JP7229582B2 - 線虫トラップ用プレート、およびその利用 - Google Patents

Description

本発明は、線虫トラップ用プレート、およびその利用に関する。より詳細には、本発明は、線虫トラップ用プレート、線虫トラップ用プレートを作製するための形成型、線虫トラップ用プレートの製造方法、線虫トラップ用プレートを作製するための容器、線虫トラップ用プレートを使用した線虫の応答評価方法、線虫トラップ用プレートを使用した線虫の行動評価方法、線虫トラップ用プレートを備える線虫トラップ試験キット、およびがん検査方法に関する。

線虫セノラブディティス・エレガンス（Caenorhabditis elegans、「Ｃ．エレガンス」と示すことがある。）は、神経生物学、発生生物学および老化学などの研究のために確立されたモデル生物である。２０１５年に、線虫Ｃ．エレガンスをバイオセンサとして用いた尿によるヒトのがん検査に関する論文が発表され（非特許文献１）、非侵襲的な検査であること、および９５％以上と言われる高いがん診断精度から、世界中の注目を集めている。

T. Hirotsu, et al., PLOS ONE, 3, e0118699, 2015

しかし、上述の検査では、がんの簡易検査としては煩雑であること、および一回試験では診断精度が十分に担保できないことなどの課題が残されており、未だ実用化には至っていない。

例えば、線虫が時間経過とともに一度誘引された化学物質エリアの外に移動することを回避するために、従来の線虫Ｃ．エレガンスを用いた化学走性試験法では、寒天平板の片方に試験対象の液体（「試験液」と示すことがある。）を、反対側に対照となる標準液を滴下して乾燥させた上で、さらに両方にアジ化ナトリウム（ＮａＮ_３）などのいわゆる麻酔薬を滴下し、一定時間乾燥させる。これにより、試験液または標準液を滴下したエリアに移動した線虫を、捕捉（以下、「トラップ」ということがある。）する。しかし、試験液と麻酔薬の乾燥に時間を要し、また時間経過に伴う麻酔薬の拡散が、試験対象物質等への応答の評価に影響する。特に後者は、麻酔薬が滴下されたエリアに侵入してしまうと、線虫の本来の応答とは無関係にそこから逃れられなくなるという応答評価に不都合な現象が起こり得る。そのため、線虫の応答評価の正確性を担保できないという問題がある。また、線虫には、時間経過に伴って化学物質への順応や連合学習などの影響が生じることがあり、麻酔薬の濃度にもよるものの、一度誘引された化学物質エリアに留まらず当該エリアの外に移動してしまうことがある。これら、麻酔および時間経過に伴う順応などの影響により、試行ごとに結果がばらつくという問題もある。この対策として、線虫行動のタイムラプス撮影を行う場合があるが、低速度動画像撮影装置が必要となり試験が煩雑となる。

また、従来の線虫Ｃ．エレガンスの化学走性試験法では、試験開始から一定時間経過後に、試験対象物質等のエリアおよび対照エリアにいる線虫の数を、目視または寒天平板全体を撮像した画像をもとに計数する。しかし、線虫のサイズに比して観察または撮像の範囲が広く、数の計数に労力を要する。

そこで、本発明は上記の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、簡便かつ時間経過に伴う問題が生じにくく、麻酔薬の影響による応答の誤評価を生じることもない線虫トラップ用プレートを提供することにある。

本発明に係る線虫トラップ用プレートは、上記課題を解決するために、容器および該容器内に形成された固相を備え、上記固相は、その表面上で線虫が移動可能なものであり、上記固相の上記表面に、上記線虫を捕捉するための少なくとも１つの凹部が形成されている構成を有する。

また、本発明に係る線虫トラップ用プレートにおいては、上記容器の底面における、波長３６０ｎｍ～１５００ｎｍの光の透過率が、７０％以上であることが好ましい。

本発明に係る形成型は、上述の線虫トラップ用プレートを作製するための形成型であって、本体部と、上記本体部に設けられた、上記少なくとも１つの凹部に対応する少なくとも１つの突起とを備え、上記容器に対して固定可能である構成を有する。

また、本発明に係る形成型においては、上記少なくとも１つの突起が、上記本体部から脱着可能であることが好ましい。

本発明に係る容器は、上述の線虫トラップ用プレートを作製するための容器であって、上記容器の底面における、上記凹部が形成される位置に対応する部分に、上記凹部を形成する筒状部材を差し込む孔が形成されており、少なくとも上記孔が形成されている部分における上記底面の下側に空隙を有している構成を有する。

本発明に係る線虫トラップ用プレートの製造方法の一態様は、上述の線虫トラップ用プレートの製造方法であって、上記固相に上記少なくとも１つの凹部を形成する工程を含み、上記工程では、上述の形成型を上記容器に固定した状態で上記固相を形成するか、または、上記容器に上記固相を形成した後に、くり抜くことによって上記少なくとも１つの凹部を形成する構成を有する。

本発明に係る線虫トラップ用プレートの製造方法の別の態様は、上述の線虫トラップ用プレートの製造方法であって、上記固相に上記少なくとも１つの凹部を形成する工程を含み、上記工程では、下端に底部を有し、上端が開口している筒状部材を、請求項５に記載の容器の上記孔に差し込み固定すること、上記固相の表面が、上記筒状部材の上端よりも低い位置となるように、上記固相を形成すること、および上記固相を形成した後、上記筒状部材の上端が上記固相の表面の位置にくるまで、上記筒状部材を押し下げることによって上記少なくとも１つの凹部を形成する構成を有する。

本発明に係る線虫の応答評価方法は、上記課題を解決するために、被験物に対する線虫の応答評価方法であって、上述の線虫トラップ用プレートの上記凹部内または上記凹部周辺に被験物が供給された、試験用プレートを準備する工程と、上記固相の表面上所定の位置に線虫を供給する工程と、一定時間経過後、上記凹部内に捕捉された線虫の数または該線虫の数と相関する要素を計測する工程とを含み、上記凹部内には液体が満たされている構成を有する。

また、本発明に係る線虫の応答評価方法の一態様では、上記被験物が、哺乳類の体液を含むものである。

また、本発明に係る線虫の応答評価方法の一態様では、上記被験物が、ヒト、イヌ、ネコ、サル、マウス、ラットまたはモルモットの尿を含むものである。

本発明に係る線虫の応答評価方法は、上記課題を解決するために、温度に対する線虫の応答評価方法であって、上述の線虫トラップ用プレートの上記凹部内または上記凹部周辺を、目的の温度に調節する工程と、上記固相の表面上所定の位置に線虫を供給する工程と、一定時間経過後、上記凹部内に捕捉された線虫の数または該線虫の数と相関する要素を計測する工程とを含み、上記凹部内には液体が満たされている構成を有する。

また、本発明に係る線虫の応答評価方法の一態様は、上記一定時間経過後、上記凹部を撮像し、得られた画像の画像処理を行うことにより、上記凹部内に捕捉された線虫の数または該線虫の数と相関する要素を計測する構成を有する。

また、本発明に係る線虫の応答評価方法の一態様は、線虫として蛍光プローブを組み込んだ線虫を使用し、凹部内に捕捉された線虫の蛍光強度の総量から捕捉された線虫の数を算出する構成を有する。

本発明に係る線虫の行動評価方法は、上記課題を解決するために、上述の線虫トラップ用プレートの上記固相の表面上所定の位置に線虫を供給する工程と、一定時間経過後、上記凹部内に捕捉された線虫の数または該線虫の数と相関する要素を計測する工程とを含み、上記凹部内には液体が満たされている構成を有する。

本発明に係る線虫トラップ試験キットは、上記課題を解決するために、上述の線虫トラップ用プレートと、上記固相上の環境を一定に保つためのカバーであって、波長３６０ｎｍ～１５００ｎｍの光の透過率が７０％以上であるカバーとを備える構成を有する。

また、本発明に係る線虫トラップ試験キットの一態様は、試験に用いられる線虫をさらに含む構成を有する。

本発明に係るがん検査方法は、上記課題を解決するために、上述の線虫トラップ用プレートの上記凹部内または上記凹部周辺に被験者から採取された尿が供給された、試験用プレートを準備する工程と、上記固相の表面上所定の位置に線虫を供給する工程と、一定時間経過後、上記凹部内に捕捉された線虫の数または該線虫の数と相関する要素を計測する工程とを含み、上記凹部内には液体が満たされており、上記凹部内に捕捉された線虫の数に基づき上記被験者のがん罹患可能性を検査する構成である。

また、本発明に係るがん検査方法の一態様では、上記被験者がヒトである。

また、本発明に係るがん検査方法の一態様では、上記被験者がイヌまたはネコである。

また、本発明に係るがん検査方法の一態様では、上記被験者がサル、マウス、ラットまたはモルモットである。

本発明によれば、線虫トラップ用プレートを応答評価試験に用いた場合に、時間経過に伴う問題が生じにくいため、応答を簡便かつ精度よく評価できるようになる。

線虫トラップ用プレートおよびカバーの一態様の概要を示す図であり、（ａ）は線虫トラップ用プレートの上面図であり、（ｂ）は線虫トラップ用プレートの断面図であり、（ｃ）は線虫トラップ用プレートにカバーを被せた状態の断面図である。 線虫トラップ用プレートの別の態様の概要を示す図であり、（ａ）は線虫トラップ用プレートの上面図であり、（ｂ）は（ａ）に示す線虫トラップ用プレートの断面図であり、（ｃ）は別の線虫トラップ用プレートの上面図であり、（ｄ）は（ｃ）に示す線虫トラップ用プレートの断面図であり、（ｅ）はさらに別の線虫トラップ用プレートの上面図であり、（ｆ）は（ｅ）に示す線虫トラップ用プレートの断面図である。 くり抜き具の一態様を示す外観斜視図である。 形成型の各構成の一態様を示す外観図である。 （ａ）は一実施形態に係る線虫トラップ用プレートを作製するための嵌め込み式の形成型の上面図であり、（ｂ）は当該形成型の断面斜視図である。 （ａ）は一実施形態に係る線虫トラップ用プレートを作製するための容器の上面図であり、（ｂ）は当該容器の断面図である。（ｃ）～（ｅ）は当該容器を用いて線虫トラップ用プレートを製造する過程を示した図である。 実施例１におけるジアセチルの希釈液を満たした落とし込み槽２ａの中に捕捉されたＣ．エレガンスを撮像した静止画の一例を示す図である。 実施例１における緩衝液を満たした対照の落とし込み槽２ｂの中に捕捉されたＣ．エレガンスを撮像した静止画の一例を示す図である。 （ａ）～（ｃ）は実施例１におけるジアセチルに対するＣ．エレガンスの応答評価試験の３回の結果を示す図である。 実施例１におけるジアセチルに対するＣ．エレガンスの応答評価試験の結果の平均を示す図である。 比較例１におけるアッセイプレート全体を撮像した静止画の一例を示す図である。 （ａ）～（ｃ）は比較例１におけるジアセチルに対するＣ．エレガンスの応答評価試験の３回の結果を示す図である。 比較例１におけるジアセチルに対するＣ．エレガンスの応答評価試験の結果の平均を示す図である。 （ａ）～（ｃ）は実施例２におけるジアセチルに対するＣ．エレガンスの応答評価試験の３回の結果を示す図である。 実施例２におけるジアセチルに対するＣ．エレガンスの応答評価試験の結果の平均を示す図である。 実施例３におけるベンズアルデヒドに対するＣ．エレガンスの応答評価試験の結果を示す図である。 実施例４における前立腺がん患者の尿に対するＣ．エレガンスの応答評価試験の結果を示す図である。 実施例５におけるがん罹患歴のない健常者の尿に対するＣ．エレガンスの応答評価試験の結果を示す図である。 実施例６におけるがん罹患歴のない雄イヌの尿に対するＣ．エレガンスの応答評価試験の結果を示す図である。 実施例７におけるがん罹患歴のない雌イヌの尿に対するＣ．エレガンスの応答評価試験の結果を示す図である。 実施例８におけるがんに罹患したイヌ（複数）の尿に対するＣ．エレガンスの応答評価試験の結果を示す図である。 実施例９におけるがん罹患歴のないイヌ（複数）の尿に対するＣ．エレガンスの応答評価試験の結果を示す図である。 実施例１０におけるがんに罹患したネコ（複数）の尿に対するＣ．エレガンスの応答評価試験の結果を示す図である。 実施例１１におけるがん罹患歴のないネコ（複数）の尿に対するＣ．エレガンスの応答評価試験の結果を示す図である。 実施例１２における乳腺がんに罹患したラット（複数）の尿に対するＣ．エレガンスの応答評価試験の結果を示す図である。 実施例１３におけるがん罹患歴のないラット（複数）の尿に対するＣ．エレガンスの応答評価試験の結果を示す図である。 実施例１４における塩化ナトリウムに対するＣ．エレガンスの応答評価試験の結果を示す図である。 実施例１５におけるバニリンに対するＣ．エレガンス以外の土壌線虫の応答評価試験の結果を示す図である。 実施例１６における線虫個体自動計数のための画像解析プログラムの処理画面の一例を示す図である。 実施例１６における線虫個体自動計数による計数結果を示す図である。

本発明の一実施形態について、適宜図面を参照して、以下説明する。

〔線虫トラップ用プレート〕
（線虫）
本発明における線虫とは、生物分類学上の線形動物門に属する動物（以下、単に「線形動物」と示す。）および類線形動物門に属する動物（以下、単に「類線形動物」と示す。）の両方を意図している。これらに含まれる動物のうち、陸生または半陸生であって、固相上で移動することができるものであれば特に制限はない。

線形動物としては、非寄生性線虫（または自由生活性線虫）、植物寄生性線虫、昆虫寄生性線虫、昆虫等便乗性線虫、および哺乳類等寄生性線虫の各種線虫などが挙げられる。

非寄生性線虫としては、例えば、セノラブディティス・エレガンス（Caenorhabditis elegans、以下では「Ｃ．エレガンス」と示すことがある。）、ニセネグサレセンチュウ（Aphelenchus avenae）、セノラブディティス・アンガリア（Caenorhabditis angaria）、セノラブディティス・ブレンネリ（Caenorhabditis brenneri）、セノラブディティス・ブリッグサエ（Caenorhabditis briggsae）、セノラブディティス・ジャポニカ（Caenorhabditis japonica）、セノラブディティス・レマネイ（Caenorhabditis remanei）、およびプリスティオンクス・パシフィクス（Pristionchus pacificus）などが対象として挙げられる。

植物寄生性線虫としては、例えば、サツマイモネコブセンチュウ（Meloidogyne incognita）、アレナリアネコブセンチュウ（Meloidogyne arenaria）、ジャワネコブセンチュウ（Meloidogyne javanica）、キタネコブセンチュウ（Meloidogyne hapla）、ダイズシストセンチュウ（Heterodera glycines）、ジャガイモシストセンチュウ（Globodera rostochiensis）、ジャガイモシロシストセンチュウ（Globodera pallida）、キタネグサレセンチュウ（Pratylenchus penetrans）、ミナミネグサレセンチュウ（Pratylenchus coffeae）、クルミネグサレセンチュウ（Pratylenchus vulnus）、ナミクキセンチュウ（Ditylenchus dipsaci）、イネシンガレセンチュウ（Aphelenchoides besseyi）、コムギツブセンチュウ（Anguina tritici）、イモグサレセンチュウ（Ditylenchus destractor）、ハガレセンチュウ（Aphelenchoides ritzemabosi）、ナガハリセンチュウ（Longidorus spp.）、ブドウオオハリセンチュウ（Xiphinema index）、イチゴセンチュウ（Aphelenchoides fragariae）、パイナップルネグサレセンチュウ（Pratylenchus brachyurus）、セノラブディティス・イノピナータ（Caenorhabditis inopinata）、およびコーヒーオオハリセンチュウ（Xiphinema brevicolle）などが対象として挙げられる。

昆虫寄生性線虫としては、例えば、マルハナバチタマセンチュウ（Sphaerularia bombi）、スズメバチタマセンチュウ（Sphaerularia vespae）、スキムシノシヘンチュウ（Hexamermis zuimyshi）、スタイナーネマ・カルポカプサエ（Steinernema carpocapsae）、スタイナーネマ・クシダイ（Steinernema kushidai）、ヒラタケヒダコブセンチュウ（Iotonchium ungulatum）、イオトンキウム・カリフォルニクム（Iotonchium californicum）、イオトンキウム・カテニフォルメ（Iotonchium cateniforme）、イオトンキウム・ラカリエ（Iotonchium laccariae）、イオトンキウム・ルスレ（Iotonchium russulae）、セノラブディティス・アウリキュラリエ（Caenorhabditis auriculariae）、およびブルサフェレンクス・タダミエンシス（Bursaphelenchus tadamiensis）などが対象として挙げられる。

昆虫等便乗性線虫としては、例えば、セノラブディティス・ジャポニカ（Caenorhabditis japonica）、プリスティオンクス・パシフィクス（Pristionchus pacificus）、マツノザイセンチュウ（Bursaphelenchus xylophilus）、クワノザイセンチュウ（Bursaphelenchus conicaudatus）、タラノザイセンチュウ（Bursaphelenchus luxuriosae）、テラトラブディティス・シンパピラータ（Teratorhabditis synpapillata）、セノラブディティス・ブリッグサエ（Caenorhabditis briggsae）、およびセノラブディティス・レマネイ（Caenorhabditis remanei）などが対象として挙げられる。これらのうち、セノラブディティス・ジャポニカ、プリスティオンクス・パシフィクス、セノラブディティス・ブリッグサエ、およびセノラブディティス・レマネイは、実験室にて自由生活性線虫（非寄生性線虫）同様に扱われる。

哺乳類等寄生性線虫としては、糞線虫、フィラリア、回虫（蛔虫）、アニサキス、鞭虫、鉤虫、顎口虫、および旋毛虫（トリヒナ）などが対象として挙げられる。

糞線虫としては、主たる宿主の分類群別に、両生網無尾目寄生性糞線虫（Strongyloides pereira（以下では、糞線虫の属名である「Strongyloides」を単に「S.」と略記することがある。）、S. carinii、S. amphibiophilus、S. bufonis、S. physali、S. spiralis、S. prokopici、およびS. mascomaiなど）、爬虫網トカゲ目寄生性糞線虫（S. cruzi、S. darevskyi、およびS. ophiusensisなど）、爬虫網ヘビ目寄生性糞線虫（S. ophidiae、S. mirzai、S. gulae、およびS. serpentisなど）、鳥網コウノトリ目寄生性糞線虫（S. cubaensis、S. ardeae、およびS. herodiaeなど）、鳥網キジ目寄生性糞線虫（S. avium、S. oswaldoi、およびS. pavonisなど）、鳥網ガンカモ目寄生性糞線虫（S. minimumなど）、鳥網チドリ目寄生性糞線虫（S. turkmenicaなど）、鳥網スズメ目寄生性糞線虫（S. quiscali Barusなど）、哺乳網有袋目寄生性糞線虫（S. thylacisなど）、哺乳網食虫目寄生性糞線虫（S. akbari、およびS. rostombekowiなど）、哺乳網霊長目寄生性糞線虫（S. stercoralis、S. fuelleborni、S. fuelleborni kellyi、およびS. cebusなど）、哺乳網異節目寄生性糞線虫（S. dasypodis、およびS. shastensisなど）、哺乳網有鱗目寄生性糞線虫（S. leiperiなど）、哺乳網齧歯目寄生性糞線虫（S. chapini、S. ratti、S. myopotami、S. venezuelensis、S. agoutii、S. robustus、およびS. sigmodontisなど）、哺乳網食肉目寄生性糞線虫（S. nasua、S. felis、S. mustelorum、S. erschowi、S. planiceps、S. puttori、S. martis、S. vulpis、S. tumefasciens、S. lutrae、およびS. procyonisなど）、哺乳網長鼻目寄生性糞線虫（S. elephantisなど）、哺乳網奇蹄目寄生性糞線虫（S. westeriなど）、および哺乳網偶蹄目寄生性糞線虫（S. papillosus、およびS. ransomiなど）などが対象として挙げられる。これらのうち、S. stercoralis、S. fuelleborni、およびS. fuelleborni kellyiは、ヒトに寄生するいわゆるヒト糞線虫である。また、アライグマ糞線虫であるS. procyonis、およびブタ糞線虫であるS. ransomiなどもヒトに寄生することがある。

フィラリアとしては、犬糸状虫（Dirofilaria immitis）、バンクロフト糸状虫（Wuchereria bancrofti）、ロア糸状虫（Loa loa）、回旋糸状虫（Onchocerca volvulus）、およびマレー糸状虫（Brugia malayi）などが対象として挙げられる。

回虫（蛔虫）としては、ヒト回虫（Ascaris lumbricoides）、ブタ回虫（Ascaris suum）、頚部膿瘍カイチュウ（Lagochilascaris minor）、ウシ回虫（Neoascaris vitulorum）、ウマ回虫（Parascaris equorum）、アライグマ回虫（Baylisascaris procyonis）、イヌ回虫（Toxocara canis）、およびネコ回虫（Toxocara cati）などが対象として挙げられる。

アニサキスとしては、アニサキス・ピグレフィー（Anisakis pegreffii）、アニサキス・シンプレックス・センス・ストリクト（Anisakis simplex sensu stricto）、およびアニサキス・シンプレックスＣ（Anisakis simplex C）のいわゆるアニサキスＩ型、アニサキスＩＩ型（Anisakis physeteris）、およびシュードテラノバ（Psudoterranova decipiens）などが対象として挙げられる。

鞭虫としては、ヒト鞭虫（Trichuris trichiura）などが対象として挙げられる。

鉤虫としては、ズビニ鉤虫（Ancylostoma duodenale）、アメリカ鉤虫（Necator americanus）、およびイヌ鉤虫（Ancylostoma caninum）などが対象として挙げられる。

顎口虫としては、日本顎口虫（Gnathostoma nipponicum）、有棘顎口虫（Gnathostoma spinigerum）、剛棘顎口虫（Gnathostoma hispidum）、およびドロレス顎口虫（Gnathostoma doloresi）などが対象として挙げられる。

旋毛虫（トリヒナ）としては、Trichinella britovi、Trichinella spiralis、Trichinella nativa、Trichinella nelsoni、およびTrichinella pseudospiralisなどが対象として挙げられる。

上記以外の哺乳類等寄生性線虫として、フィリピン毛細線虫（Capillaria philippinensis）や肝毛細線虫（Capillaria aerophila）などの毛細線虫（毛頭虫ともいう。）、および東洋眼虫（Thelazia callipaeda）などが対象として挙げられる。

また、類線形動物としては、ハリガネムシなどが対象として挙げられる。ハリガネムシとしては、フトハリガネムシ（Gordius robustus）、オガタハリガネムシ（Gordius ogatai）、タンガニーカハリガネムシ（Pseudogordius tanganykae）、およびニホンザラハリガネムシ（Chordodes japonensis）などが対象として挙げられる。

（線虫トラップ用プレート）
本実施形態における線虫トラップ用プレート（以下、単に「プレート」という場合もある。）は、容器内に固相を形成したプレートであって、当該固相の表面に少なくとも１つの凹部（後述する落とし込み槽）が形成されたものである。なお、本実施形態における線虫トラップ用プレートは、ＰＡＳＳ（Pond Assay for Sensory System）プレートと称することもできる。

本明細書において固相とは、容器内に形成された固体状の層を意図しており、その表面で線虫が移動可能であれば特に制限はない。具体的には、水分を含み、それにより表面が湿った状態にある層が想定される。固体状の層としては、非限定的な例として、寒天、アガロース、ゼラチンおよびコンニャク等から形成されたゲル、ペクチン、グアーガム、カラギーナンおよびキサンタンガム等のゲル化剤または増粘安定剤を液体に添加することで形成されたゲル等が挙げられる。線虫の生物用培地上での円滑な運動を担保する観点からは、寒天等により固化、またはゲル化した固体培地が好ましい。また、線虫の生物学的特性を阻害しない、すなわち生体適合性の観点からは、寒天等の天然由来の原料により固化、またはゲル化した固体培地が好ましい。さらに、線虫トラップ用プレートを用いた試験に影響を及ぼさないように、固体培地は無味無臭であることが好ましい。また、固体培地には、硫黄源、リン酸塩、および微量のミネラルを添加することもできる。例えば、硫酸マグネシウム（МｇＳＯ_４）、リン酸二水素カリウム（ＫＨ_２ＰＯ_４）、リン酸水素二カリウム（Ｋ_２ＨＰＯ_４）、および塩化カルシウム（ＣａＣｌ_２）等を添加することがある。固相は、例えば、生物用培地をゲル化または固化した培地であり得る。なお、以下では、説明の便宜上、固相について、生物用培地を寒天等により固化、またはゲル化した固体培地を例にして説明するが、これに限定されるものではない。

線虫が固体培地の内部に侵入することを防ぐ観点から、ゴム硬度計を使用し、ＪＩＳ Ｋ ７３１２（タイプＣ）熱硬化性ポリウレタンエラストマー成形物の物理試験方法の規定に準拠した方法で測定された固体培地のデュロメータ硬さが５以上であることが好ましく、８以上であることがより好ましく、１５以上であることがさらに好ましい。当該デュロメータ硬さが５以上であることにより、固体培地表面の液滴および凹部内の液体等、固体培地に接する液相中を遊泳中の線虫が固体培地の内部に侵入することを防ぐことができる。また、当該デュロメータ硬さが８以上であることにより、空腹等のストレスがない状態で用いられた線虫が固体培地の内部に侵入することを防ぐことができる。

固体培地の状態が試験中、または保存期間中に一定に保たれるように、固体培地中の水分が蒸発しにくいもの、または乾燥しにくい固体培地であることが好ましく、このような固体培地の例としては、コンニャクが挙げられる。一方で、寒天およびゼラチンなど、比較的乾燥しやすい固体培地を使用する場合には、プレートにカバーをしてテープで密封する、または、密封ケースに保存するなどの方法で乾燥を防げばよい。

なお、固相は、その表面で線虫が移動可能な層として形成されていればよく、その層の下側に別の層（下層）が形成されていてもよい。例えば、表面の層として、線虫の移動および後述する被験物の拡散等に適した層を採用し、下層として、線虫の内部への侵入の抑制および被験物の拡散の抑制に適した層を採用することが可能である。なお、２層とする場合に、このような性質の層の組み合わせには限らない。また、３層以上としてもよい。

詳細については後述するが、当該プレートには、凹部（落とし込み槽）が形成されており、当該凹部に液体を注入して使用する。固体培地に凹部を形成した後に、プラスチック、ガラス、およびポリジメチルシロキサン（以下、「ＰＤＭＳ」と示すことがある。）などのシリコーン樹脂等、液体を吸収または透過しない素材を母材とする凹部保護壁を凹部の内壁に密着するように配置してもよい。これにより、凹部に注入した液体またはそれに含まれる成分の固体培地内への浸出、および固体培地に含まれる液体の凹部への浸出を防ぐこともできる。なお、本明細書において「固体培地に含まれる液体」とは、固体培地を形成する際に使用された、固体培地の構成成分である液体のことを指す。

固体培地を形成させる容器は、サイズ、形状および材質に特に制限はなく、プラスチックディッシュ等の市販の容器を用いることができる。

固体培地を形成させる容器の材質に特に制限はなく、例えば、プラスチック、ガラス、およびＰＤＭＳ等であり得るが、容器の底面から顕微鏡下で観察可能に設計されていることが好ましい。すなわち、容器の底面は、顕微鏡下で観察するのに十分な可視光・紫外光透過率を有することが好ましい。具体的には、容器の底面は、波長３６０～８６０ｎｍの光の透過率が７０％以上であることが好ましく、８０％以上であることがより好ましく、９０％以上であることがさらに好ましい。また、波長８６０～１５００ｎｍの光の透過率が７０％以上であることが好ましく、８０％以上であることがより好ましく、９０％以上であることがさらに好ましい。また、自家蛍光のない、または自家蛍光の少ない素材を母材としたものであってもよい。このような母材を用いた容器は、蛍光観察に好適に用いることができる。例えば、母材としてプラスチックを用いる場合、光透過性に優れ、自家蛍光の少ないプラスチックとしては、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）等のポリエステル、ポリメタクリル酸メチル（ＰＭＭＡ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、シクロオレフィンポリマー（ＣＯＰ）およびエポキシ樹脂等が挙げられる。

容器の形状、典型的には容器の内側形状は、例えば、円形、矩形および正方形などであり得る。なお、本明細書において容器の形状とは、容器を上から見たときの形状を意図している。

また、容器の底面には、後述する落とし込み槽の形成位置を示すガイド、または、線虫供給位置を示すガイドが設けられていてもよい。

容器のサイズは、使用する線虫のサイズに応じて適宜選択することができ、例えば線虫としてＣ．エレガンスを使用する場合には、底面の最大径（内径）が３～２５ｃｍの容器が好適に利用できる。ここで最大径とは、容器の形状が円形の場合にはその直径であり、矩形の場合には長辺の長さであり、正方形の場合には一辺の長さを意図している。好適な容器の具体的な一例としては、底面の内径が５．２ｃｍの円形のディッシュ（例えばプラスチックディッシュ）、および底面の一辺が６ｃｍの正方形の角型ディッシュ（例えばプラスチックディッシュ）が挙げられる。また、このような容器を用いたときの固体培地の厚さは、概ね２ｃｍ以下であり得る。

また、後述する画像解析による線虫の計数を行うために、自動撮像機能を備えた一体型顕微鏡（一体型蛍光顕微鏡を含む）を使用する場合、あるいは、画像解析による計数に特化した、実体顕微鏡（蛍光実体顕微鏡を含む）、撮像装置および画像処理装置からなる解析システムが構築されている場合には、容器の形状およびサイズは、それらの試料ステージに合わせた形状およびサイズとすることが好ましい。

（落とし込み槽）
本実施形態に係る線虫トラップ用プレートには、固体培地の表面に、線虫を捕捉するための少なくとも１つの凹部が形成されている。なお、この凹部を「落とし込み槽」ともいう。

なお、本明細書において、「捕捉（する）」および「トラップ（する）」は同義に用いられ、所定のエリア内に入り込んだ線虫を当該エリア内に留め、エリア外に移動することができない状態にすることを意味している。また、一定時間当該エリア内に留めておくことができればよく、試験およびその後の線虫の計数の具体的態様において求められる時間、当該エリア内に留め、エリア外に移動することができない状態となっていればよい。例えば、試験開始から、捕捉された線虫の計数または回収までの時間が１時間未満である場合には、１時間はエリア外へ移動することができない状態を形成できていればよい。試験および計数の自由度を持たせる観点からは、より長い時間エリア外に移動することができない状態であることが好ましく、例えば、２時間以上が好ましく、１２時間以上がより好ましい。

落とし込み槽は、固体培地の表面から固体培地の底部に向かって延びるように形成されている。落とし込み槽は、固体培地の底面まで到達していてもよく、到達していなくてもよい。例えば、落とし込み槽の深さは、固体培地の厚さと同程度とすることができる。

さらに、落とし込み槽は、取り外し可能に予め固体培地に埋め込まれた、上部が開口したチューブであってもよい。この場合には、高底式の容器を用い、当該容器の底面に予め設けられた孔にチューブを嵌め込んで使用することもできる。高底式の容器にチューブを嵌め込んで落とし込み槽とする場合、落とし込み槽の深さは、埋め込まれるチューブの底の厚さおよびプレートの容器の深さにもよるが、典型的には固体培地の厚さと同程度かそれ以上となる。

さらに、落とし込み槽の底部を開閉可能な構成としてもよい。落とし込み槽の底部を開閉可能とすることにより、試験時には底部を閉じることで落とし込み槽として使用し、試験終了後には底部を開放することで捕捉した線虫を底部から回収することが可能となる。

落とし込み槽の数、形状および位置に特に制限はなく、使用する線虫の種類および数、被験物の種類および数、ならびに試験の目的等に応じて適宜設定すればよい。例えば、落とし込み槽の数は、１、２、３、４、５もしくは６またはそれ以上とすることができる。また、落とし込み槽の形状は、円形状、矩形状、正方形状、楕円形状および多角形状などであり得る。本明細書において落とし込み槽の形状とは、落とし込み槽を上から見たときの形状を意図している。また、落とし込み槽の位置は、典型的には、プレートの外周付近であるが、特に制限はない。外周の一部が落とし込み槽の一部となるように落とし込み槽を形成してもよい。例えば、円形プレートを用い、固体培地の外周の一部を削るように形成した円弧状の落とし込み槽、角型プレートを用い、固体培地の辺を削るように形成した直線状の落とし込み槽、および角型プレートを用い、固体培地の角を削るように形成した三角形状の落とし込み槽などであってもよい。さらには、落とし込み槽の内側に固体培地が配置されており、堀のような構造となっている落とし込み槽であってもよい。落とし込み槽の内側に固体培地を配置した堀のような構造である場合、例えば液体に溶解しない被験物であっても、落とし込み槽の内側の固体培地の上に載置することにより、落とし込み槽の内側に配置することができる。また、落とし込み槽の内側に固体培地を配置した堀のような構造である場合、被験物を含有する固体培地を落とし込み槽の内側に配置することにより、落とし込み槽の内側に被験物を配置することができる。さらには、落とし込み槽の内側に固体培地を配置した堀のような構造とした場合において、落とし込み槽の内側に配置した固体培地に孔を設け、その中に被験物を供給してもよい。さらには、当該孔の内側にさらに別の固体培地を配置することで、落とし込み槽が二重の堀のような構造をとるものであってもよい。あるいは、落とし込み槽の近傍に、落とし込み槽とは別の被験物供給孔が形成されていてよい。

落とし込み槽の容積を大きくする場合、落とし込み槽の底面積を大きくした場合には、捕捉された線虫の観察が容易となる。一方で、固体培地に被験物の濃度勾配を設ける試験においては、落とし込み槽の深さを深くし、底面積を小さくしてもよい。

（カバー）
線虫トラップ用プレートは、試験中にプレートと組み合わせて用いられる、線虫トラップ用プレートとは別体のカバーをさらに備えていてもよい。カバーは、試験中に、プレート内の状態を均一に保つために使用される。カバーをプレートに被せることにより、固体培地の乾燥の抑制、落とし込み槽内に満たした液体の蒸発の抑制、およびプレート内の湿度の保持など、試験環境を一定に保つことが可能となる。また、嗅覚試験を行う場合に、匂い物質の拡散の抑制、およびプレート外部からの匂い物質の混入の防止なども達成でき、試験環境が一定に保たれる。さらには、カバーをプレートに被せることにより、プレートから線虫が脱出することを阻止することができる。さらに密封性を高める目的で、カバーをプレートに被せた後、疎水性のテープなどで、カバーの端部を覆うとともにプレートの外周に固定することで密封してもよい。

カバーは、カバーを被せた状態でも顕微鏡下でプレートの観察が可能となるように設計されていることが好ましい。すなわち、カバーは、顕微鏡下で観察するのに十分な可視光・紫外光透過率を有することが好ましい。具体的には、カバーは、波長３６０～８６０ｎｍの光の透過率が７０％以上であることが好ましく、８０％以上であることがより好ましく、９０％以上であることがさらに好ましい。また、波長８６０～１５００ｎｍの光の透過率が７０％以上であることが好ましく、８０％以上であることがより好ましく、９０％以上であることがさらに好ましい。また、自家蛍光のない、または自家蛍光の少ない素材を母材としたものであってもよい。このような母材を用いたカバーは、蛍光観察に好適に用いることができる。

（線虫トラップ用プレートの具体例）
容器として市販の円形プラスチックディッシュを使用した場合のプレートの一例を図１に示す。図１の（ａ）はプレート１の上面図であり、図１の（ｂ）は図１の（ａ）の破線Ａ－Ａにおけるプレート１の断面図である。また、図１の（ｃ）は、プレート１にカバー３を被せた状態の断面図である。プレート１は、市販の円形プラスチックディッシュ１０に液状の培地を注入して固化、またはゲル化させて固体培地１１を形成し、２つの落とし込み槽２ａ、２ｂを形成したものである。２つの落とし込み槽２ａ、２ｂは、固体培地１１の外周近傍、円の中心に対して対称な位置に設けられている。図１の（ｂ）に示されるように、プレート１では落とし込み槽２ａ、２ｂは固体培地の底部まで到達している。

プレートのさらに別の態様を図２に示す。図２の（ａ）はプレート１の別の態様の上面図であり、図２の（ｂ）は図２の（ａ）の破線Ａ－Ａにおける断面図である。また、図２の（ｃ）はプレート１のさらに別の態様の上面図であり、図２の（ｄ）は図２の（ｃ）の破線Ａ－Ａにおける断面図である。また、図２の（ｅ）はプレート１のさらに別の態様の上面図であり、図２の（ｆ）は図２の（ｅ）の破線Ａ－Ａにおける断面図である。図２の（ａ）に示す例では、４つの落とし込み槽２ａ～２ｄが設けられており、各落とし込み槽２ａ～２ｄの内側にも固体培地１１が配置されており、各落とし込み槽２ａ～２ｄが堀のような構造となっている。図２の（ｃ）に示す例では、容器として市販の角型プラスチックディッシュを使用しており、落とし込み槽２ａ、２ｂが固体培地１１の端部を削るように設けられており、固体培地１１の外周の一部が落とし込み槽２ａ、２ｂの一部を構成している。図２の（ｅ）に示す例では、落とし込み槽２ａが固体培地１１の周囲を前周に亘って削るように設けられており、固体培地１１の上側部分（すなわち、表面側）の外周が落とし込み槽２ａの内壁を構成している。

（落とし込み槽形成方法）
落とし込み槽は、所望の形状が形成できれば、その形成方法に特に制限はなく、どのような方法で形成してもよい。簡便に落とし込み槽を形成する方法としては、（ｉ）容器内に固体培地を形成した後、一部をくり抜いて落とし込み槽を形成する方法（第１の形成方法）、または、（ｉｉ）突起が設けられた形成型を、固体培地形成前の容器に取り付けて固定した状態で固体培地を形成し、形成型を取り外すことで、落とし込み槽を形成する方法（第２の形成方法）、（ｉｉｉ）落とし込み槽となるチューブ状の容器を予め容器内に配置した状態で固体培地を形成することで、落とし込み槽を形成する方法（第３の形成方法）が挙げられる。

（第１の形成方法）
まず、固体培地を形成した後に該固体培地の一部をくり抜いて落とし込み槽を形成する方法について説明する。この方法の場合、まず初めに、液状の培地を容器内に流し込み、固化、またはゲル化させる。次いで、円形の落とし込み槽とする場合には、例えば、ストローのような円筒状の器具を刺して内部をくり抜く。これにより落とし込み槽が形成される。くり抜くための筒状の器具は、目的とする落とし込み槽の形状に応じて選定すればよく、あるいは自ら作製してもよい。落とし込み槽を形成するためのくり抜き具の例を図３に示す。図３の（ａ）は、円形状の落とし込み槽を形成するためのくり抜き具２０ａの外観斜視図であり、図３の（ｂ）は、矩形状の落とし込み槽を形成するためのくり抜き具２０ｂの外観斜視図である。図３の（ａ）に示すくり抜き具２０ａは、長手方向に直交する断面の形状が円形である中空の筒状部２２ａが、柄２１に設けられている構成を有している。図３の（ｂ）に示すくり抜き具２０ｂは、長手方向に直交する断面の形状が矩形である中空の筒状部２２ｂが、柄２１に設けられている構成を有している。

また、固体培地の一部をくり抜く方法としては、筒状の器具を使用する場合に限らず、先の尖った針を用いて輪郭を彫り、その内部をくり抜く方法なども可能である。これにより、任意の形状にくり抜くことが可能となる。当該方法に適したくり抜き具の例を図３の（ｃ）に示す。図３の（ｃ）に示すくり抜き具２０ｃは、先の尖った針２３が、柄２１に設けられている構成を有している。

固体培地の一部をくり抜くことによって落とし込み槽を形成する場合、落とし込み槽の底面の形状を均一にするために、落とし込み槽が固体培地の底面まで到達していること、すなわち容器の底面が落とし込み槽の底面となっていることが好ましい。

（第２の形成方法）
次に、形成型（成形型ともいう。）を用いて落とし込み槽を形成する方法について説明する。まず、形成型について説明する。

本実施形態における形成型は、容器の上面に固定できる器具であって、典型的には本体部分が板状であり、当該本体部分の一方の面に少なくとも１つの突起を配置したものである。本体部分が板状である形成型に限定されず、容器嵌め込み式の器具、例えば容器上面の外周に被せられる機構を有した形成型であってもよい。型の本体の素材は特に限定されないが、固化またはゲル化前の液状の培地および固化またはゲル化した後の固体培地に接触したときに変質しない素材が好ましい。また、本体の材質は、固化またはゲル化前の、水分を多く含む液状の培地の上部に配置するため、水蒸気が付着しても変性せず、安定的にプレート上に保持できる素材が好ましい。このような素材としては、ステンレス、プラスチックおよび硬質シリコーンなどが挙げられる。また、培地からの水蒸気を逃す観点から、板材に直径数ｍｍ程度の孔が均一に形成されたものであってもよい。

形成型の一態様では、突起が本体部分に対して着脱可能となる機構を有している。これにより、プレートの使用目的および使用態様に適した落とし込み槽が形成されるように、突起を所望の位置に自由に設けることが可能となる。ここで、着脱の方法としては、差し込みにより着脱する方法、およびマグネットを利用して着脱する方法などが挙げられる。差し込みによる場合、例えば、形成型本体に孔を設け、突起に棒などの差し込み部を設けておき、任意の孔に突起の差し込み部を差し込めばよい。また、マグネットを利用する場合、形成型本体および突起上面の両方にマグネットを配するか、形成型本体および突起上面の一方にマグネットを配し、他方に金属を配しておくことにより、形成型本体の任意の位置に突起を配置させることができる。さらに別の態様では、特定の形状およびサイズの突起を取り付けるものに限らず、異なる形状およびサイズの突起も取り付け可能に設計されており、それらを所望の位置に自由に設けられるものとなっている。また、この突起の高さを調整することで、固体培地に形成される落とし込み槽の深さを調整することができる。

さらに、形成型を容器の側壁の上部に挟んで固定するためのクリップ状の固定ピンも、本体部分から着脱可能としてもよい。また、クリップ状の固定ピンがプレートを傷つけず確実にプレートに固定されるように、固定ピンの両方の先端には、シリコーン樹脂等の摩擦係数が高く、弾力のある素材で形成された滑り止め防止用キャップが装着されていてもよい。また、本体部分は、容器上部に固定でき、突起を配置可能なものであれば、板状部材に限定されず、例えば、格子状部材または棒状部材など、他の形態であってもよい。

板状の形成型の各部材の例を図４に示す。図４の（ａ）は、板状の本体部分３０の外観斜視図であり、図４の（ｂ）～（ｅ）は、突起４０ａ～ｄ（区別する必要のない場合は、まとめて「突起４０」と記載する。）の外観斜視図であり、図４の（ｆ）は、クリップ状の固定ピン４３の外観斜視図である。

図４の（ａ）に示すように、本体部分３０は、突起４０を着脱可能に設置するための差し込み孔３２が、板状部材３１に格子状に複数設けられている。また、突起４０を直線上に、または同心円上に容易に設置できるように、板状部材３１にはガイドとなるようなライン３３が印刷または形成されていてもよい。

また、図４の（ｂ）～（ｅ）に示すように、突起４０は、本体部分３０に設置するための、差し込み孔３２への差し込み部４２と、差し込み部４２の差し込み孔３２への差し込み側とは反対側に設けられた、落とし込み槽を形成するための、落とし込み槽に対応した形状を有する突起本体部４１ａ～ｄ（区別する必要のない場合は、まとめて「突起本体部４１」と記載する。）とを備えた構成である。図４の（ｂ）に示す突起４０ａは、平底円形状の落とし込み槽を形成するための突起であり、突起本体部４１ａが、先端が平坦な円柱状の形状を有している。また、図４の（ｃ）に示す突起４０ｂは、平底矩形状の落とし込み槽を形成するための突起であり、突起本体部４１ｂが、先端が平坦な角柱状の形状を有している。また、図４の（ｄ）に示す突起４０ｃは、丸底円形状の落とし込み槽を形成するための突起であり、突起本体部４１ｃが、先端が丸まった円柱状の形状を有している。また、図４の（ｅ）に示す突起４０ｄは、平底矩形状の落とし込み槽であって、溝のように一辺が長い落とし込み槽を形成するための突起であり、突起本体部４１ｄが、先端が平坦な板状の形状を有している。また、本体部分３０に安定に設定するために、差し込み部４２が複数設けられている。

また、図４の（ｆ）に示すように、固定ピン４３は、本体部分３０に設置するための、差し込み孔３２への差し込み部４５と、差し込み部４５の差し込み孔３２への差し込み側とは反対側に設けられた、容器の側壁を挟むためのクリップ部４４とが設けられている。また、クリップ部４４の先端には、プレートを傷つけずに確実にプレートに固定されるようにするための滑り止め防止用キャップ４６が設けられている。

また、図４の（ｇ）は、突起４０ａおよび固定ピン４３を、本体部分３０に設置する様子を図示している。図４の（ｇ）に示すように、容器のサイズ、落とし込み槽の数、位置および形状等に応じて、任意の突起４０を、任意の差し込み孔３２に差し込むことで設置するとともに、固定ピン４３を、容器への固定に適した任意の差し込み孔３２に差し込むことで、所望の形成型を得ることができる。

なお、形成型を容器に固定するための手段は、図４の（ｇ）に示した例では、クリップ状の固定ピンを用いて、形成型の板状本体部分を容器の側壁の上部で支えることで容器上部に固定するものであるが、これに限定されるものではない。

続いて、この形成型を用いて落とし込み槽を形成する方法について説明する。

まず、形成型を容器の上面に配置し、次いで、液状の培地を容器に流し込み、これを固化（ゲル化）させる。固化後、形成型を静かに取り外すことによって、形成型の突起があった位置に落とし込み槽が形成されることになる。なお、固化前の液状の培地を容器に流し込んだ後に形成型を容器の上面に配置し、次いで、流し込んだ培地を固化させてもよい。

嵌め込み式の形成型の例を図５に示す。図５の（ａ）は、一実施形態に係る線虫トラップ用プレートを作製するための嵌め込み式の形成型５０の上面図であり、（ｂ）は形成型５０の断面斜視図である。図５に示す例は、市販の円形プラスチックディッシュの上面に嵌め込んで使用する形成型である。また、本実施形態では、容器上面より形成型５０を容器に被せる際に容器と対向する側を、嵌め込み式形成型の上面側として説明している。

図５の（ａ）および（ｂ）に示すように、形成型５０は、容器上面の外周形状に沿った形状の、本体外枠（本体部）５１、嵌め込み部５２および突起５３が外側から順に形成された環状の構造を有している。本体外枠５１と突起５３とは一体的に形成されている。嵌め込み部５２は、本体外枠５１と突起５３との間に、本体外枠５１と突起５３とによって画定される溝である。容器上面より形成型５０を容器に被せ、容器の壁を嵌め込み部５２に嵌め込んで、容器と形成型５０とを平行にした状態で固体培地を形成する。これにより、突起５３が存在している位置に環状で堀状の落とし込み槽が形成される。落とし込み槽は、当然、容器の外周に沿って堀状に設けるものに限定されず、上述したように、円形および矩形等であってもよい。この場合、任意の形状およびサイズの突起５３が、落とし込み槽を形成する位置に応じて、嵌め込み部５２から環の中心に向かって水平に延ばした部材の上面側に形成され得る。なお、本実施形態においては、円形のディッシュの上面に嵌め込んで使用する形成型について説明しているため、形成型５０は環状構造であるが、形成型５０の外形は、使用する容器の形状に応じて異なり得る。また、形成型は、固化またはゲル化前の、水分を多く含む液状の培地に接するため、水蒸気が付着しても変性せず、安定的に容器に保持できる素材が好ましい。このような素材としては、ステンレス、プラスチックおよび硬質シリコーンなどが挙げられる。また、培地からの水蒸気を逃す観点から、直径数ｍｍ程度の孔が均一に形成されたものであってもよい。

（第３の形成方法）
次に、容器の底面に予め形成された孔に落とし込み槽となるチューブ状の容器を固定した状態で固体培地を形成することで、落とし込み槽を形成する方法について図６を参照しながら説明する。まず、本方法に用いられる容器について説明する。なお、ここでは、円形ディッシュの形態を有する容器について説明する。

図６の（ａ）は本方法に用いられる容器１０ａの上面図であり、図６の（ｂ）は図６の（ａ）の破線Ｂ－Ｂにおける容器の断面図である。図６の（ａ）および（ｂ）に示すとおり、容器１０ａの底面５には、落とし込み槽が形成される位置に対応する部分に、貫通孔４ａ、４ｂが形成されている。図６では、図１に示すプレート１を形成するように、プレート１の落とし込み槽２ａ、２ｂと重畳する部分に貫通孔４ａ、４ｂが形成されているが、貫通孔の位置および数は、形成する落とし込み槽の位置および数に応じて適宜設計すればよい。詳細は後述するが、貫通孔４ａ、４ｂは、落とし込み槽となるチューブ状の容器を挿入する部位である。挿入したチューブ状の容器の下部が、容器１０ａを置いている台などとぶつからないように、容器１０ａは、底面５の下側に空隙を有する高底式の容器となっている。

容器の底面に貫通孔が設けられていることを除き、容器１０ａの材質および形状等は、上述の（線虫トラップ用プレート）の項目において説明した容器と同じであり得る。また、図６に示した容器１０ａは、高底式の容器であるが、挿入したチューブ状の容器の下部が、容器を置いている台などと接しない構造であればよく、高底式の容器に限られない。例えば、底面の下側全体に空隙を有する構成ではなく、チューブ状の容器が挿入される部分の下側のみ空隙を有する構成となっていればよい。具体的には、上側に突出した１以上の凸状部が容器の底面に形成されており、当該凸状部に貫通孔が形成されている構成などでもあり得る。

続いて、容器１０ａを用いて、プレートの落とし込み槽を形成する方法について説明する。

まず、容器１０ａの底面５に設けられた貫通孔４ａ、４ｂ（区別する必要のない場合は、まとめて「貫通孔４」と記載する。）に、最終的に落とし込み槽となるチューブ６ａ、６ｂ（区別する必要のない場合は、まとめて「チューブ６」と記載する。）を挿入する（図６の（ｃ））。チューブ６は、下端に底部を有し、上端が開口している筒状の容器である。チューブ６を挿入した後に、固化またはゲル化前の液状の培地を流し込むため、培地が隙間から漏れ出ることを防ぐために、チューブ６の外形は、貫通孔４の形状と一致することが好ましい。あるいは、貫通孔４とチューブ６との間にＯリングなどのストッパーの役割をするパーツを取り付け、チューブ６の脱落を防ぐこともできる。また、シリコーン樹脂などの摩擦係数が高く、弾力のある素材を母材とするチューブ、またはシリコーン樹脂などでコーティングしたチューブを用いてもよい。

次いで、容器内に液状の培地を流し込み、固化またはゲル化して固体培地１１を形成する（図６の（ｄ））。この際、培地の表面はチューブ６の上端の開口と同位置または当該開口よりも低い位置とする。培地がチューブ６内に入らないように、培地の表面はチューブ６の上端の開口よりも低い位置とすることが好ましい。また、培地がチューブ６内に入らないように、チューブ６に取り外し可能な蓋を被せるようにしてもよい。

固体培地１１を形成した後、チューブ６の上端が固体培地１１の表面と同じ高さとなるように、チューブ６を上から底に向かって押し込む。これにより、固体培地の表面に凹部（落とし込み槽）が形成されることになる（図６の（ｅ））。したがって、本方法では、固体培地に埋め込まれた状態のチューブ６が落とし込み槽として機能する。

本方法により作製した線虫トラップ用プレートでは、落とし込み槽となったチューブ６を試験後に容器１０ａの底面５の下側から押し上げて線虫トラップ用プレートから取り外すことで、チューブ６中に捕捉された線虫を容易に回収することができる。したがって、本方法は、試験後に落とし込み槽中に捕捉された線虫を回収する必要がある場合に、好適に利用できる。

なお、落とし込み槽の形成方法によらず、堀のような構造の落とし込み槽を形成する場合には、堀の内側の島となる固体培地を、別の固体培地をくり抜いて形成した上で、上述の何れかの方法に従って落とし込み槽を形成した後、島となる固体培地を落とし込み槽内に配置すればよい。すなわち、上記何れかの方法に従って形成した落とし込み槽内に、別の固体培地をくり抜いて形成した島となる固体培地を配置すればよい。島状の固体培地を形成するための別の固体培地は、配置する先の線虫トラップ用プレートにおける固体培地と同一の組成の固体培地でも、異なる組成の固体培地でもよい。また、試験後に線虫を計数する際には、落とし込み槽内に配置した島状の固体培地を取り除けばよい。

〔被験物に対する線虫の応答評価方法〕
以下、上述の線虫トラップ用プレートを用いた、線虫の応答評価方法の一実施形態について説明する。ここでは、被験物を線虫トラップ用プレートに供給して、線虫の応答評価を行う方法について説明する。なお、本実施形態における線虫トラップ用プレート（ＰＡＳＳプレート）を用いた線虫の応答評価方法をＰＡＳＳ法と称することもできる。

（線虫の準備）
試験に使用する線虫は、予め、所定の固体培地上、および培養液中など、使用する線虫に適した方法で培養しておく。ここでは、線虫としてＣ．エレガンスを用い、寒天平板上で予め培養する場合について説明しているが、これに限定されるものではない。培養後、線虫を培養した寒天平板に緩衝液を注入する。これによって液中に泳ぎ出した線虫をピペットで吸入するなどの方法で回収し、遠沈管に移す。数分間静置した後、大腸菌などの夾雑物を含む緩衝液の上層を除去し、新たな緩衝液を加えて線虫を洗浄し、さらに上層を除去する。これを２～３回繰り返すことで、線虫以外の夾雑物比率を低減させる。試験に使用する線虫の種類、発生段階および性別等は、試験の目的に応じて決定すればよい。

（試験用プレートの準備）
１．嗅覚試験の試験用プレート
嗅覚試験を行う場合の試験用プレートの調製方法の一例について説明する。以下では、線虫トラップ用プレートの落とし込み槽内または落とし込み槽周辺に被験物が供給されており、かつ落とし込み槽内が液体で満たされている、試験用の線虫トラップ用プレートを例にして説明するが、これに限定されるものではない。すなわち、落とし込み槽とは別に被験物供給孔を設け、そこに被験物を供給するような構成を有する線虫トラップ用プレートなどの他の形態の線虫トラップ用プレートの利用を排除するものではない。ここで、嗅覚試験用の被験物とは、被験物自体が気相中に拡散して匂い物質となる場合の他、被験物に含まれる物質が被験物から気相に放出されて当該物質が匂い物質となる場合等があり得る。

被験物を供給する方法としては、被験物を落とし込み槽内またはその周辺に滴下したり、落とし込み槽周辺に塗布するなどであればよい。

落とし込み槽内は試験前に液体で満たす。落とし込み槽が液体で満たされていることにより、落とし込み槽中に捕捉された線虫が落とし込み槽から脱出することを防ぐことができる。落とし込み槽に到達した線虫が落とし込み槽内の液体に補捉、すなわち、トラップされるように、落とし込み槽が完全に液体で満たされている、すなわち、液体の液面が固体培地の表面まで到達していることが好ましい。比較的小さな線虫の場合、落とし込み槽に到達して線虫が液面に触れると、液体の表面張力によって線虫が液中に引き込まれることになる。例えば、Ｃ．エレガンスの場合には、体の１／５程度が液面に触れると、液中に引き込まれる。

落とし込み槽内に満たす液体は、水（超純水を含む）、生理食塩水、緩衝液およびエタノールなど、被験物の希釈および気相における被験物の拡散に適した液体を選択すればよい。また、予め落とし込み槽を液体で満たした上で、そこに被験物を滴下する場合に限らず、被験物の原液または当該希釈液を落とし込み槽内に注入することで、落とし込み槽を液体で満たすと同時に、被験物の供給を行うものであってもよい。何れの場合でも、当該落とし込み槽に満たす液体の温度は、落とし込み槽周辺の固体培地の温度と同一であることが望ましい。

対照の落とし込み槽を設ける試験においては、被験物を含まないことを除き、液体の種類、容量（ボリューム）、温度および注入のタイミングを全て、被験物が供給される落とし込み槽と同一とする。

なお、落とし込み槽が複数の場合であっても、必ずしも対照の落とし込み槽を設けなくてもよい。例えば、同一の化学物質の異なる２つ以上の濃度に対する誘引応答の順位付けを目的とした比較試験、異なる２つ以上の化学物質に対する応答の比較試験、異なる性質の２つ以上の化学物質（例えば匂い物質と味物質）に対する応答の比較試験などでは、対照となる標準液を満たす落とし込み槽を設けず、全てを試験用の落とし込み槽としてもよい。

嗅覚試験を行う場合の試験用プレートにおいては、上述の処理に加えて、落とし込み槽内に満たした被験物を含む試験対象の液体（以下、「試験液」という場合もある。）からの匂い物質の放出または拡散速度を制御する処理を行ってもよい。匂い物質の放出または拡散速度を制御することで、線虫の匂い検知感度の最適化が可能となる。落とし込み槽内に満たした試験液から放出される匂い物質が線虫トラップ用プレート内空間で飽和してしまうと、線虫は走性、すなわち匂い源選択的に寄って行くか、または匂い源選択的に逃げる性質を示すことができない。空間だけでなく、固体培地表面への匂い物質付着状態も密度勾配が維持される以上に高密度となった段階で、試験が困難になる。そこで、試験対象の匂い物質が拡散し易い場合には、落とし込み槽内に満たした試験液の液面からの分子飛び出し率を低下させる薬剤を落とし込み槽内の試験液に添加する。一方で、匂い物質が気化しにくい物質である場合には、増感剤となる薬剤を落とし込み槽内の試験液に添加する。対照の落とし込み槽を設ける試験では、対照側の落とし込み槽内に満たした標準液にも試験液と同一の薬剤を同量添加する。分子飛び出し率を低下させる薬剤としては、従来公知の気化抑制作用を有する物質が使用可能である。また、増感剤となる薬剤としては、従来公知の気体拡散作用を有する物質が使用可能である。これらにより、試験対象の匂い物質の拡散量、速度および範囲を制御することができ、線虫の匂い等検知感度を制御することが可能となる。匂い物質の放出または拡散速度の制御が可能となることで、線虫トラップ用プレートのサイズを最適化（特に最小化）することが可能となる。

２．味覚試験の試験用プレート
味覚試験を行う場合の試験用プレートの調製方法の一例について説明する。以下では、線虫トラップ用プレートの落とし込み槽周辺に被験物が濃度勾配をもって供給されており、かつ落とし込み槽内が液体で満たされている、試験用の線虫トラップ用プレートを例にして説明するが、これに限定されるものではない。ここで、味覚試験用の被験物とは、被験物自体が味物質となる場合の他、被験物に含まれる物質が被験物から固体培地に放出されて当該物質が味物質となる場合等があり得る。

まず、被験物を高濃度で含むプラグを準備し、これを線虫トラップ用プレートの落とし込み槽の中、または落とし込み槽を覆うようにして固体培地上に置くことで、被験物をプラグから固体培地に拡散させ、固体培地上に、落とし込み槽を中心とした同心円状の被験物の濃度勾配を形成する。ここで、プラグとは、被験物を含有する所望の厚さの平板固体培地をくり抜くことによって準備した小片を意図している。

落とし込み槽を試験直前にくり抜きによって形成する場合には、固体培地に被験物の濃度勾配を形成させた後に、くり抜きによって落とし込み槽を形成してもよい。具体的には、固体培地上、落とし込み槽形成予定位置に、被験物を含むプラグを静置させる。これにより、落とし込み槽形成予定位置を中心とした同心円状に被験物の濃度勾配が形成される。プラグを取り除いた後、その位置に、くり抜きによって落とし込み槽を形成すればよい。これにより、落とし込み槽を中心とした同心円状に被験物の濃度勾配が形成される。

プラグの静置時間は、プレートのサイズおよび形状、固体培地の種類、落とし込み槽のサイズおよび形状、ならびに被験物の種類および濃度等に応じて、適宜設定すればよい。

プラグのサイズおよび形状は、落とし込み槽のサイズおよび形状、被験物の種類、ならびに具体的な試験方法に応じて適宜決定すればよい。１つの例としては、プレートの容器として内径５．０～１０．０ｃｍの円形ディッシュを用い、固体培地の厚さを５ｍｍ～２ｃｍ程度とした場合、厚さが３ｍｍ～１ｃｍ、サイズが数ｍｍ～１ｃｍ角程度または直径数ｍｍ～１ｃｍ程度のプラグとすることが可能である。

プラグを介して被験物を供給する場合であっても、試験開始時には、落とし込み槽内には液体を満たす。例えば、プラグを固体培地から取り除いた後、試験開始前に落とし込み槽内に液体を注入すればよい。液体は、上述の嗅覚試験の試験用プレートを準備する場合で説明した液体と同じであり得る。

また、対照の落とし込み槽を設ける試験においては、被験物を含まないことを除き、液体の種類、容量（ボリューム）、温度および注入のタイミングを全て、被験物が供給される落とし込み槽と同一とする。また、被験物を含まないことを除き、被験物の濃度勾配形成に使うのと同一の組成、サイズおよび形状のプラグを用いて同じ処理を施すことが好ましい。

味覚試験においても、落とし込み槽が複数の場合に、必ずしも対照の落とし込み槽を設けなくてもよい。

以上では、プラグを介して被験物を供給する場合について説明したが、被験物を含む溶液をプレートの落とし込み槽となる部分の周辺に滴下した上で乾燥させる方法で、固体培地に染み込ませてもよい。さらに、落とし込み槽内に味物質を含む溶液を満たす方法でもよい。あるいは、被験物を含有するプラグを落とし込み槽内に配置し、当該落とし込み槽を液体で満たす方法で被験物を落とし込み槽内に供給してもよい。

（線虫の供給）
被験物が供給された試験用プレートを準備した後、線虫をプレートに供給して試験を開始する。

線虫の供給は、典型的には、洗浄済の線虫を含む液体を、被験物が供給されたプレートの所定の位置に滴下し、液体を拭き取って除去することで行うことができる。

供給する線虫の数は、落とし込み槽の数、大きさ、計数方法、および試験目的等に応じて適宜設定すればよい。例えば、線虫としてＣ．エレガンスを使用し、直径が５ｍｍかつ深さが４ｍｍの落とし込み槽が２つ設けられたプレートを使用する場合、線虫の数は概ね１００匹～１０００匹程度である。このとき、後述する個々の線虫を認識して線虫の個体数を計測する場合には、供給した全ての線虫が特定の１つの落とし込み槽中に捕捉された場合にも、落とし込み槽の中の線虫の視認が可能な程度の数、すなわち概ね１００匹程度とすることが好ましい。一方、後述する線虫の数と相関する別の要素を計測して線虫の数を算出する場合には、概ね１０００匹程度とすることができる。

線虫を供給する位置は、試験の目的に応じて適宜設定すればよいが、落とし込み槽から離れた位置であることが好ましい。また、複数の落とし込み槽を用いて試験を行う場合、典型的には、何れの落とし込み槽からも等しい距離となる位置である。したがって、一態様においては、固体培地の外周また外周付近に２以上の落とし込み槽が形成されており、プレートの中心部分に線虫を供給できるように、プレートの中心部分には落とし込み槽が形成されていない構成であり得る。

また、線虫の供給は１点に供給する場合に限らない。例えばプレートを矩形とし、それぞれの長辺に沿って複数の落とし込み槽を設けた場合、当該プレートの中心を通る長辺と平行な直線上に線虫を供給してもよい。

上記のように線虫を供給し、線虫とともに供給された液体を除去すると、線虫がプレートの固体培地上を自由に移動し始める。そのため、液体を除去した後、速やかにプレートにカバーを被せる。

（試験条件）
プレートにカバーを被せた後、予め定めた時間が経過するまで、プレートを静置しておくことで試験を行う。プレートを保持しておく環境に特に制限はないが、環境条件が試験の結果に影響を及ぼさないように、静置場所の温度および遮光の有無等などを試験目的、被験物および線虫の種類等に応じて適宜設定すればよい。遮光して、任意の温度で静置する場合、簡単には、窓などの光透過部が扉に設けられていないクールインキュベーター、または扉の光透過部にアルミ箔等で遮光処置したクールインキュベーターの庫内にプレートを静置すればよい。または、光を透過しない素材、例えば、ステンレス、アルミニウムまたは不透明のプラスチックのバットをプレートに被せてもよい。

（線虫個体の数の測定）
予め定めた時間が経過したら試験終了とし、落とし込み槽中に捕捉された線虫の数を測定する。

線虫の数の測定方法としては、（ｉ）落とし込み槽中の個々の線虫を認識して計数する方法、および（ｉｉ）落とし込み槽中の線虫の数と相関する別の要素を計測し、個体数を算出する方法の２つの方法を選択して用いることができる。また、これら（ｉ）および（ｉｉ）の方法は、対象エリアを撮像し、画像解析によって実施するものであってもよく、捕捉された線虫を回収した上で実施するものであってもよい。また、視認が十分に可能な場合には、各落とし込み槽中の線虫を顕微鏡で観察しながら計数するのでもよい。撮像した場合に、視認による計数と後述する画像解析による計数とを併用してもよい。また、カバーが光透過性であれば、プレートにカバーを被せたままの状態で、落とし込み槽中の線虫を顕微鏡下で撮像すればよい。線虫の数と相関する別の要素としては、蛍光観察したときの蛍光強度、撮像したときの画像における陰影、線虫とともに回収した線虫を含む液体の吸光度、回収した線虫から抽出した核酸およびタンパク質自身を指標としたもの、および当該核酸およびタンパク質を処理（例えば、増幅処理、酵素反応処理）することにより得られる指標に基づくもの等が挙げられる。また、試験後速やかに、落とし込み槽中の線虫および液体を別容器に移し替える場合もあり得る。この場合には、移し替えによって線虫および液体が入れられた容器を撮像し、画像解析するものであってもよい。以下、線虫個体の計数方法のいくつかの具体例を示すが、これらに限定されるものではない。また、上記（ｉ）および（ｉｉ）の方法を単独で使ってもよいし、後述する（ｉ）および（ｉｉ）に分類される何れかの方法のうち、２つ以上を組み合わせて使ってもよい。

［Ａ．画像解析により、個々の線虫を認識して計数する方法］
本方法を採用する場合、観察画像は、明視野像でもよく、蛍光像でもよい。

（Ａ－１）撮像：顕微鏡下で試験に用いられた落とし込み槽をデジタルカメラまたはビデオカメラ等の録画機器を用いて撮像する。試験後に、落とし込み槽中の線虫を液体とともに別の容器に回収した場合には、落とし込み槽の代わりに、当該容器内の液体を、録画機器を用いて撮像する。例えば、落とし込み槽中の線虫を液体とともに回収した別の容器の内部を底面から録画機器を用いて撮像する。

（Ａ－２）前処理：上記（Ａ－１）で撮像した静止画像または動画像に対し、フィルタ処理（ローパスフィルタ、および平滑フィルタ等）を施した上で、２値化処理（白黒化）、およびコントラストの強調処理等を行う。２値化処理を行う場合、基本的には、測定対象の線虫が黒になるように処理する。

（Ａ－３）特徴量抽出：認識対象線虫の面積をもとに抽出閾値を設け（例えば、画素数による閾値）、線虫以外の陰影（ノイズ）を除去した上で、線虫の輪郭、中心線、ＨＯＧ特徴量、および面積等を算出する。このとき、落とし込み槽の中以外を全てノイズとして除去することができる他、予め解析対象エリアのサイズを設定する（撮像倍率を一律にする）などの方法により、当初から画像解析対象を落とし込み槽に限定することもできる。また、人工ニューラルネットワークによる深層学習（Ｄｅｅｐ Ｌｅａｒｎｉｎｇ）を用いることで、上記の閾値設定などをせずに線虫とノイズとを分別してもよい。

（Ａ－４）個体認識および個体分割：人工ニューラルネットワーク、およびサポートベクターマシン等といった機械学習アルゴリズム、またはパターンマッチングを適用して、線虫を認識する。３次元空間である落とし込み槽の中を２次元化した画像では、複数個体が重ね合わさって映ることが少なくない。このような場合には、特にパターンマッチング等を駆使して、複数個体を分割して別個体として認識する。

（Ａ－５）計数：上記（Ａ－４）で画像中から線虫個体として抽出された各個体にナンバリングし、落とし込み槽中の線虫の総数を算出する。

上記（Ａ－１）～（Ａ－５）の処理は、手動で行ってもよいし、完全自動化してもよく、従来公知のアルゴリズムで実現され得る。

［Ｂ．画像解析により、線虫の数と相関する別の要素を計測し個体数を算出する方法］
画像解析における線虫の数と相関する別の要素としては、（Ｂ１）線虫の集団の陰影を利用する方法、および（Ｂ２）線虫から発せられる光の量を利用する方法等が挙げられる。以下、それぞれについて説明するが、これらに限定されるものではない。なお、本方法を採用する場合も、観察画像は、明視野像でもよく、蛍光像でもよい。

（Ｂ１．線虫の集団の陰影を利用する方法）
（Ｂ１－１）画像の前処理：予め上記（Ａ－１）～（Ａ－３）の処理を行う。

（Ｂ１－２）キャリブレーション：線虫の数と（Ｂ１－１）の画像前処理後の画像面積との対応関係を求める。例えば、落とし込み槽中に、試験に用いられるのと同じ種類の線虫を１匹、５匹、１０匹、２０匹、３０匹、４０匹、５０匹と数段階に順に数を増やして投入し、それぞれ撮像する。各個体数における線虫個体に相当する画像の面積を算出し検量線を引く。これをもとに、線虫個体に相当する部分の画像面積から対象範囲（落とし込み槽）中に捕捉された線虫の数を推定する対応関係データを作成する。

（Ｂ１－３）計数：（Ｂ１－１）の前処理済みの対象画像について、その面積（画素数）から解析対象範囲内の線虫の数を（Ｂ１－２）のデータに基づいて算出する。

（Ｂ２．光の量を利用する方法）
本方法に用いられる光に関し、その種類および強弱に制限はない。したがって光としては、蛍光プローブ等を組み込んだ組換え生物から発せられる蛍光に限らず、自家蛍光であってもよい。また、タンパク質、核酸、またはある種の内在性酵素活性を利用する呈色または発光等に由来する光であってもよい。線虫の全身を常時蛍光観察できるように蛍光プローブ（例えば、緑色蛍光タンパク質）を組み込んだ遺伝子組換え線虫としては、例えば、液体中での遊泳に使われる体壁筋細胞に蛍光プローブを組み込み、体壁筋細胞の収縮に伴って放出されるカルシウムイオン濃度を蛍光強度として間接的に計測できるようにした線虫Ｃ．エレガンスのＨＢＲ４株が好適に使用できる。遺伝子組換え線虫は被験物への応答が野生型と同等であることが望ましい。以下、蛍光プローブを組み込んだ遺伝子組換え線虫を用いる場合を例に説明する。

（Ｂ２－１）撮像：蛍光顕微鏡下で解析対象エリア、すなわち、落とし込み槽中または落とし込み槽から移し替えた容器中をデジタルカメラまたはビデオカメラ等の録画機器を用いて撮像する。励起光の波長およびフィルタ等の蛍光観察および撮像の条件は、蛍光強度が安定して強くなるように、使用する遺伝子組換え線虫と顕微鏡の仕様等に応じて決定すればよい。撮像エリアは落とし込み槽中または落とし込み槽から移し替えた容器中のみであるため高解像度カメラは必ずしも必要ではなく、市販のデジタルカメラを好適に使用できる。

（Ｂ２－２）キャリブレーション：線虫の数と上記（Ｂ２－１）で撮像した静止画像または動画像における蛍光強度との対応関係を求める。例えば、落とし込み槽中に、試験に用いられるのと同じ種類の線虫を１匹、５匹、１０匹、２０匹、３０匹、４０匹、５０匹と順に数段階に数を増やして投入し、それぞれ蛍光顕微鏡で撮像する。撮像した各画像から落とし込み槽中の蛍光強度の総量を算出し検量線を引く。この処理には、自作の画像解析プログラム、第三者により有償または無償で提供される画像解析プログラム、または市販の画像解析ソフトウェア（以下、これらをまとめて、単に「画像解析ソフトウェア等」と示すことがある。）を用いればよい。この解析の結果をもとに、蛍光強度から対象範囲（落とし込み槽）中に捕捉された線虫の数を推定する対応関係データを作成する。このキャリブレーションを試験開始前に一度行えば、同種の線虫を用いたその後の試験では試験ごとに線虫を手動で計数することなく画像の蛍光強度から個体数を自動的に導出できる。

（Ｂ２－３）計数：上記（Ｂ２－１）で撮像した対象画像について、その蛍光強度から解析対象範囲内の線虫の数を（Ｂ２－２）のデータに基づいて算出する。

［Ｃ．線虫を回収し、線虫の数と相関する別の要素を計測し個体数を算出する方法］
線虫を回収した後、線虫の数と相関する別の要素を計測する方法としては、上述のとおり、線虫とともに回収した線虫を含む液体の吸光度に基づき計測する方法、回収した線虫から抽出した核酸およびタンパク質自身または当該核酸およびタンパク質を処理することにより得られる指標に基づき計測する方法、あるいは線虫を回収した上で蛍光観察を行い、蛍光強度に基づき計測する方法等が挙げられる。ここでは、その１つの例として、線虫のＤＮＡを用いた方法について説明する。例えば、マツ材線虫病の検出（診断）には、ＬＡＭＰ（Long-mediated isothermal amplification）法を用いて、材片に浸潤したマツノザイセンチュウのＤＮＡを増幅させる原理による迅速診断法（所要時間６０分程度）が活用されている。この検出においては、ＤＮＡ抽出および増幅処理後、検査溶液の色が緑の蛍光色を呈していれば陽性であり、マツノザイセンチュウの存在が確認できる。この方法を応用し、落とし込み槽中に捕捉された線虫のＤＮＡ量から、個体数を推定（同定）することが可能である。一般的な手順を以下に示す。

まず、落とし込み槽中に捕捉された線虫を、落とし込み槽内に満たした液体とともに容器、例えばチューブに回収する。落とし込み槽に予め取り外し可能なチューブを埋め込んだ構造のプレートを使用する場合には、線虫の捕捉終了後に当該チューブをプレートから取り外すことで回収してもよい。回収した線虫を含む試料に対して、ＤＮＡ抽出、および増幅処理を行う。試験液が一定の緑色蛍光を発するまでに要したＤＮＡ増幅時間と個体数との関係を予め調べておき、それをもとに落とし込み槽の中に捕捉されていた線虫の総数を同定する。あるいは、ＤＮＡ増幅時間を一定として、時間経過後の緑色蛍光の強度等と個体数との関係を予め調べておき、それをもとに落とし込み槽の中に捕捉されていた線虫の総数を同定してもよい。

［Ｄ．画像解析ソフトウェア等の実装］
上述の［Ａ．画像解析により、個々の線虫を認識して計数する方法］、［Ｂ．画像解析により、線虫の数と相関する別の要素を計数し個体数を算出する方法］および［Ｃ．線虫を回収し、線虫の数と相関する別の要素を計測し個体数を算出する方法］に含まれる処理のうち、撮像後の画像解析、および画像解析後の計数に使用する画像解析ソフトウェア等は、典型的には、汎用パーソナルコンピューターまたはワークステーション（以下、両者を合わせて単に「コンピューター」と示すことがある。）にインストールして使用する。また、モバイル向けオペレーティングシステムを搭載したモバイル端末（スマートフォン等）にインストールして使用するものであってもよい。

画像解析ソフトウェア等をインストールするコンピューターまたはモバイル端末（以下、両者を合わせて単に「媒体」と示すことがある。）としては、無線通信機能を有するものを選択することが望ましい。媒体にカメラが装備されている場合は、自動計数のための撮像をデジタルカメラまたはビデオカメラ等録画機器の代わりに媒体のカメラを使って撮像してもよい。撮像した静止画像または動画像、もしくはデジタルカメラまたはビデオカメラ等録画機器で撮像後に媒体に取り込んだ静止画像または動画像に対し、媒体上で画像解析および線虫の計数を実施する。計数の結果は、計数した媒体上で表示、または別の媒体に送信して表示する。撮像した画像をもとに、落とし込み槽中の線虫の数を視認によって計数する場合にも、その全てまたは一部の作業および解析結果の表示を、上記媒体を使用して行うことができる。

なお、画像解析ソフトウェア等による自動処理を基本とする場合にも、目視にて計数を行ってもよい。すなわち、必要に応じて両者を併用することもできる。例えば、落とし込み槽中の線虫の個体数が極めて多い場合または画像が不明瞭な場合など、画像解析ソフトウェア等による処理に支障がある静止画像または動画像については、目視にても計数を行い、両者を併用して計数してもよい。この場合、画像解析ソフトウェア等による解析に問題がある画像のみを自動的に抽出し、目視による計数を要求するなど、画像の品質確認および計数方法の選択を自動的に行う作業管理ソフトウェアを導入することもできる。

（試験結果の評価方法）
上述のようにして計測された落とし込み槽の中に捕捉された線虫の数をもとに、線虫の応答を評価する。線虫の化学物質等に対する応答を調べる嗅覚試験および味覚試験の場合には、例えば、被験物用の落とし込み槽中に捕捉された線虫の数から対照の落とし込み槽の中に捕捉された線虫の数を引き、全ての落とし込み槽の中に捕捉された線虫の合計で除した値を、試験対象の化学物質等に対する走性を評価する化学走性指標（Ｃｈｅｍｏｔａｘｉｓ Ｉｎｄeｘ、「Ｃ．Ｉ．」と略すことがある。）と定義して、応答を評価することができる。なお、被験物用の落とし込み槽が複数ある場合はそれらに捕捉された線虫の合計を、被験物用の落とし込み槽中に捕捉された線虫の数とする。同様に、対照用の落とし込み槽が複数ある場合はそれらの中に捕捉された線虫の合計を、対照の落とし込み槽の中に捕捉された線虫の数とする。すなわち、被験物用の落とし込み槽中に捕捉された線虫の総数をＮ_１とし、対照の落とし込み槽の中に捕捉された線虫の総数をＮ_２とすると、化学走性指標（Ｃ．Ｉ．）は下記式で求められる。
化学走性指標（Ｃ．Ｉ．）＝（Ｎ_１－Ｎ_２）／（Ｎ_１＋Ｎ_２）
原則として、正の値は、嗅覚試験の場合には被験物の匂いに、味覚試験の場合には被験物の味に誘引されたことを意味し、負の値は被験物の匂いまたは味から逃避したことを意味する。ただし、対照の落とし込み槽内に匂いのある液体を満たした試験でＣ．Ｉ．が負の値となった場合には対照の落とし込み槽内に満たした液体の匂いへの誘引を、Ｃ．Ｉ．が正の値となった場合には対照の落とし込み槽内に満たした液体の匂いからの逃避をそれぞれ意味する場合がある。そのため、希釈に使用する液体、および対照の落とし込み槽内に満たす液体を選定する際には、この点を考慮して選定する必要がある。温感試験等においても、上記の嗅覚試験および味覚試験におけるＣ．Ｉ．に準じた指標で被験物および温度といった試験対象に対する誘引または忌避の応答を評価することができる。温感試験では、従来公知の温度走性指標、いわゆるＴＴＸ Ｉｎｄｅｘを用いることもできる。

〔共存生物に対する線虫の応答評価方法〕
以下、上述の線虫トラップ用プレートを用いた、線虫の応答評価方法の別の実施形態について説明する。本実施形態は、嗅覚試験の一態様として、匂い物質を放出する被験物として生物を用いるものである。

農作物の病害虫の的確で効率的な駆除は農林業者等にとって重要な課題である。植物寄生性線虫は、植物の根および葉等に寄生し、植物の根枯れおよび葉枯れ等による甚大な被害をもたらす。そこで、植物寄生性線虫を、当該生物の捕食者または対抗植物を用いて効率的に駆除することを指向した、植物寄生性線虫に対する対抗または忌避生物選抜試験の一例を示す。具体的には、植物寄生性線虫の捕食者（例えば、クマムシ）または対抗植物（例えば、マリーゴールド）などを用い、その発する匂い等を植物寄生性線虫が嗅ぎ分けて忌避できるかを試験する。植物寄生性線虫が嗅ぎ分けられず容易に近寄るような匂い等を発する線虫捕食者または対抗植物が、農作物植物の共存生物として最適である。

以下、線虫捕食者を想定した対抗生物選抜試験について説明する。この試験では、被験物側の落とし込み槽および対照側の落とし込み槽を形成し、さらに被験物側の落とし込み槽の近傍に、線虫捕食者を入れておく凹部（以下、「生物待機槽」と示すことがある。）を形成した線虫トラップ用プレートを用意する。生物待機槽中に、植物寄生性線虫の捕食者で対抗生物の候補となるクマムシを予め投入する。クマムシのように生物待機槽から脱出できない線虫捕食者を用いる場合には、生物待機槽内には液体を満たさない。一方、被験物側の落とし込み槽内および対照側の落とし込み槽内には液体を満たしておく。植物寄生性線虫が生物待機槽中の線虫捕食者の発する匂いを植物寄生性線虫が忌避物質として感知すれば、生物待機槽に近接した落とし込み槽よりも対照側の落とし込み槽に多く捕捉されると推定される。試験では、まず、クマムシを生物待機槽内に投入し、各落とし込み槽内に液体を満たしておく。次に、洗浄済みの植物寄生性線虫をプレートに供給して速やかにプレートにカバーを被せる。この時点を、試験開始時刻とし、予め定めた時間が経過するまで予め定めた環境条件（温度等）下で放置する。供給する植物寄生性線虫の数は、落とし込み槽の数および大きさ、植物寄生性線虫の計数方法、ならびに試験目的等によって異なるが、概ね１００匹～１０００匹程度である。例えば、上述の個々の線虫を認識して線虫の個体数を計測する方法を用いる場合には、供給した全ての植物寄生性線虫が特定の１つの落とし込み槽中に捕捉された場合にも、その中の植物寄生性線虫の視認が可能な程度の数、すなわち概ね１００匹程度とするのが好ましい。一方で、上述の線虫の数と相関する別の要素を計測して線虫の数を算出する方法を用いる場合には、概ね１０００匹程度とすることができる。

予め定めた時間が経過して試験終了とした後の、植物寄生性線虫の個体の計数および試験結果の評価方法は、上述の被験物に対する線虫の応答評価方法にて説明した方法と同様に実施すればよい。

〔温度に対する線虫の応答評価方法〕
次に、上述の線虫トラップ用プレートを用いた、線虫の応答評価方法の別の実施形態について説明する。ここでは、線虫トラップ用プレートの温度を調節し、温度に対する線虫の応答評価を行う温感試験について説明する。

温感試験では、試験用プレートの準備段階において、落とし込み槽内または落とし込み槽周辺に被験物を供給することに代えて、落とし込み槽内または落とし込み槽周辺を目的の温度に調節する。落とし込み槽内または落とし込み槽周辺の温度を調節する方法としては、任意の幅の板の一部、好ましくは両端、さらに好ましくは中央を含む板全体に、それぞれ任意の温度に制御可能な温度制御器を配した構造の温度制御装置上に、線虫トラップ用プレートを置き、固体培地に温度勾配を形成する。このとき、試験対象の温度領域に落とし込み槽が位置するように、線虫トラップ用プレートを温度制御装置上に配置すればよい。温度制御装置としては、いわゆる、サーモプレートが好適に使用できるが、平面上に温度勾配を形成可能な装置であれば、温度制御装置の態様は上記に限定されない。また、室温よりも低い温度を考慮する場合には、試験する温度域の上限以上（例えば、２５℃）に予め全体を温めたプレートを、落とし込み槽内に液体を満たす前に裏返し、落とし込み槽の中心に、例えば、氷酢酸の入った円筒形の瓶を置くことで、同心円上に温度勾配を形成してもよい。氷酢酸を入れる容器の底面形状は円形に限られるものではなく、試験の目的によって変えればよい。融点１７℃の氷酢酸を用いれば、落とし込み槽の中心付近が１７℃、最も離れた位置が最高で２５℃となる温度勾配を形成できる。本実施形態において、落とし込み槽内に満たす液体の温度は、各落とし込み槽周辺の固体培地の温度と同一であることが望ましい。

また、上記のとおり、温度を調節した状態で線虫を供給し、試験を開始する。なお、温感試験においては、試験期間中、温度が調節された状態で維持されることが好ましい。

線虫の準備、線虫個体の計数、および試験結果の評価方法は、上述の被験物に対する線虫の応答評価方法にて説明した方法と同様に実施すればよい。

〔線虫の行動評価方法〕
上述の線虫トラップ用プレートは、被験物または温度に対する線虫の応答評価に使用される場合の他、線虫の行動を評価することで線虫の状態および性質等を評価する場合にも使用できる。例えば、以下に説明するように、線虫のストレス度の評価および線虫の運動性の評価等、特定の被験物または温度等の被験対象が想定されない評価試験にも用いられ得る。以下、上述の線虫トラップ用プレートを用いた、線虫の行動評価方法の一実施形態について説明する。

［線虫のストレス度の評価方法］
上述の線虫トラップ用プレートを用いた、線虫のストレス度の評価方法の一実施形態について説明する。本実施形態は、餌のない環境へ逃避する線虫のストレス応答の一態様に着目し、ストレス度を評価するものである。以下では、線虫としてＣ．エレガンスを用いる場合について説明するが、これに限定されるものではない。

線虫は餌が十分にある環境では、その環境に留まる傾向がある。しかしながら、ストレス条件下あるいは一定以上の強度の外的刺激または内的刺激を受容した後には、餌のある環境を離れて、餌のない環境を探索したり、餌のない環境に寄って行くことがある。すなわち、固体培地を満たしたプラスチックディッシュの中央に餌の大腸菌を培養し、その上に線虫を放すと、通常は餌の大腸菌が培養された範囲内に留まるが、ストレス条件下では、餌の範囲から離れてプラスチックディッシュの端、特に内壁に寄って行くことがある。この習性を利用することで、線虫のストレス度を評価するストレス度評価試験の一例を示す。

以下、線虫のストレス度評価試験について説明する。この試験では、図２の（ｅ）および（ｆ）に一例を示す固体培地の外周に落とし込み槽が形成された線虫トラップ用プレートを用い、固体培地の中央に餌の大腸菌を培養しておく。大腸菌の上に線虫を１００匹程度放し、一定時間経過後に落とし込み槽中に捕捉された線虫の数を計数する。本実施形態において、落とし込み槽内に満たす液体は、超純水および生理食塩水など、無臭であり、固体培地と温度差のない液体であればよい。落とし込み槽中に捕捉された線虫の計数は、落とし込み槽内を撮像して画像をもとに計数する方法で行えばよい。撮像範囲が広いことが問題となる場合には、落とし込み槽中に捕捉された線虫を落とし込み槽内に満たした液体とともにチューブ等に回収し、当該チューブ中の線虫を撮像してもよい。また、落とし込み槽の容積が小さいなどの理由で線虫の回収が難しい場合には、落とし込み槽中に捕捉されずに固体培地上に残った線虫を白金線などを使って回収した後に、落とし込み槽に満たしたのと同一の液体を線虫トラップ用プレートに注入し、線虫トラップ用プレート上に浮き出てきた線虫を液体とともに回収してもよい。その他、温度および光の条件等、本実施形態における諸条件は、上述の被験物に対する線虫の応答評価方法に記載した条件および方法等を準用することができる。

線虫のストレス度は、例えば、落とし込み槽中に捕捉された線虫の数を最初に放した線虫の総数で除した値として評価することができる。

［線虫の運動性の評価方法］
次に、上述の線虫トラップ用プレートを用いた、線虫の運動性の評価方法の一実施形態について説明する。本実施形態は、線虫の移動距離に基づいて線虫の運動性を評価するものである。以下では、線虫としてＣ．エレガンスを用いる場合について説明するが、これに限定されるものではない。

線虫は、餌のない環境では、餌を探す、いわゆる探索行動を示す。すなわち、現在位置に留まらず、環境中を広範囲にわたって移動する。一般に、日齢の小さい成虫に比べて日齢の大きい成虫の線虫では運動性が低く、単位時間当たりの総移動距離が短くなる傾向があり、老化解析の１つの指標として運動性の評価は有用である。また、突然変異体の種類によっても運動性には違いがあり、表現型の確認の意味でも運動性の評価は有用である。また、外部刺激の有無および各種環境条件によっても運動性は変化するため、刺激応答の評価においても運動性の評価は有用である。しかしながら、線虫の各個体の単位時間当たりの総移動距離を計測するのは容易ではない。ここでは、単位時間当たりの総移動距離による運動性の評価を代替する簡便な方法として、初期位置から線虫の体長に比して十分に離れた位置に設けた落とし込み槽中に捕捉された線虫の数から、線虫の運動性を推定する評価試験の一例を示す。

以下、線虫の運動性評価試験について説明する。この試験では、図２の（ｅ）および（ｆ）に一例を示す固体培地の外周に落とし込み槽が形成された線虫トラップ用プレートを用い、固体培地の中央に線虫を１００匹程度放し、一定時間経過後に落とし込み槽中に捕捉された線虫の数を計数する。ここで、試験時間は、線虫トラップ用プレートのサイズおよび試験の目的に応じて数十分から概ね十数時間の範囲を目安として自由に決めればよい。本実施形態において、落とし込み槽内に満たす液体、線虫の撮像方法、および線虫の回収方法は、上述の線虫のストレス度の評価方法に示す方法を準用することができる。その他、温度および光の条件等、本実施形態における諸条件は、上述の被験物に対する線虫の応答評価方法に記載した条件および方法等を準用することができる。

線虫の運動性は、例えば、落とし込み槽中に捕捉された線虫の数を試験対象の線虫の総数で除した値として評価することができる。また、試験対象の線虫のうち、任意の割合の個体が落とし込み槽に捕捉されるまでに要した時間を評価指標とすることもできる。

〔線虫トラップ試験キット〕
本実施形態における線虫トラップ試験キットは、少なくとも上述の線虫トラップ用プレートと、線虫トラップ用プレートの固体培地上の環境を一定に保つための上述のカバーとを備える。典型的には、線虫トラップ用プレートにカバーが取り付けられた状態である。線虫トラップ用プレートおよびカバーの好ましい態様は、上述のとおりである。また、線虫トラップ用プレートにカバーが取り付けられた状態で、複数積み重ねて保管できるようなスタッキング機構を有することが好ましい。

本実施形態における線虫トラップ試験キットのさらなる態様では、試験に用いられる線虫を含んでいる。線虫を含む場合、線虫トラップ用プレートおよびカバーとは異なる容器に入れられて提供され得る。

線虫トラップ試験キット１つ当たりの線虫トラップ用プレートおよびカバーの数ならびに線虫の数に、特に制限はない。

〔線虫トラップ用プレート作製キット〕
本実施形態における線虫トラップ用プレート作製キットは、少なくとも上述の貫通孔が形成された容器と、当該貫通孔に挿入するチューブとを備える。典型的には、容器は、チューブを挿入する複数の貫通孔を備える、高底式の容器である。容器およびチューブの好ましい態様は、上述のとおりである。

本実施形態における線虫トラップ用プレート作製キットのさらなる態様では、固体培地の材料を含んでいる。固体培地の材料を含む場合、容器およびチューブとは異なる容器に入れられて提供され得る。

本実施形態における線虫トラップ用プレート作製キットのさらなる別の態様では、上述の線虫トラップ試験キットと同様に、作製された線虫トラップ用プレートの固体培地上の環境を一定に保つためのカバー、または試験に用いられる線虫をさらに含んでいる。

線虫トラップ用プレート作製キット１つ当たりの容器およびチューブ、固体培地材料の数、ならびに線虫の種類および数等に、特に制限はない。

〔がん検査方法〕
上述のとおり、線虫（Ｃ．エレガンス）をバイオセンサとして用いた尿によるがん検査が知られている。従来知られている線虫を用いた尿によるがん検査において、本実施形態に係る線虫トラップ用プレートが好適に利用できる。詳細には、上述の〔被験物に対する線虫の応答評価方法〕の嗅覚試験において、被験物を被験者から採取した尿とすることで実施できる。ここで、被験者とは、哺乳類であり、ヒト、またはヒト以外の哺乳類を意味する。ヒト以外の哺乳類として、具体的には、イヌ、ネコ、ウサギ、ハムスターおよびフェレット等の愛玩動物、ならびにサル、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、マウス、ラットおよびモルモット等の産業動物が挙げられる。特に近年の動物園では、絶滅危惧種の動物の維持繁殖も重要な任務となっており、これに該当する哺乳類の飼育個体は当該種の維持において極めて貴重である。したがってその健康管理は重要であり、当然その尿も健康管理に資するべく被験物に含むものである。なお、絶滅危惧種の動物とは、典型的には、国際自然保護連合（ＩＵＣＮ）が作成する絶滅のおそれのある野生生物のレッドリストのうち、絶滅寸前であるとされる絶滅危惧ＩＡ類、絶滅危機であるとされる絶滅危惧ＩＢ類、および危急であるとされる絶滅危惧ＩＩ類に含まれる動物である。

また、検査対象となるがんは、がんに罹患した動物個体が、線虫の誘引行動を引き起こす、または線虫の忌避行動を引き起こす尿を作り出すことになるがんであれば、特に制限はない。例えば、がんは悪性腫瘍を含み、固形がん、なかでも特に癌腫（上皮由来の悪性腫瘍）および肉腫（非上皮性細胞由来の悪性腫瘍）を検査対象とし得る。また、原発性がんおよび転移性がんの何れでもあり得る。がんとして具体的には、例えば、前立腺がん、舌がん、喉頭がん、食道がん、頸動脈小体腫瘍、胃がん、肺がん、肺腫瘤、乳がん、胸腺腫、心膜腫瘍、大腸がん、肝臓がん、肝細胞がん、腎臓がん、胆管がん、膵臓がん、膀胱がん、精巣がん、子宮頚がん、卵巣がん、扁平上皮がん、悪性黒色腫、骨肉腫、関節腫瘍および脳腫瘍等であり得る。

試験終了後、落とし込み槽中に捕捉された線虫の数に基づき、被験者ががんに罹患している可能性があるか否かを判断する。例えば、化学走性指標（Ｃ．Ｉ．）を求め、これが試料の濃度ごとに予め定めた閾値以上または以下である場合に、被験者ががんに罹患している可能性があると判断し、閾値を下回るまたは上回る場合には、がんに罹患している可能性は低いと判断することができる。典型的には、用いる試料がごく高濃度の試料（例えば、採取した尿原液）の場合、化学走性指標（Ｃ．Ｉ．）が予め定めた閾値以上であることを、がんに罹患している可能性があるとする判断の基準とすることができる。一方で、用いる試料がごく低濃度の試料（例えば、ごく低濃度となるように尿原液を希釈した尿希釈液）の場合、化学走性指標（Ｃ．Ｉ．）が予め定めた閾値以下であることを、がんに罹患している可能性があるとする判断の基準とすることができる。

本発明のがん検査方法によれば、サル、マウス、ラットおよびモルモットなどの実験動物を用いた試験および研究において、当該実験動物のがん発症の有無を剖検または画像診断によらず、尿などの体液を試料として簡便かつ定期的に行うことができる。一回限りである剖検を回避できることは、同一個体の病態の継時的な解析が可能となることを意味する。同時に、犠牲を要する実験動物個体数の削減にも繋がる。また、画像診断では観察が不可能な微小ながんの発症確認を可能にするとともに、通常画像診断において実験動物の動きの抑制等の目的で実施される麻酔を不要とし、過剰な麻酔薬の投与による実験動物の予期せぬ死亡および障害を回避することができる。また、例えば、医薬品等の薬剤毒性試験において、実験動物を用いた当該薬剤の発がんリスクの評価および担がんマウスを用いた当該薬剤の抗がん効果評価等に本発明のがん検査方法を適用でき、簡便かつ定期的に薬剤毒性試験の評価を実施することが可能となる。また、放射線被ばくおよび老化等、種々の要因に着目した発がんリスク研究において、実験動物の発がんの確認に本発明のがん検査方法を適用できる。

本実施形態に係るがん検査方法では、線虫トラップ用プレートを利用するため、簡便に、かつ評価精度に優れた検査を行うことができる。

なお、本実施形態においては、がん検査方法について説明したが、対象の特定の体液に関し、健常者と異なる状態となっている動物個体の体液では、線虫の誘引行動および忌避行動に変化が生じるという場合には、上述のがん検査方法と同様にして、被験者の生理状態を判別することができる。したがって、線虫の応答評価方法の一態様としては、被験物が哺乳類の体液であり得る。体液としては特に限定されないが、尿、汗、涙、血液、唾液および粘液等、対象となる哺乳類からの採取が容易な体液が好ましい。

以上のとおり、本実施形態に係る線虫トラップ用プレートおよびこれを利用した応答評価は、被験物および温度に誘引された、またこれらを忌避した線虫が落とし込み槽中に一度落ちると固体培地上に戻れないことを利用して、線虫をトラップするものである。そのため、誘引されてまたは忌避して落とし込み槽中に捕捉された線虫の数を経過時間によらず正確に評価することができる。また、捕捉された線虫の数が時間経過に伴って増えることはあっても、減ることはない。そのため、応答の評価は、試験液および対照となる液体が蒸発する時間を考慮して、概ね試験開始後数分後から１日後程度までの間で設定すればよく、評価精度に大きくは影響しない。したがって、試験実施者の負担が飛躍的に改善される。さらに、従来の化学走性試験法において誘引されたエリアに線虫を留めるために用いていた麻酔薬が不要となり、特定の物質および温度への誘引あるいは忌避の応答を純粋に評価できるようになる。さらに、落とし込み槽内に試験液を注入する方法であれば、嗅覚試験における被験物が味のある物質であっても、その味にかかわらず匂いに対する応答だけを調べることができる。このことは、糖尿病に罹患した被験者の尿のように、一般に糖度の高い試料であっても、試料の味が線虫の嗅覚応答に及ぼす影響を考慮する必要がないことを意味する。さらに、落とし込み槽を設けて液体を満たすだけで準備ができ、試験自体を大幅に効率化することができる。

また、固体培地全体ではなく、落とし込み槽の中またはトラップされた線虫を回収したチューブ等の中を撮像または観察し、落とし込み槽の中またはチューブ等の中の線虫の数を測定すればよく、撮像または観察すべき範囲が狭い範囲に限られる。したがって、応答を簡便に評価でき、大幅に効率化することができる。

さらに、蛍光を発するように遺伝子組換えを行った遺伝子組換え線虫を用いた場合には、線虫が捕捉された落とし込み槽中またはトラップされた線虫を回収したチューブ等の中を蛍光撮像することで、蛍光強度から槽の中またはチューブ等の中の線虫の数を算出することができる。予め蛍光強度と個体数とのキャリブレーションを行っておくことで、落とし込み槽中に捕捉された線虫の数を精度よく算出できるため、試験ごとに撮像した画像から線虫の数を手作業で計数する必要がなくなる。そのため、結果の判明までの時間が大幅に短縮され、試験を大幅に省力化できる。

以上に示した本実施形態に係る線虫トラップ用プレートおよびこれを利用した各技術は、医学および医療、ライフサイエンス、獣医学および獣医療、農林業、食品、量子科学、ならびに環境分野等の各種産業分野での利用が可能である。特に、尿を用いる非侵襲的がん検査方法の確立による医学および医療分野ならびに獣医学および獣医療分野での本発明の利用価値は極めて高い。本実施形態に係る線虫トラップ用プレートを利用した非侵襲的検査方法を用いての、ヒトをはじめとする哺乳類のがんの早期発見・診断およびがんの治療効果のモニタリングの確立は、予防医療・予防獣医療およびがん治療フォローアップに革新をもたらすものと期待される。また、食品および環境等の分野においては、被験物に対する線虫の忌避行動に着目し、生物に毒性のある物質の探索等への応用が期待される。さらには、それぞれの試験に適した線虫を選抜するための線虫のスクリーニングにも利用可能である。

以下に実施例を示し、本発明の実施の形態についてさらに詳しく説明する。もちろん、本発明は以下の実施例に限定されるものではなく、細部については様々な態様が可能であることはいうまでもない。さらに、本発明は上述した実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、それぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された文献の全てが参考として援用される。

以下に示す各実施例では、特に断らない限り、線虫としてＣ．エレガンスを用いて各試験を行った。また、各実施例では、線虫トラップ用プレートの容器として市販の円形プラスチックディッシュを使用することとし、そのサイズ、寒天を主とする固体培地の容量（ボリューム）、および形成する落とし込み槽の数は、試験の目的および取得した試料の容量（ボリューム）等を踏まえて、適宜設定した。何れの場合も落とし込み槽は直径約５ｍｍの円筒形とした。使用したプレートの詳細を表１に示す。以下では、表１に示すプレートの名称（プレートＡ１、プレートＡ２、プレートＢ１、プレートＢ２、プレートＢ３、プレートＢ４、プレートＢ５）を用いて説明する。

〔実施例１．揮発性物質に対する線虫の応答評価試験１〕
揮発性物質の一種であるジアセチル（１５℃におけるモル濃度１１．５Ｍ）およびジアセチルを１０倍から１０００００倍まで５段階に希釈した希釈液を用いて、揮発性物質に対する線虫の応答評価試験を行った。まず、固体培地の左側に落とし込み槽２ａを外周に沿って２つ並べて設け、右側の対照位置に落とし込み槽２ｂを同様にして２つ設けたプレートＡ１を作製した。左側の落とし込み槽２ａ内に試験対象の液体（「試験液」と示すことがある。）を満たし、右側の落とし込み槽２ｂ内に対照となる緩衝液を満たした。本実施例における試験液は、上述のとおり、揮発性物質の一種であるジアセチルの原液またはその希釈液である。なお、希釈には対照となる緩衝液を使用した。次いで、緩衝液で予め洗浄した１５０匹程度の線虫をプレートの中央に放し、プレートにカバーを被せてテープで密封した上で、遮光環境下で少なくとも１時間静置した後に、落とし込み槽２ａ、２ｂを顕微鏡下で撮像した。図７および図８に一例を示す試験の結果の画像をもとに落とし込み槽２ａ、２ｂの中に捕捉された線虫の数を計数した。

（結果）
試験液を満たした左側の２つの落とし込み槽２ａのそれぞれに捕捉された線虫の合計数をＮ_１とし、対照の緩衝液を満たした右側の２つの落とし込み槽２ｂのそれぞれに捕捉された線虫の合計数をＮ_２とし、下記式で求められる値を化学走性指標（Ｃ．Ｉ．）と定義し、応答を評価した。
化学走性指標＝（Ｎ_１－Ｎ_２）／（Ｎ_１＋Ｎ_２）
正の値は左側の落とし込み槽２ａ、すなわちジアセチルへの誘引を意味し、負の値は落とし込み槽２ａからの逃避を意味する。なお、試験は、試験液として、ジアセチルの原液（１５℃におけるモル濃度１１．５Ｍ）およびその５段階の希釈液を用い、全６濃度の試験液について実施した。独立して行った３回の試験におけるＣ．Ｉ．の値を、それぞれ図９の（ａ）～（ｃ）に示す。また、図１０にその平均値を示す。

図９の（ａ）～（ｃ）に示すとおり、実施した３回全てにおいて、６段階の希釈濃度のうち、濃い方から２段階の濃度では負の値となり、線虫がジアセチルから逃避したことが示された。一方、これ以外の４段階の希釈では正の値となり、線虫がジアセチルに誘引されたことが示された。また、図９の（ａ）～（ｃ）に示した各試験の結果と、図１０に示す３回の試験の結果の平均は、同様の傾向を示したことから、本発明によれば、このような物質濃度に応じた線虫の応答変化を感度よく、かつ再現性よく、定量できることが明らかである。

〔比較例１．従来法に基づく揮発性物質に対する線虫の応答評価試験〕
比較例として、従来の化学走性試験法（例えば、非特許文献１）に基づく線虫の応答評価を行った。従来法に基づく試験には、落とし込み槽２ａおよび落とし込み槽２ｂが形成されていないことを除いて、実施例１の試験で用いたプレートＡ１と同一であるプレート（以下、「アッセイプレート」ということがある。）を用い、試験を実施した。試験液は実施例１と同じく、ジアセチルの原液および５段階の希釈液を用いた。アッセイプレートの中心の左側半径３ｃｍに位置する２か所に試験液を１滴ずつ滴下し（試験液スポット）、中心の右側半径３ｃｍに位置する点対称の位置（対照スポット）に、対照となる緩衝液を滴下した。次いで、４つのスポットに麻酔薬の一種である０．５Ｍのアジ化ナトリウムを１滴ずつ滴下した。滴下した液体が乾く、またはアッセイプレートに満たされた固体培地に染み込むまで、アッセイプレートにカバーを被せて静置した。その後、緩衝液で予め洗浄した１００匹程度の線虫をアッセイプレートの中央に放し、アッセイプレートにカバーを被せてテープで密封した上で、遮光環境下で少なくとも１時間静置した後に、アッセイプレート全体を底面から撮像した。図１１に一例を示すアッセイプレート全体を撮像した画像をもとに左側の２つの試験液スポットの同心円状の試験液エリアと、右側の２つの対照スポットの同心円状の対照エリア内のそれぞれに、麻酔固定された線虫の数を計数した。各エリアの設定は、従来公知の線虫の化学走性試験法に従った。

（結果）
試験液エリア内の線虫の数をＮ_１とし、対照エリア内の線虫の数をＮ_２とし、上記と同じ化学走性指標（Ｃ．Ｉ．）を用いて、線虫の応答を評価した。正の値は試験液エリア、すなわちジアセチルへの誘引を意味し、負の値は試験液エリアからの逃避を意味する。独立して行った３回の試験におけるＣ．Ｉ．の値を、それぞれ図１２の（ａ）～（ｃ）に示す。また、図１３にその平均値を示す。

図１２の（ａ）～（ｃ）に示すとおり、従来法では、実施した３回の試験における用量応答が異なり、大きなばらつきが認められた。特に、原液および希釈倍率の大きな試験液を用いた場合に、試験ごとに、正の値となる場合と負の値となる場合とが混在し、安定性を欠いた。図１３に示す３回の試験におけるＣ．Ｉ．の平均値は、必ずしも個別の試験の結果をよく反映したものとはなっておらず、このような再現性の低い従来法では、定量性に大きな課題があることは明らかである。

〔実施例２．揮発性物質に対する線虫の応答評価試験２〕
プレートの厚さの違いによって線虫の応答が変わるのかを調べる目的で、本実施例を行った。具体的には、プレートのサイズおよび形状、落とし込み槽の形状は実施例１で作製したプレートＡ１と同じだが、固体培地の容量（ボリューム）が概ね２倍であるプレートＡ２、すなわち落とし込み槽２ａおよび２ｂに満たすことができる液体の容量（ボリューム）が実施例１におけるプレートの概ね２倍となるプレートを作製した。左側の落とし込み槽２ａ内に試験液を満たし、右側の落とし込み槽２ｂ内に対照となる緩衝液を満たした。本実施例における試験液は、揮発性物質であるジアセチルの希釈液で、希釈には対照となる緩衝液を使用した。左側の落とし込み槽２ａ内に試験液を満たし、右側の落とし込み槽２ｂ内に対照となる緩衝液を満たした。次いで、緩衝液で予め洗浄した１５０匹程度の線虫をプレートの中央に放し、プレートにカバーを被せてテープで密封した上で、遮光環境下で少なくとも１時間静置した後に、各落とし込み槽２ａ、２ｂを顕微鏡下で撮像した。画像をもとに各落とし込み槽２ａ、２ｂの中に捕捉された線虫の数を計数した。

（結果）
実施例１と同様に化学走性指標（Ｃ．Ｉ．）を求め、線虫の応答を評価した。正の値は左側の落とし込み槽２ａ、すなわちジアセチルへの誘引を意味し、負の値は落とし込み槽２ａからの逃避を意味する。なお、試験は、実施例１と同様に、ジアセチルの原液（１５℃におけるモル濃度１１．５Ｍ）と当該原液を１０倍から１０００００倍まで５段階に希釈した、全６濃度の試験液について実施した。独立して行った３回の試験におけるＣ．Ｉ．の値を、それぞれ図１４の（ａ）～（ｃ）に示す。また、図１５にその平均値を示す。

図１４、図１５に示すとおり、試験した６段階の希釈濃度全てにおいて、落とし込み槽２ａおよび２ｂの深さならびに培地の厚さが本例の約半分であるプレートＡ１を用いた実施例１の結果と同様の結果となった。このことから、プレートの厚さが異なっても、すなわち、落とし込み槽の深さが異なっても、揮発性物質の応答評価に大きな影響が生じないことは明らかである。

〔実施例３．揮発性物質に対する線虫の応答評価試験３〕
直径が実施例１で使用したプレートＡ１の約２／３であり、固体培地の左側に落とし込み槽２ａを１つ設け、右側の対照位置に落とし込み槽２ｂを１つ設けた、図１に示すようなプレートＢ１を作製した。左側の落とし込み槽２ａ内に試験液を満たし、右側の落とし込み槽２ｂ内に対照となる超純水を満たした。本実施例における試験液は、ベンズアルデヒドの希釈液である。次いで、緩衝液で予め洗浄した１００匹程度の線虫をプレートの中央に放し、プレートにカバーを被せてテープで密封した上で、遮光環境下で１時間静置した後に、落とし込み槽２ａ、２ｂを顕微鏡下で撮像した。画像をもとに落とし込み槽２ａ、２ｂの中に捕捉された線虫の数を計数した。

（結果）
試験液を満たした左側の落とし込み槽２ａの中に捕捉された線虫の数をＮ_１とし、右側の対照の落とし込み槽２ｂの中に捕捉された線虫の数をＮ_２とし、実施例１と同様にＣ．Ｉ．を求め、線虫の応答を評価した。正の値は左側の落とし込み槽２ａ、すなわちベンズアルデヒドへの誘引を意味し、負の値は落とし込み槽２ａからの逃避を意味する。なお、試験は、ベンズアルデヒドの原液（１５℃におけるモル濃度９．８Ｍ）を１００００倍から１０００００倍までの３段階に希釈した、全３濃度の試験液について実施した。図１６に独立して行った４回の試験におけるＣ．Ｉ．の平均値を示す。図中のエラーバーは標準偏差を示す。

図１６に示すとおり、試験した３段階の希釈濃度の何れでも、Ｃ．Ｉ．が０．９以上と、最大値の１．０に迫る値となった。すなわち、線虫がベンズアルデヒドに誘引されたことが示された。この結果は、従来法による化学走性試験の結果の傾向と同様である。

〔実施例４．前立腺がん患者の尿に対する線虫の応答評価試験〕
実施例３で作製したのと同じプレートＢ１を作製した。固体培地の左側の落とし込み槽２ａ内に試験液を満たし、右側の落とし込み槽２ｂ内に対照となる生理食塩水を満たした。本実施例における試験液は、放射線または薬剤による治療を行う前の前立腺がん患者１２名から採取した尿の混合液を生理食塩水で希釈した溶液である。次いで、緩衝液で予め洗浄した１００匹程度の線虫を中央に放した。プレートにカバーを被せてテープで密封した上で、遮光環境下で１時間静置した後に、落とし込み槽２ａ、２ｂを顕微鏡下で撮像し、画像をもとに落とし込み槽２ａ、２ｂの中に捕捉された線虫の数を計数した。

（結果）
実施例３と同様に化学走性指標（Ｃ．Ｉ．）を求め、線虫の応答を評価した。正の値は左側の落とし込み槽２ａ、すなわち前立腺がん患者の尿への誘引を意味し、負の値は落とし込み槽２ａからの逃避を意味する。なお、試験は、混合尿と、当該原液を１０倍から１０００００倍まで５段階に希釈した、全６濃度の試験液について実施した。図１７に独立して行った２回の試験におけるＣ．Ｉ．の平均値を示す。

図１７に示すとおり、試験した６段階の希釈濃度で、Ｃ．Ｉ．が正の値を示した。すなわち、線虫が前立腺がん患者の尿に誘引されたことが示された。この結果は、個別の前立腺がん患者から採取した尿を単独で被験物とした場合における、従来法による化学走性試験の結果の傾向と同様である。また、ここでは詳細な結果を示さないが、各前立腺がん患者の尿を混合せず個別に希釈して用いた試験でも、混合した場合と同様に尿に誘引される傾向が観られることを確認した。

〔実施例５．がん罹患歴のない健常者の尿に対する線虫の応答評価試験〕
実施例３で作製したのと同じプレートＢ１を作製した。固体培地の左側の落とし込み槽２ａ内に試験液を満たし、右側の落とし込み槽２ｂ内に対照となる生理食塩水を満たした。本実施例における試験液は、がん罹患歴のない健常者男性１２名から採取した尿の混合液を生理食塩水で希釈した溶液である。次いで、緩衝液で予め洗浄した１００匹程度の線虫を中央に放した。プレートにカバーを被せてテープで密封した上で、遮光環境下で１時間静置した後に、落とし込み槽２ａ、２ｂを顕微鏡下で撮像し、画像をもとに落とし込み槽２ａ、２ｂの中に捕捉された線虫の数を計数した。

（結果）
実施例３と同様に化学走性指標（Ｃ．Ｉ．）を求め、線虫の応答を評価した。正の値は左側の落とし込み槽２ａ、すなわち健常者尿への誘引を意味し、負の値は落とし込み槽２ａからの逃避を意味する。なお、試験は、混合尿と、当該原液を１０倍から１０００００倍まで５段階に希釈した、全６濃度の試験液について実施した。図１８に独立して行った２回の試験におけるＣ．Ｉ．の平均値を示す。

図１８に示すとおり、試験した６段階の希釈濃度で、Ｃ．Ｉ．が負の値を示した。すなわち、線虫ががん罹患歴のない健常者の尿から逃避したことが示された。この結果は、実施例４のがん患者尿に対する誘引応答とは逆の忌避応答であり、個別の健常者から採取した尿を単独で被験物とした場合における、従来法による化学走性試験の結果の傾向と同様である。また、ここでは詳細な結果を示さないが、各健常者の尿を混合せず個別に希釈して用いた試験でも、混合した場合と同様に尿から忌避する傾向が観られることを確認した。

なお、実施例４および実施例５の結果は、個別の対象者から採取した尿を単独で被験物とした場合、または複数名の対象者から採取した尿を混合して被験物とした場合の何れであっても、線虫の応答評価試験を実施可能であることを示している。

また、実施例４および実施例５の結果から、例えばこれらの試験条件ではゼロを閾値として、化学走性指標（Ｃ．Ｉ．）が正の値となる場合はがん陽性、負の値となる場合はがん陰性とみなして、がん罹患可能性を検査することができる。また、実施例６以降の尿に対する応答評価試験においても、適宜閾値を設定し、がん罹患可能性を検査することができる。なお、判定条件は試料の種類、容量（ボリューム）、および試験条件等に依存するため、がん検査を行う場合の閾値は、試験の内容、条件ごとに設定されるものである。

〔実施例６．がん罹患歴のない雄イヌの尿に対する線虫の応答評価試験〕
プレートのサイズおよび形状、落とし込み槽のサイズおよび形状は実施例３で作製したプレートと同じだが、落とし込み槽の数が４つであるプレートＢ２、すなわち固体培地の左側に落とし込み槽２ａを２つ設け、右側の対照位置に落とし込み槽２ｂを２つ設けたプレートを作製した。左側の各落とし込み槽２ａ内に試験液を満たし、右側の各落とし込み槽２ｂ内に対照となる生理食塩水を満たした。本実施例における試験液は、がん罹患歴のない雄イヌから採取した尿である。次いで、緩衝液で予め洗浄した１５０匹程度の線虫を中央に放した。プレートにカバーを被せてテープで密封した上で、遮光環境下で１時間静置した後に、各落とし込み槽２ａ、２ｂを顕微鏡下で撮像し、画像をもとに各落とし込み槽２ａ、２ｂの中に捕捉された線虫の数を計数した。

（結果）
実施例１と同様に化学走性指標（Ｃ．Ｉ．）を求め、線虫の応答を評価した。正の値は左側の落とし込み槽２ａ、すなわち健常な雄イヌの尿の匂いへの誘引を意味し、負の値は落とし込み槽２ａからの逃避を意味する。なお、試験は、尿原液と、当該原液を１０倍から１０００００倍まで５段階に希釈した、全６濃度について実施した。結果を図１９に示す。

図１９に示すとおり、試験した６段階の希釈濃度で、Ｃ．Ｉ．が負の値を示した。すなわち、線虫ががん罹患歴のない雄イヌの尿から逃避したことが示された。この結果は、実施例３のがん罹患歴のない健常者の尿に対する応答と類似の忌避応答である。以上より、本発明によれば、ヒトの試料と同様の方法で別種哺乳類の検体を用いたがん検査を行うことが可能であることを確認した。また、実施例５の結果を踏まえれば、落とし込み槽の数が２つであるプレートを用いても４つであるプレートを用いても、同様の検査結果が得られることは明らかである。

〔実施例７．がん罹患歴のない雌イヌの尿に対する線虫の応答評価試験〕
実施例６で作製したのと同じプレートＢ２を作製した。左側の各落とし込み槽２ａ内に試験液を満たし、右側の各落とし込み槽２ｂ内に対照となる生理食塩水を満たした。本実施例における試験液は、がん罹患歴のない雌イヌから採取した尿である。次いで、緩衝液で予め洗浄した１５０匹程度の線虫を中央に放した。プレートにカバーを被せてテープで密封した上で、遮光環境下で１時間静置した後に、各落とし込み槽２ａ、２ｂを顕微鏡下で撮像し、画像をもとに各落とし込み槽２ａ、２ｂの中に捕捉された線虫の数を計数した。

（結果）
実施例１と同様に化学走性指標（Ｃ．Ｉ．）を求め、線虫の応答を評価した。正の値は左側の落とし込み槽２ａ、すなわち健常な雌イヌの尿への誘引を意味し、負の値は落とし込み槽２ａからの逃避を意味する。なお、試験は、尿原液と、当該原液を１０倍から１０００００倍まで５段階に希釈した、全６濃度の試験液について実施した。結果を図２０に示す。

図２０に示すとおり、試験した６段階の希釈濃度で、Ｃ．Ｉ．が負の値を示した。すなわち、線虫ががん罹患歴のない雌イヌの尿から逃避したことが示された。この結果は、実施例５のがん罹患歴のない健常者の尿および実施例６のがん罹患歴のない健常な雄イヌの尿に対する応答と類似の忌避応答である。以上より、本発明によれば、ヒトの試料と同様の方法で、別種哺乳類の検体を用いたがん検査を性別にかかわらず行うことが可能であることを確認した。

〔実施例８．がんに罹患した複数のイヌの尿に対する線虫の応答評価試験〕
実施例６で作製したのと同じプレートＢ２を主として作製した。この他、得られた試験液の容量（ボリューム）が少量である場合には、プレートのサイズおよび形状、落とし込み槽の形状はプレートＢ２と同じだが、固体培地の容量（ボリューム）が３／１０であるプレートＢ３を限定的に作製して使用した。左側の各落とし込み槽２ａ内に試験液を満たし、右側の各落とし込み槽２ｂ内に対照となる生理食塩水を満たした。本実施例における試験液は、がんに罹患した１１匹のイヌから採取した尿である。次いで、緩衝液で予め洗浄した１５０匹程度の線虫を中央に放した。プレートにカバーを被せてテープで密封した上で、遮光環境下で少なくとも１時間静置した後に、各落とし込み槽２ａ、２ｂを顕微鏡下で撮像し、画像をもとに各落とし込み槽２ａ、２ｂの中に捕捉された線虫の数を計数した。

（結果）
実施例１と同様に化学走性指標（Ｃ．Ｉ．）を求め、線虫の応答を評価した。正の値は左側の落とし込み槽２ａ、すなわちがんに罹患したイヌの尿への誘引を意味し、負の値は落とし込み槽２ａからの逃避を意味する。なお、試験は、がんに罹患した１１匹のイヌの尿について独立に実施した。画像診断等により確定している１１匹のイヌのがんの種類はそれぞれ、胸腺腫、頸動脈小体腫瘍、下垂体腫瘍、肺がん、心膜腫瘍および化学受容体腫瘍の併発、骨肉腫（２匹）、肝細胞がん（２匹）、膝関節腫瘍、前立腺がんであった。これらの尿を用いて、それぞれ独立して行った３回の試験におけるＣ．Ｉ．の平均値を図２１に示す。

図２１に示すとおり、試験したがんに罹患した１１匹のイヌの尿全てで、Ｃ．Ｉ．が正の値を示した。すなわち、線虫はがんに罹患したイヌの尿に誘引されたことが示された。この結果から、がんの種類によらず、尿に誘引されることは明らかである。また、１１匹には、雄と雌とが混在していた。すなわち、本発明によれば、性別を問わずイヌの多様な種類のがんを検出可能であることを確認した。

〔実施例９．がん罹患歴のない複数のイヌの尿に対する線虫の応答評価試験〕
実施例６で作製したのと同じプレートＢ２を主として作製した。この他、得られた試験液の容量（ボリューム）が少量である場合には、プレートのサイズおよび形状、落とし込み槽のサイズおよび形状はプレートＢ２と同じだが、落とし込み槽の数が２つであるプレートＢ１ないし、プレートのサイズおよび形状、落とし込み槽の形状はプレートＢ２と同じだが、固体培地の容量（ボリューム）が３／１０であるプレートＢ３を限定的に作製して使用した。左側の各落とし込み槽２ａ内に試験液を満たし、右側の各落とし込み槽２ｂ内に対照となる生理食塩水を満たした。本実施例における試験液は、がん罹患歴のない６匹のイヌから採取した尿である。次いで、緩衝液で予め洗浄した１５０匹程度の線虫を中央に放した。プレートにカバーを被せてテープで密封した上で、遮光環境下で少なくとも１時間静置した後に、各落とし込み槽２ａ、２ｂを顕微鏡下で撮像し、画像をもとに各落とし込み槽２ａ、２ｂの中に捕捉された線虫の数を計数した。

（結果）
落とし込み槽が４つのプレートでは実施例１と同様に、落とし込み槽が２つのプレートでは実施例３と同様に化学走性指標（Ｃ．Ｉ．）を求め、線虫の応答を評価した。正の値は左側の落とし込み槽２ａ、すなわちがん罹患歴のないイヌの尿への誘引を意味し、負の値は落とし込み槽２ａからの逃避を意味する。なお、試験は、がん罹患歴のない６匹のイヌの尿について独立に実施した。６匹のうち、高齢の健常個体が２匹、１歳未満の健常個体が２匹、神経障害および特発性後肢麻痺を有する個体が１匹、良性の膣腫瘍を有する個体が１匹であった。これらの尿を用いて、それぞれ独立して行った２回ないし３回の試験におけるＣ．Ｉ．の平均値を図２２に示す。

図２２に示すとおり、試験したがん罹患歴のない６匹のイヌの尿全てで、Ｃ．Ｉ．が負の値を示した。すなわち、線虫ががんに罹患歴のないイヌの尿から逃避したことが示された。以上より、本発明によれば、がん罹患歴のない健常イヌだけでなく、神経疾患や良性腫瘍を有するイヌについても、がんに罹患しているイヌとして誤検出する可能性が低いことを確認した。

〔実施例１０．がんに罹患した複数のネコの尿に対する線虫の応答評価試験〕
実施例６で作製したのと同じプレートＢ２を作製した。左側の各落とし込み槽２ａ内に試験液を満たし、右側の各落とし込み槽２ｂ内に対照となる生理食塩水を満たした。本実施例における試験液は、がんに罹患した２匹のネコから採取した尿である。次いで、緩衝液で予め洗浄した１５０匹程度の線虫を中央に放した。プレートにカバーを被せてテープで密封した上で、遮光環境下で少なくとも１時間静置した後に、各落とし込み槽２ａ、２ｂを顕微鏡下で撮像し、画像をもとに各落とし込み槽２ａ、２ｂの中に捕捉された線虫の数を計数した。

（結果）
実施例１と同様に化学走性指標（Ｃ．Ｉ．）を求め、線虫の応答を評価した。正の値は左側の落とし込み槽２ａ、すなわちがんに罹患したネコの尿への誘引を意味し、負の値は落とし込み槽２ａからの逃避を意味する。なお、試験は、がんに罹患した２匹のネコの尿について独立に実施した。画像診断等により確定している２匹のネコのがんはそれぞれ、扁平上皮がん、肺腫瘤であった。これらの尿を用いて、それぞれ独立して行った３回の試験におけるＣ．Ｉ．の平均値を図２３に示す。

図２３に示すとおり、試験したがんに罹患した２匹のネコの尿の何れでも、Ｃ．Ｉ．が正の値を示した。すなわち、線虫ががんに罹患したネコの尿に誘引されたことが示された。この結果から、がんの種類によらず、尿に誘引されることは明らかである。以上より、本発明によれば、ネコのがんを検出することが可能であることを確認した。

〔実施例１１．がん罹患歴のない複数のネコの尿に対する線虫の応答評価試験〕
プレートのサイズおよび形状、落とし込み槽の形状は実施例６で作製したプレートと同じだが、固体培地の容量（ボリューム）が３／１０であるプレートＢ３を作製した。左側の各落とし込み槽２ａ内に試験液を満たし、右側の各落とし込み槽２ｂ内に対照となる生理食塩水を満たした。本実施例における試験液は、がん罹患歴のない３匹のネコから採取した尿である。次いで、緩衝液で予め洗浄した１５０匹程度の線虫を中央に放した。プレートにカバーを被せてテープで密封した上で、遮光環境下で少なくとも１時間静置した後に、各落とし込み槽２ａ、２ｂを顕微鏡下で撮像し、画像をもとに各落とし込み槽２ａ、２ｂの中に捕捉された線虫の数を計数した。

（結果）
実施例１と同様に化学走性指標（Ｃ．Ｉ．）を求め、線虫の応答を評価した。正の値は左側の落とし込み槽２ａ、すなわち、がん罹患歴のないネコの尿への誘引を意味し、負の値は落とし込み槽２ａからの逃避を意味する。なお、試験は、がん罹患歴のない３匹のネコの尿について独立に実施した。３匹のうち、１歳未満の健常個体が２匹、水頭症を有する個体が１匹であった。これらの尿を用いて、それぞれ独立して行った３回の試験におけるＣ．Ｉ．の平均値を図２４に示す。

図２４に示すとおり、試験したがん罹患歴のない３匹のネコの尿全てで、Ｃ．Ｉ．が負の値を示した。すなわち、線虫ががん罹患歴のないネコの尿から逃避したことが示された。以上より、本発明によれば、がん罹患歴のない健常ネコだけでなく、がん以外の疾患を有するネコについても、がんに罹患しているネコとして誤検出する可能性が低いことを確認した。

〔実施例１２．がんに罹患した複数のラットの尿に対する線虫の応答評価試験〕
プレートのサイズおよび形状ならびに落とし込み槽の形状は実施例３で作製したプレートＢ２と同じだが、固体培地の容量（ボリューム）が３／１０であるプレートＢ４を作製した。左側の落とし込み槽２ａ内に試験液を満たし、右側の落とし込み槽２ｂ内に対照となる生理食塩水を満たした。本実施例における試験液は、乳腺がんに罹患した２匹のラットから採取した尿である。次いで、緩衝液で予め洗浄した１００匹程度の線虫を中央に放した。プレートにカバーを被せてテープで密封した上で、遮光環境下で少なくとも１時間静置した後に、落とし込み槽２ａ、２ｂを顕微鏡下で撮像し、画像をもとに落とし込み槽２ａ、２ｂの中に捕捉された線虫の数を計数した。

（結果）
実施例３と同様に化学走性指標（Ｃ．Ｉ．）を求め、応答を評価した。正の値は左側の落とし込み槽２ａ、すなわちがんに罹患したラットの尿への誘引を意味し、負の値は落とし込み槽２ａからの逃避を意味する。なお、試験は、乳腺がんに罹患した２匹のラットの尿について独立に実施した。これらの尿を用いて、それぞれ独立して行った３回の試験におけるＣ．Ｉ．の平均値を図２５に示す。

図２５に示すとおり、試験した２匹の乳腺がんに罹患したラットの尿の何れでも、Ｃ．Ｉ．が正の値を示した。すなわち、線虫が乳腺がんに罹患したラットの尿に誘引されたことが示された。以上より、本発明によれば、ラットのがんを検出することが可能であることを確認した。

〔実施例１３．がん罹患歴のない複数のラットの尿に対する線虫の応答評価試験〕
実施例１２で作製したのと同じプレートＢ４を作製した。左側の落とし込み槽２ａ内に試験液を満たし、右側の落とし込み槽２ｂ内に対照となる生理食塩水を満たした。本実施例における試験液は、がん罹患歴のない２匹のラットから採取した尿である。次いで、緩衝液で予め洗浄した１００匹程度の線虫を中央に放した。プレートにカバーを被せてテープで密封した上で、遮光環境下で少なくとも１時間静置した後に、落とし込み槽２ａ、２ｂを顕微鏡下で撮像し、画像をもとに落とし込み槽２ａ、２ｂの中に捕捉された線虫の数を計数した。

（結果）
実施例３と同様に化学走性指標（Ｃ．Ｉ．）を求め、応答を評価した。正の値は左側の落とし込み槽２ａ、すなわちがん罹患歴のないラットの尿への誘引を意味し、負の値は落とし込み槽２ａからの逃避を意味する。２匹のうち、健常個体が１匹、良性の線維腫を有する個体が１匹であった。これらの尿を用いて、それぞれ独立して行った３回の試験におけるＣ．Ｉ．の平均値を図２６に示す。

図２６に示すとおり、試験したがん罹患歴のない２匹のラットの尿の何れでも、Ｃ．Ｉ．が負の値を示した。すなわち、線虫ががん罹患歴のないラットの尿から逃避したことが示された。以上より、本発明によれば、がん罹患歴のないラットとがんに罹患しているラットとを区別できることを確認した。

〔実施例１４．水溶性物質に対する線虫の応答評価試験〕
水溶性物質の一種である塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）を用いて、水溶性物質に対する線虫の応答評価試験を行った。まず、線虫トラップ用プレートＢ４の基材となる固体培地の左側の１か所に、被験物を高濃度で含むプラグを静置した。それにより、当該被験物をプラグから固体培地に拡散させて濃度勾配を形成させた。プラグを一晩静置した後、プラグを固体培地から取り除き、プラグが静置されていた位置をくり抜くことで、落とし込み槽２ａを形成した。さらに、固体培地の右側の対照位置１か所をくり抜くことで落とし込み槽２ｂを形成し、プレートＢ４を完成させた。なお、ＮａＣｌの濃度勾配の形成に用いたプラグは、ＮａＣｌを最終モル濃度が１００ｍＭとなるように含有したことを除いて、線虫トラップ用プレートの固体培地と同一の組成とした固体培地を、直径５ｍｍの円筒状にくり抜いたものである。

落とし込み槽２ａ内および落とし込み槽２ｂ内に超純水を満たした。次いで、緩衝液で予め洗浄した１００匹程度の線虫をプレートの中央に放し、プレートにカバーを被せてテープで密封した上で、遮光環境下で１時間以上静置した後に、落とし込み槽２ａ、２ｂを顕微鏡下で撮像した。画像をもとに落とし込み槽２ａ、２ｂの中に捕捉された線虫の数を計数した。

（結果）
ＮａＣｌの濃度勾配の中心に形成した左側の落とし込み槽２ａの中に捕捉された線虫の数をＮ_１とし、対照の位置に形成した右側の落とし込み槽２ｂの中に捕捉された線虫の合計数をＮ_２とし、下記式で求められる値を化学走性指標（Ｃ．Ｉ．）と定義し、応答を評価した。
化学走性指標＝（Ｎ_１－Ｎ_２）／（Ｎ_１＋Ｎ_２）
正の値は左側の落とし込み槽２ａ、すなわちＮａＣｌへの誘引を意味し、負の値は落とし込み槽２ａからの逃避を意味する。独立して行った３回の試験におけるＣ．Ｉ．の平均値を図２７に示す。

図２７に示すとおり、Ｃ．Ｉ．が正の値を示した。すなわち、線虫がＮａＣｌに誘引されたことが示された。この結果は、従来の化学走性試験法による１００ｍＭのＮａＣｌに対する線虫の味覚試験の結果の傾向と同様である。以上より、本発明によれば、水溶性物質に対する線虫の応答評価を行うことが可能であることを確認した。

〔実施例１５．揮発性物質に対するＣ．エレガンス以外の土壌線虫の応答評価試験〕
Ｃ．エレガンス以外の線虫の応答評価に対する本発明のプレート適用可能性を評価する目的で、本実施例を行った。具体的には、自由生活性の土壌線虫のヘテロ集団Ｍ群（採取地：東京都小笠原村）および自由生活性の土壌線虫のヘテロ集団Ｈ群（採取地：岐阜県高山市）の揮発性物質に対する応答を調べた。実施例１で作製したのと同じプレートＡ１を作製した。左側の落とし込み槽２ａ内に試験液を満たし、右側の落とし込み槽２ｂ内に対照となる緩衝液を満たした。本実施例における試験液は、揮発性物質の一種であるバニリンの希釈液（１ｍＭ）である。次いで、緩衝液で予め洗浄した１５０匹程度の線虫をプレートの中央に放し、プレートにカバーを被せてテープで密封した上で、遮光環境下で少なくとも１時間静置した後に、落とし込み槽２ａ、２ｂを顕微鏡下で撮像した。画像をもとに落とし込み槽２ａ、２ｂの中に捕捉された線虫の数を計数した。

（結果）
実施例１と同様に化学走性指標（Ｃ．Ｉ．）を求め、線虫の応答を評価した。正の値は左側の落とし込み槽２ａ、すなわちバニリンへの誘引を意味し、負の値は落とし込み槽２ａからの逃避を意味する。なお、試験は、線虫Ｍ群および線虫Ｈ群を用いて、独立して行った。試験の結果を図２８に示す。

図２８に示すとおり、東京都小笠原村で採取した自由生活性の土壌線虫集団であるＭ群では、Ｃ．Ｉ．が負の値を示した。すなわち、線虫が食品成分の一種であるバニリンから逃避したことが示された。一方、岐阜県高山市で採取した自由生活性の土壌線虫集団であるＨ群では、Ｃ．Ｉ．が正の値を示した。すなわち、線虫がバニリンに誘引されたことが示された。このことから、由来の異なる自由生活性の土壌線虫には、それぞれ異なる嗜好性が備わっていることが見出された。以上の結果は、本発明によれば、ヘテロな線虫集団から、ある特定の環境に適した線虫のみをその嗜好性に基づいて選抜するスクリーニングを行うことができることを裏付けている。

以上の実施例の結果を踏まえれば、本発明によれば、線虫トラップ用プレートのサイズ、形成した落とし込み槽の数およびサイズ（すなわち、試験液の容量（ボリューム））、試験液とする化学物質溶液および生体試料の種類、当該試験液の希釈に用いる液体の種類、対照となる落とし込み槽に注入する液体の種類、ならびに線虫の種類等にかかわらず、線虫を用いた試験液に対する応答評価試験が行えることが明らかである。特に、試験液が哺乳類の尿の原液またはその希釈液の場合には、その被験者（動物）の動物種、性別、年齢、がんの有無、およびがんの種類等にかかわらず、本発明に基づく線虫の化学走性試験の結果に基づいて精度良くがんの有無を判定することが可能であることが明らかである。

〔実施例１６．線虫の集団の陰影を利用する方法（Ｂ１）による線虫個体数導出のためのキャリブレーションデータの作成〕
固体培地に落とし込み槽２ａを１つ設けたプレートＢ５を作製した。落とし込み槽２ａ内に緩衝液を満たした。次いで、緩衝液で予め洗浄した、実施例１に用いたのと同じ種類の線虫を落とし込み槽２ａ中に、５匹、１０匹、２０匹、３０匹、４０匹、５０匹と順に数を増やして投入し、顕微鏡に搭載したデジタルカメラで当該落とし込み槽の明視野静止画像を３枚ずつ順次撮像した。汎用パーソナルコンピューターにインストールした自作の線虫個体自動計数のための画像解析プログラムを用いて、静止画像における落とし込み槽中の線虫個体に相当する画像の面積、すなわち二値化後の黒色の画素数を算出した。当該画像解析プログラムの処理画面の一例を図２９に示す。

（結果）
落とし込み槽２ａの中に投入された線虫の個体数を横軸、画像解析により導出した線虫個体に相当する黒色画素の画像全体に対する比率を縦軸としてプロットした。結果を図３０に示す。太い破線は、各個体数における３枚の画像から求めた数値の近似曲線であり、キャリブレーションに適用する検量線である。

図３０に示すとおり、落とし込み槽中の線虫個体数と線虫に対応する画像の面積とが比例関係にあり、落とし込み槽の静止画像から、落とし込み槽中に捕捉された線虫の数を推定可能であることは明らかである。

本発明は、医学および医療分野、ライフサイエンス分野、獣医学および獣医療分野、農林分野、食品分野、量子科学および環境分野等の各種産業分野において利用することができる。

１ 線虫トラップ用プレート
２ａ、２ｂ、２ｃ、２ｄ 落とし込み槽（凹部）
３ カバー
４ａ、４ｂ 貫通孔（孔）
５ 底面
６ａ、６ｂ チューブ（筒状部材）
１０、１０ａ 容器
１１ 固体培地（固相）
２０ａ～ｃ くり抜き具
２１ 柄
２２ａ～ｂ 筒状部
２３ 針
３０ 本体部分（本体部）
３１ 板状部材
３２ 差し込み孔
４０ａ～ｄ 突起
４１ａ～ｄ 突起本体部
４２、４５ 差し込み部
４３ 固定ピン
４４ クリップ部
４６ 滑り止め防止用キャップ
５０ 形成型
５１ 本体外枠（本体部）
５２ 嵌め込み部
５３ 突起

Claims (21)

1. 容器および該容器内に形成された固相を備え、
   上記固相は、その表面上で線虫が移動可能なものであり、
   上記固相の上記表面に、上記線虫を捕捉するための少なくとも２つの凹部が形成されていることを特徴とする線虫トラップ用プレート。
2. 上記容器の底面における、波長３６０ｎｍ～１５００ｎｍの光の透過率が、７０％以上であることを特徴とする請求項１に記載の線虫トラップ用プレート。
3. 請求項１または２に記載の線虫トラップ用プレートを作製するための形成型であって、
   本体部と、
   上記本体部に設けられた、上記少なくとも２つの凹部に対応する少なくとも２つの突起とを備え、
   上記容器に対して固定可能であることを特徴とする形成型。
4. 上記少なくとも２つの突起が、上記本体部から脱着可能であることを特徴とする請求項３に記載の形成型。
5. 線虫トラップ用プレートに使用するための容器であって、
   上記線虫トラップ用プレートは、容器および該容器内に形成された固相を備え、
   上記固相は、その表面上で線虫が移動可能なものであり、
   上記固相の上記表面に、上記線虫を捕捉するための少なくとも１つの凹部が形成されていることを特徴とするトラップ用プレートであり、
   上記容器の底面における、上記凹部が形成される位置に対応する部分に、上記凹部を形成する筒状部材を差し込む孔が形成されており、
   少なくとも上記孔が形成されている部分における上記底面の下側に空隙を有していることを特徴とする容器。
6. 請求項１または２に記載の線虫トラップ用プレートの製造方法であって、
   上記固相に上記少なくとも２つの凹部を形成する工程を含み、
   上記工程では、
   請求項３または４に記載の形成型を上記容器に固定した状態で上記固相を形成するか、または、
   上記容器に上記固相を形成した後に、くり抜くことによって上記少なくとも２つの凹部を形成する
   ことを特徴とする線虫トラップ用プレートの製造方法。
7. 線虫トラップ用プレートの製造方法であって、
   前記線虫トラップ用プレートは、容器および該容器内に形成された固相を備え、
   上記固相は、その表面上で線虫が移動可能なものであり、
   上記固相の上記表面に、上記線虫を捕捉するための少なくとも１つの凹部が形成されていることを特徴とするトラップ用プレートであり、
   上記固相に上記少なくとも１つの凹部を形成する工程を含み、
   上記工程では、
   下端に底部を有し、上端が開口している筒状部材を、請求項５に記載の容器の上記孔に差し込み固定すること、
   上記固相の表面が、上記筒状部材の上端よりも低い位置となるように、上記固相を形成すること、および
   上記固相を形成した後、上記筒状部材の上端が上記固相の表面の位置にくるまで、上記筒状部材を押し下げることによって上記少なくとも１つの凹部を形成する
   ことを特徴とする線虫トラップ用プレートの製造方法。
8. 被験物に対する線虫の応答評価方法であって、
   容器および該容器内に形成された固相を備え、上記固相は、その表面上で線虫が移動可能なものであり、上記固相の上記表面に、上記線虫を捕捉するための少なくとも１つの凹部が形成されていることを特徴とするトラップ用プレートの上記凹部内または上記凹部周辺に被験物が供給された、試験用プレートを準備する工程と、
   上記固相の表面上所定の位置に線虫を供給する工程と、
   一定時間経過後、上記凹部内に捕捉された線虫の数または該線虫の数と相関する要素を計測する工程とを含み、
   上記凹部内には液体が満たされていることを特徴とする線虫の応答評価方法。
9. 上記被験物が、哺乳類の体液を含むことを特徴とする請求項８に記載の線虫の応答評価方法。
10. 上記被験物が、ヒト、イヌ、ネコ、サル、マウス、ラットまたはモルモットの尿を含むことを特徴とする請求項８または９に記載の線虫の応答評価方法。
11. 温度に対する線虫の応答評価方法であって、
    容器および該容器内に形成された固相を備え、上記固相は、その表面上で線虫が移動可能なものであり、上記固相の上記表面に、上記線虫を捕捉するための少なくとも１つの凹部が形成されていることを特徴とするトラップ用プレートの上記凹部内または上記凹部周辺を、目的の温度に調節する工程と、
    上記固相の表面上所定の位置に線虫を供給する工程と、
    一定時間経過後、上記凹部内に捕捉された線虫の数または該線虫の数と相関する要素を計測する工程とを含み、
    上記凹部内には液体が満たされていることを特徴とする線虫の応答評価方法。
12. 上記一定時間経過後、上記凹部を撮像し、得られた画像の画像処理を行うことにより、上記凹部内に捕捉された線虫の数または該線虫の数と相関する要素を計測することを特徴とする請求項８～１１の何れか１項に記載の線虫の応答評価方法。
13. 線虫として蛍光プローブを組み込んだ線虫を使用し、
    凹部内に捕捉された線虫の蛍光強度の総量から捕捉された線虫の数を算出することを特徴とする請求項８～１２の何れか１項に記載の線虫の応答評価方法。
14. 線虫の行動評価方法であって、
    容器および該容器内に形成された固相を備え、上記固相は、その表面上で線虫が移動可能なものであり、上記固相の上記表面に、上記線虫を捕捉するための少なくとも１つの凹部が形成されていることを特徴とするトラップ用プレートの上記固相の表面上所定の位置に線虫を供給する工程と、
    一定時間経過後、上記凹部内に捕捉された線虫の数または該線虫の数と相関する要素を計測する工程とを含み、
    上記凹部内には液体が満たされていることを特徴とする線虫の行動評価方法。
15. 請求項１または２に記載の線虫トラップ用プレートと、
    上記固相上の環境を一定に保つためのカバーであって、波長３６０ｎｍ～１５００ｎｍの光の透過率が７０％以上であるカバーとを備えることを特徴とする線虫トラップ試験キット。
16. 試験に用いられる線虫をさらに含むことを特徴とする請求項１５に記載の線虫トラップ試験キット。
17. 容器および該容器内に形成された固相を備え、上記固相は、その表面上で線虫が移動可能なものであり、上記固相の上記表面に、上記線虫を捕捉するための少なくとも１つの凹部が形成されていることを特徴とするトラップ用プレートの上記凹部内または上記凹部周辺に被験者から採取された尿が供給された、試験用プレートを準備する工程と、
    上記固相の表面上所定の位置に線虫を供給する工程と、
    一定時間経過後、上記凹部内に捕捉された線虫の数または該線虫の数と相関する要素を計測する工程とを含み、
    上記凹部内には液体が満たされており、
    上記凹部内に捕捉された線虫の数に基づく指標を予め定めた閾値と比較することを特徴とするがん検査方法。
18. 上記被験者がヒトである、請求項１７に記載のがん検査方法。
19. 上記被験者がイヌまたはネコである、請求項１７に記載のがん検査方法。
20. 上記被験者がサル、マウス、ラットまたはモルモットである、請求項１７に記載のがん検査方法。
21. 上記凹部が上記固相の底面まで到達している、請求項１又は２に記載のプレート。

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