KR20040025185A - 사이토카인 유전자 발현분석을 이용하여 방사선 치료에대한 암환자의 반응을 평가하는 방법 및 이를 위한 ｄｎａ칩 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 방사선 조사된 사람 말초혈액세포로부터 경과시간에 따라 수득한 유전자 중 사이토카인 유전자의 시간별 발현양상을 분석하여 방사선 치료에 대한 암환자의 반응을 평가하기 위해 사이토카인 유전자 cDNA가 기판에 집적된 DNA 칩에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 사람으로부터 말초혈액세포를 채취하고, 채취된 말초혈액세포를 일반적인 방사선 치료에 사용되는 선량으로 조사한 후, 조사된 말초혈액세포로부터 경과시간에 따라 RNA를 추출하고, 추출한 RNA를 역전사시켜 DNA를 생성하며, 생성된 DNA를 서열번호 1 및 2의 DNA 단편 또는 서열번호 3 및 4의 DNA 단편 중 하나 이상의 프라이머 쌍으로 사이토카인 유전자를 증폭시키고, 증폭된 사이토카인 유전자의 시간별 발현양상을 분석하여 방사선 치료에 대한 암환자의 반응을 평가하는 방법에 관한 것이다.

Description

사이토카인 유전자 발현분석을 이용하여 방사선 치료에 대한 암환자의 반응을 평가하는 방법 및 이를 위한 ＤＮＡ 칩{Method And DNA Chip For Monitoring Response of Irradiation on Cancer Patients Using Cytokine Gene Expression Analysis}
본 발명은 방사선 조사된 사람의 말초혈액세포로부터 특이적으로 발현되는 사이토카인(Cytokine) 유전자의 시간별 발현양상을 분석함으로써 방사선 치료에 대한 암환자의 반응을 평가하는 방법 및 이를 위한 DNA 칩에 관한 것이다.
방사선(Ionizing radiation ; IR)이 암의 치료에 사용된 지 거의 한 세기가 된다(Hall et al., Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys., 46, 1~2, 2000). 정상세포에 대한 부작용이 방사선 치료의 제한인자이므로(Peters et al., Cancer, 77, 2379~2385, 1996), 방사선 치료효율을 높이기 위해서는 암세포에게는 치명적인 용량을 전달하여야 하며 근처의 정상세포에는 독성 효과(toxic effect)를 줄여야 한다(Vijayakumar et al., Lancet, 349, 1~301, 1997). 동일한 선량의 방사선에 조사된 환자의 반응은 매우 다양하므로 방사선 치료를 시행하는 임상가들에게 방사선치료에 대한 환자의 반응을 평가하는 적절한 검사법의 개발은 주요 관심사 중의 하나이다. 특히 방사선 조사 후에 나타나는 다양한 반응을 평가(monitor)하기 위한 적절한 검사법의 개발은 최근 도래하고 있는 맞춤형 항암치료의 근간이 된다고 할 수 있다. 따라서 인체를 포함한 다양한 동물시스템에서 방사선 치료에 대한 영향을 평가하기 위한 여러 가지 시도들이 이루어져 왔다.
방사선 치료에 대한 환자의 영향을 임상적용 가능한 방법으로 검사하기 위해서는 비침습적인 방법이 이상적이므로 각종 체액 및 혈액세포의 반응을 측정하기 위한 여러 가지 방법이 개발되어왔다. 이러한 방법들은 방사선 조사 후에 나타나는 5가지 그룹의 지표(indicator)의 변화로 구분한다(Walden et al., Biological assessment of damage., 2, TMM Publications, Office of the Surgeon General., 85~103, 1989). 5가지 그룹은 전구 증후군(prodromal syndrome)의 신체적 증후학(physical symptomology), 백혈구 숫자의 변화, 혈청(serum) 조성의 변화, 소변의 성분 및 염색체의 변이이다. 이 중에서 사람의 말초혈액세포(Peripherial Blood Lymphocyte)에서 일어나는 염색체의 변이를 측정하는 것은 오래 전부터 방사선치료 중의 생체 내(in vivo) 방사선량측정(biodosimetry)에 유용한 방법으로 고려되었다. 그러나 방사선 조사에 의한 말초혈액세포에서의 염색체 변이와 방사선 손상의 상관관계를 찾고자하는 연구는 실패하였는데(Bentzen et al., Int. J. Radiat. Biol., 75, 513~517. 1999), 이는 일반적으로 실시하는 말초혈액세포 중기분석(metaphase analysis)이 정상조직의 방사선에 의한 손상을 측정(monitor)하기에 적절하지 못했기 때문이다(Lloyd et al., Phys. Med. Biol., 18, 421~431.1973). 이러한 이유는 주로 방사선 조사에 의해 세포 주기(cell cycle)가 연기되는 것이 그 원인이다(Yamada et al., Cancer Letters, 150, 215~221, 2000 ; Durante et al., Radiat. Res., 151, 670~676, 1999).
한편, 암 세포의 방사선 반응에 대한 분자적 마커(molecular marker)를 확인하고자 하는 대부분의 연구는 면역염색법(immunostaining), 노던 블럿(northern blot) 또는 웨스턴 블럿(western blot) 분석법을 통하여 유전자 발현을 조사한 것이다. 아직까지 이와 같은 방법으로 총체적인 방사선영향을 평가하기 어려우며, 1 내지 2 종류의 유전자 분석을 통한 단편적인 접근에 머물러 있다. 방사선 치료와 부수적인 화학방사선(chemoradiation)에 대한 정상세포의 반응을 평가하는 검사법은 치료환자의 반응에 따른 치료 프로토콜(protocol)개발을 위한 근간이 될 것이다. 또한 방사선 항암치료 중 방사선-반응성 유전자(radiation-responsive gene)기능에 문제가 있을 경우 치료 후유증으로 나타나는 2차 암의 생성에도 영향이 있을 수 있다. 따라서, 문헌정보학(Informatics) 및 기능유전체학적(functional genomics) 조사를 이용하여 이러한 방사선-반응성 유전자들을 특성화시키고 이들의 생체 내, 생체 외 기능을 밝히는 연구가 진행되어야 할 것이다.
정상세포 및 암세포에서 방사선에 대한 반응을 측정하기 위해 유전자의 발현양상을 이용하는데, 이를 조사하는 방법으로는 DNA 칩, DD-PCR(differential display PCR), SAGE(serial analysis gene expression) 및 EST(expressed sequence tags) 등의 방법이 있다. 이 중에서 DNA 칩은 개개의 유전자 대신 수천 또는 수만 개 유전자 조합의 발현양상을 동시에 관측할 수 있도록 해주는 장점 때문에 분자생물학의 기초 연구뿐만 아니라 질병 진단, 신약개발 등 다양한 응용분야에 적용될 수 있다. 따라서, DNA 칩 상에서 mRNA 수준을 측정하는 것은 특정 자극에 의한 여러 유전자의 반응을 알아낼 수 있는 방법이다. 암세포에서 방사선에 의해 다양한 유전자가 유도된다는 사실이 보고되어 있지만 방사선 치료중의 환자에게 이를 조사한 연구결과는 거의 없다. 또한 환자를 대상으로 방사선 반응을 연구하기 위해 현재로서 가장 적절한 모델은 사람의 혈액세포를 방사선 조사하여 이에 나타나는 유전자 반응을 연구하는 것이지만 방사선 치료에 사용되는 양이나 시간에 의해 유도되는 유전자에 관한 보고는 없는 실정이다. 그리고 유전자 유도에 관한 많은 생체 외 실험들이 초생리적(supraphysiologic) 방사선량(IR dose)하에서 수행되었기 때문에 임상에서 활용될 가능성이 제한되어 있다.
이러한 관점에서 방사선 치료 시행 전, 시행과정 중, 시행 후 따르는 결과로부터 방사선이 환자의 개별적인 체질에 따라 어느 정도 영향을 미칠 수 있는지를 방사선 조사된 시료에서 유전자의 시간별 발현양상을 비교 분석하여 정확히 예측함으로써 방사선이 환자에게 미치는 부작용을 최대한 줄일 수 있는 방안이 요구되고 있다.
본 발명은 사람의 말초혈액세포를 채취하여 일반적인 방사선 치료에 사용되는 선량으로 방사선 조사 후 경과시간에 따라 유도되는 유전자를 분석하던 중 면역체계의 반응을 매개하는 사이토카인 유전자의 특이적인 발현에 주목하였다. 즉 사이토카인 유전자의 시간별 발현양상을 통해 방사선 치료에 대한 암환자의 반응을평가하는 방법을 완성하였다.
따라서, 본 발명은 방사선 조사된 사람 말초혈액세포로부터 경과시간에 따라 수득한 유전자 중 사이토카인 유전자의 시간별 발현양상을 분석하여 방사선 치료에 대한 암환자의 반응을 평가하기 위해 사이토카인 유전자 cDNA가 기판에 집적된 DNA 칩을 제공한다.
또한, 본 발명은 사람으로부터 말초혈액세포를 채취하고, 채취된 말초혈액세포를 일반적인 방사선 치료에 사용되는 선량으로 조사한 후, 조사된 말초혈액세포로부터 경과시간에 따라 RNA를 추출하고, 추출한 RNA를 역전사시켜 DNA를 생성하며, 생성된 DNA를 서열번호 1 및 2의 DNA 단편 또는 서열번호 3 및 4의 DNA 단편 중 하나 이상의 프라이머 쌍으로 사이토카인 유전자를 증폭시키고, 증폭된 사이토카인 유전자의 시간별 발현양상을 분석하여 방사선 치료에 대한 암환자의 반응을 평가하는 방법을 제공한다.
도 1은 일반적인 방사선 치료에 사용되는 선량인 2Gy로 방사선 조사된 사람 말초혈액세포에서 경과시간에 따라 추출한 RNA 및 방사선을 조사하지 않은 사람 말초혈액세포에서 추출한 RNA를 역전사시킨 DNA 단편과 혼성화된 1,221개의 공지된 유전자 cDNA 칩의 형광 발광 프로파일을 나타낸 것이다(패널 A: 방사선 조사 후 2시간 경과한 경우, 패널 B: 방사선 조사 후 6시간 경과한 경우, 패널 C: 방사선 조사 후 24시간 경과한 경우).
도 2는 일반적인 방사선 치료에 사용되는 선량인 2Gy로 방사선 조사 된 사람 말초혈액세포에서 경과시간에 따라 추출한 RNA 및 방사선을 조사하지 않은 사람 말초혈액세포에서 추출한 RNA를 역전사시킨 DNA 단편과 혼성화된 1,221개의 공지된 유전자 cDNA 칩의 유전자 발현양상을 계층적 클러스터링으로 나타낸 것이다.
도 3은 방사선-반응성 유전자의 계층적 클러스터링 결과에 의해 분류한 결과이다(패널 A: 초기 유전자 - 방사선 조사 후 2시간 경과한 경우에 나타남, 패널 B: 유전자 - 방사선 조사 후 6시간 경과한 경우에 나타남, 패널 C: 유전자 - 방사선조사 후 24시간 경과한 경우에 나타남, 패널 D: 하우스 키핑 유전자 및 그룹핑되지 않은 유전자 - 유의적인 차이를 보이지 않음, 높은 변이를 지님).
도 4는 일반적인 방사선 치료에 사용되는 선량인 2Gy로 방사선 조사 된 사람 말초혈액세포에서 경과시간에 따라 추출한 RNA 및 방사선을 조사하지 않은 사람 말초혈액세포에서 추출한 RNA를 역전사시킨 DNA 단편 중에서 2종류의 사이토카인 유전자를 증폭시켜 이의 시간별 발현양상을 아가로스 겔에 나타낸 것이다(도 4a: IL-4의 시간별 발현양상, 도 4b: IL-6의 시간별 발현양상).
본원 명세서에 사용된 용어 "방사선 치료(irradiation)"는 예를 들면 X-선, 자외선, 알파 입자 및 감마선을 포함한 전자석 방사 또는 알파 또는 베타 입자 등의 작용에 의해 암세포를 사멸시키는 치료를 의미한다.
용어 "그레이(Gy)"는 1kg의 생물학적 조직에서 1J(Joule)을 방출시킬 수 있는 방사선 조사량이다. 본 발명에서 사용된 방사선은 감마선(gamma-ray, IBL 427 Irradiator, CIS Bio International, France)이며, 항암치료시에 일반적으로 사용되는 1회 방사선량인 2Gy를 사용하였다.
용어 "방사선-반응성 유전자"는 방사선에 노출되었을 때 여러 가지 반응을 나타내는 유전자성향을 나타내는 말이다. 즉, DNA 염기서열 변화(mutation), 세포순환의 이상, 세포의 죽음으로 인하여 발생되는 세포 사멸과 같은 반응을 나타낸다. 이러한 변화들은 세포마다 반응을 나타내는 시기가 다르다. 방사선 조사 후 즉시 이러한 변화가 나타나는 유전자를 특히, 초기 유전자(early gene)라 하며 어느 정도 시간이 지나야 변화가 나타나는 유전자도 있다. 이때, 방사선 조사 후 아무런 변화가 일어나지 않는 유전자의 경우에는 "하우스 키핑 유전자(house keeping gene)"라 한다.
방사선은 암세포와 정상세포 모두에 영향을 줄 수 있으나 여러 가지 방법과 기술을 이용하여 정상 조직에는 영향을 덜 주면서 암세포를 많이 파괴하여 암을 치료한다. 이는 암세포를 즉각 죽이지는 못하나 암세포가 분열, 증식하는 기능을 파괴하여 새로운 암세포가 분열, 생성되지 못하게 하고 더 이상 분열하지 않는 암세포는 수명이 다해 죽게된다. 매 치료마다 더 많은 세포가 죽고, 죽은 세포는 분해되어 혈액으로 운반되어 몸밖으로 배출되어 종양의 크기는 줄어든다. 정상세포의 대부분은 회복되지만 일부 정상세포는 회복되지 않아 방사선 치료의 부작용이 생긴다. 부작용으로 인해 야기될 수 있는 세포, 조직 등의 변화는 세포분열시기의 변화, 세포사멸 및 괴사억제, 조직손상 및 면역기능저하 등이 있다.
방사선 치료에 대한 암환자의 반응을 평가하기 위한 생물학적 시료는 일반적으로 사람의 정상혈액을 생체 외 방사선 조사하여 이를 모델시스템으로 사용할 수 있다. 더욱 바람직하게는 방사선 치료를 받는 암환자의 혈액으로부터 분리한 말초혈액세포(Peripherial Blood Lymphocyte)를 사용할 수 있다. 본 발명에서는 사람의 말초혈액세포를 사용하였다. 말초혈액세포는 방사선에 대한 감수성이 커서 직접적으로 손상을 받지만, 전신을 빠르게 순환하고 체내에 오랫동안 생존 및 재생이 가능하다고 알려져 있다. 그래서 말초혈액세포에서 일어나는 염색체의 변이를 측정하는 것은 방사선 치료 중의 생체 내 방사선량측정(biodosimetry)에 유용한 세포로 이용되었다. 따라서, 방사선 조사정도의 여부를 측정하기 위한 생물학적 시료로서 말초혈액세포를 선택하는 것이 가장 바람직하다.
방사선 치료에 대한 유전자의 발현을 확인하고자 하는 방법은 대표적인 유전공학 방법으로 서던블롯, 노던블롯, 돌연변이 검색 및 DNA 염기서열결정 등이 있다. 그러나 이러한 방법을 이용한 결과는 서로 차이가 많으며 어떤 경우는 반대의 결과를 나타내기도 한다. 이와 같은 문제점을 극복하기 위해 개발된 방법 중의 하나로서 정확하고 빠르게 유전자의 발현을 분석할 수 있는 DNA 칩을 이용한 유전자 검색방법이 사용된다. DNA 칩은 엄청나게 많은 종류의 DNA를 고밀도로 붙여 놓은 것을 말한다. DNA 칩은 동시에 최소한 수백 개 이상의 유전자를 빠른 시간 안에 검색할 수 있는 장점이 있다. 또한, 서던 또는 노던블롯의 경우 유전물질을 붙이는 매체로 니트로셀룰로스(nitrocell ulose)막을 사용하는데 반하여, 유리와 같은 고형체를 사용함으로써 아주 적은 양의 유전 물질을 고밀도로 붙일 수 있으며, 동시에 많은 수의 유전자를 검색할 수 있는 장점이 있다.
DNA 칩은 붙이는 유전물질의 크기에 따라 cDNA(complementary DNA)칩과 올리고뉴클레오티드 칩(oligonucleotide)으로 분류된다. cDNA 칩에는 최소한 500bp 이상의 유전자(full-length open reading frame 또는 EST)가 붙여져 있고, 올리고뉴클레오티드 칩에는 약 15 내지 25개의 염기들로 이루어진 올리고뉴클레오티드가 붙여져 있다. 표 1에 일반적인 DNA 칩 제작 기술에 대해 설명하였다.
DNA 칩 제작 기술의 특징
제작 기술 특 징 칩 종류
핀 마이크로어레이(pin microarray) 핀을 이용한마이크로스폿팅(microspotting) cDNA 및올리고뉴클레오티드
잉크젯(inkjet) 잉크젯 원리를 이용한마이크로드롭핑(microdropping) cDNA 및올리고뉴클레오티드
포토리소그래피(photolithography) 포토리소그래피를 이용한올리고뉴클레오티드 직접합성 올리고뉴클레오티드
전기적 어레이(Electronic array) 전기를 이용한 올리고뉴클레오티드어드레싱(addressing) 올리고뉴클레오티드
현재 인간 게놈 프로젝트(Human Genome Project)로부터 얻는 염기서열 정보는 빠르게 증가하고 있으며 이 정보는 생물 의학적 실험(biomedical experiment)으로부터 재확인될 수 있다. 그러므로 유전자 발현양상을 상기의 DNA 칩 기술로 분석하여 전체적인 세포반응(cellular event)을 이해할 수 있을 것이다. 따라서, 본 발명에서는 사람으로부터 분리한 말초혈액세포를 방사선 조사한 후 방사선-반응성 유전자의 시간별 발현양상을 1,221개의 알고있는 유전자 cDNA 칩을 이용하여 선별하는 방법을 이용하였다. 본 발명에서 사용된 cDNA 칩(GenoCheck, Ansan, Korea)에 집적된 유전자는 신호전달과정(signal transduction), 세포 분열(cell division), 대사 작용(metabolism) 및 적응/보호 반응(adaptive/protectiveresponse)에 관련된 유전자들이고, 이 유전자들은 1,221개의 알려진 사람 유전자(Human known gene)를 PCR로 증폭하여 제작하였다. cDNA 칩과 방사선 조사한 사람의 말초혈액세포의 RNA로부터 역전사된 DNA와의 혼성화 결과는 유전자가 시간별로 증가하는 유전자 로 구분하여 나타내었다(도 1).
DNA 칩의 혼성화한 결과를 분석하기 위해 사용한 형광 물질은 Cy3-dUTP, Cy5-dUTP(Amersham Pharmacia, U.K.)을 사용할 수 있다. 이는 임의로 색깔차이로 인해 유전자 발현의 강도를 비교하기 위해서 표지하는 물질이다. 따라서, 유전자 발현정도를 스캔을 할 때 Cy3는 532nm 파장에서 녹색을 띠게 되고 Cy5는 635nm에서 빨간색을 띠게 된다. 본 연구에서는 Cy3-dUTP, Cy5-dUTP를 사용했지만 Cy3-dCTP, Cy5-dCTP을 사용할 수 있다.
DNA 칩의 혼성화한 결과는 클러스터링 기법을 사용하여 다양한 유전자 시료를 비교 분석하였는데 이는 특정한 유전자의 발현 양상을 하나의 벡터값으로 보고 특정한 기준("metric" 이라고 부름)에 따라 유사한 정도("distance" 라고 부름)로 벡터들을 묶는 방법이다. 통계학적으로 개발된 통계적 클러스터 분석 방법(statistical cluster analysis)에는 계층적 클러스터링(hierarchical clustering), K-방법(K-means), SOM(self-organizing map), PCA(principal component analysis), SVD(decomposition) 및 SVM(suport vector machine)방법 등이 있다.
본 발명에서는 클러스터링 기법 중 계층적 클러스터링(hierarchical clustering)방법을 사용하여 발현양상이 유사한 유전자끼리 클러스터링 할 수 있었고, 각 스팟의 시그날을 각 슬라이드의 스팟 시그날의 평균값으로 나눠서 표준화하였다. 클러스터링 결과를 각각 도 2 및 도 3에 나타내었다.
그 결과, cDNA 칩의 1,221개 유전자 중에서 62개 유전자가 방사선에 조사되고 난 후 2시간 정도에 유도되었고(도 3의 패널 A), 16개의 유전자가 방사선 조사 후 6시간 후에 유도되었으며(도 3의 패널 B). 방사선 조사 후 24시간 후에는 27개의 유전자가 나타났다(도 3의 패널 C). 또한 변화가 없는 유전자(house keeping gene)를 포함하는 251개 유전자들도 나타났다(도 3의 패널 D). 그리고 1,221유전자 중 865개 유전자는 특정한 범주로 분류할 수 없었고, 이런 유전자들은 여러 정상적인 사람들에게서 나타나는 결과를 보였다. 상기 결과는 적어도 105/1,221개의 유전자가 대조군에 비해 방사선 조사된 말초혈액세포에서 유의적으로 변화함을 보여준다. 이는 cDNA 칩을 이용하여 방사선 조사된 말초혈액세포의 유전자 발현양상을 분석하는 방법을 통해 방사선 치료과정을 효과적으로 측정할 수 있음을 보여준다. 대부분의 항암치료제가 DNA 손상을 일으키며 세포 주기를 정지시키고 또한 세포 사멸을 유발하기 때문에 본 발명에서 확인된 유전자(set)는 여러 형태의 방사선 암치료에 이용할 수 있다. 또한, 방사선 조사된 말초혈액세포에서 확인된 365개 유전자의 발현양상이 방사선 치료를 받는 암환자의 반응에 대한 가치 있는 정보를 제공할 것이며 조사된 방사선에 대한 환자별 반응을 검사할 수 있는 바이오마커(biomarker)가 될 수 있다. 즉, 방사선-반응성 유전자의 상대적인 발현양상과 기존에 쓰였던 유전자 발현의 생물학적 정량(bioassay)을 비교 분석하여 그 값을 측정하면 방사선 치료를 받는 암환자의 반응을 검사할 수 있는 보완적인 방법이 될 것이다.
상기 cDNA 칩 결과로부터 유도되는 방사선-반응성 유전자 중에서 본 발명자들은 방사선 조사 후 사이토카인 유전자의 발현에 주목하였다. 방사선 조사 후 면역체계의 변화에 대한 많은 정보에도 불구하고 방사선 조사된 시료에서의 전사적 반응에 대한 연구는 거의 없다. 따라서 사이토카인 유전자들이 면역체계의 반응을 매개하기 때문에 방사선 조사된 시료에서 사이토카인 유전자의 발현양상을 분석함으로서 암환자의 방사선 치료 후에 일어나는 면역현상을 알아볼 수 있는 지표가 될 수 있을 것이다. 이를 증명하기 위해 본 발명자들은 방사선 조사된 말초혈액세포에서 유도되는 사이토카인 유전자들의 특이적인 발현을 분석하여 방사선 조사에 따른 부작용을 측정하기 위해 사이토카인 유전자의 시간별 발현양상을 조사하였다.
본 발명에서 사이토카인 유전자를 수득하기 위해 방사선 조사된 말초혈액세포에서 추출한 RNA를 이용하여 RT-PCR(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction)을 수행하였다.
RNA 추출은 당분야에 통상적인 방법을 사용할 수 있으며 Tri 시약을 사용하는 방법, 구아니딘을 사용하는 방법, TRIzol시약을 사용하는 방법등을 이용할 수 있으며 상업적으로 판매하는 RNA 추출 킷트(Qiagen 제품, introgen)를 사용할 수 있다. 바람직하게는 TRIzol 시약(GIBCO-BRL Grand Island, NY, U.S.A.)을 사용한다.
RT-PCR이란 당업계에 잘 알려진 방법으로서 특정 부위의 RNA를 주형으로 하여 이에 상응하는 cDNA(complementary DNA)를 합성한 다음 이를 이용하여 PCR 증폭을 시행하는 기술이며, 실험과정은 ⑴ 역전사효소(reverse transcriptase)를 이용하여 RNA로부터 cDNA를 제조하는 과정; ⑵ cDNA를 이용하여 특정부위를 증폭시키는 과정으로 나뉘어지며, ⑵는 게놈 DNA로부터 특정 유전자 부위를 증폭시키는 방법과 같다. 따라서 사이토카인 유전자를 생성하기 위해서 시료로부터 추출한 RNA를 역전사 효소를 이용하여 DNA를 생성하고 여기에 사이토카인 유전자를 증폭하기 위한 특이적인 DNA 서열을 프라이머 쌍으로 이용하여 증폭시킴으로서 사이토카인 유전자를 수득할 수 있었다. 하기 표 2에 특이적으로 변화하는 2종류의 사이토카인 유전자를 증폭하기 위한 프라이머 쌍을 나타내었다.
사이토카인 유전자를 증폭하기 위한 프라이머 쌍
유전자 위치 염기서열 서열번호
IL-4 64-83526-501 5'-ATGGGTCTCACCTCCCAACT-3'5'-TCAGCTCGAACACTTTGAATATTT-3' 12
IL-6 60-84708-688 5'-GCTATGAACTCCTTCTCCACAAGC-3'5'-CCCATGCTACATTTGCCGAA-3' 34
β-actin 226-243843-826 5'-GATCGTCTAGATTCCTATGTGGGCGACGA-3'5'-GATCGGAATTCCAGCGGAACCGCTCATTG-3' 56
상기 표 2의 프라이머를 이용하여 수득한 사이토카인 유전자의 시간별 발현양상을 도 4에 나타내었다. 도 4에 나타낸 바와 같이 사이토카인 유전자들이 2시간, 6시간, 24시간에 따라 발현하는 양상이 상이하게 나타났다. 아가로스 겔에서 발현이 확인된 사이토카인 유전자는 IL-4 및 IL-6 이다. IL-4의 경우는 방사선 조사 후 경과시간이 24시간 되었을 때 발현이 증가하였지만 방사선 조사되지 않은 시료에서 수득한 IL-4의 경우에는 방사선 조사 후 경과시간이 2시간, 6시간 된 시료에서 수득한 IL-4 보다 다소 증가된 발현을 보였다. IL-6의 경우는 방사선 조사 후 경과시간이 24시간 되었을 때 발현이 다소 감소하였다. 또한 2종류의 사이토카인 유전자의 시간별 발현양상을 조사하기 위하여 서로 다른 정상인 사람으로부터 분리한 말초혈액세포를 방사선 조사한 시료를 대상으로 실험하였는데 이는 다른 개체 사이의 시간별 발현양상의 재현성을 보기 위한 것이다. 조사한 바에 의하면 개체간의 유도수준(induction level)이 1.5배 보다 작았으며, 시간별 발현양상은 개체간에 비슷하였다. 이것은 유도된 전사수준(transcript level)이 뚜렷한 범위(range)의 값을 가질 때 이들 사이토카인 유전자의 mRNA가 바이오마커(biomarker)로서 각각의 환자에 사용될 수 있음을 의미한다.
한 양태로서, 본 발명은 방사선 조사된 사람 말초혈액세포로부터 경과시간에 따라 수득한 유전자 중 사이토카인 유전자의 시간별 발현양상을 분석하여 방사선 치료에 대한 암환자의 반응을 평가하기 위해 사이토카인 유전자 cDNA가 기판에 집적된 DNA 칩을 제공한다.
DNA 칩을 제작하는 방법은 상기 표 1과 같이 통상적인 방법을 사용할 수 있으며 바람직하게는 핀 마이크로어레이법을 사용한다. DNA 칩 제작방법은 일반적으로 다음과 같다. 염기서열이 밝혀진 모든 가능한 유전자(open reading frame)들을 사용하여, 각각 확인된 이들 유전자들의 시작과 끝 부분에 PCR(Polymerase Chain Reaction)을 하기 위해 필요한 염기서열인 프라이머를 컴퓨터에 의하여 찾아낸다. 이들 프라이머들은 서로 비슷한 결합온도(annealing temperature)를 가지고 있어서동시에 여러 유전자를 PCR 할 수 있어야 한다. PCR을 한 후 성공 여부는 아가로스 겔에서 검사하고 증폭된 유전자들을 적당한 농도로 농축을 한다. 이렇게 증폭·농축돤 유전자들을 마이크로어레이어 기계로 보통 현미경 실험에 자주 쓰이는 글라스 슬라이드에 심는다. 글라스는 폴리-L-라이신 글라스 이외에도 실레인(silane), 실리레이트(silylate), 수퍼-아민(super-amine)으로 코팅된 글라스를 사용할 수 있다. 글라스의 코팅은 마이크로어레이어에 의해 옮겨진 탐침의 고정을 위해 필요하다. 탐침의 고정을 위해 탐침의 3' 또는 5' 위치에 글라스에 코팅된 물질과 상보적으로 공유결합을 할 수 있는 염기를 삽입할 수 있다. 예를 들면 아민기로 코팅된 글라스에 탐침을 고정시키기 위해서 탐침의 3' 또는 5' 위치에 링커컬럼을 이용하여 알데히드기를 삽입한다. 또한 공유결합 반응이 원활이 이루어지도록 하기 위해 적당한 습도에서 1시간 이상 반응을 유도하고, 6시간 이상 방치하여 DNA 탐침을 고정시킨다.
본 발명에서 사용된 DNA 칩은 cDNA(complementary DNA)를 탐침으로 사용하였는데, 특히 사이토카인 유전자 cDNA를 포함함을 특징으로 한다. 사이토카인 유전자를 검출하기 위한 cDNA 탐침은 대표적인 사이토카인 유전자로서 IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-12p35, IL-12p40, IL-18, INF-γ 또는 TNF-α등의 유전자를 증폭시켜 제작할 수 있다.
탐침과 혼성화 결합을 통해 검출되는 DNA 단편은 시료에서 추출한 유전자를 주형으로 PCR 방법 등의 통상적인 방법을 통해 제작할 수 있다. 본 발명에서는 시료에서 추출한 RNA를 RT-PCR 방법을 통해 DNA를 수득한 후 사이토카인 유전자를특이적으로 증폭시키는 프라이머(표 1)를 이용하여 DNA 단편을 제조하였다. 제조된 DNA 단편과 DNA 칩의 혼성화를 확인하기 위해 시료로부터 추출한 RNA로부터 DNA 합성시 Cy3-dUTP, Cy5-dUTP(Amersham Pharmacia, U.K.) 등의 형광물질을 첨가하여 결합 여부를 확인한다. 이는 임의로 색깔차이로 인해 유전자 발현의 강도를 비교하기 위해서 표지하는 물질이다. 본 발명에서는 Cy3-dUTP(녹색), Cy5-dUTP(빨간색)를 사용했지만 Cy3-dCTP, Cy5-dCTP을 사용할 수 있다.
본 발명의 DNA 칩의 혼성화 결과를 분석하기 위해서 상기 제시된 클러스터링 기법 중 적절한 방법을 사용할 수 있다. 바람직하게는 계층적 클러스터링(hierarchical clustering)방법을 사용하여 발현정도가 유사한 유전자끼리 클러스터링 할 수 있다.
이와 같이, 문헌정보학 및 기능유전체학을 결합한 DNA 칩 기술을 이용하여 방사선 조사된 사람의 말초혈액세포에서 사이토카인 유전자의 발현차이를 보여줌으로써 사이토카인 유전자가 분자적 마커(molecular marker)로 사용될 수 있을 것이다.
본 발명은 하기 실시예로 보다 구체적으로 예시될 것이다. 그러나, 이들 실시예는 단지 본 발명의 구현예이며 본 발명의 범위를 한정하는 것이 아니다.
<실시예>
실시예 1
사람 말초혈액세포의 분리 및 방사선 조사
25세에서 30세의 정상인으로부터 혈액을 채취한 다음 혈액 50㎖에 항응고제(EDTA, heparin, ACD)를 처리한 다음 동량의 PBS(phosphate -buffered saline)을 첨가하였다. 15㎖ 튜브에 4㎖의 히스토파크1077(Histopaque 1077, Sigma, U.S.A.)을 채운 후 그 위에 8㎖의 수혈 받은 혈액(blood : PBS=1:1)을 섞이지 않게 살짝 쌓았다. 이 튜브를 스윙 버켓(swing bucket)에서 500 Xg(1,470rpm), 25℃, 30분간 원심분리하였다. 원심분리 하면 튜브 중간에 백혈구층(Buffy coat)이 생기는데 이층을 파스테르 피펫(pasteur pippet)으로 조심스레 떠서 15㎖ 튜브에 PBS 10㎖을 섞어 다시 700 Xg(1,800 rpm), 25℃, 10분간 세척하였다. 이렇게 얻은 펠렛을 다시 PBS 10㎖로 세척하였다. RPMI 1640(BRL/life technologies) 배지에 56℃에서 45분간 열 불활성화(heat-inactive)된 송아지 태아 혈청(fetal calf serum)을 10% 첨가하고, 100㎕/㎖ 페니실린과 10㎍/㎖ 스트렙토마이신 1%를 첨가하였다. 상기 펠렛을 RPMI 1640 배지로 현탁해서 헤모사이토미터(hematocytometer)로 세포의 숫자를 측정하여 1x106cells/㎖ 되도록 T-25 플라스크에 넣은 다음 5% CO2, 37℃의 배양기에서 배양하였다. 4시간 뒤에 상층액만을 회수하여 새로운 T-25 플라스크에 옮겼다. 각 세포들을 5x106cells 이 되게 4개의 플라스크에 분주하였다. 각 플라스크에 10㎍/㎖ 1% 적혈구 응집소(phytohaemagglutinin ; PHA, Sigma, U.S.A.)를 첨가하여 24시간 반응시켰다. 말초혈액세포에 60cGy/min인137Cs 감마선(IBL 427 Irradiator, CIS Bio International, France)이 사용된 기계(인하대학교 의대)에 2Gy가 될 때까지 상온에서 방사선 조사한 다음 2시간 후, 6시간 후 및 24시간 후에 방사선을 조사한 세포 및 방사선을 조사하지 않은 대조구를 각각 수집하고 -70℃ 초저온 냉동고에 보관한다.
실시예 2
사람 말초혈액세포로부터 총 RNA의 추출
실시예 1에서 제조한 말초혈액세포로부터 총 RNA를 추출하였다. 실시예 1의 말초혈액세포로부터 트리졸(TRIzol, GIBCO-BRL Grand Island, NY, U.S.A.) 방법을 사용하여 총 RNA를 분리하였다. 이때 사용한 모든 용액은 0.1% 디에틸피로카보네이트 처리수(diethyl pryrocarbonate-treated water , DEPC-dH2O)로 RNA분해효소 활성(RNase activity)을 저해하기 위해 처리하였다. 상기 실시예 1에서 배양된 말초혈액세포들을 PBS로 완전하게 세척한 다음 1㎖의 TRIzol/1x106cells 시약을 첨가하여 피핏팅하여 세포를 분쇄하였다. 얼음에서 20분간 방치한 후, 분쇄물을 4℃에서 14,000rpm으로 15분간 원심분리하였다. 상층액에 200㎕의 클로로포름을 첨가하고 15초 동안 볼텍싱(vortexing)하여 섞어 주고 이를 3회 반복하였다. 얼음에서 20분간 방치한 후, 혼합물을 4℃에서 14,000rpm으로 15분간 원심분리하였다. 새로운튜브에 상층액만 떠서 동량의 페놀/클로로포름, 0.2M 아산 나트륨(pH 5.2)을 첨가하여 5초 동안 섞어 주고 이를 3회 반복하였다. 얼음에서 20분간 방치한 후, 혼합물을 4℃에서 14,000rpm으로 15분간 원심분리하였다. 상층액과 동일 양의 이소프로판올을 첨가하여 혼합하고, -70℃에서 1 내지 12시간 보관한 후, 4℃에서 14,000rpm으로 10분간 원심분리하여 총 RNA를 획득하였다. RNA 펠렛을 DEPC-dH2O 처리된 1㎖의 75% 에탄올로 씻어준 다음 건조시키고, DEPC-dH2O로 재균질화시킨뒤 -70℃에서 보관하였다. RNA 농도는 동일한 조건(총 RNA/㎖ 중 40㎍) 하에서 260㎚와 280㎚의 흡광도를 측정하였다. 1% TAE 아가로스 겔에 1㎕을 러닝(running)하였다.
실시예 3
사람 말초혈액세포의 총 RNA를 이용한 DNA 단편의 제조
실시예 2에서 분리한 방사선을 조사하지 않은 대조군과 방사선을 조사한 실험군의 총 RNA를 이용하여 형광물질이 표지된 cDNA를 제조하였다. 총 RNA 50㎍에 2㎍의 18머(mer) 올리고 dT(Tele-chem)을 넣고 70℃에서 10분간 RNA를 변성시킨 다음 바로 얼음에 박았다. 방사선을 조사하지 않은 대조군 및 방사선을 조사한 실험군 각각의 50㎍ RNA 튜브에 10uM dNTP, 100uM DTT, 50uM Cy3-dUTP(대조군 RNA, Amersham Pharmacia, U.K.)과 Cy5-dUTP(방사선 처리된 RNA, Amersham Pharmacia, U.K.), 200 u 역전사 효소(reverse transcriptase, 4U/㎕, GIBCO-BRL GrandIsland, NY, U.S.A.) 를 넣고 총 부피가 30㎕가 되도록 하였다. 이때, 방사선 처리된 말초혈액세포의 RNA는 Cy5-dUTP로 표지하고 방사선 처리되지 않은 말초혈액세포의 RNA는 Cy3-dUTP로 표지하였다. 각각의 튜브를 42℃에서 2시간 배양한 다음 각 형광물질로 표지된 뉴클레오티드를 잘 혼합하고 1.5 N 수산화나트륨과 2.5mM EDTA을 첨가하여 65℃에서 10분간 배양시켰다. 여기에 pH 8.0 TE 용액을 470㎕을 첨가한 후 마이크로콘-30(Millipore, U.S.A.)에 넣어서 14,000rpm에서 5분간 원심분리하였다. 그 후에, Cy3, Cy5가 각각 8㎕씩 남게 농축시킨다음에 컬럼을 뒤집어서 5,000rpm에서 2분간 원심분리하였다.
실시예 4
사람 말초혈액세포의 RNA로부터 제조한 DNA 단편 및 cDNA 칩과의 혼성화(hybridization)
실시예 3에서 말초혈액세포의 총 RNA를 역전사하여 제조한 cDNA와 1,221개의 공지된 유전자 cDNA 칩(GenoCheck, Korea)과의 혼성화반응을 실시하였다.
실시예 3에서 제조한 각각의 cDNA를 잘 혼합하고 20X SSC 2.5㎕와 10% SDS 0.3㎕을 첨가하여 95℃에서 2분간 끓였다. 혼성화 챔버(hybridization chamber)에 스팟이 찍힌 부분을 표시한 글라스를 깔고 그 위에 상기 cDNA 칩을 올려놓았다. cDNA를 글라스에 버블이 생기지 않게 잘 놓은 다음 22 x 22mm 커버 글라스로 덮었다. 글라스 양측면에 습기를 주기 위해 3X SSC을 떨어뜨린 다음 사람의 COT1 DNA,효모 DNA 및 폴리디옥시아데닐릭 산(polydeoxyadenylic acid)을 넣고 챔버(humidified chamber, CMT-hybridization chamber, Corning)에서 65℃로 16시간동안 혼성화시켰다. 혼성화가 종료되면 슬라이드를 상온에서 0.1% SDS를 포함하는 0.5X SSC로 한 번 세척하고, 0.06X SSC로 5분간 다시 세척한 후 500rpm, 25℃, 1분 30초간 원심분리한 다음 레이저 공초점 현미경(laser confocal microscope, GenePix 5000, U.S.A.)이 있는 엑손 스캔어레이(Exon scanarray) 5000으로 스캔(scan)하였다.
실험 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이 방사선을 조사한 여부에 따라 발현된 유전자가 녹색과 빨간색으로 나타났다.
실시예 5
cDNA 칩 데이터의 계층적 클러스터링(Hierarchial Clustering)을 통한 유전자 발현양상 조사
cDNA 칩 결과들은 형광물질의 발광정도를 측정하여 비교하였다. 2개의 형광물질의 발광(fluorescence) 이미지를(Cy3 및 Cy5) 532nm, 635nm 파장으로 스캔하였고 각각 백그라운드(background)가 올라가지 않고 시그날이 최대로 취해질 수 있는 레이저 강도(laser intensity)와 PMT(photomultiplier tube) 감도를 설정하였다. 방사선 조사에 대해서 변화가 거의 없는 유전자 수준을 정상 범위로 설정하여 정상 범위 이상이면 방사선-반응성 유전자로 분류하였다. 즉,β-actin, GAPDH유전자를 기준(standard)으로 하여 “1”로 보고 그것과 비교해서 비율(ratio) 값이 2배 이상이면 상향조절(up-regulate)되는 유전자(방사선-반응성 유전자)로 보고, 비율(ratio) 값이 0.5배 이하이면 하향조절(down-regulate)되는 유전자로 보았다. 유전자의 시간별 발현양상을 별로 조사하기 위하여 Eisen(Eisen et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 95, 14863~14868. 1998)의 방법에 따라 GeneSpring 소프트웨어(Silicon Genetics, CA., U.S.A., 2001)를 사용해서 클러스터링을 수행하였다.
상기 cDNA 칩의 혼성화 결과를 유전자 발현양상이 유사한 유전자끼리 클러스터링 할 수 있었다. 클러스터링 결과를 각각 도 2및 도 3에 나타내었다. 각 스팟의 시그날을 각 슬라이드의 스팟 시그날의 평균값으로 나눠서 표준화하였다. cDNA 칩의 1,221개 유전자 중에서 62개 유전자가 방사선에 조사되고 난 후 2시간 정도에 유도되었고(도 3의 패널 A), 16개의 유전자가 방사선 조사 후 6시간 후에 유도되었으며(도 3의 패널 B). 방사선 조사 후 24시간 후에는 27개의 유전자가 나타났다(도 3의 패널 C). 또한 변화가 없는 유전자(house keeping gene)을 포함하는 251개 유전자들도 나타났다(도 3의 패널 D). 그리고 1,221유전자 중 865개 유전자는 특정한 범주로 분류할 수 없었다. 이런 유전자들은 여러 정상적인 사람들에게서 나타나는 결과를 보였다.
실시예 6
역전사연쇄중합반응(RT-PCR)을 통해 방사선 조사된 말초혈액세포에서 수득한사이토카인 유전자의 시간별 발현양상 분석
상기 실시예 2의 말초혈액세포로부터 추출한 RNA를 역전사하여 사이토카인 유전자를 동정하였다. RNA 1㎍에 10X 랜덤 핵사머(random hexamer) 1㎕를 넣고, 20 ㎕이 되도록 DEPC-처리수를 첨가한 후, 70℃에서 10분간 반응시키고, 곧바로 얼음으로 냉각시켰다. 상기 시료에 5x 첫번째 가닥 완충액(first strand buffer) 4㎕, 100mM DTT, 10mM dNTP 혼합액 4㎕, 0.2㎕ M-MLV 역전사 효소를 넣어 잘 섞어주고 원심 분리한 후 37℃, 1시간 30분 반응시킨 다음 65℃에서 10분간 배양하여 잔류 단백질을 불활성화 시켰다. 여기에 증류수를 30㎕을 넣어서 다음 사용할 때까지 -20℃에서 보관하였다. 이렇게 해서 만들어진 DNA는 10x 완충용액 2㎕, 10mM dNTP 1.6㎕, 9종류의 사이토카인 유전자를 증폭하기 위하여 사용한 프라이머 쌍(50pmol) 각각 0.5㎕, DNA 1㎕, Taq polymerase(TaKaRa, 5U/㎕) 0.1㎕ 및 나머지는 증류수로 20㎕가 되도록 첨가한 후, 94℃에서 5분간, 95℃에서 1분간, 54℃에서 1분간, 72℃에서 1분간 과정을 35 주기로 수행하였다. 72℃에서 10분간 신장시킨 다음 1% TAE 아가로스 겔에서 확인하였다. 이때,β-actin을 마커로 하고 방사선을 조사하지 않은 대조군의 말초혈액세포, 방사선 조사한 후 2시간, 6시간, 24시간 경과한 말초혈액세포를 RT-PCR한 DNA를 아가로스 겔에서 확인하였다.
그 결과로서, 사이토카인 유전자들이 2시간, 6시간, 24시간에 따라 발현하는 양상이 상이하게 나타났다. 아가로스 겔에서 발현이 확인된 사이토카인 유전자는 2종류인 IL-4 및 IL-6 이다(도 4). IL-4의 경우는 방사선 조사 후 경과시간이 24시간 되었을 때 발현이 증가하였지만 방사선 조사되지 않은 시료에서 수득한 IL-4의 경우에는 방사선 조사 후 경과시간이 2시간, 6시간 된 시료에서 수득한 IL-4 보다 다소 증가된 발현을 보였다. IL-6의 경우는 방사선 조사 후 경과시간이 24시간 되었을 때 발현이 다소 감소하였다. 또한 2종류의 사이토카인 유전자의 시간별 발현양상을 조사하기 위하여 서로 다른 정상인 사람으로부터 분리한 말초혈액세포를 방사선 조사한 시료를 대상으로 실험하였는데 이는 다른 개체 사이의 시간별 발현양상의 재현성을 보기 위한 것이다. 조사한 바에 의하면 개체간의 유도수준(induction level)이 1.5배 보다 작았으며, 시간별 발현양상은 개체간에 비슷하였다. 이것은 유도된 전사수준(transcript level)이 뚜렷한 범위(range)의 값을 가질 때 이들 사이토카인 유전자 mRNA가 바이오마커(biomarker)로서 각각의 환자에 사용될 수 있음을 의미한다.
본 발명은 방사선 조사된 사람의 말초혈액세포에서 사이토카인 유전자의 시간별 발현양상을 분석하는 방법 및 이를 위한 DNA 칩을 제공함으로써 방사선 치료에 의한 암환자의 반응을 비교 분석하는데 유용될 수 있다.

Claims (3)

  1. 방사선 조사된 사람 말초혈액세포로부터 경과시간에 따라 수득한 유전자 중 사이토카인 유전자의 시간별 발현양상을 분석하여 방사선 치료에 대한 암환자의 반응을 평가하기 위해 사이토카인 유전자 cDNA가 기판에 집적된 DNA 칩.
  2. 제 1항에 있어서, 하기와 같이 DNA 단편에 대응하여 사이토카인 유전자를 하나 이상 증폭시키고, 증폭된 사이토카인 유전자의 시간별 발현양상을 분석하는데 사용되는 DNA 칩:
    서열번호 1 및 2의 DNA 단편 - IL-4; 및
    서열번호 3 및 4의 DNA 단편 - IL-6.
  3. 사람으로부터 말초혈액세포를 채취하고, 채취된 말초혈액세포를 일반적인 방사선 치료에 사용되는 선량으로 조사한 후, 조사된 말초혈액세포로부터 경과시간에 따라 RNA를 추출하고, 추출한 RNA를 역전사시켜 DNA를 생성하며, 생성된 DNA를 서열번호 1 및 2의 DNA 단편 또는 서열번호 3 및 4의 DNA 단편 중 하나 이상의 프라이머 쌍으로 사이토카인 유전자를 증폭시키고, 증폭된 사이토카인 유전자의 시간별 발현양상을 분석하여 방사선 치료에 대한 암환자의 반응을 평가하는 방법.
KR1020020057029A 2002-09-18 2002-09-18 사이토카인 유전자 발현분석을 이용하여 방사선 치료에대한 암환자의 반응을 평가하는 방법 및 이를 위한 ｄｎａ칩 KR20040025185A (ko)

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