WO2018047959A1 - 線虫の嗅覚に基づく匂い物質に対する走性行動の評価方法、並びに該評価方法に用いるシャーレおよび行動評価系 - Google Patents

線虫の嗅覚に基づく匂い物質に対する走性行動の評価方法、並びに該評価方法に用いるシャーレおよび行動評価系 Download PDF

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崇亮 広津
隆行 魚住
覚 海渕
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株式会社Ｈｉｒｏｔｓｕバイオサイエンス
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    • B01L2300/0848—Specific forms of parts of containers

Definitions

  • the present invention relates to a chemotaxis behavior evaluation method for odor substances based on the olfactory sense of nematodes, and a petri dish and behavior evaluation system used in the evaluation method.
  • Nematodes are popular organisms that are widely bred and studied all over the world as model organisms in biological research, and are characterized by their easy breeding. Nematodes have all the nerves revealed at the cellular level, and research on behavioral analysis is actively conducted.
  • Non-patent Document 1 and Patent Document 1 For the nematode behavioral evaluation, use a 9 cm round petri dish. This is because it is indispensable to maintain a long movement distance of the nematode in order to maintain the accuracy of the behavior evaluation of the nematode.
  • the present inventors have demonstrated that cancer can be detected with high sensitivity and high accuracy by using the olfactory sense of nematodes (Non-patent Document 1 and Patent Document 1).
  • the test substance and the nematode are placed on the petri dish while being separated from each other by a certain distance, and the chemotaxis behavior is nematode on the petri dish.
  • the arrangement of was observed.
  • the nematode's chemotaxis behavior fluctuates and does not necessarily move at the shortest distance with respect to the test substance, and may show chemotaxis while detouring. This is because, in order to improve, it was considered that a method of evaluating only nematodes that moved a certain distance over a certain distance was necessary as in general behavior evaluation.
  • the odor can be transmitted remotely, it is possible to test by placing the test sample and the nematode at a large distance, and the test sample and the nematode are separated from each other by a large distance. Therefore, it was believed that the scent was suitable for an evaluation system that greatly separated the distance between the test sample and the nematode. Therefore, it has been assumed that a general behavior evaluation system is used in the evaluation of the chemotaxis behavior via the sense of smell.
  • the present invention provides a method for evaluating chemotaxis behavior with respect to odor substances based on the sense of smell of nematodes, and a petri dish and behavior evaluation system used in the evaluation method.
  • the present inventors surprisingly have a higher accuracy than conventional methods when the test sample and the nematode are placed at a short distance. We found that sexual behavior can be evaluated. Based on this finding, the present inventors have also invented a petri dish suitable for evaluating chemotaxis behavior via the olfactory sense of nematodes. The present invention is based on these findings and inventions.
  • a petri dish having a bottom surface of a substantially square shape (for example, a substantially square shape having a longitudinal direction of 3 to 6 cm and a lateral direction of 1 to 3 cm or 3 cm to 6 cm), the bottom surface being one side in the longitudinal direction Is divided into at least three regions of a first region, a second region, and a third region from one end to another end, and the second region is a boundary between the first region and the third region.
  • Petri dish which is arranged in.
  • a method for evaluating the chemotaxis behavior of a nematode with respect to the odor of a test sample a) providing a petri dish in which a test sample is arranged, wherein the nematode is arranged in a region or region on the bottom surface 1 cm to 3 cm away from the test sample; b) observing the arrangement of the nematode on the bottom surface 3 to 15 minutes after the test sample and the nematode are arranged in the petri dish; c) assessing from the observed nematode placement whether the test sample has been attracted or repelled.
  • test sample is a sample obtained from a subject suspected of being a cancer patient.
  • test sample is urine obtained from a subject suspected of being a cancer patient.
  • nematode exhibits an attracting action on the test sample in c)
  • it is determined that the test sample contains an attractant derived from cancer, or the nematode is tested
  • the petri dish according to any one of (1) to (3) above or any one petri dish included in the multiplate according to (4) is used. ) Any one of the methods.
  • the present invention is also directed to a new problem that the number of nematodes embedded in the gap between the inner wall of the petri dish and the solid medium increases with the miniaturization of the petri dish according to the above invention, and the number of nematodes that can be observed decreases with time. Provide a solution.
  • the present inventors form a planar depression that is greater than the thickness of the nematode on the solid medium, cover the depression completely, and perform chemotaxis behavior evaluation based on the sense of smell in the depression.
  • chemotaxis behavior evaluation based on the sense of smell in the depression.
  • a nematode running having a bottom surface of a substantially square shape for example, a substantially square shape having a longitudinal direction of 3 to 6 cm and a transverse direction of 1 to 3 cm or 3 to 6 cm
  • the bottom surface is divided into at least three regions of a first region, a second region, and a third region from one end to another end in a longitudinal direction by a mark
  • a chemotaxis behavior evaluation system in which the second region is arranged at the boundary between the first region and the third region.
  • (2A) The chemotaxis behavior evaluation system according to (1A) above, wherein the mark is an uneven shape or printing on the upper surface of the bottom surface, or an uneven shape or printing on the lower surface.
  • (3A) The chemotaxis behavior evaluation system according to (1A) or (2A) described above, which has a display for distinguishing between the first region and the third region.
  • (4A) A multiplate in which a plurality of the chemotaxis behavior evaluation systems according to any one of (1A) to (3A) are connected.
  • (5A) A substantially square shape indentation (for example, the longitudinal direction is 3 to 6 cm, the transverse direction is 1 to 3 cm or 3 to 6 cm), and the depth is not less than the thickness of the nematode and not more than 2 mm.
  • An evaluation system for the chemotaxis behavior of nematodes comprising a petri dish having a solid medium introduced on the surface thereof and a plate covering the depression from above.
  • (6A) Sites corresponding to the indentations on the bottom surface of the petri dish are at least three regions of a first region, a second region, and a third region from one end to another end in the longitudinal direction by a mark.
  • the chemotaxis behavior evaluation system according to (5A) above which is divided into three regions, and the second region is arranged at the boundary between the first region and the third region.
  • (12A) The nematode chemotaxis behavior evaluation system according to any one of (1A) to (11A) above, wherein the test sample is arranged in the first region or the third region.
  • (13A) A method for evaluating the chemotaxis behavior of a nematode with respect to the odor of a test sample, a) providing a petri dish in which a test sample is arranged, wherein the nematode is arranged in a region or region on the bottom surface 1 cm to 3 cm away from the test sample; b) observing the arrangement of the nematode on the bottom surface 3 to 15 minutes after the test sample and the nematode are arranged in the petri dish; c) assessing from the observed nematode placement whether the test sample has been attracted or repelled.
  • the test sample is a sample obtained from a subject suspected of being a cancer patient.
  • test sample is urine obtained from a subject suspected of being a cancer patient.
  • test sample is urine obtained from a subject suspected of being a cancer patient.
  • the nematode exhibits an attracting action on the test sample in c)
  • it is determined that the test sample contains an attractant derived from cancer, or the nematode is tested
  • the method according to (14A) or (15A) further comprising determining that the attracting substance derived from cancer is not included in the test sample when the sample exhibits repellent behavior.
  • 17.A The method according to any one of (13A) to (16A) above, wherein no nematicide is used.
  • the following petri dish (I) A petri dish having a bottom surface of a substantially square shape (for example, a substantially square shape having a longitudinal direction of 3 to 6 cm and a lateral direction of 1 to 3 cm or 3 cm to 6 cm), the bottom surface being one side in the longitudinal direction Is divided into at least three regions of a first region, a second region, and a third region from one end to another end, and the second region is a boundary between the first region and the third region.
  • a substantially square shape for example, a substantially square shape having a longitudinal direction of 3 to 6 cm and a lateral direction of 1 to 3 cm or 3 cm to 6 cm
  • the bottom surface being one side in the longitudinal direction Is divided into at least three regions of a first region, a second region, and a third region from one end to another end, and the second region is a boundary between the first region and the third region.
  • the accuracy of evaluation of chemotaxis behavior based on the olfactory sense of nematodes is improved, and the advantage that measurement time is greatly shortened and the use of deleterious substances such as sodium azide can be eliminated.
  • FIG. 1A shows a plan view of a petri dish 100 according to the first embodiment of the present invention.
  • the two-dot chain line in the figure indicates the boundary line of the bottom segmentation pattern.
  • FIG. 1B shows a front view of the petri dish 100 of the first embodiment of the present invention.
  • FIG. 1C shows a plan view of a modification 100A of the first embodiment of the present invention.
  • the two-dot chain line in the figure indicates the boundary line of the bottom segmentation pattern.
  • FIG. 1D shows a front view of the petri dish 100 of the first embodiment of the present invention with the lid 150 covered.
  • FIG. 1E shows a plan view of the lid 150.
  • FIG. 1F shows a plan view of a modification 150 ⁇ / b> A of the lid 150.
  • FIG. 1G shows a cross-sectional view taken along a straight line passing through 151 in one aspect of the modification 150A.
  • FIG. 1H is a cross-sectional view taken along a straight line passing through 151 in one aspect of the modification 150A.
  • FIG. 1I shows an AA cross-sectional view (see FIG. 1A) of the petri dish 100 according to the first embodiment of the present invention.
  • FIG. 2A shows a plan view of a petri dish 200 according to the second embodiment of the present invention.
  • the two-dot chain line in the figure indicates the boundary line of the bottom segmentation pattern.
  • FIG. 2B shows a plan view of a modified example 200A of the second embodiment of the present invention.
  • the two-dot chain line in the figure indicates the boundary line of the bottom segmentation pattern.
  • FIG. 3A shows a plan view of an example 500 of the multiplate of the present invention.
  • FIG. 3B shows a plan view of an example 500A of the multiplate of the present invention.
  • FIG. 3C shows a front view of an example multi-plate 500 with a lid 600 of the present invention.
  • FIG. 4 shows a photograph of a 5 cm ⁇ 2 cm square petri dish created in this example. In the picture, nematodes are shown by white dots.
  • FIG. 5 is a diagram showing that when the petri dish of the present invention is used, the attracting action to the attracting substance (isoamyl alcohol) and the repelling action to the repellent substance (nonanone) can be measured with high sensitivity.
  • FIG. 5 is a diagram showing that when the petri dish of the present invention is used, the attracting action to the attracting substance (isoamyl alcohol) and the repelling action to the repellent substance (nonanone) can be measured with high sensitivity.
  • FIG. 5 is a diagram
  • FIG. 6 is a diagram showing that the attracting behavior of cancer patients to urine and the avoidance behavior of healthy subjects to urine can be clearly evaluated in 5 minutes and 10 minutes using the petri dish of the present invention.
  • FIG. 7 is a diagram showing the results of chemotaxis behavior evaluation on a urine sample based on the conventional method.
  • FIG. 8 is a diagram showing the results of chemotaxis behavior evaluation using urine (1/200 dilution) obtained from various cancer patients and healthy individuals.
  • FIG. 9 is a diagram showing the results of evaluation of chemotaxis behavior using a 3 cm ⁇ 1 cm square petri dish.
  • FIG. 10 is a schematic diagram comparing a conventional nematode chemotaxis behavior evaluation system and the evaluation system of the third embodiment of the present invention.
  • FIG. 11A is a plan view showing the solid medium surface of the evaluation system according to the third embodiment of the present invention.
  • FIG. 11B is an AA sectional view showing the solid medium surface of the evaluation system according to the third embodiment of the present invention.
  • FIG. 11C is a cross-sectional view of a mold for creating a recess.
  • FIG. 12A is a plan view of an evaluation system according to the third embodiment of the present invention.
  • FIG. 12B is a BB sectional view of the evaluation system according to the third embodiment of the present invention.
  • FIG. 13 is a photograph of the evaluation system according to the third embodiment of the present invention constructed in Example B4.
  • FIG. 14 shows the evaluation results (left) of the chemotactic behavior of nematodes using the evaluation system according to the third embodiment of the present invention constructed in Example B4 and the change over time in the proportion of nematodes remaining on the observation surface ( Right).
  • nematode means Caenorhabditis elegans . Nematodes are popular organisms that are widely bred and studied all over the world as model organisms in biological research, and are characterized by easy breeding and excellent olfaction.
  • cancer refers to cancers such as stomach cancer, colorectal cancer, esophageal cancer, pancreatic cancer, prostate cancer, bile duct cancer, lung cancer, blood cancer, leukemia, and lymphoma. means.
  • subject means a mammal, for example, a human.
  • running behavior means attracting behavior or avoidance behavior. Attracting behavior means behavior that shortens the physical distance from a certain substance, and repelling behavior means behavior that widens the physical distance from a certain substance. Substances that induce attraction behavior are called attractants, and substances that induce repellent behavior are called repellent substances.
  • C. elegans has the property of attracting attractants by olfaction and repelling repellents.
  • the act of attracting an attracting substance is called attracting action, and the action of avoiding repellent substances is called repelling action.
  • repelling action is collectively referred to as chemotaxis behavior.
  • a behavior evaluation system for example, a petri dish shown in the following embodiment and its lid as necessary
  • the petri dish and the lid can be made of a resin such as plastic, and can be made of a transparent resin.
  • the expression “partition line” is used not to physically divide areas but to distinguish between areas as a mark. Nematodes can move beyond the dividing line to other areas during behavioral evaluation.
  • the petri dish 100 in the present embodiment is a petri dish having a substantially square bottom as shown in FIG. 1A.
  • the bottom surface of the petri dish 100 has at least two separation lines 25 and 35, and divides the region of the bottom surface into at least three regions in the longitudinal direction from one end to another end.
  • the bottom surface is divided into at least three regions of the first region 20, the second region 30, and the third region 40.
  • the second region 30 is divided into the first region 20 and the third region. It is arranged at the boundary with the region 40.
  • the petri dish 100 has a side wall that extends upward so as to surround the bottom surface.
  • the bottom inner surface 100a of the petri dish 100 is substantially perpendicular to the side wall.
  • the inner surface 100a of the bottom surface of the petri dish 100 is substantially parallel to the outer surface 100b of the bottom surface.
  • the petri dish 100 of the first embodiment may be a petri dish having a substantially square bottom surface, and the length of the bottom surface in the longitudinal direction is 3 cm to 6 cm and the length in the transverse direction is 1 cm to 3 cm or 3 cm to 6 cm.
  • the length in the longitudinal direction can be preferably 4 cm to 6 cm, preferably 4.5 cm to 5.5 cm, preferably 5 cm.
  • the length in the transverse direction can be preferably 1.5 cm to 2.5 cm, preferably 2 cm.
  • the length in the transverse direction can be preferably 3.5 cm to 5.5 cm, preferably 4 cm to 5 cm.
  • the petri dish 100 of the first embodiment has a substantially square bottom surface, the length of the bottom surface in the longitudinal direction is 4 cm to 6 cm, preferably 4.5 cm to 5.5 cm, and The length of the bottom surface in the transverse direction may be 1.5 cm to 2.5 cm or 3.5 cm to 5.5 cm.
  • the petri dish 100 according to the first embodiment has a substantially square bottom surface, a length in the longitudinal direction of 4.5 cm to 5.5 cm, and a length in the transverse direction of 4.5 cm to 5.5 cm. There may be. Further, the petri dish 100 of the first embodiment can have a height of 1 cm to 3 cm.
  • the second region 30 may be arranged so as to separate the first region 20 and the third region 40. As shown in FIG. 1A, the second region 30 can be preferably arranged such that the first region 20 and the third region 40 face each other with the second region 30 in between.
  • the second region 30 may be 30% or less, 25% or less, 20% or less, 15% or less, 10% or less, or 5% or less of the total area of the bottom surface.
  • the division may be made in any way as long as a human or machine can distinguish each of the at least three areas. In particular, the segmentation is only required to visually recognize the boundary between the regions, and does not completely hinder the movement between the nematode regions.
  • the partitioning can be done so that the nematode can move between regions.
  • the division is not particularly limited, and can be performed, for example, by printing on the bottom surface or an uneven shape on the bottom surface.
  • the printing on the bottom surface or the concavo-convex shape on the bottom surface may be made on the upper surface of the bottom surface or on the lower surface.
  • the division can be performed by dividing lines that are boundary lines such as the dividing line 25 and the dividing line 35.
  • the separator line does not necessarily have to be a straight line, but can preferably be a straight line.
  • the dividing line does not necessarily have an uneven shape.
  • the first area 20 and the third area 40 may each have a display so as to distinguish which is the first area and which is the third area.
  • the display may be a symbol such as ⁇ or ⁇ , a character, or some mark.
  • the petri dish 100 may have a tag 90.
  • the first region and the third region may have different areas, and may be distinguished from each other by using the different areas.
  • the tag 90 can be used to distinguish a plurality of petri dishes 100, for example.
  • the tag 90 may be provided with a display such as a barcode or a two-dimensional barcode, and the display may include management information of each petri dish 100.
  • the petri dish 100 has a side wall at the edge of the bottom as shown in FIG. 1B and has a container shape.
  • the petri dish 100 of the first embodiment is suitable for evaluating the chemotaxis behavior through the olfactory sense of nematodes.
  • the petri dish 100 of 1st embodiment is used and the method of evaluating the chemotaxis action via the olfactory sense of a nematode is demonstrated.
  • the petri dish 100 of the first embodiment can add a solid medium for nematodes inside.
  • the solid medium is, for example, an agar medium.
  • Those skilled in the art can prepare a medium such as a medium suitable for the survival of nematodes and add it to the petri dish.
  • the nematode 60 can be sown in the second region 30.
  • the nematode may be sown on the entire surface of the second region 30 or may be sown only on a part of the second region 30.
  • the test sample can be arranged in the first region 20 or the third region 40, for example, at a position about 1 cm to 3 cm away from the region where the nematode is seeded.
  • the nematode When a nematode is seeded on the petri dish 100 of the first embodiment in which the test sample is arranged, the nematode exhibits an attracting action on the test sample when the test sample is an attracting substance, and the test sample
  • the test sample when the test sample is a repellent substance, the test sample exhibits repellent behavior and moves to a location away from the test sample. Therefore, by observing the place where the nematode has moved (from the observed arrangement of the nematode), it is possible to determine whether the test sample is an attractant or a repellent.
  • the observation can be performed, for example, visually or with a microscope.
  • the observation may be performed by imaging the arrangement information of the nematode and using the image.
  • FIGS. 1A and 1B show the modification 100A of the first embodiment with respect to other components and how to use them, except that the division patterns (segmentation shapes) of the first, second, and third regions on the bottom surface are different. This is the same as the petri dish 100 of the first embodiment. Therefore, hereinafter, only the segmentation pattern will be described, and the same parts as those in the petri dish 100 of the first embodiment will be denoted by the same reference numerals and description thereof will be omitted.
  • the second region 30A is the same as the petri dish 100 of the first embodiment in that the second region 30A is arranged at the boundary between the first region 20A and the third region 40A. is there.
  • the modification 100A of the first embodiment differs from the petri dish 100 of the first embodiment in that the first region 20A and the third region 40A are in contact with each other.
  • the second region 30A may have various shapes as long as it is a closed shape.
  • it is divided into a substantially circular shape, but is not limited to a circular shape, and may be a substantially polygonal shape (for example, a substantially rectangular shape, a substantially hexagonal shape, or a substantially octagonal shape).
  • the petri dish 100 of the first embodiment and its modification 100A may include a lid 150.
  • the lid 150 will be described with reference to FIGS. 1D and 1E.
  • the lid 150 is a lid that covers the upper surface of the petri dish 100.
  • the shape of the lid 150 is not limited as long as it is a lid that covers the upper surface of the petri dish 100.
  • the lid 150 is preferably a lid that covers the upper surface of the petri dish 100 and that can block the air flow between the inside and the outside of the petri dish 100 from the viewpoint of improving the accuracy of behavioral evaluation based on the sense of smell.
  • the tag 90 may be provided on the lid 150.
  • the lid 150 can be placed on a petri dish after the test sample and nematode are placed. Thereby, it may be possible to prevent the influence of outside air and effectively confine the odor inside the petri dish.
  • Modification 150A of lid 150 A modification 150A of the lid 150 will be described below with reference to FIGS. 1D and 1F.
  • the lid 150 ⁇ / b> A is the same as the lid 150 except that the lid 150 ⁇ / b> A includes a test sample arrangement site 151. Therefore, in the following, only the test sample arrangement site 151 will be described, and the same parts as those of the lid 150 are denoted by the same reference numerals and description thereof is omitted.
  • the lid 150A includes a test sample arrangement portion 151 on a surface facing the petri dish bottom surface when the lid is closed.
  • the test sample placement site 151 is formed in a region 1 to 3 cm away from the center in the longitudinal direction of the lid 150A.
  • the test sample arrangement site 151 is illustrated in a circular shape, but is not limited thereto, and the test sample arrangement site 151 may have a substantially circular shape, a substantially linear shape, or a substantially square shape.
  • the test sample placement site 151 has a boundary 153 between the test sample placement site 151 and the other region 152.
  • the boundary 153 can be formed by printing or an uneven shape.
  • the test sample placement site 151 and the other region 152 have a step at the boundary 153.
  • the test sample arrangement site 151 may protrude toward the bottom of the petri dish when the lid is closed, rather than the other region 152.
  • the test sample arrangement site 151 may be recessed with respect to the petri dish bottom surface when the lid is closed rather than the region 152.
  • the material of the test sample arrangement site 151 is shown. May be the same as or different from the material of the region 152 and the lid 150A.
  • the test sample placement site 151 has a hydrophilicity different from that of the other region 152 on the surface facing the petri dish bottom surface when the lid is closed.
  • the test sample placement site 151 has a hydrophilic surface
  • the other region 152 has a hydrophobic surface.
  • the aqueous test sample can be accurately placed on the test sample placement portion 151.
  • the test sample placement site 151 has a hydrophobic surface
  • the other region 152 has a hydrophilic surface. As a result, the oily test sample can be accurately placed on the test sample placement site 151.
  • the lid 150A can be placed on a petri dish after the test sample and nematode are placed. Thereby, it may be possible to prevent the influence of outside air and effectively confine the odor inside the petri dish.
  • the test sample can be placed on the test sample placement site 151 of the lid 150A, and the nematode can be placed on the petri dish.
  • the test sample and the nematode may be spaced apart from each other, and even in this case, the odor can diffuse in the air and reach the nematode .
  • the test sample since the test sample is placed in the test sample placement site 151 of the lid 150A and the worm component reaches the nematode, it is suitable for evaluation of a part of the chemotaxis behavior through the olfaction. .
  • the test sample has strong chemotaxis, it is suitable for evaluating the chemotaxis behavior via the olfactory sense of the odor component contained in the test sample.
  • the test sample is placed on the lid 150A by introducing the test sample from under the lid with the surface facing the petri dish bottom surface facing downward when the lid of the lid 150A is closed. it can.
  • the test sample is introduced from under the lid with the surface facing the petri dish bottom surface facing upward when the lid of the lid 150A is closed, and then inverted upside down. Can be done.
  • the petri dish 200 of the second embodiment is the same as the petri dish 100 of the first embodiment shown in FIGS. 1A and 1B, except that the bottom sectioning pattern is different. Accordingly, the same parts as those in the petri dish 100 of the first embodiment are denoted by the same reference numerals and description thereof is omitted.
  • the first region 210, the second region 220, and the third region 30 have a bottom surface in the longitudinal direction from one end to another end.
  • the fourth region 40 is divided into at least four regions.
  • the difference from the petri dish 100 of the first embodiment is that the first region 10 is further divided into two parts, a first region 210 and a second region 220 in the petri dish 200 of the second embodiment. It is a point.
  • the first region 210 and the second region 220 are separated by a line 215.
  • the test sample can be arranged on the first region 210, the line 215, or both, for example. Since the arrangement region of the test sample is indicated by the division, the distance between the test sample and the nematode 60 (applied to part or all of the third region 30) is made constant between different tests. Easy to keep.
  • the first region 210 and the third region 30 may have a distance of about 1 cm to 3 cm, about 1 cm to 2 cm, or about 1.5 cm to 2.5 cm, or about 1.5 cm to 2 cm, for example.
  • Modification 200A of the second embodiment A modification 200A of the second embodiment will be described below with reference to FIG. 2B.
  • the modification 200A of the second embodiment is the same as the petri dish 200 of the second embodiment shown in FIGS. 2A and 1B, except that the division pattern (segmentation shape) on the bottom surface is different. Therefore, hereinafter, only the division pattern will be described, and the same portions as those in the petri dish 200 of the second embodiment are denoted by the same reference numerals and description thereof is omitted.
  • the third region 30A is the same as the petri dish 100 of the first embodiment in that the third region 30A is arranged at the boundary between the second region 220 and the fourth region 40A. is there.
  • the modification 200A of the second embodiment differs from the petri dish 200 of the second embodiment in that the second region 220 and the fourth region 40A are in contact with each other.
  • the third region 30A may have various shapes as long as it is a closed shape.
  • it is divided into a substantially circular shape, but is not limited to a circular shape, and may be a substantially polygonal shape (for example, a substantially quadrangular shape, a substantially hexagonal shape, or a substantially octagonal shape).
  • the petri dish of the present invention has been described for each embodiment.
  • the bottom surface may be further finely divided.
  • the classification may be performed in any manner as long as a human or a machine can distinguish each of the at least three regions.
  • the multi-panel 500 of the present invention may be an assembly in which the petri dishes 100 of the first embodiment of the present invention are arranged vertically or horizontally.
  • the multi-panel 500A of the present invention may be an assembly in which the petri dishes 100 of the first embodiment of the present invention are arranged vertically and horizontally.
  • the multi-panel 500 or 500A of the present invention is not particularly limited.
  • the petri dish 100 of the first embodiment of the present invention is 2 to 1000, 4 to 700, 6 to 600, 8 to 500. Or 10 to 300 pieces may be arranged.
  • the petri dishes 100 of the first embodiment adjacent to each other may be directly connected or may be connected via a spacer.
  • 3A and 3B show an example in which the petri dish 100 of the first embodiment is used as the petri dish, the petri dish may be the petri dish 200 of the second embodiment, or a modification 100A of the first embodiment. Or it is good also as modification 200A of 2nd embodiment.
  • the multi-panel 500 or 500A of the present invention may further include a lid 600. With the side walls of the lid 600 and each petri dish, it can be expected to more effectively prevent the test sample in each petri dish from leaking to the adjacent petri dish.
  • the lid 600 may include a test sample placement site 151 as with the lid 150A. Since the usage of the lid 600 is as described in the lid 150 and the lid 150A, the description is omitted.
  • the third embodiment is a new technique in which the number of nematodes that enter the gap between the petri dish inner wall and the solid medium increases as the petri dish becomes smaller, and the number of nematodes that can be observed decreases with time.
  • the solution to the problem is provided.
  • the third embodiment is characterized not by the shape of the petri dish itself but by the shape of the solid medium surface (upper surface) formed after the solid medium is introduced into the petri dish. The third embodiment will be described below with reference to FIGS.
  • FIG. 10 is a schematic diagram comparing the conventional evaluation system described in Patent Document 1 with the evaluation system of the third embodiment of the present invention.
  • the surface on which the nematode is sowed is surrounded by the side wall of the petri dish.
  • the evaluation system of the third embodiment of the present invention has a depression in the shape of a surface on the solid medium surface of the evaluation system, and evaluates chemotaxis behavior in the depression.
  • this recess is referred to as a “behavioral observation plane” in this specification because the recess is covered and the nematode is confined in the recess.
  • the solid medium surface 610 has a planar recess 600 having a substantially square shape.
  • the substantially square planar recess 600 has a recess bottom surface 600a and a recess side surface 600b.
  • the bottom surface 600a of the depression may have a length in the range of 3 cm to 6 cm in the longitudinal direction and a length in the lateral direction of 1 cm to 3 cm or 3 cm to 6 cm.
  • the length of the bottom surface 600a of the indentation in the longitudinal direction is preferably 4 cm to 6 cm, preferably 4.5 cm to 5.5 cm, preferably 5 cm.
  • the length of the bottom surface 600a of the indentation in the transverse direction is preferably 1.5 cm to 2.5 cm, preferably 2 cm.
  • the length in the transverse direction can be preferably 3.5 cm to 5.5 cm, preferably 4 cm to 5 cm.
  • the recess may have a length in the longitudinal direction of 4.5 cm to 5.5 cm and a length in the transverse direction of 4.5 cm to 5.5 cm.
  • the depth (thickness) of the recess 600 or the height of the side surface 600b of the recess is equal to or greater than the thickness of the nematode, 5 mm or less, 4 mm or less, 3 mm or less, 2 mm or less, preferably 1 mm or less, more preferably 0.5 mm.
  • it may be more preferably 0.3 mm or less, still more preferably 0.2 mm or less, for example, about 0.1 mm.
  • the bottom surface 600a of the recess is substantially flat. This makes it easy to observe the entire behavior observation surface while keeping the focus of the microscope constant.
  • the dent 600 can be completely covered with the lid 650 so that the nematode does not escape to the outside of the dent 600.
  • the depth of the dent 600 can be made close to the thickness of the nematode (for example, about 0.1 mm). By doing so, it becomes difficult for the nematode to escape from the recess 600 when covered with the plate 650 that covers the recess 600, and at the same time, the nematode attached to the inner wall 650 a of the plate 650 is also removed from the recess 600. It can be observed in the same manner as nematodes attached to the bottom surface 600a.
  • the inner surface of the indentation 600 is smoothly shaped. Smoothly shaped means that there are no gaps or holes into which nematodes can sink.
  • a medium that has been melted by heating and solidifies when cooled is introduced into the petri dish, and cooled by applying a mold in the shape of the recess 600 from above the dissolved medium before solidifying.
  • the mold in the shape of the recess 600 can be a mold 660 having a shape complementary to the shape of the recess 600, for example, as shown in FIG. 11C.
  • the petri dish may be provided with two lines 620 (marks) indicating a central region when the bottom surface 600a of the depression is observed from above. Nematodes can be placed in the area indicated by the line 620, and the test sample can be placed in either of the areas outside the two lines 620 (the test sample may be placed on the lid).
  • the bottom surface 600a (behavioral observation surface) of the indentation 600 has at least two separation lines 25 and 35 as marks as in the first embodiment and the second embodiment, and has one end in the longitudinal direction.
  • the region of the bottom surface is divided into at least three regions from one end to the other end. As a result, the bottom surface is divided into at least three regions of the first region 20, the second region 30, and the third region 40.
  • the second region 30 is divided into the first region 20 and the third region. It is arranged at the boundary with the region 40.
  • the dividing line does not physically divide the area, but it is sufficient if it serves the purpose of distinguishing the boundary between different areas as a mark.
  • the recess 600 is covered by a plate 650 that covers the entire recess during measurement.
  • the plate 650 is on a plane.
  • the plate 650 may be light transmissive when the petri dish is light transmissive, but may be light transmissive. If the plate 650 is light-transmitting, it is advantageous that the nematode can be observed with the plate 650 covering the depression 600 using a microscope from above.
  • the petri dish is preferably light transmissive. In this case, nematodes can be observed from the lower part of the petri dish using an inverted microscope.
  • the dividing line 620 may be provided on the bottom surface of the petri dish, or may be provided on the upper surface or the lower surface 650a of the plate 650.
  • the present invention provides a combination of a petri dish, a plate 650 that covers the recess 600, and a mold 660 for generating the recess 600 for creating the behavior evaluation system of the third embodiment.
  • the petri dish is located at a position corresponding to the shape of the depression 600 immediately below the part where the depression 600 is formed, the petri dish 100 of the first embodiment, the modified example 100A, the petri dish 200 of the second embodiment, Or you may have the division pattern similar to the division pattern in the bottom face of modification 200A.
  • the plate 650 covering the depression 600 has a petri dish 100 of the first embodiment, the modified example 100A, the petri dish 200 of the second embodiment, or a deformation at a position corresponding to the depression 600 when the depression 600 is covered. You may have the same division pattern as the division pattern in the bottom face of Example 200A. By doing in this way, the place which arranges a nematode can be stabilized, and it becomes easy to distinguish attraction behavior and repellent behavior.
  • a method for evaluating the chemotaxis behavior of a nematode with respect to the odor of a test sample a) providing a petri dish in which a test sample is arranged, wherein the nematode is arranged in a region or region on the bottom surface 1 cm to 3 cm away from the test sample; b) observing the nematode placement 3-15 minutes after sowing; c) assessing from the observed nematode placement whether the test sample has been attracted or repelled.
  • a method is provided.
  • a petri dish on which the test sample is arranged is used.
  • the petri dish may not have a lid, but preferably a petri dish having a lid can be used.
  • the petri dish can be added with a solid medium for nematodes.
  • a solid medium for nematodes a solid medium for culturing or growing nematodes can be used.
  • a known medium such as an agar medium can be used.
  • the test sample is not particularly limited, but may preferably be disposed on the petri dish bottom surface, and particularly disposed near the periphery of the petri dish bottom surface.
  • the test sample is not particularly limited, but may preferably be disposed on a surface (or a lower surface) facing the bottom surface of the petri dish on the lid of the petri dish, and particularly in the vicinity of the peripheral portion of the lower surface of the lid.
  • the distance from the site where the test sample is placed to the site where the nematode is seeded is about 1 cm to 3 cm, about 1 to 2.5 cm, about 1.5 to 2 cm, about 1.5 cm to 2.5 cm, Or it can be about 2 cm.
  • the number of nematodes to be seeded can be, for example, about 10 to 500, for example, about 100 to 500.
  • test sample examples include a sample of a subject (eg, human) suspected of having cancer.
  • the test sample can be, for example, a cell suspected of being a cancer cell, a tissue suspected of being a cancer tissue, or an extract or lysate thereof, or suffering from cancer.
  • a body fluid sample of a subject suspected of being for example, blood (eg, plasma) or urine.
  • Evaluation of chemotaxis via olfactory sense of nematodes can be performed as described in, for example, WO2015 / 088039.
  • a nematicide for example, sodium azide
  • nematocide does not need to be used in the method of the present invention.
  • the petri dish provided with a) in which the test sample is arranged and the nematode is arranged in a region or a part 1 cm to 3 cm away from the test sample is a line after the test sample is arranged. It may be obtained by arranging insects or by arranging a test sample after arranging nematodes. In the case where the test sample is arranged after the nematode is arranged, the test sample may be arranged after the nematode is arranged and cultured and increased at the place to be arranged. As time elapses after the nematode is placed, the possibility that the nematode spreads widely on the bottom surface increases. Therefore, it is desirable to start observation immediately after placing the nematode.
  • the test sample in a predetermined position of the petri dish, and then place the nematode in the predetermined position, and immediately start counting for 3 to 15 minutes in b) described later.
  • the test sample is placed after the nematode is placed, it is desirable to place the test sample within 3 minutes, more preferably within 1 minute after placing the nematode.
  • the nematode is preferably placed in an area that is 0.5 cm or more away from any side wall of the petri dish or its lid (however, , Does not prevent it from being placed in an area within 0.5 cm from the side wall).
  • b) Observing the arrangement of the nematode on the bottom surface of the nematode 3 to 15 minutes after the test sample and the nematode are placed on the petri dish.
  • the nematode places the test sample on the petri dish (or The nematode exhibits chemotaxis behavior as soon as it is placed in the petri dish where the test sample is placed. Wait about 3 to 15 minutes, preferably 3 to 12 minutes, more preferably 5 to 10 minutes, for example 5 minutes, 7.5 minutes or 10 minutes, and the nematode will have enough distance to evaluate chemotaxis behavior Can only move.
  • c) if the ratio of the nematode approaching the test sample is lower than the ratio of the nematode moving away from the test sample, it is evaluated that the nematode showed repellent behavior with respect to the test sample. be able to. In c), when the ratio of nematodes approaching the test sample is equal to the ratio of nematodes moving away from the test sample, it may be evaluated that the nematode did not attract or repel behavior.
  • a chemotaxis index may be obtained by the following formula to evaluate whether the nematode has shown an attracting action or a repelling action.
  • Taxis index (taxis index) ⁇ (Number of nematodes in the area indicated by ⁇ ) ⁇ (number of nematodes in the area indicated by ⁇ ) ⁇ / total number of nematodes
  • the chemotaxis index takes a value between -1 and +1, and takes a positive value when showing an attracting action and a negative value when showing a repelling action. And it can be interpreted that the greater the absolute value of the numerical value, the stronger the chemotaxis behavior.
  • c) further comprises evaluating whether the test sample is an attractant, a repellent, or neither based on the chemotaxis behavior exhibited by the nematode on the test sample. But you can.
  • nematodes exhibit attracting behavior against body fluids (for example, urine) of cancer patients and repellent behaviors for body fluids (for example, urine) of healthy individuals. It is clear to show. This is understood to be based on the fact that cancer-specific factors are released from the cancer cells and cancer tissues of the cancer patient into the body fluid of the cancer patient, which induces the nematode attracting behavior.
  • the test sample can be a cell suspected of being a cancer cell, a tissue suspected of being a cancer tissue, or an extract or lysate thereof, or cancer.
  • a body fluid sample from a subject suspected of suffering from for example, a human
  • blood for example, plasma
  • urine the sample may be cancer based on the chemotaxis behavior of the nematode. It can be determined whether or not an attracting substance derived from is included. The result of this determination is useful as one of basic information when the doctor diagnoses cancer, and assists the doctor in diagnosing cancer.
  • a method for determining whether or not a test sample contains an attractant derived from cancer comprising the above a) to c), and A method is provided that further comprises, based on the chemotaxis behavior, determining whether the test sample contains an attractant derived from cancer.
  • a method for diagnosing whether or not a subject has cancer including obtaining a test sample from the subject, and a) to c) above, and d) When the nematode exhibits an attracting action on the test sample, it is evaluated that the subject is suffering from cancer, or when the nematode shows repellent action on the test sample Provides a method comprising assessing that the subject is free of cancer.
  • the method for evaluating the chemotaxis behavior of nematodes with respect to the odor of the test sample of the present invention the method for determining whether or not the test sample contains an attractant derived from cancer, and the subject has cancer
  • the chemotaxis behavior via the olfactory sense of the nematode is evaluated, but a nematicide (for example, sodium azide) for stopping the movement of the nematode is evaluated.
  • a nematicide for example, sodium azide
  • the method of the present invention that does not use these has one practical restriction. This is beneficial in that it can be removed.
  • the method for evaluating the chemotaxis behavior of nematodes with respect to the odor of the test sample of the present invention the method for determining whether or not the test sample contains an attractant derived from cancer, and the subject has cancer
  • the petri dish or behavior evaluation system of the present invention described above can be used, and a multiplate can also be used.
  • the method of using the petri dish, behavior evaluation system, and multi-plate of the present invention in the method of the present invention is as described above.
  • Example 1 Construction of an evaluation system for chemotaxis behavior using the sense of smell of nematodes
  • an attempt was made to construct a new evaluation system for chemotaxis behavior of nematodes.
  • a square petri dish having a bottom surface of 5 cm ⁇ 2 cm was manufactured (see FIGS. 1A and B).
  • a photograph of the petri dish actually produced is as shown in FIG.
  • the nematode is sown in the area divided by two lines in the central part of the square petri dish, and the attracting substance or repellent substance is applied to the left end area, so that the attracting action or repelling of the nematode attractant is performed. Observed behaviors against the substance were observed.
  • isoamyl alcohol was used as the attracting substance
  • nonanone was used as the repellent substance.
  • isoamyl alcohol was diluted 1000 times with water and 1 ⁇ L was applied to the left end region.
  • Nonanon was applied to the left end region with 1 ⁇ L of the stock solution.
  • wild-type C. elegans (10-50 animals / experiment) was used.
  • the chemotaxis index explained below for the attracting and repelling behavior of nematodes was obtained, and the sensitivity of the constructed evaluation system was confirmed. Specifically, a region between a left end region to which an attractant or a repellent material is applied and a region where a nematode is seeded in the center in the longitudinal direction (region indicated by a circle in FIG. 4; first embodiment) And the number of nematodes that have moved to the area on the opposite side (area indicated by x in FIG. 4; corresponding to area 2 of the first embodiment). The difference in the number of individuals was obtained, and the chemotaxis index was obtained by dividing by the total number of nematode individuals.
  • Taxis index (taxis index) ⁇ (Number of nematodes in the area indicated by the symbol “ ⁇ ”) ⁇ (Number of nematodes in the area indicated by the symbol “ ⁇ ”) ⁇ / Total number of nematodes
  • FIG. 5 shows the chemotaxis index and standard error (SEM) measured only 10 minutes after nematode seeding.
  • SEM standard error
  • evaluation may be performed for the purpose of determining whether the test substance is an attractant, a repellent substance, or neither.
  • evaluation system of the present invention it has been found that it is possible to determine whether a test substance is an attractant or a repellent substance with a surprising sensitivity in a short measurement time.
  • chemotaxis behavior based on olfaction has been evaluated using a 9 cm round petri dish.
  • the movable area of the nematode is wide, and the olfaction is sensitized during movement and runs immediately. It is known to show no sexual behavior and move around randomly.
  • a countermeasure is taken such that a poison such as sodium azide is applied to the destination area.
  • the evaluation system of the present invention was able to measure the chemotaxis behavior based on the olfactory sense of nematodes without using any toxic substances.
  • Example 2 Evaluation of chemotaxis behavior via olfactory sense of nematode using urine of cancer patient Wild type nematode shows attracting behavior in urine of cancer patient and repellent behavior in urine of healthy subject It is clear that In this example, chemotaxis behavior with respect to urine derived from cancer patients was evaluated using the new evaluation system constructed in Example 1.
  • the chemotaxis behavior was evaluated in the same manner as in Example 1 except that the attractant or repellent substance was the urine of cancer patients (1/20 dilution) or the urine of healthy individuals (1/20 dilution). From the results of Example 1, the measurement time was 5 minutes or 10 minutes after seeding of the nematode. The result was as shown in FIG.
  • the nematode run was performed under the same conditions as the experiment for obtaining the results of FIG. 6 except that the urine concentration was 1/200 dilution and the measurement time was 10 minutes. Sexual behavior was observed.
  • urine urine obtained from different cancer patients was used. The result was as shown in FIG.
  • nematodes showed attracting behavior for urine from any cancer patient, and nematodes showed repellent behavior for the urine of any healthy subject.
  • the chemotaxis index was 0.1 to 0.2 even though urine was diluted at a high magnification, and the high sensitivity of this evaluation method could be demonstrated.
  • the motility index of healthy subjects was -0.15 to -0.2, and the high sensitivity of this evaluation method could be re-verified.
  • Example 3 Evaluation of chemotaxis behavior of nematodes using 3 cm x 1 cm square petri dish
  • the chemotaxis behavior of nematodes was evaluated using a smaller square petri dish than in Example 1.
  • the chemotaxis behavior of the nematode was observed under the same conditions as the experiment that obtained the results of FIG. 6 except that a 3 cm ⁇ 1 cm square petri dish was used. Evaluation was performed 5 minutes and 10 minutes after nematode seeding. The result was as shown in FIG.
  • the cause of the decrease in sensitivity was examined. After 10 minutes, the nematode was climbing up the side wall of the petri dish, or the nematode dived into the culture medium from the side wall, so that the countable nematode population was It became clear that the decline was a factor. That is, it was revealed that the place where the nematodes are arranged should be at least 0.5 cm away from the side wall of the petri dish.
  • Example B4 The chemotaxis behavior evaluation system according to the third embodiment
  • a field (indentation 600) for evaluating the chemotaxis behavior is provided in the solid medium instead of the shape of the petri dish itself, and a line is formed in the field. It evaluates the chemotaxis behavior of insects.
  • the chemotaxis behavior based on olfaction was evaluated using the nematode strain N2 Bristol strain. Nematodes were raised using NGM plates described in Table 1 below.
  • Reagents were mixed in the medium composition of the assay plate, and after autoclaving, an appropriate amount was poured into a 9 cm petri dish, and a solid medium was hardened by cooling while pressing a 5 cm ⁇ 2 cm ⁇ 1 mm plastic plate on the surface. After the solid medium was hardened, the plastic plate was removed to form a recess having a length of 5 cm, a width of 2 cm, and a depth of 1 mm on the surface of the solid medium. In this manner, a petri dish having a solid medium having a depression on the surface as shown in FIGS. 11A and 11B was obtained.
  • N (A) is the number of nematode individuals that have moved to the region A
  • N (B) is the number of nematode individuals that have moved to the region B.

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Abstract

本発明は、線虫の嗅覚に基づく匂い物質に対する走性行動の評価方法、および該評価方法に用いるシャーレおよび行動評価系を提供する。 【解決手段】被検試料の匂いに対する線虫の走性行動を評価する方法であって、　ａ）被検試料が底面に配置されたシャーレであって、被検試料から１ｃｍ～３ｃｍ離れた底面の領域または部位に線虫が配置されたシャーレを提供することと、　ｂ）被検試料または線虫のいずれか遅い方が配置されてから３～１５分後に線虫の底面上での配置を観察することと、　ｃ）被検試料に対して誘引行動を示したか忌避行動を示したかを、観察された線虫の配置から評価することと を含む、方法、および、この方法に適したシャーレまたは走性行動評価系。

Description

線虫の嗅覚に基づく匂い物質に対する走性行動の評価方法、並びに該評価方法に用いるシャーレおよび行動評価系 関連出願の相互参照
　本出願は、日本国において２０１６年９月１２日に出願された特許出願（特願２０１６－１７７６６４号）、および、２０１７年３月３１日に出願された特許出願（特願２０１７－６９７６２号）の優先権の利益を享受する出願であり、これら出願の全体は、引用されることにより本願に取り込まれるものである。
　本発明は、線虫の嗅覚に基づく匂い物質に対する走性行動の評価方法、並びに該評価方法に用いるシャーレおよび行動評価系に関する。
　線虫は、生物研究においてモデル生物として世界中で広く飼育され、研究されているポピュラーな生物であり、飼育が容易であるという特徴を有する。線虫は神経が細胞レベルですべて明らかになっており、行動解析の研究が盛んにおこなわれている。
　線虫の行動評価では、９ｃｍの丸形シャーレを用いる。これは、線虫の移動距離を長く確保することが、線虫の行動評価の精度を維持するために不可欠であるためである。本発明者らは、線虫の嗅覚を利用すると、高感度かつ高精度にがんを検出できることを実証してきた（非特許文献１および特許文献１）。
　上述の通り、従来、線虫の嗅覚を介した走性行動を評価するために、シャーレ上に被検物質と線虫とを一定以上隔離させて配置し、走性行動をシャーレ上の線虫の配置を観察していた。線虫の走性行動は、揺らぎを有し、必ずしも被験物質に対して最短距離で移動するわけではなく、迂回しながらの走性を示すこともあるため、走性行動の評価結果を精度を向上させるためには、一般的な行動評価と同様に、一定以上の長距離を移動した線虫のみを評価するといった手法が必要であると考えられていたためである。加えて、匂いは、遠隔的に伝達できるため、被検試料と線虫との距離を大きく離して配置して試験することが可能であり、被検試料と線虫との距離が大きく離れている方が正確に走性行動を評価できると考えられており、このことから匂いは被検試料と線虫との距離を大きく離す評価系に適していると信じられていた。したがって、嗅覚を介した走性行動の評価においても、一般的な行動評価の系が用いられることが前提となっていた。
　ところで、線虫に一定以上の長距離を移動させるためには、一定以上の長時間にわたって線虫が動くことを許す必要がある。一方で、一定以上の長時間にわたって嗅覚を刺激すると、線虫の嗅覚は感作を起こしてランダムに動き始めるため嗅覚による走性行動の評価が不能となる。したがって、線虫の嗅覚を介した走性行動を評価する際には、殺線虫剤（例えばアジ化ナトリウムなどの劇薬）を用い、走性行動を示した線虫の動きを止める工夫がなされていた（非特許文献１および特許文献１）。
ＷＯ２０１５／８８０３９
Hirotsu T. et al., PLOS ONE, 10(3): e0118699, 2015
　本発明は、線虫の嗅覚に基づく匂い物質に対する走性行動の評価方法、並びに該評価方法に用いるシャーレおよび行動評価系を提供する。
　本発明者らは、一般的な行動評価とは異なり、嗅覚を介した走性評価の場合には、近距離に被検試料と線虫とを配置すると、意外にも従来よりも精度高く走性行動を評価できることを見出した。本発明者らはまた、この知見に基づいて、線虫の嗅覚を介した走性行動を評価することに適したシャーレを発明した。本発明は、これらの知見および発明に基づくものである。
　本発明では、以下の発明が提供される。
（１）略角型形状（例えば、長手方向が３～６ｃｍ、横手方向が１～３ｃｍまたは３ｃｍ～６ｃｍである略角型形状）の底面を有するシャーレであって、底面は、長手方向に片側の末端から別の末端に向かって第一の領域、第二の領域および第三の領域の少なくとも３つの領域に区分けされ、第二の領域が、第一の領域と第三の領域との境界に配置されている、シャーレ。
（２）区分けが、底面の上面に対する凹凸形状若しくは印刷、または下面に対する凹凸形状若しくは印刷による区分けである、上記（１）に記載のシャーレ。
（３）第一の領域と第三の領域とを区別する表示を有する、上記（１）または（２）に記載のシャーレ。
（４）上記（１）～（３）のいずれかに記載のシャーレが複数連結した、マルチプレート。
（５）被検試料の匂いに対する線虫の走性行動を評価する方法であって、
　ａ）被検試料が配置されたシャーレであって、被検試料から１ｃｍ～３ｃｍ離れた底面の領域または部位に線虫が配置されたシャーレを提供することと、
　ｂ）被検試料と線虫がシャーレに配置されてから３～１５分後に線虫の底面上での配置を観察することと、
　ｃ）被検試料に対して誘引行動を示したか忌避行動を示したかを、観察された線虫の配置から評価することと
を含む、方法。
（６）被検試料が、がん患者であると疑われる対象から得られた試料である、上記（５）に記載の方法。
（７）被検試料が、がん患者であると疑われる対象から得られた尿である、上記（６）に記載の方法。
（８）　ｃ）において線虫が被検試料に対して誘引行動を示した場合には、被検試料にがんに由来する誘引物質が含まれると判定すること、または、線虫が被検試料に対して忌避行動を示した場合には、被検試料にがんに由来する誘引物質が含まれていないと判定することをさらに含む、上記（６）または（７）に記載の方法。
（９）殺線虫剤を用いない、上記（５）～（８）のいずれかに記載の方法。
（１０）　ａ）において、上記（１）～（３）のいずれかに記載のシャーレまたは上記（４）に記載のマルチプレートに含まれるいずれか１つのシャーレを用いる、上記（５）～（９）のいずれかに記載の方法。
　本発明はまた、上記発明によるシャーレの小型化に伴って、シャーレ内壁と固形培地の隙間に潜り込む線虫数が増大し、観察可能な線虫数が時間経過と共に減少するという新しい課題に対して解決手段を提供する。
　この点に関して、本発明者らは、固形培地に線虫の厚み以上の面状のくぼみを形成させ、くぼみを完全に覆う蓋をして、そのくぼみ内で嗅覚に基づく走性行動評価を行うと、線虫が行動観察面から逃げ出すことができず、行動評価時に観察可能な線虫数が飛躍的に増大することを見出した。本発明は、これらの知見にも基づくものである。
（１Ａ）略角型形状（例えば、長手方向が３～６ｃｍ、横手方向が１～３ｃｍまたは３ｃｍ～６ｃｍである略角型形状）の底面と底面の周囲を囲む側壁とを有する線虫の走性行動評価系であって、底面は、目印によって長手方向に片側の末端から別の末端に向かって第一の領域、第二の領域および第三の領域の少なくとも３つの領域に区分けされ、第二の領域が、第一の領域と第三の領域との境界に配置されている、走性行動評価系。
（２Ａ）目印が、底面の上面に対する凹凸形状若しくは印刷、または下面に対する凹凸形状若しくは印刷による目印である、上記（１Ａ）に記載の走性行動評価系。
（３Ａ）第一の領域と第三の領域とを区別する表示を有する、上記（１Ａ）または（２Ａ）に記載の走性行動評価系。
（４Ａ）上記（１Ａ）～（３Ａ）のいずれかに記載の走性行動評価系が複数連結した、マルチプレート。
（５Ａ）略角型形状（例えば、長手方向が３～６ｃｍ、横手方向が１～３ｃｍまたは３ｃｍ～６ｃｍ）、深さが線虫の厚み以上であり２ｍｍ以下である略角型面形状のくぼみを表面に有する固形培地が導入されたシャーレと、前記くぼみを上部から覆う板を備えた線虫の走性行動評価系。
（６Ａ）シャーレの底面の前記くぼみに対応する部位が、目印によって長手方向に片側の末端から別の末端に向かって第一の領域、第二の領域および第三の領域の少なくとも３つの領域に区分けされ、第二の領域が、第一の領域と第三の領域との境界に配置されている、上記（５Ａ）に記載の走性行動評価系。
（７Ａ）前記くぼみを上部から覆う板の前記くぼみに対応する部位が、目印によって長手方向に片側の末端から別の末端に向かって第一の領域、第二の領域および第三の領域の少なくとも３つの領域に区分けされ、第二の領域が、第一の領域と第三の領域との境界に配置されている、上記（５Ａ）に記載の走性行動評価系。
（８Ａ）目印が、底面の上面に対する凹凸形状若しくは印刷、または下面に対する凹凸形状若しくは印刷による目印である、上記（６Ａ）または（７Ａ）に記載の走性行動評価系。
（９Ａ）第一の領域と第三の領域とが接しており、第二の領域が閉じた形状である、上記（１Ａ）～（８Ａ）のいずれかに記載の線虫の走性行動評価系。
（１０Ａ）蓋を閉じたときに前記底面に対向する面上に被検試料配置部位を備える蓋を備えた、上記（１Ａ）～（４Ａ）のいずれかに記載の線虫の走性行動評価系。
（１１Ａ）第二の領域上に線虫が配置された、上記（１Ａ）～（１０Ａ）のいずれかに記載の線虫の走性行動評価系。
（１２Ａ）第一の領域または第三の領域に被検試料が配置された、上記（１Ａ）～（１１Ａ）のいずれかに記載の線虫の走性行動評価系。
（１３Ａ）被検試料の匂いに対する線虫の走性行動を評価する方法であって、
　ａ）被検試料が配置されたシャーレであって、被検試料から１ｃｍ～３ｃｍ離れた底面の領域または部位に線虫が配置されたシャーレを提供することと、
　ｂ）被検試料と線虫がシャーレに配置されてから３～１５分後に線虫の底面上での配置を観察することと、
　ｃ）被検試料に対して誘引行動を示したか忌避行動を示したかを、観察された線虫の配置から評価することと
を含む、方法。
（１４Ａ）被検試料が、がん患者であると疑われる対象から得られた試料である、上記（１３Ａ）に記載の方法。
（１５Ａ）被検試料が、がん患者であると疑われる対象から得られた尿である、上記（１４Ａ）に記載の方法。
（１６Ａ）ｃ）において線虫が被検試料に対して誘引行動を示した場合には、被検試料にがんに由来する誘引物質が含まれると判定すること、または、線虫が被検試料に対して忌避行動を示した場合には、被検試料にがんに由来する誘引物質が含まれていないと判定することをさらに含む、上記（１４Ａ）または（１５Ａ）に記載の方法。
（１７Ａ）殺線虫剤を用いない、上記（１３Ａ）～（１６Ａ）のいずれかに記載の方法。
（１８Ａ）ａ）において、上記（１Ａ）～（３Ａ）のいずれかに記載の走性行動評価系若しくは上記（４Ａ）に記載のマルチプレート、または上記（５Ａ）～（１２Ａ）のいずれかに記載の走性行動評価系のいずれか１つを用いる、上記（１３Ａ）～（１７Ａ）のいずれかに記載の方法。
（１９Ａ）ａ）において、以下のシャーレ：
　（ｉ）略角型形状（例えば、長手方向が３～６ｃｍ、横手方向が１～３ｃｍまたは３ｃｍ～６ｃｍである略角型形状）の底面を有するシャーレであって、底面は、長手方向に片側の末端から別の末端に向かって第一の領域、第二の領域および第三の領域の少なくとも３つの領域に区分けされ、第二の領域が、第一の領域と第三の領域との境界に配置されている、シャーレ；若しくは、
　（ｉｉ）略角型形状（例えば、長手方向が３～６ｃｍ、横手方向が１～３ｃｍまたは３ｃｍ～６ｃｍ）、深さが線虫の厚み以上であり２ｍｍ以下である略角型面形状のくぼみを表面に有する固形培地が導入されたシャーレと、前記くぼみを上部から覆う板を備えた線虫の走性行動評価系；または
　（ｉｉｉ）上記（ｉ）のシャーレまたは上記（ｉｉ）の走性行動評価系が複数連結したマルチプレートに含まれるいずれか１つを用いる、上記（１３Ａ）～（１８Ａ）のいずれかに記載の方法。
　本発明によれば、線虫の嗅覚に基づく走性行動の評価の精度が向上する上に、測定時間が大幅に短縮されるという利点およびアジ化ナトリウムなどの劇物の使用が不要とできるという利点がある。
図１Ａは、本発明の第一の実施形態のシャーレ１００の平面図を示す。図中の二点鎖線は、底面の区分けパターンの境界線を示す。 図１Ｂは、本発明の第一の実施形態のシャーレ１００の正面図を示す。 図１Ｃは、本発明の第一の実施形態の変形例１００Ａの平面図を示す。図中の二点鎖線は、底面の区分けパターンの境界線を示す。 図１Ｄは、蓋１５０をかぶせた本発明の第一の実施形態のシャーレ１００の正面図を示す。 図１Ｅは、蓋１５０の平面図を示す。 図１Ｆは、蓋１５０の変形例１５０Ａの平面図を示す。 図１Ｇは、変形例１５０Ａの一態様における、１５１を通る直線での断面図を示す。 図１Ｈは、変形例１５０Ａの一態様における、１５１を通る直線での断面図を示す。 図１Ｉは、本発明の第一の実施形態のシャーレ１００のＡ－Ａ断面図（図１Ａ参照）を示す。 図２Ａは、本発明の第二の実施形態のシャーレ２００の平面図を示す。図中の二点鎖線は、底面の区分けパターンの境界線を示す。 図２Ｂは、本発明の第二の実施形態の変形例２００Ａの平面図を示す。図中の二点鎖線は、底面の区分けパターンの境界線を示す。 図３Ａは、本発明のマルチプレートの一例５００の平面図を示す。 図３Ｂは、本発明のマルチプレートの一例５００Ａの平面図を示す。 図３Ｃは、本発明の蓋６００付のマルチプレートの一例５００の正面図を示す。 図４は、本実施例において作成された５ｃｍ×２ｃｍの角形シャーレの写真を示す。写真中、白い細かい点で示されるのが線虫である。 図５は、本発明のシャーレを用いると、誘引物質（イソアミルアルコール）への誘引行動および忌避物質（ノナノン）への忌避行動が高感度で測定できることを示す図である。 図６は、本発明のシャーレを用いて、５分および１０分でがん患者の尿への誘引行動および健常者の尿への忌避行動が明確に評価できることを示す図である。 図７は、従来法に基づく尿サンプルへの走性行動評価の結果を示す図である。 図８は、様々ながん患者および健常者から得た尿（１／２００希釈）を用いた走性行動評価の結果を示す図である。 図９は、３ｃｍ×１ｃｍの角形シャーレを用いて走性行動評価をした結果を示す図である。 図１０は、従来の線虫の走性行動評価系と本発明の第三の実施形態の評価系とを比較した模式図である。記号「＋」の位置に被検試料を配置し、記号「Ｃ」の領域に線虫を配置し、線虫が「Ａ」に移動した場合には誘引行動を示したことが分かり、「Ｂ」に移動した場合には忌避行動を示したことが分かるという評価系である。 図１１Ａは、本発明の第三の実施形態による評価系の固形培地表面を表す平面図である。 図１１Ｂは、本発明の第三の実施形態による評価系の固形培地表面を表すＡ－Ａ断面図である。 図１１Ｃは、くぼみを作成するための型の断面図である。 図１２Ａは、本発明の第三の実施形態による評価系の平面図である。 図１２Ｂは、本発明の第三の実施形態による評価系のＢ－Ｂ断面図である。 図１３は、実施例Ｂ４において構築した本発明の第三の実施形態による評価系の写真である。 図１４は、実施例Ｂ４において構築した本発明の第三の実施形態による評価系を用いた線虫の走性行動の評価結果（左）および観察面に残存する線虫の割合の経時変化（右）を示す。
発明の具体的な説明
　本明細書では、「線虫」とは、セノラブディティス・エレガンス（Caenorhabditis elegans）を意味する。線虫は、生物研究においてモデル生物として世界中で広く飼育され、研究されているポピュラーな生物であり、飼育が容易で、嗅覚が優れているという特徴を有する。
　本明細書では、「がん」とは、胃がん、直腸結腸がん、食道がん、すい臓がん、前立腺がん、胆管がん、肺がん、血液がん、白血病、リンパ腫等のがん腫を意味する。
　本明細書では、「対象」とは、哺乳動物、例えば、ヒトを意味する。
　本明細書では、「走性行動」とは、誘引行動または忌避行動を意味する。誘引行動とは、ある物質からの物理的距離を縮める行動を意味し、忌避行動とは、ある物質からの物理的距離を広げる行動を意味する。誘引行動を誘発する物質を誘引物質といい、忌避行動を誘発する物質を忌避物質という。
　線虫（C. elegans）は嗅覚により誘引物質に対して誘引し、忌避物質から忌避するという性質を有している。誘引物質に対して誘引する行動を誘引行動といい、忌避物質から忌避する行動を忌避行動という。また、誘引行動と忌避行動とを合わせて走性行動という。
　本発明によれば、線虫の嗅覚を介した走性行動を評価することに適した行動評価系（例えば、下記実施形態に示されるシャーレおよび必要に応じてその蓋）が提供される。シャーレおよび蓋は、プラスチックなどの樹脂製とすることができ、透明な樹脂製とすることができる。以下、実施形態ごとに本発明を説明する。なお、以下、区切り線との表現は、領域を物理的に区切るものではなく、目印として領域間を区分けするという意味で用いられている。線虫は行動評価時には、区切り線を越えて他の領域に移動できる。
第一の実施形態
　本発明の第一の実施形態を図１Ａおよび１Ｂを参照しながら説明する。
　本実施形態におけるシャーレ１００は、図１Ａに示されるように、略角型形状の底面を有するシャーレである。シャーレ１００の底面は、少なくとも２つの区切り線２５および３５を有し、長手方向に片側の末端から別の末端に向かって、底面の領域を少なくとも３つの領域に区分けしている。これにより、底面は、第一の領域２０、第二の領域３０および第三の領域４０の少なくとも３つの領域に区分けされており、特に第二の領域３０が第一の領域２０と第三の領域４０との境界に配置されている。なお、シャーレ１００は、底面の周囲を囲むように側壁が上方に延びている。また、図１Ｉに示されるように、シャーレ１００の底面内面１００ａは、側壁に対して略垂直である。また、シャーレ１００の底面の内面１００ａは、底面の外面１００ｂに対して略平行である。
　第一の実施形態のシャーレ１００は、底面が略角形の形状を有するシャーレで有り得、底面の長手方向の長さが３ｃｍ～６ｃｍ、横手方向の長さが１ｃｍ～３ｃｍまたは３ｃｍ～６ｃｍの範囲の長さであり得る。長手方向の長さは、好ましくは、４ｃｍ～６ｃｍ、好ましくは、４．５ｃｍ～５．５ｃｍ、好ましくは５ｃｍであり得る。横手方向の長さは、好ましくは、１．５ｃｍ～２．５ｃｍ、好ましくは、２ｃｍであり得る。あるいは、横手方向の長さは、好ましくは、３．５ｃｍ～５．５ｃｍ、好ましくは、４ｃｍ～５ｃｍであり得る。そして、第一の実施形態のシャーレ１００は、底面が略角形の形状を有し、底面の長手方向の長さが４ｃｍ～６ｃｍであり、好ましくは、４．５ｃｍ～５．５ｃｍであり、かつ、底面の横手方向の長さが１．５ｃｍ～２．５ｃｍまたは３．５ｃｍ～５．５ｃｍであり得る。第一の実施形態のシャーレ１００は、底面が略角形の形状を有し、長手方向の長さが４．５ｃｍ～５．５ｃｍであり、横手方向の長さが４．５ｃｍ～５．５ｃｍであってもよい。また、第一の実施形態のシャーレ１００は、高さが１ｃｍ～３ｃｍであり得る。
　第二の領域３０は、第一の領域２０と第三の領域４０とを分離するように配置されていてもよい。第二の領域３０は、図１Ａに示されるように、好ましくは、第一の領域２０と第三の領域４０とが第二の領域３０を挟んで対向するように配置され得る。
　第二の領域３０は、底面の総面積の３０％以下、２５％以下、２０％以下、１５％以下、１０％以下、または、５％以下であり得る。
　区分けは、ヒトや機械が、上記少なくとも３つの領域をそれぞれ判別できるようになされていれば、どのように区分けされていてもよい。特に、区分けは、視覚的に各領域の境界が視認できるようになされていればよく、線虫の領域間の移動を完全に妨げるものではない。区分けは、線虫が領域間を移動できるようになされ得る。区分けは、特に限定されないが例えば、底面への印刷または底面の凹凸形状によりなされ得る。底面への印刷または底面の凹凸形状は、底面の上面に対してされていてもよいし、下面に対してなされていてもよい。区分けは、例えば、図１Ａに示されるように、区切り線２５および区切り線３５などの境界線となる区切り線によりなされ得る。区切り線は、必ずしも直線でなくてもよいが、好ましくは直線とすることができる。区切り線は、必ずしも凹凸形状を有さなくてよい。
　第一の領域２０と第三の領域４０とは、それぞれどちらが第一の領域でどちらが第三の領域であるかを区別できるように表示を有していてもよい。表示は、○や×などの記号であってもよいし、文字であってもよく、何らかの印であってもよい。第一の領域と第三の領域を区別するために、シャーレ１００は、タグ９０を有していてもよい。第一の領域と第三の領域とは面積が異なっていてもよく、面積が異なることを利用してそれぞれを区別できるようになっていてもよい。
　タグ９０は、例えば、複数のシャーレ１００をそれぞれ区別するために用いることができる。タグ９０には、特に限定されないが例えば、バーコードや二次元バーコードなどの表示が付され得、前記表示にはそれぞれのシャーレ１００の管理情報が含まれ得る。
　シャーレ１００は、図１Ｂに示されるように底面の縁部に側壁を有し、容器の形状を備える。
第一の実施形態のシャーレの使用方法
　第一の実施形態のシャーレ１００は、線虫の嗅覚を介した走性行動を評価することに適している。以下では、第一の実施形態のシャーレ１００を用いて、線虫の嗅覚を介した走性行動を評価する方法について説明する。
　第一の実施形態のシャーレ１００は、内部に線虫のための固体培地を加えることができる。固体培地は、例えば、寒天培地であり、当業者であれば線虫の生存に適した培地などの培地を作成し、シャーレに添加することができる。
　線虫６０は、第二の領域３０に播種することができる。線虫は、第二の領域３０の全面に播種されてもよいし、第二の領域３０の一部だけに播種されてもよい。被検試料は、第一の領域２０または第三の領域４０であって、例えば、線虫が播種される領域から１ｃｍ～３ｃｍほど離れた位置に配置することができる。
　被検試料が配置された第一の実施形態のシャーレ１００に、線虫を播種すると、線虫は被検試料が誘引物質である場合には、被検試料に誘引行動を示し、被検試料に近い場所に移動するが、被検試料が忌避物質である場合には、被検試料に忌避行動を示し、被検試料から離れた場所に移動する。したがって、線虫が移動した場所を観察することにより（観察された線虫の配置から）、被検試料が誘引物質であるのか忌避物質であるのかを判別することができる。観察は、例えば、目視または顕微鏡で行うことができる。観察は、線虫の配置情報を画像化して、画像を用いて行ってもよい。
第一の実施形態の変形例
　第一の実施形態の変形例１００Ａについて、図１Ｃを参照しながら以下説明する。第一の実施形態の変形例１００Ａは、底面における第一、第二および第三の領域の区分けパターン（区分け形状）が異なる以外は、ほかの構成要素およびその使用法は図１Ａおよび１Ｂに示される第一の実施形態のシャーレ１００と同一である。したがって、以下では、区分けパターンについてのみ説明し、第一の実施形態のシャーレ１００と同じ部分には同一符号を付して説明は省略する。
　第一の実施形態の変形例１００Ａでは、第二の領域３０Ａが、第一の領域２０Ａと第三の領域４０Ａの境界に配置されている点は、第一の実施形態のシャーレ１００と同じである。しかし、第一の実施形態の変形例１００Ａでは、第一の領域２０Ａと第三の領域４０Ａとが接している点で、第一の実施形態のシャーレ１００と異なる。
　第二の領域３０Ａは、閉じた形状であれば様々な形状をも有し得る。図１Ｃでは、略円形状に区分けされているが、円形状に限られず、略多角形形状（例えば、略４角形、略６角形、または略８角形等）であってもよい。
第一の実施形態のシャーレ１００およびその変形例１００Ａに対する蓋１５０
　第一の実施形態のシャーレ１００およびその変形例１００Ａは、蓋１５０を備えていてもよい。以下、蓋１５０について図１Ｄおよび１Ｅを参照しながら説明する。
　図１Ｄおよび１Ｅに示されるように、蓋１５０は、シャーレ１００の上面を覆う蓋であれる。蓋１５０の形状は、シャーレ１００の上面を覆う蓋である限り、その形状は問わない。蓋１５０は、シャーレ１００の上面を覆い、かつ、シャーレ１００内部と外部との空気の流れを遮断できる蓋であることが、嗅覚に基づく行動評価の精度を高める観点で好ましい。
　タグ９０は、蓋１５０に備えられていてもよい。
蓋１５０の使用法
　蓋１５０は、被検試料と線虫を配置したら、シャーレにかぶせることができる。これにより、外気の影響を防ぎ、また、匂いをシャーレ内部に有効に閉じ込めることが可能となり得る。
蓋１５０の変形例１５０Ａ
　蓋１５０の変形例１５０Ａについて、図１Ｄおよび１Ｆを参照しながら以下説明する。蓋１５０Ａは、図１Ｆに示されるように、被検試料配置部位１５１を備える以外は、ほかの構成要素およびその使用法は蓋１５０と同様である。したがって、以下では、被検試料配置部位１５１についてのみ説明し、蓋１５０と同じ部分には同一符号を付して説明は省略する。
　図１Ｆに示されるように、蓋１５０Ａは、蓋を閉じたときにシャーレ底面に対向する面上に被検試料配置部位１５１を備える。被検試料配置部位１５１は、蓋１５０Ａの長手方向中心部から１～３ｃｍ離れた領域に形成される。図１Ｆでは、被検試料配置部位１５１は、円形状で図示されているが、これに限られず、被検試料配置部位１５１は、略円形状、略線形状または略四角形状であり得る。
　ある態様では、被検試料配置部位１５１は、被検試料配置部位１５１とそれ以外の領域１５２との境界１５３を有する。境界１５３は、印刷または凹凸形状により形成され得る。
　ある態様では、被検試料配置部位１５１とそれ以外の領域１５２とは境界１５３において段差を有する。ある態様では、図１Ｇに示されるように、被検試料配置部位１５１は、それ以外の領域１５２よりも、蓋を閉じたときにシャーレ底面に向けて突出していてもよく、ある態様では、図１Ｈに示されるように、被検試料配置部位１５１は、領域１５２よりも蓋を閉じたときにシャーレ底面に対して窪んでいてもよい。図１Ｇに示されるように、被検試料配置部位１５１は、それ以外の領域１５２よりも、蓋を閉じたときにシャーレ底面に向けて突出している場合には、被検試料配置部位１５１の素材は、領域１５２や蓋１５０Ａの素材と同じでもよいし、異なっていてもよい。
　ある態様では、蓋１５０Ａでは、蓋を閉じたときにシャーレ底面に対向する面において、被検試料配置部位１５１は、それ以外の領域１５２と異なる親水性度を有する。
　ある態様では、被検試料配置部位１５１は、親水性表面を有し、それ以外の領域１５２は疎水性表面を有する。これにより、水性の被検試料は、被検試料配置部位１５１上に正確に配置され得る。ある態様では、被検試料配置部位１５１は、疎水性表面を有し、それ以外の領域１５２は親水性表面を有する。これにより、油性の被検試料は、被検試料配置部位１５１上に正確に配置され得る。
蓋の変形例１５０Ａの使用方法
　蓋１５０Ａは、被検試料と線虫を配置したら、シャーレにかぶせることができる。これにより、外気の影響を防ぎ、また、匂いをシャーレ内部に有効に閉じ込めることが可能となり得る。
　蓋１５０Ａを用いる場合、蓋１５０Ａの被検試料配置部位１５１に被検試料を配置し、シャーレに線虫を配置することができる。嗅覚を介した走性行動の評価においては、被検試料と線虫とは空間を隔てて配置されていてもよく、この場合であっても、匂いは空中を拡散し、線虫に届き得る。また、蓋１５０Ａの被検試料配置部位１５１に被検試料を配置し、線虫に到達するのは匂い成分であることから、走性行動のうち、嗅覚を介した部分の評価に向いている。特に被検試料が強力な化学走性を有する場合に、被検試料に含まれるにおい成分の嗅覚を介した走性行動を評価することに適している。
　蓋１５０Ａへの被検試料の配置に関しては、蓋１５０Ａの蓋を閉じたときにシャーレ底面に対向する面を下に向けた状態で、被検試料を蓋の下から導入することにより行うことができる。蓋１５０Ａへの被検試料の配置は、蓋１５０Ａの蓋を閉じたときにシャーレ底面に対向する面を上に向けた状態で、被検試料を蓋の下から導入し、その後、天地反転することにより行うことができる。
第二の実施形態
　第二の実施形態のシャーレ２００について、図２Ａを用いて説明する。第二の実施形態のシャーレ２００は、底面の区分けパターンが異なる以外は、図１Ａおよび１Ｂに示される第一の実施形態のシャーレ１００と同じである。したがって、第一の実施形態のシャーレ１００と同じ部分には同一符号を付して説明は省略する。
　図２Ａに示されるように、第二の実施形態のシャーレ２００では、底面が長手方向に片側の末端から別の末端に向かって第一の領域２１０、第二の領域２２０、第三の領域３０、および第四の領域４０の少なくとも４つの領域に区分けされている。第一の実施形態のシャーレ１００との違いは、第一の領域１０が、第二の実施形態のシャーレ２００では、第一の領域２１０と第二の領域２２０との２つにさらに区分けされている点である。図２Ａに示されるように、第二の実施形態のシャーレ２００では、ライン２１５により第一の領域２１０と第二の領域２２０とが区分けされている。
　第二の実施形態のシャーレ２００では、被検試料は、例えば、第一の領域２１０もしくはライン２１５上またはその両方に配置することができる。被検試料の配置領域が区分けにより示されていることにより、被検試料と、線虫６０（第三の領域３０の一部または全部に塗布される）との距離を異なる試験間で一定に保つことが容易になる。第一の領域２１０と第三の領域３０とは、例えば、１ｃｍ～３ｃｍ程度、１ｃｍ～２ｃｍ程度、または１．５ｃｍ～２．５ｃｍ程度、１．５ｃｍ～２ｃｍ程度の距離を有し得る。
第二の実施形態の変形例２００Ａ
　第二の実施形態の変形例２００Ａについて、図２Ｂを参照しながら以下説明する。第二の実施形態の変形例２００Ａは、底面における区分けパターン（区分け形状）が異なる以外は、ほかの構成要素は図２Ａおよび１Ｂに示される第二の実施形態のシャーレ２００と同一である。したがって、以下では、区分けパターンについてのみ説明し、第二の実施形態のシャーレ２００と同じ部分には同一符号を付して説明は省略する。
　第二の実施形態の変形例２００Ａでは、第三の領域３０Ａが、第二の領域２２０と第四の領域４０Ａの境界に配置されている点は、第一の実施形態のシャーレ１００と同じである。しかし、第二の実施形態の変形例２００Ａでは、第二の領域２２０と第四の領域４０Ａとが接している点で、第二の実施形態のシャーレ２００と異なる。
　第三の領域３０Ａは、閉じた形状であれば様々な形状をも有し得る。図２Ｂでは、略円形状に区分けされているが、円形状に限られず、略多角形形状（例えば、略４角形、略６角形、または略８角形等）であってもよい。
　上記において、実施形態ごとに本発明のシャーレを説明したが、これらのシャーレにおいて、底面はさらに細かく区分けされていてもよい。区分けは、上記と同様に区分けは、ヒトや機械が、上記少なくとも３つの領域をそれぞれ判別できるようになされていれば、どのように区分けされていてもよい。
本発明のマルチパネル
　以下、本発明のマルチパネルについて図３を参照しながら説明する。
　図３Ａに示すように本発明のマルチパネル５００は、本発明の第一の実施形態のシャーレ１００が縦または横に配置されてなる集合体であり得る。また、図３Ｂに示されるように本発明のマルチパネル５００Ａは、本発明の第一の実施形態のシャーレ１００が縦横に配置されてなる集合体であり得る。本発明のマルチパネル５００または５００Ａでは、特に限定されないが例えば、本発明の第一の実施形態のシャーレ１００が２個～１０００個、４個～７００個、６個～６００個、８個～５００個、または１０個～３００個配置されていてもよい。
　また、マルチパネルでは、隣り合う第一の実施形態のシャーレ１００同士は直接連結していてもよいし、スペーサーを介して連結していてもよい。
　図３ＡおよびＢでは、シャーレとして、第一の実施形態のシャーレ１００を用いる例を示したが、シャーレは、第二の実施形態のシャーレ２００としてもよいし、第一の実施形態の変形例１００Ａまたは第二の実施形態の変形例２００Ａとしてもよい。
　本発明のマルチパネル５００または５００Ａは、蓋６００をさらに備えていてもよい。蓋６００と各シャーレとの側壁により、各シャーレ内の被検試料が隣のシャーレに漏れることをより効果的に防ぐことが期待できる。蓋６００は、蓋１５０Ａと同様に被検試料配置部位１５１を備えていてもよい。蓋６００の使用法は、蓋１５０および蓋１５０Ａにおいて説明した通りであるので説明を省略する。
第三の実施形態
　第三の実施形態は、シャーレの小型化に伴って、シャーレ内壁と固形培地の隙間に潜り込む線虫数が増大し、観察可能な線虫数が時間経過と共に減少するという新しい課題に対して、その解決手段を提供するものである。第三の実施形態は、シャーレ自体の形状ではなく、シャーレに固形培地を導入した後に形成される固形培地表面（上面）の形状に特徴がある。以下、第三の実施形態を図１０～１２により説明する。
　図１０では、従来の特許文献１に記載された評価系と、本発明の第三の実施形態の評価系とを対比した模式図である。従来の評価系は、線虫を播種する面は、シャーレの側壁によりその外周を囲われていた。本発明の第三の実施形態の評価系は、評価系の固形培地面に面形状のくぼみを有し、そのくぼみ内で走性行動を評価するものである。なお、線虫の走性行動を観察する際には、このくぼみに蓋をして線虫をくぼみ内に閉じ込めて観察を行うため、このくぼみを本明細書では、「行動観察面」とよぶことがある。
　図１１に示されるように、第三の実施形態では、固形培地面６１０は、略角型形状の面状のくぼみ６００を有する。略角型形状の面状のくぼみ６００は、くぼみの底面６００ａとくぼみの側面６００ｂとを有する。くぼみの底面６００ａは、長手方向の長さが３ｃｍ～６ｃｍ、横手方向の長さが１ｃｍ～３ｃｍまたは３ｃｍ～６ｃｍの範囲の長さであり得る。前記くぼみの底面６００ａの長手方向の長さは、好ましくは、４ｃｍ～６ｃｍ、好ましくは、４．５ｃｍ～５．５ｃｍ、好ましくは５ｃｍであり得る。前記くぼみの底面６００ａの横手方向の長さは、好ましくは、１．５ｃｍ～２．５ｃｍ、好ましくは、２ｃｍであり得る。あるいは、横手方向の長さは、好ましくは、３．５ｃｍ～５．５ｃｍ、好ましくは、４ｃｍ～５ｃｍであり得る。前記凹みはまた、長手方向の長さが４．５ｃｍ～５．５ｃｍであり、横手方向の長さが４．５ｃｍ～５．５ｃｍであってもよい。前記くぼみ６００の深さ（厚み）またはくぼみの側面６００ｂの高さは、線虫の厚み以上であり、５ｍｍ以下、４ｍｍ以下、３ｍｍ以下、２ｍｍ以下、好ましくは１ｍｍ以下、より好ましくは０．５ｍｍ以下、さらに好ましくは０．３ｍｍ以下、さらにより好ましくは０．２ｍｍ以下、例えば、０．１ｍｍ程度であり得る。行動観察に用いる線虫の厚み＋１０～５０％程度の深さ、線虫の厚み＋１０～４０％程度の深さ、線虫の厚み＋１０～３０％程度の深さ、線虫の厚み＋１０～２０％程度の深さとすると、線虫を行動観察面に閉じ込める目的と、線虫を行動観察面内で行動させる目的とを両立でき、好ましい。
　顕微鏡観察を容易にする観点では、くぼみの底面６００ａは略平面であることが望ましい。このようにすることで顕微鏡のフォーカスを一定にしたまま、行動観察面全体を観察することが容易となる。
　また、行動観察時には、くぼみ６００を蓋６５０で完全に覆って線虫がくぼみ６００の外部に逃げないようにすることができる。また、本発明では、くぼみ６００の深さを線虫の厚み（例えば、約０．１ｍｍ程度）に近づけることができる。このようにすることで、くぼみ６００を覆う板６５０で覆ったときに、線虫がくぼみ６００の外に逃れることが困難になると同時に、板６５０の内壁６５０ａに付着した線虫も、くぼみ６００の底面６００ａに付着した線虫と同様に観察することができる。
　従来、線虫は、評価系の側壁に達すると側壁と固形培地との間に潜り込んでしまい、行動評価に潜り込んだ線虫を用いることはできなかった。本発明では、くぼみ６００の内面は、その表面がスムースに整形されている。スムースに整形されているとは、線虫が潜り込める隙間や穴を有しないことを意味する。このような表面がスムースに整形されたくぼみは、熱して溶解した、冷えると固化する培地をシャーレに導入し、固まる前に溶解した培地の上方からくぼみ６００の形状の型をあてながら冷却することで作成することができる。くぼみ６００の形状の型は、例えば、図１１Ｃに示されるように、くぼみ６００の形状と相補的な形状を有する型６６０とすることができる。
　ここで、シャーレは、くぼみの底面６００ａを上方から観察したときに、中央部の領域を示す二本の線６２０（目印）が設けられていてもよい。線６２０で示された領域には線虫を配置し、二本の線６２０の外側の領域のどちらかに被検試料を配置することができる（被検試料は蓋に配置してもよい）。すなわち、くぼみ６００の底面６００ａ（行動観察面）は、第一の実施形態や第二の実施形態と同じように、少なくとも２つの区切り線２５および３５を目印として有し、長手方向に片側の末端から別の末端に向かって、底面の領域を少なくとも３つの領域に区分けしている。これにより、底面は、第一の領域２０、第二の領域３０および第三の領域４０の少なくとも３つの領域に区分けされており、特に第二の領域３０が第一の領域２０と第三の領域４０との境界に配置されている。区切り線は、領域を物理的に分断するものではなく、目印として異なる領域間の境目を区別する目的を果たせばそれで十分である。
　図１２に示されるように、くぼみ６００は、測定時にはくぼみ全体を覆う板６５０によって覆われる。板６５０は平面上である。板６５０は、シャーレが光透過性の場合には光透過性でなくてもよいが、光透過性とすることができる。板６５０が光透過性であると、上部から顕微鏡を用いて、板６５０でくぼみ６００を覆った状態で線虫を観察可能であり、有利である。板６５０が光透過性でない場合には、シャーレが光透過性であることが好ましく、この場合、シャーレの下部から倒立顕微鏡を用いて線虫を観察することができる。板もシャーレも光透過性でない場合には、観察時に、板を外してくぼみ、および／または板に付着した線虫を観察することができる。
　区切り線６２０は、シャーレの底面に設けられてもよいし、板６５０の上面または下面６５０ａに設けられていてもよい。
　本発明では、第三の実施形態の行動評価系を作成するための、シャーレ、くぼみ６００を覆う板６５０、およびくぼみ６００を作成するための型６６０の組合せが提供される。前記組合せにおいては、シャーレは、くぼみ６００が形成される部位の直下のくぼみ６００の形状に対応する位置に、第一の実施形態のシャーレ１００、変型例１００Ａ、第二の実施形態のシャーレ２００、または変形例２００Ａの底面における区分けパターンと同様の区分けパターンを有していてもよい。また、くぼみ６００を覆う板６５０には、くぼみ６００を覆ったときにくぼみ６００に対応する位置に、第一の実施形態のシャーレ１００、変型例１００Ａ、第二の実施形態のシャーレ２００、または変形例２００Ａの底面における区分けパターンと同様の区分けパターンを有していてもよい。このようにすることで、線虫を配置する場所を安定させることができ、また、誘引行動と忌避行動とを見分けることが容易になる。
本発明における線虫の嗅覚を介した走性行動の評価方法
　以下、線虫の嗅覚を介した走性行動の評価方法を説明する。
　本発明によれば、
　被検試料の匂いに対する線虫の走性行動を評価する方法であって、
　ａ）被検試料が配置されたシャーレであって、被検試料から１ｃｍ～３ｃｍ離れた底面の領域または部位に線虫が配置されたシャーレを提供することと、
　ｂ）播種から３～１５分後に線虫の配置を観察することと、
　ｃ）被検試料に対して誘引行動を示したか忌避行動を示したかを、観察された線虫の配置から評価することと
を含む、方法が提供される。
　以下、ａ）～ｃ）を工程ごとに説明する。
ａ）被検試料が配置されたシャーレであって、被検試料から１ｃｍ～３ｃｍ離れた底面の領域または部位に線虫が配置されたシャーレを提供すること
　ａ）では、被検試料が配置されたシャーレを用いる。シャーレは、蓋を有していなくてもよいが、好ましくは蓋を有するものを用い得る。シャーレには、線虫のための固体培地が添加され得る。線虫のための固体培地としては、線虫を培養または増殖させるための固体培地を用いることができる。固体培地としては、周知の培地、例えば、寒天培地を用いることができる。被検試料は、特に限定されないが好ましくは、シャーレ底面に配置され得、特にシャーレ底面の周辺部付近に配置され得る。あるいは、被検試料は、特に限定されないが好ましくはシャーレの蓋上の、シャーレ底面に対向する面（または下面）に配置され得、特に蓋の下面の周辺部付近に配置され得る。シャーレ底面または蓋の周辺部（すなわち、側壁付近）に被検試料を配置することにより、線虫をシャーレの底面中央に配置したときに、被検試料との距離を一定以上確保することが容易となる。
　被検試料が配置された部位から、線虫が播種される部位までの距離は、１ｃｍ～３ｃｍ程度、１～２．５ｃｍ程度、１．５～２ｃｍ程度、１．５ｃｍ～２．５ｃｍ程度、または２ｃｍ程度とすることができる。
　播種する線虫の個体数は、例えば、１０～５００程度、例えば１００～５００程度とすることができる。
　被検試料は、あらゆる試料を用いることができる。被検試料としては、例えば、がんに罹患していることが疑われる対象（例えば、ヒト）の試料が挙げられる。被検試料は、例えば、がん細胞であると疑われる細胞、がん組織であると疑われる組織、またはこれらの抽出物もしくは溶解物とすることができるし、あるいは、がんに罹患していることが疑われる対象の体液試料、例えば、血液（例えば、血漿）または尿とすることができる。
　線虫の嗅覚を介した走性評価については、例えば、ＷＯ２０１５／０８８０３９に記載されるように実施することができる。
　従来の方法では、ａ）で提供するシャーレには、殺線虫剤（例えば、アジ化ナトリウム）を被検試料付近および線虫を配置する位置から見て被検試料とは逆側の領域に配置しておく必要があったが、本発明の方法では、殺線虫剤を用いなくてよい。
　ａ）で提供される、被検試料が配置されたシャーレであって、被検試料から１ｃｍ～３ｃｍ離れた領域または部位に線虫が配置されたシャーレは、被検試料を配置した後で線虫を配置して得てもよいし、線虫を配置してから被検試料を配置して得てもよい。線虫を配置してから被検試料を配置する場合には、配置されるべき箇所に線虫を配置して培養して増やしてから、被検試料を配置してもよい。
　線虫を配置してから時間が経過すると線虫が底面上で広く拡散してしまう可能性が高まることから、線虫を配置した後は速やかに観察を開始することが望ましい。したがって、好ましくは、被検試料をシャーレの所定位置に配置し、その後、線虫を所定位置に配置して、すぐに後述するｂ）における３～１５分の時間のカウントを開始することが好ましい。線虫を配置してから被検試料を配置する場合には、線虫を配置して、好ましくは３分以内、より好ましくは１分以内に被検試料を配置することが望ましい。
　ａ）で提供されるシャーレにおいて、線虫が配置される場所は、好ましくは、シャーレまたはその蓋のいずれの側壁からも、０．５ｃｍ以上離れている領域に線虫が配置されている（ただし、側壁から０．５ｃｍ以内の領域に配置することを妨げない）。
ｂ）被検試料と線虫がシャーレに配置されてから３～１５分後に線虫の底面上での配置を観察すること
　ｂ）では、線虫は、シャーレに被検試料を配置すると（または線虫は、被検試料が配置されたシャーレに配置すると）すぐに走性行動を示す。３～１５分程度、好ましくは、３～１２分、より好ましくは５～１０分、例えば、５分、７．５分または１０分待つと、線虫は走性行動を評価するに十分な距離だけ移動できる。そのため、被検試料または線虫のいずれか遅い方が配置されてから、３～１５分程度、好ましくは、３～１２分、より好ましくは５～１０分、例えば、５分、７．５分または１０分後に線虫の底面上での配置を観察することができ、これにより線虫の走性行動を評価することができる。この時間を、３分以上とすることにより、線虫の走性行動が十分に可視化できる程度に大きくなるので、走性行動の評価精度が向上する。また、この時間が１５分以下だと、線虫の嗅覚が感作を受けて、線虫がシャーレ上をランダムに移動し始める可能性が低下し、走性行動の精度が向上する。シャーレの底面に線虫が配置され、蓋に被検試料が配置される場合には、「被検試料と線虫がシャーレに配置されたとき」とは、前記シャーレに前記蓋がかぶせられたときである。
ｃ）被検試料に対して誘引行動を示したか忌避行動を示したかを、観察された線虫の配置から評価すること
　ｃ）では、観察された線虫の配置から線虫が被検試料に対して誘引行動を示したか、忌避行動を示したが、どちらも示さなかったかを評価することができる。ｃ）では、被検試料に近づいた線虫の割合が、被検試料から遠ざかった線虫の割合よりも高い場合には、線虫が被検試料に対して誘引行動を示したと評価することができる。ｃ）ではまた、被検試料に近づいた線虫の割合が、被検試料から遠ざかった線虫の割合よりも低い場合には、線虫が被検試料に対して忌避行動を示したと評価することができる。ｃ）では、被検試料に近づいた線虫の割合が、被検試料から遠ざかった線虫の割合と同等の場合には、線虫が誘引行動も忌避行動もしなかったと評価してもよい。
　また、ｃ）では、例えば、下記式により走性インデックスを求めて、線虫が誘引行動を示したか、忌避行動を示したかを評価してもよい。
走性インデックス
（走性インデックス）＝
｛（○で示す領域の線虫個体数）－（×で示す領域の線虫個体数）｝／全線虫個体数
　走性インデックスは、－１～＋１の間の数値をとり、誘引行動を示した場合には正の値を、忌避行動を示した場合には負の値を取る。そして、数値の絶対値が大きいほど、走性行動が強く表れたと解釈できる。
　ｃ）は、線虫が被検試料に対して示した走性行動に基づいて、被検試料を誘引物質であるか忌避物質であるか、またはそのいずれでもないかを評価することをさらに含んでもよい。
　本発明者らは、ＷＯ２０１５／０８８０３９において、線虫ががん患者の体液（例えば、尿）に対して誘引行動を示すこと、および健常者の体液（例えば、尿）に対しては忌避行動を示すことを明らかにしている。これは、がん患者のがん細胞やがん組織からがん特有の因子ががん患者の体液中に放出されるが、これが線虫の誘引行動を惹起することに基づくと理解される。
　したがって、本発明で、被検試料として、がん細胞であると疑われる細胞、がん組織であると疑われる組織、またはこれらの抽出物もしくは溶解物とすることができるし、あるいは、がんに罹患していることが疑われる対象（例えば、ヒト）の体液試料、例えば、血液（例えば、血漿）または尿を用いた場合には、線虫の走性行動に基づいて、試料ががんに由来する誘引物質を含むか否かを判定することができる。そしてこの判定の結果は、医師ががんの診断をするときの基礎情報の一つとして有益であり、医師によるがん診断の補助となる。
　したがって、本発明の別の側面では、被検試料にがんに由来する誘引物質が含まれているか否かを判定する方法であって、上記ａ）～ｃ）を含み、かつ、線虫の走性行動に基づいて、被検試料ががんに由来する誘引物質を含むか否かを判定することをさらに含む、方法が提供される。
　また、本発明の別の側面では、対象ががんに罹患しているか否かを診断する方法であって、対象から被検試料を得ることと、上記ａ）～ｃ）を含み、かつ、ｄ）線虫が被検試料に対して誘引行動を示した場合には対象ががんに罹患していると評価すること、または線虫が被検試料に対して忌避行動を示した場合には対象ががんに罹患していないと評価することを含む、方法が提供される。
　本発明の被検試料の匂いに対する線虫の走性行動を評価する方法、被検試料にがんに由来する誘引物質が含まれているか否かを判定する方法、および、対象ががんに罹患しているか否かを診断する方法においては、線虫の嗅覚を介した走性行動が評価されるが、線虫の移動を停止させるための殺線虫剤（例えば、アジ化ナトリウムなどの劇薬）を用いる必要がない。アジ化ナトリウムなどの劇薬は、保管や使用に対して厳格な管理を行うことが求められる（そのような制約がある）から、これらを用いない本発明の方法は、実施上の制約が一つ除去できる点で有益である。
　本発明の被検試料の匂いに対する線虫の走性行動を評価する方法、被検試料にがんに由来する誘引物質が含まれているか否かを判定する方法、および、対象ががんに罹患しているか否かを診断する方法においては、上記で説明した本発明のシャーレまたは行動評価系を用いることができるし、マルチプレートを用いることもできる。本発明の方法における本発明のシャーレ、行動評価系、およびマルチプレートの使用方法は、上述した通りである。
実施例１：線虫の嗅覚を利用した走性行動の評価系の構築
　本実施例では、新しい線虫の走性行動の評価系の構築を試みた。
　まず、一例として底面が５ｃｍ×２ｃｍである角形シャーレを作製した（図１ＡおよびＢ参照）。実際に作製したシャーレの写真は図４の通りであった。この角形シャーレの長手方向中央部において２本の線で仕切られた領域に線虫を播種し、左末端の領域に誘引物質または忌避物質を塗布して、線虫の誘引物質に対する誘引行動または忌避物質に対する忌避行動をそれぞれ観察した。本実施例では、誘引物質としてイソアミルアルコールを用い、忌避物質としてノナノンを用いた。具体的には、イソアミルアルコールは、水で１０００倍希釈し、１μＬを左末端の領域に塗布した。また、ノナノンは、原液１μＬを左末端の領域に塗布した。線虫としては、野生型C. elegans（１０～５０匹／実験）を用いた。
　線虫の誘引行動および忌避行動について下記で説明される走性インデックスを求め、構築した評価系の感度を確認した。具体的には、誘引物質または忌避物質を塗布した左末端の領域と、長手方向中央部の線虫を播種する領域との間の領域（図４において○で示される領域；第一の実施形態の領域１に対応する）に移動した線虫の個体数と、その反対側の領域（図４において×で示される領域；第一の実施形態の領域２に対応する）に移動した線虫の個体数の差を求め、全線虫個体数で除して走性インデックスを求めた。
走性インデックス
（走性インデックス）＝
｛（記号"○"で示す領域の線虫個体数）－（記号"×"で示す領域の線虫個体数）｝／全線虫個体数
　実験は、５回繰り返し、走性インデックスの平均値とＳＥＭを求めた。
　結果は、図５に示される通りであった。図５は、線虫播種して、わずか１０分後に測定した走性インデックスと標準誤差（ＳＥＭ）を示す。図５に示されるように、わずか１０分の測定で、誘引物質であるイソアミルアルコールに対して走性インデックスが０．８を超える値を示した。この結果は、９割以上の線虫がこの短期間の間に誘引物質に対して誘引行動を示したものとして測定できたことを示す。
　また、忌避物質であるノナノンに対して走性インデックスが－０．８を下回る値を示した。この結果は、９割以上の線虫がこの短期間の間に忌避物質に対して忌避行動を示したものとして測定できたことを示す。
　嗅覚を用いた走性行動の評価では、試験物質が誘引物質か忌避物質か、またはどちらでもないかを判別することを目的として評価が実施される場合がある。本発明の評価系を用いると、短い測定時間で驚くべき感度で、試験物質が誘引物質であるか、忌避物質であるかを判別することが可能であることが分かった。
　従来は、嗅覚に基づく走性行動の評価を９ｃｍの丸形シャーレを用いて行っており、この場合は、線虫の可動領域が広く、また移動中に嗅覚が感作を受けてすぐに走性行動を示さなくなり、ランダムに動き回ることが知られている。いったん移動した線虫がさらにランダムに動きまわることを防ぐために、アジ化ナトリウムなどの毒物を移動先の領域に塗布するという対策が取られている。
　一方で、本発明の評価系では、毒物を一切使用せずに、線虫の嗅覚に基づく走性行動を超高感度で測定することができた。本発明では、従来、嗅覚に基づく走性行動の観察に必須であった、アジ化ナトリウムの使用は必要なかった。
　また、従来の評価系では、線虫の走性行動を評価するために、３０分以上の期間にわたって線虫を行動させる必要があった。これに対して、本発明の評価系では、従来の数分の１以下の時間にわたって線虫に行動させるだけで評価が可能であるだけでなく、従来よりも高感度に走性を評価することができた。
　本実施例は、被検試料と線虫とを従来よりも近くに配置すると、高精度の評価が可能となったというものである。本発明の評価方法で走性評価が高精度となった理由としては、嗅覚に基づく走性行動評価の際に、線虫の行動能力（例えば、栄養状態、環境温度、培養条件、および成長段階により影響を受ける）の影響が無視できないほど大きなノイズとして影響していたところ（本発明以前はこの影響自体知られていなかったが）、本発明の評価方法では、この影響が最小化できたためであると考えられる。
実施例２：がん患者の尿を用いた線虫の嗅覚を介した走性行動の評価
　野生型線虫は、がん患者の尿には誘引行動を示し、健常者の尿には忌避行動を示すことが明らかとなっている。本実施例では、実施例１で構築した新しい評価系を用いて、がん患者由来の尿に対する走性行動を評価した。
　誘引物質または忌避物質をがん患者の尿（１／２０希釈）または健常者の尿（１／２０希釈）とする以外は実施例１と同様に走性行動を評価した。測定時間は、実施例１の結果から線虫の播種から５分後または１０分後とした。結果は、図６に示される通りであった。
　図６に示されるように、高希釈倍率にも関わらず、５分後でもがん患者の尿への誘引行動と健常者の尿への忌避行動を明確に観察することができた。結果は、１０分後でも同様であった。また、走性インデックスは、がん患者の尿サンプルに対して、５分後で０．５、１０分後で０．６であり、それぞれ７５％および８０％の線虫が誘引行動を示したことを意味する良好な数値である。
　これに対して、９ｃｍディッシュを用いてWO2015/088039の実施例１と同様の実験を行うと、１／１０希釈の尿を用い、測定時間３０分、アジ化ナトリウム使用の条件下で、走性インデックスはわずか０．３と低い値に留まった（図７参照）。すなわち、９ｃｍディッシュの系では、尿濃度が２倍濃いにもかかわらず走性インデックスは低い値しか認められなかった。
　次に、本実施例の上記評価法において、尿の濃度を１／２００希釈とし、測定時間を１０分とする以外は、上記図６の結果を得た実験と同じ条件で、線虫の走性行動を観察した。尿は、異なる複数のがん患者から得た尿を用いた。結果は図８に示される通りであった。
　図８に示されるように、いずれのがん患者からの尿に対しても線虫は誘引行動を示し、いずれの健常者の尿に対しても線虫は忌避行動を示した。走性インデックスは、尿を高倍率で希釈したにも関わらず０．１～０．２であり、本評価方法の感度の高さを実証できた。一方で、健常者の尿に対しても、走性インデックス－０．１５～－０．２であり、本評価方法の感度の高さを再検証できた。
実施例３：３ｃｍ×１ｃｍの角型シャーレを用いた線虫の走性行動の評価
　本実施例では、実施例１よりもさらに小さな角型シャーレを用いて線虫の走性行動を評価した。
　３ｃｍ×１ｃｍの角型シャーレを用いる以外は、上記図６の結果を得た実験と同じ条件で、線虫の走性行動を観察した。評価は、線虫播種５分後および１０分後に行った。結果は、図９に示される通りであった。
　図９に示されるように、５分後では、がん患者の尿に対して誘引行動を示し、健常者の尿に対して忌避行動を示した。一方で、１０分後では、がん患者の尿に対しては誘引行動を示したものの、健常者の尿に対しては忌避行動を示さなかった。
　この結果は、小型の角型シャーレでも線虫の走性行動を評価することは可能であることを示すものであるが、しかし、一方で、その感度が低下する可能性を示唆するものと言える。
　感度が低下した原因を調べたところ、１０分後は、線虫がシャーレの側壁を上っていたり、または、線虫が側壁部から培地内に潜ることにより、計数可能な線虫個体数が低下していることが一因となっていることが明らかとなった。すなわち、線虫が配置される場所は、シャーレの側壁から０．５ｃｍ以上離れていた方がよいことが明らかとなった。
実施例Ｂ４：第三の実施形態による走性行動評価系
　本実施例では、シャーレ自体の形状ではなく、固形培地に走性行動を評価するためのフィールド（くぼみ６００）を設け、その内部で線虫の走性行動を評価するものである。
　線虫株であるＮ２　Ｂｒｉｓｔｏｌ株を用いて嗅覚に基づく走性行動を評価した。線虫の飼育は、以下表１に記載のＮＧＭプレートを用いて行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　また、線虫の走性行動評価は、以下表２に記載のアッセイプレート（径５ｃｍまたは９ｃｍシャーレ）を用いて行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　上記アッセイプレートの培地組成で試薬を混合し、オートクレーブ後に９ｃｍシャーレに適量を流し込み、５ｃｍ×２ｃｍ×１ｍｍのプラスチック板を表面に型押ししながら冷却して固形培地を固めた。固形培地が固まった後に、プラスチック板を除去して、長さ５ｃｍ、幅２ｃｍ、深さ１ｍｍのくぼみを固形培地表面に形成した。このようにして、図１１ＡおよびＢに示されるようなくぼみを表面に有する固形培地を有するシャーレを得た。
　次に、図１３右の「＋」で示される位置に、１０-5倍希釈したイソアミルアルコール（ＩＡＡ）または１０-3倍希釈したノナノン（Ｎｏｎａ）を配置し、２０℃で４日間培養した線虫を中央部（図１３の領域Ｂに相当する）に配置した。その後、２３℃で線虫の走性行動を観察した。
　また、実施例１および２で用いた行動評価系を用いた観察結果と比較した。
　経過時間が０分、５分、１０分、２０分後に、図１３のＡ、ＢおよびＣの領域に対応する領域にいる線虫の数を計測した。線虫の残存数としては０分の時の線虫数に対する、各時間における線虫数の割合として算出した。また、走性インデックスは［Ｎ（Ａ）－Ｎ（Ｂ）］／［Ｎ（Ａ）＋Ｎ（Ｂ）］の式をもとに算出した。ここで、Ｎ（Ａ）：領域Ａに移動した線虫個体数であり、Ｎ（Ｂ）は、領域Ｂに移動した線虫個体数である。
　結果は、図１４に示される通りであった。図１４右に示されるように、実施例１および２で用いた行動評価系（５ｃｍ　ｐｌａｔｅ（Ｎｏｎａ））では、時間経過（横軸、単位：分）とともに線虫が、固形培地とプレート側壁との間に潜り込んでしまい、観察面から減少してしまった。これに対して、第三の実施形態の評価系（Ｎｅｗ　ｐｌａｔｅ（Ｎｏｎａ）およびＮｅｗ　ｐｌａｔｅ（ＩＡＡ））では、時間経過に伴う観察面からの線虫の減少はほとんど見られなかった。また、図１４左に示されるように、第三の実施形態の評価系では、５分でノナノン（Ｎｏｎａ）に対する忌避行動が明確に観察できた。第三の実施形態の評価系ではまた、５分、特に２０分でイソアミルアルコール（ＩＡＡ）に対する遊走行動を明確に観察できた。図１４右と合わせると、結果が明瞭になる２０分後においても、第三の実施形態の評価系を用いると線虫の減少は少なく、観察結果が明瞭になるメリットが大きいと考えられた。

Claims (19)

  1. 　略角型形状の底面と底面の周囲を囲む側壁とを有する線虫の走性行動評価系であって、底面は、目印によって長手方向に片側の末端から別の末端に向かって第一の領域、第二の領域および第三の領域の少なくとも３つの領域に区分けされ、第二の領域が、第一の領域と第三の領域との境界に配置されている、走性行動評価系。
  2. 　目印が、底面の上面に対する凹凸形状若しくは印刷、または下面に対する凹凸形状若しくは印刷による目印である、請求項１に記載の走性行動評価系。
  3. 　第一の領域と第三の領域とを区別する表示を有する、請求項１または２に記載の走性行動評価系。
  4. 　請求項１～３のいずれか一項に記載の走性行動評価系が複数連結した、マルチプレート。
  5. 　深さが線虫の厚み以上であり２ｍｍ以下である略角型面形状のくぼみを表面に有する固形培地が導入されたシャーレと、前記くぼみを上部から覆う板を備えた線虫の走性行動評価系。
  6. 　シャーレの底面の前記くぼみに対応する部位が、目印によって長手方向に片側の末端から別の末端に向かって第一の領域、第二の領域および第三の領域の少なくとも３つの領域に区分けされ、第二の領域が、第一の領域と第三の領域との境界に配置されている、請求項５に記載の走性行動評価系。
  7. 　前記くぼみを上部から覆う板の前記くぼみに対応する部位が、目印によって長手方向に片側の末端から別の末端に向かって第一の領域、第二の領域および第三の領域の少なくとも３つの領域に区分けされ、第二の領域が、第一の領域と第三の領域との境界に配置されている、請求項５に記載の走性行動評価系。
  8. 　目印が、底面の上面に対する凹凸形状若しくは印刷、または下面に対する凹凸形状若しくは印刷による目印である、請求項６または７に記載の走性行動評価系。
  9. 　第一の領域と第三の領域とが接しており、第二の領域が閉じた形状である、請求項１～８のいずれか一項に記載の線虫の走性行動評価系。
  10. 　蓋を閉じたときに前記底面に対向する面上に被検試料配置部位を備える蓋を備えた、請求項１～４のいずれか一項に記載の線虫の走性行動評価系。
  11. 　第二の領域上に線虫が配置された、請求項１～１０のいずれか一項に記載の線虫の走性行動評価系。
  12. 　第一の領域または第三の領域に被検試料が配置された、請求項１～１１のいずれか一項に記載の線虫の走性行動評価系。
  13. 　被検試料の匂いに対する線虫の走性行動を評価する方法であって、
    　ａ）被検試料が配置されたシャーレであって、被検試料から１ｃｍ～３ｃｍ離れた底面の領域または部位に線虫が配置されたシャーレを提供することと、
    　ｂ）被検試料と線虫がシャーレに配置されてから３～１５分後に線虫の底面上での配置を観察することと、
    　ｃ）被検試料に対して誘引行動を示したか忌避行動を示したかを、観察された線虫の配置から評価することと
    を含む、方法。
  14. 　被検試料が、がん患者であると疑われる対象から得られた試料である、請求項１３に記載の方法。
  15. 　被検試料が、がん患者であると疑われる対象から得られた尿である、請求項１４に記載の方法。
  16. 　ｃ）において線虫が被検試料に対して誘引行動を示した場合には、被検試料にがんに由来する誘引物質が含まれると判定すること、または、線虫が被検試料に対して忌避行動を示した場合には、被検試料にがんに由来する誘引物質が含まれていないと判定することをさらに含む、請求項１４または１５に記載の方法。
  17. 　殺線虫剤を用いない、請求項１３～１６のいずれか一項に記載の方法。
  18. 　ａ）において、請求項１～３のいずれか一項に記載の走性行動評価系若しくは請求項４に記載のマルチプレート、または請求項５～１２のいずれか一項に記載の走性行動評価系のいずれか１つを用いる、請求項１３～１７のいずれか一項に記載の方法。
  19. 　ａ）において、以下のシャーレ：
    　（ｉ）略角型形状の底面を有するシャーレであって、底面は、長手方向に片側の末端から別の末端に向かって第一の領域、第二の領域および第三の領域の少なくとも３つの領域に区分けされ、第二の領域が、第一の領域と第三の領域との境界に配置されている、シャーレ；若しくは、
    　（ｉｉ）深さが線虫の厚み以上であり２ｍｍ以下である略角型面形状のくぼみを表面に有する固形培地が導入されたシャーレと、前記くぼみを上部から覆う板を備えた線虫の走性行動評価系；または
    　（ｉｉｉ）上記（ｉ）のシャーレまたは上記（ｉｉ）の走性行動評価系が複数連結したマルチプレートに含まれるいずれか１つを用いる、請求項１３～１８のいずれか一項に記載の方法。
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