ES2707648T3 - Conjugados de anticuerpo y fármaco (CAF) que se fijan a las proteínas 158P1D7 - Google Patents

Conjugados de anticuerpo y fármaco (CAF) que se fijan a las proteínas 158P1D7 Download PDF

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Josh Snyder
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Abstract

Un anticuerpo anti-158P1D7 o fragmento de fijación al antígeno del mismo, en donde el anticuerpo o fragmento del mismo comprende una región variable de la cadena pesada que comprende CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3 de la secuencia de aminoácidos presentada en la SEQ ID n.º 7 y una región variable de la cadena ligera que comprende CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 de la secuencia de aminoácidos presentada en la SEQ ID n.º 8, en donde las CDR están determinadas por el esquema de numeración de Kabat, Chothia o Contact.

Description

DESCRIPCIÓN
Conjugados de anticuerpo y fármaco (CAF) que se fijan a las proteínas 158P1D7
Campo de la invención
La invención descrita en el presente documento se refiere a anticuerpos, fragmentos de fijación y conjugados de anticuerpo y fármaco (CAF) de los mismos que se fijan a proteínas, denominadas 158P1D7. La invención se refiere además a dichos anticuerpos, fragmentos de fijación y CAF para ser usados en métodos terapéuticos y composiciones útiles para el tratamiento de cánceres que expresan la 158P1D7.
Antecedentes de la invención
El cáncer es la segunda causa de muerte en los humanos, justo detrás de la enfermedad coronaria. Por todo el mundo, millones de personas mueren de cáncer cada año. Solo en los Estados Unidos, tal y como informa la Sociedad Estadounidense del Cáncer, el cáncer ocasiona la muerte de casi medio millón de personas al año, y se diagnostican más de 1,2 millones de casos nuevos cada año. Mientras que las muertes por cardiopatías han descendido significativamente, las debidas al cáncer siguen con una tendencia generalizada al alza. En la primera parte del próximo siglo, está predicho que el cáncer se vuelva la causa principal de muerte.
Por todo el mundo, muchos tipos de cáncer se mantienen como la principal causa de muerte. En concreto, los carcinomas de pulmón, próstata, mama, colon, páncreas, ovario y vejiga representan la causa principal de muerte por cáncer. Estos y virtualmente todos los demás carcinomas comparten una característica mortal común. Con muy pocas excepciones, la enfermedad metastásica de cualquier carcinoma resulta mortal. Además, incluso para los pacientes con cáncer que sobreviven inicialmente a sus cánceres primarios, la experiencia habitual ha demostrado que su vida queda drásticamente alterada. Muchos pacientes con cáncer experimentan gran ansiedad debido a que son conscientes de la posible recidiva o del fracaso terapéutico. Muchos pacientes con cáncer experimentan debilidades físicas tras el tratamiento. Además, muchos pacientes con cáncer experimentan una recidiva.
Por todo el mundo, el cáncer de próstata es el cuarto cáncer más prevalente en los hombres. En América del Norte y el norte de Europa, es el cáncer más frecuente en los hombres con diferencia, y es la segunda causa de muerte por cáncer en los hombres. Tan solo en los Estados Unidos, más de 30 000 hombres mueren al año por esta enfermedad, la segunda por detrás del cáncer de pulmón. A pesar de la magnitud de estas cifras, sigue sin haber un tratamiento eficaz para el cáncer de próstata metastásico. La postatectomía quirúrgica, la radioterapia, el tratamiento de supresión hormonal, la castración quirúrgica y la quimioterapia siguen siendo las principales modalidades de tratamiento. Por desgracia, estos tratamientos son ineficaces para la mayoría y a menudo están asociados a consecuencias indeseables.
En el frente diagnóstico, la ausencia de un marcador tumoral para la próstata que sea capaz de detectar los tumores localizados con exactitud y en sus primeros estadios sigue siendo una limitación significativa para el diagnóstico y el tratamiento de la enfermedad. Aunque el ensayo del antígeno prostático específico (PSA por su nombre en inglés) en el suero ha sido una herramienta útil, cada vez son más los que consideran que presenta en muchas ocasionas una falta de especificidad y de utilidad general.
El progreso a la hora de identificar otros marcadores específicos para el cáncer de próstata se ha visto impulsado por la generación de xenotrasplantes de cáncer de próstata que pueden recapitular los diferentes estadios de la enfermedad en los ratones. Los xenotrasplantes del LAPC (sigla en inglés del «cáncer de próstata de Los Ángeles») son xenotrasplantes de cáncer de próstata que han sobrevivido al pase en los ratones con inmunodeficiencia combinada grave (IDCG) y que han presentado la capacidad de imitar la transición desde la dependencia de andrógenos a la independencia de andrógenos (Klein et al., 1997, Nat Med. 3: 402). Los marcadores de cáncer de próstata identificados más recientemente incluyen PCTA-1 (Su et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 7252), antígeno membranario específico de la próstata (PSMA, por su nombre en inglés) (Pinto et al., Clin Cáncer Res, 2 de septiembre de 1996 (9): 1445-51), STEAP (Hubert, et al., Proc Natl Acad Sci USA. 7 de diciembre de 1999; 96(25): 14523-8) y antígeno de las células madre de la próstata (PSCA, por su nombre en inglés) (Reiter et al., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 1735).
Mientras que los marcadores identificados con anterioridad, tales como el PSA, han facilitado los intentos de diagnosticar y tratar el cáncer de próstata, existe la necesidad de identificar otros marcadores y dianas terapéuticas adicionales para el cáncer de próstata y los cánceres relacionados con el fin de mejorar aún más el diagnóstico y el tratamiento. Se estima que en el año 2000 se produjeron 130200 casos de cáncer colorrectal en los Estados Unidos, que incluyen 93800 casos de cáncer de colon y 36400 de cáncer de recto.
El cáncer colorrectal es el tercer cáncer más frecuente en los hombres y en las mujeres. Las tasas de incidencia disminuyeron significativamente de 1992 a 1996 (-2,1 % al año). La investigación sugiere que estas disminuciones se han debido al incremento de las pruebas de detección y de la retirada de pólipos, lo que impide la progresión de los pólipos en cánceres invasivos. Se estimaron unas 56 300 muertes (47700 de cáncer de colon, 8600 de cáncer de recto) en el 2000, lo que da cuenta de aproximadamente el 11 % de las muertes por cáncer en los EE. UU.
En la actualidad, la cirugía es la forma más frecuente de tratamiento para el cáncer colorrectal y, para los cánceres que no se han extendido, con frecuencia resulta curativa. La quimioterapia, o la quimioterapia más radioterapia, se da antes o después de la cirugía a la mayoría de los pacientes cuyo cáncer ha perforado profundamente la pared del intestino o se ha extendido a los ganglios linfáticos. En ciertos casos se necesita una colostomía permanente (creación de una abertura en el abdomen para eliminar los desechos del cuerpo) para el cáncer de colon y rara vez se requiere para el cáncer rectal. Sigue existiendo la necesidad de modalidades de tratamiento y diagnóstico eficaces para el cáncer colorrectal.
De todos los nuevos casos de cáncer en los Estados Unidos, el cáncer de vejiga representa aproximadamente el 5 % en los hombres (la quinta neoplasia más frecuente) y el 3 % en las mujeres (la octava neoplasia más frecuente). La incidencia se está incrementando lentamente, a la vez que se incrementa la población de más edad. En 1998, había una estimación de 54500 casos, que incluyen 39500 entre los hombres y 15000 entre las mujeres. La incidencia ajustada a la edad en los Estados Unidos es de 32 por 100000 para los hombres y 8 por 100000 para las mujeres. La razón histórica varón/mujer de 3:1 puede estar disminuyendo debido a los patrones de tabaquismo en las mujeres. Se estimaban unas 11 000 muertes por cáncer de vejiga en 1998 (7800 en los hombres y 3900 en las mujeres). La incidencia y la mortalidad del cáncer de vejiga se incrementa fuertemente con la edad y se volverá un problema creciente a medida que la población envejezca aún más.
La mayoría de los cánceres de vejiga vuelven a aparecer en la vejiga. El cáncer de vejiga se trata con una combinación de resección transuretral (RTU) de la vejiga y quimioterapia intravesical o inmunoterapia. La naturaleza multifocal y recurrente del cáncer de vejiga hace notar las limitaciones de la RTU. La mayoría de los cánceres invasivos de músculos no se curan solo mediante una RTU. La cistectomía radical y la desviación urinaria son los medios más eficaces para eliminar el cáncer, pero acarrean un impacto innegable en la función urinaria y sexual. Continúa existiendo una importante necesidad de modalidades de tratamiento que sean beneficiosas para los pacientes con cáncer de vejiga.
Se habían estimado unos 164 100 casos nuevos de cáncer de pulmón y cáncer de bronquios en el 2000, lo que da cuenta del 14 % de todos los diagnósticos de cáncer en los EE. UU. La tasa de incidencia del cáncer de pulmón y de bronquios está disminuyendo significativamente en los hombres, desde una tasa elevada de 86,6 por 100000 en 1984 a 70,0 en 1996. En los años noventa, la tasa de incremento entre las mujeres comenzó a enlentecerse. En 1996, la tasa de incidencia en las mujeres era de 42,3 por 100000.
El cáncer de pulmón y de bronquios se estima que causó 156900 muertes en el 2000, lo que da cuenta del 28 % de las muertes de cáncer. De 1992 a 1996, la mortalidad del cáncer de pulmón descendió significativamente entre los hombres (-1 ,7% al año), mientras que la tasa para las mujeres todavía sigue incrementándose significativamente (0,9 % al año). Desde 1987, han muerto cada año más mujeres de cáncer de pulmón que de cáncer de mama, lo que fue durante más de 40 años la causa principal de muerte por cáncer en las mujeres. La disminución de las tasas de incidencia y mortalidad del cáncer de pulmón es muy probable que sea el resultado de la disminución de la tasa de tabaquismo durante los últimos 30 años; sin embargo, la disminución de los patrones de tabaquismo entre las mujeres va por detrás de la de los hombres. Es preocupante que aunque el descenso del tabaquismo en los adultos se ha enlentecido, el tabaquismo entre los jóvenes se está incrementando de nuevo.
Las opciones de tratamiento para el cáncer de pulmón y de bronquios están determinadas por el tipo y el estadio del cáncer, e incluyen cirugía, radioterapia y quimioterapia. Para muchos cánceres localizados, la cirugía suele ser el tratamiento de elección. Ya que la enfermedad suele estar extendida en el momento en el que se descubre, a menudo se necesita combinar la radioterapia y la quimioterapia con la cirugía. La quimioterapia por sí sola o combinada con la radioterapia es el tratamiento de elección para el cáncer microcítico de pulmón; en este tratamiento, un gran porcentaje de pacientes experimentan una remisión que, en algunos casos, es de larga duración. Sin embargo, sigue existiendo la necesidad de un tratamiento eficaz y de métodos diagnósticos para los cánceres de pulmón y de bronquios.
Se estima que 182800 casos nuevos de cáncer de mama invasivo se produzcan entre las mujeres en los Estados Unidos durante el 2000. Adicionalmente, se espera que se diagnostiquen aproximadamente 1400 casos nuevos de cáncer de mama en los hombres en el 2000. Después de incrementarse aproximadamente el 4 % al año en los años ochenta, la tasa de incidencia del cáncer de mama en las mujeres ha disminuido en los años noventa a aproximadamente 110,6 casos por 100000.
Solo en los EE. UU se estimaron 41 200 muertes (40 800 mujeres, 400 hombres) en el 2000 debido al cáncer de mama. El cáncer de mama se encuentra en la segunda posición entre las muertes por cáncer en las mujeres. Según los datos más recientes, la tasa de mortalidad descendió significativamente de 1992 a 1996, y la mayor disminución se produjo en las mujeres más jóvenes, tanto blancas como negras. Esta disminución fue probablemente el resultado de la detección precoz y la mejora del tratamiento.
Teniendo en cuenta las circunstancias médicas y las preferencias de los pacientes, el tratamiento del cáncer de mama puede implicar tumorectomía (retirada local del tumor) y retirada de los ganglios linfáticos de la axila; mastectomía (retirada quirúrgica de la mama) y retirada de los ganglios linfáticos de la axila; radioterapia; quimioterapia; o tratamiento hormonal. A menudo se combinan dos o más métodos en politerapia. Numerosos estudios han demostrado que, para la enfermedad en un estadio temprano, la tasa de supervivencia a largo plazo después de la tumorectomía más radioterapia es similar a la tasa de supervivencia después de la mastectomía radical modificada. Gracias a los avances significativos en las técnicas de reconstrucción, se ofrecen varias opciones para la reconstrucción de la mama después de la mastectomía. Recientemente, tal reconstrucción se ha realizado al mismo tiempo que la mastectomía.
La escisión local del carcinoma canalicular in situ (CCIS) con cantidades adecuadas de tejido normal que lo rodea en la mama puede impedir la recidiva local del CCIS. La radioterapia en la mama y/o tamoxifeno pueden reducir la posibilidad del CCIS que se produce en el tejido de mama que queda. Esto es importante porque el CCIS, si se deja sin tratar, puede convertirse en un cáncer de mama invasivo. No obstante, estos tratamientos tienen efectos secundarios graves o secuelas. Existe, por lo tanto, la necesidad de tratamientos eficaces contra el cáncer de mama.
Se estimaron 23 1000 casos nuevos de cáncer de ovario en los Estados Unidos en el 2000. Esto explica el 4 % de los cánceres entre las mujeres y lo pone en segundo lugar entre los cánceres ginecológicos. De 1992 a 1996, la tasa de incidencia del cáncer de ovario disminuyó significativamente. Como consecuencia del cáncer de ovario, se estimaron unas 14 000 muertes en el 2000. El cáncer de ovario provoca más muertes que cualquier otro cáncer del sistema reproductivo femenino.
La cirugía, la radioterapia y la quimioterapia son opciones de tratamiento para el cáncer de ovario. La cirugía habitualmente incluye la retirada de uno o ambos ovarios, las trompas de Falopio (salpingooforectomía) y el útero (histerectomía). En los primerísimos estadios de algunos tumores, sólo se retirará el ovario implicado, sobre todo en las mujeres jóvenes que desean tener hijos. En la enfermedad avanzada se intenta retirar toda la enfermedad intrabdominal para reforzar el efecto de la quimioterapia. Continúa siendo una necesidad importante el contar con opciones eficaces de tratamiento para el cáncer de ovario.
Se estimaron unos 28300 casos nuevos de cáncer de páncreas en los Estados Unidos en el 2000. Durante los últimos 20 años, la tasa de cáncer de páncreas ha disminuido en los hombres. La tasa entre las mujeres ha permanecido aproximadamente constante, pero puede estar comenzando a descender. El cáncer de páncreas se estima que ocasionó 28 200 muertes en el 2000 en los Estados Unidos. Durante los últimos 20 años, ha habido una ligera pero significativa disminución de la tasa de mortalidad entre los hombres (aproximadamente el -0,9 % al año), mientras que la tasa se ha incrementado ligeramente entre las mujeres.
La cirugía, la radioterapia y la quimioterapia son las opciones de tratamiento para el cáncer de páncreas. Estas opciones de tratamiento pueden extender la supervivencia y/o aliviar los síntomas en muchos pacientes, pero probablemente no produzcan la cura en la mayoría. Hay una necesidad importante de más opciones terapéuticas y diagnosticas para los cánceres. Estas incluyen el uso de anticuerpos, vacunas y moléculas pequeñas como modalidades de tratamiento. Además, también existe la necesidad de usar estas modalidades como herramientas de investigación para diagnosticar, detectar, vigilar y demás el estado de la técnica en todas las áreas de tratamiento y estudio del cáncer.
Se está materializando la utilidad terapéutica de los anticuerpos monoclonales (Acm) (G. Kohler y C. Milstein, Nature 256: 495-497 (1975)). Los anticuerpos monoclonales se han autorizado en la actualidad como tratamiento en trasplantes, cáncer, enfermedades infecciosas, enfermedades cardiovasculares e inflamación. Diferentes isotipos tienen diferentes funciones efectoras. Tales diferencias en la función son el reflejo de diferentes estructuras tridimensionales para los diferentes isotipos de las inmunoglobulinas (P. M. Alzari et al., Annual Rev. Immunol., 6: 555­ 580 (1988)).
Ya que los ratones son cómodos para la inmunización y reconocen la mayoría de los antígenos humanos como extraños, los Acm contra las dianas humanas con potencial terapéutico han sido típicamente de origen murino. Sin embargo, los Acm murinos tienen desventajas inherentes como medicamento para los humanos. Requieren una dosificación más frecuente ya que los Acm tienen una semivida en circulación más breve en los humanos que los anticuerpos humanos. Aún más crítico, la administración repetida de los anticuerpos murinos al sistema inmunitario humano provoca que el sistema inmunitario humano responda reconociendo la proteína murina como extraña y genere una respuesta de anticuerpos humanos antimurinos (AHAM). Tal respuesta de AHAM puede dar lugar a una reacción alérgica y a la eliminación rápida del anticuerpo murino desde el sistema, a consecuencia de lo cual el tratamiento con anticuerpos murinos se vuelve inútil. Para evitar tales efectos, se han intentado crear sistemas inmunitarios humanos en los ratones.
Las primeras iniciativas esperaban crear ratones transgénicos capaces de responder a los antígenos con anticuerpos que tienen secuencias de humano (véase Bruggemann et al., Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA 86: 6709-6713 (1989)), pero estaban limitados por la cantidad de ADN que se podía mantener de manera estable mediante los vehículos de clonación disponibles. El uso de cromosomas artificiales de levadura (YAC, por su nombre en inglés) como vectores de clonación encaminó el modo de introducir grandes fragmentos germinales del locus de Ig de humano en los mamíferos transgénicos. Esencialmente, la mayor parte de los genes de las regiones V, D y J de humano dispuestos en el mismo fragmento hallado en el genoma humano y las regiones constantes de humano se introdujeron en los ratones mediante el uso de los YAC. Una de tales cepas de ratón transgénico se denomina ratones XenoMouse® y la vende en el mercado Amgen Fremont, Inc. (Fremont CA).
Compendio de la invención
La presente invención da a conocer anticuerpos anti-158P1D7 o fragmentos de fijación al antígeno de los mismos, en donde los anticuerpos o fragmentos de los mismos comprenden una región variable de la cadena pesada que comprende las CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3 de la secuencia de aminoácidos presentada en la SEQ ID n.° 7 y una región variable de la cadena ligera que comprende las CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 de la secuencia de aminoácidos presentada en la SEQ ID n.° 8, en donde las CDR están determinadas por el esquema de numeración de Kabat, Chothia o Contact.
La invención también da a conocer conjugados de anticuerpo y fármaco que comprenden el anticuerpo anti-158P1D7 o fragmento del mismo de la invención conjugado a la monometilauristatina E de (MMAE).
La invención también da a conocer una composición farmacéutica que comprende el conjugado de anticuerpo y fármaco de la invención en una presentación farmacéutica de dosis unitaria para humanos.
En otro aspecto, la invención da a conocer un conjugado de anticuerpo y fármaco de la invención para ser usado en un método para el tratamiento del cáncer en un sujeto, en donde el cáncer es glioblastoma, cáncer de pulmón, cáncer de vejiga o cáncer de mama.
Además, la invención da a conocer un vector que comprende un polinucleótido que comprende una secuencia que codifica la región variable de la cadena pesada del anticuerpo anti-158P1D7 o fragmento del mismo de la invención y un polinucleótido que comprende una secuencia que codifica la región variable de la cadena ligera del anticuerpo anti-158P1D7 o fragmento del mismo de la invención.
La invención también da a conocer una célula hospedadora transformada con el vector de la invención.
Además, la invención da a conocer una célula hospedadora transformada con (i) un vector que comprende un polinucleótido que comprende una secuencia que codifica la región variable de la cadena pesada del anticuerpo anti-158P1D7 o fragmento del mismo de la invención, y (ii) un vector que comprende un polinucleótido que comprende una secuencia que codifica la región variable de la cadena ligera del anticuerpo anti-158P1D7 o fragmento del mismo de la invención.
En otro aspecto, la invención da a conocer métodos para producir un anticuerpo anti-158P1D7 o fragmento de fijación al antígeno del mismo, que comprende la transfección de una célula hospedadora con el vector de la invención.
La invención también da a conocer métodos para producir un anticuerpo anti-158P1D7 o fragmento de fijación al antígeno del mismo, que comprende la transfección de una célula hospedadora con (i) un vector que comprende un polinucleótido que comprende una secuencia que codifica la región variable de la cadena pesada del anticuerpo anti-158P1D7 o fragmento del mismo de la invención, y (ii) un vector que comprende un polinucleótido que comprende una secuencia que codifica la región variable de la cadena ligera del anticuerpo anti-158P1D7 o fragmento del mismo de la invención.
Finalmente, la invención da a conocer anticuerpos anti-158P1D7 o fragmentos de fijación al antígeno de los mismos producidos por los métodos de la invención.
En adelante, la referencia a anticuerpos, fragmentos de fijación y conjugados de anticuerpo y fármaco (CAF) en el contexto de la invención tendrá el significado de anticuerpos anti-158P1D7, fragmentos de fijación al antígeno de los mismos y conjugados de anticuerpo y fármaco que comprenden dichos anticuerpos anti-158P1D7 o fragmento de los mismos que comprenden una región variable de la cadena pesada que comprende las CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3 de la secuencia de aminoácidos presentada en la SEQ ID n.° 7, y una región variable de la cadena ligera que comprende las CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 de la secuencia de aminoácidos presentada en la SEQ ID n.° 8, en donde las CDR se determinan mediante el esquema de numeración de Kabat, Chothia o Contact, tal y como está definido más arriba.
La invención da a conocer anticuerpos, fragmentos de fijación y conjugados de anticuerpo y fármaco (CAF) de los mismos que se fijan a las proteínas 158P1D7 y fragmentos polipeptídicos de las proteínas 158P1D7. En algunas realizaciones, la invención comprende anticuerpos totalmente humanos conjugados con un agente terapéutico. En algunos casos, existe la condición de que la secuencia completa del ácido nucleico de la figura 3 no esté codificada y/o que la secuencia de aminoácidos completa de la figura 2 no esté preparada. En determinadas realizaciones, la secuencia completa del ácido nucleico de la figura 3 está codificada y/o la secuencia de aminoácidos completa de la figura 2 está preparada, cualquiera de las cuales están en sus respectivas presentaciones farmacéuticas de dosis unitarias para humanos.
La invención da a conocer además diferentes composiciones inmunógenas o terapéuticas, que comprenden dichos conjugados de anticuerpo y fármaco, y estrategias para tratar los cánceres que expresan la 158P1D7, tales como los cánceres de tejidos recogidos en la tabla I, sobre todo el cáncer de vejiga.
Breve descripción de las figuras
Figura 1. El ADNc y la secuencia de aminoácidos de 158P1D7 se muestran en la figura 1. La metionina iniciadora está subrayada. El marco abierto de lectura se extiende desde el nucleótido 23 al 2548, incluido el codón de parada. Figura 2. Secuencia de nucleótidos y secuencia de aminoácidos de los anticuerpos contra 158P1D7. En la figura 2 (A) se muestra la secuencia del ADNc y de aminoácidos de la cadena pesada de Ha15-10ac12. El subrayado doble es la región variable de la cadena pesada, y el subrayado es la región constante de la cadena pesada de IgG2 de humano. En la figura 2 (B) se muestra la secuencia del ADNc y de aminoácidos de la cadena ligera de Ha15-10ac12. El subrayado doble es la región variable de la cadena ligera, y el subrayado es la región constante de la cadena k de humano.
Figura 3. Secuencia de aminoácidos de los anticuerpos contra 158P1D7. En la figura 3(A) se muestra la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada de Ha15-10ac12. El subrayado doble es la región variable de la cadena pesada, y el subrayado es la región constante de IgG2 de humano. En la figura 3 (B) se muestra la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de Ha15-10ac12. El subrayado doble es la región variable de la cadena ligera, y el subrayado es la región constante de la cadena k de humano.
Figura 4. Alineamiento de los anticuerpos Ha15-10ac12 con la Ig de humano de la línea germinal. En la figura 4(A) se muestra el alineamiento de la cadena pesada de Ha15-10ac12 (SEQ ID n.° 3, posiciones 1 a 360; SEQ ID n.° 4, posiciones 1 a 120) con la Ig de humano de la línea germinal. En la figura 4(B) se muestra el alineamiento de la cadena ligera de Ha15-10ac12 (SEQ ID n.° 5, posiciones 1 a 240; SEQ ID n.° 6, posiciones 1 a 80) con la Ig de humano de la línea germinal IGKV2D-28*01 (SEQ ID n.° 10).
Figura 5. Eficacia de Ha15-10ac12vcMMAE en el modelo de xenotrasplante subcutáneo consolidado del cáncer de vejiga AG-B7 de humano en los ratones con IDCG.
Figura 6. Eficacia de Ha15-10ac12vcMMAE en el cáncer de vejiga humano RT-4-XCL consolidado subcutáneamente una vez implantado en los ratones con IDCG.
Figura 7. Eficacia de Ha15-10ac12vcMMAE en el cáncer de pulmón humano NCI-H322M-XCL consolidado subcutáneamente una vez implantado en los ratones con IDCG.
Figura 8. Eficacia de Ha15-10ac12vcMMAE en el cáncer de vejiga humano AG-B7 consolidado subcutáneamente una vez implantado en los ratones con IDCG.
Figura 9. Detección de la proteína 158P1D7 en los especímenes de pacientes con cáncer mediante IHQ. En las figuras 9(A) y 9(B) se muestran los especímenes de cáncer de vejiga. En las figuras 9(C) y 9(D) se muestran los especímenes de cáncer de mama. En las figuras 9(E) y 9(F) se muestran los especímenes de cáncer de pulmón. En las figuras 9(G) y 9(H) se muestran especímenes de glioblastoma.
Figura 10. Eficacia de Ha15-10ac12vcMMAE en el modelo de xenotrasplante subcutáneo consolidado del cáncer de vejiga humano SW780 en los ratones con IDCG.
Figura 11. Eficacia in vitro de Ha15-10ac12vcMMAE en el ensayo de citotoxicidad en CHP-212 comparado con el Acm M15-68(2)18 (también llamado 68(18)1.1).
Figura 12. Eficacia de Ha15-10ac12vcMMAE en el modelo de xenotrasplante subcutáneo consolidado del cáncer de vejiga humano AG-B8 derivado de paciente en los ratones con IDCG.
Figura 13. Una curva de saturación para Ha15-10ac12vcMMAE.
Figura 14. Un histograma que muestra el índice medio de fluorescencia (IMF) de Ha15-10ac12vcMMAE.
Figura 15. Evaluación de la citotoxicidad in vitro de Ha15-10ac12vcMMAE en la figura 15(A) sobre las células CHP-212 y en la figura 15(B) sobre las células IGROV-1.
Descripción detallada de la invención
Esquema de los apartados
I. ) Definiciones
II. ) Anticuerpos contra 158P1D7
III. ) Generalidades sobre los conjugados de anticuerpo y fármaco
III (A). Maitansinoides
III (B). Auristatinas y dolastatinas
III (C). Caliqueamicina
III (D). Otros agentes citotóxicos
IV. ) Conjugados de anticuerpo y fármaco que se fijan a 158P1D7
V. ) Unidades conectoras
VI. ) La unidad de elongación
VII. ) La unidad de aminoácido
VIII) La unidad espadadora
IX. ) La unidad de fármaco
X. ) Carga del fármaco
XI. ) Métodos para determinar el efecto citotóxico de los CAF
XII. ) Tratamiento de los cánceres que expresan la 158P1D7
XIII. ) 158P1D7 como una diana para el tratamiento basado en anticuerpos
XIV. ) Cócteles de CAF contra 158P1D7
XV. ) Politerapia
XVI. ) Kits/artículos de fabricación
I.) Definiciones
A menos que se defina de otra manera, todos los términos de la técnica, notaciones y otros términos o terminología científicos utilizados en la presente memoria pretenden tener los significados que es habitual que conozcan los expertos en la técnica a la cual pertenece la invención. En algunos casos, los términos con los significados que se conocen habitualmente se definen en la presente memoria por claridad y/o para referenciarlos con rapidez, y la inclusión de tales definiciones en la presente memoria no se debe considerar necesariamente que representa una diferencia sustancial sobre lo que se entiende en términos generales en la técnica. Muchas de las técnicas y procedimientos descritos o referenciados en la presente memoria los conocen bien y los emplean habitualmente los expertos en la técnica al hacer uso de la metodología convencional, tales como, por ejemplo, las metodologías de clonación molecular ampliamente utilizadas que se describen en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2.a edición (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York. Cuando sea apropiado, los procedimientos que implican el uso de kits y reactivos disponibles en el mercado se suelen realizar de acuerdo con los protocolos y/o parámetros definidos por el fabricante, a menos que se diga otra cosa.
Cuando se utiliza en la presente memoria una marca comercial, la referencia a la marca comercial también hace referencia a la formulación del producto, el fármaco genérico y el ingrediente o ingredientes farmacéuticos activos del producto de la marca comercial, a menos que se indique de otra manera por el contexto.
Los términos «cáncer avanzado», «cáncer localmente avanzado», «enfermedad avanzada» y «enfermedad localmente avanzada» significan cánceres que se han extendido por la cápsula del tejido pertinente, y se pretente que incluyan la enfermedad de estadio C según el sistema de la Asociación Urológica Estadounidense (AUA, por su nombre en inglés), enfermedad de estadio C1-C2 según el sistema Whitmore-Jewett, y la enfermedad de estadio T3-T4 y N+ según el sistema TNM (tumor, ganglio, metástasis). En general, no se recomienda la cirugía para los pacientes con la enfermedad localmente avanzada, y estos pacientes tienen desenlaces sustancialmente menos favorables que los pacientes que tienen el cáncer clínicamente localizado (confinado a un órgano).
La abreviatura «AFP» hace referencia a dimetilvalina-valina-dolaisoleuína-dolaproína-fenilalanina-p-fenilendiamina (véase la fórmula XVI más adelante).
La abreviatura «MMAE» hace referencia a monometilauristatina E (véase la fórmula XI más adelante).
La abreviatura «AEB» hace referencia a un éster producido al hacer reaccionar la auristatina E con el ácido paraacetilbenzoico (véase la fórmula XX más adelante).
La abreviatura «AEVB» hace referencia a un éster producido al hacer reaccionar la auristatina E con el ácido benzoilvalérico (véase la fórmula XXI más adelante).
La abreviatura «MMAF» hace referencia a dovalina-valina-dolaisoleuína-dolaproína-fenilalanina (véase la fórmula XVIV más adelante).
A menos que se advierta de otra manera, el término «alquilo» se refiere a un hidrocarburo saturado de cadena lineal o ramificada que tiene de aproximadamente 1 a aproximadamente 20 átomos de carbono (y todas las combinaciones y subcombinaciones de intervalos y números concretos de átomos de carbono en éste), preferiblemente con de aproximadamente 1 a aproximadamente 8 átomos de carbono. Ejemplos de grupos alquilo son metilo, etilo, n-propilo, /so-propilo, n-butilo, /so-butilo, sec-butilo, ferf-butilo, n-pentilo, 2-pentilo, 3-pentilo, 2-metil-2-butilo, n-hexilo, n-heptilo, n-octilo, n-nonilo, n-decilo, 3-metil-2-butilo, 3-metil-1-butilo, 2-metil-1-butilo,1-hexilo, 2-hexilo, 3-hexilo, 2-metil-2-pentilo, 3-metil-2-pentilo, 4-metil-2-pentilo, 3-metil-3-pentilo, 2-metil-3-pentilo, 2,3-dimetil-2-butilo y 3,3-dimetil-2-butilo.
Los grupos alquilo, tanto solos como formando parte de otro grupo, pueden estar opcionalmente sustituidos con uno o varios grupos, preferiblemente de 1 a 3 grupos (y cualquier sustituyente adicional seleccionado de halógeno), entre ellos, pero sin limitarse a ellos, -halógeno, -O-(alquilo(C1-Cs)), -O-(alquenilo(C2-Cs)), -O-(alquinilo(C2-Cs)), -arilo, -C(O)R', -OC(O)R', -C(O)OR', -C(O)NH2, -C(O)NHR', -C(O)N(R')2, -NHC(O)R', -SR', -SO3R', -S(O)2R', -S(O)R', -OH, =O, -N3, -NH2, -NH(R'), -N(R')2 y -CN, en donde cada R' está seleccionado de manera independiente de -H, -alquilo(C1-Ca), -alquenilo(C2-Cs), -alquinilo(C2-Cs), o -arilo, y en donde dichos grupos -O-(alquilo(C1-Cs)), -O-(alquenilo(C2-Cs)), -O-(alquinilo(C2-Cs)), -arilo, -alquilo(Ci-Ca), -alquenilo(C2-Ca) y -alquinilo(C2-Ca) pueden estar optativamente sustituidos adicionalmente con uno o varios grupos que incluyen, pero sin limitarse a ellos, -alquilo(Ci-Ca), -alquenilo(C2-Ca), -alquinilo(C2-Ca), -halógeno, -O-(alquilo(Ci-Ca)), -O-(alquenilo(C2-Ca)), -O-(alquinilo(C2-Ca)), -arilo, - C(O)R", -Oc(O)R", -C(O)OR", -C(O)NH2, -C(O)NHR", -C(O)N(R")2, -NHC(O)R", -SR", -SO3R", -S(O)2R", -S(O)R", -OH, -N3, -NH2, -NH(R"), -N(R")2 y -CN, en donde cada R" está seleccionado de manera independiente de -H, -alquilo(Ci-Ca), -alquenilo(C2-Ca), -alquinilo(C2-Ca), o -arilo.
A menos que se diga de otra manera, los términos «alquenilo» y «alquinilo» hacen referencia a cadenas de carbono lineales y ramificadas que tienen de aproximadamente 2 a aproximadamente 20 átomos de carbono (y todas las combinaciones y subcombinaciones de intervalos y números concretos de átomos de carbono entre ellos), en donde se prefieren de aproximadamente 2 a aproximadamente 8 átomos de carbono. Una cadena de alquenilo tiene al menos un doble enlace en la cadena y una cadena de alquinilo tiene al menos un triple enlace en la cadena. Los ejemplos de grupos alquenilo incluyen, pero sin limitarse a ellos, etileno o vinilo, alilo, -1 -butenilo, -2-butenilo, -isobutilenilo, -1-pentenilo, -2-pentenilo, -3-metil-1-butenilo, -2-metil-2-butenilo, y -2,3-dimetil-2- butenilo. Los ejemplos de grupos alquinilo incluyen, pero sin limitarse a ellos, acetilénico, propargilo, acetilenilo, propinilo, -1 -butinilo, -2-butinilo, -1-pentinilo, -2-pentinilo, y -3-metil-1-butinilo.
Los grupos alquenilo y alquinilo, tanto solos como formando parte de otro grupo, pueden estar opcionalmente sustituidos con uno o varios grupos, preferiblemente de 1 a 3 grupos (y cualquier sustituyente adicional seleccionado de halógeno), entre ellos, pero sin limitarse a ellos, -halógeno, -O-(alquilo(C1-Ca)), -O-(alquenilo(C2-Ca)), -O-(alquinilo(C2-C8)), -arilo, -C(O)R', -OC(O)R', -C(O)OR', -C(O)NH2, -C(O)NHR', -C(O)N(R')2, -NHC(O)R', -SR', -SO3R', -S(O)2R', -S(O)R', -OH, =O, -N3, -NH2, -NH(R'), -N(R')2 y -CN, en donde cada R' está seleccionado de manera independiente de -H, -alquilo(C1-Ca), -alquenilo(C2-Ca), -alquinilo(C2-Ca), o -arilo, y en donde dichos grupos -O-(alquilo(C1-Ca)), -O-(alquenilo(C2-Ca)), -O-(alquinilo(C2-Ca)), -arilo, -alquilo(C1-Ca), -alquenilo(C2-Ca) y -alquinilo(C2-Ca) pueden estar optativamente sustituidos adicionalmente con uno o varios sustituyentes que incluyen, pero sin limitarse a ellos, -alquilo(C1-Ca), -alquenilo(C2-Ca), -alquinilo(C2-Ca), -halógeno, -O-(alquilo(C1-Ca)), -O-(alquenilo(C2-Ca)), -O-(alquinilo(C2-C8)), -arilo, - C(O)R", -OC(O)R", -C(O)OR", -C(O)NH2, -C(O)NHR", -C(O)N(R")2, -NHC(O)R", -SR", -SO3R", -S(O)2R", -S(O)R", -Oh , -N3, -NH2, -NH(R"), -N(R")2 y -Cn , en donde cada R" está seleccionado de manera independiente de -H, -alquilo(C1-Ca), -alquenilo(C2-Ca), -alquinilo(C2-Ca), o -arilo.
A menos que se diga de otra manera, el término «alquileno» hace referencia a un radical de hidrocarburo saturado de cadena lineal o ramificada que tienen de aproximadamente 1 a aproximadamente 20 átomos de carbono (y todas las combinaciones y subcombinaciones de intervalos y números concretos de átomos de carbono entre ellos), en donde se prefieren de aproximadamente 1 a aproximadamente 8 átomos de carbono, y que tienen dos centros radicales monovalentes procedentes de la retirada de dos átomos de hidrógeno desde el mismo o dos diferentes átomos de carbono de un alcano original. Los alquilenos típicos incluyen, pero sin limitarse a ellos, metileno, etileno, propileno, butileno, pentileno, hexileno, heptileno, octileno, nonileno, decaleno, 1,4-ciclohexileno, y similares. Los grupos alquileno, tanto solos como formando parte de otros grupos, pueden estar opcionalmente sustituidos con uno o varios grupos, preferiblemente de 1 a 3 grupos (y cualquier sustituyente adicional seleccionado de halógeno), entre ellos, pero sin limitarse a ellos, -halógeno, -O-(alquilo(C1-Ca)), -O-(alquenilo(C2-Ca)), -O-(alquinilo(C2-Ca)), -arilo, -C(O)R', -OC(O)R', -C(O)OR', -C(O)NH2, -C(O)NHR', -C(O)N(R')2, -NHC(O)R', -SR', -SO3R', -S(O)2R', -S(O)R', -OH, =O, -N3, -NH2, -NH(R'), -N(R')2 y -CN, en donde cada R' está seleccionado de manera independiente de -H, -alquilo(C1-Ca), -alquenilo(C2-Ca), -alquinilo(C2-Ca), o -arilo, y en donde dichos grupos -O-(alquilo(C1-Ca)), -O-(alquenilo(C2-Ca)), -O-(alquinilo(C2-Ca)), -arilo, -alquilo(C1-Ca), -alquenilo(C2-Ca) y -alquinilo(C2-Ca) pueden estar optativamente sustituidos adicionalmente con uno o varios sustituyentes que incluyen, pero sin limitarse a ellos, -alquilo(C1-Ca), -alquenilo(C2-Ca), -alquinilo(C2-Ca), -halógeno, -O-(alquilo(C1-Ca)), -O-(alquenilo(C2-Ca)), -O-(alquinilo(C2-Ca)), -arilo, - C(O)R", -OC(O)R", -C(O)OR", -C(O)NH2, -C(O)NHR", -C(O)N(R")2, -NHC(O)R", -SR", -SO3R", -S(O)2R", -S(O)R", -OH, -N3, -NH2, -NH(R"), -N(R")2 y -CN, en donde cada R" está seleccionado de manera independiente de -H, -alquilo(C1-Ca), -alquenilo(C2-Ca), -alquinilo(C2-Ca), o -arilo.
A menos que se diga de otra manera, el término «alquenileno» hace referencia a un grupo alquileno optativamente sustituido que contiene al menos un doble enlace entre dos átomos de carbono. Los grupos alquenileno de ejemplo incluyen, por ejemplo, etenileno (-CH=CH-) y propenileno (-CH=CHCH2-).
A menos que se diga de otra manera, el término «alquinileno» hace referencia a un grupo alquileno optativamente sustituido que contiene al menos un triple enlace entre dos átomos de carbono. Los grupos alquinileno de ejemplo incluyen, por ejemplo, acetileno (-C=C-), propargilo (-CH2C=C-), y 4-pentinilo (-CH2CH2CH2C=CH-).
A menos que se diga de otra manera, el término «arilo» hace referencia a un radical monovalente de hidrocarburo aromático de 6 a 20 átomos de carbono (y todas las combinaciones y subcombinaciones de intervalos y números concretos de átomos de carbono entre ellos) procedentes de la retirada de un átomo de hidrógeno desde un único átomo de carbono de un sistema original de anillos aromáticos. Algunos grupos arilo se representan en las estructuras de ejemplo como «Ar». Los grupos arilo típicos incluyen, pero sin limitarse a ellos, radicales procedentes de benceno, benceno sustituido, fenilo, naftaleno, antraceno, bifenilo, y similares.
Un grupo arilo, tanto solo como formando parte de otros grupos, puede estar optativamente sustituido con uno o varios, preferiblemente de 1 a 5, o incluso de 1 a 2, grupos que incluyen, pero sin limitarse a ellos, -halógeno, -alquilo(Ci-C8), -alquenilo(C2-C8), -alquinilo(C2-C8), -O-(alquilo(C1-C8)), -O-(alquenilo(C2-C8)), -O-(alquinilo(C2-C8)), -arilo, -C(O)R', -OC(O)R', -C(O)OR', -C(O)NH2, -C(O)NHR', -C(O)N(R')2, -NHC(O)R', -SR', -SO3R', -S(O)2R', -S(O)R', -OH, -NO2, -N3, -NH2, -NH(R'), -N(R')2 y -Cn , en donde cada R' está seleccionado de manera independiente de -H, -alquilo(C1-C8), -alquenilo(C2-C8), -alquinilo(C2-C8), o -arilo, y en donde dichos grupos -alquilo(C1-C8), -alquenilo(C2-C8), -alquinilo(C2-C8), -O-(alquilo(C1-C8)), -O-(alquenilo(C2-C8)), -O-(alquinilo(C2-C8)) y -arilo pueden estar optativamente sustituidos adicionalmente con uno o varios sustituyentes que incluyen, pero sin limitarse a ellos, -alquilo(C1-C8), -alquenilo(C2-C8), -alquinilo(C2-C8), -halógeno, -O-(alquilo(C1-C8)), -O-(alquenilo(C2-C8)), -O-(alquinilo(C2-C8)), -arilo, - C(O)R", -OC(O)R", -C(O)OR", -C(O)NH2, -C(O)NHR", -C(O)N(R")2, -NHC(O)R", -SR", -SO3R", -S(O)2R", -S(O)R", -OH, -N3, -NH2, -NH(R"), -N(R")2 y -CN, en donde cada R" está seleccionado de manera independiente de -H, -alquilo(C1-C8), -alquenilo(C2-C8), -alquinilo(C2-C8), o -arilo.
A menos que se diga de otra manera, el término «arileno» hace referencia a un grupo arilo optativamente sustituido que es divalente (esto es, que se obtiene por la retirada de dos átomos de hidrógeno desde el mismo, o dos diferentes, átomos de carbono de un sistema original de anillos aromáticos) y puede estar en las configuraciones orto, meta o para, tal y como se muestra en las siguientes estructuras con fenilo como grupo arilo de ejemplo:
Figure imgf000009_0001
los grupos típicos «-(alquilén(C1-C8))arilo», «-(alquenilén(C2-C8))arilo», y «-(alquinilén(C2-C8))arilo» incluyen, pero sin limitarse a ellos, bencilo, 2-feniletán-1-ilo, 2-feniletén-1-ilo, naftilmetilo, 2-naftiletán-1-ilo, 2-naftiletén-1-ilo, naftobencilo, 2-naftofeniletán-1-ilo, y similares.
A menos que se indique de otra manera, el término «heterociclo» hace referencia un sistema de anillos monocícliclo, bicíclico o policíclico que tiene de 3 a 14 átomos de anillo (también denominados miembros de anillo), en donde al menos un átomo de anillo en al menos un anillo es un heteroátomo seleccionado de N, O, P o S (y todas las combinaciones y subcombinaciones de intervalos y números concretos de átomos de carbono y hetroátomos entre ellos). El heterociclo puede tener de 1 a 4 heteroátomos de anillo seleccionados independientemente de N, O, P o S. Pueden estar oxidados uno o varios átomos de N, C o S en un heterociclo. Un heterociclo monocíclico tiene preferiblemente de 3 a 7 miembros de anillo (por ejemplo, de 2 a 6 átomos de carbono y de 1 a 3 heteroátomos seleccionados independientemente de N, O, P o S), y un heterociclo bicíclico tiene preferiblemente de 5 a 10 miembros de anillo (por ejemplo, de 4 a 9 átomos de carbono y de 1 a 3 heteroátomos seleccionados independientemente de N, O, P o S). El anillo que incluye el heteroátomo puede ser aromático o no aromático. A menos que se diga otra cosa, el heterociclo está unido a su grupo colgante en cualquier heteroátomo o átomo de carbono que dé lugar a una estructura estable.
Los heterociclos se describen en Paquette, «Principles of Modern Heterocyclic Chemistry» (W. A. Benjamin, Nueva York, 1968), en concreto en los capítulos 1, 3, 4, 6, 7, y 9; «The Chemistry of Heterocyclic Compounds, A series of Monographs» (John Wiley & Sons, Nueva York, 1950 hasta hoy), en concreto en los volúmenes 13, 14, 16, 19, y 28; y J. Am. Chem. Soc. 82: 5566 (196o).
Los ejemplos de grupos «heterociclo» incluyen a modo de ejemplo y no de limitación, piridilo, dihidropiridilo, tetrahidropiridilo (piperidilo), tiazolilo, pirimidinilo, furanilo, tienilo, pirrolilo, pirazolilo, imidazolilo, tetrazolilo, benzofuranilo, tianaftalenilo, indolilo, indolenilo, quinolinilo, isoquinolinilo, bencimidazolilo, piperidinilo, 4-piperidonilo, pirrolidinilo, 2-pirrolidonilo, pirrolinilo, tetrahidrofuranilo, bis-tetrahidrofuranilo, tetrahidropiranilo, bis-tetrahidropiranilo, tetrahidroquinolinilo, tetrahidroisoquinolinilo, decahidroquinolinilo, octahidroisoquinolinilo, azocinilo, triazinilo, 6H-1,2,5-tiadiazinilo, 2H,6H-1,5,2-ditiazinilo, tienilo, tiantrenilo, piranilo, isobenzofuranilo, cromenilo, xantenilo, fenoxatinilo, 2H-pirrolilo, isotiazolilo, isoxazolilo, pirazinilo, piridazinilo, indolizinilo, isoindolilo, 3H-indolilo, 1H-indazolilo, purinilo, 4H-quinolizinilo, ftalazinilo, naftiridinilo, quinoxalinilo, quinazolinilo, cinolinilo, pteridinilo, 4H-carbazolilo, carbazolilo, pcarbolinilo, fenantridinilo, acridinilo, pirimidinilo, fenantrolinilo, fenazinilo, fenotiazinilo, furazanilo, fenoxazinilo, isocromanilo, cromanilo, imidazolidinilo, imidazolinilo, pirazolidinilo, pirazolinilo, piperazinilo, indolinilo, isoindolinilo, quinuclidinilo, morfolinilo, oxazolidinilo, benzotriazolilo, benzisoxazolilo, oxindolilo, benzoxazolinilo, e isatinoilo. Los grupos «heterociclo» incluyen, pero sin limitarse a ellos, benzofuranilo, benzotiofenilo, indolilo, benzopirazolilo, cumarinilo, isoquinolinilo, pirrolilo, tiofenilo, furanilo, tiazolilo, imidazolilo, pirazolilo, triazolilo, quinolinilo, pirimidinilo, piridinilo, piridonilo, pirazinilo, piridazinilo, isotiazolilo, isoxazolilo y tetrazolilo.
Un grupo heterociclo, tanto solo como formando parte de otro grupo, puede estar opcionalmente sustituido con uno o varios grupos, preferiblemente de 1 a 2 grupos, que incluyen, pero sin limitarse a ellos, -alquilo(C-i-C8), -alquenilo(C2-C8), -alquinilo(C2-C8), -halógeno, -O-(alquilo(C-i-C8)), -O-(alquenilo(C2-C8)), -O-(alquinilo(C2-C8)), -arilo, -C(O)R', -OC(O)R', -C(O)OR', -C(O)NH2, -C(O)NHR', -C(O)N(R')2, -NHC(O)R', -SR', -SO3R', -S(O)2R', -S(O)R', -OH, -N3, -NH2, -NH(R'), -N(R')2 y -CN, en donde cada R' está seleccionado de manera independiente de -H, -alquilo(C-i-C8), -alquenilo(C2-C8), -alquinilo(C2-C8), o -arilo, y en donde dichos grupos -O-(alquilo(C-i-C8)), -O-(alquenilo(C2-C8)), -O-(alquinilo(C2-C8)), -alquilo(C1-C8), -alquenilo(C2-C8), -alquinilo(C2-C8) y -arilo pueden estar optativamente sustituidos adicionalmente con uno o varios sustituyentes que incluyen, pero sin limitarse a ellos, -alquilo(C-i-C8), -alquenilo(C2-C8), -alquinilo(C2-C8), -halógeno, -O-(alquilo(C-i-C8)), -O-(alquenilo(C2-C8)), -O-(alquinilo(C2-C8)), -arilo, - C(O)R", -OC(O)R", -C(O)OR", -C(O)NH2, -C(O)NHR", -C(O)N(R")2, -NHC(O)R", -SR", -SO3R", -S(O)2R", -S(O)R", -OH, -N3, -NH2, -NH(R"), -N(R")2 y -CN, en donde cada R" está seleccionado de manera independiente de -H, -alquilo(C-i-C8), -alquenilo(C2-C8), -alquinilo(C2-C8), o -arilo.
A modo de ejemplo y sin limitación, los heterociclos con carbonos enlazados pueden estar enlazados en las siguientes posiciones: posición 2, 3, 4, 5 o 6 de una piridina; posición 3, 4, 5 o 6 de una piridazina; posición 2, 4, 5 o 6 de una pirimidina; posición 2, 3, 5 o 6 de una pirazina; posición 2, 3, 4 o 5 de un furano, tetrahidrofurano, tiofurano, tiofeno, pirrol o tetrahidropirrol; posición 2, 4 o 5 de un oxazol, imidazol o tiazol; posición 3, 4 o 5 de un isoxazol, pirazol o isotiazol; posición 2 o 3 de una aziridina; posición 2, 3 o 4 de una azetidina; posición 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 de una quinolina; 0 posición 1, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 de una isoquinolina. Aún más típicamente, los heterociclos con carbonos enlazados incluyen 2-piridilo, 3-piridilo, 4-piridilo, 5-piridilo, 6-piridilo, 3-piridazinilo, 4-piridazinilo, 5-piridazinilo, 6-piridazinilo, 2-pirimidinilo, 4-pirimidinilo, 5-pirimidinilo, 6-pirimidinilo, 2-pirazinilo, 3-pirazinilo, 5-pirazinilo, 6-pirazinilo, 2-tiazolilo, 4-tiazolilo o 5-tiazolilo.
A modo de ejemplo y sin limitación, los heterociclos con nitrógeno enlazado pueden estar enlazados en la posición 1 de una aziridina, azetidina, pirrol, pirrolidina, 2-pirrolina, 3-pirrolina, imidazol, imidazolidina, 2-imidazolina, 3-imidazolina, pirazol, pirazolina, 2-pirazolina, 3-pirazolina, piperidina, piperazina, indol, indolina o 1H-indazol; en la posición 2 de un isoindol o una isoindolina; en la posición 4 de una morfolina; y en la posición 9 de un carbazol o una p-carbolina. Aún más típicamente, los heterociclos con nitrógeno enlazado incluyen 1 -aziridilo, 1 -azetidilo, 1 -pirrolilo, 1 -imidazolilo, 1 -pirazolilo y 1 -piperidinilo.
A menos que se diga de otra manera, el término «carbociclo» hace referencia a un sistema de anillos no aromáticos monocíclico, bicíclico o policíclico saturado o insaturado que tiene de 3 a 14 átomos de anillo (y todas las combinaciones y subcombinaciones de intervalos y números específicos de átomos de carbono entre ellos), en donde todos los átomos de anillo son átomos de carbono. Los carbociclos monocíclicos tienen preferiblemente de 3 a 6 átomos de anillo, aún más preferiblemente 5 o 6 átomos de anillo. Los carbociclos bicíclicos tienen preferiblemente de 7 a 12 átomos de anillo, p. ej., dispuestos como un sistema biciclo [4,5], [5,5], [5,6] o [6,6], o 9 o 10 átomos de anillo dispuestos como un sistema biciclo [5,6] o [6,6]. El término «carbociclo» incluye, por ejemplo, un anillo de carbociclo monocíclico fusionado a un anillo de arilo (p. ej., un anillo de carbociclo monocíclico fusionado a un anillo de benceno). Los carbociclos tienen preferiblemente de 3 a 8 átomos de anillo de carbono.
Los grupos carbocíclicos, tanto solos o como formando parte de otro grupo, pueden estar optativamente sustituidos con, por ejemplo, uno o varios grupos, preferiblemente 1 o 2 grupos (y cualquier sustituyente adicional seleccionado de halógeno), entre ellos, pero sin limitarse a ellos, -halógeno, -alquilo(C-i-C8), -alquenilo(C2-C8), -alquinilo(C2-C8), -O-(alquilo(C-i-C8)), -O-(alquenilo(C2-C8)), -O-(alquinilo(C2-C8)), -arilo, -C(O)R', -OC(O)R', -C(O)OR', -C(O)NH2, -C(O)NHR', -C(O)N(R')2, -NHC(O)R', -SR', -SO3R', -S(O)2R', -S(O)R', -OH, , =O, -N3, -NH2, -NH(R'), -N(R')2 y -CN, en donde cada R' está seleccionado de manera independiente de -H, -alquilo(C-i-C8), -alquenilo(C2-C8), -alquinilo(C2-C8), o -arilo, y en donde dichos grupos -alquilo(C-i-C8), -alquenilo(C2-C8), -alquinilo(C2-C8), -O-(alquilo(C-i-C8)), -O-(alquenilo(C2-C8)), -O-(alquinilo(C2-C8)) y -arilo pueden estar optativamente sustituidos adicionalmente con uno o varios sustituyentes que incluyen, pero sin limitarse a ellos, -alquilo(C-i-C8), -alquenilo(C2-C8), -alquinilo(C2-C8), -halógeno, -O-(alquilo(C-i-C8)), -O-(alquenilo(C2-C8)), -O-(alquinilo(C2-C8)), -arilo, -C(O)R", -o C(O)R", -C(O)OR", -C(O)NH2, -C(O)NHR", -C(O)N(R")2, -NHC(O)R", -SR", -SO3R", -S(O)2R", -S(O)R", -OH, -N3, -NH2, -NH(R"), -N(R")2 y -CN, en donde cada R" está seleccionado de manera independiente de -H, -alquilo(C-i-C8), -alquenilo(C2-C8), -alquinilo(C2-C8), o -arilo.
Los ejemplos de sustituyentes carbocíclicos monocíclicos incluyen -ciclopropilo, -ciclobutilo, -ciclopentilo. -1-ciclopent-1-enilo, -1-ciclopent-2-enilo, -1-ciclopent-3-enilo, -ciclohexilo, -1-ciclohex-1-enilo, -1-ciclohex-2-enilo, 1-ciclohex-3-enilo, -cicloheptilo, -ciclooctilo, -1,3-ciclohexadienilo, -1,4-ciclohexadienilo, -1,3-cicloheptadienilo, -1,3,5-cicloheptatrienilo y -ciclooctadienilo.
Un «carbociclo», tanto si se utiliza solo o formando parte de otro grupo, hace referencia a un grupo carbociclo optativamente sustituido tal y como está definido más arriba que es divalente (a saber, procedente de la retirada de dos átomos de hidrógeno del mismo o de dos diferentes átomos de carbono de un sistema de anillo carbocíclico original).
A menos que se indique de otra manera según el contexto, un guión (-) designa el punto de enlace a la molécula pendiente. Por consiguiente, el término «-(alquileno(C1-C8)arilo» o «alquileno(C1-C8)(arilo)» hace referencia a un radical de alquileno(C1-C8) tal y como está definido en la presente memoria, en donde el radical alquileno está enlazado a la molécula pendiente en cualquiera de los átomos de carbono del radical alquileno y uno de los átomos de hidrógeno enlazados a un átomo de carbono del radical alquileno está remplazado con un radical arilo tal y como está definido en la presente memoria.
Cuando un grupo concreto está «sustituido», ese grupo puede tener uno o varios sustituyentes, preferiblemente de uno a cinco sustituyentes, más preferiblemente de uno a tres sustituyentes, lo más preferiblemente de uno a dos sustituyentes, seleccionados de manera independiente de la lista de sustituyentes. Sin embargo, el grupo puede tener por lo general cualquier cantidad de sustituyentes seleccionados de halógeno. Los grupos que están sustituidos están convenientemente indicados.
Se pretende que la definición de cualquier sustituyente o variable en una localización concreta de una molécula sea independiente de sus definiciones en otras posiciones de esa molécula. Se sabe que los sustituyentes y patrones de sustitución en los compuestos de esta invención los puede seleccionar el experto en la técnica para dar a conocer compuestos que son químicamente estables y que se pueden sintetizar con facilidad con las técnicas conocidas en el campo, así como los métodos presentados en la presente memoria.
Los grupos protectores, tal y como se utilizan en la presente memoria, hacen referencia a grupos que bloquean selectivamente, de manera temporal o bien permanente, un sitio reactivo en un compuesto multifuncional. Los grupos protectores de hidroxi idóneos para ser usados en la presente invención son farmacéuticamente aceptables y pueden necesitar, o no, escindirse del compuesto original después de la administración a un sujeto con el fin de que el compuesto esté activo. La escisión es a través de procesos metabólicos normales dentro del organismo. Los grupos protectores de hidroxi se conocen bien en la técnica, véase, Protective Groups in Organic Synthesis por T. W. Greene y P. G. M. Wuts (John Wiley & Sons, 3.a edición). Estos incluyen, por ejemplo, grupos protectores éter (p. ej., éteres de alquilo y éteres de sililo que incluyen, por ejemplo, éter de dialquilsililo, éter de trialquilsililo, éter de dialquilalcoxisililo), éster, carbonato, carbamatos, sulfonato y fosfato. Ejemplos de grupos protectores de hidroxi incluyen, pero sin limitarse a ellos, éter de metilo; éter de metoximetilo, éter de metiltiometilo, éter de (fenildimetilsilil)metoximetilo, éter de benciloximetilo, éter de p-metoxibenciloximetilo, éter de p-nitrobenciloximetilo, éter de o-nitrobenciloximetilo, éter de (4-metoxifenoxi)metilo, éter de guaiacolmetilo, éter de t-butoximetilo, éter de 4-penteniloximetilo, éter de siloximetilo, éter de 2-metoxietoximetilo, éter de 2,2,2-tricloroetoximetilo, éter de bis(2-clroetoxi)metilo, éter de 2-(trimetilsilil)etoximetilo, éter de metoximetilo, éter de tetrahidropiranilo, éter de 1-metoxiciclohexilo, éter de 4-metoxitetrahidrotiopiranilo, S,S-Dióxido de éter de 4-metoxitetrahidrotiopiranilo, éter de 1-[(2-cloro-4-metil)fenil]-4-metoxipiperidín-4-ilo, éter de 1-(2-fluorofenil)-4-metoxipiperidín-4-ilo, éter de 1,4-dioxán-2-ilo, éter de tetrahidrofuranilo, éter de tetrahidrotiofuranilo; éteres de etilo sustituidos, tales como éter de 1-etoxietilo, éter de 1-(2-cloroetoxi)etilo, éter de 1-[2-(trimetilsilil)etoxi]etilo, éter de 1-metil-1-metoxietilo, éter de 1 -metil-1-benciloxietilo, éter de 1-metil-1-benciloxi-2-fluoroetilo, éter de 1-metil-1-fenoxietilo, éter de 2-trimetilsililo, éter de t-butilo, éter de alilo, éteres de propargilo, éter de p-clorofenilo, éter de p-metoxifenilo, éter de bencilo, éter de p-metoxibencilo, éter de 3,4-dimetoxibencilo, éter de trimetilsililo, éter de trietilsililo, éter de tripropilsililo, éter de dimetilisopropilsililo, éter de dietilisopropilsililo, éter de dimetilhexilsililo, éter de t-butildimetilsililo, éter de difenilmetilsililo, éster de bezoilformiato, éster de acetato, éster de cloroacetato, éster de dicloroacetato, éster de tricloroacetato, éster de trifluoroacetato, éster de metoxiacetato, éster de trifenilmetoxiacetato, éster de fenilacetato, éster de benzoato, carbonato de alquilo y metilo, carbonato de alquilo y 9-fluorenilmetilo, carbonato de alquilo y etilo, carbonato de alquilo y 2,2,2-tricloroetilo, carbonato de 1,1 -dimetilo y 2,2,2-tricloroetilo, alquilsulfonato, metanosulfonato, bencilsulfonato, tosilato, acetal de metileno, acetal de etilideno y cetal de t-butilmetilideno. Los grupos protectores preferidos están representados por las fórmulas -Ra, -Si(Ra)(Ra)(Ra), -C(O)Ra, -C(O)ORa, -C(O)NH(Ra), -S(O)2Ra, -S(O)2OH, P(O)(OH)2 y -P(O)(OH)ORa, en donde Ra es -alquilo(C-i-C2o), -alquenilo(C2-C2o), -alquinilo(C2-C2o), -alquileno(C1-C2o)(carbociclo), -alquenileno(C2-C2o)(carbociclo), -alquinileno(C2-C2o)(carbociclo), -arilo(C6-C1o), -alquileno(C1-C2o)(arilo), -alquenileno(C2-C2o)(arilo), -alquinileno(C2-C2o)(arilo), -alquileno(C1-C2o)(heterociclo), -alquenileno(C2-C2o)(heterociclo), o -alquinileno(C2-C2o)(heterociclo), en donde dicho alquilo, alquenilo, alquinilo, alquileno, alquenileno, alquinileno, arilo, carbociclo y radicales de heterociclo, solos o bien como parte de otro grupo, están optativamente sustituidos.
«Que altera el patrón de glucosilación nativo» para los propósitos de la presente memoria pretende significar que elimina uno o varios restos glucídicos encontrados en la secuencia nativa de 158P1D7 (mediante la retirada del sitio de glucosilación subyacente, o bien mediante la eliminación de la glucosilación por medios químicos y/o enzimáticos) y/o añade uno o varios sitios de glucosilación que no están presentes en la secuencia nativa de 158P1D7. Además, la frase incluye cambios cualitativos en la glucosilación de las proteínas nativas, que implican un cambio en la naturaleza y en las proporciones de los diferentes restos glucídicos presentes.
El término «análogo» hace referencia a una molécula que se le parece desde el punto de vista estructural, o que comparte los correspondientes o similares atributos con otra molécula (p. ej., una proteína relacionada con 158P1D7). Por ejemplo, un análogo de una proteína 158P1D7 se puede fijar específicamente mediante un anticuerpo o linfocito T que se fija específicamente a 158P1D7.
El término «anticuerpo» se utiliza en el sentido más amplio, a menos que se indique claramente de otra manera. Así pues, un «anticuerpo» se puede producir de manera natural o lo puede fabricar el hombre, tales como los anticuerpos monoclonales producidos por tecnología convencional de hibridomas. Los anticuerpos contra 158P1D7 comprenden anticuerpos monoclonales o policlonales, así como fragmentos que contienen el dominio de fijación al antígeno y/o una o varias regiones determinantes de la complementariedad de estos anticuerpos. Tal y como se utiliza en la presente memoria, el término «anticuerpo» hace referencia a cualquier forma de un anticuerpo o fragmento del mismo que se fija específicamente a 158P1D7 y/o muestra la actividad biológica deseada y cubre específicamente anticuerpos monoclonales (que incluyen los anticuerpos monoclonales completos), anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos (p. ej., anticuerpos biespecíficos) y fragmentos de anticuerpo, siempre y cuando se fijen específicamente a 158P1D7 y/o muestren la actividad biológica deseada. Cualquiera de tales anticuerpos específicos se puede utilizar en los métodos y composiciones dados a conocer en la presente memoria. Así pues, en una realización, el término «anticuerpo» abarca una molécula que comprende al menos una región variable de una molécula de la cadena ligera de inmunoglobulina y al menos una región variable de una molécula de la cadena pesada que en combinación forman un sitio de fijación específico para el antígeno deseado. En una realización, el anticuerpo es un anticuerpo de tipo IgG. Por ejemplo, el anticuerpo es un anticuerpo de tipo IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4. Los anticuerpos útiles en los presentes métodos y composiciones se pueden generar en cultivo celular, en fagos o en diferentes animales, entre ellos, pero sin limitarse a ellos, vacas, conejos, cabras, ratones, ratas, hámsteres, conejillos de India, ovejas, perros, gatos, monos, chimpancés y orangutanes. Por lo tanto, en una realización, un anticuerpo de la presente invención es un anticuerpo de mamífero. Se pueden utilizar las técnicas de fagos para aislar un anticuerpo inicial o para generar variantes con alteración de las características de especificidad o de avidez. Tales técnicas son convencionales y se conocen bien en la técnica. En una realización, el anticuerpo está producido por medios recombinantes que se conocen en la técnica. Por ejemplo, un anticuerpo recombinante se puede producir mediante la transfección de una célula hospedadora con un vector que comprende una secuencia de ADN que codifica el anticuerpo. Se pueden utilizar uno o varios vectores para transfectar la secuencia de ADN que expresa al menos una región VL y una región VH en la célula hospedadora. Las descripciones ejemplares de los medios recombinantes con los que generar y producir anticuerpos incluyen Delves, Antibody Production: Essential Techniques (Wiley, 1997); Shepard et al., Monoclonal Antibodies (Oxford University Press, 2000); Goding, Monoclonal Antibodies: Principies and Practice (Academic Press, 1993); y Current Protocols in Immunology (John Wiley & Sons, la edición más reciente). Un anticuerpo de la presente invención se puede modificar por medios recombinantes para incrementar la eficacia del anticuerpo a la hora de intervenir en la función deseada.
Los anticuerpos se pueden modificar con sustituciones mediante el uso de medios recombinantes. Típicamente, las sustituciones serán sustituciones conservativas. Por ejemplo, se puede remplazar con un resto diferente al menos un aminoácido en la región constante del anticuerpo. Véanse, p. ej., la patente de los EE. UU. n.° 5624 821, la patente de los EE. UU. n.° 6 194551, la solicitud de patente internacional n.° WO 9958572; y Angal et al., Mol. Immunol. 30: 105-08 (1993). La modificación en los aminoácidos incluye deleciones, adiciones y sustituciones de aminoácidos. En algunos casos, tales cambios se realizan para reducir las actividades indeseadas, p. ej., citotoxicidad dependiente del complemento. Con frecuencia, los anticuerpos se marcan mediante la unión, bien covalente o bien no covalente, de una sustancia que proporciona una señal detectable. Se conoce una amplia gama de marcadores y técnicas de conjugación, y están descritas con detalle tanto en la bibliografía científica como en la de patentes. Estos anticuerpos se pueden detectar sistemáticamente por la fijación a la 158P1D7 normal o defectuosa. Véase, p. ej., Antibody Engineering: A practical Approach (Oxford University Press, 1996). Se pueden identificar anticuerpos idóneos con las actividades biológicas deseadas mediante el uso de los siguientes ensayos in vitro que incluyen, pero sin limitarse a ellos: proliferación, migración, adhesión, crecimiento en agar blando, angiogenia, comunicación de célula a célula, apoptosis, transporte, transducción de señales, y los siguientes ensayos in vivo, tales como la inhibición del crecimiento tumoral. Los anticuerpos dados a conocer en la presente memoria también pueden ser útiles en las aplicaciones diagnósticas. Como anticuerpos de captura o no neutralizantes, se pueden detectar sistemáticamente por la capacidad para fijarse al antígeno específico sin inhibir la fijación al receptor ni la actividad biológica del antígeno. Como anticuerpos neutralizantes, los anticuerpos pueden ser útiles en los ensayos de fijación competitiva. También se pueden utilizar para cuantificar la 158P1D7 o su receptor.
El término «porción de fijación a antígeno» o «fragmento de anticuerpo» de un anticuerpo (o simplemente «porción de anticuerpo»), tal y como se utiliza en la presente memoria, se refiere a uno o varios fragmentos de un anticuerpo contra 158P1D7 que conserva la capacidad para fijarse específicamente a un antígeno (p. ej., 158P1D7 y variantes; figura 1). Se ha demostrado que la función de fijación al antígeno de un anticuerpo puede ser realizada por fragmentos de un anticuerpo completo. Ejemplos de fragmentos de fijación englobados dentro del término «porción de fijación a antígeno» de un anticuerpo incluyen (i) un fragmento Fab, un fragmento monovalente que consiste en los dominios Vl , Vh, Cl y Crn; (ii) un fragmento F(ab')2, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab unidos por un puente disulfuro en la región bisagra; (iii) un fragmento Fd que consiste en los dominios Vh y Ch1 (iv) un fragmento Fv que consiste en los dominios Vl y Vh de un único brazo de un anticuerpo, (v) un fragmento de dAc (Ward et al., (1989) Nature 341: 544-546), que consiste en un dominio Vh; y (vi) una región determinante de la complementariedad (CDR) aislada. Además, aunque los dos dominios del fragmento Fv, Vl y Vh, están codificados por genes independientes, se pueden juntar con el uso de métodos recombinantes, mediante un conector sintético que permite que se los fabrique como una sola cadena proteica en la que las regiones Vl y Vh se emparejan para formar moléculas monovalentes (conocidas como una Fv monocatenaria (scFv); véanse Bird et al. (1988) Science 242: 423-426; y Huston et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883). Tales anticuerpos monocatenarios también se pretende que estén englobados dentro del término «porción de fijación a antígeno» de un anticuerpo. Estos fragmentos de anticuerpo se obtienen mediante el uso de técnicas convencionales conocidas por los expertos en la técnica, y los fragmentos se detectan sistemáticamente por su utilidad de la misma manera ya que se hace con los anticuerpos intactos.
Tal y como se utiliza en la presente memoria, se puede utilizar cualquier forma del «antígeno» para generar un anticuerpo que es específico contra 158P1D7. Así pues, el antígeno desencadenante puede ser un solo epítopo, muchos epítopos o la proteína completa sola o en combinación con uno o varios potenciadores de la inmunogenia conocidos en la técnica. El antígeno desencadenante puede ser una proteína completa aislada, una proteína de la superficie celular (p. ej., inmunización con células transfectadas con al menos una porción del antígeno) o una proteína soluble (p. ej., inmunización solo con la porción del dominio extracelular de la proteína). El antígeno se puede producir en una célula modificada genéticamente. El ADN que codifica el antígeno puede ser genómico o no genómico (p. ej., ADNc), y codifica al menos una porción del dominio extracelular. Tal y como se utiliza en la presente memoria, el término «porción» hace referencia al número mínimo de aminoácidos o nucleótidos, según sea lo apropiado, para constituir un epítopo inmunógeno del antígeno de interés. Se puede emplear cualquier vector genético idóneo para la transformación de las células de interés, incluidos, pero sin limitarse a ellos, los vectores adenovíricos, los plásmidos y los vectores no víricos, tales como lípidos catiónicos. En una realización, el anticuerpo de los métodos y composiciones en la presente memoria se fija de manera específica a al menos una porción del dominio extracelular de la 158P1D7 de interés.
Los anticuerpos o fragmentos de fijación al antígeno de los mismos dados a conocer en la presente memoria pueden estar conjugados a un «agente bioactivo». Tal y como se utiliza en la presente memoria, el término «agente bioactivo» hace referencia a cualquier compuesto sintético o que se produce de forma natural que se fija al antígeno y/o realza, o media en, un efecto biológico deseado para potenciar las toxinas citolíticas. En una realización, los fragmentos de fijación útiles en la presente invención son fragmentos biológicamente activos. Tal y como se utiliza en la presente memoria, el término «biológicamente activo» hace referencia a un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que es capaz de fijarse al epítopo antigénico deseado y ejercer de manera directa o indirecta un efecto biológico. Los efectos directos incluyen, pero sin limitarse a ellos, la modulación, estimulación y/o inhibición de una señal de crecimiento, la modulación, estimulación y/o inhibición de una señal antiapoptósica, la modulación, estimulación y/o inhibición de una señal apoptósica o necrótica, la modulación, estimulación y/o inhibición de la cascada de CCDA, y la modulación, estimulación y/o inhibición de la cascada de CDC.
Los anticuerpos «biespecíficos» son también útiles en los presentes métodos y composiciones. Tal y como se utiliza en la presente memoria, el término «anticuerpo biespecífico» hace referencia a un anticuerpo, típicamente un anticuerpo monoclonal, que tiene especificidad de fijación por al menos dos epítopos antigénicos diferentes. En una realización, los epítopos son del mismo antígeno. En otra realización, los epítopos son de dos antígenos diferentes. Los métodos para fabricar anticuerpos biespecíficos se conocen en la técnica. Por ejemplo, los anticuerpos biespecíficos se pueden producir por medios recombinantes basándose en la coexpresión de dos parejas de cadena pesada/cadena ligera de inmunoglobulina. Véase, p. ej., Milstein et al., Nature 305: 537-39 (1983). Como alternativa, se pueden preparar anticuerpos biespecíficos mediante el uso de enlaces químicos. Véase, p. ej., Brennan et al., Science 229: 81 (1985). Los anticuerpos biespecíficos incluyen fragmentos de anticuerpos biespecíficos. Véanse, p. ej., Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 90: 6444-48 (1993), Gruber et al., J. Immunol, 152: 5368 (1994).
Los anticuerpos monoclonales descritos en la presente memoria incluyen específicamente anticuerpos «quiméricos» en los que una porción de la cadena pesada y/o cadena ligera es idéntica con, u homóloga a, las correspondientes secuencias de anticuerpos procedentes de una especie concreta o que pertenecen a una clase o subclase de anticuerpos concretos, mientras que el resto de las cadenas es idéntica u homóloga a las correspondientes secuencias en los anticuerpos procedentes de otra especie o que pertenecen a otra clase o subclase de anticuerpo, así como fragmentos de tales anticuerpos, siempre y cuando se fijen específicamente al antígeno diana y/o muestren la actividad biológica deseada (patente de los EE. u U. n.° 4816 567 ; y Morrison et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 6851-6855 (1984)).
El término «quimioterápico» hace referencia a todos los compuestos químicos que son eficaces a la hora de inhibir el crecimiento tumoral. Ejemplos no limitantes de quimioterápicos incluyen los alquilantes; por ejemplo, clormetinas, compuestos de etilenoimina y sulfonatos de alquilo; antimetabolitos, por ejemplo, ácido fólico, antagonistas de purina o pirimidina; inhibidores de la mitosis, por ejemplo, agentes antitubulínicos, tales como los alcaloides vinca, las auristatinas y los derivados de la podofilotoxina; antibióticos citotóxicos; compuestos que dañan el ADN o interfieren con la expresión o replicación del ADN, por ejemplo, fijadores del surco menor del ADN; y antagonistas del receptor del factor de crecimiento. Además, los quimioterápicos incluyen agentes citotóxicos (tal y como están definidos en la presente memoria), anticuerpos, moléculas biológicas y moléculas pequeñas.
El término «compuesto» hace referencia y engloba el propio compuesto químico, así como, tanto si se menciona explícitamente como si no, y a menos que el contexto lo deje claro, que lo siguiente se ha de excluir: formas amorfas o cristalinas del compuesto, entre ellas las formas polimórficas, en donde estas formas pueden ser parte de una mezcla o de un aislamiento; formas del compuesto libres de ácido y de base, que típicamente son las formas mostradas en las estructuras dadas a conocer en la presente memoria; isómeros del compuesto, que se refieren a isómeros ópticos e isómeros tautoméricos, en donde los isómeros ópticos incluyen enantiómeros y diastereómeros, isómeros quirales e isómeros no quirales, y los isómeros ópticos incluyen isómeros ópticos aislados, así como mezclas de isómeros ópticos que incluyen mezclas racémicas y no racémicas; en donde un isómero puede estar en forma aislada o en una mezcla con uno u varios isómeros más; isótopos del compuesto, que incluyen los compuestos que contienen deuterio y tritio, y que incluyen compuestos que contienen radioisótopos, entre ellos los radioisótopos eficaces desde el punto de vista terapéutico y diagnóstico; formas multiméricas del compuesto, entre ellas las formas diméricas, triméricas, etc.; sales del compuesto, preferiblemente sales farmacéuticamente aceptables, que incluyen las sales por adición de ácido y las sales por adición de base, que incluyen sales que tienen contraiones orgánicos y contraiones inorgánicos, y que incluyen formas zwiteriónicas, en donde si un compuesto está asociado a dos o más contraiones, los dos o más contraiones pueden ser iguales o diferentes; y los solvatos del compuesto, entre ellos hemisolvatos, monosolvatos, disolvatos, etc., incluidos los solvatos orgánicos y los solvatos inorgánicos, en donde dichos solvatos inorgánicos incluyen hidratos; en donde si un compuesto está asociado a dos o más moléculas de solvente, las dos o más moléculas de solvente pueden ser la misma o diferentes. En algunos casos, la referencia hecha en la presente memoria a un compuesto de la invención incluirá una referencia explícita a una o más de las formas de más arriba, p. ej., sales y/o solvatos; sin embargo, esta referencia es solo para dar énfasis y no se ha de considerar como que descarta otras de las formas de más arriba tal y como se identifica más arriba.
Los términos «región determinante de la complementariedad» y «CDR» se sabe en la técnica que se refieren a secuencias no contiguas de aminoácidos dentro de las regiones variables del anticuerpo, que confieren especificidad de antígeno y afinidad de fijación. En general, hay tres (3) CDR en cada región variable de la cadena pesada (CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3) y tres (3) CDR en cada región variable de la cadena ligera (CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3).
Las fronteras precisas de la secuencia de aminoácidos de una CDR dada se pueden determinar con facilidad mediante el uso de alguno de los muchos esquemas bien conocidos, entre ellos los descritos por Kabat et al. (1991), «Sequences of Proteins of Immunological Interest», 5.a ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (esquema de numeración de «Kabat»), Al-Lazikani et al., (1997) JMB 273, 927-948 (esquema de numeración «Chothia»), MacCallum et al., J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996), «Antibody-antigen interactions: Contact analysis and binding site topography», J. Mol. Biol., 262, 732-745. (esquema de numeración «Contact»), Lefranc MP et al., «IMTG unique numbering for immunoglobulin and T cell receptor variable domains and Ig superfamily V-like domains», Dev. Comp. Immunol. enero de 2003; 27 (1): 55-77 (esquema de numeración «IMTG»), y Honegger A. y Plückthun A., «Yet another numbering scheme for immunoglobulin variable domains: an automatic modeling and analysis tool», J. Mol. Biol, 8 de junio de 2001, 309 (3): 657-70, (esquema de numeración AHo).
Las fronteras de una CDR dada pueden variar según el esquema utilizado para la identificación. Por ejemplo, el esquema de Kabat se basa en alineamientos estructurales, mientras que el esquema Chothia se basa en la información estructural. La numeración para ambos esquemas de Kabat y Chothia se basa en las longitudes más frecuentes de la secuencia de la región del anticuerpo, con inserciones acomodadas mediante la inserción de letras, por ejemplo, «30a», y en las deleciones que aparecen en algunos anticuerpos. Los dos esquemas colocan algunas inserciones y deleciones («indels») en diferentes posiciones, lo que da lugar a una numeración diferencial. El esquema Contact se basa en el análisis de estructuras cristalizadas complejas y es similar en muchos aspectos al esquema de numeración de Chothia. La tabla V que aparece más adelante recoge las posiciones de CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3 y CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3 tal y como las identifican los esquemas de Kabat, Chothia y Contact, respectivamente. Para CDR-H1, la numeración de los restos se recoge con los dos esquemas de numeración de Kabat y Chothia.
Así pues, a menos que se especifique de otra manera, los términos «CDR» y «región determinante de la complementariedad» de un anticuerpo dado o región del mismo, tal como una región variable, así como cada una de las CDR (p. ej., CDR-H1, CDR-H2) del anticuerpo o región del mismo, se debe entender que abarcan la región determinante de la complementariedad tal y como está definida por cualquiera de los esquemas conocidos descritos en la presente memoria más arriba. En algunos casos, se especifica el esquema para la identificación de una CDR concreta o varias CDR, tal como la CDR que se define mediante el método de Kabat, Chothia o Contact. En otros casos, se da la secuencia aminoacídica concreta de una CDR.
Tal y como se utiliza en la presente memoria, el término «sustitución conservativa» hace referencia a sustituciones de aminoácidos que conocen los expertos en esta técnica y que se pueden fabricar por lo general sin alterar la actividad biológica de la molécula resultante. Los expertos en la técnica reconocen que, en general, las sustituciones de un solo aminoácido en las regiones no esenciales de un polipéptido no alteran sustancialmente la actividad biológica (véase, p. ej., Watson et al., Molecular Biology o f the Gene, The Benjamin/Cummings Pub. Co., pág. 224 (4.a edición, 1987)). Tales sustituciones ejemplares se realizan preferiblemente de acuerdo con las presentadas en la tabla II y las tablas III (a-b). Por ejemplo, tales cambios incluyen la sustitución de alguna isoleucina (I), valina (V) y leucina (L) por cualquier otro de los aminoácidos hidrófobos; ácido aspártico (D) por el ácido glutámico (E) y viceversa; glutamina (Q) por asparagina (N) y viceversa; y serina (S) por treonina (T) y viceversa. Otras sustituciones también se pueden considerar conservativas, según el entorno del aminoácido concreto y su función en la estructura tridimensional de la proteína. Por ejemplo, la glicina (G) y la alanina (A) se pueden intercambiar con frecuencia, como también la alanina (A) y la valina (V). La metionina (M), que es relativamente hidrófoba, se puede intercambiar con frecuencia con la leucina y la isoleucina, y algunas veces con la valina. La lisina (K) y la arginina (R) son frecuentemente intercambiables en las localizaciones en las que el rasgo significativo del resto aminoacídico es su carga y los diferentes pK de estos dos restos aminoacídicos no son significativos. Otros cambios más se pueden considerar «conservativos» en determinados entornos (véanse, p. ej., la tabla III(a) en la presente memoria; las páginas 13 a 15 de Biochemistry, 2.a edición de Lubert Styrer ed (Stanford University); Henikoff et al., PNAS 1992, vol 89, 10915-10919; Lei et al., J. Biol.
Chem. 19 de mayo de 1995; 270 (20): 11882-6). También son permisibles otras sustituciones y se pueden determinar empíricamente o de acuerdo con las sustituciones conservativas conocidas.
El término «agente citotóxico» se refiere a una sustancia que inhibe o impide la actividad de expresión de las células, el funcionamiento de las células y/o provoca la destrucción de las células. El término pretende incluir isótopos radioactivos, quimioterápicos y toxinas, tales como las toxinas que son moléculas pequeñas o las toxinas enzimáticamente activas de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal, que incluyen fragmentos y/o variantes de las mismas. Los ejemplos de agentes citotóxicos incluyen, pero sin limitarse a ellos, auristatinas (p. ej., auristatina E, auristatina F, MMAE y MMAF), auromicinas, maitansinoides, ricina, cadena A de ricina, combrestatina, duocarmicinas, dolastatinas, doxorubicina, daunorubicina, taxoles, cisplatino, cc1065, bromuro de etidio, mitomicina, etopósido, tenopósido, vincristina, vinblastina, colchicina, dihidroxiantracindiona, actinomicina, toxina de la difteria, exotoxina A de Pseudomonas (PE), PE40, abrina, cadena A de la abrina, cadena A de la modecina, a-sarcina, gelonina, mitogelina, retstrictocina, fenomicina, enomicina, curicina, crotina, caliqueamicina, inhibidor de Sapaonaria officinalis, y glucocorticoide y otros quimioterápicos, así como radioisótopos tales como At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212 o Bi213, P32 e isótopos radioactivos de Lu que incluyen Lu177. Los anticuerpos también se pueden conjugar con una enzima activadora de profármaco contra el cáncer que es capaz de convertir el profármaco a su forma activa.
Tal y como se utiliza en la presente memoria, el término «diacuerpos» hace referencia a pequeños fragmentos de anticuerpos con dos sitios de fijación a antígeno, en donde dichos fragmentos comprenden un dominio variable de la cadena pesada (Vh) conectado a un dominio variable de la cadena ligera (Vl) en la misma cadena polipeptídica (Vh-Vl ). Al utilizar un conector que es demasiado corto para permitir el emparejamiento entre los dos dominios en la misma cadena, se fuerza a que los dominios se emparejen con los dominios complementarios de otra cadena y creen dos sitios de fijación al antígeno. Los diacuerpos se describen con más detalle en, p. ej., la patente europea Ep 404097; la solicitud de patente internacional WO 93/11161; y Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-48 (1993).
El término «agotar», en el contexto del efecto de un agente de fijación a 158P1D7 en las células que expresan la 158P1D7, se refiere a una reducción del número de las células que expresan la 158P1D7, o a su eliminación.
El término «producto génico» se utiliza en la presente memoria para indicar un péptido/proteína o ARNm. Por ejemplo, un «producto génico de la invención» a veces recibe el nombre en la presente memoria de una «secuencia aminoacídica del cáncer», «proteína del cáncer», «proteína de un cáncer recogido en la tabla I», un «ARNm del cáncer», un «ARNm de un cáncer recogido en la tabla I», etc. En una realización, la proteína del cáncer está codificada por un ácido nucleico de la figura 1. La proteína del cáncer puede ser un fragmento o, como alternativa, puede ser la proteína completa codificada por los ácidos nucleicos de la figura 1. En una realización, una secuencia aminoacídica de cáncer se utiliza para determinar la identidad o similitud de las secuencias. En otra realización, las secuencias son variantes alélicas que se producen de forma natural de una proteína codificada por un ácido nucleico de la figura 1. En otra realización, las secuencias son variantes de secuencia tal y como se describe adicionalmente en la presente memoria.
Los anticuerpos «heteroconjugados» son útiles en los presentes métodos y composiciones. Tal y como se usan en la presente memoria, el término «anticuerpo heteroconjugado» hace referencia a dos anticuerpos unidos covalentemente. Tales anticuerpos se pueden preparar con el uso de los métodos conocidos en la química de la síntesis de proteínas, incluidos los agentes de entrecruzamiento. Véase, por ejemplo, la patente de los EE. UU. n.° 4676 980.
El término «homólogo» hace referencia a una molécula que presenta homología con otra molécula, al tener, por ejemplo, secuencias de restos químicos que son iguales o parecidos a los de las posiciones correspondientes.
En una realización, el anticuerpo dado a conocer en la presente memoria es un «anticuerpo humano». Tal y como se utiliza en la presente memoria, el término «anticuerpo humano» hace referencia a un anticuerpo en el cual esencialmente toda la secuencia de la cadena y de la cadena pesada, que incluyen las regiones determinantes de complementariedad (CDR), proceden de genes de humano. En una realización, los anticuerpos monoclonales de humano se preparan mediante la técnica del trioma, la técnica de linfocitos B humanos (véase, p. ej., Kozbor et al., Immunology Today4: 72 (1983)), técnica de transformación con EBV (véase, p. ej., Cole et al., «Monoclonal antibodies and cancer therapy» 77-96 (1985)), o con el uso de la presentación en fagos (véase, p. ej., Marks et al., J. Mol. Biol.
222: 581 (1991)). En una realización específica, el anticuerpo humano se genera en un ratón transgénico. Las técnicas para hacer tales anticuerpos total o parcialmente humanos se conocen en la técnica y se puede utilizar cualquiera de estas tecnologías. De acuerdo con una realización particularmente preferida, las secuencias de anticuerpos totalmente humanos se fabrican en un ratón transgénico manipulado genéticamente para que exprese los genes de la cadena pesada y de la cadena ligera de los anticuerpos de humano. Una descripción de ejemplo de la preparación de ratones transgénicos que producen anticuerpos humanos se halla en la solicitud de patente internacional WO 02/43478 y en la patente de los EE. UU. n.° 6657 103 (Abgenix) y su progenie. Los linfocitos B de los ratones transgénicos que producen el anticuerpo deseado se pueden entonces fusionar para formar líneas celulares de hibridoma para la producción continua del anticuerpo. Véanse, p. ej., las patentes de los EE. UU. n.os 5569825; 5625 126; 5633 425; 5 661 016; y 5545 806; y Jakobovits, Adv. Drug Del. Rev. 31: 33-42 (1998); Green et al., J. Exp. Med. 188: 483-95 (1998).
Tal y como se usa en la presente memoria, el término «anticuerpo humanizado» hace referencia a formas de anticuerpos que contienen secuencias de anticuerpo que no son de humano (p. ej., murinas), así como de anticuerpos de humanos. Tales anticuerpos son anticuerpos quiméricos que contienen muy poca secuencia procedente de inmunoglobulina no humana. Por lo general, en anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todo de al menos uno, y típicamente dos, dominios variables, en donde todos o sustancialmente todos los lazos hipervariables corresponden a los de una inmunoglobulina no humana y todas o sustancialmente todas las regiones FR son las de una secuencia de inmunoglobulina de humano. El anticuerpo humanizado también comprenderá optativamente al menos una porción de una región constante de inmunoglobulina (Fc), típicamente la de una inmunoglobulina de humano. Véanse, p. ej., la patente de los EE. UU. a Cabilly n.° 4816567; Queen et al. (1989) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86: 10029-10033; y Antibody Engineering: A Practical Approach (Oxford University Press 1996).
Los términos «inhibir» o «inhibición de», tal y como se usan en la presente memoria, significan la reducción hasta una cantidad mensurable, o la prevención completa.
Las frases «aislado» o «biológicamente puro» hacen referencia al material que está sustancial o esencialmente libre de los componentes que suelen acompañar al material tal y como se halla en su estado nativo. Así pues, los péptidos aislados de acuerdo con la invención no contienen, preferiblemente, los materiales que suelen estar asociados a los péptidos en su entorno in situ. Por ejemplo, un polinucleótido se dice que está «aislado» cuando está sustancialmente separado de polinucleótidos contaminantes que corresponden, o que son complementarios a, los genes que no son los genes de 158P1D7 o que codifican polipéptidos que no son los del producto génico 158P1D7 o fragmentos del mismo. Un experto en la técnica puede emplear con facilidad los procedimientos de aislamiento de ácidos nucleicos para obtener un polinucleótido de 158P1D7 aislado. Una proteína se dice que está «aislada», por ejemplo, cuando se emplean métodos físicos, mecánicos o químicos para retirar las proteínas 158P1D7 de los constituyentes celulares que suelen estar asociados a la proteína. Un experto en la técnica puede emplear con facilidad los métodos estándares de purificación para obtener una proteína 158P1D7 aislada. Como alternativa, una proteína aislada se puede preparar por medios químicos.
Las «marcaciones» idóneas incluyen radionúclidos, enzimas, sustratos, cofactores, inhibidores, restos fluorescentes, restos quimioluminiscentes, partículas magnéticas, y similares. Las patentes que dan a conocer el uso de tales marcaciones incluyen las patentes de los EE. UU. n.os 3817 837; 3850 752; 3 939 350; 3996 345; 4277 437; 4 275 149; y 4366 241. Además, los anticuerpos dados a conocer en la presente memoria pueden ser útiles como componente de fijación al antígeno de los fluorocuerpos. Véase, p. ej., Zeytun et al., Nat. Biotechnol. 21: 1473-79 (2003).
El término «mamífero» hace referencia a cualquier organismo clasificado como mamífero, incluidos los ratones, ratas, conejos, perros, gatos, vacas, caballos y humanos. En una realización de la invención, el mamífero es un ratón. En otra realización de la invención, el mamífero es un humano.
Los términos «cáncer metastásico» y «enfermedad metastásica» significan cánceres que se han diseminado a los ganglios linfáticos regionales o a sitios distantes, y se pretende que incluyan la enfermedad en estadio D según el sistema AUA, y en el estadio TxNxM+ según el sistema TNM.
El término «modulador» o «compuesto problema» o «fármaco candidato» o los equivalentes gramaticales, tal y como se usan en la presente memoria, describen cualquier molécula, p. ej., proteína, oligopéptido, molécula orgánica pequeña, polisacárido, polinucleótido, etc., a la que hay que analizar su capacidad para alterar directa o indirectamente el fenotipo del cáncer o la expresión de una secuencia de cáncer, p. ej., una secuencia de ácido nucleico o de proteína, o afectar a las secuencias de cáncer (p. ej., señalización, expresión génica, interacción entre proteínas, etc.). Un modulador neutralizará el efecto de una proteína de cáncer utilizada en la invención. Por «neutralizar» se entiende que se inhibe o bloquea una actividad de una proteína, junto con el efecto consiguiente sobre la célula. Además, un modulador neutralizará el efecto de un gen, y de su correspondiente proteína utilizada en la invención, al normalizar la cantidad de dicha proteína. Por ejemplo, los moduladores alteran los perfiles de expresión, o el perfil de expresión de ácidos nucleicos o proteínas en la presente memoria, o vías efectoras posteriores. En otro ejemplo, el modulador suprime un fenotipo de cáncer, p. ej., para dar una huella genética de tejido normal. En otro ejemplo, un modulador inducía un fenotipo de cáncer. Por lo general, se corren en paralelo muchas mezclas de ensayos con diferentes concentraciones de los agentes para obtener una respuesta diferencial a las diferentes concentraciones. Típicamente, una de esas concentraciones sirve de control negativo, es decir, a la concentración cero o por debajo del nivel de detección.
Los moduladores, los fármacos candidatos o los compuestos problema abarcan muchas clases químicas, aunque típicamente son moléculas orgánicas, preferiblemente compuestos orgánicos pequeños, que tienen una masa molecular de más de 100 Da y menos de aproximadamente 2 500 Da. Las moléculas pequeñas preferidas tienen menos de 2 000 Da, o menos de 1500 Da, o menos de 1000 Da o menos de 500 Da. Los compuestos candidatos comprenden los grupos funcionales necesarios para la interacción estructural con las proteínas, sobre todo puentes de hidrógeno, e incluyen típicamente al menos un grupo amina, carbonilo, hidroxilo o carboxilo, preferiblemente al menos dos de los grupos químicos funcionales. Los compuestos candidatos comprenden estructuras cíclicas de carbono o heterocíclicas, y/o estructuras aromáticas o poliaromáticas con sustituciones de uno o varios de los grupos funcionales mencionados más arriba. Los moduladores también comprenden biomoléculas, tales como péptidos, glúcidos, ácidos grasos, esteroides, purinas, pirimidinas, derivados, análogos estructurales o combinaciones de los mismos. Los péptidos son particularmente preferidos. Una clase de moduladores son péptidos, por ejemplo, de aproximadamente 5 a aproximadamente 35 aminoácidos, preferiblemente de aproximadamente 5 a aproximadamente 20 aminoácidos, y particularmente preferidos de aproximadamente 7 a aproximadamente 15. Preferiblemente, la proteína moduladora de cáncer es soluble, incluye una región que no es transmembranaria, y/o tiene una Cys en el extremo amino para ayudar a la solubilidad. El extremo carboxilo del fragmento se mantiene como un ácido libre y el extremo amino es una amina libre para ayudar a la conjugación, es decir, con la cisteína. En un ejemplo, una proteína de cáncer está conjugada a un agente inmunógeno tal y como se explica en la presente memoria. En un ejemplo, la proteína de cáncer está conjugada a la SAB. Los péptidos descritos en la presente memoria, p. ej., de las longitudes preferidas, se pueden conectar entre sí o con otros aminoácidos para crear un péptido o proteína más largo. Los péptidos moduladores pueden ser productos de digestión de las proteínas que se producen en la naturaleza, tal y como se esboza más arriba, péptidos aleatorizados, o péptidos aleatorizados «sesgados». En un ejemplo, los moduladores basados en péptidos o proteínas son anticuerpos, y fragmentos de los mismos, tal y como está descrito en la presente memoria.
El término «anticuerpo monoclonal», tal y como se usa en la presente memoria, hace referencia a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, cada uno de los anticuerpos que conforman la población son idénticos, salvo por las posibles mutaciones que aparezcan de forma natural que podrían estar presentes en cantidades minoritarias. Los anticuerpos monoclonales son muy específicos y están dirigidos contra un único epítopo antigénico. En cambio, las preparaciones convencionales de anticuerpos (policlonales) incluyen típicamente numerosos anticuerpos dirigidos contra (o específicos de) diferentes epítopos. En una realización, el anticuerpo policlonal contiene numerosos anticuerpos monoclonales con diferente especificidad, afinidad o avidez de epítopo dentro de un único antígeno que contiene numerosos epítopos antigénicos. El modificador «monoclonal» indica que el carácter del anticuerpo se obtuvo de una población sustancialmente homogénea de anticuerpos, y no se debe interpretar que requiere que la producción del anticuerpo sea mediante ningún método concreto. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales a utilizar de acuerdo con la presente invención se pueden fabricar mediante el método de hibridomas descrito por primera vez por Kohler et al., Nature 256: 495 (1975), o se pueden fabricar mediante métodos de ADN recombinante (véase, p. ej., la patente de los EE. UU. n.° 4 816 567). Los «anticuerpos monoclonales» también se pueden aislar de genotecas de anticuerpos en fagos mediante el uso de las técnicas descritas por Clackson et al., Nature 352: 624-628 (1991) y Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1991), por ejemplo. Estos anticuerpos monoclonales se fijarán normalmente con una Kd de al menos aproximadamente 1 pM, más normalmente al menos aproximadamente 300 nM, típicamente al menos aproximadamente 30 nM, preferiblemente al menos aproximadamente 10 nM, más preferiblemente al menos aproximadamente 3 nM o mejor, que se suele determinar por ELISA.
Un «excipiente farmacéutico» comprende un material, tal como un adyuvante, un vehículo, un agente para ajustar el pH y tamponar, ajustadores de la tonicidad, humectantes, conservantes, y similares.
«Farmacéuticamente aceptable» hace referencia a un agente o composición inerte que no es tóxica y que es compatible desde el punto de vista fisiológico con los humanos o con otros mamíferos.
El término «polinucleótido» significa una forma polimérica de nucleótidos con una longitud de al menos 10 bases o pares de bases, bien sea de ribonucleótidos o de desoxirribonucleótidos, o una forma modificada de algún tipo de nucleótido, y se pretende que incluya las formas monocatenaria y bicatenaria del ADN y/o del ARN. En el campo de la técnica, este término se utiliza a menudo de manera intercambiable con «oligonucleótido». Un polinucleótido puede comprender una secuencia de nucleótidos descrita en la presente memoria, en donde la timina (T), tal y como se muestra por ejemplo en la figura 1, también puede ser uracilo (U); esta definición incumbe a las diferencias entre las estructuras químicas del ADN y del ARN, en concreto la observación de que una de las cuatro bases principales del ARN es uracilo (U) en lugar de timina (T).
El término «polipéptido» significa un polímero de al menos aproximadamente 4, 5, 6, 7 u 8 aminoácidos. A lo largo de la especificación se utilizan para los aminoácidos las designaciones estándares de tres letras (véase la tabla III) o de una única letra. En el ámbito de la técnica, este término a menudo se usa de manera intercambiable con «péptido» o «proteína».
Una molécula de ADN o ARN «recombinante» es una molécula de ADN o ARN que se ha sometido a la manipulación molecular in vitro.
Tal y como se utiliza en la presente memoria, el término anticuerpo de «monocatenario Fv» o «scFv» o de «una sola cadena» hace referencia a los fragmentos de anticuerpo que comprenden los dominios Vh y Vl del anticuerpo, en donde estos dominios están presentes en una sola cadena polipeptídica. Por lo general, el polipéptido Fv comprende además un conector polipeptídico entre los dominios Vh y Vl que permite que el sFv forme la estructura deseada para la fijación del antígeno. Para una revisión de los scFv, véase Pluckthun, The Pharmacology o f Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore, eds. Springer-Verlag, Nueva York, págs 269-315 (1994).
Tal y como se utiliza en la presente memoria, los términos «específico», «se fija específicamente» y «fijación específica» hacen referencia a la fijación selectiva del anticuerpo al epítopo del antígeno deseado. A los anticuerpos se les puede analizar su especificidad de fijación al comparar la fijación a un antígeno adecuado con la fijación a un antígeno irrelevante o a una mezcla de antígenos en un conjunto de condiciones dadas. Si el anticuerpo se fija al antígeno adecuado al menos 2, 5, 7 y preferiblemente 10 veces más que al antígeno irrelevante o a la mezcla de antígenos, entonces se considera que es específico. En una realización, un anticuerpo específico es uno que solo se fija al antígeno 158P1D7, pero que no se fija al antígeno irrelevante. En otra realización, un anticuerpo específico es uno que se fija al antígeno 158P1D7 humano, pero que no se fija a un antígeno 158P1D7 que no sea humano con una homología de aminoácidos del 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o mayor con el antígeno 158P1D7. En otra realización, un anticuerpo específico es uno que se fija al antígeno 158P1D7 de humano y que se fija al antígeno 158P1D7 murino, pero con un grado más alto de fijación al antígeno humano. En otra realización, un anticuerpo específico es uno que se fija al antígeno 158P1D7 de humano y que se fija al antígeno 158P1D7 de primate, pero con un grado más elevado de fijación al antígeno humano. En otra realización, el anticuerpo específico se fija al antígeno 158P1D7 de humano y a cualquier antígeno 158P1D7 que no sea de humano, pero con un grado más elevado de fijación al antígeno de humano o cualquier combinación de los mismos.
Tal y como se utiliza en la presente memoria, «tratar» o «terapéutico» y los términos relacionados desde el punto de vista gramatical hacen referencia a cualquier mejora de cualquier consecuencia de enfermedad, tal como la prolongación de la supervivencia, menos morbilidad y/o una reducción de los efectos secundarios que son el subproducto de una modalidad terapéutica alternativa; tal y como se aprecia con facilidad en la técnica, es preferible la erradicación completa de la enfermedad, aunque no es un requisito para un acto de tratamiento.
El término «variante» hace referencia a una molécula que muestra una variación desde un tipo o norma descrita, tal como una proteína que tiene uno o varios restos aminoacídicos diferentes en las correspondientes posiciones de una proteína específicamente descrita (p. ej., la proteína 158P1D7 que se muestra en la figura 1). Un análogo es un ejemplo de una proteína variante. Las isoformas de ayuste y los polimorfismos mononucleotídicos (SNP, por su nombre en inglés) son otros ejemplos de variantes.
Tal y como se utiliza en la presente memoria, las «proteínas 158P1D7» y/o las «proteínas relacionadas con 158P1D7» incluyen las específicamente identificadas en la presente memoria (véase la figura 1) así como variantes alélicas, variantes por sustitución conservativa, análogos y homólogos que se pueden aislar/generar y caracterizar sin experimentación innecesaria si se siguen los métodos esbozados en la presente memoria o de fácil acceso en la técnica. También están incluidas las proteínas de fusión que combinan partes de diferentes proteínas 158P1D7 o fragmentos de las mismas, así como las proteínas de fusión de una proteína 158P1D7 y un polipéptido heterólogo.
Tales proteínas 158P1D7 se denominan de forma colectiva proteínas relacionadas con 158P1D7, las proteínas de la invención, o 158P1D7. El término «proteína relacionada con 158P1D7» se refiere a un fragmento de polipéptido o una secuencia de la proteína 158P1D7 de 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 o más de 25 aminoácidos; o, al menos 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 330, 335, 345, 355, 365, 375, 385, 395, 405, 425, 450, 475, 500, 525, 550, 575, 600, 625, 650, 675, 700, 725, 750, 775, 800, 825, 830, 835, 840, 841 o más aminoácidos.
II.) Anticuerpos contra 158P1D7
Otro aspecto de la invención da a conocer anticuerpos que se fijan a las proteínas relacionadas con 158P1D7 (véase la figura 1). En una realización, el anticuerpo de la invención que se fija a las proteínas relacionadas con 158P1D7 es un anticuerpo que se fija específicamente a la proteína 158P1D7 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID n.° 2. El anticuerpo que se fija específicamente a la proteína 158P1D7 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID n.° 2 incluye los anticuerpos que pueden fijarse a otras proteínas relacionadas con 158P1D7.
Por ejemplo, los anticuerpos que se fijan a la proteína 158P1D7 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID n.° 2 pueden fijarse a las proteínas relacionadas con 158P1D7, tales como las variantes de 158P1D7 y los homólogos o análogos de la misma.
Los anticuerpos contra 158P1D7 de la invención son particularmente útiles en los ensayos pronósticos del cáncer (véase, p. ej., la tabla I), en el diagnóstico por imagen, y en las metodologías diagnósticas y terapéuticas. De igual forma, tales anticuerpos son útiles para el tratamiento y/o pronóstico del cáncer de vejiga y otros cánceres, hasta el punto en que la 158P1D7 también se expresa o sobreexpresa en estos otros cánceres. Además, los anticuerpos 158P1D7 de la invención son terapéuticamente útiles para el tratamiento de cánceres en los que está implicada la expresión de 158P1D7, sobre todo el cáncer de vejiga, tal como el cáncer de vejiga avanzado o metastásico, cuando los anticuerpos están conjugados a la monometilauristatina E (MMAE) descrita en la presente memoria.
Se conocen bien en la técnica diferentes métodos para preparar anticuerpos, sobre todo anticuerpos monoclonales.
Por ejemplo, los anticuerpos se pueden preparar mediante la inmunización de un mamífero hospedador idóneo al hacer uso de una proteína relacionada con 158P1D7, péptido o fragmento de la misma, en una forma aislada o inmunoconjugada (Antibodies: A Laboratory Manual, CSH Press, Eds, Harlow y Lane (1988); Harlow, Antibodies, Cold Spring Harbor Press, NY, (1989)). Además, también se pueden utilizar las proteínas de fusión de 158P1D7, tal como la proteína de fusión de 158P1D7 con GST. Por ejemplo, se produce una proteína de fusión con GST que comprende toda o la mayor parte de la secuencia de aminoácidos de la figura 1 y a continuación se utiliza como inmunógeno para generar los anticuerpos apropiados. En otra realización, se sintetiza una proteína relacionada con 158P1D7 y se utiliza como inmunógeno.
Además, se utilizan técnicas de inmunización con ADN desnudo conocidas en la técnica (con o sin células que expresan la 158P1D7 o la proteína relacionada con 158P1D7 purificada) para generar una respuesta inmunitaria contra el inmunógeno codificado (para una revisión, véase Donnelly et al., 1997, Ann. Rev. Immunol. 15: 617-648).
Se puede analizar la secuencia aminoacídica de una proteína 158P1D7 tal y como se muestra en la figura 1 para seleccionar regiones específicas de la proteína 158P1D7 para la generación de anticuerpos. Por ejemplo, los análisis de hidrofobia e hidrofilia de una secuencia aminoacídica de 158P1D7 se utilizan para identificar las regiones hidrófilas en la estructura de 158P1D7. Las regiones de una proteína 158P1D7 que muestran una estructura inmunógena, así como otras regiones y dominios, se pueden identificar con facilidad al hacer uso de otros métodos diferentes conocidos en la técnica, tales como los análisis de Chou-Fasman, Garnier-Robson, Kyte-Doolittle, Eisenberg, Karplus-Schultz o Jameson-Wolf. Los perfiles de hidrofilia se pueden generar con el método de Hopp, T. P y Woods, K. R., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci, USA. 78: 3824-3828. Los perfiles de hidropatía se pueden generar con el método de Kyte, J. y Doolittle, R. F., 1982, J. Mol. Biol., 157: 105-132. Se pueden generar perfiles de porcentaje (%) de restos accesibles con el método de Janin J., 1979, Nature 277: 491-492. Se pueden generar perfiles de flexibilidad media con el método de Bhaskaran R., Ponnuswamy P. K., 1988, Int. J. Pept. Protein. Res. 32: 242-255. Se pueden generar perfiles de giros p con el método de Deleage, G., Roux B., 1987, Protein Engineering 1: 289-294. Los métodos preferidos para la generación de anticuerpos contra 158P1D7 se ilustran adicionalmente por medio de los ejemplos dados a conocer en la presente memoria. Los métodos para preparar una proteína o polipéptido para ser usado como inmunógeno se conocen bien en la técnica. También se conocen bien en la técnica los métodos para preparar conjugados inmunógenos de una proteína con un vehículo, tal como SAB, KLH u otro vehículo proteico. En algunas circunstancias, se utiliza la conjugación directa, por ejemplo, se utilizan reactivos de carbodiimida; en otros casos, son eficaces los reactivos de conexión, tales como los suministrados por Pierce Chemical Co., Rockford, IL. La administración de un inmunógeno 158P1D7 a menudo se lleva a cabo mediante la inyección durante un periodo de tiempo idóneo y con el uso de un adyuvante idóneo, como se conoce en la técnica. Durante el calendario de inmunización, se pueden tomar títulos de los anticuerpos para determinar la conveniencia de la formación de los anticuerpos.
Los anticuerpos monoclonales contra 158P1D7 se pueden producir por los diferentes medios bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, las líneas de células inmortalizadas que secretan un anticuerpo monoclonal deseado se preparan con el uso de la tecnología estándar de hibridomas de Kohler y Milstein, o las modificaciones que inmortalizan los linfocitos B productores del anticuerpo, tal y como se conoce en líneas generales. Las líneas de células inmortalizadas que secretan los anticuerpos deseados se analizan sistemáticamente con un inmunoensayo en el que el antígeno es una proteína relacionada con 158P1D7. Cuando se identifica el cultivo de las células inmortalizadas adecuadas, se pueden expandir las células y se pueden producir los anticuerpos desde cultivos in vitro o bien desde líquido ascítico.
Los anticuerpos o fragmentos de la invención también se pueden producir por medios recombinantes. Las regiones que se fijan específicamente a las regiones deseadas de una proteína 158P1D7 también se pueden producir en el contexto de anticuerpos quiméricos o con injerto de región determinante de la complementariedad (CDR) cuyo origen está muchas especies. También se pueden producir anticuerpos contra 158P1D7 humanizados o humanos y se prefieren para el uso en contextos terapéuticos. Se conocen bien los métodos para humanizar los anticuerpos murinos y otros anticuerpos no humanos, por sustitución de una o más de las CDR de anticuerpo no humano por las correspondientes secuencias de anticuerpo humano (véanse, por ejemplo, Jones et al., 1986, Nature, 321: 522-525; Riechmannn et al., 1988, Nature 332: 323-327; Verhoeyen et al., 1988, Science, 239: 1534-1536). Véanse también Carter et al., 1993, Proc. Natl,. Acad. Sci. USA, 89: 4285 y Sims et al., 1993, J. Immunol. 151: 2296.
En una realización preferida, los anticuerpos de la presente invención comprenden anticuerpos contra 158P1D7 totalmente humanos (Acm contra 158P1D7). Diferentes métodos en la técnica dan a conocer los medios para producir los Acm contra 158P1D7 totalmente humanos. Por ejemplo, una realización preferida da a conocer técnicas que utilizan ratones transgénicos, con la producción de sus anticuerpos nactivada pero que se han manipulado genéticamente con locus para las cadenas pesada y ligera de humano, que se denominan Xenomouse (Amgen Freemont, Inc.). Una descripción de ejemplo para preparar ratones transgénicos que producen anticuerpos humanos se puede encontrar en la patente de los EE. UU n.° 6657 103. Véanse también las patentes de los EE. UU. n.os 5 569 825; 5 625 126; 5633 425; 5 661 016; y 5545 806; y Mendez et al., Nature Genetics, 15: 146-156 (1998); Kellerman, S. A y Green, L. L., Curr. Opin. Biotechnol. 13, 593-597 (2002).
Además, los anticuerpos humanos de la invención se pueden generar mediante el uso del ratón HuMAb (Medarex, Inc.) que contiene los minilocus del gen de la inmunoglobulina humana que codifican secuencias de inmunoglobulina de las cadenas pesada (|j y y) y ligera k sin reordenar, junto con las mutaciones deseadas que inactivan los locus de las cadenas j y k (véase, p. ej., Lonberg et al. (1994) Nature 368 (6474): 856-859).
En otra realización, los anticuerpos totalmente humanos de la invención se pueden generar al hacer uso de un ratón que lleva secuencias de inmunoglobulina humana en los transgenes y los transcromosomas, tal como un ratón que lleva un transgén de la cadena pesada de humano y un transcromosoma con la cadena ligera de humano. Tales ratones, denominados en la presente memoria «ratones KM», están descritos en Tomizuka et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 722-727 y en la publicación de patente internacional en el marco PCT WO 02/43478 para Tomizuka et al.
Los anticuerpos monoclonales humanos de la invención también se pueden preparar con los métodos de presentación en fagos para escrutar genotecas de genes de inmunoglobulinas de humano. Tales métodos de presentación en fago para aislar los anticuerpos humanos están consolidados en la técnica. Véanse, por ejemplo: las patentes de los EE. UU. n.os 5223409; 5403 484; y 5571 698 para Ladner et al.; las patentes de los EE. UU. n.os 5427908 y 5580 717 para Dower et al.; las patentes de los EE. UU. n.os 5969 108 y 6 172 197 para McCafferty et al.; y las patentes de los EE. UU. n.os 5885793; 6521 404; 6544 731; 6555 313; 6582 915 y 6593 081 para Griffiths et al.
También se pueden preparar los anticuerpos monoclonales humanos de la invención mediante el uso de ratones con IDCG en los que las células inmunitarias humanas se han reconstituido de tal manera que se puede generar una respuesta con anticuerpos humanos tras la inmunización. Tales ratones se describen en, por ejemplo, las patentes de los EE. UU. n.os 5476996 y 5698 767 para Wilson et al.
Los anticuerpos monoclonales humanos de la invención también se pueden preparar mediante el uso de ratones en los cuales las secuencias genómicas que llevan segmentos variables endógenos de ratón en los locus de inmunoglobulina para la cadena pesada (segmentos VH, DH y JH) y/o para la cadena ligera k (VK y JK) han sido remplazados, en su totalidad o en parte, por secuencias genómicas humanas que llevan segmentos variables germinales sin reorganizar de inmunoglobulina humana en los locus de la cadena pesada (VH, DH y JH) y/o de la cadena ligera k (VK y JK) (Regeneron, Tarrytown, NY). Véanse, por ejemplo, las patentes de los EE. UU. n.os6586251; 6 596 541; 7 105348; 6528 313; 6638 768 y 6528 314.
En una realización, un Acm contra 158P1D7 de la invención comprende las regiones variables de la cadena pesada y de la cadena ligera de un anticuerpo denominado Ha15-10ac12 producido por una célula de ovario de hámster chino (CHO, por su nombre en inglés) depositada en la American Type Culture Collection (ATCC) con n.° de acceso PTA-13102 (véase la figura 3), o regiones variables de la cadena pesada y de la cadena ligera que comprenden secuencias de aminoácidos que son homólogas a las secuencias de aminoácidos de las regiones variables de la cadena pesada y de la cadena ligera de Ha15-10ac12, tal como fragmentos funcionales del mismo, y en donde los anticuerpos conservan las propiedades funcionales deseadas de los Acm contra 158P1D7 de la invención. La región variable de la cadena pesada de Ha15-10ac12 tiene la secuencia de aminoácidos que va del 1.° resto Q al 120.° resto S de la SEQ ID n.° 7, y la región variable de la cadena ligera de Ha15-10ac12 tiene la secuencia de aminoácidos que va del 1.° resto D al 113.° resto R de la SEQ ID n.° 8.
En una realización, el anticuerpo contra 158P1D7 contiene las CDR de la cadena pesada y de la cadena ligera de las regiones variables de la cadena pesada y de la cadena ligera de HA15-10ac12, esto es, el anticuerpo contra 158P1D7 contiene una región variable de la cadena pesada que comprende las CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3 de la secuencia de aminoácidos presentada en la SEQ ID n.° 7 y una región variable de la cadena ligera que comprende las CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 de la secuencia de aminoácidos presentada en la SEQ ID n.° 8, en donde las CDR se determinan mediante el esquema de numeración de Kabat, Chothia o Contact. En un aspecto, las CDR1-3 de la región variable de la cadena pesada de Ha15-10ac12 contienen las secuencias de aminoácidos que abarcan los restos 31 a 35, los restos 50 a 66 y los restos 99 a 109, respectivamente, de la SEQ ID n.° 7. En un aspecto, las CDR1-3 de la región variable de la cadena ligera de Ha15-10ac12 contienen las secuencias de aminoácidos que abarcan los restos 24 a 39, los restos 55 a 61 y los restos 94 a 102, respectivamente, de la SEQ ID n.° 8. Así pues, en algunos aspectos, el anticuerpo contra 158P1D7 contiene una CDR1 de la cadena pesada que tiene los restos 31 a 35 de la SEQ ID n.° 7, una CDR2 de la cadena pesada que tiene los restos 50 a 66 de la SEQ ID n.° 7 y/o una CDR3 de la cadena pesada que tiene los restos 99 a 109 de la SEQ ID n.° 7 y/o una CDR1 de la cadena ligera que tiene los restos 24 a 39 de la Se Q ID n.° 8, una CDR2 que tiene los restos 55 a 61 de la SEQ ID n.° 8 y/o una CDR3 que tiene los restos 94 a 102 de la SEQ ID n.° 8. De igual forma, entre las realizaciones dadas a conocer se encuentran anticuerpos que compiten por la fijación al antígeno con anticuerpos que tienen tal región variable y/o secuencias de CDR. En algunas realizaciones, el anticuerpo dado a conocer incluye una región constante. La región constante puede ser cualquier subclase de región constante. En una realización, se puede utilizar la región constante de IgG2 de humano como la región constante de la cadena pesada y la región constante de k de Ig humana como la región constante de la cadena ligera.
Por ejemplo, la invención da a conocer un anticuerpo monoclonal aislado, o porción de fijación al antígeno del mismo, que comprende una región variable de la cadena pesada y una región variable de la cadena ligera, en donde:
(a) la región variable de la cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos que es homóloga al menos al 80% a la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada presentada en la figura 3; y
(b) la región variable de la cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos que es homóloga al menos al 80% a la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera presentada en la figura 3.
En otras realizaciones, las secuencias de aminoácidos de Vh y/o Vl pueden ser homólogas al 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% con las secuencias de Vh y Vl presentadas en la figura 3.
En otra realización, la invención da a conocer un anticuerpo monoclonal aislado, o porción de fijación al antígeno del mismo, que comprende una región variable de la cadena pesada humanizada y una región variable de la cadena ligera humanizada, en donde:
(a) la región variable de la cadena pesada comprende tres regiones determinantes de la complementariedad (CDR) que tienen la secuencia de aminoácidos de las CDR 1, 2 y 3 de la región variable de la cadena pesada, de la región variable de la cadena pesada presentada en la figura 3, según se determina con el esquema de numeración de Kabat, Chothia o Contact.
(b) la región variable de la cadena ligera comprende tres CDR que tienen la secuencia de aminoácidos de las CDR 1, 2 y 3 de la región variable de la cadena ligera, de la región variable de la cadena ligera presentada en la figura 3, según se determina con el esquema de numeración de Kabat, Chothia o Contact.
En otra realización, el anticuerpo o porción de fijación al antígeno del mismo compite por la fijación con un anticuerpo que tiene tales CDR de la cadena pesada y/o de la cadena ligera.
Los anticuerpos manipulados genéticamente de la invención incluyen aquellos en los que se han realizado modificaciones en los restos flanqueantes dentro de Vh y/o Vl (p. ej., para mejorar las propiedades del anticuerpo). Típicamente, tales modificaciones de las regiones flanqueantes se realizan para reducir la inmunogenia del anticuerpo. Por ejemplo, una estrategia es «retromutar» uno o varios restos flanqueantes en la correspondiente secuencia germinal. Más en concreto, un anticuerpo que ha sufrido una mutación somática puede contener restos flanqueantes que difieren de la secuencia germinal de la cual procede el anticuerpo. Tales restos se pueden identificar al comparar las secuencias flanqueantes del anticuerpo con las secuencias germinales de las cuales procede el anticuerpo. Para devolver la secuencia de las regiones flanqueantes a su configuración germinal, las mutaciones somáticas se pueden «retromutar» en la secuencia germinal mediante, por ejemplo, la mutagénesis específica de sitio o la mutagénesis por PCR (p. ej., «retromutarse» de leucina a metionina). Tales anticuerpos «retromutados» también se pretende que queden abarcados por la invención.
Otro tipo de modificación de la región flanqueante implica la mutación de uno o varios restos dentro de la región flanqueante para retirar los epítopos de los linfocitos T, con lo que se reduce la posible inmunogenia del anticuerpo. Esta estrategia también se denomina «desinmunización» y se describe con más detalle en la publicación de patente de los EE. UU. n.° 2003/0153043 para Carr et al.
Además, o como alternativa a las modificaciones hechas dentro de las regiones flanqueantes, se pueden manipular genéticamente los anticuerpos de la invención para incluir modificaciones dentro de la región Fc, típicamente para alterar una o varias propiedades funcionales del anticuerpo, tal como la semivida en el suero, la fijación del complemento, la fijación al receptor de Fc y/o citotoxicidad celular dependiente de antígenos. Además, un Acm contra 158P1D7 de la invención puede estar modificado químicamente (p. ej., se pueden unir al anticuerpo uno o varios restos químicos) o puede estar modificado para alterar su glucosilación, de nuevo para alterar una o varias propiedades funcionales del Acm. Cada una de estas realizaciones se describe con más detalle a continuación.
En una realización, la región bisagra de CH1 está modificada de tal manera que se altera, p. ej., se incrementa o se disminuye, el número de restos de cisteínas en la región bisagra. Esta estrategia se describe adicionalmente en la patente de los EE. UU. n.° 5677 425 para Bodmer et al. El número de restos de cisteína en la región bisagra de CH1 se altera para, por ejemplo, facilitar el ensamblaje de las cadenas ligera y pesada o para incrementar o disminuir la estabilidad del Acm contra 158P1D7.
En otra realización, la región bisagra de Fc de un anticuerpo está mutada para disminuir la semivida biológica del Acm contra 158P1D7. Más en concreto, se introducen una o varias mutaciones aminoacídicas en la región de la interfase de los dominios CH2-CH3 del fragmento bisagra de Fc de tal manera que el anticuerpo se fija peor a la proteína A estafilocócica (SpA) con respecto a la fijación de SpA al dominio nativo de la bisagra de Fc. Esta estrategia se describe con mayor detalle en la patente de los EE. UU. n.° 6 165745 para Ward et al.
En otra realización, el Acm contra 158P1D7 está modificado para incrementar su semivida biológica. Son posibles varias estrategias. Por ejemplo, las mutaciones se pueden introducir tal y como se describe en la patente de los EE. UU. n.° 6277 375 para Ward. Como alternativa, para incrementar la semivida biológica, se puede alterar el anticuerpo dentro de la región CH1 o CL para que contenga un epítopo de fijación al receptor de rescate tomado de dos lazos de un dominio CH2 de una región Fc de una IgG, tal y como se describe en las patentes de los EE. UU. n.os 5869046 y 6 121 022 para Presta et al.
Aún en otras realizaciones, la región Fc está alterada por el remplazo de al menos un resto aminoacídico por un resto aminoacídico diferente para alterar una o varias funciones efectoras del Acm contra 158P1D7. Por ejemplo, uno o varios aminoácidos seleccionados de restos aminoacídicos específicos se pueden remplazar por un resto aminoacídico diferente de tal manera que se altere la afinidad del anticuerpo por un ligando efector, pero conserve la capacidad de fijación al antígeno del anticuerpo original. El ligando efector cuya afinidad está alterada puede ser, por ejemplo, un receptor de Fc o el componente C1 del complemento. Esta estrategia se describe con más detalle en las patentes de los Ee . UU. n.os 5624 821 y 5648260, ambas para Winter et al.
La reactividad de los anticuerpos contra 158P1D7 con una proteína relacionada con la 158P1D7 se puede crear con una serie de medios bien conocidos, que incluyen la inmunotransferencia de tipo Western, la inmunoprecipitación, el ELISA y el análisis por FACS mediante el uso, cuando sea adecuado, de proteínas relacionadas con la 158P1D7, células que expresan la 158P1D7 o extractos de las mismas. Un anticuerpo contra 158P1D7 o fragmento del mismo puede estar marcado con una marcación detectable o puede estar conjugado a una segunda molécula. Las marcaciones detectables idóneas incluyen, pero sin limitarse a ellas, un radioisótopo, un compuesto fluorescente, un compuesto bioluminiscente, un compuesto quimioluminiscente, un quelante de metales o una enzima. Además, se generan anticuerpos biespecíficos que son específicos de dos o más epítopos de 158P1D7 al hacer uso de los métodos que se conocen por lo general en la técnica. También se pueden generar anticuerpos homodiméricos mediante las técnicas de entrecruzamiento conocidas en la técnica (p. ej., Wolff et al., Cáncer Res. 53: 2560-2565).
Aún en otra realización preferida, el Acm contra 158P1D7 de la invención es un anticuerpo que comprende las cadenas pesada y ligera de un anticuerpo denominado Ha15-10ac12. La cadena pesada de Ha15-10ac12 consiste en la secuencia de aminoácidos que va desde el primer resto, Q, al 446.° resto, K, de la SEQ ID n.° 7 y la cadena ligera de Ha15-10a12 consiste en la secuencia de aminoácidos que va desde el primer resto, D, al resto 219.°, C, de la SEQ ID n.° 8. Dichas secuencias se presentan en la figura 2 y en la figura 3. En una realización preferida, el Ha15-10ac12 está conjugado a un agente citotóxico.
La célula de ovario de hámster chino (CHO) productora del anticuerpo denominado Ha15-10ac12 se envió (a través de Federal Express) a la American Type Culture Collection (ATCC), P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108 el 25 de julio de 2012 y se le asignó el número de acceso PTA-13102.
111.) Generalidades sobre los conjugados de anticuerpo y fármaco
En otro aspecto, la invención da a conocer conjugados de anticuerpo y fármaco (CAF) que comprenden un anticuerpo anti-158P1D7 conjugado a MMAE. En algunos otros ejemplos, el anticuerpo está conjugado a un agente citotóxico, tal como un quimioterápico, un fármaco, un inhibidor del crecimiento, una toxina (p. ej., una toxina enzimáticamente activa de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal, o fragmentos de la misma) o un isótopo radiactivo (a saber, un radioconjugado). En otro aspecto, la invención da a conocer además métodos para utilizar los CAF. Un CAF puede comprender cualquiera de los Acm contra 158P1D7 anteriores unido covalentemente a un agente citotóxico o a un agente detectable.
El uso del los conjugados de anticuerpo y fármaco para la administración local de los agentes citotóxicos o citostáticos, a saber, fármacos para destruir o inhibir las células tumorales en el tratamiento del cáncer (Syrigos y Epenetos (1999) Anticancer Research 19: 605-614; Niculescu-Duvaz y Springer (1997) Adv. Drg Del. Rev. 26: 151-172; patente de los EE. UU. n.° 4 975278) permite la administración dirigida del resto farmacológico a los tumores y la acumulación intracelular en ellos, en donde la administración sistémica de estos agentes farmacológicos sin conjugar puede dar lugar a niveles inaceptables de toxicidad para las células normales, así como para las células tumorales que se desean eliminar (Baldwin et al., (1986) Lancet (15 de marzo de 1986), págs: 603-05; Thorpe, (1985) «Antibody Carriers of Cytotoxic Agents in Cancer Therapy: A Review» en Monoclonal Antibodies '84: Biological and Clinical Applications, A. Pinchera et al. (eds), págs. 475-506). De este modo se trata de buscar la máxima eficacia con la mínima toxicidad. Tanto los anticuerpos policlonales como los anticuerpos monoclonales se ha descrito que son útiles en estas estrategias (Rowland et al., (1986) Cancer Immunol. Immunother. 21: 183-87). Los fármacos utilizados en estos métodos incluyen daunomicina, doxorubicina, metotrexato y vindesina (Rowland et al., (1986) véase más arriba). Las toxinas utilizadas en los conjugados de anticuerpo y toxina incluyen las toxinas bacterianas, tales como la toxina de la difteria, toxinas vegetales, tales como la ricina, toxinas molecularmente pequeñas, tales como la geldanamicina (Mandler et al. (2000) Jour. ofthe Nat. Cancer Inst. 92 (19): 1573-1581; Mandler et al. (2000) Bioorganic & Med. Chem. Letters 10: 1025-1028; Mandler et al (2002) Bioconjugate Chem. 13: 786-791), maitansinoides (patente europea EP 1391 213; Liu et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 8618-8623) y caliqueamicina (Lode et al. (1998) Cancer Res. 58: 2928; Hinman et al. (1993) Cancer Res. 53: 3336-3342). Las toxinas pueden efectuar sus efectos citotóxicos y citostáticos mediante mecanismos que incluyen la fijación a las tubulinas, la fijación al ADN o la inhibición de las topoisomerasas. Algunos fármacos citotóxicos tienden a ser inactivos o menos activos cuando se conjugan con anticuerpos grandes o ligandos de receptores proteicos.
Ejemplos de conjugados de anticuerpo y fármaco son ZEVALIN® (ibritumomab tiuxetán, Biogen/Idec) que es un conjugado de anticuerpo y radioisótopo compuesto por un anticuerpo monoclonal de k de IgG1 murina dirigido contra el antígeno CD20 que se halla en la superficie de los linfocitos B normales y malignos, y el radioisótopo 111In o 90Y fijado mediante un enlace de tiourea al quelante (Wiseman et al. (2000) Eur. Jour. Nucl. Med. 27 (7): 766-77; Wiseman et al. (2002) Blood 99 (12): 4336-42; Witzig et al. (2002) J. Clin. Oncol. 20 (10): 2453-63; Witzig et al (2002) J. Clin. Oncol. 20 (15): 3262-69).
Adicionalmente, MYLOTARG™ (gemtuzumab ozogamicina, Wyeth Pharmaceuticals), un conjugado de anticuerpo y fármaco compuesto por un anticuerpo contra CD33 humano unido a caliqueamicina se autorizó en el 2000 para el tratamiento por inyección de la leucemia mielógena aguda («Drugs of the Future» (2000) 25 (7): 686; patentes de los EE. UU. n.os4970 198; 5079 233; 5585 089; 5606 040; 5693 762; 5739 116; 5767 285; 5773 001).
Además, cantuzumab mertansina (Immunogen, Inc.), un conjugado de anticuerpo y fármaco compuesto por el anticuerpo huC242 unido a través del enlace disulfuro SPP al resto del fármaco maitansinoide, DM1, se ha pasado a los ensayos de fase II para el tratamiento de los cánceres que expresan CanAg, tales como el cáncer de colon, de páncreas, de estómago y otros.
Adicionalmente, el MLN-2704 (Millennium Pharm., BZL Biologics, Immunogen Inc.), un conjugado de anticuerpo y fármaco compuesto por el anticuerpo monoclonal contra el antígeno membranario específico de la próstata (PSMA, por su nombre en inglés) unido al resto del fármaco maitansinoide, DM1, está en desarrollo para el posible tratamiento de los tumores de próstata.
Finalmente, los péptidos con auristatina, tales como la monometilauristatina E (MMAE), análogos sintéticos de dolastatina, se conjugaron con anticuerpos monoclonales quiméricos cBR96 (específico contra Lewis Y en los carcinomas) y cAC10 (específico contra CD30 en las neoplasias hemáticas) (Doronina et al. (2003) Nature Biotechnology 21 (7): 778-784). El cAC10 está en desarrollo terapéutico.
Adicionalmente, en la presente memoria se describen los quimioterápicos útiles para la generación de CAF. Las toxinas activas desde el punto de vista enzimático y los fragmentos de las mismas que se pueden usar incluyen la cadena A de la toxina diftérica, fragmentos activos no fijadores de la toxina de la difteria, la cadena A de la exotoxina (de Pseudomonas aeruginosa), la cadena A de la ricina, la cadena A de la abrina, la cadena A de la modecina, la asarcina, proteínas de Aeurites fordii, proteínas de diantina, proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII y PAP-S), inhibidor de Monomordica charantia, curcina, crotina, inhibidor de Sapaonaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, feomicina, enomicina, y los tricotecenos. Véase, p. ej., la solicitud de patente internacional WO 93/21232 publicada el 28 de octubre de 1993. Una amplia colección de radionúclidos está disponible para la producción de anticuerpos radioconjugados. Los ejemplos incluyen 212Bi, 131I, 131In, 90Y, y 186Re. Los conjugados del anticuerpo y los agentes citotóxicos se fabrican al hacer uso de diversos agentes bifuncionales para la conjugación de proteínas, tales como N-succinimidil-3-(2-piridilditiol)propionato (SPDP), iminotiolano (IT), derivados bifuncionales de imidoésteres (tales como hidrocloruro de adipimidato de dimetilo), ésteres activos (tales como suberato de disuccinimidilo), aldehídos (tales como glutaraldehído), compuestos de bis-azido (tales como bis-(p-azidobenzoíl)hexanodiamina), derivados de bis-diazonio (tales como bis-(p-diazoniobenzoíl)etilendiamina), diisocianatos (tales como 2,6-diisocianato de tolueno), y compuestos de bis-flúor activo (tales como 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenceno). Por ejemplo, se puede preparar una inmunotoxina de ricina tal y como se describe en Vitetta et al. (1987) Science, 238: 1098. El ácido 1-isotiocianatobencil-3-metildietilidenotriaminopentaacético (MX-DTPA) marcado con 14C es un quelante ejemplar para la conjugación de radionúclidos al anticuerpo (WO 94/11026).
También se contemplan en la presente memoria los conjugados de un anticuerpo y una o varias toxinas molecularmente pequeñas, tales como caliqueamicina, maitansinoides. dolastatinas, auristatinas, un tricoteceno, y CC1065, y los derivados de estas toxinas que tienen actividad de toxina.
III(A). Maitansinoides
Los compuestos de maitansina idóneos para ser usados como restos farmacológicos de maitansinoide se conocen bien en la técnica y se pueden aislar de fuentes naturales de acuerdo con los métodos conocidos, se puede producir mediante el uso de técnicas de ingeniería genética (véase Yu et al. (2002) PNAS 99: 7968-7973), o se pueden preparar por síntesis los análogos de maitansinol y el maitansinol de acuerdo con los métodos conocidos.
Los restos farmacológicos de maitansinoide de ejemplo incluyen los que tienen un anillo aromático modificado, tales como: C-19-descloro (US 4256 746) (preparado por la reducción en hidruro de litio y aluminio de la ansamitocina P2); C-20-hidroxi (o C-20-desmetil) ±C-19-descloro (patentes de los EE. UU. n.os 4361 650 y 4307 016) (preparado por desmetilación con Streptomyces o Actinomyces, o descloración con LAH); y C-20-desmetoxi, C-20-alcoxi (-OCOR), ±descloro (patente de los EE. UU. n.° 4294757) (preparado por acilación al hacer uso de cloruros de acilo), y los que tienen modificaciones en otras posiciones.
Los restos farmacológicos de maitansinoide de ejemplo incluyen los que tienen modificaciones tales como: C-9-SH (US 4424 219) (preparado al hacer reaccionar el maitansinol con H2S o P2S5); C-14-alcoximetil(desmetoxi/CH2OR) (US 4331 598); C-14-hidroximetilo o aciloximetilo (CH2OH o CH2OAc) (US 4450254) (preparado de Nocardia); C-15-hidroxi/aciloxi (US 4364866) (preparado por conversión del maitansinol por Streptomyces); C-15-metoxi (patentes de los EE. UU. n.os 4313 946 y 4315 929) (aislado de Trewia nudlflora); C-18-N-desmetilo (patentes de los Ee . UU. n.os 4 362 663 y 4322 348) (preparado por reducción del maitansinol en tricloruro de titanio/LAH).
Los CAF que contienen maitansinoides, los métodos para fabricarlos, y su uso terapéutico se describen, por ejemplo, en las patentes de los EE. UU. n.os 5208020; 5416 064; 6441 163 y la patente europea EP 0425 235 B1. En Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 8618-8623 (1996) se describen los CAF que comprenden un maitansinoide denominado DM1 conectado al anticuerpo monoclonal C242 dirigido contra el cáncer colorrectal de humano. El conjugado se halló que era muy citotóxico contra las células de cáncer de colon en cultivo, y mostró actividad antitumoral en un ensayo de crecimiento tumoral in vivo. En Chiari et al. Cancer Research 52: 127-313 (1992) se describen CAF en los que se conjugó un maitansinoide a través de un enlace disulfuro con en anticuerpo A7 murino que se fija a un antígeno en las líneas celulares de cáncer de colon de humano, o a otro anticuerpo monoclonal TA.1 murino que se fija al oncogén HER-2/neu. La citotoxicidad del conjugado de TA.1 y maitansinoide se analizó in vitro con la línea celular de cáncer de mama de humano SK-BR-3, que expresa 3 * 105 antígenos HER-2 de superficie por célula. El conjugado a fármaco alcanza un grado de citotoxicidad similar al del fármaco maitansinoide libre, lo que se podía incrementar al incrementar el número de moléculas de maitansinoide por molécula de anticuerpo. El conjugado de A7 y maitansinoide mostró menos citotoxicidad sistémica en los ratones.
III(B). Auristatinas y dolastatinas
En algunos ejemplos, el CAF comprende un anticuerpo de la invención conjugado a dolastatinas o a análogos y derivados peptídicos de dolastatinas, las auristatinas (patentes de los EE. UU. n.os 5635 483; 5 780 588). Las dolastatinas y las auristatinas se ha visto que interfieren con la dinámica de los microtúbulos, la hidrólisis de GTP y la división celular y nuclear (Woyke et al. (2001) Antimicrob. Agents and Chemother. 45 (12): 3580-3584) y tienen actividad contra el cáncer (US 5663 149) y antimicótica (Pettit et al. (1998) Antimicrob. Agents Chemother. 42: 2961­ 2965). El resto farmacológico de dolastatina o auristatina se puede unir al anticuerpo por el extremo amino (N) o por el carboxilo (C) del resto farmacológico peptídico (WO 02/088172).
Las auristatinas de ejemplo incluyen DE y DF, restos farmacológicos de monometilauristatina unidos al extremo amino, descritos en Senter et al. Procceedings o f the American Association for Cáncer Research, vol. 45, resumen n.° 623, presentado el 28 de marzo de 2004 y descrito en la publicación de patente de los EE. UU. n.° 2005/0238649.
El CAF de la invención está conjugado a la auristatina MMAE (en donde la línea ondulada indica la unión covalente a un conector (L, de linker) de un conjugado de anticuerpo y fármaco).
Figure imgf000024_0001
Otra auristatina de ejemplo es MMAF, en donde la línea ondulada indica la unión covalente a un conector (L, de linker) de un conjugado de anticuerpo y fármaco (US 2005/0238649);
Figure imgf000024_0002
Ejemplos y realizaciones de CAF que comprenden MMAE o MMAF y diferentes componentes conectores (descritos con más detalle en esta memoria) tienen las siguientes estructuras y abreviaturas (en las que Ab significa anticuerpo y p es de 1 a aproximadamente 8):
Figure imgf000024_0003
Típicamente, los restos farmacológicos de naturaleza peptídica se pueden preparar al formar un enlace peptídico entre dos o más aminoácidos y/o fragmentos peptídicos. Tales enlaces peptídicos se pueden preparar, por ejemplo, de acuerdo con los métodos de síntesis en fase líquida (véase E. Schroder y K. Lübke, «The Peptides», vol. 1, pp 76­ 136, 1965, Academic Press) que se conocen bien en el campo de la química de péptidos. Los restos farmacológicos de auristatina/dolastatina se pueden preparar de acuerdo con los métodos de: las patentes de los EE. UU. n.os US 5 635 483 y US 5780 588; Pettit et al. (1989) J. Am. Chem. Soc. 111: 5463-5465; Pettit et al. (1998) Anti-Cancer Drug Design 13: 243-277; Pettit, G. R., et al. Synthesis, 1996, 719-725; Pettit et al. (1996) J. Chem. Soc. Perkin Trans. 15: 859-863; y Doronina (2003) Nat Biotechnol 21 (7): 778-784.
IN(C). Caliqueamicina
En otros ejemplos, el CAF comprende un anticuerpo de la invención conjugado a una o varias moléculas de caliqueamicina. Los antibióticos de la familia de la caliqueamicina son capaces de producir roturas bicatenarias en el ADN a concentraciones subpicomolares. Para el compuesto del conjugado de la familia de la caliqueamicina, véanse las patentes de los EE. UU. n.os 5712 374, 5714 586, 5 739 116, 5767 285, 5 770 701, 5770 710, 5 773 001, y 5 877 296 (todas para compañía American Cyanamid). Los análogos estructurales de la caliqueamicina que se pueden usar incluyen, pero sin limitarse a ellos, Y11, a2I, as1, N-acetil-Y-i1, PSAG y 9^ (Hinman et al., Cancer Research 53: 3336­ 3342 (1993), Lode et al., Cancer Research 58: 2925-2928 (1998) y las anteriomente mencionadas patentes de los EE. UU. para American Cyanamid). Otros fármacos antitumorales a los que se puede conjugar el anticuerpo es el QFA, que es un antifolato. Tanto la caliqueamicina como el QFA tienen sitios de acción intracelulares y no atraviesan con facilidad la membrana plasmática. Por lo tanto, la captación celular de estos compuestos a través de la interiorización mediada por anticuerpos refuerza enormemente sus efectos citotóxicos.
III(D). Otros agentes citotóxicos
Otros antineoplásicos que se pueden conjugar a los anticuerpos de la invención incluyen BCNU, estreptozocina, vincristina y 5-flurorouracilo, la familia de agentes que se conocen colectivamente como el complejo LL-E33288 descrito en las patentes de los EE. UU. n.os 5053394, 5770 710, así como las esperamicinas (patente de los EE. UU. n.° 5877 296).
Las toxinas con actividad enzimática y los fragmentos de las mismas que se pueden usar incluyen la cadena A de la toxina diftérica, fragmentos activos no fijadores de la toxina diftérica, la cadena A de la exotoxina (de Pseudomonas aeruginosa), la cadena A de la ricina, la cadena A de la abrina, la cadena A de la modecina, la a-sarcina, proteínas de Aeurites fordii, proteínas de diantina, proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII y PAP-S), inhibidor de Monomordica charantia, curcina, crotina, inhibidor de Sapaonaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina, y los tricotecenos. Véase, por ejemplo, la solicitud de patente internacional WO 93/21232 publicada el 28 de octubre de 1993.
La presente descripción describe además un CAF formado entre un anticuerpo y un compuesto con actividad nucleolítica (p. ej., una ribonucleasa o una endonucleasa de ADN, tal como una desoxirribonucleasa; ADNasa).
Para la destrucción selectiva del tumor, los anticuerpos pueden comprender un átomo muy radiactivo. Están disponibles una amplia gama de isótopos radiactivos para la producción de anticuerpos radioconjugados. Los ejemplos incluyen At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 y los isótopos radiactivos de Lu. Cuando el conjugado se usa para la detección, puede comprender un átomo radiactivo para los estudios gammagráficos, por ejemplo, tc99m o I123, o una marcación de espín para la toma de imágenes por resonancia magnética nuclear (RMN, también conocida como diagnóstico por imágenes de resonancia magnética), tal como 123I de nuevo, 131I, 111In, 19F, 13C, 15N, 17O, gadolinio, manganeso o hierro.
La marcación radiactiva o de otro tipo se puede incorporar en el conjugado de los modos conocidos. Por ejemplo, el péptido se puede biosintetizar o se puede sintetizar por síntesis química de aminoácidos al hacer uso de los precursores aminoacídicos idóneos que incluyen, por ejemplo, 19F en lugar de hidrógeno. Las marcaciones tales como tc99m o 123I, 186Re, 188Re e 111In se pueden unir a través de un resto de cisteína del péptido. El 90Y se puede unir a través de un resto de lisina. El método IODOGEN (Fraker et al. (1978) Biochim. Biophys. Res. Commun. 80: 49-57) se puede usar para incorporar el 123I. En «Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy» (Chatal, CRC Press, 1989) se describen otros métodos con detalle.
IV.) Conjugados de anticuerpo y fármaco que se fijan a 158P1D7
La presente invención da a conocer, entre otras cosas, compuestos del conjugado de anticuerpo y fármaco para la administración dirigida de fármacos. Los inventores han hecho el descubrimiento de que los compuestos del conjugado de anticuerpo y fármaco tienen una actividad citotóxica y/o citostática potente contra las células que expresan la 158P1D7. Los compuestos del conjugado de anticuerpo y fármaco comprenden una unidad de anticuerpo unida covalentemente a al menos una unidad de fármaco. Las unidades de fármaco pueden estar unidas covalentemente de manera directa o a través de una unidad conectora (-LU-).
En algunas realizaciones, el compuesto del conjugado de anticuerpo y fármaco tiene la fórmula siguiente:
L - (LU-D)p (I)
o una sal o solvato farmacéuticamente aceptable del mismo; en donde:
L es la unidad de anticuerpo, p. ej., Acm contra 158P1D7 de la presente invención, y
(LU-D) es un resto de unidad conectora-unidad de fármaco, en donde:
LU- es una unidad conectora, y
-D es MMAE, la unidad de fármaco que tiene actividad citotóxica o citostática contra una célula destinataria; y p es un entero de 1 a 20.
En algunas realizaciones p va de 1 a 10, 1 a 9, 1 a 8, 1 a 7, 1 a 6, 1 a 5, 1 a 4, 1 a 3, o 1 a 2. En algunas realizaciones, p va de 2 a 10, 2 a 9, 2 a 8, 2 a 7, 2 a 6, 2 a 5, 2 a 4 o 2 a 3. En otras realizaciones, p es 1, 2, 3, 4, 5 o 6. En algunas realizaciones, p es 2 o 4.
En algunas realizaciones, el compuesto del conjugado de anticuerpo y fármaco tiene la fórmula siguiente:
L - (Aa-Ww-Yy-D)p (II)
o una sal o solvato farmacéuticamente aceptable del mismo; en donde:
L es la unidad de anticuerpo, p. ej., Acm contra 158P1D7; y
-Aa-Ww-Yy- es una unidad conectora (LU), en donde:
-A- es una unidad de elongación,
a es 0 o 1,
cada -W- es independientemente una unidad de aminoácido,
w es un entero que va de 0 a 12
-Y- es una unidad espaciadora autoinmolativa,
y es 0, 1 o 2;
-D es MMAE, la unidad de fármaco que tiene actividad citotóxica o citostática contra una célula destinataria; y p es un entero de 1 a 20.
En algunas realizaciones, a es 0 o 1, w es 0 o 1 e y es 0, 1 o 2. En algunas realizaciones, a es 0 o 1, w es 0 o 1 e y es 0 o 1. En algunas realizaciones, p va de 1 a 10, 1 a 9, 1 a 8, 1 a 7, 1 a 6, 1 a 5, 1 a 4, 1 a 3, o 1 a 2. En algunas realizaciones, p va de 2 a 8, 2 a 7, 2 a 6, 2 a 5, 2 a 4, o 2 a 3. En otras realizaciones, p es 1,2, 3, 4, 5 o 6. En algunas realizaciones, p es 2 o 4. En algunas realizaciones, cuando w no es cero, y es 1 o 2. En algunas realizaciones, cuando w es de 1 a 12, y es 1 o 2. En algunas realizaciones, w es de 2 a 12 e y es 1 o 2. En algunas realizaciones, a es 1 y w e y son 0.
Para las composiciones que comprenden una multitud de anticuerpos, la carga del fármaco se representa mediante p, el número promedio de moléculas de fármaco por anticuerpo. La carga del fármaco puede ir de 1 a 20 fármacos (D, de drug) por anticuerpo. El número promedio de fármacos por anticuerpo en la preparación de las reacciones de conjugación se puede caracterizar mediante los medios convencionales, tales como la espectroscopia de masas, ensayo ELISA y HPLC. También se puede determinar la distribución cuantitativa de los conjugados de anticuerpo y fármaco en términos de p. En algunos casos, la separación, purificación y caracterización de los conjugados de anticuerpo y fármaco homogéneos, cuando p es un valor determinado a partir de los conjugados de anticuerpo y fármaco con otras cargas de fármaco, se puede conseguir por medios tales como la HPLC de fase inversa o la electroforesis. En las realizaciones de ejemplo, p es de 2 a 8.
La generación de los compuestos del conjugado de anticuerpo y fármaco se puede conseguir mediante cualquier técnica conocida por el experto en la técnica. Brevemente, los compuestos del conjugado de anticuerpo y fármaco comprenden el Acm contra 158P1D7 como la unidad de anticuerpo, un fármaco y, optativamente, un conector que junta el fármaco al agente de fijación. En una realización preferida, el anticuerpo es el Acm contra 158P1D7 que comprende regiones variables de las cadenas pesada y ligera de un anticuerpo denominado Ha15-10ac12 descrito más arriba. En una realización más preferida, el anticuerpo es el Acm contra 158P1D7 que comprende las cadenas pesada y ligera de un anticuerpo denominado Ha15-10ac12 descrito más arriba. Una serie de reacciones diferentes están disponibles para la unión covalente de fármacos y/o conectores a los agentes de fijación. Esto se consigue a menudo mediante la reacción de los restos aminoacídicos del agente de fijación, p. ej., molécula de anticuerpo, que incluye los grupos amina de lisina, los grupos de ácido carboxílico libre del ácido glutámico y del ácido aspártico, los grupos sulfhidrilo de cisteína y los diferentes restos de los aminoácidos aromáticos. Uno de los métodos inespecíficos utilizados con más frecuencia para la unión covalente es la reacción de la carbodiimida para conectar un grupo carboxi (o amino) de un compuesto a grupos amino (o carboxi) del anticuerpo. Adicionalmente, se han utilizado agentes bifuncionales, tales como dialdehídos o imidoésteres, para conectar el grupo amino de un compuesto a grupos amino de una molécula de anticuerpo. También está disponible para la unión de fármacos a los agentes de fijación la reacción de base de Schiff. Este método implica la oxidación con peryodato de un fármaco que contiene grupos glicol o hidroxi, con lo que se forma así un aldehído que a continuación se hace reaccionar con el agente de fijación. La unión se produce a través de la formación de una base de Schiff con grupos amino del agente de fijación. También se pueden utilizar isiotiocianatos como agentes de conjugación para la unión covalente de fármacos a los agentes de fijación. El experto en la técnica conoce otras técnicas que se encuentran dentro del alcance de la presente invención.
En determinadas realizaciones, un intermedio, que es el precursor del conector, se hace reaccionar con el fármaco en las condiciones apropiadas. En determinadas realizaciones, los grupos reactivos se utilizan en el fármaco y/o en el intermedio. El producto de la reacción entre el fármaco y el intermedio, o el fármaco modificado, se hace reaccionar posteriormente con el Acm contra 158P1D7 en las condiciones adecuadas.
Cada una de las unidades concretas de los compuestos del conjugado de anticuerpo y fármaco se describe con más detalle en la presente memoria. La síntesis y la estructura de las unidades de conexión, de las unidades de elongación, de las unidades aminoacídicas, de la unidad espaciadora autoinmolativa y de las unidades de fármaco, todas ellas a modo de ejemplo, también se describen en las publicaciones de solicitud de patente de los EE. UU. n.os 2003-0083263, 2005-0238649 y 2005-0009751.
V.) Unidades conectoras
Típicamente, los compuestos del conjugado anticuerpo y fármaco comprenden una unidad conectora entre la unidad de fármaco y la unidad de anticuerpo. En algunas realizaciones, el conector se puede escindir en las condiciones intracelulares, de tal modo que la escisión del conector libera la unidad de fármaco del anticuerpo en el entorno intracelular. Aún en otras realizaciones, la unidad conectora no se puede escindir y se libera el fármaco, por ejemplo, mediante la degradación del anticuerpo.
En algunas realizaciones, el conector lo puede escindir un agente de escisión que está presente en el entorno intracelular (p. ej., dentro de un lisosoma o endosoma o cavéola). El conector puede ser, p. ej., un conector peptidílico que se escinde mediante una enzima peptidasa o proteasa intracelular que incluye, pero sin limitarse a ellas, una proteasa lisosómica o endosómica. En algunas realizaciones, el conector peptidílico tiene una longitud de al menos dos aminoácidos o una longitud de al menos tres aminoácidos. Los agentes de escisión pueden incluir las catepsinas B y D y la plasmina, las cuales se sabe que hidrolizan los derivados farmacológicos dipeptídicos, lo que da lugar a la liberación del fármaco activo dentro de las células deseadas (véase, p. ej., Dubowchik y Walker, 1999, Pharm. Therapeutics 83: 67-123). Los más típicos son los conectores peptidílicos que se pueden escindir con enzimas que están presentes en las células que expresan la 158P1D7. Por ejemplo, se puede utilizar un conector peptidílico que se puede escindir con la catepsina B, una proteasa dependiente de tiol, que se expresa mucho en el tejido canceroso, (p. ej., un conector Phe-Leu o Gly-Phe-Leu-Gly (SEQ ID n.° 9)). Otros ejemplos de tales conectores se describen, p. ej., en la patente de los EE. UU. n.° 6214345. En una realización específica, el conector peptidílico que puede escindir una proteasa intracelular es un conector Val-Cit o un conector Phe-Lys (véase, p. ej., la patente de los EE. UU. n.° 6 214 345, que describe la síntesis de la doxorubicina con el conector Val-Cit). Una ventaja de la utilización de la liberación proteolítica intracelular del agente terapéutico es que el agente se atenúa típicamente cuando está conjugado y la estabilidad de los conjugados en el suero es típicamente alta.
En otras realizaciones, el conector que se puede escindir es sensible al pH, a saber, sensible a la hidrólisis a determinados valores de pH. Típicamente, el conector sensible al pH se puede hidrolizar en condiciones ácidas. Por ejemplo, se puede utilizar un conector sensible a ácido que se puede hidrolizar en el lisosoma (p. ej., una hidrazona, semicarbazona, tiosemicarbazona, amida cis-aconítica, ortoéster, acetal, cetal o similares) (véanse, p. ej., las patentes de los EE. UU. n.os 5 122368; 5824 805; 5622 929; Dubowchik y Walker, 1999, Pharm. Therapeutics 83: 67-123; Neville et al., 1989, Biol. Chem. 264: 14653-14661). Tales conectores son relativamente estables en las condiciones de pH neutro, tales como las de la sangre, pero son inestables por debajo de pH 5,5 o 5,0, el pH aproximado del lisosoma. En determinadas realizaciones, el conector que se puede hidrolizar es un conector de tipo tioéter (tal como, p. ej., un tioéter unido al agente terapéutico mediante un enlace de acilhidrazona (véase, p. ej., la patente de los EE. UU. n.° 5622 929)).
Aún en otras realizaciones, el conector se puede escindir en condiciones reductoras (p. ej., un conector de tipo disulfuro). Se conocen en la técnica una serie de enlaces disulfuro que incluyen, por ejemplo, los que se pueden formar al hacer uso de SATA (N-succinimidil-S-acetiltioacetato), SPDP (N-succinimidil-3-(2-piridilditio)propionato), SPDB (N-succinimidil-3-(2-piridildiitio)butirato) y SMPT (N-succinimidil-oxicarbonil-a-metil-a-(2-piridilditio)tolueno), SPDB y SMPT (véanse, p. ej., Thorpe et al., 1987, Cáncer Res. 47: 5924-5931; Wawrzynczak et al., en Immunoconjugates: Antibody Conjugates in Radioimagery and Therapy o f Cancer (C. W. Vogel ed., Oxford U. Press, 1987. Véase también la patente de los EE. UU. n.° 4880 935).
Aún en otras realizaciones específicas, el conector es un conector de tipo malonato (Johnson et al., 1995, Anticancer Res. 15: 1387-93), un conector de tipo maleimidobenzoílo (Lau et al., 1995, Bioorg-Med-Chem. 3 (10): 1299-1304), o un análogo de 3'-N-amida (Lau et al., 1995, Bioorg-Med-Chem. 3 (10): 1305-12).
Aún en otras realizaciones, la unidad conectora no se puede escindir y el fármaco se libera por la degradación del anticuerpo (véase la publicación de patente de los EE .Uu . n.° 2005/0238649).
Típicamente, el conector no es sustancialmente sensible al medio extracelular. Tal y como se utiliza en la presente memoria, «no ser sustancialmente sensible al medio extracelular», en el contexto de un conector, significa que no más de aproximadamente el 20%, típicamente no más de aproximadamente el 15%, más típicamente no más de aproximadamente el 10%, e incluso más típicamente no más de aproximadamente el 5%, no más de aproximadamente el 3%, o no más de aproximadamente el 1%, de los conectores en una muestra de compuesto del conjugado de anticuerpo y fármaco se escinden cuando el compuesto del conjugado de anticuerpo y fármaco está presente en un entorno extracelular (p. ej., en el plasma). Se puede determinar si un conector no es sustancialmente sensible al entorno extracelular, por ejemplo, mediante la incubación del compuesto del conjugado de anticuerpo y fármaco con plasma durante un periodo de tiempo predeterminado (p. ej., 2, 4, 8, 16 o 24 horas) y luego la cuantificación de la cantidad de fármaco libre presente en el plasma.
En otras realizaciones que se no excluyen mutuamente, el conector favorece la interiorización celular. En determinadas realizaciones, el conector favorece la interiorización celular cuando está conjugado con el agente terapéutico (a saber, en el medio del resto del conector-agente terapéutico del compuesto del conjugado de anticuerpo y fármaco, tal y como se describe en la presente memoria). Aún en otras realizaciones, el conector favorece la interiorización celular cuando está conjugado tanto al compuesto MMAE como al Acm contra 158P1D7.
Una serie de conectores de ejemplo que se pueden utilizar con las presentes composiciones y métodos se describen en la solicitud de patente internacional WO 2004-010957, la publicación de patente de los EE. UU. n.° 2006/0074008, publicación de patente de los EE. UU n.° 2005/0238649 y la publicación de patente de los EE. UU. n.° 2006/0024317.
Una «unidad conectora» (LU) es un compuesto bifuncional que se puede utilizar para conectar una unidad de fármaco y una unidad de anticuerpo para formar un compuesto del conjugado de anticuerpo y fármaco. En algunas realizaciones, la unidad conectora tiene la fórmula:
-Aa-Ww-Yy-
en donde:
-A- es una unidad de elongación,
a es 0 o 1,
cada -W- es independientemente una unidad de aminoácido,
w es un entero que va de 0 a 12,
-Y- es un unidad espaciadora autoinmolativa, e
y es 0, 1 o 2.
En algunas realizaciones, a es 0 o 1, w es 0 o 1, e y es 0, 1 o 2. En algunas realizaciones, a es 0 o 1, w es 0 o 1, e y es 0 o 1. En algunas realizaciones, cuando w es de 1 a 12, y es 1 o 2. En algunas realizaciones, w es de 2 a 12, e y es 1 o 2. En algunas realizaciones, a es 1 y w e y son 0.
VI.) La unidad de elongación
La unidad de elongación (A), cuando está presente, es capaz de conectar una unidad de anticuerpo a una unidad de aminoácido (-W-), si está presente, a una unidad espaciadora (-Y-), si está presente; o a una unidad de fármaco (-D). Los grupos funcionales útiles que pueden estar presentes en un Acm contra 158P1D7 (p. ej., Ha15-10ac12), bien de forma natural o bien a través de la manipulación química, incluyen, pero sin limitarse a ellos, sulfhidrilo, amino, hidroxilo, el grupo hidroxilo anomérico de un glúcido, y carboxilo. Los grupos funcionales idóneos son sulfhidrilo y amino. En un ejemplo, los grupos sulfhidrilo se pueden generar mediante la reducción de los enlaces disulfuro intramoleculares de un Acm contra 158P1D7. En otra realización, los grupos sulfhidrilo se pueden generar al hacer reaccionar un grupo amino de un resto de lisina de un Acm contra 158P1D7 con 2-iminotiolano (reactivo de Traut) u otros reactantes que generan sulfhidrilos. En determinadas realizaciones, el Acm contra 158P1D7 es un anticuerpo recombinante y está manipulado genéticamente para que lleve una o varias lisinas. En otras realizaciones determinadas, el Acm contra 158P1D7 recombinante está manipulado genéticamente para que lleve grupos sulfhidrilo adicionales, p. ej., cisteínas adicionales.
En una realización, la unidad de elongación forma un enlace con un átomo de azufre de la unidad de anticuerpo. El átomo de azufre puede proceder de un grupo sulfhidrilo de un anticuerpo. Las unidades de elongación representativas de esta realización se describen entre los corchetes en las fórmulas Illa y IIIb, en donde L-, -W-, -Y-, -D, w e y son tal y como están definidos más arriba y R17 se selecciona de -alquileno(C-i-C10), -alquenileno(C1-C1ü), -alquinileno(C1-C1ü), carbociclo, -O-(alquileno(C1-Cs))-, -O-(alquenileno(C1-Cs))-, -O-(alquinileno(C1-Cs))-, arileno, -alquileno(C1-C1ü)-arileno-, -alquenileno(C2-C1ü)-arileno-, -alquinileno(C2-C1ü)-arileno-, -arileno-alquileno(C1-C1ü)-, -arilenoalquenileno(C2-C1ü)-, -arileno-alquinileno(C2-C1ü)-, -alquileno(C1-C1ü)-(carbociclo)-, -alquenileno(C2-C1ü)-(carbociclo)-, -alquinileno(C2-C1ü)-(carbociclo)-, -(carbociclo)-alquileno(C1-C1ü)-, -(carbociclo)-alquenileno(C2-C1ü)-, -(carbociclo)-alquinileno(C2-C1ü)-, heterociclo, -alquileno(C1-C1ü)-(heterociclo)-, -alquenileno(C2-C1ü)-(heterociclo)-, -alquinileno(C2 Cio)-(heterociclo)-, -(heterocido)-alquNeno(Ci-Cio)-, -(heterocido)-alquenileno(C2-Ci0)-, -(heterociclo^alquinileno^-C10)-, -(CH2CH2O)n o -(CH2CH2O)r-CH2-, y r es un entero que va de i a i0 , donde dicho alquilo, alquenilo, alquinilo, alquileno, alquenileno, alquinileno, arilo, carbociclo, heterociclo y radicales de arileno, tanto solos como formando parte de otro grupo, están optativamente sustituidos. En algunas realizaciones, dicho alquilo, alquenilo, alquinilo, alquileno, alquenileno, alquinileno, arilo, carbociclo, heterociclo y radicales de arileno, tanto solos como formando parte de otro grupo, no están sustituidos. En algunas realizaciones, R17 se selecciona de -alquileno(C1-C10)-, -carbociclo-, -O-(alquileno(C1-C8)-, -arileno-, -alquileno(C1-C10)-arileno-, -arileno-alquileno(C1-C10)-, -alquileno(C1-C10)-(carbociclo)-, -(carbociclo)-alquileno(C1-C10)-, -heterociclo(C3-C8)-, -alquileno(C1-C10)-(heterociclo)-, -(heterociclo)-alquileno(C1-C10)-, -(CH2CH2O)r- y -(CH2CH2O)r-CH2-; y r es un entero que va de 1 a 10, en donde dichos grupos alquileno no están sustituidos y el resto de grupos están optativamente sustituidos.
Se ha de saber a partir de todas las realizaciones de ejemplo que incluso cuando no se denoten expresamente, se pueden conectar a un anticuerpo de 1 a 20 restos de fármaco (p = 1-20).
Figure imgf000029_0001
Una unidad de elongación ilustrativa es la de la fórmula IIIa, en donde R17 es -(CH2)5-:
Figure imgf000029_0002
Otra unidad de elongación ilustrativa es la de la fórmula IIIa, en donde R17 es -(CH2CH2O)r-CH2-; y r es 2:
Figure imgf000029_0003
Una unidad de elongación ilustrativa es la de la fórmula IIIa, en donde R17 es arileno- o arileno-alquileno(C1-C10)-. En algunas realizaciones, el grupo arilo es un grupo fenilo sin sustituir.
Aún otra unidad de elongación ilustrativa es la de la fórmula IIIb, en donde R17 es -(CH2)5-:
Figure imgf000029_0004
En determinadas realizaciones, la unidad de elongación está conectada a una unidad de anticuerpo a través de un enlace disulfuro entre un átomo de azufre de la unidad de anticuerpo y un átomo de azufre de la unidad de elongación. Una unidad de elongación representativa de esta realización se describe entre los corchetes de la fórmula IV, en donde R17, L-, -W-, -Y-, -D, w e y son tal y como están definidos más arriba.
Figure imgf000029_0005
Se debe observar que, a lo largo de esta solicitud, el resto S en la fórmula que viene continuación hace referencia a un átomo de azufre de la unidad de anticuerpo, a menos que se indique de otra manera por el contexto.
Figure imgf000030_0001
Aún en otras realizaciones, la unidad de elongación contiene un sitio reactivo que puede formar un enlace con un grupo amino primario o secundario de un anticuerpo. Los ejemplos de estos sitios reactivos incluyen, pero sin limitarse a ellos, ésteres activados, tales como ésteres de succinimida, ésteres de 4-nitrofenilo, ésteres de pentafluorofenilo, ésteres de tetrafluorofenilo, anhídridos, cloruros de ácidos, cloruros de sulfonilo, isocianatos e isotiocianatos. Las unidades de elongación representativas de esta realización están representadas entre los corchetes de las fórmulas Va y Vb, en donde -R17-, L-, -W-, -Y-, -D, w e y son tal y como están definidos más arriba;
Figure imgf000030_0002
En algunas realizaciones, la unidad de elongación contiene un sitio reactivo que reacciona con un grupo (-CHO) modificado de glúcido que puede estar presente en un anticuerpo. Por ejemplo, un glúcido se puede oxidar levemente al hacer uso de un reactivo, tal como peryodato de sodio, y la resultante unidad (-CHO) del glúcido oxidado se puede condensar con una unidad de elongación que contiene una funcionalidad, tal como una hidrazida, una oxima, una amina primaria o secundaria, una hidrazina, una tiosemicarbazona, un carboxilato de hidrazina y una arilhidrazida, tal como las descritas por Kaneko et al., 1991, Bioconjugate Chem. 2: 133-41. Las unidades de elongación representativas de esta realización se describen entre los corchetes de las fórmulas VIa, VIb y VIc, en donde -R17-, L-, -W-, -Y-, -D, w e y son tal y como están definidos más arriba.
Figure imgf000030_0003
VII.) La unidad de aminoácido
La unidad de aminoácido (-W-), cuando está presente, conecta la unidad de elongación a la unidad espaciadora si la unidad espaciadora está presente, conecta la unidad de elongación al resto de fármaco si la unidad espaciadora está ausente, y conecta la unidad de anticuerpo a la unidad de fármaco si la unidad de elongación y la unidad espaciadora están ausentes.
Ww- puede ser, por ejemplo, una unidad de monopéptido, dipéptido, tripéptido, tetrapéptido, pentapéptido, hexapéptido, heptapéptido, octapéptido, nonapéptido, decapéptido, undecapéptido o dodecapéptido. Cada unidad de -W- tiene independientemente la fórmula que se representa a continuación entre los corchetes, y w es un entero que va de 0 a 12:
Figure imgf000031_0002
En algunas realizaciones, la unidad de aminoácido puede ser escindida enzimáticamente por medio de una o varias enzimas, entre ellas una proteasa asociada al cáncer o al tumor, para liberar la unidad de fármaco (-D), que en una realización se protona in vivo tras la liberación para dar proporcionar un fármaco (D).
En determinadas realizaciones, la unidad de aminoácido puede comprender aminoácidos naturales. En otras realizaciones, la unidad de aminoácido puede comprender aminoácidos no naturales. Las unidades Ww ilustrativas se representan con las fórmulas (VII) a (IX):
Figure imgf000031_0001
Bencilo (CH2)4NH2;
metilo (CH2)4NH2;
isopropilo (CH2)4NH2;
isopropilo (CH2)3NHCONH2;
bencilo (CH2)3NHCONH2;
isobutilo (CH2)3NHCONH2;
sec-butilo (CH2)3NHCONH2;
Figure imgf000032_0001
bencilo metilo;
bencilo (CH2)3NHC(=NH)NH2;
Figure imgf000032_0002
en donde R20, R21 y R22 son como sigue:
R20 R21 R22
bencilo bencilo (CH2)4NH2;
isopropilo bencilo (CH2)4NH2; y
H bencilo (CH2)4NH2;
Figure imgf000032_0003
en donde R20, R21, R22 y R23 son como sigue:
R20 R21 R22 R23
H bencilo isobutilo H; y
metilo isobutilo metilo isobutilo
Las unidades de aminoácido de ejemplo incluyen, pero sin limitarse a ellas, las unidades de la fórmula VII en donde: R20 es bencilo y R21 es -(CH2)4NH2; R20 es isopropilo y R21 es -(CH2)4NH2; o R20 es isopropilo y R21 es -(CH2)3NHCONH2. Otra unidad de aminoácido de ejemplo es una unidad de la fórmula VIII en donde R20 es bencilo, R21 es bencilo y R22 es -(CH2)4NH2.
Se pueden diseñar y optimizar unidades -Ww- útiles en su selectividad para la escisión enzimática por una enzima concreta, por ejemplo, una proteasa asociada a un tumor. En una realización, una unidad -WW- es aquella cuya escisión está catalizada por las catepsinas B, C y D, o por una proteasa de tipo plasmina.
En una realización, -WW- es un dipéptido, tripéptido, tetrapéptido o pentapéptido. Cuando R19, R20, R21, R22 o R23 es diferente a hidrógeno, el átomo de carbono al cual se une el R19, R20, R21, R22 o R23 es quiral.
Cada átomo de carbono al cual R19, R20, R21, R22 o R23 se une está independientemente en la configuración (S) o (R). En un aspecto de la unidad de aminoácido, la unidad de aminoácido es valina-citrulina (vc o val-cit). En otro aspecto, la unidad de aminoácido es fenilalanina-lisina (a saber, fk). Aún en otro aspecto de la unidad de aminoácido, la unidad d e a m in o á c id o e s N -m e tilv a lin a -c it ru lin a . A ú n e n o tro a s p e c to , la u n id a d d e a m in o á c id o e s á c id o 5 -a m in o v a lé r ic o , h o m o fe n ila la n in a lis in a , te t ra is o q u in o lin o c a rb o x ila to d e lis in a , c ic lo h e x ila la n in a lis in a , lis in a c o n á c id o is o n e p e c ó t ic o , p -a la n in a lis in a , g lic in a s e r in a v a lin a g lu ta m in a y á c id o is o n e p e c ó t ic o .
VIII.) La unidad espadadora
L a u n id a d e s p a c ia d o ra (-Y -), c u a n d o e s tá p re s e n te , c o n e c ta u n a u n id a d d e a m in o á c id o a la u n id a d d e fá rm a c o c u a n d o e s tá p re s e n te u n a u n id a d d e a m in o á c id o . C o m o a lte rn a tiv a , la u n id a d e s p a c ia d o ra c o n e c ta la u n id a d d e e lo n g a c ió n a la u n id a d d e fá rm a c o c u a n d o la u n id a d d e a m in o á c id o e s tá a u s e n te . L a u n id a d e s p a c ia d o ra ta m b ié n c o n e c ta la u n id a d d e fá rm a c o a la u n id a d d e a n t ic u e rp o c u a n d o ta n to la u n id a d d e a m in o á c id o c o m o la u n id a d d e e lo n g a c ió n e s tá n a u s e n te s .
L a s u n id a d e s e s p a c ia d o ra s s o n d e d o s t ip o s g e n e ra le s : n o a u to in m o la tiv a s o a u to in m o la tiv a s . U n a u n id a d e s p a c ia d o ra n o a u to in m o la tiv a e s u n a en la c u a l p a rte o to d a la u n id a d e s p a c ia d o ra p e rm a n e c e e n la z a d a a l re s to d e fá rm a c o d e s p u é s d e la e s c is ió n , s o b re to d o la e n z im á t ic a , d e u n a u n id a d d e a m in o á c id o d e l c o n ju g a d o d e a n t ic u e rp o y fá rm a c o . L o s e je m p lo s d e u n a u n id a d e s p a c ia d o ra n o a u to in m o la tiv a in c lu y e n , p e ro s in l im ita rs e a e lla s , u n a u n id a d e s p a c ia d o ra (g l ic in a -g lic in a ) y u n a u n id a d e s p a c ia d o ra d e g lic in a (a m b a s d e s c r ita s e n el e s q u e m a 1) (v é a s e m á s a d e la n te ). C u a n d o un c o n ju g a d o q u e c o n t ie n e u n a u n id a d e s p a c ia d o ra d e g l ic in a -g lic in a o u n a u n id a d e s p a c ia d o ra d e g lic in a s e s o m e te a la e s c is ió n e n z im á t ic a m e d ia n te u n a e n z im a (p. ej., u n a p ro te a s a a s o c ia d a a la c é lu la tu m o ra l, u n a p ro te a s a a s o c ia d a a la c é lu la c a n c e ro s a o u n a p ro te a s a a s o c ia d a a lin fo c ito ), s e e s c in d e un re s to g lic in a -g lic in a - fá rm a c o o un re s to g lic in a -fá rm a c o a p a r t ir d e L-Aa-W w . E n u n a re a liz a c ió n , t ie n e lu g a r u n a re a c c ió n d e h id ró lis is in d e p e n d ie n te d e n tro d e la c é lu la d e s t in a ta r ia , q u e e s c in d e e l e n la c e d e l re s to g lic in a - fá rm a c o y lib e ra e l fá rm a c o .
Figure imgf000033_0001
E n a lg u n a s re a liz a c io n e s , u n a u n id a d e s p a c ia d o ra n o a u to in m o la tiv a (-Y -) e s -G ly - . E n a lg u n a s re a liz a c io n e s , u n a u n id a d e s p a c ia d o ra n o a u to in m o la tiv a ( -Y -) e s -G ly -G ly - .
E n u n a re a liz a c ió n , se d a a c o n o c e r un c o n ju g a d o d e fá rm a c o y c o n e c to r e n el c u a l la u n id a d e s p a c ia d o ra e s tá a u s e n te (y = 0 ), o u n a s a l o s o lv a to fa rm a c é u t ic a m e n te a c e p ta b le d e l m is m o .
C o m o a lte rn a t iv a , un c o n ju g a d o q u e c o n t ie n e u n a u n id a d e s p a c ia d o ra a u to in m o la tiv a p u e d e lib e ra r -D . T a l y c o m o se u t iliz a e n la p re s e n te m e m o r ia , e l té rm in o « e s p a c ia d o r a u to in m o la tiv o » s e re f ie re a un re s to q u ím ic o b ifu n c io n a l q u e e s c a p a z d e c o n e c ta r c o v a le n te m e n te d o s re s to s q u ím ic o s e s p a c ia d o s e n u n a m o lé c u la t r ip a r t i ta e s ta b le . S e s e p a ra rá e s p o n tá n e a m e n te d e l s e g u n d o re s to q u ím ic o s i s e e s c in d e su e n la c e c o n e l p r im e r re s to .
E n a lg u n a s re a liz a c io n e s , -Y y - e s u n a u n id a d d e a lc o h o l p -a m in o b e n c íl ic o (P A B ) ( v é a n s e lo s e s q u e m a s 2 y 3 ) c u y a p o rc ió n d e fe n ile n o e s tá s u s t itu id a c o n Qm, e n d o n d e Q e s -a lq u ilo (C i-C 8 ) , -a lq u e n ilo (C i-C 8 ) , -a lq u in ilo (C i-C 8 ) , -O -(a lq u ilo (C i-C 8 ) I- , -O -(a lq u e n ilo (C i-C 8 ) ) , -O -(a lq u in ilo (C i-C 8 ) ) , h a ló g e n o , -n it ro o -c ia n o ; y m e s un e n te ro q u e v a d e 0 a 4. L o s g ru p o s a lq u ilo , a lq u e n ilo y a lq u in ilo , ta n to s o lo s c o m o fo rm a n d o p a rte d e o tro g ru p o , p u e d e n e s ta r o p ta t iv a m e n te s u s t itu id o s .
E n a lg u n a s re a liz a c io n e s , -Y - e s un g ru p o P A B q u e e s tá c o n e c ta d o a -W w- a t ra v é s d e l á to m o d e n it ró g e n o d e t ip o a m in o d e l g ru p o P A B y c o n e c ta d o d ire c ta m e n te a -D m e d ia n te un g ru p o c a rb o n a to , c a rb a m a to o é te r. S in d e s e a r c o m p ro m e te rs e c o n n in g u n a te o r ía o m e c a n is m o c o n c re to s , e l e s q u e m a 2 d e s c r ib e un p o s ib le m e c a n is m o d e lib e ra c ió n d e l fá rm a c o d e un g ru p o P A B q u e e s tá f i ja d o d ire c ta m e n te a -D a t ra v é s d e un g ru p o c a rb a m a to o c a rb o n a to , ta l y c o m o se d e s c r ib e e n T o k i e t a l., 2002 , J. Org. Chem., 67 : i866 - i872 .
Figure imgf000034_0001
En el esquema 2, Q es -alquilo(Ci -C8), -alquenilo(Ci -C8), -alquinilo(Ci -C8), -O-(alquilo(Ci -C8)), -O-(alquenilo(Ci -C8)), -O-(alquinilo(Ci -C8)), -halógeno, -nitro o -ciano; m es un entero que va de 0 a 4; y p va de 1 a aproximadamente 20. Los grupos alquilo, alquenilo y alquinilo, tanto solos como formando parte de otro grupo, pueden estar optativamente sustituidos.
Sin desear comprometerse con ninguna teoría o mecanismo concretos, el esquema 3 describe un posible mecanismo de liberación del fármaco de un grupo PAB que está fijado directamente a -D a través de un conector de tipo éter o amina, en donde D incluye el grupo de oxígeno o nitrógeno que es parte de la unidad de fármaco.
Figure imgf000035_0001
En el esquema 3, Q es -alquilo(Ci -C8), -alquenilo(Ci -C8), -alquinilo(Ci -C8), -O-(alquilo(Ci -C8)), -O-(alquenilo(Ci -C8)), -O-(alquinilo(Ci -C8)), -halógeno, -nitro o -ciano; m es un entero que va de 0 a 4; y p va de 1 a aproximadamente 20. Los grupos alquilo, alquenilo y alquinilo, tanto solos como formando parte de otro grupo, pueden estar optativamente sustituidos.
Otros ejemplos de espaciadores autoinmolativos incluyen, pero sin limitarse a ellos, los compuestos aromáticos que son similares, desde el punto de vista electrónico, a los grupos PAB, tales como los derivados de 2-aminoimidazol-5-metanol (Hay et al., 1999, Bioorg. Med. Chem. Lett 9: 2237) y orto- o para-aminobencilacetales. Los espaciadores que pueden ser usados puede someterse a ciclación tras la hidrólisis del enlace amida, tal como amidas del ácido 4-aminobutírico sustituido y sin sustituir (Rodrigues et al., 1995, Chemistry Biology 2: 223), sistemas de anillos biciclo[2.2.1] y biciclo[2.2.2] adecuadamente sustituidos (Storm et al., 1972, J. Amer. Chem. Soc. 94: 5815) y amidas del ácido 2-aminofenilpropiónico (Amsberry et al., 1990, J. Org. Chem. 55:5867). La eliminación de los fármacos que contienen amina que están sustituidos en la posición a de la glicina (Kingsbury et al., 1984, J. Med. Chem. 27: 1447) también son ejemplos también de espaciadores autoinmolativos.
En una realización, la unidad espaciadora es una unidad de bis(hidroximetil)-estireno (BHMS) ramificado tal y como se representa en el esquema 4, que se puede utilizar para incorporar y liberar muchos fármacos.
Figure imgf000035_0002
En el esquema 4, Q es -alquilo(C1-C8), -alquenilo(C1-C8), -alquinilo(C1-C8), -O-(alquilo(C1-C8)), -O-(alquenilo(C1-C8)), -O-(alquinilo(C1-C8)), -halógeno, -nitro o -ciano; m es un entero que va de 0 a 4; n es 0 o 1; y p va de 1 a aproximadamente 20. Los grupos alquilo, alquenilo y alquinilo, tanto solos como formando parte de otro grupo, pueden estar optativamente sustituidos.
En algunas realizaciones, los restos -D son iguales. Aún en otra realización, los restos -D son diferentes.
En un aspecto, las unidades espadadoras (-Yy-) están representadas por las fórmulas (X) a (XII):
Figure imgf000036_0001
en donde Q es -alquilo(C1-C8), -alquenilo(C1-C8), -alquinilo(C1-C8), -O-(alquilo(C1-C8)), -O-(alquenilo(C1-C8)), -O-(alquinilo(C1-C8)), -halógeno, -nitro o -ciano; y m es un entero que va de 0 a 4. Los grupos alquilo, alquenilo y alquinilo, tanto solos como formando parte de otro grupo, pueden estar optativamente sustituidos.
Figure imgf000036_0002
Las realizaciones de las fórmulas I y II que comprenden compuestos del conjugado de anticuerpo y fármaco pueden incluir:
Figure imgf000036_0003
en donde w e y son cada uno 0, 1, o 2, y
Figure imgf000036_0004
en donde w e y son cada uno 0,
Figure imgf000036_0005
Figure imgf000037_0001
y
Figure imgf000037_0002
IX.) La unidad de fármaco
En el contexto del conjugado de anticuerpo y fármaco de la invención, la referencia a una unidad de fármaco o a un resto de fármaco deberá entenderse como monometilauristatina E (MMAE). Otros ejemplos de restos de fármaco están descritos en la presente memoria solo para referencia. El resto de fármaco (D) puede ser cualquier citotóxico, citostático o inmunomodulador (p. ej., inmunodepresor) o fármaco. D es una unidad (resto) de fármaco que tiene un átomo que puede formar un enlace con la unidad espaciadora, con la unidad de aminoácido, con la unidad de elongación o con la unidad de anticuerpo. En algunas realizaciones, la unidad de fármaco D tiene un átomo de nitrógeno que puede formar un enlace con la unidad espaciadora. Tal y como se utiliza en la presente memoria, los términos «unida de fármaco» y «resto de fármaco» son sinónimos y se utilizan indistintamente.
Las clases útiles de agentes citotóxicos o inmunomoduladores incluyen, por ejemplo, agentes antitubulínicos, fijadores del surco menor del ADN, inhibidores de la replicación del ADN y alquilantes.
En algunos ejemplos, el fármaco es una auristatina, tal como auristatina E (también conocida en la técnica como un derivado de la dolastatina 10) o un derivado de la misma. La auristatina puede ser, por ejemplo, un éster formado entre la auristatina E y un cetoácido. Por ejemplo, la auristatina E se puede hacer reaccionar con el ácido paraacetilbenzoico o el ácido benzoilvalérico para producir AEB y AEVB, respectivamente. Otras auristatinas típicas incluyen AFP y MMAF. El CAF de la invención está conjugado a MMAE. La síntesis y estructura de las auristatinas de ejemplo se describen en las publicaciones de solicitud de patente de los EE. UU. n.os 2003-0083263, 2005-0238649 y 2005-0009751; en las solicitudes de patente internacional n.os WO 04/010957 y WO 02/088172, y en las patentes de los EE. UU. n.os 6323 315; 6239 104; 6034 065; 5780 588; 5665 860; 5663 149; 5635 483; 5599 902; 5554 725; 5 530 097; 5521 284; 5504 191; 5410 024; 5 138036; 5076 973; 4986 988; 4 978 744; 4879 278; 4 816444; y 4 486 414.
Las auristatinas se ha demostrado que interfieren con la dinámica de los microtúbulos y del núcleo, y con la división nuclear, y tienen actividad contra el cáncer. Las auristatinas se fijan a la tubulina y pueden ejercer un efecto citotóxico o citostático sobre las células que expresan la 158P1D7. Existe una serie de ensayos diferentes, conocidos en la técnica, que se pueden utilizar para determinar si una auristatina o un conjugado de anticuerpo y fármaco resultante ejerce un efecto citotóxico o citostático sobre una línea celular deseada.
En la técnica se conocen los métodos para determinar si un compuesto se fija a la tubulina. Véanse, por ejemplo, Muller et al., Anal. Chem 2006, 78, 4390-4397; Hamel et al., Molecular Pharmacology, 199547: 965-976; y Hamel et al., The Journal o f Biological Chemistry, 1990, 265: 28, 17141-17149. Se puede determinar la afinidad relativa de un compuesto por la tubulina. Algunas auristatinas descritas en la presente memoria se fijan a la tubulina con una afinidad que va desde 10 veces más baja (muy poca afinidad) que la afinidad de fijación de la MMAE por la tubulina, hasta 10 veces, 20 veces o incluso 100 veces mayor (afinidad muy alta) que la afinidad de fijación de la MMAE por la tubulina.
En algunos ejemplos, -D es una auristatina de la fórmula DE o DF:
Figure imgf000038_0001
o una sal o solvato farmacéuticamente aceptable de las mismas; en donde, de manera independiente en cada posición:
la línea ondulada indica un enlace;
R2 es -alquilo(C1-C20), -alquenilo(C2-C20), o -alquinilo(C2-C20);
R3 es -H, -alquilo(C1-C20), -alquenilo(C2-C20), -alquinilo(C2-C20), -carbociclo, -alquileno(C1-C20)(carbociclo), -alquenileno(C2-C20)(carbociclo), -alquinileno(C2-C20)(carbociclo), -arilo, -alquileno(C1-C20)(arilo), -alquenileno(C2-C20)(arilo), -alquinileno(C2-C20)(arilo), heterociclo, -alquileno(C1-C20)(heterociclo), -alquenileno(C2-C20)(heterociclo), o -alquinileno(C2-C20)(heterociclo);
R4 es -H, -alquilo(C1-C20), -alquenilo(C2-C20), -alquinilo(C2-C20), -carbociclo, -alquileno(C1-C20)(carbociclo), -alquenileno(C2-C20)(carbociclo), -alquinileno(C2-C20)(carbociclo), -arilo, -alquileno(C1-C20)(arilo), -alquenileno(C2-C20)(arilo), -alquinileno(C2-C20)(arilo), heterociclo, -alquileno(C1-C20)(heterociclo), -alquenileno(C2-C20)(heterociclo), o -alquinileno(C2-C20)(heterociclo);
R5 es -H o -alquilo(C1-C8);
o R4 y R5 juntos forman un anillo carbocíclico y tienen la fórmula -(CRaRb)s- en donde Ra y Rb son independientemente -H, -alquilo(C1-C20), -alquenilo(C2-C20), -alquinilo(C2-C20), o -carbociclo y s es 2, 3, 4, 5 o 6,
R6 es -H, -alquilo(C1-C20), -alquenilo(C2-C20), o -alquinilo(C2-C20);
R7 es -H, -alquilo(C1-C20), -alquenilo(C2-C20), -alquinilo(C2-C20), -carbociclo, -alquileno(C1-C20)(carbociclo), -alquenileno(C2-C20)(carbociclo), -alquinileno(C2-C20)(carbociclo), -arilo, -alquileno(C1-C20)(arilo), -alquenileno(C2-C20) (arilo), -alquinileno(C2-C20)(arilo), -heterociclo, -alquileno(C1-C20)(heterociclo), -alquenileno(C2-C20)(heterociclo), o -alquinileno(C2-C20)(heterociclo);
cada R8 es independientemente -H, -OH, -alquilo(C1-C20), -alquenilo(C2-C20), -alquinilo(C2-C20), -O-(alquilo(C1-C20)), -O-(alquenilo(C2-C20)), -O-(alquinilo((C1-C20)), o -carbociclo;
R9 es -H, -alquilo(C1-C20), -alquenilo(C2-C20), o -alquinilo(C2-C20);
R24 es -arilo, -heterociclo, o -carbociclo;
R25 es -H, -alquilo(C1-C20), -alquenilo(C2-C20), -alquinilo(C2-C20), -carbociclo, -O-(alquilo(C1-C20)), -O-(alquenilo(C2-C20)), -O-(alquinilo((C2-C20)), u OR18 en donde R18 es -H, un grupo protector de hidroxilo, o un enlace directo donde OR18 representa =O;
R26 es -H, -alquilo(C1-C20), -alquenilo(C2-C20), o -alquinilo(C2-C20), -arilo, -heterociclo, o -carbociclo;
R10 es -arilo o -heterociclo;
Z es -O, -S, -NH, o -NR12, en donde R12 es -alquilo(C1-C20), -alquenilo(C2-C20), o -alquinilo(C2-C20);
R11 es -H, -alquilo(C1-C20), -alquenilo(C2-C20), -alquinilo(C2-C20), -arilo, -heterociclo, -(R13O)m-R14, o -(R13O)m-CH(R15)2;
m es un entero que va de 1 a 1000;
R13 es -alquileno(C2-C2o), -alquenileno(C2-C2o), o -alquinileno(C2-C2o);
R14 es -H, -alquilo(Ci-C2o), -alquenilo(C2-C2o), o -alquinilo(C2-C2o);
cada aparición de R15 es independientemente -H, -COOH, -(CH2)n-N(R16)2, -(CH2)n-SO3H, -(CH2)n-SO3-alquilo(C1-C2o), -(CH2)n-SO3-alquenilo(C2-C2o), o -(CH2)n-SO3-alquinilo(C2-C2o);
cada aparición de R16 es independientemente -H, -alquilo(C1-C2o), -alquenilo(C2-C2o), -alquinilo(C2-C2o) o -(CH2)n-COOH; y
n es un entero que va de 0 a 6;
en donde dichos radicales alquilo, alquenilo, alquinilo, alquileno, alquenileno, alquinileno, arilo, carbociclo, y heterociclo, tanto solos como formando parte de otro grupo, están optativamente sustituidos.
Las auristatinas de la fórmula De incluyen aquellas en las que dichos radicales alquilo, alquenilo, alquinilo, alquileno, alquenileno, alquinileno, arilo, carbociclo, y heterociclo están sin sustituir.
Las auristatinas de la fórmula De incluyen aquellas en las que los grupos de R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, y sustituir y los grupos de R19, R20 y R21 están optativamente sustituidos tal y como está descrito en esta memoria.
Las auristatinas de la fórmula De incluyen aquellas en las que:
R2 es -alquilo(C1-C8);
R3, R4 y R7 está seleccionado de manera independiente de -H, -alquilo(C1-C2o), -alquenilo(C2-C2o), -alquinilo(C2-C20), carbociclo(C3-C6) monocíclico, -alquileno(C1-C2o)(carbociclo(C3-C6) monocíclico), -alquenileno(C2-C2o)(carbociclo(C3-C6) monocíclico), -alquinileno(C2-C2o)(carbociclo(C3-C6) monocíclico), arilo(C6-C1o), -alquileno(C1-C2o)(arilo(C6-C1o)), -alquenileno(C2-C2o)(arilo(C6-C1o)), -alquinileno(C2-C2o)(arilo(C6-C1o)), heterociclo, -alquileno(C1-C2o)(heterociclo), -alquenileno(C2-C2o)(heterociclo), o -alquinileno(C2-C2o)(heterociclo); en donde dichos radicales alquilo, alquenilo, alquinilo, alquileno, alquenileno, alquinileno, carbociclo, arilo y heterociclo están optativamente sustituidos:
R5 es -H;
R6 es -alquilo(C1-C8);
cada R8 está seleccionado de manera independiente de -OH, -O-(alquilo(C1-C2o)), -O-(alquenilo(C2-C2o)), -O-(alquinilo((C2-C2o)), en donde dichos radicales alquilo, alquenilo, y alquinilo están optativamente sustituidos;
R9 es -H o -alquilo(C1-C8);
R24 es -fenilo optativamente sustituido;
R25 es -OR18; en donde R18 es H, un grupo protector de hidroxilo, o un enlace directo donde OR18 representa
=O;
R26 está seleccionado de -H, -alquilo(C1-C2o), -alquenilo(C2-C2o), o -alquinilo(C2-C2o), o -carbociclo; en donde dichos radicales alquilo, alquenilo, alquinilo y carbociclo están optativamente sustituidos;
o una sal o solvato farmacéuticamente aceptable de las mismas.
Las auristatinas de la fórmula De incluyen aquellas en las que:
R2 es metilo;
R3 es -H, -alquilo(C1-C8), -alquenilo(C2-C8), -alquinilo(C2-C8), en donde dichos radicales alquilo, alquenilo y alquinilo están optativamente sustituidos;
R4 es -H, -alquilo(C1-C8), -alquenilo(C2-C8), -alquinilo(C2-C8), carbociclo(C3-C6) monocíclico, -arilo(C6-C1o), -alquileno(C1-C8)(arilo(C6-C1o)), -alquenileno(C2-C8)(arilo(C6-C1o)), -alquinileno(C2-C8)(arilo(C6-C1o)), -alquileno(C1-C8)(carbociclo(C3-C6) monocíclico), -alquenileno(C2-C8)(carbociclo(C3-C6) monocíclico), -alquinileno(C2-C8)(carbociclo(C3-C6) monocíclico); en donde dichos radicales alquilo, alquenilo, alquinilo, alquileno, alquenileno, alquinileno, arilo y carbociclo, tanto solos como formando parte de otro grupo, están optativamente sustituidos;
R5 es -H;
R6 es metilo;
R7 es -alquilo(Ci-C8), -alquenilo(C2-C8), o -alquinilo(C2-C8);
cada R8 es metoxi;
R9 es -H o -alquilo(Ci-C8);
R24 es -fenilo;
R25 es -OR18; en donde R18 es H, un grupo protector de hidroxilo, o un enlace directo donde OR18 representa =O;
R26 es metilo;
o una sal farmacéuticamente aceptable de las mismas.
Las auristatinas de la fórmula De incluyen aquellas en las que: R2 es metilo; R3 es -H o -alquilo(C1-C3); R4 es -alquilo(C1-C5); R5 es -H; R6 es metilo; R7 es isopropilo o sec-butilo; R8 es metoxi; R9 es -H o -alquilo(C1-C8); R24 es fenilo; R25 es -OR18; en donde R18 es -H, un grupo protector de hidroxilo, o un enlace directo donde OR18 representa =O; y R26 es metilo; o una sal o solvato farmacéuticamente aceptable de las mismas.
Las auristatinas de la fórmula De incluyen aquellas en las que:
R2 es metilo o -alquilo(C1-C3);
R3 es -H o -alquilo(C1-C3);
R4 es -alquilo(C1-C5);
R5 es H;
R6 es -alquilo(C1-C3);
R7 es -alquilo(C1-C5);
R8 es -alcoxi(C1-C3);
R9 es -H o -alquilo(C1-C8);
R24 es fenilo;
R25 es -OR18; en donde R18 es -H, un grupo protector de hidroxilo, o un enlace directo donde OR18 representa =O; y
R26 es -alquilo(C1-C3);
o una sal farmacéuticamente aceptable de las mismas.
Las auristatinas de la fórmula Df incluyen aquellas en las que:
R2 es metilo;
R3, R4, y R7 están seleccionados de manera independiente de -H, -alquilo(C1-C20), -alquenilo(C2-C20), -alquinilo(C2-C20), carbociclo(C3-C6) monocíclico, -alquileno(C1-C20)(carbociclo(C3-C6) monocíclico), -alquenileno(C2-C20)(carbociclo(C3-C6) monocíclico), -alquinileno(C2-C20)(carbociclo(C3-C6) monocíclico), arilo(C6-C10), -alquileno(C1-C20)(arilo(C6-C10)), -alquenileno(C2-C20)(arilo(C6-C10)), -alquinileno(C2-C20)(arilo(C6-C10)), heterociclo, -alquileno(C1-C20)(heterociclo), -alquenileno(C2-C20)(heterociclo), o -alquinileno(C2-C20)(heterociclo); en donde dichos radicales alquilo, alquenilo, alquinilo, alquileno, alquenileno, alquinileno, carbociclo, arilo y heterociclo, tanto solos como formando parte de otro grupo, están optativamente sustituidos; R5 es -H;
R6 es metilo;
cada R8 es metoxi;
R9 es -H, -alquilo(C1-C20), -alquenilo(C2-C20), o -alquinilo(C2-C20); en donde dichos radicales alquilo, alquenilo y alquinilo están optativamente sustituidos;
R10 es arilo optativamente sustituido o heterociclo opcionalmente sustituido;
Z es -O-, -S-, -NH-, o -NR12, en donde R12 es -alquilo(Ci-C2o), -alquenilo(C2-C2o), o -alquinilo(C2-C2o), cada uno de los cuales está opcionalmente sustituido;
R11 es -H, -alquilo(C1-C20), -alquenilo(C2-C20), -alquinilo(C2-C20), -arilo, -heterociclo, -(R13O)m-R14, o -(R13O)m-CH(R15)2, en donde dichos radicales alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo y heterociclo están optativamente sustituidos;
m es un entero que va de 1 a 1000 o m = 0;
R13 es -alquileno(C2-C20), -alquenileno(C2-C20), o -alquinileno(C2-C20), cada uno de los cuales está optativamente sustituido;
R14 es -H, -alquilo(C1-C20), -alquenilo(C2-C20), o -alquinilo(C2-C20), en donde dichos radicales alquilo, alquenilo y alquinilo están optativamente sustituidos;
cada aparición de R15 es independientemente -H, -COOH, -(CH2)n-N(R16)2, -(CH2V S O 3H, -(CH2)n-SO3-alquilo(C1-C20), -(CH2)n-SO3-alquenilo(C2-C20), o -(CH2)n-SO3-alquinilo(C2-C20), en donde dichos radicales alquilo, alquenilo y alquinilo están optativamente sustituidos;
cada aparición de R16 es independientemente -H, -alquilo(C1-C20), -alquenilo(C2-C20), -alquinilo(C2-C20), o -(CH2)n-COOH, en donde dichos radicales alquilo, alquenilo y alquinilo están optativamente sustituidos;
n es un entero que va de 0 a 6;
o una sal farmacéuticamente aceptable de las mismas.
En determinadas realizaciones de estas, R10 es fenilo optativamente sustituido.
Las auristatinas de la fórmula Df incluyen aquellas en las que los grupos de R2, R3, R4, R5, R6, R7, sustituir y los grupos de R10 y R11 son tal y como está descrito en esta memoria.
Las auristatinas de la fórmula Df incluyen aquellas en las que dichos radicales alquilo, alquenilo, alquinilo, alquileno, alquenileno, alquinileno, arilo, carbociclo, y heterociclo están sin sustituir.
Las auristatinas de la fórmula Df incluyen aquellas en las que:
R2 es -alquilo(C1-C3); R3 es -H o -alquilo(C1-C3); R4 es -alquilo(C1-C5); R5 es -H; R6 es -alquilo(C1-C3); R7 es -alquilo(C1-C5); R8 es -alcoxi(C1-C3); R9 es -H o -alquilo(C1-C8); R10 es fenilo optativamente sustituido; Z es -O-, -S-, o -Nh-; R11 es tal y como está definido en la presente memoria; o una sal farmacéuticamente aceptable de las mismas.
Las auristatinas de la fórmula Df incluyen aquellas en las que:
R2 es metilo; R3 es -H o -alquilo(C1-C3); R4 es -alquilo(C1-C5); R5 es -H; R6 es metilo; R7 es isopropilo o sec-butilo; R8 es metoxi; R9 es -H o -alquilo(C1-C8); R10 es fenilo optativamente sustituido; Z es -O-, -S-, o -NH-; y R11 es tal y como está definido en la presente memoria; o una sal farmacéuticamente aceptable de las mismas.
Las auristatinas de la fórmula Df incluyen aquellas en las que:
R2 es metilo; R3 es -H o -alquilo(C1-C3); R4 es -alquilo(C1-C5); R5 es -H; R6 es metilo; R7 es isopropilo o sec-butilo; R8 es metoxi; R9 es -H o -alquilo(C1-C8); R10 es fenilo; y Z es -O- o -NH-; y R11 es tal y como está definido en la presente memoria, preferiblemente hidrógeno; o una sal farmacéuticamente aceptable de las mismas.
Las auristatinas de la fórmula Df incluyen aquellas en las que:
R2 es -alquilo(C1-C3); R3 es -H o -alquilo(C1-C3); R4 es -alquilo(C1-C5); R5 es -H; R6 es -alquilo(C1-C3); R7 es -alquilo(C1-C5); R8 es -alcoxi(C1-C3); R9 es -H o -alquilo(C1-C8); R10 es fenilo; y Z es -O- o -NH-; y R11 es tal y como está definido en la presente memoria, preferiblemente hidrógeno; o una sal farmacéuticamente aceptable de las mismas.
Las auristatinas de la fórmula De o Df incluyen aquellas en las que R3, R4 y R7 son independientemente isopropilo o sec-butilo y R5 es -H. En una realización de ejemplo, R3 y R4 son cada uno isoporpilo, R5 es H y R7 es sec-butilo. Los demás sustituyentes son tal y como está definido en la presente memoria.
Las auristatinas de la fórmula De o Df incluyen aquellas en las que R2 y R6 son cada uno metilo, y R9 es H. Los demás sustituyentes son tal y como está definido en la presente memoria.
Las auristatinas de la fórmula De o Df incluyen aquellas en las que cada aparición de R8 es -OCH3. Los demás sustituyentes son tal y como está definido en la presente memoria.
Las auristatinas de la fórmula De o Df incluyen aquellas en las que R3 y R4 son cada uno isopropilo, R2 y R6 son cada uno metilo, R5 es H, R7 es sec-butilo, cada aparición de R8 es -OCH3, y R9 es H. Los demás sustituyentes son tal y
como está definido en la presente memoria.
Las auristatinas de la fórmula DF incluyen aquellas en las que Z es -O- o -NH-. Los demás sustituyentes son tal y como está definido en la presente memoria.
Las auristatinas de la fórmula Df incluyen aquellas en las que R10 es arilo. Los demás sustituyentes son tal y como está definido en la presente memoria.
Las auristatinas de la fórmula Df incluyen aquellas en las que R10 es fenilo. Los demás sustituyentes son tal y como está definido en la presente memoria.
Las auristatinas de la fórmula DF incluyen aquellas en las que Z es -O-, y R11 es H, metilo o /-butilo. Los demás sustituyentes son tal y como está definido en la presente memoria.
Las auristatinas de la fórmula DF incluyen aquellas en las que Z es -NH-, R11 es -(R13O)m-CH(R15)2, en donde R15 es -(CH2)n-N(R16)2, y R16 es -alquilo(C1-C8) o -(CH2)n-COOH. Los demás sustituyentes son tal y como está definido en la presente memoria.
Las auristatinas de la fórmula DF incluyen aquellas en las que Z es -NH-, R11 es -(R"O)m-CH(R15)2, en donde R15 es -(CH2)n-SO3H. Los demás sustituyentes son tal y como está definido en la presente memoria.
En las realizaciones preferidas, cuando D es una auristatina de la fórmula De, w es un es un entero que va de 1 a 12, preferiblemente de 2 a 12, y es 1 o 2, y a es preferiblemente 1.
En algunas realizaciones, en donde D es una auristatina de la fórmula Df, a es 1 y w e y son 0.
Las unidades de fármaco (-D) ilustrativas incluyen las unidades de fármaco que tienen las siguientes estructuras:
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y
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o sales o solvatos farmacéuticamente aceptables de las mismas.
En un aspecto, los grupos hidrófilos, tales como, pero sin limitarse a ellos, los éteres de trietilenglicol (TEG) se pueden unir a la unidad de fármaco por el R11. Sin querer comprometerse con la teoría, los grupos hidrófilos ayudan a la interiorización de la unidad de fármaco, y a que esta no se aglomere.
En algunos ejemplos, la unidad de fármaco no es TZT-1027. En algunos ejemplos, la unidad de fármaco no es auristatina E, dolastatina 10 ni auristatina PE.
Los compuestos del conjugado de anticuerpo y fármaco de ejemplo tienen las estructuras que vienen a continuación, en donde «L» o «mAb-s-» representan un Acm contra 158P1D7 denominado Ha15-10ac12 que se presenta en la presente memoria:
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o sal farmacéuticamente aceptable de los mismos.
En otros ejemplos, la unidad de fármaco es caliqueamicina, camptotecina, un maitansinoide, o una antraciclina. En algunos otros ejemplos, el fármaco es un taxano, un inhibidor de topoisomerasas, un alcaloide de vinca, o similares. En algunos ejemplos típicos, los agentes citotóxicos idóneos incluyen, por ejemplo, fijadores del surco menor del ADN (p. ej., enodiínos y lexitropsinas, un compuesto CBI; véase también la patente de los EE. UU. n.° 6 130237, duocarmicinas, taxanos (p. ej., paclitaxel y docetaxel), puromicinas y alcaloides de vinca. Otros agentes citotóxicos incluyen, por ejemplo, Cc -1065, SN-38, topotecán, mofolino-doxorubicina, rizoxina, cianomorfolino-doxorubicina, equinomicina, combretastatina, netropsina, epotilona A y B, estramustina, criptofisinas, cemadotina, maitansinoides, discodermolida, eleuterobina y mitoxantrona.
En algunos ejemplos, el fármaco es un agente antitubulínico. Los ejemplos de antitubulínicos incluyen auristatinas, taxanos (p. ej., Taxol® [paclitaxel], Taxotere® [docetaxel]), T67 (Tularik) y alcaloides de vinca (p. ej., vincristina, vinblastina, vindesina y vinorelbina). Otros antitubulínicos incluyen, por ejemplo, derivados de bacatina, análogos de taxano (p. ej., epotilona A y B), nocodazol, colchicina y colcimida, estramustina, criptoficinas, cemadoina, maitansinoides, combretastatinas, discodermolida y eleuterobina.
En determinados ejemplos, el gente citotóxico es un maitansinoide, otro grupo de antitubulínicos. Por ejemplo, en realizaciones específicas, el maitansinoide es maitansina o DM-1 (ImmunoGen, Inc.; véase también Chari et al., 1992, Cáncer Res. 52: 127-131).
En determinados casos, el agente citotóxico o citostático es una dolastatina. El determinados casos, el agente citotóxico o citostático es de la clase de las auristatinas. Así pues, en un aspecto específico de la invención, el agente citotóxico o citostático es MMAE (fórmula XI). En otro ejemplo, el agente citotóxico o citostático es AFP (fórmula XVI).
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En otros determinados casos, el agente citotóxico o citostático es un compuestos de las fórmulas XII a XXI o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos:
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X.) Carga del fármaco
La carga del fármaco se representa con una p y es el número medio de los restos de fármaco por anticuerpo en una molécula. La carga del fármaco puede ir de 1 a 20 restos de fármaco (D) por anticuerpo. Los CAF de la invención comprenden los anticuerpos anti-158P1D7 o fragmentos de los mismos de la invención conjugados con un intervalo de restos de MMAE, de 1 a 20. El número medio de restos farmacológicos por anticuerpo en las preparaciones de CAF de las reacciones de conjugación se puede caracterizar por medios convencionales, tales como la espectroscopia de masas y el ensayo ELISA. También se puede determinar la distribución cuantitativa de los CAF en términos de p. En algunos casos, la separación, purificación y caracterización de CAF homogéneos, en donde p es un valor determinado de CAF con otras cargas del fármaco, se puede conseguir por medios tales como la electroforesis.
Para los conjugados de anticuerpo y fármaco, p puede estar limitada por el número de sitios de unión en el anticuerpo. Por ejemplo, cuando la unión es un tiol de cisteína, como en las realizaciones ejemplares de más arriba, un anticuerpo puede tener solo uno o varios grupos tiol de cisteína, o puede tener solo uno o varios grupos tiol suficientemente reactivos a través de los cuales se puede unir un conector. En algunas realizaciones, una carga de fármaco mayor, p. ej., p > 5, puede ocasionar agregación, insolubilidad, toxicidad o pérdida de la permeabilidad celular de determinados conjugados de anticuerpo y fármaco. En algunas realizaciones, la carga del fármaco para un CAF de la invención va de 1 a aproximadamente 8; de aproximadamente 2 a aproximadamente 6; de aproximadamente 3 a aproximadamente 5; de aproximadamente 3 a aproximadamente 4; de aproximadamente 3,1 a aproximadamente 3,9; de aproximadamente 3,2 a aproximadamente 3,8; de aproximadamente 3,2 a aproximadamente 3,7; de aproximadamente 3,2 a aproximadamente 3,6; de aproximadamente 3,3 a aproximadamente 3,8; o de aproximadamente 3,3 a aproximadamente 3,7. De hecho, se ha demostrado que para algunos CAF, la relación óptima de los restos de fármaco por anticuerpo puede ser menos de 8, y puede ser de aproximadamente 2 a aproximadamente 5. Véase la patente de los EE. UU. 2005-0238649 A1.
En determinadas realizaciones, a un anticuerpo se le conjugan menos restos de fármaco que el máximo teórico durante una reacción de conjugación. Un anticuerpo puede contener, por ejemplo, restos de lisina que no reaccionan con el intermedio fármaco-conector o el reactivo de conector, como se explica más adelante. Por lo general, los anticuerpos no contienen muchos grupos tiol de cisteína libres y reactivos que puedan unirse a un resto de fármaco; de hecho, la mayoría de restos tiol de cisteína en los anticuerpos existen como puentes disulfuro. En algunas realizaciones, un anticuerpo se puede reducir con un reductor, tal como ditiotreitol (DTT) o tricarboniletilfosfina (TCEP), en las condiciones de reducción parcial o total, para generar grupos tiol de cisteína reactivos. En determinadas realizaciones, un anticuerpo se somete a condiciones de desnaturalización para revelar los grupos nucleófilos reactivos, tales como lisina o cisteína.
La carga (razón fármaco/anticuerpo) de un CAF se puede controlar de diferentes maneras, p. ej., mediante: (i) la limitación del exceso molar del intermedio fármaco-conector o el reactivo conector con respecto al anticuerpo; (ii) la limitación del tiempo de reacción de la conjugación o la temperatura, (iii) con condiciones de reducción limitantes o parciales para la modificación de tioles de cisteína, (iv) la manipulación genética de la secuencia aminoacídica del anticuerpo mediante técnicas recombinantes, de tal manera que el número y la posición de los restos de cisteína queda modificado para controlar el número y/o la posición de las uniones entre el conector y el fármaco (tales como tioMab o tioFab preparados tal y como está descrito en la presente memoria y en la solicitud de patente internacional WO 2006/034488).
Se ha de saber que cuando más de un grupo nucleófilo reacciona con un intermedio fármaco-conector o reactivo conector seguido del reactivo con el resto de fármaco, entonces el producto resultante es una mezcla de compuestos de CAF con una distribución de uno o varios restos de fármaco unidos a un anticuerpo. El número promedio de fármacos por anticuerpo se puede calcular a partir de la mezcla mediante un ensayo de anticuerpo por ELISA dual, que es específico para el anticuerpo y específico para el fármaco. Se pueden identificar cada una de las moléculas de CAF en la mezcla mediante espectroscopia de masas y se pueden separar por HPLC, p. ej., cromatografía de interacciones hidrófobas (véanse, p. ej., Hamblett, K. J. et al. «Effect of drug loading on the pharmacology, pharmacokinetics and toxicity of an anti-CD30 antibody-drug conjugate», resumen n.° 624, American Association for Cancer Research, encuentro anual de 2004, 27-31 de marzo, 2004 Proceedings o f the AACR, volumen 45, marzo de 2004; Alley, S. C. et al., «Controlling the location of drug attachment in antibody-drug conjugates», resumen n.° 627, American Association for Cancer Research, encuentro anual de 2004, 27-31 de marzo de 2004, Proceedings o f the AACR, volumen 45, marzo de 2004). En determinadas realizaciones, se puede aislar de la mezcla de conjugación, mediante electroforesis o cromatografía, un CAF homogéneo con un solo valor de carga.
XI.) Métodos para determinar el efecto cito tóxico de los CAF
Se conocen los métodos para determinar si un fármaco o un conjugado de anticuerpo y fármaco ejerce un efecto citostático y/o citotóxico sobre una célula. Por lo general, la actividad citotóxica o citostática de un conjugado de anticuerpo y fármaco se puede medir mediante: la exposición de células de mamífero que expresan una proteína diana del conjugado de anticuerpo y fármaco en un medio de cultivo celular; el cultivo de las células durante un periodo de aproximadamente 6 horas a aproximadamente 5 días; y la medición de la viabilidad celular. Los ensayos in vitro con células se pueden utilizar para medir la viabilidad (proliferación), citotoxicidad e inducción de la apoptosis (activación de las caspasas) debidas al conjugado de anticuerpo y fármaco.
Para determinar si un conjugado de anticuerpo y fármaco ejerce un efecto citostático, se puede utilizar un ensayo de incorporación de timidina. Por ejemplo, las células cancerosas que expresan un antígeno diana a una densidad de 5 000 células/pocillo de una placa de 96 pocillos se pueden cultivar durante un periodo de 72 horas y exponerse a 0,5 |jC¡ de 3H-timidina durante las 8 últimas horas del periodo de 72 horas. La incorporación de 3H-timidina en las células del cultivo se mide en presencia o ausencia del conjugado de anticuerpo y fármaco.
Para determinar la citotoxicidad, se pueden medir la necrosis o la apoptosis (muerte celular programada). La necrosis viene típicamente acompañada por un incremento de la permeabilidad de la membrana plasmática, hinchamiento de la célula, y ruptura de la membrana plasmática. La apoptosis se caracteriza típicamente por zeiosis de la membrana, condensación del citoplasma y activación de las endonucleasas endógenas. La determinación de cualquiera de estos efectos sobre las células cancerosas indica que un conjugado de anticuerpo y fármaco es útil para el tratamiento de los cánceres.
La viabilidad celular se puede medir con la determinación de la captación de un colorante en una célula, tal como rojo neutro, azul tripano o azul ALAMAR™ (véase, p. ej., Page et al., 1993, Intl. J. Oncology 3: 473-476). En tal ensayo, las células se incuban en medios que contienen el colorante, se lavan las células y lo que queda de colorante, que es reflejo la captación celular del colorante, se mide mediante espectrofotometría. Para medir la citotoxicidad, también se puede utilizar el colorante fijador de proteínas sulforrodamina B (SRB) (Skehan et al., 1990, J. Natl. Cancer Inst. 82: 1107-12).
Como alternativa, se utiliza en un ensayo colorimétrico cuantitativo una sal de tetrazolio, tal como MTT, para la supervivencia y la proliferación de las células de mamífero al detectar las células vivas pero no las muertas (véase, p. ej., Mosmann, 1983, J. Immunol. Methods 65: 55-63).
La apoptosis se puede cuantificar al medir, por ejemplo, la fragmentación del ADN. Hay disponibles métodos fotométricos comerciales para la determinación cuantitativa in vitro de la fragmentación del ADN. En Biochemica, 1999, n.° 2, págs. 34-37 (Roche Molecular Biochemicals) se describen ejemplos de tales ensayos, entre ellos TUNEL (que detecta la incorporación de los nucleótidos marcados en el ADN fragmentado) y ensayos basados en ELISA.
La apoptosis también se puede determinar al medir los cambios morfológicos de una célula. Por ejemplo, como con la necrosis, la pérdida de la integridad de la membrana plasmática se puede determinar con la medición de la captación de determinados colorantes (p. ej., un colorante fluorescente tal como, por ejemplo, naranja de acridina o bromuro de etidio). Un método para medir el número de células apoptósicas lo han descrito Duje y Cohen, en Current Protocols in Immunology (Coligan et al, eds. 1992, págs. 3.17.1-3.17.16). Las células también se pueden marcar con un colorante del ADN (p. ej., naranja de acridina, bromuro de etidio o yoduro de propidio) y en las células se puede observar la condensación y la marginación de la cromatina a lo largo de la membrana nuclear interna. Otros cambios morfológicos que se pueden medir para determinar la apoptosis incluyen, p. ej., condensación citoplasmática, incremento de la zeiosis de la membrana, y encogimiento de las células.
La presencia de las células apoptósicas se puede medir tanto en los compartimentos unidos como en los «flotantes» de los cultivos. Por ejemplo, los dos compartimentos se pueden recoger mediante la retirada del sobrenadante, el tratamiento con tripsina de las células adheridas, la combinación de las preparaciones después de una etapa de lavado por centrifugación (p. ej., 10 minutos a 2000 rpm) y la detección de la apoptosis (p. ej., al medir la fragmentación del ADN) (véase, p. ej., Piazza et al., 1995, Cáncer Research, 55: 3110-16).
In vivo, el efecto de una composición terapéutica de 158P1D7 se puede evaluar en un modelo de animal idóneo. Por ejemplo, se pueden utilizar modelos de cáncer alógenos, en donde los explantes de cáncer o tejidos de pase de xenotrasplantes se introducen en los animales que tienen el sistema inmunitario comprometido, tales como ratones atímicos o IDCG (Klein et al, 1997, Nature Medicine 3: 402-408). Por ejemplo, la solicitud de patente internacional en el marco PCT WO 98/16628 y la patente de los EE. UU. n.° 6 107540 describen diferentes modelos con xenotrasplante de cáncer de próstata humano capaces de recapitular el desarrollo de los tumores primarios, micrometástasis y la formación de metástasis osteoblásticas características de los últimos estadios de la enfermedad. La eficacia se puede predecir con el uso de ensayos que miden la inhibición de la formación de tumores, la regresión tumoral o la metástasis, y similares.
Los ensayos in vivo que evalúan la promoción de la apoptosis son útiles para evaluar las composiciones terapéuticas. En una realización, a los xenotrasplantes de ratones portadores de tumores tratados con la composición terapéutica se les puede examinar la presencia de focos apoptósicos y se les puede comparar con los ratones portadores de xenotrasplantes de control sin tratar. La extensión a la que se encuentran los focos apoptósicos en los tumores de los ratones tratados proporciona una indicación de la eficacia terapéutica de la composición.
Las composiciones terapéuticas utilizadas en la práctica de los métodos que vienen a continuación se pueden formular en las composiciones farmacéuticas que comprenden un vehículo idóneo para el método de administración deseado. Los vehículos idóneos incluyen cualquier material que, cuando se combina con la composición terapéutica, conserva la función antitumoral de la composición terapéutica y, por lo general, no hace reaccionar al sistema inmunitario del paciente. Los ejemplos incluyen, pero sin limitarse a ellos, cualquiera de una serie de vehículos farmacéuticos estándares, tales como las soluciones salinas estériles tamponadas con fosfato, agua bacteriostática, y similares (véase, para las líneas generales, Remington's Pharmaceutical Sciences 16.a edición, A. Osal., Ed., 1980).
Las formulaciones terapéuticas se pueden solubilizar y administrar por cualquier vía capaz de administrar la composición terapéutica al sitio del tumor. Las vías potencialmente eficaces de administración incluyen, pero sin limitarse a ellas, intravenosa, parenteral, intraperitoneal, intramuscular, intratumoral, intradérmica, intraorgánica, ortotópica, y similares. Una formulación preferida para la inyección intravenosa comprende la composición terapéutica en una solución de agua bacteriostática conservada, agua estéril sin conservar y/o diluida en bolsas de cloruro de polivinilo o de polietileno que contienen cloruro de sodio estéril al 0,9% para la inyección, según la farmacopea de EE. UU. Las preparaciones terapéuticas de proteínas se pueden liofilizar o conservar como polvos estériles, preferiblemente al vacío, y a continuación se pueden reconstituir en agua bacteriostática (que contiene, por ejemplo, el conservante alcohol bencílico) o en agua estéril antes de la inyección.
Las dosis y los protocolos de administración para el tratamiento de los cánceres mediante el uso de los métodos de más arriba variarán con el método y el cáncer destinatario, y dependerán por lo general de una serie de factores distintos apreciados en la técnica.
XII.) Tratamiento de los cánceres que expresan la 158P1D7
La identificación de la 158P1D7 como una proteína que se suele expresar en un conjunto restringido de tejidos, pero que también se expresa en el cáncer, tales como los recogidos en la tabla I, abre una serie de estrategias terapéuticas para el tratamiento de tales cánceres.
Cabe destacar que los tratamientos antitumorales dirigidos han sido útiles incluso cuando la proteína destinataria se expresa en los tejidos normales, incluso en los tejidos normales de los órganos vitales. Un órgano vital es uno que es necesario para mantener la vida, tal como el corazón o el colon. Un órgano no vital es uno que se puede retirar y sin el cual el individuo sigue siendo capaz de sobrevivir. Los ejemplos de órganos no vitales son ovario, mama y próstata.
La expresión de una proteína destinataria en un tejido normal, incluso en un tejido normal vital, no frustra la utilidad de un agente dirigido contra la proteína como un medicamento para determinados tumores en los que también se sobreexpresa la proteína. Por ejemplo, la expresión en órganos vitales no es en sí ni por sí mismo perjudicial. Además, los órganos considerados dispensables, tales como la próstata y el ovario, se pueden retirar sin afectar a la mortalidad. Finalmente, algunos órganos vitales no se ven afectados por la expresión en órganos normales debido a un inmunoprivilegio. Los órganos inmunoprivilegiados son órganos que están protegidos de la sangre por una barrera hematoorgánica y, así pues, no son accesibles para la inmunoterapia. Los ejemplos de órganos inmunoprivilegiados son el cerebro y los testículos.
En consecuencia, las estrategias terapéuticas que inhiben la actividad de una proteína 158P1D7 son útiles para los pacientes que padecen un cáncer que expresa la 158P1D7. Estas estrategias terapéuticas se suelen clasifican en general en tres clases. La primera clase modula la función de 158P1D7, ya que está relacionada con el crecimiento de las células tumorales, lo que conduce a la inhibición o retraso del crecimiento de células tumorales, o a la inducción de su muerte. La segunda clase comprende diferentes métodos para inhibir la fijación o asociación de una proteína 158P1D7 con su asociado de fijación o con otras proteínas. La tercera clase comprende una serie de métodos para inhibir la transcripción de un gen de 158P1D7 o la traducción del ARNm de 158P1D7.
De acuerdo con esto, a los pacientes con cáncer se les puede evaluar por la presencia y el nivel de expresión de 158P1D7, preferiblemente con el uso de valoraciones inmunohistoquímicas del tejido tumoral, toma de imágenes cuantitativas de la 158P1D7 u otras técnicas que indican con fiabilidad la presencia y el grado de la expresión de 158P1D7. Para este propósito, se prefiere el análisis inmunohistoquímico de las biopsias tumorales o de las muestras quirúrgicas. Los métodos para el análisis inmunohistoquímico de los tejidos tumorales se conocen bien en la técnica.
La invención da a conocer un conjugado de anticuerpo y fármaco de la invención para ser usado en un método para tratar el cáncer en un sujeto, en donde el cáncer es glioblastoma, cáncer de pulmón, cáncer de vejiga o cáncer de mama.
XIN.) 158P1D7 como una diana para el tratamiento basado en anticuerpos
La 158P1D7 es una diana atractiva para las estrategias terapéuticas basadas en anticuerpos. Se conocen en la técnica una serie de estrategias con anticuerpos para actuar selectivamente sobre moléculas extracelulares e intracelulares (véase, p. ej., la destrucción mediada por el complemento y por CCDA, así como el uso de intracuerpos). Ya que la 158P1D7 se expresa en las células cancerosas de diferentes linajes con respecto a las correspondientes células normales, se prepara la administración sistémica de composiciones inmunorreactivas contra 158P1D7 que muestran una excelente sensibilidad sin efectos tóxicos ni inespecíficos y/o fuera de la diana debidos a la fijación de la composición inmunorreactiva a los órganos y tejidos no destinatarios. Los anticuerpos que reaccionan específicamente con los dominios de 158P1D7 son útiles para tratar los cánceres que expresan 158P1D7 de forma sistémica, preferiblemente como conjugados de anticuerpo y fármaco (a saber, los CAF), en donde el conjugado es con una toxina o un agente terapéutico.
Los expertos en la técnica saben que los anticuerpos se pueden utilizar para, de manera específica, actuar selectivamente y fijarse a las moléculas inmunógenas, tales como una región inmunógena de una secuencia de 158P1D7 mostrada en la figura 1. Además, los expertos en la técnica saben que es corriente conjugar los anticuerpos a agentes citotóxicos (véase, p. ej., Slevers et al. Blood 93: 11, 3678-3684 (1 de junio de 1999)). Cuando los agentes citotóxicos y/o terapéuticos se administran directamente a las células, tal como al conjugarlos a anticuerpos específicos contra una molécula expresada por esa célula (p. ej., 158P1D7), el agente citotóxico ejercerá su efecto biológico conocido (a saber, citotoxicidad) sobre esas células.
En la técnica se conocen una amplia gama de composiciones y métodos para usar conjugados de anticuerpo y agente citotóxico para destruir células. En el contexto de los cánceres, los métodos típicos implican administrar a un mamífero que tiene un tumor una cantidad biológicamente eficaz de un conjugado que comprende un agente citotóxico y/o terapéutico seleccionado unido a un agente selector de la diana (p. ej., un Acm contra 158P1D7, preferiblemente Ha15-10ac12) que se fija a un antígeno (p. ej., 158P1D7) que se expresa, que es accesible para la fijarión o que está localizado en las superficies celulares. Una realización típica es un método para administrar un agente citotóxico y/o terapéutico a una célula que expresa la 158P1D7, que comprende conjugar el agente citotóxico a un anticuerpo que se fija inmunoespecíficamente a un epítopo de 158P1D7 y exponer la célula al conjugado de anticuerpo y fármaco (CAF). Otro ejemplo ilustrativo es un método para tratar un individuo que se sospecha que padece un cáncer con metásitasis, que comprende una etapa de administrar por vía parenteral a dicho individuo una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo conjugado a un agente citotóxico y/o terapéutico.
La inmunoterapia contra el cáncer que hace uso de anticuerpos contra 158P1D7 se puede realizar de acuerdo con diferentes métodos que se han empleado con éxito en el tratamiento de otros tipos de cáncer, entre ellos, pero sin limitarse a ellos, el cáncer de colon (Arlen et al., 1998, Crit. Rev. Immunol. 18: 133-138), mieloma múltiple (Ozaki et al., 1997, Blood 90: 3179-3186, Tsunenari et al., 1997, Blood 90: 2437-2444), cáncer de estómago (Kasprzyk et al., 1992, Cáncer Res. 52: 2771-2776), linfoma de linfocitos B (Funakoshi et al., 1996, J. Immunother. Emphasis Tumor Immunol. 19: 93-101), leucemia (Zhong et al., 1996, Leuk. Res. 20: 581-589), cáncer colorrectal (Moun et al., 1994, Cáncer Res. 54: 6160-6166; Velders et al., 1995, Cáncer Res. 55: 4398-4403) y cáncer de mama (Shepard et al., 1991, J. Clin. Immunol. 11: 117-127). Algunos métodos terapéuticos implican la conjugación del anticuerpo desnudo a una toxina o radioisótopo, tal como la conjugación de Y91 o I131 a los anticuerpos anti-CD20 (p. ej., Zevalin™, IDEC Pharmaceuticals Corp. o Bexxar™, Coulter Pharmaceuticals), respectivamente, mientras que otros implican la coadministración de anticuerpos y otros agentes terapéuticos, tales como Herceptin™ (trastuzu MAb) con paclitaxel (Genentech, Inc.). En un aspecto específico, los anticuerpos de la invención se conjugarán a un agente citotóxico, véase más arriba, preferiblemente un derivado de auristatina denominado MMAE (Seattle Genetics).
Aunque el tratamiento con el anticuerpo contra 158P1D7 es útil para todos los estadios del cáncer, el tratamiento con el anticuerpo puede ser particularmente adecuado en el cáncer avanzado o metastásico. El tratamiento con la terapia basada en anticuerpos de la invención está indicado para los pacientes que han recibido uno o varios ciclos de quimioterapia. Como alternativa, el tratamiento con el anticuerpo de la invención se combina con una pauta de quimioterapia o de radioterapia para los pacientes que no han recibido un tratamiento quimioterápico. Además, el tratamiento con el anticuerpo puede permitir el uso de dosis reducidas de la quimioterapia concomitante, en particular para los pacientes que no toleran muy bien la toxicidad del quimioterápico. En Fan et al. (Cáncer Res. 53: 4637-4642, 1993), Prewett et al. (International J, o f Onco. 9: 217-224, 1996) y Hancock et al., (Cáncer Res. 51: 4575-4580, 1991) se describe el uso de diferentes anticuerpos junto con quimioterápicos.
En consecuencia, los anticuerpos monoclonales preferidos que se utilizan en los usos terapéuticos de la invención son los que son totalmente humanos y que se fijan de manera específica al antígeno destinatario de 158P1D7 con gran afinidad. Aunque el conjugado de anticuerpo y fármaco de la invención es útil para tratar cánceres en los que se expresa la 158P1D7, el conjugado de anticuerpo y fármaco de la invención puede ser particularmente útil desde el punto de vista terapéutico para tratar los cánceres de vejiga.
XIV.) Cócteles de CAF contra 158P1D7
Los usos terapéuticos de la invención contemplan la administración de un solo CAF contra 158P1D7, así como combinaciones, o cócteles, de diferentes Acm (a saber, los Acm contra 158P1D7 o los Acm que se fijan a otra proteína). Tales cócteles de Acm pueden tener determinadas ventajas en tanto en cuanto que contienen Acm que actúan selectivamente sobre diferentes epítopos, explotan diferentes mecanismos efectores o combinan directamente los Acm citotóxicos con los Acm que se basan en la funcionalidad efectora inmunitaria. Tales Acm en combinación pueden mostrar efectos terapéuticos sinérgicos. Además, los Acm contra 158P1D7 pueden administrarse concomitantemente con otras modalidades terapéuticas, entre ellas, pero sin limitarse a ellas, diferentes quimioterápicos y agentes biológicos, bloqueantes de andrógenos, moduladores inmunitarios (p. ej., IL-2, GM-CSF), cirugía o radioterapia. En una realización preferida, los Acm contra 158P1D7 se administran en forma conjugada.
Las formulaciones de CAF contra 158P1D7 se administran por cualquier vía que sea capaz de enviar los anticuerpos a una célula tumoral. Las vías de administración incluyen, pero sin limitarse a ellas, intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, intratumoral, intradérmica y similares. El tratamiento implica en líneas generales la administración repetida de la preparación de CAF contra 158P1D7 por una vía de administración aceptable, tal como la inyección intravenosa (i.v.), típicamente a una dosis en el margen que incluye, pero sin limitarse a ellos, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 o 25 mg/kg de masa corporal. En general, las dosis en el margen de 10 a 1000 mg de Acm por semana son eficaces y se toleran bien.
Sobre la base de los experimentos clínicos con Herceptin® (Trastuzumab) en el tratamiento del cáncer de mama metastásico, una dosis de carga inicial de aproximadamente 4 mg/kg de masa corporal del paciente i.v., seguido de dosis semanales de aproximadamente 2 mg/kg i.v. de la preparación del Acm, representa una pauta de dosificación aceptable. Preferiblemente, la dosis de carga inicial se administra como una infusión de 90 minutos o más. La dosis de mantenimiento periódica se administra como una infusión de 30 minutos o más, siempre y cuando la dosis inicial se tolere bien. Tal y como apreciarán los expertos en la técnica, hay diferentes factores que pueden influir en la pauta de dosificación ideal en un caso en concreto. Tales factores incluyen, por ejemplo, la afinidad de fijación y la semivida de los Acm utilizados, el grado de expresión de 158P1D7 en el paciente, la extensión del antígeno de 158P1D7 desprendido en circulación, el valor deseado de concentración del anticuerpo en estado estacionario, la frecuencia de tratamiento y la influencia de los quimioterápicos u otros agentes utilizados en combinación con el método de tratamiento de la invención, así como el estado de salud de un paciente en concreto.
Optativamente, a los pacientes se les debe evaluar la cantidad de 158P1D7 en una muestra dada (p. ej., la cantidad del antígeno 158P1D7 en circulación y/o la cantidad de las células que expresan la 158P1D7) con el fin de ayudar a la determinación de la pauta de dosificación más eficaz, etc. Tales evaluaciones también se utilizan con propósitos de seguimiento a lo largo del tratamiento y son útiles para calibrar el éxito terapéutico en combinación con la evaluación de otros parámetros (por ejemplo, citología de orina y/o los niveles de ImmunoCyt en el tratamiento del cáncer de vejiga, o, por analogía, los niveles de PSA en el suero en el tratamiento del cáncer de próstata).
Un objeto de la presente invención es dar a conocer los CAF contra 158P1D7 que inhiben o retrasan el crecimiento de las células tumorales que expresan la 158P1D7. Otro objeto de esta invención es dar a conocer métodos para inhibir la angiogénesis y otras funciones biológicas y, gracias a ello, reducir el crecimiento del tumor en los mamíferos, preferiblemente humanos, al hacer uso de tales CAF contra 158P1D7 y, en particular, al hacer uso de tales CAF contra 158P1D7 en combinación con otros fármacos o tratamientos inmunitariamente activos.
XV. ) Politerapia
En otra realización, hay sinergia cuando los tumores, incluidos los tumores de humano, se tratan con los CAF contra 158P1D7 junto con quimioterápicos o radioterapia o combinaciones de los mismos. En otras palabras, la inhibición del crecimiento tumoral mediante un CAF contra 158P1D7 aumenta más de lo esperado cuando se combina con quimioterápicos o radioterapia o combinaciones de los mismos. La sinergia se puede mostrar, por ejemplo, mediante una inhibición mayor del crecimiento tumoral con la politerapia de lo que se esperaría a partir del tratamiento monoterápico con el CAF contra 158P1D7 o del efecto aditivo del tratamiento con un CAF contra 158P1D7 y un quimioterápico o radioterapia. Preferiblemente, la sinergia se demuestra mediante la remisión del cáncer, cuando no se espera ninguna remisión a partir del tratamiento con un CAF contra 158P1D7 o bien con el tratamiento que hace uso de una combinación adictiva de un CAF contra 158P1D7 y un quimioterápico o radioterapia.
El método para inhibir el crecimiento de las células tumorales al hacer uso de un CAF contra 158P1D7 y una combinación de quimioterapia o radioterapia o ambas comprende administrar el CAF contra 158P1D7 antes, durante o después de comenzar la quimioterapia o la radioterapia, así como cualquier combinación de las mismas (a saber, antes y durante, antes y después, durante y después, o antes, durante, y después de comenzar la quimioterapia y/o radioterapia). Por ejemplo, el CAF contra 158P1D7 se administra típicamente entre 1 y 60 días, preferiblemente entre 3 y 40 días, más preferiblemente entre 5 y 12 días, antes de comenzar la radioterapia y/o quimioterapia. Sin embargo, según el protocolo del tratamiento y las necesidades específicas del paciente, el método se realiza de una manera que proporcionará el tratamiento más eficaz y, en última instancia, prolongará la vida del paciente.
La administración de los quimioterápicos se puede realizar en una serie de modos que incluyen la administración sistémica por las vías parenteral y enteral. En una realización, los CAF contra 158P1D7 y el quimioterápico se administran como moléculas independientes. Los ejemplos concretos de quimioterápicos o quimioterapia incluyen cisplatino, dacarbazina (DTIC), dactinomicina, mecloretamina, estreptozocina, ciclofosfamida, carmustina (BCNU), lomustina (CCNU), doxorubicina (adriamicina), daunorubicina, procarbazina, mitomicina, citarabina, etopósido, metotrexato, 5-fluorouracilo, vinblastina, vincristina, bleomicina, paclitaxel (taxol), docetaxel (taxotere), aldesleucina, asparaginasa, busulfano, carboplatino, cladribina, dacarbazina, floxuridina, fludarabina, hidroxiurea, ifosfamida, interferón a, leuprorelina, megestrol, melfalán, mercaptopurina, plicamicina, mitotano, pegaspargasa, pentostatina, pipobromán, plicamicina, estreptozocina, tamoxifeno, tenopósido, testolactona, tioguanina, tiotepa, uramustina, vinorelbina, gemcitabina, clorambucilo, taxol y combinaciones de los mismos.
La fuente de la radioterapia, utilizada en combinación con un CAF contra 158P1D7, puede ser externa o interna al paciente que se esté tratando. Cuando la fuente es externa al paciente, el tratamiento se conoce como radioterapia de haz externo o telerradioterapia (TRT). Cuando la fuente de la radioterapia es interna al paciente, el tratamiento se denomina braquirradioterapia (BRT).
Las pautas terapéuticas descritas más arriba pueden además combinarse con más agentes y/o pautas con los que tratar el cáncer, por ejemplo, quimioterapia adicional, vacunas contra el cáncer, inhibidores de la transducción de señales, agentes útiles para tratar el crecimiento celular anormal o el cáncer, anticuerpos (p. ej., anticuerpos anti-CTLA-4 como el descrito en la solicitud de patente internacional WO 2005/092380 (Pfizer)) u otros ligandos que inhiben el crecimiento del tumor mediante la fijación a IGF-IR, y citocinas.
Cuando el mamífero está sometido además a quimioterapia, se pueden utilizar los quimioterápicos descritos más arriba. Adicionalmente, se pueden utilizar inhibidores del factor de crecimiento, modificadores de la respuesta biológica, tratamiento antihormonal, moduladores selectivos de los receptores de estrógenos (MSRE), inhibidores de la angiogénesis y antiandrógenos. Por ejemplo, se pueden utilizar las antihormonas, por ejemplo, antiestrógenos, tales como Nolvadex (tamoxifeno), o antiandrógenos, tales como Casodex (4-ciano-3-(4-fluorofenilsulfonil)-2-hidroxi-2-metil-3-'-(trifluorometil)propionanilida).
Los métodos terapéuticos de más arriba se pueden combinar con cualquiera de una amplia gama de tratamientos quirúrgicos, quimioterapia o radioterapia. Los métodos terapéuticos de la invención pueden permitir el uso de dosis reducidas de quimioterapia (u otros tratamientos) y/o una administración menos frecuente, una ventaja para todos los pacientes y, en particular, para los que no toleran bien la toxicidad del quimioterápico.
XVI. ) Kits/artículos de fabricación
Para el uso en las aplicaciones de laboratorio, pronósticas, profilácticas, diagnósticas y terapéuticas descritas en la presente memoria, los kits se encuentran dentro del alcance de la descripción. Tales kits pueden comprender un vehículo, envase o contenedor que está compartimentado para recibir uno o varios contenedores, tales como viales, tubos y similares, en donde cada uno de los contenedores comprende uno de los elementos independientes que se utilizan en el método, junto con una etiqueta o prospecto que comprende las instrucciones de uso, tales como un uso descrito en la presente memoria. Por ejemplo, el uno o varios contenedores puede comprender un anticuerpo que está o puede estar marcado de manera detectable. Los kits pueden comprender un contenedor que comprende una unidad de fármaco. El kit puede incluir toda o parte de las secuencias de aminoácidos de la figura 2, o de la figura 3, o análogos de las mismas, o una molécula de ácido nucleico que codifica tales secuencias aminoacídicas.
El kit descrito en la presente memoria comprenderá típicamente el contenedor descrito más arriba y uno o varios contenedores más asociados a este que comprenden materiales deseables desde un punto de vista comercial y del usuario, entre ellos tamponantes, diluyentes, filtros, agujas, jeringuillas; vehículo, envase, contenedor, vial y/o etiquetas de tubo que recogen el contenido y/o las instrucciones de uso, y prospectos con las instrucciones de uso.
Puede estar presente sobre o dentro del contenedor una etiqueta que indica que la composición se utiliza para un tratamiento o aplicación no terapéutica específicos, tal como una aplicación pronóstica, profiláctica, diagnóstica o de laboratorio, y puede también indicar directrices para el uso in vivo o bien in vitro, tales como las descritas en la presente memoria. También se pueden incluir directrices y/o otra información en uno o varios insertos o etiquetas que se incluyen con o en el kit. La etiqueta puede estar sobre el contenedor o estar asociada a él. Una etiqueta puede estar sobre un contenedor cuando las letras, números u otros caracteres que forman la etiqueta están moldeadas o grabadas en el propio contenedor; una etiqueta puede estar asociada a un contenedor cuando está presente dentro de un receptáculo o vehículo que también aloja el contenedor, p. ej., como un prospecto. La etiqueta puede indicar que la composición se utiliza para el diagnóstico, tratamiento, profilaxis o pronóstico de una afección, tal como un cáncer de tejido que se presenta en la tabla I.
Los términos «kit» y «artículo de fabricación» se puede utilizar como sinónimos.
En otro ejemplo, se da a conocer uno o varios artículos de fabricación que contienen composiciones, tales como uno o varios anticuerpos, o conjugados de anticuerpo y fármaco (CAF), p. ej., materiales útiles para el diagnóstico, pronóstico, profilaxis y/o tratamiento de cánceres de tejido tales como los presentados en la tabla I. El artículo de fabricación comprende típicamente al menos un contenedor y al menos una etiqueta. Los contenedores idóneos incluyen, por ejemplo, botellas, viales, jeringuillas y tubos de ensayo. Los contenedores pueden estar formados de muy diferentes materiales, tales como vidrio, metal o plástico. El contenedor puede alojar una o varias secuencias de aminoácidos, una o varias moléculas pequeñas, una o varias secuencias de ácido nucleico, una o varias poblaciones de células y/o uno o varios anticuerpos. En otro ejemplo, un contenedor comprende un anticuerpo, fragmento de fijación del mismo, o proteína de fijación específica, para ser usados en la evaluación de la expresión de la proteína de 158P1D7 en las células y en los tejidos, o para propósitos de laboratorio, pronósticos, diagnósticos, profilácticos y terapéuticos relevantes; indicaciones y/o directrices para tales usos se pueden incluir sobre tal contenedor o con él, tal y como lo son los reactivos y otras composiciones o herramientas utilizadas para estos propósitos.
El contenedor puede alojar, como alternativa, una composición que es eficaz para el tratamiento, diagnóstico, pronóstico o profilaxis de una afección, y puede tener un puerto de acceso estéril (por ejemplo, el contenedor puede ser una bolsa o un vial con solución intravenosa que tiene un tapón que se puede perforar con una aguja de inyección hipodérmica). Los agentes activos en la composición pueden ser un anticuerpo capaz de fijarse específicamente a 158P1D7 o un conjugado de anticuerpo y fármaco que se fija específicamente a 158P1D7.
El artículo de fabricación puede comprender además un segundo contenedor que comprende un tampón farmacéuticamente aceptable, tal como solución salina tamponada con fosfato, solución de Ringer y/o solución de dextrosa. Puede además incluir otros materiales deseables desde un punto de vista comercial y del usuario, que incluyen otros tamponantes, diluyentes, filtros, agitadores, agujas, jeringuillas y/o prospectos con indicaciones y/o instrucciones de uso.
Ejemplos
Diferentes aspectos de la invención se describen e ilustran adicionalmente por medio de los diferentes ejemplos que vienen a continuación, ninguno de los cuales pretende limitar el alcance de la invención.
Ejemplo 1: El antígeno contra 158P1D7
La secuencia génica de 158P1D7 se descubrió con el uso de los métodos de hibridación sustractiva de supresión (HSS) conocidos en la técnica. La secuencia de HSS de 158P1D7 de 223 pb se identificó de una sustracción del ADNc de vejiga normal a la combinación de cánceres de vejiga. Se aisló un clon de ADNc de longitud completa para 158P1D7 de una combinación de tejidos de cáncer de vejiga. El ADNc tiene una longitud de 2555 pb y codifica una ORF de 841 aminoácidos (véase la figura 1). El gen de 158P1D7 muestra homología con el gen de SLITRK6. Para más información, véase la patente de los EE. UU. n.° 6863892 (Agensys, Inc., Santa Monica, CA), la patente de los EE. UU. n.° 7358 353 (Agensys, Inc., Santa Monica, CA) y la patente europea EP 1311 675 (Agensys, Inc., Santa Monica, CA). Para las realizaciones de ejemplo del antígeno de 158P1D7, véase la figura 1.
Ejemplo 2: Generación de los anticuerpos monoclonales (Acm) contra 158P1D7
En una realización, los anticuerpos monoclonales (Acm) terapéuticos contra 158P1D7 y las variantes de 158P1D7 comprenden los que reaccionan con epítopos específicos de cada proteína o específicos de las secuencias en común entre las variantes que se fijarían, internarían, destruirían o modularían la función biológica de 158P1D7 o de las variantes de 158P1D7, por ejemplo, las que destruirían la interacción con ligandos, sustratos y compañeros de fijación. Los inmunógenos para la generación de tales Acm incluyen los diseñados para codificar o contener los dominios extracelulares o toda la secuencia de la proteína 158P1D7, regiones que se predice que contienen motivos funcionales y regiones de las variantes de la proteína 158P1D7 que se predicen que son antigénicas a partir del análisis bioinformático de la secuencia de aminoácidos. Los inmunógenos incluyen péptidos y proteínas recombinantes, tales como tag5-158P1D7, una proteína purificada con etiqueta de His procedente de las células de mamífero. Además, para inmunizar los ratones se utilizan las células manipuladas genéticamente que expresan una gran cantidad de 158P1D7, tales como UMUC-158P1D7 o 3T3-158P1D7.
Los Acm contra 158P1D7 se generaron con la tecnología XenoMouse® (Amgem Fremont), en donde los locus de la cadena ligera k y de la cadena pesada murinas se han inactivado y se ha insertado la mayor parte de los locus de inmunoglobulina con las cadenas ligera k y pesada humanas. El Acm denominado Ha15-10ac12 se generó a partir de la inmunización de XenoMice productores de y2 humana con las células 3T3 recombinantes que expresan la 158P1D7.
El Acm contra 158P1D7 Ha15-10ac12 se fija específicamente a las células que expresan la 158P1D7 (recombinante y endógena), así como a la proteína 158P1D7 recombinante mediante ELISA.
Las secuencias codificantes del ADN para el Acm contra 158P1D7 Ha15-10ac12 se determinó después de aislar el ARNm de las correspondientes células de hibridoma con el reactivo Trizol (Life Technologies, Gibco BRL).
Las secuencias de ácido nucleico variables de las cadenas pesada y ligera del Ha15-10ac12 anti-158P1D7 se secuenciaron de las células de hibridoma al hacer uso del protocolo que viene a continuación. Las células de hibridoma que secretan el Ha15-10ac12 se lisaron con el reactivo Trizol (Life Technologies, Gibco BRL). Se purificó el ARN total y se cuantificó. Se generó la primera cadena de los ADNc a partir del ARN total con cebado de oligo(dT)i2-i8 al hacer uso del sistema de preamplificación con Superscript de Gibco-BRL. La primera cadena del ADNc se amplificó con los cebadores de la región variable de la cadena pesada de inmunoglobulina de humano y con los cebadores de la región variable de la cadena ligera de inmunoglobulina de humano. Se secuenciaron los productos de las PCR y se determinaron las regiones variables de las cadenas ligera y pesada.
Las secuencias de ácido nucleico y de aminoácidos de las regiones variables de las cadenas ligera y pesada se recogen en la figura 2 y en la figura 3. El alineamiento del Acm Ha15-10ac12 con la Ig de la línea germinal de humano se presenta en la figura 4A-4B.
Ejemplo 3: Expresión de Ha15-10ac12 al hacer uso de los métodos de ADN recombinante
Para expresar el Acm Ha15-10ac12 de manera recombinante en las células transfectadas, las secuencias variables de las cadenas pesada y ligera del Acm Ha15-10ac12 se clonaron delante de las regiones constantes de la cadena pesada de IgG2 de humano y de la cadena ligera de IgK de humano, respectivamente. Los casetes completos de la cadena pesada y de la cadena ligera de humano del Acm Ha15-10ac12 se clonaron detrás del promotor/potenciador del CMV en un vector de clonación. Se incluyó un sitio de poliadenilación detrás de la secuencia codificante del Acm. Las construcciones que expresan el Acm Ha15-10ac12 recombinante se transfectaron en las células CHO-K1SV. Al Acm relacionado con Ha15-10ac12 secretado desde las células CHO recombinantes se le evaluó la fijación a la 158P1D7 de la superficie celular mediante citometría de flujo. Las células de UMUC de control y UMUC con 158P1D7 se tiñeron con el Acm Ha15-10ac12 de hibridoma o bien de células CHO transfectadas con las construcciones en los vectores con las cadenas pesada y cadena ligera de Ha15-10ac12. La fijación se detectó por citometría de flujo.
Los resultados muestran que el Ha15-10a12 expresado de manera recombinante en las células CHO se fija a la 158P1D7 de un modo parecido al Ha15-10ac12 purificado de hibridoma. Al Acm Ha15-10ac12 secretado desde las células recombinantes también se le evaluó la fijación a la proteína recombinante 158P1D7 mediante ELISA. La fijación de Ha15-10ac12 a la proteína 158P1D7 era idéntica entre el material de Acm procedente de CHO y de las células de hibridoma.
Las células de ovario de hámster chino (CHO) que producen un anticuerpo denominado Ha15-10ac12 se enviaron (vía Federal Express) a la American Type Culture Collection (ATCC), P.O., Box 1549, Manassas, VA 20108 el 25 de julio de 2012 y se le asignó el número de acceso PTA-13102.
Ejemplo 4: Conjugación de anticuerpo y fármaco del Acm Ha15-10ac12
El Acm Ha15-10ac12 (figura 2) se conjugó a un derivado de la auristatina denominado MMAE (fórmula XI) gracias a un conector vc (Val-Cit) descrito en la presente memoria para crear el conjugado de anticuerpo y fármaco (CAF) de la invención denominado Ha15-10ac12vcMMAE al hacer uso de los protocolos que vienen a continuación. La conjugación del conector vc (Val-Cit) a MMAE (Seattle Genetics, Seattle, WA) se completó al hacer uso del método general presentado en la tabla IV para crear el vcMMAE citotóxico (véase la patente de los EE. UU. US 2006/0074008).
Después, el conjugado de anticuerpo y fármaco (CAF) de la invención denominado Ha15-10ac12vcMMAE se fabricó con el uso de los protocolos que vienen a continuación.
Brevemente, el Acm Ha15-10ac12 en el tampón de formulación (acetato a 10 mM, pH 5,0 con sorbitol al 5%) se cambia al tampón de reducción (borato de sodio a 25 mM, cloruro de sodio a 300 mM, pH 9,0 ± 0,1). Luego, el Acm Ha15-10ac12 se reduce parcialmente con la adición de EDTA a 5 mM y 2,65 equivalentes molares de TCEP (con respecto a los moles del Acm Ha15-10ac12). A continuación, esta mezcla se agita a 37 °C durante tres (3) horas. Después de la reducción de los disulfuros, la mezcla se enfría a una temperatura deseada de 15 a 17 °C y se le añaden cinco (5) equivalentes de fármaco de vcMMAE por mol como una solución al 4% (v/v) en DMSO. Al cabo de 60 a 75 minutos, el exceso de vc que no ha reaccionado se desactiva con la adición de N-acetil-L-cisteína en la cantidad de 1 mol por mol de vcMMAE añadido al comienzo de la conjugación. Después de 15 minutos, el Ha15-10ac12vcMMAE se ajusta a un pH deseado de 6,0 a 6,4 con un tampón concentrado de histidina a pH 5,2 y se filtra a través de una membrana de PES de 0,5/0,2 ^m para retirar el conjugado de anticuerpo y fármaco agregado. Inmediatamente después de la filtración, se realiza la filtración de flujo tangencial para retirar el DMSO y se desactiva el conector del fármaco y se cambia el conjugado de anticuerpo y fármaco al tampón de histidina a 20 mM (pH 6,0 ± 0,1) que contiene trehalosa deshidratada al 5,5%, Después de la filtración de flujo tangencial, el Ha15-10ac12vcMMAE se diluye a una concentración final de 6 ± 1 mg/ml y se le añade polisorbato 20 a una concentración final del 0,01%.
El conjugado de anticuerpo y fármaco (CAF) resultante se denomina Ha15-10ac12vcMMAE y tiene la fórmula siguiente:
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en donde mAb es el Ha15-10ac12 (figura 2 y figura 3) y p es de 1 a 12. El valor preferido de p del conjugado de anticuerpo y fármaco presentado en este ejemplo está entre 3,5 y 3,7.
Ejemplo 5: Caracterización del Ha15-10ac12vcMMAE
Los conjugados de anticuerpo y fármaco que se fijan a la 158P1D7 se generaron con el uso de los procedimientos presentados en el ejemplo titulado «Conjugación de anticuerpo y fármaco del Acm Ha15-10ac12» y se escrutaron, identificaron y caracterizaron mediante una combinación de ensayos conocidos en la técnica.
A. Determinación de la afinidad por FACS
Al Ha15-10ac12vcMMAE se le analizó su afinidad de fijación por la 158P1D7 expresada en la superficie de las células SW780. Brevemente, once (11) diluciones del Ha15-Í0ac12vcMMAE se incubaron con las células SW780 (50000 células por pocillo) durante una noche a 4 °C a una concentración final de 6,67 nM a 0,0001 nM. Al final de la incubación, se lavaron las células y se incubaron con el anticuerpo de detección anti-hIgG-PE durante 45 min a 4 °C. Después de lavar los anticuerpos de detección sin fijar, las células se analizaron por FACS. Se obtuvieron los valores de índice medio de fluorescencia (IFM) que se recogen en la tabla VI. Los valores del IMF se introdujeron en el programa informático Graphad Prisim y se analizaron con la ecuación de fijación a un único sitio (hipérbola) de Y = Bmax x X/(Kd X) para generar la curva de saturación del Ha15-10ac12vcMMAE mostrada en la figura 13. Bmax es el valor del IMF en la fijación máxima del Ha15-10ac12vcMMAE a la 158P1D7; Kd es la afinidad de fijación del Ha15-10ac12vcMMAE que es la concentración del Ha15-10ac12vcMMAE que se necesita para alcanzar la mitad de la fijación máxima.
La afinidad calculada (Kd) del Ha15-10ac12vcMMAE por la 158P1D7 expresada en la superficie de la célula SW780 es de 0,005 nM.
B. Fijación por FACS
Al Ha15-10ac12vcMMAE se le analizó por FACS su fijación a la 158P1D7 expresada en la superficie de las células UMUC, SW780 y CHP-212. Brevemente, las células se recogieron y se sembraron en placas a una concentración de 50 000 células por pocillo. El Ha15-10ac12vcMMAE se diluyó a 3 ^g/ml (para las células UMUC y SW780) o bien a 10 ^g/ml (para las células CHP-212) y se incubaron con las células (1 hora a 4 °C). Al terminar la incubación, se lavaron las células y se incubaron con el anticuerpo de detección anti-hIgG-PE durante 1 hora a 4 °C. Después de lavar los anticuerpos de detección sin fijar, las células se analizaron por FACS. Se obtuvieron los valores del índice medio de fluorescencia (IMF) (tabla VII) y se muestran los histogramas (figura 14).
Ejemplo 6: Citotoxicidad celular in vitro mediada por el Ha15-10ac12vcMMAE
La capacidad del Ha15-10ac12vcMMAE para mediar en la citotoxicidad dependiente de SLITRK-6 se evaluó con la línea celular CHP-212 de neuroblastoma humano, que expresa de manera endógena la SLITRK-6, y la línea celular de cáncer de ovario de humano, IGROV-1, que no expresa la SLITRK-6.
Brevemente, las células CHP-212 e IGROV-1 se inocularon en 50 ^l de medio completo, a una densidad de 1000 células/pocillo, en placas de 96 pocillos, y se colocaron en una incubadora de cultivo de tejidos a 37 °C con CO2 al 5%. Al día siguiente, se preparó en medio completo una solución de concentrada a 2x de Ha15-10ac12vcMMAE y el anticuerpo de control de isotipo conjugado a vcMMAE, y a los pocillos adecuados se les añadieron 50 ^l de las diluciones seriadas de los CAF. Las células se trataron con Ha15-10ac12vcMMAE y el anticuerpo de control de isotipo conjugado a vcMMAE durante seis (6) días en una incubadora de cultivo de tejidos a 37 °C con CO2 al 5%. Al terminar el periodo de incubación, a cada pocilio se le añadieron 12 |jl de Alamar Blue o Presto Blue y se incubaron durante cuatro (4) horas. Se leyeron las placas con el lector de placas BioTek Synergy H4 con las longitudes de onda de 540 nm para excitación y de 590 nm para emisión.
Estos datos muestran que el CAF titulado Ha15-10ac12vcMMAE puede inducir selectivamente la citotoxicidad de la línea de células CHP-212 que expresa la SLITRK-6 mientras que es incapaz de inducir la citotoxicidad de la línea celular IGROV-1 que no expresa la SLITRK-6. Así pues, estos resultados indican que el Ha15-10ac12vcMMAE puede llevar selectivamente un fármaco citotóxico a las células que expresan la 158P1D7, lo que conduce a su destrucción (figura 15).
En otro experimento, las células de neuroblastoma humano, CHP-212, que expresan la SLITRK6 (diana para el Acm Ha15-10ac12 y el Acm M15-68(2)18 (también conocido como 68(18)1.1., véase la solicitud de patente internacional WO 2004/072263), se incubaron con los artículos problema, Ha15-10ac12vcMMAE y M15-68(2)18, para demostrar cualquier actividad de muerte celular (citotoxicidad) in vitro que tengan estos artículos. Brevemente, se inocularon placas de ensayo con noventa y seis (96) pocillos con 4000 células CHP-212 por mililitro y los anticuerpos problema se añadieron en una dilución seriada de 10000 ng/ml hasta 0,006 ng/ml al utilizar una dilución de seis (6) veces a lo largo de nueve (9) puntos más un pocillo problema final a 0,0 ng/ml. Los pocillos se prepararon por triplicado. Además, los anticuerpos de control y las células de control (IGROV-1) se prepararon de un modo similar para la comparación con los artículos problema. El ensayo se dejó en marcha durante cuatro (4) días antes de añadir PrestoBlue (pigmento que tiñe las células vivas) a los pocillos para dar una lectura colorimétrica de la viabilidad celular. A continuación, se calculó el porcentaje de la supervivencia celular en cada pocillo y los datos se analizaron con un ajuste no lineal de la respuesta sigmoidea a la dosis. Se calcularon los valores de CI50 con el uso del programa informático de representaciones Prism y se compararon los efectos citotóxicos del Ha15-10ac12vcMMAE con los del M15-68(2)18 y otros controles utilizados en el experimento.
Los resultados demuestran que el Ha15-10ac12vcMMAE posee mayor citotoxicidad in vitro que el anticuerpo M15-68(2)18 y otros controles (figura 11). El CI50 para Ha15-10ac12vcMMAE se muestra que es de 0,9076 y el CI50 para M15-68(2)18 no se pudo calcular.
Ejemplo 7: El Ha15-10ac12vcMMAE inhibe el crecimiento de los tumores in vivo
La expresión significativa de 158P1D7 en la superficie celular de los tejidos tumorales, junto con la restricción de su expresión en los tejidos normales, convierte a la 158P1D7 en una buena diana para el tratamiento con anticuerpos y, de igual modo, para el tratamiento con CAF. Así pues, se evaluó la eficacia terapéutica del Ha15-10ac12vcMMAE en los modelos de ratón con xenotrasplante humano de cáncer de vejiga, de pulmón, de mama y glioblastoma.
La eficacia del conjugado de anticuerpo y fármaco sobre el crecimiento del tumor y la formación de metástasis se estudió en los modelos de ratón con xenotrasplante de cáncer (p. ej., por vía subcutánea y ortotópica).
Se generan tumores subcutáneos (s.c.) con la inyección de 5 * 104 a 106 células cancerosas mezcladas a una dilución de 1:1 con Matrigel (Collaborative Research) en el flanco derecho de ratones macho con IDCG. Para analizar la eficacia del CAF en la formación del tumor, se comienzan las inyecciones del CAF el mismo día que las inyecciones de células tumorales. Como control, a los ratones se les inyectaron IgG de humano purificadas, o bien PBS; o un Acm purificado que reconoce un antígeno irrelevante que no se expresa en las células de humano. En los estudios preliminares, no se encuentra ninguna diferencia entre la IgG de control o el PBS con respecto al crecimiento del tumor. El tamaño de los tumores se determinó mediante la medición del calibre, y el volumen del tumor se calcula como anchura2 * longitud/2, en donde la anchura es la dimensión más pequeña y la longitud es la dimensión más grande. Se sacrifican los ratones con tumores subcutáneos de más de 1,5 cm de diámetro.
Una ventaja de los modelos de cáncer por xenotrasplante es la capacidad para estudiar la neovascularización y la angiogénesis. El crecimiento del tumor es parcialmente dependiente del desarrollo de nuevos vasos sanguíneos. Aunque el sistema capilar y la red sanguínea en desarrollo tiene su origen en el hospedador, el inicio y la arquitectura de la neovasculatura está regulada por el tumor xenotrasplantado (Davidoff et al., Clin Cáncer Res. (2001) 7: 2870; Solesvik et al., Eur J Cáncer Clin Oncol (1984) 20: 1295). El efecto de un anticuerpo y molécula pequeña sobre la neovascularización se estudia de acuerdo con los procedimientos que se conocen en la técnica, tales como mediante análisis de IHQ de los tejidos tumorales y su microentorno circundante.
CAF contra 158P1D7:
Los anticuerpos monoclonales se generaron contra la 158P1D7 tal y como se describe en el ejemplo titulado «Generación de anticuerpos monoclonales (Acm) contra 158P1D7». Además, los Acm se conjugan a una toxina tal y como se describe en el ejemplo titulado «Conjugación de anticuerpo y fármaco del Acm Ha15-10ac12» para formar el Ha15-10ac12vcMMAE. El Ha15-10ac12vcMMAE se caracteriza por FACS y otros métodos conocidos en la técnica para determinar su capacidad para fijarse a la 158P1D7.
Líneas celulares y xenotrasplantes:
Las células se mantuvieron en DMEM, complementadas con L-glutamina y SBF al 10%, tal y como se conoce en la técnica. Los xenotrasplantes de AG-B7, RT-4-XCL y NCI-H322M-XCL se mantienen mediante la propagación en serie en los ratones con IDCG. SW780 y RT-4-XCL son líneas celulares de células de cáncer de vejiga que se obtuvieron de la ATCC (Manassas, VA). AG-B7 y AG-B8 son xenotrasplantes procedentes de pacientes que proceden de especímenes de cáncer de vejiga de humano. Un experto en la técnica apreciará que muchos experimentos se realizan in vivo sobre los CAF de la invención. Esto se debe, en parte, a que cada modelo in vivo, incluso si es en la misma indicación de enfermedad, muestra un nivel de impredictibilidad para los expertos en la técnica. Así pues, el experto en la técnica apreciará que la utilización de diferentes tipos de modelos in vivo permitirá al experto en la técnica valorar mejor los CAF de la invención.
Evaluación del Ha15-10ac12vcMMAE en el modelo de xenotrasplante subcutáneo consolidado del cáncer de vejiga de humano AG-B7 en los ratones con IDCG
En este experimento, las células AG-B7 de cáncer de vejiga de humano (5 * 106 células por ratón) se inyectaron en los flancos de cada ratón con IDCG y se dejaron crecer los tumores sin tratamiento hasta que alcanzaron un volumen aproximado de 250 mm3 En este punto, los animales se distribuyeron en cada grupo basándose en el volumen del tumor en el momento del inicio del tratamiento para asegurar que tamaño tumoral medio y la variación en cada grupo eran similares mediante el uso del programa informático Study Director (v. 1.7; Studylog Systems, Inc., South San Francisco, CA). Todos los grupos tratados con CAF recibieron una dosis única de 10 mg/kg mediante una inyección de infusión intravenosa. El crecimiento del tumor en cada grupo se vigiló dos veces cada semana con el uso de mediciones del calibre hasta la finalización del estudio. El análisis estadístico del volumen de los tumores se realizó en el último punto de tiempo, cuando estuvieron disponibles los datos de todos los grupos, mediante el uso de un análisis no paramétrico de la varianza (ANOVA) sobre los datos ordenados.
Los resultados demuestran que el Ha15-10ac12vcMMAE mostraba un potente efecto inhibidor cuando se comparó con el control sin tratar (p < 0,0001) (figura 5).
Evaluación de Ha15-10ac12vcMMAE en el cáncer de vejiga de humano RT-4-XCL consolidado subcutáneamente implantado en los ratones con IDCG
En otro experimento, la reserva de tumores AG-B7 de cáncer de vejiga de humano para xenotrasplante se recogieron en esterilidad y se trocearon en piezas pequeñas (aproximadamente 1 mm3). Seis trozos se implantaron subcutáneamente en los flancos de cada uno de los ratones con IDCG. Cuando el volumen tumoral medio alcanzó un tamaño predeterminado de 100 mm3 de volumen, los animales se distribuyeron al azar entre los grupos tratados con CAF y un grupo de control sin tratar (véase el gráfico del volumen tumoral) con un tamaño medio de tumor y una variación similares en cada grupo mediante el uso del programa informático Study Director (v. 1.7, Studylog Systems, Inc, South San Francisco, CA). Todos los grupos tratados con el CAF, entre ellos dos CAF de control, recibieron una única dosis de 5 mg/kg por inyección de infusión intravenosa. El crecimiento del tumor en cada grupo se vigiló dos veces cada semana con mediciones del calibre hasta la terminación del estudio. El análisis estadístico del volumen tumoral se realizó en el último punto de tiempo, cuando estuvieron disponibles los datos de todos los grupos, mediante un análisis no paramétrico de la varianza (ANOVA) sobre los datos ordenados.
Los resultados demuestran que el Ha15-10ac12vcMMAE mostraba un potente efecto inhibidor de tumores cuando se comparó con el control sin tratar o con el correspondiente CAF de control H3-1.4.1.2vc.MMAE (ambos p < 0,0001) (figura 6).
Evaluación del Ha15-10ac12vcMMAE en el cáncer de pulmón de humano NCI-H322M-XCL consolidado subcutáneamente implantado en los ratones con IDCG
En otro experimento, las células NCI-H322M-XCL de cáncer de pulmón de humano (2,5 * 106 células por ratón) se inyectaron en los flancos de cada uno de los ratones con IDCG y los tumores se dejaron crecer sin tratamiento hasta que alcanzaron un volumen aproximado de 200 mm3. En ese momento, los animales se distribuyeron en cada grupo basándose en el volumen tumoral en el momento del inicio del tratamiento para asegurar un tamaño medio de tumor y variación similares en cada grupo mediante el uso del programa informático Study Director (v. 1.7, Studylog Systems, Inc, South San Francisco, CA). Todos los grupos de CAF, que incluyen los dos CAF de control, se dosificaron a 3 mg/kg dos veces a la semana durante un total de cinco dosis por inyección de infusión intravenosa. El crecimiento tumoral en cada grupo se vigiló dos veces cada semana con mediciones del calibre hasta la terminación del estudio. El análisis estadístico del volumen de los tumores se realizó en el último momento, cuando estuvieron disponibles los datos de todos los grupos, mediante un análisis no paramétrico de la varianza (ANOVA) sobre los datos ordenados.
Los resultados demuestran que el Ha15-10ac12vcMMAE mostraba un potente efecto inhibidor cuando se comparaba con el vehículo de control (p < 0,0001) o el correspondiente Ha3-12bc1.1vcMMAE de control de CAF (p = 0,0041) (figura 7).
Eficacia de Ha15-10ac12vcMMAE en el modelo de xenotrasplante subcutáneo consolidado del cáncer de vejiga de humano AG-B7 en los ratones con IDCG
En otro experimento, la reserva de tumores para xenotrasplante del cáncer de vejiga de humano AG-B7 se recogió en esterilidad y se troceó en piezas pequeñas (de aproximadamente 1 mm3). Se implantaron subcutáneamente cinco piezas en los flancos de cada uno de los ratones con IDCG. Los tumores se dejaron crecer sin tratamiento hasta que alcanzaron un volumen aproximado de 200 mm3. En ese momento, los animales se distribuyeron en cada grupo basándose en el volumen tumoral en el momento del inicio del tratamiento para asegurar un tamaño medio y variación del tumor similares en cada grupo mediante el programa informático Study Director (v. 1.7; Studylog Systems, Inc, South San Francisco, CA). Todos los grupos de CAF, que incluyen los dos CAF de control, se dosificaron a 0,5 mg/kg dos veces a la semana durante un total de siete dosis por inyección de infusión intravenosa. El crecimiento tumoral en cada grupo se vigiló dos veces cada semana con mediciones del calibre hasta la terminación del estudio. El análisis estadístico del volumen de los tumores se realizó en el último momento, cuando estuvieron disponibles los datos de todos los grupos, mediante un análisis no paramétrico de la varianza (ANOVA) sobre los datos ordenados.
Los resultados demuestran que el Ha15-10ac12vcMMAE producido a partir de hibridoma (Ha15-10ac12.1vcMMAE) y en las células CHO (Ha15-10ac12vcMMAE) mostraban ambos un potente efecto inhibidor tumoral cuando se comparaban con el vehículo de control (p < 0,0001) o bien el correspondiente Ha3-12abc1vcMMAE de control de CAF (p < 0,0001) (figura 8).
Eficacia del Ha15-10ac12vcMMAE en el modelo de xenotrasplante subcutáneo consolidado del cáncer de vejiga de humano SW780 en los ratones con IDCG
En otro experimento, las células SW780 de xenotrasplante de cáncer de vejiga de humano se implantaron en los flancos de los ratones con IDCG y los tumores se dejaron crecer hasta que alcanzaron un volumen aproximado de 200 mm3. En ese momento, los animales se distribuyeron en los grupos de tratamiento según el volumen tumoral en el momento del inicio del tratamiento para asegurar un tamaño medio y variación del tumor similares en cada grupo. La distribución de los ratones en los grupos de tratamiento estuvo asistida por el programa informático Study Director (v. 1.7, Studylog Systems, Inc., South San Francisco, CA) para ayudar a emparejar los ratones por tamaño. Todos los grupos de CAF, que incluyen los dos CAF de control, se dosificaron por inyección de infusión intravenosa a 1 mg/kg al comienzo del estudio. El crecimiento tumoral en cada grupo se vigiló dos veces a la semana con mediciones del calibre hasta la terminación del estudio. El análisis estadístico del volumen de los tumores se realizó en el último momento, cuando estuvieron disponibles los datos de todos los grupos, mediante un análisis no paramétrico de la varianza (ANOVA) sobre los datos ordenados.
Los resultados demuestran que el Ha15-10ac12vcMMAE tiene mayor actividad inhibidora tumoral que el Acm Ha15-10ac12. Además, se puede concluir que el Acm Ha15-10ac12 no tiene ningún efecto inhibidor sobre el tumor, ya que la dinámica de crecimiento del tumor en este grupo de tratamiento sigue la de los anticuerpos de control de isotipo. Además, después de una dosis única de 1 mg/kg, el Ha15-10ac12vcMMAE demostró una inhibición del crecimiento estadísticamente significativa en comparación con el CAF de control de isotipo (p < 0,001) (figura 10).
Eficacia del Ha15-10ac12vcMMAE en el modelo de xenotrasplante subcutáneo consolidado del cáncer de vejiga de humano AG-B8 derivado de paciente en los ratones con IDCG
En otro experimento, los trozos de tumor AG-B8 de cáncer de vejiga de humano derivado de paciente se implantaron en los flancos de ratones con IDCG y los tumores se dejaron crecer hasta que alcanzaron un volumen aproximado de 200 mm3. En ese momento, los animales se distribuyeron en los grupos de tratamiento según el volumen tumoral en el momento del inicio del tratamiento para asegurar un tamaño medio y variación del tumor similares en cada grupo. La distribución de los ratones en los grupos de tratamiento estuvo asistida por el programa informático Study Director (v. 1.7, Studylog Systems, Inc., South San Francisco, CA) para ayudar a emparejar los ratones por tamaño. Todos los grupos de CAF, que incluyen los dos CAF de control, se dosificaron por inyección de infusión intravenosa de 5 mg/kg al comienzo del estudio (día cero (0)). El crecimiento del tumor en cada grupo se vigiló dos veces a la semana con mediciones del calibre hasta la terminación del estudio. El análisis estadístico del volumen de los tumores se realizó en el último momento, cuando estuvieron disponibles los datos de todos los grupos, mediante un análisis no paramétrico de la varianza (ANOVA) sobre los datos ordenados.
Los resultados demuestran que el Ha15-10ac12vcMMAE tiene mayor actividad inhibidora del tumor que los controles sin tratar (p < 0,0001) o bien que los otros CAF de control y2 correspondientes (p < 0,0001). Además, el Ha15ac12vcMMAE también mostró un efecto estadísticamente significativo superior cuando se comparó con el Ha15-10ac12mcMMAF (p < 0,0458) (figura 12).
Conclusión
En resumen, las figuras 5 a 8, 10 y 12 muestran que el CAF contra 158P1D7 denominado Ha15-10ac12vcMMAE inhibía significativamente el crecimiento de las células tumorales que expresan la 158P1D7 cuando se comparó con los CAF de control. Así pues, el Ha15-10ac12vcMMAE se puede utilizar para los propósitos terapéuticos de tratar y controlar los cánceres presentados en la tabla I. Específicamente, estos resultados indican que el Ha15-10ac12vcMMAE tenía un efecto inhibidor sobre diferentes tipos de modelos de cáncer de vejiga, lo que demuestra que puede ser particularmente útil desde el punto de vista terapéutico para el tratamiento del cáncer de vejiga.
Ejemplo 8
Ensayos clínicos con humanos para el tratamiento y el diagnóstico de los carcinomas humanos con el uso de los CAF contra 158P1D7
Los CAF contra la 158P1D7 se utilizan según la presente invención, que se fijan específicamente a la 158P1D7, y se utilizan en el tratamiento de determinados tumores, preferiblemente los recogidos en la tabla I. En relación con cada una de estas indicaciones, se prosiguieron con éxito dos estrategias clínicas.
I. ) Tratamiento complementario: En el tratamiento complementario, los pacientes se tratan con los CAF contra 158P1D7 en combinación con un quimioterápico o un antineoplásico y/o radioterapia, o una combinación de los mismos. Las dianas del cáncer primario, tales como los recogidos en la tabla I, se tratan con protocolos estándares mediante la adición de los CAF contra 158P1D7 para las primera y segunda líneas de tratamiento estándares. Los protocolos se diseñan para abordar la eficacia tal y como se valoró mediante los ejemplos que siguen, que incluyen, pero sin limitarse a ellos, la reducción en la masa tumoral de las lesiones primarias o metastásicas, incremento de la supervivencia libre de progresión, supervivencia global, mejora de la salud de los pacientes, estabilización de la enfermedad, así como la capacidad para reducir las dosis usuales de quimioterapia estándar y de otros agentes biológicos. Estas reducciones de la dosis permiten un tratamiento adicional y/o prolongado al reducir la toxicidad relacionada con la dosis del quimioterápico o del agente biológico. Los CAF contra 158P1D7 se utilizan en varios ensayos clínicos complementarios en combinación con los quimioterápicos o antineoplásicos.
II. ) Monoterapia: en relación con el uso de los CAF contra 158P1D7 en la monoterapia de los tumores, los CAF contra 158P1D7 se administran a los pacientes sin ningún quimioterápico ni antineoplásico. En una realización, la monoterapia se realiza desde el punto de vista clínico en los pacientes con cáncer de estadio terminal con una enfermedad metastásica extensa. Los protocolos se diseñan para abordar la eficacia tal y como se valora en los ejemplos que siguen, que incluyen, pero sin limitarse a ellos, la reducción en la masa tumoral de las lesiones primarias o metastásicas, incremento de la supervivencia libre de progresión, supervivencia global, mejora de la salud de los pacientes, estabilización de la enfermedad, así como la capacidad para reducir las dosis habituales de la quimioterapia estándar y de otros agentes biológicos.
Dosificación
Las pautas de la dosificación se pueden ajustar para dar la respuesta deseada óptima. Por ejemplo, se puede administrar una sola infusión, varias dosis divididas en el tiempo, o la dosis se puede reducir o incrementar proporcionadamente según indiquen las exigencias de la situación terapéutica. Es especialmente ventajoso formular composiciones parenterales en la presentación farmacéutica de dosis unitaria para facilitar la administración y la uniformidad de dosificación. La presentación farmacéutica de dosis unitaria tal y como se utiliza en la presente memoria se refiere a unidades físicamente independientes adaptadas como dosis unitarias para los sujetos mamíferos a tratar; cada unidad contiene una cantidad predeterminada del compuesto activo que se calcula que produce el efecto terapéutico deseado en asociación con el vehículo farmacéutico necesario. La especificación para la presentación farmacéutica de dosis unitaria de la invención está dictada y depende directamente de (a) las características únicas del anticuerpo y/o CAF y el efecto terapéutico o profiláctico concreto a conseguir, y (b) las limitaciones inherentes en la técnica de formulación, tal como un compuesto activo para el tratamiento de la sensibilidad en los individuos.
Un margen no limitante de ejemplo para una cantidad terapéuticamente eficaz de un CAF contra 158P1D7 administrado en politerapia según la invención es de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 10 mg/kg, de aproximadamente 1 a aproximadamente 5 mg/kg, al menos 1 mg/kg, al menos 2 mg/kg, al menos 3 mg/kg, o al menos 4 mg/kg. Otros márgenes no limitantes de ejemplo son, por ejemplo, de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 5 mg/kg, o, por ejemplo, de aproximadamente 0,8 a aproximadamente 5 mg/kg, o, por ejemplo, de aproximadamente 1 a aproximadamente 7,5 mg/kg. La realización de dosis elevada de la invención se refiere a una dosis de más de 10 mg/kg. Se ha de señalar que los valores de las dosis pueden variar con el tipo y la gravedad de la afección a aliviar, y puede incluir dosis únicas o múltiples. Se ha de saber además que, para cualquier sujeto en concreto, las pautas de dosis específicas se deben ajustar con el tiempo de acuerdo con la necesidad de cada individuo y el juicio profesional de la persona que administra o supervisa la administración de las composiciones, y que los márgenes de dosis presentados en la presente memoria son solo de ejemplo y no pretenden limitar el alcance ni la práctica de la composición reivindicada.
Plan del desarrollo clínico (PDC)
El PDC sigue y desarrolla tratamientos de los CAF contra 158P1D7 en relación con el tratamiento complementario o la monoterapia. Los ensayos muestran inicialmente seguridad y después confirman la eficacia en dosis repetidas. Los ensayos son de abiertos y comparan la quimioterapia estándar con el tratamiento estándar más los CAF contra 158P1D7. Como se apreciará, unos criterios no limitantes que se pueden utilizar en conexión con la participación de los pacientes son los niveles de expresión de la 158P1D7 en sus tumores, tal y como se determina mediante la biopsia.
Al igual que con cualquier proteína o tratamiento basado en la infusión de anticuerpos, las preocupaciones sobre la seguridad están relacionadas principalmente con (i) síndrome de liberación de citocinas, a saber, hipotensión, fiebre, agitación, escalofríos; (ii) el desarrollo de una respuesta inmunógena contra el material (a saber, desarrollo de anticuerpos humanos de el paciente contra el anticuerpo del tratamiento o respuesta de AHAM); y (iii) toxicidad en las células normales que expresan la 158P1D7. Las pruebas estándares y el seguimiento se utilizan para vigilar cada una de estas preocupaciones de seguridad. Los CAF contra 158P1D7 se encuentra que son seguros tras la administración a los humanos.
Ejemplo 9: Detección de la proteína 158P1D7 en los especímenes de pacientes con cáncer mediante IHQ
La expresión de la proteína 158P1D7 mediante inmunohistoquímica se analizó en los especímenes de tumor de pacientes con cáncer de (i) vejiga, (ii) mama, (iii) pulmón y (iv) glioblastoma. Brevemente, tejidos fijados con formol e incluidos en cera parafinada se cortaron en trozos de cuatro (4) pm y se montaron en portaobjetos de cristal. Los cortes se desparafinaron, se rehidrataron y se trataron con la solución citra de recuperación del antígeno (Biogenex, San Ramon, CA) en el microondas EZ-Retriever (Biogenex, San Ramon, CA) durante 15 minutos a 95 °C. A continuación, los cortes se trataron con la solución de peróxido de hidrógeno al 3% para inactivar la actividad peroxidasa endógena. El bloque proteico libre de suero (Dako, Carpenteria, CA) se utilizó para inhibir la fijación inespecífica antes de la incubación con el anticuerpo monoclonal de ratón anti-158P1D7 o un control de isotipo. Posteriormente, los cortes se trataron con el sistema de detección Super Sensitive™ Polymer conjugado a peroxidasa de rábano picante (HRP) que consiste en una incubación en el reactivo Super Enhancer™ seguido de una incubación con el polímero conjugado al anticuerpo secundario-HRP (BioGenex, San Ramón, CA). Los cortes se revelaron luego al hacer uso del kit de DAB (BioGenex, San Ramon, CA). Los núcleos se tiñeron con hematoxilina y se analizaron con microscopia de campo brillante. La tinción específica se detectó en los especímenes de pacientes con el anticuerpo inmunorreactivo contra 158P1D7, tal y como se indica mediante la tinción marrón (véanse las figuras 9(A), 9(C), 9(E) y 9(G)). En cambio, el anticuerpo de control no tiñó ningún espécimen de pacientes (véanse las figuras 9(B), 9(D), 9(F) y 9(H).
Los resultados muestran la expresión de 158P1D7 en las células tumorales de tejidos de cáncer de vejiga, mama, pulmón y glioblastoma de pacientes. Estos resultados indican que la 158P1D7 se expresa en los cánceres de humano y que los anticuerpos dirigidos contra este antígeno y el conjugado de anticuerpo y fármaco denominado Ha15-10ac12vcMMAE son útiles para propósitos diagnósticos y terapéuticos (figura 9).
A lo largo de esta solicitud, se hace referencia a diferentes contenidos de datos de páginas de internet, publicaciones, solicitudes de patente y patentes (las páginas web están referenciadas por su localizador de recursos uniforme, o URL, localizables en Internet).
Tablas
Tabla I: Tejidos que expresan la 158P1D7 cuando son malignos.
Glioblastoma
Pulmón
Vejiga
Mama
Tabla II: abreviatura de los aminoácidos
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Tabla III: Matriz de sustitución de aminoácidos
Adaptado de la tabla de sustitución de aminoácidos (matriz de sustitución de bloques) BLOSUM62 de la suite de programas del GCG v 9.0. Cuanto mayores el valor, más probable es que se halle la sustitución en las proteínas naturales relacionadas.
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Tabla IV: Método general para la síntesis de vcMMAE
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Tabla V: Posiciones de CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3 y CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3 según se identifican por los esquemas de Kabat, Chothia y Contact, respectivamente. Para CDR-H1, la numeración de los restos se da como una lista al hacer uso los esquemas de numeración de Kabat y Chothia.
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Tabla VI: Valores del índice medio de fluorescencia (IMF) en el ensayo por FACS.
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Claims (35)

REIVINDICACIONES
1. Un anticuerpo anti-158P1D7 o fragmento de fijación al antígeno del mismo, en donde el anticuerpo o fragmento del mismo comprende una región variable de la cadena pesada que comprende CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3 de la secuencia de aminoácidos presentada en la SEQ ID n.° 7 y una región variable de la cadena ligera que comprende CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 de la secuencia de aminoácidos presentada en la SEQ ID n.° 8, en donde las CDR están determinadas por el esquema de numeración de Kabat, Chothia o Contact.
2. El anticuerpo anti-158P1D7 o fragmento del mismo de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el anticuerpo o fragmento del mismo comprende una región variable de la cadena pesada que comprende la CDR-H1 que consiste en la secuencia de aminoácidos que va de la posición 31 a la 35 de la SEQ ID n.° 7, la CDR-H2 que consiste en la secuencia de aminoácidos que va de la posición 50 a la 66 de la SEQ ID n.° 7, y la CDR-H3 que consiste en la secuencia de aminoácidos que va de la posición 99 a la 109 de la SEQ ID n.° 7, y una región variable de la cadena ligera que comprende la CDR-L1 que consiste en la secuencia de aminoácidos que va de la posición 24 a la 39 de la SEQ ID n.° 8, la CDR-L2 que consiste en la secuencia de aminoácidos que va de la posición 55 a la 61 de la SEQ ID n.° 8, y la CDR-L3 que consiste en la secuencia de aminoácidos que va de la posición 94 a la 102 de la SEQ ID n.° 8.
3. El anticuerpo anti-158P1D7 o fragmento del mismo de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en donde el anticuerpo o fragmento del mismo comprende una región variable de la cadena pesada que consiste en la secuencia de aminoácidos que va de la posición 1 a la posición 120 de la SEQ ID n.° 7 y una región variable de la cadena ligera que consiste en la secuencia de aminoácidos que va de la posición 1 a la posición 113 de la SEQ ID n.° 8.
4. El anticuerpo anti-158P1D7 o fragmento del mismo de acuerdo con la reivindicación 3, en donde el anticuerpo comprende una cadena pesada que consiste en la secuencia de aminoácidos que va de la posición 1 a la posición 446 de la SEQ ID n.° 7 y una cadena ligera que consiste en la secuencia de aminoácidos que va de la posición 1 a la posición 219 de la SEQ ID n.° 8.
5. El anticuerpo anti-158P1D7 o fragmento del mismo de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en donde el anticuerpo o fragmento del mismo comprende una región variable de la cadena pesada que consiste en la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada de un anticuerpo producido por una célula de ovario de hámster chino (CHO) depositada en la American Type Culture Collection (ATCC) con el n.° de acceso PTA-13102, y una región variable de la cadena ligera que consiste en la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera de un anticuerpo producido por una célula de ovario de hámster chino (CHO) depositada en la ATCC con el n.° de acceso PTA-13102.
6. El anticuerpo anti-158P1D7 o fragmento del mismo de acuerdo con la reivindicación 5, en donde el anticuerpo comprende una cadena pesada que consiste en la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada de un anticuerpo producido por una célula de ovario de hámster chino (CHO) depositada en la American Type Culture Collection (ATCC) con el n.° de acceso PTA-13102, y una cadena ligera que consiste en la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de un anticuerpo producido por una célula de ovario de hámster chino (CHO) depositada en la ATCC con el n.° de acceso PTA-13102.
7. El anticuerpo anti-158P1D7 o fragmento del mismo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 y 5, en donde el anticuerpo comprende además una región constante de IgG de humano y una región constante de la cadena ligera de humano.
8. El anticuerpo anti-158P1D7 o fragmento del mismo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde el anticuerpo es un anticuerpo totalmente humano.
9. El anticuerpo anti-158P1D7 o fragmento del mismo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde el anticuerpo se produce de manera recombinante.
10. El anticuerpo anti-158P1D7 o fragmento del mismo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde el fragmento es un fragmento Fab, F(ab')2, Fv o scFv.
11. Un conjugado de anticuerpo y fármaco que comprende el anticuerpo anti-158P1D7 o fragmento del mismo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 conjugado a monometilauristatina E (MMAE).
12. El conjugado de anticuerpo y fármaco de acuerdo con la reivindicación 11, en donde el anticuerpo o fragmento del mismo está conjugado a MMAE mediante una unidad conectora.
13. El conjugado de anticuerpo y fármaco de acuerdo con la reivindicación 12, en donde la unidad conectora es un conector peptidílico que se puede escindir con una enzima.
14. El conjugado de anticuerpo y fármaco de acuerdo con la reivindicación 12 o 13, en donde la unidad conectora forma un enlace con un átomo de azufre del anticuerpo o fragmento del mismo.
15. El conjugado de anticuerpo y fármaco de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 11 a 14, en donde el conjugado de anticuerpo y fármaco tiene la siguiente fórmula:
L - (LU - D)p
en donde:
L es el anticuerpo anti-158P1D7 o fragmento del mismo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10,
(LU-D) es un resto de unidad conectora-unidad de fármaco, en donde:
LU es una unidad conectora, y
D es MMAE; y
p es un entero de 1 a 20.
16. El conjugado de anticuerpo y fármaco de acuerdo con la reivindicación 15, en donde p va de 1 a 10, o en donde p va de 2 a 5.
17. El conjugado de anticuerpo y fármaco de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 12 a 16, en donde la unidad conectora tiene la fórmula:
-Aa-Ww-Yy-,
en donde:
-A- es una unidad de elongación,
a es 0 o 1;
-W- es una unidad de aminoácido,
w es un entero que va de 0 a 12;
-Y- es una unidad espaciadora autoinmolativa, e
y es 0, 1 o 2.
18. El conjugado de anticuerpo y fármaco de acuerdo con la reivindicación 17, en donde la unidad de aminoácido comprende valina-citrulina (Val-Cit).
19. El conjugado de anticuerpo y fármaco de acuerdo con la reivindicación 17 o 18, en donde:
la unidad de elongación tiene la estructura de la fórmula Illa:
Figure imgf000079_0001
la unidad de aminoácido es valina-citrulina (Val-Cit); y
la unidad espaciadora tiene la estructura de la fórmula Xa:
Figure imgf000080_0001
20. El conjugado de anticuerpo y fármaco de acuerdo con la reivindicación 19, en donde la unidad de elongación forma un enlace con un átomo de azufre del anticuerpo o fragmento del mismo; en donde la unidad espaciadora es una unidad de alcohol p-aminobencílico (PAB), y en donde la unidad espaciadora está unida a MMAE a través de un grupo carbamato.
21. El conjugado de anticuerpo y fármaco de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 11 a 20, en donde el conjugado de anticuerpo y fármaco tiene la siguiente estructura:
Figure imgf000080_0002
en donde p va de 1 a 10.
22. El conjugado de anticuerpo y fármaco de acuerdo con la reivindicación 21, en donde p va de 2 a 5.
23. Una composición farmacéutica que comprende el conjugado de anticuerpo y fármaco de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 11 a 22 en una presentación farmacéutica de dosis unitaria para humanos.
24. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 23, en donde la composición farmacéutica comprende además un quimioterápico en una presentación farmacéutica de dosis unitaria para humanos.
25. Un conjugado de anticuerpo y fármaco tal y como está definido en cualquiera de las reivindicaciones 11 a 22 para ser usado en un método para tratar el cáncer en un sujeto, en donde el cáncer es glioblastoma, cáncer de pulmón, cáncer de vejiga o cáncer de mama.
26. El conjugado de anticuerpo y fármaco para ser usado de acuerdo con la reivindicación 25, en donde el cáncer es cáncer de vejiga.
27. El conjugado de anticuerpo y fármaco para ser usado de acuerdo con la reivindicación 25 o 26, en donde el método comprende además administrar al sujeto radioterapia o un quimioterápico.
28. El conjugado de anticuerpo y fármaco para ser usado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 25 a 27, en donde el sujeto es un sujeto humano.
29. El conjugado de anticuerpo y fármaco para ser usado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 25 a 28, en donde el método comprende administrar al sujeto el conjugado de anticuerpo y fármaco en una cantidad de 1, 2, 3, 4, 5 o 6 mg/kg de masa corporal.
30. Un vector que comprende un polinucleótido que comprende una secuencia que codifica la región variable de la cadena pesada del anticuerpo anti-158P1D7 o fragmento del mismo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 y un polinucleótido que comprende una secuencia que codifica la región variable de la cadena ligera del anticuerpo anti-158P1D7 o fragmento del mismo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10.
31. Una célula hospedadora transformada con el vector de acuerdo con la reivindicación 24.
32. Una célula hospedadora transformada con (i) un vector que comprende un polinucleótido que comprende una secuencia que codifica la región variable de la cadena pesada del anticuerpo anti-158P1D7 o fragmento del mismo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, y (ii) un vector que comprende un polinucleótido que comprende una secuencia que codifica la región variable de la cadena ligera del anticuerpo anti-158P1D7 o fragmento del mismo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10.
33. Un método para producir un anticuerpo anti-158P1D7 o fragmento de fijación al antígeno del mismo, que comprende transfectar una célula hospedadora con el vector de la reivindicación 30.
34. Un método para producir un anticuerpo anti-158P1D7 o fragmento de fijación al antígeno del mismo, que comprende transfectar una célula hospedadora con (i) un vector que comprende un polinucleótido que comprende una secuencia que codifica la región variable de la cadena pesada del anticuerpo anti-158P1D7 o fragmento del mismo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, y (ii) un vector que comprende un polinucleótido que comprende una secuencia que codifica la región variable de la cadena ligera del anticuerpo anti-158P1D7 o fragmento del mismo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10.
35. Un anticuerpo anti-158P1D7 o fragmento de fijación al antígeno del mismo producido por el método de acuerdo con la reivindicación 33 o 34.
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