KR102247737B1 - 선충의 후각을 이용한 암 검출법 - Google Patents

Abstract

선충을 피검자 유래의 생체 관련 물질 또는 그 처리물의 존재하에서 사육하고, 선충의 후각에 의한 화학 주성을 지표로 하여 암을 검출하는 것을 특징으로 하는 암의 검출 방법.

Description

선충의 후각을 이용한 암 검출법 {CANCER DETECTION METHOD USING SENSE OF SMELL OF NEMATODE}

본 발명은 선충의 후각을 이용한 암 검출 방법에 관한 것이다.

암을 포함하는 악성 신생물은, 1981년부터 일본인의 사인 (死因) 탑을 차지하고 있다. 세계 보건 기구에 의하면, 2005년에 있어서의 세계의 악성 신생물에 의한 사망률은 13 ％ (760 만 명) 를 차지하고, 앞으로도 계속 증가할 것으로 예측되고 있다.

암은, 조기이면 일수록, 진료에 걸리는 정신적·신체적·경제적·사회적 부담이 가볍고, 근치 (根治) 의 가능성도 높다. 진행되면 될수록, 근치의 가능성은 저하되고, 절제 불능의 진행 재발암에 이르러서는, 막대한 부담과 손실 뿐만 아니라 연명 치료가 되는 현실이 있다. 암은 세포의 유전자 이상이 원인이 되어 발생하기 때문에, 대부분의 암에 있어서 인구 10 만 대(對) 각 연령에 있어서의 발생 빈도는 4-6 승에 비례하여 증가한다 (Cancer Patterns in Canada, 1982). 이 때문에, 어느 연령이나 사회에 있어서도, 암을 조기 발견·조기 치료할 수 있으면, 다양한 장면에 있어서 부담과 손실을 작게 할 수 있는 것은 명백하다.

그러나, 조기암에서는 증상이 없는 것이 일반적이고, 진찰자는 암 검진을 받기 위한 모티베이션이 부족한 것이 현실이다. 실제로, 일본의 암 검진 진찰률은 전체에 있어서 10-35 ％ 정도로, 2017년까지 암 검진 진찰률 50 ％ 이상을 목표로 하는 일본의 암 대책 기본 계획의 목표를 크게 밑돌고 있다. 내시경이나 수술 기술 등, 조기암에 대한 치료 기술에서 세계 탑에 있는 일본에 있어서, 고통이 적고, 간단하고 저렴하고, 많은 인간을 대상으로 하여 시행 가능하고 고정밀한 암 검진법이 새롭게 개발·응용되면, 세계의 암 진료에 혁명을 가져온다고 해도 과언은 아니다.

본 발명자들을 포함하여 몇 개 팀에서는, 훈련된 개 (암 탐지견) 를 이용하여, 암에는 특유한 냄새가 있어, 조기암을 포함하는 검체에 대해서 감도·특이도 모두 90 ％ 를 초과하는 높은 정밀도로 검출 가능한 것을 보고해 왔다 (비특허문헌 1：Sonoda, H. et al., Colorectal cancer screening with odour material by canine scent detection. Gut, 60, 814-819, 2011).

이로부터, 암 특유의 냄새를 검출하면, 고정밀도의 암 탐지 시스템의 구축이 가능한 것으로 생각된다.

그러나, 암 탐지견의 능력에는 개체차가 있어, 기온이 상승하는 여름에는 집중력이 저하된다. 또, 탐지견의 훈련 방법에 관해서도 일정한 방법론이 존재하지 않는다. 또한, 암 탐지견의 상태가 갖추어진 상황에서도 1 일에 5 회의 테스트가 한계이다. 무엇보다도, 정답이 전혀 불분명한 검진 목적의 샘플에 있어서 테스트를 계속하는 행위는, 암 탐지견이 잘못된 행동을 취해도 탐지견에게 「볼로 논다」 라고 하는 보수를 제공해 버리기 때문에, 정밀도를 떨어뜨리는 결과가 된다. 따라서, 탐지견을 이용한 암 검진을 업무로서 실시할 수 없다.

또, GC/MS (gas chromatography/mass spectroscopy) 분석 등의 분석 장치를 사용하여 휘발성 물질을 특정하고, 암의 진단을 실시하는 방법이 보고되어 있다 (비특허문헌 2：Y. Hanai, et al., Urinary volatile compounds as biomarkers for lung cancer. Biosci. Biotechnol. Biochem. 76, 679-84, 2012) (비특허문헌 3：Khalid et al., A pilot study combining a GC-sensor device with a statistical model for the identification of bladder cancer from urine headspace. PLoS ONE, 8, e69602, 2013). 그러나, 일상적으로 존재하는 휘발성 물질이 노이즈가 될 가능성이 높고, 검출하기 위한 기기의 개발과 제조에 고액의 자금과 분석 기술이 필요하다.

Sonoda, H. et al., Colorectal cancer screening with odour material by canine scent detection. Gut, 60, 814-819, 2011 Y. Hanai, et al. Urinary volatile compounds as biomarkers for lung cancer. Biosci. Biotechnol. Biochem. 76, 679-84, 2012 Khalid et al., A pilot study combining a GC-sensor device with a statistical model for the identification of bladder cancer from urine headspace. PLoS ONE, 8, e69602, 2013

본 발명은 선충의 후각을 이용한 암의 검출 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명자는, 상기 과제를 해결하기 위해서 예의 연구를 실시한 결과, 선충의 후각에 기초하는 화학 주성 (走性) 또는 후각 신경의 응답에 의해 암을 검출할 수 있는 것을 알아내어, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

즉, 본 발명은 이하와 같다.

(1) 피검자 유래의 생체 관련 물질 또는 그 처리물의 냄새에 대한 선충의 반응을 지표로 하여 암을 검출하는 것을 특징으로 하는 암의 검출 방법.

(2) 선충이 시노랩디티스·엘레강스 (Caenorhabditis elegans) 인 (1) 에 기재된 방법.

(3) 선충이 야생형 선충, 변이형 선충 또는 트랜스제닉 선충인 (1) 또는 (2) 에 기재된 방법.

(4) 피검자 유래의 생체 관련 물질 또는 그 처리물의 냄새에 대해서, 선충이 정 (正) 의 응답을 나타냈을 때는, 피검자가 암인, 또는 암의 리스크가 있다고 판정하는, (1) ∼ (3) 중 어느 한 항에 기재된 방법.

(5) 피검자 유래의 생체 관련 물질 또는 그 처리물의 냄새에 대해서, 선충의 후각 신경의 응답이 클 때는, 피검자가 암인, 또는 암의 리스크가 있다고 판정하는, (1) ∼ (4) 중 어느 한 항에 기재된 방법.

(6) 생체 관련 물질 또는 그 처리물이 체액, 세포, 조직, 또는 세포 혹은 조직의 배양물 혹은 보존액인 (1) ∼ (5) 중 어느 한 항에 기재된 방법.

(7) 체액이 뇨 (尿) 인 (6) 에 기재된 방법.

(8) 보존액이 생리 식염수인 (6) 에 기재된 방법.

(9) 선충을 이용하여 냄새 수용체의 동정 (同定) 을 실시하는 것을 특징으로 하는, 선충에 있어서의 냄새 수용체의 동정 방법.

(10) 상기 수용체를 코드하는 유전자의 발현 또는 기능을 저해하고, 당해 저해된 선충에 있어서의 냄새에 대한 반응을 검사하는 것인 (9) 에 기재된 방법.

(11) 수용체 유전자의 발현 또는 기능 저해가 RNAi 에 의한 것인 (10) 에 기재된 방법.

(12) 냄새가 암종의 냄새인 (9) ∼ (11) 중 어느 한 항에 기재된 방법.

(13) 동정되는 수용체의 종류가 암종에 따라, 또는 냄새 물질의 농도에 의존하여 상이한 것인 (9) ∼ (12) 중 어느 한 항에 기재된 방법.

(14) 선충이 시노랩디티스·엘레강스 (Caenorhabditis elegans) 인 (9) ∼ (13) 중 어느 한 항에 기재된 방법.

(15) 피검자 유래의 생체 관련 물질 또는 그 처리물의 냄새에 대한 선충의 반응을 지표로 하여 암종을 동정하는 것을 특징으로 하는 암종의 동정 방법.

(16) 이하의 공정을 포함하는, (15) 에 기재된 방법：

(a) 상기 (1) ∼ (8) 중 어느 한 항에 기재된 방법에 의해 암을 검출하고,

(b) 상기 공정 (a) 에 있어서 암인 것이 검출된 시료에 대해, 상기 (9) ∼ (14) 중 어느 한 항에 기재된 방법에 의해 동정된 수용체를 개변한 개변체 선충을 이용하여 냄새에 대한 반응을 검사하고,

(c) 상기 개변체 선충과, 상기 공정 (a) 에서 사용한 선충의 사이에서 냄새에 대한 반응이 상이할 때는, 동정된 수용체에 대응하는 암종을 동정의 대상 암종이라고 판정함.

(17) 수용체의 개변이 수용체의 결실 (缺失), 수용체의 발현 또는 기능의 저해, 및 수용체의 고발현 또는 고기능화로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 개인 (16) 에 기재된 방법.

(18) 선충을 포함하는, 암의 검출 또는 동정용 키트.

(19) 선충이 시노랩디티스·엘레강스 (Caenorhabditis elegans) 인 (17) 에 기재된 키트.

(20) 선충이 야생형 선충, 변이형 선충 또는 트랜스제닉 선충인 (18) 또는 (19) 에 기재된 키트.

(21) 선충과,

생체 관련 물질 또는 그 처리물 및 상기 선충을 수용하는 수용부와,

상기 수용부의 선충의 냄새에 대한 반응을 탐지하는 탐지부

를 구비하는 암의 검출 시스템.

본 발명에 의해 선충을 이용한 암의 검출 방법이 제공된다. 본 발명의 방법에 의하면, 암을 고감도로 또한 저비용으로 검출할 수 있다. 또한, 본 발명의 방법은, 샘플의 채취 및 해석이 용이하고, 비용도 저렴하다. 또한, 본 발명의 방법은 조기암을 검출할 수 있다. 따라서, 본 발명의 방법은 암의 임상 검사 등에 매우 유용하다.

도 1 은, 정상인 및 암 환자의 뇨에 대한 선충의 반응 시험 결과를 나타내는 도면이다.
도 2 는, 본 발명의 방법에 사용하는 샬레의 포맷을 나타내는 도면이다.
도 3 은, 인디케이터 유전자로서 황색 카멜레온 (Yellow Cameleon) 유전자를 사용했을 때의 측정 원리를 나타내는 도면이다.
도 4 는, 인디케이터 유전자로서 GCaMP 유전자를 사용했을 때의 측정 원리를 나타내는 도면이다.
도 5 는, 선충을 배치하기 위한 마이크로 유로 (流路) 를 갖는 칩을 나타내는 도면이다.
도 6 은, 마이크로 유로를 갖는 칩 내에서의 유로의 전환을 나타내는 도면이다.
도 7 은, 암 환자 유래의 뇨에 대해서, 선충의 AWC 후각 신경의 반응을 시험한 결과를 나타내는 도면이다.
도 8 은, 암 환자 유래의 뇨에 대해서, 선충의 AWC 후각 신경의 반응을 시험한 결과를 나타내는 도면이다.
도 9 는, 침전물 및 고형물을 제거한 뇨 샘플을 사용하여 선충의 화학 주성을 시험한 결과를 나타내는 도면이다.
도 10 은, 암 환자 유래의 뇨에 대해서, 선충의 AWA 후각 신경의 반응을 시험한 결과를 나타내는 도면이다.
도 11 은, 암 환자 유래의 뇨에 대해서, 선충의 AWA 후각 신경의 반응을 시험한 결과를 나타내는 도면이다.
도 12 는, 어세이 플레이트를 나타내는 도면이다.
도 13 은, 암 세포의 배양 배지에 대한 선충의 유인 행동을 나타내는 도면이다.
도 14 는, 본 발명의 방법의 중규모 시험 결과를 나타내는 도면이다.
도 15 는, 본 발명의 방법과 다른 종양 마커를 사용하여 중규모 시험을 실시하고, 감도를 비교한 결과를 나타내는 도면이다.
도 16A 는, 본 발명의 시스템의 블록도이다.
도 16B 는, 본 발명의 시스템의 처리부의 구성도이다.
도 17 은, 각종 농도의 섬유아 세포 배양 배지에 대한 선충의 주성을 나타내는 도면이다.
도 18 은, 각종 농도의 암 세포 배양 배지에 대한 선충의 주성을 나타내는 도면이다.
colo205 = 대장암, MKN1 = 위암
도 19 는, S 상 결장암 환자의 암 조직 및 정상 조직에 대한 선충의 주성을 나타내는 도면이다.
도 20 은, 인간의 암 조직 절편을 생리 식염수에 넣어 보존한 후의 당해 생리 식염수의 희석액에 대한 선충의 주성을 나타내는 도면이다.
도 21 은, 뇨의 농도를 바꾸어 선충의 주성을 시험한 결과를 나타내는 도면이다.
도 22 는, 특정한 냄새 물질에 대한 응답에 관여한 후각 수용체에 대한 RNAi 스크리닝을 나타내는 도면이다.
(A) RNAi 스크리닝 전략이 효과적이었던 것의 확인. 디아세틸의 10^-3 희석 또는 피라진의 10^-3 희석에 대한 주화성 응답에 있어서의 eri-1 변이체에서의 odr-10 을 표적으로 하는 RNAi 의 효과를 나타낸다. 대조와의 유의한 차를 나타낸다 (P < 0.001, 스튜던트 t 검정). (B) 냄새 물질에 대한 주화성과 관련지어진, 제 3 차 스크리닝 후에 얻어진 후각 수용체 후보 유전자의 수. (C) srx-47 또는 sra-17 프로모터에 의해 발현 유도된 형광 리포터의 발현 패턴. 녹색은, 이들 유전자의 프로모터에 의해 유도되는 형광 단백질 Venus 의 발현을 나타낸다. 마젠타색은, AWA, AWB, 및 AWC 후각 뉴런에 있어서의 mCherry 의 발현을 나타낸다. srx-47 의 발현은, AWA 및 ASH 뉴런에 있어서 관찰되었다. sra-17 의 발현은, AWA 뉴런에 있어서 검출되었다. 스케일 바, 10 ㎛.
도 23 은, 후각 수용체 후보 유전자의 발현 패턴을 나타내는 도면이다.
(왼쪽) 녹색은, 후각 수용체 후보 유전자의 프로모터에 의해 발현 유도된 Venus 의 발현을 나타낸다. (중앙) 마젠타색은, AWA, AWB 및 AWC 뉴런에 있어서의 mCherry 의 발현 (A) 또는 색소 (dye) 염색된 감각 뉴런 (ASH, ASJ, AWB, ASK, ADL, ASI, PHA 및 PHB 뉴런) (B-M) 을 나타낸다. (오른쪽) 중첩한 도면. 모든 화상은, 꼬리부 영역 (C, 하부) 을 제외하고, 선충의 머리부 영역의 좌측면 화상의 것이다. 화살표 및 화살촉은, 수용체 후보 유전자가 발현하는 뉴런의 세포체를 나타낸다. 스케일 바 = 10 ㎛.
도 24 는, SRI-14 는 ASH 뉴런에 있어서 고농도의 디아세틸에 대한 응답에 기능하는 것을 나타내는 도면이다.
(A) 야생형 (WT), odr-10, 및 sri-14 변이체에 있어서의 저농도 및 고농도의 디아세틸에 대한 화학 주성. 디아세틸 농도를 하부에 나타낸다 (n = 5). (B) 고농도의 디아세틸 (5 ㎕ 미희석) 에 대한 기피 응답에 있어서의 sri-14 를 표적으로 하는 RNAi 의 효과 (n = 8). (C) 고농도의 디아세틸 (5 ㎕ 미희석, Da), 이소아밀알코올 (5 ㎕ 미희석, Iaa), 및 벤즈알데히드 (1 ㎕ 미희석, Bz), 그리고 기피 물질 옥탄올 (1 ㎕ 미희석, Oct) 및 노나논 (1 ㎕ 미희석, Nona) 에 대한 sri-14 변이체의 화학 주성 (n = 6). (D) sri-14 프로모터에 의해 발현 유도되는 형광 리포터 (녹색) 의 발현 패턴. 화살촉은, 각각 mCherry 또는 형광 색소에 의해 동정된 AWC 또는 ASH 의 세포체를 나타낸다 (마젠타). (E) 고농도의 디아세틸 (5 ㎕ 미희석) 에 대한 화학 주성에 있어서, 야생형 선충에서 sri-14 를 ASH 또는 AWC 특이적으로 RNAi 했을 때의 효과 (n = 5). (F) 고농도의 디아세틸 (5 ㎕ 미희석) 에 대한 sri-14 변이체의 응답의 결함에 대해 sri-14 cDNA 의 뉴런 특이적 발현의 효과 (n = 5). (G) ASH 의 감각 섬모에 있어서의 SRI-14::GFP 의 국재. 스케일 바, 10 ㎛ (D 및 G). 에러 바는 SEM 을 나타낸다. ^*P < 0.05, ^**P < 0.01, ^***P < 0.001, 스튜던트 t 검정 (B 및 C) 또는 두네트 검정 (A, E, 및 F).
도 25 는, RNAi 처리된 선충의 고농도 디아세틸 농도에 대한 화학 주성을 반복 어세이한 결과를 나타내는 도면이다.
sri-14 에 더하여, 제 3 스크리닝 후에 얻어진 고농도 디아세틸 (5 ㎕ 의 미희석) 에 대한 응답에 관한 수용체 후보 유전자 중, srh-25, srh-79, srh-216, 또는 srh-281 의 RNAi 는, 디아세틸로부터의 기피 행동에 유의 (有意) 하고 재현성이 있는 결함을 일으켰다. 오차 바는 SEM 을 나타낸다. 대조와 비교한 유의차를 나타낸다 (^*P < 0.05, ^**P < 0.01；본페로니 보정을 포함하는 스튜던트 t 검정).
도 26 은, sri-14 의 구조를 나타내는 도면이다.
sri-14 는 7 회 막관통형 단백질을 코드한다. (A) sri-14 의 구조. ok2685 주 (株) 의 결실 영역을 나타낸다. (B) SRI-14 의 예측된 아미노산 배열. 은닉 마르코프 모델에 의해 예측된 7 회 막관통형 도메인을 나타낸다. (C) SRI-14 의 소수성 플롯. 플롯은, Kyte & Doolittle 에 의해 정의된 하이드로퍼시 파라미터에서 유래한다. (D) sri-14 변이체는, 높은 삼투압 자극 (4M NaCl) 에 대해 정상적인 기피 행동을 나타내었다. 오차 바는 SEM 을 나타낸다. 대조와 비교한 유의차를 나타낸다 (^**P < 0.01, 두네트 검정).
도 27 은, 고농도 디아세틸에 대한 응답에 관여하는 뉴런을 나타내는 도면이다. (A) 감각 뉴런이 특이적으로 파괴된 야생형 선충에 있어서의 고농도 디아세틸 (5 ㎕ 미희석) 에 대한 화학 주성 (n ≥ 8). (B) AWA 가 제거된 선충에 있어서의 10^-3 희석의 디아세틸에 대한 화학 주성. (C) AWA, ASH 감각 뉴런과 4 개의 제 1 층 개재 뉴런의 사이의 신경 배선의 모식도. (D) 개재 뉴런이 특이적으로 저해된 야생형 선충에 있어서의 고농도 디아세틸 (5 ㎕ 미희석) 에 대한 화학 주성 (n ≥ 5). (E) 개재 뉴런이 특이적으로 저해된 야생형 선충에 있어서의 10^-3 희석의 디아세틸에 대한 화학 주성 (n ≥ 5). 오차 바는 SEM 을 나타낸다. ^**P < 0.01, ^***P < 0.001, 두네트 검정；†††P < 0.001；스튜던트 t 검정. (A) 에 있어서, 아스테리스크는, 어느 뉴런도 제거, 저해되어 있지 않은 야생형 대조주와 비교한, 통계학적인 유의차를 나타낸다.
도 28 은, 각종 디아세틸 농도에 대한 AWA 뉴런의 응답을 나타내는 도면이다. (A) 지시된 유전자형의 선충에 있어서의 저농도의 디아세틸 (10^-5 희석) 에 의한 자극 후의 AWA 뉴런의 칼슘 응답. 곡선 주위의 음영 영역은 SEM 을 나타낸다 (모든 유전자형에 대해 n ≥ 8). 흑색 바는, 디아세틸 자극이 존재한 것을 나타낸다. (B) 저농도의 디아세틸 (10^-5 희석) 을 첨가하고 나서 10 초 후의 평균 형광 변화. 오차 바는 SEM 을 나타낸다. ^**P < 0.01, 두네트 검정 (각각의 유전자형에 대해 n ≥ 8). 흑색은 WT 이고, 적색은 sri-14 변이체이며, 청색은 odr-10 변이체이다. (C) 지시된 유전자형의 선충에 있어서의 고농도의 디아세틸 (10^-3 희석) 에 의한 자극 후의 AWA 뉴런의 칼슘 응답. 데이터는 (A) 와 동일하게 나타난다 (모든 유전자형에 대해 n ≥ 8). (D) 고농도의 디아세틸 (10^-3 희석) 의 첨가로부터 10 초 후의 평균 형광 변화. 오차 바는 SEM 을 나타낸다 (모든 유전자형에 대해 n ≥ 8).
도 29 는, 각종 디아세틸 농도에 대한 ASH 뉴런의 응답을 나타내는 도면이다. (A) 야생형 선충에 있어서의 저농도 (10^-5 희석) 및 고농도 (10^-3 희석) 의 디아세틸 자극 후의 ASH 뉴런의 칼슘 응답 (n ≥ 11). (B) sri-14 변이체 (n = 26), odr-10 변이체 (n = 28), sri-14 cDNA 의 ASH 특이적 발현을 수반하는 sri-14 변이체 (sri-14 레스큐, n = 9), 및 sri-14 를 ASH 특이적으로 RNAi 한 야생형 선충 (n = 20) 에 있어서의 ASH 뉴런의 칼슘 응답. 곡선 주위의 음영 영역은 SEM 을 나타낸다. 흑색 바는, 디아세틸 자극이 존재한 것을 나타낸다. (C) 고농도 디아세틸 (10^-3 희석) 을 첨가하고 나서 10 초 후의 평균 형광 변화. 오차 바는 SEM 을 나타낸다. ^*P < 0.05, 두네트 검정 (n ≥ 11).
도 30 은, unc-13 변이체 및 AWA 가 파괴된 선충에 있어서의 ASH 뉴런의 칼슘 이미징의 도면이다. 야생형 (A, N = 14), unc-13 변이체 (B, N = 14) 및 AWA 가 파괴된 선충 (C, N = 11) 에 있어서의 고농도의 디아세틸 (10^-3 희석) 자극 후의 ASH 뉴런의 칼슘 응답. unc-13 변이체 및 AWA 가 파괴된 선충에서는, 야생형 선충 뉴런과 비교하여, 크게 장시간 지속하는 칼슘 응답이 관찰되었다. 곡선 주위의 음영 영역은 SEM 을 나타낸다. 흑색 바는, 디아세틸 자극이 존재한 것을 나타낸다. (D) 고농도 디아세틸을 첨가하고 나서 10 초 후의 평균 형광 변화. 오차 바는 SEM 을 나타낸다. 대조로부터의 유의차는, (^*P < 0.05, 두네트 검정) 에 의해 나타내어진다.
도 31 은, AWC 뉴런이 고농도 디아세틸의 제거에 응답하는 것을 나타내는 도면이다. 야생형에 있어서의 고농도 디아세틸 (10^-3 희석) 의 제거 후의 AWC 뉴런의 칼슘 응답 (N = 10). 곡선 주위의 음영 영역은 SEM 을 나타낸다. 흑색 바는, 디아세틸이 존재한 것을 나타낸다.
도 32 는, 고농도 또는 저농도의 디아세틸의 제거에 대한 AWB 뉴런의 응답을 나타내는 도면이다. (A) 야생형 선충 (갈색, n = 10) 또는 AWB 뉴런에 있어서 sri-14 를 이소성으로 발현시킨 선충 (등색 (橙色), n = 11) 에 있어서의, 저농도 (10^-5 희석, 왼쪽) 또는 고농도 (10^-3 희석, 오른쪽) 의 디아세틸의 제거 후의 AWB 뉴런의 칼슘 응답. 곡선 주위의 음영 영역은 SEM 을 나타낸다. 흑색 바는, 디아세틸이 존재한 것을 나타낸다. (B) 디아세틸을 제거하고 나서 10 초 후의 평균 형광 변화. 백색 바, 야생형；등색 바, AWB 에 있어서 sri-14 를 이소성으로 발현시킨 주. 오차 바는 SEM 을 표시. ^***P < 0.001, 스튜던트 t 검정 (n ≥ 10).
도 33 은, 냄새의 농도에 의존한 후각 수용체의 스위치의 모델도이다. 저농도 디아세틸에 대해서는, ASH 뉴런에 있어서의 SRI-14 가 아니라, AWA 뉴런에 있어서의 ODR-10 이, 디아세틸 수용체로서 기능하고, AWA 의 활성화 및 유인 행동을 가져온다. 대조적으로, 고농도 디아세틸은, ASH 뉴런에 있어서의 SRI-14 에 의해 감지되지만, AWA 뉴런에 있어서의 ODR-10 에 의해 감지되지 않는다. ASH 뉴런은, 고농도 디아세틸에 의해서만 활성화되고, 기피 행동을 유도한다. AWA 도 고농도 디아세틸에 응답하지만, 이것은, ODR-10 이외의 후각 수용체가 AWA 뉴런에 있어서 응답하는 것을 나타낸다.
도 34 는, N2 주 및 유전자 변이주에 있어서의 각종 암 환자의 뇨에 대한 주성을 나타내는 도면이다.
도 35 는, N2 주 및 유전자 변이주에 있어서의 각종 화학 물질에 대한 주성을 나타내는 도면이다.
도 36 은, 후각 수용체 녹다운 주에 있어서의 유방암 환자의 뇨에 대한 주성을 나타내는 도면이다.
도 37 은, 선충의 주성 테스트에 의해 암종을 특정하는 방법의 모식도이다.

이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.

1. 개요

(1) 암의 검출

본 발명은, 선충을, 피검자 유래의 생체 관련 물질 또는 그 처리물의 존재하에서 사육하고, 예를 들어 선충의 후각에 의한 화학 주성 등을 지표로 하여 암을 검출하는 것을 특징으로 하는 암의 검출 방법이다.

본 발명자는, 피검자가 암인지 여부를 검사할 때에, 일 양태로서 피검자 유래의 샘플에 대한 선충 C. 엘레강스 (C. elegans) 의 후각에 의한 화학 주성에 주목하였다.

선충인 시노랩디티스·엘레강스 (Caenorhabditis elegans, 이하 「C. 엘레강스 (C. elegans)」 라고도 한다) 는 생물 연구의 모델 생물로서, 전 세계 연구실에서 널리 사육, 연구되고 있는 포퓰러한 생물이며, 사육이 용이하고, 후각이 우수하다는 특징이 있다.

선충은 냄새나 물질에 대해서, 접근하거나, 도망친다는 화학 주성을 나타내기 때문에, 본 발명에 있어서는, 이 행동을 지표로 하여 암의 냄새에 대한 선충의 반응을 조사한다.

정상인 및 암 환자의 뇨에 대한 선충의 반응을 조사한 결과, 정상인의 뇨에 대해서는 기피 행동을, 암 환자의 뇨에 대해서는 유인 행동을 나타내며, 30 검체를 조사하여 그 정밀도는 100 ％ 였다 (도 1).

또, 조기암을 포함하는, 위암, 결장·직장암, 췌장암 모두에 반응했기 때문에, 암 탐지견의 행동과 동일하게, 다양한 암에 공통된, 암 특유의 냄새에 반응하고 있는 것이 나타났다.

따라서, 본 발명에 있어서는, 위암, 결장·직장암, 식도암, 췌장암, 전립선암, 담관암, 유방암, 악성 림프종, 소화관 간엽성 종양, 맹장암, 폐암 등의 암종을 검출의 대상으로 할 수 있다.

이 선충을 이용한 암 진단 시스템은, 이하와 같이, 종래의 문제점의 대부분을 해결할 수 있다.

(i) 조기암을 검출하는 것이 가능하다.

스테이지 0, 1 의 조기암에 대해서도, 고정밀도로 검출 가능하다. 뇨를 채취한 시점 (2011년) 에서 기존의 종양 마커에서 음성이라고 판단된 검체에 대해, 이 테스트에서는 양성을 나타내었다. 이 환자는, 경과 관찰 중 2 년 사이에 암을 발증하였다. 즉, 기존의 종양 마커에서는 검출할 수 없는 암을, 본 발명에 의해 검출하는 것이 가능하다.

(ii) 다종류의 암의 존재를 단일 검사로 진단할 수 있다. 즉, 한 번의 검진으로 많은 종류의 암에 대해 진단할 수 있다. 지금까지, 위암, 결장·직장암, 식도암, 췌장암, 전립선암, 담관암, 유방암, 악성 림프종, 소화관 간엽성 종양, 맹장암, 폐암에 대해 검출 가능한 것을 확인하였다.

(iii) 고감도이다.

30 검체의 테스트에서는 100 ％ 의 감도·특이도로 검출이 가능하였다. 또한, 중규모 테스트 (242 검체) 를 실시해도, 암 환자에 대해 100 ％ 의 감도·95 ％ 의 특이도로 검출이 가능하였다.

(iv) 샘플의 채취가 용이하다.

뇨 샘플의 채취에는, 식사 제한 등의 특별한 조건을 규정하고 있지 않고, 통상적인 정기 검진으로 채취한 뇨 샘플을 사용하여 해석할 수 있다. 이 때문에, 피검자는 고통을 수반하지 않고, 다른 뇨 검사와 동시에 샘플 채취가 가능하다. 필요한 뇨의 양은 수 ㎕ 로 족하다.

(v) 해석은 저렴하고 용이하게 할 수 있다.

(v-1) 빠르다

단시간에 해석 가능. 선충의 화학 주성의 해석은, 1 시간반 정도로 실시할 수 있다. 트랜스제닉 선충을 이용한 후각 신경의 응답의 해석은, 30 분 정도로 실시할 수 있다.

(v-2) 저렴함

예를 들어, 1 검체당, 선충 사육용 샬레 2 매 (1 매 약 10 엔), 주성 해석용 샬레 3 ∼ 5 매 (1 매 약 10 엔). 한천은 각각의 샬레 1 매당, 2.5 엔, 10 엔. 그 외 시약을 합해도, 1 검체당 100 엔 정도. 인건비를 합해도, 매우 저렴하게 해석할 수 있다.

(v-3) 해석이 용이하고, 전문적인 기술은 필요로 하지 않는다.

선충의 주성 해석은 매우 용이하여, 누구라도 실시할 수 있다. 선충의 사육도 용이하다. 선충에 대한 특별한 훈련은 필요로 하지 않고, 통상적으로 사육한 선충을 이용하여 해석할 수 있다.

(v-4) 다검체의 해석이 가능

실험자 1 인당 1 일에 150 회 정도의 횟수로 주성 해석을 실시할 수 있다. 1 검체당 3 회의 주성을 해석하는 경우, 1 일에 50 검체를 해석할 수 있다. 이 작업을 자동화하는 것도 가능하다.

(vi) 실용화가 용이, 전 세계에서 도입 가능

(vi-1) 시스템 전체가 저렴하고 도입하기 쉽다

선충의 사육에 특별한 방은 필요없다. 필요로 하는 기기는, 20 ℃ 인큐베이터와 실체 현미경뿐이며, 저렴하고 또한 단시간에 시스템의 구축을 할 수 있다.

(vi-2) 전 세계에 도입 가능

고가의 측정 기기를 필요로 하지 않기 때문에, 선진국 뿐만 아니라, 모든 나라에 도입 가능하다.

(vii) 암 치료 후의 재발 진단에 응용 가능

모든 부위의 암을 검출할 수 있기 때문에, 수술 후 재발 가능성 판단에 응용할 수 있다.

이상으로부터, 본 발명은, 피검자의 고통이 적고, 조작을 간단하게 또한 저렴하게 실시할 수 있고, 많은 인간을 대상으로 하여 실시 가능하고 고정밀한 새로운 암 검진법으로서 유용하다.

(2) 후각 수용체의 동정

냄새는 후각 신경 상의 후각 수용체에 의해 수취된다. 인간에는 약 350 종의 후각 수용체가 존재하며, 약 1 만종의 냄새를 식별할 수 있는 것으로 일컬어지고 있다. 냄새 종류에 대해서 압도적으로 적은 수용체에 있어서, 어떻게 방대한 종류의 냄새를 식별할 수 있는지는 불분명하기 때문에, 그것을 분명히 하기 위해서, 냄새와 수용체의 대응 관계를 분명히 할 필요가 있다. 그러나, 그러한 시도는 부분적으로밖에 실시되지 않았고, 특히 생체 내에 있어서의 대응 관계는 거의 알 수 없었다.

선충 C. 엘레강스는 생체 내에서의 해석이 우수하고, 후각 신경이 불과 10 개 정도 (인간에서는 약 500 만 개) 밖에 없는 점이나, 신경 회로가 모두 동정되어 있는 점, 나아가서는 냄새를 느끼는 구조가 포유류와 거의 동일한 점에서, 후각 연구의 모델 생물이라고 생각되고 있다. 선충의 후각 수용체는 포유류와 동일한 7 회 막관통형 G 단백질 공액형이며, 게놈 상에 1200 개 이상 있는 것으로 예상되고 있다. 그러나, 냄새와의 대응 관계가 판명되어 있는 수용체는 불과 1 개 (디아세틸 수용체의 ODR-10) 이며, 냄새 시그널을 어떻게 수용하고 있는 것인지 불분명하였다.

그래서 본 발명자는, RNAi 에 의해 선충체 내에서 후각 수용체 유전자의 기능을 저해하고, 그 개체가 11 종의 냄새에 대해서 어떠한 반응을 나타내는지를 조사하는, 망라적 스크리닝을 실시하였다. 냄새에 대한 반응에 변화를 가져온 유전자를 픽업하고, 해석을 반복하였다. 그 결과, 조사한 냄새 전부에 대해 후보 유전자를 얻는 것에 성공하였다 (도 22B).

다음으로, 얻어진 후보 유전자는 정말로 생체 내에서 후각 수용체로서 기능하고 있는 것인지 여부를 분명히 하기 위해서, 본 발명자는 동일한 냄새라도 농도에 따라 기호성 (좋고 싫음) 이 변화하는 현상에 주목하여, 해석을 진행하기로 하였다. 인간에서는, 냄새의 농도에 따라 기호성이 변화하는 것이 경험적으로 알려져 있으며, 예를 들어 인돌은 저농도에서는 쟈스민 향기, 고농도에서는 분뇨 냄새가 난다. 선충에서도 동일한 현상이 관찰되고, 냄새의 농도에 따라 활성화하는 후각 신경의 종류가 변화하고, 그에 따라 기호성이 변화하는 것을, 본 발명자는 선행 연구에 의해 분명히 하고 있다 (Yoshida, K. et al. : Nature Communications 3, 739 (2012)). 그럼, 동일한 냄새라도 농도에 따라 반응하는 수용체가 변화하는 것일까. 이 흥미로운 의문에 대해 해석하기 위해서, 본 발명자는 고농도 디아세틸의 수용에 관련되는 것으로서 얻어진 sri-14 유전자에 주목하였다. sri-14 기능 저하형 변이체는, 저농도 디아세틸에 대한 반응은 정상이고, 고농도 디아세틸에 대한 반응에만 이상을 나타내었다. 한편, 이미 알려진 디아세틸 수용체 ODR-10 의 변이체는, 저농도의 디아세틸에 대한 반응만 저하되었다 (도 24A). ODR-10 은 좋아하는 냄새를 수용하는 AWA 후각 신경으로 기능하고 있는 것이 이미 보고되어 있었지만 (Sengupta, P. et al. : Cell 84, 899-909 (1996)), sri-14 의 발현 해석이나 표현형 회복 실험, 신경 특이적 유전자 발현 저해 실험에 의해, SRI-14 는 싫은 냄새를 수용하는 ASH 감각 신경으로 기능하고 있는 것을 알 수 있었다 (도 24). 또 SRI-14 는 후각 수용체가 존재하는 감각 섬모에 국재 (局在) 가 관찰되었다 (도 24G).

여기서, 유전자 발현 저해 실험은, 예를 들어 RNAi 를 이용한 저해, 안티센스 핵산을 이용한 저해, 도미넌트 네거티브형 변이 유전자의 발현에 의한 저해 등을 들 수 있지만, RNAi 를 이용한 저해가 바람직하다.

다음으로, 칼슘 이미징을 이용하여 AWA, ASH 감각 신경의 디아세틸에 대한 응답을 관찰하였다. AWA 신경은 저농도, 고농도 어느 쪽의 디아세틸에도 응답했지만, odr-10 변이체에서는 저농도 디아세틸에 대한 응답이 보이지 않았다 (도 28). sri-14 변이체에서는 정상이었다. 한편, ASH 감각 신경은 고농도 디아세틸에만 응답을 나타내고, 그 응답은 sri-14 변이체에서 유의하게 저하되었다. odr-10 변이체에서는 정상이었다 (도 29). 또한, sri-14 를 디아세틸에 응답하지 않는 다른 감각 신경 AWB 에 이소적으로 발현시키면, AWB 가 고농도 디아세틸에 강하게 응답하게 되었기 때문에 (도 32), SRI-14 가 디아세틸 수용체로서 생체 내에서 기능하고 있는 것이 강하게 시사되었다. 이상의 결과로부터, 동일한 냄새라도 농도에 따라 수용체가 구분 사용되고 있으며, 저농도 디아세틸은 AWA 신경에 있는 ODR-10 에서 수용하여 좋다고 느끼고, 고농도 디아세틸은 ASH 신경에 있는 SRI-14 가 수용하여 싫다고 느끼는 것을 알 수 있었다 (Taniguchi, G. et al. : Science Signaling 7, ra39 (2014)) (도 33).

선충은, 개와 거의 동수 (同數) 의 후각 수용체를 갖는 후각이 우수한 생물이기 때문에, 마약 탐지견과 같이 유해한 물질, 유익한 물질의 냄새를 양호한 감도로 인식하고 있을 가능성이 있다. 그 경우, 본 연구의 성과로부터, 그들 냄새의 수용체를 동정할 수 있다. 냄새와 수용체의 대응 관계를 알면, 그 결합을 모델로 한 인공 냄새 센서의 개발이 가능할 것으로 예상되며, 장래적으로 선충을 이용한 후각 해석은 널리 사회에 공헌하는 것으로서 유용하다.

2. 검출 방법

(1) 선충

본 발명의 방법에 사용하는 선충은 토양 자활 선충의 일종이며, 생물 연구의 모델 생물로서 널리 연구에 이용되고 있다. 본 발명의 방법에 사용하는 선충은, 자웅을 불문하지만, 자가 수정에 의해 증식할 수 있는 점에서 자웅동체인 것이 바람직하다. 또, 본 발명에 있어서 사용하는 선충은, 샬레 중에서 대장균을 먹이로서 사육하면 되고, 사육은 용이하다. 부모를 샬레로 옮겨 두면, 4 일 후에는 아이가 태어나 성충으로까지 성장하고, 50 ∼ 100 배로 개체수가 늘어난다. 그 동안, 인큐베이터에 넣어 방치해 두면 되고, 특별한 조작은 필요없다. 자웅동체를 사용하는 경우에는, 교배 등의 조작도 필요없다. 사육하는 데에 필요한 설비는 20 ℃ 인큐베이터 및 실체 현미경이며, 시스템의 가동은 단시간에, 저렴하게 실시할 수 있다.

본 발명에 있어서 사용되는 선충으로는, 예를 들어 야생형 선충의 경우에는, 시노랩디티스·엘레강스 (Caenorhabditis elegans) 를 들 수 있으며, C. 엘레강스 Briostol N2 주의 자웅동체를 사용하는 것이 바람직하지만, 각종 유전자를 결손한 유전자 변이주를 이용할 수도 있다. 이들 선충은, 예를 들어 선충 유전 센터 (Caenorhabditis Genetic Center) (CGC) 로부터 입수할 수 있다.

본 발명에 있어서는, 상기 선충 (야생형 선충) 외에, 변이형 선충이나 트랜스제닉 선충을 이용할 수 있다. 트랜스제닉 선충에는, 선충의 후각 신경 AWC, AWA 에, 인디케이터 유전자를 도입한 선충, 암 냄새의 수용에 관련된 유전자 (수용체 유전자) 의 발현 또는 기능을 저해한 선충, 암 냄새의 수용에 관련된 유전자 (수용체 유전자) 를 고발현 또는 고기능화한 선충, 선충의 행동 해석을 용이하게 하기 위해서 각 세포에 형광 단백질을 발현시킨 선충 등을 예로서 들 수 있지만, 이들에 한정되는 것이 아니라, 외래 유전자를 도입한 모든 트랜스제닉 주를 대상으로 한다.

본 발명에서는, 선충의 소정의 프로모터의 바로 아래에 목적 유전자를 연결한 DNA 를 구축하고, 이것을 선충의 야생주나 유전자 변이주 (예를 들어, 생식선) 에 미량 주사한다. 이에 따라, 외래 유전자를 안정적으로 계대할 수 있는 트랜스제닉 선충을 제조할 수 있다. 칼슘 농도가 상승하는 것은, 신경이 활성화한 것을 나타내기 때문에, 예를 들어 신경 내 칼슘 농도를 측정할 수 있는 인디케이터 유전자를 이용하고, 칼슘 농도의 변화를 지표로 하여 암을 검출할 수 있다.

AWC 에 발현시키기 위해서 사용하는 프로모터로는, 예를 들어 odr-1 프로모터 (Yu, S., Avery, L., Baude, E. & Garbers, D. L. Guanylyl cyclase expression in specific sensory neurons : a new family of chemosensory receptors. Proc Natl Acad Sci USA 94, 3384-3387 (1997).) 등을 들 수 있다. odr-1 은 AWC 와 AWB (AWC 와는 다른 후각 신경) 에 발현 유도한다.

또, AWA 에 발현시키기 위해서 사용하는 프로모터로는, 예를 들어 odr-10 프로모터 (Sengupta, P., Chou, J. H. & Bargmann, C. I. odr-10 encodes a seven transmembrane domain olfactory receptor required for responses to the odorant diacetyl. Cell 84, 899-909 (1996).) 를 들 수 있다. odr-10 은 AWA 에만 발현 유도하는 것이 알려져 있다.

이들 프로모터의 염기 배열 정보는, 예를 들어 액세션 번호 Z68118, FO080931 에 의해 얻을 수 있다. 또, 프로모터는 선충 게놈 DNA 를 정제하고, 그것을 주형 (鑄型) 으로 하여 PCR 에 의해 증폭하여 입수하는 것도 가능하다.

칼슘 인디케이터 유전자로는, 황색 카멜레온 (Yellow Cameleon) (YC) 유전자 (Nagai, T., Yamada, S., Tominaga, T., Ichikawa, M. & Miyawaki, A. Expanded dynamic range of fluorescent indicators for Ca(2+) by circularly permuted yellow fluorescent proteins. Proc Natl Acad Sci USA 101, 10554-10559 (2004).), GCaMP 유전자 (Nakai, J., Ohkura, M. & Imoto, K. A high signal-to-noise Ca2+ probe composed of a single green fluorescent protein. Nat. Biotechnol. 19, 137-141 (2001).) 등을 들 수 있으며, 이들 유전자는, 예를 들어 액세션 번호 AB178712, HM143847 에 의해 염기 배열 정보를 얻을 수 있다. 또, 이들 유전자는, addgene 에 의해 입수하는 것도 가능하다.

프로모터 바로 아래에 인디케이터 유전자를 연결하는 방법이나 마이크로 인젝션법 등은 당분야에 있어서 주지이며, 예를 들어 Molecular Cloning : A Laboratory Manual (4th Edition)」 (Cold Spring Harbor Laboratory Press (2012)) 등을 참조하면 된다. 혹은, 선충의 생식선에 DNA 용액을 주입하려면 공지 수법에 의해 실시할 수 있다 (Mello, C. C., Kramer, J. M., Stinchcomb, D. & Ambros, V. Efficient gene transfer in C. elegans : extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences. EMBO J 10, 3959-3970 (1991).).

변이형 선충은, 예를 들어 야생형 선충의 게놈에 다형이 발생한 선충, 암종 각각의 냄새에 대한 후각 수용체를 결실한 변이체 등을 의미한다 (후술하는 실시예에 있어서 설명한다).

(2) 피검자 유래의 생체 관련 물질 또는 그 처리물

본 발명에 있어서 사용되는 시료는 피검자 (정상인, 암 환자, 암이 의심되는 환자 등, 동물) 유래의 생체 관련 물질이다. 「생체 관련 물질」 이란, 피검자로부터 채취된 생체 시료이며, 예를 들어 체액 (뇨, 땀, 타액, 변즙), 세포 (생검 세포 등), 암 조직 (생검 조직, 조직 절편 등) 혈액, 호기 (呼氣) 등을 들 수 있다. 본 발명에 있어서는, 이들 생체 시료 그 자체를 사용할 수 있지만, 생체 관련 물질의 처리물을 사용하는 것이 바람직하다. 「처리물」 이란, 생체 관련 물질을 물리적 및/또는 화학적으로 처리한 샘플을 의미한다.

뇨 등의 체액 샘플에는 고형물이나 침전물이 포함되어 있다. 예를 들어 뇨는, 채취된 것을 그대로 사용할 수도 있지만, 가는 관을 통해서 선충에 줄 필요가 있으므로, 필터 제거 처리를 실시하는 것이 바람직하다 (예를 들어, 기공 크기 0.22 ㎛, MillexGP, Merck Millipore). 이와 같은 필터에 의해 고형물의 제거 처리를 실시한 뇨 샘플은, 상기 「처리물」 에 포함된다. 또한, 본 발명자는, 예비 실험에 의해, 필터 처리에 의해 선충의 반응 (뇨에 대한 유인 행동) 이 변화하지 않는 것을 확인하였다 (도 9).

상기와 마찬가지로, 생체 관련 물질로서 세포 (예를 들어, 생검에 의한 암 세포) 를 사용하는 경우에는, 세포 배양 후의 배양물로부터 원심 분리나 필터링 등에 의해 세포 파쇄물 등의 고형물을 제거하고, 고형물 제거 후의 배양 상청액을 처리물로서 얻는다.

또, 본 발명에 있어서는, 상기 시료 외 암 세포 또는 암 조직 (생검 조직, 조직 절편 등) 의 보존액을 사용할 수도 있다. 보존액으로는, 예를 들어 생리 식염수, 완충액, 포르말린, DMSO 등을 들 수 있지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 보존액에는 동결 보존에 일반적으로 사용되는 동결 보존용 보존액이 포함되고, 동결 보존 후에는, 융해하여 사용할 수 있다.

(3) 선충의 후각을 이용한 검출

먼저, 검출에 필요한 선충을 얻기 위해서 증식시킨다.

선충 (성충) 을 샬레 (대장균을 뿌린 NGM 배지) 에 수 마리 두고, 3 ∼ 6 일, 바람직하게는 4 일간, 15 ∼ 25 ℃, 바람직하게는 20 ℃ 에서 사육한다. 이에 따라 다음 세대의 선충이 300 ∼ 500 마리 정도 성충까지 자란다.

다음으로, 실제로 검사를 실시하기 위한 샬레를 제조한다. 샬레에 도 2 와 같은 포맷을 작성하고, 4 점에 아지화나트륨 (NaN₃) 을 둔다 (첨가한다). 아지화나트륨은 선충을 마취하여 움직이지 않게 하기 위한 것이며, 첨가량은 1 M 농도에서는 0.2 ∼ 3 ㎕, 바람직하게는 0.5 ㎕ 이다.

샬레에 뿌린 대장균을 세정 버퍼에 의해 제거하고, 샬레에 생체 관련 물질 또는 그 처리물의 샘플을 둔다 (첨가한다). 샘플로서 뇨를 사용하는 경우, 뇨 샘플은 원액을 사용할 수도 있지만, 채취된 뇨를 예를 들어 멸균수, 완충액 등에 따라 1.5 ∼ 1000 배로 희석해도 된다. 희석 배율은 10 배인 것이 바람직하다. 샬레에 첨가하는 뇨 샘플은 0.5 ∼ 10 ㎕, 바람직하게는 1 ㎕ 이다.

이와 같이 하여 준비된 샬레의 중심에 선충을 둔다.

소정 시간 (1 시간 정도) 선충을 사육한다 (자유롭게 행동하게 한다). 실온은 23 ℃ ± 1 ℃.

소정 시간 경과 후, ＋ 측의 개체수, ― 측의 개체수를 세고, 주화성 지수 (chemotaxis index) (하기 식) 를 계산한다. ＋ 측의 개체수를 N(+), ― 측의 개체수를 N(―) 로 하면,

주화성 지수 = N(+) ― N(―) / 전체 개체수

가 된다.

그 후, 정 (正) 의 응답 또는 부 (負) 의 응답을 지표로 하여, 암을 검출한다.

「정의 응답」 이란, 선충이 샘플에 대해 「좋은」 것 또는 「흥미있는」 것을 의미하며, 「부의 응답」 이란, 선충이 샘플에 대해 「싫은」 것 또는 「흥미없는」 것을 의미한다.

화학 주성을 지표로 하는 경우에는, 정의 값 (＋) 은 정의 응답 (정의 화학 주성, 좋음), 부의 값 (―) 은 부의 응답 (부의 화학 주성, 싫음) 을 나타낸다.

주화성 지수는 ＋1 ∼ ―1 의 값을 취하고, 유인된 경우 플러스의 값을, 기피한 경우 마이너스의 값을 취한다.

1 검체당 1 회 해석이어도 되지만, 복수 회의 해석을 실시하고, 주화성 지수의 값의 평균값을 계산함으로써 값의 정밀도를 높일 수 있다. 해석에 의해 얻어진 값 (복수 회 실시했을 때는 그 평균값) 이 정의 값인 경우, 암인 또는 암의 리스크 (가능성) 가 있는 것으로 예비적으로 또는 확정적으로 판단할 수 있다. 「암이다」 라는 판단은, 예를 들어 암의 확정 진단 또는 예비적 진단의 보조 자료로서 사용할 수 있으며, 「암 리스크가 있다」 라는 판단은, 예를 들어 건강 진단이나 암의 초진 등에 있어서 암을 의심하기 위한 보조 자료로서 사용할 수 있다.

선충의 냄새에 대한 반응은, 화학 주성 이외의 행동이나 생체 반응을 지표로 하여 검출할 수도 있다. 예를 들어, 선충이 냄새의 농도가 높아지는 방향으로 방향을 바꾸는 풍향계 행동 (Iino & Yoshida, The Journal of Neuroscience, 2009) 이나, 냄새의 농도가 낮아지면 일으키는 턴 행동 (Pierce-Shimomura et al., The Journal of Neuroscience, 1999), 몸의 굴곡도 (Luo et al., Journal of Neurophysiology, 2008), 신경의 응답 등을 들 수 있다.

풍향계 행동에 있어서, 「정의 응답」 이란, 선충이 샘플 방향으로 방향을 바꾸는 것을 의미한다. 또, 턴 행동에 있어서는, 샘플이 높은 농도로부터 낮은 농도로 바뀌었을 때에 턴하면, 선충은 「부의 응답」 을 하였다고 할 수 있다. 몸의 굴곡도의 경우에는, 머리부와 꼬리부의 사이의 거리가 길면, 「정의 응답」 을 취하였다고 말할 수 있다.

(4) 유전자 조작 선충을 이용한 검출

(i) 유전자 조작 선충을 이용한 검출에 대해서도, 상기와 같이 실시할 수 있지만, 선충의 후각 신경 AWC, AWA 에, 신경 내 칼슘 농도를 측정할 수 있는 인디케이터 유전자를 발현시킨 트랜스제닉 선충을 이용하고, 칼슘 농도의 변화 (신경의 응답) 를 지표로 하여 검출한다. 이 방법은 선충 수 개체에서 해석할 수 있기 때문에, 선충의 배양에 드는 비용이 낮고, 단시간에 실시할 수 있는 이점이 있다.

인디케이터 유전자로서 황색 카멜레온 (Yellow Cameleon) 유전자를 사용했을 때의 측정 원리를 도 3 에 나타낸다.

측정에 사용하는 인디케이터 단백질은, 칼슘 결합 단백질 CaM 과, CaM 이 결합하는 타겟의 M13 을 잇고, 그 양단에 CFP, YFP 를 이은 융합 단백질이다 (유전자에 코드되어 있고, 유전학적으로 생체 내에서 발현시킬 수 있다). 칼슘 농도가 낮을 때는, CaM 과 M13 이 떨어져 있고, CFP 와 YFP 도 떨어진 위치에 있다 (좌측도). 그 때문에, CFP 를 여기시키는 광을 부여하면, CFP 로부터 푸른 광이 발해진다. 한편, 칼슘 농도가 높아져 CaM 과 M13 이 결합하면, CFP 와 YFP 가 접근하고, 양자 사이에서 형광 공명 에너지 이동 (또는 푀르스터 공명 에너지 이동) (FRET) 이 발생한다. 그러면, CFP 를 여기하는 광을 부여해도, YFP 로부터 노란 광이 발해지게 된다 (우측도). 그래서, 푸른 광, 노란 광을 동시에 계측하고, 그 비를 계산하면, 칼슘 농도 변화를 알 수 있다.

인디케이터 유전자로서 GCaMP 유전자를 사용했을 때의 측정 원리를 도 4 에 나타낸다.

인디케이터 단백질은, CaM 과 M13 을 GFP 에 이은 구조를 하고 있는 융합 단백질이다. 이 단백질도, 유전자에 의해 코드되어 있고, 유전학적으로 생체 내에서 발현시킬 수 있다. 칼슘 농도가 높아져 CaM 과 결합하면, GFP 의 형광 강도가 상승한다. 그래서, GFP 의 형광을 측정하면, 칼슘 농도의 변화를 알 수 있다.

본 발명에 있어서는, 피검자 유래의 생체 관련 물질 또는 그 처리물에 대해서, 선충의 후각 신경의 응답이 클 때, 즉 칼슘 농도 변화가 클 때는, 피검자는 암이라고, 또는 암 리스크가 있다고 판정한다. 여기서, 「후각 신경의 응답이 클 때」 및 「칼슘 농도 변화가 클 때」 에 있어서의 「클 때」 란, 대조 (정상인 유래의 생체 관련 물질 또는 그 처리물) 와 비교하여, 피검자 유래의 생체 관련 물질 또는 그 처리물을 자극으로서 주었을 때의, 형광 강도비 (비 = YFP/CFP) 의 변화, 혹은 GFP 의 형광 강도 변화가 유의하게 큰 것을 의미한다.

(ii) 후각 신경에 칼슘 인디케이터를 발현시킨 선충 개체를, 수지제 (예를 들어, 디메틸폴리실록산 (PDMS) 수지제) 의 칩에 넣는다 (도 5). 도 5 에서는, PDMS 수지제 칩에, 선충을 끼워 넣는 부분과, 4 개의 유로 (流路) 가 형성되어 있다.

관류 장치 (WPI 사. Multi Channel Perfusion System MPS-2 등) 로 1 ∼ 4 의 유로를 전환함으로써 (도 6), 뇨 자극의 온 (ON), 오프 (OFF) 를 실시한다 (Chalasani, S. H. et al. Dissecting a circuit for olfactory behaviour in Caenorhabditis elegans. Nature 450, 63-70 (2007) ; Chronis, N., Zimmer, M. & Bargmann, C. I. Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans. Nat Methods 4, 727-731 (2007).).

도 6 은, 칩 내에서의 유로의 전환을 나타내는 도면이다. 유로 (1, 2 및 4) 에 버퍼, 유로 (3) 에 뇨를 넣어 둔다. 유로 (2 및 3) 는 항상 온으로 해 둔다. 유로 (1) 가 온이고, 유로 (4) 가 오프일 때는, 선충에 뇨 자극은 닿지 않는다. 유로 (1) 를 오프, 유로 (4) 를 온으로 하면, 선충에 뇨 자극이 주어진다.

AWC 후각 신경은 「냄새 있음」 →「없음」 으로 반응하는 신경이기 때문에 (후각-오프 반응), 뇨가 있는 상태에서 없는 상태로 변화시켰을 때의 반응을 본다. AWA 신경은 그 반대로, 「냄새 없음」 →「있음」 으로 반응하는 신경이기 때문에 (후각-온 반응), 뇨가 없는 상태에서 있는 상태로 변화시켰을 때의 반응을 본다.

그런데, 정상인의 뇨에서도 선충의 후각 신경은 약하게 반응하기 때문에, 컨트롤의 뇨 (정상인의 뇨) 를 준비하고, 동일한 선충 개체에 컨트롤 뇨, 검체 뇨를 차례로 주어, 그 반응의 강도 차이에 따라, 암의 검출을 실시하는 것이 바람직하다.

(iii) 형광 현미경 (Leica DMI3000B 등) 을 사용하여, 대물 렌즈 (40 배) 로 형광 화상을 취득한다. 화상 취득은, 예를 들어 200 ms 마다 실시하지만, 현미경, 렌즈 등에 따라 적절히 변경할 수 있다. 황색 카멜레온 (Yellow Cameleon) 인 경우에는, 2 파장의 화상을 나누어 취득할 필요가 있으므로, 카메라는, 동시에 2 파장의 화상을 취득할 수 있는 카메라, 예를 들어 ORCA-D2 디지털 카메라 (하마마츠 포토닉스) 인 것이 바람직하다 (그 밖에도 동일한 기능을 갖는 카메라가 판매되고 있다). GCaMP 의 경우 1 파장의 화상을 취득할 수 있으면 되므로, GFP 화상을 취득할 수 있는 일반적인 현미경용 카메라가 있으면 된다.

(iv) 취득 화상에 대해, 후각 신경의 세포체 (가장 변화가 보이기 쉬운 부위) 를 ROI (주목 영역) 로서 둘러싸고, 각 픽셀마다의 형광 강도를 소프트웨어 (예를 들어, Molecular devices 사 Metamorph software) 를 사용하여 모든 계산과 영상 작성을 실시한다. 또한, 각 사로부터 판매되고 있는 다른 소프트도 사용 가능하다. 황색 카멜레온 (Yellow Cameleon) 의 경우, 각 픽셀마다의 YFP/CFP 비를 계산하고, ROI 내에서의 평균값을 계산한다. 또, GCaMP 의 경우, ROI 내에서의 형광 강도의 평균값을 계산한다.

3. 수용체의 동정

본 발명에 있어서는, 선충을 이용하여 냄새 수용체의 동정을 실시하는 것을 특징으로 하는, 선충에 있어서의 냄새 수용체의 동정 방법을 제공한다.

본 발명의 동정 방법은, 수용체를 코드하는 유전자의 발현 또는 기능을 저해하고, 당해 저해된 선충에 있어서의 냄새에 대한 반응을 검사하는 공정을 포함한다.

후각 수용체 유전자의 발현 또는 기능 저해는, 상기한 바와 같이 RNAi 를 이용한 저해, 안티센스 핵산을 이용한 저해, 도미넌트 네거티브형 변이 유전자의 발현에 의한 저해 등을 들 수 있지만, RNAi 를 이용한 저해가 바람직하다.

수용체 유전자의 발현을 저해한 선충을 이용하여, 각종 암 유래의 시료의 냄새에 대한 반응을 검사한다. 어느 암종에 의해 냄새에 대한 반응이 없는 경우에는, 수용체는 당해 암종의 냄새에 대한 수용체라고 판단할 수 있다.

또, 동정되는 수용체의 종류는, 또는 냄새 물질의 농도에 의존하여 상이하다. 따라서, 어느 농도의 시료에 대해서 반응하는지를 검사하고, 고농도의 시료에 대한 수용체, 및 저농도의 시료에 대한 수용체를 동정할 수 있다.

후각계는, 다양한 냄새나 물질을 감지하고, 응답한다. 후각 수용체는, 대부분의 생물에 있어서, G 단백질 (헤테로 3 량체 구아닌 뉴클레오티드 결합 단백질) 결합형 수용체이며, 휘발성 또는 가용성 냄새 물질에 직접 결합한다. 포유 동물의 게놈과 비교하여, 선충 시노랩디티스·엘레강스 (Caenorhabditis elegans) 의 게놈은, 보다 많은 추정 상의 후각 수용체 유전자를 포함하고, 이것은, 선충에 있어서, 수용체-냄새의 관계에 대해서, 조합적인 복잡함이 존재할 수 있는 것을 시사하고 있다. 본 발명자는, 특정한 냄새 물질에 대한 응답에 필요해지는 선충의 후각 수용체를 동정하기 위해서, RNA 간섭 (RNAi) 스크리닝을 이용하였다. 이 스크리닝에 의해, 11 개의 냄새 물질에 관련지어진 194 개의 후보 후각 수용체 유전자를 동정하였다. 또한, 본 발명자는, 고농도의 디아세틸의 감지에 관여하는 것으로서 SRI-14 를 동정하였다. 레스큐 및 뉴런 특이적인 RNAi 실험에 의해, SRI-14 가, 특정한 화학 감각 뉴런인 ASH 뉴런 (싫은 냄새나 화학 물질을 수용하는 선충의 감각 신경) 에 있어서 기능하고, 기피 응답을 가져오는 것을 실증하였다. 칼슘 이미징에 의해, ASH 뉴런은 고농도 디아세틸에 대해서만 응답하고, 한편, 다른 종류의 화학 감각 뉴런인 AWA 뉴런 (주로 좋아하는 냄새를 수용하는 선충의 후각 감각 신경) 은, 낮은 농도와 높은 농도의 양방에 반응하는 것을 나타내었다. SRI-14 의 기능 상실은, 고농도 디아세틸에 대한 ASH 의 응답을 방해하고, 한편, ODR-10 의 기능 상실은, 저농도 디아세틸에 대한 AWA 의 응답을 감소시켰다. SPI-14 를 이소적으로 발현하고 있는 화학 감각 뉴런은, 고농도의 디아세틸에 대해서 응답하였다. 따라서, 선충은, 후각 수용체 레벨과 감각 뉴런 레벨로 분별되는, 농도 의존적인 냄새나 감수성 기구를 갖는다.

일반적으로 동물은, 그들의 후각계를 통해서 다양한 냄새나 물질을 감지하고, 응답한다. 냄새 물질은, 그 대부분은 휘발성 화합물이며, 후각 수용체 뉴런 (ORN) 에 의해 감지된다. ORN 에 있어서, 냄새 분자는, 후각 수용체에 직접 결합하고, 다음으로, 세포 내 시그널 전달 경로를 통해서 정보를 전달한다 (1). 포유 동물에 있어서, 후각 수용체는, 7 회 막관통형 G 단백질 (헤테로 3 량체 구아닌 뉴클레오티드 결합 단백질) 결합형 수용체 (GPCR) 패밀리의 일원이며 (2), 단 1 개의 후각 수용체형이 임의의 개개의 ORN 에 존재한다 (3). 그러나, 냄새와 수용체의 대응 관계의 동정을 목적으로 한 각종 연구에도 불구하고, 개개의 냄새와 수용체의 관계는 대부분이 미지의 상태이다 (4, 5). 맛 (미각 (gestation)) 은 유사한 프로세스이지만, 가용성 화학 물질의 검출에 관여한다.

선충 시노랩디티스·엘레강스 (Caenorhabditis elegans) 는, 냄새 (smell) 및 맛에 관련된 화학 감각 프로세스의 분석 (후각, 휘발성 시그널의 검출, 및 미각, 가용성 시그널의 검출) 에 사용되는 모델 생물이며, 화학 물질에 응답하는 것이 알려져 있는, 약 13 개의 감각 뉴런을 통해서, 다수의 화학 자극 (chemical cue) 을 감지하고, 응답한다 (6, 7). 편의상, 본 발명자는, 후각으로서 이 화학 감각 프로세스, 및 냄새 물질로서 화학 물질을 언급한다. 선충 (C. elegans) 게놈은, GPCR 을 코드하는 1200 을 초과하는 추정 상의 후각 수용체 유전자를 포함하는 것이 예측되며, GPCR 은 화학 감각 뉴런 중 11 개에 있어서 발현이 보인다 (8). 이들 소견은, 후각과는 상이하지만, (3), 포유 동물에 있어서의 맛 인식 (10) 에 유사한, 각각의 ORN 에 있어서 복수 타입의 후각 수용체 (9) 가 발현하고 있을 가능성이 있는 것을 나타내고 있다. 그러나, 수용체와 냄새나 물질 또는 다른 화학 물질의 관계가, 디아세틸에 특이적인 수용체인 ODR-10 (11) 및 페로몬 수용체 (GPCR 이기도 하다 (12 ∼ 14)) 에 대해서만 동정되어 있을 뿐으로, 선충 (C. elegans) 의 ORN 에 있어서의 수용체의 이들 조합에 의해 어떻게 냄새 물질이 감지되는지는 알려져 있지 않다.

많은 동물과 마찬가지로, 선충 (C. elegans) 도 또한, 특정한 냄새 물질에 기호성을 나타내고, 그것들을 AWA 또는 AWC 후각 뉴런에 의해 감지했을 때, 냄새 물질에 대한 유인 행동 (attraction behavior) 을 나타내고, AWB, ASH, 또는 ADL 감각 뉴런에 의해 물질을 감지했을 때, 기피 행동을 나타낸다 (6, 15, 16). 그러나, 몇 개의 뉴런은, 기피 행동과 유인 행동의 양방에 관여하고 있으며, 예를 들어, AWB 뉴런이 해당한다 (16). 본 발명자들은, 지금까지, 선충 (C. elegans) 에 있어서의, 동일한 냄새 물질에 대한 유인 응답 또는 기피 응답이, 냄새 물질의 농도에 의존하는 것을 나타내었다 (17). 이것은, 동일한 냄새 물질이라도 농도에 따라 상이한 후각 수용체가 기능한다는 가능성을 가져온다.

여기서는, 본 발명자는, 디아세틸의 상이한 농도를 상이한 후각 수용체가 매개하고, 그에 따라 기호성이 변화하는 것을 나타내었다. 냄새-수용체쌍을 스크리닝함으로써, 본 발명자는, 11 개의 냄새 물질에 대해서, 194 개의 후보 후각 수용체 유전자를 동정하였다. 이들 중, 본 발명자는, 고농도의 디아세틸에 특이적으로 응답하는 것으로서 SRI-14 를 동정하였다. 본 발명자의 결과는, 디아세틸의 수용에 대해, AWA 뉴런에 있어서의 ODR-10 은 저농도에 대해서 유인 응답을 매개하고, ASH 뉴런에 있어서의 SRI-14 는 고농도에 대해서 기피 응답을 매개하는 것을 나타내었다.

4. 암종의 특정

본 발명에 있어서는, 선충 주성 테스트에 의해 암종을 특정하는 것이 가능해진다. 따라서, 본 발명에 있어서는, 피검자 유래의 생체 관련 물질 또는 그 처리물의 냄새에 대한 선충의 반응을 지표로 하여 암종을 동정하는 것을 특징으로 하는 암종의 동정 방법을 제공한다.

암 탐지견의 연구로부터, 암종에 따라 냄새가 상이한 것으로 예상되고 있다. 그래서, 선충에 있어서, 암종 각각의 냄새에 대한 후각 수용체를 동정하고, 그 수용체를 개변한 개변체를 제조한다. 개변체에는, 수용체 유전자가 결실한 주 (결실 변이체), 수용체 유전자의 발현 또는 기능을 저해한 주, 수용체 유전자를 고발현 또는 고기능화한 주 등을 들 수 있다.

결실 변이체의 제조법으로는, CRISPR/Cas9 법 (Friedland et al, Heritable genome editing in C. elegans via a CRISPR-Cas9 system, Nature Methods, 2013) 등을 들 수 있다. 또, 수용체 유전자의 발현 또는 기능을 저해한 주, 수용체 유전자를 고발현 또는 고기능화한 개변 선충을 제조한다. 발현 또는 기능을 저해하려면, RNAi 를 이용한 저해, 안티센스 핵산을 이용한 저해, 도미넌트 네거티브형 변이 유전자의 발현에 의한 저해 등을 들 수 있다. 수용체 유전자를 고발현 또는 고기능화하려면, 수용체 유전자의 프로모터를 탠덤에 연결하는 방법, 인핸서를 도입하는 방법, 수용체 유전자를 다(多) 카피 도입하는 방법, 수용체의 냄새나 G 단백질과의 결합 부위에 개변을 가하는 방법, 수용체의 활성화나 국재, 냄새와의 친화성을 제어하는 부위에 개변을 가하는 방법 등이 있다.

본 발명의 동정 방법은, 예를 들어 이하의 공정을 포함한다.

(a) 먼저 단계 1 로서, 상기 본 발명의 검출 방법에 의해 암을 검출한다. 예를 들어, N2 주를 이용하여, 암종의 유무를 검사한다.

(b) 다음으로, 단계 2 로서, 각 암종의 수용체의 변이체나 수용체 유전자의 발현, 기능을 변화시킨 주를 이용하여, 암종을 특정한다.

상기 공정 (a) 에 있어서 암인 것이 검출된 시료에 대해, 상기 동정된 후각 수용체를 결실시킨 변이체 선충이나 수용체 유전자의 발현, 기능을 변화시킨 주를 이용하여, 냄새에 대한 반응을 검사한다.

(c) 상기 개변체 선충과, 상기 공정 (a) 에서 사용한 선충의 사이에서 냄새에 대한 반응이 상이할 때는, 동정된 수용체에 대응하는 암종을, 동정의 대상 암종이라고 판정한다.

예를 들어, 상기 변이체 선충이나 수용체 유전자의 발현 또는 기능을 저해한 선충 중 냄새에 대한 반응을 나타내지 않았던 선충에 있어서 동정된 수용체에 대응하는 암종을, 동정의 대상 암종이라고 판정한다. 혹은, 수용체 유전자를 고발현 또는 고기능화한 선충 중 냄새에 대한 반응이 항진한 선충에 있어서 동정된 수용체에 대응하는 암종을, 동정의 대상 암종이라고 판정한다.

예를 들어, 대장암 냄새의 수용체 변이체가 유인 행동을 나타내지 않는 경우, 대장암이라고 판단 (진단) 할 수 있다 (도 37).

5. 키트 및 시스템

본 발명은, 선충을 포함하는 암의 검출용 키트를 제공한다. 본 발명의 키트에는 선충이 포함되지만, 본 발명의 검출 방법을 실시하기 위해서 필요한 1 종 이상의 성분을 포함할 수 있다. 이와 같은 성분으로는, 예를 들어 완충액, 배양액, 아지화나트륨, 대장균, 샬레, 한천 등을 들 수 있다. 또 본 발명의 키트는, 필요한 성분 중 일부만을 포함하는 부분적 키트여도 되고, 그 경우에는, 사용자가 다른 성분을 준비할 수 있다. 또, 본 발명의 키트에는, 검출법 또는 동정법을 설명한 사용 설명서를 포함할 수 있다.

또, 본 발명은, 선충과, 생체 관련 물질 또는 그 처리물 및 상기 선충을 수용하는 수용부와, 상기 수용부의 선충의 행동을 탐지하는 탐지부를 구비하는 암의 검출 시스템을 제공한다.

도 16A 는, 본 발명의 시스템의 블록도이다. 도 16A 에 있어서, 본 발명의 시스템은 생체 관련 물질 또는 그 처리물 및 상기 선충을 수용하는 수용부 (30) 와, 상기 수용부 (30) 의 선충의 냄새에 대한 반응을 탐지하는 탐지부 (10) 와, 탐지된 정보를 처리하는 처리부 (20) 를 갖는다. 또한, 본 발명의 시스템은, 상기 처리부 (20) 에서 처리된 데이터를 보존하는 보존부 (40) 를 구비할 수 있다. 보존부 (40) 에는, 암 검출을 위한 프로그램이나 데이터베이스가 구비되어 있다.

수용부 (30) 는, 샬레, 배양 접시, 마이크로 유로를 갖는 칩 등이 예시되지만, 선충 및 시료를 수용할 수 있는 한 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 시스템은, 선충 중 적어도 1 마리의 동화상을 리얼 타임으로 촬영할 수 있는 적어도 1 개의 탐지부 (10) 를 포함한다. 탐지부 (10) 는 선충의 화상, 개체수, 움직임의 궤적 등의 데이터를 취득하는 디바이스이며, 현미경 또는 카메라, 예를 들어 형광 현미경, 디지털 현미경, 디지털 비디오 카메라 등을 구비한다. 현미경 및 카메라에는, 선충의 움직임을 추종할 수 있는 자동 추미 (追尾) (추적) 시스템을 구비할 수 있으며, 선충 1 마리마다 또는 복수 마리를 동시에 추적한다. 그리고, 그 궤적으로부터 선충의 이동 거리를 측정한다. 혹은, 소정의 에어리어에 집합되어 있는 선충을 촬영하고, 개체수를 센다. 또, 현미경 및 카메라에는, 형광 강도를 검출할 수 있는 센서를 구비할 수도 있다.

본 발명의 시스템에서는, 리얼 타임의 화상에 의해 선충의 움직임을 측정할 수도 있고, 정지 화상 (사진) 을 이용하여 선충의 움직임을 측정할 수도 있다. 리얼 타임으로 선충의 화상을 촬영하면, 선충의 위치를 동적으로 찾아 구하는 것이 가능하다.

도 16B 는, 본 발명의 시스템의 처리부 (20) 의 구성도이다. 처리부 (20) 는, 계산 수단 (110) 과 데이터베이스 (120) 로 구성되며, 계산 수단 (110) 은, (i) 검사 조건 설정 수단 (111), (ii) 선충의 반응 검사 수단 (112), (iii) 암의 판정 수단 (113), 및 (iv) 검사 결과 표시 수단 (114) 을 구비한다.

(i) 검사 조건 설정 수단 (111)

검사 조건 설정 수단 (111) 은, GUI (Graphical User Interface) 에 의해, 계산에 필요한 조건을, 마우스나 키보드로부터 입력하기 위한 수단이며, 입력된 정보는 그래프에 의해 확인할 수 있다.

검사 조건 설정 수단에 의해, 본 발명의 시스템에, 검사 목적에 따라 소정의 조건을 기억시켜 둘 수 있다. 조건으로서, 예를 들어, 선충의 개체수, 선충의 특징, 주화성 지수의 채택 여부, 측정 시간 등이 있다.

선충의 특징은, 결실 변이체인 것, 유전자 발현 등을 저해한 주인 것, 측정을 위해서 형광 단백질을 코드하는 유전자 (예를 들어, GFP 유전자, RFP 유전자 등) 가 도입된 것 등이 포함된다. 단, 조건은 이들에 한정되는 것이 아니라, 검사 목적에 따라 적절히 설정할 수 있다.

(ii) 선충의 반응 검사 수단 (112)

선충의 반응 검사 수단 (112) 은, 검사 조건 설정 수단 (111) 또는 데이터베이스 (120) 로부터 암을 검출 또는 동정하기 위한 계산식 (예를 들어, 주화성 지수) 을 선택함과 함께, 각각의 계산식에 기초하여, 선충의 반응을 계산하는 수단이다. 이 수단에서는, 소정 에어리어 내의 선충의 개체수의 측정, 1 마리의 선충이 움직인 총거리의 측정, 1 마리의 선충이 발하는 형광 강도의 검출 등을 실시하고, 피검 샘플에 반응한 선충의 행동을 기록한다. 예를 들어, 1 마리의 선충에 주목하여 샘플에 유인되어 이동했을 때의 거리를 측정하고, 각 선충의 이동 거리를 합산하여 총합을 구한다. 혹은, 선충에 형광 단백질 유전자를 도입했을 때는, 샘플에 반응한 선충의 형광 강도를 측정한다. 이것도 1 마리의 선충당 형광 강도를 측정하여 선충의 총합을 구해도 되고, 일정한 에어리어에 모인 선충 전체로부터 발하는 형광 강도를, 에어리어 단위로 측정할 수도 있다.

(iii) 암의 판정 수단 (113)

암의 판정 수단 (113) 은, 선충의 냄새에 대한 반응을 기초로 암의 유무를 검출하고, 또는 암의 종류를 동정하는 수단이다.

검사 조건으로서 개체수를 채용한 경우, 대조의 에어리어로 이동한 선충의 개체수에 대해서, 검사 대상 에어리어로 이동한 선충의 개체의 비 또는 차 등을 구한다. 검사 조건으로서 이동 거리를 채용한 경우, 대조 선충의 이동 거리와 비교하여 몇 ％ 많으면 반응했는지, 그 차 또는 비를 구할 수 있다. 미리 이 차 또는 비의 일정값을 경계값으로서 설정해 두면, 이 경계값은 암의 판정의 판단 기준으로서 사용된다. 또, 검사 조건으로서 형광 강도를 채용한 경우에는, 대조의 선충의 형광 강도와 비교하여 몇 ％ 많으면 반응하였다고 말할 수 있는지 등, 상기 이동 거리와 마찬가지로 경계값을 설정할 수 있다.

측정된 데이터와, 경계값과, 샘플 정보 (암종의 정보 등) 를 대비하여, 소정의 암인지 여부를 판정한다.

(iv) 판정 결과 출력 수단 (114)

판정 결과 출력 수단 (114) 은, 검출 또는 동정된 암종 또는 암의 유무에 기초하여 그 정보를 출력하는 수단이며, 암종 및 그 확률 (리스크) 을 표시한다. 표시는 그래프여도 되고 표여도 된다. 상기 (ii) 에 의해 계산된 선충의 행동의 애니메이션을 표시할 수도 있다.

(v) 데이터 축적 수단

입력된 검사 조건과 검사 결과는, 관련지어져 데이터 축적 수단으로서 데이터베이스 (120) 에 보존된다.

보존된 검사 조건과 계산 결과는, 재차 데이터베이스 (120) 로부터, 혹은 검사 조건 설정 수단 (111) 과 판정 결과 표시 수단 (114) 으로부터 읽어들일 수 있다.

이하, 실시예에 의해 본 발명을 더욱 구체적으로 설명한다. 단, 본 발명은 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

[실시예 1]

암의 검출

(i) 선충의 사육

야생형 선충 N2 의 성충을 6 ㎝ 샬레 (대장균을 뿌린 NGM 배지) 에 5 ∼ 6 마리 두고, 4 일간, 20 ℃ 에서 배양하였다. 다음 세대의 선충을 300 ∼ 500 마리 정도, 성충까지 길렀다.

(ii) 주성 해석

9 ㎝ 샬레에 도 2 에 나타내는 포맷을 작성하고, 4 점에 아지화나트륨 (NaN₃) 을 0.5 ㎕ 씩 두었다.

선충 사육 플레이트에 세척 완충액 1 ㎖ 를 뿌리고, 떠오른 선충을 완충액 째 튜브에 회수하였다. 잠깐 놓아두면 선충이 아래에 가라앉으므로, 가라앉은 곳에서 상청액을 폐기하였다. 또한 튜브에 세척 완충액 1 ㎖ 를 넣고, 선충이 아래에 가라앉은 곳에서 상청액을 폐기하였다. 이 세정을 3 회 반복하고, 대장균을 제거하였다.

9 ㎝ 샬레의 「＋」 의 곳에, 멸균수에 의해 10 배로 묽게 한 뇨 샘플을 1 ㎕ 씩 두었다.

다음으로, 샬레의 중심에 선충을 100 마리 정도 두고, 1 시간 선충을 사육하였다 (자유롭게 행동하게 하였다). 실온은 23 ℃ ± 1 ℃ 에서 실시하였다.

1 시간 후, ＋ 측의 개체수, ― 측의 개체수를 세어 주화성 지수를 계산하였다.

1 검체당 5 회 해석을 실시하고, 5 회분의 주화성 지수 값의 평균값을 계산하였다.

(iii) 결과

결과를 도 1 에 나타낸다. 도 1 로부터, 정상인 유래의 대조의 뇨 (c1 ∼ c10) 는 모두 부 (―) 의 주화성 지수 (기피 반응) 를 나타낸 데 반해, 암 환자 유래의 뇨 (p1 ∼ p20) 는 모두 정 (＋) 의 주화성 지수 (유인) 를 나타내고, 100 ％ 의 정밀도로 암을 검출할 수 있었다.

또한, 도 1 에 있어서 에러 바는 SEM 을 나타낸다.

[실시예 2]

칼슘 이미징

마이크로 유로를 사용한 이미징 실험에 있어서는, 뇨 샘플은 얇은 튜브 중에 흘릴 필요가 있기 때문에, 뇨 중의 침전물 및 고형물을 원심 및 여과에 의해 제거하였다 (기공 크기 0.22 ㎛, MillexGP, Merck Millipore). AWC 및 AWA 뉴런을 모니터하기 위해서, 각각 odr-1 및 odr-10 프로모터에 의해 황색 카멜레온 (Yellow Cameleon) 유전자 (YC3.60) 를 신경 세포에 발현시켰다. 칼슘 이미징은, 공지 방법으로 실시하였다 (Uozumi, T. et al. Temporally-regulated quick activation and inactivation of Ras is important for olfactory behaviour. Sci Rep 2, 500 (2012) ; Shinkai, Y. et al. Behavioral choice between conflicting alternatives is regulated by a receptor guanylyl cyclase, GCY-28, and a receptor tyrosine kinase, SCD-2, in AIA interneurons of Caenorhabditis elegans. J Neurosci 31, 3007-3015 (2011)).

선충의 머리부를 마이크로 채널 밖으로 낼 수 있도록, 선충을 마이크로 채널에 고정시켰다 (도 5). 대조의 뇨 및 암 환자 유래의 뇨의 각각에 대해, 동일한 선충을 이용하여 반응을 시험하였다.

YC3.60 의 형광 화상은, Leica DMI3000B 현미경 (40 배 대물 렌즈) 및 ORCA-D2 디지털 카메라 (Hamamatsu) 를 사용하여 취득하였다. 모든 화상은, 노광 시간 200 ms 로 취득하였다. AWC 또는 AWA 신경의 CFP 및 YFP 의 형광 강도를 취득하고, CFP 의 형광 강도에 대한 YFP 의 형광 강도의 비에 대해, Metamorph 소프트웨어 (Molecular devices) 에 의해 해석하였다. 이 형광 강도비는, YFP 강도/CFP 강도 (=R) 로서 계산하고, 10-s 윈도우의 비의 평균 (―10-0 s) 을 R0 으로서 세트하였다.

암 환자 유래의 뇨에 대해서, 선충의 AWC 및 AWA 후각 신경의 반응을 시험한 결과를 도 7, 8 에 나타낸다.

도 7 에 있어서, 왼쪽 2 개의 패널은 대조 뇨, 오른쪽 2 개의 패널은 위암 환자 유래의 뇨를 사용하여 시험한 결과이다. 도 7 은 AWC 후각 신경의 뇨 자극 (뇨 있음 → 없음) 에 대한 칼슘 농도 변화 (황색 카멜레온 (Yellow Cameleon) 의 YFP/CFP 비 변화) 를 나타내는 도면이다. 정상인의 뇨 (대조) 와 비교하여, 암 환자의 뇨에 대해서 유의하게 강하게 반응하였다. 도 8 은 평균의 형광 강도비 (YFP/CFP 비) 의 변화량을 나타낸다. *** 는 p < 0.001 에서 유의한 것을 나타낸다.

또한, 본 실시예에 있어서 뇨 중의 침전물 및 고형물은 원심 분리 및 여과에 의해 제거했지만, 이 처리에 의해 선충의 화학 주성에는 영향을 미치지 않았다 (도 9). AWA 후각 신경에 대해서도, 뇨의 첨가에 의해 응답이 관찰되었다 (도 10, 11).

이들 결과는, 대조의 뇨와 암 환자 유래의 뇨를 식별하기 위해서 선충의 후각 신경이 중요한 역할을 하고 있는 것을 나타내는 것이며, 도 7 ∼ 11 로부터, 선충의 후각 신경을 이용하여 암을 검출할 수 있는 것을 나타내는 것이다. 또한, 도 8, 9 및 11 에 있어서, 에러 바는 SEM 을 나타낸다.

[실시예 3]

본 실시예에서는, 피검자 유래의 생체 관련 물질의 모델로서, 수립된 암 세포주, 및 배양 배지 또는 보존액을 사용하여, 암의 검출 실험을 실시하였다.

(1) 암 세포주를 이용한 암의 검출

인간 암 세포의 배양 상청액을 사용한 암 검출을 실시하기 위해거, 대장암 (결장 직장암) 세포로서 SW480, COLO201 및 COLO205, 유방암 세포로서 MCF7, 위암 세포로서 NUGC4, MKN1 및 MKN7 을 사용하였다.

SW480, COLO201 및 COLO205 는 독립 행정법인 의약 기반 연구소 JCRB 셀 뱅크 (Japanese Collection of Research Bioresources Cell Bank (Tokyo, http://cellbank.nibio.go.jp)) 로부터 입수하고, 그 이외의 세포는 토호쿠 대학 가령 의학 연구소 의료용 세포 자원 센터 (Cell Resource Center for Biomedical Research, Institute of Development, Aging and Cancer (Tohoku University, Sendai, Japan)) 로부터 입수하였다. 모든 세포주는, 10 ％ FBS 첨가 RPMI 1640 배지를 사용하고, 37 ℃, 5 ％ CO₂ 에어레이션하에서 컨플루언트가 아닌 상태에서 유지하였다. 배지 상부의 맑고 깨끗한 층의 배양액을 시험에 사용하였다. 세포를 배양한 후의 배지는, 어세이 플레이트 (도 12) 의 「＋」 의 위치에 스폿하였다. 배지 자체의 냄새에 의한 영향을 없애기 위해서, 세포를 배양한 배지의 스폿 위치와는 반대측의 위치에, 동일한 농도로 희석한 대조의 배양액을 스폿하였다 (도 12).

실시예 1 과 동일하게 어세이 플레이트 상에서 선충의 화학 주성을 시험한 결과, 야생형 선충 (C. elegans) 은, 암 세포의 배양 배지 (1/10⁶ ∼ 1/10⁷ 로 희석) 에 대해 유인 행동을 나타내었다 (도 13).

도 13 중, 각 세포에 있어서의 좌측의 바는 1/10⁶ 희석, 우측의 바는 1/10⁷ 희석의 암 세포 배양 배지를 사용한 결과이다. 또, ^* 는 p < 0.05, ^** 는 p < 0.01, ^*** 는 p < 0.001 에서 유의한 것을 나타낸다 (두네트 검정 (Dunnett's test)). 또, 도 13 중, 에러 바는 SEM 을 나타낸다.

선유아 세포 (암화되어 있지 않은 세포) 의 배양액 또는 보존액에 대해서도 상기와 동일하게 시험한 결과, 선충은 유인 행동을 나타내지 않는 (약한 기피) 것이 나타났다 (도 13). 이것은, 「인간의 세포의 분비물」 에 선충은 유인 행동을 나타내고 있는 것이 아니라, 「암 세포의 분비물」 에 유인 행동을 나타내는 것을 의미한다.

MEM, EMEM, RPMI 는 배지만. KMST-6, CCD-112CoN 은 선유아 세포 (입수처는 각각 RBC, ATCC).

(2) 선유아 세포 배양 배지 및 암 세포 배양 배지에 대한 주성

또, 다양한 농도의 선유아 세포 배양 배지 및 암 세포 배양 배지에 대한 주성, 그리고 인간의 암 조직에 대한 선충의 주성을 검토하였다. 수법은 이하와 같음. 선유아 세포 배양 배지 및 암 세포 배양 배지를 물로 각종 농도 (원액 ∼ 10^-9) 로 묽게 하고, 그에 대한 야생형 선충의 화학 주성을 관찰하였다. 인간의 암 조직, 정상 조직에 대해서는 인폼드 컨셉을 얻은 다음에 암 환자로부터 절제하고, 그것을 직경 0.1 ∼ 0.8 ㎜ 로 세분하여 사용하였다.

그 결과, 섬유아 세포에 대해서는 어느 농도에서도 유인 행동은 나타내지 않는 데 반해, 암 세포에 대해서는 10^-6, 10^-7 의 농도로 유의한 유인 행동이 관찰되었다 (도 17, 18).

인간의 암 조직에 대한 선충의 주성에 대해서는, 암 조직편에 대해서 유인 행동을 나타내는 데 반해, 동일 환자의 정상 조직 (암 조직으로부터 가장 떨어진 조직) 에 대해서는 기피 행동을 나타내었다 (도 19). 편측에 암 조직, 반대측에 정상 조직을 두면, 암 조직의 쪽에 선충이 접근하는 것도 알 수 있었다.

(3) 암 조직 절편의 생리 식염수 보존액에 대한 주성

인간의 암 조직편을 생리 식염수에 넣어 ―20 ℃ 에서 보존하였다 (보존 기간：3 개월). 그 생리 식염수의 희석액에 대한 선충의 주성을 검토하였다.

암 환자로부터 인폼드 컨셉을 얻은 다음에 암 조직을 직경 0.5 ㎝ 절제하고, 20 ㎖ 의 생리 식염수에 넣었다. 그 생리 식염수를 물로 10^-2 ∼ 10^-4 의 농도로 묽게 하고, 그에 대한 야생형 선충의 화학 주성을 관찰하였다.

그 결과, 암 조직을 넣은 생리 식염수에 대해서는 유인 행동을 나타내는 데 반해, 정상 조직을 넣은 생리 식염수에 대해서는 기피 행동을 나타내었다 (도 20).

odr-3 변이체는 암 조직의 식염수에 유인 행동을 나타내지 않기 때문에, 선충은 냄새를 느끼고 있다고 말할 수 있다.

[실시예 4]

중규모 시험

본 발명의 방법이 고정밀도인 것을 확인하기 위해서, 242 개의 뇨 샘플 (218 의 대조 샘플, 24 의 암 환자 유래의 샘플) 을 사용하여 시험을 실시하였다 (표 1). 표 1 은 피검자의 배경을 나타낸다.

[표 1]

모든 뇨 샘플은 10 배로 희석하고, 선충을 이용한 화학 주성 시험은, 각 샘플에 대해 3 회 실시하였다.

그 결과, 선충은 암 환자 유래의 모든 뇨 (24/24) 에 대해서 유인 반응을 나타내고, 검출 감도는 100 ％ 였다 (도 14). 한편, 선충은, 대부분의 대조 뇨 샘플 (207/218) 에 대해서 기피 행동을 나타내었다 (도 14). 도 14 에 있어서, 오렌지 바 (1, 2, 41, 44, 54, 56, 90, 157, 196, 202, 208, 213, 220, 226, 232-239 및 241-242 번) 는 암 환자 유래의 샘플, 푸른 바 (상기 이외의 번호) 는 대조 샘플을 나타낸다. 또, 도 14 중, 에러 바는 SEM 을 나타낸다.

본 발명자는 또, 동일 피검자에 대해, 다른 종양 마커에 대해서도 해석하였다.

해석 대상이 되는 종양 마커로서, 혈청 CEA, 혈청항 p53 항체 (항-p53Ab) 및 뇨 N¹,N¹²-디아세틸스페르민 (DiAcSpm) 을 사용하였다. 이들 종양 마커와 비교하여, 본 발명의 방법 (NSDT) 에 의한 감도는 매우 높았다 (도 15, 표 2). 또한, 감도 (％) 는, 암 환자 유래의 샘플에 대한 양성의 비율이다.

[표 2]

표 2 에는, 스테이지 0 및 1 의 암 환자가 포함되어 있다. 이것은, 본 발명의 방법은, 조기암의 검출에도 유용한 것을 의미하고 있다.

[실시예 5]

뇨의 최적 농도의 검토

방법：

정상인의 뇨 샘플 3 검체 (c1, c2, c3), 암 환자의 뇨 샘플 5 검체 (p2, p5, p8, p17, p18) 에 대해 물로 각종 농도 (원액 ∼ 10^-5) 로 묽게 하고, 그것들에 대한 야생형 선충의 화학 주성을 조사하였다.

결과：

도 21 로부터, 10 배 희석이 바람직한 것이 나타났다. 도 21 에 있어서, 각 농도에 기재된 막대 그래프는, 좌측 3 개의 그래프가 정상인 유래의 뇨, 우측 5 개의 그래프가 암 환자 유래의 뇨를 사용했을 때의 결과를 나타낸다.

[실시예 6]

수용체의 동정

(1) 재료 및 방법

선충 배양 및 선충주

선충 (C. elegans) 은, 대장균 (E. coli) OP50 과 함께 배양한 eri-1 변이체를 제외하고, 음식원으로서 대장균 (Escherichia coli) NA22 를 포함하는 선충 증식 배지 (NGM) 플레이트 (36) 상에서, 표준적인 조건하에서 20 ℃ 에서 배양하였다. 사용한 야생형 선충은, Bristol N2 주였다. 다른 선충주로서, GR1373：eri-1(mg366), VC2123：sri-14(ok2865), CX3410：odr-10(ky225), 및 MT7929：unc-13(e51) 을 사용하였다.

RNA 간섭 및 화학 주성 어세이

RNAi 어세이는, Ahringer 라이브러리 (37) 을 이용하여, eri-1(mg366)(19) 에 대해서, 먹이에 의한 RNAi 법 (피딩 (feeding) RNAi 법) 에 의해 실시하였다.

9 개체의 eri-1 변이체의 성충을, 이소프로필β-D-1-티오갈락토피라노시드 (0.19 g/ℓ), 암피실린 (60 mg/ℓ), 및 대장균 (E. coli) 을 포함하는 NGM 플레이트 상에 두고, 4 일간 배양하였다. 다음으로, 성충을 화학 주성 어세이에 사용하였다. 화학 주성 어세이는, 이전에 보고되어 있는 바와 같이 실시하였다 (6, 17). 화학 주성 어세이에 대해, 본 발명자는, 각각 1 ㎕ 의 10^-3 혹은 10^-4 희석된 냄새 물질 (저농도), 또는 각각 1 및 5 ㎕ 의 미희석의 냄새 물질 (고농도) 을 사용한 각각의 실험에 있어서, 30 ∼ 50 개체를 사용하였다.

RNAi 스크리닝 결과의 통계 분석은 이하와 같이 실시하였다.

모든 날 (표 3) 또는 매일의, 2SD 로부터의 각각의 단일 시험의 z 스코어와 대조값을 계산하였다. 큰 차로서의 임계값으로서 z 스코어 (―1.96 및 1.96, P < 0.05) 를 이용하였다. 그러나, 1 개의 수용체의 저해가 현저한 효과를 일으키지 않는 것 같았다. 따라서, 본 발명자는, 보다 약한 임계값으로서 z 스코어 ±1 (―0.96 및 0.96, P < 0.33) 을 이용하였다.

삼투압 기피

본 발명자는, 삼투압 자극을 위해서 4M NaCl 을 사용하고, 삼투압 기피 행동에 대해 이전에 보고되어 있는 바와 같이 어세이하였다 (38).

sri-14 의 기능의 세포 특이적 녹다운

특이적 뉴런에 있어서의 sri-14 의 기능을 녹다운하기 위한 도입 유전자의 구축은, 이전에 보고되어 있는 바와 같이 실시하였다 (24). sri-14 의 표적 영역 (1.6 kb 의 게놈 배열) 을 이하의 2 개의 프라이머를 이용하여 증폭하였다.

Tf, 5'-ggcgccgatataattgctaa-3' (배열 번호 1), 및

Tr, 5'-ctgctgcgtttttcgtatca-3' (배열 번호 2)

유전자 발현은, ASH 에 대해서는 sra-6(20) 프로모터에 의해, 및 AWC 에 대해서는 ceh-36(39) 와 srd-17 프로모터에 의해 실시하였다.

뉴런의 유전적 제거 및 저해

본 발명자는, AWA, AWB, AWC, 및 ASH 뉴런의 제거를 위해서 마우스의 카스파제-1 (mCasp1) 을 사용하였다. 이들은, 각각, odr-10(11), str-1(15), ceh-36(39), 및 sra-6(20) 프로모터에 의해 발현시켰다. 또, 개재 뉴런의 저해를 위해서 unc-103(gf) 를 사용하였다. unc-103(gf) 의 AIA-, AIB-, AIY-, 또는 AIZ- 특이적 발현은, 각각, gcy-28.d(29), npr-9(40), ttx-3(41, 42), 또는 lin-11(43, 44) 프로모터에 의해 실시하였다.

sri-14 cDNA 의 조제 및 증폭

PureLink RNA 미니 키트 (Ambion) 를 사용하여 단리된 전체량 RNA 는, 제조업자의 지시서에 따라, gDNA Remover (Toyobo) 를 사용한 ReverTra Ace qPCR 마스터 믹스에 의해 cDNA 로 변환하였다. sri-14 cDNA 를 하기의 2 개의 프라이머를 사용하여 증폭하고, NheI 와 KpnI 로 소화하고, pPD-DEST 벡터 (Invitrogen) 에 삽입하였다.

5'-gagaGCTAGCaaaaaatgcctgcaggtccac-3' (배열 번호 3)

5'-gagaGGTACCttattgaattctcggttg-3' (배열 번호 4)

칼슘 이미징

AWA, AWB, AWC, 및 ASH 뉴런의 응답을 모니터하기 위해서, 본 발명자는, 각각, odr-10, str-1, odr-3, 및 sra-6 프로모터 (11, 15, 20, 45) 를 사용하여, YC3.60 을 발현하는 주를 제조하였다. 칼슘 이미징은, 이전에 보고되어 있는 바와 같이 (33, 46, 47), 마이크로 유체 디바이스를 사용하여 실시되었다. 마이크로 유체 디바이스를 사용한 실험에 대해, 선충의 코가, 디아세틸 [10^-5 희석 (저농도) 과 10^-3 희석 (고농도)] 또는 냄새가 없는 용액을 포함하는 유수에 노출되도록, 마이크로 채널에 선충을 포착함으로써, 각각의 선충을 고정시켰다. 실온은 20 ℃ 내지 23 ℃ 로 설정하였다. YC3.60 의 형광 화상은, 40× 대물 렌즈와 3CCD 디지털 카메라 (C7780, Hamamatsu Photonics) 를 구비한 Zeiss Axioplan 2 를 사용하여 얻었다. 모든 화상은, 노광 시간을 200 ms 로 하여 회수하였다. AWA, AWB, AWC, 및 ASH 세포체의 타임 스택을 포착하고, AquaCosmos 소프트웨어 (ver. 2.6, Hamamatsu Photonics) 를 사용하여, 황색 형광 단백질 (YFP) 과 시안 형광 단백질 (CFP) 의 발광비에 대해 분석하였다. 이 비는, YEP 강도/CFP 강도 (R) 로서 계산되고, 10 초 윈도우 (―10 ∼ 0 초) 에 있어서의 평균비는, R0 으로서 설정하였다.

(2) 결과

냄새-수용체쌍의 RNA 간섭 스크리닝

특정한 냄새 물질에 대한 응답에 필요해지는 후각 수용체를 망라적으로 동정하기 위해서, 본 발명자는 시스테마틱 RNA 간섭 (RNAi) 스크리닝을 실시하였다. 선충 (C. elegans) 에 있어서의 뉴런의 RNAi 는, RNAi 에 대한 선충 (C. elegans) 뉴런의 저감수성 때문에 (18), 야생형 선충에 있어서는 유효하지 않기 때문에, RNAi 증강형 선충주 eri-1(mg366)(19) 를 사용하였다.

본 발명자는, eri-1 변이체에 있어서의 RNAi 에 의해 odr-10 의 녹다운이, 저농도 (10^-3 희석) 의 디아세틸에 대한 응답에 특정한 결함을 일으키는 것을 나타내고, 이 선충주가, 후각 수용체 유전자의 RNAi 스크리닝에 효과적으로 사용될 수 있는 것을 확인하였다 (도 22). SRH 패밀리를 포함하는, 822 개의 추정 상의 후각 수용체를 코드하는 유전자 (모든 유전자가 GPCR 을 코드한다) 를 스크리닝하였다. 그리고, 11 개의 냄새 물질에 대한, RNAi 처리된 선충의 응답을 시험하였다. 선충 (C. elegans) 은, 냄새 물질의 농도에 의존하여 기호성이 변화할 수 있기 때문에 (17), 또한, 고농도 (미희석의 냄새 물질의 각각 1 ㎕ 와 5 ㎕) 의 냄새 물질 (저농도에서는 유인 행동을 일으킨다) 에 대한 응답도 시험하였다. 냄새 물질은, 저농도의 6 개의 유인 물질 (6), 고농도로 기피를 유도하는 3 개의 고농도 유인 물질 (17), 및 고농도의 2 개의 기피 물질 (6, 20) 을 포함하는 것으로 하였다 (도 22).

냄새 물질에 대한 화학 감각 유도성의 운동 응답에 이상을 나타낸 RNAi 처리 선충주에 대해서는 반복 시험하였다 (재료 및 방법을 참조) (표 3). 제 3 차 스크리닝의 결과, 194 개의 추정 상의 후각 수용체를 코드하는 유전자를 표적으로 하는 RNAi 는, 1 개 또는 복수의 냄새 물질에 대해서, 대조보다 약한 응답을 일으켰기 때문에, 후각 수용체 후보를 코드하는 것으로 생각되었다 (도 22 및 표 4).

감각 뉴런에 발현하는 유전자는 후각 수용체로서 작용할 가능성이 있기 때문에, 이들 유전자의 발현 패턴을 조사하였다.

본 발명자는, 개개의 후각 수용체를 코드하는 유전자의 프로모터에 연결된 형광 리포터를 사용하여, 녹다운했을 때에 화학 감각 유도성의 운동에 있어서 중대한 결함을 나타낸, 16 개의 추정 상의 후각 수용체를 코드하는 유전자의 발현 패턴을 분석하였다 (도 22C 및 도 23, A ∼ L). 또한, 19 개의 후각 수용체 유전자의 발현 패턴은, WormBase (http://www.wormbase.org) 에 기재되어 있는 정보를 이용하였다. 이들 35 개의 유전자 중, 30 개는 뉴런에 있어서 발현하였다. 리포터 발현에 의해 분석한 16 개의 유전자 중 15 개는, 냄새 감각에 관여하는 감각 뉴런에 있어서 발현하였다 (표 5).

고농도의 디아세틸에 응답하는 후각 수용체 SRI-14 의 동정

ODR-10 은 디아세틸 수용체이며, odr-10 변이체는, 낮은 디아세틸 농도에 대한 화학 주성에 결함이 있다 (11). 종래 보고되어 있는 바와 같이 (11), 본 발명자는, odr-10 변이체가 고농도 디아세틸에 대해서, 정상적인 화학 주성을 나타내는 것을 확인하였다 (도 24A). 이것은, 디아세틸에 대해서 다른 수용체가 존재하고, ODR-10 이 저농도에 특이적일 가능성이 있는 (21) 것을 시사하고 있다. RNAi 스크리닝에 의해, 5 개의 후각 수용체 후보 유전자 (srh-25, srh-79, srh-216, srh-281, 및 sri-14) 가 고농도 디아세틸에 관여하는 것으로서 얻어졌다 (표 3 및 도 25). 그래서 본 발명자는, 상류의 프로모터를 이용하여 발현 해석을 실시한 결과, srh-79 및 srh-216 의 발현은 검출할 수 없고, srh-25 및 srh-281 의 발현은, 고농도의 디아세틸에 대한 기피 행동에 관여하고 있지 않는 ADL 감각 뉴런에 있어서 관찰되었다 (표 5). 따라서, 다양한 수용체가, 어떻게 단일의 냄새 물질에 대해서 농도 의존의 반응을 발생시키고 있는지를 이해하기 위해서, 본 발명자는 sri-14 에 주목하기로 하였다. 이것은, 이 유전자를 표적으로 하는 RNAi 가, 고농도 디아세틸로부터의 기피에 있어서 유의하게 큰 결함을 일으켰기 때문이다 (도 24B).

SRI-14 는, 7 개의 엑손을 갖는 유전자에 의해 코드되고, WormBase 에 의하면, ok2685 는, 기능 결손인 것이 예측되는 결실 변이체이다 (도 26A). SRI-14 의 예상 아미노산 배열 (배열 번호 5) 에 의하면, 단백질이 추정 상의 7 회 막관통형 도메인을 갖는 것을 알 수 있었다 (도 26, B 및 C). 고삼투압 조건하에서의 sri-14 (ok2865) 변이체의 행동 분석은, 선충이 정상적인 고삼투압 기피 행동을 나타내는 것을 나타내었다. 그러나, sri-14 변이체는, sri-14 RNAi 처리된 선충과 동일하게, 고농도의 디아세틸에 대해서 기피 응답의 결함을 나타내었다 (도 24A). 또한, odr-10 변이체와 비교하여, sri-14 변이체는, 고농도 디아세틸에 특이적인 화학 주성의 결함을 나타내었다 (도 24A). sri-14 변이체는, 다른 기피 물질 및 고농도의 다른 유인 물질에 대해서 정상적인 응답을 나타내었다 (도 24C). 이것은, 조사한 냄새 물질 중, SRI-14 는 고농도 디아세틸의 감지에만 관여하는 것을 나타내고 있다.

리포터 발현 해석에 의해, sri-14 가 AWC 및 ASH 화학 감각 뉴런에 있어서 발현하고 있는 것을 알 수 있었다 (도 24D). AWC 뉴런은, 10 배 희석한 디아세틸을 포함하는 다수의 유인 물질의 감지에 필요해지고 (22, 23), ASH 뉴런은, 기피 물질 (9) 및 고농도의 이소아밀알코올 (17) 의 기피에 관여한다. SRI-14 가, 고농도의 디아세틸에 응답하여 AWC 또는 ASH 뉴런에 있어서 기능하는지를 분명히 하기 위해서, 본 발명자는, AWC 및 ASH 뉴런에 있어서, sri-14 의 뉴런 특이적 녹다운을 실시하였다 (24). sri-14 의 ASH 특이적 녹다운은, 디아세틸로부터의 기피에 있어서 결함을 일으켰지만, AWC 특이적 녹다운에서는 이상이 나타나지 않았다 (도 24E).

또한, 고농도 디아세틸로부터의 기피에 있어서의 sri-14 변이체의 결함은, sri-14 cDNA 의 ASH 특이적 발현에 의해 레스큐되었지만, AWA, AWB, 또는 AWC 후각 뉴런에 있어서의 특이적 발현에 의해, 부분적으로 레스큐 혹은 레스큐되지 않았다 (도 24F). 이들 결과는, ASH 감각 뉴런에 있어서의 SRI-14 의 기능이, 고농도 디아세틸로부터의 기피를 매개하기 위해서 필요하고 또한 충분한 것을 나타내고 있다. 고삼투압 조건에 대한 기피 응답은, ASH 뉴런에 의해 매개되고 (25, 26), 이 응답은, sri-14 변이체에 있어서 정상이고 (도 26 D), ASH 뉴런이 다른 기피 자극의 감지와 응답은 정상이었던 것을 나타내고 있다. 게다가, SRI-14-녹색 형광 단백질 (GFP) 융합 단백질은, ASH 뉴런의 감각 섬모에 국재하였다 (도 24G). 이것은, SRI-14 가, ASH 에 있어서의 감각 섬모에 있어서의 후각 시그널링의 인자로서 기능하는 것을 나타내고 있다.

냄새 물질의 농도에 의존한 기호성 변화에 관여하는 감각 뉴런 및 개재 뉴런의 동정

저농도의 디아세틸 (10^-4 희석 용액) 은 AWA 뉴런에 의해 감지되고 (6), 중간 농도 (10^-1 희석 용액) 는 AWC 뉴런에 의해 감지된다 (22, 23). 이들은 함께 유인을 매개한다. 그러나, 어느 감각 뉴런이, 고농도의 디아세틸 (미희석) 을 감지하고, 기피 응답에 관여하는지는 알려져 있지 않다. 이전의 연구에 있어서, ASH 및 AWB 감각 뉴런은, 고농도 이소아밀알코올 (17) 을 검출하고, 기피를 매개하는 것이 나타나 있다. 또한, AWC 및 AWB 뉴런은, 유인과 기피의 양방에 관여한다 (17, 27).

그래서 본 발명자는, 고농도 디아세틸에 대한 기피 응답에 있어서의 ASH, AWB, 및 AWC 감각 뉴런의 관여를 조사하였다. AWB 또는 AWC 가 유전적으로 제거된 선충은, 고농도 디아세틸에 응답한 화학 주성의 결함을 나타내지 않았다 (도 27A). 그러나, ASH 뉴런을 제거하면, 이 기피 행동이 저해되었다 (도 27A). 이들 결과는, 주로 ASH 뉴런이, 고농도 디아세틸 농도를 감지한 것을 나타내고, 이것은, SRI-14 가 ASH 뉴런에 있어서 기능하는 것을 나타내는 결과와 일치하고 있다.

AWA 뉴런이 디아세틸의 기피 및 디아세틸에 대한 유인을 매개하는지 여부를 조사하기 위해서, 본 발명자는, AWA 뉴런이 특이적으로 제거된 선충의 행동 응답을 분석하였다. AWA 가 제거된 선충은, 고농도 디아세틸로부터의 기피의 저하 (도 24A), 및 저농도에 대한 유인의 저하를 나타내었다 (도 27B). 이것은, 유인과 기피의 양방에 기능하는 AWC 와 AWB 뉴런의 능력에 유사하다 (17, 27). AWA 와 ASH 양방의 이중 제거는, 단일 제거보다 중대한 결함을 일으키고, 이것은, AWA 와 ASH 가 고농도 디아세틸에 대한 응답에 대해, 병행하여 작용하고 있는 것을 나타내고 있다 (도 27A).

냄새의 농도에 의존한 기호성 변화에 대한 개재 뉴런의 공헌을 분명히 하기 위해서, 본 발명자는, AWA 혹은 ASH 감각 뉴런 또는 양방의 감각 뉴런에 직접적인 시냅스 결합 또는 갭 결합을 갖는 AIA, AIB, AIY, 및 AIZ 개재 뉴런의 관여를 조사하였다 (도 27C). 이들 개재 뉴런을, 과분극을 가져오는 unc-103(gf) 의 뉴런 특이적 발현에 의해 개별적으로 저해하였다 (28, 29). AIA, AIY, 또는 AIZ 개재 뉴런의 기능 목표 저해는, 고농도 디아세틸에 노출된 선충에 있어서 기피로부터 유인으로 응답을 변화시키고 (도 27D), AIB 의 저해는, 기피 응답을 약하게 하였다. 이 결과는, 이들 개재 뉴런이, 냄새의 농도 의존적인 기호성 변화에 있어서 중요한 역할을 하는 것을 나타내고 있으며, AIB, AIY, 및 AIZ 가 고농도 및 저농도의 이소아밀알코올에 대한 상이한 행동 응답에 중요하다는 이전의 보고와 일치하고 있다 (17). 대조적으로, 저농도의 디아세틸에 대한 유인은, AIY 를 제거한 이들 개재 뉴런의 저해에 의해 영향을 받지 않았다 (도 27E). 이것은, 저농도 디아세틸에 대한 유인을 매개하는 신경 회로가, 고농도 디아세틸로부터의 기피를 매개하는 신경 회로와 상이한 것을 시사하고 있다.

냄새 농도에 의존한 후각 수용체의 구분 사용

본 발명자에 의한 선충의 행동 실험의 결과와 종래의 연구 결과 (11) 은, 디아세틸에 대한 농도 의존적인 기호성 변화가, 2 개 타입의 수용체, AWA 뉴런에 있어서의 ODR-10 과 ASH 뉴런에 있어서의 SRI-14 에 의해 매개되는 것을 시사하고 있다. 그래서 본 발명자는, 야생형 주, odr-10 변이체, 및 sri-14 변이체에 있어서, 유전적으로 코드한 칼슘 지시약인 황색 카멜레온 (Yellow Cameleon) (YC) 3.60 (30) 을 사용한 칼슘 이미징에 의해, 다양한 농도의 디아세틸에 대한 AWA 및 ASH 뉴런의 응답을 모니터하였다.

야생형 선충 또는 sri-14 변이체에 있어서의 AWA 뉴런은, 세포 내 칼슘이 저농도의 디아세틸에 노출 후에 증가하였다 (29) (도 28, A 및 B). 그러나, odr-10 변이체는 저농도 디아세틸에 응답을 나타내지 않았다 (도 28, A 및 B). 이것은, ODR-10 이 AWA 뉴런에 있어서 저농도 디아세틸에 특이적인 수용체로서 기능한다는 소견과 일치하고 있다 (21). 대조적으로, odr-10 변이체 및 야생형 선충에 있어서, AWA 뉴런이, 고농도의 디아세틸에 대해서 정상적으로 응답하였다 (도 28, C 및 D). 이들 결과는, odr-10 변이체가 고농도 디아세틸에 대해서 정상적인 화학 주성을 나타낸 소견과 일치하고 있다 (도 24A). 이들 뉴런의 제거가 유인과 기피 응답의 양방을 감소시켰기 때문에 (도 27, A 및 B), 이들 결과와 합하면, ODR-10 이외의 수용체가 AWA 뉴런에 존재하고, 고농도 디아세틸을 감지하는 것이 시사된다.

본 발명자는, ASH 뉴런에 있어서의 일과성 Ca2+ 응답을 모니터하였다. 야생형 선충의 ASH 뉴런에 있어서는, 고농도의 디아세틸에만 Ca2+ 응답이 검출되었다 (도 29A). 고농도 디아세틸에 대한 ASH 의 응답이 다른 뉴런에 의해 영향을 받는지 여부를 분명히 하기 위해서, 본 발명자는, 시냅스 소포 (小胞) 의 엑소사이토시스에 결손을 갖는, unc-13(e51) 변이체의 ASH 에 있어서의 Ca2+ 응답을 해석하였다 (31). unc-13 변이체의 ASH 뉴런에 있어서의 고농도의 디아세틸에 대한 칼슘 응답은, 야생형 선충의 ASH 뉴런보다 유의하게 크고, 오래 계속되었다 (도 30, A, B, 및 D). 이것은, 다른 뉴런으로부터의 시그널이 디아세틸에 대한 ASH 의 활성을 저해하고 있는 것을 나타내고 있다.

AWA 제거 선충에서는, 디아세틸에 대한 응답이 변화하는 것이 관찰되었기 때문에 (도 27, A 및 B), 또한 본 발명자는, ASH 뉴런에 있어서의 고농도의 디아세틸에 대한 칼슘 응답에 있어서의 AWA 제거 효과를 시험하고, AWA 뉴런의 제거가 ASH 뉴런의 칼슘 응답을 증강시키는 것을 알아내었다 (도 30, A, C, 및 D). 이것은, AWA 가 ASH 의 응답의 억제성 회로에 관여하는 것을 나타내는 것이다.

다음으로, 본 발명자는, 변이 선충의 ASH 뉴런에 있어서의 고농도 디아세틸에 대한 Ca2+ 응답을 모니터하였다. Ca2+ 응답은, odr-10 변이체의 ASH 뉴런에서는 정상적으로 일어났지만, sri-14 변이체의 ASH 뉴런에 있어서는 응답이 유의하게 감소하였다 (도 29, B 및 C). sri-14 변이체의 ASH 에 있어서의 고농도 디아세틸에 대한 응답의 결함은, 야생형 sri-14 유전자의 ASH 특이적 발현에 의해 레스큐되었다 (도 29, B 및 C). 또한, 야생형 선충에 있어서 ASH 특이적으로 sri-14 를 녹다운하면, 고농도의 디아세틸에 대한 ASH 의 Ca2+ 응답이 감소하였다 (도 29, B 및 C). 이들 결과는, SRI-14 가, ASH 뉴런에 있어서 고농도 디아세틸의 수용을 위한 주요한 컴포넌트로서 기능하는 것을 나타내고 있다.

sri-14 의 발현이 AWC 뉴런 그리고 ASH 뉴런에 있어서 관찰되었기 때문에 (도 24D), 본 발명자는, 고농도의 디아세틸에 대한 AWC 응답을 모니터하였다. AWC 에 있어서의 Ca2+ 농도의 증가는, 냄새 제거에 의해 발생한다 (32). 따라서, 본 발명자는, 고농도의 디아세틸의 제거 후에 AWC 뉴런의 응답을 시험하고, AWC 뉴런에 있어서 Ca2+ 응답이 일어나는 것을 알아내었다 (도 31). 이 결과는, 디아세틸이 AWC 및 AWA 에 의해 감지된다는 이전의 보고와 일치하고 있다 (22, 23). 그러나, AWC 의 제거는, 고농도 디아세틸로부터의 기피에 영향을 미치지 않았다 (도 27A). 이것은, AWC 뉴런의 응답이 디아세틸의 기피에 중요하지 않은 것을 나타내고 있다. 고농도의 디아세틸에 대한 행동 응답은 sri-14 의 AWC 특이적 발현 또는 sri-14 의 AWC 특이적 녹다운 중 어느 것에 의해서도 영향이 없었기 때문에 (도 24, E 및 F), 고농도 디아세틸에 대한 AWC 의 응답을 매개하는 SRI-14 이외의 수용체가 존재하고 있는 것으로 생각된다.

AWB 뉴런은, 일반적으로, 기피 행동과 관련지어진다 (15). 이전의 연구에서는, AWB 뉴런에 있어서의 Ca2+ 응답이 노나논 또는 높은 이소아밀알코올 농도의 제거 후에 발생하는 것이 보고되었기 때문에 (17, 33), 본 발명자는, AWB 뉴런에 있어서 sri-14 cDNA 의 이소성 발현을 실시하고, 다양한 농도의 디아세틸에 대한 Ca2+ 응답을 모니터하였다.

야생형 AWB 뉴런에 있어서, 본 발명자는, 저농도 또는 고농도의 디아세틸 중 어느 것에 있어서도 냄새 제거 후 약간의 Ca2+ 응답을 관찰하였다. 야생형 AWB 뉴런에 있어서의 이 약한 응답과 비교하여, 고농도 디아세틸의 제거에 대한 AWB 뉴런에 있어서의 Ca2+ 응답은, SRI-14 의 이소성 발현에 의해 유의하게 증강하였다. SRI-14 이소성 발현은, 저농도의 디아세틸의 제거에 대한 응답은 변화시키지 않았다 (도 32, A 및 B). 이 결과는, SRI-14 가, 고농도의 디아세틸의 감지에 기여한다는 우리의 결론을 지지하고 있다. 더불어, 이들 소견은, AWA 뉴런에 있어서의 ODR-10 및 ASH 뉴런에 있어서의 SRI-14 가, 각각 저농도 및 고농도 디아세틸에 응답하여, 유인 및 기피 행동을 매개하는 수용체로서 기능하는 것을 시사하고 있다 (도 33).

(3) 고찰

본 발명자는, 특정한 냄새 물질에 대해 후각 수용체를 망라적으로 동정하기 위해서 RNAi 스크리닝을 이용하였다. 선충 (C. elegans) 은, 후각 수용체 및 후각 시그널링이 포유 동물의 것과 유사하기 때문에 (23, 34), 후각 해석을 위한 모델 생물이라고 생각되고 있다. 또한, 후각 시그널이 신경 회로에 있어서 전달되는 경로를 더듬어 갈 수 있는 전체 신경 네트워크가 기술되어 있다 (35). 그러나, 대부분의 냄새 물질은, 특정한 수용체 또는 수용체 올리고머와의 대응 관계를 알 수 없고, 냄새 물질과 후각 수용체의 사이의 상호 작용의 기구는 알려져 있지 않다. 결론적으로, 어떻게 냄새 시그널이 인풋되는지, 어떻게 후각 시그널이 신경 회로 상을 전달되는지, 어떻게 선충 (C. elegans) 에 있어서의 소수의 ORN 이 매우 많은 냄새 물질을 식별할 수 있는지에 대해 이해되어 있지 않다. RNAi 스크리닝에 의해 얻은 수용체 후보의 추가적인 해석은, 특정한 냄새 물질에 관한 후각 수용체를 동정하고, 이들 기구의 이해를 주기 위해서 도움이 된다.

본 발명자는, 상이한 감각 뉴런이 냄새나 농도에 의존하여 기능하는 것을 이전에 보고하였다 (17). 이 연구에 있어서, 본 발명자는, 디아세틸의 수용에 대해, ODR-10 및 SRI-14 가, 특정한 ORN 내의 저농도 또는 고농도에 특이적인 수용체로서 각각 기능하는 것을 알아내었다 (도 33). SRI-14 가, ODR-10 보다 디아세틸에 대해서 낮은 친화성을 가질 가능성이 추측된다. 그러나, 이들 수용체는, 냄새 물질 인식 부위 내에 상동 배열성을 갖고 있지 않고, 상이한 농도의 동일한 화학 물질을 구별하는 이들 수용체의 능력의 기반이 되는 기구는 미지인 상태이다.

칼슘 이미징 실험은, AWA 감각 뉴런이 저농도 및 고농도의 디아세틸의 양방에 응답하는 것을 나타내었다. AWA 뉴런의 유전적 제거는, 고농도 디아세틸로부터의 기피 및 저농도 디아세틸에 대한 유인의 양방에서 결함을 일으켰다. 이들 결과는, AWA 뉴런이 광범위의 농도에 대해서 디아세틸을 검출하고, 상이한 농도에 대해서 반대의 행동을 일으키는 데에 기여하는 것을 시사하고 있다. 이들 소견, 그리고 AWB 뉴런 (16) 및 AWC 뉴런 (26) 에 관해서 이전에 보고된 소견은, 선충 (C. elegans) 의 이들 ORN 이 유인 행동과 기피 행동의 양방을 매개할 수 있는 것을 나타내고 있다. ODR-10 이 AWA 뉴런에 존재하고 (11), odr-10 변이체는 저농도의 디아세틸에 대한 유인이 저하되었지만, 고농도의 디아세틸에 대한 기피는 정상이었기 때문에, AWA 뉴런이, 특히, 높은 디아세틸 농도에 대해서, 복수의 디아세틸 수용체를 갖는 것이 시사된다.

본 발명자가 RNAi 스크리닝에 있어서 얻은, SRI-14 이외의 고농도 디아세틸에 대한 수용체 후보가 존재한다. 이들 다른 후보의 해석은, 다른 디아세틸 수용체의 동정, 냄새의 농도에 따라 상이한 수용체가 작용하는 전략의 추가를 가져올 가능성이 있다.

[표 3a]

[표 3b]

표 3. srh 후각 수용체 패밀리 유전자의 RNAi 스크리닝의 생(生) 데이터.

제 1 차 (A), 제 2 차 (B), 및 제 3 차 (C) 의 스크리닝에 있어서의 srh 패밀리 유전자에 대해 RNAi 처리한 선충의 11 개의 냄새 물질에 대한 화학 주성 인덱스. 11 개의 냄새 물질은, 저농도의 6 개의 유인 물질 [이소아밀알코올 (Iaa), 벤즈알데히드 (Bz), 부타논 (Bu), 펜탄디온 (Pd), 피라진 (Pz), 및 트리메틸티아졸 (Tmt)], 2 개의 기피 물질 [노나논 (Nona) 및 옥탄올 (Oct)], 그리고 고농도의 3 개의 유인 물질 [이소아밀알코올 (고(高) Iaa), 벤즈알데히드 (고 Bz), 및 디아세틸 (고 Da)] 을 포함하고 있다. 청색, 등색 (橙色), 및 녹색의 음영은, 각각, 동일 (同日) 의 대조값, 모든 날의 대조값의 평균, 및 이들 양방과 비교한 통계차를 나타낸다 (재료 및 방법을 참조).

[표 4a]

[표 4b]

[표 4c]

[표 4d]

[표 4e]

[표 4f]

표 4. 194 개의 후보 후각 수용체 유전자의 RNAi 스크리닝의 생 데이터. 제 3 차 스크리닝 후에 전체 194 개의 후각 수용체 후보 유전자가 얻어졌다. 이 표는, 제 1 차, 제 2 차, 및 제 3 차 스크리닝에 있어서의 이들 유전자에 대해 RNAi 처리한 선충의 화학 주성 인덱스를 나타낸다. 몇 개의 유전자는, 복수의 냄새 물질의 감지에 관여하는 것이 나타났다.

[표 5]

표 5. 35 개의 수용체 후보 유전자의 발현 패턴 및 관련된 냄새 물질. 감각 뉴런만을 명칭에 따라 열거하고 있다. 다른 뉴런은, 1 군의 몇 개의 뉴런으로서 열거하고 있다. 해석 유전자의 발현 사진에 대해서는 도 23 을 참조했으면 한다. 볼드체의 유전자는, 제거한 경우, 디아세틸에 대한 화학 감각 응답성을 가져온 뉴런에 있어서 (리포터 유전자 발현에 기초하여) 발현이 보인 것. Bu, 부타논；Bz, 벤즈알데히드；Da, 디아세틸；Iaa, 이소아밀알코올；Nona, 노나논；Oct, 옥탄올；Pd, 펜탄디온；Pz, 피라진；Tmt, 트리메틸티아졸.

[실시예 7]

본 발명자는, 각지에서 채취한 C. 엘레강스 주에 있어서 상기 실시예를 실시한 결과, 각종 암 환자 유래의 뇨에 유인 행동을 나타내지 않는 주가 발견되었다. 이 주의 게놈 배열을 조사한 결과, 게놈 상에 많은 1 염기 치환을 갖는 것이 판명되었다.

그래서 본 실시예에 있어서는, 야생주와 함께 상기 유전자 변이주를 이용하여, 암 검출의 정밀도를 검토하였다.

방법：

유방암, 식도암, 담관암, 직장암, 맹장암, 전립선암, 췌장암, 폐암, 소화관 간엽성 종양의 암 환자의 뇨 샘플, 정상인의 뇨 샘플, 중규모 실험에서 위양성 (僞陽性) 을 나타낸 정상인의 뇨 샘플에 대해, 야생주, 유전자 변이주의 화학 주성을 조사하였다.

결과：

유전자 변이주는, 거의 모든 암종의 뇨에 유인 행동을 나타내지 않았다 (도 34).

유전자 변이주는, 다른 냄새에 대해서는 정상적인 주성을 나타내기 때문에, 기본적인 후각은 작용하고 있다고 말할 수 있다. 따라서, 유전자 변이주에는 암종의 냄새를 수용하는 수용체에 결손이 있는 것으로 예상된다 (도 35).

또, 유전자 변이주는 위양성 샘플에는 정상적으로 유인 행동을 나타낸다. 따라서, 야생주 (N2 주) 에서 양성을 나타낸 샘플에 대해 유전자 변이주에서 해석하고, 유전자 변이주에서 음성이 되었을 때는 암이라고 진단하고, 유전자 변이주에서 양성이 되었을 때는 위양성이라고 진단할 수 있다. 따라서, 유전자 변이주를 이용하면, 암 검출의 정밀도를 높일 수 있다 (도 35).

[실시예 8]

각 암종의 냄새의 수용에 관련된 수용체 후보의 동정

차세대 시퀀서 (일루미나사) 를 이용하여, 실시예 7 에서 얻어진 유전자 변이주의 전체 게놈을 해독하고, N2 의 게놈 배열과 비교하여, 변이가 있는 수용체 유전자를 탐색하였다.

그 결과, 수용체 유전자에 강한 변이가 들어가 있었다 (표 6).

[표 6]

이들 유전자에 대해, 후각 신경 AWC 특이적 RNAi (Esposito et al, Efficient and cell specific knock-down of gene function in targeted C. elegans neurons. Gene 395, 170?176, 2007) 에 의해 녹다운하고, 각 암종의 뇨에 대한 주성을 측정하였다.

그 결과, 암종에 따라, 반응하는 수용체가 상이한 것을 알 수 있었다.

이에 따라, 선충 주성 테스트에 의해 암종을 특정하는 것이 가능해진다.

수용체 녹다운 주에 있어서의 유방암 환자의 뇨에 대한 주성을 조사한 결과를 도 36 에 나타낸다.

암 탐지견의 연구로부터, 암종에 따라 냄새가 상이한 것으로 예상되고 있다. 그래서, 선충에 있어서, 암종 각각의 냄새에 대한 후각 수용체를 동정하고, 그 수용체를 결실한 변이체를 제조한다. 변이체의 제조법으로는, CRISPR/Cas9 법 (Friedland et al, Heritable genome editing in C. elegans via a CRISPR-Cas9 system, Nature Methods, 2013) 등을 들 수 있다.

먼저, 단계 1 로서, N2 주를 이용하여, 암종의 유무를 검사한다.

다음으로, 단계 2 로서, 각 암종의 수용체의 변이체를 이용하여, 암종을 특정한다. 예를 들어, 대장암 냄새의 수용체 변이체가 유인 행동을 나타내지 않는 경우, 대장암이라고 진단할 수 있다 (도 37).

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10：탐지부
20：처리부
30：수용부
40：보존부
110：계산 수단
120：데이터베이스
[배열표 프리 텍스트]
배열 번호 1：합성 DNA
배열 번호 2：합성 DNA
배열 번호 3：합성 DNA
배열 번호 4：합성 DNA
또한, 본 명세서에 있어서 인용한 문헌, 및 공개 공보, 특허 공보 그 밖의 특허문헌은, 참조로서 본 명세서에 삽입하는 것으로 한다. 또 본 명세서는, 본원 우선권 주장의 기초가 되는 일본 특허출원 2013-255145호 (2013년 12월 10일 출원) 및 US 61/982,341호 (2014년 4월 22일 출원) 의 명세서의 내용을 포함한다.

<110> Kyushu University <120> A method of detecting a cancer using oflactory sense of nematode <130> G1264WO <150> JP2013-255145 <151> 2013-12-10 <150> US61/982,341 <151> 2014-04-22 <160> 5 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 1 ggcgccgata taattgctaa 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 2 ctgctgcgtt tttcgtatca 20 <210> 3 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 3 gagagctagc aaaaaatgcc tgcaggtcca c 31 <210> 4 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 4 gagaggtacc ttattgaatt ctcggttg 28 <210> 5 <211> 341 <212> PRT <213> Caenorhabditis elegans <400> 5 Met Pro Ala Gly Pro Pro Cys Pro Ser Ser Ile Pro Thr Tyr Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Thr Leu His Ile Ile Gly Gly Ile Ser Ile Pro Ile Asn Leu Ile 20 25 30 Gly Phe Tyr Leu Val Trp Phe Gln Ser Pro Lys Met Gln Gly Tyr Lys 35 40 45 Tyr Cys Leu Cys Tyr Leu Gln Leu Val Ser Phe Ile Ala Glu Ile Glu 50 55 60 Met Ile Phe Ile Cys Pro Ala Phe Tyr Phe Phe Pro Leu Ile Gly Gly 65 70 75 80 Phe Asn Val Gly Ala Asp Ile Ile Ala Asn Asn Ile Ser Ser His His 85 90 95 Thr Met Thr Leu Tyr Val Phe Val Phe Thr Phe Glu Leu Pro Ser Thr 100 105 110 Leu Leu Cys Phe Ile Phe Arg His Asn Ala Ala Gly Lys Val Asp Gln 115 120 125 Lys Cys Phe Ser Ser Lys Tyr Leu Lys Lys Phe Ser Leu Val Leu Ala 130 135 140 His Phe Leu Pro Phe Val Thr Ala Phe Cys Phe Trp Asn Ser Arg Leu 145 150 155 160 Thr Ala Lys Glu Arg Met Asp Leu Val Met Asn Asn Trp Pro Gln Cys 165 170 175 Ala His Trp Leu Lys Phe Pro Ala Phe Glu Val Tyr Asp Tyr His Leu 180 185 190 Asn Pro Trp Leu Ala Val Val Gly Ile Gly Ala Phe Phe Val Leu Phe 195 200 205 Met Val Phe Ser Tyr Cys Ile Phe Leu Gly Val Gln Thr Leu Leu Ile 210 215 220 Leu Gln Gln His Arg Lys Ser Met Ser Arg Gln Thr Tyr Gln Ala His 225 230 235 240 Lys Asn Ala Leu Phe Arg Leu Val Met Gln Ile Val Leu Pro Gly Val 245 250 255 Phe Ile Val Val Pro Leu Cys Ile Cys Met Phe Val Val Val Gln Gly 260 265 270 Asp Val His Leu Gln Glu Phe Ala Thr Asp Thr Met Phe Phe Val Ser 275 280 285 Ser His Ser Met Cys Ser Cys Ile Ile Met Ile Ile Ser Asn Pro Lys 290 295 300 Tyr Arg Ser Val Leu Arg Lys Lys Ile Leu Arg Ile Leu Gly Ile Ser 305 310 315 320 Ala Lys Ser Lys Ser Asn Arg Arg Arg Gly Asn Thr Val Leu Pro Ser 325 330 335 Gln Pro Arg Ile Gln 340

Claims (21)

1. 피검자 유래의 생체 관련 물질 또는 그 처리물의 냄새에 대한 선충의 반응을 지표로 하여 암을 검출하는 것을 특징으로 하는 암의 검출 방법으로서, 상기 생체 관련 물질 또는 그 처리물이 체액, 세포, 조직, 또는 세포 혹은 조직의 배양물 혹은 보존액인 방법.
2. 제 1 항에 있어서,
   선충이 시노랩디티스·엘레강스 (Caenorhabditis elegans) 인 방법.
3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
   선충이 야생형 선충, 변이형 선충 또는 트랜스제닉 선충인 방법.
4. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
   피검자 유래의 생체 관련 물질 또는 그 처리물의 냄새에 대해서, 선충이 정 (正) 의 응답을 나타냈을 때는, 피검자가 암인, 또는 암의 리스크가 있다고 판정하는 방법.
5. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
   피검자 유래의 생체 관련 물질 또는 그 처리물의 냄새에 대해서, 선충의 후각 신경의 응답이 클 때는, 피검자가 암인, 또는 암의 리스크가 있다고 판정하는 방법.
6. 삭제
7. 제 1 항에 있어서,
   체액이 뇨 (尿) 인 방법.
8. 제 1 항에 있어서,
   보존액이 생리 식염수인 방법.
9. 선충을 이용하여 냄새 수용체의 동정 (同定) 을 실시하는 것을 특징으로 하는, 선충에 있어서의 냄새 수용체의 동정 방법으로서, 냄새가 암종의 냄새인 방법.
10. 제 9 항에 있어서,
    상기 수용체를 코드하는 유전자의 발현을 저해하고, 당해 저해된 선충에 있어서의 냄새에 대한 반응을 검사하는 것인 방법.
11. 제 10 항에 있어서,
    수용체 유전자의 발현 저해가 RNAi 에 의한 것인 방법.
12. 삭제
13. 제 9 항 또는 제 10 항에 있어서,
    동정되는 수용체의 종류가 암종에 따라, 또는 냄새 물질의 농도에 의존하여 상이한 것인 방법.
14. 제 9 항 또는 제 10 항에 있어서,
    선충이 시노랩디티스·엘레강스 (Caenorhabditis elegans) 인 방법.
15. 피검자 유래의 생체 관련 물질 또는 그 처리물의 냄새에 대한 선충의 반응을 지표로 하여 암종을 동정하는 것을 특징으로 하는 암종의 동정 방법으로서, 상기 생체 관련 물질 또는 그 처리물이 체액, 세포, 조직, 또는 세포 혹은 조직의 배양물 혹은 보존액이고, 이하의 공정을 포함하는 방법：
    (a) 피검자 유래의 생체 관련 물질 또는 그 처리물의 냄새에 대한 선충의 반응을 지표로 하여 암을 검출하는 것을 특징으로 하는 암의 검출 방법에 의해 암을 검출하고,
    (b) 상기 공정 (a) 에 있어서 암인 것이 검출된 시료에 대해, 제 9 항에 기재된 방법에 의해 동정된 수용체를 개변한 개변체 선충을 이용하여 냄새에 대한 반응을 검사하고,
    (c) 상기 개변체 선충과, 상기 공정 (a) 에서 사용한 선충의 사이에서 냄새에 대한 반응이 상이할 때는, 동정된 수용체에 대응하는 암종을 동정의 대상 암종이라고 판정함.
16. 삭제
17. 제 15 항에 있어서,
    수용체의 개변이 수용체의 결실, 수용체의 발현 또는 기능의 저해, 및 수용체의 고발현 또는 고기능화로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 개인 방법.
18. 선충 및 샬레, 또는 선충 및 유로를 가지는 칩을 포함하는, 암의 검출 또는 동정용 키트.
19. 제 18 항에 있어서,
    선충이 시노랩디티스·엘레강스 (Caenorhabditis elegans) 인 키트.
20. 제 18 항 또는 제 19 항에 있어서,
    선충이 야생형 선충, 변이형 선충 또는 트랜스제닉 선충인 키트.
21. 제 1 항 또는 제 15 항의 방법에 사용하기 위한 암의 검출 시스템으로서,
    선충과,
    생체 관련 물질 또는 그 처리물 및 상기 선충을 수용하는 수용부와,
    상기 수용부의 선충의 냄새에 대한 반응을 탐지하는 탐지부
    를 구비하고, 상기 생체 관련 물질 또는 그 처리물이 체액, 세포, 조직, 또는 세포 혹은 조직의 배양물 혹은 보존액인 시스템.

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