ ｓｉｌｉｃｏでツールを使用して比較的正確に評価され得る。Ｔ細胞エピトープを同定するためのイムノインフォマティック（Ｉｍｍｕｎｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃ）アルゴリズムが、免疫療法が望ましくない免疫原性をもたらすかどうかを評価および分析するために適用され得る。２６のｍＩｇＧ３残基の存在により作製された本発明者らのハイブリッドＳＤ２８６ ３０６＋３３９ ３７８コンストラクトの潜在的な免疫原性を評価するために、本発明者らは、ＭＨＣＩＩ結合エピトープに関するＳＤ２８６ ３０６＋３３９ ３７８配列のスクリーニングをｉｎ ｓｉｌｉｃｏで行った（Ｉｍｍｕｎｅ Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｄａｔａｂａｓｅ， ＩＥＤＢ）。クラスＩＩ制限Ｔヘルパー細胞は、液性免疫応答により関連しており、予測された結合クラスターがＴ細胞応答の強力な指標であることが示されている（Ｊａｗａ ｅｔ ａｌ． ２０１３）。いくつかの高いスコアの結合エピトープを含む２つのＭＨＣＩＩ結合クラスター：クラスター１（残基２９４－３１５）およびクラスター２（残基３６５－３９３）を同定した（図５／図２０）。クラスター１の中のヒトの残基への３つのマウスの残基、２９４（ＡからＥ）、３００（ＦからＹ）、および３０５（ＡからＶ）の復帰は、個体が寛容化されているヒト配列のセクションをもたらした。同様に、３３９－３７８領域の中の２つの残基３５１（ＩからＬ）および３７１（ＮからＧ）の反転は、２つのＭＨＣＩＩ結合コアを除去した。

１つのｉｎ ｓｉｌｉｃｏで同定された免疫原性クラスターの反転は、主要な候補の、強力な細胞殺滅、ポア形成能、および健全な免疫エフェクター機能を有する、改善された「ｉ」８８Ｇ１をもたらした。

選択された残基を導入する効果が、抗グリカン抗体に限定されないことを示すために、増殖因子受容体のＨＥＲ２を標的とするトラスツズマブ（特に商品名ハーセプチン（登録商標）の下販売）を、関与する残基の移動に供した。結果得られたｉトラスツズマブは、控えめにＨＥＲ２を発現する細胞株に対する定常状態の細胞結合が改善しており、これは、ＰＩの取り込みの増大と一致する。さらに、野生型と比較して遅い解離速度を介して、親和性を改善させた。

本発明の第７の態様では、Ｆｃ領域の以下の残基：Ｎ２８６、Ｋ２８８、Ｋ２９０、Ｑ３４２、Ｐ３４３、Ｅ３４５、Ｌ３５１、Ｔ３５９、Ｎ３６１、Ｑ３６２、Ｇ３７１、Ｐ３７４、Ｓ３７５、Ｄ３７６、Ａ３７８のうちの１つ以上に修飾を有する、修飾されたＩｇＧ１抗体またはその抗原結合フラグメントが提供される。

本発明の第８の態様では、Ｆｃ領域に対し以下の修飾：Ｎ２８６Ｔ、Ｋ２８８Ｗ、Ｋ２９０Ｑ、Ｑ３４２Ｒ、Ｐ３４３Ａ、Ｅ３４５Ｔ、Ｌ３５１Ｉ、Ｔ３５９Ｓ、Ｎ３６１Ｋ、Ｑ３６２Ｋ、Ｇ３７１Ｎ、Ｐ３７４Ｓ、Ｓ３７５Ｅ、Ｄ３７６Ａ、Ａ３７８Ｓのうちの１つ以上を有する、修飾されたＩｇＧ１抗体またはその抗原結合フラグメントが提供される。

この１５の修飾のセットは、図９Ｃおよび９Ｄにおいて抗体１２９および８８で例証されている。

本発明の一部の態様では、修飾されたＩｇＧ１抗体またはその抗原結合フラグメントは、位置Ｎ２８６、Ｋ２８８、Ｋ２９０、Ｑ３４２、Ｐ３４３、Ｅ３４５、Ｌ３５１、Ｔ３５９、Ｎ３６１、Ｑ３６２、Ｇ３７１、Ｐ３７４、Ｓ３７５、Ｄ３７６、Ａ３７８から選択される１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５の残基での修飾を含む。本発明の好ましい態様では、修飾されたＩｇＧ１抗体またはその抗原結合フラグメントは、１５全ての残基での修飾を含む。

本発明の一部の態様では、修飾されたＩｇＧ１抗体またはその抗原結合フラグメントは、Ｎ２８６Ｔ、Ｋ２８８Ｗ、Ｋ２９０Ｑ、Ｑ３４２Ｒ、Ｐ３４３Ａ、Ｅ３４５Ｔ、Ｌ３５１Ｉ、Ｔ３５９Ｓ、Ｎ３６１Ｋ、Ｑ３６２Ｋ、Ｇ３７１Ｎ、Ｐ３７４Ｓ、Ｓ３７５Ｅ、Ｄ３７６Ａ、Ａ３７８Ｓから選択される１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５の修飾を含む。本発明の好ましい態様では、修飾されたＩｇＧ１抗体またはその抗原結合フラグメントは、１５全ての残基での修飾を含む。

本発明の第９の態様ではＦｃ領域の以下の残基：Ｑ３４２、Ｐ３４３、Ｅ３４５、Ｎ３６１、Ｑ３６２、Ｐ３７４、Ｄ３７６のうちの１つ以上に対する修飾を有する、修飾されたＩｇＧ１抗体またはその抗原結合フラグメントが提供される。

本発明の第１０の態様では、Ｆｃ領域に対し以下の修飾：Ｑ３４２Ｒ、Ｐ３４３Ａ、Ｅ３４５Ｔ、Ｎ３６１Ｋ、Ｑ３６２Ｋ、Ｐ３７４Ｓ、Ｄ３７６Ａのうちの１つ以上を有する、修飾されたＩｇＧ１抗体またはその抗原結合フラグメントが提供される。

この７つの修飾のセットは、図９Ｆの抗体８８で例証されている。

本発明の一部の態様では、修飾されたＩｇＧ１抗体またはその抗原結合フラグメントは、位置Ｑ３４２、Ｐ３４３、Ｅ３４５、Ｎ３６１、Ｑ３６２、Ｐ３７４、Ｄ３７６から選択される１、２、３、４、５、６、または７の残基での修飾を含む。本発明の好ましい態様では、修飾されたＩｇＧ１抗体またはその抗原結合フラグメントは、７つ全ての残基での修飾を含む。

本発明の一部の態様では、修飾されたＩｇＧ１抗体またはその抗原結合フラグメントは、Ｑ３４２Ｒ、Ｐ３４３Ａ、Ｅ３４５Ｔ、Ｎ３６１Ｋ、Ｑ３６２Ｋ、Ｐ３７４Ｓ、Ｄ３７６Ａから選択される１、２、３、４、５、６、または７つの修飾を含む。本発明の好ましい態様では、修飾されたＩｇＧ１抗体またはその抗原結合フラグメントは、７つ全ての修飾を含む。

本発明の一態様では、修飾されたＩｇＧ１抗体またはその抗原結合フラグメントは、図１５に開示される配列の１つ以上を含む。本発明の一態様では、図１５に開示される重鎖および軽鎖の配列を含む修飾されたＩｇＧ１抗体またはその抗原結合フラグメントが提供される。

本発明の一態様では、修飾されたＩｇＧ１抗体またはその抗原結合フラグメントは、図１６に開示される配列の１つ以上を含む。本発明の一態様では、図１６に開示される重鎖および軽鎖の配列を含む修飾されたＩｇＧ１抗体またはその抗原結合フラグメントが提供される。

本発明の一態様では、修飾されたＩｇＧ１抗体またはその抗原結合フラグメントは、図１７に開示される配列の１つ以上を含む。本発明の一態様では、図１７に開示される重鎖および軽鎖の配列を含む修飾されたＩｇＧ１抗体またはその抗原結合フラグメントが提供される。

本発明の一態様では、修飾されたＩｇＧ１抗体またはその抗原結合フラグメントは、図１９に開示される配列の１つ以上を含む。本発明の一態様では、図１９に開示される重鎖および軽鎖の配列を含む修飾されたＩｇＧ１抗体またはその抗原結合フラグメントが提供される。

本発明の一部の態様では、「対応するＩｇＧ１抗体またはその抗原結合フラグメント」は、対応するマウスＩｇＧ３残基に対し全く変化を伴わないネイティブな残基を含む修飾されていない（すなわち野生型の）抗体またはその抗原結合フラグメントを表す。本発明の一部の態様では、対応するＩｇＧ１抗体またはその抗原結合フラグメントは、修飾されたＩｇＧ１抗体またはその抗原結合フラグメントと同じ標的（複数可）（たとえば同じエピトープ）に結合する。本発明の一部の態様では、修飾されたＩｇＧ１抗体またはその抗原結合フラグメントおよび対応する修飾されていないＩｇＧ１抗体またはその抗原結合フラグメントは、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、または少なくとも６個の同じＣＤＲ配列（すなわちＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２、ＶＨＣＤＲ３、ＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２、ＶＬＣＤＲ３）を含む。本発明の一部の態様では、修飾されたＩｇＧ１抗体またはその抗原結合フラグメントおよび対応する修飾されていないＩｇＧ１抗体またはその抗原結合フラグメントは、同じ結合領域配列を含む。本発明の一部の態様では、修飾されたＩｇＧ１抗体またはその抗原結合フラグメントおよび対応する修飾されていないＩｇＧ１抗体またはその抗原結合フラグメントは、同じ可変領域配列（たとえば同じ可変重鎖配列および／または同じ可変軽鎖配列）を含む。

本発明の一部の態様では、「結合領域」は、標的抗原への結合に寄与する抗体またはその抗原結合フラグメントの一部を表す。たとえば、これは、重鎖および軽鎖のそれぞれの１つの定常領域および１つの可変領域を含み得る。本発明の一部の態様では、結合領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）配列（すなわちＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２、ＶＨＣＤＲ３、ＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２、ＶＬＣＤＲ３）を表し得る。

ＩｇＧ１抗体またはその抗原結合フラグメントの構造は、全般的に、抗体の重鎖もしくは軽鎖配列またはその実質的な一部である。イムノグロブリンドメインの構造および位置は、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ／を参照することにより決定され得る。

本明細書を通して、残基のナンバリングは、Ｌｅｆｒａｎｃ ＭＰ， Ｇｉｕｄｉｃｅｌｌｉ Ｖ， Ｇｉｎｅｓｔｏｕｘ Ｃ， Ｊａｂａｄｏ－Ｍｉｃｈａｌｏｕｄ Ｊ， Ｆｏｌｃｈ Ｇ， Ｂｅｌｌａｈｃｅｎｅ Ｆ， ｅｔ ａｌ． ＩＭＧＴ， ｔｈｅ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ． Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ ｒｅｓｅａｒｃｈ． ２００９；３７：Ｄ１００６－１２に開示される、抗体配列のナンバリングのための標準化されたＩＭＧＴシステムを表す。他の適切なナンバリングシステムは、当業者に知られている。他の適切なナンバリングシステムが、修飾されたＩｇＧ１抗体とその抗原結合フラグメントとの間またはその抗原結合フラグメント間で対応する残基を同定するために使用され得る。対応する残基の同定を可能にする全てのナンバリングシステムが、本発明での使用に適している。本明細書中使用されるナンバリングシステムは、本発明の範囲を限定するものではなく、単純に修飾され得る関連する残基を同定するために使用される。用語「対応する残基」は、比較される２つ以上の抗体またはその抗原結合フラグメントにおける構造的または機能的に同等な位置の残基を意味するように意図されている。場合により、対応する残基は、配列アライメントにより同定され得る。場合により、対応する残基は、構造の比較により同定され得る。

本発明の一部の態様では、イムノグロブリンのＦｃ領域の１つ以上の残基を含むＩｇＧ１抗体またはその抗原結合フラグメントは、少なくとも１０アミノ酸残基のＦｃ領域、少なくとも２０アミノ酸残基のＦｃ領域、少なくとも３０アミノ酸残基のＦｃ領域、少なくとも４０アミノ酸残基のＦｃ領域、少なくとも５０アミノ酸残基のＦｃ領域、少なくとも７５アミノ酸残基のＦｃ領域、少なくとも１００アミノ酸残基のＦｃ領域、少なくとも２００アミノ酸残基のＦｃ領域、少なくとも３００アミノ酸残基のＦｃ領域、少なくとも４００アミノ酸残基のＦｃ領域、または少なくとも５００アミノ酸残基のＦｃ領域を含む。好ましくは、ＩｇＧ１抗体またはその抗原結合フラグメントは、イムノグロブリンのＦｃ領域全体を含む。

本発明の一部の態様では、Ｆｃ領域の１つ以上の残基は、ＣＨ２ドメインおよび／またはＣＨ３ドメインから選択される。一部の態様では、１つ以上の残基は、ＣＨ２ドメインから選択される。一部の態様では、１つ以上の残基は、ＣＨ３ドメインから選択される。

本発明の一部の態様では、修飾されたＩｇＧ１抗体またはその抗原結合フラグメントおよび対応する野生型のＩｇＧ１抗体またはその抗原結合フラグメントの機能的な親和性の決定が、表面プラズモン共鳴（たとえばＢｉａｃｏｒｅ ３０００／ Ｔ２００， ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）により、たとえば増大する濃度（０．３ｎｍｏｌ／Ｌ～２００ｎｍｏｌ／Ｌ）のＩｇＧ１抗体またはその抗原結合フラグメントを、適切なリガンドを含むＣＭ５チップを通し注入し、適切なソフトウェア（たとえばＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ４．１）を使用してこのデータを適切な結合モデルに適合することにより、行われ得る。同じ条件を使用する対応する実験が、修飾されたＩｇＧ１抗体またはその抗原結合フラグメントで行われ得る。本発明の一部の態様では、修飾されたＩｇＧ１抗体またはその抗原結合フラグメントは、表面プラズモン共鳴のデータが、修飾されたＩｇＧ１抗体またはその抗原結合フラグメントがリガンドでコーティングされたＣＭ５チップにより強固に結合することを表す場合、対応する野生型のＩｇＧ１抗体またはその抗原結合フラグメントに対し高い機能的な親和性を示す。リガンドは、グリカン－ＨＳＡおよび抗グリカン抗体に関する対照コンジュゲートを含む。

抗ヒス抗体でコーティングされたＢｉａｃｏｒｅ ＣＭ５チップは、金の表面に共有結合したカルボキシメチル化デキストランを含む。分子は、アミン基、チオール基、アルデヒド基、またはカルボキシル基を介してセンサーの表面に共有結合する。薬物候補などの有機小分子から大分子のアセンブリまたはウイルス全体にまで及ぶ相互作用が試験され得る。高い結合能は、高い応答を提供し、これは、捕捉アッセイおよび小分子が関与する相互作用に好適である。著しい表面の安定性は、正確性および精度を提供し、同じ表面での反復した分析を可能にする。他の適切なチップが当業者に知られており、表面プラズモン共鳴のプロトコルは、当該分野で知られている標準的な技術により適応され得る。

本発明の一部の態様では、修飾されたＩｇＧ１抗体またはその抗原結合フラグメントおよび対応する野生型のＩｇＧ１抗体またはその抗原結合フラグメントの直接的な細胞殺滅は、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）の取り込みにより、たとえばＩｇＧ１抗体またはその抗原結合フラグメントをＣＯＬＯ２０５またはＨＣＴ－１５細胞（５×１０^４）と３７℃で２時間インキュベートし、次に１μｇのＰＩを３０分間添加し、細胞をＰＢＳで再懸濁し、フローサイトメーター（たとえばＢｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ ＦＣ－５００またはＭＡＣＳＱｕａｎｔ １０）で細胞を処理し、適切なソフトウェア（たとえばＷｉｎＭＤＩ ２．９またはＦｌｏｗＪｏ ｖ１０）で結果を分析することにより、決定され得る。同じ条件を使用する対応する実験が、修飾されたＩｇＧ１抗体またはその抗原結合フラグメントで行われ得る。本発明の一部の態様では、修飾されたＩｇＧ１抗体またはその抗原結合フラグメントは、ＰＩの取り込みが、細胞が修飾されたＩｇＧ１抗体またはその抗原結合フラグメントとインキュベートされる場合に高い場合、対応する野生型のＩｇＧ１抗体またはその抗原結合フラグメントよりも高い直接的な細胞殺滅を提供する。

修飾されたＩｇＧ１抗体またはその抗原結合フラグメントの機能的な特性の改善は、Ｆｃ領域に修飾された残基を含まない野生型のＩｇＧ１抗体またはその抗原結合フラグメントの対応する機能的な特性と比較して測定される。改善された機能的な特性は、相対的な尺度であるため、請求されるＩｇＧ１抗体またはその抗原結合フラグメントの機能的な親和性および／もしくは直接的な細胞殺滅、または他のいずれかの機能的な特性を決定するために使用される精確な方法は、この機能的な特性の相対的な変化に影響を与えない。抗体およびその抗原結合フラグメントの機能的な特性を測定する多くの適切な方法が、当業者に知られている。これら機能的な特性を測定するいずれかの適切な方法が、請求される修飾されたＩｇＧ１抗体およびその抗原結合フラグメントまたはその抗原結合フラグメントの機能的な特性を測定するために使用され得るが、ただし公平な比較のため、同じ方法が、対応する野生型のＩｇＧ１抗体またはその抗原結合フラグメントに適用される。

分子間協同作用による結合を確立することを介した、機能的な親和性および直接的な細胞傷害性が高い改善されたがんグリカンを標的とするｍＡｂの作製は、優れた臨床上の有用性をもたらし得る。またこの手法は、反復するかまたは高密度の抗原を標的とする他のｍＡｂにも価値があり得る。さらに、多くのグリカンを標的とするｍＩｇＧ３ ｍＡｂで観察される通常にはない炎症促進性細胞殺滅モードをＩｇＧ１フレームワークへ復帰させることは、他の免疫療法と組み合わせて使用される可能性を有する。

本発明の修飾されたＩｇＧ１抗体は、ヒトまたは動物の対象の腫瘍の診断および処置の方法に使用され得る。診断に使用される場合、本発明の修飾されたＩｇＧ１抗体およびその抗原結合フラグメントは、検出可能な標識、たとえば、抗体イメージングの分野で知られている従来の化学技術を使用して本発明の修飾されたＩｇＧ１抗体に結合し得る、ＩまたはＴｃなどの放射標識で標識され得る。また標識は、西洋ワサビペルオキシダーゼなどの酵素標識を含む。さらに標識として、特異的な同族の検出可能な部分、たとえば標識されたアビジンに対する結合を介して検出され得るビオチンなどの化学的な部分が挙げられる。本発明の修飾されたＩｇＧ１抗体およびその抗原結合フラグメントは、それ自体ががん細胞の殺滅に有効であることが示されているが、これらはさらに機能的な標識で標識され得る。機能的な標識は、がんの破壊を引き起こすために当該がんの部位に対し標的化されるように設計されている物質を含む。このような機能的な標識として、リシンなどの毒素および細菌性カルボキシペプチダーゼまたはニトロレダクターゼなどの酵素が挙げられ、これらは、プロドラッグを活性薬物に変換できる。さらに、修飾されたＩｇＧ１抗体およびその抗原結合フラグメントは、化学療法剤または細胞傷害剤、たとえばマイタンシン（ＤＭｌおよびＤＭ４）、オニド（ｏｎｉｄｅｓ）、アウリスタチン、カリケアマイシン、デュオカルマイシン（ｄｕｏｃａｍｙｃｉｎ）、ドキソルビシン９０ １３１、または放射標識、たとえばＹもしくはＩと結合または他の方法で関連し得る。さらに、本発明の修飾されたＩｇＧ１抗体およびその抗原結合フラグメントは、単独でか、または他の処置と組み合わせて処置される状態に応じて同時もしくは連続して、投与され得る。よって、本発明は、本発明の修飾されたＩｇＧ１抗体およびその抗原結合フラグメントと、腫瘍の処置での同時、別々、または連続的な使用のための併用される製剤としての有効な作用物質とを含む製品をさらに提供する。有効な作用物質は、本発明の修飾されたＩｇＧ１抗体およびその抗原結合フラグメントと相乗的に作用し得る、５－フルオロウラシル、シスプラチン、マイトマイシンＣ、オキサリプラチン、およびタモキシフェンを含む、化学療法剤または細胞傷害剤を含み得る。他の有効な作用物質は、適切な容量の疼痛を軽減する薬物、たとえば非ステロイド系抗炎症性薬物（たとえばアスピリン、パラセタモール、イブプロフェン、もしくはケトプロフェン）またはオピエート、たとえばモルヒネもしくは鎮吐剤を含み得る。

理論により拘束されることを望むものではないが、腫瘍の殺滅を高めるために有効な作用物質と相乗的に協同する本発明の修飾されたＩｇＧ１抗体およびその抗原結合フラグメントの特性は、免疫エフェクター機構によるものでなくてもよく、むしろ、細胞表面レセプターに対する修飾されたＩｇＧ１抗体およびその抗原結合フラグメントの結合の直接的な結果であり得る。本発明の修飾されたＩｇＧ１抗体およびその抗原結合フラグメントは、通常、修飾されたＩｇＧ１抗体およびその抗原結合フラグメントに加えて少なくとも１つの成分を含み得る医薬組成物の形態で投与される。

本医薬組成物は、有効成分に加え、薬学的に許容される賦形剤、希釈剤、担体、バッファー、安定化剤、または当業者によく知られている他の物質を含み得る。このような物質は非毒性でなければならず、有効成分の効果を妨げるべきではない。担体または他の物質の精確な性質は、投与経路に応じて変化し、これは、経口であるか、またはたとえば静脈内注射といった注射によるものであり得る。好ましい投与経路は、静脈内である。

注射は、カテーテルまたは他の外科的なチューブを介した送達も使用されるが、本組成物の治療上の投与にとって主要な経路であることが想定されている。一部の適切な投与経路として、静脈内投与、皮下投与、腹腔内投与、および筋肉内投与が挙げられる。液体製剤は、粉末の製剤からの再構成の後に利用され得る。

静脈内注射または罹患部位での注射では、有効成分は、パイロジェンフリーであり、適切なｐＨ、等張性、および安定性を有する非経口的に許容される水溶液の形態である。当業者は、たとえば塩化ナトリウム注射液、リンゲル液、乳酸加リンゲル液などの等張性ビヒクルを使用して適切な溶液を調製することができる。保存剤、安定化剤、バッファー、抗酸化剤、および／または他の添加剤が、必要に応じて含まれ得る。

経口投与用の医薬組成物は、錠剤、カプセル剤、散剤、または液体の形態であり得る。錠剤は、ゼラチンまたはアジュバントなどの固体の担体を含み得る。液体の医薬組成物は、全般的に、水、石油、動物性または植物性の油、鉱物油または合成油などの液体の担体を含む。生理食塩水、デキストロース、または他の糖類の溶液またはグリコール、たとえばエチレングリコール、プロピレングリコール、もしくはポリエチレングリコールが含まれ得る。製剤が液体である場合、これは、たとえば、ｐＨ６．８～７．６の非リン酸塩バッファーを含む生理的な塩の溶液、または凍結乾燥した粉末であり得る。

また本組成物は、血液を含む特定の組織に置かれるマイクロスフィア、リポソーム、他のマイクロ粒子送達システム、または徐放製剤を介して、投与され得る。徐放担体の適切な例は、共有される物品、たとえば座薬またはマイクロカプセルの形態における半浸透性ポリマーマトリックスを含む。埋め込む可能であるかまたはマイクロカプセルの徐放マトリックスとして、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号；欧州特許公開公報第００５８４８１号）Ｌ－グルタミン酸およびγエチル－Ｌ－グルタマートのコポリマー［４３］、ポリ（２－ヒドロキシエチル－メタクリラート）が挙げられる。ポリペプチドを含むリポソームは、よく知られている方法：（Ｅｐｐｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ． １９８５； Ｈｗａｎｇ， Ｌｕｋ， ａｎｄ Ｂｅａｕｍｉｅｒ １９８０）；欧州特許公開公報第００５２５２２号；同第００３６６７６号；同第００８８０４６号；同第０１４３９４９号；同第０１４２５４１号；ＪＰ－Ａ－８３－１１８０８；米国特許第４，４８５，０４５号および同第４，５４４，５４５号により調製される。通常、リポソームは、小さな（約２００～８００オングストローム）の単層型であり、ここでの脂質含有量は、約３０ｍｏｌ％超のコレステロールであり、選択される比率は、ポリペプチドの漏出に最適な比率で調節されている。本組成物は、腫瘍部位もしくは他の望ましい部位への局在化した方法で投与され得るか、または腫瘍もしくは他の細胞を標的とする方法で送達され得る。

本組成物は、好ましくは、「治療上有効量」で個体に投与され、これは、個体に利点を示すために十分な量である。実際に投与される量、および比率、および投与の時間経過は、処置されるものの性質および重症度に応じて変化する。処置の処方、たとえば用量の決定などは、一般医および他の医師の責任の範囲内にあり、通常、処置される障害、個別の患者の状態、送達部位、投与方法、および医師に知られている他の要因を考慮する。本発明の組成物は、特に、既存の腫瘍、特にがんの処置、および最初の処置または外科手術の後の当該病態の再発の予防に関連する。上述の技術およびプロトコルの例は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １６ ｅｄｉｔｉｏｎ Ｏｓｌｏ，Ａ （ｅｄ） １９８０で見出され得る。

最適な用量は、たとえば年齢、性別、体重、処置される病態の重症度、投与される有効成分、および投与経路を含む多くのパラメータに基づき医師により決定され得る。一般的に、受容体の飽和を許容するポリペプチドおよび抗体の血清中濃度が望ましい。通常、約１ｎＭ（ｌｎＭ）超の濃度が十分である。たとえば１００ｍｇ／ｍ^２の用量の抗体は、約８日間、約２０ｎＭの血清中濃度を提供する。おおよそのガイドラインとして、抗体の用量は、１０～３００ｍｇ／^２の量で毎週提供され得る。同等の用量の抗体フラグメントは、グリカンの飽和を許容する濃度を上回る血清レベルを維持するために、より頻繁な間隔で使用される。

本組成物の用量は、修飾されたＩｇＧ１抗体およびその抗原結合フラグメントの特性、たとえばその結合活性およびｉｎ ｖｉｖｏでの血漿中半減期、製剤におけるポリペプチドの濃度、投与経路、投与部位および投与速度、関与する患者の臨床的耐性、患者を苦しめる病態などに応じて変化し、これは医師の技能の範囲内にある。たとえば、患者あたりに、投与あたり３０００ｇの用量の抗体が好ましいが、用量は、投与あたり約１０μｇ～６ｍｇの範囲であり得る。一連の接種のシリーズの間で、異なる容量が利用され；医師は、最初の接種を行った後、比較的小さい用量の抗体でブーストを行い得る。

本発明の修飾されたＩｇＧ１抗体およびその抗原結合フラグメントは、全体的または部分的に化学的合成により、作製され得る。修飾されたＩｇＧ１抗体およびその抗原結合フラグメントは、良好に確立されている標準的な液相または好ましくは固相ペプチド合成法（この方法の全般的な説明は、広く利用可能である（たとえばＪ．Ｍ． Ｓｔｅｗａｒｔ ａｎｄ Ｊ．Ｄ． Ｙｏｕｎｇ， （１９８４） ［４６］， ｉｎ Ｍ． Ｂｏｄａｎｚｓｋｙ ａｎｄ Ａ． Ｂｏｄａｎｚｓｋｙ， （１９８４）を参照））により容易に調製でき；またはこれらは、溶液において、液相法、もしくは固相、液相、および溶液の化学技術のいずれかの組み合わせにより、たとえば最初に各ペプチド部分を完成させ、次に、必要に応じて望ましい場合に、存在する全ての保護基を除去した後、各炭酸もしくはスルホン酸もしくはその反応性誘導体の反応による残基Ｘの導入により、調製され得る。

本発明に係る修飾されたＩｇＧ１抗体およびその抗原結合フラグメントを産生させる別の簡便な方法は、発現系で核酸を使用することにより、それらをコードする核酸を発現させることである。さらに本発明は、本発明の修飾されたＩｇＧ１抗体およびその抗原結合フラグメントをコードする単離された核酸を提供する。核酸は、ＤＮＡおよびＲＮＡを含む。当業者は、本発明の修飾されたＩｇＧ１抗体およびその抗原結合フラグメントをさらに提供する当該核酸に対する置換、欠失、および／または付加を決定することができる。

また本発明は、上述の少なくとも１つの核酸を含むプラスミド、ベクター、転写または発現カセットの形態のコンストラクトを提供する。また本発明は、上記の１つ以上のコンストラクトを含む組み換え宿主細胞を提供する。上述されるように、本発明の修飾されたＩｇＧ１抗体およびその抗原結合フラグメントをコードする核酸は、それに関するコードした核酸からの発現を含む修飾されたＩｇＧ１抗体およびその抗原結合フラグメントの産生方法と同様に、本発明の一態様を形成する。発現は、核酸を含む組み換え宿主細胞を適切な条件下で培養することにより簡便に達成され得る。発現により産生された後、修飾されたＩｇＧ１抗体およびその抗原結合フラグメントは、いずれかの適切な技術を使用して単離および／または精製され、その後適宜使用され得る。様々な異なる宿主細胞におけるポリペプチドのクローニングおよび発現のためのシステムは、よく知られている。適切な宿主細胞として、細菌、哺乳類細胞、酵母、およびバキュロウイルスの系が挙げられる。異種性ポリペプチドの発現のための当該分野で利用可能な哺乳類細胞株として、チャイニーズハムスター卵巣細胞、ヒーラ細胞、ベビーハムスター腎臓細胞、ＮＳＯマウスメラノーマ細胞、および多くの他の細胞が挙げられる。一般的な好ましい細菌の宿主は、大腸菌である。大腸菌などの原核細胞における抗体および抗体フラグメントの発現は、当該分野で良好に確立されている。概説として、たとえば（Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ １９９１）を参照されたい。培養での真核細胞での発現もまた、修飾されたＩｇＧ１抗体およびその抗原結合フラグメントの産生のための選択肢として当業者が利用可能である。最近の概説として、たとえば（Ｒｅｆｆ １９９３； Ｔｒｉｌｌ， Ｓｈａｔｚｍａｎ， ａｎｄ Ｇａｎｇｕｌｙ １９９５）を参照されたい。

プロモーター配列、転写終結配列、ポリアデニル化配列、エンハーサー配列、マーカー遺伝子、および他の配列を適宜含む適切な制御配列を含む適切なベクターが、選択または構築され得る。ベクターは、適宜、プラスミド、ウイルス、たとえばファージまたファージミドであり得る。さらなる詳細に関しては、たとえば、（Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｆｒｉｔｓｃｈ， ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ １９８９）を参照されたい、たとえば核酸のコンストラクト、突然変異誘発、シーケンシング、ＤＮＡの細胞への導入、および遺伝子発現の調製、ならびにタンパク質の分析において、核酸を操作するための多くの知られている技術およびプロトコルは、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ． ， １９９２ （Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ． １９９２）に詳述されている。

よって、本発明のさらなる態様は、本明細書中開示される核酸を含む宿主細胞を提供する。さらなる態様は、このような核酸を宿主細胞に導入することを含む方法を提供する。この導入は、いずれかの利用可能な技術を使用し得る。真核細胞では、適切な技術は、リン酸カルシウムのトランスフェクション、ＤＥＡＥ－デキストラン、エレクトロポレーション、リポソームが介在するトランスフェクション、およびレトロウイルスまたは他のウイルス、たとえばワクシニアウイルスまたは昆虫細胞ではバキュロウイルスを使用する形質導入を含み得る。細菌細胞では、適切な技術は、塩化カルシウムの形質転換、エレクトロポレーション、およびバクテリオファージを含むトランスフェクションを含み得る。導入を行った後に、たとえば遺伝子発現のための条件下で宿主細胞を培養することにより、核酸からの発現がもたらされ得るかまたは可能となり得る。一実施形態では、本発明の核酸は、宿主細胞のゲノム（たとえば染色体）に統合される。統合は、標準的な技術による、ゲノムとの組み換えを促進する配列の包含により促進され得る。また本発明は、上記の修飾されたＩｇＧ１抗体およびその抗原結合フラグメントを発現するための発現系において上述のコンストラクトを使用することを含む方法を提供する。

フラグメント結晶化可能領域（Ｆｃ領域）は、Ｆｃ受容体と呼ばれる細胞表面受容体および補体系のいくつかのタンパク質と相互作用する抗体の尾領域である。この部分は、抗体に免疫系を活性化させる。ＩｇＧ抗体のアイソタイプでは、Ｆｃ領域は、抗体の２つの重鎖の第２および第３の定常ドメインに由来する、２つの同一のタンパク質フラグメントから構成される。ＩｇＧのＦｃ領域は、著しく保存されているＮ－グリコシル化部位を含む。

ＩｇＧのＦｃ（フラグメント、結晶化可能）は、それぞれがＣＨ３に融合したＣＨ２を有する、抗体のＨＣドメインの対形成されたセットからなり、約５０ｋＤａの構造を形成する。「フラグメント、結晶化可能」（Ｆｃ）の名称は、血清に由来するミエローマのＩｇＧフラクションのパパインでの切断の後に、結晶化され得る唯一のフラグメントが対形成されたＣＨ２－ＣＨ３フラグメントであったという事実から来ている。

Ｆｃの中で、２つのＣＨ３ドメインは、互いにきつく結合しており、対して２つのＣＨ２ドメインは、互いに対し直接的なタンパク質間の接触を有していない。オリゴ糖は、２つのＣＨ２ドメインのそれぞれの中のアスパラギン－２９７（Ｎ２９７）に結合し、２つのＣＨ２の間の空間の一部を充填する。一部の結晶構造では、水素結合が、直接かつ水分子の架橋を介して、２つの炭化水素鎖の間で観察される。抗体は、著しく分割された分子であるかのように思われるが、Ｆｃの構造は、目的の抗原に対するＦＡｂの結合に影響を与えることができ、同様に、ＦＡｂにおける可変鎖の中身は、様々な受容体に対するＦｃの結合に影響を与え得ることが示されている。近年の円二色性試験から、ＩｇＧのＦＡｂアームとＦｃとの間に有意な構造上のカップリングが確認された。よって、ＩｇＧ分子は、異なるドメインが長い距離であっても有意に相互作用する著しく複雑な分子である。

二価／多価抗体は、エピトープと相互作用する結合ドメインを含み、合成の二価／多価のリガンドは、標的部位と相互作用するファーマコフォアを含む。用語「機能的な親和性」はまた、二価／多価に関連する明らかな親和性の増大を表すために使用され得る。この用語は「結合活性」と同義である。

結合活性は、タンパク質受容体とそのリガンドとの間などの個別の非共有結合の相互作用の複数の親和性の集積された強度を表し、また、「機能的な親和性」とも表され得る。よって、結合活性は、単一の相互作用の強度を説明する、固有の親和性とは明らかに異なる。しかしながら、個別の結合イベントは、他の相互作用が起こる可能性を増大させる（すなわち結合部位の近くでそれぞれが結合するパートナーの局所的な濃度を増大させる）ため、結合活性は、単に成分の親和性の合計として考えるべきではなく、生体分子の相互作用に関与する全ての親和性の組み合わされた作用として考えるべきである。「固有の親和性（ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ ａｆｆｉｎｉｔｙ）」と「機能的な親和性」との間の区別の有用性は、各用語に関与する異なる強調から生じる。前者は、抗体の結合部位（ａｎｔｉｂｏｄｙ ｃｏｍｂｉｎｉｎｇ ｓｉｔｅ）とリガンドの相補領域との間の構造上の関係が調査中である場合か、または特異的な相互作用の動的な機構が調査中である場合に最も有用である。他方で、後者は、本発明の場合におけるように、親和性の亢進の定量的な測定が実施される場合に特に有用である。

「機能的な親和性」および「固有の親和性」は、以下のように形式的に同一の可逆的なプロセスを表す：

（式中、Ｆ_１は、一価の抗体フラグメントであり、Ｌ_１は一価のリガンドであり、Ａｂ_ｎは、多価抗体であり、Ｌ_ｍは、ｍ基を有する多価リガンドである）。各例では、２つの動態の単位は、１つの単位を形成するために可逆的に組み合わさり、各プロセスは、原則的に、結合定数を特徴とし得る。結合定数は、熱力学的な親和性の尺度であるため、親和性の定量的な値が、両プロセスに割り当てられ得る。

抗体および抗原結合分子のフラグメント
本発明の抗原結合分子は、抗体のフラグメント、具体的には抗体の抗原結合フラグメントであり得る。抗原結合フラグメントは、１つ以上の抗原結合領域を含む。全抗体のフラグメントは、抗原結合の機能を行うことができることが示されている。結合フラグメントの例は、（ｉ）ＶＬドメイン、ＶＨドメイン、ＣＬドメイン、およびＣＨ１ドメインからなるＦａｂフラグメント；（ｉｉ）ＶＨドメインおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄフラグメント；（ｉｉｉ）単一の抗体のＶＬドメインおよびＶＨドメインからなるＦｖフラグメント；（ｉｖ）ＶＨドメインからなるｄＡｂフラグメント（Ｗａｒｄ， Ｅ．Ｓ． ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４－５４６（１９８９））；（ｖ）単離されたＣＤＲ領域；（ｖｉ）２つの結合したＦａｂフラグメントを含む二価フラグメントである、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント；（ｖｉｉ）ＶＨドメインおよびＶＬドメインが、抗原結合部位を形成するために２つのドメインを結合させるペプチドリンカーにより結合している、一本鎖Ｆｖ分子（ｓｃＦｖ）（Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３－４２６ （１９８８）；Ｈｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．， ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８５：５８７９－５８８３ （１９８８））；（ｖｉｉｉ）二重特異性の一本鎖Ｆｖ二量体（国際特許公開公報第９２／０９９６５号）、ならびに（ｉｘ）「ジアボディ」（遺伝子融合により構築される多価または多重特異性フラグメント）（国際特許公開公報第９４／１３８０４号；Ｐ． Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０： ６４４４－６４４８ （１９９３））である。通常、フラグメントは、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２もしくはＦｖフラグメント、またはｓｃＦｖ分子である。

ジアボディは、各ポリペプチドがイムノグロブリン軽鎖の結合領域を含む第１のドメインと、イムノグロブリン重鎖の結合領域を含む第２のドメインとを含み、２つのドメインは（たとえばペプチドリンカーにより）結合しているが、抗原結合部位を形成するために互いには結合できない、ポリペプチドの多量体である：抗原結合部位は、多量体の中の１つのポリペプチドの第１のドメインの、多量体の中の別のポリペプチドの第２のドメインとの結合により形成される（国際特許公開公報第９４／１３８０４号）。

二重特異性抗体が使用される場合、これらは、従来の二重特異性抗体であってよく、様々な方法（Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ ＆ Ｗｉｎｔｅｒ， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ４：４４６－４４９ （１９９３））で製造することができ、たとえば化学的にもしくはハイブリッドハイブリドーマから調製され得、または、以下に記載の二重特異性抗体フラグメントのいずれかであり得る。全抗体よりもｓｃＦｖ二量体またはジアボディを使用することが好ましいとされ得る。ジアボディおよびｓｃＦｖは、可変ドメインのみを使用して、Ｆｃ領域を用いることなく構築することができ、これにより抗イディオタイプの反応の作用を低減させ得る。二重特異性抗体の他の形態として、Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．， ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ １０：３６５５－３６５９ （１９９１）に記載の一本鎖「Ｊａｎｕｓｉｎｓ」が挙げられる。

二重特異性抗体は、２つの抗原または２つのエピトープなどの、２つの標的分子に同時に結合できる抗体である。二重特異性抗体はまた、二重結合抗体とも呼ばれ得る。二重特異性抗体の形式の例として、限定するものではないが、（ｍＡｂ）２、Ｆｃａｂ、Ｆ（ｍＡｂ’）２、クアドローマ、ｓｃＦｖ（一本鎖可変フラグメント）、ｂｓＤｂ（二重特異性ジアボディ）、ｓｃＢｓＤｂ（一本鎖二重特異性ジアボディ）、ＢｉＴＥ（二重特異性Ｔ細胞誘導抗体）、ＤＡＲＴ（ｄｕａｌ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｒｅ－ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）、電荷対、タンデム抗体、タンデムｓｃＦｖ－Ｆｃ、Ｆａｂ－ｓｃＦｖ－Ｆｃ、Ｆａｂ－ｓｃＦｖ、ミニボディ、ｚｙｂｏｄｙ、ＤＮＬ－Ｆ（ａｂ）３（ｄｏｃｋ－ａｎｄ－ｌｏｃｋ ｔｒｉｖａｌｅｎｔ Ｆａｂｓ）、ｂｓｓｄＡｂ（二重特異性単一ドメイン抗体）、およびｋｎｏｂｓ－ｉｎ－ｈｏｌｅｓが挙げられる。

二重特異性ジアボディはまた、二重特異性全抗体とは反対に、大腸菌で容易に構築および発現できるため、有用であり得る。適切な結合特異性のジアボディ（および多くの他のポリペプチド、たとえば抗体フラグメント）は、ファージディスプレイ（国際特許公開公報第９４／１３８０４号）を使用してライブラリーから容易に選択され得る。ジアボディの１つのアームが、たとえば抗原Ｘに対する特異性を有しつつ、一定であり続ける場合、他のアームが変動するライブラリーを作製でき、適切な特異性の抗体が選択され得る。

本発明の一部の態様では、同じまたは異なる分子の少なくとも２つの異なるエピトープに対する結合特異性を有する多重特異性（たとえば二重特異性）抗標的抗体を作製することが望ましいとされ得る。例示的な二重特異性抗体は、標的分子の２つの異なるエピトープに結合し得る。あるいは、標的に特異的な抗体アームは、Ｔ細胞受容体分子（たとえばＣＤ３）などの細胞表面分子に結合するアームと組み合わせられ得る。本発明の例示的な二重特異性抗体は、Ｔ細胞受容体分子（たとえばＣＤ３）に由来する抗原および他のいずれかの標的に結合し得る。

本発明の修飾されたＩｇＧ１抗体およびその抗原結合フラグメントは、抗体または抗体フラグメント、Ｆａｂ、（Ｆａｂ’）２、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、ｄＡｂ、Ｆｄ、またはジアボディであり得る。本抗体は、ポリクローナル抗体であり得る。本抗体は、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）であり得る。本発明の修飾されたＩｇＧ１抗体およびその抗原結合フラグメントは、ヒト化抗体、キメラ抗体、もしくはベニヤ（ｖｅｎｅｅｒｅｄ）抗体であってもよく、またはいずれかの種の非ヒト抗体であり得る。好ましい実施形態では、本発明の修飾されたＩｇＧ１抗体およびその抗原結合フラグメントは、ヒトまたはヒト化されている。

マウス抗体またはキメラ抗体は、患者において有害な抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）反応の高いリスクを担持する（Ｓｃｈｒｏｆｆ ｅｔ ａｌ． １９８５； Ａｚｉｎｏｖｉｃ ｅｔ ａｌ． ２００６； Ｍｉｏｔｔｉ ｅｔ ａｌ． １９９９； Ｄ’Ａｒｃｙ ａｎｄ Ｍａｎｎｉｋ ２００１）。よって、大部分の承認されている治療用ｍＡｂは、ヒト化されているかまたは完全にヒトのＩｇＧ抗体である。

バリアント
また本発明は、本明細書中開示されるいずれかのペプチド配列のバリアントまで及ぶ。本明細書中使用される場合、用語「バリアント」は、同様のアミノ酸配列を有し、かつ／または同じ機能を保持するタンパク質に関する。たとえば、用語「バリアント」は、１つ以上のアミノ酸の付加、欠失、置換などを含むタンパク質またはポリペプチドを包有する。本発明のバリアントの例は、１つ以上のアミノ酸を１つ以上の他のアミノ酸で置換されていることを除き以下に定義されるペプチドを含むタンパク質である。アミノ酸の置換は、たとえば、アミノ酸配列の傾向を低減または排除するためになされ得る。あるいは、アミノ酸の置換は、必要に応じて、抗原の親和性を改善するため、または抗体をヒト化もしくは非免疫化（ｄｅｉｍｍｕｎｉｓｅ）するためになされ得る。記述した抗体の親和性が成熟したバリアント、ヒト化バリアント、および非免疫化したバリアント、ならびに抗体の配列の何らかの傾向を低減または排除するためのアミノ酸の置換を含むバリアントが、本明細書中に提供される。

上述のように、一部の実施形態では、全ての置換は、フレームワーク領域でのみ起こり得る。このような実施形態では、元のＣＤＲ配列は保持されているが、１つ以上のフレームワーク領域においてバリエーションが生じ得る。

１つ以上のアミノ酸の置換を有するバリアント抗原結合分子は、バリアント抗原結合分子が由来する抗原結合分子の機能的な活性（たとえばＥＣ５０、ＩＣ５０、ＩＣ９０、Ｋｄ、機能的な親和性、および／または直接的な細胞殺滅）を保持し得る。本発明のバリアント抗原結合分子は、これらが由来する抗原結合分子で記載される方法と同じ方法で使用および製剤化され得る。

置換
当業者は、様々なアミノ酸が同様の特性を有することを認識している。物質の１つ以上のこのようなアミノ酸は、多くの場合、その物質の望ましい活性を排除することなく、１つ以上の他のこのようなアミノ酸で置換され得る。

よって、アミノ酸のグリシン、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシンは、多くの場合、互いに（脂肪族側鎖を有するアミノ酸で）置換され得る。これらの可能性のある置換のうち、グリシンおよびアラニンが、互いに置換するために使用されること（これらが比較的短い側鎖を有するため）、ならびにバリン、ロイシン、およびイソロイシンが互いに置換するために使用されること（これらが疎水性である大きな脂肪族側鎖を有するため）が好ましい。多くの場合互いに置換され得る他のアミノ酸として、フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファン（芳香族側鎖を有するアミノ酸）；リジン、アルギニン、およびヒスチジン（塩基性側鎖を有するアミノ酸）；アスパラギン酸およびグルタミン酸（酸性側鎖を有するアミノ酸）；アスパラギンおよびグルタミン（アミド側鎖を有するアミノ酸）；ならびにシステインおよびメチオニン（硫黄含有側鎖を有するアミノ酸）が挙げられる。

この性質の置換は、多くの場合、「保存的な」または「半保存的な」アミノ酸の置換と呼ばれる。

３文字および１文字の表記を使用して、天然に存在するアミノ酸は、以下のように呼ばれ得る：グリシン（ＧまたはＧｌｙ）、アラニン（ＡまたはＡｌａ）、バリン（ＶまたはＶａｌ）、ロイシン（ＬまたはＬｅｕ）、イソロイシン（ＩまたはＩｌｅ）、プロリン（ＰまたはＰｒｏ）、フェニルアラニン（ＦまたはＰｈｅ）、チロシン（ＹまたはＴｙｒ）、トリプトファン（ＷまたはＴｒｐ）、リジン（ＫまたはＬｙｓ）、アルギニン（ＲまたはＡｒｇ）、ヒスチジン（ＨまたはＨｉｓ）、アスパラギン酸（ＤまたはＡｓｐ）、グルタミン酸（ＥまたはＧｌｕ）、アスパラギン（ＮまたはＡｓｎ）、グルタミン（ＱまたはＧｌｎ）、システイン（ＣまたはＣｙｓ）、メチオニン（ＭまたはＭｅｔ）、セリン（ＳまたはＳｅｒ）、およびスレオニン（ＴまたはＴｈｒ）。残基がアスパラギン酸またはアスパラギンであり得る場合、ＡｓｘまたはＢの記号が使用され得る。残基がグルタミン酸またはグルタミンであり得る場合、ＧｌｘまたはＺの記号が使用され得る。特段文脈が他の意味を記載しない限り、アスパラギン酸（ａｓｐａｒｔｉｃ ａｃｉｄ）への言及は、アスパラギン酸（ａｓｐａｒｔａｔｅ）を含み、グルタミン酸（ｇｌｕｔａｍｉｃ ａｃｉｄ）はグルタミン酸（ｇｌｕｔａｍａｔｅ）を含む。

また、以下に表される融合タンパク質のアミノ酸配列に対して、アミノ酸の欠失または挿入がなされ得る。よって、たとえば、ポリペプチドの活性に実質的に作用しないか、または少なくとも当該活性を排除しないアミノ酸が、欠失され得る。このような欠失は、ポリペプチドの全長および分子量が依然として活性を保持しつつ低減され得るため、好適であり得る。これは、特定の目的に必要とされるポリペプチドの量を減らすことを可能にし、たとえば用量のレベルが低減され得る。

一部の実施形態では、以下のアミノ酸は、保存的なアミノ酸の置換で、互いに交換され得る。

よって、「保存的な」アミノ酸の置換に対する言及は、抗体の配列（たとえばＣＤＲまたはＶＨ配列もしくはＶＬ配列）における１つ以上のアミノ酸が上述の同じクラスの別のアミノ酸で置換されるアミノ酸の置換を表す。抗体の機能に及ぼす有害な作用を最小限にするため、ＣＤＲ領域では保存的なアミノ酸の置換が好ましい場合がある。しかしながら、保存的なアミノ酸の置換はまた、フレームワーク領域でも起こり得る。

以下に提供される配列と比較したアミノ酸の変化は、任意の適切な技術を使用して、たとえば部位特異的変異誘発または固相合成（ｓｏｌｉｄ－ｓｔａｔｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）を使用することにより、作製され得る。

本発明の範囲内のアミノ酸の置換または挿入は、天然に存在するアミノ酸または天然に存在しないアミノ酸を使用してなされ得るが、天然に存在するアミノ酸が好ましいとされ得ることを理解されたい。天然または合成のアミノ酸が使用されるかどうかにかかわらず、Ｌ－アミノ酸のみが存在することが好ましいとされ得る。

傾向の製造
抗体などの治療用タンパク質は、化学的な修飾および翻訳後修飾（ＰＴＭ）により、本来は異種性かつ複雑である。修飾は、宿主細胞系、保存または製造の間の製造または条件で使用されるプロセスなどの多くの要因により引き起こされ得る。修飾は、分子自体の化学的安定性または集積の可能性に関連し得、よってこれは、抗体の固有の物理的な安定性に作用する。製造または保存の間に修飾を自然に起こし得る所定の抗体配列におけるアミノ酸のモチーフまたは残基は、傾向（ｌｉａｂｉｌｉｔｙ）と呼ばれる。よって、修飾および分解に対する抗体の影響の受けやすさを低減するための傾向を提示するため、抗体配列に対して変異が作製され得る。

抗体配列における傾向の結果としてのこのような修飾は、グリコシル化、脱アミド、酸化、およびＣ末端またはＮ末端のバリエーションを含み得る。このような修飾は、製造の間に生じ得る。特定の残基および構造または配列モチーフは、特定の修飾を有しやすい傾向がある。このような修飾に対する傾向の例として、ＡｓｎのＮ結合したグリコシル化、Ｓｅｒ／ＴｈｒのＯが結合したグリコシル化、Ａｓｎの脱アミド、Ａｓｐの異性化／フラグメント化、Ｌｙｓの糖化、Ｍｅｔ／Ｔｒｐの酸化、遊離チオール基、ピロ－グルタマート、Ｃ末端のＬｙｓが挙げられる。

当業者は、潜在的に修飾をもたらし得る構造上および配列の傾向を予測および同定するためにコンピュータツールが使用され得ることを認識している。修飾の発生を最小限にするために、製造プロセスに対する変更がなされ得る。タンパク質の操作もまた、このリスクを下げるために考慮され得る。たとえばこれら傾向の選択的な変異は、抗体の安定性を危うくする修飾のリスクの同定および低減を支援し得る。

アスパラギン酸残基（Ａｓｐ）は、自然に発生する修飾を経る場合がある。Ａｓｐ－Ｇｌｙ配列などのＡｓｐ含有モチーフは、イソアスパラギン酸を形成するように自然に発生する異性化を経る場合がある。イソアスパラギン酸の形成は、抗体の結合を弱体化または完全に廃止し得る。これは、Ａｓｐ残基が抗体のＣＤＲに現れる場合、さらに重要である。

よって、アスパラギン酸残基（Ａｓｐ）は、この修飾に対する傾向を低減するためにいずれかの天然に存在するアミノ酸で置換され得る。任意選択で、アスパラギン酸残基（Ａｓｐ）は、この修飾に対する傾向を低減するためにアラニン（Ａｌａ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、またはグルタミン酸（Ｇｌｕ）で置換され得る。異性化を低減するための生産／製剤化の最適化もまた、研究され得る。あるいは、Ａｓｐ－Ｇｌｙモチーフは、Ａｓｐ残基の置換よりはむしろ、グリシン残基を脱アミドを阻害するために別の天然に存在するアミノ酸で置換することにより修飾され得る。

メチオニン残基（Ｍｅｔ）は、自然に発生する修飾を経る場合がある。ＣＤＲにおけるメチオニン（Ｍｅｔ）の存在は、特に溶媒に曝露される場合、メチオニンが酸化され、これが結合を妨げるかどうかの問題をもたらし得る。よってメチオニン残基は、この修飾に対する傾向を低減するために、他のいずれかの天然に存在するアミノ酸で置換され得る。メチオニン残基は、好ましくはＡｌａまたはＬｅｕで置換され得る。酸化を低減するための生産／製剤化の最適化もまた、研究され得る。

本発明の各態様の好ましい性質は、必要な変更を加えた他の各態様と同様である。本明細書中記載される従来技術の文書は、法により許容される完全な度合いまで組み込まれている。

以下の詳細な説明は、例として提供されており、本発明を記載の特定の実施形態のみに限定するように意図されておらず、添付の図面と併せて最良に理解され得る。

８８ｍＩｇＧ３および親のハイブリドーマｍＡｂと比較した、８８ＩｇＧ１の、がん細胞の結合は維持されているが、直接的な細胞傷害性の有意な減少。Ａ．８８ＩｇＧ１、８８ｍＩｇＧ３、およびＦＧ８８（ハイブリドーマｍＡｂ）による同等なＨＣＴ１５細胞およびＣＯＬＯ２０５細胞の結合分析結果；Ｂ．親の８８ｍＩｇＧ３およびＦＧ８８と比較した８８ＩｇＧ１によるＨＣＴ１５に及ぼす直接的な細胞傷害性（ＰＩの取り込み）の有意な低減；ＣＯＬＯ２０５（Ｃ）およびＨＣＴ１５（Ｄ）に及ぼす親の８８ｍＩｇＧ３およびＦＧ８８と比較した８８ＩｇＧ１による増殖阻害の有意な低減。有意性は、多重比較のためダネットの補正を伴う２元ＡＮＯＶＡから推定した。 直接的な細胞傷害性および機能的な親和性の改善には、ｍＩｇＧ３ ＣＨ３が寄与し、それより少ない度合いではあるがＣＨ２も寄与する。定常ドメインのシャッフリングは、直接的な細胞傷害性に対するＣＨ１による有意な寄与がないことを示唆している（ＰＩの取り込み、ＨＣＴ１５、パネルＡ、ＣＯＬＯ２０５に及ぼす増殖阻害、パネルＢ）。対照的に、ＣＨ３（１ｍ３および３ｈ３）は、直接的な細胞傷害性に有意に寄与し、ここで、ｍＣＨ２による小さな寄与は、機能喪失の手法でのみ明らかである（３ｈ２）（ＰＩの取り込み、ＨＣＴ１５、パネルＣ；増殖阻害、ＣＯＬＯ２０５、パネルＤ）。１ｍ３による有意な機能的な親和性の増加およびオフ速度の減少；ここで３ｈ２により、および３ｈ３によりさらに明瞭に、機能的な親和性の有意な減少およびオフ速度の増加が表されており、大きなＣＨ３および小さなＣＨ２の寄与が確認される（パネルＥ、Ｆ）。各親のコンストラクトと比較した有意性は、多重比較のためダネットの補正を伴う２元ＡＮＯＶＡ（直接的な細胞傷害性）または１元ＡＮＯＶＡ（機能的な親和性、オフ速度）から推定した。 ＣＨ２：ＣＨ３ジャンクションを包有するＳＤ２８６－３９７は、ｍＩｇＧ３の直接的な細胞傷害性および機能的な親和性の改善の根底にある。ＣＨ２ＣＨ３のサブドメインの分割は、寄与しない２つの領域：ＳＤ２３２－２９４およびＳＤ３９０－４４７、ならびに直接的な細胞傷害性および機能的な親和性に有意に寄与する２つの領域：ＳＤ２８６－３４５（ＣＨ２）およびＳＤ３３９－３９７（ＣＨ３）を同定する。ＨＣＴ１５（パネルＡ）およびＣＯＬＯ２０５（パネルＢ）での８８ＩｇＧ１と比較した両方のコンストラクトおよび組み合わせ（ＳＤ２８６－３９７）によるＰＩの取り込みの有意な増加。ＣＯＬＯ２０５（パネルＣ）およびＨＣＴ１５（パネルＤ）での８８ＩｇＧ１と比較した両方のコンストラクトおよび組み合わせによる増殖阻害の有意な増大。２つの上述のコンストラクトによるオフ速度の低下から主にもたらされる、機能的な親和性の有意な増大（ＳＰＲ）（それぞれパネルＥおよびＦ）。８８ＩｇＧ１と比較したＳＤ３３９－３９７によるＣＤＣ活性（ＨＣＴ１５）の有意な低減（パネルＧ）；上述のコンストラクトによるＡＤＣＣ活性（ＣＯＬＯ２０５）の維持（パネルＨ）。各親のコンストラクトに対する有意性は、多重比較のためダネットの補正を伴う２元ＡＮＯＶＡ（直接的な細胞傷害性）または１元ＡＮＯＶＡ（機能的な親和性、オフ速度、エフェクター機能）から推定した。 ３３９－３７８と組み合わせた２８６－３０６からなる不連続な領域は、免疫エフェクター機能を維持しながら、直接的な細胞傷害性および機能的な親和性の亢進を提供する。ＨＣＴ１５での８８ＩｇＧ１と比較したＳＤ３３９－３７８による有意なＰＩの取り込みの増大（パネルＡ）および増殖阻害の増大（パネルＢ）。ＳＤ２８６－３４５と比較したＳＤ３０７－３４５によるＰＩの取り込みの有意な減少から、ＳＤ２８６－３０６による寄与が示唆される（パネルＣ）。８８ＩｇＧ１と比較したＳＤ２８６－３０６＋３３９－３７８の組み合わせによる、ＨＣＴ１５（パネルＤ）およびＣＯＬＯ２０５（パネルＥ）での増殖阻害の有意な増大、ならびにＣＯＬＯ２０５でのＰＩの取り込みの有意な増大（パネルＦ）。８８ＩｇＧ１と比較したＳＤ２８６－３０６＋３３９－３７８による機能的な親和性の有意な増大（ＳＰＲ）（パネルＧ）。８８ＩｇＧ１と比較したＳＤ２８６－３０６＋３３９－３７８によるＨＣＴ１５でのＣＤＣ活性の維持（パネルＨ）およびＣＯＬＯ２０５でのＡＤＣＣ活性の維持（パネルＩ）。各親のコンストラクトと比較した有意性は、多重比較のためダネットの補正を伴う２元ＡＮＯＶＡ（直接的な細胞傷害性）または１元ＡＮＯＶＡ（機能的な親和性およびエフェクター機能）から推定した。 いくつかの高いスコアの結合エピトープを含むＭＨＣＩＩ結合クラスター。クラスター１は、残基２９４－３１５からなり、クラスター２は、残基３６５－３９３からなる。 免疫エフェクター機能を維持しながら直接的な細胞傷害性および高い機能的な親和性を有するｉ８８Ｇ１は、ポア形成能を呈する。８８ＩｇＧ１と比較したｉ８８Ｇ１によるＨＣＴ１５（パネルＡ）およびＣＯＬＯ２０５（パネルＢ）での増殖阻害の有意な増大。８８ＩｇＧ１と比較したｉ８８Ｇ１による機能的な親和性の有意な増大（ＳＰＲ）（パネルＣ）。ＣＯＬＯ２０５での８８ＩｇＧ１と比較したｉ８８Ｇ１によるＡＤＣＣのわずかではあるが有意な低減（パネルＤ）およびＨＣＴ１５での８８ＩｇＧ１と比較したｉ８８Ｇ１によるＣＤＣ活性の有意な増大（パネルＥ）。ＨＣＴ１５でのｉ８８Ｇ１による細胞の解離、凝集、およびポア形成能のエビデンス（パネルＦ）。 免疫エフェクター機能を維持しながら直接的な細胞傷害性および高い機能的な親和性を有するｉ１２９Ｇ１は、ポア形成能およびｉｎ ｖｉｖｏでの腫瘍制御を呈する。１２９ＩｇＧ１と比較したｉ１２９Ｇ１によるＣＯＬＯ２０５での増殖阻害（パネルＡ）およびＰＩの取り込み（パネルＢ）の有意な増大。１２９ＩｇＧ１と比較したｉ１２９Ｇ１による機能的な親和性の有意な増大（ＳＰＲ）（パネルＣ）。ｉ１２９Ｇ１は、ＣＯＬＯ２０５でいくらかのＡＤＣＣ活性を維持するが、ｈ１２９ＩｇＧ１と比較して有意に低減している（パネルＤ）。ＣＯＬＯ２０５でのｉ１２９Ｇ１によるＣＤＣ活性は、１２９ＩｇＧ１と比較して有意に増大している（パネルＥ）。ＣＯＬＯ２０５でのｉ１２９Ｇ１による細胞の解離、凝集、およびポア形成能のエビデンス（パネルＦ）。ＣＯＬＯ２０５異種移植モデル（Ｂａｌｂ／ｃマウス）においてビヒクル対照および１２９ＩｇＧ１と比較したｉ１２９Ｇ１によるｉｎ ｖｉｖｏでの有意な腫瘍制御（パネルＧ）。マウス試験の過程の間平均体重に及ぼす有意な作用はない（パネルＨ）。各親のコンストラクトと比較した有意性は、多重比較のためダネットの補正を伴う２元ＡＮＯＶＡ（直接的な細胞傷害性、およびｉｎ ｖｉｖｏでの腫瘍制御）または１元ＡＮＯＶＡ（機能的な親和性およびエフェクター機能）から推定した。 ｉ２７Ｇ１は、免疫エフェクター機能を維持しながら、２７ＩｇＧ１と比較して有意に改善した直接的な細胞傷害性および機能的な親和性を呈する。２７ＩｇＧ１と比較したｉ２７Ｇ１によるＭＣＦ７（パネルＡ）およびＡＧＳ（パネルＢ）での増殖阻害の有意な増大。２７ＩｇＧ１と比較したｉ２７Ｇ１による機能的な親和性の有意な増大（ＳＰＲ）（パネルＣ）。ｉ２７Ｇ１は、ＭＣＦ７で同等のＡＤＣＣ活性（パネルＤ）およびＣＤＣ活性（パネルＥ）を維持する。親のコンストラクトと比較した有意性は、多重比較のためダネットの補正を伴う２元ＡＮＯＶＡ（直接的な細胞傷害性）または１元ＡＮＯＶＡ（機能的な親和性）から推定した。 単一の復帰変異体の分析は、最小１５の残基が、直接的な細胞殺滅を維持するために必要であることを明らかにする。ＣＯＬＯ２０５（パネルＡ）およびＨＣＴ１５（パネルＢ）での２３の単一のｉ８８Ｇ１復帰変異体の直接的な細胞傷害性。（ｉ８８Ｇ１に対し）正規化した細胞殺滅は、ＣＯＬＯ２０５と比較して（７残基）ＨＣＴ１５で直接的な細胞傷害性を維持するためのｍＧ３残基の数を増やす必要性（１５残基）を示している。１５のｍＧ３残基を伴う改善されたコンストラクト（ｉ８８Ｇ１ｖ２、パネルＣおよびＥならびにｉ１２９Ｇ１ｖ２、パネルＤ）は、それぞれ２３のｍＧ３残基を有する親のコンストラクト、ｉ８８Ｇ１、およびｉ１２９Ｇ１と比較して同等のＣＯＬＯ２０５およびＨＣＴ１５での直接的な細胞傷害性を維持する。 ＳＴ１６、ＨＵＶＥＣおよびＰＢＭＣに対するＦＧ２７．１０およびＦＧ２７．１８の結合。このアッセイの陰性対照は、ＳＴ１６およびＨＵＶＥＣではＮＳＯの上清であり、またはＰＢＭＣでは細胞単独であり、陽性対照は、ＨＬＡを認識する、抗シアリル－ジＬｅｗｉｓ^ａ ｍＡｂ、５０５／４、またはＷ６／３２であった。 結腸小腸細胞株（Ｃ１７０）、卵巣細胞株（ＯＶＣＡＲ－３、ＯＶＣＡＲ－４、ＯＶＣＡ４３３、ＯＡＷ２８、ＯＡＷ４２）、および胃細胞株（ＳＴ１６、ＭＫＮ４５、ＡＧＳ）に由来する糖脂質抽出物に対するＦＧ２７．１０およびＦＧ２７．１８の結合。ある範囲のがん細胞株から抽出した糖脂質を、ＥＬＩＳＡプレートに載置した。次に、細胞および糖脂質を、ＦＧ２７．１０またはＦＧ２７．１８の上清とインキュベートした。糖脂質に対する結合は、抗ＩｇＧ－ＨＲＰ／ＴＭＢでプロービングした。 図１２Ａ．ＩｇＧ３ ｍＡｂ ＦＧ２７．１０が介在するＳＴ１６細胞のＰＩの取り込みは、４℃であっても強力なＰＩの取り込みを誘導したが、ＩｇＧ１バリアントのＦＧ２７．１８はこれを誘導しなかった。図１２Ｂ：腫瘍細胞株のパネル（ＡＧＳ、Ｃｏｌｏ２０１、Ｃ１７０、Ｃ１７０ＨＭ２、ＭＣＦ７、ＯＶＣＡ４、ＬｏＶｏ、ＭＫＮ４５、７９１Ｔ、およびＳｋｏｖ３）でのＦＧ２７．１０およびＦＧ２７．１８が介在するＰＩの取り込み。図１２Ｃ：Ｃ１７０細胞でのＦＧ２７．１０、ＦＧ２７．１８、ＣＨ２７ ＩｇＧ２、ＣＨ２７ ＩｇＧ１が介在するＰＩの取り込み。 細胞株のパネル：図１３Ａ、ＨＣＴ１５；図１３Ｂ、ＡＧＳ；図１３Ｃ、ＯＶＣＡＲ３；図１３Ｄ、Ｈ３２２、および図１３Ｅ、ＭＣＦ７に対するＦＧ２７．１０、ＦＧ２７．１８、ｃｈ２７ＩｇＧ１およびヒト化バリアントｈＬｅｗＡＣの結合、ならびにＦＧ２７．１０（図１３Ｆ）およびＦＧ２７．１８（図１３Ｇ）のＳＰＲ分析。 ｉ２７Ｇ１は、免疫エフェクター機能を維持しながら、２７ＩｇＧ１と比較して有意に改善した直接的な細胞傷害性および機能的な親和性を呈する。２７ＩｇＧ１と比較したｉ２７Ｇ１によるＭＣＦ７（パネルｉ）およびＡＧＳ（パネルｉｉ）での増殖阻害の有意な増大。２７ＩｇＧ１と比較したｉ２７Ｇ１による機能的な親和性の有意な増大（ＳＰＲ）（パネルｉｉｉ）。ｉ２７Ｇ１は、ＭＣＦ７で同等のＡＤＣＣ活性（パネルｉｖ）およびＣＤＣ活性（パネルｖ）を維持する。親のコンストラクトと比較した有意性は、多重比較のためダネットの補正を伴う２元ＡＮＯＶＡ（直接的な細胞傷害性）または１元ＡＮＯＶＡ（機能的な親和性）から推定した。 「改善した」バージョン１～３を含むＤＮＡおよびタンパク質抗体の８８抗体の配列。 「改善した」バージョン１～３を含むＤＮＡおよびタンパク質抗体の１２９抗体の配列。 「改善した」バージョン１を含むＤＮＡおよびタンパク質抗体の２７抗体の配列。 ｉトラスツズマブ（ｉＴｖ１およびｉＴｖ２）は、リガンドの密度に依存する様式で、野生型のトラスツズマブ（ＷＴ）と比較して改善した機能的な親和性を呈する（Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００ ａｎａｌｙｓｉｓ、パネルＡ）。ある範囲の高結合（ＳＫＢＲ３、ＢＴ４７４）および低い～中程度の結合の細胞株（ＭＤＡ－ＭＢ２３１およびＳＫＯＶ３）に及ぼすトラスツズマブコンストラクトの細胞結合の概要（パネルＢ）。野生型のトラスツズマブと比較して有意に改善したＭＤＡ－ＭＢ２３１での直接的な細胞傷害性（ｉＴｖ２）（パネルＣ）。野生型のトラスツズマブと比較して高いｉＴｖ１およびｉＴｖ２（最高濃度）によるＢＴ４７４細胞によるＰＩの取り込み（膜損傷を反映）（パネルＤ）。野生型のトラスツズマブと比較して改善した直接標識したｉＴｖ２による固相のＨｅｒ２の結合（パネルＥ）。親のコンストラクトと比較した有意性は、多重比較のためダネットの補正を伴う２元ＡＮＯＶＡ（直接的な細胞傷害性）から推定した。 「改善した」バージョン１および２を含むタンパク質抗体のトラスツズマブ抗体の配列。 ＭＨＣクラスＩＩ結合エピトープのＩＥＤＢのスクリーニング。上部、ＳＤ２８６－３０６＋３３９－３７８を含むｈＩｇＧ１およびｍＩｇＧ３の配列の配列アライメント（ＣｌｕｓｔａｌＷ）。組み合わされたサブドメインの２８６－３０６および３３９－３７８を枠で囲んである；ＩＥＤＢ分析により同定したクラスター１および２が、矢印により表されている。下部、中央の列にＭＨＣＩＩ結合エピトープ、ＤＲアレル、およびスコアを有するＩＥＤＢ分析表。右手側の列は、免疫原性を回復させる残基の変化（下線が引かれているｍＩｇＧ３－＞ｈＩｇＧ１）を列挙している。ＤＩ、非免疫化したコンストラクト。

本発明の実施形態を説明する際に、専門用語は、これにより選択される特定の用語に限定するようには意図されておらず、各特定の用語が、同様の目的を達成するための同様の方法で作動する全ての技術的な均等物を含むことを理解されたい。

用語「イムノグロブリン」またはＩｇは、２対のポリペプチド鎖からなる構造上関連する糖タンパク質のクラスを表し、１対は、軽鎖（Ｌ）である低分子量の鎖であり、もう１対は、重鎖（Ｈ）であり、４つ全てが潜在的にジスルフィド結合により内部で結合している。イムノグロブリンの構造は良好に特徴づけられている。たとえば、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｃｈ．７（Ｐａｕｌ， Ｗ．， ｅｄ．， ２^ｎｄ ｅｄ． Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ， Ｎ．Ｙ． （１９８９））を参照されたい。

方法
材料、細胞、および抗体
全てのがん細胞株：ＣＯＬＯ２０５、ＨＣＴ１５（Ｃ１７０、Ｃ１７０ＨＭ２）、ＡＧＳ、ＣＯＬＯ２０１、ＳＴ１６、ＭＣＦ７、ＯＶＣＡＲ３、Ｈ３２２、ＯＶＣＡ４、ＬｏＶｏ、ＭＫＮ４５、７９１Ｔ、ＢＴ４７４、ＭＤＡ－ＭＢ２３１、ＳＫＢＲ３、ＳＫＯＶ３、および７９１Ｔ、ならびにマウスのメラノーマＮＳ０細胞株は、ＡＴＣＣ（Ｖｉｒｇｉｎｉａ， ＵＳＡ）から購入した。全ての細胞株は、短いタンデム反復プロファイリングを使用して確認した。ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）－ＡＰＤ－シアリル－Ｌｅｗｉｓ^ａおよびＨＳＡ－ＡＰＤ－Ｌｅｗｉｓ^ａは、ＩｓｏＳｅｐＡＢ（Ｓｗｅｄｅｎ）製であった。Ｅｒｂ２－Ｈｉｓは、ＡｂｃａｍおよびＳｔｒａｔｅｃｈから供給された。細胞株は、１０％のウシ胎仔血清、Ｌ－グルタミン（２ｍＭ）、および緩衝された炭酸水素ナトリウムを含むＲＰＭＩ１６４０培地（Ｓｉｇｍａ）またはＤＭＥＭ高グルコースで維持した。親のマウスＦＧ８８およびＦＧ１２９のｍＡｂは、以前に記載されるように作製した（Ｃｈｕａ ｅｔ ａｌ． ２０１５）。

修飾されたｍＡｂコンストラクトのクローニング
本発明者らのハイブリドーマにより産生されるｍＡｂのキメラＩｇＧ１バリアント（ＦＧ８８．２およびＦＧ１２９）を作製するために、各ｍＡｂをコードする重鎖および軽鎖の可変領域を、制限酵素ＢａｍＨＩ／ＢｓｉＷＩ（軽鎖の位置）またはＨｉｎｄＩＩＩ／ＡｆｅＩ（重鎖の位置）を使用してｐＤＣＯｒｉｇベクターに導入した（Ｍｅｔｈｅｒｉｎｇｈａｍ ｅｔ ａｌ． ２００９）。完全なｍＩｇＧ３定常領域および相互交換されたｍＩｇＧ３－ＩｇＧ１ドメインおよび単一の残基の変化を含む、合成の重鎖定常領域が、Ｅｕｒｏｆｉｎｓ ＭＷＧ（Ｅｂｅｒｓｂｅｒｇ， Ｇｅｒｍａｎｙ）から設計および注文された。通常、これは、１０５４ｂｐのカセットを含み、ＪＨ／ＣＨジャンクションのＡｆｅＩ制限部位からＣＨストップコドンに対するＸｂａＩ部位の３´末端にわたる。合成遺伝子は、専売のＥｕｒｏｆｉｎｓベクターで供給した。マキシプレップ（ｐｌａｓｍｉｄ ｍａｘｉ ｋｉｔ， Ｑｉａｇｅｎ）の後、１５μｇのプラスミドＤＮＡを、ＡｆｅＩおよびＸｂａＩ（両方ともＮＥＢ）で消化し、インサートゲルを精製した（ＱＩＡｑｕｉｃｋ ｇｅｌ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ， Ｑｉａｇｅｎ）。このインサートを、ライゲーション（Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ、ＮＥＢ、製造社の推奨による）によりＡｆｅＩ／ＸｂａＩで消化したベクターｐＯｒｉｇＨｉＢ（Ｍｅｔｈｅｒｉｎｇｈａｍ ｅｔ ａｌ． ２００９）に導入した。配列の確認およびｍａｘｉｐｒｅｐの後、１５μｇのプラスミドＤＮＡをＡｆｅＩおよびＡｖｒＩＩ（両方ともＮＥＢ）で消化し、インサートゲルを精製した。次に、このインサートを、ライゲーションによりＡｆｅＩ／ＡｖｒＩＩで消化したベクターｐＤＣＯｒｉｇに導入した。

ＨＥＫ２９３のトランスフェクションおよびｍＡｂの精製
ｍＡｂコンストラクトを、ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２９３ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｇｉｂｃｏ， ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用するＥｘｐｉ２９３Ｆ（商標）細胞の一時的なトランスフェクションにより得た。簡潔に述べると、ＨＥＫ２９３細胞の懸濁液（１００ｍｌ、２×１０^６／ｍｌ）を１００μｇのＤＮＡでトランスフェクトし、トランスフェクションから７日後に、条件付けした培地を回収した。条件付けしたトランスフェクションの上清を、０．２２μｍのボトルトップフィルター（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を介してろ過し、アジ化ナトリウムを０．２（ｗ／ｖ）％の最終濃度となるまで添加した。抗体を、ＡＫＴＡ ＦＰＬＣ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用してプロテインＧのカラム（ＨｉＴｒａｐ ＰｒｏｔｅｉｎＧ ＨＰ， ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で精製した。カラムを、ＰＢＳ／Ｔｒｉｓバッファー（５０ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌを含むＰＢＳ、ｐＨ７．０）で洗浄した後、１００ｍＭのグリシン、ｐＨ１２（０．０５（ｖ／ｖ）％のＴｗｅｅｎ ２０が補充されている）に、迅速（２ｍｌ）な勾配で抗体を溶出し、２ｍｌのフラクションを回収した。ｍＡｂを含むフラクションを、集め、中和し（１ＭのＨＣｌを使用）、濃度を決定した。次に、全ての一時的に発現したｍＡｂコンストラクトを、ｍＡｂコンストラクトの正確なフォールディングの読み取りとしてフローサイトメトリーを使用し、親のｍＡｂと比較し細胞の結合に関して分析した（データ不図示）。

間接的な免疫蛍光およびフローサイトメトリー
がん細胞（１×１０^５）を、以前に記載（Ｃｈｕａ ｅｔ ａｌ． ２０１５）されているように、一次ｍＡｂ（３３．３ｎｍｏｌ／Ｌまたは滴定済み）と４℃で１時間インキュベートした後、抗マウス／抗ヒトＦＩＴＣ標識二次抗体と４℃で１時間インキュベートし、０．４％のホルムアルデヒドで固定した。染色したサンプルを、ＭＡＣＳＱｕａｎｔ １０フローサイトメーターで分析し、ＦｌｏｗＪｏ ｖ１０を使用して分析した。

機能的な親和性の決定
Ｌｅｗｉｓ^ａ－またはシアリル－Ｌｅｗｉｓ^ａ－ＡＰＤ－ＨＳＡに対する８８および１２９ｍＡｂの結合の動的なパラメータを、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ， Ｂｉａｃｏｒｅ ３０００， ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）により決定した。増大する濃度（０．３ｎｍｏｌ／Ｌから２００ｎｍｏｌ／Ｌ）のｍＡｂを、ＣＭ５チップを通して注入し、データを、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ４．１を使用して異種性のリガンド結合モデルに適合した。このチップは、４種の細胞を含み、このうちの２つは、ＨＳＡでコーティングされており（インライン参照細胞）、残りの２つは、少量（３０～８０の応答単位（ＲＵ））および多量（３６０～３９０ＲＵ）の各グリカン－ＡＰＤ－ＨＳＡでコーティングされていた。

そのリガンド、ＨＥＲ２に対するトラスツズマブ抗体対トラスツズマブを操作した抗体バリアントの結合の動的なパラメータを、ＳＰＲ（Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００， Ｃｙｔｉｖａ（旧ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ））により決定した。増大する濃度（９０．０ｎＭ～０．３７ｎＭ）の抗体を、抗Ｈｉｓ抗体および捕捉されたヒスタグ付けされたＨＥＲ２でコーティングしたＣＭ５チップを通して注入した。

Ｉｎ ｖｉｔｒｏでの細胞傷害性
ＰＩの取り込みおよび増殖阻害を行わせ、ｍＡｂの直接的な細胞傷害性作用を分析した。ＣＯＬＯ２０５細胞、ＨＣＴ－１５細胞、またはＢＴ４７４細胞（５×１０^４）を、ｍＡｂと３７℃で２時間インキュベートした後、１μｇのＰＩを３０分間添加した。細胞を、ＰＢＳに再懸濁し、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ ＦＣ－５００またはＭＡＣＳＱｕａｎｔ １０フローサイトメーターにて実験を行い、それぞれＷｉｎＭＤＩ ２．９またはＦｌｏｗＪｏ ｖ１０ソフトウェアで分析した。

コンストラクトによる増殖阻害を、水溶性のテトラゾリウム塩ＷＳＴ－８（ＣＣＫ８ ｋｉｔ， Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用することにより評価して、生細胞の数に直接比例する細胞のヒドロゲナーゼの活性を測定した。簡潔に述べると、がん細胞（１０００－２０００細胞／９０μｌ／ウェル）を一晩プレーティングした後、コンストラクトを、１０μｌ／ウェルの最終容量にて異なる濃度で添加し、プレートを、３７℃（５％ＣＯ_２）で７２～９６時間インキュベートした。次に、ＷＳＴ－８試薬（１０μｌ／ウェル）を添加し、さらに３時間インキュベートした後、プレートを４５０ｎｍで読み取り（Ｔｅｃａｎ Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｆ５０）、阻害のパーセンテージを計算した。ＥＣ_５０値を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ｖ ８．０（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｉｎｃ， Ｌａ Ｊｏｌｌａ， ＣＡ）を用いて、非線形回帰（曲線の適合）を使用して決定した。

走査電子顕微鏡
ＨＣＴ－１５またはＣＯＬＯ２０５細胞（１×１０^５）を、無菌性のカバーチップ上で２４時間増殖させた後、３７℃で１８時間にわたりｍＡｂ（０．２μｍｏｌ／Ｌ）を添加した。対照は、培地単独および０．５（ｖ／ｖ）％の過酸化水素（Ｈ_２Ｏ_２）（Ｓｉｇｍａ）を含んでいた。細胞を、あらかじめ温めた０．１Ｍのカコジル酸ナトリウムバッファーｐＨ７．４（ＳＤＢ）で洗浄し、１２．５（ｖ／ｖ）％のグルタルアルデヒドで２４時間固定した。固定した細胞を、ＳＤＢで２回洗浄し、１（ｖ／ｖ）％の四酸化オスミウム（ｐＨ７．４）で４５分間さらに固定（ｐｏｓｔ－ｆｉｘｅｄ）した。Ｈ_２Ｏで最終的な洗浄を行った後、細胞を、増大する濃度のエタノールにおいて脱水させ、臨界点乾燥に曝した後、金でスパッタリングを行い、ＳＥＭ分析を行った（ＪＳＭ－８４０ ＳＥＭ， ＪＥＯＬ）。

Ｉｎ ｖｉｖｏのモデル
この試験は、ＮＣＲＩ、ＬＡＳＡ、およびＦＥＬＡＳのガイドラインに従い、ＵＫ Ｈｏｍｅ Ｏｆｆｉｃｅ Ｌｉｃｅｎｃｅの下ＣｒｏｗｎＢｉｏ ＵＫにより行った。ＣＯＬＯ ２０５のヒトの結腸直腸腺癌モデルの皮下腫瘍を、年齢が一致した雌性のＢＡＬＢ／ｃヌードマウスＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ， ＵＫ）において、５×１０^６個の生細胞を含む０．１ｍｌの血清フリーのＲＰＭＩ：Ｍａｔｒｉｇｅｌ（１：１）を各マウスの左側腹部に注射することにより確立した。試験６日目に、マウス（ｎ＝１０）を、それらの平均腫瘍体積（約１０３ｍｍ^３±１３ｍｍ^３）に基づく処置グループに無作為に割り当て、最大５週目まで、ｍＡｂ（０．１ｍｇ）またはビヒクル（ＰＢＳ、１００μｌ）を、隔週にて静脈内（ｉ．ｖ．）に投与した。体重および腫瘍体積を、週に３回評価し、腫瘍体積の低減を、Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉの事後検定（相互作用係数；ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ｖ ７．４（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｉｎｃ， Ｌａ Ｊｏｌｌａ， ＣＡ）を伴う２元ＡＮＯＶＡ検定を使用して統計的に分析した。

実施例
ここで、本発明を、以下の実施例および添付の図面を参照してさらに説明する。

実施例１．ｍ８８Ｇ３は、補体および免疫エフェクター細胞の非存在下で強力なグリカン結合および直接的な細胞傷害性を呈し、これら両方が８８ＩｇＧ１へのキメラ化の後に低減される。
以前に、ハイブリドーマにより産生されたｍＩｇＧ３ ｍＡｂ ＦＧ８８．２が、補体またはエフェクター細胞の非存在下で、ＣＯＬＯ２０５およびＨＣＴ１５などの高結合がん細胞株に直接的な細胞傷害性作用を発揮することが示されている（Ｃｈｕａ ｅｔ ａｌ． ２０１５）。この直接的な細胞傷害性は、腫瘍溶解性の機構を介して、ｍＡｂにより誘導される細胞の凝集、増殖阻害、および不規則なポア形成を含んでいた。その後、本発明者らは、臨床での実施のため、キメラのＨＥＫ２９３により発現されるＩｇＧ１ ｍＡｂ、８８ＩｇＧ１を作製した。８８ＩｇＧ１は、ハイブリドーマにより産生されるＦＧ８８．２およびＨＥＫ２９３により発現される８８ｍＩｇＧ３と比較して、同等のＨＣＴ１５およびＣＯＬＯ２０５がん細胞の結合レベルを維持していた（図１Ａ）。後者のｍＡｂは、マウスハイブリドーマ対ＨＥＫ２９３細胞の使用により、差次的なＦｃグリコシル化などの発現系に関連する作用を排除するように作製された。驚くべきことに、８８ＩｇＧ１は、２つの機能的なアッセイのＰＩの取り込みおよび増殖阻害を通して、８８ｍＩｇＧ３と比較して有意に低いＣＯＬＯ２０５およびＨＣＴ１５での直接的な細胞傷害性を呈した（図１Ｂ－Ｄ）。また８８ｍＩｇＧ３は、ハイブリドーマにより産生されるＦＧ８８．２と比較して控えめな直接的な細胞傷害性の低減を示し、２つの発現状況（マウスハイブリドーマ対ＨＥＫ２９３細胞）によるＦｃ領域の差次的なグリコシル化が、この作用に寄与し得ることが示唆される。これは、直接的な細胞殺滅が異なるアイソタイプの動的な結合に関連していたことを示唆している。結果として、本発明者らのアイソタイプを切り替えたｍＡｂの動的な結合を、ＳＰＲを使用してＬｅｗｉｓ^ａ－ＡＰＤ－ＨＳＡでコーディングしたチップで分析した（表１）。ＦＧ８８．２は、高密度のフローセルでの迅速な見かけ上のオン速度（ｋ_ｏｎ約１０^４ １／ｓｍｏｌ／Ｌ）および非常に遅いオフ速度（ｋ_ｏｆｆ約１０^－６ １／ｓ）を伴う強力なＬｅｗｉｓ^ａ－ＡＰＤ－ＨＳＡ結合を呈した。ＨＥＫ２９３により産生される８８ｍＩｇＧ３は、ＦＧ８８．２と比較してより速い見かけ上のオン速度（ｋ_ｏｎ約×１０^５ １／ｓｍｏｌ／Ｌ）およびいくらか速いオフ速度（ｋ_ｏｆｆ約１０^－４ １／ｓ）を呈し、これは、ＦＧ８８．２と比較してわずかに低い細胞傷害性を説明し得る。比較すると、８８ＩｇＧ１は、迅速な見かけ上のオン速度（ｋ_ｏｎ約１０^５ １／ｓｍｏｌ／Ｌ）でその標的と結合するが、ｍＩｇＧ３アイソタイプとは対照的に、はるかに速い解離相（見かけのｋ_ｏｆｆ約１０^－２ １／ｓｍｏｌ／Ｌ）を呈し、これは、がん細胞結合後のその細胞傷害性活性の低減の根拠となる可能性がある。低密度フローセルでのｍＡｂ結合挙動は、３つ全てのｍＡｂで１０^－８ｍｏｌ／Ｌの大きさの平衡解離定数（Ｋ_ｄ）を伴う３つのｍＡｂ間でほぼ同等であった。

実施例２．ｍＩｇＧ３定常領域のドメイン分析は、ｍＩｇＧ３ ＣＨ３ドメインによる大きな寄与およびＣＨ２による小さな関与を示唆している。
まとめると、この結果は、高いＬｅｗｉｓ^ａ－ＡＰＤ－ＨＳＡの機能的な親和性が、ＦＧ８８および８８ｍＩｇＧ３により呈され、おそらくはこのアイソタイプの分子間協同作用からもたらされる、それらの遅い解離により主に駆動され、高結合がん細胞株に及ぼすそれらの直接的な細胞傷害性作用に寄与することを示唆していた。よって、本発明者らは、選択されたｍＩｇＧ３定常領域の残基を８８ＩｇＧ１へ移動することを介して、直接的な細胞傷害性活性を伴うＩｇＧ１のがんグリカンを標的とするｍＡｂを操作することに着手した。最初に、ｍＩｇＧ３の寄与領域を、ｍＩｇＧ３ ＣＨ１、ＣＨ２、またはＣＨ３ドメインを含む、ハイブリッド８８ＩｇＧ１コンストラクトの作製を介して同定した。予備分析は、ｍＩｇＧ３ ＣＨ１の８８ＩｇＧ１への導入（１ｍ１）が細胞傷害性の有意な増大をもたらさなかったため８８ｍＩｇＧ３の直接的な細胞傷害能に対するｍＩｇＧ３ ＣＨ１の寄与はごくわずかであることを解明した（図２Ａおよび２Ｂ）。逆に、ＩｇＧ１ ＣＨ１を８８ｍＩｇＧ３へ導入すること（３ｈ１）は、同様に、殺滅活性の有意な低減を引き起こさなかった（図２Ａおよび２Ｂ）。次に、機能獲得の手法において、ｍＩｇＧ３ ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを、別々に、８８ＩｇＧ１に導入した。マウスＣＨ３を含む８８ＩｇＧ１（１ｍ３）は、８８ＩｇＧ１と比較して、ＨＣＴ１５でのＰＩの取り込みの有意な増加およびＣＯＬＯ２０５細胞の増殖阻害の有意な増大を呈した（図２ＣおよびＤ）。マウスＣＨ２を８８ＩｇＧ１に導入すること（１ｍ２）は、両方のアッセイを通してく有意ではない殺滅活性の増大をもたらした（図２ＣおよびＤ）。両方のドメインによりなされた寄与の確認として、逆の戦略を続けて行い、これにより、細胞傷害性活性の喪失が、ＩｇＧ１のＣＨ２ドメインまたはＣＨ３ドメインの８８ｍＩｇＧ３への導入により評価された。このシナリオは、ＩｇＧ１ ＣＨ３を含む８８ｍＧ３（３ｈ３）で細胞傷害性の有意な減少をもたらし、以前の機能獲得の結果を裏付けている。重要なことに、この戦略はまた、ヒトＣＨ２を含む８８ｍＩｇＧ３（３ｈ２）が細胞傷害性活性の有意な減少を呈したため、マウスＣＨ２による小さな寄与を同定した（図２ＣおよびＤ）。次に、ハイブリッドコンストラクトの動的な結合の挙動を分析した。ハイブリッドコンストラクト１ｍ３は、中程度ではあるが有意な機能的な親和性の増大（Ｋ_ｄの減少）を呈し、対してヒトＣＨ３を含む３ｈ３は、機能的な親和性の有意な減少（Ｋ_ｄの増大、図２Ｅ）を呈し、両方の場合において、直接的な細胞傷害性が反映されている。コンストラクト３ｈ２におけるヒトＣＨ２もまた、中程度ではあるが有意な機能的な親和性の低下をもたらした。全ての場合で、機能的な親和性の変化は、主に、ｍＡｂのオフ速度の変化により駆動され、ここで１ｍ３は、８８ＩｇＧ１と比較して有意に減少したオフ速度を示し、３ｈ３および３ｈ２は、８８ｍＩｇＧ３と比較して有意に高いオフ速度を呈する（図２Ｆ）。コンストラクト１ｍ２におけるマウスＣＨ２は、機能的な親和性の増大も、オフ速度の減少ももたらさず、８８ＩｇＧ１と比較して有意ではないこのコンストラクトの細胞傷害性の根拠をなす（図２ＣおよびＤ）。まとめると、この結果は、マウスＣＨ３が、細胞傷害性および動的な結合へのより顕著な寄与を有し、対してマウスＣＨ２による寄与は小さく、機能喪失の状況でのみ観察されることを表している。

実施例３．ａａ２８６－３９７のＣＨ２－ＣＨ３領域の中の不連続な配列は、殺滅活性および機能的な親和性の増大に重要である。
マウスＣＨ３により提供される細胞傷害性作用は完全ではないため、他の寄与する残基をさらに絞り込むために、本発明者らは、ハイブリッド８８ｍＡｂコンストラクトを設計した（ここでＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインは、１０の残基の重複を含むジャンクション領域を伴う２つのサブドメイン（ＳＤ）にさらに細分された：ＣＨ２：ＳＤ２３２－２９４およびＳＤ２８６－３４５ならびにＣＨ３：ＳＤ３３９－３９７およびＳＤ３９０－４４７）。ＣＯＬＯ２０５では、ＳＤ３３９－３９７およびＳＤ２８６－３４５は両方とも、類似する有意な細胞傷害性の増大をもたらし、これは低い濃度で最も明らかであり、対して単独または組み合わせた（不図示）ＳＤ２３２－２９４およびＳＤ３９０－４４７は、細胞傷害性に重要ではなかった（図３ＡおよびＣ）。しかしながら、ＨＣＴ１５では、ＳＤ３３９－３９７の中の残基による有意な寄与は、ＳＤ２８６－３４５の寄与よりも大きく（図３ＢおよびＤ）、グリコ抗原密度および組成物のわずかな差異が、ｍＡｂ結合およびその後の細胞傷害性活性を調節し得ることを示唆している。厳密に述べると、組み合わせたｍＩｇＧ３ ＳＤ２８６－３４５およびＳＤ３３９－３９７（ＳＤ２８６－３９７）を含む８８ＩｇＧ１は、両細胞株にて両方のアッセイを通して８８ｍＩｇＧ３の全ての細胞傷害性を実質的に回復させ（図３Ａ～Ｄ）、さらなるサブドメインを追加する必要性を排除した。８８ＩｇＧ１と比較したサブドメインコンストラクトの機能的な親和性の分析は、ＳＤ２８６－３９７、およびＳＤ３３９－３９７での機能的な親和性の著しい改善を明らかにし、これは両方とも８８ｍＩｇＧ３の機能的な親和性と一致し、ＳＤ２８６－３４５ではより控えめに改善した（図３Ｅ）。機能的な親和性の改善は、ＳＤ２８６－３９７およびＳＤ３３９－３９７での見かけのオフ速度（～約１０^－６ １／ｓ）の著しい低下から主にもたらされ、ここでＳＤ２８６－３４５のオフ速度は、より控えめな改善（約１０^－３ １／ｓ）を示している（図３Ｆ）。これら結果は、細胞傷害性の知見にさらに重みを与え、低減した標的解離速度を有するｍＡｂを作製することが直接的な細胞傷害性を支援することを示唆している。

２７のｍＩｇＧ３残基を有するＳＤ３３９－３９７は８８ｍＩｇＧ３の望ましい特性、特に遅い解離および高い細胞傷害性の最大９０％を再現したが、これは、８８ＩｇＧ１と比較して有意に低いＣＤＣ活性を呈し（図３Ｇ）、さらなる開発のためにＳＤ２８６－３９７の使用を必要とする。対照的に、ＳＤ３３９－３９７のＡＤＣＣ活性は、８８ＩｇＧ１と比較して低減しなかった（図３Ｈ）。ＳＤ２８６－３９７は８８ｍＩｇＧ３の細胞傷害性を完全に再現したが、これは、４１のｍＩｇＧ３残基をさらに含んでいた。結果として、ＳＤ２８６－３４５およびＳＤ３３９－３９７のさらなる再分割を、細胞傷害性活性および機能的な親和性に関して分析した。この分析は、直接的な細胞傷害性に寄与した、ＳＤ３３９－３９７およびＳＤ２８６－３４５における２つの領域をそれぞれ強調した。まず、８８ＩｇＧ１の導入後の２０のｍＩｇＧ３に特異的な残基を含むＳＤ３３９－３７８は、両方の分析を通してｍＩｇＧ３の細胞傷害性の約８０～９０％の範囲内まで細胞傷害性の有意な復帰をもたらした（図４ＡおよびＢ）。この領域はまた、８８ＩｇＧ１と比較して有意な機能的な親和性の増大をもたらしたが、この改善は、ＳＤ３３９－３９７の場合と同程度に明確ではなかった（図４Ｇ）。同じセットのコンストラクトの中で、本発明者らは、機能喪失の手法を介して対象となる別の領域を同定した。ＳＤ２８６－３４５と比較したＳＤ３０７－３４５による細胞傷害性の有意な低減は、残基２８６－３０６によるさらなる寄与を暗示していた（図４Ｃ）。まとめると、この結果は、残基２８６－３０６および３３９－３７８の組み合わせを含み、ｍＩｇＧ３に特異的な残基が合計２６となるコンストラクトが、恐らくは完全に、８８ｍＩｇＧ３の直接的な細胞傷害性および機能的な親和性を再現し得ることを示唆していた。この仮説を試験するために、ＳＤ２８６－３０６＋３３９－３７８の細胞傷害性活性および機能的な親和性を評価した。ＳＤ２８６－３０６＋３３９－３７８は、両方の細胞株において、８８ＩｇＧ１と比較して有意に改善した直接的な細胞傷害性を呈し、これは８８ｍＩｇＧ３の細胞傷害性と一致する（図４Ｄ－Ｆ）。ＳＤ２８６－３０６＋３３９－３７８のＳＰＲ分析は、８８ｍＩｇＧ３と同様の、Ｋ_ｄ（０．３×１０^－９ｎｍｏｌ／Ｌ）での８８ＩｇＧ１と比較して有意に改善した機能的な親和性を明らかにした（図４Ｇ）。重要なことに、ＳＤ２８６－３０６＋３３９－３７８コンストラクトのＣＤＣ活性もＡＤＣＣ活性も、８８ＩｇＧ１の活性と有意に異なるものではなかった（図４ＨおよびＩ）。直接的な細胞傷害性および維持された免疫エフェクター機能との機能的な親和性の改善の組み合わせは、本発明者らのＳＤ２８６－３０６＋３３９－３７８ハイブリッドＩｇＧ１が８８ｍＩｇＧ３の望ましい特性を模倣していることを表している。

実施例４．１つのｉｎ ｓｉｌｉｃｏで同定した免疫原性クラスターの反転は、強力な細胞殺滅、ポア形成能、および健全な免疫エフェクター機能を伴う主要な候補の改善された「ｉ」８８Ｇ１をもたらす。
２６のｍＩｇＧ３残基の存在により作製した、本発明者らのハイブリッドＳＤ２８６－３０６＋３３９－３７８コンストラクトの潜在的な免疫原性を評価するために、本発明者らは、ＭＨＣＩＩ結合エピトープに関するＳＤ２８６－３０６＋３３９－３７８の配列のｉｎ ｓｉｌｉｃｏでのスクリーニングを行った（Ｉｍｍｕｎｅ Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｄａｔａｂａｓｅ， ＩＥＤＢ）。クラスＩＩ制限Ｔヘルパー細胞は、液性免疫応答により関連しており、予測された結合クラスターは、Ｔ細胞応答の強力な指標であることが示されている（Ｊａｗａ ｅｔ ａｌ． ２０１３）。いくつかの高いスコアの結合エピトープを含む２つのＭＨＣＩＩ結合クラスター：クラスター１（残基２９４－３１５）およびクラスター２（残基３６５－３９３）を同定した（図５／図２０）。クラスター１の中でのヒトの残基への３つのマウスの残基、２９４（ＡからＥ）、３００（ＦからＹ）および３０５（ＡからＶ）の復帰は、個体が寛容化されているヒト配列セクションをもたらした。同様に、３３９－３７８領域の中の２つの残基３５１（ＩからＬ）および３７１（ＮからＧ）の反転は、２つのＭＨＣＩＩ結合コアを除去した。よって、本発明者らは、上記のｉｎ ｓｉｌｉｃｏでのスクリーニングに基づき、２つのさらなるＳＤ２８６－３０６＋３３９－３７８ベースのコンストラクト：それぞれ３つおよび２つの復帰したヒト残基を含むクラスター１（ＤＩ１）および２（ＤＩ２）を作製し、それらの細胞傷害性をアッセイした。ＤＩ１およびＤＩ２は、８８ＩｇＧ１と比較して細胞傷害性の改善を有意に維持したが、ＤＩ２は、８８ｍＩｇＧ３と比較して小さいが一定した活性の減少を示した（図６ＡおよびＢ）。さらに、８８ＤＩ１の場合、直接的な細胞傷害性は、８８ｍＩｇＧ３と有意に異ならない見かけのオフ速度（約１０^－４ １／ｓ）および０．５×１０^－９ｎｍｏｌ／ＬのＫ_ｄを伴う、有用な機能的な親和性のプロファイルと一致していた（図６Ｃ、表２）。対照的に、ＤＩ２は、８８ｍＩｇＧ３と比較して有意に減少した機能的な親和性を呈した（図６Ｃ）。これら知見に基づき、本発明者らは、その免疫エフェクター機能のさらなる分析のため、２３のｍＩｇＧ３残基を含む８８ＤＩ１に焦点を当て、改善された「ｉ」（ｉｍｐｒｏｖｅｄ）８８Ｇ１と再度名付けた。８８ＩｇＧ１は、ナノモル以下のＥＣ_５０を伴うＣＯＬＯ２０５での強力なＡＤＣＣ活性を示し（図６Ｄ）、これは、ＦＧ８８の強力な免疫エフェクター機能と一致していた（Ｃｈｕａ ｅｔ ａｌ． ２０１５）。同様に、ｉ８８Ｇ１は、８８ＩｇＧ１（ＥＣ_５０ ０．１３ｎｍｏｌ／Ｌ）と比較していくらか低減したが強力な、ナノモル以下のＥＣ_５０（０．３５ｎｍｏｌ／Ｌ）を伴うＡＤＣＣを呈した。ｉ８８Ｇ１のＣＤＣ活性は、８８ＩｇＧ１と比較して控えめに改善した（図６Ｅ、表２）。

親のハイブリドーマにより産生されるＦＧ８８ ｍＡｂの早期の作用は、そのポア形成能を示し、これはその細胞傷害性の根底にあると推測されている（Ｃｈｕａ ｅｔ ａｌ． ２０１５）。よって、本発明者らは、ＳＥＭを使用して、ＨＣＴ１５でのｉ８８Ｇ１のポア形成能を分析することに着手した。ＨＣＴ１５のｉ８８Ｇ１または８８ｍＩｇＧ３とのインキュベーションは、単層の破壊、細胞の円形化およびクラスター化をもたらしたが、８８ＩｇＧ１とのインキュベーションはこれをもたらさなかった。高倍率では、不規則なポア形成が明らかであり（図６Ｆ）、ハイブリドーマにより産生されるＦＧ８８ ｍＡｂで観察される元のデータ（Ｃｈｕａ ｅｔ ａｌ． ２０１５）を反映していた。

まとめると、この結果は、ｍＩｇＧ３定常領域から８８ＩｇＧ１骨格への選択された領域の移動が、直接的な細胞殺滅能、機能的な親和性の増大、および強力な免疫エフェクター機能を伴うハイブリッドｍＡｂをもたらしたことを表している。

実施例５．「ｉＧ１」配列の別の殺滅しないグリカン結合ｍＡｂ（１２９ ＩｇＧ１）への移動は、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏでの抗腫瘍活性が改善したがんを標的とするｍＡｂをもたらす。
近年、本発明者らは、がんの免疫療法に対し可能性のある開発でシアリル－ジ－Ｌｅｗｉｓ^ａを認識するｍＡｂ（１２９ｍＡｂ）の作製を記載した。１２９ｍＡｂは、主にその非常に制限された正常な組織の反応性からもたらされる上述の８８ｍＡｂと比較したより有用な腫瘍対正常なヒト組織の分布を有する。ハイブリドーマにより産生されるＦＧ１２９、マウスＩｇＧ１ｍＡｂ、およびキメラ１２９ＩｇＧ１は全て直接的な細胞傷害性を呈さない。これにより、本発明者らは、２３の上記で選択したｍＩｇＧ３の定常領域の残基のＣＨ１２９のＦｃ領域への導入が、直接的な細胞傷害性および改善した機能的な親和性を伴う「ｉ」１２９Ｇ１をもたらし、よって優れた臨床上の有用性を呈するとの仮説を試験した。

本発明者らは、１２９ｍＡｂに対して高結合ながん細胞株であることが以前に示されているＣＯＬＯ２０５でのｉ１２９Ｇ１の直接的な細胞傷害能を評価した。ｉ１２９Ｇ１は、４５．６ｎｍｏｌ／ＬのＥＣ_５０の（１２９ＩｇＧ１と比較して）有意に改善した用量依存的な増殖阻害（図７Ａ）を呈し、そして、有意に改善しているがより控えめなＰＩの取り込み（図７Ｂ）を呈した。次に、本発明者らは、シアリルＬｅｗｉｓ^ａ－ＡＰＤ－ＨＳＡでコーティングしたチップおよびＳＰＲを使用してｉ１２９Ｇ１の機能的な親和性を分析した。ｉ１２９Ｇ１ ｍＡｂは、１２９ＩｇＧ１と比較して有意に改善した機能的な親和性を呈し（図７Ｃ、表２）、これはおおよそ２ｌｏｇ（１２９ＩｇＧ１およびｉ１２９Ｇ１でそれぞれ２．６×１０^－４ｓ^－１および５．５×１０^－６ｓ^－１）によるオフ速度の改善から主にもたらされる。１２９ＩｇＧ１は、以前に、ＣＯＬＯ２０５で強力なＡＤＣＣエフェクター機能を発揮し、結果としてＣＯＬＯ２０５でのｉ１２９Ｇ１のＡＤＣＣおよびＣＤＣ活性を評価した。ｉ１２９Ｇ１のＡＤＣＣ活性は、１２９ＩｇＧ１の活性と比較して有意に低下していたが、細胞の溶解は、ナノモルの範囲で維持されていた（ｉ１２９Ｇおよび１２９ＩｇＧ１それぞれで２．４×ｎｍｏｌ／Ｌおよび１．７×ｎｍｏｌ／ＬのＥＣ_５０）（図７Ｄ、表２）。しかしながら、ｉ１２９Ｇ１のＣＤＣ活性は、親の１２９ＩｇＧ１と比較して有意に増大しており、ここでｉ１２９Ｇ１および１２９ＩｇＧ１のＥＣ_５０はそれぞれで８．２×ｎｍｏｌ／Ｌおよび７５×ｎｍｏｌ／Ｌであった（図７Ｅ、表２）。ｉ１２９Ｇ１が直接的な細胞傷害性および改善した機能的な親和性を呈したことを受け、本発明者らはＣＯＬＯ２０５でのそのポア形成能を分析することとした。ＣＯＬＯ２０５のｉ１２９Ｇ１とのインキュベーションは、不均一な表面の大きな細胞の凝集塊の形成および不規則なポア様構造の出現を引き起こした（図７Ｆ）。また、同じ濃度での１２９ＩｇＧ１とのインキュベーションは、ある度合いの細胞の凝集塊化をもたらしたが、上記よりも少なく小さな凝集塊が観察され、ポア形成能のエビデンスはみられなかった。

ｉ１２９Ｇ１の直接的な細胞傷害性および改善した機能的な親和性により、本発明者らは、ＣＯＬＯ２０５異種移植モデルでの親の１２９ＩｇＧ１と比較したｉ１２９Ｇ１のｉｎ ｖｉｖｏでの抗腫瘍活性を分析することに目を向けた。ｉ１２９Ｇ１ ｍＡｂは、１２９ＩｇＧ１と比較した場合に依然として有意であったビヒクル対照と比較して有意な腫瘍体積の減少をもたらし（２元ＡＮＯＶＡ、ｐ＜０．０００１）、これによりｉｎ ｖｉｔｒｏでの結果が裏付けられた（図７Ｇ）。平均体重に及ぼす作用は観察されなかった（図７Ｈ）。

直接的な細胞傷害性、改善した機能的な親和性、および優れたｉｎ ｖｉｖｏでの抗腫瘍活性を伴う選択された数のｍＩｇＧ３の定常領域の残基の導入を介したｍＡｂの作製は、本発明者らの戦略を臨床上有用性がある他のがんを標的とするｍＡｂに適用する道を開いている。

実施例６．「ｉＧ１」配列の別のＬｅｗｉｓ^Ｙグリカン結合ｍＡｂ（２７ＩｇＧ１）への移動は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの直接的な細胞殺滅能が改善したがんを標的とするｍＡｂをもたらす。
また本発明者らは、幅広い範囲の腫瘍組織分布および好ましい正常ヒト組織への結合性を伴うモノ特異的なＬｅｗｉｓ^ｙ結合のｍＡｂの、２７ｍＡｂを作製した。このｍＩｇＧ３ ｍＡｂは、Ｌｅｗｉｓ^ｙを発現するＡＧＳおよびＭＣＦ７細胞株で直接的な細胞殺滅を呈し、キメラ２７ＩｇＧ１はこれを呈さなかった（図８ＡおよびＢ）。本発明者らは、本発明者らの選択された２３のｍＧ３残基を２７ＩｇＧ１へ導入することにより、ｉ２７Ｇ１を作製し、その直接的な細胞殺滅能を分析した。ＭＣＦ７およびＡＧＳの両方で、ｉ２７Ｇ１は、２７ＩｇＧ１と比較して有意に改善した直接的な細胞殺滅を呈し、これは、２７ｍＧ３ ｍＡｂと同等であった（図８ＡおよびＢ）。さらに、ｉ２７Ｇ１は、２７ＩｇＧ１と比較して有意に改善した機能的なＬｅｗｉｓ^ｙの親和性を呈する（図８Ｃ）。重要なことに、ｉ２７Ｇ１のエフェクター機能、ＡＤＣＣ、およびＣＤＣは全て、ＭＣＦ７で２７ＩｇＧ１と同等であった（図８Ｄおよび８Ｅ）。

まとめると、この結果は、ｍＩｇＧ３定常領域から２７ＩｇＧ１骨格への選択された領域の移動が、直接的な細胞殺滅能、増大した機能的な親和性、および強力な免疫エフェクター機能を伴うハイブリッドｍＡｂをもたらしたことを表す。

実施例７．２３の「ｉＧ１」配列のさらなる微調整は、１５または７残基が、細胞種に依存する様式で直接的な細胞殺滅を維持するために重要であることを示唆している。
２３の選択されたｍＧ３残基のそれぞれの個別の寄与を評価するために、ｉ８８Ｇ１（実施例４）に基づく単一の復帰変異体の戦略を行った。ｉ８８Ｇ１における２３のｍＧ３残基のそれぞれを、単独で、ｈＧ１残基に復帰させ、結果得られるコンストラクトを、細胞増殖アッセイ（ＣＣＫ－８， Ｓｉｇｍａ ９６９９２）を使用して、親のｉ８８Ｇ１と比較して、直接的な細胞殺滅に関してＣＯＬＯ２０５およびＨＣＴ１５で分析した。一定の濃度のパーセンテージの殺滅を、同じ実験の同じ濃度のｉ８８Ｇ１による対応するパーセンテージの殺滅に対して正規化し、複数の実験を通した細胞殺滅を関連付けた。大部分のｉ８８Ｇ１復帰変異体コンストラクトは、ＣＯＬＯ２０５細胞に対して良好な直接的な細胞殺滅を保持していた（図９Ａ）。残基３４２、３４３、３４５、３６１、３６２、３７４、および３７６（合計７つ）は、１未満の正規化された殺滅の平均を有し、高結合ＣＯＬＯ２０５細胞株での直接的な細胞殺滅に重要であるとみなされた。対照的に、これら７つの残基が単独で復帰した場合、この最小コンストラクトは、発現／フォールディングせず、よってこのコンストラクトは追跡されていない。中程度の結合のＨＣＴ１５の直接的な細胞殺滅は、ｈＧ１残基への反転に対してより感受性があることが証明されており、ここでは、８つの復帰した残基（３３９、３４４、３５４、３５６、３５７、３５８、３７０、３７３）のみが１標準偏差の範囲内までｉ８８Ｇ１の細胞殺滅を維持しており、よって１５のｍＧ３残基：Ｎ２８６Ｔ、Ｋ２８８Ｗ、Ｋ２９０Ｑ、Ｑ３４２Ｒ、Ｐ３４３Ａ、Ｅ３４５Ｔ、Ｌ３５１Ｉ、Ｔ３５９Ｓ、Ｎ３６１Ｋ、Ｑ３６２Ｋ、Ｇ３７１Ｎ、Ｐ３７４Ｓ、Ｓ３７５Ｅ、Ｄ３７６Ａ、Ａ３７８Ｓの保持を必要とする（図９Ｂ）。後者のコンストラクトは、８８および１２９ｍＡｂ、ｉ８８Ｇ１ｖ２およびｉ１２９Ｇ１ｖ２のそれぞれの両方で作製し、ＣＯＬＯ２０５およびＨＣＴ１５でそれらの細胞殺滅を分析した。ｉ８８Ｇ１ｖ２およびｉ１２９Ｇ１ｖ２によるＣＯＬＯ２０５の直接的な細胞殺滅は、ｉ８８Ｇ１およびｉ１２９Ｇ１のそれぞれにより観察されるものと同等であった（図９Ｃおよび９Ｄ）。また、ｉ８８Ｇ１ｖ２によるＨＣＴ１５の直接的な細胞殺滅は、ｉ８８Ｇ１により観察されるものと一致していた（図９Ｅ）。

まとめると、これら結果は、１５のｍＧ３残基：Ｎ２８６Ｔ、Ｋ２８８Ｗ、Ｋ２９０Ｑ、Ｑ３４２Ｒ、Ｐ３４３Ａ、Ｅ３４５Ｔ、Ｌ３５１Ｉ、Ｔ３５９Ｓ、Ｎ３６１Ｋ、Ｑ３６２Ｋ、Ｇ３７１Ｎ、Ｐ３７４Ｓ、Ｓ３７５Ｅ、Ｄ３７６Ａ、Ａ３７８Ｓが、高結合がん細胞株および中程度の結合のがん細胞株に直接的な細胞殺滅を誘導するために十分であることを示唆している。

実施例８．ＦＧ２７ ｍＡｂの作製および最初の性質決定：ＦＧ２７は、胃腫瘍細胞の糖脂質での免疫処置により産生された。
免疫処置に対する抗体応答の分析：最初に抗体の力価を、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）によりモニタリングした。その後、ＳＴ１６の全体および細胞膜の脂質抽出物を使用する薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）分析、ＳＴ１６腫瘍細胞を使用するフローサイトメトリー分析（ＦＡＣＳ）ならびにＳＴ１６の全細胞抽出物、全体および細胞膜の脂質抽出物を使用するウェスタンブロットを行った。出血させる前の血清対照と比較して最良の応答を有するとみなしたマウスに、融合前のＳＴ１６細胞膜脂質抽出物を静脈内（ｉ．ｖ．）にブーストした。

腫瘍細胞株のパネルに対するＦＧ２７ハイブリドーマの上清の結合を、直接的な免疫蛍光およびＦＡＣＳ分析により分析した。ＦＧ２７．１０およびＦＧ２７．１８は両方とも、陽性対照抗ＨＬＡ ｍＡｂ、Ｗ６／３２（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ， ＣＡ， ＵＳＡ）および陰性対照と比較して、ＳＴ１６に結合したが、ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）または末梢血単核球（ＰＢＭＣ）には結合しなかった（図１０）。ＦＧ２７．１０およびＦＧ２７．１８の両方をクローニングした。ＦＧ２７．１０はＩｇＧ３κのサブクラスであり、ＦＧ２７．１８はＩｇＧ１κのサブクラスであった。両ｍＡｂが糖脂質への結合したことを確認するために、糖脂質をある範囲の細胞株から抽出し、ＥＬＩＳＡプレート上で乾燥させた後、ＦＧ２７．１０およびＦＧ２７．１８とインキュベートした。結合は、両方のｍＡｂとＣ１７０、ＳＴ１６、およびＡＧＳに由来する糖脂質とで見られるが、全細胞に対する結合を示さなかった細胞株では見られなかった（ＭＫＮ－４５、ＯＡＷ２８、ＯＶＣＡＲ－３、ＯＶＣＡＲ－４、およびＯＡＷ４２；図１１）。

実施例９．親のＦＧ２７ ｍＡｂの直接的な細胞殺滅
多くの抗グリカンｍＡｂは、エフェクター細胞または補体を必要とせずに抗原陽性細胞株で直接的な細胞死を誘導することが示されている。これは、腫瘍が免疫が介在する細胞死を回避するための機構を開発し得るため、それらのｉｎ ｖｉｖｏでの効果を潜在的に高め得る。この特性は、主に、ｍＩｇＧ３のアイソタイプのグリカン結合ｍＡｂに関連し、よってその特性は、キメラ化またはヒト化により失われる。

ＦＧ２７．１０およびＦＧ２７．１８が、直接的な細胞死を引き起こす特性を有するかどうかを決定するために、ＳＴ１６細胞を、ＦＧ２７．１０、ＦＧ２７．１８、および抗シアリルＬｅｗｉｓ^ａ ｍＡｂ ＳＣ１０４と室温で２時間インキュベートした後、細胞死を、ＰＩ（死細胞によりのみ取り込まれるＤＮＡ挿入剤である）の取り込みにより測定した（図１２Ａ）。興味深いことに、同じ可変領域を有するにも関わらず、ＦＧ２７．１０のみが、直接的な細胞死を誘導することができ、ＦＧ２７．１８ではＰＩの取り込みは観察されなかった。図１２Ｂは、様々な量の殺滅を示す２つのｍＡｂを用いたある範囲の抗原陽性（ＡＧＳ、Ｃｏｌｏ２０１、Ｃ１７０、Ｃ１７０ＨＭ、ＭＣＦ－７、ＯＶＣＡＲ４）細胞株の直接的な細胞殺滅を示す。いずれのｍＡｂも、抗原陰性細胞株（ＬｏＶｏ、ＭＫＮ４５、７９１Ｔ、ＳＫＯＶ３）の殺滅を示さなかった。

図１２Ｃは、ある範囲のｍＡｂによる結腸直腸細胞株Ｃ１７０のＰＩの取り込みを示す。ＦＧ２７．１０および陽性対照抗体ＳＣ１０１は、強力な滴定できる殺滅を示した。ＦＧ２７．１８は、弱く滴定できない殺滅を示した。修飾されたキメラのＩｇＧ１は、控えめな滴定可能な殺滅を示したが、ＩｇＧ２バリアントはこれを示さなかった。

実施例１０．ＦＧ２７の結合試験
ヒト化したｍＡｂ（ヒト化２７）およびキメラｍＡｂ（ＣＨ２７）は、がん細胞株での滴定で類似の細胞結合パターンを示した（図１３Ａ～Ｅ）。平衡親和性定数は、全体的に同じ位数であるが、親のマウス抗体と比較してわずかに高く（図１３Ｆ～Ｇ）、ヒト化２７およびＣＨ２７の最大結合能は、マウスｍＡｂの値と比較して大きかった。この結果は、ヒト化プロセスのアウトカムの成功を示唆している。

実施例１１．ヒト化ＦＧ２７ ｍＡｂの直接的な細胞殺滅
ヒトＩｇＧ１ ２７のキメラ（２７ＩｇＧ１）の直接的な細胞殺滅を高めるために、本発明者らは、選択したｍＩｇＧ３定常領域の残基をＩｇＧ１のＦｃドメインに移し、これにより、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの直接的な細胞殺滅能が改善された、改善された「ｉ２７Ｇ１」ＬｅｗｉｓＹグリカン結合ｍＡｂを作製した。

図１４は、改善されたｉ２７Ｇ１の直接的な細胞殺滅、機能的な親和性、およびエフェクター機能を示す。ｍＩｇＧ３ ２７抗体は、Ｌｅｗｉｓ^ｙを発現するＭＣＦ７（図１４ｉ）およびＡＧＳ細胞株（図１４ｉｉ）で直接的な細胞殺滅能を有し、キメラ２７ＩｇＧ１はこれを有さない。選択されたｍＩｇＧ３定常領域の残基を含む本発明者らのｉ２７Ｇ１は、ＭＣＦ７（図１４ｉ）およびＡＧＳ（図１４ｉｉ）の両方で、２７ｍＧ３ ｍＡｂと同等の、２７ＩｇＧ１と比較して有意に改善された直接的な細胞殺滅を呈する。さらに、ｉ２７Ｇ１は、２７ＩｇＧ１と比較して有意に改善された機能的なＬｅｗｉｓ^ｙ親和性を呈する（図１４ｉｉｉ）。重要なことに、ｉ２７Ｇ１のエフェクター機能、ＡＤＣＣ、およびＣＤＣは全て、ＭＣＦ７で２７ＩｇＧ１と同等であった（図１４ｉｖおよび１４ｖ）。まとめると、この結果は、ｍＩｇＧ３定常領域から２７ＩｇＧ１骨格への選択された領域の移動は、直接的な細胞殺滅能、機能的な親和性の増大、および強力な免疫エフェクター機能を伴うハイブリッドｍＡｂをもたらしたことを表している。

実施例１２．「ｉＧ１」配列のタンパク質結合ｍＡｂ（トラスツズマブ）への移動は、機能的な親和性が改善したがんを標的化するｍＡｂをもたらす。
がんに関連するタンパク質を標的とする抗体のアミノ酸残基を変えることが機能的な親和性の増大をもたらしたかどうかを評価するために、「ｉＧ１」残基（２３、「ｖ１」および１５、「ｖ２」）を変え、ＳＰＲ分析を介して、結果得られる「改善された」抗体のバリアントの親和性を決定した。機能的な親和性を決定するために、３つのトラスツズマブ抗体コンストラクトを、３つの異なるリガンド密度にてＨＥＲ２でコーティングしたチップを通して滴定した。複数回の動態解析（９０ｎＭ～０．３７Ｍの濃度範囲）が行われ、これは、低密度（２０ＲＵ）および高密度（２００ＲＵ）の表面の両方でＷＴと比較して高いｉＴｖ１およびｉＴｖ２による機能的な親和性を示した（図１８Ａ）。この改善は、高密度の表面でより顕著であり、主にオフ速度の低下（ＷＴの６．０×１０^－７ １／ｓに対しｉＴＶ１で８．５×１０^－８ １／ｓおよびｉＴｖ２で７．４×１０^－８ １／ｓ）により駆動された。ＨＥＫ２９３で発現した野生型のトラスツズマブ（ＷＴ）および「改善された」バリアント（ｉＴｖ１およびｉＴｖ２）は、ＨＥＲ２を発現する細胞株ＳＫＢＲ３およびＢＴ４７４に対して高結合、ならびにＭＤＡ－ＭＢ２３１およびＳＫＯＶ３に対して低い～中程度の結合を示した（図１８Ｂ）。ｉＴｖ１およびｉＴｖ２によるより強力な結合が差次的な細胞傷害性をもたらすかどうかを評価するために、ＭＤＡ－ＭＢ２３１での増殖阻害およびＢＴ４７４でのＰＩの取り込みを探索した。ｉＴｖ２は、ＭＤＡ－ＭＢ２３１にてＷＴと比較して有意に改善した増殖阻害を呈し（図１８Ｃ）、ここでｉＴｖ１およびｉＴｖ２は、ＷＴと比較してＢＴ４７４細胞で改善されたＰＩの取り込みを示し、これは試験した最も高い濃度で最も顕著であった（図１８Ｄ）。ＨＥＲ２でコーティングしたＥＬＩＳＡプレートで直接ＨＲＰＯ標識したｍＡｂの滴定から、ＷＴと比較して改善したｉＴｖ２による結合が明らかとなった。まとめると、これら結果は、「ｉＧ１」による改善された機能的な親和性が、トラスツズマブコンストラクトを操作することを表しており、本発明者らの手法が、グリカン標的に加え、タンパク質を標的とするｍＡｂにも有用であり得ることが示唆される。しかしながら、本発明者らの操作手法の最終的な結果は、標的密度と組み合わせたｍＡｂの複雑な結合活性間での関係に依存する。

実施形態
本発明の特定の実施形態を、以下に記載する。以下の実施形態の様々な特性は、他の実施形態の特性と組み合わされてよく、たとえば、配列モチーフなどの構造的な特性は、請求される抗体またはその抗原結合フラグメントの機能的な特性と組み合わせられ得る。

１．イムノグロブリンのＦｃ領域の１つ以上の残基および結合領域を含む修飾されたＩｇＧ１抗体またはその抗原結合フラグメントであって、Ｆｃ領域の１つ以上の残基が、マウスＩｇＧ３抗体由来の対応する残基へと修飾されており、修飾されたＩｇＧ１抗体またはその抗原結合フラグメントが、野生型のＦｃ領域残基を含む対応するＩｇＧ１抗体またはその抗原結合フラグメントと比較して高い機能的な親和性を有する、修飾されたＩｇＧ１抗体またはその抗原結合フラグメント。

２．前記修飾されたＩｇＧ１抗体またはその抗原結合フラグメントの機能的な親和性が、野生型のＦｃ領域残基を含む対応するＩｇＧ１抗体またはその抗原結合フラグメントと比較して少なくとも約１０％高い、実施形態１に記載の修飾されたＩｇＧ１抗体またはその抗原結合フラグメント。

３．前記修飾されたＩｇＧ１抗体またはその抗原結合フラグメントの機能的な親和性が、野生型のＦｃ領域残基を含む対応するＩｇＧ１抗体またはその抗原結合フラグメントと比較して少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または少なくとも約１００％高い、実施形態１または２に記載の修飾されたＩｇＧ１抗体またはその抗原結合フラグメント。

４．前記修飾されたＩｇＧ１抗体またはその抗原結合フラグメントが、野生型のＦｃ領域残基を含む対応するＩｇＧ１抗体またはその抗原結合フラグメントと比較して高い直接的な細胞殺滅を有する、実施形態１～３のいずれか１つに記載の修飾されたＩｇＧ１抗体またはその抗原結合フラグメント。

５．前記修飾されたＩｇＧ１抗体またはその抗原結合フラグメントの直接的な細胞殺滅が、野生型のＦｃ領域残基を含む対応するＩｇＧ１抗体またはその抗原結合フラグメントと比較して少なくとも約１０％高い、実施形態４に記載の修飾されたＩｇＧ１抗体またはその抗原結合フラグメント。

６．前記修飾されたＩｇＧ１抗体またはその抗原結合フラグメントの直接的な細胞殺滅が、野生型のＦｃ領域残基を含む対応するＩｇＧ１抗体またはその抗原結合フラグメントと比較して少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または少なくとも約１００％高い、実施形態１または２に記載の修飾されたＩｇＧ１抗体またはその抗原結合フラグメント。

７．Ｆｃ領域の１つ以上の残基が、Ｑ３４２、Ｐ３４３、Ｅ３４５、Ｎ３６１、Ｑ３６２、Ｐ３７４、Ｄ３７６から選択される、先行する実施形態のいずれか１つに記載の修飾されたＩｇＧ１抗体またはその抗原結合フラグメント。

８．Ｆｃ領域の１つ以上の修飾された残基が、Ｑ３４２Ｒ、Ｐ３４３Ａ、Ｅ３４５Ｔ、Ｎ３６１Ｋ、Ｑ３６２Ｋ、Ｐ３７４Ｓ、Ｄ３７６Ａから選択される、先行する実施形態のいずれか１つに記載の修飾されたＩｇＧ１抗体またはその抗原結合フラグメント。

９．Ｆｃ領域の１つ以上の残基が、Ｎ２８６、Ｋ２８８、Ｋ２９０、Ｑ３４２、Ｐ３４３、Ｅ３４５、Ｌ３５１、Ｔ３５９、Ｎ３６１、Ｑ３６２、Ｇ３７１、Ｐ３７４、Ｓ３７５、Ｄ３７６、Ａ３７８から選択される、先行する実施形態のいずれか１つに記載の修飾されたＩｇＧ１抗体またはその抗原結合フラグメント。

１０．Ｆｃ領域の１つ以上の修飾された残基が、Ｎ２８６Ｔ、Ｋ２８８Ｗ、Ｋ２９０Ｑ、Ｑ３４２Ｒ、Ｐ３４３Ａ、Ｅ３４５Ｔ、Ｌ３５１Ｉ、Ｔ３５９Ｓ、Ｎ３６１Ｋ、Ｑ３６２Ｋ、Ｇ３７１Ｎ、Ｐ３７４Ｓ、Ｓ３７５Ｅ、Ｄ３７６Ａ、Ａ３７８Ｓから選択される、先行する実施形態のいずれか１つに記載の修飾されたＩｇＧ１抗体またはその抗原結合フラグメント。

１１．Ｆｃ領域の１つ以上の残基が、Ｎ２８６、Ｋ２８８、Ｋ２９０、Ａ３３９、Ｑ３４２、Ｐ３４３、Ｒ３４４、Ｅ３４５、Ｌ３５１、Ｓ３５４、Ｄ３５６、Ｅ３５７、Ｌ３５８、Ｔ３５９、Ｎ３６１、Ｑ３６２、Ｋ３７０、Ｇ３７１、Ｙ３７３、Ｐ３７４、Ｓ３７５、Ｄ３７６、Ａ３７８から選択される、先行する実施形態のいずれか１つに記載の修飾されたＩｇＧ１抗体またはその抗原結合フラグメント。

１２．Ｆｃ領域の１つ以上の修飾された残基が、Ｎ２８６Ｔ、Ｋ２８８Ｗ、Ｋ２９０Ｑ、Ａ３３９Ｐ、Ｑ３４２Ｒ、Ｐ３４３Ａ、Ｒ３４４Ｑ、Ｅ３４５Ｔ、Ｌ３５１Ｉ、Ｓ３５４Ｐ、Ｄ３５６Ｅ、Ｅ３５７Ｑ、Ｌ３５８Ｍ、Ｔ３５９Ｓ、Ｎ３６１Ｋ、Ｑ３６２Ｋ、Ｋ３７０Ｔ、Ｇ３７１Ｎ、Ｙ３７３Ｆ、Ｐ３７４Ｓ、Ｓ３７５Ｅ、Ｄ３７６Ａ、Ａ３７８Ｓから選択される、先行する実施形態のいずれか１つに記載の修飾されたＩｇＧ１抗体またはその抗原結合フラグメント。

１３．Ｆｃ領域の１つ以上の残基が、Ｎ２８６、Ｋ２８８、Ｋ２９０、Ｅ２９４、Ｙ３００、Ｖ３０５、Ａ３３９、Ｑ３４２、Ｐ３４３、Ｒ３４４、Ｅ３４５、Ｌ３５１、Ｓ３５４、Ｄ３５６、Ｅ３５７、Ｌ３５８、Ｔ３５９、Ｎ３６１、Ｑ３６２、Ｋ３７０、Ｇ３７１、Ｙ３７３、Ｐ３７４、Ｓ３７５、Ｄ３７６、Ａ３７８から選択される、先行する実施形態のいずれか１つに記載の修飾されたＩｇＧ１抗体またはその抗原結合フラグメント。

１４．Ｆｃ領域の１つ以上の修飾された残基が、Ｎ２８６Ｔ、Ｋ２８８Ｗ、Ｋ２９０Ｑ、Ｅ２９４Ａ、Ｙ３００Ｆ、Ｖ３０５Ａ、Ａ３３９Ｐ、Ｑ３４２Ｒ、Ｐ３４３Ａ、Ｒ３４４Ｑ、Ｅ３４５Ｔ、Ｌ３５１Ｉ、Ｓ３５４Ｐ、Ｄ３５６Ｅ、Ｅ３５７Ｑ、Ｌ３５８Ｍ、Ｔ３５９Ｓ、Ｎ３６１Ｋ、Ｑ３６２Ｋ、Ｋ３７０Ｔ、Ｇ３７１Ｎ、Ｙ３７３Ｆ、Ｐ３７４Ｓ、Ｓ３７５Ｅ、Ｄ３７６Ａ、Ａ３７８Ｓから選択される、先行する実施形態のいずれか１つに記載の修飾されたＩｇＧ１抗体またはその抗原結合フラグメント。

１５．前記抗体またはその抗原結合フラグメントが、ヒト抗体、ヒト化抗体、またはキメラ抗体である、先行する実施形態のいずれか１つに記載の修飾されたＩｇＧ１抗体またはその抗原結合フラグメント。

１６．ＩｇＧ１抗体またはその抗原結合フラグメントが、単一特異性抗体、二重特異性抗体、または多重特異性抗体である、先行する実施形態のいずれか１つに記載の修飾されたＩｇＧ１抗体またはその抗原結合フラグメント。

１７．ＩｇＧ１抗体またはその抗原結合フラグメントが、第１の重鎖および第１の抗原結合領域、第２の重鎖および第２の抗原結合領域を伴うＦｃ領域を含む二重特異性抗体である、実施形態１６に記載の修飾されたＩｇＧ１抗体またはその抗原結合フラグメント。

１８．ＩｇＧ１抗体またはその抗原結合フラグメントが、ＣＤ３抗原に結合する二重特異性抗体である、実施形態１６または１７に記載の修飾されたＩｇＧ１抗体またはその抗原結合フラグメント。

１９．モチーフＲＡＸＴＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＫＫＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＳＸＡ（式中Ｘは任意のアミノ酸である）を含む、修飾されたＩｇＧ１抗体またはその抗原結合フラグメント。

２０．モチーフＴＸＷＸＱＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＲＡＸＴＸＸＸＸＸＩＸＸＸＸＸＸＸＳＸＫＫＸＸＸＸＸＸＸＸＮＸＸＳＥＡＸＳ（式中Ｘは任意のアミノ酸である）を含む、修飾されたＩｇＧ１抗体またはその抗原結合フラグメント。

２１．モチーフＴＸＷＸＱＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＡＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＰＸＸＲＡＱＴＸＸＸＸＸＩＸＸＰＸＥＱＭＳＸＫＫＸＸＸＸＸＸＸＴＸＸＦＳＥＡＸＳ（式中Ｘは任意のアミノ酸である）を含む、修飾されたＩｇＧ１抗体またはその抗原結合フラグメント。

２２．モチーフＴＸＷＸＱＸＸＸＡＸＸＸＸＸＦＸＸＸＸＡＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＰＸＸＲＡＱＴＸＸＸＸＸＩＸＸＰＸＥＱＭＳＸＫＫＸＸＸＸＸＸＸＴＮＸＦＳＥＡＸＳ（式中Ｘは任意のアミノ酸である）を含む、修飾されたＩｇＧ１抗体またはその抗原結合フラグメント。

２３．以下のリスト：
（ｉ）ＴＸＷＸＱ
（ｉｉ）ＲＡＸＴＸＸＸＸＸＩ
（ｉｉｉ）ＳＸＫＫＸＸＸＸＸＸＸＸＮＸＸＳＥＡＸＳ
（ｉｖ）ＮＸＸＳＥＡＸＳ
（式中Ｘは任意のアミノ酸である）
から選択されるいずれか１つ以上のモチーフを含む、修飾されたＩｇＧ１抗体またはその抗原結合フラグメント。

２４．イムノグロブリンのＦｃ領域の１つ以上の残基および結合領域を含むＩｇＧ１抗体またはその抗原結合フラグメントの直接的な細胞殺滅能を増大させる方法であって、前記Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインおよび／またはＣＨ３ドメインの１つ以上の残基を、マウスＩｇＧ３のＣＨ２ドメインおよび／またはＣＨ３ドメイン由来の１つ以上の対応する残基と置き換えるステップを含む、方法。

２５．前記方法が、Ｑ３４２、Ｐ３４３、Ｅ３４５、Ｎ３６１、Ｑ３６２、Ｐ３７４、Ｄ３７６から選択されるＦｃ領域の１つ以上の残基を修飾するステップを含む、実施形態２４に記載のＩｇＧ１抗体またはその抗原結合フラグメントの直接的な細胞殺滅能を増大させる方法。

２６．１つ以上の修飾された残基が、Ｑ３４２Ｒ、Ｐ３４３Ａ、Ｅ３４５Ｔ、Ｎ３６１Ｋ、Ｑ３６２Ｋ、Ｐ３７４Ｓ、Ｄ３７６Ａから選択される、実施形態２５に記載の方法。

２７．前記方法が、Ｎ２８６、Ｋ２８８、Ｋ２９０、Ｑ３４２、Ｐ３４３、Ｅ３４５、Ｌ３５１、Ｔ３５９、Ｎ３６１、Ｑ３６２、Ｇ３７１、Ｐ３７４、Ｓ３７５、Ｄ３７６、Ａ３７８から選択されるＦｃ領域の１つ以上の残基を修飾するステップを含む、実施形態２４に記載のＩｇＧ１抗体またはその抗原結合フラグメントの直接的な細胞殺滅能を増大させる方法。

２８．前記１つ以上の修飾された残基が、Ｎ２８６Ｔ、Ｋ２８８Ｗ、Ｋ２９０Ｑ、Ｑ３４２Ｒ、Ｐ３４３Ａ、Ｅ３４５Ｔ、Ｌ３５１Ｉ、Ｔ３５９Ｓ、Ｎ３６１Ｋ、Ｑ３６２Ｋ、Ｇ３７１Ｎ、Ｐ３７４Ｓ、Ｓ３７５Ｅ、Ｄ３７６Ａ、Ａ３７８Ｓから選択される、実施形態２７に記載の方法。

２９．前記方法が、Ｎ２８６、Ｋ２８８、Ｋ２９０、Ａ３３９、Ｑ３４２、Ｐ３４３、Ｒ３４４、Ｅ３４５、Ｌ３５１、Ｓ３５４、Ｄ３５６、Ｅ３５７、Ｌ３５８、Ｔ３５９、Ｎ３６１、Ｑ３６２、Ｋ３７０、Ｇ３７１、Ｙ３７３、Ｐ３７４、Ｓ３７５、Ｄ３７６、Ａ３７８から選択されるＦｃ領域の１つ以上の残基を修飾するステップを含む、実施形態２４に記載のＩｇＧ１抗体またはその抗原結合フラグメントの直接的な細胞殺滅能を増大させる方法。

３０．１つ以上の修飾された残基が、Ｎ２８６Ｔ、Ｋ２８８Ｗ、Ｋ２９０Ｑ、Ａ３３９Ｐ、Ｑ３４２Ｒ、Ｐ３４３Ａ、Ｒ３４４Ｑ、Ｅ３４５Ｔ、Ｌ３５１Ｉ、Ｓ３５４Ｐ、Ｄ３５６Ｅ、Ｅ３５７Ｑ、Ｌ３５８Ｍ、Ｔ３５９Ｓ、Ｎ３６１Ｋ、Ｑ３６２Ｋ、Ｋ３７０Ｔ、Ｇ３７１Ｎ、Ｙ３７３Ｆ、Ｐ３７４Ｓ、Ｓ３７５Ｅ、Ｄ３７６Ａ、Ａ３７８Ｓから選択される、実施形態２９に記載の方法。

３１．前記方法が、Ｎ２８６、Ｋ２８８、Ｋ２９０、Ｅ２９４、Ｙ３００、Ｖ３０５、Ａ３３９、Ｑ３４２、Ｐ３４３、Ｒ３４４、Ｅ３４５、Ｌ３５１、Ｓ３５４、Ｄ３５６、Ｅ３５７、Ｌ３５８、Ｔ３５９、Ｎ３６１、Ｑ３６２、Ｋ３７０、Ｇ３７１、Ｙ３７３、Ｐ３７４、Ｓ３７５、Ｄ３７６、Ａ３７８から選択されるＦｃ領域の１つ以上の残基を修飾するステップを含む、実施形態２４に記載のＩｇＧ１抗体またはその抗原結合フラグメントの直接的な細胞殺滅能を増大させる方法。

３２．１つ以上の修飾された残基が、Ｎ２８６Ｔ、Ｋ２８８Ｗ、Ｋ２９０Ｑ、Ｅ２９４Ａ、Ｙ３００Ｆ、Ｖ３０５Ａ、Ａ３３９Ｐ、Ｑ３４２Ｒ、Ｐ３４３Ａ、Ｒ３４４Ｑ、Ｅ３４５Ｔ、Ｌ３５１Ｉ、Ｓ３５４Ｐ、Ｄ３５６Ｅ、Ｅ３５７Ｑ、Ｌ３５８Ｍ、Ｔ３５９Ｓ、Ｎ３６１Ｋ、Ｑ３６２Ｋ、Ｋ３７０Ｔ、Ｇ３７１Ｎ、Ｙ３７３Ｆ、Ｐ３７４Ｓ、Ｓ３７５Ｅ、Ｄ３７６Ａ、Ａ３７８Ｓから選択される、実施形態３１に記載の方法。

３３．実施形態１～２３のいずれか１つに記載の修飾されたＩｇＧ１抗体またはその抗原結合フラグメントと、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物。

３４．少なくとも１つの他の治療用作用物質をさらに含む、実施形態３３に記載の医薬組成物。

３５．実施形態１～２３のいずれか１つに記載の修飾されたＩｇＧ１抗体またはその抗原結合フラグメントと、免疫調節剤とを含む、実施形態３３または３４に記載の医薬組成物。

３６．医薬として使用するための、実施形態１～２３のいずれか１つに記載の修飾されたＩｇＧ１抗体もしくはその抗原結合フラグメントまたは実施形態３３～３５のいずれか１つに記載の組成物。

３７．がん、自己免疫疾患、炎症性疾患、または感染性疾患の処置に使用するための、実施形態１～２３のいずれか１つに記載の修飾されたＩｇＧ１抗体もしくはその抗原結合フラグメントまたは実施形態３３～３５のいずれか１つに記載の組成物。

３８．疾患を有する個体を処置する方法であって、実施形態１～２３のいずれか１つに記載の修飾されたＩｇＧ１抗体もしくはその抗原結合フラグメントまたは実施形態３３～３５のいずれか１つに記載の組成物の薬学的有効量を前記個体に投与するステップを含む、方法。

３９．前記疾患が、がん、自己免疫疾患、炎症性疾患、および感染性疾患の群から選択される、実施形態３８に記載の個体を処置する方法。

４０．前記個体にさらなる治療用作用物質を投与するステップをさらに含む、実施形態３８～３９のいずれか１つに記載の個体を処置する方法。

４１．前記さらなる治療用作用物質が、免疫調節剤である、実施形態４０に記載の個体を処置する方法。

４２．前記修飾されたＩｇＧ１抗体もしくはその抗原結合フラグメントまたは組成物が、バイアルなどの１つ以上の容器の中にある、実施形態１～２３のいずれか１つに記載の修飾されたＩｇＧ１抗体もしくはその抗原結合フラグメントまたは実施形態３３～３５のいずれか１つに記載の組成物を含むキット。

４３．前記修飾されたＩｇＧ１抗体もしくはその抗原結合フラグメントまたは組成物が、治療における同時使用、別々の使用、または連続的な使用のためのものである、実施形態４２に記載のキット。

４４．疾患の処置用の医薬の製造のための、実施形態１～２３のいずれか１つに記載の修飾されたＩｇＧ１抗体もしくはその抗原結合フラグメントまたは実施形態３３～３５のいずれか１つに記載の組成物の使用。

４５．前記疾患が、がん、自己免疫疾患、炎症性疾患、または感染性疾患である、実施形態４４に記載の使用。

４６．Ｑ３４２、Ｐ３４３、Ｅ３４５、Ｎ３６１、Ｑ３６２、Ｐ３７４、Ｄ３７６から選択される残基の位置でＦｃ領域に対する１つ以上の残基の修飾を含む、修飾されたＩｇＧ１抗体またはその抗原結合フラグメント。

４７．Ｑ３４２Ｒ、Ｐ３４３Ａ、Ｅ３４５Ｔ、Ｎ３６１Ｋ、Ｑ３６２Ｋ、Ｐ３７４Ｓ、Ｄ３７６Ａから選択されるＦｃ領域に対する１つ以上の修飾を含む、修飾されたＩｇＧ１抗体またはその抗原結合フラグメント。

４８．Ｎ２８６、Ｋ２８８、Ｋ２９０、Ｑ３４２、Ｐ３４３、Ｅ３４５、Ｌ３５１、Ｔ３５９、Ｎ３６１、Ｑ３６２、Ｇ３７１、Ｐ３７４、Ｓ３７５、Ｄ３７６、Ａ３７８から選択される残基の位置でＦｃ領域に対する１つ以上の残基の修飾を含む、修飾されたＩｇＧ１抗体またはその抗原結合フラグメント。

４９．Ｎ２８６Ｔ、Ｋ２８８Ｗ、Ｋ２９０Ｑ、Ｑ３４２Ｒ、Ｐ３４３Ａ、Ｅ３４５Ｔ、Ｌ３５１Ｉ、Ｔ３５９Ｓ、Ｎ３６１Ｋ、Ｑ３６２Ｋ、Ｇ３７１Ｎ、Ｐ３７４Ｓ、Ｓ３７５Ｅ、Ｄ３７６Ａ、Ａ３７８Ｓから選択されるＦｃ領域に対する１つ以上の修飾を含む、修飾されたＩｇＧ１抗体またはその抗原結合フラグメント。

５０．Ｎ２８６、Ｋ２８８、Ｋ２９０、Ａ３３９、Ｑ３４２、Ｐ３４３、Ｒ３４４、Ｅ３４５、Ｌ３５１、Ｓ３５４、Ｄ３５６、Ｅ３５７、Ｌ３５８、Ｔ３５９、Ｎ３６１、Ｑ３６２、Ｋ３７０、Ｇ３７１、Ｙ３７３、Ｐ３７４、Ｓ３７５、Ｄ３７６、Ａ３７８から選択される残基の位置でＦｃ領域に対する１つ以上の残基の修飾を含む、修飾されたＩｇＧ１抗体またはその抗原結合フラグメント。

５１．Ｎ２８６Ｔ、Ｋ２８８Ｗ、Ｋ２９０Ｑ、Ａ３３９Ｐ、Ｑ３４２Ｒ、Ｐ３４３Ａ、Ｒ３４４Ｑ、Ｅ３４５Ｔ、Ｌ３５１Ｉ、Ｓ３５４Ｐ、Ｄ３５６Ｅ、Ｅ３５７Ｑ、Ｌ３５８Ｍ、Ｔ３５９Ｓ、Ｎ３６１Ｋ、Ｑ３６２Ｋ、Ｋ３７０Ｔ、Ｇ３７１Ｎ、Ｙ３７３Ｆ、Ｐ３７４Ｓ、Ｓ３７５Ｅ、Ｄ３７６Ａ、Ａ３７８Ｓから選択されるＦｃ領域に対する１つ以上の修飾を含む、修飾されたＩｇＧ１抗体またはその抗原結合フラグメント。

５２．Ｎ２８６、Ｋ２８８、Ｋ２９０、Ｅ２９４、Ｙ３００、Ｖ３０５、Ａ３３９、Ｑ３４２、Ｐ３４３、Ｒ３４４、Ｅ３４５、Ｌ３５１、Ｓ３５４、Ｄ３５６、Ｅ３５７、Ｌ３５８、Ｔ３５９、Ｎ３６１、Ｑ３６２、Ｋ３７０、Ｇ３７１、Ｙ３７３、Ｐ３７４、Ｓ３７５、Ｄ３７６、Ａ３７８から選択される残基の位置でＦｃ領域に対する１つ以上の残基の修飾を含む、修飾されたＩｇＧ１抗体またはその抗原結合フラグメント。

５３．Ｎ２８６Ｔ、Ｋ２８８Ｗ、Ｋ２９０Ｑ、Ｅ２９４Ａ、Ｙ３００Ｆ、Ｖ３０５Ａ、Ａ３３９Ｐ、Ｑ３４２Ｒ、Ｐ３４３Ａ、Ｒ３４４Ｑ、Ｅ３４５Ｔ、Ｌ３５１Ｉ、Ｓ３５４Ｐ、Ｄ３５６Ｅ、Ｅ３５７Ｑ、Ｌ３５８Ｍ、Ｔ３５９Ｓ、Ｎ３６１Ｋ、Ｑ３６２Ｋ、Ｋ３７０Ｔ、Ｇ３７１Ｎ、Ｙ３７３Ｆ、Ｐ３７４Ｓ、Ｓ３７５Ｅ、Ｄ３７６Ａ、Ａ３７８Ｓから選択されるＦｃ領域に対する１つ以上の修飾を含む、修飾されたＩｇＧ１抗体またはその抗原結合フラグメント。

５４．図１９に開示される１つ以上の配列を含む、修飾されたＩｇＧ１抗体またはその抗原結合フラグメント。

５５．図１９に開示される重鎖および軽鎖の配列を含む、修飾されたＩｇＧ１抗体またはその抗原結合フラグメント。

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Ｈｅｒｎａｎｄｅｚ， Ａ． Ｍ．， Ｎ． Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ， Ｊ． Ｅ． Ｇｏｎｚａｌｅｚ， Ｅ． Ｒｅｙｅｓ， Ｔ． Ｒｏｎｄｏｎ， Ｔ． Ｇｒｉｎａｎ， Ａ． Ｍａｃｉａｓ， Ｓ． Ａｌｆｏｎｓｏ， Ａ． Ｍ． Ｖａｚｑｕｅｚ， ａｎｄ Ｒ． Ｐｅｒｅｚ． ２０１１． ‘Ａｎｔｉ－ＮｅｕＧｃＧＭ３ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， ａｃｔｉｖｅｌｙ ｅｌｉｃｉｔｅｄ ｂｙ ｉｄｉｏｔｙｐｉｃ ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ ｉｎ ｎｏｎｓｍａｌｌ ｃｅｌｌ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ ｐａｔｉｅｎｔｓ， ｉｎｄｕｃｅ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ ｂｙ ａｎ ｏｎｃｏｓｉｓ－ｌｉｋｅ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ’， Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ， １８６： ３７３５－４４．
Ｈｏｖｅｎｄｅｎ， Ｍ．， Ｍ． Ａ． Ｈｕｂｂａｒｄ， Ｄ． Ｐ． Ａｕｃｏｉｎ， Ｐ． Ｔｈｏｒｋｉｌｄｓｏｎ， Ｄ． Ｅ． Ｒｅｅｄ， Ｗ． Ｈ． Ｗｅｌｃｈ， Ｃ． Ｒ． Ｌｙｏｎｓ， Ｊ． Ａ． Ｌｏｖｃｈｉｋ， ａｎｄ Ｔ． Ｒ． Ｋｏｚｅｌ． ２０１３． ‘ＩｇＧ ｓｕｂｃｌａｓｓ ａｎｄ ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ ｄｏｍａｉｎｓ ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅ ｔｏ ｂｉｎｄｉｎｇ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ｂｙ ｍＡｂｓ ｔｏ ｔｈｅ ｐｏｌｙ ｇａｍｍａ－Ｄ－ｇｌｕｔａｍｉｃ ａｃｉｄ ｃａｐｓｕｌａｒ ａｎｔｉｇｅｎ ｏｆ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ’， ＰＬｏＳ Ｐａｔｈｏｇ， ９： ｅ１００３３０６．
Ｈｗａｎｇ， Ｋ． Ｊ．， Ｋ． Ｆ． Ｌｕｋ， ａｎｄ Ｐ． Ｌ． Ｂｅａｕｍｉｅｒ． １９８０． ‘Ｈｅｐａｔｉｃ ｕｐｔａｋｅ ａｎｄ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｏｆ ｕｎｉｌａｍｅｌｌａｒ ｓｐｈｉｎｇｏｍｙｅｌｉｎ／ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ： ａ ｋｉｎｅｔｉｃ ｓｔｕｄｙ’， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ， ７７： ４０３０－４．
Ｊａｗａ， Ｖ．， Ｌ． Ｐ． Ｃｏｕｓｅｎｓ， Ｍ． Ａｗｗａｄ， Ｅ． Ｗａｋｓｈｕｌｌ， Ｈ． Ｋｒｏｐｓｈｏｆｅｒ， ａｎｄ Ａ． Ｓ． Ｄｅ Ｇｒｏｏｔ． ２０１３． ‘Ｔ－ｃｅｌｌ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ： Ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ａｎｄ ｍｉｔｉｇａｔｉｏｎ’， Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ， １４９： ５３４－５５．
Ｋｌａｕｓ， Ｔ．， ａｎｄ Ｊ． Ｂｅｒｅｔａ． ２０１８． ‘ＣＨ２ Ｄｏｍａｉｎ ｏｆ Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ３ Ｇｏｖｅｒｎｓ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ， Ｉｎｃｒｅａｓｅｓ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ａｆｆｉｎｉｔｙ ｔｏ Ｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｔ Ａｎｔｉｇｅｎｓ ａｎｄ Ｅｎｈａｎｃｅｓ Ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｏｎ’， Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ， ９： １０９６．
Ｌａｂｒａｄａ， Ｍ．， Ｄ． Ｄｏｒｖｉｇｎｉｔ， Ｇ． Ｈｅｖｉａ， Ｎ． Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ－Ｚｈｕｒｂｅｎｋｏ， Ａ． Ｍ． Ｈｅｒｎａｎｄｅｚ， Ａ． Ｍ． Ｖａｚｑｕｅｚ， ａｎｄ Ｌ． Ｅ． Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ． ２０１８． ‘ＧＭ３（Ｎｅｕ５Ｇｃ） ｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｅ： ａｎ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｆｉｘｅｄ ｎｅｏａｎｔｉｇｅｎ ｆｏｒ ｃａｎｃｅｒ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ’， Ｓｅｍｉｎ Ｏｎｃｏｌ， ４５： ４１－５１．
Ｌａｄｅｎｓｔｅｉｎ， Ｒ．， Ｕ． Ｐｏｔｓｃｈｇｅｒ， Ｄ． Ｖａｌｔｅａｕ－Ｃｏｕａｎｅｔ， Ｒ． Ｌｕｋｓｃｈ， Ｖ． Ｃａｓｔｅｌ， Ｉ． Ｙａｎｉｖ， Ｇ． Ｌａｕｒｅｙｓ， Ｐ． Ｂｒｏｃｋ， Ｊ． Ｍ． Ｍｉｃｈｏｎ， Ｃ． Ｏｗｅｎｓ， Ｔ． Ｔｒａｈａｉｒ， Ｇ． Ｃ． Ｆ． Ｃｈａｎ， Ｅ． Ｒｕｕｄ， Ｈ． Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ， Ｍ． Ｂｅｃｋ Ｐｏｐｏｖｉｃ， Ｇ． Ｓｃｈｒｅｉｅｒ， Ｈ． Ｌｏｉｂｎｅｒ， Ｐ． Ａｍｂｒｏｓ， Ｋ． Ｈｏｌｍｅｓ， Ｍ． Ｒ． Ｃａｓｔｅｌｌａｎｉ， Ｍ． Ｎ． Ｇａｚｅ， Ａ． Ｇａｒａｖｅｎｔａ， Ａ． Ｄ． Ｊ． Ｐｅａｒｓｏｎ， ａｎｄ Ｈ． Ｎ． Ｌｏｄｅ． ２０１８． ‘Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ ２ ｗｉｔｈ ａｎｔｉ－ＧＤ２ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｃｈ１４．１８／ＣＨＯ （ｄｉｎｕｔｕｘｉｍａｂ ｂｅｔａ） ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈ－ｒｉｓｋ ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ （ＨＲ－ＮＢＬ１／ＳＩＯＰＥＮ）： ａ ｍｕｌｔｉｃｅｎｔｒｅ， ｒａｎｄｏｍｉｓｅｄ， ｐｈａｓｅ ３ ｔｒｉａｌ’， Ｌａｎｃｅｔ Ｏｎｃｏｌ， １９： １６１７－２９．
Ｌｏｏ， Ｄ．， Ｎ． Ｐｒｙｅｒ， Ｐ． Ｙｏｕｎｇ， Ｔ． Ｌｉａｎｇ， Ｓ． Ｃｏｂｅｒｌｙ， Ｋ． Ｌ． Ｋｉｎｇ， Ｋ． Ｋａｎｇ， Ｐ． Ｒｏｂｅｒｔｓ， Ｍ． Ｔｓａｏ， Ｘ． Ｘｕ， Ｂ． Ｐｏｔｔｓ， ａｎｄ Ｊ． Ｐ． Ｍａｔｈｅｒ． ２００７． ‘Ｔｈｅ ｇｌｙｃｏｔｏｐｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＲＡＶ１２ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｉｎｄｕｃｅｓ ｏｎｃｏｓｉｓ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｈａｓ ａｎｔｉｔｕｍｏｒ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｇａｉｎｓｔ ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ ｔｕｍｏｒ ｘｅｎｏｇｒａｆｔｓ ｉｎ ｖｉｖｏ’， Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ， ６： ８５６－６５．
Ｍｅｔｈｅｒｉｎｇｈａｍ， Ｒ． Ｌ．， Ｖ． Ａ． Ｐｕｄｎｅｙ， Ｂ． Ｇｕｎｎ， Ｍ． Ｔｏｗｅｙ， Ｉ． Ｓｐｅｎｄｌｏｖｅ， ａｎｄ Ｌ． Ｇ． Ｄｕｒｒａｎｔ． ２００９． ‘Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ａｓ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｃａｎｃｅｒ ｖａｃｃｉｎｅｓ’， ＭＡｂｓ， １： ７１－８５．
Ｍｉｏｔｔｉ， Ｓ．， Ｄ． Ｒ． Ｎｅｇｒｉ， Ｏ． Ｖａｌｏｔａ， Ｍ． Ｃａｌａｂｒｅｓｅ， Ｒ． Ｌ． Ｂｏｌｈｕｉｓ， Ｊ． Ｗ． Ｇｒａｔａｍａ， Ｍ． Ｉ． Ｃｏｌｎａｇｈｉ， ａｎｄ Ｓ． Ｃａｎｅｖａｒｉ． １９９９． ‘Ｌｅｖｅｌ ｏｆ ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ－ａｎｔｉｂｏｄｙ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ｂｉ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ＯＣ／ＴＲ ｉｎ ｏｖａｒｉａｎ－ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｉｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｌｏｎｇｅｒ ｓｕｒｖｉｖａｌ’， Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ， ８４： ６２－８．
Ｎｏｂｌｅ， Ｐ．， Ｉ． Ｓｐｅｎｄｌｏｖｅ， Ｓ． Ｈａｒｄｉｎｇ， Ｔ． Ｐａｒｓｏｎｓ， ａｎｄ Ｌ． Ｇ． Ｄｕｒｒａｎｔ． ２０１３． ‘Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｏｆ Ｌｅｗｉｓ（ｙ） ａｎｄ Ｌｅｗｉｓ（ｂ） ｗｉｔｈ ａ ｎｏｖｅｌ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ６９２／２９’， ＰＬｏＳ Ｏｎｅ， ８： ｅ５４８９２．
Ｏｇａｎｅｓｙａｎ， Ｖ．， Ｍ． Ｍ． Ｄａｍｓｃｈｒｏｄｅｒ， Ｋ． Ｅ． Ｃｏｏｋ， Ｑ． Ｌｉ， Ｃ． Ｇａｏ， Ｈ． Ｗｕ， ａｎｄ Ｗ． Ｆ． Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ． ２０１４． ‘Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｉｎｓｉｇｈｔｓ ｉｎｔｏ ｎｅｏｎａｔａｌ Ｆｃ ｒｅｃｅｐｔｏｒ－ｂａｓｅｄ ｒｅｃｙｃｌｉｎｇ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ’， Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ， ２８９： ７８１２－２４．
Ｐｉｎｈｏ， Ｓ． Ｓ．， ａｎｄ Ｃ． Ａ． Ｒｅｉｓ． ２０１５． ‘Ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ： ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ａｎｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ’， Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ， １５： ５４０－５５．
Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ， Ａ． １９９１． ‘Ａｎｔｉｂｏｄｙ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ： ａｄｖａｎｃｅｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍｓ’， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ （Ｎ Ｙ）， ９： ５４５－５１．
Ｒａｂｕ， Ｃ．， Ｒ． ＭｃＩｎｔｏｓｈ， Ｚ． Ｊｕｒａｓｏｖａ， ａｎｄ Ｌ． Ｄｕｒｒａｎｔ． ２０１２． ‘Ｇｌｙｃａｎｓ ａｓ ｔａｒｇｅｔｓ ｆｏｒ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｎｔｉｔｕｍｏｒ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ’， Ｆｕｔｕｒｅ Ｏｎｃｏｌ， ８： ９４３－６０．
Ｒｅｆｆ， Ｍ． Ｅ． １９９３． ‘Ｈｉｇｈ－ｌｅｖｅｌ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ’， Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ， ４： ５７３－６．
ＲｏｄｒＩｇｕｅｚ， Ｅ．， Ｓ． Ｔ． Ｔ． Ｓｃｈｅｔｔｅｒｓ， ａｎｄ Ｙ． ｖａｎ Ｋｏｏｙｋ． ２０１８． ‘Ｔｈｅ ｔｕｍｏｕｒ ｇｌｙｃｏ－ｃｏｄｅ ａｓ ａ ｎｏｖｅｌ ｉｍｍｕｎｅ ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ ｆｏｒ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ’， Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ， １８： ２０４－１１．
Ｒｏｑｕｅ－Ｎａｖａｒｒｏ， Ｌ．， Ｋ． Ｃｈａｋｒａｂａｎｄｈｕ， Ｊ． ｄｅ Ｌｅｏｎ， Ｓ． Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ， Ｃ． Ｔｏｌｅｄｏ， Ａ． Ｃａｒｒ， Ｃ． Ｍ． ｄｅ Ａｃｏｓｔａ， Ａ． Ｏ． Ｈｕｅｂｅｒ， ａｎｄ Ｒ． Ｐｅｒｅｚ． ２００８． ‘Ａｎｔｉ－ｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ ｂｙ ｌｏｓｓ ｏｆ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ’， Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ， ７： ２０３３－４１．
Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ．， Ｅ．Ｆ． Ｆｒｉｔｓｃｈ， ａｎｄ Ｔ． Ｍａｎｉａｔｉｓ． １９８９． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ： ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ （Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ．Ｙ． ： Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， １９８９．）．
Ｓａｐｈｉｒｅ， Ｅ． Ｏ．， Ｐ． Ｗ． Ｐａｒｒｅｎ， Ｒ． Ｐａｎｔｏｐｈｌｅｔ， Ｍ． Ｂ． Ｚｗｉｃｋ， Ｇ． Ｍ． Ｍｏｒｒｉｓ， Ｐ． Ｍ． Ｒｕｄｄ， Ｒ． Ａ． Ｄｗｅｋ， Ｒ． Ｌ． Ｓｔａｎｆｉｅｌｄ， Ｄ． Ｒ． Ｂｕｒｔｏｎ， ａｎｄ Ｉ． Ａ． Ｗｉｌｓｏｎ． ２００１． ‘Ｃｒｙｓｔａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ａ ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ ｈｕｍａｎ ＩＧＧ ａｇａｉｎｓｔ ＨＩＶ－１： ａ ｔｅｍｐｌａｔｅ ｆｏｒ ｖａｃｃｉｎｅ ｄｅｓｉｇｎ’， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２９３： １１５５－９．
Ｓｃｈｒｏｆｆ， Ｒ． Ｗ．， Ｋ． Ａ． Ｆｏｏｎ， Ｓ． Ｍ． Ｂｅａｔｔｙ， Ｒ． Ｋ． Ｏｌｄｈａｍ， ａｎｄ Ａ． Ｃ． Ｍｏｒｇａｎ， Ｊｒ． １９８５． ‘Ｈｕｍａｎ ａｎｔｉ－ｍｕｒｉｎｅ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｒｅｃｅｉｖｉｎｇ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｈｅｒａｐｙ’， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ， ４５： ８７９－８５．
Ｔｒｉｌｌ， Ｊ． Ｊ．， Ａ． Ｒ． Ｓｈａｔｚｍａｎ， ａｎｄ Ｓ． Ｇａｎｇｕｌｙ． １９９５． ‘Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｉｎ ＣＯＳ ａｎｄ ＣＨＯ ｃｅｌｌｓ’， Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ， ６： ５５３－６０．
Ｕｇｕｒｌａｒ， Ｄ．， Ｓ． Ｃ． Ｈｏｗｅｓ， Ｂ． Ｊ． ｄｅ Ｋｒｅｕｋ， Ｒ． Ｉ． Ｋｏｎｉｎｇ， Ｒ． Ｎ． ｄｅ Ｊｏｎｇ， Ｆ． Ｊ． Ｂｅｕｒｓｋｅｎｓ， Ｊ． Ｓｃｈｕｕｒｍａｎ， Ａ． Ｊ． Ｋｏｓｔｅｒ， Ｔ． Ｈ． Ｓｈａｒｐ， Ｐｗｈｉ Ｐａｒｒｅｎ， ａｎｄ Ｐ． Ｇｒｏｓ． ２０１８． ‘Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｏｆ Ｃ１－ＩｇＧ１ ｐｒｏｖｉｄｅ ｉｎｓｉｇｈｔｓ ｉｎｔｏ ｈｏｗ ｄａｎｇｅｒ ｐａｔｔｅｒｎ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ａｃｔｉｖａｔｅｓ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ’， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ３５９： ７９４－９７．
Ｖａｎｄｅｎ Ｂｅｒｇｈｅ， Ｔ．， Ｎ． Ｖａｎｌａｎｇｅｎａｋｋｅｒ， Ｅ． Ｐａｒｔｈｏｅｎｓ， Ｗ． Ｄｅｃｋｅｒｓ， Ｍ． Ｄｅｖｏｓ， Ｎ． Ｆｅｓｔｊｅｎｓ， Ｃ． Ｊ． Ｇｕｅｒｉｎ， Ｕ． Ｔ． Ｂｒｕｎｋ， Ｗ． Ｄｅｃｌｅｒｃｑ， ａｎｄ Ｐ． Ｖａｎｄｅｎａｂｅｅｌｅ． ２０１０． ‘Ｎｅｃｒｏｐｔｏｓｉｓ， ｎｅｃｒｏｓｉｓ ａｎｄ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｃｏｎｖｅｒｇｅ ｏｎ ｓｉｍｉｌａｒ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｄｉｓｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ｆｅａｔｕｒｅｓ’， Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ Ｄｉｆｆｅｒ， １７： ９２２－３０．
Ｗａｎｇ， Ｘ．， Ｍ． Ｍａｔｈｉｅｕ， ａｎｄ Ｒ． Ｊ． Ｂｒｅｚｓｋｉ． ２０１８． ‘ＩｇＧ Ｆｃ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｔｏ ｍｏｄｕｌａｔｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ’， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｅｌｌ， ９： ６３－７３．
Ｗｅｌｔ， Ｓ．， Ｅ． Ａ． Ｃａｒｓｗｅｌｌ， Ｃ． Ｗ． Ｖｏｇｅｌ， Ｈ． Ｆ． Ｏｅｔｔｇｅｎ， ａｎｄ Ｌ． Ｊ． Ｏｌｄ． １９８７． ‘Ｉｍｍｕｎｅ ａｎｄ ｎｏｎｉｍｍｕｎｅ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ｏｆ ＩｇＧ３ ｍｏｕｓｅ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｒ２４ ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ｔｈｅ ｄｉｓｉａｌｏｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｅ ＧＤ３ ｏｎ ｔｈｅ ｓｕｒｆａｃｅ ｏｆ ｍｅｌａｎｏｍａ ｃｅｌｌｓ’， Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ， ４５： ２１４－２９．
Ｙａｔｉｍ， Ｎ．， Ｓ． Ｃｕｌｌｅｎ， ａｎｄ Ｍ． Ｌ． Ａｌｂｅｒｔ． ２０１７． ‘Ｄｙｉｎｇ ｃｅｌｌｓ ａｃｔｉｖｅｌｙ ｒｅｇｕｌａｔｅ ａｄａｐｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ’， Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ， １７： ２６２－７５．
Ｚｈｅｎｇ， Ｊ． Ｙ．， Ｈ． Ｌ． Ｔａｎ， Ｐ． Ｔ． Ｍａｔｓｕｄａｉｒａ， ａｎｄ Ａ． Ｃｈｏｏ． ２０１７． ‘Ｅｘｃｅｓｓ ｒｅａｃｔｉｖｅ ｏｘｙｇｅｎ ｓｐｅｃｉｅｓ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｍｅｄｉａｔｅｓ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｈｕｍａｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ ｖｉａ ｏｎｃｏｓｉｓ’， Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ Ｄｉｆｆｅｒ， ２４： ５４６－５８．

Claims (25)

1. イムノグロブリンのＦｃ領域の１つ以上の残基および結合領域を含む修飾されたＩｇＧ１抗体またはその抗原結合フラグメントであって、Ｆｃ領域の１つ以上の残基が、マウスＩｇＧ３抗体由来の対応する残基へと修飾されており、修飾されたＩｇＧ１抗体またはその抗原結合フラグメントが、野生型のＦｃ領域残基を含む対応するＩｇＧ１抗体またはその抗原結合フラグメントと比較して高い機能的な親和性を有する、修飾されたＩｇＧ１抗体またはその抗原結合フラグメント。
2. 前記修飾されたＩｇＧ１抗体またはその抗原結合フラグメントの機能的な親和性が、野生型のＦｃ領域残基を含む対応するＩｇＧ１抗体またはその抗原結合フラグメントと比較して少なくとも約１０％高い、請求項１に記載の修飾されたＩｇＧ１抗体またはその抗原結合フラグメント。
3. 前記修飾されたＩｇＧ１抗体またはその抗原結合フラグメントが、野生型のＦｃ領域残基を含む対応するＩｇＧ１抗体またはその抗原結合フラグメントと比較して高い直接的な細胞殺滅を有する、請求項１または２に記載の修飾されたＩｇＧ１抗体またはその抗原結合フラグメント。
4. 前記修飾されたＩｇＧ１抗体またはその抗原結合フラグメントの直接的な細胞殺滅が、野生型のＦｃ領域残基を含む対応するＩｇＧ１抗体またはその抗原結合フラグメントと比較して少なくとも約１０％高い、請求項３に記載の修飾されたＩｇＧ１抗体またはその抗原結合フラグメント。
5. Ｆｃ領域の１つ以上の残基が、Ｑ３４２、Ｐ３４３、Ｅ３４５、Ｎ３６１、Ｑ３６２、Ｐ３７４、Ｄ３７６から選択される、先行する請求項のいずれか１項に記載の修飾されたＩｇＧ１抗体またはその抗原結合フラグメント。
6. Ｆｃ領域の１つ以上の修飾された残基が、Ｑ３４２Ｒ、Ｐ３４３Ａ、Ｅ３４５Ｔ、Ｎ３６１Ｋ、Ｑ３６２Ｋ、Ｐ３７４Ｓ、Ｄ３７６Ａから選択される、先行する請求項のいずれか１項に記載の修飾されたＩｇＧ１抗体またはその抗原結合フラグメント。
7. Ｆｃ領域の１つ以上の残基が、Ｎ２８６、Ｋ２８８、Ｋ２９０、Ｑ３４２、Ｐ３４３、Ｅ３４５、Ｌ３５１、Ｔ３５９、Ｎ３６１、Ｑ３６２、Ｇ３７１、Ｐ３７４、Ｓ３７５、Ｄ３７６、Ａ３７８から選択される、先行する請求項のいずれか１項に記載の修飾されたＩｇＧ１抗体またはその抗原結合フラグメント。
8. Ｆｃ領域の１つ以上の修飾された残基が、Ｎ２８６Ｔ、Ｋ２８８Ｗ、Ｋ２９０Ｑ、Ｑ３４２Ｒ、Ｐ３４３Ａ、Ｅ３４５Ｔ、Ｌ３５１Ｉ、Ｔ３５９Ｓ、Ｎ３６１Ｋ、Ｑ３６２Ｋ、Ｇ３７１Ｎ、Ｐ３７４Ｓ、Ｓ３７５Ｅ、Ｄ３７６Ａ、Ａ３７８Ｓから選択される、先行する請求項のいずれか１項に記載の修飾されたＩｇＧ１抗体またはその抗原結合フラグメント。
9. Ｆｃ領域の１つ以上の残基が、Ｎ２８６、Ｋ２８８、Ｋ２９０、Ａ３３９、Ｑ３４２、Ｐ３４３、Ｒ３４４、Ｅ３４５、Ｌ３５１、Ｓ３５４、Ｄ３５６、Ｅ３５７、Ｌ３５８、Ｔ３５９、Ｎ３６１、Ｑ３６２、Ｋ３７０、Ｇ３７１、Ｙ３７３、Ｐ３７４、Ｓ３７５、Ｄ３７６、Ａ３７８から選択される、先行する請求項のいずれか１項に記載の修飾されたＩｇＧ１抗体またはその抗原結合フラグメント。
10. Ｆｃ領域の１つ以上の修飾された残基が、Ｎ２８６Ｔ、Ｋ２８８Ｗ、Ｋ２９０Ｑ、Ａ３３９Ｐ、Ｑ３４２Ｒ、Ｐ３４３Ａ、Ｒ３４４Ｑ、Ｅ３４５Ｔ、Ｌ３５１Ｉ、Ｓ３５４Ｐ、Ｄ３５６Ｅ、Ｅ３５７Ｑ、Ｌ３５８Ｍ、Ｔ３５９Ｓ、Ｎ３６１Ｋ、Ｑ３６２Ｋ、Ｋ３７０Ｔ、Ｇ３７１Ｎ、Ｙ３７３Ｆ、Ｐ３７４Ｓ、Ｓ３７５Ｅ、Ｄ３７６Ａ、Ａ３７８Ｓから選択される、先行する請求項のいずれか１項に記載の修飾されたＩｇＧ１抗体またはその抗原結合フラグメント。
11. Ｆｃ領域の１つ以上の残基が、Ｎ２８６、Ｋ２８８、Ｋ２９０、Ｅ２９４、Ｙ３００、Ｖ３０５、Ａ３３９、Ｑ３４２、Ｐ３４３、Ｒ３４４、Ｅ３４５、Ｌ３５１、Ｓ３５４、Ｄ３５６、Ｅ３５７、Ｌ３５８、Ｔ３５９、Ｎ３６１、Ｑ３６２、Ｋ３７０、Ｇ３７１、Ｙ３７３、Ｐ３７４、Ｓ３７５、Ｄ３７６、Ａ３７８から選択される、先行する請求項のいずれか１項に記載の修飾されたＩｇＧ１抗体またはその抗原結合フラグメント。
12. Ｆｃ領域の１つ以上の修飾された残基が、Ｎ２８６Ｔ、Ｋ２８８Ｗ、Ｋ２９０Ｑ、Ｅ２９４Ａ、Ｙ３００Ｆ、Ｖ３０５Ａ、Ａ３３９Ｐ、Ｑ３４２Ｒ、Ｐ３４３Ａ、Ｒ３４４Ｑ、Ｅ３４５Ｔ、Ｌ３５１Ｉ、Ｓ３５４Ｐ、Ｄ３５６Ｅ、Ｅ３５７Ｑ、Ｌ３５８Ｍ、Ｔ３５９Ｓ、Ｎ３６１Ｋ、Ｑ３６２Ｋ、Ｋ３７０Ｔ、Ｇ３７１Ｎ、Ｙ３７３Ｆ、Ｐ３７４Ｓ、Ｓ３７５Ｅ、Ｄ３７６Ａ、Ａ３７８Ｓから選択される、先行する請求項のいずれか１項に記載の修飾されたＩｇＧ１抗体またはその抗原結合フラグメント。
13. イムノグロブリンのＦｃ領域の１つ以上の残基および結合領域を含むＩｇＧ１抗体またはその抗原結合フラグメントの直接的な細胞殺滅能を増大させる方法であって、前記Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインおよび／またはＣＨ３ドメインの１つ以上の残基を、マウスＩｇＧ３のＣＨ２ドメインおよび／またはＣＨ３ドメイン由来の１つ以上の対応する残基と置き換えるステップを含む、方法。
14. 前記方法が、
    （ａ）任意選択で１つ以上の修飾された残基がＱ３４２Ｒ、Ｐ３４３Ａ、Ｅ３４５Ｔ、Ｎ３６１Ｋ、Ｑ３６２Ｋ、Ｐ３７４Ｓ、Ｄ３７６Ａから選択される、Ｑ３４２、Ｐ３４３、Ｅ３４５、Ｎ３６１、Ｑ３６２、Ｐ３７４、Ｄ３７６；
    （ｂ）任意選択で１つ以上の修飾された残基がＮ２８６Ｔ、Ｋ２８８Ｗ、Ｋ２９０Ｑ、Ｑ３４２Ｒ、Ｐ３４３Ａ、Ｅ３４５Ｔ、Ｌ３５１Ｉ、Ｔ３５９Ｓ、Ｎ３６１Ｋ、Ｑ３６２Ｋ、Ｇ３７１Ｎ、Ｐ３７４Ｓ、Ｓ３７５Ｅ、Ｄ３７６Ａ、Ａ３７８Ｓから選択される、Ｎ２８６、Ｋ２８８、Ｋ２９０、Ｑ３４２、Ｐ３４３、Ｅ３４５、Ｌ３５１、Ｔ３５９、Ｎ３６１、Ｑ３６２、Ｇ３７１、Ｐ３７４、Ｓ３７５、Ｄ３７６、Ａ３７８；
    （ｃ）任意選択で１つ以上の修飾された残基がＮ２８６Ｔ、Ｋ２８８Ｗ、Ｋ２９０Ｑ、Ａ３３９Ｐ、Ｑ３４２Ｒ、Ｐ３４３Ａ、Ｒ３４４Ｑ、Ｅ３４５Ｔ、Ｌ３５１Ｉ、Ｓ３５４Ｐ、Ｄ３５６Ｅ、Ｅ３５７Ｑ、Ｌ３５８Ｍ、Ｔ３５９Ｓ、Ｎ３６１Ｋ、Ｑ３６２Ｋ、Ｋ３７０Ｔ、Ｇ３７１Ｎ、Ｙ３７３Ｆ、Ｐ３７４Ｓ、Ｓ３７５Ｅ、Ｄ３７６Ａ、Ａ３７８Ｓから選択される、Ｎ２８６、Ｋ２８８、Ｋ２９０、Ａ３３９、Ｑ３４２、Ｐ３４３、Ｒ３４４、Ｅ３４５、Ｌ３５１、Ｓ３５４、Ｄ３５６、Ｅ３５７、Ｌ３５８、Ｔ３５９、Ｎ３６１、Ｑ３６２、Ｋ３７０、Ｇ３７１、Ｙ３７３、Ｐ３７４、Ｓ３７５、Ｄ３７６、Ａ３７８；または
    （ｄ）任意選択で１つ以上の修飾された残基がＮ２８６Ｔ、Ｋ２８８Ｗ、Ｋ２９０Ｑ、Ｅ２９４Ａ、Ｙ３００Ｆ、Ｖ３０５Ａ、Ａ３３９Ｐ、Ｑ３４２Ｒ、Ｐ３４３Ａ、Ｒ３４４Ｑ、Ｅ３４５Ｔ、Ｌ３５１Ｉ、Ｓ３５４Ｐ、Ｄ３５６Ｅ、Ｅ３５７Ｑ、Ｌ３５８Ｍ、Ｔ３５９Ｓ、Ｎ３６１Ｋ、Ｑ３６２Ｋ、Ｋ３７０Ｔ、Ｇ３７１Ｎ、Ｙ３７３Ｆ、Ｐ３７４Ｓ、Ｓ３７５Ｅ、Ｄ３７６Ａ、Ａ３７８Ｓから選択される、Ｎ２８６、Ｋ２８８、Ｋ２９０、Ｅ２９４、Ｙ３００、Ｖ３０５、Ａ３３９、Ｑ３４２、Ｐ３４３、Ｒ３４４、Ｅ３４５、Ｌ３５１、Ｓ３５４、Ｄ３５６、Ｅ３５７、Ｌ３５８、Ｔ３５９、Ｎ３６１、Ｑ３６２、Ｋ３７０、Ｇ３７１、Ｙ３７３、Ｐ３７４、Ｓ３７５、Ｄ３７６、Ａ３７８
    から選択されるＦｃ領域の１つ以上の残基を修飾するステップを含む、請求項１３に記載のＩｇＧ１抗体またはその抗原結合フラグメントの直接的な細胞殺滅能を増大させる方法。
15. 請求項１～１２のいずれか１項に記載の修飾されたＩｇＧ１抗体またはその抗原結合フラグメントと、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物。
16. 少なくとも１つの他の治療用作用物質をさらに含み、任意選択で前記さらなる作用物質が免疫調節剤である、請求項１５に記載の医薬組成物。
17. 医薬として使用するための、請求項１～１２のいずれか１項に記載の修飾されたＩｇＧ１抗体もしくはその抗原結合フラグメントまたは請求項１５もしくは１６に記載の組成物。
18. がん、自己免疫疾患、炎症性疾患、または感染性疾患の処置に使用するための、請求項１～１２のいずれか１項に記載の修飾されたＩｇＧ１抗体もしくはその抗原結合フラグメントまたは請求項１５もしくは１６に記載の組成物。
19. 疾患を有する個体を処置する方法であって、請求項１～１２のいずれか１項に記載の修飾されたＩｇＧ１抗体もしくはその抗原結合フラグメントまたは請求項１５もしくは１６に記載の組成物の薬学的有効量を前記個体に投与するステップを含む、方法。
20. 前記疾患が、がん、自己免疫疾患、炎症性疾患、および感染性疾患の群から選択される、請求項１９に記載の個体を処置する方法。
21. 任意選択で免疫調節剤である、さらなる治療用作用物質を前記個体に投与するステップをさらに含む、請求項１９～２０のいずれか１項に記載の個体を処置する方法。
22. 請求項１～１２のいずれか１項に記載の修飾されたＩｇＧ１抗体もしくはその抗原結合フラグメントまたは請求項１５もしくは１６に記載の組成物を含むキットであって、前記修飾されたＩｇＧ１抗体もしくはその抗原結合フラグメントまたは組成物が、バイアルなどの１つ以上の容器の中にある、キット。
23. 前記修飾されたＩｇＧ１抗体もしくはその抗原結合フラグメントまたは組成物が、治療における同時使用、別々の使用、または連続的な使用のためのものである、請求項２２に記載のキット。
24. 疾患の処置用の医薬の製造のための、請求項１～１２のいずれか１項に記載の修飾されたＩｇＧ１抗体もしくはその抗原結合フラグメントまたは請求項１５もしくは１６に記載の組成物の使用。
25. 前記疾患が、がん、自己免疫疾患、炎症性疾患、または感染性疾患である、請求項２４に記載の使用。

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