ES2750960T3

ES2750960T3 - Vacuna de virus de la fiebre porcina africana atenuado

Info

Publication number: ES2750960T3
Application number: ES15733494T
Authority: ES
Inventors: Charles Abrams; Anna-Luisa Reis; Chris Netherton; Linda Dixon; Dave Chapman; Pedro Sanchez-Cordon
Original assignee: Pirbright Institute
Current assignee: Pirbright Institute
Priority date: 2014-06-19
Filing date: 2015-06-19
Publication date: 2020-03-30
Anticipated expiration: 2035-06-19
Also published as: EA201692509A1; US20200129609A1; UA121217C2; EP3157550A1; WO2015193685A1; CN106459931B; US11331383B2; ZA201608257B; HUE045815T2; EP3639849A1; GB201410971D0; EP3157550B1; EA035441B1; CN106459931A; US10507237B2; PL3157550T3; US20170136114A1; AP2016009664A0

Abstract

Un virus de la fiebre porcina africana (ASF) atenuado, en el que se eliminan los siguientes genes o se interrumpen de modo que los genes no se transcriban y/o traduzcan: familia multigénica 360 genes 9L, 10L, 11L, 12L, 13L y 14L; y familia multigénica 505 genes 1R, 2R, 3R y 4R.

Description

DESCRIPCIÓN

Vacuna de virus de la fiebre porcina africana atenuado

Campo de la invención

La presente invención se refiere a virus de la fiebre porcina africana atenuados. Los virus manipulados protegen a los cerdos contra la exposición posterior a virus virulento. La presente invención también se refiere al uso de dichos virus atenuados para tratar y/o prevenir la fiebre porcina africana. La invención se refiere además a la administración intranasal de virus de la fiebre porcina africana atenuados.

Antecedentes de la invención

Fiebre porcina africana (ASF)

La fiebre porcina africana es una enfermedad hemorrágica devastadora de los cerdos domésticos causada por un virus de ADN bicatenario, el virus de la fiebre porcina africana (ASFV). El ASFV es único miembro de la familia Asfarviridae y se replica predominantemente en el citoplasma de las células. Las cepas virulentas de ASFV pueden matar cerdos domésticos en aproximadamente 5-14 desde la infección con una tasa de mortalidad que se aproxima al 100 %.

La ASFV puede infectar y replicarse en facóqueros (Phacochoerus sp.), potamóqueros (Potamocherus sp.) y garrapatas blandas de las especies Ornithodoros, pero en estas especies se observan pocos signos clínicos, si los hay, y pueden establecerse infecciones persistentes a largo plazo. La enfermedad actualmente es endémica en muchos países subsaharianos y en Europa en Cerdeña. Después de su introducción en la región transcaucásica de Georgia en 2007, el ASFV se ha propagado ampliamente a través de países vecinos incluyendo la Federación Rusa. En 2012 se informó del primer brote en Ucrania y en 2013 los primeros brotes en Bielorrusia. En 2014 se informó de brotes adicionales en cerdos de Ucrania y detección en jabalís en Lituania y Polonia.

Actualmente no hay tratamiento para ASF. Se ha intentado la prevención en países fuera de África a nivel nacional mediante restricciones de cerdos y productos porcinos importados, obligatoria cocción de productos de desecho animales con licencia antes de suministrarlo a cerdos y la aplicación de una política de sacrificio cuando se diagnostica la enfermedad. La prevención en África se basa en medidas para mantener a los facóqueros y los materiales contaminados por los facóqueros lejos de la piara.

Hasta la fecha, no se han desarrollado vacunas atenuadas o inactivadas eficaces (véase http://www.thepigsite.com/pighelth/article/441/african-swine-fever-asf).

Por tanto, hay una necesidad de medidas mejoradas para controlar la infección por ASFV y evitar la propagación de la enfermedad.

Virus de la fiebre porcina africana (ASFV)

El genoma de ASFV codifica cinco familias multigénicas (MGF 100, MGF 110, MGF 360 y MGF 505/530) ubicadas dentro de las regiones variables terminales de 35 kb a mano izquierda o 15 kb a mano derecha. Las MGF constituyen entre un 17 y un 25 % de la capacidad codificante total del genoma de ASFV. Carecen de similitud con otros genes conocidos. Aunque la función de los genes MGF individuales es desconocida, se ha demostrado que las familias MGF 360 y 505 codifican genes esenciales para la función del rango de hospedador que implica promover la supervivencia de la célula infectada y suprimir la respuesta de interferón de tipo I.

El aislado OURT88/3

OURT88/3 es un aislado no patógeno de ASFV de Portugal. La infección previa con ASFV OURT88/3 ha demostrado conferir protección contra exposición a virus virulentos relacionados (Boinas et al., (2004) J Gen Virol 85:2177-2187; Oura et al., (2005) J. Gen. Virol. 86:2445-2450).

Se ha demostrado que se requieren linfocitos T CD8+ para la protección inducida por la cepa OURT88/3, ya que la reducción mediada por anticuerpos de los linfocitos T CD8+ anula la protección (Oura et al., 2005, como anteriormente).

Se realizaron estudios usando las líneas de cerdo endogámicas de NIH cc y dd. En estos estudios, se inmunizó un grupo de control de 3 cerdos dd y un grupo de control de 6 cerdos dd con OURT88/3. En el primero de estos experimentos, después de la inmunización con OURT88/3 un cerdo dd desarrolló una baja viremia transitoria de log10 2-3 de TCID 50/ml, pero nada de fiebre o signos clínicos de la enfermedad. Se observó que 3 de 6 de los cerdos endogámicos cc inmunizados con OURT88/3 no estaban protegidos después de exposición mortal con aislado OURT88/3, mientras que se indujeron respuestas protectoras en todos los cerdos dd. Estos resultados indican que el fondo genético del cerdo influye en la respuesta a la inoculación de OURT88/3.

En experimentos posteriores, se inmunizaron 5 cerdos dd y 5 cc con OURT88/3 y se expusieron a OURT88/1 (Takamatsu et al., 2003 resultados no publicados). Esto confirmó que se inducían respuestas protectoras en todos los cerdos dd, pero no se inducían en todos los cerdos cc después de inmunización con OURT88/3 y que se inducían reacciones adversas incluyendo pirexia transitoria, inflamación articular y cojera en algunos de los cerdos cc.

Se realizaron experimentos posteriores en Francia usando la piara Anses de cerdos SPF. En estos cerdos, similares a las observaciones con cerdos cc, algunos cerdos desarrollaron reacciones adversas incluyendo fiebre transitoria, inflamación articular y cojera después de inmunización con OURT88/3 (resultados no publicados).

Aunque se ha demostrado que OURT88/3 induce una respuesta inmunitaria protectora en determinados animales, este efecto no parece ser universal. La inmunización con OURT88/3 parece ser ineficaz en proteger algunos cerdos de la exposición posterior. También está asociada con la inducción de respuestas inmunitarias adversas, tales como inflamación articular en algunos cerdos.

Dixon et al., (Developments in Biologicals; 2013; vol. 135; 147-157) describe el desarrollo de vacunas de virus de la fiebre porcina africana y describe que cerdos inmunizados con aislados naturales de baja virulencia o virus atenuados producidos por pase en cultivo tisular y por eliminaciones génicas dirigidas pueden protegerse contra la exposición a virus virulentos. King et al., (Vaccine; 2011; 29; 4593-4600) describe que la inmunización experimental de cerdos con el aislado OURT88/3 de genotipo I avirulento de Portugal seguido del aislado OURT88/1 de genotipo I virulento muy relacionado podía conferir protección contra la exposición a aislados virulentos de África, incluyendo el aislado Benin 97/1 de genotipo I y el aislado Uganda 1965 de genotipo X. Chapman et al., (Journal of General Virology; 2008; 89; 397-408) describe una comparación de las secuencias genómicas del aislado no patógeno de Portugal, OURT88/3, y un aislado altamente patógeno de África occidental, Benin 97/1, con el de un aislado adaptado a cultivo tisular, BA71V.

Por lo tanto, hay una necesidad de candidatos de vacuna de ASFV alternativos con eficacia y perfiles de seguridad mejorados.

Descripción de las figuras

Figura 1 - Diagrama esquemático que muestra la generación de virus recombinante BeninAMGF con la eliminación de cinco genes MGF 360 10L, 11L, 12L, 13L, 14L y la eliminación de tres genes MGF 505 1R, 2R, 3R. El virus recombinante BeninAMGF se creó mediante la recombinación homóloga entre el gen MGF 360 9L y el gen MGF 505 4R y el genoma Benin 97/1 de tipo silvestre y el plásmido de vector de transferencia pAMGFGUS produciendo la eliminación de los ochos genes MGF y la inserción del gen marcador GUS.

Figura 2 - Análisis de eliminaciones génicas de ADN vírico genómico e inserciones por PCR. Se extrajo el ADN vírico de Benin 97/1 de tipo silvestre y el virus recombinante Benin AMGF. Se amplificaron fragmentos específicos por PCR y los productos se analizaron en un gel de TAE de agarosa al 1 %. Se usaron los siguientes conjuntos de cebadores en el carril 1 (BeninD8F y BeninD8R), los carriles 2 y 3 (BeninD8F y RGUS), los carriles 4 y 5 (BeninD8INTF y BeninD8lNT). El carril 0 contiene una escala de ADN.

Figura 3 - Análisis de la secuencia de ADN del virus recombinante BeninAMGF en el sitio de eliminación/inserción en comparación con la secuencia publicada de Benin 97/1 de tipo silvestre. Se aisló el ADNg vírico de células infectadas por BeninAMGF y el flanco izquierdo de la eliminación/inserción se secuenció con el cebador 9LF y el flanco derecho se secuenció con el cebador 4RR.La secuencia de flanco izquierdo de BeninAMGF muestra la inserción de secuencias del promotor vp72, loxP y el gen GUS 5' y la eliminación de ocho genes MGF y la eliminación de los primeros cinco nucleótidos del gen MGF 3609L que incluye el codón de inicio ATG. La secuencia del flanco derecho de BeninAMGF muestra la inserción del gen GUS 3' y la eliminación de los primeros siete nucleótidos del gen MGF 5054R, que incluye el codón de inicio ATG.

Figura 4 - Cinética de replicación de los virus Benin 97/1 y recombinante BeninAMGF. Se infectaron macrófagos de médula ósea de cerdo a alta multiplicidad de infección con los virus original BeninA97/1 o recombinante BeninAMGF. A distintas horas después de la infección, como se indica en el eje de abscisas, se recogió el virus total y se tituló el virus infeccioso en placas de 96 pocillos por análisis de hemoadsorción en cultivos de macrófagos de médula ósea de cerdo. El título del virus (HAD⁵⁰/ml) es la media de tres observaciones individuales.

Figura 5 - Puntuaciones clínicas después de la primera inoculación. Puntuaciones clínicas (eje de ordenadas) de cerdos individuales en diferentes días (eje de abscisas) después de la inoculación. Los cerdos 16, 18, 19 y 20 se inocularon con 10⁴TCID50 de virus OURT88/3. Los cerdos 21, 22, 23 se inocularon con 10²HAD50 de virus BeninAMGFA2. Los cerdos 24 y 25 se inocularon con 10²HAD50 de virus BeninAMGFA1. Sistema de puntuación clínica diseñado por King et al., 2011.

Figura 6 - Temperaturas después de la primera inoculación. Temperaturas (eje de ordenadas) de cerdos individuales en diferentes días (eje de abscisas) después de la inoculación. Los cerdos 16, 18, 19 y 20 se inocularon con virus OURT88/3. Los cerdos 21, 22, 23 se inocularon con virus BeninAMGFA2. Los cerdos 24 y 25 se inocularon con virus BeninAMGFA1.

Figura 7 - Ensayos de ELISPOT de IFN-y. Se estimularon células mononucleares de sangre periférica recogidas en el días 20 después de la inoculación ex vivo con medio en solitario, OURT88/3 o BeninAMGF. Los resultados se muestran como producción de IFN-y por 10⁶linfocitos (eje de ordenadas) y número de cerdo (eje de abscisas). Manchas por 10⁶células producidas por PBMC purificadas en el día 20 después de la inoculación con OUR T88/3 (cerdos l6 a 20) o BeninAMGF (cerdos 21 a 25) en un ELIspot de IFNy porcino. Las barras de error representan la desviación típica de la media de pocillos duplicados. La dilución 1 contenía dos veces las células de la dilución 2.

Figura 8 - Puntuaciones clínicas después de la inoculación de refuerzo. Puntuaciones clínicas (eje de ordenadas) de cerdos individuales en diferentes días (eje de abscisas) después de la inoculación de refuerzo. Los cerdos 16, 18, 19 y 20 se inocularon de refuerzo con 10⁴TCID50 de virus OURT88/3. Los cerdos 21,22, 23 se inocularon de refuerzo con 10⁴HAD50 de virus BeninAMGFA2. Los cerdos 24 y 25 se inocularon de refuerzo con 10⁴TCID50 de virus BeninAMGFA1.

Figura 9 - Temperaturas después de la inoculación de refuerzo. Temperaturas (eje de ordenadas) de cerdos individuales en diferentes días (eje de abscisas) después de la inoculación. Los cerdos 16, 18, 19 y 20 se inocularon con 10⁴TCID50 de virus OURT88/3. Los cerdos 21, 22, 23 se inocularon con 10⁴HAD50 de virus BeninAMGFA2. Los cerdos 24 y 25 se inocularon con 10⁴HAD50 de virus BeninAMGFA1.

Figura 10 - Puntuaciones clínicas de cerdos después de exposición a Benin 97/1. Los cerdos de los grupos 1 (cerdos 21,22, 23), grupo 2 (cerdos 24, 25), grupo 3 (cerdos 16, 18, 19, 20) y un grupo 4 no vacunado (cerdos 26, 27, 28) se expusieron a 10⁴HAD50 de virus Benin 97/1 y las puntuaciones clínicas (eje de ordenadas) se registraron en diferentes días (eje de abscisas) después de la exposición.

Figura 11 - Temperaturas de cerdos después de exposición a Benin 97/1. Los cerdos de los grupos 1 (cerdos 21,22, 23), grupo 2 (cerdos 24, 25), grupo 3 (cerdos 16, 18, 19, 20) y un grupo 4 no vacunado (cerdos 26, 27, 28) se expusieron a 10⁴HAD50 de virus Benin 97/1 y las temperaturas (eje de ordenadas) se registraron en diferentes días (eje de abscisas) después de la exposición.

Figura 12 - Resultados de tasas de supervivencia para los cuatro grupos de cerdos. El eje de ordenadas muestra el porcentaje de cerdos que sobrevivieron después de la inoculación inicial (día 0), la inoculación de refuerzo (día 25) y la exposición (día 46) con virus virulento Benin 97/1. Grupos 1 y 2 ★ , Grupo 3 • , Grupo 4 D

Figura 13 - Ensayos de ELISPOT de IFN-y. Se estimularon células mononucleares de sangre periférica o células de homogeneizado de bazo aisladas en el día 63 después de la primera inoculación ex vivo con medio en solitario o virus Benin 97/1. Los resultados se muestran como producción de IFN-y por 10⁶linfocitos (eje de ordenadas) y número de cerdo (eje de abscisas).

Figura 14 - Porcentaje de linfocitos totales en circulación en muestras de sangre periférica (en comparación con el día 0) recogidas en diferentes días después de la infección (eje de abscisas) de cerdos infectados con OURT88/3 (cerdos 16 a 20) o BeninAMGF (cerdos 21 a 25).

Figura 15 - Porcentaje de células CD4+ en circulación en muestras de sangre periférica (en comparación con el día 0) recogidas en diferentes días después de la infección (eje de abscisas) de cerdos infectados con OURT88/3 (cerdos 16 a 20) o BeninAMGF (cerdos 21 a 25).

Figura 16 - Porcentaje de células CD8+ totales en circulación en muestras de sangre periférica (en comparación con el día 0) recogidas en diferentes días después de la infección (eje de abscisas) de cerdos infectados con OURT88/3 (cerdos 16 a 20) o BeninAMGF (cerdos 21 a 25).

Figura 17 - Porcentaje de células CD8+CD4-YÓTCR- (CD8 únicamente) en circulación en muestras de sangre periférica (en comparación con el día 0) recogidas en diferentes días después de la infección (eje de abscisas) de cerdos infectados con OURT88/ 3 (cerdos 16 a 20) o BeninAMGF (cerdos 21 a 25).

Figura 18 - Porcentaje de células CD8+/CD3- en circulación en muestras de sangre periférica (en comparación con el día 0) recogidas en diferentes días después de la infección (eje de abscisas) de cerdos infectados con OURT88/3 (cerdos 16 a 20) o BeninAMGF (cerdos 21 a 25).

Figura 19 - Porcentaje de células gamma delta en circulación en muestras de sangre periférica (en comparación con el día 0) recogidas en diferentes días después de la infección (eje de abscisas) de cerdos infectados con OURT88/3 (cerdos 16 a 20) o BeninAMGF (cerdos 21 a 25).

Figura 20 - Porcentaje de células gamma delta/CD8+ en circulación en muestras de sangre periférica (en comparación con el día 0) recogidas en diferentes días después de la infección (eje de abscisas) de cerdos infectados con OURT88/3 (cerdos 16 a 20) o BeninAMGF (cerdos 21 a 25).

Figura 21 - Temperaturas de cerdos del ejemplo 6 grupos A, B, C, D, E, F en diferentes días después de la inmunización y la exposición y de un grupo de control G después de la exposición.

Figura 22 - Las temperaturas medias de todos los cerdos en los grupos A a F del ejemplo 6 después de inmunización y exposición se muestran en el panel A. El panel B muestra las temperaturas medias de los cerdos supervivientes en los grupos A a F y el panel C las temperaturas de los no supervivientes.

Figura 23 - Puntuaciones clínicas de cerdos del ejemplo 6 grupos A, B, C, D, E, F en diferentes días después de la inmunización y la exposición y de un grupo de control G después de la exposición.

Figure 24 - Se muestran las puntuaciones clínicas medias de todos los cerdos del ejemplo 6 grupos A a F después de la inmunización y la exposición en el panel A. El panel B muestra las temperaturas medias de los cerdos supervivientes en los grupos A a F y el panel C las temperaturas de los no supervivientes.

Figura 25 - Puntuación de lesiones observadas en la necropsia para diferentes grupos de cerdos del ejemplo 6. Se muestran las puntuaciones medias para varias lesiones observadas en diferentes grupos de A a F. El panel A muestra las puntuaciones de lesiones macroscópicas, el panel B de lesiones pulmonares y el panel C de lesiones cutáneas y musculoesqueléticas.

Figura 26 - Inducción de ARNm de IFN-p por diferentes aislados de ASFV en macrófagos alveolares porcinos primarios.

Figura 27 - Sombreado en gris está la secuencia del gen DP148R que se eliminó del genoma de ASFV. Los codones de inicio y parada se muestran en negrita. Las secuencias usadas para amplificar las regiones flanqueantes izquierda y derecha están subrayadas. Las secuencias amplificadas están entre estos cebadores. Figura 28 - Curvas de crecimiento de Benin97/1, BeninADP148R y BeninAMGF en macrófagos alveolares porcinos. Figura 29 - Temperaturas de cerdos inmunizados con BeninAMGF a dosis HAD50 de 10²(A), 10³(B) y 10⁴(C) usando la vía IM, 10³HAD50 usando la vía intranasal (D) y BeninADP148R a 10³HAD50 usando la vía IM (E), en diferentes días después de la inmunización y la exposición y de un grupo de control (F) después de la exposición. Figura 30 - Puntuaciones clínicas de cerdos de los grupos A a E como se describe en la figura 29 en diferentes días después de la inmunización y la exposición y de un grupo de control (F) después de la exposición.

Figura 31 - Temperaturas medias de todos los cerdos de los grupos A a E como se describe en la figura 29 después de la inmunización y la exposición.

Figura 32 - Puntuaciones clínicas medias de todos los cerdos de los grupos A a E como se describe en la figura 29 después de la inmunización y la exposición

Sumario de aspectos de la invención

Los autores de la presente invención han descubierto sorprendentemente que la eliminación de cinco genes de la familia multigénica (MGF) 360 10L, 11L, 12L, 13L, 14L y tres genes MGF 5051R, 2R, 3R del extremo a mano izquierda del genoma del virus de ASF y la interrupción de dos genes adicionales (MGF360 9L y MGF 505 4R) provocó la atenuación de un virus virulento y la inducción de un 100 % de protección contra la exposición a virus virulento ASFV precursor.

Por tanto, en un primer aspecto, la presente invención proporciona un virus de la fiebre porcina africana (ASF) atenuado en el que están eliminados o están interrumpidos los siguientes genes de modo que el gen no se transcriba y/o traduzca:

familia multigénica 360 genes 9L, 10L, 11L, 12L, 13L y 14L; y

familia multigénica 505 genes 1R, 2R, 3R y 4R.

Los siguientes genes pueden eliminarse:

familia multigénica 360 genes 10L, 11L, 12L, 13L y 14L; y

familia multigénica 505 genes 1R, 2R y 3R.

Los siguientes genes pueden interrumpirse de modo que el gen no se transcriba y/o traduzca:

familia multigénica 360 gen 9L; y

familia multigénica 505 gen 4R.

Los autores de la invención también han descubierto sorprendentemente que la eliminación de únicamente un gen, concretamente el gen DP148R, de una región cercana al extremo derecho del genoma de Benin97/1 virulento, provocaba la atenuación de un virus virulento y no reduce la replicación del virus en macrófagos. Un grupo de 5 cerdos inmunizados con BeninADP148R por vía intramuscular con l0³unidades de HAD50 desarrolló una fiebre transitoria y pérdida de apetito durante 1 o 2 días en el día 5 después de la inmunización. No se observaron signos clínicos adicionales después de 21 tras el refuerzo o en la exposición 42 días después de la primera inmunización. Los 5 cerdos sobrevivieron a la exposición.

Por consiguiente, en este documento se describe un virus de la fiebre porcina africana (ASF) atenuado que carece de una versión funcional del gen DP148R. El gen puede estar parcial o completamente eliminado, o interrumpido. La mutación DP148R también puede hacerse en combinación con la mutación de los genes de la familia multigénica 360 9L, 10L, 11L, 12L, 13L y i 4l y los genes de la familia multigénica 505 1R, 2R, 3R y 4R como se describe en este documento. Por lo tanto, en este documento se describe un virus de la fiebre porcina africana (ASF) atenuado que carece de una versión funcional de los siguientes genes:

familia multigénica 360 genes 9L, 10L, 11L, 12L, 13L y 14L;

familia multigénica 505 genes 1R, 2R, 3R y 4R; y

DP148R.

El virus puede obtenerse de un aislado de virus ASFV virulento. En otras palabras, el genoma del virus atenuado de la invención (distinto de los genes MGF 360 9L, 10L, 11L, 12L, 13L y 14L, y los genes MGF 505 1R, 2R, 3R y 4R; y/o DP148R) puede corresponder al genoma de un aislado de virus ASFV virulento. El virus atenuado de la invención puede prepararse eliminando/interrumpiendo los genes: genes MGF 360 9L, 10L, 11L, 12L, 13L y 14L y genes MGF 505 1R, 2R, 3R y 4R; y/o DP148R; de un aislado de virus ASFV virulento.

El virus puede obtenerse de uno de los siguientes aislados de virus ASFV virulento: Georgia 2007/1, Benin 97/1, Kenyan, Malawi Lil20/1, Pretorisuskop/96/4 y Tengani 62.

El virus puede obtenerse de Benin 97/1.

El virus de ASF atenuado, cuando se administra a un sujeto, puede inducir una respuesta inmunitaria que es protectora contra la posterior exposición a virus de ASF virulento.

El virus de ASF atenuado, cuando se administra a un sujeto, puede inducir una respuesta inmunitaria mediada por linfocitos T reducida en comparación con la respuesta inmunitaria inducida por el virus atenuado OURT88/3. La respuesta inmunitaria puede implicar un número inferior de linfocitos y§T positivos CD8+

En un segundo aspecto, loa presente invención proporciona una vacuna que comprende un virus de ASF atenuado de acuerdo con el primer aspecto de la invención.

La vacuna puede comprenden una pluralidad de virus de ASF atenuados de diferentes genotipos.

En un tercer aspecto, la presente invención proporciona una vacuna de acuerdo con el segundo aspecto de la invención para su uso en el tratamiento y/o la prevención de la fiebre porcina africana. La vacuna puede inducir una respuesta inmunitaria de protección cruzada contra una pluralidad de genotipos de virus de ASF.

En un cuarto aspecto, la presente invención proporciona un método de atenuación de un virus de la fiebre porcina africana (ASF), que comprende la etapa de eliminar los siguientes genes, o interrumpir los siguientes genes de modo que el gen no se transcriba y/o traduzca:

familia multigénica 360 genes 9L, 10L, 11L, 12L, 13L y 14L; y

familia multigénica 505 genes 1R, 2R, 3R y 4R.

Los siguientes genes pueden eliminarse:

familia multigénica 360 genes 10L, 11L, 12L, 13L y 14L; y

familia multigénica 505 genes 1R, 2R y 3R.

familia multigénica 360 gen 9L; y

familia multigénica 505 gen 4R.

También se describe en este documento un método de atenuación de un virus de la fiebre porcina africana (ASF), que comprende la etapa de eliminar parcial o completamente, o interrumpir la expresión del gen DP148R.

En este documento se describe además un método para tratar y/o prevenir la fiebre porcina africana en un sujeto, que comprende la etapa de administrar al sujeto una cantidad eficaz de una vacuna de acuerdo con el segundo aspecto de la invención.

El sujeto puede ser, por ejemplo, un cerdo doméstico.

La vacuna puede administrarse siguiendo una pauta de sensibilización-refuerzo.

El virus manipulado BeninAMGF de la presente invención tiene varias ventajas sobre OURT88/3, por ejemplo:

• Es eficaz en inducir una respuesta inmunitaria protectora en mayor proporción de cerdos que OURT88/3

• Tiene un perfil de seguridad mejorado en comparación con OURT88/3 y no induce reacciones inmunológicas adversas tales como inflamación articular.

• Es más eficaz y tiene eficacia a una dosis inferior que OURT88/3

• Induce un "mejor" tipo de respuesta inmunitaria que OURT88/3, ya que OURT88/3 induce una respuesta de IFNy mucho mayor. BeninAMGF tiene una respuesta mediada por linfocitos T reducida que OURT88/3.

El virus manipulado BeninADP148R descrito en este documento también tiene varias ventajas sobre OURT88/3, por ejemplo:

• Tiene un perfil de seguridad mejorado en comparación con OURT88/3 ya que no se observaron lesiones pulmonares, musculoesqueléticas o macroscópicas en el examen tras la muerte.

• Tiene mayor eficacia que OURT88/3 ya que un 100 % de los cerdos ensayados estaban protegidos contra la exposición a Benin 97/1.

Los autores de la presente invención, además, han descubierto sorprendentemente que la administración intranasal de un virus de la fiebre porcina africana (ASF) atenuado provoca protección mejorada y menos efectos secundarios en comparación con la administración mediante la vía intramuscular, y puede requerir una dosis inferior para obtener protección.

Por consiguiente, en este documento también se describe un virus de ASF atenuado para su uso en el tratamiento y/o la prevención de la fiebre porcina africana, en el que el virus atenuado se administra por vía intranasal.

En este documento se describe además un método para tratar y/o prevenir la fiebre porcina africana en un sujeto, que comprende la etapa de administrar una cantidad eficaz de un virus de ASF atenuado al sujeto por vía intranasal. También se describe una vacuna que comprende un virus de ASF atenuado, en la que la vacuna se formula para administración intranasal.

Se proporciona además un kit para el suministro de una formulación de vacuna intranasal, que comprende:

a) una vacuna de virus de ASF atenuado; y

b) un dispositivo de suministro intranasal.

También se describe en este documento un dispositivo de suministro intranasal que comprende una vacuna de virus de ASF atenuado.

EL virus de ASF atenuado puede ser cualquier virus de ASF atenuado, tal como OURT88/13, BeninAMGF o BeninADP148R.

Descripción detallada

VIRUS DE LA FIEBRE PORCINA AFRICANA (ASFV)

El virus de la fiebre porcina africana (ASFV) es el agente causante de la fiebre porcina africana (ASF). El virus causa una fiebre hemorrágica con altas tasas de mortalidad en cerdos, pero infecta de forma persistente a sus hospedadores naturales, facóqueros, potamóqueros sin signos de enfermedad. También infecta garrapatas del género Ornithodoros, que se cree que se usan como portador. ASFV se replica en el citoplasma de células infectadas, y es el único miembro de la familia Asfarviridae. El ASFV es endémico de África subsahariana y existe en estado silvestre mediante un ciclo de infección entre garrapatas y cerdos, potamóqueros y facóqueros. La ASFV se describió por primera vez después de que los colonos europeos trajeran cerdos en zonas endémicas de ASFV y, por tanto, es un ejemplo de una "infección emergente".

El ASFV es un virus de ADN bicatenario, icosaédrico grande con un genoma lineal que contiene al menos 150 genes. El número de genes difiere ligeramente entre diferentes aislados del virus. El ASFV tiene similitudes con los otros virus de ADN grandes, por ejemplo, poxvirus, iridovirus y mimivirus. En común con otras fiebres hemorrágicas víricas, las células diana principales para la replicación son las del linaje de monocitos, macrófagos.

Basándose en la variación de secuencia en la región del extremo C del gen B646L que codifica la proteína principal de la cápsida p72, se han identificado 22 genotipos de ASFV (I-XXII). Todos los genotipos de p72 de ASFV han estado en circulación en África oriental y del sur. El genotipo I ha estado en circulación en Europa, América del sur, el Caribe y África occidental. El genotipo VIII está confinado a cuatro países de África oriental.

Ejemplos de cepas de algunos de los genotipos se dan a continuación:

Genotipo I: OURT88/3; Brazil/79; Lisbon/60; BA715; Pret; Benin 97/1; IC/1/96; IC/576; CAM/82; Madrid/62; Malta/78; ZAR85; Katange63; Togo; Dakar59; Ourt88/1; BEN/1/97; Dom_Rep; VAL/76; IC/2/96; Awoshie/99; NIG/1/99; NIG/1/98; ANG/70; BEL/85; SPEC120; Lisbon/57; ASFV-Warm; GHA/1/00; GAM/1/00; Ghana; HOL/86; NAM/1/80; NUR/90/1; CAM/4/85; ASFV-Teng; Tegani; ASFV-E75.

Genotipo II: Georgia 2007/1

Genotipo III: BOT 1/99

Genotipo IV: ASFV-War; RSA/1/99/W

Genotipo VI: MOZ 94/1

Genotipo VII: VICT/90/1; ASFV-Mku; RSA/1/98

Genotipo VIII: NDA/1/90; KAL88/1; ZAM/2/84; JON89/13; KAV89/1; DEZda; AFSV-Mal; Malawi LIL 20/1 Genotipo IX: UGA/1/95

Genotipo X: BUR/1/84; BUR/2/84; BUR/90/1; UGA/3/95; TAN/Kwh12; HindeII; ASFV-Ken; Virulent ilganda 65. FAMILIAS MULTIGÉNICAS

El ASFV contiene cinco familias multigénicas que están presentes en las regiones variables izquierda y derecha del genoma. Las MGF se nombran seguidas del número promedio de codones presentes en cada gen: MGF100, 110, 300, 360 y 505/530. Las regiones del extremo N de los miembros de MGF 300, 360 y 505/530 comparten similitud significativa entre sí. Varios genes en MGF360 y 505/530 determinan el intervalo de hospedador y la virulencia. Las cinco familias multigénicas del genoma de ASFV (MGF 100, MGF 110, MGF 360 y MGF 505/530) están ubicadas dentro de las regiones variables terminales de 35 kb a mano izquierda o 15 kb a mano derecha. Las MGF constituyen entre un 17 y un 25 % de la capacidad codificante total del genoma de ASFV. Carecen de similitud con otros genes conocidos.

Las secuencias genómicas completas del aislado Benin 97/1 (un virus altamente patógeno de África occidental, grupo 1), el lado OURT88/3 (no patógeno, virus atenuado de Portugal, grupo 1) y el aislado BA71V (virus no patógeno adaptado a cultivo tisular de células Vero, grupo 1) se han comparado (Chapman et al., (2008) J. Gen Virol. 89:397-408). El aislado OURT88/3 tiene una eliminación de 10007 pb en comparación con Benin 97/1 que se prolonga desde el número de nucleótido (nt n.°) 19448 hasta el nt n.° 29525 en el genoma de Benin 97/1. En total, se eliminan cinco genes MGF 360 (10L, 11L, 12L, 13L y 14L) del genoma de OURT88/3. Se eliminan dos genes MGF 505 (1R, 2R) y el gen MGF 505R 3R se trunca en el genoma de OURT88/3. Estos genes están presentes en los genomas de los otros ocho aislados patógenos de ASFV que se han secuenciado.

En el aislado BA71V adaptado a cultivo tisular atenuado, el genoma contiene el gen MGF 505 3R, pero carece de los otros siete genes MGF y además también tiene el gen MGF 3609L truncado (eliminación total de 8250 pb).

Previamente seis genes MGF 360 (9L, 10L, 11L, 12L, 13L y 14L) y dos genes MGF 505 (1R y 2R) se eliminaron del aislado Pr4 de África del Sur altamente patógeno. Esta eliminación redujo notablemente el crecimiento vírico en cultivos celulares de macrófagos primarios de 100 a 1000 veces (Zsak et al., 2001, como anteriormente) y dio lugar a atenuación del virus (citado como resultados no publicados, Afonso et al., 2004 J. Virol 78:1858-1864). Sin embargo, no se realizaron experimentos para exponer los cerdos recuperados para determinar si estaban protegidos. De hecho, en un seminario de virus de fiebre porcina africana en el Biosecurity Research Institute, Manhattan Kansas en mayo de 2011, se mencionó que el mutante de eliminación de Pr4 no era protector e inducía una forma crónica de la enfermedad.

También se ha demostrado que la eliminación de tres genes MGF 360 (12L, 13L y 14L) y cuatro genes MGF 505 (1R, 2R, 3R y truncamiento de 4R) del virus patógeno MalawiADP71 reduce la replicación del virus en cerdos y además atenuaba el virus (Neilan et al., (2002) J. Virol. 76:3095-3104). Sin embargo, de nuevo, no se presentaron experimentos para determinar si los cerdos recuperados estaban protegidos contra la exposición.

El ASFV atenuado de acuerdo con una realización de la presente invención carece de una versión funcional de los siguientes genes:

familia multigénica 360 genes 9L, 10L, 11L, 12L, 13L y 14L; y

familia multigénica 505 genes 1R, 2R, 3R y 4R.

genes en los genomas de una diversidad de cepas de ASFV se proporciona a continuación ;e proporciona la identidad de secuencia de cada gen con el correspondiente gen de Benin 97/1.

Tabla 1a - MGF 360-9L

Cepa Número del nucleótido de Número del nucleótido de % de identidad de inicio parada nucleótidos Benin 97/1 19487 18435 100

Georgia 2007/1 25215 24163 98

BA71V 17495 17057 100

OURT88/3 20355 19937 99

Kenya1950 29478 28424 86

Malawi-Lil/20 23685 22630 86

Mkuzi 1979 26939 25887 99

Pretorisuskop/9( 26016 24958 85

Tengani62 20398 19346 98

Warmbaths 25244 24186 86

Warthog 22020 20962 85

E75 18802 17750 99

Tabla 1b - MGF 360-10L

Cepa Número del nucleótido de inicio Número del nucleótido de % de identidad de parada nucleótidos

Benin 97/1 20677 19607 100

Georgia 2007/1 26438 25368 93

BA71V Eliminado

OURT88/3 Eliminado

Kenya1950 30628 29563 82

Malawi-Lil/20 24802 23763 91

Mkuzi 1979 28139 27069 99 Pretorisuskop/96/4 27186 26116 96

Tengani 62 21600 20530 92

Warmbaths 26361 25322 94

Warthog 23130 22091 95

E75 19981 18911 100

Tabla 1c - MGF 360-11L

Benin 97/1 21764 20703 100

Georgia 2007/1 27526 26465 97

BA71V Eliminado

OURT88/3 Eliminado

Kenya1950 31716 30655 84

Malawi-Lil/20 25892 24831 86

(continuación)

Mkuzi 1979 29225 28164 99

Pretorisuskop/96/4 28275 27214 97

Tengani62 22688 21627 97

Warmbaths 27449 26388 97

Warthog 24218 23157 97

E75 21068 20007 100

Tabla 1d- MGF 360-12L

Cepa Número del nucleótido de Número del nucleótido de % de identidad de inicio parada nucleótidos

Benin 97/1 24668 23616 100

Georgia 2007/1 30434 29382 96

BA71V Eliminado

OURT88/3 Eliminado

Kenya1950 34566 33549 90

Malawi-Lil/20 28731 27682 92

Mkuzi 1979 32125 31073 97

Pretorisuskop/96/4 30098 95

Tengani 62 25592 24540 96

Warmbaths 30346 29294 96

Warthog 27088 26036 96

E75 23971 22920 99

Tabla 1e - MGF 360-13L

Benin 97/1 25901 24840 100

Georgia 2007/1 31656 30595 97

BA71V Eliminado

OURT88/3 Eliminado

Kenya1950 35812 34757 90

Malawi-Lil/20 29980 28925 91

Mkuzi 1979 33347 32286 99

Pretorisuskop/96/4 31307 95

Tengani 62 26814 25753 95

Warmbaths 31559 30498 95

Warthog 28338 27277 95

E75 25204 24143 99

Tabla 1f - MGF 360-14L

Benin 97/1 27146 26073 100

Georgia 2007/1 32913 31840 99

BA71V Eliminado

OURT88/3 Eliminado

Kenya1950 37194 36121 92

Malawi-Lil/20 31266 30193 92

Mkuzi 1979 34620 33547 99

Pretorisuskop/96/4 33598 32525 97

(continuación)

Tengani 62 28056 26983 97

Warmbaths 32820 31747 96

Warthog 29568 28495 97

E75 26449 25376 100

Tabla 1g - MGF 505-1R

Benin 97/1 21971 23566 100

Georgia 2007/1 27734 29329 95

BA71 V Eliminado

OURT88/3 Eliminado

Kenya1950 31904 33496 91

Malawi-Lil/20 26041 27627 93

Mkuzi 1979 29425 31020 96

Pretorisuskop/96/4 28449 30044 94

Tengani 62 22891 24486 95

Warmbaths 27651 29246 95

Warthog 24387 25982 95

E75 21275 22870 100

Tabla 1h - MGF 505-2R

Benin 97/1 27352 28932 100

Georgia 2007/1 33119 34699 99

BA71V 17725 19304 99

OURT88/3 29532 29981 76

Kenya1950 37419 38985 90

Malawi-Lil/20 31541 33121 93

Mkuzi 1979 34826 36406 99

Pretorisuskop/96/4 33795 35374 97

Tengani 62 28261 29830 98

Warmbaths 33029 34597 96

Warthog 29773 31352 97

E75 26655 28236 99

Tabla 1 i - MGF 505-3R

Benin 97/1 29019 29861 100

Georgia 2007/1 34786 35625 96

BA71V 20398 21915 100

OURT88/3 20850 22367 100

Kenya1950 40295 41815 89

Malawi-Lil/20 34322 35842 89

Mkuzi 1979 37500 39017 99

Pretorisuskop/96/4 36480 37985 89

Tengani 62 30926 32443 90

Warmbaths 35712 37232 93

(continuación)

Cepa Número del nucleótido de Número del nucleótido de % de identidad de inicio parada nucleótidos Warthog 32449 33954 90

E75 29330 30847 100

Tabla 1j - MGF 505-4R

Cepa Número del nucleótido de Número del nucleótido de % de identidad de inicio parada nucleótidos Benin 97/1 30026 31543 100

Georgia 2007/1 35796 37316 94

BA71V 20394 21915 100

OURT88/3 20850 22367 100

Kenya1950 40295 41815 89

Malawi-Lil/20 34322 35842 89

Mkuzi 1979 37500 39017 99

Pretorisuskop/96/4 37985 89

Tengani 62 30926 32443 90

Warmbaths 35712 37232 93

Warthog 32449 33954 90

E75 29330 30847 100

Los productos de traducción de estos genes se da a continuación:

SEQ ID NO: 1 - traducción de 360-9L

MVLSLQTLTKKVLASQYPAKCHPHFLKCCGLWWHNGPIMYHQKK

IWTPYFKNGTNLNAALVKAVEENNHDLIELFTEWGANINYGLLSVNTEHTRDLCRGLG

AKEQLNDQEILRFFYTLKRDLTSSNIIFCHEVFSNNPILDTINRFEVKGMIYEQLEGL

MVETDILSEMFTKYWYAMAIEFNLKEAICYFYQRYAHLHRWRLMCALFYNNVFDLHEL

YAKEKVRMDMDEMLRWACRKNYNYLTIYYCCVALGADINQAMFHSIQFYNIGNIFFCI

DLGANAFEEGKTLAHQKDNSFiASMLSLNCYSMNDSLSLKETDPEVIKRMLKDYHSKN

LSIAHKHYINDGFND!

SEQ ID NO: 2 - traducción de 360-10L

MVPSLQSFAKKVLASGHVSIDYHVILERCGLVWVYKAPISLDCKH

MLIKLPNFADGLDLNTALMLATKENNYQLIKMFTDWGADINYGLICANTPPIREFCWE

LGAKYGVDKKK!MH!FFKLIHPNTTSNN!ILCLKFFNDNPFSAYV!IREIKSCIHWKL

KNLAEDTNVLSNISDGDMLTIYCFIVALQDNLREAISYVYQHFKYLNTWWLTCALCYN

KLFDLHNLYEKEKIRMDMDEMMRÍACTKDNNFLTIYYCFiLGANINLAMIASÍRFYNM

DNLFFCIDLGADAFEEAKALAEGGNYYLISHRLSLDIYSPDSSLLTLKEADPNKIYRL

LKNYKSKSMLAYLNYDINDTSL

SEQ ID NO: 3 - traducción de 360-11L

MLPSLQSLTKKVLAGQCVSVDHYHILKCCGLWWHNGPIMLHIRR

NKLFIRSTCFSQGIELNIGLMKAVKENNHDLIKLFTEWGADINYGMICALTENTRDLC

KELGAKEYLEREYILKIFFDTTRDKTSSNIIFCHEVFSNNPNLRIIDNLDLRGEIMWE

LRGLMEITFMLDHDDSFSTVLTKYWYAIAVDYDLKDAIRYFYQKYPRLHRWRLMCALF

YNNVFDLHELYEIERVRMDIDEMMHIACIQDYSYSAIYYCFIMGANINQAMLVSIQNY

NLGNLFFCIDLGANAFEEGKALAEQKENYLIAHALSLKHYNPVISLLSNVMDPEKINY

MLKNYHSINMGIFLDYEQR

SEQ ID NO: 4 - traducción de 360-12L

MLPSLQSLTKKVLAGQCVPTNQHYLLKYYDLWWYNAPÍTFDHNL RLIKSSGlKEGLDLNTALVKAVRENNYSLIKLFTEWGADINYGLVSVNTEHTRDLCQE

LGAKEILNEEEILQIFIDLKFHKTSSNIILCHEVFSNNPILQKVNNLKLRIEIFWELR

ELIEKTDLLNNEFLLSTLLLKYWYAIAVRYSLKEAIQYFYQKYTHMNTWRLTGALCFN

NVFDLHEAYEKDKIHMDIEEMMRIACIKDHNLSTMYYCYMLGANINQAMLTSIQYYNI

ENMFFCMDLGADVFEEGTTALGEGYELIKNlLSLKiYSPTTIPLPKSTDPEIIDHALK NYFSKNMMIFLSYDLR

SEQ ID NO: 5 - traducción de 360-13L

MSLPLSLQTLVKKTVASQGLSIDEHCILKYCGLWWHDAPLKLCM

DRGRIQIKSGFLGEDIDLRVALIIAVKENNYSLIKLFTEWGANINYSLLSINTKHIRE

LCRQLGAKETLEDNDIFRIFTRIMHNKTSGSIILCHEIFMNNPMLENKFVIQLRGLIY

KRLWGLIEIKETDELNDLLVKYWYAKAVQYVCKNAICFLDEKYTDLNEWRLKCLLYYN

KIYELHEMYHKKKVQIDVHDMICLACAKDNNLLTIYYCYALGGNINQAMLTSVQYYNV

GNÍFFCIDLGGNAFEEGRAIAEGKGYNFLSHSLTLDÍYSSDASLPLNLKDPEKiSSLL KDYKSKNLSIiWEYSHNiL

SEQ ID NO: 6 - traducción de 360-14L

MLSLQTLAKKWACNYLSSDYDYTLQRFGLWWDLGPIHLCNNCK

GVFSYKHLQCFSEDDLCLEAALVKAVKSDNLELIRLFVDWGANPEYGLIRVPAVYLKR

LCAELGGLTPVSEPRLLEILKEVANLKSCAGVLLGYDMFCHNPLLETVTRTTLDTVTY

TCSNIPLTGDTAHLLLTKFWFALALRHNFTKAIHYFYKRHKNQLYWRVACSLYFNNIF

DIHELCREKEICISPNLMMKFACLREKNYAAIYYCHRLGASLDYGMNLSIYNNNTLNM

FFCIDLGAADFDRAQLIAHKAYMYNLSNIFLVKGLFSRDVTLVLDVTEPQEIYDMLKT

YTSKNMKRAEEYLTAHPEliVID

SEQ ID NO: 7 - traducción de 505-1R

MFSLQNLCRKTLPDCKLPEFFDDYILQLLGLYWENHGTIQRAGN

NCVLÍQQHTLIPVNEALRIAASEENYEIVGLLLAWEGNLYYAIIGALEGNRYNURKY

DDQIKDHHDILPFIDDPIIFHKCHIMRRCFFDCILYQAVKYSKFRVLLYFKYTLEDDL

PLVHLLIEKACEDHNYEVIKWIYENLHVCHÍIDTFDCAIÁHKDLRLYCLGYTFIYNR!

VPYKYHHLDILILSSLQLLHKVAAKGYLDFILETLKYDHNIDNLDVILTQAATYNHRK

iLTYFIPQSTYAGIEGCLFVAIKTKSSKKTLNLLLSHLNLSIKÜQKISQYVATFNST

NIIGILSMKRKKKIYLDIILTKFVKNAIFNKFWRCMERFSINPERIVKMAARINKMM

LVKKISEHVWKNHAARLKHLKHAVHTMKHKDGKNRLMNFIYEHCYYHMQGEEIFSLAR

FYAlHHAPKLFDVFYNCCILDTiRFKSLLLDCSHIlGKNÁHDÁTNINIVNKYIGNLFA MGVLSKKEILQDYPSIYSKHYMP

SEQ ID NO: 8 - traducción de 505-2R

MFSLQDLCRKHLFÍLPDVFGEHVLGRLGLYWRGHGSLGRIGDDH

ILIRRDLILSTNEALRMAGEEGNNEWKLLLLWKGNLHYAVIGALQGDQYDLIHKYEN

QIGDFHFILPLIQDANTFEKCHALERFCGVSCLLKHATKYNMLPILQKYQEELSMRAY

LHETLFELACLWGRYDVLKWlEQTMHWDLKlMFNiAiSKRDLTMYSLGYiFLFDRGN

TEATLLTQHLEKTAAKGLLHFVLETLKYGGNIDTVLTQAVKYNHRKLLDYFLRQLPRK

HIEKLLLLAVQEKASKKTLNLLLSHLNYSVKRIKKLLRYVIEYESTLVIKILLKKRVN

LIDAMLEKMVRYFSATKVRTIMDELSISPERVIKMAIQKMRTDIVIHTSYVWEDDLER

LTRLKNMVYTIKYEHGKKMLIKVMHGIYKNLLYGEREKVMFHLAKLYVAQNAATQFRD

ICKDCYKLDVARFKPRFKQLILDCLEIVTKKSCYSILEILEKHIISLFTMKVMTEEEK

NLCLEILYKVIHYKTIQC

SEQ ID NO: 9 - traducción de 505-3R

MSSSLQELCRKKLPDCILPEFFDDYVLQLLGLHWQDHGSLQRIE

KNQILVQQEPIHINEALKVAASEGNYEIVELLLSWEADPRYAVVGALESKYYDLVYKY

YDLVKDCHDILPLIQNPETFEKCHELNNPCSLKCLFKHAVIHDMLPILQKYTYFLDGW

EYCNQMLFELACSKKKYEMVVWIEGVLGIGKVTSLFTIAISNRDLHLYSLGHLIILER

MQSCGQDPTFLLNHFLRDVSIKGLLPFVLKTIEYGGSKEIAITLAKKYQHKHILKYFE

TGKC

SEQ ID NO: 10 - traducción de 505-4R

MFSLQDICRKYLFQLPDSFDEYTLQVLGLYWEKHGSLQRIRKDA

VFVQRNLIISINEALRIAASEGNGRVVKLLLSWEGNFHYVIIGALEGDHYDLIHKYGS

QIEDYHMILSSIHNANTFEKCHELSNCDMWCLIQNAIKYNMLPILQKHRNILTHEGEN

QELFEMACEEQKYDIVLWIGQTLMLNEPEFIFDIAFERIDFSLLTMGYSLLFNNKMSS

IDIHDEEDLISLLTEHLEKAATKGCFFFMLETLKHGGNVNMAVLSKAVEYNHRKILDY

FIRQKCLSRKDIEKLLLVAISNSASKKTLNLLLSYLNHSVKNIIGKIVQSVLKNGDFT

IIIFLKKKKINLVEPALIGFINYYYSYCFLEQFIHEFDIRPEKMIKMAARKGKLNMII

EFLNEKYVHKDDLGAIFKFLKNLVCTMKHKKGKETLIVLIHKIYQVIQLETKEKFKLL

RFYVMHDATIQFISMYKDCFNLAGFKPFLLECLDIAIKKNYPDMIRNIETLLKCE

El genoma completo para el aislado patógeno Benin 97/1 del virus de la fiebre porcina africana se da en el sitio Genbank: AM712239.1

A partir del estudio descrito por Chapman et al., (2008 - como anteriormente) se determinó que el genoma completo del aislado BA71 codifica 151 marcos abiertos de lectura (ORF), el aislado Benin 97/1 codifica 157 ORF y el aislado OURT88/3 codifica 151 ORF.

En este documento se describe un ASFV atenuado que carece de una versión funcional del gen DP148R.

La mutación de DP148R puede hacerse por si misma, o en combinación con mutaciones de la familia multigénica 360 genes 9L, 10L, 11L, 12L, 13L y 14L, u la familia multigénica 505 genes 1R, 2R, 3R y 4R como se describe en este documento. Esta combinación de mutaciones génicas puede producir un mejor perfil de seguridad para el virus atenuado.

DP148R está ubicado en la posición genómica 177915 a 178679 en el genoma de Benin 97/1. La secuencia proteínica es: Benin 97/1 177915-178679 - SEQ ID NO: 11

MQNKIPNFNLFFFFLYRMLEÍVLATLLGDLQRLRVLTPQQRAVAFFRANTKELEDFLR

SDGQSEEILSGPLLNRLLEPSCPLDILTGYHLFRQNPKAGQLRGLEVKMLERLYDANI

YNILSRLRPKKVRNKAIELYWVFRAIHICHAPLVLDIVRYEEPDFAELAFICAAYFGEP

QVMYLLYKYMPLTRAVLTDAÍQÍSLESNNGVGICYAYLMGGSLKGLVSAPLRKRLRA

KLRSQRKKKDVLSPHDFLLLLG.

Las secuencias ortólogas de DP148R de otros genomas comparten entre un 74 y un 99 % de identidad de aminoácidos. Los genes de DP148R ortólogos de otros aislados de ASFV están ubicados en las posiciones:

Warthog: 181103 a 181549 - SEQ ID NO: 12

MLERLYDAN¡YN!L.SRLKPEKVRNKAVELYWVFRA!NMCHAPLVLD¡VRYEEPDFAEL

AFICAAYFGEPQVMYLLYKYMPLTRAVLTDAIQiSLESNSGVGICYAYLMGGSLKGLV RAPLRKRLRAKLRSQRKKKDVLPPHDFLLLLG

Kenya: 189417 a 189872 - SEQ ID NO: 13

MLERLYDANIYNMLARLRPELVRDKAÍELYWLFRAILMCHSPLVLEIVRHETMDFAET

AFÍCAAYFSEPQVMYALYKFIPISRAVLADAIQMCLESNSEAGICYAYLMGGSLKGKV

PGSLRKRLRASPLRGERKKKNVLPPHEFLLMLHGi

Malawi LIL20/1: 183687 a 184346 - SEQ ID NO: 14

MQRAVAFFRVNTKELEDFLYPDGQSEELLPGLLLNRLLEPSGPIDILTGYHLFRENPK

AGRLRGLEVKLLERLYDANIYNMLAQiRPELVR!KAIELYWLFRAILMCHSPLVLE!VRH ETMDFAELAFICAAYFSEPGVMYALYKFiPISRAVLADAIEMSLESNSETGiCYAYLMG GSLKGKVPGPLRKRLRASPLRGERKKKNVLPPHEFLLMLHG1

Mkuzi: 185751 a 186515 - SEQ ID NO: 15

MGNKIPNFNLFFFFLYRMLEIVLATLLGDLQRLRVLTPQQRAVAFFRANTKELEDFLC

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Pretoriskup: 185416 a 185862 - SEQ ID NO: 16

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Tengani: 180112 a 180558 - SEQ ID NO: 17

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Warmbaths: 184606 a 185052 - SEQ ID NO: 18

MLERLYDANIYNILSRLRPEKVRNKAIELYWVFRAIHICHAPLVLDIVRYEEPDFAELAF

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OURT88/3: 169146 a 169592 - SEQ ID NO: 19

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AISLADOS DE VIRUS DE ASF

El virus de ASF atenuado de la presente invención puede obtenerse de un aislado de virus de ASF de tipo silvestre, pero incluye mutaciones en su genoma de modo que se eliminen o se interrumpan los siguientes genes de modo que el gen no se transcriba y/o traduzca: genes MGF 360 9L, 10L, 11L, 12L, 13L y 14L y genes MGF 505 1R, 2R, 3R y 4R.

La expresión "de tipo silvestre" indica que el virus existía (en algún punto) en el terreno, y se aisló de un hospedador natural, tal como un cerdo doméstico, garrapata o facóquero. La siguiente tabla 2 enumera aislados de virus de ASF conocidos.

La estructura genómica de los ASFV es conocida en la técnica, como se detalla en Chapman et al., (2008) J. Gen. Virol. 89:397-408.

La expresión "corresponde a" significa que el resto del genoma es igual, o sustancialmente igual, a la cepa de tipo silvestre. Por tanto, el genoma del virus atenuado de la presente invención puede incluir los genes de la cepa de tipo silvestre, distintos de los genes MGF 360 9L, 10L, 11L, 12L, 13L y 14L y los genes MGF 505 1R, 2R, 3R y 4r . El genoma del virus atenuado puede comprender los ORF conservados en las 10 secuencias genómicas disponibles y completamente eliminadas o interrumpidas de modo que el gen no se transcriba y/o traduzca: genes MGF 360 9L, 10L, 11L, 12L, 13L y 14L y genes MGF 505 1R, 2R, 3R y 4R.

El genoma del virus de ASF recombinante atenuado de la invención puede corresponder al de una cepa de virus de ASF virulenta (con la excepción de los genes MGF 3609L, 10L, 11L, 12L, 13L y 14L y los genes MGF 505 1R, 2R, 3R y 4R.

Los aislados del virus de la fiebre porcina africana descritos hasta la fecha se resumen en la tabla 2, junto con sus números de acceso a Genbank.

Las cepas del virus de ASF virulentas conocidas incluyen: Georgia 2007/1, Benin 97/1, Kenyan, Malawi Lil20/1, Pretorisuskop/96/4 y Tengani 62.

Tabla 2

El genoma del virus de ASF recombinante atenuado de la invención (con la excepción de los genes MGF 3609L, 10L, 11L, 12L, 13L y 14L y los genes MGF 505 1R, 2R, 3R y 4R) puede corresponder al del aislado Benin 97/1.

El genoma del virus de ASF recombinante atenuado de la invención (con la excepción de los genes MGF 3609L, 10L, 11L, 12L, 13L y 14L y los genes MGF 505 1R, 2R, 3R y 4R) puede corresponder al de una cepa de virus de ASF cuya virulencia actualmente es desconocida, por ejemplo: Mkuzi, Warmbaths y Warthog.

La presente invención también proporciona una composición de vacuna que comprende una pluralidad de virus de ASF atenuados. La pluralidad de virus de ASF atenuados puede corresponder a una pluralidad de diferentes aislados, por ejemplo, diferentes aislados de virulencia alta o desconocida.

Dicha composición de vacuna puede provocar una respuesta inmunitaria de protección cruzada contra varios o sustancialmente todos los virus de ASF.

ELIMINACIONES

En el virus de la fiebre porcina africana (ASF) atenuado de la presente invención se eliminan o se interrumpen los siguientes genes de modo que el gen no se transcriba y/o traduzca:

familia multigénica 360 genes 9L, 10L, 11L, 12L, 13L y 14L; y

familia multigénica 505 genes 1R, 2R, 3R y 4R.

Los genes pueden, por ejemplo, eliminarse completamente.

En particular, pueden eliminarse los siguientes genes:

familia multigénica 360 genes 10L, 11L, 12L, 13L y 14L; y

familia multigénica 505 genes 1R, 2R y 3R.

También se describe en este documento un ASFV atenuado que carece de versión funcional de DP148R. El gen puede estar completa o parcialmente eliminado.

INTERRUPCIONES

En el virus de la fiebre porcina africana (ASF) atenuado de una realización de la presente invención puede interrumpirse uno o más de los siguientes genes de modo que el gen no se transcriba y/o traduzca::

familia multigénica 360 genes 9L, 10L, 11L, 12L, 13L y 14L; y

familia multigénica 505 genes 1R, 2R, 3R y 4R

En particular, los siguientes genes pueden interrumpirse de modo que el gen no se transcriba y/o traduzca: familia multigénica 360 gen 9L; y

familia multigénica 505 gen 4R

También se describe en este documento un virus de ASF atenuado en el que está interrumpido el gen DP148R. El gen puede interrumpirse, por ejemplo, eliminando o modificando de otro modo el codón de inicio ATG del gen. El genoma puede comprender uno o más cambios nucleotídicos que anulen la expresión del gen. Por ejemplo, la expresión del gen puede anularse por un desplazamiento de marco o por la introducción de uno o más codones de parada en el marco abierto de lectura del gen o una modificación de un sitio de inicio de la traducción.

La interrupción causa que el gen no se transcriba y/o traduzca.

GENES FUNCIONALES

Como se menciona anteriormente, la secuencia genómica completa de la cepa de ASFV atenuada OURT88/3 se ha determinado y comparado con la de virus virulentos (Chapman et al., 2008 como anteriormente). Además de las eliminaciones mencionadas anteriormente, la cepa OURT88Á3 también tiene interrupciones en otros 3 genes: EP402R, EP153R y DP148R (previamente denominado MGF360 18R).

EP402R codifica una proteína CD2v que se incorpora en la capa externa del virus y puede tener una función en la entrada y la propagación del virus. También puede ser una diana de anticuerpos que inhiben la infección. EP153R es una lectina de tipo C. DP148R inhibe el interferón de tipo I.

El genoma del virus atenuado de la presente invención puede comprender versiones completas, ininterrumpidas o funcionales de uno o más de los genes EP402R y EP 153R. En el virus atenuado de la presente invención, estos dos genes pueden estar completos, ininterrumpidos y ser funcionales.

COMPOSICIÓN DE VACUNA/FARMACÉUTICA

La presente invención también proporciona una vacuna que comprende un virus de ASF atenuado de la invención. El término "vacuna", como se usa en este documento, se refiere a una preparación que, cuando se administra a un sujeto, induce o estimula una respuesta inmunitaria protectora. Una vacuna puede hacer que un organismo sea inmune a una enfermedad particular, en el presente caso ASF. La vacuna de la presente invención, por tanto, induce una respuesta inmunitaria en un sujeto, que es protectora contra la posterior exposición al virus de ASF.

La vacuna puede comprenden una pluralidad de virus de ASF atenuados de diferentes genotipos. Dicha vacuna puede tener la capacidad de inducir una respuesta inmunitaria de protección cruzada contra una pluralidad de genotipos de virus de a Sf .

La vacuna puede ser útil en la prevención de la fiebre porcina africana.

La presente invención también proporciona una composición farmacéutica que comprende uno o más virus de ASF atenuados de la invención. La composición farmacéutica puede usarse para tratar la fiebre porcina africana.

La vacuna o la composición farmacéutica puede comprender uno o más virus de ASF atenuados de la invención y opcionalmente uno o más adyuvantes, excipientes, vehículos y diluyentes.

La inmunización con OURT88/3 induce una alta respuesta de IFNy, que sugiere que está mediada por linfocitos T. El virus atenuado de la presente invención parece inducir una respuesta mediada por linfocitos T reducida (véanse las figuras 7 y 13). El virus atenuado de la presente invención, por lo tanto, parece inducir una respuesta inmunitaria celular más "útil" (es decir, más protectora) que OURT88/3.

El virus atenuado de la presente invención puede inducir una respuesta mediada por linfocitos T reducida en comparación con OURT88/3. Los métodos para analizar y comparar las respuestas mediada por linfocitos T son conocidos en la técnica, por ejemplo, mediante el análisis de la proliferación de linfocitos T en respuesta a un antígeno (por ejemplo, recuentos celulares, incorporación de timidina o incorporación de BrdU), ensayo de la secreción y/o expresión de citocinas en respuesta a antígeno (por ejemplo, ELISA, ELISPOT, citometría de flujo) o determinación de subpoblaciones de linfocitos presentes después de inoculación de un sujeto con el virus (por ejemplo, usando citometría de flujo).

El virus atenuado de la presente invención puede inducir una respuesta inmunitaria que comprende un porcentaje reducido de células gamma delta/CD8+ en circulación y/o un porcentaje reducido de CD8+/CD4-/y§TCR- (células únicamente CD8) y/o un porcentaje reducido de células CD8+/CD3-(NK) en comparación con OURT88/3.

MÉTODOS DE PREVENCIÓN/TRATAMIENTO

En este documento se describe un método de prevención y/o tratamiento de ASF en un sujeto mediante la administración de una cantidad eficaz de un virus atenuado, vacuna o composición farmacéutica de la invención.

El término "prevención" pretende hacer referencia a evitar, retardar, impedir o dificultar el contagio de ASF. La vacuna puede, por ejemplo, prevenir o reducir la probabilidad de que un ASFV infeccioso entre en una célula.

El término "tratamiento" pretende hacer referencia a la reducción o el alivio de al menos un síntoma de una infección existente por ASF.

El sujeto puede ser cualquier animal que sea susceptible a infección por ASF. Los animales susceptibles a ASF incluyen cerdos domésticos, facóqueros, cerdos salvajes o garrapatas.

El sujeto vacunado de acuerdo con la presente invención puede ser un cerdo doméstico.

ADMINISTRACIÓN

La vacuna de la invención puede administrarse por cualquier vía conveniente, tal como por inyección intramuscular. Otras vías adecuadas de administración incluyen intranasal, oral, subcutánea, transdérmica y vaginal (por ejemplo, durante inseminación artificial). En una realización, la administración oral comprende añadir la vacuna al pienso para animales o al agua de beber. En otra realización, la vacuna puede añadirse a un cebo para un animal salvaje, por ejemplo, un cebo adecuado para jabalís, cerdos salvajes, potamóqueros o facóqueros.

Los autores de la presente invención han descubierto que el virus atenuado BeninAMGF de la invención es eficaz a una dosis inferior en comparación con OURT88/3. Por ejemplo, en el ejemplo 3, los cerdos recibieron 10²HAD de BeninAMGF que se comparó con una dosis de 10⁴TCID50 del virus OURT88/3.

La dosis para inmunización de cerdos puede ser, por lo tanto, de menos de 10⁴HAD50 o TCID50 por cerdo. Por ejemplo, la dosis puede ser entre 10²-10³HAD50 o TCID50. La dosis puede ser de aproximadamente 10²HAD50 o TCID50 por cerdo.

La vacuna puede administrarse siguiendo una pauta de sensibilización-refuerzo. Por ejemplo, después de la primera inoculación, los sujetos pueden recibir una segunda administración de refuerzo en algún momento (tal como aproximadamente 7, 14, 21 o 28 días) después. Típicamente, la administración de refuerzo es a una dosis mayor que la administración de sensibilización. La dosis de refuerzo puede ser de aproximadamente 10², 10³o 10⁴HAD50 o TCID50 del virus atenuado recombinante por cerdo.

MÉTODO PARA PREPARAR VIRUS ATENUADO

La presente invención también proporciona un método de atenuación de un virus de la fiebre porcina africana (ASF), que comprende la etapa de eliminar los siguientes genes y/o de interrumpir los siguientes genes de modo que el gen no se transcriba y/o traduzca:

familia multigénica 360 genes 9L, 10L, 11L, 12L, 13L y 14L; y

familia multigénica 505 genes 1R, 2R, 3R y 4R.

Los siguientes genes pueden eliminarse:

familia multigénica 360 genes 10L, 11L, 12L, 13L y 14L; y

familia multigénica 505 genes 1R, 2R y 3R.

familia multigénica 360 gen 9L; y

familia multigénica 505 gen 4R.

También se describe en este documento un método de atenuación de un virus de la fiebre porcina africana (ASF), que comprende la etapa de eliminar o interrumpir parcial o completamente, la expresión del gen DP148R.

La mutación DP148R también puede hacerse en combinación con mutaciones de los genes de la familia multigénica 360 9L, 10L, 11L, 12L, 13L y 14l y los genes de la familia multigénica 505 1R, 2R, 3R y 4R como se describe en este documento.

Los métodos para la eliminación de genes víricos son conocidos en la técnica. Por ejemplo, puede usarse recombinación homóloga, en que se crea un vector de transferencia en que se ha perdido uno o más genes relevantes y usarse para transfectar células infectadas por virus. Los virus recombinantes que expresan la nueva parte de secuencia entonces pueden seleccionarse. Pueden usarse procedimientos similares para interrumpir la expresión génica, por ejemplo, por eliminación del codón de inicio ATG.

ADMINISTRACIÓN INTRANASAL

Los autores de la presente invención, han descubierto sorprendentemente que la administración intranasal de un virus de la fiebre porcina africana (ASF) atenuado provoca protección mejorada y menos efectos secundarios en comparación con la administración mediante la vía intramuscular, y puede requerir una dosis inferior para obtener protección. En particular, la administración intranasal de la cepa atenuada OURT88/3 demostró protección completa (100 %) contra exposición a virus ASFV virulento precursor, que representa una mejora significativa sobre las tasas de supervivencia usando el mismo virus atenuado mediante vía intramuscular.

Por consiguiente, en este documento se describe un virus de ASF atenuado para su uso en el tratamiento y/o la prevención de la fiebre porcina africana, en el que el virus atenuado se administra por vía intranasal.

También se describe en este documento un método para tratar y/o prevenir la fiebre porcina africana en un sujeto, que comprende la etapa de administrar una cantidad eficaz de un virus de ASF atenuado al sujeto por vía intranasal.

También se describe en este documento una vacuna que comprende un virus de ASF atenuado, en la que la vacuna se formula para administración intranasal.

a) una vacuna de virus de ASF atenuado; y

b) un dispositivo de suministro intranasal.

También se describe en este documento un dispositivo de suministro intranasal que comprende una vacuna de virus de ASF atenuado. Los dispositivos adecuados para administración intranasal de vacunas son bien conocidos en la técnica, por ejemplo, una jeringa o gotero, un dispositivo de aerosol (por ejemplo, Omron, Philips Respironics InnoSpire Deluxe, Devilbiss máscara/nebulizador y compresor BreathEazy), un dispositivo de atomización a la mucosa (por ejemplo, LMA MAD Nasal™, Teleflex VaxINator™), una bomba rociadora monodosis o multidosis, un dispensador de polvo monodosis o un dispensador de polvo bidosis.

El virus de ASF atenuado puede ser cualquier virus de ASF adecuado. En una realización, el virus de ASF atenuado puede ser uno que no se considere adecuado para su uso en la prevención o el tratamiento de la fiebre porcina africana cuando se administre por una vía diferente de administración, tal como la vía intramuscular, por ejemplo, debido a un perfil de seguridad inaceptable o baja eficacia. En particular, el virus de ASF atenuado puede ser OURT88/3. El virus de ASF atenuado puede ser, como alternativa, un virus de ASF atenuado que carece de una versión funcional de la familia multigénica 360 genes 9L, 10L, 11L, 12L, 13L y 14L y la familia multigénica 505 genes 1R, 2R, 3R y 4R, y/o carece de una versión funcional de DP148R. El virus de ASF atenuado puede ser cualquier virus de ASF atenuado adecuado como se describe en este documento, tal como BeninAMGF o BeninADP148R.

La administración intranasal puede ser en forma de gota, pulverización o polvo seco, o puede ser una formulación de vacuna nebulizada o en forma de aerosol. La dosis es típicamente de 2 ml, administrada como 1 ml por fosa nasal.

Las autores de la presente invención han descubierto que la administración intranasal de virus de ASF atenuado es eficaz a una dosis inferior en comparación con la administración intramuscular. Por ejemplo, en el ejemplo 6, cerdos inmunizados por vía intranasal con 103 o 104 del OURT883 tuvieron protección completa (100 %) contra exposición mortal, en comparación con tasas de supervivencia mucho más bajas en cerdos inmunizados con las mismas dosis mediante vía intramuscular.

La dosis para inmunización intranasal puede ser, por lo tanto, de 10⁴HAD50 o TCID50 o menos por cerdo. Por ejemplo, la dosis puede ser entre 10²-10³HAD50 o TCID50. La dosis puede ser de aproximadamente 10²HAD50 o TCID50 por cerdo.

La invención se describirá ahora adicionalmente por medio de ejemplos, que pretenden servir para ayudar a un experto en la materia a realizar la invención y no pretenden limitar de ninguna manera el alcance de la invención.

Ejemplos

Ejemplo 1 - Aislamiento del virus recombinante BeninAMGF

Los genes MGF 360 10L, 11L, 12L, 13L, 14L y los genes MGF 505 1R, 2R, 3R se eliminaron del aislado de ASFV Benin 97/1. Además, los codones ATG de MGF 3609L y de MGF 5054R se eliminaron para interrumpir la expresión de estos genes. Los genes eliminados se remplazaron con el gen GUS bajo el control del promotor de p72 de ASFV. Esto se consiguió por recombinación homóloga entre el plásmido pAMGFGuS y el genoma vírico (véase materiales y métodos y la fig. 1). Los virus recombinantes se identificaron por expresión del gen GUS y se purificaron por infección a dilución limitante. Se aislaron dos virus independientes BeninAMGFA2 y BeninAMGFA1 usando el método para reducir la posibilidad de que el fenotipo de la eliminación génica estuviera asociado con mutaciones que pueden haberse producido en otra parte en el genoma.

El virus recombinante BeninAMGFA2, se caracterizó adicionalmente. Se aisló el ADN genómico de Benin 97/1 de tipo silvestre y de BeninAMGFA2 y se analizó por PCR para ensayar la inserción del gen marcador GUS y la eliminación de los ocho genes MGF (fig. 2). Se diseñaron los cebadores BeninD8F y BeninD8R para hibridar dentro del gen MGF 360 9L y el gen MGF360 4R, que flanquean el sitio de inserción. La PCR usando estos cebadores amplificó un fragmento de 2046 pb usando el ADNg del virus recombinante BeninAMGFA2 como molde (fig. 2, carril 1).

El tamaño de esta banda es coherente con la de un producto de PCR en que se han eliminado los ocho genes MGF y se han remplazado por el gen marcador GUS bajo el control del promotor de vp72 de ASFV. Para confirmar que el virus recombinante BeninAMGFA2 contiene el gen GUS, se realizó una PCR usando un cebador del gen GUS interno, RGUS, y el cebador BeninA8F. Esta PCR amplificó un fragmento coherente con el tamaño esperado de 1552 pb (fig.

2, carril 2) cuando se usaba el ADN de BeninAMGFA2 como molde. Como se esperaba, no se detectó ningún fragmento de PCR usando estos cebadores con el ADNg de Benin 97/1 de tipo silvestre como molde (fig. 2, carril 3). Para confirmar que el virus recombinante BeninAMGFA2 no contenía el gen MGF 360 10L, se realizaron reacciones de PCR usando los cebadores BeninA8INTF y BeninA8INTR ubicados en las posiciones 19613 y 20110 dentro del gen MGF 360 10L. No se aisló ningún fragmento de PCR usando el ADNg del virus recombinante BeninAMGFA2 como molde (fig. 2, carril 3), pero como se esperaba se aisló un fragmento de 498 pb usando el ADNg de Benin 97/1 de tipo silvestre como molde (fig. 2, carril 4). Tomados conjuntamente, los datos de PCR mostraron que el virus recombinante BeninAMGFA2 contiene el gen GUS en el sitio de los ocho MGF. Para confirmar adicionalmente que los ocho genes MGF se habían eliminado, se aisló el ADNg del virus BeninAMGFA2 y se secuenció la unión en el sitio de eliminación/inserción usando los cebadores X e Y. El análisis de la secuencia reveló que lo ocho genes MGF se habían eliminado y el gen marcador GUS se había insertado (fig. 3). Las cinco primeras pb del gen flanqueante MGF 360 9L y las siete primeras pb del gen flanqueante MGF 5054R también se habían eliminado. Como las secuencias eliminadas adicionales contenían cada una el codón de inicio ATG, puede concluirse que los genes MGF 360 9L y MGF 5054R no se expresan por el virus recombinante BeninAMGFA2.

Ejemplo 2 - Características de crecimiento del virus recombinante BeninAMGFA2

Para investigar si la eliminación de los ocho genes MGF afectaba a la replicación del virus, se comparó el crecimiento de BeninAMGFA2 con el virus Benin 97/1 precursor en macrófagos primarios de médula ósea porcina. Se infectaron células a alta multiplicidad de infección (m.o.i.) (10 HAD50/célula) y se recogió el virus total de los sobrenadantes en diferentes momentos después de la infección. La fig. 4 muestra que no hubo diferencias significativas entre los títulos de Benin 97/1 de tipo silvestre y los de virus BeninAMGFA2 recuperados en cualquiera de los puntos temporales medidos. Esto muestra que la eliminación de los ocho genes MGF no afectaba significativamente a la replicación de BeninAMGFA2 en macrófagos primarios de médula ósea porcina.

Ejemplo 3 - Inoculación de cerdos con virus recombinante BeninAMGF y virus atenuado OURT88/3

Un grupo de tres cerdos (grupo 1) se inmunizó por vía intramuscular con 10²HAD del virus de eliminación BeninAMGFA2, un segundo grupo de dos cerdos (grupo 2) se inoculó con 10²HAD del virus de eliminación BeninAMGFAl y un tercer grupo de cuatro cerdos (grupo 3) se inoculó con 10⁴TCID50 de virus atenuado OURT88/3. Se registraron las puntuaciones clínicas y las temperaturas para cada cerdo cada día y se tomaron muestras sanguíneas cada siete días. Los resultados de estos registros se muestran en la fig. 5 y en la fig. 6 y muestran que ninguno de los cerdos tenía una puntuación clínica por encima de 3 en ningún día después de la inoculación. Cuatro cerdos (grupo 1 cerdos 21 y 22, grupo 2 cerdos 23 y 25) tuvieron una temperatura por encima de 40 °C, pero esto fue durante uno o dos días únicamente.

En el día 20 después de la inoculación, se tomaron 20 ml de sangre de cada cerdo, se purificaron las PBMC y las células de cerdo de los grupos 1 y 2 se estimularon con virus BeninAMGFA2 y BeninAMGFAl, respectivamente. Las PBMC aisladas de los cerdos del grupo 3 se estimularon con aislado de virus OURT88/3 y se midieron los números de células productoras de IFNg de los tres grupos por ELIspot. Los resultados muestran que tres de los cuatro cerdos del grupo 3 tenían una alta respuesta de IFNg contra OURT88/3, mientras que ninguno de los cerdos de los grupos 1 y 2 tenían una alta respuesta de IFNg contra BeninAMGF u OURT88/3 (fig. 7). A los 21 días después de la primera inoculación, los cerdos de los grupos 1 y 2 recibieron refuerzo por vía intramuscular con 10⁴HAD de los virus BeninAMGFA2 y BeninAMGFA1, respectivamente, y los cerdos del grupo 3 con 10⁴TCID50 de OURT88/3. Las observaciones clínicas mostraron que únicamente un cerdo (grupo 3, cerdo 19) tenía una puntuación clínica por encima de la puntuación 2 (fig. 8) y que únicamente un cerdo (grupo 3 cerdo 19) tenían una temperatura por encima de 40 °C durante 1 día (fig. 9).

Ejemplo 4 - Exposición de todos los cerdos a Benin 97/1 virulento

En el día 46 después de la inoculación inicial (21 días después del refuerzo) los tres grupos de cerdos (grupos 1, 2 y 3) se expusieron por vía intramuscular con 10⁴HAD de virus Benin 97/1 virulento. Además, también se expuso un grupo de control de tres cerdos no inoculados (grupo 4) con 10⁴HAD de virus Benin 97/1 virulento. Los tres cerdos del grupo 4 y un cerdo (cerdo 19) del grupo 3 desarrollaron altas temperaturas y altas puntuaciones clínicas (por encima de la puntuación 4) y se sacrificaron a los cinco días después de la exposición porque se había alcanzado el criterio de valoración compasivo sobre autorización en animales (fig. 10 y 11). Los cinco cerdos de los grupos 1 y 2 y los tres cerdos restantes del grupo 3 estaban protegidos contra exposición a virus virulento Benin 97/1 y siguieron estando sanos hasta el día 63 cuando se terminó el experimento (fig. 12).

En el día 63 después de la inoculación inicial, se aislaron las PBMC de sangre y se aislaron células de bazo y estas se estimularon con cepas de virus y se detectaron los números de células productoras de IFNy por ensayo ELIspot. Los resultados mostraron que los tres cerdos del grupo 3 mostraban alta respuestas de IFNg en células tanto de sangre como de bazo, mientras que únicamente un cerdo (cerdo 24, grupo 2) de los grupos 1 y 2 mostró altas respuestas de IFNy en sangre y bazo (fig. 13).

Ejemplo 5 - Caracterización de la respuesta inmunitaria generada por BeninAMGF

Se demostró que la infección con BeninAMGF disminuía el número de linfocitos T CD8+ gamma delta en circulación tan pronto como el día 10 después de la infección. Se observaron números mayores de células CD8+CD4- y§TCR-(únicamente CD8) y CD8+CD3-(linfocitos NK) en cerdos infectados con OURT88/3 en los últimos días después de la infección (días 53 y 63). No se observaron otras diferencias significativas entre los animales infectados con OURT88/3 y BeninAMGF para las otras poblaciones celulares estudiadas (CD4+ total, CD4+ CD8+ y linfocitos T gamma delta totales) (véanse las figuras 14 a 20).

Conclusiones

La inoculación de cerdos con BeninAMGF demuestra que los virus están atenuados Se inocularon cerdos de los grupos 1 y 2 con 102 HAD de los virus recombinantes aislados independientemente BeninAMGFA2 y BeninAMGFA1. Ninguno de los cerdos mostró una puntuación clínica por encima de la puntuación 3 y ninguno mostró una temperatura por encima de 40,5 °C. Esto demostró que los virus de eliminación BeninAMGFA2 y BeninAMGFA1 estaban atenuados y se detectó una corta fiebre transitoria (1 o 2 días) en 4 de los 5 cerdos, pero ningún otro signo clínico asociado con infección por ASFV.

Los cerdos de los grupos 1 y 2 recibieron refuerzo por vía intramuscular con 104 HAD de virus BeninAMGFA2 y BeninAMGFA1. Ninguno de los cerdos mostró una puntuación clínica por encima de la puntuación 2 y ningún cerdo mostró una temperatura por encima de 40,1 °C. Se observaron resultados similares después del refuerzo de los cerdos del grupo 3 con la cepa atenuada OURT88/3.

La exposición de cerdos inmunizados con BeninAMGF con una dosis mortal de Benin 97/1 demostró un 100 % de protección

Los cerdos de los grupos 1, 2 y 3 y tres cerdos de control no inoculados se expusieron a 104 HAD de aislado de virus virulento Benin 97/1. Los cinco cerdos (100 %) de los grupos 1 y 2 (BeninAMGFA2 y BeninAMGFA1) estaban protegidos contra exposición al virus virulento. Un 75 % de los cerdos del 3 y un 0 % de los cerdos del grupo 4 estaban protegidos contra Benin 97/1 (fig. 12). Después de la exposición a Benin 97/1, ningún cerdo de los grupos 1 y 2 mostró una temperatura por encima de 39,6 °C y ningún cerdo tenía una puntuación clínica por encima de 2. Por el contrario, todos los cerdos del grupo 4 mostraron temperaturas por encima de 40,8 °C y tenían puntuaciones clínicas por encima de la puntuación 8.

Los virus de eliminación BeninAMGFA2 y BeninAMGFA1 mostraron un mejor nivel de protección (100 %) en comparación con la cepa atenuada OURT88/3 (75 %) frente a la exposición con Benin 97/1 virulento.

Materiales y métodos

Células y virus

Se obtuvo el aislado de ASFV no hemoabsorbente avirulento OUR T88/3 de Ourique en Portugal. Se ha descrito previamente el aislado hemoabsorbente virulento Benin 97/1. Tanto OUR T88/3 como Benin 97/1 son virus de genotipo I de p72 que se cultivaron en cultivos de macrófagos primarios derivados de médula ósea. Los títulos de los virus se determinaron como la cantidad de virus que causaba hemoadsorción (para aislados HAD) o efectos citopáticos (para aislados no HAD) en un 50 % de los cultivos infectados (HADso/ml o TClDso/ml).

Construcción del vector de transferencia plasmídica pDMGFGUS

Se construyó el vector plasmídico pAMGFGUS para facilitar la eliminación de los ocho genes MGF (MGF 360 10L, 11L, 12L, 13L, 14L y m Gf 505 1R, 2R, 3R) del genoma de Benin 97/1. Usando el ADN genómico de Benin 97/1 como molde, se amplificó un fragmento de 479 pb (flanco I) ubicado en el extremo 3' del gen MGF 360 9L en la posición 19004 - 19482 inmediatamente en dirección 5' del gen MGF 360 10L usando los cebadores Flancol directo (ACGTTGCAAAGCTTCCATTAATCCCTCCAGTTGTTC) y FlancoI inverso (ACGTTGCAGGTACCCCTCTCTCTGCAGACTCTCACC). Usando el ADN genómico de Benin 97/1 como molde, se amplificó un fragmento de 501 pb (flanco D) ubicado en el extremo 5' del gen MGF 505 4R en la posición 30033 -30533 inmediatamente en dirección 3' del gen MGF 505 3R usando el cebador FlancoD directo (ACGTTGCAGCGGCCGCCTCTCCAAGACATCTGTCGG) y cebador FlancoD inverso (ACGTACGTCTCGAGCCTCACATGCCATCTCAAACAATTCC). El fragmento flanco I se digirió con Hindlll y Kpnl y se ligó en el vector pP72loxPGUS que también se digirió con Hindlll y Kpnl para crear el plásmido pFlancol-GUS. El fragmento flanco D se digirió con las enzimas Notl y Xhol y se ligó en el vector pFlancol-GUS digerido con las mismas enzimas para crear el vector de transferencia pDMGFGUS. El plásmido pDMGFGUS contiene un gen marcador GUS flanqueado en el lado a mano izquierda por la sección 3' terminal del gen MGF 360 9L, una secuencia promotora de vp72 de ASFV y una secuencia los. Al lado derecho del gen GUS está ubicada la secuencia 5' terminal del gen MGF 505 4R. (fig. 1).

Construcción y aislamiento del virus recombinante BeninAMGF

Se infectaron macrófagos alveolares porcinos primarios (placa de 35 mm, 10⁶células) con Benin 97/3 a una multiplicidad de infección (m.o.i). de 10 y se incubaron a 37 °C durante 5 horas, y después se lavaron con solución salina de Earle (suero porcino al 10 %, penicilina/estreptomicina 10000 u mg-1 ml-1). Se incubó una mezcla de transfección que contenía 250 j l de Optimem (Gibco-Life Technologies), 5 |jg de pAMGFGUS y 7,5 j l de reactivo de transfección TrANS-IT LT-1 (Mirus) a 20 °C durante 20 minutos antes de añadirla a las células infectadas. La incubación se continuó a 37 °C durante 4 horas antes de la adición de 1 ml de solución salina de Earle y se continuó la incubación a 37 °C. Se recogió el virus de las células infectadas y transfectadas 72 horas después de la infección y se retiraron los desechos celulares por centrifugación. Se usaron alícuotas del sobrenadante que contenía virus para infectar macrófagos de médula ósea en placas de 96 pocillos. A las 90 horas después de la infección, se añadió solución salina de Earle que contenía 100 jg/m l de 5-bromo-4-cloro-1H-indol-3-ilo (ácido p-D-glucopiranosidurónico (X-Gluc)) y se recogieron los pocillos que aparecían "azules" que contenían virus que expresan GUS recombinantes. Se realizaron además infecciones a dilución limitante en macrófagos de médula ósea de cerdo que contenían X-Gluc hasta que se observó únicamente un pocillo azul por placa de 96 pocillos que indicaba infección con el virus de eliminación recombinante. No se observó ninguna evidencia de infección por virus (efecto citopático (cpe)) en los otros 95 pocillos. Se aislaron dos virus recombinantes independientes (BeninAMGFA2 y BeninAMGFA1) usando este método. Se cultivaron soluciones madre de alto título de los virus recombinantes BeninAMGFA2 y BeninAMGFA1 en macrófagos de médula ósea porcina.

Características de crecimiento del virus recombinante BeninAMGFA2

El crecimiento de BeninAMGFA2 se comparó con el del virus Benin 97/1 precursor en macrófagos primarios de médula ósea porcina. Las células se infectaron a alta multiplicidad de infección (m.o.i.) (10 HAD⁵⁰/célula) y se recogió el virus total de los sobrenadantes en diferentes momentos después de la infección.

Purificación del ADN genómico vírico y PCR

Se purificó el ADN genómico vírico de recolecciones de virus BeninAMGF y Benin 97/1 de 300 ul de sobrenadante de células infectadas que son macrófagos infectados de médula ósea porcina usando un kit GE Healthcare Illustra Genomic Prep Mini Spin. El análisis del ADN genómico vírico se realizó por PCR usando los cebadores de ADN específicos BeninD8F (GGTGAGAGTCTGCAGAGAGAGG), BeninD8R (GCCCTAGCACTTGTAACG), RGUS (CCTTCTCTGCCGTTTCCAAATCGCCGC), BeninD8INTF (CGATGTATCATTGATGTC), BeninD8INTR (GGATAATCTTAGGGAGGCC)

Secuenciación del virus recombinante BeninAMGFA2

Se aisló el ADNg vírico de la recolección de células infectadas BeninDMGF y se secuenció usando los siguientes cebadores 9LF (ATGACGCATTAAACCGGCG) y 4RR (CAGTATAGCCCTAGCACTTG)

ELIspot

Se realizó ELIspot de IFNg como se describe previamente (Gerner et al., 2006 Virus Res> 121:223-228).

Inoculación de cerdos y exposición

Los cerdos usados eran cruce Large white x Landrace, de un peso promedio de 15 kg en la primera inoculación. Todos los cerdos se mantuvieron en instalaciones SAPO4 de alta seguridad todo el tiempo y el experimento se realizó bajo licencia del Ministerio del Interior PPL 70/7198-. Un grupo de tres cerdos (grupo 1, cerdos 21, 22 y 23) se inoculó por vía intramuscular con 10²HAD⁵⁰de virus recombinante BeninDMGFA2. Un segundo grupo de dos cerdos (grupo 2, cerdos 24 y 25) se inoculó por vía intramuscular con 10²HAD⁵⁰de virus recombinante BeninAMGFA1. un tercer grupo de cuatro cerdos (grupo 3, cerdos 16, 18, 19 y 20) se inoculó con 10⁴TCID50 de la cepa atenuada OURT88/3. Los autores de la invención habían determinado previamente que se necesitaba una dosis de 10⁴TCID50 de OURT88/3 para inducir protección y que 10³era menos eficaz.

Tres semanas después del refuerzo de las respuestas inmunitarias adaptativas específicas de ASFV, los cerdos de los grupos 1 y 2 se inocularon con 10⁴HAD⁵⁰de virus recombinante BeninDMGFA2 y BeninDMGFA1, respectivamente, y los cerdos del grupo 3 se inmunizaron con 10⁴TCID⁵⁰de OURT88/3. Tres semanas después del refuerzo, los grupos 1, 2, 3 y un cuarto grupo de tres cerdos (grupo 4, cerdos 26, 27 y 28) que contenía tres cerdos no inmunizados, se expusieron por vía intramuscular con 10⁴HAD⁵⁰de aislado de ASFv virulento Benin 97/1. Los cerdos inoculados con ASFV y expuestos se controlaron diariamente para la temperatura corporal y los signos clínicos y estos se puntuaron como se presenta por King et al., 2011. Todos los cerdos se examinaron tras la muerte por sacrificio y se recogieron el bazo y los tejidos linfáticos.

Caracterización de subpoblaciones de linfocitos T

Se recogieron muestras de sangre de los cerdos infectados en diferentes momentos después de la infección y se identificaron las diferentes poblaciones de linfocitos T usando los siguientes anticuerpos marcados de Zenon (Invitrogen): IgG1 de ratón antiCD3 porcino (Alexa Fluor 405), IgG2b de ratón antiCD4 porcino (Alexa Fluor 647), IgG2a de ratón antiCD8aa porcino (R-PE) e IgG2b de ratón antiTCR gamma delta porcino (Alexa Fluor 488). En resumen, se incubaron 100 pl de sangre completa con 5 pl de cada anticuerpo conjugado durante 20 minutos a temperatura ambiente. Los glóbulos rojos se lisaron añadiendo 4 ml de solución de lisis de FACS BD 1x (BD Biosciences) y agitando con vórtice. Las células se sedimentaron por centrifugación a 1200 rpm durante 7 minutos y se descartó el sobrenadante. Las células entonces se fijaron con paraformaldehído al 4 % durante 30 minutos, se lavaron dos veces con PBS y finalmente se analizaron por citometría de flujo (MACSQuant, Miltenyi Biotec). Se seleccionaron subconjuntos de linfocitos basándose en los marcadores de superficie celular usando el programa informático FCS express.

Ejemplo 6 -Inmunización con OUR T88/3 a través de diferentes vías

Los experimentos se realizaron en instalaciones de biocontención de nivel 3 (BSL-3) en el Centro de Investigación en Sanidad Animal (CReSA, Barcelona, España). Todos los experimentos con animales se realizaron según la licencia del Ministerio del Interior británico número 70/7198 con la aprobación del Comité ético para experimentos en animales de la Universidad Autónoma de Barcelona (N.° 1189R5) y el Gobierno regional de Cataluña, España (N.° 5796), y cumplía completamente los procedimientos regulados del acta sobre animales (Procedimientos científicos) 1986.

Materiales y métodos

Se usaron lechones macho cruzados Large White y Pietrain de 7 semanas de edad en buen estado de salud, vacunados frente al Circovirus porcino de tipo 2 y Mycoplasma hyopneumoniae, con un peso promedio de 15 kg, de una camada muy saludable que dio resultado negativo en ensayo para el síndrome respiratorio y reproductor porcino (PRRS) y la enfermedad de Aujeszky. Después de un periodo de aclimatación de 5 días, se inmunizaron tres grupos de seis cerdos cada uno por vía intramuscular (IM) con 1 ml que contenía 10³(grupo A), 10⁴(grupo C) y 10⁵(grupo E) TCID⁵⁰/ml del aislado de ASFV de baja virulencia u OUR T88/3, respectivamente. Se inmunizaron tres grupos adicionales de seis cerdos cada uno por vía intranasal (IN), usando un dispositivo de atomización a la mucosa, conteniendo 1 ml por fosa nasal 10³(grupo B), 10⁴(grupo D) y 10⁵(grupo F) TCIDso/ml del aislado de baja virulencia OUR T88/3. Tres semanas después todos los grupos inmunizados, junto con un grupo de control (grupo G) que contenía tres cerdos no inmunizados, se expusieron por vía intramuscular con 1 ml que contenía 10⁴TCID⁵⁰/ml del aislado de ASFV virulento muy relacionado OUR T88/1. Este grupo de control se alojó por separado (sala 4), mientras que los cerdos inmunizados con el mismo título de ASFV, pero por diferentes vías de inoculación (IN o IM), se ubicaron en la misma sala de aislamiento separados por un tabique de 1 m de altura de la siguiente manera: experimento 1 (grupos A y B), experimento 2 (grupos C y D), experimento 3 (grupos E y F).

Muestreo, examen clínico y tras la muerte

El día de la inmunización se definió como el día 0 (0 dpi). Se controlaron las temperaturas rectales y los signos clínicos diariamente antes de la inmunización y durante todo el estudio, siguiendo una puntuación clínica presentada previamente (King et al., 2011). Se recogió muestras de sangre y suero con EDTA de todos los cerdos antes de la inmunización con virus (0 dpi), después de la inmunización (a 3, 5, 7, 14 y 21 dpi) y después de la exposición (a 3, 5, 7, 14 y 19 dpc).

Se realizó también un examen tras la muerte para evaluar las lesiones manifiestas de los cerdos muertos o de cerdos sacrificados durante experimento tras alcanzar un criterio de valoración compasivo predeterminado, así como el fin del experimento a los 19 días después de la exposición (dpc). Se evaluaron las lesiones macroscópicas de acuerdo con el marco patológico normalizado de infecciones por ASFV (Galindo-Cardiel et al., 2013). El criterio de valoración compasivo se determinó de acuerdo con las regulaciones de bienestar animal especificadas en la licencia del Ministerio del Interior británico, de modo que cerdos con una temperatura rectal por encima de 40,5 °C durante tres días consecutivos, o que mostraran tres o más signos clínicos de enfermedad combinados en un solo día, se sacrificaron. Se realizó eutanasia mediante inyección intravenosa de pentobarbital de sodio.

Detección de ASFV y evaluación de la respuesta inmunitaria.

Después de recogerlas, las muestras de sangre con EDTA se congelaron a -80 °C hasta la detección de ASFV por PCR cuantitativa (qPCR) como se describe previamente (King et al., 2003). También se analizaron muestras tisulares congeladas (bazo, amígdala, pulmón, ganglios linfáticos submandibulares, retrofaríngeos y gastrohepáticos) para la presencia de ASFV por qPCR. También se congelaron muestras de suero a -80 °C hasta que se analizaron por kits de ELISA disponibles en el mercado para la detección de anticuerpos contra la proteína estructural Vp72 de ASFV (INGEZIM PPA Compac, Ingenasa Madrid, España). Además, se usaron muestras de suero para evaluar, mediante kits de ELISA disponibles en el mercado (R&D Systems, Abingdon, R.U.), las citocinas porcinas con funciones inflamatorias e inmunológicas durante la inmunidad humoral y mediada por células en cerdos (IL-1p, TNFa, IFNy, IL-4 e IL-10). Las concentraciones de citocinas se presentaron como pg/ml.

Análisis estadísticos

Los datos se analizaron usando el programa de análisis estadístico GraphPad Prism Versión 6.0 (programa informático GraphPad). Los valores de temperatura rectal, signos clínicos, lesiones macroscópicas, viremia, anticuerpos contra ASFV y niveles de citocinas se evaluaron para calcular la media ± la desviación típica (DT). Para el análisis de la temperatura y los signos clínicos, se analizaron las diferencias entre los valores iniciales (día 0) y los valores obtenidos en cada punto temporal en el grupo de control no inoculado y los grupos inoculados usando ANOVA unidireccional con ensayo a posteriori de Bonferroni. Además, se analizaron las diferencias entre el grupo de control no inoculado y los grupos infectados, así como las diferencias entre ambos grupos infectados en el mismo punto temporal usando un ANOVA bidireccional con ensayo a posteriori de Bonferroni. Para todas las comparaciones, las diferencias se consideraron significativas a P< 0,05.

Resultados de los cerdos no inmunes de control

Desde 3 dpc, los cerdos del grupo G de control (no inmunes) presentaban síntomas no específicos tales como fiebre (40,8-41,7 °C) y apatía (véase la figura 21 G). Estos signos clínicos aumentaron progresivamente hasta 5 dpc, con temperaturas rectales entre 41,4- 41,6 °C, postración y la presencia de eritema cutáneo y zonas cianóticas en la punta de las orejas, que se sacrificaron por razones éticas. Después de la eutanasia de los cerdos en 5 dpc, las necropsias revelaron la presencia de lesiones manifiestas características de formas agudas de ASF tales como linfadenitis hemorrágica (siendo los ganglios linfáticos gastrohepáticos y renales los más gravemente afectados), esplenomegalia hiperémica, pulmones no colapsados con edema intersticial y alveolar, así como espuma en la tráquea, petequias en los riñones (corteza y médula) y en los pulmones, edema retroperitoneal y congestión hepática moderada.

Resultados de los grupos inmunizados por vía intranasal

De aquellos cerdos inmunizados con OURT88/3 por vía intranasal, el 100 % (n = 6) de los de los grupos B (10³TCID50) y D (10⁴TCID ⁵⁰) sobrevivieron a la exposición. Algunos de los cerdos que sobrevivieron presentaban una inflamación articular moderada transitoria antes y después de la exposición. Dos cerdos del grupo B (B3 y B4) y 3 del grupo D (D2, D4 y D5) mostraron otros signos clínicos transitorios cortos después de la exposición (temperatura, inapetencia, apatía). En el grupo F (10⁵TCID50) un 66 % sobrevivieron a la exposición. Los dos cerdos que no sobrevivieron (F3 y F5) se sacrificaron en el día 5 después de la exposición, que mostraban lesiones manifiestas características de ASF y algunos otros signos clínicos (inflamación del codo y erosión de la piel de la nariz). Tres cerdos supervivientes (F1, F2 y F4) también mostraban signos clínicos y lesiones que incluyen inflamación articular grave, dificultad respiratoria, eritema en las orejas, conjuntivitis así como erosiones/úlceras cutáneas en la nariz, los flancos y las extremidades que duraban hasta el final del experimento.

Resultados de grupos inmunizados por vía intramuscular

De los cerdos inmunizados por vía intramuscular, 3 (E2, E3 y E6) del grupo E (10⁵TCID50) se sacrificaron o se encontraron muertos entre 13 y 14 dpi y antes de la exposición, que mostraban signos típicos de ASF. De los cerdos expuestos, un 50 % (3/6) del grupo A (10³TCID50), un 66 % (4/6) del grupo C (10⁴TCID50) y un 33 % (2/6) del grupo E (10⁵TCID50) sobrevivieron a la exposición.

Análisis estadístico de los resultados

El análisis estadístico comparativo de las puntuaciones clínicas (5 días antes de la muerte) desarrollados por cerdos que murieron o se sacrificaron dentro de cada grupo experimental (incluyendo cerdos muertos antes de la exposición en el grupo E y cerdos de control no inmunizados), reveló una cinética similar, así como diferencias no significativas en las temperaturas alcanzadas entre los grupos (fig. 22). Además, la cinética de las puntuaciones clínicas fue similar, aparecieron diferencias significativas junto entre cerdos muertos en el grupo F (IN, 10⁵) y el grupo A (IM, 10³) (fig. 24). Por otro lado, el análisis estadístico de las puntuaciones clínicas en cerdos que sobrevivieron reveló que después de la exposición, los cerdos supervivientes en el grupo F (IN, 10⁵) mostraban diferencias significativas en las puntuaciones clínicas con respecto a los cerdos supervivientes que se incluyen en otros grupos hasta el final del estudio (fig. 24).

Durante la evaluación macroscópica de los cerdos supervivientes, se observaron principalmente lesiones en el sistema cardiorrespiratorio, el sistema cutáneo y musculoesquelético. En general, los cerdos supervivientes inmunizados por vía intramuscular (9 cerdos en total) no presentaban lesiones o presentaban lesiones pulmonares mínimas (6/9 cerdos), mientras que los cerdos supervivientes inmunizados por vía intranasal (16 cerdos en total) mostraban lesiones cardiorrespiratorias (12/16 cerdos), así como lesiones en la piel y las articulaciones (7/16 cerdos). En este sentido, aunque las lesiones eran moderadas en los cerdos supervivientes inmunizados por vía intranasal con 10³y 10⁴(grupos B y D), los cerdos supervivientes inoculados por vía intranasal con 10⁵(grupo F) presentaban las lesiones cardiorrespiratorias y musculoesqueléticas más intensas (pleuritis fibrinosa, pleuroneumonía fibrinonecrótica, pericarditis fibrinosa y periartritis serofibrinosa/purulenta), lesiones cardiorrespiratorias que con compatibles con la presencia de infecciones bacterianas secundarias. El análisis estadístico de las puntuaciones de lesiones macroscópicas confirmó las diferencias significativas entre los cerdos supervivientes en el grupo F (IN, 10⁵) y los otros grupos de animales supervivientes (fig. 25).

Discusión

Estos resultados han demostrado una protección completa (100 %) en cerdos inmunizados por vía intranasal con 10³y 10⁴TCID⁵⁰/ml del aislado de ASFV de baja virulencia OUR T88/3. Los cerdos presentaban reacciones clínicas adversas mínimas y transitorias antes y después de la exposición al aislado de ASFV virulento OUR T88/1, así como lesiones leves en los pulmones, asociadas con infecciones bacterianas secundarias, y las articulaciones principalmente. Se predice a partir de nuestros resultados que una dosis inferior (por ejemplo, 10²TCID50) también puede inducir altos niveles de protección contra exposición mortal.

Sin embargo, tanto en el grupo de cerdos inmunizados por vía intranasal con 10⁵TCID⁵⁰)/ml como en todos los grupos inmunizados por vía intramuscular, la tasa de protección conferida fue inferior. Las tasas de supervivencia más bajas se observaron en cerdos inmunizados por vía intramuscular con 10⁵TCID⁵⁰/ml, donde 3 de los 6 cerdos inmunizados (E2, E3 y E6) murieron antes de la exposición. Los resultados muestran que la inmunización intranasal en cerdos con vacunas de ASFV atenuado vivo es una alternativa a la vía intramuscular previamente presentada. La inmunización intranasal indujo menos signos clínicos antes de la exposición en comparación con la vía intramuscular y estuvo protegido un porcentaje mayor de cerdos.

Ejemplo 7 - Inmunización con BeninAMGF por diferentes vías

Esto implicó ensayar el suministro de ASFV atenuado con el gen eliminado BeninAMGF a tres dosis diferentes usando la vía IM (10², 10³, 10⁴HAD50) y mediante una dosis (10³HAD50) usando la vía intranasal y exposición con virus virulento precursor.

Materiales y métodos

Los experimentos se realizaron en instalaciones de biocontención SAPO-4 en The Pirbright Institute. Todos los experimentos con animales se realizaron según la licencia del Ministerio del Interior Británico número 70/7198 y cumplían completamente los procedimientos regulados del acta de animales (Procedimientos científicos) 1986.

Se usaron lechones hembra cruzados Large White Landrace en buen estado de salud, con un peso promedio de 15 -20 kg, de una piara muy sana. Después de un periodo de aclimatación de 5 días, se inmunizaron tres grupos de seis cerdos cada uno por vía intramuscular (IM) con 1 ml que contenía 10²(grupo A), 10³(grupo B) y 10⁴(grupo C) HAD 50 de la cepa de ASFV atenuado con eliminación génica BeninAMGF, respectivamente. Se inmunizó un grupo adicional de seis cerdos por vía intranasal (IN), usando un dispositivo de atomización a la mucosa, con 1 ml por fosa nasal que contenía 10³BeninAMGF (grupo D). Tres semanas después, todos los grupos inmunizados recibieron refuerzo con la misma dosis de virus por la misma vía. Después de 19 días más, los cerdos de los grupos A a D, junto con un grupo de control (grupo F) que contenía seis cerdos no inmunizados, se expusieron por vía intramuscular con 1 ml que contenía 10⁴TCID⁵o/ml del aislado de ASFV virulento precursor Benin 97/1. Este grupo de control se alojó por separado, mientras que los otros cerdos se ubicaron en la misma sala de aislamiento separados por un tabique de 1 m de altura de la siguiente manera: sala 1 (grupos A y B), sala 2 (grupos C y D).

Muestreo, examen clínico y tras la muerte.

El día de la inmunización se definió como el día 0 (0 dpi). Se controlaron las temperaturas rectales y los signos clínicos diariamente antes de la inmunización y durante todo el estudio, siguiendo una puntuación clínica presentada previamente (King et al., 2011). Se recogió muestras de sangre y suero con EDTA de todos los cerdos antes de la inmunización con virus (0 dpi), después de la inmunización (a 2, 4, 7, 10, 14 y 21 dpi) y después de la exposición (a 3, 5, 7, 14 y 19 dpc).

Se realizó también un examen tras la muerte para evaluar las lesiones manifiestas de los cerdos muertos o sacrificados durante experimento tras alcanzar un criterio de valoración compasivo predeterminado, así como al final del experimento. Se evaluaron las lesiones macroscópicas de acuerdo con el marco patológico normalizado de infecciones por ASFV (Galindo-Cardiel et al., 2013). El criterio de valoración compasivo se determinó de acuerdo con las regulaciones de bienestar animal especificadas en la licencia del Ministerio del Interior británico, de modo que cerdos con una temperatura rectal por encima de 40,5 °C durante tres días consecutivos, o que mostraran tres o más signos clínicos de enfermedad combinados en un solo día, se sacrificaron. Se realizó eutanasia mediante inyección intravenosa de pentobarbital de sodio.

Resultados

Los cerdos se inmunizaron y observaron diariamente para los signos clínicos incluyendo las temperaturas. Los resultados se muestran en la figura 29. De los cerdos en los grupos A (10²) y B (10³), 4/6 desarrollaron una fiebre baja transitoria durante 1 o 2 días desde el día 4 o 5 después de la inmunización. En el grupo C (IM 10⁴), 3/6 cerdos desarrollaron una fiebre baja transitoria durante 1 o 2 días. En el grupo D (IN 10³), 1/6 cerdos desarrolló una fiebre baja transitoria en el día 5 después de la inmunización. No se observaron otros signos clínicos.

Los resultados confirman que aumentar la dosis de BeninAMGF no aumenta los signos clínicos después de la inmunización por vía IM. La figura 29 muestra que se observaron signos clínicos en estos cerdos y en los cerdos restantes después del refuerzo y hasta después de la exposición. Después de la exposición, se sacrificaron varios cerdos porque alcanzaron el criterio de valoración de gravedad moderada (3 días de fiebre por encima de 40,5 o 2 días sin comer). Estos incluyeron 3 de los 6 cerdos del grupo inmunizado con 10²IM, 2 cerdos inmunizados con 10³IM, 1 cerdo inmunizado con 10⁴IM y 2 cerdos inmunizados con 10³IN. Después de la muerte, no se observaron lesiones en ningún excepto para 1 cerdo del grupo de BeninAMGF 10²IM que tenía una única lesión pulmonar.

Una comparación de las temperaturas medias de los diferentes grupos (figura 31) mostró diferencias estadísticamente significativas entre el grupo inmunizado con BeninAMGF 10²IM y otros grupos después de la inmunización en el día 4 (mayor en comparación con todos los demás grupos), día 15 (mayor en comparación con BeninAMGF 10³IM, 10³IN y 10⁴IM). Se observaron diferencias estadísticamente significativas después del refuerzo entre BeninAMGF 10²IM (mayor en comparación con BeninAMGF 10³IN y BeninADP148R). En el día 12 después de la exposición, los cerdos inmunizados con BeninAMGF 10²IM tenían una temperatura significativamente mayor en comparación con cerdos inmunizados con BeninAMGF 10⁴IM.

Los cerdos inmunizados con BeninAMGF 10³IN tenían temperaturas significativamente diferentes en el día 4 después de la inmunización (inferior en comparación con BeninAMGF 10³IM, 10⁴IM y BeninADP148R), día 6 después de la inmunización (mayor en comparación con BeninADP148R), día 11 después de la exposición (mayor en comparación con BeninAMGF 10 ⁴IM). Los cerdos inmunizados con BeninAMGF 10⁴IM tenían temperaturas estadísticamente significativas en el día 8 después de la inmunización (mayor en comparación con BeninAMGF 10³IM, 10³IN) y día 9 después de la inmunización (mayor en comparación con BeninADP148R). Los cerdos inmunizados con BeninAMGF 10³IM tenían temperaturas significativamente diferentes en el día 12 después de la inmunización (inferior en comparación con BeninAMGF 10⁴IM y 10³IN).

Una comparación de las medias de las puntuaciones clínicas de los diferentes grupos (figura 32) mostró diferencias estadísticamente significativas entre el grupo inmunizado con BeninAMGF10²IM y otros grupos después de la inmunización en el día 2 (mayor que BeninAMGF 10³IM, 10³IN, BeninADP148R), día 4 (mayor que BeninAMGF 10³ IM, 10⁴IM, 10³IN) y día 5 (inferior que BeninADP148R, mayor que BeninAMGF 10³IM, 10³IN).

En conclusión, BeninAMGF 10²IM mostró puntuaciones clínicas significativamente mayores y temperaturas menores que otros grupos después de la inmunización.

Ejemplo 8 - Inducción de ARNm de IFN-p por diferentes aislados de ASFV

Se infectaron macrófagos alveolares porcinos con aislados de ASFV indicados a multiplicidad de infección 3 (Benin 97/1, BeninAMGF, OURT88/3) o se infectaron de forma simulada. En diferentes momentos después de la infección (2, 4, 6, 8, 10, 12, 16, 20 horas), se recogió el ARN de las células infectadas y se midieron los niveles de ARNm para A r N de IFN-p, GAPDH y el gen B646L de ASFV (VP72) por PCR con transcriptasa inversa cuantitativa. La figura 26, panel A, muestra los niveles de IFN-p en comparación con el gen constitutivo de control GAPDH. El panel B muestra los niveles de ARNm para el gen B646L de a SfV (VP72).

El mutante de eliminación BeninAMGF tiene una eliminación o interrupción de 6 miembros de MGF360 y 4 miembros de MGF 505 de una región cercana al extremo izquierdo del genoma de Benin 97/1. La eliminación de estos genes aumenta la inducción de ARNm de IFN -p en macrófagos infectados con BeninAMGF360 en comparación con el virus virulento precursor en que apenas se detectaba ARNm de IFN-p (véase la figura 26). Los IFN de tipo I inducen expresión de genes estimulados por IFN que están implicados en la activación de las rutas de respuesta inmunitaria innata y adaptativa y en la creación de un estado antivírico. Nuestra hipótesis es que la inducción de IFN de tipo I es importante para la atenuación del ASFV virulento y la inducción de una respuesta inmunitaria protectora.

Ejemplo 9 - Mutante de eliminación BeninADP148R

Un único gen, DP148R, se eliminó de una región cercana al extremo derecho del genoma de Benin97/1 virulento. Para conseguir esto, se amplificó un fragmento de 529 pb de la región izquierda y un fragmento de 740 pb de la región derecha que flanquean el gen MGF36018R por PCR. La fig. 27 muestra los cebadores usados para amplificar la región flanqueante izquierda (360-18RFlancoI) y aquellos para amplificar la región flanqueante derecha (360-18RFlancoD). Las secuencias amplificadas están entre estos cebadores. Está sombreada en gris la secuencia del gen MGF360 -18R que se eliminó del genoma de ASFV. Los codones de inicio y parada se muestran en negrita. Las regiones flanqueantes se clonaron a cada lado de un gen indicador que consistía en el gen de la p-glucorimidasa (p-GUS) en dirección 3' del promotor de VP72 de ASFV. Este plásmido se transfectó en macrófagos de cerdo infectados con el aislado Benin 97/1. El virus descendiente se ensayó para la expresión del gen p-GUS y se aislaron virus recombinantes en que el gen p-GUS remplazaba el gen MGF360-18R por dilución limitante. La eliminación del gen y la ubicación de la inserción se confirmaron por análisis de PCR usando cebadores que eran del genoma de ASFV fuera de las regiones clonadas en el plásmido de transferencia (véase la fig. 27).

La eliminación del gen DP148R no reduce la replicación vírica en macrófagos

La replicación de la cepa del virus BeninAMGF36018R en macrófagos porcinos se comparó con el virus Benin 97/1 precursor. Se infectaron macrófagos alveolares porcinos a una multiplicidad de 3 y en diferentes momentos después de la infección (0, 24, 48, 72, 96 horas) el virus de las células y los sobrenadantes se recogió y tituló usando macrófagos alveolares porcinos. Los resultados (figura 28) mostraron que la eliminación del gen MGF360 18R no reducía la replicación del virus en macrófagos.

La eliminación del gen DP148R atenúa el ASFV en cerdos

Se inmunizó un grupo de 5 cerdos cruzados Large white/landrace macho (15-20 kg) por vía intramuscular con 10³HAD50 de BeninADP148R y se observaron para los signos clínicos. Los 5 cerdos presentaban signos clínicos transitorios durante 1 o 2 días en los días 4 o 5 después de la inmunización. Estos signos incluían fiebre transitoria, pérdida de apetito y letargia.

Los cerdos recibieron refuerzo con la misma dosis de virus por la misma vía en el día 21 después de la inmunización y se expusieron a Benin97/1 virulento en paralelo con cerdos no inmunizados de control en el día 39 después de la inmunización. No se observaron signos clínicos adicionales después del refuerzo y todos los cerdos sobrevivieron a la exposición (sacrificados a los 19-21 días después de la exposición). No se observaron lesiones después de la muerte.

Una comparación de las temperaturas medias de los diferentes grupos (figura 31) mostró diferencias estadísticamente significativas entre el grupo inmunizado con BeninADP148R y otros grupos después de la inmunización en el día 2 (inferior en comparación con los grupos BeninAMGF 10²IM y 10⁴IM) y día 5 (mayor en comparación con los grupos BeninAMGF 10³IM, 10⁴IM y 10³IN). En los días después del refuerzo, se observaron temperaturas significativamente inferiores entre BeninADP148R y otros grupos: 5, (BeninAMGF10²IM, 10³IM) 6 (BeninAMGF 10²IM), 12 (BeninAMGF 10²IM, 10³IN), 13 (BeninAMGF 10⁴IM, 10³IN), 14 (BeninAMGF 10²IM, 10³IM, 10³IN), 15 (BeninAMGF 10²IM, 10³IM), 17 -19 todos los grupos (BeninAMGF). Después de la exposición, se observaron temperaturas significativamente inferiores entre cerdos inmunizados con BeninADP148R y otros grupos inmunizados en el día 3 (BeninAMGF 10³IN), 5 (10²IM), 6 (10³IM).

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un virus de la fiebre porcina africana (ASF) atenuado, en el que se eliminan los siguientes genes o se interrumpen de modo que los genes no se transcriban y/o traduzcan:

familia multigénica 360 genes 9L, 10L, 11L, 12L, 13L y 14L; y

familia multigénica 505 genes 1R, 2R, 3R y 4R.

2. Un virus de ASF atenuado de acuerdo con la reivindicación 1, en el que se eliminan los siguientes genes: familia multigénica 360 genes 10L, 11L, 12L, 13L y 14L; y

familia multigénica 505 genes 1R, 2R y 3R.

3. Un virus atenuado de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, en el que se interrumpen los siguientes genes de modo que los genes no se transcriban y/o traduzcan:

familia multigénica 360 gen 9L; y

familia multigénica 505 gen 4R.

4. Un virus de ASF atenuado de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, en el que la interrupción comprende eliminación o modificación del codón de inicio ATG del gen; o una modificación de un sitio de inicio de la traducción; o un desplazamiento del marco; o introducción de uno o más codones de parada en el marco abierto de lectura del gen.

5. Un virus de ASF atenuado de acuerdo con cualquier reivindicación precedente en que el resto del genoma corresponde al genoma de un aislado de virus ASFV virulento, preferiblemente en el que el resto del genoma corresponde al genoma de uno de los siguientes aislados de virus ASFV virulento: Georgia 2007/1, Benin 97/1, Kenyan, Malawi Lil20/1, Pretoriuskop/96/4 y Tengani 62, mucho más preferiblemente en que el resto del genoma corresponde al genoma del virus Benin 97/1.

6. Una vacuna que comprende un virus de ASF atenuado de acuerdo con cualquier reivindicación precedente.

7. Una vacuna de acuerdo con la reivindicación 6, que comprende una pluralidad de virus de ASF atenuados de diferentes genotipos.

8. Una vacuna de acuerdo con la reivindicación 6 o 7, para su uso en el tratamiento y/o la prevención de la fiebre porcina africana.

9. Una vacuna de acuerdo con la reivindicación 6 o reivindicación 7, para su uso en la inducción de una respuesta inmunitaria de protección cruzada contra una pluralidad de genotipos de virus de ASF.

10. Un método in vitro de atenuación de un virus de la fiebre porcina africana (ASF), que comprende la etapa de eliminar los siguientes genes, o interrumpir los siguientes genes de modo que los genes no se transcriban y/o traduzcan:

familia multigénica 360 genes 9L, 10L, 11L, 12L, 13L y 14L; y

familia multigénica 505 genes 1R, 2R, 3R y 4R.

11. Un método de acuerdo con la reivindicación 10, en el que se eliminan los siguientes genes:

familia multigénica 360 genes 10L, 11L, 12L, 13L y 14L; y

familia multigénica 505 genes 1R, 2R y 3R.

12. Un método de acuerdo con la reivindicación 10 u 11, en el que se interrumpen los siguientes genes de modo que los genes no se transcriban y/o traduzcan:

familia multigénica 360 gen 9L; y

familia multigénica 505 gen 4R.

13. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 10-12, en el que la interrupción comprende: eliminación de modificación del codón de inicio ATG de los genes o una modificación de un sitio de inicio de la traducción; o un desplazamiento del marco; o introducción de uno o más codones de parada en el marco abierto de lectura del gen.

14. Una vacuna para su uso de acuerdo con la reivindicación 8, en la que el sujeto es un cerdo doméstico y/o en la que la vacuna se administra siguiendo una pauta de sensibilización-refuerzo.