WO2018181869A1 - 線虫変異体を含むがんの診断薬および該変異体を用いた走性行動評価方法 - Google Patents

線虫変異体を含むがんの診断薬および該変異体を用いた走性行動評価方法 Download PDF

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cancer
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崇亮 広津
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株式会社Ｈｉｒｏｔｓｕバイオサイエンス
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/483—Physical analysis of biological material
    • G01N33/487—Physical analysis of biological material of liquid biological material
    • G01N33/493—Physical analysis of biological material of liquid biological material urine

Definitions

  • the present invention provides a diagnostic agent for cancer containing a nematode mutant and a method for evaluating chemotaxis behavior using the mutant.
  • Patent Document 1 describes that a cancer patient could be detected with 100% sensitivity and 95% specificity by a medium-scale test of 242 specimens.
  • the present inventors have been developing technology for extracting healthy individuals who are false positives in the evaluation based on the above-mentioned chemotaxis behavior.
  • the present inventors are a nematode registered as an AB1 strain in Caenorhabditis Genetics Center (CGC) of the Department of Biological Sciences of the University of Minnesota, USA.
  • CGC Caenorhabditis Genetics Center
  • the AB1 strain showed an attracting action on the urine of a healthy person who became false positive in a test using a wild strain.
  • the present invention is based on these findings.
  • composition according to (3) above which is used for detecting a false positive target.
  • composition according to (2) above wherein at least one of a wild type strain and an AB1 strain is labeled.
  • (6) A method for determining whether a subject has cancer or not, Observing the chemotaxis behavior of AB1 strains on the subject's urine; Determining that the subject from which the urine from which the AB1 strain has shown an attractive behavior is derived from or likely to be healthy.
  • the subject derived from urine that has induced attracting behavior in both the wild strain and the AB1 strain further comprises determining that the subject is not suffering from or likely to have cancer. The method described.
  • FIG. 1 shows a plan view of a petri dish 1 used for behavior evaluation of nematodes described in Example 1.
  • FIG. FIG. 2 shows the chemotaxis index of wild strain and AB1 strain against urine of various cancer patients.
  • subject means a mammal, for example, a primate (eg, monkey, chimpanzee, gorilla, bonobo, orangutan, marmoset, and human), eg, a human.
  • a primate eg, monkey, chimpanzee, gorilla, bonobo, orangutan, marmoset, and human
  • the subject is preferably a human.
  • “subject” is used in a sense that includes healthy subjects, subjects suspected of having cancer, and subjects suffering from cancer.
  • cancer means a malignant tumor.
  • Cancers can be broadly classified into hematopoietic tumors, epithelial cancers (carcinoma), and non-epithelial sarcomas (sarcoma). Examples of hematopoietic tumors include leukemia, malignant lymphoma, and myeloma.
  • Epithelial cancers include lung cancer, breast cancer, stomach cancer, colon cancer, uterine cancer, ovarian cancer, head and neck cancer, and tongue cancer.
  • Sarcomas include osteosarcoma, chondrosarcoma, rhabdomyosarcoma, leiomyosarcoma, fibrosarcoma, liposarcoma, and angiosarcoma.
  • cancer includes early stage cancers such as stage 0 early stage cancer and stage 1 early stage cancer.
  • composition for use in cancer diagnosis is sometimes simply referred to as “cancer diagnostic agent”.
  • nematode means Caenorhabditis elegans . Nematodes can be transferred to the Caenorhabditis Genetics Center (CGC) at the University of Minnesota's Department of Biological Sciences. Thus, those skilled in the art can obtain most known strains from CGC. From the viewpoint of being able to reproduce by self-fertilization, hermaphrodite can be preferably used.
  • CGC Caenorhabditis Genetics Center
  • running behavior means attracting behavior or avoidance behavior. Attracting behavior means behavior that shortens the physical distance from a certain substance, and repelling behavior means behavior that widens the physical distance from a certain substance. Substances that induce attraction behavior are called attractants, and substances that induce repellent behavior are called repellent substances. Nematodes have the property of attracting attractants by olfaction and repelling repellents. The act of attracting an attracting substance is called an attracting action (sometimes referred to as “positive” in the present specification), and an action repelling from a repellent substance is referred to as a repelling action (sometimes referred to as “negative” in this specification). . In addition, attracting behavior and repelling behavior are collectively referred to as chemotaxis behavior.
  • wild strain is a wild strain of a nematode, for example, an N2 Bristol strain.
  • the wild strain in the present specification can be a strain that exhibits attracting behavior in urine obtained from a subject having cancer and exhibits repellent behavior in urine obtained from a subject not having cancer.
  • AB1 strain refers to a nematode strain registered as AB1 (registration number 5459) in CGC (see WBG 10 (2) 140-141 and WBG 8 (2) 52). It is considered to be a nematode mutant isolated from nature.
  • the present inventors show an attracting action on the urine of cancer patients and a repelling action on the urine of healthy persons. Therefore, it is possible to determine whether the subject from which urine is derived is a cancer patient or a healthy person based on the chemotaxis behavior of the nematode.
  • the chemotaxis behavior of nematodes is examined in more detail, it is clear that there are cases of attracting behavior (hereinafter also referred to as “false positives”) even though they are healthy at a certain rate. It has become.
  • false negatives we tested various nematode strains. As a result, it succeeded in isolating a strain (AB1 strain) that exhibits attracting behavior against false positives.
  • the method of analyzing urine using the nematode chemotaxis behavior evaluation system is to analyze a test sample (eg, urine) obtained from a subject and a nematode. It can be performed by locating a certain distance and observing whether the nematode exhibits an attracting action or a repelling action with respect to the test sample. And when a wild strain shows attraction behavior, it can be evaluated that the subject is suffering from or possibly has cancer. In this way, WO2015 / 088039 was able to detect cancer patients with 100% sensitivity and 95% specificity by a medium-scale test of 242 specimens.
  • a test sample eg, urine
  • a method for analyzing urine using a nematode chemotaxis behavior evaluation system is, for example, Placing a test sample (eg, urine) obtained from a subject in a petri dish (eg, a petri dish into which a solid medium has been introduced); Placing nematodes in a petri dish where the test sample is placed at a position away from the test sample; After placement, make the nematode act, If the nematode exhibits chemotaxis behavior on the test sample, assess that the subject is or may be affected by cancer, Can be included.
  • a test sample eg, urine
  • a petri dish eg, a petri dish into which a solid medium has been introduced
  • Placing nematodes in a petri dish where the test sample is placed at a position away from the test sample. After placement, make the nematode act, If the nematode exhibits chemotaxis behavior on the test sample, assess that the subject is
  • the chemotactic behavior of a nematode can be evaluated by the difference or ratio between the number of nematodes approaching the test sample and the number of nematodes far from the test sample. In the case of evaluation based on the difference in the number of nematodes, if the difference is a positive value, the test sample as a whole induces attracting behavior and is derived from a cancer patient. If it can be evaluated and is a negative value, the test sample as a whole induces repellent behavior and can be evaluated to be derived from a healthy person. Moreover, the chemotaxis behavior of a nematode can be evaluated using, for example, the chemotaxis index as an index as follows. ⁇ In the formula, A is the number of nematodes that have attracted the test sample, and B is the number of nematodes that have repelled the test sample. ⁇
  • the test sample as a whole induces attracting behavior and can be evaluated to be derived from a cancer patient and is a negative value
  • the test sample as a whole induces repellent behavior and can be evaluated to be derived from a healthy person.
  • Nematodes may be labeled by genetic modification techniques.
  • the label include a fluorescent protein, and a nematode that expresses the fluorescent protein emits fluorescence of a specific wavelength by irradiating excitation light of a specific wavelength, and can identify an individual.
  • fluorescent protein Green fluorescent protein (GFP), yellow fluorescent protein (YFP), blue fluorescent protein (CFP), and GCaMP are mentioned.
  • the nematode AB1 strain Unlike the wild strain, the nematode AB1 strain exhibits repellent behavior against cancer patients and healthy individuals. However, the AB1 strain exhibits an attracting behavior for some healthy individuals. The urine showing the attracting behavior was the urine of the subject diagnosed as a healthy person by doctors. Therefore, it is highly possible that a subject who is positive in the AB1 strain is a healthy person. Therefore, in the present invention, the AB1 strain can be used for evaluating whether or not the subject suffers from cancer based on the chemotaxis behavior of the subject against urine.
  • the present invention is a composition containing a nematode for use in evaluating whether or not a subject is suffering from cancer based on chemotaxis behavior with respect to urine of the subject, Is a strain AB1.
  • the present invention provides a composition containing the AB1 strain, which is used for detecting healthy individuals in cancer diagnosis.
  • the AB1 strain can be used to determine whether the subject is positive in the wild strain or not.
  • the present invention is a composition containing a nematode for use in evaluating whether or not a subject is suffering from cancer based on chemotaxis behavior with respect to urine of the subject, Provides a composition wherein is a mixture of a wild type strain and an AB1 strain.
  • the present invention is also a composition comprising a nematode for use in evaluating whether or not a subject suffers from cancer based on chemotaxis behavior of the subject against urine,
  • chemotaxis behavior with respect to urine can be evaluated as follows using the AB1 strain, for example.
  • the AB1 strain exhibits an attracting action on the urine of some healthy individuals. Therefore, the AB1 strain can be used to detect urine of a healthy person.
  • the evaluation method can be implemented as follows, for example. First, the chemotaxis behavior of the AB1 strain with respect to the subject's urine (ie, urine obtained from the subject) is observed.
  • the urine in which the AB1 strain has shown an attraction behavior is or may be urine obtained from a healthy person. Therefore, it can be determined (or evaluated, predicted, inferred, or diagnosed) that the subject from which the urine from which the AB1 strain has been attracted is derived from or is likely to be healthy. . That is, it is indicated that the subject from which the urine from which the AB1 strain has attracted is derived from a healthy person.
  • AB1 strain is positive in subjects that showed false positives in the chemotaxis behavior evaluation test using other wild nematode strains, and negative in other subjects. Therefore, the AB1 strain can also be used to detect a subject that is false positive or likely from a subject that is positive in the chemotaxis behavior evaluation using other wild nematode strains.
  • the evaluation method can be performed, for example, as described below in the evaluation method (A) or (B).
  • the chemotaxis behavior of the wild strain with respect to the urine of the subject is observed.
  • the urine from which the wild strain has attracted ie, “positive” urine
  • the chemotaxis behavior of the AB1 strain against the positive urine is observed.
  • the urine in which the AB1 strain has shown an attraction behavior is or may be urine obtained from a healthy person. Therefore, it can be determined (or evaluated, predicted, inferred, or diagnosed) that the subject from which the urine from which the AB1 strain has been attracted is derived is or is likely to be false positive. . That is, it is indicated that the subject from which the urine from which the AB1 strain has attracted is derived from a healthy person.
  • Evaluation method (B) In the said evaluation method (A), it tested using the wild type nematode (wild strain) and AB1 strain separately.
  • a wild strain and an AB1 strain are mixed and used.
  • the wild strain and the AB1 strain can be cultured separately.
  • a wild strain and an AB1 strain can be mixed and used at the time of behavioral evaluation.
  • the wild strain and the AB1 strain are not particularly limited, but can be used in a mixed quantity ratio of 2: 1 to 1: 2, preferably about 1: 1.
  • a wild strain and AB1 strain are not specifically limited, they can be cultured under the same conditions.
  • the wild strain and AB1 strain can also be mixed together and cultured.
  • the wild strain and the AB1 strain can be mixed and cultured together during culturing.
  • the wild strain and the AB1 strain are not particularly limited, but can be mixed and cultured in a quantity ratio of 2: 1 to 1: 2, preferably in a quantity ratio of about 1: 1. Since the AB1 strain has almost the same growth rate as the wild strain, when mixed at 1: 1 at the beginning of the culture, the nematode quantity ratio obtained after the culture can be about 1: 1.
  • the AB1 strain can be labeled as a landmark. Although it does not specifically limit as a label, For example, the label
  • Fluorescent proteins can be stably expressed in nematodes by genetic modification techniques.
  • it has the side that AB1 strain
  • a wild strain may be labeled as a landmark.
  • marker which can be visualized for example, a fluorescent label
  • Fluorescent proteins can be stably expressed in nematodes by genetic modification techniques. The label can be introduced into either the wild strain or AB1, or both. When both wild and AB1 strains are labeled, the wild strain and AB1 strain can be distinguishably labeled.
  • chemotaxis behavior can be observed using the urine of the subject and the nematode mixture obtained above.
  • a subject derived from urine that has induced attracting behavior in both the wild strain and the AB1 strain is not suffering from cancer or may not suffer from cancer (or evaluation) Predict, guess, or diagnose). That is, it is indicated that the subject from which the urine from which the AB1 strain has attracted is derived does not have cancer or may not have cancer.
  • the evaluation method (B) determines that a subject from which urine from which a wild strain induces attracting behavior and an AB1 strain induces repellent behavior is suffering from or is likely to have cancer ( (Evaluating, predicting, inferring, or diagnosing) may be further included.
  • the evaluation method (B) also determines (or evaluates, predicts) that the subject from which urine that induced repellent behavior in both the wild strain and the AB1 strain is or is likely to be healthy. Inferring or diagnosing). That is, it is indicated that the subject from which the urine from which the AB1 strain has attracted is derived from a healthy person.
  • the composition containing the AB1 strain of the present invention can be used.
  • prevention and / or treatment of cancer comprising administering an anticancer agent to a subject suffering from or determined to be highly likely to have cancer by the above method of the present invention.
  • a method is provided.
  • the method for preventing and / or treating cancer further comprises determining that the subject derived from urine to which the AB1 strain has been attracted is suffering from or likely to have cancer. obtain.
  • Example 1 Investigation of chemotaxis behavior based on olfaction using different nematode strains
  • chemotaxis behavior based on olfaction was evaluated using different strains isolated from various soils.
  • Nematode strains were purchased from Caenorhabditis Genetics Center (CGC) to evaluate chemotaxis behavior based on the olfactory sense of nematodes. Specifically, the nematodes were raised using the NGM plates described in Table 1 below.
  • urine samples from various cancer patients were used. More specifically, breast cancer, stomach cancer, bile duct cancer, colorectal cancer, cecum, prostate cancer, pancreatic cancer, lung cancer, and healthy subjects (including false positive healthy subjects) 10 times each Or it was used after diluting 100 times.
  • Each nematode was cultured at 20 ° C. for 4 days.
  • the plates used in the examples are shown in FIG. In FIG. 1, the odor substance was applied to the sample arrangement site 5 of the plate, the nematode was arranged on the nematode arrangement site 3 of the plate, and then the behavior of the nematode was observed at 23 ° C.
  • the strain was AB1.
  • the AB1 strain is a strain that was isolated in 1984 and registered with CGC, and is available from CGC.
  • the AB1 strain is a mutant that exhibits a behavior different from that of the wild strain in the attraction based on olfaction.
  • the results also show that the normal wild strains show attracting behavior, the AB1 strain shows repellent behavior is positive, and the normal wild strain and AB1 strain show repellent behavior are false positives.
  • AB1 strain was fluorescently labeled. Specifically, AB1 strain that emits fluorescence was produced by expressing green fluorescent protein (GFP) in the body wall muscle of AB1 strain and irradiating it with excitation light. Specifically, a plasmid containing a gene operably linked to the GFP gene downstream of the myo-3 promoter was injected into the AB1 gonad to obtain a transformant. Plasmids injected with ⁇ -rays of this strain were integrated into the chromosome.
  • GFP green fluorescent protein
  • the chemotaxis index for urine of cancer patients is a positive value, showing attraction behavior, Indicates negative behavior and repellent behavior.
  • the AB1 strain it was revealed that the chemotaxis index was negative in both the urine of cancer patients and the urine of healthy subjects, and showed repellent behavior.
  • the test was carried out with 8 wild strains, all of which showed the same chemotaxis behavior as the N2 Bristol strain.

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Abstract

本発明は、線虫変異体ＡＢ１株を含むがんの診断薬および該変異体を用いた走性行動評価方法を提供する。

Description

線虫変異体を含むがんの診断薬および該変異体を用いた走性行動評価方法
　本発明は、線虫変異体を含むがんの診断薬および該変異体を用いた走性行動評価方法を提供する。
　線虫は、がん患者の尿に対して誘引行動を示し、健常者の尿に対して忌避行動を示す。従って、線虫の走性行動に基づいて尿が由来する対象が、がん患者であるのか、健常者であるのかを判別することができる（特許文献１）。より具体的には、特許文献１には、２４２検体の中規模試験により、がん患者を１００％の感度および９５％の特異度で検出することができたことが記載されている。
ＷＯ２０１５／０８８０３９
　本発明者らは、上記走性行動に基づく評価において偽陽性となる健常者を抽出するための技術開発を行っていた。本発明者らは、米国ミネソタ大学の生物科学部のCaenorhabditis Genetics Center (CGC)にＡＢ１株として登録された線虫が、線虫の変異体であり、通常はがん患者および健常者において忌避行動を示すが、一部の健常者において誘引行動を示すことを見出した。また、ＡＢ１株は、野生株を用いた検査で偽陽性となる健常者の尿に対しては、誘引行動を示した。本発明は、これらの知見に基づく発明である。
　すなわち、本発明によれば、以下の発明が提供される。
（１）対象ががんに罹患しているか否かを対象の尿に対する走性行動に基づいて評価することに用いるための、線虫を含む組成物であって、線虫がＡＢ１株である、組成物。
（２）対象ががんに罹患しているか否かを対象の尿に対する走性行動に基づいて評価することに用いるための、線虫を含む組成物であって、線虫が野生型株とＡＢ１株との混合物である、上記（１）に記載の組成物。
（３）野生株が誘引行動を示した尿を対象とする、上記（１）に記載の組成物。
（４）偽陽性の対象を検出することに用いるための、上記（３）に記載の組成物。
（５）野生型株およびＡＢ１株のいずれか少なくとも１つが標識されている、上記（２）に記載の組成物。
（６）対象ががんに罹患しているか否かを決定する方法であって、
　対象の尿に対するＡＢ１株の走性行動を観察することと、
　ＡＢ１株が誘引行動を示した尿が由来する対象は、健常者である、またはその可能性があると決定することと
を含む、方法。
（７）対象ががんに罹患しているか否かを決定する方法であって、
　対象の尿に対する線虫の野生株とＡＢ１株の走性行動を観察することと、
　野生株およびＡＢ１株の両方で誘引行動を誘発した尿が由来する対象はがんに罹患してない、またはその可能性がある、と決定することと
を含む、方法。
（８）野生株およびＡＢ１株の両方で誘引行動を誘発した尿が由来する対象は、がんに罹患していない、またはその可能性があると決定することをさらに含む、上記（７）に記載の方法。
（９）線虫の野生株とＡＢ１株との混合物を培養することをさらに含む、上記（８）に記載の方法。
（１０）野生型株およびＡＢ１株のいずれか少なくとも１つが標識されている、上記（９）に記載の方法。
図１は、実施例１に記載した線虫の行動評価に用いたシャーレ１の平面図を示す。 図２は、各種がん患者の尿に対する野生株とＡＢ１株の走性インデックスを示す。
発明の具体的な説明
　本明細書では、「対象」とは、哺乳動物を意味し、例えば、霊長類（例えば、サル、チンパンジー、ゴリラ、ボノボ、オランウータン、マーモセット、およびヒト）、例えば、ヒトを意味する。本明細書では、対象は好ましくはヒトである。また、本明細書では、「対象」には、健常者、がんであると疑われる対象およびがんに罹患している対象が含まれる意味で用いられる。
　本明細書では、「がん」は、悪性腫瘍を意味する。がんには、造血器腫瘍、上皮癌（カルシノーマ）、および非上皮性の肉腫（サルコーマ）に大きく分類され得る。造血器腫瘍としては、白血病、悪性リンパ腫、および骨髄腫などが挙げられる。上皮癌としては、肺がん、乳がん、胃がん、大腸がん、子宮がん、卵巣がん、頭頸部がん、および舌がんが挙げられる。肉腫としては、骨肉腫、軟骨肉腫、横紋筋肉腫、平滑筋肉腫、線維肉腫、脂肪肉腫、および血管肉腫が挙げられる。本明細書では、「がん」は、ステージ０の早期がん、およびステージ１の早期がんなどの早期がんを含む。
　本明細書では、「がん診断に用いるための組成物」を単に「がんの診断薬」ということがある。
　本明細書では、「線虫」とは、カエノラブディチス・エレガンス（Caenorhabditis elegans）を意味する。線虫は、米国ミネソタ大学の生物科学部のCaenorhabditis Genetics Center (CGC)に様々な環境から単離された株が登録および公開され、分譲可能である。従って、当業者であれば、知られているほとんどの株をCGCから入手することができる。自家受精により繁殖できるという観点では、雌雄同体が好ましく用いられ得る。
　本明細書では、「走性行動」とは、誘引行動または忌避行動を意味する。誘引行動とは、ある物質からの物理的距離を縮める行動を意味し、忌避行動とは、ある物質からの物理的距離を広げる行動を意味する。誘引行動を誘発する物質を誘引物質といい、忌避行動を誘発する物質を忌避物質という。線虫は嗅覚により誘引物質に対して誘引し、忌避物質から忌避するという性質を有している。誘引物質に対して誘引する行動を誘引行動（本明細書では「陽性」ということがある）といい、忌避物質から忌避する行動を忌避行動（本明細書では「陰性」ということがある）という。また、誘引行動と忌避行動とを合わせて走性行動という。
　本明細書では、「野生株」とは、線虫の野生株であり、例えば、Ｎ２　Ｂｒｉｓｔｏｌ株が挙げられる。本明細書における野生株は、がんを有する対象から得られた尿には誘引行動を示し、がんを有しない対象から得られた尿には忌避行動を示す株とすることができる。
　本明細書では、「ＡＢ１株」とは、ＣＧＣにおいてＡＢ１（登録番号５４５９）として登録されている線虫株を指す（WBG 10(2) 140-141、及びWBG 8(2) 52参照）。天然から分離された線虫の変異体であると考えられる。
　本発明者らは、既にＷＯ２０１５／０８８０３９で示したように、線虫は、がん患者の尿に対して誘引行動を示し、健常者の尿に対して忌避行動を示す。従って、線虫の走性行動に基づいて尿が由来する対象が、がん患者であるのか、健常者であるのかを判別することができる。ところが、線虫の走性行動をより詳細に調べると、一定の割合で健常者であるにも関わらず、誘引行動を示す場合（以下、「偽陽性」ともいう）が存在することが明らかとなってきた。偽陰性を検出するため、本発明者らは様々な線虫株を試験した。その結果、偽陽性に対して誘引行動を示す株（ＡＢ１株）を単離することに成功した。
線虫の走性行動評価系を用いた尿の分析方法
　線虫の走性行動評価系を用いた尿の分析方法は、対象から得られた被検試料（例えば、尿）と線虫とを一定距離離して配置し、線虫が被検試料に対して誘引行動を示すか、忌避行動を示すかを観察することによって行うことができる。そして、野生株が誘引行動を示した場合には、対象は、がんに罹患している、またはその可能性があると評価することができる。このようにして、ＷＯ２０１５／０８８０３９では、２４２検体の中規模試験により、がん患者を１００％の感度および９５％の特異度で検出することができた。
　より詳細には、線虫の走性行動評価系を用いた尿の分析方法は例えば、
　シャーレ（例えば、固形培地を導入したシャーレ）に対象から得られた被検試料（例えば、尿）を配置することと、
　被検試料が配置されたシャーレに、被検試料と一定距離離れた位置に線虫を配置することと、
　配置後、線虫に行動させることと、
　線虫が被検試料に対して走性行動を示した場合には、対象ががんに罹患している、またはがんに罹患している可能性があると評価することと、
を含みうる。
　線虫の走性行動は、被検試料に近づいた線虫数と被検試料から遠のいた線虫数の差や比により評価することができる。線虫数の差に基づく評価の場合には、差が正の値である場合には、全体として被検試料は、誘引行動を誘発するものであり、がん患者に由来するものであると評価することができ、負の値である場合には、全体として被検試料は、忌避行動を誘発するものであり、健常者に由来するものであると評価することができる。また、線虫の走性行動は、例えば、以下のように走性インデックスを指標として評価することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000001
 ｛式中、Ａは、被検試料に対して誘引行動を示した線虫の数であり、Ｂは、被検試料に対して忌避行動を示した線虫の数である。｝
　走性インデックスが正の値である場合には、全体として被検試料は、誘引行動を誘発するものであり、がん患者に由来するものであると評価することができ、負の値である場合には、全体として被検試料は、忌避行動を誘発するものであり、健常者に由来するものであると評価することができる。
　線虫は、遺伝子改変技術により標識してもよい。標識としては、例えば、蛍光タンパク質が挙げられ、蛍光タンパク質を発現する線虫は、特定波長の励起光を照射することで特定波長の蛍光を発し、個体を特定することができる。蛍光タンパク質としては、特に限定されないが、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、ＧＣａＭＰが挙げられる。
ＡＢ１株について
　線虫のＡＢ１株は、野生株とは異なり、がん患者および健常者に対して忌避行動を示す。しかし、ＡＢ１株は一部の健常者に対しては誘引行動を示す。誘引行動を示す尿は、医師らにより健常者であると診断された対象の尿であった。従って、ＡＢ１株で陽性を示した対象は、健常者である可能性が高い。
　従って、本発明では、ＡＢ１株を対象ががんに罹患しているか否かを対象の尿に対する走性行動に基づいて評価することに用いるために用いることができる。この側面では、本発明は、対象ががんに罹患しているか否かを対象の尿に対する走性行動に基づいて評価することに用いるための、線虫を含む組成物であって、線虫がＡＢ１株である、組成物を提供するものである。言い換えると、本発明では、ＡＢ１株を含む組成物であって、がん診断において健常者を検出することに用いるための組成物が提供される。
　一方で、ＡＢ１株で陽性を示した対象は、通常の野生株を用いた評価では陽性であり、偽陽性の対象であった。従って、ＡＢ１株で陽性を示し、通常の野生株で陽性である対象は、偽陽性である可能性が高い。
　従って、本発明では、野生株で陽性である対象に対して、偽陽性であるか否かを判別することに、ＡＢ１株を用いることができる。この側面では、本発明は、対象ががんに罹患しているか否かを対象の尿に対する走性行動に基づいて評価することに用いるための、線虫を含む組成物であって、線虫が野生型株とＡＢ１株との混合物である、組成物を提供するものである。本発明はまた、本発明は、対象ががんに罹患しているか否かを対象の尿に対する走性行動に基づいて評価することに用いるための、線虫を含む組成物であって、線虫がＡＢ１株であり、対象が、線虫の野生株を用いた当該患者の尿に対して誘引行動を誘発した対象である、組成物を提供するものである。
ＡＢ１株を用いた尿に対する走性行動の評価方法（１）
　本発明では、ＡＢ１株を用いて尿に対する走性行動を、例えば、以下のように評価することができる。
　ＡＢ１株は、一部の健常者の尿に対して誘引行動を示す。従って、ＡＢ１株は、健常者の尿を検出することに用いることができる。評価方法は、例えば、以下の通り実施できる。
　まず、対象の尿（すなわち、対象から得られた尿）に対するＡＢ１株の走性行動を観察する。ＡＢ１株が誘引行動を示した尿は、健常者から得られた尿である、またはその可能性がある。従って、ＡＢ１株が誘引行動を示した尿が由来する対象は、健常者である、またはその可能性があると決定する（または、評価する、予測する、推測する、若しくは診断する）ことができる。すなわち、ＡＢ１株が誘引行動を示した尿が由来する対象は、健常者である、またはその可能性があると示される。
ＡＢ１株を用いた尿に対する走性行動の評価方法（２）
　本発明では、ＡＢ１株は、他の線虫野生株を用いた走性行動評価試験において偽陽性を示した対象において陽性を示し、その他の対象においては陰性を示す。従って、ＡＢ１株は、他の線虫野生株を用いた走性行動評価で陽性であった対象から偽陽性である、またはその可能性がある対象を検出することにも、用いることができる。評価方法は、例えば、以下評価方法（Ａ）または（Ｂ）の通り実施できる。
評価方法（Ａ）
　まず、対象の尿（すなわち、対象から得られた尿）に対する野生株の走性行動を観察する。野生株が誘引行動を示した尿（すなわち、「陽性」の尿）は、がん患者の尿である可能性が高い。ここで、上記陽性である尿に対するＡＢ１株の走性行動を観察する。ＡＢ１株が誘引行動を示した尿は、健常者から得られた尿である、またはその可能性がある。従って、ＡＢ１株が誘引行動を示した尿が由来する対象は、偽陽性である、またはその可能性があると決定する（または、評価する、予測する、推測する、若しくは診断する）ことができる。すなわち、ＡＢ１株が誘引行動を示した尿が由来する対象は、健常者である、またはその可能性があると示される。
評価方法（Ｂ）
　上記評価方法（Ａ）では、野生型線虫（野生株）とＡＢ１株とを別々に用いて試験した。評価方法（Ｂ）では、野生株とＡＢ１株とを混合して用いる。
　野生株とＡＢ１株とは、別々に培養することができる。別々に培養する場合には、行動評価時に、野生株とＡＢ１株とを混合して用いることができる。野生株とＡＢ１株とは、特に限定されないが２：１～１：２の数量比で、好ましくは略１：１の数量比で混合して用いることができる。また、野生株とＡＢ１株とは、特に限定されないが同一条件下で培養することができる。
　野生株とＡＢ１株とは、一緒に混ぜて培養することもできる。一緒に培養する場合には、培養時に野生株とＡＢ１株とを混合して、一緒に培養することができる。野生株とＡＢ１株とは、特に限定されないが２：１～１：２の数量比で、好ましくは略１：１の数量比で混合して培養することができる。ＡＢ１株は、野生株と増殖速度がほぼ同じであるので、培養開始時に１：１で混合すると、培養後に得られる線虫数量比も１：１程度となり得る。
　ＡＢ１株は、目印として標識しておくことができる。標識としては、特に限定されないが例えば、可視化できる標識、例えば、蛍光標識、より好ましくは蛍光タンパク質による標識を用いることができる。蛍光タンパク質は、遺伝子改変技術によって線虫に安定発現させることができる。なお、本発明では、蛍光タンパク質を発現するＡＢ１株が提供されるという側面も有している。あるいは、野生株を目印として標識してもよい。標識としては、特に限定されないが例えば、可視化できる標識、例えば、蛍光標識、より好ましくは蛍光タンパク質による標識を用いることができる。蛍光タンパク質は、遺伝子改変技術によって線虫に安定発現させることができる。標識は、野生株若しくはＡＢ１のいずれか一方または両方に導入することができる。野生株およびＡＢ１株の両方を標識する場合は、野生株およびＡＢ１株が区別可能に標識され得る。
　その後、対象の尿と上記で得られた線虫混合物とを用いて走性行動を観察することができる。その結果、野生株およびＡＢ１株の両方で誘引行動を誘発した尿が由来する対象はがんに罹患してない、またはがんに罹患していない可能性がある、と決定する（または、評価する、予測する、推測する、若しくは診断する）ことができる。すなわち、ＡＢ１株が誘引行動を示した尿が由来する対象は、がんに罹患してない、またはがんに罹患していない可能性があると示される。
　上記評価方法（Ｂ）は、野生株が誘引行動を誘発し、ＡＢ１株が忌避行動を誘発した尿が由来する対象は、がんに罹患している、またはその可能性が高いと決定する（または、評価する、予測する、推測する、若しくは診断する）ことをさらに含んでいてもよい。上記評価方法（Ｂ）はまた、野生株もＡＢ１株も忌避行動を誘発した尿が由来する対象は、健常者である、またはその可能性が高いと決定する（または、評価する、予測する、推測する、若しくは診断する）ことをさらに含んでいてもよい。すなわち、ＡＢ１株が誘引行動を示した尿が由来する対象は、健常者である、またはその可能性があると示される。
　上記のＡＢ１株を用いた尿に対する走性行動の評価方法においては、本発明のＡＢ１株を含む組成物を用いることができる。
　本発明では、本発明の上記方法によってがんに罹患している、またはその可能性が高いと決定された対象に、抗がん剤を投与することを含む、がんの予防および／または治療方法が提供される。この態様では、がんの予防および／または治療方法は、ＡＢ１株が誘引行動を示した尿に由来する対象をがんに罹患している、またはその可能性が高いと決定することをさらに含み得る。
　以下、実施例に基づいて本発明を説明する。
実施例１：異なる複数の線虫株を用いた嗅覚に基づく走性行動の調査
　本実施例では、様々な土壌から単離された異なる複数株を用いて嗅覚に基づく走性行動を評価した。
　線虫株をCaenorhabditis Genetics Center (CGC)から購入して、線虫の嗅覚に基づく走性行動を評価した。具体的には、線虫の飼育は、以下表１に記載のＮＧＭプレートを用いて行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　また、線虫の走性行動評価は、以下表２に記載のアッセイプレート（径５ｃｍまたは９ｃｍシャーレ）を用いて行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　匂い物質としては、各種がん患者の尿サンプルを用いた。より具体的には、乳がん、胃がん、胆管がん、大腸がん、盲腸、前立腺がん、膵臓がん、肺がん、および健常者（偽陽性の健常者を含む）のそれぞれの尿検体を10倍ないしは100倍に希釈して使用した。
　それぞれの線虫を２０℃で４日間培養した。実施例で用いたプレートを図１に示す。図１における、プレートのサンプル配置部位５の箇所に上記匂い物質を塗布し、プレートの線虫配置部位３に線虫を配置して、その後２３℃において線虫の行動観察を行った。
　線虫を配置した３０分後に領域２および領域４に存在する線虫数をカウントし、以下式により走性インデックスを求めた。
　（走性インデックス）＝｛Ｎ（２）－Ｎ（４）｝／｛Ｎ（２）＋Ｎ（４）｝
｛式中、Ｎ（２）は、図１の領域２に分布した線虫の数であり、Ｎ（４）は、図１の領域４に分布した線虫の数である。｝
　その結果、通常の線虫の野生株は、がん患者の尿に対して誘引して近づき、健常者の尿に対して忌避して遠ざかる行動を示す。しかしながら、発明者らは、線虫株の中から、がん患者の尿に対しても健常者の尿に対しても忌避行動を示す株を見出した。その株は、ＡＢ１という株であった。ＡＢ１株は、１９８４年に単離され、ＣＧＣに登録された株であり、ＣＧＣから入手可能である。
　ＡＢ１株の行動をさらに評価したところ、他の野生株が誘引行動を示してしまう偽陽性の健常者の尿に対して、誘引行動を示すことが分かった。
　この結果から、ＡＢ１株は嗅覚に基づく誘引行動において野生株とは異なる挙動を示す変異体であることが明らかとなった。
　この結果からはまた、通常の野生株では誘引行動を示し、ＡＢ１株が忌避行動を示すものは、陽性であることが示され、通常の野生株でもＡＢ１株でも忌避行動を示すものは偽陽性であることが示されることが理解できる。
　次に、ＡＢ１株を蛍光標識した。具体的には、ＡＢ１株の体壁筋に緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現させ、励起光を照射することで蛍光を発するＡＢ１株を作成した。具体的には、ｍｙｏ－３プロモーター下流にＧＦＰ遺伝子を作動可能に連結した遺伝子を含むプラスミドをＡＢ１株の生殖腺にインジェクションし、形質転換体を得た。この株にγ線を照射してインジェクションしたプラスミドを染色体にインテグレートさせた。
　さらに、標識したＡＢ１株の成虫と野生株の成虫のそれぞれ同数を餌をまいた寒天培地に播種し、３～５日後に標識したＡＢ１株と野生株とを含む混合物を得た。それぞれが約半数であることを確認し、これを走性行動評価に用いた。行動評価では、可視光およびＧＦＰの励起光照射下で線虫を観察し、それぞれの走性インデックスを求めることができた。結果は図２に示される通りであった。
　図２に示されるように、通常の野生株（図１ではN2　Bristol株）では、がん患者の尿に対する走性インデックスが正の値であり、誘引行動を示し、健常者の尿に対しては、走性インデックスが負の値であり、忌避行動を示す。これに対して、ＡＢ１株では、がん患者の尿に対しても健常者の尿に対しても、走性インデックスが負の値であり、忌避行動を示すことが明らかとなった。また、Ｎ２　Ｂｒｉｓｔｏｌ株の他に８種類の野生株で試験を行ったが、全てＮ２　Ｂｒｉｓｔｏｌ株と同様の走性行動を示した。
　このようにして、ＡＢ１と通常の野生株とを用いることにより偽陽性の割合を低減することが可能となり、評価精度が向上することが期待できる。

Claims (10)

  1. 　対象ががんに罹患しているか否かを対象の尿に対する走性行動に基づいて評価することに用いるための、線虫を含む組成物であって、線虫がＡＢ１株である、組成物。
  2. 　対象ががんに罹患しているか否かを対象の尿に対する走性行動に基づいて評価することに用いるための、線虫を含む組成物であって、線虫が野生型株とＡＢ１株との混合物である、請求項１に記載の組成物。
  3. 　野生株が誘引行動を示した尿を対象とする、請求項１に記載の組成物。
  4. 　偽陽性の対象を検出することに用いるための、請求項３に記載の組成物。
  5. 　野生型株およびＡＢ１株のいずれか少なくとも１つが標識されている、請求項２に記載の組成物。
  6. 　対象ががんに罹患しているか否かを決定する方法であって、
    　対象の尿に対するＡＢ１株の走性行動を観察することと、
    　ＡＢ１株が誘引行動を示した尿が由来する対象は、健常者である、またはその可能性があると決定することと
    を含む、方法。
  7. 　対象ががんに罹患しているか否かを決定する方法であって、
    　対象の尿に対する線虫の野生株とＡＢ１株の走性行動を観察することと、
    　野生株およびＡＢ１株の両方で誘引行動を誘発した尿が由来する対象はがんに罹患してない、またはその可能性がある、と決定することと
    を含む、方法。
  8. 　野生株およびＡＢ１株の両方で誘引行動を誘発した尿が由来する対象は、がんに罹患していない、またはその可能性があると決定することをさらに含む、請求項７に記載の方法。
  9. 　線虫の野生株とＡＢ１株との混合物を培養することをさらに含む、請求項８に記載の方法。
  10. 　野生型株およびＡＢ１株のいずれか少なくとも１つが標識されている、請求項９に記載の方法。
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