ES2707977T3 - Método de detección de cáncer mediante el sentido del olfato del nematodo - Google Patents

Abstract

Un método in vitro para detectar cáncer, caracterizado por la detección de cáncer utilizando, como indicador, la reacción de los nematodos al olor de una sustancia relacionada con la biología derivada del sujeto o un producto procesado de la misma; en donde la sustancia relacionada con la biología o un producto procesado de la misma es una muestra biológica recolectada de un sujeto, o un producto procesado de la misma, en donde la muestra biológica es un fluido corporal, células, tejidos, sangre o espiración.

Description

DESCRIPCION

Metodo de deteccion de cancer mediante el sentido del olfato del nematodo

Campo tecnico

La presente invencion se refiere a un metodo para detectar cancer usando el sistema olfativo de nematodos.

Tecnica anterior

La neoplasia maligna, incluido el cancer, ha sido la principal causa de muerte entre los japoneses desde 1981. De acuerdo con la Organizacion Mundial de la Salud, la tasa de muertes por neoplasia maligna en 2005 fue del 13% (7.600.000 personas) en todo el mundo y se predijo que la tasa de muertes por neoplasia maligna continuarfa aumentando en el futuro.

Mientras la etapa del cancer sea temprana, la carga mental, ffsica, economica y social sobre la atencion medica serfa leve y la capacidad de curacion tambien aumentarfa. A medida que avanza la etapa del cancer, dicha capacidad de curacion disminuye, y en el caso de un cancer recurrente progresivo no resecable, el cancer causa una carga y perdidas excesivas y da como resultado un tratamiento que prolonga la vida en las circunstancias actuales. Debido a que el cancer se desarrolla como resultado de una anomalfa en las funciones de los genes, en casi todos los tipos de cancer, se produce un aumento en una poblacion de 100.000 en proporcion de 4-6 frente a la incidencia en cada edad (Cancer Patterns in Canada, 1982). Como tal, en todos los grupos de edad o sociedades, si el cancer se puede encontrar y tratar en una etapa temprana, la carga y las perdidas pueden reducirse aparentemente en diversas situaciones.

Sin embargo, en general, el cancer temprano no tiene sfntomas, los examinados medicos no tienen motivacion suficiente para someterse a una prueba de deteccion de cancer en las circunstancias actuales. De hecho, la tasa de deteccion de cancer es aproximadamente del 10% al 35% en todos los tipos de cancer en Japon. Estos valores numericos son mucho mas bajos que el objetivo del plan basico de medidas contra el cancer en Japon, que tiene como objetivo el 50% o mas de la tasa de deteccion de cancer hasta 2017. En Japon, donde las tecnicas para tratar el cancer temprano, como los endoscopios o las tecnicas quirurgicas, se encuentran en un nivel superior en el mundo, si un metodo de deteccion de cancer de alta precision, que produce menos dolor, es simple y barato y se puede realizar en muchas personas como destinatarios, se desarrollara y aplicara recientemente, no es exagerado decir que supondrfa una revolucion en los tratamientos contra el cancer en el mundo.

Varios equipos, incluidos los presentes inventores, han estudiado el cancer utilizando perros entrenados (perros detectores de cancer) y han informado que el cancer tiene un olor unico y, por lo tanto, que el cancer puede detectarse en una muestra que contiene cancer temprano con una alta precision de mas del 90% (tanto la sensibilidad como la especificidad) (Bibliograffa no de patente 1: Sonoda, H. et al., Colorectal cancer screening with odour material by canine scent detection. Gut, 60, 814-819, 2011).

A partir de estos informes, se considera que se puede construir un sistema de deteccion de cancer de alta precision mediante la deteccion de un olor que sea especffico de un cancer.

Sin embargo, la capacidad de dicho perro detector de cancer depende de una diferencia individual y la concentracion de los perros disminuye en verano, a medida que aumenta la temperatura. Por otra parte, no existe una metodologfa especifica respecto a un metodo de entrenamiento de perros detectores. Adicionalmente, incluso en circunstancias en las que dicho perro detector de cancer esta en buenas condiciones, el lfmite de pruebas al dfa para el perro son cinco. Una prueba, que se realiza continuamente en una muestra, cuyo proposito de examen es completamente desconocido, proporciona una recompensa que es "jugar con una pelota" a un perro detector de cancer, incluso si el perro detector se comporta de forma incorrecta. Esto da como resultado una reduccion de la precision. En consecuencia, la deteccion de cancer, en la que se utilizan perros detectores, no se puede aplicar para uso comercial.

Ademas, se ha presentado un metodo para diagnosticar cancer, que comprende especificar una sustancia volatil que utiliza un dispositivo analftico como el analisis GC/MS (cromatograffa de gases/espectroscopfa de masas) (Bibliograffa no de patente 2: Y. Hanai, et al., Urinary volatile compounds as biomarkers for lung cancer. Biosci. Biotechnol. Biochem. 76, 679-84, 2012) (Bibliograffa no de patente 3: Khalid et al., A pilot study combining a GC-sensor device with a statistical model for the identification of bladder cancer from urine headspace. PLoS ONE, 8, e69602, 2013). Sin embargo, es muy probable que una sustancia volatil que existe en la vida diaria se convierta en un ruido y, por lo tanto, se necesitan enormes cantidades de fondos y tecnicas analfticas para el desarrollo y la produccion de equipos de deteccion.

Troemel et al. (Olfactory detection and discrimination in C. elegans, Mol. Biol. Cell, 7, no. Suppl., 170A, 1996) y Brgmann et al. (Odorant-selective genes and neurons mediate olfaction in C. elegans, Cell, 74(3)3, 515-527, 1993) describen la identificacion y mutacion de genes sospechosos de estar involucrados en la deteccion de odorantes. El documento US 2006/191023 A1 describe kits para la deteccion de la actividad de uno o mas agentes en un nematodo. El documento US 2010/248268 A1 describe el uso de protemas quimiosensoriales derivadas de invertebrados para diagnosticar enfermedades como el cancer.

BIBLIOGRAFIAS DE TECNICAS RELACIONADAS BIBLIOGRAFIAS NO DE PATENTE

Bibliograffa no de patente 1: Sonoda, H. et al., Colorectal cancer screening with odour material by canine scent detection. Gut, 60, 814-819, 2011

Bibliograffa no de patente 2: Y. Hanai, et al. Urinary volatile compounds as biomarkers for lung cancer. Biosci. Biotechnol. Biochem. 76, 679-84, 2012

Bibliograffa no de patente 3: Khalid et al., A pilot study combining a GC-sensor device with a statistical model for the identification of bladder cancer from urine headspace. PLoS ONE, 8, e69602, 2013

Sumario de la invencion

PROBLEMA A RESOLVER POR LA INVENCION

Es un objeto de la presente invencion proporcionar un metodo para detectar cancer, utilizando el sistema olfativo de nematodos.

MEDIOS PARA RESOLVER EL PROBLEMA

Como resultado de los estudios intensivos dirigidos a resolver el problema mencionado anteriormente, el presente inventor ha encontrado que el cancer puede detectarse, utilizando la quimiotaxis de los nematodos en funcion de su olfato o de la respuesta de la neurona olfativa, completando de esta forma la presente invencion.

Especfficamente, la presente invencion es la siguiente.

(1) Un metodo in vitro para detectar cancer, caracterizado por la deteccion de cancer utilizando, como indicador, la reaccion de los nematodos al olor de una sustancia relacionada con la biologfa derivada del sujeto o un producto procesado de la misma; en donde la sustancia relacionada con la biologfa o un producto procesado de la misma es una muestra biologica recolectada de un sujeto, o un producto procesado de la misma, en donde la muestra biologica es un fluido corporal, celulas, tejidos, sangre o espiracion.

(2) El metodo de acuerdo con el anteriormente mencionado (1), en donde el nematodo es

(a) Caenorhabditis elegans; y/o

(b) un nematodo de tipo silvestre, un nematodo mutante o un nematodo transgenico.

(3) El metodo de acuerdo con los anteriormente mencionados (1) o (2), en donde cuando el nematodo muestra una respuesta positiva al olor de la sustancia relacionada con la biologfa derivada del sujeto o un producto procesado de la misma, se determina que el sujeto tiene cancer o tiene riesgo de padecer cancer.

(4) El metodo de acuerdo con uno cualquiera de los anteriormente mencionados (1) a (3), en donde cuando la respuesta de la neurona olfativa del nematodo es alta al olor de la sustancia relacionada con la biologfa derivada del sujeto o un producto procesado de la misma, se determina que el sujeto tiene cancer o tiene riesgo de padecer cancer.

(5) El metodo de acuerdo con uno cualquiera de los anteriormente mencionados (1) a (4), en donde la sustancia relacionada con la biologfa o un producto procesado de la misma es un fluido corporal tal como orina, celulas, tejidos, un cultivo de las celulas o tejidos, o una solucion conservante de las celulas o tejidos tal como solucion salina fisiologica.

(6) Un metodo para identificar un receptor olfativo en nematodos, caracterizado por identificar un receptor olfativo usando nematodos; en donde se inhibe la expresion o funcion de un gen que codifica el receptor y se prueba la reaccion del nematodo inhibido a un olor y, en donde

(a) el olor es el olor de los tipos de cancer; y/o

(b) el tipo de receptor a identificar es diferente segun los tipos de cancer o la concentracion de un odorante. (7) El metodo de acuerdo con el anteriormente mencionado (6), en donde la expresion o funcion del gen receptor es inhibida por ARNi.

(8) El metodo de acuerdo con los anteriormente mencionados (6) o (7), en donde el nematodo es Caenorhabditis elegans.

(9) Un metodo para identificar tipos de cancer, caracterizado por identificar tipos de cancer utilizando, como indicador, la reaccion de los nematodos al olor de una sustancia relacionada con la biologfa derivada del sujeto o un producto procesado de la misma; en donde el metodo comprende las siguientes etapas:

(a) detectar cancer por el metodo de acuerdo con uno cualquiera de los anteriormente mencionados (1) a (5),

(b) probar la reaccion de un nematodo modificado, que se ha preparado modificando un receptor identificado por el metodo de acuerdo con uno cualquiera de los anteriormente mencionados (6) a (8), al olor de una muestra, que se ha detectado que tiene cancer en la etapa (a) y

(c) determinar los tipos de cancer correspondientes al receptor identificado como tipos de cancer diana de la identificacion cuando la reaccion al olor es diferente entre el nematodo modificado y el nematodo utilizado en la etapa (a);

en donde la sustancia relacionada con la biologfa o un producto procesado de la misma es una muestra biologica recolectada de un sujeto, o un producto procesado de la misma, en donde la muestra biologica es un fluido corporal, celulas, tejidos, sangre o espiracion.

(10) El metodo de acuerdo con el anteriormente mencionado (9), en donde la modificacion del receptor es al menos una seleccionada del grupo que consiste en la eliminacion del receptor, la inhibicion de la expresion o funcion del receptor y la alta expresion o alta funcionalizacion del receptor.

(11) Uso de un kit para detectar o identificar cancer, en el que el kit comprende nematodos.

(12) El uso de acuerdo con el anteriormente mencionado (11), en donde el nematodo es:

(a) Caenorhabditis elegans; y/o

(b) un nematodo de tipo silvestre, un nematodo mutante o un nematodo transgenico.

(13) Uso de un sistema para detectar cancer, en donde el sistema comprende:

un nematodo,

una parte de almacenamiento para almacenar una sustancia relacionada con la biologfa o un producto procesado de la misma y el nematodo y una parte de deteccion para detectar la reaccion a un olor del nematodo en la parte de almacenamiento.

EFECTO DE LA INVENCION

De acuerdo con la presente invencion, se proporciona un metodo in vitro para detectar cancer usando un nematodo. De acuerdo con el metodo de la presente invencion, el cancer puede detectarse con alta sensibilidad y a bajos costes. Por otra parte, de acuerdo con el metodo de la presente invencion, el analisis de las muestras recolectadas se realiza facilmente, y ademas, es barato. Adicionalmente, el metodo de la presente invencion es capaz de detectar cancer temprano. Por lo tanto, el metodo de la presente invencion es extremadamente util para pruebas clfnicas para el cancer.

Breve descripcion de los dibujos

La Figura 1 es una vista que muestra los resultados de la prueba de reaccion de nematodos a la orina de sujetos sanos y de pacientes con cancer.

La Figura 2 es una vista que muestra el formato de una placa de Petri utilizada en el metodo de la presente invencion.

La Figura 3 es una vista que muestra un principio de medicion cuando se usa un gen Yellow Cameleon como gen indicador.

La Figura 4 es una vista que muestra un principio de medicion cuando se utiliza un gen GCaMP como gen indicador.

La Figura 5 una vista que muestra un chip que tiene un canal de micro flujo, en el que se dispone para un nematodo.

La Figura 6 es una vista que muestra el cambio de canales de flujo en un chip que tiene canales de micro flujo.

La Figura 7 es una vista que muestra los resultados obtenidos al examinar la reaccion de la neurona olfativa AWC de un nematodo a la orina derivada de un paciente con cancer.

La Figura 8 es una vista que muestra los resultados obtenidos al examinar la reaccion de la neurona olfativa AWC de un nematodo a la orina derivada de un paciente con cancer.

La Figura 9 es una vista que muestra los resultados obtenidos al examinar la quimiotaxis de los nematodos, utilizando una muestra de orina de la que se han eliminado los precipitados y los solidos.

La Figura 10 es una vista que muestra los resultados obtenidos al examinar la reaccion de la neurona olfativa AWA de un nematodo a la orina derivada de un paciente con cancer.

La Figura 11 es una vista que muestra los resultados obtenidos al examinar la reaccion de la neurona olfativa AWA de un nematodo a la orina derivada de un paciente con cancer.

La figura 12 es una vista que muestra las placas de ensayo.

La Figura 13 es una vista que muestra el comportamiento de atraccion de los nematodos a un medio de cultivo de celulas cancerosas.

La Figura 14 es una vista que muestra los resultados de una prueba a mediana escala del metodo de la presente invencion.

La Figura 15 es una vista que muestra los resultados obtenidos al realizar una prueba a mediana escala utilizando el metodo de la presente invencion y otros marcadores tumorales y, a continuacion, hacer una comparacion entre ellos, en terminos de sensibilidad.

La Figura 16A es un diagrama de bloques que muestra un sistema para su uso con la presente invencion.

La Figura 16B es un diagrama de configuracion que muestra una parte de procesamiento de un sistema para su uso con la presente invencion.

La Figura 17 es una vista que muestra la quimiotaxis de los nematodos en medios de cultivo de fibroblastos que tienen diferentes concentraciones.

La Figura 18 es una vista que muestra la quimiotaxis de los nematodos en medios de cultivo de celulas cancerosas que tienen diferentes concentraciones.

colo205 = cancer de intestino grueso, MKN1 = cancer gastrico

La Figura 19 es una vista que muestra la quimiotaxis de los nematodos en los tejidos cancerosos y en los tejidos normales de un paciente con cancer de colon sigmoide.

La Figura 20 es una vista que muestra la quimiotaxis de los nematodos en una solucion diluida de una solucion salina fisiologica, a la que se ha agregado una seccion de tejido de cancer humano y se ha conservado.

La Figura 21 es una vista que muestra los resultados obtenidos al probar la quimiotaxis de los nematodos, mientras se cambia la concentracion de orina.

La Figura 22 es una vista que muestra el analisis de ARNi de un receptor olfativo asociado con una respuesta a un odorante especffico.

(A) Confirmacion de la eficacia de la estrategia de analisis de ARNi. El efecto del ARNi de un mutante eri-1 que se dirige a odr-10 se muestra en una respuesta quimiotactica a una dilucion 10-3 de diacetilo o una dilucion 10-3 de pirazina. Se muestra una diferencia significativa respecto a un control (P <0,001, prueba t de Student). (B) El numero de genes candidatos a receptores olfativos obtenidos despues del tercer analisis, que se ha asociado con la quimiotaxis a un odorante. (C) Los patrones de expresion de los indicadores fluorescentes, cuya expresion ha sido inducida por un promotor srx-47 o sra-17. El color verde indica la expresion de la protefna fluorescente Venus inducida por los promotores de estos genes. El color magenta indica la expresion de mCherry en las neuronas olfativas AWA, ^{a W b} y AWC. Se observo la expresion de srx-47 en neuronas AWA y ASH. Se detecto la expresion de sra-17 en neuronas AWA. Barra de escala: 10 pm.

La Figura 23 es una vista que muestra los patrones de expresion de los genes candidatos a receptores olfativos. (Izquierda) El color verde indica la expresion de Venus, que ha sido inducida por los promotores de los genes candidatos a receptores olfativos. (Centro) El color magenta indica (A) la expresion de mCherry en neuronas AWA, AWB y AWC, o neuronas sensoriales tenidas de colorante (neuronas ^{A s h ,} ASJ, AWB, ASK, ADL, ASI, PHA y PHB ) (B-M). (Derecha) Vista fusionada. Todas las imagenes son las imagenes del lado izquierdo de las regiones principales de los nematodos, a excepcion de C, partes inferiores (regiones de la cola). Las flechas y las puntas de flecha indican los cuerpos celulares de las neuronas que expresan genes candidatos a receptores. Barra de escala = 10 pm.

La Figura 24 es una vista que muestra que SRI-14 funciona para una respuesta a una alta concentracion de diacetilo en neuronas ASH.

(A) La quimiotaxis de tipo silvestre (WT),odr-10 y sri-14 mutantes a una concentracion baja y una concentracion alta de diacetilo. Las concentraciones de diacetilo se muestran en las partes inferiores (n = 5). (B) Efectos de ARNi dirigidos a sri-14 en respuesta de evitacion a una alta concentracion de diacetilo (5 pl, sin diluir) (n = 8). (C) La quimiotaxis del mutante sri-14 a una alta concentracion de diacetilo (5 pl, sin diluir, Da), alcohol isoamflico (5 pl, sin diluir, laa) y benzaldehfdo (1 pl, sin diluir, Bz), y tambien de los repelentes octanol (1 pl, sin diluir, OCT) y nonanona (1 pl, sin diluir, Nona) (n = 6). (D) Los patrones de expresion de los indicadores fluorescentes (verde), cuya expresion ha sido inducida por un promotor sri-14. La punta de flecha indica el cuerpo celular de AWC o ASH identificado por mCherry o por tinte fluorescente, respectivamente (magenta). (E) Efectos obtenidos por el ARNi especffico de ASH o AWC de un nematodo de tipo silvestre en sri-14, con respecto a la quimiotaxis a una alta concentracion de diacetilo (5 pl, sin diluir) (n = 5). (F) Efectos obtenidos por la expresion neuronal especffica del ADNc de sri-14, con respecto a un defecto en la respuesta de un mutante sri-14 a una alta concentracion de diacetilo (5 pl, sin diluir) (n = 5). (G) Localizacion de SRI-14::GFP en los cilios sensoriales de ASH. Barra de escala: 10 pm (D y G). Las barras de error indican EEM. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, Prueba t de Student (B y C) o prueba de Dunnett (A, E, y F).

La Figura 25 es una vista que muestra los resultados obtenidos al analizar de manera repetida la quimiotaxis de nematodos tratados con ARNi a una alta concentracion de diacetilo.

Ademas de los ARNi de sri-14, los ARNi de srh-25, srh-79, srh-216 o srh-281, entre los genes de receptores candidatos con respecto a la respuesta a una alta concentracion de diacetilo (5 pl, sin diluir) obtenida despues del tercer analisis, han causado un defecto significativo y reproducible en un comportamiento de evitacion de diacetilo. Las barras de error indican EEM. Se muestra una diferencia significativa de un control (*P <0,05, **P < 0,01; prueba t de Student incluyendo la correccion de Bonferroni).

La Figura 26 es una vista de la estructura de sri-14.

sri-14 codifica una protefna 7-transmembrana. (A) La estructura del gen sri-14. Muestra una region de delecion del alelo ok2685. (B) Las supuestas secuencias de aminoacidos de SRI-14. Muestra un dominio 7-transmembrana predicho por un modelo oculto de Markov. (C) Un grafico hidrofobo de SRI-14. El grafico deriva de un parametro de hidropatfa definido por Kyte y Doolittle. (D) El mutante sri-14 mostro un comportamiento de evitacion normal a un estfmulo osmotico alto (NaCl 4M). Las barras de error indican EEM. Se muestra una diferencia significativa de un control (**P <0,01, prueba de Dunnett ).

La Figura 27 es una vista que muestra neuronas asociadas con una respuesta a una alta concentracion de diacetilo. (A) La quimiotaxis de nematodos de tipo silvestre (n > 8), en los que se han eliminado las neuronas sensoriales especfficas, a una alta concentracion de diacetilo (5 pl, sin diluir). (B) La quimiotaxis de nematodos, de los cuales se ha eliminado AWA, a diacetilo diluido a 10-3 (C) Una vista esquematica que muestra conexiones neuronales entre las neuronas sensoriales AWA y ASH y 4 interneuronas de primera capa. (D) La quimiotaxis de los nematodos de tipo silvestre (n > 5), en los que se han inhibido interneuronas especfficas, a una alta concentracion de diacetilo (5 pl, sin diluir). (E) La quimiotaxis de los nematodos de tipo silvestre (n > 5), en los que se han inhibido interneuronas especfficas, a diacetilo diluido a 10-3 Las barras de error indican EEM. **P < 0,01, ***P < 0,001, Prueba de Dunnett; t t t P < 0,001; prueba t de Student. En la Figura 27 (A), el asterisco indica una diferencia estadfsticamente significativa, en comparacion con una cepa de control de tipo silvestre en la que ninguna neurona ha sido eliminada ni inhibida.

La Figura 28 es una vista que muestra la respuesta de las neuronas AWA a diversas concentraciones de diacetilo. (A) La respuesta a calcio de las neuronas AWA en un nematodo de cada genotipo designado, despues de la estimulacion por una baja concentracion de diacetilo (diluido a 10-5 ). La region sombreada alrededor de la curva indica EEM (n > 8 en todos los genotipos). La barra negra indica la presencia de estimulacion con diacetilo. (B) Un cambio en la fluorescencia media 10 segundos despues de la adicion de una baja concentracion de diacetilo (diluido a 10-5). Las barras de error indican EEM. **P < 0,01, Prueba de Dunnett (n > 8 en cada genotipo). El color negro indica TS, el color rojo indica mutantes sri-14 y el color azul indica mutantes odr-10. (C) La respuesta a calcio de las neuronas AWA en un nematodo de cada genotipo designado, despues de la estimulacion por una alta concentracion de diacetilo (diluido a 10-3 ). Los datos se muestran de la misma manera que en (A) anteriormente descrita (n > 8 en todos los genotipos). (D) Un cambio en la fluorescencia media 10 segundos despues de la adicion de una alta concentracion de diacetilo (diluido a 10-3). La barra de error indica EEM (n > 8 en todos los genotipos).

La Figura 29 es una vista que muestra la respuesta de las neuronas ASH a diversas concentraciones de diacetilo. (A) La respuesta a calcio de las neuronas ASH en nematodos de tipo silvestre, despues de la estimulacion por una concentracion baja (diluido a 10-5) y una concentracion alta (diluido a 10-3) de diacetilo (n > 11). (B) La respuesta a calcio de las neuronas ASH en los mutantes sri-14 (n = 26), los mutantes odr-10 (n = 28), los mutantes de sri-14 que tienen la expresion especffica de ASH del ADNc de sri-14 (rescate de sri-14, n = 9), y nematodos de tipo silvestre que involucran los ARNi especfficos de ASH de sri-14 (n = 20). La region sombreada alrededor de la curva indica EEM. La barra negra indica la presencia de estimulacion con diacetilo. (C) Un cambio en la fluorescencia media 10 segundos despues de la adicion de una alta concentracion de diacetilo (diluido a 10-3). Las barras de error indican EEM. *P < 0,05, prueba de Dunnett (n > 11).

La Figura 30 es una vista que muestra la imagen de calcio de neuronas ASH en mutantes unc-13 y nematodos con AWA eliminadas. La respuesta a calcio de las neuronas ASH en nematodos de tipo silvestre (A, N = 14), mutantes unc-13 (B, N = 14) y nematodos con AWA eliminadas (C, N = 11), despues de la estimulacion por una alta concentracion de diacetilo (diluido a 10-3). En el caso de los mutantes unc-13 y los nematodos con AWA eliminadas, se observo una respuesta a calcio, que ha continuado durante un perfodo de tiempo mas largo que en el caso de las neuronas de nematodos de tipo silvestre. La region sombreada alrededor de la curva indica EEM. La barra negra indica la presencia de estimulacion con diacetilo. (D) Un cambio en la fluorescencia media 10 segundos despues de la adicion de una alta concentracion de diacetilo. Las barras de error indican EEM. Se muestra una diferencia significativa de un control (*P <0,05, prueba de Dunnett ).

La Figura 31 es una vista que muestra la respuesta de neuronas AWC a la eliminacion de una alta concentracion de diacetilo. La respuesta a calcio de las neuronas AWC en nematodos de tipo silvestre, despues de la eliminacion de una alta concentracion de diacetilo (diluido a 10-3 )(n= 10). La region sombreada alrededor de la curva indica EEM. La barra negra indica la presencia de diacetilo.

La Figura 32 es una vista que muestra la respuesta de neuronas AWB a la eliminacion de una alta concentracion o una baja concentracion de diacetilo. (A) La respuesta a calcio de las neuronas AWB en nematodos de tipo silvestre (marron, n = 10) o de neuronas AWB en nematodos en los cuales se ha expresado sri-14 ectopicamente (naranja, n = 11), despues de la eliminacion de una baja concentracion (diluido a 10 , izquierda) o de una alta concentracion (diluido a 10-3, derecha) de diacetilo. La region sombreada alrededor de la curva indica EEM. La barra negra indica la presencia de diacetilo. (B) Un cambio en la fluorescencia media 10 segundos despues de la eliminacion de diacetilo. La barra blanca indica una cepa de tipo silvestre; y la barra naranja indica una cepa en la que se ha expresado sri-14 ectopicamente en AWB. Las barras de error indican EEM. ***P < 0,001, prueba t de Student ( n > 10).

La Figura 33 es un diagrama modelo que muestra el cambio de un receptor olfativo, que depende de la concentracion de un olor. A una concentracion mas baja de diacetilo, ODR-10 en las neuronas AWA funciona como un receptor de diacetilo y provoca la activacion de ^aW^a y un comportamiento de atraccion pero no SRI-14 en las neuronas ASH. Por el contrario, SRI-14 en las neuronas ASH detecta una concentracion mas alta de diacetilo, pero no la detecta ODR-10 en las neuronas AWA. Las neuronas ASH se activan solo por una mayor concentracion de diacetilo, e inducen un comportamiento de evitacion. AWA tambien responde a una mayor concentracion de diacetilo, lo que indica que los receptores olfativos distintos de ODR-10 en las neuronas AWA responden a una mayor concentracion de diacetilo.

La Figura 34 es una vista que muestra la quimiotaxis de una cepa N2 y una cepa mutante genetica en la orina de pacientes que tienen varios tipos de cancer.

La Figura 35 es una vista que muestra la quimiotaxis de una cepa N2 y una cepa mutante genetica para varios tipos de sustancias qufmicas.

La Figura 36 es una vista que muestra la quimiotaxis de la cepa con receptor olfativo atenuado en la orina de pacientes con cancer de mama.

La Figura 37 es una vista esquematica que muestra un metodo para especificar tipos de cancer mediante la realizacion de una prueba con respecto a la quimiotaxis de nematodos.

REALIZACIONES PARA LLEVAR A CABO LA INVENCION

En lo sucesivo en el presente documento, la presente invencion se describira con detalle.

1. Sumario

(1) Deteccion de cancer

La presente invencion se refiere a un metodo in vitro para detectar cancer como se define en las reivindicaciones. En algunas realizaciones, el metodo se caracteriza por la crfa de nematodos en presencia de una sustancia relacionada con la biologfa derivada del sujeto o un producto procesado de la misma, y a continuacion detectar cancer, por ejemplo, utilizando la quimiotaxis de los nematodos basandose en su olfato como un indicador.

Tras evaluar si un sujeto ha tenido cancer o no, el presente inventor se ha centrado en, en un aspecto, la quimiotaxis del nematodo C. elegans basandose en el olfato del mismo en una muestra derivada del sujeto.

Un nematodo, Caenorhabditis elegans (en los sucesivo en este documento tambien abreviado como "C. elegans"), es un organismo popular, que ha sido ampliamente criado y estudiado como un organismo modelo para el estudio biologico en laboratorios de todo el mundo. Caenorhabditis elegans se caracteriza porque su crfa es facil y tiene un excelente sistema olfativo.

Dichos nematodos muestran una quimiotaxis a un odorante, tal como acercarse o escapar de el. Por lo tanto, en la presente invencion, utilizando tal comportamiento como un indicador, se examinaran las reacciones de los nematodos a los olores de canceres.

Se han examinado las reacciones de los nematodos a la orina de sujetos sanos y pacientes con cancer. Como resultado, los nematodos han mostrado un comportamiento de evitacion a la orina de los sujetos sanos, mientras que han mostrado un comportamiento de atraccion a la orina de los pacientes con cancer. Como resultado del examen realizado en 30 muestras, se encontro que la precision era del 100% (Figura 1).

Por otra parte, los nematodos han reaccionado con todos los canceres gastricos, canceres de colon/recto y canceres pancreaticos, incluidos los canceres tempranos. Por lo tanto, se ha demostrado que, al igual que con el comportamiento de los perros detectores de cancer, los nematodos reaccionan con olores especfficos del cancer, que son comunes en varios tipos de cancer.

En consecuencia, en la presente invencion, tipos de cancer, tales como cancer gastrico, cancer de colon/rectal, cancer de esofago, cancer pancreatico, cancer de prostata, cancer del conducto biliar, cancer de mama, linfoma maligno, tumor estromal gastrointestinal, cancer de ciego y cancer de pulmon, pueden usarse como dianas de deteccion.

Este sistema de diagnostico de cancer que utiliza nematodos puede resolver muchos problemas de las tecnicas de la tecnica anterior, como se describe a continuacion.

(i) El sistema actual de diagnostico de cancer es capaz de detectar el cancer temprano.

Incluso se puede detectar cancer temprano de etapa 0 o 1 con alta precision. Una muestra, que se habfa determinado que era negativa por un marcador tumoral existente en el momento de la recoleccion de orina (2011), ha dado positivo por esta prueba. Este paciente ha desarrollado cancer durante dos anos en la observacion de seguimiento. Es decir, puede detectarse cancer no detectable por los marcadores tumorales existentes por la presente invencion.

(ii) La presencia de muchos tipos de cancer se puede diagnosticar con una sola prueba. Es decir, muchos tipos de canceres pueden diagnosticarse por un unico examen medico. Hasta la fecha, se ha confirmado que el cancer gastrico, cancer de colon/rectal, cancer de esofago, cancer pancreatico, cancer de prostata, cancer del conducto biliar, cancer de mama, linfoma maligno, tumor estromal gastrointestinal, cancer de ciego y cancer de pulmon se pueden detectar mediante el presente sistema de diagnostico de cancer.

(iii) El presente sistema de diagnostico de cancer tiene una alta sensibilidad.

En una prueba utilizando 30 muestras, el presente sistema de diagnostico de cancer ha sido capaz de detectar canceres con una sensibilidad/especificidad del 100%. Por otra parte, incluso en una prueba a mediana escala (con 242 muestras), el presente sistema de diagnostico de cancer ha sido capaz de detectar canceres en pacientes con cancer con una sensibilidad del 100% y una especificidad del 95%.

(iv) Es facil recoger muestras.

No se determinan condiciones especiales tales como restriccion dietetica para la recoleccion de muestras de orina. Pueden usarse muestras de orina recogidas en un examen medico ordinario y regular para el analisis. Por lo tanto, los sujetos no necesitan sentir dolor y es posible recolectar muestras al mismo tiempo que se realiza otro examen de orina. La cantidad necesaria de orina es solo de varios microlitros (pl).

(v) El analisis puede realizarse facilmente a bajos costes.

(v-1) El analisis puede llevarse a cabo con prontitud.

Es posible realizar analisis en poco tiempo. Se tarda aproximadamente 1,5 horas en analizar la quimiotaxis de los nematodos. Se tarda aproximadamente 30 minutos en analizar la respuesta de la neurona olfativa de los nematodos transgenicos.

(v-2) Economico

Por ejemplo, el presente sistema de diagnostico de cancer cuesta lo siguiente: para una muestra, dos placas de petri para criar nematodos (aproximadamente 10 yenes por placa de petri) y de tres a cinco placas de petri para analizar la quimiotaxis de los nematodos (aproximadamente 10 yenes por placa de petri). El agar cuesta 2,5 yenes y cada tipo de placa de Petri 10 yenes. Por lo tanto, el coste de una muestra es de aproximadamente 100 yenes, incluidos los costes de otros reactivos y similares. Incluso si se anaden los gastos de personal a los costes mencionados anteriormente, el analisis puede realizarse de forma extremadamente economica. (v-3) El analisis es facil, y por lo tanto, no requiere habilidades profesionales. La quimiotaxis de los nematodos se puede analizar de manera extremadamente sencilla y, por lo tanto, cualquiera puede hacerlo. Ademas, la crfa de los nematodos tambien es facil. No es necesario entrenamiento especial de nematodos y normalmente se pueden usar nematodos criados para el analisis.

(v-4) El analisis puede llevarse a cabo en muchas muestras.

Un solo investigador es capaz de realizar el analisis de quimiotaxis unas 150 veces al dfa. Como se analiza la quimiotaxis 3 veces para una sola muestra, se pueden analizar 50 muestras por dfa. Tambien es posible automatizar esta operacion.

(vi) La aplicacion del presente sistema de diagnostico de cancer es facil y el sistema puede aplicarse en todo el mundo.

(vi-1) El sistema en su conjunto es barato y se puede aplicar facilmente.

La crfa de nematodos no requiere una sala especial. Los aparatos necesarios son unicamente una incubadora a 20 °C y un microscopio estereoscopico, y por lo tanto, el sistema se puede construir a bajo coste y en poco tiempo.

(vi-2) El sistema se puede aplicar en todo el mundo.

Debido a que el presente sistema no necesita un dispositivo de medicion costoso, se puede introducir, no solo en pafses avanzados, sino tambien en todos los pafses.

(vii) El presente sistema de diagnostico de cancer puede aplicarse al diagnostico de cancer recurrente despues de la terapia contra el cancer.

Debido a que el presente sistema es capaz de detectar canceres en todos los sitios, puede aplicarse a la determinacion de la posibilidad de recurrencia postoperatoria.

Como se ha descrito anteriormente, la presente invencion es util como un metodo de examen del cancer novedoso, altamente preciso, que produce menos dolor a un sujeto, en el cual las operaciones se pueden realizar facilmente a bajo coste y se pueden realizar en muchas personas como destinatarios.

(2) Identificacion de receptores olfativos

Un olor es recibido por un receptor olfativo en una neurona olfativa. Se puede decir que un ser humano tiene aproximadamente 350 tipos de receptores olfativos y es capaz de identificar aproximadamente diez mil tipos de olores. Se desconoce como un numero tan pequeno de receptores son capaces de identificar un enorme numero de odorantes. Para dilucidarlo, es necesario revelar la relacion de correspondencia entre un olor y un receptor. Sin embargo, tal intento se ha llevado a cabo solo parcialmente, y como resultado, apenas se conoce la relacion de correspondencia, en particular, en un animal vivo.

El nematodo C. elegans es util para analisis in vivo, tiene solo alrededor de 10 neuronas olfativas (por otro lado, un humano tiene alrededor de 5.000.000 de neuronas olfativas), y se han identificado todos sus circuitos neurales. Ademas, el nematodo C. elegans tiene casi el mismo mecanismo para detectar un olor que el de los mamfferos. En consecuencia, se consideran C. elegans como un organismo modelo para el estudio de los mecanismos olfativos. Los receptores olfativos de C. elegans son del mismo tipo acoplado a protefna G 7-transmembrana que los mamfferos y hay 1.200 o mas receptores olfativos predichos en su genoma. Sin embargo, entre tales receptores olfativos, solo se ha revelado un receptor (un receptor de diacetilo, ODR-10) con respecto a la relacion de correspondencia con un odorante y se desconoce como el nematodo recibe senales de olor.

Por lo tanto, el presente inventor ha llevado a cabo un analisis exhaustivo, en el que el inventor ha inhibido la funcion de los genes de los receptores olfativos en los nematodos vivos mediante ARNi y, a continuacion, ha examinado como los nematodos tratados con ARNi responden a 11 tipos de odorantes. Se han recogido y analizado genes implicados en la respuesta del nematodo para cada olor de manera repetida. Como resultado, el presente inventor ha logrado obtener genes candidatos para todos los odorantes examinados (Figura 22B).

Posteriormente, con el fin de aclarar si los genes candidatos obtenidos funcionan o no realmente como receptores olfativos en el animal vivo, el presente inventor se ha centrado en un fenomeno por el cual la preferencia (gustos y aversiones) a un solo olor varfa dependiendo de la concentracion del olor. En el caso de un ser humano, se conoce empfricamente que la preferencia por un olor cambia dependiendo de sus concentraciones, y por ejemplo, una baja concentracion de indol provoca el olor a jazmfn, mientras que una alta concentracion de indol provoca el olor de las heces y la orina. El presente inventor habfa aclarado en los estudios previos que se observa un fenomeno similar tambien en nematodos y que cambia el tipo de neurona olfativa que se activa segun la concentracion de un olor y, de este modo, se modifica la preferencia (Yoshida, K. et al.: Nature Communications 3, 739 (2012)). ^El tipo de un receptor que reacciona a un solo olor cambia, dependiendo de la concentracion del olor? Para analizar esta interesante pregunta, el presente inventor se ha centrado en un gen sri-14, que se obtuvo como un gen asociado con la recepcion de una alta concentracion de diacetilo. Un mutante de perdida de funcion sri-14 ha tenido una reaccion normal a una baja concentracion de diacetilo y ha mostrado anomalfas solo en la reaccion a una alta concentracion de diacetilo. Por otro lado, en un mutante del receptor de diacetilo ODR-10 existente, solo se ha reducido la reaccion a una baja concentracion de diacetilo (Figura 24A). Ya se habfa informado de que ODR-10 funciona en una neurona olfativa AWA que recibe un olor favorito (Sengupta, P.et al.: Cell 84, 899-909 (1996)). Como resultado del analisis de la expresion de sri-14, un experimento de rescate y un experimento de inhibicion de la expresion genica de neuronas especfficas, se ha descubierto que SRI-14 funciona en una neurona sensorial ASH que recibe un olor repulsivo (Figura 24 ). Ademas, se ha observado la localizacion de SRI-14 en los cilios sensoriales, en los que estan presentes receptores olfativos (Figura 24G).

En el presente documento, ejemplos del experimento de inhibicion de la expresion genica incluyen: inhibicion en la que se utiliza ARNi; inhibicion en la que se utiliza acido nucleico antisentido; e inhibicion por la expresion de un gen mutante dominante negativo. Entre estas, se prefiere la inhibicion utilizando ARNi.

A continuacion, se ha observado la respuesta de las neuronas sensoriales AWA y ASH al diacetilo utilizando imagenes de calcio. La neurona AWA de tipo silvestre respondio tanto a una baja concentracion como a una alta concentracion de diacetilo, pero la neurona AWA de un mutante odr-10 no respondio a una baja concentracion de diacetilo (Figura 28). La neurona AWA de un mutante sri-14 mostro una respuesta normal. Por otro lado, la neurona sensorial ASH respondio solo a una alta concentracion de diacetilo y la respuesta de la misma se redujo significativamente en un mutante sri-14. La respuesta fue normal en un mutante odr-10 (Figura 29). Por otra parte, cuando se expreso sri-14 ectopicamente en otra neurona sensorial AWB, que no respondio al diacetilo, AWB respondio fuertemente a una alta concentracion de diacetilo (Figura 32). Por lo tanto, se ha sugerido firmemente que SRI-14 funciona como un receptor de diacetilo in vivo. A partir de estos resultados, se ha descubierto que varios receptores estan acostumbrados a un unico olor, dependiendo de sus concentraciones, y que ODR-10 recibe una baja concentracion de diacetilo en la neurona AWA y se percibe como un olor favorable, mientras que SRI-14 recibe una alta concentracion de diacetilo en la neurona ASH y se percibe como un olor repulsivo (Taniguchi, G. et al.: Science Signaling 7, ra39 (2014)) (Figura 33).

Debido a que un nematodo es un organismo excelente en el sistema olfativo, que tiene casi la misma cantidad de receptores olfativos que un perro, es probable que el nematodo reconozca, con alta sensibilidad, el olor de una sustancia nociva y el olor de una sustancia util, como con los perros detectores de drogas. En dicho caso, a partir de los resultados del presente estudio, se puede identificar el receptor de tal olor. Si se entendiera la relacion de correspondencia entre el olor y el receptor, se predecirfa que se puede desarrollar un sensor de olor artificial basado en la union del olor y el receptor como un modelo. Un analisis del olfato utilizando nematodos es util y contribuira ampliamente a la sociedad en el futuro.

2. Metodo de deteccion

(1) Nematodo

El nematodo utilizado en el metodo de la presente invencion es un tipo de nematodo de vida libre en el suelo y se ha utilizado ampliamente como un organismo modelo para estudios biologicos. El nematodo utilizado en el metodo de la presente invencion es un gusano macho o hembra y se prefiere un nematodo hermafrodita porque puede proliferar como resultado de la auto-proliferacion. Ademas, el nematodo utilizado en la presente invencion puede criarse en una placa de Petri, dando Escherichia coli como alimento, y por lo tanto, la crfa del mismo es facil. Si un nematodo padre se transfiere a una placa de Petri, las larvas nacen y crecen hasta gusanos adultos cuatro dfas despues, y por lo tanto, el numero de nematodos aumentara de 50 a 100 veces. Durante tal crfa, la placa de Petri se puede colocar en una incubadora y se puede dejar, a continuacion, como esta. No se necesitan operaciones especiales. Si se usa un nematodo hermafrodita, las operaciones como el cruce tampoco son necesarias. Los aparatos necesarios para la crfa son una incubadora a 20 °C y un microscopio estereoscopico, y por lo tanto, el sistema se puede construir a bajo coste y en poco tiempo.

Un ejemplo de los nematodos usados en la presente invencion, cuando es un nematodo de tipo silvestre, incluye Caenorhabditis elegans. Preferentemente se utiliza un hermafrodita de la cepa Briostol N2 de C. elegans. De otro modo, tambien se pueden usar cepas geneticas mutantes que incluyen una mutacion de varios genes. Estos nematodos estan disponibles, por ejemplo, del Centro Genetico de Caenorhabditis (CGC).

En la presente invencion, ademas de los nematodos mencionados anteriormente (nematodos de tipo silvestre), tambien se pueden usar nematodos mutantes y nematodos transgenicos. Los ejemplos del nematodo transgenico incluyen: un nematodo, en el que se ha introducido un gen indicador en las neuronas olfativas AWC y AWA; un nematodo, en el que se ha inhibido la expresion o funcion de un gen asociado con la recepcion del olor del cancer (gen receptor); un nematodo, en el que se ha sobreexpresado o funcionalizado al alza un gen asociado con la recepcion del olor del cancer (gen receptor); y un nematodo, en el que se ha expresado en cada celula una protefna fluorescente para facilitar el analisis del comportamiento del mismo. Sin embargo, los ejemplos del nematodo transgenico no estan limitados a ellos, y se pueden usar todas las cepas transgenicas, en las que se ha introducido un gen extrano.

En algunas realizaciones de la presente invencion, se construye ADN, en el que un gen de interes se liga inmediatamente cadena abajo de un promotor predeterminado de un nematodo, y el ADN obtenido se microinyecta, a continuacion, en una cepa de nematodo de tipo silvestre o en una cepa de nematodo mutado geneticamente (por ejemplo, gonada). De este modo, se puede producir un nematodo transgenico capaz de pasar de manera estable el gen extrano. Un aumento en la concentracion de calcio indica activacion de las neuronas. Por lo tanto, por ejemplo, se utiliza un gen indicador capaz de medir una concentracion de calcio en la neurona, y el cancer puede detectarse utilizando un cambio en la concentracion de calcio como indicador.

Un ejemplo del promotor utilizado para la expresion en AWC incluye un promotor odr-1 (Yu, S., Avery, L., Baude, E. y Garbers, D. L. Guanylyl cyclase expression in specific sensory neurons: a new family of chemosensory receptors. Proc Natl Acad Sci ^{U s A} 94, 3384-3387 (1997).). El odr-1 induce la expresion en AWC y en AWB (que es otra neurona olfativa distinta de AWC).

Un ejemplo del promotor utilizado para la expresion en AWA incluye un promotorodr-10 (Sengupta, P., Chou, J. H. y Bargmann, C. I. odr-10 encodes a seven transmembrane domain olfactory receptor required for responses to the odorant diacetyl. Cell 84, 899-909 (1996).). Se sabe que odr-10 induce la expresion solo en AWA.

La informacion de la secuencia base con respecto a estos promotores se puede obtener, por ejemplo, de los numeros de acceso Z68118 y FO080931. Como alternativa, tambien es posible obtener tal promotor mediante la purificacion del ADN genomico de un nematodo y a continuacion, mediante la realizacion de la amplificacion por PCR utilizando el ADN genomico como plantilla.

Ejemplos del gen indicador de calcio incluyen: un gen Yellow Cameleon (YC) (Nagai, T., Yamada, S., Tominaga, T., Ichikawa, M. y Miyawaki, A. Expanded dynamic range of fluorescent indicators for Ca(2+) by circularly permuted yellow fluorescent proteins. Proc Natl Acad Sci USA 101, 10554-10559 (2004).); y un gen GCaMP (Nakai, J., Ohkura, M. y Imoto, K. A high signal-to-noise Ca2+ probe composed of a single green fluorescent protein. Nat. Biotechnol. 19, 137-141 (2001).). La informacion de la secuencia base con respecto a estos genes esta disponible, por ejemplo, de los numeros de acceso AB178712 y HM143847. Como alternativa, estos genes tambien se pueden obtener de Addgene.

El metodo de ligar un gen indicador inmediatamente cadena abajo de un promotor, el metodo de microinyeccion y similares son bien conocidos en el campo tecnico actual, y por ejemplo, puede hacerse referencia a "Molecular Cloning: A Laboratory Manual (4a Edicion)" (Cold Spring Harbor Laboratory Press (2012)),etc. Como alternativa, se puede inyectar una solucion de ADN en la gonada de un nematodo de acuerdo con un metodo conocido (Mello, C. C., Kramer, J. M., Stinchcomb, D.y Ambros, V. Efficient gene transfer in C. elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences. EMBO J 10, 3959-3970 (1991).).

Se utiliza nematodo mutante para referirse a, por ejemplo, un nematodo que comprende un polimorfismo en el genoma de un nematodo de tipo silvestre, un nematodo mutante que comprende una mutacion de un receptor olfativo para el olor de cada tipo de cancer, etc. (que se describira en los ejemplos mas adelante).

(2) sustancia relacionada con la biologfa derivada del sujeto o producto procesado de la misma

La muestra utilizada en la presente invencion es una sustancia relacionada con la biologfa derivada del sujeto (un sujeto sano, un paciente con cancer, un paciente sospechoso de tener cancer, un animal, etc.) o un producto procesado de la misma, en donde la sustancia relacionada con la biologfa o un producto procesado de la misma es una muestra biologica recolectada de un sujeto, o un producto procesado de la misma, en donde la sustancia relacionada con la biologfa es un fluido corporal (orina, sudor, saliva o lfquido de heces), celulas (celulas obtenidas de biopsia,etc.), tejidos tales como tejidos cancerosos (tejidos obtenidos de biopsia, secciones de tejido, etc.), sangre y espiracion. En la presente invencion, se pueden utilizar estas muestras biologicas directamente. Sin embargo, se usa preferentemente un producto procesado de tal sustancia relacionada con la biologfa. La expresion "producto procesado" se usa para referirse a una muestra obtenida mediante el procesamiento ffsico y/o qufmico de una sustancia relacionada con la biologfa.

La muestra de fluido corporal, como la orina, incluye un solido y un precipitado. En el caso de la orina, por ejemplo, se puede utilizar orina recogida directamente. Sin embargo, debido a que la muestra de orina debe administrarse a un nematodo a traves de un tubo estrecho, se somete preferentemente a un tratamiento de eliminacion por filtro (por ejemplo, tamano de poro: 0,22 pm, Millex GP, Merck Millipore). Una muestra de orina, que ha sido sometida a un tratamiento de eliminacion de solidos utilizando filtro de este tipo, se incluye en el "producto procesado" descrito anteriormente. Debe observarse que el presente inventor ha confirmado mediante un experimento preliminar que la reaccion de un nematodo (comportamiento de atraccion a la orina) no se modifica por dicho tratamiento de filtro (Figura 9).

Como se ha descrito anteriormente, cuando las celulas (p. ej., las celulas cancerosas obtenidas de la biopsia) se usan como una sustancia relacionada con la biologfa, se elimina un solido, tal como un producto desintegrado celular, de un cultivo obtenido despues del cultivo celular mediante centrifugacion, filtracion o similar, y se puede utilizar como un producto procesado, un sobrenadante del cultivo obtenido despues de la eliminacion del solido. Por otra parte, en la presente invencion, ademas de las muestras mencionadas anteriormente, tambien se puede usar una solucion conservante de celulas cancerosas o tejidos cancerosos (tejidos obtenidos de biopsias, secciones de tejidos, etc.). Los ejemplos de dicha solucion conservante incluyen una solucion salina fisiologica, un tampon, formalina y DMSO, pero los ejemplos no estan limitados a ellos. La solucion conservante incluye una solucion conservante para la crioconservacion, que se utiliza comunmente para la crioconservacion. Despues de la crioconservacion, dicha solucion conservante para la crioconservacion puede utilizarse descongelandola.

(3) Deteccion utilizando olfato de nematodo

En primer lugar, para obtener los nematodos necesarios para la deteccion, se les permite proliferar.

Varios nematodos (gusanos adultos) se colocan en una placa de Petri (que contiene un medio NGM en el que se ha dispersado Escherichia coli), y posteriormente, se crfan durante 3 a 6 dfas, preferentemente durante 4 dfas, y a una temperatura de 15 °C a 25 °C, preferentemente a 20 °C. De este modo, aproximadamente de 300 a 500 nematodos de la nueva generacion crecen hasta gusanos adultos.

Posteriormente, se prepara una placa de petri utilizada para una prueba real. Un formato como se muestra en la Figura 2 se produce en una placa de petri, y a continuacion se coloca azida sodica (NaN3) en (anade a) 4 puntos en la placa de petri. La azida sodica se utiliza para anestesiar e inmovilizar nematodos. La cantidad de azida sodica agregada es de 0,2 a 3 pl, y preferentemente de 0,5 pl, a una concentracion de 1 M.

La Escherichia coli dispersada en la placa de petri se elimina con un tampon de lavado y, posteriormente, se coloca en (anade a) la placa de petri una sustancia relacionada con la biologfa o un producto procesado de la misma, utilizada como muestra. Cuando se usa orina como una muestra, puede usarse una solucion madre de la muestra de orina. Sin embargo, la orina recogida puede diluirse entre 1,5 y 1000 veces, por ejemplo, con agua esterilizada, un tampon, etc. El aumento de dilucion es preferentemente 10 veces. La cantidad de la muestra de orina anadida a la placa de Petri es de 0,5 a 10 pl y preferentemente 1 pl.

Los nematodos se colocan en el centro de la placa de Petri asf preparada.

Los nematodos se crfan (se les permite nadar) durante un perfodo de tiempo predeterminado (aproximadamente 1 hora). Temperatura ambiente: se ajusta a 23 °C ± 1 °C.

Una vez transcurrido el perfodo de tiempo predeterminado, se cuenta el numero de nematodos en el lado y el numero de nematodos en el lado - y, a continuacion, se calcula el fndice de quimiotaxis (la siguiente formula). Cuando el numero de nematodos en el lado esta representado por N (+) y el numero de nematodos en el lado -esta representado por N (-), se realiza la siguiente formula:

fndice de quimiotaxis = N(+) - N(-)/numero total de nematodos.

Posteriormente, se detecta el cancer utilizando como indicador la respuesta positiva o la respuesta negativa.

La expresion "respuesta positiva" se usa para referirse a que los nematodos "quieren" o "estan interesados en" la muestra, mientras que la expresion "respuesta negativa" se usa para referirse a que los nematodos "no quieren" o "no estan interesados en” la muestra.

Cuando se utiliza la quimiotaxis como indicador, el valor positivo (+) indica una respuesta positiva (quimiotaxis positiva, quieren),y el valor negativo (-) indica una respuesta negativa (quimiotaxis negativa, no quieren).

El fndice de quimiotaxis tiene los valores de 1 a -1. Cuando los nematodos son atrafdos hacia la muestra, el fndice de quimiotaxis tiene un valor positivo, y cuando los nematodos evitan la muestra, el fndice de quimiotaxis tiene un valor negativo.

Se puede realizar un solo analisis en una sola muestra. Sin embargo, se puede realizar una pluralidad de analisis en una sola muestra, y se calcula un valor medio de los valores del fndice de quimiotaxis, de modo que se puede mejorar la precision del valor obtenido. Cuando el valor obtenido por el analisis (que es un valor medio cuando se ha realizado una pluralidad de analisis) es un valor positivo, puede determinarse preliminar o definitivamente que el sujeto tiene cancer o tiene riesgo de cancer (posibilidad). La determinacion de que el sujeto "tiene cancer" se puede usar, por ejemplo, como una documentacion de apoyo para el diagnostico definitivo o diagnostico preliminar de cancer, y la determinacion de que el sujeto "tiene riesgo de cancer" se puede usar, por ejemplo, como una documentacion de apoyo para sospechar de cancer en un examen medico, un primer examen de cancer, etc.

La reaccion de un nematodo a un olor tambien puede detectarse utilizando como un indicador un comportamiento distinto de la quimiotaxis, o una reaccion biologica. Los ejemplos del comportamiento distinto de la quimiotaxis o la reaccion biologica incluyen: un comportamiento de veleta (Lino y Yoshida, The Journal of Neuroscience, 2009), por el cual un nematodo se dirige a una direccion en la que la concentracion de un olor es alta; un comportamiento de giro (Pierce-Shimomura et al., The Journal of Neuroscience, 1999), que tiene lugar cuando la concentracion de un olor se vuelve baja; el grado de flexion del cuerpo del nematodo (Luo et al., Journal of Neurophysiology, 2008); y respuesta neural.

Con respecto al comportamiento de veleta, la "respuesta positiva" significa que un nematodo gira en la direccion de una muestra. Con respecto al comportamiento de giro, cuando un nematodo gira en el momento en que una alta concentracion de muestra cambia a una baja concentracion de muestra, se puede decir que el nematodo tiene una "respuesta negativa". En el caso del grado de flexion del cuerpo, cuando la distancia entre la parte de la cabeza de un nematodo y la parte de su cola es larga, se puede decir que el nematodo tiene una "respuesta positiva".

(4) Deteccion utilizando nematodos modificados geneticamente

(i) La deteccion utilizando nematodos modificados geneticamente tambien se puede llevar a cabo como se describe anteriormente. En el presente documento, se utiliza un nematodo transgenico, en el que se ha expresado un gen indicador capaz de medir una concentracion de calcio en la neurona en las neuronas olfativas AWC y AWA de un nematodo, y se detecta cancer utilizando, como un indicador,un cambio en la concentracion de calcio (respuesta neural). Debido a que este metodo es capaz de realizar analisis utilizando varios nematodos, es ventajoso porque se puede ahorrar el costo para el cultivo de nematodos y porque el analisis se puede realizar en poco tiempo.

En la Figura 3 se muestra un principio de medicion cuando se usa un gen Yellow Cameleon como gen indicador. La protefna indicadora utilizada en la medicion es una protefna de fusion formada al conectar la protefna de union a calcio CaM con el dominio diana M13, al que se une el CaM, y al conectar, a continuacion, CFP e YFP con ambos extremos de los mismos (que esta codificado por el gen y por lo tanto puede expresarse geneticamente in vivo). Cuando la concentracion de calcio es baja, CaM se separa de M13 y CFP tambien se coloca aparte de YFP (vista izquierda). Por lo tanto, si se proporciona luz para la excitacion de la CFP, la luz azul se emite desde la CFP. Por otro lado, cuando la concentracion de calcio aumenta, de modo que CaM se une a M13, CFP se acerca a YFP y se produce una transferencia de energfa de resonancia de fluorescencia (o transferencia de energfa de resonancia de Forster) (FRET). Como resultado, incluso si se proporciona luz para la excitacion de CFP, la luz amarilla se emite desde YFP (vista derecha). Como tal, la intensidad de la luz azul y la luz amarilla se miden simultaneamente, y a continuacion, se calcula la relacion entre ellas, de modo que se pueda encontrar un cambio en la concentracion de calcio.

Un principio de medicion cuando se usa un gen GCaMP como gen indicador se muestra en la figura 4.

La protefna indicadora es una protefna de fusion que tiene una estructura en la que CaM y M13 pueden unirse a GFP. Esta protefna tambien esta codificada por el gen y, por lo tanto, puede expresarse geneticamente in vivo. Cuando aumenta la concentracion de calcio y M13 se une a CaM, aumenta la intensidad de fluorescencia de GFP. Por lo tanto, al medir la fluorescencia de GFP, se puede encontrar un cambio en la concentracion de calcio. En la presente invencion, cuando la respuesta de la neurona olfativa de un nematodo es alta al olor de la sustancia relacionada con la biologfa derivada del sujeto o un producto procesado de la misma, concretamente, cuando es alto un cambio en la concentracion de calcio, se determina que el sujeto tiene cancer o tiene riesgo de padecer cancer. En el presente documento, el termino "cuando... es alto" en las frases "la respuesta de la neurona olfativa... es alta" y "un cambio en la concentracion de calcio es alto" significa que cuando se administra como un estfmulo la sustancia relacionada con la biologfa derivada del sujeto o un producto procesado de la misma, un cambio en la relacion de intensidad de fluorescencia (relacion = YFP/CFP) o un cambio en la intensidad de fluorescencia de GFP es significativamente grande, en comparacion con un control (una sustancia relacionada con la biologfa derivada del sujeto sano relacionado o un producto procesado de la misma).

(ii) Un nematodo individual, en el que se ha expresado un indicador de calcio en la neurona olfativa, se coloca en un chip hecho de resina (por ejemplo, hecho de resina de dimetilpolisiloxano (PDMS)) (Figura 5). En la figura 5, se forman una parte para sujetar el nematodo y cuatro canales de flujo en el chip de resina PDMS.

Al cambiar los canales de flujo 1 a 4 utilizando un aparato de reflujo (fabricado por WPI, sistema de perfusion multicanal MPS-2, etc.) (Figura 6), se realiza el encendido o apagado de la estimulacion urinaria (Chalasani, S. H. et al. Dissecting a circuit for olfactory behaviour in Caenorhabditis elegans. Nature 450, 63-70 (2007); Chronis, N., Zimmer, M. y Bargmann, C. I. Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans. Nat Methods 4, 727-731 (2007).).

La Figura 6 es una vista que muestra el cambio de canales de flujo en un chip. Se coloco un tampon en los canales de flujo 1, 2 y 4, y la orina se coloco en el canal de flujo 3. Los canales de flujo 2 y 3 se mantienen constantemente en la posicion "encendido". Cuando el canal de flujo 1 esta "encendido" y el canal de flujo 4 esta "apagado", el nematodo no recibe estimulacion de la orina. Cuando el canal de flujo 1 se convierte en "apagado" y el canal de flujo 4 se convierte en "encendido", el nematodo recibe la estimulacion de la orina.

Debido a que la neurona olfativa AWC es reactiva cuando "hay un olor" ^ "no hay olor" (reaccion de apagado de olor), la reaccion del nematodo se observa cuando cambia un estado con orina a un estado sin orina. Por el contrario, en el caso de la neurona AWA, debido a que la neurona AWA es reactiva a "no hay olor" ^ "hay un olor" (reaccion de encendido de olor), la reaccion del nematodo se observa cuando un estado sin orina cambia a un estado con orina.

De esa manera, la neurona olfativa de un nematodo es debilmente reactiva incluso con la orina de un sujeto sano. Por lo tanto, se prepara la orina de un control (la orina de un sujeto sano), y la orina de control y la orina como una muestra se administran sucesivamente a un solo nematodo, de modo que el cancer puede detectarse preferentemente en funcion de una diferencia en la intensidad de reaccion.

(iii) Utilizando un microscopio de fluorescencia (Leica DMI3000B, etc.), se obtiene una imagen de fluorescencia con lente objetiva (40 veces). Dicha imagen se obtiene, por ejemplo, a cada 200 ms, pero se puede cambiar, segun sea apropiado, dependiendo del tipo de microscopio o lente. En el caso de Yellow Cameleon, se deben obtener imagenes en dos longitudes de onda, por separado. Por lo tanto, se usa preferentemente una camara capaz de obtener simultaneamente tales imagenes en dos longitudes de onda, por ejemplo, la camara digital ORCA-D2 (Hamamatsu Photonics) (sin embargo, aparte de esta camara, las camaras que tienen funciones similares estan disponibles comercialmente). En el caso de GCaMP, es suficiente obtener una imagen en una longitud de onda. Por lo tanto, se puede usar una camara microscopica comun capaz de obtener una imagen de GFP.

(iv) Con respecto a la imagen obtenida, el cuerpo celular de una neurona olfativa (un sitio en el que un cambio es mas visible) se incluye como ROI (region de interes), y para la intensidad de fluorescencia de cada pixel, se llevan a cabo todos los calculos y la produccion de video utilizando software (por ejemplo, el software Metamorph, fabricado por Molecular Devices). Tambien estan disponibles otros productos de software vendidos por varias companfas. En el caso de Yellow Cameleon, la proporcion YFP/CFP se calcula para cada pixel y a continuacion, se calcula un valor medio en la ROI. Ademas, en el caso de GCaMP, se calcula un valor medio de intensidad de fluorescencia en la ROI.

3. Identificacion del receptor

La presente invencion proporciona un metodo para identificar un receptor olfativo en un nematodo, que se caracteriza por identificar el receptor olfativo utilizando el nematodo.

El metodo de identificacion de la presente invencion comprende una etapa de inhibir la expresion o funcion de un gen que codifica un receptor, y probar la reaccion del nematodo inhibido a un olor. El olor es el olor de los tipos de cancer y/o el tipo de receptor que se identifica es diferente dependiendo de los tipos de cancer o la concentracion de un odorante.

Como se ha descrito anteriormente, los ejemplos de la inhibicion de la expresion o funcion de un gen del receptor olfativo incluyen la inhibicion en la que se utiliza ARNi, la inhibicion en la que se utiliza el acido nucleico antisentido y la inhibicion por la expresion de un gen mutante negativo dominante. Entre estas, se prefiere la inhibicion utilizando ARNi.

Usando nematodos, en los cuales se ha inhibido la expresion del gen del receptor, se prueba la reaccion a los olores de muestras derivadas de varios tipos de cancer. Cuando los nematodos no son reactivos al olor de un cierto tipo de cancer, se puede determinar que el receptor es un receptor del olor del tipo de cancer.

El tipo de receptor a identificar es diferente dependiendo de la concentracion de un odorante. En consecuencia, se analiza a que concentracion de muestra los nematodos son reactivos, de modo que se pueda identificar un receptor con una alta concentracion de muestra y un receptor con una baja concentracion de muestra.

El sistema olfativo detecta varios odorantes y responde a ellos. El receptor olfativo es un receptor acoplado a protefna G (protefna de union a nucleotidos de guanina heterotrimerica) en la mayorfa de los organismos, y se une directamente a un odorante volatil o soluble. Cuando se compara con el genoma de un mamffero, el genoma del nematodo Caenorhabditis elegans (C. elegans) comprende un numero mayor de genes del receptor olfativo supuesto y esto sugiere que la complejidad combinatoria puede estar presente con respecto a la relacion entre un receptor y un olor en nematodos. Con el fin de identificar el receptor olfativo de un nematodo necesario para la respuesta a un odorante especffico, el presente inventor ha llevado a cabo el analisis del ARN de interferencia (ARNi). Como resultado de este analisis, el presente inventor ha identificado 194 genes de receptores olfativos candidatos, que estan asociados con 11 odorantes. Por otra parte, el presente inventor tambien ha identificado SRI-14 como un gen candidato asociado con la deteccion de una alta concentracion de diacetilo. Como resultado de los experimentos de rescate y de ARNi especfficos de neuronas, el inventor ha demostrado que SRI-14 funciona en neuronas quimiosensoriales especfficas, neuronas ASH (la neurona sensorial de un nematodo que recibe olores repulsivos o sustancias qufmicas) y proporciona una respuesta de evitacion. Segun las imagenes de calcio, se ha demostrado que las neuronas ASH responden solo a una alta concentracion de diacetilo, mientras que otro tipo de neuronas quimiosensoriales, las neuronas AWA (la neurona olfativa de un nematodo que recibe principalmente olores favoritos) responde tanto a una concentracion baja como a una concentracion alta de diacetilo. La perdida de la funcion de SRI-14 ha impedido que ASH responda a una alta concentracion de diacetilo, mientras que la perdida de la funcion de ODR-10 ha reducido la respuesta de AWA a una menor concentracion de diacetilo. Las neuronas quimiosensoriales, en las que SPI-14 se expresa ectopicamente, han respondido a una alta concentracion de diacetilo. En consecuencia, el nematodo tiene un mecanismo de deteccion de olor dependiente de la concentracion, que se clasifica basandose en un nivel de receptor olfativo y en un nivel de neurona sensorial.

En general, los animales detectan varios odorantes a traves de su sistema olfativo y responden a ellos. La mayorfa de los odorantes son compuestos volatiles y se detectan por las neuronas receptoras del olfato(ORN). En la ORN, un agente odorante se une directamente a un receptor olfativo y, posteriormente, transmite informacion a traves de una via de senalizacion intracelular (1). En mamfferos, el receptor olfativo es un miembro de la familia del receptor (GPCR) acoplado a protefna G 7-transmembrana (protefna de union a nucleotido de guanina heterotrimerica ) (2), y solo un tipo de receptor olfativo esta presente en la ORN individual (3). Sin embargo, aunque se han realizado varios tipos de estudios con el fin de identificar la relacion de correspondencia entre un olor y un receptor, la relacion entre los olores individuales y los receptores ha sido casi desconocida (4, 5). El gusto (sentido gustativo (gestacion)) tiene un proceso similar, pero el sabor esta asociado con la deteccion de sustancias qufmicas solubles.

El nematodo Caenorhabditis elegans es un organismo modelo utilizado en el analisis de procesos quimiosensoriales asociados con el olfato y el gusto (olfato, deteccion de senales volatiles; y sabor, deteccion de senales solubles), y C. elegans detecta una gran cantidad de senales qufmicas a traves de aproximadamente 13 neuronas sensoriales de la mismas, que se sabe que responden a sustancias qufmicas, y, por lo tanto, responde a ellas (6, 7). Por conveniencia, el presente inventor se refiere a este proceso quimiosensorial como sentido olfativo, y a sustancias qufmicas como sustancias olorosas. Se predice que el genoma del nematodo (C. elegans) comprende mas de 1200 supuestos genes de receptores olfativos que codifican GPCR y el GPCR se expresa en 11 neuronas quimiosensoriales (8). Estos hallazgos han indicado que es probable que multiples tipos de receptores olfativos (9) se expresen en ORN individuales, que son diferentes del olfato (3), pero son similares a la percepcion del gusto (10) en mamfferos. Sin embargo, la relacion entre un receptor y un odorante u otra sustancia qufmica se ha identificado solo para un receptor especffico de diacetilo, ODR-10 (11) y un receptor de feromonas (que tambien es GPCR (12­ 14)). Se desconoce como se detecta un odorante en una combinacion de este tipo de un receptor en la ORN del nematodo (C. elegans).

Al igual que con muchos tipos de animales, el nematodo (C. elegans) tambien muestra preferencia por odorantes especfficos. Cuando dicho odorante especffico se detecta por neuronas olfativas AWA o AWC, el nematodo muestra un comportamiento de atraccion hacia el odorante. Cuando el odorante se detecta por neuronas sensoriales AWB, ASH o ADL, el nematodo exhibe un comportamiento de evitacion (6, 15, 16). Sin embargo, algunos tipos de neuronas estan asociadas tanto con el comportamiento de evitacion como con el de atraccion y un ejemplo de tales neuronas son las neuronas AWB (16). Hasta el momento, los presentes inventores demostraron que la respuesta de atraccion o la respuesta de evitacion del nematodo (C. elegans) a un solo odorante depende de la concentracion del odorante (17). Esto sugiere que es probable que diferentes receptores olfativos funcionen incluso con un solo odorante, dependiendo de la concentracion del odorante.

En el presente documento, el presente inventor ha demostrado que diferentes concentraciones de sustancias de diacetilo estan mediadas por diferentes receptores olfativos y esa preferencia se modifica de este modo. Como resultado del analisis de pares de receptor-olor, el presente inventor ha identificado 194 genes de receptores olfativos candidatos con respecto a 11 odorantes. Entre estos genes candidatos, el presente inventor ha identificado SRI-14 como un gen que responde especfficamente a una alta concentracion de diacetilo. Los resultados obtenidos por el presente inventor han demostrado que, con respecto a la recepcion de diacetilo, ODR-10 en las neuronas AWA media una respuesta de atraccion a una concentracion baja y SRI-14 en las neuronas ASH media una respuesta de evitacion a una concentracion alta.

4. Especificacion de tipos de cancer

En la presente invencion, es posible especificar tipos de cancer de acuerdo con una prueba de quimiotaxis de nematodos. En consecuencia, la presente invencion proporciona un metodo para identificar especies de cancer, que se caracteriza por identificar especies de cancer, usando la reaccion de un nematodo al olor de una sustancia relacionada con la biologfa derivada del sujeto o un producto procesado de la misma como un indicador, en donde el metodo comprende las etapas definidas en las reivindicaciones.

Como resultado de estudios con perros detectores de cancer, se predijo que cada tipo de cancer tiene un olor diferente. Por lo tanto, se identifica el receptor olfativo de un nematodo al olor de cada tipo de cancer, y a continuacion, se modifica el receptor para producir un nematodo modificado. Los ejemplos de dichos nematodos modificados incluyen una cepa que comprende una mutacion o eliminacion de un gen del receptor, una cepa en la que se inhibe la expresion o funcion de un gen receptor, una cepa en la que se inhibe la expresion o funcion de un gen del receptor, y una cepa en la que un gen del receptor es altamente expresado o altamente funcionalizado.

Un ejemplo de un metodo para producir un mutante por delecion incluye un metodo CRISPR/Cas9 (Friedland et al, Heritable genome editing in C. elegans via a CRISPR-Cas9 system, Nature Methods, 2013). Por otra parte, tambien se produce una cepa en la que se inhibe la expresion o funcion de un gen del receptor o un nematodo modificado en el que un gen del receptor es altamente expresado o altamente funcionalizado. Ejemplos de inhibicion de la expresion o funcion incluyen: inhibicion en la que se utiliza ARNi; inhibicion en la que se utiliza acido nucleico antisentido; e inhibicion por la expresion de un gen mutante dominante negativo. Los ejemplos de un metodo para un gen receptor de alta expresion o alto funcionamiento alto incluyen: un metodo para conectar el promotor de un gen del receptor con un tandem; un metodo para introducir un potenciador; un metodo que involucra la introduccion de multiples copias de un gen del receptor; un metodo para modificar el sitio de union de un receptor con un olor o una protefna G; y un metodo para modificar un sitio para controlar la activacion o localizacion de un receptor o afinidad por un olor.

El metodo de identificacion de la presente invencion comprende, por ejemplo, las siguientes etapas.

(a) Primero, como ETAPA 1, se detecta cancer mediante el metodo de deteccion descrito anteriormente de la presente invencion. Por ejemplo, utilizando la cepa N2, se prueba la presencia o ausencia de especies de cancer.

(b) A continuacion, como ETAPA 2, se especifica el tipo de cancer utilizando un mutante del receptor de cada tipo de cancer, o una cepa en la que se ha cambiado la expresion o funcion de un gen del receptor.

Usando un nematodo mutante que comprende una mutacion o delecion del receptor olfativo identificado anteriormente, o una cepa en la que se ha cambiado la expresion o funcion de un gen del receptor, se prueba la reaccion de tal nematodo al olor de una muestra en la que se ha detectado cancer en el paso (a) descrito anteriormente.

(c) Cuando la reaccion al olor es diferente entre el nematodo modificado descrito anteriormente y el nematodo utilizado en la etapa (a) descrita anteriormente, se determina que el tipo de cancer correspondiente al receptor identificado es el tipo de cancer diana de la identificacion.

Por ejemplo, entre los nematodos mutantes descritos anteriormente y los nematodos en los que se ha inhibido la expresion o funcion de un gen del receptor, se determina que el tipo de cancer correspondiente al receptor identificado en nematodos, que no han reaccionado al olor, es el tipo de cancer diana de la identificacion. Como alternativa, entre los nematodos en los que un gen del receptor ha sido altamente expresado o tiene una funcion alta, se determina que el tipo de cancer correspondiente al receptor identificado en nematodos, cuya reaccion al olor se ha acelerado, es el tipo de cancer diana de la identificacion.

Por ejemplo, cuando un receptor mutante con respecto al olor del cancer de intestino grueso no muestra un comportamiento de atraccion, se puede determinar (diagnosticar) que se tiene cancer de intestino grueso (Figura 37).

5. Kit y Sistema

La presente invencion proporciona el uso de un kit para detectar cancer. El kit comprende nematodos. El presente kit tambien puede comprender uno o mas componentes necesarios para llevar a cabo el metodo de deteccion de la presente invencion. Los ejemplos de dicho componente incluyen un tampon, una solucion de cultivo, azida de sodio, Escherichia coli, una placa de Petri y agar. Ademas, el kit tambien puede ser un kit parcial que comprende solo algunos de los componentes necesarios, y en tal caso, el usuario puede preparar otros componentes. Por otra parte, el kit puede incluir tambien un manual de instrucciones, que explica un metodo de deteccion o un metodo de identificacion.

Adicionalmente, la presente invencion proporciona el uso de un sistema de deteccion de cancer, en el que el sistema comprende nematodos, una parte de almacenamiento para almacenar una sustancia relacionada con la biologfa o un producto procesado de la misma y los nematodos, y una parte de deteccion para detectar la reaccion de los nematodos en la parte de almacenamiento.

La Figura 16A es un diagrama de bloques que muestra el sistema. En la Figura 16A, el sistema de la presente invencion tiene una parte de almacenamiento 30 para almacenar una sustancia relacionada con la biologfa o un producto procesado de la misma y los nematodos mencionados anteriormente, una parte de deteccion 10 para detectar la reaccion de los nematodos en la parte de almacenamiento 30 a un olor, y una parte de procesamiento 20 para procesar la informacion detectada. Por otra parte, el sistema puede comprender ademas una parte de preservacion 40 para conservar los datos procesados en la parte de procesamiento 20. La parte de preservacion 40 comprende programa y base de datos, que son para su uso en deteccion de cancer.

Ejemplos de la parte de almacenamiento 30 incluyen una placa de Petri, una placa de cultivo y un chip que tiene canales de micro flujo. Sin embargo, el tipo de la parte de almacenamiento no esta limitado, siempre que sea capaz de almacenar nematodos y una muestra.

El sistema comprende al menos una parte de deteccion 10 capaz de tomar la imagen en movimiento de al menos un nematodo en tiempo real. La parte de deteccion 10 es un dispositivo para obtener datos como la imagen de nematodos, el numero de nematodos y las pistas de movimientos. La parte de deteccion 10 comprende un microscopio o una camara, por ejemplo, un microscopio de fluorescencia, un microscopio digital, una camara digital, etc. El microscopio y la camara pueden comprender un sistema de seguimiento automatico (siguiente) capaz de rastrear el movimiento de los nematodos, y este sistema rastrea un solo nematodo, o rastrea simultaneamente una pluralidad de nematodos. A continuacion, a partir de las pistas obtenidas, se mide la distancia de movimiento de los nematodos. Como alternativa, se fotograffan los nematodos que se reunen en un area predeterminada y, a continuacion, se cuenta el numero de nematodos. Por otra parte, el microscopio y la camara tambien pueden comprender un sensor capaz de detectar la intensidad de la fluorescencia.

El sistema puede medir el movimiento de los nematodos en funcion de una imagen en tiempo real, y tambien puede medir el movimiento de los mismos en funcion de una imagen estatica (fotograffa). Al tomar la imagen de los nematodos en tiempo real, es posible buscar dinamicamente la posicion de los nematodos.

La Figura 16B es un diagrama de configuracion que muestra la parte de procesamiento 20 del sistema. La parte de procesamiento 20 esta compuesta por un medio de calculo 110 y una base de datos 120. El medio de calculo 110 comprende (i) un medio de determinacion de condicion de prueba 111, (ii) un medio de prueba de reaccion de nematodo 112, (iii) un medio de determinacion de cancer 113, y (iv) un medio de visualizacion de resultado de prueba 114.

(i) Medio de determinacion de condicion de prueba 111

El medio de determinacion de la condicion de prueba 111 es un medio para introducir las condiciones necesarias para el calculo desde un raton o un teclado de acuerdo con la IGU (interfaz grafica de usuario), y la informacion introducida se puede confirmar con un grafico.

Por este medio de determinacion de la condicion de prueba, el sistema de la presente invencion se ha permitido previamente almacenar condiciones predeterminadas, que dependen del proposito de la prueba. Los ejemplos de tales condiciones predeterminadas incluyen el numero de nematodos, las caracterfsticas de los nematodos, la aplicacion o no aplicacion del fndice de quimiotaxis y el tiempo de medicion.

Las caracterfsticas de los nematodos incluyen: mutantes por delecion; cepas en las que se inhibe una expresion genica o similar; y la introduccion de un gen que codifica una protefna fluorescente (por ejemplo, un gen GFP, un gen RFP, etc.) para la medicion. Sin embargo, las condiciones no se limitan a ellas, y se pueden determinar, segun sea apropiado, segun el proposito de la prueba.

(ii) Medio de prueba de reaccion de nematodo 112

El medio de prueba de reaccion de nematodos 112 es un medio para seleccionar una formula de calculo para detectar o identificar cancer (por ejemplo, fndice de quimiotaxis) del medio de determinacion de condicion de prueba 111 o la base de datos 120, y calcular la reaccion de los nematodos de acuerdo con cada formula de calculo. De esta manera, se llevan a cabo la medicion del numero de nematodos en un area predeterminada, la medicion de la distancia total en la que se ha movido un nematodo individual, la deteccion de la intensidad de fluorescencia emitida por un solo nematodo, etc., y se registra el comportamiento de un(os) nematodo(s) que reacciona(n) a una muestra de prueba. Por ejemplo, centrandose en un solo nematodo, se mide la distancia obtenida cuando el nematodo ha sido atrafdo hacia una muestra y se ha movido hacia la misma y, a continuacion, se suman las distancias de movimiento de los nematodos individuales para obtener una suma. Como alternativa, cuando se han introducido genes de protefnas fluorescentes en los nematodos, se mide la intensidad de fluorescencia de los nematodos que han reaccionado a una muestra. En este caso tambien, se puede medir la intensidad de fluorescencia de un solo nematodo, y a continuacion, se puede obtener, de este modo, la suma de nematodos. Tambien puede ser posible medir la intensidad de fluorescencia emitida por todos los nematodos, que se reunen en un area determinada, en una unidad de area.

(iii) Medio de determinacion de cancer 113

El medio de determinacion de cancer 113 es un medio para detectar la presencia o ausencia de cancer basandose en la reaccion de los nematodos a un olor, o para identificar el tipo de cancer.

Cuando se adopta el numero de nematodos como condicion de prueba, se obtiene una diferencia entre la relacion de la cantidad de nematodos que se transfirieron a un area diana de la prueba y la cantidad de nematodos que se transfirieron a un area de control. Cuando se adopta la distancia de movimiento como condicion de prueba, se puede obtener el porcentaje por el cual la distancia de movimiento del nematodo en cuestion aumenta en comparacion con la distancia de movimiento de un nematodo control, en el cual el nematodo en cuestion reacciona a un olor, es decir, la diferencia o la relacion entre las distancias de movimiento. Si se ha determinado previamente el valor constante tal como una diferencia o proporcion como un valor lfmite, este valor lfmite puede usarse como un criterio para la determinacion del cancer. Por otra parte, cuando se adopta la intensidad de fluorescencia como condicion de prueba, se puede determinar el porcentaje en el cual la intensidad de fluorescencia del nematodo en cuestion aumenta en comparacion con la intensidad de fluorescencia de un nematodo control, en el cual el nematodo en cuestion reacciona a un olor, etc. como un valor lfmite, como en el caso de la distancia de movimiento descrita anteriormente.

Se realiza una comparacion entre los datos medidos, el valor lfmite y la informacion de la muestra (informacion sobre los tipos de cancer, etc.), de modo que se determina si la muestra tiene o no un cierto cancer.

(iv) Medio de extraccion de resultados de determinacion 114

El medio de extraccion de resultados de determinacion 114 es un medio para extraer informacion relevante, en funcion de los tipos de cancer detectados o identificados o la presencia o ausencia de cancer, y muestra los tipos de cancer y la probabilidad (riesgo). Los resultados pueden mostrarse en un grafico o en una tabla. Tambien se puede mostrar una animacion del comportamiento de los nematodos, que se ha calculado en el anterior (ii).

(v) Medio de almacenamiento de datos

Las condiciones de prueba introducidas y los resultados de la prueba estan correlacionados entre sf, y se conservan como medios de almacenamiento de datos en la base de datos 120.

Las condiciones de prueba y los resultados de calculo asf preservados pueden leerse nuevamente en la base de datos 120, o en los medios de determinacion de condiciones de prueba 111 y en los medios de visualizacion de resultados de determinacion 114.

En lo sucesivo en el presente documento, la presente invencion se describira mas especfficamente en los siguientes ejemplos. Sin embargo, la presente invencion no esta limitada a estos ejemplos.

[Ejemplo 1]

Deteccion del cancer

(i) Crfa de nematodos

Se colocaron cinco o seis nematodos adultos de tipo silvestre N2 en una placa petri de 6 cm (que contenfa un medio NGM, en el que se habfa dispersado Escherichia coli), y a continuacion, se cultivaron a 20 °C durante 4 dfas. Aproximadamente de 300 a 500 nematodos de la nueva generacion se les permitio crecer hasta lombrices adultas. (ii) Analisis de la quimiotaxis

El formato mostrado en la Figura 2 se produjo en una placa de Petri de 9 cm, y a continuacion, se colocaron 0,5 pl de azida de sodio (NaN3) en cada uno de los cuatro puntos de la placa de Petri.

Posteriormente, se aplico 1 ml de tampon de lavado sobre una placa de crfa de nematodos y se recuperaron en un tubo los nematodos flotantes, junto con el tampon. Cuando los nematodos asf recuperados se dejaron durante un tiempo, se fueron al fondo. Por lo tanto, se descarto el sobrenadante despues de que los nematodos hubieran bajado al fondo. Posteriormente, se coloco 1 ml de tampon de lavado en el tubo y se descarto el sobrenadante despues de que los nematodos hubieran bajado al fondo. Esta operacion de lavado se repitio tres veces para eliminar Escherichia coli.

Se coloco 1 pl de cada muestra de orina, que se habfa diluido 10 veces con agua esterilizada, en la marca "+" en la placa de Petri de 9 cm.

Posteriormente, se colocaron aproximadamente 100 nematodos en el centro de la placa de Petri y los nematodos se criaron (se les permitio nadar) durante 1 hora. La temperatura ambiente se ajusto a 23 ° C ± 1 ° C.

Una hora mas tarde, se conto el numero de nematodos en el lado y el numero de nematodos en el lado - y, a continuacion, se calculo el fndice de quimiotaxis.

Para una muestra, se realizaron los analisis cinco veces. A continuacion, se calculo un valor medio de las 5 veces de los indices de quimiotaxis.

(iii) Resultados

En la Figura 1 se muestran los resultados. Tal como se muestra en la Figura 1, se mostro un fndice de quimiotaxis negativo(-) ( reaccion de evitacion) en todas las muestras de orina derivadas de sujetos sanos que se usaron como controles (c1 a c10), mientras que se mostro un fndice de quimiotaxis positivo (+) (reaccion de atraccion) en todas muestras de orina derivadas de los pacientes con cancer (p1 a p20). Por lo tanto, el cancer se pudo detectar con una precision del 100%.

Debe entenderse que, en la Figura 1, la barra de error indica EEM.

[Ejemplo 2]

Imagenes de calcio

En un experimento de imagen que utiliza canales de micro flujo, debido a que una muestra de orina debfa pasar a traves de un tubo delgado, los precipitados y los solidos contenidos en la orina se eliminaron mediante centrifugacion y filtracion (tamano de poro: 0,22 pm, Millex GP, Merck Millipore). Para monitorizar las neuronas AWC y AWA, mediante el uso de los promotores odr-1 y odr-10, respectivamente, se permitio que un gen Yellow Cameleon (YC3.60) se expresara en las neuronas. La toma de imagenes de calcio se llevo a cabo de acuerdo con un metodo conocido (Uozumi, T. et al. Temporally-regulated quick activation and inactivation of Ras is important for olfactory behaviour. Sci Rep 2, 500 (2012); Shinkai, Y. et al. Behavioral choice between conflicting alternatives is regulated by a receptor guanylyl cyclase, GCY-28, and a receptor tyrosine kinase, SCD-2, in AIA interneurons of Caenorhabditis elegans. J Neurosci 31,3007-3015 (2011)).

Se inmovilizo un nematodo en un microcanal, de modo que la porcion de la cabeza del nematodo se pudiera sacar del microcanal (Figura 5). Usando un solo nematodo, se probo la reaccion del nematodo individual a la orina control y a la orina derivada de pacientes con cancer.

La imagen de fluorescencia de YC3.60 se obtuvo utilizando un microscopio Leica DMI3000B (lente objetivo de 40 veces) y una camara digital ORCA-D2 (Hamamatsu). Todas las imagenes se obtuvieron a un tiempo de exposicion de 200 ms. Las intensidades de fluorescencia de CFP e YFP se obtuvieron de la neurona AWC o AWA. La relacion de la intensidad de fluorescencia de YFP y la intensidad de fluorescencia de CFP se analizo utilizando el software Metamorph (Molecular devices). Esta relacion de intensidad de fluorescencia se calculo como intensidad de YFP/intensidad de CFP (= R), y se establecio un promedio de las proporciones de ventanas de 10 s (-10-0 s) en R0. Los resultados obtenidos al examinar la reaccion de las neuronas olfatorias AWC de los nematodos a la orina derivada de pacientes con cancer se muestran en las Figuras 7 y 8.

En la figura 7, dos paneles de la izquierda muestran los resultados de una prueba realizada con orina control y dos paneles de la derecha muestran los resultados de una prueba realizada con orina derivada de un paciente con cancer gastrico. La Figura 7 es una vista que muestra un cambio en la concentracion de calcio de la neurona olfativa AWC (un cambio en la relacion YFP/CFP de Yellow Cameleon) a la estimulacion de orina (con orina ^ sin orina). En comparacion con la orina de un sujeto sano (control), se encontro una reaccion significativamente fuerte a la orina de un paciente con cancer. La Figura 8 muestra un cambio en la cantidad de la relacion de intensidad de fluorescencia media (relacion YFP/CFP). El sfmbolo *** indica que es significativo en p <0,001.

En el presente ejemplo, los precipitados y los solidos contenidos en la orina se eliminaron mediante centrifugacion y filtracion. Estos tratamientos no influyeron en la quimiotaxis de los nematodos (Figura 9).

Incluso en el caso de la neurona olfativa AWA, la respuesta se observo como resultado de la adicion de orina (Figuras 10 y 11).

Estos resultados demuestran que la neurona olfativa de un nematodo desempena un papel importante en la distincion entre la orina control y la orina derivada de un paciente con cancer. Las figuras 7 a 11 muestran que el cancer puede detectarse utilizando la neurona olfativa de un nematodo. Debe entenderse que, en las Figuras 8, 9 y 11, la barra de error indica EEM.

[Ejemplo 3]

En el presente ejemplo, las lfneas celulares de cancer establecidas y los medios de cultivo o las soluciones de preservacion se utilizaron como modelos de sustancias relacionadas con la biologfa derivadas del sujeto, y se llevo a cabo un experimento de deteccion de cancer.

(1) Deteccion de cancer utilizando lfneas celulares de cancer

Con el fin de detectar el cancer utilizando un sobrenadante de cultivo de celulas cancerosas humanas, se usaron SW480, COLO201 y COLO205 como celulas de cancer de intestino grueso (cancer de colon rectal); se uso MCF7 como celulas de cancer de mama; y se usaron NUGC4, MKN1 y MKN7 como celulas de cancer gastrico.

SW480, COLO201 y COLO205 fueron adquiridas del Instituto Nacional de Innovacion Biomedica, JCRB Cell Bank Japanese Collection of Research Bioresources Cell Bank (Tokyo, http://cellbank.nibio.go.jp)), y los otros tipos de celulas se adquirieron del Centro de Recursos Celulares para la Investigacion Biomedica, Institute of Development, Aging and Cancer (Tohoku University, Sendai, Japan)). Usando medio RPMI 1640 con FBS al 10%, se mantuvieron todas las lfneas celulares en una condicion en la que no eran confluentes a 37 °C en una aireacion con un 5% de CO2. Se utilizo en la prueba una solucion de cultivo, que era una capa clara en la porcion superior del medio. El medio despues del cultivo de celulas se observo en la posicion "+" en una placa de ensayo (Figura 12). Para eliminar la influencia del olor del medio en sf, se coloco una solucion de cultivo de control, que se habfa diluido a la misma concentracion que la descrita anteriormente, en una posicion en el lado opuesto a la posicion donde se coloco el medio de cultivo celular (Figura 12).

La quimiotaxis de los nematodos se probo en una placa de ensayo de la misma manera que en el Ejemplo 1. Como resultado, los nematodos de tipo silvestre (C. elegans) mostraron un comportamiento de atraccion al medio de cultivo (diluido de 1/106 to 1/107) en el que se habfan cultivado las celulas cancerosas (Figura 13).

En la figura 13, la barra izquierda muestra los resultados obtenidos utilizando un medio de cultivo de celulas cancerosas diluidas en 1/106, yJ la ba 7rra derecha muestra los resultados obtenidos utilizando un medio de cultivo de celulas cancerosas diluidas en 1/10 . Ademas, el sfmbolo * indica que es significativo en p <0,05; ** indica que es significativo en p <0,01; y *** indica que es significativo en p <0,001(prueba de Dunnett). Por otra parte, en la Figura 13, la barra de error indica EEM.

Una solucion de cultivo o una solucion conservante de fibroblastos (celulas no cancerosas) tambien se probo de la misma manera como se describe anteriormente. Como resultado, se demostro que los nematodos no mostraban un comportamiento de atraccion a la solucion de cultivo o solucion conservante (evitacion debil) (Figura 13). Esto significa que los nematodos no muestran un comportamiento de atraccion a una "secrecion de celulas humanas", sino que muestran un comportamiento de atraccion a una "secrecion de celulas cancerosas".

MEM, EMEM y RPMI indican un medio solo. KMST-6 y CCD-112CoN indican fibroblastos (que fueron adquiridos de RBC y ATCC, respectivamente).

(2) Quimiotaxis para medios de cultivo de fibroblastos y medios de cultivo de celulas cancerosas

Por otra parte, tambien se examinaron la quimiotaxis en los medios de cultivo de fibroblastos y en los medios de cultivo de celulas cancerosas, que tenfan diversas concentraciones, y la quimiotaxis de nematodos en tejidos de cancer humanos. Los metodos para ello son los siguientes.

Un medio de cultivo de fibroblastos y un medio de cultivo de celulas cancerosas se diluyeron cada uno con agua para dar como resultado diversas concentraciones (que iban desde su solucion madre hasta 10"9), y se observo la quimiotaxis de nematodos de tipo silvestre en medios de cultivo individuales. Con respecto a los tejidos cancerosos humanos y a los tejidos normales, despues de obtener el consentimiento informado, estos tejidos se extirparon de un paciente con cancer, y se fragmentaron en muestras, cada una con un diametro de 0,1 a 0,8 mm, y a continuacion, se utilizaron.

Como resultado, los nematodos no mostraron un comportamiento de atraccion a todas las concentraciones de fibroblastos, pero se observo que los nematodos mostraban un comportamiento de atraccion significativo a las celulas cancerosas que teman concentraciones de 10-6 y 10-7 (Figuras 17 y 18).

Con respecto a la quimiotaxis de nematodos en tejidos cancerosos humanos, los nematodos mostraron un comportamiento de atraccion a una seccion de tejido canceroso, pero mostraron un comportamiento de evitacion a los tejidos normales (tejidos mas alejados de los tejidos cancerosos) del mismo paciente que el que tema los tejidos cancerosos antes mencionados (Figura 19). Tambien se encontro que cuando los tejidos cancerosos se colocan en un lado y los tejidos normales se colocan en el otro lado, los nematodos se acercan a los tejidos cancerosos.

(3) Quimotaxis para solucion conservadora salina fisiologica que contiene una seccion de tejido canceroso Se anadio una seccion de tejido canceroso humano a una solucion salina fisiologica y la solucion obtenida se conservo a -20 °C (penodo de conservacion: 3 meses). Posteriormente, se estudio la quimiotaxis de los nematodos a una dilucion de la solucion salina fisiologica.

Tras obtener el consentimiento informado, los tejidos cancerosos que teman un diametro de 0,5 cm se extirparon de un paciente con cancer y luego se agregaron a 20 ml de solucion salina fisiologica. La solucion salina fisiologica resultante se diluyo con agua para dar lugar a concentraciones de 10-2 a 10-4, y a continuacion, se observo la quimiotaxis de los nematodos de tipo silvestre en estas soluciones diluidas.

Como resultado, los nematodos mostraron un comportamiento de atraccion a la solucion salina fisiologica que contema tejidos cancerosos, pero mostraron un comportamiento de evitacion a una solucion salina fisiologica que contema tejidos normales (Figura 20).

Debido a que el mutante odr-3 no mostro un comportamiento de atraccion a la solucion salina fisiologica que contema tejidos cancerosos, se puede decir que los nematodos sienten el olor.

[Ejemplo 4]

Prueba a mediana escala

Para confirmar la alta precision del metodo de la presente invencion, se llevo a cabo una prueba utilizando 242 muestras de orina (218 muestras de control y 24 muestras derivadas de pacientes con cancer) (Tabla 1). La tabla 1 muestra los antecedentes de los sujetos.

Tabla 1

a, Caracterfsticas de los antecedentes de los participantes para el examen final

NSDT(+)

Valor p de NSDT Cancer 2 anos Cancer cer no NSDT(+) NSDT(-) positivo frente a antes dentro de 2 Can

encontrado negativo anos

n 19 5 11 35 207

Genero (masculino) 12 3 2 17 87 0,68 NS Edad (anos) (mediana) 47-89(68) 53-70(60) 41-73(53) 41-89(66) 26-78(46) 1.3E-08 P<0,001 Historia de cancer 0 0 0 0 6 0,67 NS Dolencias

Tos o esputo 0 1 1 2 7 0,85 NS Perdida de apetito 1 1 0 2 0 0,02 P<0,05 Malestar abdominal 0 0 1 1 6 0,60 NS Malestar 1 1 2 4 15 0,61 NS Malestar de pecho 1 1 1 3 4 0,11 NS Alteracion intestinal 3 1 0 4 9 0,19 NS Dolor de cabeza 0 1 3 4 12 0,38 NS Secrecion sangrienta 1 0 0 1 1 0,67 NS a, Caracterfsticas de los antecedentes de los participantes para el examen final

a, Caracterfsticas de los antecedentes de los participantes para el examen final

Todas las muestras de orina se diluyeron 10 veces y la prueba de quimiotaxis con nematodos se llevo a cabo tres veces para cada muestra.

Como resultado, los nematodos mostraron una reaccion de atraccion a todas las muestras de orina derivadas de pacientes con cancer (24/24) y la sensibilidad de deteccion fue del 100% (Figura 14). Por otro lado, el nematodo mostro un comportamiento de evitacion en casi todas las muestras de orina de control (207/218) (Figura 14). En la figura 14, las barras naranjas (numeros 1, 2, 41, 44, 54, 56, 90, 157, 196, 202, 208, 213, 220, 226, 232-239, 241 y 242) indican muestras derivadas de pacientes con cancer y las barras azules (los numeros que no sean los numeros mencionados anteriormente) indican muestras de control. Por otra parte, en la Figura 14, la barra de error indica EEM.

El presente inventor tambien ha estudiado otros marcadores tumorales para los mismos sujetos.

Los marcadores tumorales utilizados como dianas del estudio fueron CEA en suero, Anticuerpos anti-p53 en suero (Anti-p53 Ab) y N1,N12-diacetilspermina de orina (DiAcSpm). Cuando se comparo con estos marcadores tumorales, el metodo de la presente invencion (NSDT) tenia una sensibilidad extremadamente alta (Figura 15 y Tabla 2). Cabe senalar que la sensibilidad (%) indica la proporcion de respuestas positivas a las muestras derivadas de pacientes con cancer.

Tabla 2

Tabla 3 de datos extendidos La precision de los marcadores tumorales en el examen final

Tabla 3 de datos extendidos La precision de los marcadores tumorales en el examen final

La tabla 2 incluye pacientes con cancer en las etapas 0 y 1. Esto significa que el metodo de la presente invencion tambien es util para la deteccion del cancer temprano.

[Ejemplo 5]

Estudios sobre la concentracion optima de la orina. Metodo:

Se diluyeron con agua tres muestras como muestras de orina de sujetos sanos (c1, c2 y c3) y cinco muestras como muestras de orina de pacientes con cancer (p2, p5, p8, p17 y p18) para dar lugar a varios tipos de concentraciones ( que van desde la solucion madre de la misma a 10-5), y posteriormente, se estudio la quimiotaxis de los nematodos de tipo silvestre en las mismas.

Resultados:

Tal como se muestra en la Figura 21, se demostro que es preferible una dilucion de 10 veces. En la figura 21, en el grafico de barras que muestra cada concentracion, las tres barras en el lado izquierdo muestran los resultados obtenidos utilizando orina derivada de sujetos sanos, y las cinco barras en el lado derecho muestran los resultados obtenidos utilizando orina derivada de pacientes con cancer.

[Ejemplo 6]

Identificacion del receptor

(1) Materiales y metodos

Cultivo de nematodos y cepas de nematodos

Excepto por el mutante eri-1 que se cultivo con Escherichia coli (E. coli) OP50, los nematodos (C. elegans) se cultivaron a 20 °C en condiciones estandar en una placa de medio de crecimiento de nematodos (NGM) (36) que comprende Escherichia Coli NA22 como fuente de alimento. Los nematodos de tipo silvestre utilizados fueron de una cepa Bristol N2. Como otras cepas de nematodos, se usaron GR1373: eri-1 (mg366), VC2123: sri-14 (ok2865), CX3410: odr-10 (ky225) y MT7929: unc-13 (e51).

ARN de interferencia y ensayo de quimiotaxis

El ensayo de ARNi se llevo a cabo realizando un metodo de ARNi que involucra la alimentacion (metodo de alimentacion de ARNi) de eri-1 (mg366) (19), utilizando una biblioteca Ahringer (37).

Se colocaron nueve mutantes eri-1 adultos en una placa NGM que contema isopropil p-D-1-tiogalactopiranosido (0,19 g/l), ampicilina (60 mg/l) y Escherichia coli (E. coli) y a continuacion, se cultivaron durante 4 dfas. Posteriormente, los gusanos adultos se utilizaron en un ensayo de quimiotaxis. El ensayo de quimiotaxis se llevo a cabo como se indica anteriormente (6, 17). En el ensayo de quimiotaxis, el presente inventor ha utilizado de 30 a 50 gusanos en cada experimento en el que se usaron 1 pl de odorante diluido a 10-3 o a 10-4 (baja concentracion), o 1 y 5 pl de odorantes sin diluir (alta concentracion).

Los resultados del analisis de ARNi se analizaron estadfsticamente de la siguiente manera.

Se calcularon la puntuacion z y un valor de control en cada prueba individual de 2SD cada dfa (Tabla 3) o todos los dfas. La puntuacion z se uso como un umbral que indica una gran diferencia (-1.96 y 1.96, P < 0,05 ). Sin embargo, parecfa que la inhibicion de un receptor no causaba efectos notables. En consecuencia, el presente inventor ha utilizado la puntuacion z ± 1 (-0.96 y 0.96, P <0.33) como un umbral mas debil.

Evitacion de la presion osmotica

El presente inventor ha utilizado NaCl 4 M para el estfmulo osmotico y ha analizado un comportamiento de evitacion de la presion osmotica, como se indica anteriormente (38).

Desactivacion de la funcion especffica de celulas de sri-14

Se construyo un gen para desactivar la funcion de sri-14 en neuronas especfficas, como se indica anteriormente (24). La region diana de sri-14 (una secuencia del genoma de 1,6 kb) se amplifico utilizando los dos cebadores siguientes:

Tf: 5'-ggcgccgatataattgctaa-3' (SEQ ID NO: 1), y

Tr; 5'-ctgctgcgtttttcgtatca-3' (SEQ ID NO: 2).

La expresion genica de ASH se llevo a cabo utilizando un promotor sra-6 (20), y la de AWC se llevo a cabo utilizando los promotores ceh-36 (39) y srd-17.

Ablacion genetica e inhibicion de neuronas

El presente inventor ha utilizado la caspasa-1 de raton (mCasp1) para la ablacion de las neuronas AWA, AWB, AWC y ASH. mCasp1 se expreso en cada una por los promotores odr-10 (11), str-1 (15), ceh-36 (39) y sra-6 (20), respectivamente. Por otra parte, para la inhibicion de las interneuronas, se utilizo unc-103 (gf). La expresion especffica de AIA, AIB, AIY o AIZ de unc-103 (gf) se llevo a cabo utilizando un promotor gcy-28.d (29), npr-9 (40), ttx-3 (41, 42), o lin-11 (43, 44), respectivamente. Preparacion y amplificacion del ADNc de sri-14

El ARN total, que se habfa aislado usando PureLink RNA Minikit (Ambion), se convirtio en ADNc mediante la mezcla maestra de qPCR ReverTra Ace usando el ADNg Remover (Toyobo) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El ADNc de sri-14 se amplifico utilizando los dos cebadores siguientes, a continuacion, se digirio con Nhe I y Kpn I, y luego se inserto en un vector pPD-DEST (Invitrogen):

5'-gagaGCTAGCaaaaaatgcctgcaggtccac-3' (SEQ ID NO: 3), y

5'-gagaGGTACCttattgaattctcggttg-3' (SEQ ID NO: 4).

Imagenes de calcio

Para monitorear la respuesta de las neuronas AWA, AWB, AWC y ASH, el presente inventor ha producido cepas que expresan YC3.60, utilizando los promotores odr-10, str-1, odr-3 y sra-6 (11, 15, 20, y 45), respectivamente. Como se informo anteriormente (33, 46, 47), las imagenes de calcio se llevaron a cabo utilizando un dispositivo microflufdico. En un experimento que utiliza un dispositivo microflufdico de este tipo, se capturo un nematodo por un microcanal de manera que la nariz del nematodo se expuso a agua corriente que contenfa una solucion de diacetilo [diluido a 10-5 (baja concentracion) y diluido a 10-3 ( alta concentracion)], o una solucion sin olor, y a continuacion, se inmovilizo cada nematodo. La temperatura ambiente se ajusto de 20°C a 23°C. La imagen de fluorescencia de YC3.60 se tomo utilizando Zeiss Axioplan 2 que comprende lentes objetivas 40 x y una camara digital 3CCD (C7780, Hamamatsu Photonics). Todas las imagenes se recuperaron a un tiempo de exposicion de 200 ms. Las pilas de tiempo de los cuerpos celulares AWA, AWB, AWC y ASH se capturaron y, posteriormente, utilizando el software AquaCosmos (ver. 2.6, Hamamatsu Photonics), se analizo la relacion de emision entre una protefna fluorescente amarilla (YFP) y una protefna fluorescente cian (CFP). Esta relacion se calculo como intensidad de intensidad de YEP/intensidad de CFP ( R), y se establecio un promedio de las proporciones de ventanas de 10 segundos (de -10 a 0 segundos) en R0.

(2) Resultados

Analisis de ARN de interferencia de pares de olor -receptor

Con el fin de identificar exhaustivamente los receptores olfativos necesarios para la respuesta a determinados odorantes, el presente inventor ha llevado a cabo un analisis sistematica de ARN de interferencia (ARNi). El ARNi en las neuronas de los nematodos (C. elegans) no es eficaz para los nematodos de tipo silvestre debido a la baja sensibilidad de las neuronas del nematodo (C. elegans) al ARNi (18). Por lo tanto, se utilizo en el presente documento la cepa de nematodo eri-1 potenciada con ARNi (mg366) (19).

El presente inventor ha demostrado que, como resultado del ARNi del mutante eri-1, la desactivacion de odr-10 causa un defecto especffico en la respuesta a una baja concentracion (diluido a 10-3) de diacetilo, y el inventor ha confirmado que esta cepa de nematodo se puede utilizar de manera eficaz para el analisis de ARNi de genes de receptores olfativos (Figura 22). Se analizaron los genes que codifican 822 receptores olfativos supuestos, incluida la familia SRH, (en donde todos los genes codifican GPCR). Se probo la respuesta a 11 odorantes de los nematodos tratados con ARNi. Debido a que los nematodos (C. elegans) pueden cambiar la preferencia dependiendo de la concentracion de un odorante (17), se examino adicionalmente su respuesta a concentraciones mas altas de los odorantes (1 pl y 5 pl de odorantes sin diluir) (en donde los odorantes causan un comportamiento de atraccion a nematodos, cuando se utilizan en bajas concentraciones). Los odorantes incluyeron bajas concentraciones de seis atrayentes (6), altas concentraciones de tres atrayentes que inducen evitacion en altas concentraciones (17) y altas concentraciones de dos repelentes (6, 20) (Figura 22).

La prueba se realizo de manera repetida en una cepa de nematodo tratada con ARNi, que presentaba anomalfas en la respuesta de movimiento inducida por la sensacion qufmica a un odorante (vease la seccion "Materiales y metodo") (Tabla 3). Como resultado del tercer analisis, debido a que los ARNi de los genes que codifican 194 receptores olfativos supuestos causaron una respuesta mas debil a uno o mas odorantes que un control, se considero que los genes codifican los receptores olfativos candidatos (Figura 22 y Tabla 4).

Debido a que los genes, que se expresan en las neuronas sensoriales, es probable que actuen como receptores olfativos, se examinaron a continuacion, los patrones de expresion de estos genes.

Usando indicadores fluorescentes ligados a los promotores de genes que codifican receptores olfativos individuales, el presente inventor ha analizado los patrones de expresion de los genes que codifican 16 receptores olfativos supuestos, cuya desactivacion habfa causado defectos graves en los movimientos inducidos por sensacion qufmica (Figura 22C y Figura 23A -L). Por otra parte, con respecto a los patrones de expresion de 19 genes de receptores olfativos, se utilizo la informacion divulgada en WormBase (http://www.wormbase.org). Entre estos 35 genes, se expresaron 30 genes en neuronas. Entre los 16 genes analizados en funcion de la expresion indicadora, 15 genes se expresaron en neuronas sensoriales asociadas con el sentido del olfato (Tabla 5).

Identificacion del receptor olfativo SRI-14 que responde a una alta concentracion de diacetilo

ODR-10 es un receptor de diacetilo y un mutante odr-10 tiene un defecto en la quimiotaxis a una baja concentracion de diacetilo (11). Como se indico anteriormente (11), el presente inventor habfa confirmado que el mutante odr-10 muestra una quimiotaxis normal a una alta concentracion de diacetilo (Figura 24A). Esto sugiere que estan presentes otros receptores con respecto a diacetilo y que ODR-10 puede ser especffica a una baja concentracion de diacetilo (21). Como resultado del analisis de ARNi, Se obtuvieron 5 genes candidatos del receptor olfativo (srh-25, srh-79, srh-216, srh-281 y sri-14 asociados con una alta concentracion de diacetilo (Tabla 3 y Figura 25). Por lo tanto, el presente inventor ha analizado la expresion usando promotores cadena arriba. Como resultado, no se pudo detectar la expresion de srh-79 y srh-216 y se observo la expresion de srh-25 y srh-281 en las neuronas sensoriales ADL, que no se asociaron con el comportamiento de evitacion a una alta concentracion de diacetilo (Tabla 5 ). En consecuencia, con el fin de entender como los diversos receptores causan reacciones dependientes de la concentracion a un solo odorante, el presente inventor se ha centrado en sri-14. Esto se debe a que el ARNi de este gen causo un defecto significativamente fuerte en la evitacion a una alta concentracion de diacetilo (Figura 24B).

SRI-14 esta codificado por un gen que tiene 7 exones y de acuerdo con WormBase, ok2685 es un mutante por delecion que se predice que es una perdida de funcion (Figura 26A). En referencia a la secuencia de aminoacidos putativa de SRI-14 (SEQ ID NO: 5), se encontro que la protefna tiene un dominio putativo de 7-transmembrana (Figura 26B y C). El analisis del comportamiento de un mutante sri-14 (ok2865) en condiciones de alta presion osmotica demostro que los nematodos exhiben un comportamiento normal de evitacion a la presion osmotica alta. Sin embargo, el mutante sri-14 mostro un defecto en la respuesta de evitacion a una alta concentracion de diacetilo, como en el caso de los nematodos sri-14 tratados con ARNi (Figura 24A). Por otra parte, cuando se comparo con el mutante odr-10, el mutante sri-14 mostro un defecto en la quimiotaxis especffica para una alta concentracion de diacetilo (Figura 24A). El mutante sri-14 mostro una respuesta normal a otros repelentes y a altas concentraciones de otros atrayentes (Figura 24C). Esto sugiere que el SRI-14 se asocia solo con la deteccion de una alta concentracion de diacetilo, entre los odorantes examinados.

Como resultado del analisis de la expresion indicadora, se encontro que sri-14 se expresa en las neuronas quimiosensoriales AWC y ASH (Figura 24D). Se considera que las neuronas AWC son necesarias para la deteccion de un gran numero de atrayentes que comprenden diacetilo diluido 10 veces (22, 23), y las neuronas ASH se asocian con la evitacion de un repelente (9) y una alta concentracion de alcohol isoamflico ( 17). Con el fin de aclarar si SRI-14 funciona en las neuronas AWC o ASH en la respuesta a una alta concentracion de diacetilo, el presente inventor ha llevado a cabo la desactivacion especffica de sri-14 en las neuronas AWC y ASH (24). Como resultado, la desactivacion de sri-14 especffica de ASH causo un defecto en la evitacion del diacetilo, pero en el caso de la desactivacion especffica de AWC, no se observo ninguna anomalfa (Figura 24E).

Adicionalmente, se rescato un defecto en la evitacion del mutante sri-14 de una alta concentracion de diacetilo por la expresion del ADNc de sri-14 especffica de ASH, pero se rescato parcialmente o no se rescato por la expresion especffica en las neuronas olfativas AWA, AWB o AWC (Figura 24F). Estos resultados demuestran que la funcion de ^{s R I - 1 4} en las neuronas sensoriales ASH es necesaria y suficiente para mediar la evitacion de una alta concentracion de diacetilo. La respuesta de evitacion a condiciones de alta presion osmotica esta mediada por las neuronas ASH (25, 26). El resultado de que esta es una respuesta normal en el caso del mutante sri-14 (Figura 26D) indica que las neuronas ASH son normales con respecto a la deteccion de otras estimulaciones de evitacion y la respuesta a las mismas. Ademas, se localizo una protefna de fusion de SRI-14 y una protefna verde fluorescente (GFP) en los cilios sensoriales de las neuronas ASH (Figura 24G). Esto demuestra que SRI-14 funciona como un factor para la senalizacion olfativa en los cilios sensoriales de ASH.

Identificacion de neuronas sensoriales e interneuronas asociadas con el cambio de preferencia en funcion de la concentracion de odorante

Las neuronas AWA (6) detectan una baja concentracion de diacetilo (solucion diluida a 10-4) y las neuronas AWC (22, 23) detectan una concentracion intermedia de diacetilo (solucion diluida a 10-1). Ambas neuronas median la atraccion. Sin embargo, no se sabe que neuronas sensoriales detectan una alta concentracion de diacetilo (sin diluir) y se asocian con una respuesta de evitacion. En los estudios previos, se habfa demostrado que las neuronas sensoriales ASH y AWB detectan una alta concentracion de alcohol isoamflico (17) y median la evitacion. Ademas, las neuronas AWC y AWB estan asociadas tanto con la atraccion como con la evitacion (17, 27).

Por lo tanto, el presente inventor ha examinado la implicacion de las neuronas sensoriales ASH, AWB y AWC con la respuesta de evitacion a una alta concentracion de diacetilo. Los nematodos, de los cuales AWB o AWC habfan sido sometidos a eliminacion genetica, no mostraron un defecto en la quimiotaxis de responder a una alta concentracion de diacetilo (Figura 27A). Sin embargo, cuando se eliminaron las neuronas ASH, se inhibio este comportamiento de evitacion (Figura 27A). Estos resultados demuestran que las neuronas ASH detectan principalmente una alta concentracion de diacetilo, y los resultados son consistentes con los resultados de que SRI-14 funciona en las neuronas ASH.

Con el fin de examinar si las neuronas AWA median o no la evitacion al diacetilo y la atraccion al diacetilo, el presente inventor ha analizado la respuesta de comportamiento de los nematodos, a partir de aquellos en los que las neuronas AWA se habfan eliminado especfficamente. Los nematodos, de aquellos en los que las neuronas AWA se habfan eliminado, mostraron una disminucion en la evitacion de una alta concentracion de diacetilo (Figura 27A), y una disminucion en la atraccion a una baja concentracion de diacetilo (Figura 27B). Esto es similar a la capacidad de las neuronas AWC y AWB, que funcionan tanto para la atraccion como para la evitacion (17, 27). La doble eliminacion de AWA y ASH causa un defecto mas grave que en el caso de una sola eliminacion y estos resultados muestran que tanto AWA como ASH funcionan en paralelo, en la respuesta a una alta concentracion de diacetilo (Figura 27A).

Con el fin de aclarar la contribucion de las interneuronas a un cambio de preferencia dependiente del olor y la concentracion, el presente inventor ha examinado la participacion de las interneuronas AIA, AIB, AIY y AIZ que tienen una union sinaptica directa o una union gap con las neuronas sensoriales AWA o ASH, o con ambas neuronas sensoriales (Figura 27C). Estas interneuronas se inhibieron individualmente por la expresion especffica de neuronas de unc-103 (gf) que proporciona hiperpolarizacion (28, 29). La inhibicion funcional de las interneuronas AIA, AIY o AIZ cambio la respuesta de los nematodos expuestos a una alta concentracion de diacetilo de una respuesta de evitacion a una respuesta de atraccion (Figura 27D), y la inhibicion de AIB atenuo la respuesta de evitacion. Estos resultados muestran que estas interneuronas desempenan un papel importante en un cambio de preferencia dependiente del olor y la concentracion, y se corresponden con el informe anterior de que AIB, AIY y AIZ son importantes para diferentes respuestas de comportamiento a una alta concentracion de y a una baja concentracion de alcohol isoamflico (17). Por el contrario, la atraccion a una baja concentracion de diacetilo no fue influenciada por la inhibicion de estas interneuronas, excepto por AIY (Figura 27E). Esto sugiere que un circuito neural para mediar la atraccion a una concentracion mas baja de diacetilo es diferente de un circuito neuronal para mediar la evitacion de una alta concentracion de diacetilo.

Uso adecuado de los receptores olfativos dependiendo de la concentracion del olor

Los resultados de los experimentos de comportamiento de nematodos realizados por el presente inventor y los resultados del estudio anterior (11) sugieren que un cambio de preferencia dependiente de la concentracion a diacetilo esta mediado por dos tipos de receptores, concretamente, ODR-10 en las neuronas AWA y SRI-14 en las neuronas ASH. Por lo tanto, el presente inventor ha monitoreado la respuesta de las neuronas AWA y ASH a diversas concentraciones de diacetilo mediante imagenes de calcio, en las cuales se uso un indicador de calcio codificado geneticamente Yellow Cameleon (YC) 3.60 (30) en nematodos de tipo silvestre, mutantes odr-10 y mutantes sri-14.

En las neuronas AWA de los nematodos de tipo silvestre o de los mutantes sri-14, el calcio intracelular aumento despues de que los nematodos se hubieran expuesto a una baja concentracion de diacetilo (29) (Figura 28A y B). Sin embargo, los mutantes odr-10 no respondieron a una concentracion tan baja de diacetilo (Figura 28A y B). Estos resultados concuerdan con los hallazgos de que ODR-10 funciona como un receptor especffico para una baja concentracion de diacetilo en las neuronas AWA (21). Por el contrario, las neuronas AWA de los mutantes odr-10 y los nematodos de tipo silvestre respondieron normalmente a una alta concentracion de diacetilo (Figura 28C y D).

Estos resultados son consistentes con los hallazgos de que los mutantes odr-10 mostraron una quimiotaxis normal a una alta concentracion de diacetilo (Figura 24A). Debido a que la eliminacion de estas neuronas redujo las respuestas tanto de atraccion como de evitacion (Figura 27A y B), estos resultados sugieren ampliamente que otros receptores distintos de ODR-10 estan presentes en las neuronas AWA y detectan una alta concentracion de diacetilo.

El presente inventor ha monitoreado una respuesta transitoria de Ca2+ en las neuronas ASH. En las neuronas ASH de los nematodos de tipo silvestre, se detecto una respuesta de Ca2 solo a una alta concentracion de diacetilo (Figura 29A). Para aclarar si la respuesta de ASH a una alta concentracion de diacetilo esta o no influenciada por otras neuronas, el presente inventor ha analizado la respuesta de Ca2 en la ASH de mutantes unc-13 (e51) que tienen un defecto en la exocitosis de vesfculas sinapticas (31). La respuesta de calcio de las neuronas ASH de los mutantes unc-13 a una alta concentracion de diacetilo fue significativamente mayor que la de las neuronas ASH de los nematodos de tipo silvestre, y se prolongo (Figura 30A, B y D). Esto sugiere que las senales de otras neuronas inhiben la actividad de ASH en la respuesta al diacetilo.

Debido a que se ha observado que la respuesta al diacetilo se modifica en los nematodos con eliminacion de AWA (Figura 27, A y B), el presente inventor ha probado adicionalmente los efectos de la eliminacion de AWA sobre la respuesta de calcio de las neuronas de ASH a una alta concentracion de diacetilo. Como resultado, el inventor ha encontrado que la eliminacion de las neuronas AWA mejora la respuesta de calcio de las neuronas ASH (Figura 30A, C y D). Esto sugiere que AWA esta asociada con un circuito inhibitorio de respuesta de ASH.

Posteriormente, el presente inventor ha monitoreado la respuesta de Ca2 de las neuronas ASH de nematodos mutantes a una alta concentracion de diacetilo. La respuesta de Ca2 se indujo normalmente en las neuronas ASH del mutante odr-10, pero dicha respuesta se redujo significativamente en las neuronas ASH del mutante sri-14 (Figura 29B y C). Se rescato un defecto en la respuesta de ASH del mutante sri-14 a una alta concentracion de diacetilo fue rescatado por la expresion especffica de ASH de un gen de sri-14 de tipo silvestre (Figura 29B y C). Por otra parte, cuando se elimino sri-14 especfficamente de ASH en nematodos de tipo silvestre, se redujo la respuesta de Ca2 de ASH a una alta concentracion de diacetilo (Figura 29B y C). Estos resultados demuestran que SRI-14 funciona como un componente principal para la recepcion de una alta concentracion de diacetilo en las neuronas ASH.

Debido que se ha observado la expresion de sri-14 en las neuronas AWC y en las neuronas ASH (Figura 24D), el presente inventor ha monitoreado la respuesta de AWC a una alta concentracion de diacetilo. Un aumento en la concentracion de Ca2 en AWC fue causado por la eliminacion del olor (32). Como tal, el presente inventor ha probado la respuesta de las neuronas AWC despues de la eliminacion de una alta concentracion de diacetilo, y como resultado, el inventor ha encontrado que se produce una respuesta de Ca2 en las neuronas AWC (Figura 31). Estos resultados concuerdan con el informe anterior de que AWC y AWA (22,23) detectan el diacetilo. Sin embargo, la eliminacion de AWC no influyo en la evitacion de una alta concentracion de diacetilo (Figura 27A). Esto sugiere que la respuesta de las neuronas AWC no es importante para la evitacion del diacetilo. Debido a que la respuesta de comportamiento a una alta concentracion de diacetilo no se vio influenciada por la expresion especffica de AWC de sri-14 o la reduccion especffica de AWC de sri-14 (Figura 24E y F), se considera que habra otros receptores distintos a SRI-14, que median la respuesta de AWC a una alta concentracion de diacetilo.

En general, las neuronas AWB estan asociadas con un comportamiento de evitacion (15). En los estudios previos, se habfa indicado que la respuesta de Ca2 de las neuronas AWB se produce despues de la eliminacion de nonanona o una alta concentracion de alcohol isoamflico (17,33). Por lo tanto, el presente inventor ha llevado a cabo la expresion ectopica del ADNc de sri-14 en las neuronas AWB y ha monitoreado la respuesta de Ca2 a diversas concentraciones de diacetilo.

El presente inventor ha observado una ligera respuesta de Ca2 despues de la eliminacion del olor en ambos casos de baja concentracion y alta concentracion de diacetilo en las neuronas AWB de tipo silvestre. Cuando se compara con una respuesta tan debil en las neuronas AWB de tipo silvestre, la respuesta de Ca2 de las neuronas AWB despues de la eliminacion de una alta concentracion de diacetilo se mejoro significativamente por la expresion ectopica de SRI-14. Sin embargo, la expresion ectopica de SRI-14 no cambio la respuesta a la eliminacion de una baja concentracion de diacetilo (Figura 32A y B). Estos resultados respaldan nuestra conclusion de que SRI-14 contribuye a la deteccion de una alta concentracion de diacetilo. Ademas, estos hallazgos sugieren que ODR-10 en las neuronas AWA y SRI-14 en las neuronas ASH responden a una concentracion baja y una concentracion alta de diacetilo, respectivamente, y que funcionan como receptores para mediar los comportamientos de atraccion y evitacion (Figura 33).

(3) Consideracion

Con el fin de identificar exhaustivamente los receptores olfativos odorantes especfficos, el presente inventor ha usado el analisis del ARNi. Debido a que los nematodos (C. elegans) tienen receptores olfativos y senalizacion olfativa, que son similares a los de los mamfferos (23, 34), se consideran organismos modelo para el analisis olfativo. Por otra parte, se describen todas las redes neuronales capaces de seguir rutas en las que se transmiten senales olfativas en los circuitos neurales (35). Sin embargo, la relacion de correspondencia de la mayorfa de los odorantes con receptores especfficos u oligomeros del receptor no se conoce y tampoco se conoce el mecanismo de la interaccion entre los odorantes y los receptores olfativos. Como consecuencia, no se entiende como se introducen las senales de olor, como se transmiten las senales olfativas en los circuitos neurales y como un pequeno numero de ORN en los nematodos (C. elegans) pueden distinguir un gran numero de odorantes. Un analisis adicional de los candidatos a receptores obtenidos como resultado del analisis de ARNi es util para identificar los receptores olfativos para los odorantes especfficos y comprender estos mecanismos.

El presente inventor habfa indicado previamente que diferentes neuronas sensoriales funcionan dependiendo de la concentracion de un olor (17). En este estudio, el presente inventor ha encontrado que, con respecto a la recepcion de diacetilo, ODR-10 y SRI-14 funcionan respectivamente como receptores especfficos a una baja concentracion y una alta concentracion de diacetilo en ORN especfficas (Figura 33). Se supone que es probable que SRI-14 tenga una afinidad mas baja por el diacetilo que la de ODR-10. Sin embargo, estos receptores no tienen una secuencia homologa en un sitio de reconocimiento de odorantes, y por lo tanto, el mecanismo que es la base de la capacidad de estos receptores para distinguir las mismas sustancias qufmicas que tienen diferentes concentraciones sigue siendo desconocido.

En el experimento de imagenes de calcio, se ha demostrado que las neuronas sensoriales AWA responden tanto a una concentracion baja como a una alta concentracion de diacetilo. La eliminacion genetica de las neuronas AWA causo un defecto en la evitacion de una alta concentracion de diacetilo y en la atraccion a una baja concentracion de diacetilo. Estos resultados sugieren que las neuronas AWA contribuyen a detectar el diacetilo que tiene un amplio rango de concentraciones y producir un comportamiento opuesto a una concentracion diferente. Estos hallazgos y los hallazgos indicados previamente con respecto a las neuronas AWB (16) y las neuronas AWC (26), muestran que estas ORN de los nematodos (C. elegans) pueden mediar tanto un comportamiento de atraccion como un comportamiento de evitacion. ODR-10 estaba presente en las neuronas AWA (11) y el mutante odr-10 exhibio una atraccion reducida a una baja concentracion de diacetilo, pero mostro una evitacion normal a una alta concentracion de diacetilo. Estos resultados sugieren que las neuronas AWA tienen una pluralidad de receptores de diacetilo, particularmente para una alta concentracion de diacetilo.

Hay candidatos de receptores para una alta concentracion de diacetilo, distintos de SRI-14, que se obtuvieron por el presente inventor de acuerdo con el analisis de ARNi. Es probable que el analisis de estos otros candidatos provoque la identificacion de otros receptores de diacetilo y la adicion de estrategias por medio de las cuales los diferentes receptores actuan dependiendo de la concentracion de un olor.

Tabla 3

Tabla 3. Datos sin procesar con respecto al analisis de ARNi de los genes de la familia de receptores olfativos srh

Los indices de quimiotaxis de nematodos, cuyos genes de la familia srh se trataron con ARNi en el primer (A), el segundo (B) y el tercer analisis (C), a 11 odorantes. Los 11 odorantes incluyen: bajas concentraciones de seis atrayentes [alcohol isoairnlico (laa), benzaldehfdo (Bz), butanona (Bu), pentanodiona (Pd), pirazina (Pz) y trimetiltiazol (Tmt)]; dos repelentes [nonanona (Nona) y octanol (Oct)]; y altas concentraciones de tres atrayentes [alcohol isoamnlico (alto laa), benzaldehfdo (Bz alto) y diacetilo (Da alto)]. Los tonos azul, naranja y verde indican diferencias estadfsticas, respectivamente, comparadas con el valor de control en la misma fecha, comparadas con el promedio de los valores de control en todos los dfas y comparadas con estos dos valores (vease la seccion "Materiales y metodo" ).

Tabla 4

Tabla 4. Datos sin procesar con respecto al analisis de ARNi de 194 genes candidatos de receptores olfativos Despues del tercer analisis, se obtuvieron un total de 194 genes candidatos de receptores olfativos. Esta tabla muestra los indices de quimiotaxis de los nematodos, en los cuales estos genes se trataron con ARNi en el primer, segundo y tercer analisis. Se demostro que algunos genes estan asociados con la deteccion de una pluralidad de odorantes.

Tabla 5

Tabla 5. Patrones de expresion de 35 genes candidatos de receptores y odorantes relevantes.

Solo las neuronas sensoriales se enumeran con sus nombres. Otras neuronas se enumeran como varias neuronas que pertenecen a un solo grupo. Para fotograffas que muestren la expresion de los genes analizados, vease la Figura 23. Los genes escritos con letras en negrita indican genes, que se expresaron (segun la expresion de un gen indicador) en neuronas que muestran una respuesta quimiosensorial al diacetilo cuando se eliminaron. Bu, butanona; Bz, benzaldehfdo; Da, diacetilo; laa, alcohol isoamflico; Nona, nonanona; Oct, octanol; Pd, pentanodiona; Pz, pirazina; Tmt, trimetiltiazol.

[Ejemplo 7]

El presente inventor ha llevado a cabo los ejemplos descritos anteriormente sobre las cepas de C. elegans que se habfan recolectado en varios lugares. Como resultado, se encontro una cepa que no mostraba un comportamiento de atraccion a la orina derivada de varios tipos de pacientes con cancer. Se examino la secuencia del genoma de esta cepa. Como resultado, se revelo que hay muchas sustituciones de nucleotidos individuales en el genoma. Por lo tanto, en el presente ejemplo, la precision de la deteccion del cancer se ha estudiado utilizando la cepa mutante genetica mencionada anteriormente, asf como una cepa de tipo silvestre.

Metodo:

Se examinaron la quimiotaxis de una cepa de tipo silvestre y de una cepa mutante genetica a las muestras de orina de pacientes con cancer que tienen cancer de mama, cancer de esofago, cancer del conducto biliar, cancer de recto, cancer de ciego, cancer de prostata, cancer pancreatico, cancer de pulmon y tumor del estroma gastrointestinal, a la muestra de orina de un sujeto sano y a la muestra de orina de un sujeto sano que mostraba falsos positivos en un experimento de mediana escala.

Resultados:

La cepa mutante genetica no mostro un comportamiento de atraccion a la orina de casi ningun tipo de cancer (Figura 34).

Debido a que la cepa mutante genetica muestra una quimiotaxis normal a otros olores, se puede decir que su sentido olfativo basico funciona. En consecuencia, se predice que la cepa mutante genetica tendra un defecto en un receptor para recibir el olor de los tipos de cancer (Figura 35).

Por otra parte, la cepa mutante genetica muestra un comportamiento de atraccion normal hacia las muestras falsas positivas. Por lo tanto, se analizo una muestra que resulto positiva por la cepa de tipo salvaje (cepa N2) utilizando una cepa mutante genetica, y cuando la cepa mutante genetica dio negativo a la muestra, se diagnostico que la muestra era cancer y cuando la muestra resulto positiva por la cepa mutante genetica, se diagnostico como falso positivo. En consecuencia, al utilizar cepas mutantes geneticas, se puede mejorar la precision de la deteccion del cancer (Figura 35).

[Ejemplo 8]

Identificacion de receptores candidatos asociados con la recepcion de olores de especies de cancer individuales Usando el secuenciador de nueva generacion (Illumina), se decodifico la secuencia del genoma completo de la cepa mutante genetica obtenida en el Ejemplo 7. Posteriormente, la secuencia descodificada se comparo con la secuencia del genoma de N2 y se buscaron los genes receptores que tienen una mutacion.

Como resultado, las mutaciones fuertes estaban comprendidas en los genes receptores (Tabla 6).

Estos genes fueron desactivados por el ARNi especffico de la neurona olfativa AWC (Esposito et al, Efficient and cell specific knock-down of gene function in targeted C. elegans neurons. Gene 395, 170-176, 2007) y a continuacion, se midio la quimiotaxis a la orina de tipos de cancer individuales.

Como resultado, se encontro que los receptores reactivos son diferentes dependiendo de las especies de cancer.

De este modo, es posible especificar tipos de cancer de acuerdo con una prueba de quimiotaxis de nematodos.

En la Figura 36 se muestran los resultados obtenidos al examinar la quimiotaxis de una cepa con el receptor desactivado en la orina de pacientes con cancer de mama.

De estudios sobre perros detectores de cancer, se predijo que los tipos de cancer individuales tienen diferentes olores. Por lo tanto, los receptores olfativos de los nematodos a los olores de los tipos de cancer individuales se identifican y a continuacion, se producen los mutantes, que tienen la delecion del receptor o de los receptores. Un ejemplo del metodo para producir tal mutante por delecion incluye un metodo CRISPR/Cas9 (Friedland et al, Heritable genome editing in C. elegans via a CRISPR-Cas9 system, Nature Methods, 2013).

En primer lugar, como ETAPA 1, la presencia o ausencia de cancer se prueba utilizando una cepa N2.

A continuacion, como ETAPA 2, se especifica un tipo de cancer utilizando un mutante del receptor de cada tipo de cancer. Por ejemplo, cuando un receptor mutante para el olor del cancer de intestino grueso no muestra un comportamiento de atraccion, se puede diagnosticar que se trata de cancer de intestino grueso (Figura 37).

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[Descripcion de los signos]

10: Parte de deteccion, 20: Parte de procesamiento, 30: Parte de almacenamiento, 40: Parte de preservacion 110: Medios de calculo, 120: Base de datos

Claims (13)

REIVINDICACIONES

1. Un metodo in vitro para detectar cancer, caracterizado por la deteccion de cancer utilizando, como indicador, la reaccion de los nematodos al olor de una sustancia relacionada con la biologfa derivada del sujeto o un producto procesado de la misma; en donde la sustancia relacionada con la biologfa o un producto procesado de la misma es una muestra biologica recolectada de un sujeto, o un producto procesado de la misma, en donde la muestra biologica es un fluido corporal, celulas, tejidos, sangre o espiracion.

2. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 1, en donde el nematodo es

(a) Caenorhabditis elegans; y/o

(b) un nematodo de tipo silvestre, un nematodo mutante o un nematodo transgenico.

3. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 1 o 2, en donde cuando el nematodo muestra una respuesta positiva al olor de la sustancia relacionada con la biologfa derivada del sujeto o un producto procesado de la misma, se determina que el sujeto tiene cancer o tiene riesgo de padecer cancer.

4. El metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde cuando la respuesta de la neurona olfativa del nematodo es alta al olor de la sustancia relacionada con la biologfa derivada del sujeto o un producto procesado de la misma, se determina que el sujeto tiene cancer o tiene riesgo de padecer cancer.

5. El metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde la sustancia relacionada con la biologfa o un producto procesado de la misma es un fluido corporal tal como orina, celulas, tejidos, un cultivo de las celulas o tejidos, o una solucion conservante de las celulas o tejidos tal como solucion salina fisiologica.

6. Un metodo para identificar un receptor olfativo en nematodos, caracterizado por identificar un receptor olfativo usando nematodos; en donde se inhibe la expresion o funcion de un gen que codifica el receptor y se prueba la reaccion del nematodo inhibido a un olor y, en donde

(a) el olor es el olor de los tipos de cancer; y/o

(b) el tipo de receptor a identificar es diferente segun los tipos de cancer o la concentracion de un odorante.

7. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 6, en donde la expresion o funcion del gen receptor es inhibida por ARNi.

8. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 6 o 7, en donde el nematodo es Caenorhabditis elegans.

9. Un metodo para identificar tipos de cancer, caracterizado por identificar tipos de cancer utilizando, como indicador, la reaccion de los nematodos al olor de una sustancia relacionada con la biologfa derivada del sujeto o un producto procesado de la misma; en donde el metodo comprende las siguientes etapas:

(a) detectar cancer por el metodo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5,

(b) probar la reaccion de un nematodo modificado, que se ha preparado modificando un receptor identificado por el metodo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, al olor de una muestra, que se ha detectado que tiene cancer en la etapa (a) y

(c) determinar los tipos de cancer correspondientes al receptor identificado como tipos de cancer diana de la identificacion cuando la reaccion al olor es diferente entre el nematodo modificado y el nematodo utilizado en la etapa (a);

en donde la sustancia relacionada con la biologfa o un producto procesado de la misma es una muestra biologica recolectada de un sujeto, o un producto procesado de la misma, en donde la muestra biologica es un fluido corporal, celulas, tejidos, sangre o espiracion.

10. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 9, en donde la modificacion del receptor es al menos una seleccionada del grupo que consiste en la eliminacion del receptor, la inhibicion de la expresion o funcion del receptor y la alta expresion o alta funcionalizacion del receptor.

11. Uso de un kit para detectar o identificar cancer, en el que el kit comprende nematodos.

12. El uso de acuerdo con la reivindicacion 11, en donde el nematodo es:

(a) Caenorhabditis elegans; y/o

(b) un nematodo de tipo silvestre, un nematodo mutante o un nematodo transgenico.

13. Uso de un sistema para detectar cancer, en donde el sistema comprende:

un nematodo,

una parte de almacenamiento para almacenar una sustancia relacionada con la biologfa o un producto procesado de la misma y el nematodo, y

una parte de deteccion para detectar la reaccion del nematodo a un olor en la parte de almacenamiento.