KR20220041185A

KR20220041185A - 항체 및 이의 항원 결합 단편의 기능적 친화도를 향상시키기 위한 변형된 Fc-영역

Info

Publication number: KR20220041185A
Application number: KR1020227006889A
Authority: KR
Inventors: 린다 질리언 더런트; 미레일 반케멜베케
Original assignee: 스캔셀 리미티드
Priority date: 2019-07-31
Filing date: 2020-07-31
Publication date: 2022-03-31
Also published as: EP4004047A1; WO2021019094A1; US20220298256A1; GB201910900D0; JP2022549559A; CA3146208A1; AU2020319854A1; CN114746449A; BR112022001522A2

Abstract

본 발명은 분자간 협동성을 담당하는 마우스 IgG3 항체 (mAb) 내의 주요 잔기의 확인 및 이들의 기능적 친화도 및 직접적인 세포 사멸을 향상시키기 위해 IgG1 항체로의 이들의 전달에 관한 것이다.

Description

항체 및 이의 항원 결합 단편의 기능적 친화도를 향상시키기 위한 변형된 Fc-영역

본 발명은 분자간 협동성에 책임이 있는 마우스 IgG3 항체(mAb) 내의 주요 잔기의 확인 및 이들의 기능적 친화도 및 직접적인 세포 사멸을 향상시키기 위해 IgG1 항체로의 이들의 전달에 관한 것이다.

마우스 (m) IgG3은 세균 감염에 대한 높은 보호 기능을 하며 mIgG 중에서 비공유 올리고머를 형성하는 유일한 이소형으로, 이들의 생물학적 활성에 강하게 영향을 미치고 (Abdelmoula et al. 1989) 다가 항원에 대한 기능적 친화도를 증가시킨다. mIgG3 올리고머화의 경향은 다가 항원에 결합하는 것이 mIgG3 분자간 상호작용을 촉진하여 '분자간 협동성' (Greenspan and Cooper 1993; Greenspan, Dacek, and Cooper 1989; Greenspan and Cooper 1992)이라고 특징적으로 불리는 항원 (Greenspan, Monafo, and Davie 1987; Greenspan and Cooper 1993)에 대한 기능적 친화도를 증가시킨다는 것을 보여준 Gray 등 (Grey, Hirst, and Cohn 1971)에 의해 처음 확인되었다. 이 현상은 IgG3 F(ab')2 단편이 항원에 협동적으로 결합되지 않아 Fc에 의존한다고 결정되었다 (Greenspan, Monafo, and Davie 1987). mIgG3 이소형은 반복적인 항원에 대한 분자간 협동성 경향과 관련이 있으며, 이로써 낮은 1가 친화성은 결합력 (avidity)-매개된 강화된 결합에 의해 구제된다 (Greenspan and Cooper 1993, 1992). 인접한 mIgG3 Fc 영역 사이의 비공유 상호작용은 표적 점유 연장 및 해리 속도 감소를 통해 증가된 기능적 친화도를 뒷받침하는 것으로 생각된다 (Cooper et al. 1991; Greenspan, Dacek, and Cooper 1989).

종양 글리콤은 형질전환 과정과 관련된 변경으로 인해 mAb 개발을 위한 암-특이적 표적의 풍부하고 탐구되지 않은 공급원이다 (Pinho and Reis 2015). 글리칸 구조는 단백질과 당지질 백본 둘 모두에 존재하며 글리코트랜스퍼라제의 변경된 발현으로 인해 암에서 대량으로 과발현될 수 있다. 글리칸은 암 세포 생존, 증식, 전파 및 면역 회피를 위한 핵심 공동-보조 (co-accessory) 분자인 것으로 나타났다; 이러한 항원을 가교하면 면역 이펙터 세포 또는 보체 없이 직접적인 세포 사멸을 유발할 수 있다 (Dalziel et al. 2014; RodrIguez, Schetters, and van Kooyk 2018; Rabu et al. 2012). 물론, 본 발명자들은 이들의 강한 차별적 종양 대 건강한 조직 결합, 높은 기능적 친화도 및 전이성 결장직장암 마우스를 치료하는 이들의 능력으로 인해 암 치료제에 대한 잠재적인 적용을 갖는 다수의 글리칸-표적화 mAb (Chua et al. 2015; Durrant et al. 2006; Noble et al. 2013), 수동 또는 능동 면역요법으로서 임상 개발 중이거나 키메라 항원 수용체(CAR) T 세포 (Burris et al. 2010; Labrada et al. 2018; Hege et al. 2017)에 대해 재포맷된 다수의 다른 mAb를 생성하는 반면, 항 GD2 mAb인 디누툭시맙 베타는 현재 신경모세포종의 치료에 사용된다 (Ladenstein et al. 2018).

본 발명자들은 이전에 루이스^a/c/x, 루이스^y 뿐만 아니라 시알릴-디-루이스^a 반응성을 갖는 mAb를 표적화하는 암 글리칸 패널을 기술했다 (WO2017/033020A1; WO2015/063500A1; Chua et al. 2015; Noble et al. 2013). 흥미롭게도, 글리칸-결합 mAb가 mIgG3 이소형인 경우, 암 세포를 발현하는 고밀도 표적에 직접적인 세포독성 효과를 나타내고, 보체 또는 면역 이펙터 세포의 존재와 무관하며 적응성 항종양 면역 반응 및 장기간의 종양 조절을 개시할 가능성이 있다. 이것은 mIgG3 이소형에 의해 활성화된 분자간 공동-협동성이 직접적인 세포 사멸에 책임이 있음을 시사했다. 이 직접적인 세포독성 능력은 또한 다른 항-글리칸 mAb에서도 관찰되었으며 전형적으로 mAb-유도 동형 세포 부착, 세포골격 재배열 후 세포 팽윤, 막 병변 및 최종 세포 사멸을 포함한다 (Loo et al. 2007; Faraj et al. 2017; Roque-Navarro et al. 2008; Chua et al. 2015; Welt et al. 1987). 대부분의 경우, 세포 사멸은 비고전적 아폽토시스의 한 형태로, 잠재적으로 종양 괴사와 가장 유사한 활성 산소 종 (ROS) 생성의 생성과 관련이 있다 (Zheng et al. 2017; Hernandez et al. 2011). 중요하게도, 면역원성 또는 염증성 세포 사멸 (ICD)과 유사하게, 염증 매개체 - 손상 관련된 분자 패턴 (DAMP)의 동시 방출은 mAb-매개된 이펙터 기능을 추가로 증가시킬 수 있는 종양 부위에 선천적 면역 세포를 모집할 가능성이 있다 (Galluzzi et al. 2017). 따라서, 이러한 항-글리칸 mAb는 다른 면역억제 환경에서 면역계의 전체 잠재력을 재동원하는 중요한 도구가 될 수 있다.

인간 항체 치료제의 경우, 표적 특이성에 책임이 없는 영역은 임상적으로 유용한 항체의 인간화 버전을 생성하기 위해 전형적으로 이들의 동등한 인간으로 대체된다. 본 발명자들이 마우스 mAb를 IgG1 (예를 들어, 인간 IgG1, hIgG1)로 키메라화했을 때 이들은 직접적인 세포 사멸을 잃었고 분자간 협동성이 인간 IgG에 존재하지 않기 때문에 기능적 친화도가 감소했다. 마우스 IgG3 항체가 다른 항체 서브부류가 하지 않는 방식으로 이들의 표적에 결합되면, 함께 결합하여 결합을 안정화하고 항체의 임상 효능을 증폭시킬 수 있다고 이전에 제안되었다.

US2011/0123440은 변경된 항체 Fc-영역 및 이의 용도를 기재하고 있다. 변경된 Fc-영역은 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는다. 이 특허는 많은 부위에서 임의의 치환을 주장하지만 정확한 예는 본 발명에 대한 모든 상이한 치환이며 이러한 치환은 직접적인 세포 사멸에 책임이 없음을 예시한다.

US2008/0089892는 ADCC를 개선하기 위해 위치 251, 256, 268, 280, 332, 378 및 440에서 아미노산 치환을 갖는 이들 Fc-영역 변이체를 포함하는 폴리펩티드 Fc-영역 변이체 및 조성물을 기재하고 있다. 이 특허에 요약된 변형과의 유일한 유사점은 위치 378이었지만 본 발명자들은 이를 아스파라긴산 대신 세린으로 대체하여 감소된 ADCC를 나타낸다.

US2010/0184959는 2개 이상의 아미노산 치환 및 Fc 리간드(예를 들어, FcγR 또는 C1q) 및/또는 이펙터 기능(예를 들어, ADCC)의 변경된 인식을 갖는 Fc 폴리펩티드 변이체를 제공하는 방법을 기재하고 있다. 대조적으로, 본 발명자들의 대체는 증가된 세포 사멸과 관련이 있다. 현재 개시된 26개 및 23개 아미노산 모티프는 V305A, Q342R, R344Q 치환을 포함하는 반면, 15개 아미노산 모티프는 Q342R만을 포함한다.

US2010/015133은 폴리펩티드 결합을 조절함으로써 폴리펩티드를 생산하는 방법을 기재하고 있다. 그들은 위치 356/439, 357/370 및 399/409에서 항체의 CH3 불변 영역에서 짝을 이루는 아미노산의 전하를 음전하로부터 양전하로 변경하거나 그 반대로 변경한다고 주장한다. 대조적으로, 이 특허는 아미노산 356을 아스파르트산 (D)으로부터 글루탐산 (E)으로 변화시켜 전하를 변화시키지 않고 아미노산 357을 글루탐산 (E)으로부터 글루타민 (Q)으로 변화시켜 음전하를 중성으로 변화시키고 아미노산 370을 라이신 (K)으로부터 트레오닌으로 변화시켜 음전하를 중성으로 변화시키는 것을 기재하고 있다.

WO2018/146317은 Fc 영역 및 항원-결합 영역을 갖는 폴리펩티드 및 항체를 기재하고 있으며, 여기서, Fc 영역은 증가된 CDC 활성 및/또는 효능제 활성을 갖는 폴리펩티드 또는 항체를 제공하는 Fc-Fc 강화 돌연변이 및 C1q 결합-강화 돌연변이를 갖는다. Fc 영역은 (a) E430, E345 또는 S440Y 또는 S440W 치환으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 위치에서의 치환 및 (b) G236, S239, S267, H268, S324, K326, I332, E333 및 P396으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 위치(들)에서의 치환을 포함하는 것으로 언급되고, 여기서, 위치는 인간 IgG1에 상응한다. 폴리펩티드는 E430G, E345K, E430S, E430F, E430T, E345Q, E345R, E345Y, S440Y 및 S440W로 이루어진 그룹으로부터 적어도 하나의 치환을 포함한다. 본 발명은 이러한 치환 어느 것도 포함하지 않는다.

WO2018/083126은 변이체 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드 및 항체를 기재하고 있다. Fc 영역은 폴리펩티드(들), 항체 또는 항체가 세포 표면의 표적, 항원 또는 항원들에 결합될 때 안정화된 Fc:Fc 상호작용을 제공하는 동시에 또한 감소된 보체-의존성 세포독성(CDC)을 가지며 또한 Fc 영역에서 하나 이상의 아미노산 변형으로 인해 다른 이펙터 기능의 활성화가 감소될 수 있다. Fc 영역은 (i) E430, E345 또는 S440에서의 제1 돌연변이(단, S440에서의 돌연변이는 S440Y 또는 S440W이다); 및 (ii) K322 또는 P329에서의 제2 돌연변이를 포함하는 것으로 언급된다. 제1 돌연변이는 E430G, E345K, E430S, E430F, E430T, E345Q, E345R, E345Y, S440W 및 S440Y로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 본 발명은 이러한 치환 어느 것도 포함하지 않는다.

WO2014/108198은 증가된 보체-의존성 세포독성(CDC)을 초래하는 하나 이상의 아미노산 변형을 갖는 변이체 Fc 영역을 포함하는 항체와 같은 폴리펩티드를 개시한다. 본 발명은 이러한 치환 어느 것도 포함하지 않는다.

WO2013/004842는 폴리펩타이드(들), 항체 또는 항체들이 CDC 반응과 같은 개선된 이펙터 기능을 위해 세포 표면 상의 이의 표적에 결합될 때 Fc:Fc 상호작용을 안정화하기 위한 변이체 Fc 도메인을 포함하는 폴리펩타이드 및 관련된 항체를 기재하고 있다. 본 발명은 이러한 치환 어느 것도 포함하지 않는다.

본 발명은 이의 모 폴리펩티드, 항체, 변이체 및 이의 항원-결합 단편과 비교하여 향상된 기능적 친화도를 갖는 폴리펩티드, 항체, 변이체 및 이의 항원-결합 단편을 제공한다. 본 발명은 또한 이의 모 폴리펩티드, 항체, 변이체 및 이의 항원-결합 단편과 비교하여 향상된 세포 사멸을 갖는 폴리펩티드, 항체, 변이체 및 이의 항원-결합 단편을 제공한다. 이론에 제한되지 않고, 그러한 변형된 폴리펩타이드, 항체, 변이체 및 이의 항원-결합 단편은 2개의 항체의 Fc 영역 사이에서 보다 안정한 결합 상호작용을 할 수 있어 항체-항원 결합의 증가된 기능적 친화도를 제공하는 것으로 여겨진다. 또한, 본 발명자들은 mIgG3 CH2 및 CH3 도메인 내의 불연속 영역을 개시하여 이 이소형에 결합 반복 글리칸 항원에 대한 증가된 기능적 친화도를 부여할 뿐만 아니라 높은-결합 암 세포주에 대한 직접적인 세포독성을 부여한다. 관련된 잔기를 IgG1 이소형으로 바꾸면 시험관 내 및 생체내 항종양 활성이 증가하여 개선된 'i'IgG1이 생성된다.

키메라 mAb를 항인간 Ig 항혈청과 가교시키거나, 하나의 주요 아미노산 잔기를 변경함으로써 본 발명자들은 직접적인 세포 사멸이 기능적 친화도와 직접적으로 관련되어 있음을 입증했다. 또한, 본 발명자들은 키메라 작제물에 분자간 협동성을 도입함으로써 새로운 마우스 mAb의 기능적 친화도를 반복하였다. 아무도 mIgG3 협동성을 매핑하지 않았으며 IgG1과 mIgG3 간에 상이한 주요 아미노산은 이전에 설명되지 않았다. 따라서, 본 발명자들은 본 발명의 일련의 항당지질 mAb의 개발을 유발시켰을 뿐만 아니라 임의의 mAb의 치료 지수를 향상시키는 유용성을 갖는 기술을 개발했다.

인간 IgG1 백본 상의 mIgG3 mAb의 키메라화는 직접적인 세포독성의 극적인 감소와 일치하여, 본 발명자들은 이것이 감소된 분자간 협동성의 결과라는 가설을 세웠다. 결과적으로, 본 발명자들은 분자간 협동성에 책임이 있는 mIgG3 내의 주요 잔기를 확인하고 이를 IgG1로 전달하여 mIgG3에서 관찰된 직접적인 세포독성 활성을 반복하고 이로써 탁월한 임상 유용성을 갖는 키메라 IgG1을 생성하는 방법을 모색했다.

선택된 mIgG3 불변 영역 잔기의 전달을 통해 증가된 기능적 친화도 및 직접적인 세포독성 활성을 갖는 IgG1 항-글리칸 mAb의 생성은 mAb를 표적으로 하는 본 발명의 패널 또는 이전에 생성된 글리칸을 활용하여 발명자들에 의해 수행되었다. mIgG3 기여 영역은 mIgG3 CH1, CH2 또는 CH3 도메인을 포함하는 하이브리드 IgG1 작제물의 생성을 통해 확인되었다. 후보 잔기는 IgG1에 도입될 때 증가된 직접적인 세포독성 및 기능적 친화도(기능 획득) 및/또는 mIgG3에서 각각의 IgG1 잔기로 대체될 때 직접적인 세포독성 및 기능적 친화도 감소 (기능 상실)를 기반으로 하는 스크린을 통해 식별되었다. 예비 분석으로 mIgG3 CH1을 IgG1에 도입해도 세포독성의 유의한 증가를 유발하지 않았기 때문에 mIgG3 CH1이 직접적인 세포독성 능력에 미미하게 기여하는 것으로 확인되었다. 반대로, 인간 IgG1 (hIgG1) CH1을 mIgG3에 동등하게 도입해도 사멸 활성의 유의한 감소를 일으키지 않았다. 다음으로, 기능 획득 접근법에서 mIgG3 CH2 및 CH3 도메인을 별도로 IgG1에 도입했다. 뮤린 CH3을 함유하는 IgG1은 세포독성에서 유의한 증가를 나타내었다. 뮤린 CH2를 IgG1에 도입하면 사멸 활성이 작지만 유의하게 증가하지는 않는다. 두 도메인에 의한 기여를 확인하기 위해 역 전략이 뒤따랐는데 이로써 mIgG3에 IgG1 CH2 또는 CH3 도메인이 도입됨에 따라 세포독성 활성의 손실이 평가되었다. 이 시나리오는 IgG1 CH3을 포함하는 mIgG3에 대한 세포독성의 유의한 감소를 야기하여, 이는 이전의 기능 획득 결과를 확정하였다. 중요하게도, 인간 CH2를 함유하는 mIgG3이 세포독성 활성의 유의한 감소를 나타내기 때문에 이 전략은 또한 뮤린 CH2에 의한 작은 기여를 확인하였다.

본 발명의 한 측면에 따르면, 면역글로불린의 Fc 영역 및 결합 영역의 하나 이상의 잔기를 포함하는 변형된 IgG1 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 제공되며, 여기서, Fc-영역의 하나 이상의 잔기는 마우스 IgG3 항체의 상응하는 잔기로 변형되고, 변형된 IgG1 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 야생형 Fc-영역 잔기를 포함하는 상응하는 IgG1 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 비교할 때 향상된 기능적 친화도를 갖는다.

본 발명의 일부 측면에서, 변형된 IgG1 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 제공되고, 여기서, 변형된 IgG1 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 기능적 친화도는 야생형 Fc-영역 잔기를 포함하는 상응하는 IgG1 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 비교할 때 적어도 약 10% 향상된다.

본 발명의 일부 측면에서, 변형된 IgG1 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 기능적 친화도는 야생형 Fc-영역 잔기를 포함하는 상응하는 IgG1 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 비교할 때 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90% 또는 적어도 약 100% 향상된다.

본 발명의 일부 측면에서, 변형된 IgG1 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 야생형 Fc-영역 잔기를 포함하는 상응하는 IgG1 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 비교할 때 향상된 직접적인 세포-사멸을 갖는다.

본 발명의 일부 측면에서, 변형된 IgG1 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 직접적인 세포-사멸은 야생형 Fc-영역 잔기를 포함하는 상응하는 IgG1 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 비교할 때 적어도 약 10% 향상된다.

본 발명의 일부 측면에서, 변형된 IgG1 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 직접적인 세포-사멸은 야생형 Fc-영역 잔기를 포함하는 상응하는 IgG1 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 비교할 때 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90% 또는 적어도 약 100% 향상된다.

본 발명의 제1 측면에 따르면, CH2 및/또는 CH3 도메인의 하나 이상의 잔기가 마우스 IgG3 CH2 및/또는 CH3 도메인으로부터 상응하는 잔기로 대체된 변형된 IgG1 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 제공된다.

본 발명의 제2 측면에 따르면, CH2 및/또는 CH3 도메인이 마우스 IgG3 CH2 및/또는 CH3 도메인으로 대체된 변형된 IgG1 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 제공된다.

하위도메인 분석을 통해 결합된 CH2-CH3 영역을 추가로 절단하여, 총 26개의 mIgG3 잔기의 CH2 및 CH3 요소를 포함하는 잔기 286-306 및 339-378을 포함하는 불연속 섹션을 전달함으로써 IgG1에 대한 mIgG3 직접 세포독성의 완전한 회복이 밝혀졌다.

26개 잔기는 N286T, K288W, K290Q, E294A, Y300F, V305A, A339P, Q342R, P343A, R344Q, E345T, L351I, S354P, D356E, E357Q, L358M, T359S, N361K, Q362K, K370T, G371N, Y373F, P374S, S375E, D376A, A378S이다. 이러한 잔기는 구조적 잔기뿐만 아니라 직접 상호작용의 결합된 효과로 인해 분자간 협동성을 통해 기능적 친화도를 증가시키는 데 필요하며, 후자는 잠재적으로 허용 프레임워크를 생성한다. 특히 CH2에서 전하 분포 패턴의 역할은 또한 음전하를 띤 다가 항원에 대한 mIgG3 결합을 향상시키는 것으로 나타났고 IgG1과 구별되기 때문에 배제할 수 없다 (Klaus and Bereta 2018; Hovenden et al. 2013). 본 발명의 접근법에 관련된 잔기 중 일부는 단백질 A, 단백질 G, 류마티스 인자 및 신생아 FcRn과 같은 많은 자연 결합 파트너에 대한 더 큰 공통 결합 부위 내에 있다 (DeLano et al. 2000). 그러나 본 발명의 잔기 중 어느 것도 FcRn 결합에 직접적으로 관여하지 않는다 (Oganesyan et al. 2014).

본 발명의 제3 측면에 따르면, Fc 영역의 하기 잔기 중 하나 이상이 변형된, 변형된 IgG1 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 제공된다: N286, K288, K290, E294, Y300, V305, A339, Q342, P343, R344, E345, L351, S354, D356, E357, L358, T359, N361, Q362, K370, G371, Y373, P374, S375, D376, A378.

본 발명의 제4 측면에 따르면, Fc 영역에 대한 하기 변형 중 하나 이상을 갖는, 변형된 IgG1 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 제공된다: N286T, K288W, K290Q, E294A, Y300F, V305A, A339P, Q342R, P343A, R344Q, E345T, L351I, S354P, D356E, E357Q, L358M, T359S, N361K, Q362K, K370T, G371N, Y373F, P374S, S375E, D376A, A378S.

본 발명의 일부 측면에서, 변형된 IgG1 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 위치 N286, K288, K290, E294, Y300, V305, A339, Q342, P343, R344, E345, L351, S354, D356, E357, L358, T359, N361, Q362, K370, G371, Y373, P374, S375, D376, A378로부터 선택된 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 또는 26개 잔기에서의 변형을 포함한다. 본 발명의 바람직한 측면에서, 변형된 IgG1 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 26개 잔기 모두에서 변형을 포함한다.

본 발명의 일부 측면에서, 변형된 IgG1 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 N286T, K288W, K290Q, E294A, Y300F, V305A, A339P, Q342R, P343A, R344Q, E345T, L351I, S354P, D356E, E357Q, L358M, T359S, N361K, Q362K, K370T, G371N, Y373F, P374S, S375E, D376A 및 A378S로부터 선택된 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 또는 26개의 변형을 포함한다. 본 발명의 바람직한 측면에서, 변형된 IgG1 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 26개 변형 모두를 포함한다.

FcRn 결합을 통한 mAb 반감기 뿐만 아니라 FcγR 또는 C1q 결합의 변형을 통해 주로 mAb 이펙터 기능 (ADCC 및 CDC)에 영향을 미치는 과다한 Fc 조작 전략이 문헌에 설명되어 있다 (Wang, Mathieu, and Brezski 2018; Carter 2006). 이들 중 어느 것도 이 특허의 일부를 형성하는 아미노산 변화를 설명하지 않는다. 추가로, 다수의 인간 mAb 이소형(Saphire et al. 2001)에서 Fc:Fc 상호작용을 통한 결정 패킹-유도 mAb 올리고머화는 개선된 보체 활성화를 위해 최근에 기술된 6량체 mAb 플랫폼의 기초를 형성했다 (WO2014/006217 A9; WO2018/083126 A1; WO2018/146317 A1, Ugurlar et al. 2018; de Jong et al. 2016; Diebolder et al. 2014). 효율적인 6량체 배열 및 C1q 결합은 이 특허의 기초를 형성하는 아미노산 변화와 구별되는 개별 돌연변이 (E345K 또는 E430G)에 따라 달라진다. 실제로, 강한 CDC 능력을 유도하는 이들 돌연변이를 통해 II형 CD20 mAb 11B8에 의한 프로그램된 세포 사멸 (즉, 직접적인 세포독성)을 유도하는 능력은 향상되지 않았으며, 이는 이 위치가 직접적인 세포 사멸에 책임이 없음을 시사한다.

대부분의 승인된 치료용 mAb는 환자의 항뮤린 항체 (HAMA) 반응 위험이 증가된 뮤린 또는 키메라 항체가 있는 인간화 또는 완전한 인간 IgG 항체이다 (Schroff et al. 1985; Azinovic et al. 2006; Miotti et al. 1999; D'Arcy and Mannik 2001). IgG1에 26mIgG3만 도입하면 HAMA 반응을 유도할 가능성이 없다. 그러나, 이들은 특정 환자에서 HAMA 반응을 유도할 가능성이 있는 MHCII 결합 에피토프를 생성할 수 있다. 26개 잔기-함유 하이브리드 88IgG1의 면역 에피토프 데이터베이스 (IEDB) 분석은 여러 잠재적인 고득점 에피토프를 포함하는 클러스터(클러스터 1, 잔기 294-315)를 밝혀냈다. 3개의 mIgG3을 위치 294, 300 및 305에서 클러스터 1의 IgG1 잔기로 되돌리는 것은 기능적 친화도와 직접적인 세포독성을 유지했다. 중요한 것은, 이 23 aa 모티프 (N286, K288, K290, A339, Q342, P343, R344, E345, L351, S354, D356, E357, L358, T359, N361, Q362, K370, G371, Y373, P374, S375, D376, A378)의 변형은 상응하는 마우스 IgG3 잔기로 변형될 때 (N286T, K288W, K290Q, A339P, Q342R, P343A, R344Q, E345T, L351I, S354P, D356E, E357Q, L358M, T359S, N361K, Q362K, K370T, G371N, Y373F, P374S, S375E, D376A, A378S) 직접적인 세포독성, 세포 응집, 기공 형성 및 최종 세포 용해를 유도한다. 기공 형성 및 최종 세포 용해는 괴사와 유사한 세포 분해 특징을 공유하지만 괴사 또는 이차 괴사와 구별할 수 없다 (Vanden Berghe et al. 2010). 방출된 DAMP의 최종 결과 - 구성적이거나 활성화된 스트레스 경로의 결과로 유도됨 - 는 기본 신호 캐스케이드뿐만 아니라 세포 환경에 따라 달라지지만, 집합적으로 면역 이펙터 기능을 더욱 향상시키고/시키거나 방출된 종양 항원의 교차-제시를 통해 적응성 면역 반응을 유발할 수 있는 염증 환경을 생성할 가능성이 있다 (Yatim, Cullen, and Albert 2017; Galluzzi et al. 2017).

본 발명의 제5 측면에 따르면, Fc 영역의 하기 잔기 중 하나 이상이 변형된, 변형된 IgG1 항체 또는 이의 항원-결합 단편 이 제공된다: N286, K288, K290, A339, Q342, P343, R344, E345, L351, S354, D356, E357, L358, T359, N361, Q362, K370, G371, Y373, P374, S375, D376, A378.

본 발명의 제6 측면에 따르면, Fc 영역에 대한 하기 변형 중 하나 이상을 갖는 변형된 IgG1 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 제공된다: N286T, K288W, K290Q, A339P, Q342R, P343A, R344Q, E345T, L351I, S354P, D356E, E357Q, L358M, T359S, N361K, Q362K, K370T, G371N, Y373F, P374S, S375E, D376A, A378S.

본 발명의 일부 측면에서, 변형된 IgG1 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 위치 N286, K288, K290, A339, Q342, P343, R344, E345, L351, S354, D356, E357, L358, T359, N361, Q362, K370, G371, Y373, P374, S375, D376, A378로부터 선택된 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 또는 23개 잔기에서의 변형을 포함한다. 본 발명의 바람직한 측면에서, 변형된 IgG1 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 23개 잔기 모두에서 변형을 포함한다.

본 발명의 일부 측면에서, 변형된 IgG1 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 N286T, K288W, K290Q, A339P, Q342R, P343A, R344Q, E345T, L351I, S354P, D356E, E357Q, L358M, T359S, N361K, Q362K, K370T, G371N, Y373F, P374S, S375E, D376A, A378S로부터 선택된 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 또는 23개 변형을 포함한다. 본 발명의 바람직한 측면에서, 변형된 IgG1 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 23개 변형 모두를 포함한다.

이러한 23개 변형 세트는 도 9a 및 9b의 88개 항체에 대해 예시되어 있다.

129 mAb를 표적으로 하는 선택된 23 mIgG3 잔기를 시알릴-디-루이스^a에 도입함으로써 추가 검증이 입증되었으며, 이는 광범위한 종양 조직, 특히 췌장의 70% 초과, 위 및 결장직장 종양의 30% 초과, 난소 및 비소세포 폐암 종양의 20% 초과를 표적으로 하면서 보다 유리한 정상 조직 분포를 나타낸다. 흥미롭게도, 하이브리도마-생성 모 129 mAb는 직접적인 세포독성 능력이 없는 mIgG1이다. 따라서, COLO205에 대한 나노몰 직접적인 세포 사멸 능력과 일치하는 129IgG1과 비교하여 더 느린 해리 속도를 통해 기능적 친화도가 상당히 개선된 i129G1 mAb 생성은 본 발명자들의 접근법이 결합력 효과에 의존하는 면역조절 mAb와 관련될 뿐만 아니라 더 넓은 적용가능성을 가질 수 있음을 시사한다 (Wang, Mathieu, and Brezski 2018). i129G1에 의해 가해지는 직접적인 세포 사멸은 i88G1과 유사한 방식으로 나타난다: mAb는 세포 응집 후 기공 형성 및 최종 세포 용해를 유도했다. i129G1 mAb에 23개의 mIgG3 잔기를 도입하면 이펙터 기능에 혼합 영향을 미쳤다: ADCC는 상당히 감소했지만 나노몰 EC₅₀을 유지하면서 i129G1의 CDC 활성은 유의하게 증가했다. 이것은 i129G1에 대한 ADCC가 더 강력하게 감소함에도 불구하고 i88G1로 얻은 결과를 반영하여 당-표적의 특성이 ADCC 효능에도 영향을 미치는 반면, 88 mAb는 당단백질과 당지질을 표적으로 하고 129 mAb는 당단백질만을 표적으로 함을 시사한다. 현저하게, i129G1은 효과적인 종양 조절을 나타냈고, i129G1은 129IgG1보다 유의하게 더 우수하여 유의한 종양 부피 감소를 나타냈고, 후자는 유의한 종양 감소를 나타내지 않았다. 이것은 129IgG1의 결합된 이펙터 기능이 이 모델에서 종양 성장을 제어할 수 없음을 나타내며, 직접적인 세포독성 능력을 갖는 가치를 더욱 강조한다.

23개의 선택된 mG3 잔기 각각의 개별 기여를 평가하기 위해, i88G1 (실시예 4)에 기반한 단일 복귀 전략이 수행되었다. i88G1에 있는 23개의 mG3 잔기 각각을 단독으로 hG1 잔기로 되돌렸고 생성된 작제물을 직접적인 세포 사멸에 대해 분석하여 직접적인 세포 사멸 능력의 상당한 손실 없이 상기 언급된 23개 잔기를 15개 잔기로 추가로 감소시킬 수 있음을 확인하였다. 특히, i88G1에서 6개의 mIgG3 잔기는 직접적인 세포 사멸의 유의한 손실 없이 IgG1 잔기로 복귀될 수 있었다. 이것은 15 mIgG3 잔기의 도입이 COLO205에서 나노몰의 직접적인 세포 사멸을 유지하는 129 mAb를 사용하여 추가로 예시되었다.

면역원성은 성공적인 치료에 주요한 장애물이 될 수 있다. 항-약물 항체는 치료 기능을 무력화하고 약동학에 영향을 미치며 잠재적으로 심각한 부작용을 유발할 수 있다. 면역원성 위험에 기여하는 T 세포 에피토프는 인 실리코 (in silico) 도구를 사용하여 비교적 정확하게 평가할 수 있다.

T 세포 에피토프를 식별하기 위한 면역정보학 알고리즘을 적용하여 면역요법이 원치 않는 면역원성을 유발하는지 여부를 평가하고 분석할 수 있다. 26개 mIgG3 잔기의 존재에 의해 생성된 하이브리드 SD286 306+339 378 작제물의 잠재적인 면역원성을 평가하기 위해, 본 발명자들은 MHCII 결합 에피토프(Immune Epitope Database, IEDB)에 대한 SD286 306+339 378 서열의 인 실리코 스크린을 수행하였다. 부류 II-제한된 T 헬퍼 세포는 체액성 면역 반응과 더 관련이 있으며 예측된 결합 클러스터는 T 세포 반응의 강력한 지표인 것으로 나타났다 (Jawa et al. 2013). 여러 고득점 결합 에피토프를 포함하는 2개의 MHCII 결합 클러스터가 확인되었다: 클러스터 1 (잔기 294 315) 및 클러스터 2 (잔기 365 393) (도 5/도 20). 클러스터 1 내에서 3개의 뮤린 잔기, 294 (A에서 E), 300 (F에서 Y) 및 305 (A에서 V)를 인간 잔기로 되돌리면 개체가 관용화된 인간 서열 섹션이 생성되었다. 유사하게, 339-378 영역 내에서 2개의 잔기 351 (I에서 L로) 및 371 (N에서 G로)의 역전은 2개의 MHCII 결합 코어를 제거하였다.

하나의 인 실리코로 확인된 면역원성 클러스터의 역전은 강력한 세포 사멸, 기공 형성 능력 및 건전한 면역 이펙터 기능을 가진 개선된 'i' 88G1의 주요 후보를 생성한다.

선택된 잔기를 도입하는 효과가 항-글리칸 항체에 국한되지 않음을 입증하기 위해, 성장 인자 수용체, HER2를 표적으로 하는 트라스투주맙 (특히 Herceptin®이라는 상표명으로 판매됨)은 관련된 잔기의 전달을 받았다. 생성된 i트라스투주맙은 PI 흡수 증가와 동시에 중간 정도의 HER2-발현 세포주에 대한 정상-상태 세포 결합을 개선했다. 또한, 야생형에 비해 더 느린 해리 속도를 통해 친화력이 향상되었다.

본 발명의 제7 측면에 따르면, Fc 영역의 하기 잔기 중 하나 이상이 변형된, 변형된 IgG1 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 제공된다: N286, K288, K290, Q342, P343, E345, L351, T359, N361, Q362, G371, P374, S375, D376, A378.

본 발명의 제8 측면에 따르면, Fc 영역에 대한 하기 변형 중 하나 이상을 갖는 변형된 IgG1 항체 또는 이의 항원- 결합 단편이 제공된다: N286T, K288W, K290Q, Q342R, P343A, E345T, L351I, T359S, N361K, Q362K, G371N, P374S, S375E, D376A, A378S.

이러한 15개 변형 세트는 도 9c 및 9d에서 항체 129 및 88에 대해 예시되어 있다.

본 발명의 일부 측면에서, 변형된 IgG1 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 위치 N286, K288, K290, Q342, P343, E345, L351, T359, N361, Q362, G371, P374, S375, D376, A378로부터 선택된 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15개 잔기에서의 변형을 포함한다. 본 발명의 바람직한 측면에서, 변형된 IgG1 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 15개 잔기 모두에서 변형을 포함한다.

본 발명의 일부 측면에서, 변형된 IgG1 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 N286T, K288W, K290Q, Q342R, P343A, E345T, L351I, T359S, N361K, Q362K, G371N, P374S, S375E, D376A, A378로부터 선택된 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15개의 변형을 포함한다. 본 발명의 바람직한 측면에서, 변형된 IgG1 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 15개 변형 모두를 포함한다.

본 발명의 제9 측면에 따라, Fc 영역의 하기 잔기 중 하나 이상이 변형된, 변형된 IgG1 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 제공된다: Q342, P343, E345, N361, Q362, P374, D376.

본 발명의 제10 측면에 따라, Fc 영역에 대한 하기 변형 중 하나 이상을 갖는 변형된 IgG1 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 제공된다: Q342R, P343A, E345T, N361K, Q362K, P374S, D376A.

이러한 7개 변형 세트는 도 9f에서 항체 88에 대해 예시되어 있다.

본 발명의 일부 측면에서, 변형된 IgG1 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 위치 Q342, P343, E345, N361, Q362, P374, D376으로부터 선택된 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7개 잔기에서의 변형을 포함한다. 본 발명의 바람직한 측면에서, 변형된 IgG1 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 7개 잔기 모두에서 변형을 포함한다..

본 발명의 일부 측면에서, 변형된 IgG1 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 Q342R, P343A, E345T, N361K, Q362K, P374S, D376A로부터 선택된 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7개의 변형을 포함한다. 본 발명의 바람직한 측면에서, 변형된 IgG1 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 7개 변형 모두를 포함한다.

본 발명의 한 측면에서, 변형된 IgG1 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 도 15에 개시된 서열 중 하나 이상을 포함한다. 본 발명의 한 측면에서, 도 15에 개시된 바와 같은 중쇄 및 경쇄 서열을 포함하는 변형된 IgG1 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 제공된다.

본 발명의 한 측면에서, 변형된 IgG1 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 도 16에 개시된 서열 중 하나 이상을 포함한다. 본 발명의 한 측면에서, 도 16에 개시된 바와 같은 중쇄 및 경쇄 서열을 포함하는 변형된 IgG1 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 제공된다.

본 발명의 한 측면에서, 변형된 IgG1 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 도 17에 개시된 서열 중 하나 이상을 포함한다. 본 발명의 한 측면에서, 도 17에 개시된 바와 같은 중쇄 및 경쇄 서열을 포함하는 변형된 IgG1 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 제공된다.

본 발명의 한 측면에서, 변형된 IgG1 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 도 19에 개시된 서열 중 하나 이상을 포함한다. 본 발명의 한 측면에서, 도 19에 개시된 바와 같은 중쇄 및 경쇄 서열을 포함하는 변형된 IgG1 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 제공된다.

본 발명의 일부 측면에서, "상응하는 IgG1 항체 또는 이의 항원-결합 단편"은 상응하는 마우스 IgG3 잔기에 대한 어떠한 변화 없이 천연 잔기를 포함하는 비변형된 (즉, 야생형) 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 지칭한다. 본 발명의 일부 측면에서, 상응하는 IgG1 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 변형된 IgG1 항체 또는 이의 항원-결합 단편과 동일한 표적 또는 표적들 (예를 들어, 동일한 에피토프)에 결합한다. 본 발명의 일부 측면에서, 변형된 및 상응하는 비변형된 IgG1 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 동일한 CDR 서열 (즉, VHCDR1, VHCDR2, VHCDR3, VLCDR1, VLCDR2, VLCDR3) 중 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개 또는 적어도 6개를 포함한다. 본 발명의 일부 측면에서, 변형된 및 상응하는 비변형된 IgG1 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 동일한 결합 영역 서열을 포함한다. 본 발명의 일부 측면에서, 변형된 및 상응하는 비변형된 IgG1 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 동일한 가변 영역 서열 (예를 들어, 동일한 가변 중쇄 서열 및/또는 동일한 가변 경쇄 서열)을 포함한다.

본 발명의 일부 측면에서, "결합 영역"은 표적 항원에 대한 결합에 책임이 있는 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 부분을 지칭한다. 예를 들어, 중쇄 및 경쇄 각각의 하나의 불변 및 하나의 가변 도메인을 포함할 수 있다. 본 발명의 일부 측면에서, 결합 영역은 상보성 결정 영역 (CDR) 서열 (즉, VHCDR1, VHCDR2, VHCDR3, VLCDR1, VLCDR2, VLCDR3)을 지칭할 수 있다.

IgG1 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 구조는 일반적으로 항체 중쇄 또는 경쇄 서열 또는 이의 실질적인 부분일 것이다. 면역글로불린 도메인의 구조 및 위치는 http://www.imgt.org/를 참조하여 확인할 수 있다.

명세서 전반에 걸쳐, 잔기 넘버링은 문헌 (Lefranc MP, Giudicelli V, Ginestoux C, Jabado-Michaloud J, Folch G, Bellahcene F, et al. IMGT, the international ImMunoGeneTics information system. Nucleic acids research. 2009;37:D1006-12)에 개시된 바와 같이 항체 서열의 넘버링을 위한 표준화된 IMGT 시스템을 지칭한다. 다른 적합한 넘버링 시스템은 당업자에게 알려져 있다. 변형된 IgG1 항체와 이의 항원-결합 단편 또는 이의 항원-결합 단편 사이의 상응하는 잔기를 확인하기 위해 다른 적합한 넘버링 시스템이 사용될 수 있다. 상응하는 잔기의 식별을 허용하는 임의의 넘버링 시스템은 본 발명에 사용하기에 적합하다. 본원에 사용된 넘버링 시스템은 본 발명의 범위를 제한하는 것이 아니라, 단순히 변형될 수 있는 관련 잔기를 식별하기 위해 사용된다. 용어 "상응하는 잔기"는 비교되는 2개 이상의 항체 또는 이의 항원-결합 단편에서 구조적으로 또는 기능적으로 등가 위치에서의 잔기를 의미하는 것으로 의도된다. 일부 경우에, 상응하는 잔기는 서열 정렬에 의해 확인될 수 있다. 일부 경우에, 구조적 비교에 의해 상응하는 잔기가 확인될 수 있다.

본 발명의 일부 측면에서, 면역글로불린의 Fc-영역의 하나 이상의 잔기를 포함하는 IgG1 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 Fc 영역의 적어도 10개의 아미노산 잔기, Fc 영역의 적어도 20개의 아미노산 잔기, Fc 영역의 적어도 30개의 아미노산 잔기, Fc 영역의 적어도 40개의 아미노산 잔기, Fc 영역의 잔기의 적어도 50개의 아미노산 잔기, Fc 영역의 적어도 75개의 아미노산 잔기, Fc 영역의 적어도 100개의 아미노산 잔기, Fc 영역의 적어도 200개의 아미노산 잔기, Fc 영역의 적어도 300개의 아미노산 잔기, Fc 영역의 적어도 400개의 아미노산 잔기, 또는 Fc 영역의 적어도 500개의 아미노산 잔기를 포함한다. 바람직하게는, IgG1 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 면역글로불린의 전체 Fc-영역을 포함한다.

본 발명의 일부 측면에서, Fc 영역의 하나 이상의 잔기는 CH2 및/또는 CH3 도메인으로부터 선택된다. 일부 측면에서, 하나 이상의 잔기는 CH2 도메인으로부터 선택된다. 일부 측면에서, 하나 이상의 잔기는 CH3 도메인으로부터 선택된다.

본 발명의 일부 측면에서, 변형된 IgG1 항체 또는 이의 항원-결합 단편 및 상응하는 야생형 IgG1 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 기능적 친화도는 표면 플라스몬 공명(예를 들어, Biacore 3000/T200, GE Healthcare)에 의해, 예를 들어, 증가하는 농도 (0.3 nmol/L-200 nmol/L)의 IgG1 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 적절한 리간드를 포함하는 CM5 칩에 걸쳐 주입하고 적절한 소프트웨어 (예를 들어, BIAevaluation 4.1)를 사용하여 데이터를 적절한 결합 모델에 피팅함으로써 결정될 수 있다. 동일한 조건을 사용하는 상응하는 실험은 변형된 IgG1 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 대해 수행될 수 있다. 본 발명의 일부 측면에서, 변형된 IgG1 항체 또는 이의 항원-결합 단편은, 표면 플라스몬 공명 데이터가 변형된 IgG1 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 리간드-코팅된 CM5 칩에 더 단단히 결합함을 나타내는 경우, 상응하는 야생형 IgG1 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 대해 더 큰 기능적 친화도를 나타낸다. 리간드는 글리칸-HSA 및 항-글리칸 항체용 대조군 접합체를 포함한다.

항히스 항체로 코팅된 Biacore CM5 칩은 금 표면에 공유 부착된 카복시메틸화 덱스트란을 포함한다. 분자는 아민, 티올, 알데하이드 또는 카복실 그룹을 통해 센서 표면에 공유 결합된다. 약물 후보와 같은 작은 유기 분자와 관련된 상호작용에서 큰 분자 어셈블리 또는 전체 바이러스에 이르는 상호작용을 연구할 수 있다. 높은 결합 능력은 높은 반응을 제공하여 포획 검정 및 소분자와 관련된 상호작용에 유리하다. 높은 표면 안정성은 정확성과 정밀도를 제공하고 동일한 표면에서 반복 분석을 허용한다. 다른 적합한 칩은 당업자에게 알려져 있고 표면 플라스몬 공명 프로토콜은 당업계에 알려진 표준 기술에 의해 조정될 수 있다.

본 발명의 일부 측면에서, 변형된 IgG1 항체 또는 이의 항원-결합 단편 및 상응하는 야생형 IgG1 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 직접적인 세포 사멸은 프로피디움 요오다이드 (PI) 흡수에 의해 결정될 수 있으며, 예를 들어, IgG1 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 COLO205 또는 HCT 15 세포 (5 x 10⁴)와 함께 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션한 후 1 μg의 PI를 30분 동안 추가하고 PBS에 세포를 재현탁하고 유세포 분석기, 예를 들어, Beckman Coulter FC-500 또는 MACSQuant 10)에서 세포를 처리하고 적절한 소프트웨어 (예를 들어, WinMDI 2.9 또는 FlowJo v10)로 결과를 분석함으로써 결정될 수 있다. 동일한 조건을 사용하는 상응하는 실험은 변형된 IgG1 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 대해 수행될 수 있다. 본 발명의 일부 측면에서, 변형된 IgG1 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 세포가 변형된 IgG1 항체 또는 이의 항원-결합 단편과 함께 인큐베이션될 때 PI 흡수가 더 큰 경우 상응하는 야생형 IgG1 항체 또는 이의 항원-결합 단편보다 더 큰 직접적인 세포 사멸을 제공한다.

변형된 IgG1 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 개선된 기능적 특성은 Fc-영역에 변형된 잔기를 포함하지 않는 야생형 IgG1 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 상응하는 기능적 성질과 관련하여 측정된다. 개선된 기능적 성질은 상대적인 척도이므로, 청구된 IgG1 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 기능적 친화도 및/또는 직접적인 세포 사멸 또는 기타 기능적 성질을 결정하는 데 사용되는 정확한 방법은 해당 기능적 성질의 상대적 변화에 영향을 미치지 않는다. 항체 및 이의 항원-결합 단편의 기능적 성질을 측정하는 많은 적합한 방법이 당업자에게 알려져 있다. 이들 기능적 성질을 측정하는 임의의 적합한 방법을 사용하여 청구된 변형된 IgG1 항체 및 그의 항원 결합 단편 또는 그의 항원 결합 단편의 기능적 특성을 측정할 수 있는데, 단, 공정한 비교를 위해 상응하는 야생형 IgG1 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 동일한 방법을 적용한다.

분자간 협동성 결합의 확립을 통해 향상된 기능적 친화도 및 직접적인 세포독성을 갖는 mAb를 표적으로 하는 개선된 암 글리칸의 생성은 우수한 임상 유용성을 유발할 수 있다. 이 접근법은 반복 또는 고밀도 항원을 표적으로 하는 다른 mAb에도 가치가 있을 수 있다. 또한, mIgG3 mAb를 표적으로 하는 많은 글리칸에 대해 관찰된 비정상적인 전염증성 세포 사멸 모드를 IgG1 프레임워크로 복귀시키는 것은 다른 면역요법과 함께 사용될 가능성이 있다.

본 발명의 변형된 IgG1 항체는 인간 또는 동물 대상체에서 종양의 진단 및 치료 방법에 사용될 수 있다. 진단에 사용될 때, 본 발명의 변형된 IgG1 항체 및 이의 항원-결합 단편은 검출 가능한 표지, 예를 들어, I 또는 Tc와 같은 방사성 표지로 표지될 수 있으며, 이는 항체 영상화 분야에 알려진 통상적인 화학을 사용하여 본 발명의 변형된 IgG1 항체에 부착될 수 있다. 표지는 양고추냉이 퍼옥시다제와 같은 효소 표지도 포함한다. 표지는 특정 동족 검출 가능한 모이어티, 예를 들어, 표지된 아비딘에 대한 결합을 통해 검출될 수 있는 비오틴과 같은 화학적 모이어티를 추가로 포함한다. 본 발명의 변형된 IgG1 항체 및 이의 항원-결합 단편은 그 자체로 암 세포를 사멸하는 데 효과적인 것으로 나타났지만, 이들은 추가로 기능적 표지로 표지될 수 있다. 기능적 표지는 암의 파괴를 유발하기 위해 암 부위를 표적으로 하도록 설계된 물질을 포함한다. 그러한 기능적 표지는 프로드럭을 활성 약물로 전환할 수 있는 리신과 같은 독소 및 세균 카복시펩티다제 또는 니트로리덕타제와 같은 효소를 포함한다. 또한, 변형된 IgG1 항체 및 이의 항원-결합 단편은 화학요법제 또는 세포독성제, 예컨대 메이탄신 (DM1 및 DM4), 오니드, 아우리스타틴, 칼리케아미신, 듀오카마이신, 독소루비신 90 131 또는 방사성 표지, 예컨대 Y 또는 I와 부착되거나 달리 회합될 수 있다. 또한, 본 발명의 변형된 IgG1 항체 및 이의 항원-결합 단편은 단독으로 또는 치료될 상태에 따라 동시에 또는 순차적으로 다른 치료와 조합하여 투여될 수 있다. 따라서, 본 발명은 종양 치료에서 동시, 개별 또는 순차적 사용을 위한 조합 제제로서 본 발명의 변형된 IgG1 항체 및 이의 항원-결합 단편 및 활성제를 함유하는 생성물을 추가로 제공한다. 활성제는 본 발명의 변형된 IgG1 항체 및 이의 항원-결합 단편과 상승적으로 작용할 수 있는 플루오로우라실, 시스플라틴, 미토마이신 C, 옥살리플라틴 및 타목시펜을 포함한 화학요법제 또는 세포독성제를 포함할 수 있다. 다른 활성제는 적절한 용량의 통증 완화 약물, 예컨대 비스테로이드성 항염증성 약물 (예를 들어, 아스피린, 파라세타몰, 이부프로펜 또는 케토프로펜) 또는 아편제, 예컨대 모르핀 또는 항구토제를 포함할 수 있다. 이론에 얽매이지 않길 바라지만, 종양 사멸을 향상시키기 위해 활성제와 상승작용하는 본 발명의 변형된 IgG1 항체 및 이의 항원-결합 단편의 능력은 면역 이팩터 기전에 기인한 것이 아니라 오히려 세포 표면 수용체에 결합하는 변형된 IgG1 항체 및 이의 항원-결합 단편의 직접적인 결과일 수 있다. 본 발명의 변형된 IgG1 항체 및 이의 항원-결합 단편은 일반적으로 변형된 IgG1 항체 및 이의 항원-결합 단편에 추가로 적어도 하나의 성분을 포함할 수 있는 약제학적 조성물의 형태로 투여될 것이다.

약제학적 조성물은 활성 성분에 추가로 약제학적으로 허용되는 부형제, 희석제, 담체, 완충제, 안정화제 또는 당업자에게 잘 알려진 기타 물질을 포함할 수 있다. 그러한 물질은 무독성이야 하며 활성 성분의 효능을 방해해서는 안된다. 담체 또는 기타 물질의 정확한 특성은 경구 또는 주사, 예를 들어, 정맥 투여일 수 있는 투여 경로에 따라 달라질 것이다. 바람직하게는, 투여 경로는 정맥내이다.

카테터 또는 다른 외과용 튜브를 통한 전달이 또한 사용되지만 주사는 조성물의 치료적 투여를 위한 주요 경로일 것으로 예상된다. 일부 적합한 투여 경로는 정맥내, 피하, 복강내 및 근육내 투여를 포함한다. 액체 제형은 분말 제형으로부터 재구성한 후 사용될 수 있다.

정맥내 주사 또는 고통 부위에 주사하는 경우, 활성 성분은 발열원이 없고 적합한 pH, 등장성 및 안정성을 갖는 비경구적으로 허용되는 수용액의 형태일 것이다. 당업자는, 예를 들어, 염화나트륨 주사, 링거 주사, 락트산화된 링거 주사와 같은 등장성 비히클을 사용하여 적합한 용액을 잘 제조할 수 있다. 필요에 따라, 방부제, 안정화제, 완충제, 항산화제 및/또는 기타 첨가제가 포함될 수 있다.

경구 투여용 약제학적 조성물은 정제, 캡슐제, 산제 또는 액체 형태일 수 있다. 정제는 젤라틴 또는 보조제와 같은 고체 담체를 포함할 수 있다. 액체 약제학적 조성물은 일반적으로 물, 석유, 동물성 또는 식물성 오일, 광물성 오일 또는 합성 오일과 같은 액체 담체를 포함한다. 생리 식염수, 덱스트로스 또는 기타 사카라이드 용액 또는 글리콜, 예컨대 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜이 포함될 수 있다. 제형이 액체인 경우, 예를 들어, pH 6.8 내지 7.6에서 비인산염 완충액을 함유하는 생리학적 염 용액 또는 동결건조된 분말일 수 있다.

조성물은 또한 미소구체, 리포솜, 기타 미세미립자 전달 시스템 또는 혈액을 포함한 특정 조직에 배치된 서방출 제형을 통해 투여될 수 있다. 서방출 담체의 적합한 예는 공유 물품 형태의 반투과성 중합체 매트릭스, 예를 들어, 좌약 또는 마이크로캡슐을 포함한다. 이식 가능한 또는 마이크로캡슐 서방출 매트릭스는 L-글루탐산과 감마 에틸-L-글루타메이트의 폴리락티드 (미국 특허 번호 3,773,919; EP-A-0058481) 공중합체[43], 폴리(2-하이드록시에틸-메타클리레이트)를 포함한다. 폴리펩티드를 포함하는 리포솜은 잘 알려진 방법으로 제조된다: (Eppstein et al. 1985; Hwang, Luk, and Beaumier 1980); EP-A-0052522; EP-A-0036676; EP-A-0088046; EP-A-0143949; EP-A-0142541; JP-A-83-11808; 미국 특허 번호 4,485,045 및 4,544,545. 일반적으로, 리포솜은 지질 함량이 약 30 몰% 콜레스테롤보다 큰 작은 (약 200 내지 800 옹스트롬) 단층 유형이며, 선택된 비율은 최적의 폴리펩티드 누출 속도에 맞게 조정된다. 조성물은 종양 부위 또는 다른 원하는 부위에 국부적인 방식으로 투여될 수 있거나, 종양 또는 다른 세포를 표적으로 하는 방식으로 전달될 수 있다.

조성물은 바람직하게는 "치료학적 유효량"으로 개체에게 투여되며, 이는 개인에게 이점을 나타내기에 충분하다. 투여되는 실제 양, 투여 속도 및 시간 경과는 치료되는 대상의 특성 및 중증도에 따라 달라질 것이다. 치료, 예를 들어, 투여량에 대한 결정 등에 대한 처방은 일반 개업의 및 기타 의사의 책임이며 전형적으로 치료할 장애, 개별 환자의 병태, 전달 부위, 투여 방법 및 의사에게 알려진 기타 요인을 고려한다. 본 발명의 조성물은 특히 기존 종양, 특히 암의 치료, 및 초기 치료 또는 수술 후 그러한 병태의 재발 예방과 관련이 있다. 상기 언급된 기술 및 프로토콜의 예는 문헌 (Remington's Pharmaceutical Sciences 16 edition Oslo,A (ed) 1980)에서 찾을 수 있다.

최적의 용량은, 예를 들어, 연령, 성별, 체중, 치료되는 병태의 중증도, 투여되는 활성 성분 및 투여 경로를 포함한 다수의 파라미터에 기반하여 의사에 의해 결정될 수 있다. 일반적으로, 수용체의 포화를 허용하는 폴리펩티드 및 항체의 혈청 농도가 바람직하다. 대략 1 nM을 초과하는 농도가 일반적으로 충분하다. 예를 들어, 100 mg/m²의 항체의 용량은 대략 8일 동안 대략 20 nM의 혈청 농도를 제공한다. 대략적인 지침으로, 항체의 용량은 매주 10 내지 300 mg/m²의 양으로 주어질 수 있다. 글리칸의 포화를 허용하는 농도를 초과하는 혈청 수준을 유지하기 위해 항체 단편의 등가 용량을 보다 빈번한 간격으로 사용해야 한다

조성물의 용량은 변형된 IgG1 항체 및 이의 항원-결합 단편, 예를 들어, 이의 결합 활성 및 생체내 혈장 반감기, 제형 내 폴리펩티드의 농도, 투여 경로, 투여 부위 및 비율, 임상 내성 관련된 환자, 환자가 앓고 있는 병리학적 병태 등의 성질에 따라 달라질 것이며 이는 의사의 기술 범위 내에서도 마찬가지이다. 예를 들어, 투여량은 용량당 약 10 μg 내지 6 mg의 범위일 수 있지만, 투여당 환자당 3000 g의 항체 용량이 바람직하다. 일련의 순차 접종 동안 상이한 투여량이 사용된다; 의사는 초기 접종을 실시한 다음, 상대적으로 적은 용량의 항체로 부스팅할 수 있다.

본 발명의 변형된 IgG1 항체 및 이의 항원-결합 단편은 화학적 합성에 의해 전체적으로 또는 부분적으로 생성될 수 있다. 변형된 IgG1 항체 및 이의 항원-결합 단편은 널리 확립된 표준 액체 또는 바람직하게는 고체상 펩티드 합성 방법에 따라 쉽게 제조될 수 있으며, 이에 대한 일반적인 설명은 널리 이용 가능하거나 (예를 들어, 문헌 (J.M. Stewart and J.D. Young, (1984) [46], in M. Bodanzsky and A. Bodanzsky, (1984)) 참조); 이들은 용액 중에서 액체상 방법 또는 고체상, 액체상 및 용액 화학의 임의의 조합에 의해, 예를 들어, 먼저 각각의 펩티드 부분을 완성한 다음, 필요하고 적절한 경우 존재하는 임의의 보호기를 제거한 후에 의해, 각각의 탄산 또는 설폰산 또는 이의 반응성 유도체의 반응에 의한 잔기 X의 도입에 의해 제조될 수 있다.

본 발명에 따른 변형된 IgG1 항체 및 이의 항원-결합 단편을 생성하는 또 다른 편리한 방법은 발현 시스템에서 핵산을 사용하여 이들을 코딩하는 핵산을 발현시키는 것이다. 본 발명은 또한 본 발명의 변형된 IgG1 항체 및 이의 항원-결합 단편을 코딩하는 단리된 핵산을 제공한다. 핵산은 DNA와 RNA를 포함한다. 당업자는 본 발명의 변형된 IgG1 항체 및 이의 항원-결합 단편을 여전히 제공할 그러한 핵산에 대한 치환, 결실 및/또는 첨가를 결정할 수 있을 것이다.

본 발명은 또한 상기 기재된 바와 같은 적어도 하나의 핵산을 포함하는 플라스미드, 벡터, 전사 또는 발현 카세트 형태의 작제물을 제공한다. 본 발명은 또한 상기와 같은 하나 이상의 작제물을 포함하는 재조합 숙주 세포를 제공한다. 언급된 바와 같이, 본 발명의 변형된 IgG1 항체 및 이의 항원-결합 단편을 코딩하는 핵산은 핵산을 코딩하는 것으로부터의 발현을 포함하는 변형된 IgG1 항체 및 이의 항원-결합 단편의 생성 방법과 마찬가지로 본 발명의 한 측면을 형성한다. 발현은 핵산을 함유하는 재조합 숙주 세포를 적절한 조건 하에 배양함으로써 편리하게 달성될 수 있다. 발현에 의한 생성 후에 변형된 IgG1 항체 및 이의 항원-결합 단편은 임의의 적합한 기술을 사용하여 단리 및/또는 정제된 다음, 적절하게 사용될 수 있다. 여러 가지 다양한 숙주 세포에서 폴리펩티드의 클로닝 및 발현을 위한 시스템은 잘 알려져 있다. 적합한 숙주 세포는 세균, 포유동물 세포, 효모 및 배큘로바이러스 시스템을 포함한다. 이종성 폴리펩타이드의 발현을 위해 당업계에서 이용 가능한 포유동물 세포주는 차이니즈 햄스터 난소 세포, HeLa 세포, 아기 햄스터 신장 세포, NSO 마우스 흑색종 세포 및 기타 다수를 포함한다. 일반적으로 선호되는 세균 숙주는 이. 콜리 (E. coli)이다. 이. 콜리와 같은 원핵 세포에서 항체 및 항체 단편의 발현은 당업계에 잘 확립되어 있다. 리뷰를 위해, 예를 들어, 문헌 (Pluckthun 1991)를 참조한다. 배양 중 진핵 세포에서의 발현은 또한 변형된 IgG1 항체 및 이의 항원-결합 단편의 생성을 위한 옵션으로서 당업자에게 이용 가능하다 (예를 들어, 최근 리뷰 (Ref 1993; Trill, Shatzman, and Ganguly 1995)를 참조한다).

프로모터 서열, 종결자 서열, 폴리아데닐화 서열, 인핸서 서열, 마커 유전자 및 기타 적절한 서열을 포함하는 적절한 조절 서열을 함유하는 적합한 벡터를 선택하거나 작제할 수 있다. 벡터는 플라스미드, 바이러스, 예를 들어, 적절한 경우 '파지' 또는 파지미드일 수 있다. 더 자세한 내용은, 예를 들어, 문헌 (Sambrook, Fritsch, and Maniatis 1989)를 참조한다. 예를 들어, 핵산 작제물의 제조, 돌연변이 유발, 시퀀싱, 세포 내로의 DNA의 도입 및 유전자 발현, 단백질 분석과 같은 핵산 조작을 위한 많은 알려진 기술 및 프로토콜은 문헌 (Ausubel et al. , 1992 (Ausubel et al. 1992))에 자세히 설명되어 있다.

따라서, 본 발명의 추가 측면은 본원에 개시된 바와 같은 핵산을 함유하는 숙주 세포를 제공한다. 또 다른 측면은 그러한 핵산을 숙주 세포에 도입하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 도입부는 임의의 사용 가능한 기술을 사용할 수 있다. 진핵 세포의 경우, 적합한 기술은 인산칼슘 형질감염, DEAE-덱스트란, 전기천공, 리포솜-매개된 형질감염 및 레트로바이러스 또는 기타 바이러스, 예를 들어 백시니아 또는 곤충 세포의 경우 배큘로바이러스를 사용한 형질도입을 포함할 수 있다. 세균 세포의 경우, 적합한 기술은 염화칼슘 형질전환, 전기천공 및 박테리오파지를 사용한 형질감염을 포함할 수 있다. 도입 후, 예를 들어, 유전자의 발현을 위한 조건 하에 숙주 세포를 배양함으로써 핵산으로부터 발현을 야기하거나 허용할 수 있다. 한 구현예에서, 본 발명의 핵산은 숙주 세포의 게놈 (예를 들어, 염색체) 내로 통합된다. 통합은 표준 기술에 따라 게놈과의 재조합을 촉진하는 서열을 포함함으로써 촉진될 수 있다. 본 발명은 또한 상기와 같이 변형된 IgG1 항체 및 이의 항원-결합 단편을 발현시키기 위해 발현 시스템에서 상기 언급된 바와 같은 작제물을 사용하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.

단편 결정화 가능한 영역 (Fc 영역)은 Fc 수용체로 불리는 세포 표면 수용체 및 보체 시스템의 일부 단백질과 상호작용하는 항체의 꼬리 영역이다. 이 성질은 항체가 면역계를 활성화하도록 한다. IgG 항체 이소형에서, Fc 영역은 항체의 2개의 중쇄의 제2 및 제3 불변 도메인으로부터 유래된 2개의 동일한 단백질 단편으로 구성된다. IgG의 Fc 영역은 고도로 보존된 N 글리코실화 부위를 포함한다.

IgG의 Fc (단편, 결정화 가능한)는 약 50 kDa의 구조를 형성하는 CH3에 융합된 CH2를 각각 갖는 항체 HC 도메인의 쌍으로 이루어진다. 명명 "단편, 결정화 가능한" (FC)은 혈청-유래 골수종 IgG 분획을 파파인으로 절단한 후 결정화될 수 있는 유일한 단편이 쌍을 이루는 CH2-CH3 단편이라는 사실에서 비롯된다.

Fc 내에서, 2개의 CH3 도메인은 서로 단단히 결합하는 반면, 2개의 CH2 도메인은 서로 직접적인 단백질-단백질 접촉이 없다. 올리고사카라이드는 2개의 CH2 도메인 각각 내에서 아스파라긴-297 (N297)에 결합되어 2개의 CH2 사이 공간의 일부를 채운다. 일부 결정 구조에서, 2개의 탄수화물 사슬 사이의 수소 결합이 직접적으로 그리고 물 분자 브릿지를 통해 관찰되었다. 항체가 고도로 분절된 분자인 것처럼 보이지만, Fc의 구조가 표적 항원에 대한 FAb의 결합에 영향을 미칠 수 있고, 유사하게 FAb의 가변 사슬의 함량이 다양한 수용체에 대한 Fc의 결합에 영향을 미칠 수 있다는 것이 입증되었다. 최근에, 원형 이색성 연구는 FAb 아암과 IgG의 Fc 사이에 상당한 구조적 커플링을 확인했다. 따라서, IgG 분자는 장거리에서도 상이한 도메인이 크게 상호작용하는 매우 복잡한 분자이다.

2가/다가 항체는 에피토프와 상호작용하는 결합 도메인을 포함하는 반면, 합성 2가/다가 리간드는 표적 부위와 상호작용하는 약물작용발생단 (pharmacophore)을 포함한다. 용어 '기능적 친화도'는 또한 겉보기 친화도의 2가/다가-관련 증가를 지정하는 데 사용될 수 있다. 이 용어는 '결합력'과 동의어이다.

결합력은 단백질 수용체 및 이의 리간드 사이와 같은 개별 비공유 결합 상호작용의 다중 친화도의 축적된 강도를 지칭하며 '기능적 친화도'로도 지칭할 수 있다. 이와 같이, 결합력은 단일 상호작용의 강도를 설명하는 고유 친화도와 구별된다. 그러나, 개별 결합 이벤트는 다른 상호작용이 발생할 가능성을 증가 (즉, 결합 부위에 근접한 각 결합 파트너의 국소 농도 증가)시키기 때문에, 결합력은 구성요소 친화성의 단순한 합으로 생각되어야 하는 것이 아니라 생체분자 상호작용에 참여하는 모든 친화도의 결합된 효과로서 생각되어야 한다. "본질적 친화도" 및 "기능적 친화도" 사이의 구분의 유용성은 각 용어에 관련된 상이한 강조점으로부터 비롯된다. 전자는 항체 결합 부위와 리간드의 상보적 영역 사이의 구조적 관계가 정밀 조사 중이거나 특정 상호 작용의 동역학 메커니즘이 조사 중인 경우에 가장 유용하다. 한편, 후자는 본 발명에서와 같이 친화도 향상의 정량적 측정이 조사될 때 특히 중요하다.

'기능적 친화도'와 '본질적 친화도' 둘 모두는 다음과 같이 공식적으로 동일한 가역적 과정을 지칭한다:

여기서, F₁은 1가 항체 단편이고, L₁은 1가 리간드이고, Ab_n은 다가 항체이고, L_m은 m 그룹을 갖는 다가 리간드이다. 각 경우에, 2개의 동역학 단위가 가역적으로 결합하여 하나의 단위를 형성하고 각 과정은 원칙적으로 결합 상수로 특징지어질 수 있다. 결합 상수는 열역학적 친화도의 척도이기 때문에 두 과정 모두 친화도의 정량적 값을 할당할 수 있다.

항체 및 항원-결합 분자의 단편

본 발명의 항원-결합 분자는 항체의 단편, 구체적으로 항체의 항원-결합 단편일 수 있다. 항원-결합 단편은 하나 이상의 항원-결합 영역을 포함한다. 전체 항체의 단편이 결합 항원의 기능을 수행할 수 있는 것으로 나타났다. 결합 단편의 예는 (i) VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fab 단편; (ii) VH 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fd 단편; (iii) 단일 항체의 VL 및 VH 도메인으로 이루어진 Fv 단편; (iv) VH 도메인으로 이루어진 dAb 단편 (Ward, E.S. et al., Nature 341:544-546 (1989)); (v) 단리된 CDR 영역; (vi) 2개의 연결된 Fab 단편을 포함하는 2가 단편인 F(ab')2 단편; (vii) 단일 사슬 Fv 분자 (scFv) (여기서, VH 도메인 및 VL 도메인은 2개의 도메인이 회합하여 항원-결합 부위를 형성하도록 하는 펩티드 링커에 의해 연결된다) (Bird et al., Science 242:423-426 (1988); Huston et al., PNAS USA 85:5879-5883 (1988)); (viii) 이중특이적 단일 사슬 Fv 이량체 (PCT/US92/09965) 및 (ix) 유전자 융합에 의해 작제된 "디아바디", 다가 또는 다중특이적 단편 (WO94/13804; P. Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993))이다. 전형적으로, 단편은 Fab, F(ab')2 또는 Fv 단편 또는 scFv 분자이다.

디아바디는 폴리펩티드의 다량체이며, 각 폴리펩티드는 면역글로불린 경쇄의 결합 영역을 포함하는 제1 도메인 및 면역글로불린 중쇄의 결합 영역을 포함하는 제2 도메인을 포함하고, 두 도메인은 (예를 들어, 펩티드 링커에 의해) 연결되지만 서로 결합하여 항원-결합 부위를 형성할 수 없고: 항원-결합 부위는 다량체 내 한 폴리펩티드의 제1 도메인과 다량체 내 다른 폴리펩티드의 제2 도메인의 회합에 의해 형성된다 (WO94/13804).

이중특이성 항체가 사용되는 경우, 이들은 다양한 방식으로 제조될 수 있는(Hollinger & Winter, Current Opinion Biotechnol. 4:446-449 (1993)), 예를 들어 화학적으로 또는 하이브리드 하이브리도마로부터 제조될 수 있는 통상적인 이중특이성 항체일 수 있거나, 또는 하기에 언급된 임의의 이중특이성 항체 단편일 수 있다. 전체 항체보다 scFv 이량체 또는 디아바디를 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 디아바디 및 scFv는 가변 도메인만을 사용하여 Fc 영역 없이 작제될 수 있어 잠재적으로 항개별특이형 반응의 효과를 감소시킬 수 있다. 이중특이성 항체의 다른 형태는 문헌 (Traunecker et al., EMBO Journal 10:3655 3659 (1991))에 기재된 단일 사슬 "야누신"을 포함한다.

이중특이성 항체는 2개의 항원 또는 2개의 에피토프와 같이 2개의 표적 분자에 동시에 결합할 수 있는 항체이다. 이중특이적 항체는 또한 이중 결합 항체로 지칭될 수 있다. 이중특이적 항체 형식의 예는 (mAb)2, Fcab, F(mAb')2, 쿼드로마스 (quadromas), scFv (단일 사슬 가변 단편), bsDb (이중특이적 디아바디), scBsDb (단일 사슬 이중특이적 디아바디), BiTE (이중특이적 T 세포 인게이저), DART (이중 친화도 재표적화 항체), 전하 쌍, 탠덤 항체, 탠덤 scFv-Fc, Fab-scFv-Fc, Fab-scFv, 미니바디, 지바디 (zybody), DNL-F(ab)3 (독-및-락 3가 Fab), bssdAb (이중특이적 단일 도메인 항체) 및 놉 인 홀(knobs-in-hole)을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.

이중특이성 전체 항체와 대조적으로 이중특이성 디아바디는 또한 이. 콜리에서 쉽게 작제되고 발현될 수 있기 때문에 유용할 수 있다. 적절한 결합 특이성의 디아바디 (및 많은 다른 폴리펩티드, 예컨대 항체 단편)는 라이브러리의 파지 디스플레이 (WO94/13804)를 사용하여 쉽게 선택될 수 있다. 예를 들어, 디아바디의 한 아암이 항원 X에 대한 특이성으로 일정하게 유지되어야 하는 경우 다른 아암이 변하고 적절한 특이성의 항체가 선택되는 라이브러리가 만들어질 수 있다.

본 발명의 일부 측면에서, 동일하거나 상이한 분자의 적어도 2개의 상이한 에피토프에 대한 결합 특이성을 갖는 다중특이성 (예를 들어, 이중특이성) 항-표적 항체를 생성하는 것이 바람직할 수 있다. 예시적인 이중특이적 항체는 표적 분자의 2개의 상이한 에피토프에 결합할 수 있다. 대안적으로, 표적-특이적 항체 아암은 T-세포 수용체 분자 (예를 들어, CD3)와 같은 세포 표면 분자에 결합하는 아암과 조합될 수 있다. 본 발명의 예시적인 이중특이적 항체는 T-세포 수용체 분자 (예를 들어, CD3) 및 임의의 다른 표적으로부터의 항원에 결합할 수 있다.

본 발명의 변형된 IgG1 항체 및 이의 항원-결합 단편은 항체 또는 항체 단편, Fab, (Fab')2, scFv, Fv, dAb, Fd 또는 디아바디일 수 있다. 항체는 다클론 항체일 수 있다. 항체는 모노클로날 항체 (mAb)일 수 있다. 본 발명의 변형된 IgG1 항체 및 이의 항원-결합 단편은 인간화, 키메라 또는 베니어된 항체일 수 있거나, 임의의 종의 비인간 항체일 수 있다. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 변형된 IgG1 항체 및 이의 항원-결합 단편은 인간 또는 인간화된다

뮤린 또는 키메라 항체는 환자에서 유해한 항-뮤린 항체 (HAMA) 반응의 위험이 증가한다 (Schroff et al. 1985; Azinovic et al. 2006; Miotti et al. 1999; D'Arcy and Mannik 2001). 따라서, 대부분의 승인된 치료용 mAb는 인간화 또는 완전한 인간 IgG 항체이다.

변이체

본 발명은 또한 본원에 개시된 임의의 펩티드 서열의 변이체로 확장된다. 본원에 사용된 용어 "변이체"는 유사한 아미노산 서열을 갖고/갖거나 동일한 기능을 유지하는 단백질에 관한 것이다. 예를 들어, 용어 "변이체"는 하나 이상의 아미노산 첨가, 결실, 치환 등을 포함하는 단백질 또는 폴리펩티드를 포함한다. 본 발명의 변이체의 예는 하나 이상의 아미노산이 하나 이상의 다른 아미노산으로 치환되는 것을 제외하고, 하기에 정의된 바와 같은 펩티드를 포함하는 단백질이다. 아미노산 치환은, 예를 들어, 아미노산 서열의 경향 (liability)을 감소 또는 제거하기 위해 이루어질 수 있다. 대안적으로, 아미노산 치환은 필요한 경우 항원 친화도를 개선하거나 항체를 인간화 또는 탈면역화하기 위해 이루어질 수 있다. 특정 항체의 친화도 성숙 변이체, 인간화 변이체 및 탈면역화 변이체, 뿐만 아니라 항체의 서열에서 임의의 경향을 감소 또는 제거하기 위한 아미노산 치환을 포함하는 변이체가 본원에 제공된다.

상기 언급된 바와 같이, 일부 구현예에서, 임의의 치환은 프레임워크 영역에서만 발생할 수 있다. 그러한 구현예에서, 원래의 CDR 서열은 유지되지만, 하나 이상의 프레임워크 영역에서 변이가 발생할 수 있다.

하나 이상의 아미노산 치환을 갖는 변이체 항원-결합 분자는 변이체 항원-결합 분자가 유래된 항원-결합 분자의 기능적 활성 (예를 들어, EC50, IC50, IC90, Kd, 기능적 친화도 및/또는 직접적인 세포 사멸)을 유지할 수 있다. 본 발명의 변이체 항원-결합 분자는 이들이 유래된 항원-결합 분자에 대해 기재된 것과 동일한 방식으로 사용 및 제형화될 수 있다.

치환

당업자는 다양한 아미노산이 유사한 성질을 갖는다는 것을 알고 있다. 물질의 하나 이상의 그러한 아미노산은 종종 그 물질의 원하는 활성을 제거하지 않고 하나 이상의 다른 아미노산으로 치환될 수 있다.

따라서, 아미노산 글리신, 알라닌, 발린, 류신 및 이소류신은 종종 서로 (지방족 측쇄를 갖는 아미노산) 치환될 수 있다. 이러한 가능한 치환 중, 글리신과 알라닌은 (이들이 상대적으로 짧은 측쇄를 가지고 있기 때문에) 서로를 치환하는 데 사용되는 것이 바람직하고 발린, 류신 및 이소류신은 (소수성인 더 큰 지방족 측쇄를 갖고 있기 때문에) 서로를 치환하는 데 사용되는 것이 바람직하다. 종종 서로 치환될 수 있는 다른 아미노산은 다음을 포함한다: 페닐알라닌, 티로신 및 트립토판 (방향족 측쇄를 갖는 아미노산); 라이신, 아르기닌 및 히스티딘 (염기성 측쇄를 갖는 아미노산); 아스파르테이트 및 글루타메이트 (산성 측쇄를 갖는 아미노산); 아스파라긴 및 글루타민 (아미드 측쇄를 갖는 아미노산); 및 시스테인 및 메티오닌 (황 함유 측쇄를 갖는 아미노산).

이러한 특성의 치환은 종종 "보존적" 또는 "반보존적" 아미노산 치환으로 지칭된다.

3개의 문자와 1개의 문자 코드를 사용하여 자연 발생 아미노산을 다음과 같이 나타낼 수 있다: 글리신 (G 또는 Gly), 알라닌 (A 또는 Ala), 발린 (V 또는 Val), 류신 (L 또는 Leu), 이소류신 (I 또는 Ile), 프롤린 (P 또는 Pro), 페닐알라닌 (F 또는 Phe), 티로신 (Y 또는 Tyr), 트립토판 (W 또는 Trp), 라이신 (K 또는 Lys), 아르기닌 (R 또는 Arg), 히스티딘 (H 또는 His), 아스파르트산 (D 또는 Asp), 글루탐산 (E 또는 Glu), 아스파라긴 (N 또는 Asn), 글루타민 (Q 또는 Gln), 시스테인 (C 또는 Cys), 메티오닌 (M 또는 Met), 세린 (S 또는 Ser) 및 트레오닌 (T 또는 Thr). 잔기가 아스파라긴산 또는 아스파라긴일 수 있는 경우, 기호 Asx 또는 B를 사용할 수 있다. 잔기가 글루탐산 또는 글루타민일 수 있는 경우, 기호 Glx 또는 Z를 사용할 수 있다. 아스파르트산에 대한 언급은 아스파르테이트를 포함하고, 글루탐산은 문맥에서 달리 지정하지 않는 한 글루타메이트를 포함한다.

아미노산 결실 또는 삽입은 또한 하기에 언급된 융합 단백질에 대한 아미노산 서열에 대해 이루어질 수 있다. 따라서, 예를 들어, 폴리펩타이드의 활성에 실질적인 영향을 미치지 않거나 적어도 그러한 활성을 제거하지 않는 아미노산은 결실될 수 있다. 그러한 결실은 활성을 여전히 유지하면서 폴리펩티드의 전체 길이 및 분자량이 감소될 수 있기 때문에 유리할 수 있다. 이는 특정 목적에 필요한 폴리펩티드의 양을 감소시킬 수 있으며, 예를 들어, 투여량 수준을 감소시킬 수 있다.

일부 구현예에서, 하기 아미노산은 보존적 아미노산 치환을 위해 서로 교환될 수 있다:

따라서, "보존적" 아미노산 치환에 대한 언급은 항체의 서열 (예를 들어, CDR 또는 VH 또는 VL 서열)의 하나 이상의 아미노산이 상기 나타낸 바와 같은 동일한 부류의 또 다른 아미노산으로 치환된 아미노산 치환을 지칭한다. 항체의 기능에 대한 부작용을 최소화하기 위해 CDR 영역에서 보존적 아미노산 치환이 바람직할 수 있다. 그러나, 보존적 아미노산 치환은 프레임워크 영역에서도 발생할 수 있다.

하기에 주어진 서열과 관련된 아미노산 변화는 임의의 적합한 기술을 사용하여, 예를 들어, 부위-지정 돌연변이 유발 또는 고체-상태 합성을 사용함으로써 이루어질 수 있다.

본 발명의 범위 내에서 아미노산 치환 또는 삽입은 천연 발생 또는 비천연 발생 아미노산을 사용하여 이루어질 수 있지만, 자연 발생 아미노산이 바람직할 수 있음을 이해해야 한다. 천연 또는 합성 아미노산이 사용되는지 여부에 관계없이 L-아미노산만 존재하는 것이 바람직할 수 있다.

제조 경향

항체와 같은 치료 단백질은 화학적 변형 및 번역 후 변형 (PTM)으로 인해 본질적으로 이질적이고 복잡하다. 변형은 숙주 세포 시스템, 제조에 사용된 공정 또는 보관 또는 제조 동안 조건과 같은 다수의 인자에 의해 야기될 수 있다. 변형은 분자 자체의 화학적 안정성 또는 응집 가능성 및 이것이 항체의 고유한 물리적 안정성에 미치는 영향과 관련될 수 있다. 제조 또는 보관 동안 자발적인 변형을 겪을 수 있는 주어진 항체 서열의 아미노산 모티프 또는 잔기를 경향이라 지칭한다. 따라서, 변형 및 분해에 대한 항체의 감수성을 감소시키는 경향을 해결하기 위해 항체 서열에 돌연변이가 이루어질 수 있다.

항체 서열의 경향으로 인한 그러한 변형은 글리코실화, 탈아미드화, 산화 및 C- 및 N-말단의 변형을 포함할 수 있다. 그러한 변형은 제조 동안 발생할 수 있다. 특정 잔기 및 구조적 및 서열 모티프는 특정 변형에 더 취약하다. 변형에 대한 그러한 경향의 예는 Asn N-연결된 글리코실화, Ser/Thr O-연결된 글리코실화, Asn 탈아미드화, Asp 이성질체화/단편화, Lys 글리코실화, Met/Trp 산화, 유리 티올 그룹, 피로-글루타메이트, C-말단 Lys를 포함한다.

당업자는 잠재적으로 변형을 초래할 수 있는 구조적 및 서열 경향을 예측하고 식별하기 위해 계산 도구가 사용될 수 있음을 알고 있다. 변형의 발생을 최소화하기 위해, 제조 공정을 변경할 수 있다. 위험을 감소시키기 위해 단백질 조작을 고려할 수도 있다. 예를 들어, 이러한 경향의 선택적 돌연변이는 항체의 안정성을 위협하는 변형의 위험을 확인하고 감소시키는 데 도움이 될 수 있다.

아스파르트산 잔기 (Asp)는 자발적인 변형을 겪을 수 있다. Asp-Gly 서열과 같은 Asp 함유 모티프는 자발적인 이성질체화를 거쳐 이소아스파르트산을 형성할 수 있다. 이소아스파르테이트의 형성은 항체의 결합을 약화시키거나 완전히 폐지할 수 있다. Asp 잔기가 항체의 CDR에 나타나는 경우 이는 추가로 중요하다.

따라서, 아스파르트산 잔기 (Asp)는 임의의 자연 발생 아미노산으로 치환되어 이러한 변형 가능성을 감소시킬 수 있다. 임의로, 아스파르트산 잔기 (Asp)는 알라닌 (Ala), 글루타민 (Gln) 또는 글루탐산 (Glu)으로 치환되어 이러한 변형 가능성을 감소시킨다. 이성질체화를 감소시키기 위해 생산/제형 최적화를 조사할 수도 있다. 대안적으로, Asp-Gly 모티프는 Asp 잔기의 치환보다는 탈아미드화를 억제하기 위해 글리신 잔기를 또 다른 자연 발생 아미노산으로 치환함으로써 변형될 수 있다. 메티오닌 잔기 (Met)는 자발적인 변형을 겪을 수 있다. CDR에 메티오닌 (Met)이 존재하면 특히 용매에 노출되면 메티오닌이 산화되어 결합을 방해하는 경우 문제가 발생할 수 있다. 따라서, 메티오닌 잔기는 변형에 대한 이러한 가능성을 감소시키기 위해 임의의 다른 자연 발생 아미노산으로 치환될 수 있다. 메티오닌 잔기는 바람직하게는 Ala 또는 Leu로 치환될 수 있다. 산화를 감소시키기 위해 생산/제형의 최적화를 조사할 수도 있다. 본 발명의 각 측면의 바람직한 특징은 필요한 수정을 가하여 다른 측면 각각에 대한 것과 같다. 본원에 언급된 선행 기술 문서는 법에 의해 허용되는 최대 범위까지 통합된다.

예로서 주어진 다음의 상세한 설명은 본 발명을 설명된 특정 구현예로만 제한하려는 것이 아니라 첨부 도면과 함께 가장 잘 이해될 수 있다.
도 1. 암 세포 결합이 유지되나, 88mIgG3 및 모 하이브리도마 mAb와 비교하여 88IgG1의 직접적인 세포 독성은 유의하게 감소했다. A. 88IgG1, 88mIgG3 및 FG88 (하이브리도마 mAb)에 의한 비교 가능한 HCT15 및 COLO205 세포 결합 분석; B. 모체 88mIgG3 및 FG88과 비교하여 88IgG1에 의해 HCT15에 대한 유의하게 감소된 직접적인 세포독성 (PI 흡수); COLO205 (C) 및 HCT15 (D)에서 모체 88mIgG3 및 FG88에 비해 88IgG1에 의한 유의하게 감소된 증식 억제. 다중 비교에 대한 던네트의 보정 (Dunnett’s correction)을 사용하여 이원분산분석 (two-way ANOVA)으로부터 유의성을 추론했다.
도 2. mIgG3 CH3 및 적은 정도의 CH2는 직접적인 세포독성 및 개선된 기능적 친화도에 기여한다. 불변 도메인 셔플링은 직접적인 세포독성에 대한 CH1의 유의미한 기여를 시사하지 않는다 (PI 흡수, HCT15, 패널 A; COLO205에 대한 증식 억제, 패널 B). 대조적으로, CH3 (1m3 및 3h3)은 직접적인 세포독성에 유의하게 기여하며 mCH2에 의한 약간의 기여는 기능 상실 접근법 (3h2)에서만 분명하다 (PI 흡수, HCT15, 패널 C; 증식 억제, COLO205, 패널 D). 1m3에 의해 기능적 친화도가 유의하게 증가하고 오프-레이트가 감소하고; 3h2에 의해 기능적 친화도가 유의하게 감소되고 오프-레이트가 증가하고 3h3에 의해 더 명백하여 주 CH3 및 부 CH2 기여를 확인한다 (패널 E, F). 다중 비교에 대한 던네트의 보정을 사용하여 이원분산분석(직접적인 세포독성) 또는 일원분산분석(one-way ANOVA) (기능적 친화도, 오프-레이트)로부터 각각의 모 체 작제물에 대한 유의성을 추론했다.
도 3. CH2:CH3 접합부를 포함하는 SD286 397은 mIgG3 직접적인 세포독성 및 개선된 기능적 친화도의 기초가 된다. CH2CH3의 하위 도메인 분할은 기여하지 않는 2개 영역인 SD232-294 및 SD390-447과 직접적인 세포독성 및 기능적 친화도에 유의하게 기여하는 2개 영역인 SD286-345 (CH2) 및 SD339-397 (CH3)을 식별한다. HCT15 (패널 A) 및 COLO205 (패널 B)에서 88IgG1과 비교하여 두 작제물 및 조합(SD286-397)에 의한 PI 흡수가 유의하게 증가했다. COLO205 (패널 C) 및 HCT15 (패널 D)에서 88IgG1과 비교하여 두 작제물 및 조합에 의한 증식 억제가 유의하게 증가했다. 유의하게 증가된 기능적 친화도 (SPR)는 주로 상기 언급된 2개 작제물 (각각 패널 E 및 F)에 의한 감소된 오프-레이트로 인해 발생한다. 88IgG1 (패널 G)과 비교하여 SD339 397에 의해 CDC 활성 (HCT15)이 유의하게 감소하고; 상기 언급된 작제물 (패널 H)에 의한 ADCC 활성 (COLO205)이 유지되었다. 각 모체 작제물에 대한 유의성은 다중 비교에 대한 던네트의 보정을 사용하여 이원분산분석(직접적인 세포독성) 또는 일원분산분석 (기능적 친화도, 오프-레이트, 이펙터 기능)으로부터 추론했다.
도 4. 339-378과 결합된 286-306으로 이루어진 불연속 영역은 면역 이펙터 기능을 유지하면서 직접적인 세포독성과 향상된 기능적 친화도를 부여한다. HCT15에 대한 88IgG1과 비교하여 SD339-378에 의한 PI 흡수 (패널 A) 및 증식 억제 (패널 B)가 유의하게 증가했다. SD286-345와 비교하여 SD307-345에 의해 PI 흡수가 유의하게 감소하는데, 이는 SD286-306 (패널 C)에 의한 기여를 시사한다. HCT15 (패널 D) 및 COLO205 (패널 E)에 대한 88IgG1과 비교하여 SD286-306+339-378의 조합에 의해 증식 억제 및 COLO205 (패널 F)에 대한 PI 흡수가 유의하게 증가했다. 88IgG1 (패널 G)과 비교하여 SD286-306+339-378에 의해 기능적 친화도 (SPR)가 유의하게 증가했다. 88IgG1과 비교하여 SD286-306+339-378에 의한 HCT15 (패널 H)에 대한 CDC 활성 및 COLO205 (패널 I)에 대한 ADCC의 유지. 각 모체 작제물에 대한 유의성은 다중 비교에 대한 던네트의 보정을 사용하여 이원분산분석(직접적인 세포독성) 또는 일원분산분석 (기능적 친화도 및 이펙터 기능)으로부터 추론했다.
도 5. 여러 고득점 결합 에피토프를 포함하는 MHCII 결합 클러스터. 클러스터 1은 잔기 294-315 및 클러스터 2, 잔기 365-393으로 이루어진다,
도 6. 면역 이펙터 기능을 유지하면서 직접적인 세포독성과 향상된 기능적 친화성을 가진 i88G1은 기공 형성 능력을 나타낸다. 88IgG1과 비교하여 i88G1에 의해 HCT15 (패널 A) 및 COLO205 (패널 B)에 대한 증식 억제가 유의하게 증가했다. 88IgG1 (패널 C)과 비교하여 i88G1에 의해 기능적 친화도 (SPR)가 유의하게 증가했다. COLO205 (패널 D)에 대한 88IgG1과 비교하여 i88G1에 의한 ADCC의 경미하지만 유의하게 감소했고 HCT15 (패널 E)에 대한 88IgG1과 비교하여 i88G1에 의한 CDC 활성이 상당히 증가했다. HCT15 (패널 F)에 대한 i88G1에 의한 세포 분리, 응집 및 기공 형성 능력의 증거.
도 7. 면역 이펙터 기능을 유지하면서 직접적인 세포독성과 향상된 기능적 친화성을 가진 i129G1은 기공 형성 능력과 생체내 종양 제어를 나타낸다.
129IgG1과 비교하여 i129G1에 의해 COLO205 (패널 A)에 대한 증식 억제 (패널 A) 및 PI 흡수 (패널 B)가 유의하게 증가했다. 129IgG1 (패널 C)과 비교하여 i129G1에 의해 기능적 친화도 (SPR)가 유의하게 증가했다. i129G1은 COLO205에서 일부 ADCC 활성을 유지하지만 h129IgG1 (패널 D)과 비교하여 유의하게 감소했다. COLO205에 대한 i129G1에 의한 CDC 활성은 129IgG1 (패널 E)과 비교하여 유의하게 증가한다. COLO205 (패널 F)에 대한 i129G1에 의한 세포 분리, 응집 및 기공 형성 능력의 증거. 비히클 대조군과 비교하고 COLO205 이종이식 모델 (Balb/c 마우스)에서 129IgG1과 비교한 i129G1에 의한 유의한 생체내 종양 제어 (패널 G). 마우스 연구 과정 동안 평균 체중에 대한 유의미한 영향이 없다 (패널 H). 각 모체 작제물에 대한 유의성은 다중 비교에 대한 던네트의 보정을 사용하여 이원분산분석(직접적인 세포독성, 및 생체내 종양 제어) 또는 일원분산분석 (기능적 친화도 및 이펙터 기능)으로부터 추론했다.
도 8. i27G1은 면역 이펙터 기능을 유지하면서 27IgG1과 비교하여 상당히 개선된 직접적인 세포독성 및 기능적 친화성을 나타낸다. 27IgG1과 비교하여 i27G1에 의한 MCF7 (패널 A) 및 AGS (패널 B)에 대한 증식 억제가 유의하게 증가했다. 27IgG1 (패널 C)과 비교하여 i27G1에 의해 기능적 친화도(SPR)가 유의하게 증가했다. i27G1은 MCF7에 대해 동등한 ADCC (패널 D) 및 CDC 활동 (패널 E)을 유지한다. 각 모체 작제물에 대한 유의성은 다중 비교에 대한 던네트의 보정을 사용하여 이원분산분석 (직접적인 세포독성) 또는 일원분산분석 (기능적 친화도)으로부터 추론했다.
도 9. 단일 복귀체 분석은 직접적인 세포 사멸을 유지하기 위해 최소 15개의 잔기가 필요함을 보여준다. COLO205 (패널 A) 및 HCT15 (패널 B)에 대한 23개의 단일 i88G1 복귀체의 직접적인 세포독성. 정규화된 세포 사멸 (i88G1에 비해)은 COLO205 (7개 잔기)와 비교하여 HCT15 (15개 잔기)에 대한 직접적인 세포독성을 유지하기 위해 mG3 잔기의 증가된 수의 필요성을 입증한다. 15mG3 잔기 (i88G1v2, 패널 C 및 E 및 i129G1v2, 패널 D)가 있는 개선된 작제물은 각각 23mG3 잔기, i88G1 및 i129G1이 있는 모체 작제물과 비교하여 COLO205 및 HCT15에 대한 동등한 직접적인 세포독성을 유지한다.
도 10. ST16, HUVEC 및 PBMC에 대한 FG27.10 및 FG27.18의 결합. 이 검정에 대한 음성 대조군은 ST16 및 HUVEC에 대한 NSO 상청액, 또는 PBMC에 대한 세포 단독이었고 양성 대조군은 HLA를 인식하는 항-시알릴-디 루이스^a mAb, 505/4 또는 W6/32 중 하나였다.
도 11. 결장직장 (C170), 난소 (OVCAR-3, OVCAR-4, OVCA433, OAW28, OAW42) 및 위 세포주 (ST16, MKN45, AGS)로부터의 당지질 추출물에 대한 FG27.10 및 FG27.18의 결합. 다양한 암 세포주로부터 추출된 당지질을 ELISA 플레이트에 플레이팅했다. 이어서, 세포 및 당지질을 FG27.10 또는 FG27.18 상청액과 함께 인큐베이션하였다. 당지질에 대한 결합은 항-IgG-HRP/TMB로 조사되었다.
도 12a. 마우스 IgG3 mAb FG27.10에 의해 매개된 ST16 세포의 PI 흡수는 4℃에서도 강력한 PI 흡수를 유도했지만 IgG1 변이체 FG27.18은 그렇지 않았다. 도12b: 종양 세포주 (AGS, Colo201, C170, C170HM2, MCF7, OVCA4, LoVo, MKN45, 791T 및 Skov3) 패널에서 FG27.10 및 FG27.18에 의해 매개되는 PI 흡수. 도 12c: C170 세포에 대한 FG27.10, FG27.18, CH27 IgG2, CH27 IgG1에 의해 매개되는 PI 흡수.
도 13. 세포주의 패널에 대한 FG27.10, FG27.18, ch27IgG1 및 인간화 변이체 hLewAC의 결합: 도 13a, HCT15; 도 13b, AGS; 도 13c, OVCAR3; 도 13d, H322, 및 도 13e, MCF7, 및 FG27.10 (도 13f) 및 FG27.18 (도 13g)에 대한 SPR 분석
도 14. i27G1은 면역 이펙터 기능을 유지하면서 27IgG1과 비교하여 현저하게 개선된 직접적인 세포독성 및 기능적 친화도를 나타낸다. 27IgG1과 비교하여 i27G1에 의해 MCF7 (패널 i) 및 AGS (패널 ii)에 대한 증식 억제가 유의하게 증가했다. 27IgG1 (패널 iii)과 비교하여 i27G1에 의해 기능적 친화도 (SPR)가 유의하게 증가했다. i27G1은 MCF7에 대한 동등한 ADCC (패널 iv) 및 CDC 활성 (패널 v)을 유지한다. 모체 작제물에 대한 유의성은 다중 비교에 대한 던네트의 보정을 사용하여 이원분산분석(직접적인 세포독성) 또는 일원분산분석 (기능적 친화도)으로부터 추론했다.
도 15. "향상된" 버전 1-3을 포함하는 DNA 및 단백질 항체 88 항체 서열.
도 16. "향상된" 버전 1-3을 포함하는 DNA 및 단백질 항체 129 항체 서열.
도 17. "향상된" 버전 1을 포함하는 DNA 및 단백질 항체 27 항체 서열.
도 18. i트라스투주맙 (iTv1 및 iTv2)은 리간드 밀도-의존 방식으로 야생형 트라스투주맙 (WT)과 비교하여 개선된 기능적 친화도를 나타낸다 (Biacore T200 분석, 패널 A). 다양한 고결합성 (SKBR3, BT474) 및 중등도 결합 세포주 (MDA-MB231 및 SKOV3)에 대한 트라스투주맙 작제물의 세포 결합 개요 (패널 B). 야생형 트라스투주맙과 비교하여 MDA-MB231에 대한 직접 세포독성 (iTv2)이 유의하게 향상되었다 (패널 C). 야생형 트라스투주맙과 비교하여 iTv1 및 iTv2 (최고 농도)에 의한 BT474 세포 (막 손상 반영)에 대한 향상된 PI 흡수 (패널 D). 야생형 트라스투주맙과 비교하여 직접 표지된 iTv2에 의한 개선된 고체상 Her2 결합 (패널 E). 모체 작제물에 대한 유의성은 다중 비교에 대한 던네트의 보정을 사용하여 이원분산분석(직접적인 세포독성)으로부터 추론했다.
도 19. "향상된" 버전 1 및 2를 포함하는 단백질 항체 트라스투주맙 항체 서열.
도 20. MHC 부류 II 결합 에피토프에 대한 IEDB 스크리닝. 상단, SD286-306+339-378을 포함하는 hIgG1 및 mIgG3 서열의 서열 정렬 (ClustalW). 결합된 하위 도메인인 286-306 및 339-378은 박스로 표시되고; IEDB 분석에 의해 식별된 클러스터 1 및 2는 화살표로 표시된다. 아래, 중간 열에 MHCII 결합 에피토프, DR 대립유전자 및 스코어가 있는 IEDB 분석 표. 오른쪽 열은 면역원성을 해결할 수 있는 잔기 변화 (mIgG3 -> hIgG1, 밑줄)를 나열한다. DI, 탈면역화된 작제물.

본 발명의 구현예를 설명함에 있어, 용어는 그렇게 선택된 특정 용어로 제한되지 않으며, 각 특정 용어는 유사한 목적을 달성하기 위해 유사한 방식으로 작동하는 모든 기술적 등가물을 포함하는 것으로 이해된다.

용어 '면역글로불린' 또는 Ig는 2쌍의 폴리펩티드 사슬, 1쌍의 경쇄 (L) 저분자량 사슬 및 1쌍의 중쇄 (H)로 이루어진 구조적으로 관련된 당단백질 부류를 지칭하며, 4개 모두 잠재적으로 이황화 결합에 의해 상호연결되어 있다. 면역글로불린의 구조는 잘 특성화되어 있다. 예를 들어, 문헌 (Fundamental Immunology Ch.7 (Paul, W., ed., 2nd ed. Raven Press, N.Y. (1989))을 참조한다.

방법

재료, 세포 및 항체

모든 암 세포주: COLO205, HCT15 (C170, C170HM2), AGS, COLO201, ST16, MCF7, OVCAR3, H322, OVCA4, LoVo, MKN45, 791T, BT474, MDA-MB231, SKBR3, SKOV3, 및 791T와 뮤린 골수종 NS0 세포주는 ATCC (미국 버지니아주 소재)로부터 구입했다. 모든 세포주는 짧은 탠덤 반복 프로파일링을 사용하여 증명되었다. 인간 혈청 알부민 (HSA)-APD-시알릴-루이스^a 및 HSA-APD-루이스^a는 IsoSepAB (Sweden)로부터 공급받았다. Erb2-His는 Abcam과 Stratech로부터 공급받았다. 세포주는 RPMI 배지 1640 (Sigma), 또는 10% 소태아 혈청, L-글루타민 (2 mM) 및 완충된 중탄산나트륨이 보충된 DMEM 고 글루코스에서 유지되었다. 모체 뮤린 FG88 및 FG129 mAb는 이전에 설명한 대로 생성되었다 (Chua et al. 2015).

변형된 mAb 작제물의 클로닝

본 발명의 하이브리도마-생성된 mAb (FG88.2 및 FG129)의 키메라 IgG1 변이체를 생성하기 위해, 각각의 mAb를 암호화하는 중쇄 및 경쇄 가변 영역은 제한 효소 BamHI/BsiWI (경쇄 유전자좌) 또는 HindIII/AfeI (중쇄 유전자좌)를 사용하여 pDCOrig 벡터에 도입되었다 (Metheringham et al. 2009). 전체 mIgG3 불변 영역뿐만 아니라 교환된 mIgG3 IgG1 도메인 및 단일 잔기 변경을 포함하는 합성 중쇄 불변 영역은 Eurofins MWG (Ebersberg, Germany)로부터 설계 및 주문되었다. 전형적으로, 이것은 JH/CH 접합부의 AfeI 제한 부위로부터 CH 정지 코돈의 XbaI 부위 3'까지 연장되는 1054 bp 카세트를 포함했다. 합성 유전자는 독점적인 Eurofins 벡터로 공급되었다. 맥시프렙(maxiprep) (플라스미드 맥시 키트, Qiagen) 후, 15 μg의 플라스미드 DNA를 AfeI 및 XbaI (둘 모두 NEB)로 분해하고 삽입 겔을 정제하였다 (QIAquick 겔 추출 키트, Qiagen). 이 삽입물은 라이게이션 (T4 DNA 리가제, NEB, 제조업체 권장사항에 따름)에 의해 AfeI/XbaI 분해된 벡터 pOrigHiB (Metheringham et al. 2009)에 도입되었다. 서열 확인 및 맥시프렙 후, 15 μg의 플라스미드 DNA를 AfeI 및 AvrII (둘 모두 NEB)로 분해하고 삽입 겔을 정제하였다. 이어서, 이 삽입물이 라이게이션에 의해 AfeI/AvrII 분해된 벡터 pDCOrig에 도입되었다.

HEK293 형질감염 및 mAb 정제

ExpiFectamine^TM 293 형질감염 키트 (Gibco, LifeTechnologies)를 사용하여 Expi293F^TM 세포를 일시적으로 형질감염시킨 후 mAb 작제물을 얻었다. 간단히, 현탁액 (100 ml, 2x10⁶/ml) 중 HEK293 세포를 100 μg DNA로 형질감염시키고 형질감염 후 7일째에 조건 배지를 수확하였다. 조건화된 형질감염 상청액을 0.22 μm 병 상단 필터 (Merck Millipore)를 통해 여과하고 아지드화나트륨을 0.2% (w/v)의 최종 농도로 첨가하였다. 항체는 AKTA FPLC (GE Healthcare)를 사용하여 단백질 G 컬럼 (HiTrap ProteinG HP, GE Healthcare)에서 정제하였다. 컬럼은 100 mM 글리신, pH 12 (0.05% v/v Tween 20으로 보충됨)로의 빠른 (2 ml) 구배로 항체 용출 전에 PBS/Tris 완충액 (50 mM Tris/HCl을 갖는 PBS, pH 7.0)으로 세척하여 2 ml 분획을 수집하였다. mAb를 함유하는 분획을 모아 중화하고 (1M HCl 사용) 농도를 측정했다. 모든 일시적으로 발현된 mAb 작제물은 모체 mAb와 비교하여 세포 결합에 대해 mAb 작제물의 정확한 폴딩에 대한 판독으로서 유세포 분석을 사용하여 분석되었다 (데이터는 나타내지 않음).

간접 면역형광 및 유세포 분석

이전에 설명한 대로 (Chua et al. 2015) 암 세포 (1x10⁵)를 4℃에서 1시간 동안 1차 mAb (33.3 nmol/L 또는 적정)와 함께 배양한 다음, 항마우스/항인간 FITC 표지된 2차 항체와 함께 4℃에서 1시간 배양하고, 0.4% 포름알데히드에 고정하였다. 염색된 샘플을 MACSQuant 10 유세포 분석기에서 분석하고 FlowJo v10을 사용하여 분석하였다.

기능적 친화도 결정

루이스^a - 또는 시알릴-루이스^a -APD-HSA에 결합하는 88 및 129 mAb의 동역학 파라미터는 표면 플라스몬 공명 (SPR, Biacore 3000, GE Healthcare)에 의해 결정되었다. 증가하는 농도 (0.3 nmol/L-200 nmol/L)의 mAb를 CM5 칩에 걸쳐 주입하고 데이터를 BIAevaluation 4.1을 사용하여 이종 리간드 결합 모델에 맞추었다. 칩에는 4개의 셀이 포함되어 있으며 그 중 2개는 HSA-코팅되고(인-라인 참조 셀)이고 다른 2개는 소량 (30-80 응답 단위(RU)) 및 다량 (360-390 RU)의 각각의 글리칸-APD-HSA로 코팅되었다.

트라스투주맙 항체 대 이의 리간드 HER2에 결합하는 트라스투주맙 조작된 항체 변이체의 동역학 파라미터는 SPR (Biacore T200, Cytiva, formerly GE Healthcare)에 의해 결정되었다. 증가하는 농도 (90.0 nM 내지 0.37 nM)의 항체를 항-His 항체로 코팅된 CM5 칩을 가로질러 주입하고 His-태그된 HER2를 포획했다.

시험관내 세포독성

증식 억제뿐만 아니라 PI 흡수를 수행하여 mAb의 직접적인 세포독성 효과를 분석하였다. COLO205, HCT-15 또는 BT474 세포 (5 x 10⁴)를 37℃에서 2시간 동안 mAb와 함께 배양한 다음, 1 μg의 PI를 30분 동안 첨가하였다. 세포를 PBS에 재현탁하고 Beckman Coulter FC 500 또는 MACSQuant 10 유세포 분석기에서 실행하고 각각 WinMDI 2.9 또는 FlowJo v10 소프트웨어로 분석하였다.

작제물에 의한 증식 억제는 생존 세포의 수에 정비례하는 세포 하이드로게나제의 활성을 측정하기 위해 수용성 테트라졸륨 염 WST-8 (CCK8 키트, Sigma Aldrich)을 사용하여 평가되었다. 간단히, 암세포를 밤새 플레이팅 (1000-2000개 세포/90 μl/웰) 후, 작제물을 10 μl/웰의 최종 부피로 상이한 농도로 첨가하고 플레이트를 37℃ (5% CO₂)에서 72 내지 96시간 동안 인큐베이션했다. 이어서, WST-8 시약을 첨가하고 (10 μl/웰) 추가 3시간 인큐베이션 후, 플레이트를 450 nm (Tecan Infinite F50)에서 판독하고 억제 백분율을 계산하였다. EC₅₀ 값은 GraphPad Prism v 8.0 (GraphPad Inc, 캘리포니아주 라 호이아 소재)을 사용하여 비선형 회귀 (곡선 맞춤)를 사용하여 결정하였다.

주사 전자 현미경 검사법

HCT-15 또는 COLO205 세포 (1 x 10⁵)를 37℃에서 18시간 동안 mAb (0.2 μmol/L)를 첨가하기 전에 24시간 동안 멸균 커버슬립에서 성장시켰다. 대조군에는 배지 단독 및 0.5% (v/v) 과산화수소 (H₂O₂) (Sigma)가 포함되었다. 세포를 미리 데운 0.1 M 나트륨 카코딜레이트 완충액 pH 7.4 (SDB)로 세척하고 12.5% (v/v) 글루타르알데히드로 24시간 동안 고정하였다. 고정된 세포를 SDB로 2회 세척하고 45분 동안 1% (v/v) 오스뮴 테트라옥사이드 (pH 7.4)로 사후 고정하였다. H₂O로 최종 세척한 후, SEM 분석 (JSM 840 SEM, JEOL) 전에 금으로 스퍼터링하기 전에 세포를 증가하는 농도의 에탄올에서 탈수하고 임계점 건조에 노출시켰다.

생체내 모델

연구는 NCRI, LASA 및 FELAS 지침에 따라 UK Home Office License에 따라 CrownBio UK에서 수행하였다. COLO 205의 인간 결장직장 선암종 모델의 피하 종양은 각 마우스의 왼쪽 옆구리에 0.1 ml 무혈청 RPMI:Matrigel (1:1) 중 5x10⁶ 생존 세포의 주사를 통해 연령이 일치하는 암컷 BALB/c 누드 (Charles River, UK) 마우스에서 확립되었다. 마우스 (n=10)를 연구 6일차에 이들의 평균 종양 부피 (~103 mm³ ± 13 mm³)에 따라 처리 그룹에 무작위로 할당하고 5주차까지 mAb (0.1 mg) 또는 비히클 (PBS, 100 μl)을 격주로 정맥내 (iv) 투여하였다. 체중과 종양 부피는 매주 3회 평가되었고 종양 부피의 감소는 본페로니의 사후 시험 (Bonferroni's post-test) (상호작용 인자; GraphPad Prism v 7.4 (GraphPad Inc, 캘리포니아주 라 호이아 소재))과 함께 이원분산분석 시험을 사용하여 통계적으로 분석하였다.

실시예

본 발명은 이제 하기 실시예 및 첨부 도면을 참조하여 추가로 설명될 것이다.

실시예 1. m88G3은 88IgG1로 키메라화 시 감소되는 보체 및 면역 이펙터 세포의 부재 하에 직접적인 세포독성뿐만 아니라 친화성 (avid) 글리칸 결합을 나타낸다.

이전에 하이브리도마 생성된 mIgG3 mAb FG88.2가 보체 또는 이펙터 세포의 부재하에 COLO205 및 HCT15와 같은 고결합 암 세포주에 직접적인 세포독성 효과를 발휘하는 것으로 나타났다 (Chua et al. 2015). 이 직접적인 세포독성은 mAb-유도된 세포 응집, 증식 억제 및 종양용해 기전을 통한 불규칙한 기공 형성과 관련이 있다. 이후 본 발명자들은 임상 개발을 위해 키메라 HEK293-발현된 IgG1 mAb, 88IgG1을 만들었다. 88IgG1은 하이브리도마-생성된 FG88.2 및 88mIgG3을 발현한 HEK293과 비교하여 동등한 HCT15 및 COLO205 암 세포 결합 수준을 유지하였다 (도 1a). 후자의 mAb는 뮤린 하이브리도마 세포 대 HEK293 세포의 사용으로 인한 차등 Fc 글리코실화와 같은 발현 시스템 관련 효과를 배제하기 위해 생성되었다. 놀랍게도, 88IgG1은 88mIgG3과 비교하여 2가지 기능 검정, PI 흡수 및 증식 억제에 걸쳐 COLO205 및 HCT15에 대해 현저하게 감소된 직접적인 세포독성을 나타내었다 (도 1b-d). 88mIgG3은 또한 하이브리도마-생성된 FG88.2와 비교하여 직접적인 세포독성에서 완만한 감소를 보이는데, 이는 2가지 발현 설정 (마우스 하이브리도마 대 HEK293 세포)에 의한 Fc 영역의 차등 글리코실화가 효과에 기여할 수 있음을 시사한다. 이것은 직접적인 세포 사멸이 상이한 이소형의 동역학적 결합과 관련되어 있음을 시사한다. 결과적으로, SPR을 사용하여 루이스^a-APD-HSA 코팅된 칩에서 본 발명의 이소형-전환된 mAb의 동역학적 결합을 분석하였다 (표 1). FG88.2는 고밀도 유동 세포에서 빠른 겉보기 온-레이트 (k_on ~ 10⁴ 1/smol/L)와 매우 느린 오프-레이트 (k_off ~ 10^-6 1/s)로 친화성 루이스^a-APD-HSA 결합을 나타냈다. HEK293-생성된 88mIgG3은 FG88.2와 비교하여 더 빠른 온-레이트 (k_on ~ x 10⁵ 1/smol/L)와 다소 빠른 오프-레이트 (k_off ~10⁴ 1/s)를 나타내어 FG88.2에 비해 세포 독성이 약간 감소한 것을 설명할 수 있다. 이에 비해, 88IgG1은 겉보기 빠른 온-레이트 (k_on ~ 10⁵ 1/smol/L)로 표적에 결합했지만 mIgG3 이소형과 대조적으로 훨씬 빠른 해리 단계 (겉보기 k_off ~ 10^-2 1/smol/L)를 나타내어 암세포 결합 시 감소된 세포독성 활성의 기초가 될 가능성이 있다. 저밀도 유동 세포에 대한 mAb 결합 거동은 3개의 mAb 모두에 대해 10^-8 mol/L 정도의 평형 해리 상수 (K_d)를 갖는 3개의 mAb 간에 대체로 유사했다.

실시예 2. mIgG3 불변 영역의 도메인 분석은 mIgG3 CH3 도메인에 의한 주요 기여와 CH2의 미미한 관여를 시사한다.

종합적으로, 결과는 FG88 및 88mIgG3에 의해 나타나는 높은 Lewis^a-APD-HSA 기능적 친화도가 주로 느린 해리에 의해 유도되고 잠재적으로 이 이소형의 분자간 협동성으로 인해 발생하며, 고결합 암 세포주에 대한 이들의 직접적인 세포독성 효과에 기여함을 시사하였다. 따라서, 본 발명자들은 선택된 mIgG3 불변 영역 잔기의 88IgG1로의 전달을 통해 직접적인 세포독성 활성을 갖는 mAb를 표적으로 하는 IgG1 암 글리칸을 조작하기 시작했다. 먼저, mIgG3 기여 영역은 mIgG3 CH1, CH2 또는 CH3 도메인을 포함하는 하이브리드 88IgG1 작제물의 생성을 통해 확인되었다. 예비 분석은 mIgG3 CH1을 88IgG1 (1 m1)에 도입해도 세포독성이 유의하게 증가하지 않았기 때문에 mIgG3 CH1이 88mIgG3의 직접적인 세포독성 능력에 미미한 기여를 하는 것으로 확인되었다 (도 2a 및 2b). 반대로, IgG1 CH1을 88mIgG3 (3h1)에 동등하게 도입해도 사멸 활성의 유의한 감소를 일으키지 않았다 (도 2a 및 2b). 다음으로, 기능 획득 접근법에서 mIgG3 CH2 및 CH3 도메인을 별도로 88IgG1에 도입했다. 뮤린 CH3 (1m3)을 함유하는 88IgG1은 88IgG1과 비교할 때 HCT15에 대한 PI 흡수에서의 유의한 증가 및 COLO205 세포의 유의한 증식 억제를 나타냈다 (도 2c 및 d). 뮤린 CH2를 88IgG1 (1m2)에 도입하면 두 검정 모두에서 사멸 활성이 작지만 유의하게 증가하지는 않는다 (도 2c 및 d). 두 도메인에 의한 기여를 확인하기 위해 역 전략이 뒤따랐는데 이로써 88mIgG3에 IgG1 CH2 또는 CH3 도메인이 도입됨에 따라 세포독성 활성의 손실이 평가되었다. 이 시나리오는 IgG1 CH3 (3h3)을 포함하는 88mG3에 대한 세포독성의 유의한 감소를 야기하여, 이는 이전의 기능 획득 결과를 확정하였다. 중요하게도, 인간 CH2 (3h2)를 함유하는 88mIgG3이 세포독성 활성의 유의한 감소를 나타내기 때문에 이 전략은 또한 뮤린 CH2에 의한 작은 기여를 확인하였다 (도 2c 및 d). 다음으로, 하이브리드 작제물의 동역학적 결합 거동을 분석하였다. 하이브리드 작제물 1m3은 기능적 친화도에서 완만하지만 유의한 증가 (K_d 감소)를 나타낸 반면, 인간 CH3를 포함하는 3h3은 두 경우 모두에서 직접적인 세포독성을 반영하여 기능적 친화도에서 유의한 감소를 나타냈다 (K_d 증가, 도 2e)를 나타냈다. 작제물 3h2에서 인간 CH2는 또한 기능적 친화도에서 적절하지만 유의한 감소를 유발하였다. 모든 경우에, 기능적 친화도의 변화는 주로 mAb의 오프-레이트의 변화에 의해 주도되었으며, 1m3은 88IgG1 및 3h3과 비교하여 유의하게 감소된 오프-레이트를 나타내고 3h2는 88mIgG3과 비교하여 유의하게 증가된 오프-레이트를 나타낸다 (도 2f). 작제물 1m2에서 뮤린 CH2는 88IgG1과 비교하여 이 작제물의 중요하지 않은 세포독성의 기반이 되는 증가된 기능적 친화도 또는 감소된 오프-레이트를 유발하지 않았다 (도 2c 및 d). 결과를 종합하면 뮤린 CH3이 세포독성과 동역학적 결합에 더 두드러진 기여를 하는 반면, 뮤린 CH2에 의한 기여는 더 작고 기능 손실 설정에서만 관찰됨을 나타낸다.

실시예 3. aa 286 397의 CH2-CH3 영역 내의 불연속 서열은 사멸 활성 및 증가된 기능적 친화도에 필수적이다.

뮤린 CH3에 의해 부여된 세포독성 효과가 완전하지 않았기 때문에, 그리고 다른 기여하는 잔기를 더 좁히기 위해, 본 발명자들은 CH2 및 CH3 도메인이 10개의 잔기 중첩: CH2: SD232-294 및 SD286-345 및 CH3: SD339-397 및 SD390-447을 포함하는 접합부 영역을 포함하는 2개의 하위도메인 (SD)으로 더 세분화되는 하이브리드 88 mAb 작제물을 설계하였다. COLO205에서 SSD339-397과 SD286-345 둘 모두는 더 낮은 농도에서 가장 명백한 세포독성에서 유사한 유의한 증가를 제공한 반면, SD232-294 및 SD390-447은 단독으로 또는 조합하여 (나타내지 않음) 세포독성에 대해 불필요했다 (도 3a 및 c). 그러나, HCT15에서 SD339-397 내의 잔기에 의한 유의한 기여는 SD286 345 (도 3b 및 d)의 것보다 컸으며, 이는 글리코-항원 밀도 및 조성의 미묘한 차이가 mAb 결합 및 이어지는 세포독성 활성을 조절할 수 있음을 시사한다. 두드러지게, 결합된 mIgG3 SD286-345 및 SD339-397 (SD286-397)을 포함하는 88IgG1은 두 세포주와 두 검정에서 모두 88mIgG3의 거의 모든 세포독성을 회복하여 (도 3a-d) 추가 하위도메인을 추가할 필요가 없다. 88IgG1과 비교하여 하위도메인 작제물의 기능적 친화도 분석은 SD286-397 및 SD339-397에 대한 기능 친화도의 현저한 개선을 나타내었으며, 둘 다 현재 88mIgG3 기능 친화도와 일치하고 SD286-345에 대한 보다 완만한 개선이 있다 (도 3e). 개선된 기능적 친화도는 SD286-397 및 SD339-397에 대해 현저하게 감소된 겉보기 오프-레이트 (~10^-6 1/s)로 인해 주로 발생했으며, SD286-345 오프-레이트는 보다 완만한 개선(~ 10^-3 1/s)을 나타낸다 (도 3f). 이러한 결과는 세포독성 관찰에 추가 가중치를 더하고 감소된 표적 해리 속도를 갖는 mAb를 생성하는 것이 직접적인 세포독성을 지원함을 시사한다. 27개의 mIgG3 잔기가 있는 SD339 397이 88mIgG3의 바람직한 특성, 특히 느린 해리 및 강화된 세포독성의 최대 90%를 반복했지만, 이는 88IgG1 (도 3g)에 비해 유의하게 감소된 CDC 활성을 나타내어 추가 개발을 위해 SD286-397의 사용을 필요로 했다. 대조적으로, SD339-397의 ADCC 활성은 88IgG1에 비해 감소되지 않았다 (도 3h). SD286-397이 88mIgG3 세포독성을 완전히 반복했지만, 여전히 41mIgG3 잔기를 포함하였다. 결과적으로, SD286-345 및 SD339-397의 추가 세분화가 세포독성 활성 및 기능적 친화도에 대해 분석되었다. 이 분석은 직접적인 세포독성에 기여한 SD339-397 및 SD286-345의 두 영역을 각각 강조했다. 첫째, 20개의 mIgG3-특이적 잔기를 함유하는 SD339-378은 88IgG1에 도입 시 두 검정에 걸쳐 mIgG3 세포독성의 ~80% 내지 90% 이내로 유의한 세포독성을 회복했다 (도 4a 및 b). 이 영역은 또한 88IgG1과 비교하여 기능적 친화도가 유의하게 증가했지만 이러한 개선은 SD339-397의 경우만큼 두드러지지 않았다 (도 4g). 동일한 세트의 작제물 내에서, 기능 손실 접근법을 통해 또 다른 관심 영역을 확인하였다. SD286-345와 비교하여 SD307-345에 의한 세포독성의 현저한 감소는 잔기 286-306에 의한 추가 기여를 암시하였다 (도 4c). 종합적으로, 결과는 총 26개 mIgG3 특이적 잔기를 포함하는 잔기 286-306 및 339-378의 조합을 포함하는 작제물이 88mIgG3 직접 세포독성 및 기능적 친화도를 잠재적으로 완전히 반복할 수 있음을 시사했다. 이 가설을 시험하기 위해, SD286-306+339-378의 세포독성 활성 및 기능적 친화도를 평가하였다. SD286-306+339-378은 두 세포주 모두에서 88 IgG1과 비교하여 상당히 개선된 직접적인 세포독성을 나타내어 현재 88mIgG3 세포독성과 일치한다 (도 4d-f). SD286-306+339-378의 SPR 분석은 K_d (0.3 x 10^-9nmol/L)를 갖는 88IgG1과 비교하여 유의하게 개선된 기능적 친화도를 나타냈으며 88mIgG3와 유사하였다 (도 4g). 중요하게는, SD286-306+339-378 작제물의 CDC 활성도 ADCC 활성도 88IgG1의 활성과 유의하게 다르지 않았다 (도 4h 및 i). 개선된 기능적 친화도와 직접적인 세포독성의 조합 및 유지된 면역 이펙터 기능은 SD286-306+339-378 하이브리드 IgG1이 88mIgG3의 바람직한 특성을 모방함을 나타낸다.

실시예 4. 인 실리코로 확인된 면역원성 클러스터의 역전은 강력한 세포 사멸, 기공-형성 능력 및 건전한 면역 이펙터 기능을 가진 개선된 'i' 88G1의 주요 후보를 생성한다.

26개 mIgG3 잔기의 존재에 의해 생성된 하이브리드 SD286-306+339-378 작제물의 잠재적 면역원성을 평가하기 위해, 본 발명자들은 MHCII-결합 에피토프 (Immune Epitope Database, IEDB)에 대한 SD286-306+339-378 서열의 인 실리코 스크린을 수행하였다. 부류 II-제한된 T 헬퍼 세포는 체액성 면역 반응과 더 관련이 있으며 예측된 결합 클러스터는 T 세포 반응의 강력한 지표인 것으로 나타났다 (Jawa et al. 2013). 여러 고득점 결합 에피토프를 포함하는 2개의 MHCII 결합 클러스터가 확인되었다: 클러스터 1 (잔기 294-315) 및 클러스터 2 (잔기 365-393) (도 5/도 20). 클러스터 1 내에서 3개의 뮤린 잔기, 294 (A에서 E), 300 (F에서 Y) 및 305 (A에서 V)를 인간 잔기로 되돌리면 개체가 관용화된 인간 서열 섹션이 생성되었다. 유사하게, 339-378 영역 내에서 2개의 잔기 351 (I에서 L로) 및 371 (N에서 G로)의 역전은 2개의 MHCII 결합 코어를 제거하였다. 따라서, 본 발명자들은 상기 인 실리코 스크린을 기반으로 2개의 추가 SD286-306+339-378-기반 작제물: 클러스터 1 (DI1) 및 2 (DI2)를 만들었는데, 이는 각각 3개 및 2개의 인간 복귀 잔기를 함유하고 이들의 세포독성을 분석하였다. DI1 및 DI2는 88IgG1과 비교하여 유의하게 개선된 세포독성을 유지했지만, DI2는 88mIgG3과 비교하여 작지만 일관되게 감소된 활성을 나타냈다 (도 6a 및 b). 또한, 88DI1의 경우, 직접적인 세포독성은 88mIgG3과 유의하게 다르지 않은 0.5 x 10^-9 nmol/L의 명백한 오프-레이트 (~ 10^-4 1/s) 및 K_d로 유리한 기능적 친화도 프로파일과 일치했다 (도 6c, 표 2). 대조적으로, DI2는 88mIgG3과 비교하여 유의하게 감소된 기능적 친화도를 나타냈다 (도 6c). 이러한 발견에 기반하여, 본 발명자들은 이의 면역 이펙터 기능에 대한 추가 분석을 위해 개선된 'i'(개선된) 88G1로 이제는 명칭이 변경된 23개 mIgG3 잔기를 포함하는 88DI1에 초점을 맞추었다. 88IgG1은 FG88의 강력한 면역 이펙터 기능과 일치하는 서브-나노몰 EC50을 갖는 COLO205에서 강력한 ADCC 활성을 나타냈다 (도 6D) (Chua et al. 2015). 유사하게, i88G1은 88IgG1 (EC₅₀0.13 nmol/L)에 비해 다소 감소했지만 서브나노몰 EC₅₀ (0.35 nmol/L)으로 강력한 ADCC를 나타냈다. i88G1의 CDC 활성은 88IgG1에 비해 완만하게 개선되었다 (도 6e, 표 2).

모체 하이브리도마-생성된 FG88 mAb에 대한 초기 작업은 이의 기공 형성 능력을 입증했으며, 이는 세포독성의 기반이 되는 것으로 추정된다 (Chua et al. 2015). 따라서, 본 발명자들은 SEM을 사용하여 HCT15에 대한 i88G1의 기공-형성 능력을 분석하기 시작했다. 88IgG1이 아닌 i88G1 또는 88mIgG3과 HCT15의 배양은 단층 파괴, 세포 라운딩 및 클러스터링을 초래했다. 더 높은 배율에서 불규칙한 기공 형성이 분명했으며 (도 6f), 하이브리도마-생성된 FG88 mAb에 대해 관찰된 원래 데이터를 반영한다 (Chua et al. 2015).

종합적으로, 결과는 mIgG3 불변 영역에서 88IgG1 백본으로 선택된 영역의 전달이 직접적인 세포 사멸 능력, 증가된 기능적 친화도 및 강력한 면역 이펙터 기능을 갖는 하이브리드 mAb를 생성했음을 나타낸다.

실시예 5. 'iG1' 서열을 대안적인 비사멸 글리칸 결합 mAb (129 IgG1)로 전달하면 시험관 내 및 생체내 항종양 활성이 개선된 암-표적 mAb를 생성한다.

최근에 본 발명자들은 암 면역요법에 대한 개발 가능성이 있는 mAb (129 mAb)를 인식하는 시알릴-디-루이스^a의 생성을 설명했다. 129 mAb는 상기 기술된 88 mAb와 비교하여 정상 인간 조직 분포에 비해 더 유리한 종양을 가지며, 이는 주로 매우 제한된 정상 조직 반응성으로 인해 발생한다. 뮤린 IgG1 mAb인 하이브리도마-생성된 FG129도 키메라 129IgG1도 직접적인 세포독성을 나타내지 않는다. 이것은 상기 선택된 23개 mIgG3 불변 영역 잔기를 CH129의 Fc 영역에 도입하면 직접적인 세포독성 및 개선된 기능적 친화도를 갖는 'i'129G1이 생성되어 우수한 임상 유용성을 나타낼 것이라는 가설을 시험하도록 할 수 있었다.

본 발명자들은 이전에 129 mAb에 대한 고결합 암 세포주로 밝혀진 COLO205에 대한 i129G1의 직접적인 세포독성 능력을 평가하였다. i129G1은 45.6 nmol/L의 EC₅₀과 함께 유의하게 개선된 (129IgG1과 비교하여) 용량-의존적 증식 억제 (도 7a)를 나타냈을 뿐만 아니라 유의하게 개선되었지만 보다 완만한 PI 흡수를 나타냈다 (도 7b). 다음으로, 본 발명자들은 시알릴 루이스^a-APD-HSA-코팅된 칩 및 SPR을 사용하여 i129G1의 기능적 친화성을 분석하였다. i129G1 mAb는 129IgG1 (도 7c, 표 2)과 비교하여 상당히 개선된 기능적 친화도를 나타냈으며, 이는 주로 거의 2 로그 (129IgG1 및 i129G1에 대해 각각 2.6 x 10^-4 s^-1및 5.5 x 10^-6 s^-1)의 오프-레이트 개선으로 인한 것이다. 129IgG1은 이전에 COLO205에 대해 강력한 ADCC 이펙터 기능을 발휘했으며, 결과적으로 COLO205에 대한 i129G1의 ADCC 및 CDC 활성이 평가되었다. i129G1의 ADCC 활성은 129IgG1의 ADCC 활성과 비교하여 유의하게 감소했지만 세포 용해는 나노몰 범위에서 유지되었다 (i129G 및 129IgG1에 대해 각각 2.4 x nmol/L 및 1.7 x nmol/L의 EC₅₀) (도 7d, 표 2). 그러나, i129G1의 CDC 활성은 i129G1 및 129IgG1에 대해 각각 8.2 x nmol/L 및 75 x nmol/L의 EC₅₀으로 모체 129IgG1에 비해 유의하게 증가했다 (도 7e, 표 2). i129G1의 직접적인 세포독성 및 개선된 기능적 친화도는 COLO205에 대한 기공-형성 능력을 분석하게 했다. COLO205를 i129G1과 함께 배양하면 표면이 고르지 않은 큰 세포 덩어리가 형성되고 불규칙한 기공-유사 구조가 나타난다 (도 7f). 동일한 농도에서 129IgG1과 함께 배양하면 어느 정도의 세포 덩어리가 생겼지만 기공 형성의 증거 없이 점점 더 작은 덩어리가 관찰되었다.

i129G1의 직접적인 세포독성 및 개선된 기능적 친화도는 COLO205 이종이식 모델에서 모체 129IgG1과 비교하여 i129G1의 생체내 항종양 활성을 분석하도록 지시했다. i129G1 mAb는 비히클 대조군 (이원분산분석, p<0.0001)과 비교하여 종양 부피의 유의한 감소를 유발했으며, 이는 129IgG1과 비교할 때 유의하게 유지되어 시험관내 결과를 확증한다 (도 7g). 평균 체중에 대한 영향은 관찰되지 않았다 (도 7h).

직접적인 세포독성, 개선된 기능적 친화도 및 우수한 생체내 항종양 활성을 가진 선별된 수의 mIgG3 불변 영역 잔기의 도입을 통한 mAb의 생성은 임상적 유용성을 가진 mAb를 표적으로 하는 다른 암에 본 발명의 전략을 적용하는 길을 열어준다.

실시예 6. 'iG1' 서열을 대안적인 루이스 ^Y 글리칸 결합 mAb (27IgG1)로 전달하면 시험관내 직접적인 세포 사멸 능력이 개선된 암-표적 mAb를 생성한다.

본 발명자들은 또한 광범위한 종양 조직 분포 및 유리한 정상 인간 조직 결합을 갖는 단일 특이적 루이스^y-결합 mAb, 27mAb를 생성하였다. 이 mIgG3 mAb는 루이스^y-발현 AGS 및 MCF7 세포주에서 직접적인 세포 사멸을 나타내는 반면 키메라 27IgG1은 그렇지 않았다 (도 8a 및 b). 본 발명자들은 선택된 23개 mG3 잔기를 27IgG1에 도입하여 i27G1을 생성하고 직접적인 세포 사멸을 분석하였다. MCF7와 AGS 둘 모두에서, i27G1은 27mG3 mAb와 동등한 27IgG1과 비교하여 유의하게 개선된 직접적인 세포 사멸을 나타낸다 (도 8a 및 b). 또한, i27G1은 27IgG1과 비교하여 유의하게 개선된 기능적 루이스^y 친화도를 나타낸다 (도 8c). 중요하게도, i27G1, ADCC 및 CDC의 이펙터 기능은 둘 모두 MCF7에 대한 27IgG1의 기능과 동일했다 (도 8d 및 8e). 종합적으로, 결과는 mIgG3 불변 영역으로부터 27IgG1 백본으로 선택된 영역의 전달이 직접적인 세포 사멸 능력, 증가된 기능적 친화성 및 강력한 면역 이펙터 기능을 갖는 하이브리드 mAb를 생성했음을 나타낸다.

실시예 7. 23개의 'iG1' 서열의 추가 미세 조정은 15개 또는 7개의 잔기가 세포-유형 의존 방식으로 직접적인 세포 사멸을 유지하는 데 필수적임을 시사한다.

23개의 선택된 mG3 잔기 각각의 개별 기여도를 평가하기 위해, i88G1 (실시예 4)에 기반한 단일 복귀 전략이 수행되었다. i88G1에 있는 23개의 mG3 잔기 각각은 단독으로 hG1 잔기로 되돌아갔고, 생성된 작제물은 세포 증식 검정 (CCK 8, Sigma 96992)을 사용하여 COLO205 및 HCT15에 대한 직접적인 세포 사멸에 대해 분석하고 모체 i88G1과 비교하였다. 고정 농도 백분율 사멸은 여러 실험에 걸친 세포 사멸을 연관시키기 위해 동일한 실험에서 동일한 농도에서 i88G1에 의한 해당 백분율 사멸에 대해 정규화되었다. 대부분의 i88G1 복귀 작제물은 COLO205 세포에 대해 우수한 직접적인 세포 사멸을 유지하였다 (도 9a). 잔기 342, 343, 345, 361, 362, 374 및 376 (총 7개)은 1 미만의 평균 정규화된 사멸을 가졌고 고결합 COLO205 세포주에서 직접적인 세포 사멸에 필수적인 것으로 간주되었다. 대조적으로, 이들 7개 잔기 단독으로 복귀된 경우 이 최소 작제물은 발현/폴딩되지 않았으므로 이 작제물은 추구되지 않았다. 중간-결합 HCT15의 직접적인 세포 사멸은 i88G1의 1 표준 편차 이내로 세포 사멸을 유지하는 단 8개의 복귀된 잔기 (339, 344, 354, 356, 357, 358, 370, 373)와 함께 hG1 잔기로의 역전에 더 민감한 것으로 입증되었으며, 따라서 15 mG3 잔기: N286T, K288W, K290Q, Q342R, P343A, E345T, L351I, T359S, N361K, Q362K, G371N, P374S, S375E, D376A, A378S의 보유가 필요하다 (도 9b). 후자의 작제물은 각각 88 및 129mAb, i88G1v2 및 i129G1v2에 대해 생성되었으며 이들의 세포 사멸은 COLO205 및 HCT15에 대해 분석되었다. i88G1v2 및 i129G1v2에 의한 COLO205의 직접적인 세포 사멸은 각각 i88G1 및 i129G1에서 관찰된 것과 동일했다 (도 9c 및 9d). i88G1v2에 의한 HCT15의 직접적인 세포 사멸은 i88G1에 의해 관찰된 것과 동일하게 일치했다 (도 9e).

종합적으로, 결과는 15개 mG3 잔기: N286T, K288W, K290Q, Q342R, P343A, E345T, L351I, T359S, N361K, Q362K, G371N, P374S, S375E, D376A, A378S가 높은 결합 및 중간 결합 암 세포주에서 직접적인 세포 사멸을 유도하기에 충분함을 시사한다.

[표 1]

모체 88 mAb의 동역학적 결합 파라미터의 개요

^a최소 3개 분석을 대표함

^b고밀도 표면 결합에 대한 결과가 표시된다

[표 2]

개선된 작제물의 기능적 특성의 개요

^a COLO205에 대한 증식 억제로부터 추론됨

N/A: 적절하지 않음, ND: 결정되지 않음

실시예 8. FG27 mAb의 생성 및 초기 특성화: FG27은 위 종양 세포 당지질로 면역화하여 발생시켰다

면역화에 대한 항체 반응의 분석: 항체 역가는 초기에 지질 효소-연결된 면역흡착 검정 (ELISA)에 의해 모니터링되었다. ST16 전체 및 원형질막 지질 추출물을 사용한 박층 크로마토그래피 (TLC) 분석, ST16 종양 세포를 사용한 유세포 분석 (FACS) 및 ST16 전체 세포 추출물, 전체 및 원형질막 지질 추출물을 사용한 웨스턴 블롯이 후속적으로 수행되었다. 출혈 전 혈청 대조군과 비교하여 최상의 반응을 갖는 것으로 간주되는 마우스를 융합 전에 ST16 원형질막 지질 추출물로 정맥내(i.v.) 부스팅하였다.

종양 세포주의 패널에 대한 FG27 하이브리도마 상청액의 결합은 직접 면역형광 및 FACS 분석에 의해 분석하였다. FG27.10과 FG27.18 둘 모두는 ST16에 결합했지만 양성 대조군 항-HLA mAb, W6/32 (eBioscience, 미국 캘리포니아주 소재) 및 음성 대조군과 비교할 때 인간 제대 정맥 내피 세포 (HUVEC) 또는 말초 혈액 단핵 세포 PBMC에는 결합하지 않았다 (도 10). FG27.10 및 FG27.18은 둘 모두 클로닝되었다. FG27.10은 IgG3κ였고 FG27.18은 IgG1κ 하위부류였다. 두 mAb가 모두 당지질에 결합되도록 하려면, 당지질을 다양한 세포주로부터 추출하고, FG27.10 및 FG27.18과 함께 인큐베이션하기 전에 ELISA 플레이트 상에서 건조시켰다. C170, ST16 및 AGS 유래 당지질과 두 mAb 모두에서 결합이 관찰되었지만 전체 세포에 대한 결합 부족을 나타내는 세포주에서는 그렇지 않았다 (MKN-45, OAW28, OVCAR-3, OVCAR-4 및 OAW42; 도 11).

실시예 9. 모체 FG27 mAb의 직접적인 세포 사멸

다수의 항-글리칸 mAb는 이펙터 세포 또는 보체에 대한 필요 없이 항원 양성 세포주에서 직접적인 세포 사멸을 유도하는 것으로 나타났다. 이것은 종양이 면역-매개된 세포 사멸을 피하기 위한 메커니즘을 개발할 수 있기 때문에 잠재적으로 생체내 효능을 향상시킬 수 있다. 이 기능은 주로 mIgG3 이소형의 글리칸-결합 mAb와 관련이 있으므로 키메라화 또는 인간화 시 성질이 손실된다.

FG27.10 및 FG27.18이 직접적인 세포 사멸을 야기하는 능력이 있는지 여부를 결정하기 위해, ST16 세포를 FG27.10, FG27.18 및 항-시알릴 루이스^a mAb SC104와 함께 실온에서 2시간 동안 인큐베이션한 후, 세포 사멸을 죽어가는 세포에 의해서만 흡수되는 DNA 삽입제 (intercalating agent)인 PI의 흡수에 의해 측정하였다 (도 12a). 흥미롭게도, 동일한 가변 영역을 가짐에도 불구하고, FG27.10만이 직접적인 세포 사멸을 유도할 수 있었고 FG27.18에서는 PI의 흡수가 관찰되지 않았다. 도 12b는 다양한 양의 사멸을 나타내는 2개의 mAb를 갖는 항원 양성 (AGS, Colo201, C170, C170HM, MCF-7, OVCAR4) 세포주의 범위의 직접적인 세포 사멸을 나타낸다. mAb는 항원 음성 세포주 (LoVo, MKN45, 791T, SKOV3)의 사멸을 나타내지 않았다.

도 12c는 mAb 범위에 의한 결장직장 세포주 C170에서의 PI 흡수를 나타낸다. FG27.10 및 양성 대조군 항체 SC101은 강한 적정성 사멸을 나타냈다. FG27.18은 약한 비 적정성 사멸을 나타냈다. 변형된 IgG1 키메라는 중간 정도의 적정성 사멸을 보인 반면, IgG2 변이체는 그렇지 않았다.

실시예 10. FG27 결합 연구

인간화 (인간화 27) 및 키메라 mAb (CH27)는 암 세포주에 대한 적정에서 유사한 세포 결합 패턴을 입증하였다 (도 13a-e). 평형 친화도 상수는 전반적으로 동일한 순서이지만, 모체 뮤린 항체와 비교하여 약간 더 높은 반면 (도 13f-g), 인간화 27 및 CH27의 최대 결합 용량은 뮤린 mAb와 비교하여 더 크다. 이 결과는 인간화 과정의 성공적인 결과를 시사한다.

실시예 11. 인간화 FG27 mAb의 직접적인 세포 사멸

인간 IgG1 27 키메라 (27IgG1)의 직접적인 세포 사멸을 향상시키기 위해, 본 발명자들은 선택된 mIgG3 불변 영역 잔기를 IgG1 Fc 도메인으로 전달시켜 개선된 시험관내 직접적인 세포 사멸 능력을 가진 개선된 'i27G1' 루이스Y 글리칸 결합 mAb를 생성하였다.

도 14는 개선된 i27G1의 직접적인 세포 사멸, 기능적 친화도 및 이펙터 기능을 나타낸다. mIgG3 27 항체는 루이스^y-발현 MCF7 (도 14i) 및 AGS 세포주 (도 14ii)에 대한 직접적인 세포 사멸 능력을 갖는 반면 키메라 27IgG1은 그렇지 않다. 선택된 mIgG3 불변 영역 잔기를 포함하는 본 발명의 i27G1은 MCF7 (도 14i) 및 AGS (도 14ii) 둘 모두에서 27mG3 mAb와 동등한, 27IgG1과 비교하여 유의하게 개선된 직접적인 세포 사멸을 나타낸다. 또한, i27G1은 27IgG1과 비교하여 유의하게 향상된 기능적 루이스^y 친화도를 나타낸다 (도 14iii). 중요하게도, i27G1, ADCC 및 CDC의 이펙터 기능은 모두 MCF7에 대한 27IgG1의 기능과 동일하였다 (도 14iv 및 14v). 종합적으로, 결과는 mIgG3 불변 영역으로부터 27IgG1 백본으로 선택된 영역의 전달이 직접적인 세포 사멸 능력, 증가된 기능적 친화도 및 강력한 면역 이펙터 기능을 갖는 하이브리드 mAb를 생성했음을 나타낸다.

실시예 12. 'iG1' 서열을 단백질 결합 mAb (트라스투주맙)로 전달하면 기능적 친화도가 향상된 암 표적화된 mAb가 생성된다.

암-관련된 단백질을 표적으로 하는 항체의 아미노산 잔기를 변경하면 기능적 친화도가 증가하는지 평가하기 위해, 'iG1' 잔기 (23, 'v1' 및 15, 'v2')가 변경되었고 생성된 '개선된' 항체 변이체의 친화도가 SPR 분석을 통해 결정되었다. 기능적 친화도를 결정하기 위해, 3개의 트라스투주맙 항체 작제물을 3개의 상이한 리간드 밀도에서 HER2-코팅된 칩에 걸쳐 적정하였다. 다중사이클 동역학 분석 (90 nM - 0.37M 농도 범위에서)이 수행되었으며 저밀도 (20RU) 및 고밀도(200RU) 표면 둘 모두에서 WT와 비교하여 iTv1 및 iTv2에 의해 증가된 기능적 친화도가 입증되었다 (도 18a). 이러한 개선은 고밀도 표면에서 더욱 두드러졌으며 주로 오프-레이트 (iTV1의 경우 8.5 x 10^-8 1/s 및 iTv2의 7.4 x 10^-8 1/s 대 WT의 경우 6.0 x10^-7 1/s)의 감소에 의해 주도되었다. HEK293-발현된 야생형 트라스투주맙 (WT) 및 '개선된' 변이체 (iTv1 및 iTv2)는 HER2 발현 세포주 SKBR3 및 BT474에 대해 높은 결합을 제공하고 MDA-MB231 및 SKOV3에 대한 낮은 내지 중간 결합을 제공했다 (도 18b). iTv1 및 iTv2에 의한 더 많은 친화성 결합이 차등적인 세포독성을 초래하는지 여부를 평가하기 위해, MDA-MB231에 대한 증식 억제 및 BT474에 대한 PI 흡수를 조사하였다. iTv2는 MDA-MB231에 대한 WT와 비교하여 유의하게 개선된 증식 억제를 나타냈으며 (도 18c), iTv1 및 iTv2는 둘 모두 WT와 비교하여 BT474 세포에서 개선된 PI 흡수를 나타내었으며, 시험된 최고 농도에서 가장 두드러졌다 (도 18d). HER2 코팅된 ELISA 플레이트 상의 직접적으로 HRPO-표지된 mAb의 적정은 WT에 비해 iTv2에 의한 개선된 결합을 나타내었다. 종합적으로, 결과는 'iG1' 조작된 트라스투주맙 작제물에 의해 개선된 기능적 친화도를 나타내며, 이는 본 발명의 접근법이 글리칸 표적에 추가로 단백질-표적 mAb에도 도움이 될 수 있음을 시사한다. 그러나 본 발명의 엔지니어링 접근법의 최종 결과는 표적 밀도와 결합된 mAb의 복잡한 결합력 간의 상호 작용에 의존한다.

구현예

본 발명의 특정 구현예가 아래에 기술된다. 하기 구현예의 다양한 특징은 다른 구현예의 특징과 조합될 수 있으며, 예를 들어, 서열 모티프와 같은 구조적 특징은 청구된 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 기능적 특징과 조합될 수 있다.

1. 면역글로불린의 Fc-영역 및 결합 영역의 하나 이상의 잔기를 포함하는 변형된 IgG1 항체 또는 이의 항원-결합 단편으로서, 여기서, 상기 Fc-영역의 하나 이상의 잔기는 마우스 IgG3 항체로부터 상응하는 잔기로 변형되고, 상기 변형된 IgG1 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 야생형 Fc-영역 잔기를 포함하는 상응하는 IgG1 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 비교할 때 향상된 기능적 친화도를 갖는, 변형된 IgG1 항체 또는 이의 항원-결합 단편.

2. 구현예 1에 있어서, 상기 변형된 IgG1 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 기능적 친화도는 야생형 Fc-영역 잔기를 포함하는 상응하는 IgG1 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 비교할 때 적어도 약 10% 향상되는, 변형된 IgG1 항체 또는 이의 항원-결합 단편.

3. 구현예 1 또는 구현예 2에 있어서, 상기 변형된 IgG1 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 기능적 친화도는 야생형 Fc-영역 잔기를 포함하는 상응하는 IgG1 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 비교할 때 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90% 또는 적어도 약 100% 향상되는, 변형된 IgG1 항체 또는 이의 항원-결합 단편.

4. 구현예 1 내지 3 중 어느 한 구현예에 있어, 상기 변형된 IgG1 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 야생형 Fc-영역 잔기를 포함하는 상응하는 IgG1 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 비교할 때 향상된 직접적인 세포-사멸을 갖는, 변형된 IgG1 항체 또는 이의 항원-결합 단편.

5. 구현예 4에 있어서, 상기 변형된 IgG1 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 직접적인 세포-사멸은 야생형 Fc-영역 잔기를 포함하는 상응하는 IgG1 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 비교할 때 적어도 약 10% 향상되는, 변형된 IgG1 항체 또는 이의 항원-결합 단편.

6. 구현예 1 또는 구현예 2에 있어서, 상기 변형된 IgG1 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 직접적인 세포-사멸은 야생형 Fc-영역 잔기를 포함하는 상응하는 IgG1 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 비교할 때 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90% 또는 적어도 약 100% 향상되는, 변형된 IgG1 항체 또는 이의 항원-결합 단편.

7. 구현예 1 내지 6 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 Fc-영역의 하나 이상의 잔기는 Q342, P343, E345, N361, Q362, P374, D376으로부터 선택되는, 변형된 IgG1 항체 또는 이의 항원-결합 단편.

8. 구현예 1 내지 7 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 Fc-영역의 하나 이상의 변형된 잔기는 Q342R, P343A, E345T, N361K, Q362K, P374S, D376A로부터 선택되는, 변형된 IgG1 항체 또는 이의 항원-결합 단편.

9. 구현예 1 내지 8 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 Fc-영역의 하나 이상의 잔기는 N286, K288, K290, Q342, P343, E345, L351, T359, N361, Q362, G371, P374, S375, D376, A378로부터 선택되는, 변형된 IgG1 항체 또는 이의 항원-결합 단편.

10. 구현예 1 내지 9 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 Fc-영역의 하나 이상의 변형된 잔기는 N286T, K288W, K290Q, Q342R, P343A, E345T, L351I, T359S, N361K, Q362K, G371N, P374S, S375E, D376A, A378S로부터 선택되는, 변형된 IgG1 항체 또는 이의 항원-결합 단편.

11. 구현예 1 내지 10 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 Fc-영역의 하나 이상의 잔기는 N286, K288, K290, A339, Q342, P343, R344, E345, L351, S354, D356, E357, L358, T359, N361, Q362, K370, G371, Y373, P374, S375, D376, A378로부터 선택되는, 변형된 IgG1 항체 또는 이의 항원-결합 단편.

12. 구현예 1 내지 11 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 Fc-영역의 하나 이상의 변형된 잔기는 N286T, K288W, K290Q, A339P, Q342R, P343A, R344Q, E345T, L351I, S354P, D356E, E357Q, L358M, T359S, N361K, Q362K, K370T, G371N, Y373F, P374S, S375E, D376A, A378S로부터 선택되는, 변형된 IgG1 항체 또는 이의 항원-결합 단편.

13. 구현예 1 내지 12 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 Fc-영역의 하나 이상의 잔기는 N286, K288, K290, E294, Y300, V305, A339, Q342, P343, R344, E345, L351, S354, D356, E357, L358, T359, N361, Q362, K370, G371, Y373, P374, S375, D376, A378로부터 선택되는, 변형된 IgG1 항체 또는 이의 항원-결합 단편.

14. 구현예 1 내지 13 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 Fc-영역의 하나 이상의 변형된 잔기는 N286T, K288W, K290Q, E294A, Y300F, V305A, A339P, Q342R, P343A, R344Q, E345T, L351I, S354P, D356E, E357Q, L358M, T359S, N361K, Q362K, K370T, G371N, Y373F, P374S, S375E, D376A, A378S로부터 선택되는, 변형된 IgG1 항체 또는 이의 항원-결합 단편.

15. 구현예 1 내지 14 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 인간 항체, 인간화 항체 또는 키메라 항체인, 변형된 IgG1 항체 또는 이의 항원-결합 단편.

16. 구현예 1 내지 15 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 IgG1 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 단일특이성 항체, 이중특이적 항체 또는 다중특이적 항체인, 변형된 IgG1 항체 또는 이의 항원-결합 단편.

17. 구현예 16에 있어서, 상기 IgG1 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 제1 중쇄 및 제1 항원-결합 영역, 제2 중쇄 및 제2 항원-결합 영역을 갖는 Fc-영역 포함하는 이중특이적 항체인, 변형된 IgG1 항체 또는 이의 항원-결합 단편.

18. 구현예 16 또는 17에 있어서, 상기 IgG1 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 CD3 항원에 결합하는 이중특이적 항체인, 변형된 IgG1 항체 또는 이의 항원-결합 단편.

19. 모티프 RAXTXXXXXXXXXXXXXXXKKXXXXXXXXXXXSXA를 포함하고 X가 임의의 아미노산인, 변형된 IgG1 항체 또는 이의 항원-결합 단편.

20. 모티프TXWXQXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXRAXTXXXXXIXXXXXXXSXKKXXXXXXXXNXXSEAXS를 포함하고 X가 임의의 아미노산인, 변형된 IgG1 항체 또는 이의 항원-결합 단편.

21. 모티프TXWXQXXXXXXXXXXXXXXAXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXPXXRAQTXXXXXIXXPXEQMSXKKXXXXXXXTXXFSEAXS를 포함하고 X가 임의의 아미노산인, 변형된 IgG1 항체 또는 이의 항원-결합 단편.

22. 모티프TXWXQXXXAXXXXXFXXXXAXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXPXXRAQTXXXXXIXXPXEQMSXKKXXXXXXXTNXFSEAXS를 포함하고 X가 임의의 아미노산인, 변형된 IgG1 항체 또는 이의 항원-결합 단편.

23. 하기 목록으로부터 선택된 임의의 하나 이상의 모티프를 포함하는 변형된 IgG1 항체 또는 이의 항원-결합 단편:

(i) TXWXQ

(ii) RAXTXXXXXI

(iii) SXKKXXXXXXXXNXXSEAXS

(iv) NXXSEAXS

(여기서, X는 임의의 아미노산이다).

24. 면역글로불린의 Fc 영역 및 결합 영역의 하나 이상의 잔기를 포함하는 IgG1 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 직접적인 세포 사멸 능력을 증가시키는 방법으로서, 여기서, 상기 방법은 상기 Fc-영역의 CH2 및/또는 CH3 도메인의 하나 이상의 잔기를 마우스 IgG3 CH2 및/또는 CH3 도메인으로부터의 하나 이상의 상응하는 잔기로 대체하는 단계를 포함하는, 방법.

25. 구현예 24에 있어서, 상기 방법은 Q342, P343, E345, N361, Q362, P374, D376으로부터 선택되는 Fc 영역의 하나 이상의 잔기를 변형시키는 단계를 포함하는, IgG1 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 직접적인 세포 사멸 능력을 증가시키는 방법.

26. 구현예 25에 있어서, 상기 하나 이상의 변형된 잔기는 Q342R, P343A, E345T, N361K, Q362K, P374S, D376A로부터 선택되는, 방법.

27. 구현예 24에 있어서, 상기 방법은 N286, K288, K290, Q342, P343, E345, L351, T359, N361, Q362, G371, P374, S375, D376, A378로부터 선택되는 Fc 영역의 하나 이상의 잔기를 변형시키는 단계를 포함하는, IgG1 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 직접적인 세포 사멸 능력을 증가시키는 방법.

28. 구현예 27에 있어서, 상기 하나 이상의 변형된 잔기는 N286T, K288W, K290Q, Q342R, P343A, E345T, L351I, T359S, N361K, Q362K, G371N, P374S, S375E, D376A, A378S로부터 선택되는, 방법.

29. 구현예 24에 있어서, 상기 방법은 N286, K288, K290, A339, Q342, P343, R344, E345, L351, S354, D356, E357, L358, T359, N361, Q362, K370, G371, Y373, P374, S375, D376, A378로부터 선택되는 Fc 영역의 하나 이상의 잔기를 변형시키는 단계를 포함하는, IgG1 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 직접적인 세포 사멸 능력을 증가시키는 방법.

30. 구현예 29에 있어서, 상기 하나 이상의 변형된 잔기는 N286T, K288W, K290Q, A339P, Q342R, P343A, R344Q, E345T, L351I, S354P, D356E, E357Q, L358M, T359S, N361K, Q362K, K370T, G371N, Y373F, P374S, S375E, D376A, A378S로부터 선택되는, 방법.

31. 구현예 24에 있어서, 상기 방법은 N286, K288, K290, E294, Y300, V305, A339, Q342, P343, R344, E345, L351, S354, D356, E357, L358, T359, N361, Q362, K370, G371, Y373, P374, S375, D376, A378로부터 선택되는 Fc 영역의 하나 이상의 잔기를 변형시키는 단계를 포함하는, IgG1 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 직접적인 세포 사멸 능력을 증가시키는 방법.

32. 구현예 31에 있어서, 상기 하나 이상의 변형된 잔기는 N286T, K288W, K290Q, E294A, Y300F, V305A, A339P, Q342R, P343A, R344Q, E345T, L351I, S354P, D356E, E357Q, L358M, T359S, N361K, Q362K, K370T, G371N, Y373F, P374S, S375E, D376A, A378S로부터 선택되는, 방법.

33. 구현예 1 내지 23 중 어느 한 구현예에 따른 변형된 IgG1 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물.

34. 구현예 33에 있어서, 적어도 하나의 다른 치료제를 추가로 포함하는, 약제학적 조성물.

35. 구현예 33 또는 34에 있어서, 구현예 1 내지 23 중 어느 한 구현예에 따른 변형된 IgG1 항체 또는 이의 항원-결합 단편 및 면역조절제를 포함하는, 약제학적 조성물.

36. 약제로서 사용하기 위한, 구현예 1 내지 23 중 어느 하나의 구현예에 따른 변형된 IgG1 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 구체예 33 내지 35 중 어느 한 구현예에 따른 조성물.

37. 암, 자가면역 질환, 염증성 질환 또는 감염성 질환의 치료에 사용하기 위한, 구현예 1 내지 23 중 어느 한 구현예에 따른 변형된 IgG1 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 구현예 33 내지 35 중 어느 한 구현예에 따른 조성물.

38. 약제학적 유효량의 구현예 1 내지 23 중 어느 한 구현예에 따른 변형된 IgG1 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 구현예 33 내지 35 중 어느 한 구현예에 따른 조성물의 약제학적 유효량을 개체에게 투여하는 단계를 포함하여, 질환을 갖는 개체를 치료하는 방법.

39. 구현예 38에 있어서, 상기 질환이 암, 자가면역 질환, 염증성 질환 및 감염성 질환의 그룹으로부터 선택되는, 개체를 치료하는 방법.

40. 구현예 38 또는 39에 있어서, 상기 방법은 추가 치료제를 개체에게 투여하는 단계를 추가로 포함하여, 개체를 치료하는 방법.

41. 구현예 40에 있어서, 상기 추가 치료제는 면역조절제인, 개체를 치료하는 방법.

42. 구현예 1 내지 23 중 어느 한 구현예에 따른 변형된 IgG1 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 구현예 33 내지 35 중 어느 한 구현예에 따른 조성물을 포함하는 키트로서, 여기서 상기 변형된 IgG1 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 또는 조성물이 바이알과 같은 하나 이상의 용기에 있는, 키트.

43. 구현예 42에 있어서, 상기 변형된 IgG1 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 조성물은 요법에서 동시, 개별 또는 순차적 사용을 위한 것인, 키트.

44. 질환 치료용 약제의 제조를 위한, 구현예 1 내지 23 중 어느 한 구현예에 따른 변형된 IgG1 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 구현예 33 내지 35 중 어느 한 구현예에 따른 조성물의 용도.

45. 구현예 44에 있어서, 상기 질환은 암, 자가면역 질환, 염증성 질환 또는 감염성 질환인, 용도.

46. Q342, P343, E345, N361, Q362, P374, D376으로부터 선택되는 잔기 위치에서 Fc 영역에 대한 하나 이상의 잔기 변형을 포함하는 변형된 IgG1 항체 또는 이의 항원-결합 단편.

47. Q342R, P343A, E345T, N361K, Q362K, P374S, D376A로부터 선택되는 Fc 영역에 대한 하나 이상의 변형을 포함하는 변형된 IgG1 항체 또는 이의 항원-결합 단편.

48. N286, K288, K290, Q342, P343, E345, L351, T359, N361, Q362, G371, P374, S375, D376, A378로부터 선택되는 잔기 위치에서 Fc 영역에 대한 하나 이상의 잔기 변형을 포함하는 변형된 IgG1 항체 또는 이의 항원-결합 단편.

49. N286T, K288W, K290Q, Q342R, P343A, E345T, L351I, T359S, N361K, Q362K, G371N, P374S, S375E, D376A, A378S로부터 선택되는 Fc 영역에 대한 하나 이상의 변형을 포함하는 변형된 IgG1 항체 또는 이의 항원-결합 단편.

50. N286, K288, K290, A339, Q342, P343, R344, E345, L351, S354, D356, E357, L358, T359, N361, Q362, K370, G371, Y373, P374, S375, D376, A378로부터 선택되는 잔기 위치에서 Fc 영역에 대한 하나 이상의 잔기 변형을 포함하는 변형된 IgG1 항체 또는 이의 항원-결합 단편.

51. N286T, K288W, K290Q, A339P, Q342R, P343A, R344Q, E345T, L351I, S354P, D356E, E357Q, L358M, T359S, N361K, Q362K, K370T, G371N, Y373F, P374S, S375E, D376A, A378S로부터 선택되는 Fc 영역에 대한 하나 이상의 변형을 포함하는 변형된 IgG1 항체 또는 이의 항원-결합 단편.

52. N286, K288, K290, E294, Y300, V305, A339, Q342, P343, R344, E345, L351, S354, D356, E357, L358, T359, N361, Q362, K370, G371, Y373, P374, S375, D376, A378로부터 선택되는 잔기 위치에서 Fc 영역에 대한 하나 이상의 잔기 변형을 포함하는 변형된 IgG1 항체 또는 이의 항원-결합 단편.

53. N286T, K288W, K290Q, E294A, Y300F, V305A, A339P, Q342R, P343A, R344Q, E345T, L351I, S354P, D356E, E357Q, L358M, T359S, N361K, Q362K, K370T, G371N, Y373F, P374S, S375E, D376A, A378S로부터 선택되는 Fc 영역에 대한 하나 이상의 변형을 포함하는 변형된 IgG1 항체 또는 이의 항원-결합 단편.

54. 도 19에 개시된 서열 중 하나 이상을 포함하는 변형된 IgG1 항체 또는 이의 항원 결합 단편.

55. 도 19에 개시된 바와 같은 중쇄 및 경쇄 서열을 포함하는 변형된 IgG1 항체 또는 이의 항원 결합 단편.

참조문헌

Abdelmoula, M., F. Spertini, T. Shibata, Y. Gyotoku, S. Luzuy, P. H. Lambert, and S. Izui. 1989. 'IgG3 is the major source of cryoglobulins in mice', J Immunol, 143: 526-32.

Ausubel, F.M., R. Brent, R.E. Kingston, D.D. Moore, J.G. Seidman, J.A. Smith, and K. Struhl. 1992. Short protocols in molecular biology : a compendium of methods from Current protocols in molecular biology (Brooklyn, NY : Green Pub. Associates : New York, NY : Wiley).

Azinovic, I., G. L. DeNardo, K. R. Lamborn, G. Mirick, D. Goldstein, B. M. Bradt, and S. J. DeNardo. 2006. 'Survival benefit associated with human anti-mouse antibody (HAMA) in patients with B-cell malignancies', Cancer Immunol Immunother, 55: 1451-8.

Burris, H. A., 3rd, L. S. Rosen, C. M. Rocha-Lima, J. Marshall, S. Jones, R. B. Cohen, L. A. Kunkel, D. Loo, J. Baughman, S. J. Stewart, and N. Lewis. 2010. 'Phase 1 experience with an anti-glycotope monoclonal antibody, RAV12, in recurrent adenocarcinoma', Clin Cancer Res, 16: 1673-81.

Carter, P. J. 2006. 'Potent antibody therapeutics by design', Nat Rev Immunol, 6: 343-57.

Chua, J. X., M. Vankemmelbeke, R. S. McIntosh, P. A. Clarke, R. Moss, T. Parsons, I. Spendlove, A. M. Zaitoun, S. Madhusudan, and L. G. Durrant. 2015. 'Monoclonal Antibodies Targeting LecLex-Related Glycans with Potent Antitumor Activity', Clin Cancer Res, 21: 2963-74.

Cooper, L. J., J. C. Schimenti, D. D. Glass, and N. S. Greenspan. 1991. 'H chain C domains influence the strength of binding of IgG for streptococcal group A carbohydrate', J Immunol, 146: 2659-63.

D'Arcy, C. A., and M. Mannik. 2001. 'Serum sickness secondary to treatment with the murine-human chimeric antibody IDEC-C2B8 (rituximab)', Arthritis Rheum, 44: 1717-8.

Dalziel, M., M. Crispin, C. N. Scanlan, N. Zitzmann, and R. A. Dwek. 2014. 'Emerging principles for the therapeutic exploitation of glycosylation', Science, 343: 1235681.

de Jong, R. N., F. J. Beurskens, S. Verploegen, K. Strumane, M. D. van Kampen, M. Voorhorst, W. Horstman, P. J. Engelberts, S. C. Oostindie, G. Wang, A. J. Heck, J. Schuurman, and P. W. Parren. 2016. 'A Novel Platform for the Potentiation of Therapeutic Antibodies Based on Antigen-Dependent Formation of IgG Hexamers at the Cell Surface', PLoS Biol, 14: e1002344.

DeLano, W. L., M. H. Ultsch, A. M. de Vos, and J. A. Wells. 2000. 'Convergent solutions to binding at a protein-protein interface', Science, 287: 1279-83.

Diebolder, C. A., F. J. Beurskens, R. N. de Jong, R. I. Koning, K. Strumane, M. A. Lindorfer, M. Voorhorst, D. Ugurlar, S. Rosati, A. J. Heck, J. G. van de Winkel, I. A. Wilson, A. J. Koster, R. P. Taylor, E. O. Saphire, D. R. Burton, J. Schuurman, P. Gros, and P. W. Parren. 2014. 'Complement is activated by IgG hexamers assembled at the cell surface', Science, 343: 1260-3.

Durrant, L. G., S. J. Harding, N. H. Green, L. D. Buckberry, and T. Parsons. 2006. 'A new anticancer glycolipid monoclonal antibody, SC104, which directly induces tumor cell apoptosis', Cancer Res, 66: 5901-9.

Eppstein, D. A., Y. V. Marsh, M. van der Pas, P. L. Felgner, and A. B. Schreiber. 1985. 'Biological activity of liposome-encapsulated murine interferon gamma is mediated by a cell membrane receptor', Proc Natl Acad Sci U S A, 82: 3688-92.

Faraj, S., M. Bahri, S. Fougeray, A. El Roz, J. Fleurence, J. Veziers, M. D. Leclair, E. Thebaud, F. Paris, and S. Birkle. 2017. 'Neuroblastoma chemotherapy can be augmented by immunotargeting O-acetyl-GD2 tumor-associated ganglioside', Oncoimmunology, 7: e1373232.

Galluzzi, L., A. Buque, O. Kepp, L. Zitvogel, and G. Kroemer. 2017. 'Immunogenic cell death in cancer and infectious disease', Nat Rev Immunol, 17: 97-111.

Greenspan, N. S., and L. J. Cooper. 1992. 'Intermolecular cooperativity: a clue to why mice have IgG3?', Immunol Today, 13: 164-8.

―――. 1993. 'Cooperative binding by mouse IgG3 antibodies: implications for functional affinity, effector function, and isotype restriction', Springer Semin Immunopathol, 15: 275-91.

Greenspan, N. S., D. A. Dacek, and L. J. Cooper. 1989. 'Cooperative binding of two antibodies to independent antigens by an Fc-dependent mechanism', FASEB J, 3: 2203-7.

Greenspan, N. S., W. J. Monafo, and J. M. Davie. 1987. 'Interaction of IgG3 anti-streptococcal group A carbohydrate (GAC) antibody with streptococcal group A vaccine: enhancing and inhibiting effects of anti-GAC, anti-isotypic, and anti-idiotypic antibodies', J Immunol, 138: 285-92.

Grey, H. M., J. W. Hirst, and M. Cohn. 1971. 'A new mouse immunoglobulin: IgG3', J Exp Med, 133: 289-304.

Hege, K. M., E. K. Bergsland, G. A. Fisher, J. J. Nemunaitis, R. S. Warren, J. G. McArthur, A. A. Lin, J. Schlom, C. H. June, and S. A. Sherwin. 2017. 'Safety, tumor trafficking and immunogenicity of chimeric antigen receptor (CAR)-T cells specific for TAG-72 in colorectal cancer', J Immunother Cancer, 5: 22.

Hernandez, A. M., N. Rodriguez, J. E. Gonzalez, E. Reyes, T. Rondon, T. Grinan, A. Macias, S. Alfonso, A. M. Vazquez, and R. Perez. 2011. 'Anti-NeuGcGM3 antibodies, actively elicited by idiotypic vaccination in nonsmall cell lung cancer patients, induce tumor cell death by an oncosis-like mechanism', J Immunol, 186: 3735-44.

Hovenden, M., M. A. Hubbard, D. P. Aucoin, P. Thorkildson, D. E. Reed, W. H. Welch, C. R. Lyons, J. A. Lovchik, and T. R. Kozel. 2013. 'IgG subclass and heavy chain domains contribute to binding and protection by mAbs to the poly gamma-D-glutamic acid capsular antigen of Bacillus anthracis', PLoS Pathog, 9: e1003306.

Hwang, K. J., K. F. Luk, and P. L. Beaumier. 1980. 'Hepatic uptake and degradation of unilamellar sphingomyelin/cholesterol liposomes: a kinetic study', Proc Natl Acad Sci U S A, 77: 4030-4.

Jawa, V., L. P. Cousens, M. Awwad, E. Wakshull, H. Kropshofer, and A. S. De Groot. 2013. 'T-cell dependent immunogenicity of protein therapeutics: Preclinical assessment and mitigation', Clin Immunol, 149: 534-55.

Klaus, T., and J. Bereta. 2018. 'CH2 Domain of Mouse IgG3 Governs Antibody Oligomerization, Increases Functional Affinity to Multivalent Antigens and Enhances Hemagglutination', Front Immunol, 9: 1096.

Labrada, M., D. Dorvignit, G. Hevia, N. Rodriguez-Zhurbenko, A. M. Hernandez, A. M. Vazquez, and L. E. Fernandez. 2018. 'GM3(Neu5Gc) ganglioside: an evolution fixed neoantigen for cancer immunotherapy', Semin Oncol, 45: 41-51.

Ladenstein, R., U. Potschger, D. Valteau-Couanet, R. Luksch, V. Castel, I. Yaniv, G. Laureys, P. Brock, J. M. Michon, C. Owens, T. Trahair, G. C. F. Chan, E. Ruud, H. Schroeder, M. Beck Popovic, G. Schreier, H. Loibner, P. Ambros, K. Holmes, M. R. Castellani, M. N. Gaze, A. Garaventa, A. D. J. Pearson, and H. N. Lode. 2018. 'Interleukin 2 with anti-GD2 antibody ch14.18/CHO (dinutuximab beta) in patients with high-risk neuroblastoma (HR-NBL1/SIOPEN): a multicentre, randomised, phase 3 trial', Lancet Oncol, 19: 1617-29.

Loo, D., N. Pryer, P. Young, T. Liang, S. Coberly, K. L. King, K. Kang, P. Roberts, M. Tsao, X. Xu, B. Potts, and J. P. Mather. 2007. 'The glycotope-specific RAV12 monoclonal antibody induces oncosis in vitro and has antitumor activity against gastrointestinal adenocarcinoma tumor xenografts in vivo', Mol Cancer Ther, 6: 856-65.

Metheringham, R. L., V. A. Pudney, B. Gunn, M. Towey, I. Spendlove, and L. G. Durrant. 2009. 'Antibodies designed as effective cancer vaccines', MAbs, 1: 71-85.

Miotti, S., D. R. Negri, O. Valota, M. Calabrese, R. L. Bolhuis, J. W. Gratama, M. I. Colnaghi, and S. Canevari. 1999. 'Level of anti-mouse-antibody response induced by bi-specific monoclonal antibody OC/TR in ovarian-carcinoma patients is associated with longer survival', Int J Cancer, 84: 62-8.

Noble, P., I. Spendlove, S. Harding, T. Parsons, and L. G. Durrant. 2013. 'Therapeutic targeting of Lewis(y) and Lewis(b) with a novel monoclonal antibody 692/29', PLoS One, 8: e54892.

Oganesyan, V., M. M. Damschroder, K. E. Cook, Q. Li, C. Gao, H. Wu, and W. F. Dall'Acqua. 2014. 'Structural insights into neonatal Fc receptor-based recycling mechanisms', J Biol Chem, 289: 7812-24.

Pinho, S. S., and C. A. Reis. 2015. 'Glycosylation in cancer: mechanisms and clinical implications', Nat Rev Cancer, 15: 540-55.

Pluckthun, A. 1991. 'Antibody engineering: advances from the use of Escherichia coli expression systems', Biotechnology (N Y), 9: 545-51.

Rabu, C., R. McIntosh, Z. Jurasova, and L. Durrant. 2012. 'Glycans as targets for therapeutic antitumor antibodies', Future Oncol, 8: 943-60.

Reff, M. E. 1993. 'High-level production of recombinant immunoglobulins in mammalian cells', Curr Opin Biotechnol, 4: 573-6.

RodrIguez, E., S. T. T. Schetters, and Y. van Kooyk. 2018. 'The tumour glyco-code as a novel immune checkpoint for immunotherapy', Nat Rev Immunol, 18: 204-11.

Roque-Navarro, L., K. Chakrabandhu, J. de Leon, S. Rodriguez, C. Toledo, A. Carr, C. M. de Acosta, A. O. Hueber, and R. Perez. 2008. 'Anti-ganglioside antibody-induced tumor cell death by loss of membrane integrity', Mol Cancer Ther, 7: 2033-41.

Sambrook, J., E.F. Fritsch, and T. Maniatis. 1989. Molecular Cloning : a laboratory manual (Cold Spring Harbor, N.Y. : Cold Spring Harbor Laboratory, 1989.).

Saphire, E. O., P. W. Parren, R. Pantophlet, M. B. Zwick, G. M. Morris, P. M. Rudd, R. A. Dwek, R. L. Stanfield, D. R. Burton, and I. A. Wilson. 2001. 'Crystal structure of a neutralizing human IGG against HIV-1: a template for vaccine design', Science, 293: 1155-9.

Schroff, R. W., K. A. Foon, S. M. Beatty, R. K. Oldham, and A. C. Morgan, Jr. 1985. 'Human anti-murine immunoglobulin responses in patients receiving monoclonal antibody therapy', Cancer Res, 45: 879-85.

Trill, J. J., A. R. Shatzman, and S. Ganguly. 1995. 'Production of monoclonal antibodies in COS and CHO cells', Curr Opin Biotechnol, 6: 553-60.

Ugurlar, D., S. C. Howes, B. J. de Kreuk, R. I. Koning, R. N. de Jong, F. J. Beurskens, J. Schuurman, A. J. Koster, T. H. Sharp, Pwhi Parren, and P. Gros. 2018. 'Structures of C1-IgG1 provide insights into how danger pattern recognition activates complement', Science, 359: 794-97.

Vanden Berghe, T., N. Vanlangenakker, E. Parthoens, W. Deckers, M. Devos, N. Festjens, C. J. Guerin, U. T. Brunk, W. Declercq, and P. Vandenabeele. 2010. 'Necroptosis, necrosis and secondary necrosis converge on similar cellular disintegration features', Cell Death Differ, 17: 922-30.

Wang, X., M. Mathieu, and R. J. Brezski. 2018. 'IgG Fc engineering to modulate antibody effector functions', Protein Cell, 9: 63-73.

Welt, S., E. A. Carswell, C. W. Vogel, H. F. Oettgen, and L. J. Old. 1987. 'Immune and nonimmune effector functions of IgG3 mouse monoclonal antibody R24 detecting the disialoganglioside GD3 on the surface of melanoma cells', Clin Immunol Immunopathol, 45: 214-29.

Yatim, N., S. Cullen, and M. L. Albert. 2017. 'Dying cells actively regulate adaptive immune responses', Nat Rev Immunol, 17: 262-75.

Zheng, J. Y., H. L. Tan, P. T. Matsudaira, and A. Choo. 2017. 'Excess reactive oxygen species production mediates monoclonal antibody-induced human embryonic stem cell death via oncosis', Cell Death Differ, 24: 546-58.

<110> Scancell Limited <120> Modified Fc-regions to enhance functional affinity of antibodies and antigen binding fragments thereof <130> P125250WO <150> GB1910900.8 <151> 2019-07-31 <160> 44 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Modified Fc motif <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> Xaa can be any amino acid <220> <221> misc_feature <222> (5)..(19) <223> Xaa can be any amino acid <220> <221> misc_feature <222> (22)..(32) <223> Xaa can be any amino acid <220> <221> misc_feature <222> (34)..(34) <223> Xaa can be any amino acid <400> 1 Arg Ala Xaa Thr Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa Xaa Xaa Lys Lys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 20 25 30 Ser Xaa Ala 35 <210> 2 <211> 93 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Modified Fc motif <220> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> Xaa can be any amino acid <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> Xaa can be any amino acid <220> 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actgggtccg ccaggctcca 180 ggaaagggtt tggaatgggt tgctcgcata agaagtaaaa gtaataatta tgcaacatat 240 tatgccgatt cagtgaaaga caggttcacc atatccagag atgattcaca aagcatgctc 300 tatctgcaaa tgaacaactt gaaaaaggag gacacagcca tgtattactg tgtagggtac 360 ggtagtgggg gaaactactg gggtcaagga acctcagtca ccgtctccag cgcttccacc 420 aagggcccat cggtcttccc cctggcaccc tcctccaaga gcacctctgg gggcacagcg 480 gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc cccgaaccgg tgacggtgtc gtggaactca 540 ggcgccctga ccagcggcgt gcacaccttc ccggctgtcc tacagtcctc aggactctac 600 tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc agcagcttgg gcacccagac ctacatctgc 660 aacgtgaatc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga aagttgagcc caaatcttgt 720 gacaaaactc acacatgccc accgtgccca gcacctgaac tcctgggggg accgtcagtc 780 ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca 840 tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac 900 ggcgtggagg tgcatacagc ctggacacag ccccgtgaag agcagtacaa cagtacctac 960 cgagtggtca gtgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa 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31 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr 20 25 30 Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys 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Claims

면역글로불린의 Fc-영역 및 결합 영역의 하나 이상의 잔기를 포함하는 변형된 IgG1 항체 또는 이의 항원-결합 단편으로서, 여기서, 상기 Fc-영역의 하나 이상의 잔기는 마우스 IgG3 항체로부터 상응하는 잔기로 변형되고, 상기 변형된 IgG1 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 야생형 Fc-영역 잔기를 포함하는 상응하는 IgG1 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 비교할 때 향상된 기능적 친화도를 갖는, 변형된 IgG1 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
제1항에 있어서, 상기 변형된 IgG1 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 기능적 친화도는 야생형 Fc-영역 잔기를 포함하는 상응하는 IgG1 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 비교할 때 적어도 약 10% 향상되는, 변형된 IgG1 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 변형된 IgG1 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 야생형 Fc-영역 잔기를 포함하는 상응하는 IgG1 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 비교할 때 직접적인 세포-사멸을 향상시키는, 변형된 IgG1 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
제3항에 있어서, 상기 변형된 IgG1 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 직접적인 세포-사멸은 야생형 Fc-영역 잔기를 포함하는 상응하는 IgG1 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 비교할 때 적어도 약 10% 향상되는, 변형된 IgG1 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Fc-영역의 하나 이상의 잔기는 Q342, P343, E345, N361, Q362, P374, D376으로부터 선택되는, 변형된 IgG1 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Fc-영역의 하나 이상의 변형된 잔기는 Q342R, P343A, E345T, N361K, Q362K, P374S, D376A로부터 선택되는, 변형된 IgG1 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Fc-영역의 하나 이상의 잔기는 N286, K288, K290, Q342, P343, E345, L351, T359, N361, Q362, G371, P374, S375, D376, A378로부터 선택되는, 변형된 IgG1 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Fc-영역의 하나 이상의 변형된 잔기는 N286T, K288W, K290Q, Q342R, P343A, E345T, L351I, T359S, N361K, Q362K, G371N, P374S, S375E, D376A, A378S로부터 선택되는, 변형된 IgG1 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Fc-영역의 하나 이상의 잔기는 N286, K288, K290, A339, Q342, P343, R344, E345, L351, S354, D356, E357, L358, T359, N361, Q362, K370, G371, Y373, P374, S375, D376, A378로부터 선택되는, 변형된 IgG1 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Fc-영역의 하나 이상의 변형된 잔기는 N286T, K288W, K290Q, A339P, Q342R, P343A, R344Q, E345T, L351I, S354P, D356E, E357Q, L358M, T359S, N361K, Q362K, K370T, G371N, Y373F, P374S, S375E, D376A, A378S로부터 선택되는, 변형된 IgG1 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Fc-영역의 하나 이상의 잔기는 N286, K288, K290, E294, Y300, V305, A339, Q342, P343, R344, E345, L351, S354, D356, E357, L358, T359, N361, Q362, K370, G371, Y373, P374, S375, D376, A378로부터 선택되는, 변형된 IgG1 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Fc-영역의 하나 이상의 변형된 잔기는 N286T, K288W, K290Q, E294A, Y300F, V305A, A339P, Q342R, P343A, R344Q, E345T, L351I, S354P, D356E, E357Q, L358M, T359S, N361K, Q362K, K370T, G371N, Y373F, P374S, S375E, D376A, A378S로부터 선택되는, 변형된 IgG1 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
면역글로불린의 Fc-영역 및 결합 영역의 하나 이상의 잔기를 포함하는 IgG1 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 직접적인 세포 사멸 능력을 증가시키는 방법으로서, 여기서, 상기 방법은 상기 Fc-영역의 CH2 및/또는 CH3 도메인의 하나 이상의 잔기를 마우스 IgG3 CH2 및/또는 CH3 도메인으로부터의 하나 이상의 상응하는 잔기로 대체하는 단계를 포함하는, 방법.
제13항에 있어서,상기 방법은 하기로부터 선택된 상기 Fc 영역의 하나 이상의 잔기를 변형시키는 단계를 포함하는, IgG1 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 직접적인 세포 사멸 능력을 증가시키는 방법:
(a) Q342, P343, E345, N361, Q362, P374, D376, 임의로 여기서 상기 하나 이상의 변형된 잔기는 Q342R, P343A, E345T, N361K, Q362K, P374S, D376A로부터 선택됨;
(b) N286, K288, K290, Q342, P343, E345, L351, T359, N361, Q362, G371, P374, S375, D376, A378, 임의로 여기서 상기 하나 이상의 변형된 잔기는 N286T, K288W, K290Q, Q342R, P343A, E345T, L351I, T359S, N361K, Q362K, G371N, P374S, S375E, D376A, A378S로부터 선택됨;
(c) N286, K288, K290, A339, Q342, P343, R344, E345, L351, S354, D356, E357, L358, T359, N361, Q362, K370, G371, Y373, P374, S375, D376, A378, 임의로 여기서 상기 하나 이상의 변형된 잔기는 N286T, K288W, K290Q, A339P, Q342R, P343A, R344Q, E345T, L351I, S354P, D356E, E357Q, L358M, T359S, N361K, Q362K, K370T, G371N, Y373F, P374S, S375E, D376A, A378S로부터 선택됨; 또는
(d) N286, K288, K290, E294, Y300, V305, A339, Q342, P343, R344, E345, L351, S354, D356, E357, L358, T359, N361, Q362, K370, G371, Y373, P374, S375, D376, A378, 임의로 여기서 상기 하나 이상의 변형된 잔기는 N286T, K288W, K290Q, E294A, Y300F, V305A, A339P, Q342R, P343A, R344Q, E345T, L351I, S354P, D356E, E357Q, L358M, T359S, N361K, Q362K, K370T, G371N, Y373F, P374S, S375E, D376A, A378S로부터 선택됨.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 변형된 IgG1 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
제15항에 있어서, 적어도 하나의 다른 치료제를 추가로 포함하고, 임의로 여기서 상기 추가 제제는 면역조절제인, 약제학적 조성물.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 변형된 IgG1 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 약제로서 사용하기 위한 제15항 또는 제16항에 따른 조성물.
암, 자가면역 질환, 염증성 질환 또는 감염성 질환의 치료에 사용하기 위한, 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 변형된 IgG1 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 제15항 또는 제16항에 따른 조성물.
약제학적 유효량의 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 변형된 IgG1 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 제15항 또는 제16항에 따른 조성물을 상기 개체에게 투여하는 단계를 포함하여, 질환을 갖는 개체를 치료하는 방법.
제19항에 있어서, 상기 질환이 암, 자가면역 질환, 염증성 질환 및 감염성 질환의 그룹으로부터 선택되는, 개체를 치료하는 방법.
제19항 또는 제20항에 있어서, 상기 방법은 추가 치료제를 개체에게 투여하는 단계를 추가로 포함하며, 임의로 여기서 추가 치료제는 면역조절제인, 개체를 치료하는 방법.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 변형된 IgG1 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 제15항 또는 제16항에 따른 조성물을 포함하는 키트로서, 여기서 상기 변형된 IgG1 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 또는 조성물은 바이알과 같은 하나 이상의 용기에 있는, 키트.
제22항에 있어서, 상기 변형된 IgG1 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 조성물은 요법에서 동시, 개별 또는 순차적 사용을 위한 것인, 키트.
질환 치료용 약제의 제조를 위한, 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 변형된 IgG1 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 제15항 또는 제16항에 따른 조성물의 용도.
제24항에 있어서, 상기 질환은 암, 자가면역 질환, 염증성 질환 또는 감염성 질환인, 용도.