ES2738289T3

ES2738289T3 - Procedimiento para el subtipado de tipos de linfoma por medio de perfiles de expresión

Info

Publication number: ES2738289T3
Application number: ES14803288T
Authority: ES
Inventors: Louis M Staudt; George W Wright; David William Scott; Joseph M Connors; Randy D Gascoyne; Lisa Rimsza; Guerri Elias Campo; Timothy C Greiner; James Robert Cook; Kai Fu; Paul Michael Williams; Chih-Jian Lih; Elaine S Jaffe; Rita M Braziel; Andreas Rosenwald; Erlend B Smeland; Wing C Chan; German Ott; Jan Delabie; Dennis Weisenburger
Original assignee: British Columbia Cancer Agency BCCA; Julius Maximilians Universitaet Wuerzburg; Universitat Autonoma de Barcelona UAB; Universitat de Barcelona UB; Hospital Clinic de Barcelona; Oslo Universitetssykehus hf; Arizona Board of Regents of University of Arizona; US Department of Health and Human Services; Oregon Health Science University; University of Nebraska; Cleveland Clinic
Current assignee: British Columbia Cancer Agency BCCA; Julius Maximilians Universitaet Wuerzburg; Universitat Autonoma de Barcelona UAB; Universitat de Barcelona UB; Hospital Clinic de Barcelona; Oslo Universitetssykehus hf; Arizona Board of Regents of University of Arizona; US Department of Health and Human Services; Oregon Health Science University; University of Nebraska; Cleveland Clinic
Priority date: 2013-11-06
Filing date: 2014-11-05
Publication date: 2020-01-21
Anticipated expiration: 2034-11-05
Also published as: ES2923942T3; JP2020078323A; AU2014346788A8; WO2015069790A9; JP6657105B2; US10607717B2; JP7016129B2; KR102357699B1; AU2014346788B8; AU2014346788A1; EP3066215A1; WO2015069790A1; CA2929826C; US20160283653A1; US11574704B2; AU2014346788B2; US20200143906A1; JP2017502686A; EP3594359A1; EP3066215B1

Abstract

Un procedimiento para seleccionar una opción de tratamiento para un sujeto con linfoma difuso de linfocitos B grandes similares a linfocitos B activados (ABC DLBCL), un sujeto con linfoma difuso de linfocitos B grandes similares a linfocitos B del centro germinal (GCB DLBCL), un sujeto con linfoma primario mediastínico de linfocitos B (PMBL), un sujeto con linfoma de Burkitt (BL) o un sujeto con linfoma de células del manto (MCL), que comprende las etapas de: (a) aislar un producto de expresión génica de una muestra de biopsia de un sujeto con linfoma; (b) obtener datos de expresión génica digital a partir del producto de expresión génica aislado, en el que los datos de expresión génica digital comprenden datos para genes en una firma de expresión génica, y en el que la firma de expresión génica comprende al menos uno de los genes enumerados en la tabla 2; (c) obtener opcionalmente datos de expresión génica digital de un primer y segundo conjunto de sondas de referencia, el segundo conjunto de sondas de referencia conocido para clasificar ABC DLBCL, GCB DLBCL, PMBL, BL o MCL; (d) generar un promedio ponderado de los niveles de expresión de los genes a partir de la firma de expresión génica para obtener de este modo un valor de firma de expresión génica; (e) calcular una puntuación predictiva basada en el valor de la firma de expresión génica usando la ecuación: **Fórmula** en la que yi es una puntuación predictiva, xi son los recuentos para el gen i para el conjunto de sondas i, el conjunto de sondas i es de la muestra que se está sometiendo a análisis, xj es el recuento para el gen j para el conjunto de sondas j, el conjunto de sondas j es el conjunto de genes de normalización de la muestra que se está sometiendo a prueba, hj es el peso de normalización para el conjunto de sondas j como se enumera en la tabla 4, ri es el recuento para el gen i para el conjunto de sondas i en el primer conjunto de sondas de referencia, 30 y gi es el recuento de gen i para el conjunto de sondas i en el segundo conjunto de sondas de referencia, siendo los términos matemáticos con ri y gi igual a cero si no se obtienen datos de expresión génica digital de un primer y segundo conjunto de sondas de referencia; (f) clasificar el sujeto como perteneciente a uno de los siguientes en base a la puntuación predictiva de (e): (i) ABC DLBCL, (ii) GCB DLBCL, (iii) PMBL, (iv) BL o (v) MCL; (g) seleccionar una opción de tratamiento para el sujeto basada en la clasificación del sujeto en (f);

Description

DESC

Procedimiento para el subtipado de tipos de linfoma por

La presente invención fue realizada con la financiación d por los Institutos Nacionales de Salud. La presente inve número de proyecto ZIA BC011006-05 por los Instituto gobierno tiene determinados derechos sobre la invención

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

En los últimos 25 años se ha propuesto una variedad de si de 1980, se introdujo la Formulación de trabajo como u características morfológicas y clínicas. En la década de Lymphoma (REAL) en un intento por tener en cuent clasificación de los linfomas (Harris 1994). El estándar Salud (OMS), intenta desarrollar estos sistemas anteri Tumours of Haematopoietic and Lymphoid Tissues, 4.a ed Organization (2008); y Jaffe, E.S., Pathology & Genetics Classification of Tumours, Pathology and Genetics series en varios factores, que incluyen la morfología del tumor, características clínicas.

Otros diagnósticos a los que no se han asignado númer VIH, el subtipo similar a linfocitos B del centro germinal linfocitos B activados de linfoma difuso de linfocitos mononucleosis infecciosa (no cancerosa).

Aunque la clasificación de la OMS ha demostrado su util asignados a la misma categoría de diagnóstico de la diferentes. En muchos casos, estos resultados diferentes que no se pueden observar fácilmente mediante el anális

El linfoma difuso de linfocitos B grandes (DLBCL) se pued (GCB) o el subtipo de linfocitos B activados (ABC) en describe previamente desde el punto de vista molecu linfomas/leucemias (Lymphoma/Leukemia Molecular Profi 511 (2000)). Sin embargo, se necesitan ensayos de diag los requisitos para participar en ensayos clínicos que uti predictivos.

Por lo tanto, se necesitan procedimientos más preciso características moleculares. La invención proporciona dic

BREVE SUMARIO DE LA INVENCIÓN

La invención proporciona un procedimiento para selecci difuso de linfocitos B grandes similares a linfocitos B activ B grandes similares a linfocitos B del centro germinal (G linfocitos B (PMBL), un sujeto con linfoma de Burkitt (B procedimiento comprende: (a) aislar un producto de exp linfoma; (b) obtener datos de expresión génica digital a p datos de expresión génica digital comprenden datos para de expresión génica comprende al menos uno de los ponderado de los niveles de expresión de los genes a part un valor de firma de expresión génica; (d) calcular una pun génica; (e) clasificar al sujeto como perteneciente a uno (d): (i) ABC DLBCL, (ii) GCB DLBc L, (iii) PMBL, (iv) BL sujeto basada en la clasificación del sujeto en (e); y (g) p

La invención también proporciona un procedimiento par linfoma difuso de células B grandes (DLBCL). El procedi de una muestra de biopsia de un sujeto con DLBCL; (b) o de expresión génica aislado, en el que los datos de exp firma de expresión génica, y en el que la firma de expresi ASB13 (n.° de acceso a GenBank Nm_024701.3), CCDC CIÓN

io de perfiles de expresión

obierno con la subvención n.° U01 CA084967, otorgada n fue realizada con la financiación del gobierno con el acionales de la Salud, Instituto Nacional del Cáncer. El

mas para identificar y clasificar los linfomas. En la década rocedimiento para clasificar los linfomas basado en las 0, se introdujo el sistema Revised European American s características inmunofenotípicas y genéticas en la reciente, establecido por la Organización Mundial de la s (véase Swerdlow et al., eds., WHO Classification of ternational Agency for Research on Cancer; World Health umours of Haematopoietic and Lymphoid Tissues, WHO 01)). La clasificación de la OMS de los linfomas se basa munofenotipo, las anomalías genéticas recurrentes y las

e diagnóstico de la OMS incluyen el linfoma asociado al nfoma difuso de linfocitos B grandes, el subtipo similar a grandes, la hiperplasia folicular (no cancerosa), y la

d en el control y tratamiento de los pacientes, pacientes S a menudo tienen resultados clínicos notablemente cen deberse a diferencias moleculares entre los tumores e la morfología del tumor.

asificar como el subtipo de linfocitos B del centro germinal e a la distinción de las células de origen (COO) según el Proyecto de determinación del perfil molecular de Project, LLMPP) (véase Alizadeh et al., Nature, 403:503-ico más exactos para determinar si los pacientes reúnen n agentes dirigidos y para su uso como biomarcadores

ara identificar y clasificar los linfomas basados en sus procedimientos.

r una opción de tratamiento para un sujeto con linfoma s (ABC DLBCL), un sujeto con linfoma difuso de linfocitos DLBCL), un sujeto con linfoma primario mediastínico de un sujeto con linfoma de células del manto (MCL). El ión génica de una muestra de biopsia de un sujeto con r del producto de expresión génica aislado, en el que los es en una firma de expresión génica, y en el que la firma es enumerados en la tabla 2; (c) generar un promedio e la firma de expresión génica para obtener de este modo ción predictiva basada en el valor de firma de la expresión os siguientes grupos en base la puntuación predictiva de ) MCL; (f) seleccionar una opción de tratamiento para el rcionar la opción de tratamiento al sujeto.

leccionar una opción de tratamiento para un sujeto con to comprende: (a) aislar un producto de expresión génica er datos de expresión génica digital a partir del producto ón génica digital comprenden datos para genes en una énica comprende al menos uno de los siguientes genes: (n.° de acceso a GenBank NM_174908.3), CREB3L2 (n.° de acceso de GenBank NM_194071.2), CYB5R2 (n.° d GenBank NM_002460.1), ISY1 (n.° de acceso a Ge NM_002221.3), LIMD1 (n.° de acceso a GenBank NM_ MME (n.° de acceso a GenBank NM_000902.2), MYB acceso a GenBank NM_006875.2), R3HDM1 (n.° de a GenBank NM_001135664.1), S1p R2 (n.° de acceso a G NM_001042518.1), TNFRSF13B (n.° de acceso a Ge NM_030961.1), UBXNN4 (n.° de acceso a GenBa NM_017706.4); (c) generar un promedio ponderado de expresión génica para obtener de este modo un valor predictiva basada en el valor de firma de expresión gé siguientes grupos en base a la puntuación predictiva linfocitos B activados (ABC DLBCL) o (ii) linfoma difus germinal (GCB DLBCL); (f) seleccionar una opción de tr en (e); y (g) proporcionar la opción de tratamiento al suj

La invención proporciona un procedimiento para selec similares a linfocitos B del centro germinal (GCB DLBC hidroxidaunorubicina, Oncovin (vincristina) y prednison producto de expresión génica de una muestra de biop génica digital a partir del producto de expresión géni comprenden datos para genes en una firma de expresió al menos uno de los siguientes genes: ASB13 (n.° de a GenBank NM_174908.3), CREB3L2 (n.° de acceso a NM_016229.3), IRF4 (n.° de acceso a GenBank NM_ ITPKB (n.° de acceso a GenBank NM_002221.3), LIMD acceso a GenBank NM_018717.4), MME (n.° de acceso XM_034274.14), PIM2 (n.° de acceso a GenBank NM_0 RAB7L1 (n.° de acceso a GenBank NM_001135664.1), (n.° de acceso a GenBank NM_001042518.1), TNFRS de acceso a GenBank NM_030961.1), UBXn N4 (n.° de GenBank NM_017706.4); (c) generar un promedio pon firma de expresión génica para obtener de este mod puntuación predictiva basada en el valor de firma de e uno de los siguientes grupos en base a la puntuación similares a linfocitos B activados (ABC DLBCL) o (ii) linf centro germinal (GCB DLBCL); (f) seleccionar un suj proporcionar tratamiento con R-CHOP al sujeto con g C con ABC DLBCL.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS VARIAS VISTAS DE

La figura es un diagrama que ilustra la lógica empleada GCB DLBCL, (iii) PMBL, (iv) BL o (v) MCL en base a los

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

El perfil de expresión génica de una célula cancerosa momento del diagnóstico. Como consecuencia, la i genómica proporciona una base para una nueva clasific de la supervivencia y la respuesta al tratamiento. La inve clasificar un linfoma, un tumor maligno linfático o un tra génica. La información obtenida usando estos procedimi se empleará con respecto a un sujeto en particular.

El término "trastorno linfoproliferativo", como se usa linfocitos, y se puede referir tanto a tumores malignos linfática", como se usan en el presente documento, se linfocitos y linfoblastos. Los ejemplos de linfomas incluye (BL), linfoma de células del manto (MCL), hiperplasia linfoma del tejido linfático asociado a la mucosa (MALT), trastorno linfoproliferativo postrasplante (PTLD), linfoma difuso de linfocitos B grandes similares a linfocitos B del similares a linfocitos B activados (ABC) y linfoma primar eso a GenBank NM_016229.3), IRF4 (n.° de acceso a k NM_020701.2), ITPKB (n.° de acceso a GenBank 0.2), MAML3 (n.° de acceso a GenBank NM_018717.4), ° de acceso a GenBank XM_034274.14), PIM2 (n.° de a GenBank NM_015361.2), RAB7L1 (n.° de acceso a nk NM_004230.2), SERPINA9 (n.° de acceso a GenBank k NM_012452.2), TRIM56 (n.° de acceso a GenBank _014607.3) y WDR55 (n.° de acceso a GenBank iveles de expresión de los genes a partir de la firma de irma de expresión génica; (d) calcular una puntuación (e) clasificar al sujeto como perteneciente a uno de los ): (i) linfoma difuso de linfocitos B grandes similares a linfocitos B grandes similares a linfocitos B del centro iento para el sujeto basada en la clasificación del sujeto

a un sujeto con linfoma difuso de linfocitos B grandes ra el tratamiento con R-CHOP (Rituxan, ciclofosfamida, procedimiento comprende las etapas de: (a) aislar un un sujeto con DLBCL; (b) obtener datos de expresión lado, en el que los datos de expresión génica digital ica, y en el que la firma de expresión génica comprende a GenBank NM_024701.3), CCDC50 (n.° de acceso a nk NM_194071.2), CYB5R2 (n.° de acceso a GenBank 0.1), ISY1 (n.° de acceso a GenBank NM_020701.2), de acceso a GenBank NM_014240.2), MAML3 (n.° de Bank NM_000902.2), MYBL1 (n.° de acceso a GenBank .2), R3HDM1 (n.° de acceso a GenBank NM_015361.2), 2 (n.° de acceso a GenBank NM_004230.2), SERPINA9 (n.° de acceso a GenBank NM_012452.2), TRIM56 (n.° o a GenBank NM_014607.3) y WDR55 (n.° de acceso a de los niveles de expresión de los genes a partir de la valor de firma de expresión génica; (d) calcular una ión génica; (e) clasificar al sujeto como perteneciente a ictiva de (d): (i) linfoma difuso de linfocitos B grandes difuso de linfocitos B grandes similares a linfocitos C del on GCB DLBCL para tratamiento con R-CHOP; y (g) BCL y proporcionar un tratamiento diferente a un sujeto

IBUJOS

clasificación de un sujeto que tiene (i) ABC DLBCL, (ii) elos de predicción descritos en este documento.

opsia refleja el fenotipo molecular de un cáncer en el detallada proporcionada por el patrón de expresión sistemática de los cánceres y predictores más exactos divulga procedimientos para identificar, diagnosticar y/o o linfoproliferativo en base a sus patrones de expresión será útil para evaluar el enfoque terapéutico óptimo que

presente documento, se refiere a cualquier tumor de benignos. Los términos "linfoma" y "neoplasia maligna ren específicamente a tumores malignos derivados de o no se limitan a, linfoma folicular (FL), linfoma de Burkitt lar (FH), linfoma linfocítico de células pequeñas (SLL), a esplénico, mieloma múltiple, linfoma linfoplasmocítico, lástico, linfoma de la zona marginal nodal (NMZ), linfoma o germinal (GCB), linfoma difuso de linfocitos B grandes diastínico de linfocitos B (PMBL).

La frase "tipo de linfoma" (o simplemente "tipo") como s diagnóstica de un linfoma. La frase se puede referir a etc.) o a un subtipo o subgrupo que está dentro de un DLBCL). En un modo de realización, la invención com que tiene un linfoma difuso de linfocitos B grandes simil de linfocitos B grandes similares a linfocitos B del centr linfocitos B (PMBL), un linfoma de Burkitt (BL) o un linfo

El procedimiento de la invención comprende aislar un pr muestra de biopsia de un sujeto, tal como de una mue biopsia fijada con formol e incluida en parafina (FFPE) se usa en el presente documento, se refiere a cualquier de genes. El producto de expresión génica puede ser, transcripción inversa de ARNm celular total, o una prot sujeto de cualquier manera adecuada. Por ejemplo, se p al que se ha diagnosticado un tipo de linfoma particular, en parafina usando protocolos que son conocidos en ejemplo, Keirnan, J. (ed.), Histological and Histochemi Harbor Laboratory Press (2008)). El producto de expres usando procedimientos conocidos en la técnica o dis Cancer Epidemiol Biomarkers Prev., 19: 973-977 (20 (Qiagen, Venlo, Netherlands); y MAGMAX™ FFPE DN

El procedimiento según la invención comprende además de expresión génica aislado, en el que los datos de ex firma de expresión génica. La frase "datos de expresión información relativa al nivel relativo o absoluto de expre células. El nivel de expresión de un gen se puede deter por el gen. De forma alternativa, el nivel de expresió fragmento del mismo codificado por el gen. Se pueden o para un grupo de células, tal como un tumor o una mu para cuantificar la expresión de al menos un gen, conj datos de expresión génica para su uso en la invención. génica usando una o más micromatrices. Las micromatr limitarse a, los basados en ácidos nucleicos o los bas medir mediante una variedad de otras técnicas, incluye tiempo real, amplificación de RNA, hibridación in situ, in de la expresión génica (SAGE) (Velculescu et al., Scienc o hibridación por inmunoelectrotransferencia.

Las micromatrices de ácido nucleico comprenden en gen y colocadas en una matriz ordenada sobre un soporte.

una membrana de nailon o una oblea de silicona. Los hibridando la micromatriz con el producto de expresión g ser, por ejemplo, ARNm celular total, ARNr o ADNc producto de expresión génica de una muestra se marca la detección. Después de la hibridación, se lava la micr expresión génica con cada sonda de ácido nucleico en l phosphorimager o un microscopio confocal de barrido.

La micromatriz puede ser una micromatriz de ADNc o consisten en cientos o miles de sondas de ADNc inmov por ejemplo, Southern et al., Genomics, 13:1008-1017 ( Gress et al., Oncogene, 13:1819-1830 (1996); Pietu et 270:467-470 (1995); DeRisi et al., Nat. Genet., 14:457-4 10619 (1996); Shalon et al., Genome Res., 6:639-645 ( Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94:2150-2155 (1997); y Lash Las matrices de oligonucleótidos difieren de las matrice meros. Las matrices de oligonucleótidos se producen técnicas de enmascaramiento fotolitográfico (véase, po 5026 (1994); Lipshutz et al., Biotechniques, 19:442-447 al., Nat. Biotechnol., 14:1675-1680 (1996); y Wodicka e para matrices de oligonucleótidos es típicamente una s

Se han descrito procedimientos y técnicas aplicables a de EE. UU 5.143.854, 5.242.974, 5.252.743, 5.324.6 en el presente documento se refiere a una clasificación ase amplia de linfomas (por ejemplo, DLBCL, FL, MCL, e amplia de linfomas (por ejemplo, GCB DLBCL y ABC e seleccionar una opción de tratamiento para un sujeto a linfocitos B activados (ABC DLBCL), un linfoma difuso inal (GCB DLBCL), un linfoma primario mediastínico de células del manto (MCL).

to de expresión génica de un sujeto, por ejemplo, de una e biopsia ultracongelada de un sujeto o una muestra de sujeto. El término "producto de expresión génica", como cula que se produce como resultado de la transcripción jemplo, ARNm celular total, ARNr, ADNc obtenido por El producto de expresión génica se puede obtener del n obtener una o más muestras de biopsia de un paciente muestras de biopsia se pueden fijar con formol e incluir cnica o están disponibles comercialmente (véase, por ethods: Theory and Practice, 4.a edición, Cold Spring énica se puede extraer de una muestra de biopsia FFPE es comercialmente (véase, por ejemplo, Huang et al., lAamp DNA FFPE Tissue Kit, RNAEASY™ FFPE Kit tion Kit (Life Technologies, Carlsbad, CA)).

ner datos de expresión génica digital a partir del producto ón génica digital comprenden datos para genes en una a", como se usa en el presente documento, se refiere a e un gen o conjunto de genes en una célula o grupo de en base al nivel de ARN, tal como el ARNm, codificado uede determinar en base al nivel de un polipéptido o rir "datos de expresión génica" para una célula individual e biopsia. Se puede usar cualquier procedimiento eficaz de genes o grupo de conjuntos de genes para adquirir ejemplo, se pueden medir o estimar datos de expresión pueden ser de cualquier tipo eficaz, incluyendo, pero sin en anticuerpos. La expresión génica también se puede pero sin limitarse a, p Cr , RT-PCR cuantitativa, PCR en istoquímica, inmunocitoquímica, FACS, análisis en serie :484-487 (1995)), hibridación por transferencia Northern

ondas de ácido nucleico derivadas de genes individuales oporte puede ser, por ejemplo, un portaobjetos de vidrio, ones de expresión génica en una muestra se obtienen de la muestra. Este producto de expresión génica puede do por transcripción inversa de ARNm celular total. El n marcador radioactivo, fluorescente u otro para permitir z y se detecta y cuantifica la hibridación del producto de romatriz usando un dispositivo de detección tal como un

micromatriz de oligonucleótido. Las matrices de ADNc s sobre un soporte sólido, y se describen en detalle en, Southern et al., Nucl. Acids. Res., 22:1368-1373 (1994); enome Res., 6:492-503 (1996); Schena et al., Science, 96); Schena et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:10614-DeRisi et al., Science, 278:680-686 (1997); Heller et al., t al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94:13057-13062 (1997). DNc en que las sondas son oligonucleótidos de 20 a 25 neral por síntesis de oligonucleótidos in situ junto con plo, Pease et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:5022-5); Chee et al., Science, 274:610-14 (1996); Lockhart et at. Biotechnol., 15:1359-1367 (1997)). El soporte sólido ie de vidrio o silicona.

tesis y el uso de matrices , por ejemplo, en las patentes 384.261, 5.424.186, 5.445.934, 5.451.683, 5.482.867, 5.491.074, 5.527.681, 5.550.215, 5.571.639, 5.578.83 5.831.070, 5.837.832, 5.856.101, 5.858.659, 5.936.32 6.033.860, 6.040.193, 6.090.555 y 6.410.229, y la publi técnicas para la síntesis de micromatrices utilizando pro en las patentes de EE. UU. 5.384.261 y 6.040.193. Las superficies poliméricas, fibras tal como fibra óptica, vidri patentes de EE. UU. 5.708.153, 5.770.358, 5.789.162, 5

Las micromatrices se pueden empaquetar de tal manera todo incluido (véase, por ejemplo, las patentes de EE. U micromatrices dirigidas a una variedad de propósitos de

"Datos de expresión génica digital", como se usan en e que se basa en la generación de marcas de secuencia, basan en hibridación con colecciones de ADNc o de olig

Se pueden obtener y analizar datos de expresión génica la técnica, tal como, por ejemplo, análisis en serie de la al., Science, 270 (5235):484-487 (1995)), SuperSAGE USA, 100(26):15718-15723 (2003)), análisis de transfer Cancer Research, 10: R91 (2008)) y RNA-seq (véase, po En un modo de realización, los datos de expresión géni NCOUNTER™ disponible de NanoString Technologies, hasta 800 genes en una única reacción con alta sen expresión. El ensayo NCOUNTER™ se basa en la dete pares de sondas codificadas por colores, específicas de transcripción inversa o la amplificación del ADNc result un par de sondas indicadoras y de captura que llevan Además, cada sonda indicadora lleva un código de color de los genes de interés, mientras que las sondas de proporciona un identificador molecular para la unión d Después de la hibridación en fase de solución entre el A eliminan las sondas sobrantes y los complejos sonda/di que a continuación se coloca en un analizador digital p Cientos de miles de códigos de color que designan di superficie del cartucho. El nivel de expresión de un gen s de barras codificado por colores para ese gen, y a con tecnología NANOSTRING™ y el análisis de datos de ex Kulkarni, M. M., "Digital Multiplexed Gene Expression A Current Protocols in Molecular Biology. 94:25B.10.1-25B (2008); y la patente de EE. UU. 7.919.237.

El término "firma de expresión génica" o "firma" como se expresados coordinadamente. Los genes que compone específico, una etapa de diferenciación o durante un aspectos biológicos de los tumores en los que se expre las células no cancerosas en la biopsia y los mecanism Shaffer et al., Immunity, 15:375-385 (2001)). Los ejempl (véase Shaffer et al., supra), proliferación (véase, por e (2002)), MHC de clase II, ABC DLBCL alto, diferen inmunitaria 1, respuesta inmunitaria 2 y linfocitos B del c

La invención proporciona firmas de expresión génica qu y a continuación seleccionar una opción de tratamiento invención proporciona una novedosa matriz de 800 ge linfoma. La matriz de 800 genes contiene genes identifi ABC DLBCL, GCB DLBCL, PMBL, BL y MCL, que se DLBCL o MCL, o conocidos en la técnica como de pa secuencias de sondas que comprenden la matriz de 80 93.839, 5.599.695, 5.624.711, 5.631.734, 5.795.716, 68.740, 5.974.164, 5.981.185, 5.981.956, 6.025.601, de solicitud de patente de EE. UU. 2003/0104411. Las ientos de síntesis mecánica se describen, por ejemplo, matrices pueden ser ácidos nucleicos en perlas, geles, alquier otro sustrato apropiado (véase, por ejemplo, las 992 y 6.040.193.

ermitan un uso diagnóstico, o pueden ser un dispositivo 56.174 y 5.922.591). Están disponibles comercialmente etrix (Affymetrix, Santa Clara, CA).

cumento, se refieren a información de expresión génica rencia de "datos de expresión génica analógica" que se leótidos en matrices como se describe anteriormente.

l usando una variedad de procedimientos conocidos en sión génica (SAGE) (véase, por ejemplo, Velculescu et , por ejemplo, Matsumura et al., Proc. Natl. Acad. Sci. Northern digital (véase, por ejemplo, Cao et al., Breast plo, Mortazavi et al. Nat Methods, 5(7):621 -628 (2008)). ital se obtienen usando el ensayo de expresión génica l ensayo NCOUNTER™ puede detectar la expresión de ad y linealidad en una amplio intervalo de niveles de digital directa de moléculas de ARNm de interés usando iana, y no requiere la conversión de ARNm a ADNc por or PCR. Cada gen diana de interés se detecta usando ncias específicas de una diana de 35 a 50 nucleótidos. en el extremo 5' que activa el código de barras molecular a llevan un marcador de biotina en el extremo 3' que genes diana para facilitar la detección digital posterior. diana y los pares de sondas indicadoras-de captura, se e alinean e inmovilizan en un cartucho NCOUNTER™, adquisición de imágenes y el procesamiento de datos. de interés de ARNm se muestran directamente en la e contando el número de veces que se detecta el código ión se tabulan los recuentos de códigos de barras. La n génica digital se describen en detalle en, por ejemplo, is Using the NANOSTRING™ NCOUNTER™ System", 7 (2011); Geiss et al., Nature Biotechnology, 26:317-325

n el presente documento se refiere a un grupo de genes firma particular se pueden expresar en un linaje celular uesta biológica particular. Los genes pueden reflejar al como la célula de origen del cáncer, la naturaleza de ogénicos responsables del cáncer (véase, por ejemplo, firmas de expresión génica incluyen ganglios linfáticos o, Rosenwald et al., New Engl. J. Med., 346:1937-1947 de linfocitos B, linfocitos T, macrófagos, respuesta germinal.

ueden usar para clasificar tipos particulares de linfomas piada basada en esa clasificación. A este respecto, la ara la identificación y diagnóstico de diversos tipos de previamente como expresados diferencialmente entre mostrado que están asociados con la supervivencia en ar importancia en la biología linfática. Los genes y las s se exponen en la tabla 1.

Tabla

Se pueden usar firmas de expresión génica basadas e de 800 genes para diagnosticar a un paciente que tiene B activados (ABC DLBCL), un linfoma difuso de linfocito DLBCL), un linfoma primario mediastínico de linfocitos del manto (MCL). Por ejemplo, una firma de expresión tiene uno de los tipos de linfoma mencionados anterior de los genes expuestos en la tabla 1 (por ejemplo, 2, 5, 500, 600 o 700 genes, o un intervalo definido por cualq firma de expresión génica que se puede usar para diag BL o MCL incluye 15-200 de los genes expuestos en la genes, o un intervalo definido por cualquiera de los do expresión génica usada para diagnosticar a un paciente genes expuestos en la tabla 2, o un subconjunto de los 100, 125, 150 o 190 de los genes expuestos en la tabl anteriores).

vedosas combinaciones de genes derivados de la matriz linfoma difuso de linfocitos B grandes similares a linfocitos grandes similares a linfocitos B del centro germinal (GCB MBL), un linfoma de Burkitt (BL) o un linfoma de células a que se puede usar para diagnosticar a un paciente que e incluye al menos uno, pero preferentemente dos o más 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 400, a de los dos valores anteriores). De manera deseable, la icar a un paciente con ABC DLBCL, GCB DLBCL, PMBL, a 1 (por ejemplo, 15, 30, 50, 75, 100, 125, 150, 175 o 200 lores anteriores). En un modo de realización, la firma de ABC DLBCL, GCB DLBCL, PMBL, BL o MCL incluye los s expuestos en la tabla 2 (por ejemplo, 10, 15, 30, 50, 75, o un intervalo definido por cualquiera de los dos valores Tabla 2

La invención también proporciona un procedimiento para ya se ha diagnosticado un linfoma difuso de linfocitos producto de expresión génica de una muestra de biopsia digital a partir del producto de expresión génica aislado.

génica de una muestra de biopsia de un sujeto con DLB producto de expresión génica aislado. Las descripcione génica digital y la firma de expresión génica expuestas a la invención también son aplicables a esos mismos as anteriormente para seleccionar una opción de tratamient

La invención proporciona además un procedimiento para R-CHOP (Rituxan, ciclofosfamida, hidroxidaunorubicin comprende (a) aislar un producto de expresión génica de datos de expresión génica digital a partir del producto de génica digital comprenden datos para genes en una firma los niveles de expresión de genes de la firma de expresi expresión génica; (d) calcular una puntuación predictiva b al sujeto como perteneciente a ABC DLBCL o GCB DLB un sujeto con GCB DLBCL para tratamiento con R-CHO GCB DLBCL y proporcionar un tratamiento diferente a un expresión génica, los datos de expresión génica digital relación con otros modos de realización de la invenci procedimiento según la invención mencionado anterior tratamiento con R-CHOP.

La invención proporciona firmas de expresión génica que al subtipo GCB o al subtipo ABC y a continuación selec clasificación. A este respecto, la invención proporciona diagnóstico de diversos tipos de linfoma. La matriz d mantenimiento, y se basa en un estudio piloto descrito e también el ejemplo del presente documento). Los genes leccionar una opción de tratamiento para un sujeto al que randes (DLBCL). El procedimiento comprende aislar un n sujeto con DLBCL, y obtener datos de expresión génica rocedimiento comprende aislar un producto de expresión , y obtener datos de expresión génica digital a partir del el producto de expresión génica, los datos de expresión riormente en relación con otros modos de realización de ctos del procedimiento según la invención mencionado ara un sujeto al que ya se ha diagnosticado un DLBCL.

leccionar un sujeto con GCB DLBCL para tratamiento con Oncovin (vincristina) y prednisona). El procedimiento a muestra de biopsia de un sujeto con DLBCL; (b) obtener presión génica aislado, en el que los datos de expresión expresión génica (c) generar un promedio ponderado de génica para, de este modo, obtener un valor de firma de ada en el valor de firma de expresión génica; (e) clasificar en base a la puntuación predictiva de (d); (f) seleccionar y (g) proporcionar tratamiento con R-CHOP al sujeto con jeto con ABC DLBCL. Las descripciones del producto de firma de expresión génica expuestas anteriormente en también son aplicables a esos mismos aspectos del nte para seleccionar un sujeto con GCB DLBCL para

pueden usar para clasificar un DLBCL como perteneciente nar una opción de tratamiento adecuada basada en esa a novedosa matriz de 20 genes para la identificación y 0 genes contiene 15 genes de interés y 5 genes de enz et al., N. Engl. J. Med., 359:2313-2323 (2008) (véase s secuencias de sondas que comprenden la matriz de 20 genes se exponen en la tabla 3. Se pueden usar firmas de de los genes de la matriz de 20 genes para diagnosticar ejemplo, una firma de expresión génica que se puede usa DLBCL incluye al menos uno, pero preferentemente dos o 15, 16, 17, 18 , 19 o 20) de los genes expuestos en la tabla presión génica basadas en la totalidad o combinaciones ue un paciente tiene ABC DLBCL o GCB DLBCL. Por ara diagnosticar a un paciente con ABC DLBCL o GCB ás (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6 , 7, 8 , 9, 10, 11, 12, 13, 14,

En un modo de realización, un procedimiento usado p pertenezca a ABC DLBCL, GCB DLBCL, PMBL, BL o MC génica de la firma de expresión génica y realizar un contr evaluar la probabilidad de que una muestra particular plica (1) normalizar y transformar los datos de expresión de calidad, (2 ) formar submodelos trinarios individuales, y (3) combinar submodelos en una predicción final. Los d con cada conjunto de sondas un valor igual a log2 de los sondas. A continuación, se puede generar un promedio firma de expresión génica multiplicando los datos transfo se expone en la tabla 4) y sumándolos para llegar a un fac que 4,5, la muestra se excluye por ser de mala calidad.

cada uno de los recuentos de datos transformados logarít el lote de chips y una matriz estándar de referencia, ent puntuación para los recuentos de la matriz de referencia para ese gen. Estas etapas mencionadas anteriormen puntuación predictiva y¡ (la señal de salida final usada par

^y, ^{= lo§ 2 O,-) - X lo§^ (} j

en la que x ^¡es el recuento para el conjunto de sondas i e h ^jes el peso de mantenimiento para el conjunto de sonda de referencia y g ^¡es el recuento para el conjunto de sond

La clasificación final del sujeto como perteneciente a (i) A basa en una combinación de cinco submodelos trinarios myc, PMBL, ABC DLBCL y GCB DLBCL), cada uno de lo 1 ,0 ,1 ) de acuerdo con la siguiente fórmula:

s de expresión génica se pueden transformar asociando uentos de los que se ha informado para ese conjunto de nderado de los niveles de expresión de los genes de la ados por sus respectivos pesos de normalización (como de normalización. Si el factor de normalización es menor otro modo, el factor de normalización se puede restar de camente. Si hay disponible una matriz de referencia para es para cada conjunto de sondas se resta el log2 de la ra ese gen y se suma el log2 de los recuentos estándar se resumen en la siguiente ecuación, que calcula la l conjunto de sondas i):

^{hj ~} ^{lo§ 2 i r ,) lo§ 2 (§,■)}

a matriz de la muestra que se está sometiendo a prueba, r ^¡es el recuento para el conjunto de sondas i en la matriz i en la matriz estándar.

DLBCL, (ii) GCB DLBCL, (iii) PMBL, (iv) BL o (v) MCL se ra cada tipo de linfoma (es decir, MCL, BL non-myc, BL uales produce tres valores de salida posibles (es decir, -

en la que y¡ es la puntuación predictiva y¡ asignada al conj pesos asociados con ese conjunto de sondas para el mod los puntos de corte superior e inferior para un submodelo o de sondas ¡ como se describe anteriormente, w¡ son los particular como se presenta en la tabla 4, y se establecen rticular en la tabla 5.

abla 5

Los cinco submodelos se pueden combinar de acuerdo (1) Si el submodelo de MCL tiene un valor de 1, la m Si el submodelo de MCL tiene un valor de 0, la mues Si el submodelo de MCL tiene un valor de -1, contin (2) Si el submodelo de BL non-myc tiene un valor de Si el submodelo de BL non-myc tiene un valor de 0, l Si el submodelo de BL non-myc de tiene un valor de (3) Si el submodelo de BL myc tiene un valor de 0 o Si el submodelo de BL myc tiene un valor de -1, la m (4) Si el submodelo de PMBL tiene un valor de 1, la Si el submodelo de PMBL tiene un valor de 0, la mu Si el submodelo de PMBL tiene un valor de -1, conti (5) Si el submodelo de ABC/GCB tiene un valor de 1 Si el submodelo de ABC/GCB tiene un valor de 0, la Si el submodelo de ABC/GCB tiene un valor de -1, l Se puede realizar un análisis similar para predecir si un de linfocitos B del centro germinal (GCB) o el subtipo de A este respecto, se supone que la muestra no es de PM que emplea la siguiente lógica:

Si el submodelo de ABC/GCB tiene un valor de 1, la Si el submodelo de ABC/GCB tiene un valor de 0, la Si el submodelo de ABC/GCB tiene un valor de -1, l En otro modo de realización, evaluar la probabilidad de ABC o al subtipo GCB puede implicar el cálculo de u contiene los genes expuestos en la tabla 3. La puntuació anteriormente con respecto a la clasificación de ABC DL diferente de pesos del modelo, pesos de mantenimiento el conjunto de sondas de 20 genes para el submodelo de corte inferior para el submodelo de ABC/GCB es 1988 de ABC/GCB es 2513,9.

T la lógica expuesta a continuación y resumida en la figura. tra se llama MCL.

se llama MCL inclasificable pero en el límite.

a la etapa 2.

continuar a la etapa 3.

uestra se llama BL inclasificable pero en el límite.

continuar a la etapa 4.

a muestra se llama BL.

stra se llama BL inclasificable pero en el límite.

estra se llama PMBL.

a se denomina PMBL inclasificable pero en el límite.

r a la etapa 5.

muestra se llama ABC.

estra se llama DLBCL sin clasificar.

uestra se llama GCB.

jeto al que ya se ha diagnosticado DLBCL tiene el subtipo focitos B activados (ABC) usando la matriz de 800 genes. LBCL, por lo que solo se usa un submodelo de ABC/GCB

estra se llama ABC

estra se llama DLBCL sin clasificar

uestra se llama GCB.

e una muestra de DLBCL particular pertenezca al subtipo puntuación predictiva usando la matriz de 20 genes que redictiva se puede calcular usando los algoritmos descritos , GCB DLBCL, PMBL, BL o MCL, pero usando un conjunto untos de corte. Por ejemplo, los pesos (w) asociados con icular se exponen en la tabla 6. En este ejemplo, el punto mientras que el punto de corte superior para el submodelo

a 6

Un procedimiento alternativo para informar de la probabilid GCB DLBCL, PMBL, BL o Mc L evita asignar marcador cambio, proporciona un vector de cinco valores de confia muestra sea de uno de los cinco tipos de linfoma. Por

lineales para cada submodelo

como se de

de corte discretos para indicar uno de los tres grupos disc una puntuación de submodelo bayesiano:

de que una muestra particular pertenezca a ABC DLBCL, de clase de predicción discretos a cada muestra y, en . Cada valor de confianza indica la probabilidad de que la plo, en primer lugar se crean puntuaciones predictivas

ibe anteriormente. Sin embargo, en lugar de usar puntos

os, se puede usar la siguiente transformación para definir

en la que y¡, es el valor asignado al conjunto de sondas i con ese conjunto de sondas para el modelo particular c asociados con el submodelo como se expone en la tabla o se describe anteriormente; w¡ son los pesos asociados o se presenta en la tabla 4; mi vi, m² y V² son valores y 0 es la densidad gaussiana definida como sigue:

Ta 7

Los dos submodelos bayesianos se pueden combinar a c

g _ [ ^BLnon-myc BL {min(BBLnoii.myc, Los valores de confianza de cada subtipo se pueden calc inuación en la siguiente puntuación bayesiana única, B^{b l}:

S1 ^BLroyc ^ , 1

) si BEUnyc<0,\ '

r como sigue:

Confianza d

Confianza de BL

C o n fian za de P M B L =

Confianza de ABC = <'BAn

C o n fian za de G C B = 0 " ® ^ab

Se puede realizar un análisis similar del valor de la confi DLBCL tiene el subtipo de linfocitos B del centro germin la matriz de 800 genes. A este respecto, se supone que submodelo de ABC/GCB que emplea la siguiente lógica

Confianza de

Confianza de G

En otro modo de realización, evaluar la probabilidad de ABC o al subtipo GCB puede implicar el cálculo de valo los genes expuestos en la tabla 3. Los valores de co anteriormente con respecto a ABC DLBCL, GCB DLB pesos del modelo, pesos de mantenimiento y puntos de de sondas de 20 genes para el submodelo particular se modelo son, por ejemplo, 916,74, -449,76, 294,24 y 343

La clasificación de un trastorno linfoproliferativo de acu en combinación con cualquier otra característica o conj un trastorno se puede clasificar por un procedimiento propiedades morfológicas, propiedades histoquímica proliferación celular, inmunorreactividad, cuadro clínic pueden usar modos de realización de la invención en lu los linfomas, tales como inmunohistoquímica, citometría

Los procedimientos según la invención comprenden a basada en la clasificación del linfoma del sujeto. La dete mejor selección y aplicación de procedimientos terapéuti permite a un médico seleccionar los tratamientos que evita tratamientos que no sean productivas o incluso s nervioso central (SNC) puede ser útil para tratar el BL hidroxidaunorubicina, Oncovin (vincristina) y prednisona (véase, por ejemplo, Fisher et al., N. Engl. J. Med., 328: (1998)), y los sujetos con linfoma folicular con frecuenci folicular no lo hacen.

La opción de tratamiento seleccionada puede compr adecuados que muestren eficacia en el tratamiento d referencia actual para el linfoma difuso de linfocitos B antraciclinas tal como CHOP en combinación con la a (RITUXAN™, Genentech, Inc. , South San Franci (ciclofosfamida, doxorubicina, vincristina, metotrexato/if SNC y radioterapia. En un modo de realización, la inve sujeto con GCB DLBCL, mientras se proporciona un tr diagnóstico de ABC DLBCL puede tener un peor pr comparación con un diagnóstico de GCB DLBCL. En est proporcionar cualquiera de las opciones de tratamiento en la técnica por ser eficaces contra el linfoma.

Las opciones de tratamiento para el MCL incluyen, por (por ejemplo, rituximab), radioinmunoterapia y agent L — BMCL

(Bnr )(1 - BMCL)

mbl )( l - B ^bl) ( 1 - B MCL )

(1 - Bpmbl )(1 - Bl;l X1" BMCL)

)C1 " ^ ^pmbl) ( l “ ® ^{b l}“ ® ^mcl)■

para predecir si un sujeto al que ya se ha diagnosticado CB) o el subtipo de linfocitos B activados (ABC) usando uestra no es de PMBL DLBCL, por lo que solo se usa un

= (B ,iBC;ClCD)

= ( 1 - B . R(- ,GCR).

una muestra de DLBCL particular pertenezca al subtipo e confianza usando la matriz de 20 genes que contiene za se pueden calcular usando los algoritmos descritos MBL, Bl o MCL, pero usando un conjunto diferente de e. Por ejemplo, los pesos (w,) asociados con el conjunto nen en la tabla 6. Los valores de mi, m², vi y V² para este respectivamente.

con modos de realización de la invención se puede usar de características de clasificación eficaces. Por ejemplo, invención junto con directrices sugeridas por la o Ms , tructura cromosómica, mutación genética, tasas de respuesta a agentes químicos, biológicos u otros. Se o junto con otros procedimientos para el diagnóstico de ujo, FISH para translocaciones o diagnósticos de virus.

s seleccionar una opción de tratamiento para el sujeto ción exacta del tipo de linfoma en un sujeto permite una El conocimiento del linfoma exacto que afecta a un sujeto más apropiados y útiles para ese sujeto, al tiempo que ontraproducentes. Por ejemplo, la profilaxis del sistema no el DLBCL, el tratamiento con CHOP (ciclofosfamida, de ser útil para tratar el DLBCL pero no el MCL blástico 1006 (1993) y Khouri et al., J. Clin. Oncol., 12:3803-3809 ben tratamiento mientras que los sujetos con hiperplasia

cualquier régimen terapéutico o agente farmacéutico o de linfoma particular. Por ejemplo, el tratamiento de es (DLBCL) incluye pautas de quimioterapia a base de stración del anticuerpo monoclonal anti-CD20 rituximab CA) ("R-CHOP"), tratamiento con CODOX-M/IVAC ida, etopósido, citarabina en dosis altas), profilaxis del comprende proporcionar tratamiento con R-CHOP a un iento diferente a un sujeto con ABC DLBCL, ya que un ico en respuesta a la quimioterapia con R-CHOP en do de realización, al sujeto con ABC DLBCL se le puede itas en el presente documento o de otro modo conocidas

plo, quimioterapia (por ejemplo, CHOP), inmunoterapia iológicos (por ejemplo, inhibidores del proteasoma e inhibidores de mTor). Las opciones de tratamiento para decir, rituximab, etopósido, prednisona, Oncovirin (vincrist M/IVAC, inmunoterapia, trasplante de médula ósea, tras de tratamiento para el PBML son similares a las de DL radioterapia y/o trasplante de células madre. Otros trata vías específicas que sostienen la supervivencia en el linf

Los siguientes ejemplos ilustran más la invención, pero, ningún modo de su alcance.

EJEMPLO 1

Este ejemplo demuestra un procedimiento para determin usando perfiles de expresión génica en tejido incluido en

Aunque los subtipos ABC DLBCL y GCB DLBCL se defi (GEP) en tejidos ultracongelados (denominados en el p una práctica común usar procedimientos inmunohistoquí y ampliamente aplicables que usan tejidos incluidos en p la invención permite un ensayo molecular robusto y alta usando nuevas técnicas de GEP aplicables a FFPET. revisadas centralmente procedentes de casos coincide linfomas/leucemias (LLMPP) que tenían una COO "est U133 más 2,0 micromatrices (Affymetrix, Santa Clara, C comprendían 20 GCB DLBCL, 19 ABC DLBCL y 12 casos que incluye 68 casos (28 GCB DLBCL, 30 ABC DLBCL y et al., N. Engl. J. Med., 359:2313-2323 (2008), tenía las poblaciones con DLBCL.

Los ácidos nucleicos se extrajeron de rollos de FFPET d ARN usando el ensayo NANOSTRING™ (NanoString

FFPET se realizaron en paralelo en dos centros indepe MD) usando diferentes rollos de FFPET para determina portabilidad del ensayo. Para asignar COO por IHC, se cr 0,6 mm para la cohorte de validación y se tiñeron para det y LMO2. Dos hematopatólogos evaluaron independi alcanzándose el consenso sobre los casos discordan validación, los que producían y analizaban los datos de COO "estándar".

Las 119 biopsias de FFPET produjeron ARN suficiente. U 20 genes (es decir, 15 genes de interés y 5 genes NANOSTRING™, permitiría una replicación exacta del

El ensayo NANOSTRING™ se usó para cuantificar la ex que permitió optimizar el modelo de COO. A pesar de la e de las muestras de entrenamiento produjo datos de e incluyendo los coeficientes, los umbrales y los parámetro de validación independiente. El noventa y nueve por cie 12 años) proporcionó una expresión génica de calidad a y GCB DLBCL, las asignaciones de COO realizadas concordantes en un 93 %, con un 5 % U marcadas y 1 A en la tabla 8.

T L incluyen, por ejemplo, tratamiento con R-EPOCH (es - doxorubicina-ciclofosfamida), tratamiento con CODOX-te de células madre, cirugía y radioterapia. Las opciones , y también pueden incluir quimioterapia en dosis altas, ntos para el linfoma incluyen fármacos que se dirigen a , tal como, por ejemplo, el ibrutinib.

r supuesto, no se deben interpretar como limitantes de

btipos de linfoma difuso de linfocitos B grandes (DLBCL) afina y fijado con formol.

on originalmente utilizando el perfil de expresión génica nte documento "GEP congelado"), se ha convertido en s (IHC) menos precisos pero relativamente económicos na y fijados con formol (FFPET). El procedimiento según e exacto para la distinción entre células de origen (COO) realizaron estudios en biopsias de FFPET de DLBCL del Proyecto de determinación del perfil molecular de r" asignada por GEP congelado usando GENECHIP™ La cohorte de entrenamiento consistió en 51 casos que lasificables (U). Una cohorte de validación independiente, U) extraídos de la cohorte de validación descrita en Lenz orciones típicas de los subtipos de COO observados en

pm. La expresión génica digital se realizó en 200 ng de nologies, Seattle, WA). Todos los estudios de GEP de ntes (BC Cancer Agency, Vancouver y NCI, Bethesda, concordancia entre centros, que evalúa la robustez y la n micromatrices de tejido usando núcleos duplicados de r anticuerpos para CD10, BCL6, MUM1, FOXP1, GCET1 mente la proporción de células tumorales teñidas, con un tercer hematopatólogo. Para los estudios de e IHC estuvieron sometidos a enmascaramiento de la

tudio piloto que usó la cohorte de entrenamiento identificó antenimiento) cuya expresión, medida con el ensayo lo de asignación de COO descrito en Lenz et al., supra. ión de estos 20 genes en la cohorte de entrenamiento, lo de los bloques de FFPET (6 a 32 años), un 95 % (49/51) sión génica de calidad suficiente. El modelo de COO, QC, se "bloqueó" a continuación y se aplicó a la cohorte (67/68) de las muestras de la cohorte de validación (5 a ada. Al considerar los casos "estándar" de ABC DLBCL el ensayo NANOSTRING™ en el centro NCI fueron lasificado incorrectamente como GCB, como se muestra

8

Por tanto, 119 casos de DLBCL altamente caracterizados un algoritmo de definición de enfermedad publicado us cedentes del LLMPP, que se subtiparon previamente por GEP congelado, se analizaron con gran exactitud de acuerdo con el procedimiento según la invención. Est invención, que utilizó ARN de FFPET que se obtiene de fo deseable a las técnicas existentes para el análisis de cas los casos de ABC y GCB por el procedimiento según la 9 %, 6 % y 17 % para los algoritmos Hans, Tally y Choi (2004); Meyer et al., J. Clin. Oncol., 29(2):200-207 (2011 Además, la concordancia en un 100% de la asignación de entre los centros de la Agencia de Cáncer de BC y los procedimiento según la invención es robusto.

El procedimiento según la invención presenta un alto r respuesta rápido (<36 horas desde el bloqueo de FFP práctica clínica.

EJEMPLO 2

Este ejemplo demuestra un procedimiento para determi de gran malignidad (agg-B-NHL) usando perfiles de expre

Se evaluaron biopsias de tejido incluido en parafina y fija de expertos en hematopatología que tenían un contenido B. Las categorías diagnósticas incluyeron el linfoma difu similar a linfocitos B activados (ABC) y similar a linfocitos el linfoma primario mediastínico de linfocitos B (PMBCL), (MCL). Usando datos de GEP previos, firmas de dia (NanoString Technologies, Seattle, WA) y empleando pro DOI: 10.1182/blood-2013-11-536433), se diseñaron son utilidad para distinguir entre estas entidades patológicas.

La cohorte de entrenamiento comprendió 107 cas independientemente en el Laboratorio de Caracteriz Investigación de Cáncer (Frederick, MD) y el Centro par BC). El algoritmo resultante se bloqueó y se aplicó a una de las biopsias FFPET de estos casos se extrajeron analizándose 83 casos en ambos laboratorios para eval el cual se comparó la clasificación de NANOSTRING™ biopsias congeladas emparejadas en los casos de ABC, anatomopatológico por el panel de revisión de hematopat humanos y datos clínicos para este estudio fue aprobad Arizona de acuerdo con la Declaración de Helsinki.

El algoritmo bloqueado final consistió en 297 sondas de mantenimiento. Se analizaron de nuevo treinta y seis c conjunto de códigos de NANOSTRING™ para permitir la procedimiento de laboratorio y el algoritmo, conjuntament jerárquica de comparaciones por pares. En el conjunto d proporcionaron datos de expresión génica de calidad su presenta un resumen de la clasificación.

Ta resultados demuestran que el procedimiento según la a rutinaria para el diagnóstico, proporciona una alternativa de DLBCL. La tasa de error de clasificación de un 2 % de ención se compara favorablemente con las tasas de un espectivamente (véase Hans et al. Blood, 103(1):275-82 Choi et al., Clin. Cancer Res., 15(17):5494-502 (2009)). o (un 95 % si también se incluyen los casos U "estándar") CI indica que, a diferencia de los algoritmos de IHC, el

imiento con FFPET de archivo y permite un tiempo de hasta el resultado), lo que es altamente deseable en la

los subtipos de linfomas de linfocitos B no hodgkinianos n génica en tejido incluido en parafina y fijado con formol.

con formol (FFPET) calificadas por un panel de revisión tumor de >60 % e inmunofenotipo confirmado de linfocitos de linfocitos B grandes (DLBCL), incluyendo los subtipos de centro germinal (GCB), el DLBCL inclasificable (UNC), linfoma de Burkitt (BL) y el linfoma de células del manto óstico, el ensayo de expresión génica NCOUNTER™ dimientos publicados (Scott et al., Blood, (enero de 2014); s para 800 genes (que se muestran en la tabla 4) con

únicos, cuyas biopsias de FFPET se analizaron ión Molecular, el Laboratorio Nacional Frederick de el Cáncer Linfático, Agencia del Cáncer BC (Vancouver, horte independiente de 199 casos. Los ácidos nucleicos se analizaron en los dos laboratorios independientes, el desempeño entre laboratorios. El "estándar" mediante basó en el perfil de expresión génica de Affymetrix de B y DLBCL UNC (Lenz et al., supra) y en el diagnóstico gía en los casos de BL, MCL y p Mb c L. El uso de tejidos or la Junta de Revisión Institucional de la Universidad de

nes (mostradas en la tabla 2) que incluyen 47 genes de os de la cohorte de entrenamiento en el nuevo lote del libración de conjuntos de códigos cruzados del ensayo. El enominados la prueba "Lymph5Cx", consiste en una serie lidación independiente, 257/282 (91,1 %) de los ensayos ente (un total de 185 de los 199 casos). En la tabla 9 se

9

En esta cohorte, 136 casos (82 %) se asignaron correc diagnósticos incorrectos como sigue: 6 BL asignados denominado PMBCL y 4 PMBCL asignados a subtipo resultados indeterminados entre dos entidades de diagn centros de laboratorio fue 71/72 (99 %) de los casos qu ambos centros.

ente, mientras que a 12 casos (6 %) se les asignaron GCB, 1 GCB marcados como PMBCL, 1 DLBCL UNC e DLBCL. La prueba Lymph5Cx incluyó categorías de ico y se declararon en el límite. El acuerdo entre los dos roporcionaron datos adecuados de expresión génica en Por lo tanto, los resultados de este ejemplo demuestran las categorías diagnósticas a menudo clínicamente difícil con características histológicas e inmunofenotípicas de bajos, lo que sugiere que esta prueba sería útil junto co cuantificaron las vías que pueden ser dianas, así como l DLBCL (estromal) y m Cl (proliferación).

El uso de los términos "uno" y "una" y "el/la" y "al menos de la invención (especialmente en el contexto de las sig cubra tanto el singular como el plural, a menos que se in lo contradiga claramente. El uso del término "al menos un "al menos uno de A y B") se debe interpretar como un el o cualquier combinación de dos o más de los elementos en el presente documento o el contexto lo contradiga cl incluye" y "que contiene" se deben interpretar como térm limitarse a") a menos que se indique de otro modo. La r pretende servir simplemente como un procedimiento abr que esté dentro del intervalo, a menos que se indique de se incorpora a la memoria descriptiva como si se hubiera los procedimientos descritos en el presente documento s se indique de otro modo en el presente documento o el co los ejemplos, o lenguaje ejemplar (por ejemplo, "tal c simplemente iluminar mejor la invención y no plantea un indique de otro modo. Ningún lenguaje en la memoria cualquier elemento no reivindicado es esencial para la pr la prueba Lymph5Cx fue robusta y capaz de discriminar de agg-B-NHL usando una única metodología para casos agg-B-NHL. Los errores de clasificación errónea fueron los procedimientos de diagnóstico actuales. Además, se genes asociados con firmas de pronóstico conocidas en

o" y referentes similares en el contexto de la descripción ntes reivindicaciones) se debe interpretar de modo que ue de otro modo en el presente documento o el contexto eguido de una lista de uno o más elementos (por ejemplo, ento seleccionado de los elementos enumerados (A o B) umerados (A y B), a menos que se indique de otro modo mente. Los términos "que comprende", "que tiene", "que s abiertos (es decir, que significan "incluyendo, pero sin ación de intervalos de valores en el presente documento do para referirse individualmente a cada valor separado o modo en el presente documento, y cada valor separado citado individualmente en el presente documento. Todos ueden realizar en cualquier orden adecuado a menos que xto lo contradiga claramente. El uso de cualquiera y todos ") proporcionado en el presente documento, pretende limitación en el alcance de la invención a menos que se scriptiva se debe interpretar de forma que indique que ica de la invención.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un procedimiento para seleccionar una opción de tratamiento para un sujeto con linfoma difuso de linfocitos B grandes similares a linfocitos B activados (ABC DLBCL), un sujeto con linfoma difuso de linfocitos B grandes similares a linfocitos B del centro germinal (GCB DLBCL), un sujeto con linfoma primario mediastínico de linfocitos B (PMBL), un sujeto con linfoma de Burkitt (BL) o un sujeto con linfoma de células del manto (MCL), que comprende las etapas de:

(a) aislar un producto de expresión génica de una muestra de biopsia de un sujeto con linfoma;

(b) obtener datos de expresión génica digital a partir del producto de expresión génica aislado, en el que los datos de expresión génica digital comprenden datos para genes en una firma de expresión génica, y en el que la firma de expresión génica comprende al menos uno de los genes enumerados en la tabla 2;

(c) obtener opcionalmente datos de expresión génica digital de un primer y segundo conjunto de sondas de referencia, el segundo conjunto de sondas de referencia conocido para clasificar ABC DLBCL, GCB DLBCL, PMBL, BL o MCL;

(d) generar un promedio ponderado de los niveles de expresión de los genes a partir de la firma de expresión génica para obtener de este modo un valor de firma de expresión génica;

(e) calcular una puntuación predictiva basada en el valor de la firma de expresión génica usando la ecuación:

y i ^{= l o g 2 ( ^ ) - X l 0 § 2} (XJ )kJ - ^{l 0 § 2} (r¡) ^{l o g}2 (g¡)

i

en la que y es una puntuación predictiva, x ^¡son los recuentos para el gen i para el conjunto de sondas i, el conjunto de sondas i es de la muestra que se está sometiendo a análisis, x ^jes el recuento para el gen j para el conjunto de sondas j, el conjunto de sondas j es el conjunto de genes de normalización de la muestra que se está sometiendo a prueba, h ^jes el peso de normalización para el conjunto de sondas j como se enumera en la tabla 4, r¡ es el recuento para el gen i para el conjunto de sondas i en el primer conjunto de sondas de referencia, y g¡ es el recuento de gen i para el conjunto de sondas i en el segundo conjunto de sondas de referencia, siendo los términos matemáticos con r ^¡y g ^¡igual a cero si no se obtienen datos de expresión génica digital de un primer y segundo conjunto de sondas de referencia;

(f) clasificar el sujeto como perteneciente a uno de los siguientes en base a la puntuación predictiva de (e): (i) ABC DLBCL, (ii) GCB DLBCL, (iii) PMBL, (iv) BL o (v) MCL;

(g) seleccionar una opción de tratamiento para el sujeto basada en la clasificación del sujeto en (f);

2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la firma de expresión génica comprende los genes enumerados en la tabla 2.

3. El procedimiento de la reivindicación 1 o 2, en el que la clasificación del sujeto comprende además usar la fórmula:

^{- 1 s}i ⁱ y¡ W¡ ^{— P un to de corte in fe rio r}

i __

Llamada de submodelo = 0 si ^{P un to de corte in fe rio r <} y. ^{vy \ < P un to de corte superior}

_ i

1 ^gsi ⁱV ^{y v i/, > P un to de corte superior}

en donde y¡ es la puntuación predictiva, w¡ son los pesos asociados con el conjunto de sondas como se enumeran en la tabla 4, y los puntos de corte superior e inferior son como se enumeran en la tabla 5,

y usando la lógica:

(1) si el submodelo de MCL tiene un valor de 1, la muestra se llama MCL,

si el submodelo de MCL tiene un valor de 0, la muestra se llama MCL inclasificable pero en el límite, si el submodelo de MCL tiene un valor de -1, continuar a la etapa 2,

(2) si el submodelo de BL non-myc tiene un valor de 1, continuar a la etapa 3,

si el submodelo de BL non-myc tiene un valor de 0, la muestra se llama BL inclasificable pero en el límite. si el submodelo de BL non-myc de tiene un valor de -1, continuar a la etapa 4,

(3) si el submodelo de BL myc tiene un valor de 0 o 1, la muestra se llama BL,

si el submodelo de BL myc tiene un valor de -1, la muestra se llama BL inclasificable pero en el límite,

(4) si el submodelo de PMBL tiene un valor de 1, la muestra se llama PMBL,

si el submodelo de PMBL tiene un valor de 0, la muestra se denomina PMBL inclasificable pero en el límite, si el submodelo de PMBL tiene un valor de -1, continuar a la etapa 5,

(5) si el submodelo de ABC/GCB tiene un valor de 1, la muestra se llama ABC,

si el submodelo de ABC/GCB tiene un valor de 0, la muestra se llama DLBCL sin clasificar,

si el submodelo de ABC/GCB tiene un valor de -1, la muestra se llama GCB.

4. Un procedimiento para seleccionar una opción de tratamiento para un sujeto con linfoma difuso de linfocitos B grandes (DLBCL) que comprende las etapas de:

(a) aislar un producto de expresión génica de una muestra de biopsia de un sujeto con DLBCL;

(b) obtener datos de expresión génica digital a partir del producto de expresión génica aislado, en el que los datos de expresión génica digital comprenden datos para genes en una firma de expresión génica, y en el que la firma de expresión génica comprende al menos uno de los genes siguientes: ASB13 (n.° de acceso a GenBanK NM_024701.3), CCDC50 (n.° de acceso a GenBanK NM_174908.3), CREB3L2 (n.° de acceso a GenBanK NM_194071.2), CYB5R2 (n.° de acceso a GenBanK NM_016229.3), |Rf4 (n.° de acceso a GenBanK NM_002460.1), ISY1 (n.° de acceso a GenBanK NM_020701.2), ITPKB (n.° de acceso a GenBanK NM_002221.3), LIMD1 (n.° de acceso a GenBanK NM_014240.2), MAML3 (n.° de acceso a GenBanK NM_018717.4), MME (n.° de acceso a GenBanK NM_000902.2), MYBL1 (n.° de acceso a GenBanK XM_034274.14), PIM2 (n.° de acceso a GenBanK NM_006875.2), R3HDM1 (n.° de acceso a GenBanK NM_015361.2), RAB7L1 (n.° de acceso a GenBanK NM_001135664.1), S1PR2 (n.° de acceso a GenBanK NM_004230.2), SERPINA9 (n.° de acceso a GenBanK NM_001042518.1), TNFRSF13B (n.° de acceso a GenBanK NM_012452.2), TRIM56 (n.° de acceso a GenBanK NM_030961.1), UBXN4 (n.° de acceso a GenBanK NM_014607.3) y WDR55 (n.° de acceso a GenBanK NM_017706.4);

(c) obtener opcionalmente datos de expresión génica digital de un primer y segundo conjunto de sondas de referencia, el segundo conjunto de sondas de referencia conocido para clasificar ABC DLBCL o GCB DLBCL; (d) generar un promedio ponderado de los niveles de expresión de los genes a partir de la firma de expresión génica para obtener de este modo un valor de firma de expresión génica;

y i = log 2 (x¡) - £ log 2 (Xj )hj - log 2 (r¡) log 2 (g¿)

/

en la que y es una puntuación predictiva, x ⁱson los recuentos para el gen i para el conjunto de sondas i, el conjunto de sondas i es de la muestra que se está sometiendo a análisis, x ^jes el recuento para el gen j para el conjunto de sondas j, el conjunto de sondas j es el conjunto de genes de normalización de la muestra que se está sometiendo a prueba, h ^jes el peso de normalización para el conjunto de sondas j como se enumera en la tabla 4, r¡ es el recuento para el gen i para el conjunto de sondas i en el primer conjunto de sondas de referencia, y g¡ es el recuento de gen i para el conjunto de sondas i en el segundo conjunto de sondas de referencia, siendo los términos matemáticos con r ^¡y g ^¡igual a cero si no se obtienen datos de expresión génica digital de un primer y segundo conjunto de sondas de referencia;

(f) clasificar el sujeto como perteneciente a uno de los siguientes en base a la puntuación predictiva de (e): (i) linfoma difuso de linfocitos B grandes similares a linfocitos B activados (ABC DLBCL) o (ii) linfoma difuso de linfocitos B grandes similares a linfocitos B del centro germinal (GCB DLBCL);

(g) seleccionar una opción de tratamiento para el sujeto basada en la clasificación del sujeto en (f); 5. El procedimiento de la reivindicación 4, en el que la firma de expresión génica comprende los siguientes genes:

ASB13 (n.° de acceso a GenBanK NM_024701.3), CCDC50 (n.° de acceso a GenBanK NM_174908.3), CREB3L2 (n.° de acceso a GenBanK NM_194071.2), CYB5R2 (n.° de acceso a GenBanK NM_016229.3), IRF4 (n.° de acceso a GenBanK NM_002460.1), ISY1 (n.° de acceso a GenBanK NM_020701.2), ITPKB (n.° de acceso a GenBanK NM_002221.3), LIMD1 (n.° de acceso a GenBanK NM_014240.2), MAML3 (n.° de acceso a GenBanK NM_018717.4),

MME (n.° de acceso a GenBanK NM_000902.2), MYBL1 (n.° de acceso a GenBanK XM_034274.14), PIM2 (n.° de acceso a GenBanK NM_006875.2), R3HDM1 (n.° de acceso a GenBanK NM_015361.2), RAB7L1 (n.° de acceso a GenBanK NM_001135664.1), S1PR2 (n.° de acceso a GenBanK NM_004230.2), SERPINA9 (n.° de acceso de GenBanK NM_001042518.1), TNFRSF13B (n.° de acceso a GenBanK NM_012452.2), TRIM56 (n.° de acceso a GenBanK NM_030961.1), UBXN4 (n.° de acceso a GenBanK NM_014607.3) y WDR55 (n.° de acceso a GenBanK NM_017706.4).

6. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en el que la opción de tratamiento comprende uno o más de los siguientes: tratamiento con CHOP, tratamiento con R-CHOP, tratamiento con CODOX-M/IVAC, profilaxis del SNC con tratamiento con R-EPOCH, radioterapia, inmunoterapia, trasplante de médula ósea, trasplante de células madre y/o cirugía.

7. Un procedimiento para seleccionar a un sujeto con linfoma difuso de linfocitos B grandes similares a linfocitos B del centro germinal (GCB DLBCL) para el tratamiento con R-CHOP (Rituxan, ciclofosfamida, hidroxidaunorubicina, Oncovin (vincristina) y prednisona) que comprende las etapas de:

(b) obtener datos de expresión génica digital a partir del producto de expresión génica aislado, en el que los datos de expresión génica digital comprenden datos para genes en una firma de expresión génica, y en el que la firma de expresión génica comprende al menos uno de los genes siguientes: ASB13 (n.° de acceso a GenBanK NM_024701.3), CCDC50 (n.° de acceso a GenBanK NM_174908.3), CREB3L2 (n.° de acceso a GenBanK NM_194071.2), CYB5R2 (n.° de acceso a GenBanK NM_016229.3), iRf4 (n.° de acceso a GenBanK NM_002460.1), ISY1 (n.° de acceso a GenBanK NM_020701.2), ITPKB (n.° de acceso a GenBanK NM_002221.3), LIMD1 (n.° de acceso a GenBanK NM_014240.2), MAML3 (n.° de acceso a GenBanK NM_018717.4), MME (n.° de acceso a GenBanK NM_000902.2), MYBL1 (n.° de acceso a GenBanK XM_034274.14), PIM2 (n.° de acceso a GenBanK NM_006875.2), R3HDM1 (n.° de acceso a GenBanK NM_015361.2), RAB7L1 (n.° de acceso a GenBanK NM_001135664.1), S1PR2 (n.° de acceso a GenBanK NM_004230.2), SERPINA9 (n.° de acceso a GenBanK NM_001042518.1), TNFRSF13B (n.° de acceso a GenBanK NM_012452.2), TRIM56 (n.° de acceso a GenBanK NM_030961.1), UBXN4 (n.° de acceso a GenBanK NM_014607.3) y WDR55 (n.° de acceso a GenBanK NM_017706.4);

(c) obtener opcionalmente datos de expresión génica digital de un primer y segundo conjunto de sondas de referencia, el segundo conjunto de sondas de referencia conocido para clasificar ABC DLBCL o GCB DLBCL;

en la que y¡ es una puntuación predictiva, x ^¡son los recuentos para el gen i para el conjunto de sondas i, el conjunto de sondas i es de la muestra que se está sometiendo a análisis, x ^jes el recuento para el gen j para el conjunto de sondas j, el conjunto de sondas j es el conjunto de genes de normalización de la muestra que se está sometiendo a prueba, h ^jes el peso de normalización para el conjunto de sondas j como se enumera en la tabla 4, r¡ es el recuento para el gen i para el conjunto de sondas i en el primer conjunto de sondas de referencia, y g¡ es el recuento de gen i para el conjunto de sondas i en el segundo conjunto de sondas de referencia, siendo los términos matemáticos con r ^¡y g ^¡igual a cero si no se obtienen datos de expresión génica digital de un primer y segundo conjunto de sondas de referencia;

(g) seleccionar un sujeto con GCB DLBCL para tratamiento con R-CHOP; y

(h) seleccionar un tratamiento diferente para un sujeto con ABC DLBCL.

8. El procedimiento de la reivindicación 7, en el que la firma de expresión génica comprende los siguientes genes: ASB13 (n.° de acceso a GenBanK NM_024701.3), CCDC50 (n.° de acceso a GenBanK NM_174908.3), CREB3L2 (n.° de acceso a GenBanK NM_194071.2), CYB5R2 (n.° de acceso a GenBanK NM_016229.3), IRF4 (n.° de acceso a GenBanK NM_002460.1), ISY1 (n.° de acceso a GenBanK NM_020701.2), ITPKB (n.° de acceso a GenBanK NM_002221.3), LIMD1 (n.° de acceso a GenBanK NM_014240.2), MAML3 (n.° de acceso a GenBanK NM_018717.4), MME (n.° de acceso a GenBanK NM_000902.2), MYBL1 (n.° de acceso a GenBanK XM_034274.14), PIM2 (n.° de acceso a GenBanK NM_006875.2), R3HDM1 (n.° de acceso a GenBanK NM_015361.2), RAB7L1 (n.° de acceso a GenBanK NM_001135664.1), S1PR2 (n.° de acceso a GenBanK NM_004230.2), SERPINA9 (n.° de acceso a GenBanK NM_001042518.1), TNFRSF13B (n.° de acceso a GenBanK NM_012452.2), TRIM56 (n.° de acceso a GenBanK NM_030961.1), UBXN4 (n.° de acceso a GenBanK NM_014607.3) y WDR55 (n.° de acceso a GenBanK NM_017706.4).

9. El procedimiento de la reivindicación 7 u 8, que comprende seleccionar para el sujeto con ABC DLBCL tratamiento con CODOX-M/IVAC, profilaxis del SNC con tratamiento con R-EPOCH, radioterapia, inmunoterapia, trasplante de médula ósea, trasplante de células madre y/o cirugía.

10. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 4-9, en el que la clasificación del sujeto comprende además usar la fórmula:

-1 si V. V'. < Punto de corte inferior

I _

Llamada de submodelo = ^{0 si Punto de corte inferior <^} y. W¡ ^{< Punto de corte superior}

i

1 ^si^' y, V. Y Punto de corte superior

y usando la lógica:

si el submodelo de ABC/GCB tiene un valor de 1, la muestra se llama ABC,

si el submodelo de ABC/GCB tiene un valor de -1, la muestra se llama GCB.

11. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1-10, en el que el producto de expresión génica se aísla de una muestra de biopsia fijada con formol e incluida en parafina (FFPE) del sujeto.

12. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1-11, en el que los datos de expresión génica digital se obtienen usando un ensayo NANOSTRING™.