BR112015003751B1 - Conjugados anticorpo-fármaco, uso dos mesmos, composição farmacêutica, vetor, anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno, método para produzir os mesmos e anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno que se liga a 158p1d7 - Google Patents

Conjugados anticorpo-fármaco, uso dos mesmos, composição farmacêutica, vetor, anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno, método para produzir os mesmos e anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno que se liga a 158p1d7 Download PDF

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Zili An
Karen Jane Meyrick Morrison
Josh SNYDER
Xiao-Chi Jia
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Abstract

conjugados anticorpo-fármaco, seus uso e composição o compreendendo, anticorpo anti-158p1d7 ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo, bem como polinucleotídeo isolado, vetor isolado, célula hospedeira isolada e métodos de fabricação de um conjugado anticorpo-fármaco anti- 158p1d7 e de um anticorpo anti-158p1d7 ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo são aqui descritos conjugados anticorpo-fármaco (adc) que se ligam à proteína 158p1d7 e variantes desta. 158p1d7 exibe expressão tecido-específica em tecido adulto normal, e é expressa aberrantemente nos cânceres listados n a tabela i. conseqüentemente, os adcs da invenção fornecem uma composição terapêutica para o tratamento de câncer.

Description

REFERÊNCIA CRUZADA COM PEDIDOS RELACIONADOS
[001] Esse pedido reivindica prioridade para o Pedido de Patente U.S. Provisório número 61/692.448, depositado em 23 de agosto de 2012, cujos conteúdos são totalmente incorporados por referência.
DECLARAÇÃO DE DIREITOS PARA INVENÇÕES FEITAS SOB PESQUISA COM FINANCIAMENTO FEDERAL
[002] Não aplicável.
SUBMISSÃO DE LISTAGEM DE SEQÜÊNCIAS EM ARQUIVO DE TEXTO ASCII
[003] O conteúdo da submissão seguinte em arquivo de texto ASCII é aqui incorporado por referência em sua totalidade: uma forma legível por computador (CRF) da Listagem de Seqüências (nome do arquivo: 511582005088SeqList.txt, data da gravação: 21 de agosto de 2013, tamanho: 40.154 bytes.
CAMPO DA INVENÇÃO
[004] A invenção aqui descrita está relacionada a anticorpos, fragmentos de ligação e conjugados anticorpo- fármaco (ADCs) destes, que se ligam à proteína denominada 158P1D7. A invenção ainda está relacionada a métodos e composições prognósticas, profiláticas e terapêuticas úteis no tratamento de cânceres que expressam 158P1D7.
FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO
[005] O câncer é a segunda causa principal de morte humana, logo após morte por doença coronariana. Em todo o mundo, milhões de pessoas morrem de câncer a cada ano. Somente nos Estados Unidos, como relatado pela “American Cancer Society”, o câncer causa a morte de mais de meio milhão de pessoas anualmente, com mais de 1,2 milhão de novos casos diagnosticados por ano. Enquanto as mortes decorrentes de doença cardíaca venham declinando significantemente, as que resultam de câncer geralmente estão em elevação. Prevê-se que na parte inicial do próximo século, o câncer se torne a principal causa de morte.
[006] Em todo o mundo, vários cânceres se sobressaem como os principais assassinos. Em particular, carcinomas do pulmão, próstata, mama, cólon, pâncreas, ovário e bexiga representam as causas primárias de morte por câncer. Esses e praticamente todos os outros carcinomas compartilham uma característica letal comum. Com muito poucas exceções, a doença metastática de um carcinoma é fatal. Além disso, até mesmo para aqueles pacientes com câncer que inicialmente sobrevivem aos seus cânceres primários, a experiência comum demonstrou que suas vidas são dramaticamente alteradas. Muitos pacientes com câncer apresentam fortes ansiedades conduzidas pela consciência do potencial para recorrência ou fracasso do tratamento. Muitos pacientes com câncer apresentam debilitações físicas após tratamento. Além disso, muitos pacientes com câncer apresentam uma recorrência.
[007] Em todo o mundo, o câncer de próstata é o quarto câncer mais prevalente em homens. Na América do Norte e no Norte da Europa, é de longe o câncer mais comum em homens e é a segunda causa principal de morte por câncer em homens.Somente nos Estados Unidos, bem mais de 30.000 de homens morrem anualmente dessa doença - após apenas do câncer de pulmão. Apesar da magnitude desses números, ainda não há tratamento eficaz para o câncer de próstata metastático. A prostatectomia cirúrgica, a radioterapia, a terapia de ablação hormonal, a castração cirúrgica e a quimioterapia continuam a ser as modalidades de tratamento principais. Infelizmente, esses tratamentos são ineficazes para muitos e estão freqüentemente associados a conseqüências indesejáveis.
[008] Na frente diagnóstica, a ausência de um marcador de tumor de próstata que possa detectar com precisão tumores localizados em estágio inicial permanece uma limitação significante no diagnóstico e gerenciamento dessa doença. Embora o ensaio do antígeno sérico específico da próstata (PSA) tenha sido uma ferramenta muito útil, sua especificidade e utilidade geral são amplamente consideradas como ausentes em muitos aspectos importantes.
[009] O progresso na identificação de marcadores específicos adicionais para o câncer de próstata foi aprimorado pela geração de xenoenxertos de câncer de próstata que podem recapitular estágios diferentes da doença em camundongos. Os xenoenxertos do LAPC (“Los Angeles Prostate Cancer”) são xenoenxertos de câncer de próstata que sobreviveram à passagem em camundongos severamente imunodeficientes combinados (SCID) e exibiram a capacidade de mimetizar a transição da dependência ao androgênio à independência ao androgênio (Klein e cols., 1997, Nat. Med. 3: 402). Marcadores de câncer de próstata mais recentemente identificados incluem PCTA-1 (Su e cols., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93: 7.252), antígeno da membrana específico da próstata (PSMA) (Pinto e cols., Clin. Cancer Res. 2 de setembro de 1996 (9): 1445-51), STEAP (Hubert, e cols., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 7 de dezembro de 1999; 96(25): 14.523-8) e antígeno de célula- tronco da próstata (PSCA) (Reiter e cols., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95: 1.735).
[010] Embora marcadores previamente identificados como, por exemplo, PSA, tenham facilitado os esforços para o diagnóstico e tratamento do câncer de próstata, há a necessidade da identificação de marcadores e alvos terapêuticos adicionais para cânceres de próstata e cânceres relacionados a fim de aprimorar ainda mais o diagnóstico e a terapia. Estima-se que 130.200 casos de câncer cólon-retal ocorreram em 2000 nos Estados Unidos, incluindo 93.800 casos de câncer de cólon e 36.400 de câncer retal.
[011] Os cânceres cólon-retais são os terceiros cânceres mais comuns em homens e mulheres. As taxas de incidência declinaram significantemente durante 1992-1996 (-2,1% por ano). Pesquisas sugerem que esses declínios foram causados por aumento das triagens e da remoção de pólipos, evitando a progressão de pólipos para cânceres invasivos. Estima-se que tenha havido 56.300 mortes (47.700 de câncer de cólon, 8.600 de câncer retal) em 2000, responsáveis por cerca de 11% de todas as mortes por câncer nos Estados Unidos.
[012] Atualmente, a cirurgia é a forma mais comum de terapia para o câncer cólon-retal e, para cânceres que não se disseminaram, é freqüentemente curativa. A quimioterapia, ou quimioterapia mais radiação, é dada antes ou após a cirurgia à maioria dos pacientes cujo câncer perfurou profundamente a parede intestinal ou se disseminou para os linfonodos. Uma colostomia permanente (criação de uma abertura abdominal para eliminação de dejetos do corpo) é ocasionalmente necessária para o câncer de cólon e é raramente necessária para o câncer retal. Continua a existir uma necessidade por modalidades diagnósticas e de tratamento eficazes para o câncer cólon-retal.
[013] De todos os novos casos de câncer nos Estados Unidos, o câncer da bexiga representa aproximadamente 5 por cento em homens (quinta neoplasia mais comum) e 3 por cento em mulheres (oitava neoplasia mais comum). A incidência está crescendo lentamente, concomitante com uma população cada vez mais velha. Em 1998, estima-se que houve 54.500 casos, incluindo 39.500 em homens e 15.000 em mulheres. A incidência ajustada à idade nos Estados Unidos é de 32 por 100.000 para homens e oito por 100.000 em mulheres. A proporção histórica homens/mulheres de 3:1 pode estar diminuindo relacionada aos padrões de tabagismo em mulheres. Estima-se que tenha havido 11.000 mortes por câncer da bexiga em 1998 (7.800 em homens e 3.900 em mulheres). A incidência e mortalidade do câncer da bexiga aumentam fortemente com a idade e serão um problema crescente à medida em que a população se torna mais idosa.
[014] A maioria dos cânceres de bexiga recorre na bexiga. O câncer da bexiga é tratado com uma combinação de ressecção transuretral da bexiga (TUR) e quimioterapia ou imunoterapia intravesical. A natureza multifocal e recorrente do câncer da bexiga ressalta as limitações da TUR. Os cânceres invasivos para os músculos não são curados por TUR isoladamente. A cistectomia radical e o desvio urinário é o meio mais eficaz para eliminar o câncer, mas traz um impacto inegável sobre as funções urinária e sexual. Continua a existir uma necessidade significante por modalidades de tratamento que sejam benéficas para pacientes com câncer da bexiga.
[015] Estima-se que tenha havido 164.100 novos casos de câncer de pulmão e brônquico em 2000, sendo responsável por 14% de todos os diagnósticos de câncer nos Estados Unidos. A taxa de incidência de câncer de pulmão e brônquico está declinando significantemente em homens, de uma taxa elevada de 86,5 por 100.000 em 1984 para 70,0 em 1996. Na década de 90, a taxa de aumento entre mulheres começou a reduzir. Em 1996, a taxa de incidência em mulheres foi de 42,3 por 100.000.
[016] Estima-se que o câncer de pulmão e brônquico tenha causado 156.900 mortes em 2000, sendo responsável por 28% de todas as mortes por câncer. Durante 1992-1996, a mortalidade por câncer de pulmão declinou significantemente entre homens (-1,7% por ano), enquanto as taxas para mulheres ainda estavam aumentando significantemente (0,9% por ano). Desde 1987, mais mulheres morreram a cada ano de câncer de pulmão do que por câncer de mama que, para mulheres acima de 40 anos, era a causa principal de morte por câncer em mulheres. A diminuição das taxas de incidência e mortalidade câncer de pulmão mais provavelmente resultou de taxas de tabagismo diminuídas ao longo dos 30 anos anteriores; no entanto, os padrões de tabagismo decrescentes entre mulheres ficaram atrás daqueles para homens. É preocupante, no entanto, que, embora o uso de tabaco por adultos tenha diminuído, uso de tabaco em jovens está crescendo novamente.
[017] As opções de tratamento para o câncer de pulmão e brônquico são determinadas pelo tipo e estágio do câncer, e incluem cirurgia, radioterapia e quimioterapia. Para muitos cânceres localizados, a cirurgia é normalmente o tratamento de escolha. Como a doença normalmente já se disseminou no momento em que é descoberta, freqüentemente são necessárias radioterapia e quimioterapia em combinação com cirurgia. A quimioterapia isoladamente ou combinada com radiação é o tratamento de escolha para câncer de pulmão de pequena célula; nesse regime, uma grande percentagem de pacientes apresenta remissão que, em alguns casos é de longa duração. Há, no entanto, uma necessidade crescente por abordagens de tratamento e diagnósticas eficazes para cânceres de pulmão e brônquicos.
[018] Estima-se que ocorram 182.800 novos casos de câncer de mama invasivo entre mulheres nos Estados Unidos durante 2000. Adicionalmente, espera-se que cerca de 1.400 novos casos de câncer de mama sejam diagnosticados em homens em 2000. Após um aumento de cerca de 4% por ano na década de 80, as taxas de incidência de câncer de mama em mulheres se estabilizaram na década de 90 até cerca de 110.6 casos por 100.000.
[019] Somente nos Estados Unidos, estima-se que houve 41.200 mortes (40.800 mulheres, 400 homens) em 2000 em conseqüência do câncer de mama. O câncer de mama é o segundo entre as mortes por câncer em mulheres. De acordo com os dados mais recentes, as taxas de mortalidade declinaram significantemente durante 1992-1996, com as maiores diminuições em mulheres mais jovens, brancas e negras. Essas diminuições foram provavelmente o resultado da detecção precoce e tratamento aprimorado.
[020] Levando em conta as circunstâncias médicas e as preferências do paciente, o tratamento de câncer de mama pode envolver lumpectomia (remoção local do tumor) e remoção dos linfonodos sob o braço; mastectomia (remoção cirúrgica da mama) e remoção dos linfonodos sob o braço; radioterapia; quimioterapia; ou terapia hormonal. Freqüentemente, dois ou mais métodos são usados em combinação. Diversos estudos demonstraram que, para doença em estágio inicial, as taxas de sobrevida de longo prazo após lumpectomia mais radioterapia são similares às taxas de sobrevida após mastectomia radical modificada. Avanços significantes nas técnicas reconstrução fornecem várias opções para reconstrução da mama após mastectomia. Recentemente, essa reconstrução foi feita ao mesmo tempo que a mastectomia.
[021] A excisão local de carcinoma ductal in situ (DCIS) com quantidades adequadas de tecido de mama normal circundante podem evitar a recorrência local do DCIS. A radiação da mama e/ou tamoxifeno podem reduzir a probabilidade de ocorrência de DCIS no tecido mamário restante. Isso é importante, pois o DCIS, se não tratado, pode se desenvolver em câncer de mama invasivo. No entanto, há efeitos colaterais sérios ou seqüelas para esses tratamentos. Há, portanto, uma necessidade por tratamentos eficazes para o câncer de mama.
[022] Estima-se que tenha havido 23.100 novos casos de câncer ovariano nos Estados Unidos em 2000. Ele é responsável por 4% de todos os cânceres entre mulheres e se situa em segundo lugar entre cânceres ginecológicos. Durante 1992-1996, as taxas de incidência câncer ovariano eram significantemente declinantes. Em conseqüência do câncer ovariano, estima-se que houve 14.000 mortes em 2000. O câncer ovariano causa mais mortes do que qualquer outro câncer do sistema reprodutivo feminino.
[023] A cirurgia, radioterapia e quimioterapia são opções de tratamento para o câncer ovariano. Cirurgia normalmente inclui a remoção de um ou ambos os ovários, das trompas de Falópio (salpingoooforectomia) e do útero (histerectomia). Em alguns tumores muitos iniciais, somente o ovário envolvido será removido, especialmente em mulheres jovens que desejam engravidar. Na doença avançada, é feita uma tentativa de remover toda a doença intra-abdominal para aumentar o efeito da quimioterapia. Continua a existir uma necessidade importante por opções de tratamento eficazes para o câncer ovariano.
[024] Estima-se que tenha havido 28.300 novos casos de câncer pancreático nos Estados Unidos em 2000. Ao longo dos últimos 20 anos, as taxas de câncer pancreático declinaram em homens. As taxas entre mulheres permaneceram aproximadamente constantes, mas podem estar começando a declinar. Estima-se que o câncer pancreático tenha causado 28.200 mortes em 2000 nos Estados Unidos. Nos últimos 20 anos, houve uma ligeira, mas significante diminuição nas taxas de mortalidade entre homens (cerca de -0,9% por ano), enquanto as taxas aumentaram ligeiramente entre mulheres.
[025] A cirurgia, radioterapia e quimioterapia são opções de tratamento para o câncer pancreático. Essas opções de tratamento podem prolongar a sobrevida e/ou aliviar os sintomas em muitos pacientes, mas provavelmente não produzem uma cura para a maioria. Há uma necessidade significante por opções terapêuticas e diagnósticas adicionais para os cânceres. Essas incluem o uso de anticorpos, vacinas e pequenas moléculas como modalidades de tratamento. Adicionalmente, também há a necessidade de utilização dessas modalidades como ferramentas de pesquisa para diagnosticar, detectar, monitorar e aprimorar o estado-da-arte em todas as áreas de tratamento e estudos do câncer.
[026] A utilidade terapêutica de anticorpos monoclonais (mAbs) (G. Kohler e C. Milstein, Nature 256: 495-497 (1975)) está sendo percebida. Anticorpos monoclonais foram agora aprovados como terapias em transplante, câncer, doença infecciosa, doença cardiovascular e inflamação. Isótipos diferentes possuem funções efetoras diferentes. Essas diferenças na função são refletidas em estruturas tridimensionais distintas para os vários isótipos de imunoglobulina (P.M. Alzari e cols., Annual Rev. Immunol., 6: 555-580 (1988)).
[027] Como os camundongos são convenientes para imunização e reconhecem a maioria dos antígenos humanos como estranhos, mAbs contra alvos humanos com potencial terapêutico tipicamente têm sido de origem murídea. No entanto, mAbs murídeos possuem desvantagens inerentes como substâncias terapêuticas humanas. Eles necessitam de dosagem mais freqüente, na medida em que os mAbs possuem uma meia-vida circulante mais curta em humanos do que anticorpos humanos. Mais criticamente, a administração repetida de anticorpos murídeos ao sistema imune humano faz com que o sistema imune humano responda por reconhecimento da proteína de camundongo como estranha e que gere uma resposta de anticorpo humano anti-camundongo (HAMA). Essa resposta de HAMA pode resultar em uma reação alérgica e na depuração rápida do anticorpo murídeo do sistema tornando, dessa forma, o tratamento com o anticorpo murídeo inútil. Para evitar esses efeitos, foram feitas tentativas de criar sistemas imunes humanos dentro de camundongos.
[028] As tentativas iniciais visavam criar camundongos transgênicos capazes de responder aos antígenos com anticorpos que possuem seqüências humanas (veja Bruggemann e cols., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86: 6.709-6.713 (1989)), mas eram limitadas pela quantidade de DNA que poderia ser mantida estavelmente por veículos de clonagem disponíveis. O uso de vetores de clonagem de cromossomo artificial de levedura (YAC) levou à forma para a introdução de grandes fragmentos de linhagem germinativa de lócus de Ig humana em mamíferos transgênicos. Essencialmente a maioria dos genes de regiões V, D e J humanas dispostos com o mesmo espaçamento encontrado no genoma humano e as regiões constantes humanas foi introduzida em camundongos usando YACs. Uma dessas cepas de camundongo transgênico é conhecida como camundongos XenoMouse® e é comercialmente disponível por Amgen Fremont, Inc. (Fremont CA).
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[029] A invenção fornece anticorpos, fragmentos de ligação e conjugados anticorpo-fármaco (ADCs) destes que se ligam às proteínas 158P1D7 e fragmentos de polipeptídeo de proteínas 158P1D7. Em algumas modalidades, a invenção compreende anticorpos totalmente humanos conjugados com um agente terapêutico. Em certas modalidades, há a condição de que toda uma seqüência de ácidos nucléicos da Figura não seja codificada e/ou toda uma seqüência de aminoácidos da Figura 2 não seja preparada. Em certas modalidades, toda uma seqüência de ácidos nucléicos da Figura 3 é codificada e/ou toda uma seqüência de aminoácidos da Figura 2 é preparada, qualquer uma delas estando nas respectivas formas de dose unitária humana.
[030] A invenção ainda fornece várias composições imunogênicas ou terapêuticas, por exemplo, conjugados anticorpo-fármaco, e estratégias para o tratamento de cânceres que expressam 158P1D7, por exemplo, cânceres de tecidos listados na Tabela I, especialmente câncer da bexiga.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
[031] Figura 1. A seqüência de cDNA e de aminoácidos de 158P1D7 é mostrada na Figura 1. A metionina de partida está sublinhada. O quadro de leitura aberta se estende do ácido nucléico 23-2548, incluindo o códon de parada.
[032] Figura 2. Seqüências de ácidos nucléicos e de aminoácidos de anticorpos para 158P1D7. A Figura 2(A) mostra uma seqüência de cDNA e de aminoácidos da cadeia pesada de Ha15-10ac12. Está com sublinhado duplo a região variável da cadeia pesada, está sublinhada a região constante da cadeia pesada de IgG2 humana. A Figura 2(B) mostra uma seqüência de cDNA e de aminoácidos da cadeia leve de Ha15-10ac12. Está com sublinhado duplo a região variável da cadeia leve, está sublinhada a região constante kappa humana.
[033] Figura 3. Seqüências de aminoácidos de anticorpos para 158P1D7. A Figura 3(A) mostra uma seqüência de aminoácidos da cadeia pesada de Ha15-10ac12. Está com sublinhado duplo a região variável da cadeia pesada, e está sublinhada a região constante de IgG2 humana. A Figura 3(B) mostra uma seqüência de aminoácidos da cadeia leve de Ha15- 10ac12. Está com sublinhado duplo a região variável da cadeia leve, e está sublinhada a região constante kappa humana.
[034] Figura 4. Alinhamento de anticorpos Ha15-10ac12 para linhagem germinativa de Ig humana. Figura 4(A): alinhamento da cadeia pesada de Ha15-10ac12 (ID. DE SEQ. N°: 3, posições 1-360; ID. DE SEQ. N°: 4, posições 1-120) para a linhagem germinativa de Ig humana. Figura 4(B): alinhamento da cadeia leve de Ha15-10ac12 (ID. DE SEQ. N°: 5, posições 1-240; ID. DE SEQ. N°: 6, posições 1-80) para IGKV2D-28*01 da linhagem germinativa de Ig humana (ID. DE SEQ. N°: 10).
[035] Figura 5. Eficácia de Ha15-10ac12vcMMAE em um modelo de xenoenxerto subcutâneo estabelecido de câncer da bexiga humano AG-B7 em camundongos SCID.
[036] Figura 6. Eficácia de Ha15-10ac12vcMMAE em câncer da bexiga humano estabelecido por via subcutânea RT-4-XCL implantado em camundongos SCID.
[037] Figura 7. Eficácia de Ha15-10ac12vcMMAE em câncer de pulmão humano estabelecido por via subcutânea NCI-H322M- XCL implantado em camundongos SCID.
[038] Figura 8. Eficácia de Ha15-10ac12vcMMAE em um modelo de xenoenxerto subcutâneo estabelecido de câncer da bexiga humano AG-B7 em camundongos SCID.
[039] Figura 9. Detecção de proteína 158P1D7 em amostras de paciente com câncer por IHC. Figura 9(A) e 9(B) mostram amostras de câncer da bexiga. As Figura 9(C) e 9(D) mostram amostras de câncer de mama. A Figura 9(E) e 9(F) mostram amostras de câncer de pulmã . As Figura 9(G) e 9(H) mostram amostras de câncer de glioblastoma.
[040] Figura 10. Eficácia de Ha15-10ac12vcMMAE em modelo de xenoenxerto subcutâneo estabelecido de câncer da bexiga humano SW780 em camundongos SCID.
[041] Figura 11. Eficácia in vitro de Ha15-10ac12vcMMAE no ensaio de citotoxicidade de CHP-212 comparado com MAb M15-68(2)18 (também conhecido como 68(18)1.1).
[042] Figura 12. Eficácia de Ha15-10ac12vcMMAE em modelo de xenoenxerto subcutâneo estabelecido de câncer da bexiga humano derivado de paciente AG-B8 em camundongos SCID.
[043] Figura 13. Uma curva de saturação para Ha15- 10ac12vcMMAE.
[044] Figura 14. Um histograma que mostra a intensidade de fluorescência média (MFI) de Ha15-10ac12vcMMAE.
[045] Figura 15. Avaliação da citotoxicidade in vitro de Ha15-10ac12vcMMAE, Figura 15(A) nas células CHP-212 e Figura 15(B) nas células IGROV-1.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO Descrição das seções
[046] I) Definições
[047] II) Anticorpos para 158P1D7
[048] III) Conjugados anticorpo-fármaco de forma geral
[049] III(A) Maitansinóides
[050] III(B) Auristatinas e dolastatinas
[051] III(C) Caliqueamicina
[052] III(D) Outros agentes citotóxicos
[053] IV) Conjugados anticorpo-fármaco que se ligam a 158P1D7.
[054] V) Unidades vinculadoras
[055] VI) A unidade esticadora
[056] VII) A unidade de aminoácido
[057] VIII) A unidade espaçadora
[058] IX) A unidade de fármaco
[059] X) Unidade de carregamento
[060] XII) Métodos de determinação do efeito citotóxico de ADCs
[061] XII) Tratamento de cânceres que expressam 158P1D7
[062] XIII) 158P1D7 como um alvo para terapia à base de anticorpo.
[063] XIV) Coquetéis de 158P1D7-ADC
[064] XV) Terapia combinada
[065] XVI) Kits/ artigos manufaturados
[066] I) Definições:
[067] A menos que definido de forma diferente, todos os termos de técnica, notações e outros termos ou terminologia científicos aqui usados têm os significados comumente subentendidos por aqueles habilitados na técnica à qual essa invenção pertence. Em alguns casos, termos com significados comumente compreendidos são aqui definidos por clareza e/ou para pronta referência, e a inclusão aqui dessas definições não deve ser necessariamente considerada como representando uma diferença substancial em relação àquelas que são geralmente compreendidas na técnica. Muitas das técnicas e procedimentos aqui descritos ou citados são bem compreendidos e comumente empregados com o uso de metodologia convencional por aqueles habilitados na técnica como, por exemplo, as metodologias de clonagem molecular amplamente utilizadas descritas em Sambrook e cols., “Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, 2a Edição (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. Como apropriado, procedimentos que envolvem o uso de kits e reagentes comercialmente disponíveis são geralmente realizados de acordo com protocolos e/ou parâmetros definidos pelo fabricante, a menos que observado de forma diferente.
[068] Quando um nome comercial é aqui usado, a referência ao nome comercial também se refere à formulação de produto, ao fármaco genérico e ao(s) ingrediente(s) farmacêutico(s) ativo(s) do produto de nome comercial, a menos que indicado de forma diferente pelo contexto.
[069] Os termos “câncer avançado”, “câncer localmente avançado”, “doença avançada” e “doença localmente avançada” significam cânceres que se estenderam através da cápsula de tecido relevante, e visam incluir doença em estágio C sob o sistema da “American Urological Association” (AUA), doença em estágio C1 - C2 sob o sistema de Whitmore-Jewett e doença em estágio T3 - T4 e N+ sob o sistema TNM (tumor, linfonodo, metástase). Em geral, cirurgia não está recomendada para pacientes com doença localmente avançada, e esses pacientes possuem resultados finais substancialmente menos favoráveis, comparados com pacientes que possuem câncer clinicamente localizado (confinado ao órgão).
[070] A abreviação “AFP” se refere a dimetilvalina- valina-dolaisoleucina-dolaproína-fenilalanina-p- fenilenediamina (veja a Fórmula XVI infra).
[071] A abreviação “MMAE” se refere a monometil- auristatina E (veja a Fórmula XI infra).
[072] A abreviação “AEB” se refere a um éster produzido por reação de auristatina E com ácido para-acetil-benzóico (veja a Fórmula XX infra).
[073] A abreviação “AEVB” se refere a um éster produzido por reação de auristatina E com ácido benzoilvalérico (veja a Fórmula XXI infra).
[074] A abreviação “MMAF” se refere a dovalina-valina- dolaisoleucina-dolaproína-fenilalanina (veja a Fórmula XVI infra).
[075] A menos que observado de forma diferente, o termo “alquil” se refere a um hidrocarboneto saturado linear ou ramificado que possui de cerca de 1 a cerca de 20 átomos de carbono (e todas as combinações e subcombinações de faixas e números específicos de átomos de carbono presentes), com de cerca de 1 a cerca de 8 átomos de carbono sendo preferidos. Exemplos de grupos alquil são metil, etil, n- propil, iso- propil, n-butil, iso-butil, sec-butil, terc- butil, n-pentil, 2-pentil, 3-pentil, 2-metil-2-butil, n- hexil, n-heptil, n-octil, n-nonil, n-decil, 3-metil-2- butil, 3-metil-1-butil, 2-metil-1-butil, 1-hexil, 2-hexil, 3-hexil, 2-metil-2-pentil, 3-metil-2-pentil, 4-metil-2- pentil, 3-metil-3-pentil, 2-metil-3-pentil, 2,3-dimetil-2- butil e 3,3-dimetil-2-butil.
[076] Grupos alquil, isoladamente ou como parte de outro grupo, pode ser opcionalmente substituído com um ou mais grupos, preferivelmente 1 a 3 grupos (e quaisquer substituintes adicionais selecionados de halogênio) incluindo, sem limitação, -halogênio, -O-(C1-C8 alquil), - O-(C2-C8 alquenil), -O-(C2-C8 alquinil), -aril, -C(O)R’-, - OC(O)R’, -C(O)OR’, -C(O)NH2, -C(O)NHR’-, -C(O)N(R’)2, - NHC(O)R’-SR’, -SO3R’, -S(O)2R’, -S(O)R’, -OH, =O, -N3, -NH2, -NH(R’), -N(R’)2 e -CN, em que cada R’ é selecionado independentemente de -H, -C1-C8 alquil, -C2-C8 alquenil, - C2-C8 alquinil ou -aril, e em que os referidos grupos -O- (C1-C8 alquil), -O-(C2-C8 alquenil), -O-(C2-C8 alquinil), - aril, -C1-C8 alquil, -C2-C8 alquenil e -C2-C8 alquinil podem ser opcionalmente ainda substituídos com um ou mais grupos incluindo, sem limitação, -C1-C8 alquil, -C2-C8 alquenil, - C2-C8 alquinil, -halogênio, -O-(C1-C8 alquil), -O-(C2-C8 alquenil), -O-(C2-C8 alquinil), -aril, -C(O)R”, -OC(O)R”, - C(O)OR”, -C(O)NH2, -C(O)NHR”, -C(O)N(R”)2, -NHC(O)R”, -SR”, -SO3R”, -S(O)2R”, -S(O)R”, -OH, -N3, -NH2, -NH(R”), -N(R”)2 e -CN, em que cada R” é selecionado independentemente de - H, -C1-C8 alquil, -C2-C8 alquenil, -C2-C8 alquinil ou -aril.
[077] A menos que observado de forma diferente, os termos “alquenil” e “alquinil” se referem às cadeias de carbono lineares e ramificadas que possuem de cerca de 2 a cerca de 20 átomos de carbono (e todas as combinações e subcombinações de faixas e números específicos de átomos de carbono presentes), com de cerca de 2 a cerca de 8 átomos de carbono sendo preferidos. Uma cadeia alquenil possui pelo menos uma ligação dupla na cadeia e uma cadeia alquinil possui pelo menos uma ligação tripla na cadeia. Exemplos de grupos alquenil incluem, sem limitação, etileno ou vinil, alil, -1-butenil, -2-butenil, -isobutilenil, -1- pentenil, -2-pentenil, -3-metil-1-butenil, -2-metil-2- butenil, e -2,3-dimetil-2- butenil. Exemplos de grupos alquinil incluem, sem limitação, acetilênico, propargil, acetilenil, propinil, -1-butinil, -2-butinil, -1-pentinil, -2-pentinil e -3-metil- 1 butinil.
[078] Grupos alquenil e alquinil, isoladamente ou como parte de outro grupo, podem ser opcionalmente substituídos com um ou mais grupos, preferivelmente 1 a 3 grupos (e quaisquer substituintes adicionais selecionados de halogênio) incluindo, sem limitação, -halogênio, -O-(C1-C8 alquil), -O- (C2-C8 alquenil), -O-(C2-C8 alquinil), -aril, - C(O)R’-, -OC(O)R’, -C(O)OR’, -C(O)NH2, -C(O)NHR’- C(O)N(R’)2, -NHC(O)R’-SR’, -SO3R’, -S(O)2R’, -S(O)R’-OH, =O, -N3, -NH2, -NH(R’), -N(R’)2 e -CN, em que cada R’ é selecionado independentemente de -H, -C1-C8 alquil, -C2-C8 alquenil, -C2-C8 alquinil ou -aril e em que os referidos grupos -O-(C1-C8 alquil), -O-(C2-C8 alquenil), -O- (C2-C8 alquinil), -aril, -C1-C8 alquil, -C2-C8 alquenil e -C2-C8 alquinil podem ser opcionalmente ainda substituídos com um ou mais substituintes incluindo, sem limitação, -C1-C8 alquil, -C2-C8 alquenil, -C2-C8 alquinil, -halogênio, -O- (C1-C8 alquil), -O-(C2-C8 alquenil), -O-(C2-C8 alquinil), - aril, -C(O)R”, -OC(O)R”, -C(O)OR”, -C(O)NH2, -C(O)NHR”, - C(O)N(R”)2, -NHC(O)R”, -SR”, -SO3R”, -S(O)2R”, -S(O)R”, -OH, -N3, -NH2, -NH(R”), -N(R”)2 e -CN, em que cada R” é selecionado independentemente de -H, -C1-C8 alquil, -C2-C8 alquenil, -C2-C8 alquinil ou -aril.
[079] A menos que observado de forma diferente, o termo “alquileno” se refere a um radical hidrocarboneto saturado de cadeia ramificada ou linear que possui de cerca de 1 a cerca de 20 átomos de carbono (e todas as combinações e subcombinações de faixas e números específicos de átomos de carbono presentes), com de cerca de 1 a cerca de 8 átomos de carbono sendo preferidos e que possui dois centros de radical monovalente derivados pela remoção de dois átomos de hidrogênio do mesmo átomo de carbono ou de dois átomos de carbono diferentes de um alcano parente. Alquilenos típicos incluem, sem limitação, metileno, etileno, propileno, butileno, pentileno, hexileno, heptileno, octileno, nonileno, decaleno, 1,4-ciclohexileno, e semelhantes. Grupos alquileno, isoladamente ou como parte de outro grupo, podem ser opcionalmente substituídos com um ou mais grupos, preferivelmente 1 a 3 grupos (e quaisquer substituintes adicionais selecionados de halogênio) incluindo, sem limitação, -halogênio, -O-(C1-C8 alquil), - O-(C2-C8 alquenil), -O-(C2-C8 alquinil), -aril, -C(O)R’, - OC(O)R’, -C(O)OR’, -C(O)NH2, -C(O)NHR’, -C(O)N(R’)2, - NHC(O)R’, -SR’, -SO3R’, -S(O)2R’, -S(O)R’, -OH, =O, -N3, - NH2, -NH(R’), -N(R’)2 e -CN, em que cada R’ é selecionado independentemente de -H, -C1-C8 alquil, -C2-C8 alquenil, - C2-C8 alquinil ou -aril e em que os referidos grupos -O-(C1- C8 alquil), -O-(C2-C8 alquenil), -O-(C2-C8 alquinil), -aril, -C1-C8 alquil, -C2-C8 alquenil e -C2-C8 alquinil podem ainda ser opcionalmente substituídos com um ou mais substituintes incluindo, sem limitação, -C1-C8 alquil, -C2-C8 alquenil, - C2-C8 alquinil, -halogênio, -O-(C1-C8 alquil), -O-(C2-C8 alquenil), -O-(C2-C8 alquinil), -aril, -C(O)R”, -OC(O)R”, - C(O)OR”, -C(O)NH2, -C(O)NHR”, -C(O)N(R”)2, -NHC(O)R”, -SR”, -SO3R”, -S(O)2R”, -S(O)R”, -OH, -N3, -NH2, -NH(R”), -N(R”)2 e -CN, em que cada R” é selecionado independentemente de - H, -C1-C8 alquil, -C2-C8 alquenil, -C2-C8 alquinil ou -aril.
[080] A menos que observado de forma diferente, o termo “alquenileno” se refere a um grupo alquileno opcionalmente substituído que contém pelo menos uma ligação dupla carbono-carbono. Grupos alquenileno exemplares incluem, por exemplo, etenileno (-CH=CH-) e propenileno (-CH=CHCH2-).
[081] A menos que observado de forma diferente, o termo “alquinileno” se refere a um grupo alquileno opcionalmente substituído que contém pelo menos uma ligação tripla carbono-carbono. Grupos alquinileno exemplares incluem, por exemplo, acetileno (-C=C-), propargil (-CH2C=C—) e 4- pentinil (-CH2CH2CH2C=CH-).
[082] A menos que observado de forma diferente, o termo “aril” se refere a um radical hidrocarboneto monovalente aromático de 6-20 átomos de carbono (e todas as combinações e subcombinações de faixas e números específicos de átomos de carbono presentes) derivado pela remoção de um átomo de hidrogênio de um único átomo de carbono de um sistema de anel aromático parente. Alguns grupos aril são representados nas estruturas exemplares como “Ar”. Grupos aril típicos incluem, sem limitação, radicais derivados de benzeno, benzeno substituído, fenil, naftaleno, antraceno, bifenil, e semelhantes.
[083] Um grupo aril, isoladamente ou como parte de outro grupo, pode ser opcionalmente substituído com um ou mais, preferivelmente 1 a 5, ou até mesmo 1 a 2 grupos incluindo, sem limitação, -halogênio, -C1-C8 alquil, -C2-C8 alquenil, -C2-C8 alquinil, -O-(C1-C8 alquil), -O-(C2-C8 alquenil), -O-(C2-C8 alquinil), -aril, -C(O)R’-, -OC(O)R’, -C(O)OR’, -C(O)NH2, -C(O)NHR’-C(O)N(R’)2, -NHC(O)R’, -SR’, -SO3R’, -S(O)2R’, -S(O)R’-OH, -NO2, -N3, -NH2, -NH(R’), - N(R’)2 e -CN, em que cada R’ é selecionado independentemente de -H, -C1-C8 alquil, -C2-C8 alquenil, - C2-C8 alquinil ou -aril e em que os referidos grupos -C1-C8 alquil, -C2-C8 alquenil, -C2-C8 alquinil, O-(C1-C8 alquil), - O-(C2-C8 alquenil), -O-(C2-C8 alquinil), e -grupos aril podem ainda ser opcionalmente substituídos com um ou mais substituintes incluindo, sem limitação, -C1-C8 alquil, -C2C8 alquenil, -C2-C8 alquinil, -halogênio, -O-(C1-C8 alquil), -O-(C2-C8 alquenil), -O-(C2-C8 alquinil), -aril, -C(O)R”, - OC(O)R”, -C(O)OR”, -C(O)NH2, -C(O)NHR”, -C(O)N(R”)2, - NHC(O)R”, -SR”, -SO3R”, -S(O)2R”, -S(O)R”, -OH, -N3, -NH2, - NH(R”), -N(R”)2 e -CN, em que cada R” é selecionado independentemente de -H, -C1-C8 alquil, -C2-C8 alquenil, - C2-C8 alquinil ou -aril.
[084] A menos que observado de forma diferente, o termo “arileno” se refere a um grupo aril opcionalmente substituído que é divalente (ou seja, derivado pela remoção de dois átomos de hidrogênio do mesmo átomo de carbono ou de dois átomos de carbono diferentes de um sistema de anel aromático parente) e pode estar nas configurações orto, meta ou para, como mostrado nas estruturas seguintes com fenil como o grupo aril exemplar:
Figure img0001
[085] Grupos “-(C1-C8 alquileno)aril”, “-(C2-C8 alquenileno)aril” e “-(C2-C8 alquinileno)aril” típicos incluem, sem limitação, benzil, 2-feniletan-1-il, 2- fenileten-1-il, naftilmetil, 2- naftiletan-1-il, 2- naftileten-1-il, naftobenzil, 2-naftofeniletan-1-il e semelhantes.
[086] A menos que observado de forma diferente, o termo “heterociclo” se refere a um sistema de anel monocíclico, bicíclico ou policíclico que possui de 3 a 14 átomos no anel (também denominados membros do anel), em que pelo menos um átomo no anel em pelo menos um anel é um heteroátomo selecionado de N, O, P ou S (e todas as combinações e subcombinações de faixas e números específicos de átomos de carbono e heteroátomos presentes). O heterociclo pode ter de 1 a 4 heteroátomos no anel selecionados independentemente de N, O, P ou S. Um ou mais átomos de N, C ou S em um heterociclo podem ser oxidados. Um heterociclo monocíclico preferivelmente possui 3 a 7 membros do anel (por exemplo, 2 a 6 átomos de carbono e 1 a 3 heteroátomos selecionados independentemente de N, O, P ou S), e um heterociclo bicíclico preferivelmente possui 5 a 10 membros do anel (por exemplo, 4 a 9 átomos de carbono e 1 a 3 heteroátomos selecionados independentemente de N, O, P ou S). O anel que inclui o heteroátomo pode ser aromático ou não aromático. A menos que observado de forma diferente, o heterociclo está anexado ao seu grupo pendente em qualquer heteroátomo ou átomo de carbono que resulte em uma estrutura estável.
[087] Heterociclos são descritos em Paquette, “Principles of Modern Heterociclic Chemistry” (W.A. Benjamin, Nova York, 1968), particularmente Capítulos 1, 3, 4, 6, 7 e 9; “The Chemistry of Heterocyclic Compounds, A Series of Monographs” (John Wiley & Sons, Nova York, 1950 até a presente data), em particular Volumes 13, 14, 16, 19 e 28; e J. Am. Chem. Soc. 82: 5.566 (1960).
[088] Exemplos de grupos “heterociclo” incluem, apenas como exemplo e não limitação, piridil, diidropiridil, tetrahidropiridil (piperidil), tiazolil, pirimidinil, furanil, tienil, pirrolil, pirazolil, imidazolil, tetrazolil, benzofuranil, tianaftalenil, indolil, indolenil, quinolinil, isoquinolinil, benzimidazolil, piperidinil, 4-piperidonil, pirrolidinil, 2-pirrolidonil, pirrolinil, tetrahidrofuranil, bis-tetrahidrofuranil, tetrahidropiranil, bis-tetrahidropiranil, tetrahidroquinolinil, tetrahidroisoquinolinil, decahidroquinolinil, octahidroisoquinolinil, azocinil, triazinil, 6H-1,2,5-tiadiazinil, 2H,6H-1,5,2-ditiazinil, tienil, tiantrenil, piranil, isobenzofuranil, cromenil, xantenil, fenoxatinil, 2H-pirrolil, isotiazolil, isoxazolil, pirazinil, piridazinil, indolizinil, isoindolil, 3H-indolil, 1H-indazolil, purinil, 4H- quinolizinil, ftalazinil, naftiridinil, quinoxalinil, quinazolinil, cinnolinil, pteridinil, 4H-carbazolil, carbazolil, β-carbolinil, fenantridinil, acridinil, pirimidinil, fenantrolinil, fenazinil, fenotiazinil, furazanil, fenoxazinil, isocromanil, cromanil, imidazolidinil, imidazolinil, pirazolidinil, pirazolinil, piperazinil, indolinil, isoindolinil, quinuclidinil, morfolinil, oxazolidinil, benzotriazolil, benzisoxazolil, oxindolil, benzoxazolinil e isatinoil. Grupos “heterociclo” preferidos incluem, sem limitação, benzofuranil, benzotiofenil, indolil, benzopirazolil, cumarinil, isoquinolinil, pirrolil, tiofenil, furanil, tiazolil, imidazolil, pirazolil, triazolil, quinolinil, pirimidinil, piridinil, piridonil, pirazinil, piridazinil, isotiazolil, isoxazolil e tetrazolil.
[089] Um grupo heterociclo, isoladamente ou como parte de outro grupo, pode ser opcionalmente substituído com um ou mais grupos, preferivelmente 1 a 2 grupos incluindo, sem limitação, -C1-C8 alquil, -C2-C8 alquenil, -C2-C8 alquinil, - halogênio, -O-(C1-C8 alquil), -O-(C2-C8 alquenil), -O-(C2-C8 alquinil), -aril, -C(O)R’, -OC(O)R’, -C(O)OR’, -C(O)NH2, - C(O)NHR’, -C(O)N(R’)2, -NHC(O)R’, -SR’, -SO3R’, -S(O)2R’, - S(O)R’, -OH, -N3, -NH2, -NH(R’), -N(R’)2 e -CN, em que cada R’ é selecionado independentemente de -H, -C1-C8 alquil, - C2-C8 alquenil, -C2-C8 alquinil ou -aril, e em que os referidos grupos -O-(C1-C8 alquil), -O-(C2-C8 alquenil), -O- (C2-C8 alquinil), -C1-C8 alquil, -C2-C8 alquenil, -C2-C8 alquinil e -aril podem ainda ser opcionalmente substituídos com um ou mais substituintes incluindo, sem limitação, -C1C8 alquil, -C2-C8 alquenil, -C2-C8 alquinil, -halogênio, -O- (C1-C8 alquil), -O-(C2-C8 alquenil), -O-(C2-C8 alquinil), - aril, -C(O)R”, -OC(O)R”, -C(O)OR”, -C(O)NH2, -C(O)NHR”, - C(O)N(R”)2, -NHC(O)R”, -SR”, -SO3R”, -S(O)2R”, -S(O)R”, -OH, -N3, -NH2, -NH(R”), -N(R”)2 e -CN, em que cada R” é selecionado independentemente de -H, -C1-C8 alquil, -C2-C8 alquenil, -C2-C8 alquinil ou aril.
[090] Apenas como exemplo, e não limitação, heterociclos ligados ao carbono podem ser ligados nas seguintes posições: posição 2, 3, 4, 5 ou 6 de uma piridina; posição 3, 4, 5 ou 6 de uma piridazina; posição 2, 4, 5 ou 6 de uma pirimidina; posição 2, 3, 5 ou 6 de uma pirazina; posição 2, 3, 4 ou 5 de um furano, tetrahidrofurano, tiofurano, tiofeno, pirrol ou tetrahidropirrol; posição 2, 4 ou 5 de um oxazol, imidazol ou tiazol; posição 3, 4 ou 5 de um isoxazol, pirazol ou isotiazol; posição 2 ou 3 de uma aziridina; posição 2, 3 ou 4 de uma azetidina; posição 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8 de uma quinolina; ou posição 1, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8 de uma isoquinolina. Ainda mais tipicamente, heterociclos ligados ao carbono incluem 2-piridil, 3-piridil, 4-piridil, 5- piridil, 6-piridil, 3 -piridazinil, 4- piridazinil, 5- piridazinil, 6-piridazinil, 2-pirimidinil, 4-pirimidinil, 5-pirimidinil, 6- pirimidinil, 2-pirazinil, 3-pirazinil, 5- pirazinil, 6-pirazinil, 2-tiazolil, 4-tiazolil ou 5- tiazolil.
[091] Apenas como exemplo, e não limitação, heterociclos ligados ao nitrogênio podem ser ligados na posição 1 de uma aziridina, azetidina, pirrol, pirrolidina, 2-pirrolina, 3-pirrolina, imidazol, imidazolidina, 2- imidazolina, 3-imidazolina, pirazol, pirazolina, 2- pirazolina, 3-pirazolina, piperidina, piperazina, indol, indolina ou 1H-indazol; posição 2 de um isoindol ou isoindolina; posição 4 de um morfolino; e posição 9 de um carbazol ou β-carbolina. Ainda mais tipicamente, heterociclos ligados ao nitrogênio incluem 1-aziridil, 1- azetedil, 1-pirrolil, 1-imidazolil, 1-pirazolil e 1- piperidinil.
[092] A menos que observado de forma diferente, o termo “carbociclo” se refere a um sistema de anel monocíclico, bicíclico ou policíclico, saturado ou insaturado, não aromático que possui de 3 a 14 átomos no anel (e todas as combinações e subcombinações de faixas e números específicos de átomos de carbono presentes), em que todos os átomos no anel são átomos de carbono. Carbociclos monocíclicos preferivelmente possuem 3 a 6 átomos no anel, ainda mais preferivelmente 5 ou 6 átomos no anel. Carbociclos bicíclicos preferivelmente possuem 7 a 12 átomos no anel, por exemplo, dispostos como um sistema biciclo [4,5], [5,5], [5,6] ou [6,6], ou 9 ou 10 átomos no anel dispostos como um sistema biciclo [5,6] ou [6,6]. O termo “carbociclo” inclui, por exemplo, um anel carbociclo monocíclico fundido a um anel aril (por exemplo, um anel carbociclo monocíclico fundido a um anel benzeno), Carbociclos preferivelmente possuem 3 a 8 átomos de carbono no anel.
[093] Grupos carbociclo, isoladamente ou como parte de outro grupo, pode ser opcionalmente substituído com, por exemplo, um ou mais grupos, preferivelmente 1 ou 2 grupos (e quaisquer substituintes adicionais selecionados de halogênio) incluindo, sem limitação, -halogênio, -C1-C8 alquil, -C2-C8 alquenil, -C2-C8 alquinil, -O-(C1-C8 alquil), -O-(C2-C8 alquenil), -O-(C2-C8 alquinil), -aril, -C(O)R’, - OC(O)R’, -C(O)OR’, -C(O)NH2, -C(O)NHR’, -C(O)N(R’)2, - NHC(O)R’, -SR’, -SO3R’, -S(O)2R’, -S(O)R’, -OH, =O, -N3, - NH2, -NH(R’), -N(R’)2 e -CN, em que cada R’ é selecionado independentemente de -H, -C1-C8 alquil, -C2-C8 alquenil, - C2-C8 alquinil ou -aril e em que os referidos grupos -C1-C8 alquil, -C2-C8 alquenil, -C2-C8 alquinil, -O-(C1-C8 alquil), -O-(C2-C8 alquenil), -O-(C2-C8 alquinil) e - aril podem ainda ser opcionalmente substituídos com um ou mais substituintes incluindo, sem limitação, -C1-C8 alquil, -C2C8 alquenil, -C2-C8 alquinil, -halogênio, -O-(C1-C8 alquil), -O-(C2-C8 alquenil), -O-(C2-C8 alquinil), -aril, -C(O)R”, - OC(O)R”, -C(O)OR”, -C(O)NH2, -C(O)NHR”, -C(O)N(R”)2, - NHC(O)R”, -SR”, -SO3R”, -S(O)2R”, -S(O)R”, -OH, -N3, -NH2, - NH(R”), -N(R”)2 e -CN, em que cada R” é selecionado independentemente de -H, -C1-C8 alquil, -C2-C8 alquenil, -C2C8 alquinil ou -aril.
[094] Exemplos de substituintes de carbocíclico monocíclico incluem -ciclopropil, -ciclobutil, - ciclopentil, -1-ciclopent-1-enil, -1-ciclopent-2-enil, -1- ciclopent-3-enil, ciclohexil, -1-ciclohex-1-enil, -1- ciclohex-2-enil, -1-ciclohex-3-enil, -cicloheptil, - ciclooctil, -1,3-ciclohexadienil, -1,4-ciclohexadienil, - 1,3-cicloheptadienil, -1,3,5-cicloheptatrienil e - ciclooctadienil.
[095] Um “carbociclo”, usado isoladamente ou como parte de outro grupo, se refere a um grupo carbociclo opcionalmente substituído como definido acima que é divalente (ou seja, derivado pela remoção de dois átomos de hidrogênio do mesmo átomo de carbono ou de dois átomos de carbono diferentes de um sistema de anel carbocíclico parente).
[096] A menos que indicado pelo contexto, um hífen (-) representa o ponto de adesão à molécula pendente. Conseqüentemente, o termo “-(C1-C8 alquileno)aril” ou “-C1C8 alquileno(aril)” se refere a um radical C1-C8 alquileno como aqui definido em que o radical alquileno está anexado à molécula pendente em qualquer um dos átomos de carbono do radical alquileno, e um dos átomos de hidrogênio ligados a um átomo de carbono do radical alquileno é substituído com um radical aril como aqui definido.
[097] Quando um grupo particular é “substituído”, aquele grupo pode ter um ou mais substituintes, preferivelmente de um a cinco substituintes, mais preferivelmente de um a três substituintes, mais preferivelmente ainda, de um a dois substituintes, selecionados independentemente da lista de substituintes. O grupo pode, no entanto, geralmente ter qualquer número de substituintes selecionados de halogênio. Grupos que são substituídos são assim indicados.
[098] Deseja-se que a definição de qualquer substituinte ou variável em uma localização particular em uma molécula seja independente de suas definições em outro lugar naquela molécula. Subentende-se que substituintes e padrões de substituição nos compostos dessa invenção podem ser selecionados por aqueles habilitados na técnica para fornecer compostos que sejam quimicamente estáveis e que possam ser facilmente sintetizados por metodologias conhecidas na técnica, bem como por aqueles métodos aqui apresentados.
[099] Grupos de proteção, como aqui usados, se referem a grupos que bloqueiam seletivamente, temporária ou permanentemente, um sítio reativo em um composto multifuncional. Grupos de proteção de hidróxi adequados para uso na presente invenção são farmaceuticamente aceitáveis e podem ou não precisar ser clivados do composto parente após administração a um indivíduo a fim de que o composto seja ativo. A clivagem se dá por meio de processos metabólicos normais dentro do corpo. Grupos de proteção de hidróxi são bem conhecidos na técnica, veja, “Protective Groups in Organic Synthesis” por T.W. Greene e P.G.M. Wuts (John Wiley & Sons, 3a Edição) aqui incorporado por referência em sua totalidade e para todas as finalidades e incluem, por exemplo, éter (por exemplo, alquil éteres e silil éteres incluindo, por exemplo, grupos de proteção de dialquilsililéter, trialquilsililéter, dialquilalcoxisililéter), éster, carbonato, carbamatos, sulfonato e fosfato. Exemplos de grupos de proteção de hidróxi incluem, sem limitação, metil éter; metoximetil éter, metiltiometil éter, (fenildimetilsilil)metoximetil éter, benziloximetil éter, p-metoxibenziloximetil éter, p- nitrobenziloximetil éter, o-nitrobenziloximetil éter, (4- metoxifenoxi)metil éter, guaiacolmetil éter, t-butoximetil éter, 4-penteniloximetil éter, siloximetil éter, 2- metoxietoximetil éter, 2,2,2-tricloroetoximetil éter,bis(2- cloroetoxi)metil éter, 2-(trimetilsilil)etoximetil éter, metoximetil éter, tetrahidropiranil éter, 1- metoxiciclohexil éter, 4-metoxitetrahidrotiopiranil éter, 4-metoxitetrahidrotiopiranil éter S,S-dióxido, 1-[(2-cloro- 4-metil)fenil]-4-metoxipiperidin-4-il éter, 1-(2-fluorfenil)-4-metoxipiperidin-4-il éter, 1,4-dioxan-2-il éter, tetrahidrofuranil éter, tetrahidrotiofuranil éter; substituído etil éteres como, por exemplo, 1-etoxietil éter, 1-(2-cloroetoxi)etil éter, 1-[2-(trimetilsilil)etóxi]etil éter, 1-metil-1-metoxietil éter, 1-metil-1-benziloxietil éter, 1-metil-1-benziloxi-2-fluoretil éter, 1-metil-1-fenoxietil éter, 2-trimetilsilil éter, t-butil éter, alil éter, propargil éteres, p- clorofenil éter, p-metoxifenil éter, benzil éter, p- metoxibenzil éter 3,4-dimetoxibenzil éter, trimetilsilil éter, trietilsilil éter, tripropilsililéter, dimetilisopropilsilil éter, dietilisopropilsilil éter, dimetilhexilsilil éter, t-butildimetilsilil éter, difenilmetilsilil éter, benzoilformato éster, acetato éster, cloroacetato éster, dicloroacetato éster, tricloro acetato éster, trifluoracetato éster, metoxiacetato éster, trifenilmetoxiacetato éster, fenilacetato éster, benzoato éster, alquil metil carbonato, alquil 9-fluorenilmetil carbonato, alquil etil carbonato, alquil 2,2,2,- tricloroetil carbonato, 1,1-dimetil-2,2,2-tricloroetil carbonato, alquilsulfonato, metanossulfonato, benzilsulfonato, tosilato, metileno acetal, etilideno acetal e t-butilmetilideno cetal. Grupos de proteção preferidos são representados pelas fórmulas -Ra, - Si(Ra)(Ra)(Ra), -C(O)Ra, -C(O)ORa, -C(O)NH(Ra), -S(O)2Ra, - S(O)2OH, P(O)(OH)2 e -P(O)(OH)ORa, em que Ra é C1-C20 alquil, C2-C20 alquenil, C2-C20 alquinil, -C1-C20 alquileno(carbociclo), -C2-C20 alquenileno(carbociclo), -C2C20 alquinileno(carbociclo), -C6-C10 aril, -C1-C20 alquileno(aril), -C2-C20 alquenileno(aril), -C2-C20 alquinileno(aril), -C1-C20 alquileno(heterociclo), -C2-C20 alquenileno(heterociclo), ou -C2-C20 alquinileno(heterociclo), em que os referidos radicais alquil, alquenil, alquinil, alquileno, alquenileno, alquinileno, aril, carbociclo e heterociclo isoladamente ou como parte de outro grupo são opcionalmente substituídos.
[100] O termo “alteração do padrão de glicosilação nativo” significa, para os objetivos dessa invenção, deleção de uma ou mais porções de carboidrato encontradas na seqüência 158P1D7 nativa (por remoção do sítio de glicosilação subjacente ou por deleção da glicosilação por meios químicos e/ou enzimáticos), e/ou adição de um ou mais sítios de glicosilação que não estão presentes na seqüência 158P1D7 nativa. Além disso, a frase inclui alterações qualitativas na glicosilação das proteínas nativas, que envolvem uma alteração na natureza e proporções das várias porções de carboidrato presentes.
[101] O termo “análogo” se refere a uma molécula que é estruturalmente similar ou compartilha atributos similares ou correspondentes com outra molécula (por exemplo, uma proteína relacionada à 158P1D7) Por exemplo, um análogo de uma proteína 158P1D7 pode ser ligado especificamente por um anticorpo ou célula T que se liga especificamente a 158P1D7.
[102] O termo “anticorpo” é usado em seu sentido mais amplo, a menos que claramente indicado de forma diferente. Portanto, um “anticorpo” pode ser de ocorrência natural ou feito pelo homem como, por exemplo, anticorpos monoclonais produzidos por tecnologia de hibridoma convencional. Anticorpos para 158P1D7 compreendem anticorpos monoclonais e policlonais, além de fragmentos que contêm o domínio de ligação de antígeno e/ou uma ou mais regiões determinantes de complementaridade desses anticorpos. Como aqui usado, o termo “anticorpo” se refere a qualquer forma de anticorpo ou fragmento deste que liga especificamente 158P1D7 e/ou exibe a atividade biológica desejada e engloba especificamente anticorpos monoclonais (incluindo anticorpos monoclonais de comprimento total), anticorpos policlonais, anticorpos multiespecíficos (por exemplo, anticorpos biespecíficos) e fragmentos de anticorpo, desde que eles se liguem especificamente a 158P1D7 e/ou exibam a atividade biológica desejada. Qualquer anticorpo específico pode ser usado nos métodos e composições aqui fornecidas. Dessa forma, em uma modalidade, o termo “anticorpo” engloba uma molécula que compreende pelo menos uma região variável de uma molécula de imunoglobulina de cadeia leve e pelo menos uma região variável de uma molécula de cadeia pesada que, em combinação, formam a sítio de ligação específico para o antígeno-alvo. Em uma modalidade, o anticorpo é um anticorpo IgG. Por exemplo, o anticorpo é um anticorpo IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4. Os anticorpos úteis nos presentes métodos e composições podem ser gerados em cultura de células, em fago, ou em vários animais incluindo, sem limitação, vacas, coelhos, cabras, camundongos, ratos, hamsters, porquinhos-da-índia, carneiros, cães, gatos, macacos, chimpanzés e símios. Portanto, em uma modalidade, um anticorpo da presente invenção é um anticorpo de mamífero. Técnicas de fago podem ser usadas para isolar um anticorpo inicial ou para gerar variantes com especificidade ou características de avidez alteradas. Essas técnicas são rotineiras e bem conhecidas na técnica. Em uma modalidade, o anticorpo é produzido por meios recombinantes conhecidos na técnica. Por exemplo, um anticorpo recombinante pode ser produzido por transfecção de uma célula hospedeira com um vetor que compreende uma seqüência de DNA que codifica o anticorpo. Um ou mais vetores podem ser usados para transfectar a seqüência de DNA que expressa pelo menos uma região VL e uma região VH na célula hospedeira. Descrições exemplares de meios recombinantes de geração e produção de anticorpos incluem Delves, “ANTIBODY PRODUCTION: ESSENTIAL TECHNIQUES” (Wiley, 1997); Shephard, e cols., “MONOCLONAL ANTIBODIES” (Oxford University Press, 2000); Goding, “MONOCLONAL ANTIBODIES: PRINCIPLES AND PRACTICE” (Academic Press, 1993); e “CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY” (John Wiley & Sons, edição mais recente). Um anticorpo da presente invenção pode ser modificado por meios recombinantes para aumentar a eficácia do anticorpo na mediação da função desejada. Dessa forma, está dentro do escopo da invenção que anticorpos podem ser modificados por substituições com o uso de meios recombinantes. Tipicamente, as substituições serão substituições conservadoras. Por exemplo, pelo menos um aminoácido na região constante do anticorpo pode ser substituído com um resíduo diferente. Veja, por exemplo, a Patente U.S. N° 5.624.821, Patente U.S. N° 6.194.551, Pedido N° WO 9958572; e Angal, e cols. , Mol. Immunol. 30: 105-08 (1993). A modificação em aminoácidos inclui deleções, adições e substituições de aminoácidos. Em alguns casos, essas alterações são feitas para reduzir atividades indesejáveis, por exemplo, citotoxicidade complemento- dependente. Freqüentemente, os anticorpos são marcados por união, covalentemente ou não covalentemente, a uma substância que fornece um sinal detectável. Uma ampla variedade de marcadores e técnicas de conjugação é conhecida e relatada extensamente na literatura científica e de patentes. Esses anticorpos podem ser avaliados quanto à ligação à 158P1D7 normal ou defeituosa. Veja, por exemplo, “ANTIBODY ENGINEERING: A PRACTICAL APPROACH” (Oxford University Press, 1996). Anticorpos adequados com as atividades biológicas desejadas podem ser identificados usando os ensaios in vitro que incluem, sem limitação: ensaios de proliferação, migração, adesão, crescimento em ágar macio, angiogênese, comunicação célula-célula, apoptose, transporte, transdução de sinal, e ensaios in vivo como, por exemplo, a inibição do crescimento tumoral. Os anticorpos aqui fornecidos também podem ser úteis em aplicações diagnósticas. Como anticorpos de captura ou não neutralizantes, eles podem ser avaliados quanto à habilidade para se ligar ao antígeno específico sem inibição da atividade de ligação ao receptor ou biológica do antígeno. Como anticorpos neutralizantes, os anticorpos podem ser úteis em ensaios de ligação competitiva. Eles também podem ser usados para quantificar a 158P1D7 ou seu receptor.
[103] O termo “porção de ligação de antígeno” ou “fragmento de anticorpo” de um anticorpo (ou simplesmente “porção de anticorpo”), como aqui usado, se refere a um ou mais fragmentos de um anticorpo para 158P1D7 que retêm a habilidade para se ligar especificamente a um antígeno (por exemplo, 158P1D7 e variantes; Figura 1). Foi demonstrado que a função de ligação de antígeno de um anticorpo pode ser realizada por fragmentos de um anticorpo de comprimento total. Exemplos de fragmentos de ligação englobados dentro do termo “porção de ligação de antígeno” de um anticorpo incluem: (i) um fragmento Fab, um fragmento monovalente que consiste nos domínios VL, VH, CL e CH1; (ii) um fragmento F(ab’)2, um fragmento bivalente que compreende dois fragmentos Fab ligados por uma ponte dissulfeto na região de dobradiça; (iii) um fragmento Fd que consiste nos domínios VH e CH1; (iv) um fragmento Fv que consiste nos domínios VL e VH de um único braço de um anticorpo, (v) um fragmento dAb (Ward e cols., (1989) Nature 341: 544-546), que consiste em um domínio VH; e (vi) uma região determinante de complementaridade isolada (CDR). Além disso, embora os dois domínios do fragmento Fv, VL e VH, sejam codificados por genes separados, eles podem ser unidos, usando métodos recombinantes, por um vinculador sintético que permite que eles sejam feitos como uma cadeia única de proteína na qual as regiões VL e VH se pareiam para formar moléculas monovalentes (conhecidas como Fv de cadeia única (scFv); veja, por exemplo, Bird e cols. (1988) Science 242: 423-426; e Huston e cols. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85: 5.879-5.883). Esses anticorpos de cadeia única também estão englobados dentro do termo “porção de ligação de antígeno” de um anticorpo. Esses fragmentos de anticorpo são obtidos co o uso de metodologias convencionais conhecidas por aqueles habilitados na técnica, e os fragmentos são avaliados quanto à utilidade da mesma forma que são anticorpos intactos.
[104] Como aqui usado, qualquer forma do “antígeno” pode ser usada para gerar um anticorpo que é específico para 158P1D7. Dessa forma, o antígeno desencadeador pode ser um epitopo único, múltiplos epitopos ou toda a proteína isoladamente ou em combinação com um ou mais agentes intensificadores da imunogenicidade conhecidos na técnica. O antígeno desencadeador pode ser uma proteína de comprimento total isolada, uma proteína da superfície celular (por exemplo, imunização com células transfectadas com pelo menos uma porção do antígeno), ou uma proteína solúvel (por exemplo, imunização apenas com a porção do domínio extracelular da proteína). O antígeno pode ser produzido em uma célula geneticamente modificada. O DNA que codifica o antígeno pode ser genômico ou não genômico (por exemplo, cDNA) e codifica pelo menos uma porção do domínio extracelular. Como aqui usado, o termo “porção” se refere ao número mínimo de aminoácidos ou ácidos nucléicos, como adequado, para constituir um epitopo imunogênico do antígeno de interesse. Quaisquer vetores genéticos adequados à transformação das células de interesse podem ser empregados incluindo, sem limitação, vetores adenovirais, plasmídeos e vetores não virais, por exemplo, lipídeos catiônicos. Em uma modalidade, o anticorpo dos métodos e composições aqui apresentadas se ligam especificamente a pelo menos uma porção do domínio extracelular da 158P1D7 de interesse.
[105] Os anticorpos ou fragmentos de ligação de antígeno destes aqui fornecidos podem ser conjugados a um “agente bioativo”. Como aqui usado, o termo “agente bioativo” se refere a qualquer composto sintético ou de ocorrência natural que se liga ao antígeno e/ou intensifica ou medeia um efeito biológico desejado para aumentar as toxinas de morte celular. Em uma modalidade, os fragmentos de ligação úteis na presente invenção são fragmentos biologicamente ativos. Como aqui usado, o termo “biologicamente ativo” se refere a um anticorpo ou fragmento de anticorpo que é capaz se ligar ao epitopo antigênico desejado e direta ou indiretamente exercer um efeito biológico. Efeitos diretos incluem, sem limitação, a modulação, estimulação e/ou inibição de um sinal de crescimento, a modulação, estimulação e/ou inibição de um sinal antiapoptótico, a modulação, estimulação e/ou inibição de um sinal apoptótico ou necrótico, modulação, estimulação e/ou inibição da cascata de ADCC, e modulação, estimulação e/ou inibição da cascata de CDC.
[106] Anticorpos “biespecíficos” também são úteis nos presentes métodos e composições. Como aqui usado, o termo “anticorpo biespecífico” se refere a um anticorpo, tipicamente um anticorpo monoclonal, que possui especificidades de ligação por pelo menos dois epitopos antigênicos diferentes. Em uma modalidade, os epitopos são do mesmo antígeno. Em outra modalidade, os epitopos são de dois antígenos diferentes. Métodos para a produção de anticorpos biespecíficos são conhecidos na técnica. Por exemplo, anticorpos biespecíficos podem ser produzidos de forma recombinante com o uso da co-expressão de dois pares de cadeia pesada/cadeia leve de imunoglobulina. Veja, por exemplo, Milstein e cols., Nature 305: 537-39 (1983). Alternativamente, anticorpos biespecíficos podem ser preparados com o uso de ligação química. Veja, por exemplo, Brennan, e cols., Science 229:81 (1985). Anticorpos biespecíficos incluem fragmentos de anticorpo biespecífico. Veja, por exemplo, Hollinger, e cols., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90: 6.444-48 (1993), Gruber, e cols., J. Immunol. 152: 5.368 (1994).
[107] Os anticorpos monoclonais aqui descritos incluem especificamente anticorpos “quiméricos” nos quais uma porção da cadeia pesada e/ou leve é idêntica ou homóloga às seqüências correspondentes em anticorpos derivados de uma espécie particular ou que pertencem a uma classe ou subclasse de anticorpo particular, enquanto o restante da(s) cadeia(s) é idêntico ou homólogo às seqüências correspondentes em anticorpos derivados de outra espécie ou que pertencem a outra classe ou subclasse de anticorpo, bem como fragmentos desses anticorpos, desde que se liguem especificamente ao antígeno-alvo e/ou exibam a atividade biológica desejada (Patente U.S. N° 4.816.567; e Morrison e cols., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81: 6.851-6.855 (1984)).
[108] O termo “agente quimioterápico” se refere a todos os compostos químicos que são eficazes na inibição do crescimento tumoral. Exemplos não limitantes de agentes quimioterápicos incluem agentes alquilantes; por exemplo, mostardas nitrogenadas, compostos de etilenoimina e alquil sulfonatos; antimetabólitos, por exemplo, antagonistas de ácido fólico, purina ou pirimidina; inibidores mitóticos, por exemplo, agentes anti-tubulina, por exemplo, alcalóides da vinca, auristatinas e derivados de podofilotoxina; antibióticos citotóxicos; compostos que danificam ou interferem com a expressão ou replicação de DNA, por exemplo, aglutinantes do sulco menor de DNA; e antagonistas do receptor do fator de crescimento. Além disso, agentes quimioterápicos incluem agentes citotóxicos (como aqui definidos), anticorpos, moléculas biológicas e pequenas moléculas.
[109] O termo “composto” se refere e engloba o próprio composto químico, bem como, esteja estabelecido explicitamente ou não, e a menos que o contexto torne claro que o seguinte deva ser excluído, formas amorfas e cristalinas do composto, incluindo formas polimórficas, nas quais essas formas podem ser parte de uma mistura ou em isolamento; formas de ácido livre e base livre do composto, que são tipicamente as formas mostradas nas estruturas aqui fornecidas; isômeros do composto, que se referem aos isômeros ópticos e isômeros tautoméricos, em que isômeros ópticos incluem enantiômeros e diastereômeros, isômeros quirais e isômeros não quirais, e os isômeros ópticos incluem isômeros ópticos isolados, bem como misturas de isômeros ópticos, incluindo misturas racêmicas e não racêmicas; em que um isômero pode estar em forma isolada ou em uma mistura com um ou mais outros isômeros; isótopos do composto, incluindo compostos que contêm deutério e trítio, e incluindo compostos que contêm radioisótopos, incluindo radioisótopos terapeuticamente e diagnosticamente eficazes; formas multiméricas do composto, incluindo formas diméricas, triméricas etc.; sais do composto, preferivelmente sais farmaceuticamente aceitáveis, incluindo sais de adição ácida e sais de adição básica, incluindo sais que possuem contra-íons orgânicos e contra- íons inorgânicos, e incluindo formas zwitteriônicas, nas quais um composto está associado a dois ou mais contra- íons, os dois ou mais contra-íons podendo ser iguais ou diferentes; e solvatos do composto, incluindo hemissolvatos, monossolvatos, dissolvatos etc., incluindo solvatos orgânicos e solvatos inorgânicos, os referidos solvatos inorgânicos incluindo hidratos; em que, se um composto está associado a duas ou mais moléculas de solvente, as duas ou mais moléculas de solvente podem ser iguais ou diferentes. Em alguns casos, referência aqui feita a um composto da invenção incluirá uma referência explícita a uma ou mais das formas acima, por exemplo, sais e/ou solvatos; no entanto, essa referência é somente para ênfase, e não deve ser considerada como excluindo outras das formas acima, como identificadas acima.
[110] Os termos “região determinante de complementaridade” e “CDR” são conhecidos na técnica por se referirem a seqüências de aminoácidos não contíguas dentro das regiões variáveis do anticorpo, que conferem especificidade e afinidade de ligação de antígeno. Em geral, há três (3) CDRs em cada região variável da cadeia pesada (CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3) e três (3) CDRs em cada região variável da cadeia leve (CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3).
[111] Os limites precisos da seqüência de aminoácidos de certa CDR podem ser facilmente determinados usando qualquer entre diversos esquemas bem conhecidos, incluindo aqueles descritos por Kabat e cols. (1991), “Sequences of Proteins of Immunological Interest”, 5a Edição, “Public Health Service”, “National Institutes of Health”, Bethesda, MD (esquema de numeração de “Kabat”), Al-Lazikani e cols., (1997) JMB 273, 927-948 (esquema de numeração de “Chotia”), MacCallum e cols., J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996), “Antibody-Antigen Interações: Contact Analysis and Binding Site Topography”, J. Mol. Biol. 262, 732-745”. (esquema de numeração de “Contact”), Lefranc M.P. e cols., “EVIGT Unique Numbering for Immunoglobulin and T Cell Receptor Variable Domains and Ig Superfamily V-Like Domains”, Dev. Comp. Immunol., Janeiro de 2003; 27 (1): 55-77 (esquema de numeração de “IMGT”), e Honegger A. e Pliickthun A., “Yet Another Numbering Scheme for Immunoglobulin Variable Domains: an Automatic Modeling and Analysis Tool”, J. Mol. 111.1, 8 de janeiro de 2001; 309 (3): 657-70, (esquema de numeração AHo).
[112] Os limites de certa CDR podem variar dependendo do esquema usado para identificação. Por exemplo, o esquema de Kabat se baseia em alinhamentos estruturais, enquanto o esquema de Chotia se baseia em informação estrutural. A numeração para ambos os esquemas de Kabat e Chotia se baseia nos comprimentos de seqüência da região de anticorpo mais comuns, com inserções acomodadas por inserção de letras, por exemplo, “30a”, e deleções que aparecem em alguns anticorpos. Os dois esquemas colocam certas inserções e deleções (“indels”) em posições diferentes, que resultam em numeração diferencial. O esquema de Contact se baseia na análise de estruturas cristais complexas e é similar em muitos aspectos ao esquema de numeração de Chotia. A Tabela V, infra, lista as posições de CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3 e CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, como identificadas pelos esquemas de Kabat, Chotia e Contact, respectivamente. Para CDR-H1, a numeração de resíduos é listada usando os esquemas de numeração de Kabat e Chotia.
[113] Dessa forma, a menos que especificado de forma diferente, os termos “CDR” e “região determinante de complementaridade” de certo anticorpo ou região deste, por exemplo, uma região variável, além de CDRs individuais (por exemplo, CDR-H1, CDR-H2) do anticorpo ou região deste, deve ser subentendido como englobando a região determinante de complementaridade como definida por qualquer um dos esquemas conhecidos aqui descritos acima. Em alguns casos, o esquema para identificação de uma CDR ou CDRs particulares é especificado, por exemplo, a CDR como definida pelo método de Kabat, Chotia ou Contact. Em outros casos, a seqüência de aminoácidos particular de uma CDR é apresentada.
[114] Como aqui usado, o termo “substituição conservadora” se refere às substituições de aminoácidos que são conhecidas por aqueles habilitados na técnica e podem ser feitas geralmente sem alteração da atividade biológica da molécula resultante. Aqueles habilitados na técnica reconhecem que, em geral, substituições de aminoácidos únicas em regiões não essenciais de um polipeptídeo não alteram substancialmente a atividade biológica (veja, por exemplo, Watson, e cols., “MOLECULAR BIOLOGY OF THE GENE”, The Benjamin/Cummings Pub. Co., página 224 (4 a Edição, 1987)). Essas substituições exemplares são feitas preferivelmente de acordo com aquelas descritas na Tabela II e nas Tabelas III (a-b). Por exemplo, essas alterações incluem a substituição de qualquer de isoleucina (I), valina (V) e leucina (L) para qualquer outros desses aminoácidos hidrofóbicos; ácido aspártico (D) para ácido glutâmico (E) e vice-versa; glutamina (Q) para asparagina (N) e vice-versa; e serina (S) para treonina (T) e vice- versa. Outras substituições também podem ser consideradas conservadoras, dependendo do ambiente do aminoácido particular e de seu papel na estrutura tridimensional da proteína. Por exemplo, glicina (G) e alanina (A) podem freqüentemente ser intercambiáveis, bem como alanina (A) e valina (V). Metionina (M), que é relativamente hidrofóbica, pode freqüentemente ser intercambiável com leucina e isoleucina, e algumas vezes com valina. Lisina (K) e arginina (R) são freqüentemente intercambiáveis em localizações nas quais a característica significante do resíduo de aminoácido e sua charge e as pK’s diferentes desses dois resíduos de aminoácidos não são significantes. Ainda outras alterações podem ser consideradas “conservadoras” em ambientes particulares (veja, por exemplo, a Tabela III (a) aqui apresentada; páginas 13-15, “Biochemistry” 2a Edição, Lubert Stryer Ed. (Stanford University); Henikoff e cols., PNAS 1992 Vol. 89 10.915 10.919; Lei e cols., J. Biol. Chem., 19 de maio de 1995; 270 (20): 11.882-6). Outras substituições também são permissíveis e podem ser determinadas empiricamente ou de acordo com substituições conservadoras conhecidas.
[115] O termo “agente citotóxico” se refere a uma substância que inibe ou evita a atividade de expressão de células, função de células e/ou causa a destruição de células. O termo visa incluir isótopos radioativos, agentes quimioterápicos e toxinas como, por exemplo, toxinas de pequena molécula ou toxinas enzimaticamente ativas de origem bacteriana, fúngica, vegetal ou animal, incluindo fragmentos e/ou variantes destas. Exemplos de agentes citotóxicos incluem, sem limitação, auristatinas (por exemplo, auristatina E, auristatina F, MMAE e MMAF), auromicinas, maitansinóides, ricina, ricina cadeia-A, combrestatina, duocarmicinas, dolastatinas, doxorrubicina, daunorrubicina, taxóis, cisplatina, cc1065, brometo de etídio, mitomicina, etoposida, tenoposida, vincristina, vinblastina, colchicina, diidróxi antracina diona,actinomicina, toxina diftérica, exotoxina de Pseudomonas (PE) A, PE40, abrina, cadeia A de abrina, cadeia A de modecina, alfa-sarcina, gelonina, mitogelina,restrictocina, fenomicina, enomicina, curicina, crotina, caliqueamicina, inibidor de Saponaria officinalis, e glicocorticóide e outros agentes quimioterápicos, além de radioisótopos como, por exemplo, At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212 ou Bi213, P32 e isótopos radioativos de Lu, incluindo Lu177. Anticorpos também podem ser conjugados a uma enzima de ativação de pró-fármaco anticâncer capaz de converter o pró-fármaco em sua forma ativa.
[116] Como aqui usado, o termo “diabodies” se refere aos pequenos fragmentos de anticorpo com dois sítios de ligação de antígeno, cujos fragmentos compreendem um domínio variável da cadeia pesada (VH) conectado a um domínio variável da cadeia leve (VL) na mesma cadeia de polipeptídeo (VH-VL). Utilizando-se um vinculador que seja muito curto para permitir o pareamento entre os dois domínios na mesma cadeia, os domínios são forçados a parear com os domínios de complementaridade de outra cadeia e criar dois sítios de ligação de antígeno. Diabodies são descritos mais totalmente, por exemplo, em EP 404.097; WO 93/11161; e Hollinger e cols., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90: 6.444-48 (1993).
[117] O termo “depletar”, no contexto do efeito de um agente de ligação de 158P1D7 em células que expressam 158P1D7, se refere a uma redução no número ou eliminação das células que expressam 158P1D7.
[118] O termo “produto gênico” é aqui usado para indicar um peptídeo/proteína ou mRNA. Por exemplo, um “produto gênico da invenção” é algumas vezes aqui denominado uma “seqüência de aminoácidos de câncer”, “proteína de câncer”, “proteína de um câncer listado na Tabela I”, um “mRNA de câncer”, “mRNA de um câncer listado na Tabela I” etc. Em uma modalidade, a proteína de câncer é codificada por um ácido nucléico da Figura 1. A proteína de câncer pode ser um fragmento ou, alternativamente, ser a proteína de comprimento total codificada por ácidos nucléicos da Figura 1. Em uma modalidade, uma seqüência de aminoácidos de câncer é usada para determinar a identidade ou similaridade de seqüência. Em outra modalidade, as seqüências são variantes alélicas de ocorrência natural variantes alélicas de uma proteína codificada por um ácido nucléico da Figura 1. Em outra modalidade, as seqüências são variantes de seqüência, como posteriormente aqui descritas.
[119] Anticorpos “heteroconjugados” são úteis nos presentes métodos e composições. Como aqui usado, o termo “anticorpo heteroconjugado” se refere a dois anticorpos unidos covalentemente. Esses anticorpos podem ser preparados com o uso de métodos conhecidos em química sintética de proteínas, incluindo a utilização de agentes de reticulação. Veja, por exemplo, a Patente U.S. N° 4.676.980.
[120] O termo “homólogo” se refere a uma molécula que exibe homologia para outra molécula, por exemplo, por ter seqüências de resíduos químicos que são iguais ou similares em posições correspondentes.
[121] Em uma modalidade, o anticorpo aqui fornecido é um “anticorpo humano”. Como aqui usado, o termo “anticorpo humano” se refere a um anticorpo no qual basicamente toda as seqüências das seqüências da cadeia leve e cadeia pesada, incluindo as regiões determinantes de complementaridade (CDRs), são de genes humanos. Em uma modalidade, anticorpos monoclonais humanos são preparados pela técnica de trioma, a técnica de célula B humana (veja, por exemplo, Kozbor, e cols., Immunol. Today 4: 72 (1983),técnica de transformação de EBV (veja, por exemplo, Cole e cols. “MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY”, 77-96 (1985)), ou usando apresentação em fago (veja, por exemplo, Marks e cols., J. Mol. Biol. 222: 581 (1991)). Em uma modalidade específica, o anticorpo humano é gerado em um camundongo transgênico. Metodologias para a produção desses anticorpos parcial a totalmente humanos são conhecidas na técnica e qualquer uma dessas metodologias pode ser usada. De acordo com uma modalidade particularmente preferida, seqüências de anticorpo totalmente humanas são feitas em um camundongo transgênico modificado geneticamente para expressar genes de anticorpo de cadeia pesada e leve humanos. Uma descrição exemplar de preparação de camundongos transgênicos que produzem anticorpos humanos é encontrada no Pedido N° WO 02/43478 e Patente U.S. 6.657.103 (Abgenix) e sua prole. Células B de camundongos transgênicos que produzem o anticorpo desejado podem então ser fundidas para produzir linhagens de células de hibridoma para produção contínua do anticorpo. Veja, por exemplo, Patentes U.S. Nos 5.569.825, 5.625.126, 5.633.425, 5.661.016 e 5.545.806; e Jakobovits, Adv. Drug Del. Rev. 31: 33-42 (1998); Green, e cols., J. Exp. Med. 188: 483-95 (1998).
[122] Como aqui usado, o termo “anticorpo humanizado” se refere às formas de anticorpos que contêm seqüências de anticorpos não humanos (por exemplo, murídeos), além de anticorpos humanos. Esses anticorpos são anticorpos quiméricos que contêm seqüência mínima derivada de imunoglobulina não humana. Em geral, o anticorpo humanizado compreenderá substancialmente tudo de pelo menos um, e tipicamente dois, domínios variáveis, nos quais todas ou substancialmente todas as alças hipervariáveis correspondem àquelas de uma imunoglobulina não humana e todas ou substancialmente todas as regiões FR são aquelas de uma seqüência de imunoglobulina humana. O anticorpo humanizado opcionalmente também compreenderá pelo menos uma porção de uma região constante de imunoglobulina (Fc), tipicamente aquela de uma imunoglobulina humana. Veja, por exemplo, Cabilly, Patente U.S. N° 4.816.567; Queen e cols. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86: 10.029-10.033; e “ANTIBODY ENGINEERING: A PRACTICAL APPROACH” (Oxford University Press 1996).
[123] Os termos “inibir” ou “inibição de”, como aqui usado, significa reduzir por uma quantidade mensurável, ou evitar inteiramente.
[124] As frases “isolado” ou “biologicamente puro” se referem a um material que é substancialmente ou basicamente livre de componentes que normalmente acompanham o material como ele é encontrado em seu estado nativo. Dessa forma, peptídeos isolados de acordo com a invenção preferivelmente não contêm materiais normalmente associados aos peptídeos em seu ambiente in situ. Por exemplo, um polinucleotídeo é considerado como sendo “isolado” quando está substancialmente separado de polinucleotídeos contaminantes que correspondem ou são complementares aos genes diferentes dos genes de 158P1D7 ou que codificam polipeptídeos diferentes de produto do gene de 158P1D7 ou fragmentos destes. Aqueles habilitados na técnica podem facilmente empregar procedimentos de isolamento de ácido nucléico para obter um polinucleotídeo 158P1D7 isolado. Uma proteína é considerada como sendo “isolada”, por exemplo, quando métodos físicos, mecânicos ou químicos são empregados para remover as proteínas 158P1D7 de constituintes celulares que estão normalmente associados à proteína. Aqueles habilitados na técnica podem facilmente empregar métodos de purificação padronizados para obter uma proteína 158P1D7 isolada. Alternativamente, uma proteína isolada pode ser preparada por meios químicos.
[125] “Marcadores” adequados incluem radionuclídeos, enzimas, substratos, co-fatores, inibidores, porções fluorescentes, porções quimioluminescentes, partículas magnéticas, e semelhantes. Patentes que ensinam o uso desses marcadores incluem as Patentes U.S. Nos 3.817.837, 3.850.752, 3.939.350, 3.996.345, 4.277.437, 4.275.149 e 4.366.241. Além disso, os anticorpos aqui fornecidos podem ser úteis como o componente de ligação de antígeno de anticorpos fluorescentes (fluorbodies). Veja, por exemplo, Zeytun e cols., Nat. Biotechnol. 21: 1.473-79 (2003).
[126] O termo “mamífero” se refere a qualquer organismo classificado como um mamífero, incluindo camundongos, ratos, coelhos, cães, gatos, vacas, cavalos e humanos. Em uma modalidade da invenção, o mamífero é um camundongo. Em outra modalidade da invenção, o mamífero é um humano.
[127] Os termos “câncer metastático” e “doença metastática” significam cânceres que se disseminaram para linfonodos regionais ou para locais distantes, e visam incluir doença em estágio D sob o sistema da AUA e estágio TxNxM+ sob o Sistema TNM.
[128] Os termos “modulador” ou “composto de teste” ou “fármaco candidato” ou equivalentes gramaticais como aqui usados descrevem qualquer molécula, por exemplo, proteína, oligopeptídeo, pequena molécula orgânica, polissacarídeo, polinucleotídeo etc., a ser testada quanto à capacidade para alterar direta ou indiretamente o fenótipo de câncer ou a expressão de uma seqüência de câncer, por exemplo, seqüências de ácido nucléico ou proteína, ou efeitos das seqüências de câncer (por exemplo, sinalização, expressão do gene, interação da proteína etc.). Em um aspecto, um modulador neutralizará o efeito de uma proteína de câncer da invenção. O termo “neutralizar” significa que uma atividade de uma proteína é inibida ou bloqueada, juntamente com o efeito conseqüente sobre a célula. Em outro aspecto, um modulador neutralizará o efeito de um gene, e sua proteína correspondente, da invenção por normalização dos níveis da referida proteína. Em modalidades preferidas, moduladores alteram os perfis de expressão, ou perfil de expressão de ácidos nucléicos ou proteínas aqui fornecidas, ou vias efetoras downstream. Em uma modalidade, o modulador suprime um fenótipo de câncer, por exemplo, para uma impressão digital tecidual normal. Em outra modalidade, um modulador induz um fenótipo de câncer. Geralmente, diversas misturas de ensaio são processadas em paralelo com diferentes concentrações de agente para obter uma resposta diferencial às várias concentrações. Tipicamente, uma dessas concentrações serve como um controle negativo, ou seja, em concentração zero ou abaixo do nível de detecção.
[129] Moduladores, fármaco candidatos, ou compostos de teste englobam diversas classes químicas, embora tipicamente sejam moléculas orgânicas, preferivelmente pequenos compostos orgânicos que possuem um peso molecular de mais do que 100 e menos do que cerca de 2.500 Dáltons. Pequenas moléculas preferidas possuem menos do que 2.000, ou menos do que 1.500 ou menos do que 1.000 ou menos do que 500 D. Agentes candidatos compreendem grupos funcionais necessários à interação estrutural com proteínas, particularmente ligação hidrogênio, e tipicamente incluem pelo menos um grupo amina, carbonil, hidroxil ou carboxil, preferivelmente pelo menos dois dos grupos químicos funcionais. Os agentes candidatos freqüentemente compreendem estruturas de carbono cíclicas ou heterocíclicas e/ou estruturas aromáticas ou poliaromáticas substituídas com um ou mais dos grupos funcionais acima. Moduladores também compreendem biomoléculas como, por exemplo, peptídeos, sacarídeos, ácidos graxos, esteróides, purinas, pirimidinas, derivados, análogos estruturais ou combinações destes. São particularmente preferidos peptídeos. Uma classe de moduladores consiste em peptídeos, por exemplo, de cerca de cinco a cerca de 35 aminoácidos, com de cerca de cinco a cerca de 20 aminoácidos sendo preferido, e de cerca de 7 a cerca de 15 sendo particularmente preferido. De preferência, a proteína moduladora de câncer é solúvel, inclui uma região não transmembrana, e/ou possui uma Cys no terminal N para auxiliar na solubilidade. Em uma modalidade, o terminal C do fragmento é mantido como um ácido livre e o terminal N é uma amina livre para auxiliar no acoplamento, ou seja, à cisteína. Em uma modalidade, a proteína de câncer da invenção é conjugada a um agente imunogênico como aqui discutido. Em uma modalidade, a proteína de câncer é conjugada a BSA. Os peptídeos da invenção, por exemplo, de comprimentos preferidos, podem ser ligados uns aos outros ou a outros aminoácidos para criar um peptídeo/proteína mais longa. Os peptídeos moduladores podem ser digestos de proteínas de ocorrência natural, como descrito acima, peptídeos aleatórios, ou peptídeos aleatórios “tendenciosos”. Em uma modalidade preferida, moduladores à base de peptídeo/proteína são anticorpos, e fragmentos destes, como aqui definidos.
[130] O termo “anticorpo monoclonal”, como aqui usado, se refere a um anticorpo obtido de uma população substancialmente homogênea de anticorpos, ou seja, os anticorpos individuais que compreendem a população são idênticos, exceto por possíveis mutações de ocorrência natural que podem estar presentes em pequenas quantidades. Anticorpos monoclonais são altamente específicos, sendo dirigidos contra um único epitopo antigênico. Em contraste, preparações de anticorpos convencionais (policlonais) tipicamente incluem diversos anticorpos dirigidos contra (ou específicos para) epitopos diferentes. Em uma modalidade, o anticorpo policlonal contém diversos anticorpos monoclonais com especificidades, afinidades ou avidezes de epitopo diferentes dentro de um único antígeno que contém múltiplos epitopos antigênicos. O modificador “monoclonal” indica o caráter do anticorpo como sendo obtido de uma população substancialmente homogênea de anticorpos, e não deve ser considerado como necessitando da produção do anticorpo por qualquer método particular. Por exemplo, os anticorpos monoclonais a serem usados de acordo com a presente invenção podem ser feitos pelo método de hibridoma descrito primeiro por Kohler e cols., Nature 256: 495 (1975), ou podem ser feitos por métodos de DNA recombinante (veja, por exemplo, a Patente U.S. N° 4.816.567), Os “anticorpos monoclonais” também podem ser isolados de bibliotecas em fago de anticorpos com o uso das técnicas descritas em Clackson e cols., Nature 352: 624628 (1991) e Marks e cols., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1991), por exemplo. Esses anticorpos monoclonais normalmente se ligarão com pelo menos uma Kd de cerca de 1 μM, mais normalmente pelo menos cerca de 300 nM, tipicamente pelo menos cerca de 30 nM, preferivelmente pelo menos cerca de 10 nM, mais preferivelmente pelo menos cerca de 3 nM ou melhor, normalmente determinado por ELISA.
[131] Um “excipiente farmacêutico” compreende um material como, por exemplo, um adjuvante, um veículo, agentes de ajuste do pH e de tamponamento, agentes de ajuste da tonicidade, agentes umidificantes, conservante, e semelhantes.
[132] O termo “farmaceuticamente aceitável” se refere a uma composição atóxica, inerte, que é fisiologicamente compatível com humanos ou outros mamíferos.
[133] O termo “polinucleotídeo” significa uma forma polimérica de nucleotídeos de pelo menos 10 bases ou pares de bases de comprimento, ribonucleotídeos ou desoxinucleotídeos, ou uma forma modificada de qualquer tipo de nucleotídeo, e visa incluir formas de fita simples e dupla de DNA e/ou RNA. Na técnica, esse termo é freqüentemente usado de forma intercambiável com “oligonucleotídeo”. Um polinucleotídeo pode compreender uma seqüência de nucleotídeos aqui revelada, em que timidina (T), como mostrado, por exemplo, na Figura 1, também pode ser uracil (U); essa definição está relacionada às diferenças entre as estruturas químicas de DNA e RNA, em particular à observação de que uma das quatro bases principais no RNA é uracil (U) ao invés de timidina (T).
[134] O termo “polipeptídeo” significa um polímero de pelo menos cerca de 4, 5, 6, 7 ou 8 aminoácidos. Ao longo do relatório descritivo, são usadas designações padronizadas de três letras (veja a Tabela III) ou de uma única letra para aminoácidos. Na técnica, esse termo é freqüentemente usado de forma intercambiável com “peptídeo” ou “proteína”.
[135] Uma molécula de DNA ou RNA “recombinante” é uma molécula de DNA ou RNA que foi submetida à manipulação molecular in vitro.
[136] Como aqui usado, o termo “Fv de cadeia única” ou “scFv” ou anticorpo de “cadeia única” se refere aos fragmentos de anticorpo que compreendem os domínios VH e VL de anticorpo, em que esses domínios estão presentes em uma cadeia única de polipeptídeo. Geralmente, o polipeptídeo Fv ainda compreende um vinculador de polipeptídeo entre os domínios VH e VL, o que permite que o sFv forme a estrutura desejada para ligação de antígeno. Para uma revisão de sFv, veja Pluckthun, “THE PHARMACOLOGY OF MONOCLONAL ANTIBODIES”, vol. 113, Rosenburg e Moore eds. SpringerVerlag, Nova York, páginas 269-315 (1994).
[137] Como aqui usados, os termos “específico”, “que se liga especificamente” e “se liga especificamente” se referem à ligação seletiva do anticorpo ao epitopo do antígeno-alvo. Anticorpos podem ser testados quanto à especificidade de ligação por comparação da ligação ao antígeno apropriado com a ligação a um antígeno ou mistura de antígenos irrelevante sob certo conjunto de condições. Se o anticorpo se liga ao antígeno apropriado pelo menos 2, 5, 7 e preferivelmente 10 vezes mais do que ao antígeno ou mistura de antígenos irrelevante, então ele é considerado como sendo específico. Em uma modalidade, um anticorpo específico é aquele que se liga somente ao antígeno de 158P1D7, mas não se liga ao antígeno irrelevante. Em outra modalidade, um anticorpo específico é aquele que se liga ao antígeno de 158P1D7 humana, mas não se liga a um antígeno de 158P1D7 não humana com 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de homologia de aminoácidos com o antígeno de 158P1D7. Em outra modalidade, um anticorpo específico que se liga ao antígeno de 158P1D7 humana e se liga ao antígeno de 158P1D7 murídea, mas com um grau maior de ligação ao antígeno humano. Em outra modalidade, um anticorpo específico que se liga ao antígeno de 158P1D7 humana e se liga ao antígeno de 158P1D7 de primata, mas com um grau maior de ligação ao antígeno humano. Em outra modalidade, o anticorpo específico se liga ao antígeno de 158P1D7 humana e a qualquer antígeno de 158P1D7 não humana, mas com um grau maior de ligação ao antígeno humano, ou qualquer combinação destes.
[138] Como aqui usado, o termo “tratar” ou “terapêutico” e termos gramaticais relacionados se referem a qualquer melhora de qualquer conseqüência de doença, por exemplo, sobrevida prolongada, menos morbidade e/ou uma redução de efeitos colaterais que são os subprodutos de uma modalidade terapêutica alternativa; como é facilmente observado na técnica, a erradicação plena da doença é preferida, mas, no entanto, não é uma exigência para um ato de tratamento.
[139] O termo “variante” se refere a uma molécula que exibe uma variação de um tipo ou norma descrita, por exemplo, uma proteína que possui um ou mais resíduos de aminoácidos diferentes na posição (ou posições) correspondente de uma proteína especificamente descrita (por exemplo, a proteína 158P1D7 mostrada na Figura 1). Um análogo é um exemplo de uma proteína variante. Isoformas de junção e polimorfismos de nucleotídeos únicos (SNPs) são exemplos adicionais de variantes.
[140] As “proteínas 158P1D7” e/ou “proteínas relacionadas à 158P1D7” da invenção incluem aquelas especificamente aqui identificadas (veja a Figura 1), além de variantes alélicas, variantes de substituição conservadora, análogos e homólogos que podem ser isolados/gerados e caracterizados sem experimentação indevida seguindo os métodos aqui descritos ou facilmente disponíveis na técnica. Proteínas de fusão que combinam partes de proteínas 158P1D7 diferentes ou fragmentos destas, além de proteínas de fusão de uma proteína 158P1D7 e um polipeptídeo heterólogo também estão incluídas. Essas proteínas 158P1D7 são coletivamente denominadas as proteínas relacionadas à 158P1D7, as proteínas da invenção ou 158P1D7. O termo “proteína relacionada à 158P1D7” se refere a um fragmento de polipeptídeo ou uma seqüência da proteína 158P1D7 de 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 ou mais do que 25 aminoácidos; ou, pelo menos 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 330, 335, 345, 355, 365, 375, 385, 395, 405, 425, 450, 475, 500, 525, 550, 575, 600, 625, 650, 675, 700, 725, 750, 775, 800, 825, 830, 835, 840, 841 ou mais aminoácidos.
II) Anticorpos para 158P1D7
[141] Outro aspecto da invenção fornece anticorpos que se ligam às proteínas relacionadas à 158P1D7 (veja Figura 1) . Em uma modalidade, o anticorpo que se liga às proteínas relacionadas à 158P1D7 é um anticorpo que se liga especificamente à proteína 158P1D7, que compreende a seqüência de aminoácidos do ID. DE SEQ. N°: 2. O anticorpo que se liga especificamente à proteína 158P1D7, que compreende a seqüência de aminoácidos do ID. DE SEQ. N°: 2, inclui anticorpos que podem ser ligar a outras proteínas relacionadas à 158P1D7. Por exemplo, anticorpos que se ligam à proteína 158P1D7 que compreendem a seqüência de aminoácidos do ID. DE SEQ. N°: 2 podem se ligar às proteínas relacionadas à 158P1D7, por exemplo, variantes de 158P1D7 e os homólogos ou análogos destas.
[142] Os anticorpos para 158P1D7 da invenção são particularmente úteis em ensaios prognósticos, imageamento, metodologias diagnósticas e terapêuticas para o câncer (veja, por exemplo, a Tabela I). Similarmente, esses anticorpos são úteis no tratamento e/ou prognóstico de câncer da bexiga e outros cânceres, na medida em que 158P1D7 também é expressa ou superexpressa nesses outros cânceres. Além disso, os anticorpos para 158P1D7 da invenção são terapeuticamente úteis no tratamento de cânceres nos quais a expressão de 158P1D7 está envolvida, especialmente câncer da bexiga, por exemplo, cânceres avançados ou metastáticos da bexiga, quando os anticorpos são conjugados à monometil-auristatina E (MMAE) aqui descritos.
[143] Vários métodos para a preparação de anticorpos, especificamente anticorpos monoclonais, são bem conhecidos na técnica. Por exemplo, anticorpos podem ser preparados por imunização de um hospedeiro mamífero adequado usando uma proteína, peptídeo ou fragmento relacionado à 158P1D7, em forma isolada ou imunoconjugada (“Antibodies: A Laboratory Manual”, CSH Press, Eds., Harlow, e Lane (1988); Harlow, “Antibodies”, Cold Spring Harbor Press, NY (1989)). Além disso, proteínas de fusão de 158P1D7 também podem ser usadas, por exemplo, uma fusão 158P1D7-proteína GST. Em uma modalidade particular, uma proteína de fusão de GST que compreende toda ou a maior parte da seqüência de aminoácidos da Figura 1 é produzida, e depois usada como um imunógeno para gerar anticorpos apropriados. Em outra modalidade, uma proteína relacionada à 158P1D7 é sintetizada e usada como um imunógeno.
[144] Além disso, metodologias de imunização com DNA desnudo (naked) conhecidas na técnica são usadas (com ou sem proteína relacionada à 158P1D7 purificada ou células que expressam 158P1D7) para gerar uma resposta imune ao imunógeno codificado (para uma revisão, veja Donnelly e cols., 1997, Ann. Rev. Immunol. 15: 617-648).
[145] A seqüência de aminoácidos de uma proteína 158P1D7 como mostrada na Figura 1 pode ser analisada para selecionar regiões específicas da proteína 158P1D7 para a geração de anticorpos. Por exemplo, análises de hidrofobicidade e hidrofilicidade de uma seqüência de aminoácidos de 158P1D7 são usadas para identificar regiões hidrofílicas na estrutura de 158P1D7. Regiões de uma proteína 158P1D7 que mostram estrutura imunogênica, além de outras regiões e domínios, podem facilmente ser identificadas com o uso de vários outros métodos conhecidos na técnica, por exemplo, análise de Chou-Fasman, Garnier- Robson, Kyte-Doolittle, Eisenberg, Karplus-Schultz ou Jameson-Wolf. Perfis de hidrofilicidade podem ser gerados usando o método de Hopp, T.P. e Woods, K.R., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78: 3.824-3.828. Perfis de hidropaticidade podem ser gerados usando o método de Kyte, J. e Doolittle, R.F., 1982, J. Mol. Biol. 157: 105-132. Perfis de percentual (%) de resíduos acessíveis podem ser gerados usando o método de Janin J., 1979, Nature 277: 491492. Perfis de flexibilidade média podem ser gerados usando o método de Bhaskaran R., Ponnuswamy P.K., 1988, Int. J. Pept. Protein Res. 32: 242-255. Perfis de Beta-turn podem ser gerados usando o método de Deleage, G., Roux B., 1987, Protein Engineering 1: 289-294. Dessa forma, cada região identificada por qualquer um desses programas ou métodos está dentro do escopo da presente invenção. Métodos preferidos para a geração de anticorpos para 158P1D7 são ainda ilustrados por meio dos exemplos aqui fornecidos. Métodos para a preparação de uma proteína ou polipeptídeo para uso como um imunógeno são bem conhecidos na técnica.Também são conhecidos na técnica métodos para a preparação de conjugados imunogênicos de uma proteína com um veículo, por exemplo, BSA, KLH ou outra proteína transportadora. Em algumas circunstâncias, a conjugação direta usando, por exemplo, reagentes de carbodiimida, é usada; em outros casos, reagentes de ligação, tais como aqueles fornecidos por Pierce Chemical Co., Rockford, IL, são eficazes. A administração de um imunógeno de 158P1D7 é freqüentemente realizada por injeção ao longo de um período de tempo adequado e com uso de um adjuvante adequado, como é conhecido na técnica. Durante o esquema de imunização, titulações de anticorpos podem ser feitas para determinar a adequação da formação do anticorpo.
[146] Anticorpos monoclonais para 158P1D7 podem ser produzidos por vários meios bem conhecidos na técnica. Por exemplo, linhagens de células imortalizadas que secretam um anticorpo monoclonal desejado são preparadas usando a tecnologia de hibridoma padronizada de Kohler e Milstein ou modificações que imortalizam células B produtoras de anticorpos, como é geralmente conhecido. Linhagens de células imortalizadas que secretam os anticorpos desejados são avaliadas por imunoensaio no qual o antígeno é uma proteína relacionada à 158P1D7. Quando uma cultura de células imortalizadas apropriada é identificada, as células podem ser expandidas e anticorpos produzidos a partir de culturas in vitro ou e fluido ascítico.
[147] Os anticorpos ou fragmentos da invenção também podem ser produzidos por meios recombinantes. Regiões que se ligam especificamente às regiões desejadas de uma proteína 158P1D7 também podem ser produzidas no contexto de anticorpos quiméricos ou enxertados com região determinante de complementaridade (CDR) originária de várias espécies. Anticorpos humanizados ou humanos para 158P1D7 também podem ser produzidos, e são preferidos para uso em contextos terapêuticos. Métodos para humanização de anticorpos murídeos e outros anticorpos não humanos, por substituição de um ou mais das CDRs de anticorpo não humano para seqüências de anticorpo humano correspondentes, são bem conhecidos (veja, por exemplo, Jones e cols., 1986, Nature 321: 522-525; Riechmann e cols., 1988, Nature 332: 323-327; Verhoeyen e cols., 1988, Science 239: 1.534-1.536). Veja também Carter e cols., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89: 4.285 e Sims e cols., 1993, J. Immunol. 151: 2.296.
[148] Em uma modalidade preferida, os anticorpos da presente invenção compreendem anticorpos totalmente humanos para 158P1D7 (MAbs para 158P1D7). Vários métodos na técnica fornecem meios para a produção de MAbs totalmente humanos para 158P1D7. Por exemplo, uma modalidade preferida fornece técnicas que utilizam camundongos transgênicos, inativados para produção de anticorpo, modificados geneticamente com loci de cadeias pesadas e leves humanas denominados Xenomouse (Amgen Fremont, Inc.). Uma descrição exemplar de preparação de camundongos transgênicos que produzem anticorpos humanos pode ser encontrada em U.S. 6.657.103. Veja também Patentes U.S. Nos 5.569.825, 5.625.126, 5.633.425, 5.661.016 e 5.545,806; e Mendez, e cols., Nature Genetics, 15: 146-156 (1998); Kellerman, S.A. & Green, L.L., Curr. Opin. Biotechnol. 13, 593-597 (2002).
[149] Além disso, anticorpos humanos da invenção podem ser gerados usando o HuMAb de camundongo (Medarex, Inc.) que contém miniloci do gene de imunoglobulina humana que codificam seqüências de imunoglobulina humana não rearranjadas da cadeia pesada (mu e gama) e leve kappa, junto com mutações dirigidas que inativam os loci endógenos das cadeias mu e kappa (veja, por exemplo, Lonberg, e cols. (1994) Nature 368 (6.474): 856-859).
[150] Em outra modalidade, os anticorpos totalmente humanos da invenção podem ser despertados usando um camundongo que carrega seqüências de imunoglobulina humana em transgenes e transcromossomos, por exemplo, um camundongo que carrega um transgene da cadeia pesada humana e um transcromossomo da cadeia leve humana. Esses camundongos, aqui denominados “Camundongos KM”, são descritos em Tomizuka e cols. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97: 722-727 e Publicação PCT WO 02/43478 para Tomizuka, e cols.
[151] Os Anticorpos monoclonais humanos da invenção também podem ser preparados usando métodos de apresentação em fago para avaliação bibliotecas de genes de imunoglobulina humana. Esses métodos de apresentação em fago para o isolamento de anticorpos humanos estão estabelecidos na técnica. Veja, por exemplo: Patentes U.S. Nos 5.223.409, 5.403.484 e 5.571.698 para Ladner e cols.; Patentes U.S. Nos 5.427.908 e 5.580.717 para Dower e cols.; Patentes U.S. Nos 5.969.108 e 6.172.197 para McCafferty e cols.; e Patentes U.S. Nos 5.885.793, 6.521.404, 6.544.731, 6.555.313, 6.582.915 e 6.593.081 para Griffiths e cols.
[152] Os anticorpos monoclonais humanos da invenção também podem ser preparados usando camundongos SCID nos quais células imunes humanas foram reconstituídas de tal forma que uma resposta de anticorpo humano possa ser gerada após imunização. Esses camundongos são descritos, por exemplo, nas Patentes U.S. Nos 5.476.996 e 5.698.767 para Wilson e cols.
[153] Os anticorpos monoclonais humanos da invenção também podem ser preparados usando camundongos nos quais seqüências genômicas que abrigam segmentos variáveis endógenos de camundongo nos loci da cadeia pesada de imunoglobulina (segmentos VH, DH, e JH) e/ou cadeia leve kappa (VK e JK) foram substituídas, no todo ou em parte, com seqüências genômicas humanas que abrigam segmentos variáveis não rearranjados de loci da linhagem germinativa da cadeia pesada (VH, DH, e JH) e/ou cadeia leve kappa de imunoglobulina humana (VK e JK) (Regeneron, Tarrytown, NY) Veja, por exemplo, as Patentes U.S. Nos 6.586.251. 6.596.541. 7.105.348. 6.528.313. 6.638.768 e 6.528.314.
[154] Em uma modalidade, um MAbs para 158P1D7 da invenção compreende regiões variáveis da cadeia pesada e leve de um anticorpo designado Ha15-10ac12 produzido por a célula de ovário de hamster chinês (CHO) depositada sob o N° de Acesso na “American Type Culture Collection” (ATCC): PTA-13102 (veja a Figura 3), ou regiões variáveis pesada e leve que compreendem seqüências de aminoácidos que são homólogas às seqüências de aminoácidos das regiões variáveis da cadeia pesada e leve de Ha15-10ac12, por exemplo, fragmentos funcionais destes, e em que os anticorpos retêm as propriedades funcionais desejadas dos MAbs para 158P1D7 da invenção. A região variável da cadeia pesada de Ha15-10ac12 possui a seqüência de aminoácidos que varia do 1° resíduo Q ao 120° resíduo S do ID. DE SEQ. N°:7, e a região variável da cadeia leve de Ha15-10ac12 possui a seqüência de aminoácidos que varia do 1° resíduo D ao 113° resíduo R do ID. DE SEQ. N°: 8.
[155] Em uma modalidade, o anticorpo para 158P1D7 contém uma CDR da cadeia pesada da região variável da cadeia pesada de HA15-10ac12, por exemplo, CDR da cadeia pesada 1, 2 e/ou 3 da região variável da cadeia pesada de HA15-10ac12, por exemplo, CDR1, CDR2 e/ou CDR3 da seqüência de aminoácidos descrita como ID. DE SEQ. N°: 7, determinada por qualquer esquema de numeração conhecido para identificação de CDRs, por exemplo, qualquer um dos aqui descritos. Em uma modalidade, o anticorpo para 158P1D7 contém uma CDR da cadeia leve da região variável da cadeia leve de HA15-10ac12, por exemplo, CDR da cadeia leve 1, 2, e/ou 3 da região variável da cadeia leve de HA15-10ac12, por exemplo, CDR1, CDR2 e/ou CDR3 da seqüência de aminoácidos descrita como ID. DE SEQ. N°: 8, como determinada por qualquer esquema de numeração conhecido para identificação de CDRs, por exemplo, qualquer um dos aqui descritos. Em um aspecto, CDRs 1-3 da região variável da cadeia pesada de Ha15-10ac12 contêm as seqüências de aminoácidos que variam de resíduos 31-35, de resíduos 50-66 e de resíduos 99-109, respectivamente, do ID. DE SEQ. N°: 7. Em um aspecto, CDRs 1-3 da região variável da cadeia leve de Ha15-10ac12 contêm as seqüências de aminoácidos que variam de resíduos 24-39, de resíduos 55-61 e de resíduos 94-102, respectivamente, do ID. DE SEQ. N°: 8. Dessa forma, em alguns aspectos, o anticorpo para 158P1D7 contém uma CDR1 da cadeia pesada que possui resíduos 31-35 do ID. DE SEQ. N°: 7, uma CDR2 da cadeia pesada que possui resíduos 50-66 do ID. DE SEQ. N°: 7 e/ou uma CDR3 da cadeia pesada que possui resíduos 99-109 do ID. DE SEQ. N°: 7 e/ou uma CDR1 da cadeia leve que possui resíduos 24-39 do ID. DE SEQ. N°: 8, uma CDR2 que possui resíduos 55-61 do ID. DE SEQ. N°: 8 e/ou uma CDR3 que possui resíduos 94-102 do ID. DE SEQ. N°: 8. Também entre as modalidades fornecidas estão anticorpos que competem pela ligação ao antígeno com anticorpos que possuem essas seqüências da região variável e/ou da CDR. Em algumas modalidades, o anticorpo fornecido inclui uma região constante. A região constante pode ser qualquer subclasse de região constante. Em uma modalidade, a região constante de IgG2 humana como a região constante da cadeia pesada e a região constante kappa de Ig humana como a região constante da cadeia leve podem ser usadas.
[156] Por exemplo, a invenção fornece um anticorpo monoclonal isolado, ou porção de ligação de antígeno deste, que compreende uma região variável da cadeia pesada e uma região variável da cadeia leve, em que: (a) a região variável da cadeia pesada compreende uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 80% homóloga à seqüência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada descrita na Figura 3; e (b) a região variável da cadeia leve compreende uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 80% homóloga à seqüência de aminoácidos da região variável da cadeia leve descrita na Figura 3.
[157] Em outras modalidades, as seqüências de aminoácidos de VH e/ou VL podem ser 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% homólogas às seqüências de VH e VL descritas na Figura 3.
[158] Em outra modalidade, a invenção fornece um anticorpo monoclonal isolado, ou porção de ligação de antígeno deste, que compreende uma região variável da cadeia pesada humanizada e uma região variável da cadeia leve humanizada, em que: (a) a região variável da cadeia pesada compreende uma, duas três regiões determinantes de complementaridade (CDRs) que possuem a(s) seqüência(s) de aminoácidos da região variável da CDRs 1, 2 e/ou 3 da cadeia pesada, da região variável da cadeia pesada descritas na Figura 3, como determinado com o uso de qualquer esquema de numeração conhecido, por exemplo, qualquer um dos aqui descritos; (b) a região variável da cadeia leve compreende uma, duas ou três CDRs que possuem a(s) seqüência(s) de aminoácidos das CDRs 1, 2, e/ou 3 da região variável da cadeia leve, da região variável da cadeia leve descrita na Figura 3, como determinado com o uso de qualquer esquema de numeração conhecido, por exemplo, qualquer um dos aqui descritos.
[159] Em outra modalidade, o anticorpo ou porção de ligação de antígeno deste compete pela ligação com um anticorpo que possui essa(s) CDR(s) da cadeia pesada e/ou leve.
[160] Os anticorpos modificados geneticamente da invenção incluem aqueles nos quais foram feitas modificações aos resíduos do arcabouço (framework) dentro de VH e/ou VL (por exemplo, para aprimorar as propriedades do anticorpo). Tipicamente essas modificações do arcabouço são feitas para diminuir a imunogenicidade do anticorpo. Por exemplo, uma abordagem é a “retromutação” de um ou mais resíduos do arcabouço para a seqüência da linhagem germinativa correspondente. Mais especificamente, um anticorpo que passou por mutação somática pode conter resíduos do arcabouço que diferem da seqüência da linhagem germinativa da qual o anticorpo é derivado. Esses resíduos podem ser identificados por comparação das seqüências arcabouço do anticorpo com as seqüências da linhagem germinativa das quais o anticorpo é derivado. Para retornar as seqüências da região do arcabouço para sua configuração da linhagem germinativa, as mutações somáticas podem sofrer “retromutações” para a seqüência da linhagem germinativa, por exemplo, por mutagênese sítio-dirigida ou mutagênese mediada por PCR (por exemplo, “retromutação” de leucina para metionina). Esses anticorpos que sofreram “retromutação” também estão englobados pela invenção.
[161] Outro tipo de modificação do arcabouço envolve a mutação de um ou mais resíduos dentro da região do arcabouço, ou até mesmo dentro de uma ou mais regiões CDR, para remover epitopos célula T para, dessa forma, reduzir a imunogenicidade potencial do anticorpo. Essa abordagem também é denominada “desimunização” e é descrita em mais detalhe na Publicação de Patente U.S. N° 2003/0153043 por Carr e cols.
[162] Em adição ou como alternativa às modificações feitas dentro das regiões do arcabouço ou CDR, os anticorpos da invenção podem ser modificados geneticamente para incluir modificações dentro da região Fc, tipicamente para alterar uma ou mais propriedades funcionais do anticorpo, por exemplo, meia-vida sérica, fixação de complemento, ligação do receptor Fc e/ou citotoxicidade celular antígeno-dependente. Além disso, um MAb para 158P1D7 da invenção pode ser modificado quimicamente (por exemplo, uma ou mais porções químicas podem ser anexadas ao anticorpo) ou ser modificados para alterar sua glicosilação, novamente para alterar uma ou mais propriedades funcionais do MAb. Cada uma dessas modalidades é descrita em mais detalhe abaixo.
[163] Em uma modalidade, a região de dobradiça de CH1 é modificada de tal forma que o número de resíduos de cisteína na região de dobradiça seja alterado, por exemplo, aumentado ou diminuído. Essa abordagem é ainda descrita na Patente U.S. N° 5.677.425 por Bodmer e cols. O número de resíduos de cisteína na região de dobradiça de CH1 é alterada, por exemplo, para facilitar a montagem das cadeias leves e pesadas ou para aumentar ou diminuir a estabilidade do MAb para 158P1D7.
[164] Em outra modalidade, a região de dobradiça Fc de um anticorpo é mutada para diminuir a meia-vida biológica do MAb para 158P1D7. Mais especificamente, uma ou mais mutações de aminoácidos são introduzidas na região de interface do domínio CH2-CH3 do Fc-fragmento de dobradiça, de tal forma que o anticorpo possua ligação deficiente da proteína A de estafilococos (SpA) em relação à ligação nativa de SpA ao domínio de Fc-dobradiça. Essa abordagem é descrita em mais detalhe na Patente U.S. N° 6.165.745 por Ward e cols.
[165] Em outra modalidade, o MAb para 158P1D7 é modificado para aumentar sua meia-vida biológica. Várias abordagens são possíveis. Por exemplo, mutações podem ser introduzidas como descrito na Patente U.S. N° 6.277.375 para Ward. Alternativamente, para aumentar a meia-vida biológica, o anticorpo pode ser alterado dentro da região CH1 ou CL para conter um epitopo de ligação ao receptor selvagem retirado de duas alças de um domínio CH2 de uma região Fc de uma IgG, como descrito nas Patentes U.S. Nos 5.869.046 e 6.121.022 por Presta e cols.
[166] Ainda em outras modalidades, a região Fc é alterada por substituição de pelo menos um resíduo de aminoácido com um resíduo de aminoácido diferente para alterar a função (ou funções) efetora do MAb para 158P1D7. Por exemplo, um ou mais aminoácidos selecionados de resíduos de aminoácidos específicos podem ser substituídos com um resíduo de aminoácido diferente, de tal forma que o anticorpo possua uma afinidade alterada por um ligante efetor, mas retenha a habilidade de ligação de antígeno do anticorpo parente. O ligante efetor para o qual a afinidade é alterada pode ser, por exemplo, um receptor Fc ou o componente C1 do complemento. Essa abordagem é descrita em mais detalhe nas Patentes U.S. Nos 5.624.821 e 5.648.260, ambas por Winter e cols.
[167] A reatividade de anticorpos para 158P1D7 com uma proteína relacionada à 158P1D7 pode ser estabelecida por diversos meios bem conhecidos, incluindo análises Western blot, imunoprecipitação, ELISA e FACS usando, como adequado, proteínas relacionadas à 158P1D7, células que expressam 158P1D7 ou extratos destas. Um anticorpo para 158P1D7 ou fragmento deste pode ser marcado com um marcador detectável ou conjugado a uma segunda molécula. Marcadores detectáveis adequados incluem, sem limitação, um radioisótopo, um composto fluorescente, um composto bioluminescente, um composto quimioluminescente, um quelante de metal ou uma enzima. Além disso, anticorpos biespecíficos específicos para dois ou mais epitopos de 158P1D7 são gerados usando métodos geralmente conhecidos na técnica. Anticorpos homodiméricos também podem ser gerados por metodologias de reticulação conhecidas na técnica (por exemplo, Wolff e cols., Cancer Res. 53: 2.560-2.565).
[168] Ainda em outra modalidade preferida, o MAb para 158P1D7 da invenção é um anticorpo que compreende as cadeias pesada e leve de um anticorpo designado Ha15- 10ac12. A cadeia pesada de Ha15-10ac12 consiste na seqüência de aminoácidos que varia do 1° resíduo Q ao 446° resíduo K do ID. DE SEQ. N°: 7 e a cadeia leve de Ha15- 10ac12 consiste na seqüência de aminoácidos que varia do 1° resíduo D ao 219° resíduo C do ID. DE SEQ. N°: 8, cuja seqüência é descrita na Figura 2 e Figura 3. Em uma modalidade preferida, Ha15-10ac12 é conjugado a um agente citotóxico.
[169] A célula de ovário de hamster chinês (CHO) que produz o anticorpo designado Ha15-10ac12 foi enviada (por meio de “Federal Express”) ao “American Type Culture Collection” (ATCC), P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108 em 25 de julho de 2012 e recebeu o Número de Acesso PTA-13102.
III) Conjugados anticorpo-fármaco de forma geral
[170] Em outro aspecto, a invenção fornece conjugados anticorpo-fármaco (ADCs), que compreendem um anticorpo conjugado a um agente citotóxico como, por exemplo, um agente quimioterápico, um fármaco, um agente inibidor do crescimento, uma toxina (por exemplo, uma toxina enzimaticamente ativa de origem bacteriana, fúngica, vegetal ou animal, ou fragmentos destas), ou um isótopo radioativo (ou seja, um radioconjugado). Em outro aspecto, a invenção ainda fornece métodos de utilização dos ADCs. Em um aspecto, um ADC compreende qualquer um dos MAbs para 158P1D7 acima anexado covalentemente a um agente citotóxico ou um agente detectável.
[171] O uso de conjugados anticorpo-fármaco para a liberação local de agentes citotóxicos ou citostáticos, ou seja, fármacos para matar ou inibir células tumorais no tratamento de câncer (Syrigos e Epenetos (1999) Anticancer Research 19: 605-614; Niculescu-Duvaz e Springer (1997) Adv. Drug Del. Rev. 26: 151-172; Patente U.S. 4.975.278) permite a liberação direcionada da porção farmacológica aos tumores, e acúmulo intracelular neles, em que a administração sistêmica desses agentes farmacológicos não conjugados pode resultar em níveis inaceitáveis de toxicidade às células normais, bem como às células tumorais que visam ser eliminadas (Baldwin e cols., (1986) Lancet (15 de março de 1986): 603-05; Thorpe, (1985) “Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review”, em “Monoclonal Antibodies” “‘84: Biological And Clinical Applications”, A. Pinchera e cols. (Editores), páginas 475-506). Busca-se eficácia máxima com toxicidade mínima. Tanto anticorpos policlonais quanto anticorpos monoclonais foram relatados como úteis nessas estratégias (Rowland e cols., (1986) Cancer Immunol. Immunother., 21: 183-87). Os fármacos usados nesses métodos incluem daunomicina, doxorrubicina, metotrexato e vindesina (Rowland e cols., (1986) supra). As toxinas usadas em conjugados anticorpo- toxina incluem toxinas bacterianas como, por exemplo, toxina diftérica, toxinas vegetais como, por exemplo, ricina, toxinas de pequena molécula como, por exemplo, geldanamicina (Mandler e cols. (2000) J. of the Nat. Cancer Inst. 92(19): 1.573-1.581; Mandler e cols. (2000) Bioorganic & Med. Chem. Letters 10: 1.025-1.028; Mandler e cols. (2002) Bioconjugate Chem. 13: 786-791), maitansinóides (EP 1391213; Liu e cols., (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93: 8.618-8.623) e caliqueamicina (Lode e cols. (1998) Cancer Res. 58: 2.928; Hinman e cols. (1993) Cancer Res. 53: 3.336-3.342). As toxinas podem efetuar seus efeitos citotóxicos e citostáticos por mecanismos que incluem ligação de tubulina, ligação DNA ou inibição de topoisomerase. Alguns fármacos citotóxicos tendem a ser inativos ou menos ativos quando conjugados a anticorpos grandes ou ligantes de receptor de proteína.
[172] Exemplos de conjugados anticorpo-fármaco são ZEVALIN® (ibritumomab tiuxetan, Biogen/Idec), que é um conjugado anticorpo-radioisótopo composto por um anticorpo monoclonal kappa IgG1 murídeo dirigido contra o antígeno CD20 encontrado na superfície de linfócitos B normais e malignos e radioisótopo 111In ou 90Y ligado por um vinculador-quelante de tiouréia (Wiseman e cols. (2000) Eur. Jour. Nucl. Med. 27(7): 766-77; Wiseman e cols. (2002) Blood 99 (12): 4.336-42; Witzig e cols. (2002) J. Clin. Oncol. 20 (10): 2.453-63; Witzig e cols. (2002) J. Clin. Oncol. 20 (15): 3.262-69).
[173] Adicionalmente, MYLOTARG™ (gemtuzumab ozogamicina, Wyeth Pharmaceuticals), um composto de conjugado anticorpo-fármaco por um anticorpo para CD33 humano ligado à caliqueamicina, foi aprovado em 2000 para o tratamento de leucemia mielóide aguda por injeção (Drugs of the Future (2000) 25(7): 686; Patentes U.S. Nos 4970198, 5079233, 5585089, 5606040, 5693762, 5739116, 5767285, 5773001).
[174] Além disso, Cantuzumab mertansina (Immunogen, Inc.), um composto de conjugado anticorpo-fármaco pelo anticorpo huC242 ligado por meio do vinculador dissulfeto SPP à porção farmacológica de maitansinóide, DM1, está avançando para experimentos de Fase II para o tratamento de cânceres que expressam CanAg, por exemplo, câncer de cólon, pancreático, gástrico, e outros.
[175] Adicionalmente, MLN-2704 (Millennium Pharm., BZL Biologies, Immunogen Inc.), um composto de conjugado anticorpo-fármaco pelo anticorpo monoclonal antipróstata específico para antígeno da membrana (PSMA) ligado à porção farmacológica de maitansinóide, DM1, está sob desenvolvimento para o tratamento potencial de tumores da próstata.
[176] Finalmente, os peptídeos de auristatina, por exemplo, monometil-auristatina E (MMAE), análogos sintéticos de dolastatina, foram conjugados a anticorpos monoclonais quiméricos cBR96 (específico para Lewis Y em carcinomas) e cAC10 (específico para CD30 em malignidades hematológicas) (Doronina e cols. (2003) Nature Biotechnology 21 (7): 778-784). O cAC10 está sob desenvolvimento terapêutico.
[177] Além disso, agentes quimioterápicos úteis na geração de ADCs são aqui descritos. Toxinas enzimaticamente ativas e fragmentos destas que podem ser usados incluem cadeia A da toxina diftérica, fragmentos ativos não-ligação de toxina diftérica, cadeia A de exotoxina (de Pseudomonas aeruginosa), cadeia A de ricina, cadeia A de abrina, cadeia A de modecina, alfa-sarcina, proteínas de Aleurites fordii, proteínas de diantina, proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII e PAP-S), inibidor de Momordica charantia, curcina, crotina, inibidor de Saponaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina e os tricotecenos. Veja, por exemplo, WO 93/21232 publicado em 28 de outubro de 1993. Diversos radionuclídeos estão disponíveis para a produção de anticorpos radioconjugados. Exemplos incluem 212Bi, 131I, 131In, 90Y e 186Re. Conjugados do anticorpo e agente citotóxico são feitos com o uso de diversos agentes bifuncionais de acoplamento de proteína como, por exemplo, N-succinimidil-3-(2- piridilditiol)propionato (SPDP), iminotiolano (IT), derivados bifuncionais de imidoésteres (por exemplo, dimetil adipimidato HCl), ésteres ativos (por exemplo, disuccinimidil suberato), aldeídos (por exemplo, glutaraldeído), compostos de bis-azido (por exemplo, bis(p- azidobenzoil)hexanodiamina), derivados de bis-diazônio (por exemplo, bis-(p-diazôniobenzoil)-etilenodiamina), diisocianatos (por exemplo, tolueno 2,6-diisocianato) e compostos de flúor bis-ativos (por exemplo, 1,5-diflúor- 2,4-dinitrobenzeno). Por exemplo, uma imunotoxina de ricina pode ser preparada como descrito em Vitetta e cols. (1987) Science, 238: 1098. Ácido 1-isotiocianatobenzil-3- metildietileno triamina-pentaacético (MX-DTPA) marcado com carbono-14 é um agente quelante exemplar para conjugação de radionucleotídeo ao anticorpo (WO 94/11026).
[178] Conjugados de um anticorpo e uma ou mais toxinas de pequena molécula, por exemplo, uma caliqueamicina, maitansinóides, dolastatinas, auristatinas, um tricoteceno e CC1065, e os derivados dessas toxinas que possuem atividade de toxina, também são aqui contemplados.
III(A) Maitansinóides
[179] Compostos de maitansina adequados para uso como porções farmacológicas de maitansinóide são bem conhecidos na técnica, e podem ser isolados de fontes naturais de acordo com métodos conhecidos, produzidos com o uso de técnicas de engenharia genética (veja Yu e cols. (2002) PNAS 99: 7.968-7.973), ou maitansinol e análogos de maitansinol preparados sinteticamente de acordo com métodos conhecidos.
[180] Porções de fármaco de maitansinóide exemplares incluem aquelas que possuem um anel aromático modificado, por exemplo: C-19-decloro (US 4256746) (preparado por redução de hidreto de lítio-alumínio de ansamitocina P2); C-20-hidróxi (ou C-20-demetil) +/-C-19-decloro (Patentes U.S. Nos 4.361.650 e 4.307.016) (preparado por desmetilação usando Streptomyces ou Actinomyces ou descloração usando LAH); e C-20-demetóxi, C-20-acilóxi (-OCOR), +/-decloro (Patente U.S. N° 4.294.757) (preparado por acilação usando cloretos de acila), e aquelas que possuem modificações em outras posições.
[181] Porções farmacológicas de maitansinóide exemplares também incluem aquelas que possuem modificações como, por exemplo: C-9-SH (U.S. 4.424.219) (preparado pela reação de maitansinol com H2S ou P2S5); C-14- alcoximetil(demetóxi/CH2OR) (U.S. 4.331.598); C-14- hidroximetil ou aciloximetil (CH2OH ou CH2OAc) (U.S. 4.450.254) (preparado por Nocardia); C-15-hidróxi/acilóxi (U.S. 4.364.866) (preparado pela conversão de maitansinol por Streptomyces); C-15-metóxi (Patentes U.S. Nos 4.313.946 e 4.315.929) (isolado de Trewia nudlflora); C-18-N-demetil (Patentes U.S. Nos 4.362.663 e 4.322.348) (preparado pela desmetilação de maitansinol por Streptomyces); e 4,5-desóxi (U.S. 4.371.533) (preparado pela redução por tricloreto de titânio/LAH de maitansinol).
[182] ADCs que contêm maitansinóides, métodos de produção dos mesmos e seu uso terapêutico são revelados, por exemplo, nas Patentes U.S. Nos 5.208.020, 5.416.064, 6.441.163 e Patente Européia EP 0 425 235 B1, cujas revelações são aqui expressamente incorporadas por referência. Liu e cols., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93: 8.618-8.623 (1996) descrevem ADCs que compreendem um maitansinóide designado DM1 ligado ao anticorpo monoclonal C242 dirigido contra câncer cólon-retal humano. Foi verificado que o conjugado é altamente citotóxico para células cultivadas de câncer de cólon, e mostrou atividade antitumoral em um ensaio de crescimento tumoral in vivo. Chari e cols., Cancer Research 52: 127-131 (1992) descrevem ADCs nos quais um maitansinóide foi conjugado por meio de um vinculador dissulfeto à ligação do anticorpo murídeo A7 a um antígeno em linhagens de células de câncer de cólon humano, ou a outro anticorpo monoclonal murídeo TA.1 que se liga ao oncogene de HER-2/neu. A citotoxicidade do conjugado TA.1-maitansinóide foi testado in vitro na linhagem de célula de câncer de mama humano SK-BR-3, que expressa 3 x 105 antígenos de superfície HER-2 por célula. O conjugado de fármaco obteve um grau de citotoxicidade similar ao fármaco maitansinóide livre, que poderia ser aumentado por aumento do número de moléculas de maitansinóide por molécula de anticorpo. O conjugado A7- maitansinóide exibiu baixa citotoxicidade sistêmica em camundongos.
III(B) Auristatinas e dolastatinas
[183] Em algumas modalidades, o ADC compreende um anticorpo da invenção conjugado às dolastatinas ou análogos peptídicos e derivados de dolastatina, às auristatinas (Patentes U.S. Nos 5.635.483 e 5.780.588). Foi demonstrado que dolastatinas e auristatinas interferem com a dinâmica dos microtúbulos, hidrólise de GTP e divisão nuclear e celular (Woyke e cols. (2001) Antimicrob. Agents and Chemother. 45 (12): 3.580-3.584) e possuem atividade anticâncer (U.S. 5.663.149) e antifúngica (Pettit e cols. (1998) Antimicrob. Agents Chemother. 42: 2.961-2.965). A porção farmacológica de dolastatina ou auristatina pode ser anexada ao anticorpo por meio do terminal N (amino) ou do terminal C (carboxil) da porção farmacológica peptídica (WO 02/088172).
[184] Modalidades de auristatina exemplares incluem as porções farmacológicas de monometilauristatina DE e DF ligadas ao terminal N, reveladas em Senter e cols., “Proceedings of the American Association for Cancer Research”, Volume 45, Resumo Número 623, apresentado em 28 de março de 2004 e descrito na Publicação de Patente U.S. N° 2005/0238649, cuja revelação é expressamente incorporada por referência em sua totalidade.Uma modalidade exemplar de auristatina é MMAE (em que a linha ondulada indica a adesão covalente a um vinculador (L) de um conjugado anticorpo-fármaco).
Figure img0002
[185] Outra modalidade exemplar de auristatina é MMAF, em que a linha ondulada indica a adesão covalente a um vinculador (L) de um conjugado anticorpo-fármaco (U.S. 2005/0238649):
Figure img0003
[186] Modalidades exemplares adicionais que compreendem MMAE ou MMAF e vários componentes vinculadores (aqui adicionalmente descritos) possuem as estruturas e abreviações seguintes (em que Ab significa anticorpo e p é 1 a cerca de 8):
Figure img0004
[187] Tipicamente, porções farmacológicas à base de peptídeos podem ser preparadas por formação de uma ligação peptídica entre dois ou mais aminoácidos e/ou fragmentos peptídicos. Essas ligações peptídicas podem ser preparadas, por exemplo, de acordo com o método de síntese de fase líquida (veja E. Schroder e K. Liibke, “The Peptides”, volume 1, páginas 76-136, 1965, Academic Press) que é bem conhecido no campo de química de peptídeos. As porções farmacológicas de auristatina/dolastatina podem ser preparadas de acordo com os métodos de: US 5635483, US 5780588 Pettit e cols. (1989) J. Am. Chem. Soc. 111: 5.4635.465; Pettit e cols. (1998) Anti-Cancer Drug Design 13: 243-277; Pettit, G.R., e cols. Synthesis, 1996, 719-725; Pettit e cols. (1996) J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1 5: 859863; e Doronina (2003) Nat. Biotechnol. 21(7): 778-784.
III(C) Caliqueamicina
[188] Em outras modalidades, o ADC compreende um anticorpo da invenção conjugado a uma ou mais moléculas de caliqueamicina. A família caliqueamicina de antibióticos é capaz de produzir quebras de DNA de fita dupla em concentrações subpicomolares. Para a preparação de conjugados da família caliqueamicina, veja as Patentes U.S. 5.712.374, 5.714.586, 5.739.116, 5.767.285, 5.770.701, 5.770.710, 5.773.001 e 5.877.296 (todas para American Cyanamid Company). Análogos estruturais de caliqueamicina que podem ser usados incluem, sem limitação, YiI, α2I, α3I, N-acetil-yiI, PSAG e θiI (Hinman e cols. , Cancer Research 53: 3.336-3.342 (1993), Lode e cols., Cancer Research 58: 2.925-2.928 (1998) e as Patentes U.S. mencionadas anteriormente para American Cyanamid). Outro fármaco antitumoral ao qual o anticorpo pode ser conjugado é QFA, que é um antifolato. Tanto caliqueamicina quanto QFA possuem sítios de ação intracelulares e não cruzam facilmente a membrana plasmática. Portanto, a captação celular desses agentes por meio de internalização mediada por anticorpo aumenta grandemente seus efeitos citotóxicos.
III(D) Outros agentes citotóxicos
[189] Outros agentes antitumorais que podem conjugados aos anticorpos da invenção incluem BCNU, estreptozocina, vincristina e 5-fluoruracil, a família de agentes conhecidos coletivamente complexo de LL-E33288 descrita nas Patentes U.S. 5.053.394, 5.770.710, além de espiramicinas (Patente U.S. 5.877.296).
[190] Toxinas enzimaticamente ativas e fragmentos destas que podem ser usados incluem cadeia A de difteria, fragmentos ativos não-ligação de toxina diftérica, cadeia A de exotoxina (de Pseudomonas aeruginosa), cadeia A de ricina, cadeia A de abrina, cadeia A de modecina, alfa- sarcina, proteínas de Aleurites fordii, proteínas de diantina, proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII, e PAP-S), inibidor de Momordica charantia, curcina, crotina, inibidor de Saponaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina e os tricotecenos. Veja, por exemplo, WO 93/21232, publicado em 28 de outubro de 1993.
[191] A presente invenção ainda contempla um ADC formado entre um anticorpo e um composto com atividade nucleolítica (por exemplo, uma ribonuclease ou uma DNA endonuclease como, por exemplo, uma desoxirribonuclease; DNase).
[192] Para a destruição seletiva do tumor, o anticorpo pode compreender a átomo altamente radioativo. Diversos isótopos radioativos estão disponíveis para a produção deanticorpos radioconjugados. Exemplos incluem At211, I131, radioativos de Lu. Quando o conjugado é usado para detecção, ele pode compreender a átomo radioativo para estudos cintigráficos, por exemplo, tc99m ou I123, ou um spin label para imageamento por ressonância nuclear magnética (RNM) (também conhecido como imageamento por ressonância magnética, MRI), por exemplo, iodo-123 novamente, iodo-131, índio-111, flúor-19, carbono-13, nitrogênio-15, oxigênio- 17, gadolínio, manganês ou ferro.
[193] O radiomarcador ou outros marcadores podem ser incorporados no conjugado de formas conhecidas. Por exemplo, o peptídeo pode ser biossintetizado ou pode ser sintetizado por síntese química de aminoácidos usando precursores de aminoácidos adequados que envolvem, por exemplo, flúor-19 no lugar de hidrogênio. Marcadores como, por exemplo, tc99m ou I123, Re186, Re188 e In111, podem ser anexados por meio de um resíduo de cisteína no peptídeo. Ítrio-90 pode ser anexado por meio de um resíduo de lisina. O método IODOGEN (Fraker e cols. (1978) Biochem. Biophys. Res. Commun. 80: 49-57) pode ser usado para incorporar iodo-123. “Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy” (Chatal, CRC Press 1989) descreve outros métodos em detalhe.
IV) Composto de conjugado anticorpo-fármaco que se ligam à 158P1D7
[194] A presente invenção fornece, inter alia, compostos de conjugado anticorpo-fármaco para liberação direcionada de fármacos. Os inventores fizeram a descoberta de que os compostos de conjugado anticorpo-fármaco possuem atividade citotóxica e/ou citostática potente contra células que expressam 158P1D7. Os compostos de conjugado anticorpo-fármaco compreendem uma unidade de anticorpo ligada covalentemente a pelo menos uma unidade de fármaco. As unidades de fármaco podem ser ligadas covalentemente diretamente ou por meio de uma unidade vinculadora (-LU-).
[195] Em algumas modalidades, o composto de conjugado anticorpo-fármaco possui a seguinte fórmula: L-(LU-D)P (I) ou um sal farmaceuticamente aceitável ou solvato deste; em que: L é a unidade de anticorpo, por exemplo, MAb para 158P1D7 da presente invenção, e (LU-D) é uma porção de unidade vinculadora-unidade de fármaco, em que: LU- é uma unidade vinculadora, e -D é uma unidade de fármaco que possui atividade citostática ou citotóxica contra uma célula-alvo; e p é um número inteiro de 1 a 20.
[196] Em algumas modalidades, p varia de 1 a 10, 1 a 9, 1 a 8, 1 a 7, 1 a 6, 1 a 5, 1 a 4, 1 a 3 ou 1 a 2. Em algumas modalidades, p varia de 2 a 10, 2 a 9, 2 a 8, 2 a 7, 2 a 6, 2 a 5, 2 a 4 ou 2 a 3. Em outras modalidades, p é 1, 2, 3, 4, 5 ou 6. Em algumas modalidades, p é 2 ou 4.
[197] Em algumas modalidades, o composto de conjugado anticorpo-fármaco possui a seguinte fórmula: L-(Aa-Ww-Yy-D)p (II) ou um sal farmaceuticamente aceitável ou solvato deste, em que: L é a unidade de anticorpo, por exemplo, MAb para 158P1D7; e - Aa-Ww-Yy- é uma unidade vinculadora (LU), em que: - A- é uma unidade esticadora, a é 0 ou 1, cada -W- é independentemente uma unidade de aminoácido, w é um número inteiro que varia de 0 a 12, - Y- é uma unidade espaçadora auto-imoladora, y é 0, 1 ou 2; - D é uma unidade de fármaco que possui atividade citostática ou citotóxica contra a célula-alvo; e p é um número inteiro de 1 a 20.
[198] Em algumas modalidades, a é 0 ou 1, w é 0 ou 1, e y é 0, 1 ou 2. Em algumas modalidades, a é 0 ou 1, w é 0 ou 1, e y é 0 ou 1. Em algumas modalidades, p varia de 1 a 10, 1 a 9, 1 a 8, 1 a 7, 1 a 6, 1 a 5, 1 a 4, 1 a 3 ou 1 a 2. Em algumas modalidades, p varia de 2 a 8, 2 a 7, 2 a 6, 2 a 5, 2 a 4 ou 2 a 3. Em outras modalidades, p é 1, 2, 3, 4, 5 ou 6. Em algumas modalidades, p é 2 ou 4. Em algumas modalidades, quando w não é zero, y é 1 ou 2. Em algumas modalidades, quando w é 1 a 12, y é 1 ou 2. Em algumas modalidades, w é 2 a 12 e y é 1 ou 2. Em algumas modalidades, a é 1 e w e y são 0.
[199] Para composições que compreendem diversos anticorpos, o carregamento de fármaco é representado por p, o número médio de moléculas de fármaco por anticorpo. O carregamento de fármaco pode variar de 1 a 20 fármacos (D) por anticorpo. O número médio de fármacos por anticorpo na preparação de reações de conjugação pode ser caracterizado por meios convencionais como, por exemplo, espectroscopia de massa, ensaio de ELISA e HPLC. A distribuição quantitativa de conjugados anticorpo-fármaco em termos de p também pode ser determinada. Em alguns casos, separação, purificação e caracterização de conjugados anticorpo- fármaco homogêneos, em que p é certo valor de conjugados anticorpo-fármaco com outros carregamentos de fármaco, podem ser obtidas por meios como, por exemplo, HPLC de fase reversa ou eletroforese. Em modalidades exemplares, p é de 2 a 8.
[200] A geração de compostos de conjugado anticorpo- fármaco pode ser obtida por qualquer metodologia conhecida por aqueles habilitados na técnica. Resumidamente, os compostos de conjugado anticorpo-fármaco compreendem MAb para 158P1D7 como a unidade de anticorpo, um fármaco e, opcionalmente, um vinculador que une o fármaco e o agente de ligação. Em uma modalidade preferida, o anticorpo é MAb para 158P1D7 que compreende regiões variáveis da cadeia pesada e leve de um anticorpo designado Ha15-10ac12 descrito acima. Em uma modalidade mais preferida, o anticorpo é MAb para 158P1D7 que compreende cadeia pesada e leve de um anticorpo designado Ha15-10ac12 descrito acima. Diversas reações diferentes estão disponíveis para adesão covalente de fármacos e/ou vinculadores aos agentes de ligação. Isso é freqüentemente obtido por reação dos resíduos de aminoácidos do agente de ligação, por exemplo, molécula de anticorpo, incluindo os grupos amina de lisina, os grupos de ácido carboxílico livres de ácidos glutâmico e aspártico, os grupos sulfidrila de cisteína e as várias porções dos aminoácidos aromáticos. Um dos métodos não específicos mais comumente usados de adesão covalente é a reação de carbodiimida para ligar um grupo carbóxi (ou amino) de um composto a grupos amino (ou carbóxi) do anticorpo. Adicionalmente, agentes bifuncionais como, por exemplo, dialdeídos ou imidoésteres, foram usados para ligar ao grupo amino de um composto aos grupos amino de uma molécula de anticorpo. Também está disponível para adesão de fármacos aos agentes de ligação é a reação da base de Schiff. Esse método envolve a oxidação de periodato de um fármaco que contém grupos glicol ou hidróxi formando, dessa forma, um aldeído que é então reagido com o agente de ligação. A adesão ocorre por meio da formação de uma base de Schiff com grupos amino do agente de ligação. Isotiocianatos também podem ser usados como agentes de acoplamento para adesão covalentemente de fármacos aos agentes de ligação. Outras metodologias são conhecidas por aqueles habilitados na técnica e dentro do escopo da presente invenção.
[201] Em certas modalidades, um intermediário, que é o precursor do vinculador, é reagido com o fármaco sob condições apropriadas. Em certas modalidades, grupos reativos são usados no fármaco e/ou no intermediário. O produto da reação entre o fármaco e o intermediário, ou o fármaco derivatizado, é subseqüentemente reagido com o MAb para 158P1D7 sob condições apropriadas.
[202] Cada uma das unidades particulares dos compostos de conjugado anticorpo-fármaco é aqui descrita em mais detalhes. A síntese e estrutura de unidades vinculadoras, unidades esticadoras, unidades de aminoácido, unidade espaçadora auto-imoladora e unidades de fármaco exemplares também são descritas nas Publicações de Pedidos de Patente U.S. Nos 2003-0083263, 2005-0238649 e 2005-0009751, cada uma delas sendo aqui incorporada por referência em sua totalidade e para todas as finalidades.
V) Unidades vinculadoras
[203] Tipicamente, os compostos de conjugado anticorpo- fármaco compreendem uma unidade vinculadora entre a unidade de fármaco e a unidade de anticorpo. Em algumas modalidades, o vinculador é clivável sob condições intracelulares, de tal forma que a clivagem do vinculador libere a unidade de fármaco do anticorpo no ambiente intracelular. Ainda em outras modalidades, a unidade vinculadora não é clivável e o fármaco é liberado, por exemplo, por degradação do anticorpo.
[204] Em algumas modalidades, o vinculador é clivável por um agente de clivagem que está presente no ambiente intracelular (por exemplo, dentro de um lisossomo ou endossomo ou vesículas de pinocitose). O vinculador pode ser, por exemplo, um vinculador de peptidil que é clivado por uma enzima intracelular peptidase ou protease incluindo, sem limitação, uma protease lisossômica ou endossômica. Em algumas modalidades, o vinculador de peptidil tem pelo menos dois aminoácidos de comprimento ou pelo menos três aminoácidos de comprimento. Os agentes de clivagem podem incluir catepsinas B e D e plasmina, todos conhecidos por hidrolisarem derivados de fármaco de dipeptídeo que resultam na liberação de fármaco ativo dentro de células-alvo (veja, por exemplo, Dubowchik e Walker, 1999, Pharm. Therapeutics 83: 67-123). São mais típicos vinculadores de peptidil que são cliváveis por enzimas que estão presentes em células que expressam 158P1D7. Por exemplo, um vinculador de peptidil que é clivável pela protease tiol-dependente catepsina-B, que é altamente expressa em tecido canceroso, pode ser usado (por exemplo, um vinculador Phe-Leu ou Gly-Phe-Leu-Gly (ID. DE SEQ. N°: 9)). Outros exemplos desses vinculadores são descritos, por exemplo, na Patente U.S. N° 6.214.345, aqui incorporada por referência em sua totalidade e para todas as finalidades. Em uma modalidade específica, o vinculador de peptidil clivável por uma protease intracelular é um vinculador Val-Cit ou um vinculador Phe-Lys (veja, por exemplo, Patente U.S. 6.214.345, que descreve a síntese de doxorrubicina com o vinculador val-cit). Uma vantagem da utilização da liberação proteolítica intracelular do agente terapêutico é que o agente é tipicamente atenuado quando conjugado e as estabilidades séricas dos conjugados são tipicamente elevadas.
[205] Em outras modalidades, o vinculador clivável é sensível ao pH, ou seja, sensível à hidrólise em certos valores de pH. Tipicamente, o vinculador sensível ao pH é hidrolisável sob condições ácidas. Por exemplo, um vinculador ácido-lábil que é hidrolisável no lisossomo (por exemplo, uma hidrazona, semicarbazona, tiossemicarbazona, amida cis-aconítica, ortoéster, acetal, cetal, ou semelhantes) pode ser usado (veja, por exemplo, Patentes U.S. Nos 5.122.368, 5.824.805, 5.622.929; Dubowchik e Walker, 1999, Pharm. Therapeutics 83: 67-123; Neville e cols., 1989, Biol. Chem. 264: 14.653-14.661). Esses vinculadores são relativamente estáveis sob condições de pH neutro, tais como aquelas no sangue, mas são instáveis em pH abaixo de 5,5 ou 5,0, o pH aproximado do lisossomo. Em certas modalidades, o vinculador hidrolisável é um vinculador de tioéter (como, por exemplo, um tioéter anexado ao agente terapêutico por meio de uma ligação acil- hidrazona (veja, por exemplo, a Patente U.S. N° 5.622.929).
[206] Ainda em outras modalidades, o vinculador é clivável sob condições redutoras (por exemplo, um vinculador de dissulfeto). Diversos vinculadores de dissulfeto são conhecidos na técnica, incluindo, por exemplo, aqueles que podem ser formados usando SATA (N- succinimidil-S-acetiltioacetato), SPDP (N-succinimidil-3- (2-piridilditio)propionato), SPDB (N-succinimidil-3-(2-piridilditio)butirato) e SMPT (N-succinimidil-oxicarbonil- alpha-metil-alfa-(2-piridil-ditio)tolueno), SPDB e SMPT (veja, por exemplo, Thorpe e cols., 1987, Cancer Res. 47: 5.924-5.931; Wawrzynczak e cols., Em “Immunoconjugates: Antibody Conjugates in Radioimagery and Therapy of Cancer” (C.W. Vogel Ed., Oxford U. Press, 1987. Veja também a Patente U.S. N° 4.880.935).
[207] Ainda em outras modalidades específicas, o vinculador é um vinculador de malonato (Johnson e cols., 1995, Anticancer Res. 15: 1.387-93), um vinculador de maleimidobenzoil (Lau e cols., 1995, Bioorg-Med-Chem. 3(10): 1.299-1.304) ou um análogo de 3’-N-amida (Lau e cols., 1995, Bioorg-Med-Chem. 3(10): 1.305-12).
[208] Ainda em outras modalidades, a unidade vinculadora não é clivável e o fármaco é liberado por degradação do anticorpo (veja Publicação U.S. N° 2005/0238649, aqui incorporada por referência em sua totalidade e para todas as finalidades).
[209] Tipicamente, o vinculador não é substancialmente sensível ao ambiente extracelular. Como aqui usado, “não substancialmente sensível ao ambiente extracelular”, no contexto de um vinculador, significa que no máximo cerca de 20%, tipicamente no máximo cerca de 15%, mais tipicamente no máximo cerca de 10%, e ainda mais tipicamente no máximo cerca de 5%, no máximo cerca de 3%, ou no máximo cerca de 1% dos vinculadores, em uma amostra de composto de conjugado anticorpo-fármaco, são clivados quando o composto de conjugado anticorpo-fármaco se apresenta em um ambiente extracelular (por exemplo, no plasma). Se um vinculador não é substancialmente sensível ao ambiente extracelular pode ser determinado, por exemplo, por incubação com plasma do composto de conjugado anticorpo-fármaco por um período de tempo predeterminado (por exemplo, 2, 4, 8, 16 ou 24 horas) e depois quantificação da quantidade de fármaco livre presente no plasma.
[210] Em outras modalidades não mutuamente exclusivas, o vinculador promove internalização celular. Em certas modalidades, o vinculador promove internalização celular quando conjugado ao agente terapêutico (ou seja, no ambiente da porção de vinculador-agente terapêutico do composto de conjugado anticorpo-fármaco como aqui descrito). Ainda em outras modalidades, o vinculador promove internalização celular quando conjugado tanto ao composto de auristatina quanto ao MAb para 158P1D7.
[211] Diversos vinculadores exemplares que podem ser usados com as presentes composições e métodos são descritos em WO 2004-010957, Publicação U.S. N° 2006/0074008, Publicação U.S. N° 20050238649 e Publicação U.S. N° 2006/0024317 (cada um deles sendo aqui incorporado por referência em sua totalidade e para todas as finalidades).
[212] Uma “unidade vinculadora” (LU) é um composto bifuncional que pode ser usado para ligar uma unidade de fármaco e uma unidade de anticorpo para formar um composto de conjugado anticorpo-fármaco. Em algumas modalidades, a unidade vinculadora possui a fórmula: -Aa-Ww-Yy- em que:-A- é uma unidade esticadora, a é 0 ou 1, cada -W- é independentemente uma unidade de aminoácido, w é um número inteiro que varia de 0 a 12, -Y- é uma unidade espaçadora auto-imoladora, e y é 0, 1 ou 2.
[213] Em algumas modalidades, a é 0 ou 1, w é 0 ou 1, e y é 0, 1 ou 2. Em algumas modalidades, a é 0 ou 1, w é 0 ou 1, e y é 0 ou 1. Em algumas modalidades, quando w é 1 a 12, y é 1 ou 2. Em algumas modalidades, w é 2 a 12 e y é 1 ou 2, Em algumas modalidades, a é 1 e w e y são 0.
VI) A unidade esticadora
[214] A unidade esticadora (A), quando presente, é capaz de ligar uma unidade de anticorpo a uma unidade de aminoácido (-W-), se presente, a uma unidade espaçadora (Y-), se presente; ou a uma unidade de fármaco (-D). Grupos funcionais úteis que podem estar presentes em um MAb para 158P1D7 (por exemplo, Ha15-10ac12), naturalmente ou por meio de manipulação química, incluem, sem limitação, grupo sulfidrila, amino, hidroxil, o grupo hidroxila anomérico de um carboidrato, e carboxil. Grupos funcionais adequados são sulfidrila e amino. Em um exemplo, grupos sulfidrila podem ser gerados por redução das ligações dissulfeto intramoleculares de um MAb para 158P1D7. Em outra modalidade, grupos sulfidrila podem ser gerados por reação de um grupo amino de uma porção de lisina de um MAb para 158P1D7 com 2-iminotiolano (reagente de Traut) ou outros reagentes geradores de sulfidrila. Em certas modalidades, o MAb para 158P1D7 é um anticorpo recombinante e é modificado geneticamente para carregar uma ou mais lisinas. Em algumas outras modalidades, o MAb para 158P1D7 recombinante é modificado geneticamente para carregar grupos sulfidrila adicionais, por exemplo, cisteínas adicionais.
[215] Em uma modalidade, a unidade esticadora forma uma ligação com um átomo de enxofre da unidade de anticorpo. O átomo de enxofre pode ser derivado de um grupo sulfidrila de um anticorpo. Unidades esticadoras representativas dessa modalidade são reveladas dentro de colchetes das Fórmulas IIIa e IIIb, em que L-, -W-, -Y-, -D, w e y são como definidos acima, e R17 é selecionado de -C1-C10 alquileno-, -C1-C10 alquenileno-, -C1-C10 alquinileno-, carbociclo-, -O- (C1-C8 alquileno)-, O-(C1-C8 alquenileno)-, -O-(C1-C8 alquinileno)-, -arileno-, -C1-C10 alquileno- arileno-, -C2-C10 alquenileno-arileno, -C2-C10 alquinileno-arileno, - arileno-C1-C10 alquileno-, -arileno-C1-C10 alquenileno-, - arileno-C1-C10 alquinileno-, -C1-C10 alquileno-(carbociclo)-, -C2-C10 alquenileno-(carbociclo)-, -C2-C10 alquinileno- (carbociclo)-, -(carbociclo)-C1-C10 alquileno-, - (carbociclo)-C2-C10 alquenileno-, -(carbociclo)-C2-C10 alquinileno, -heterociclo-, -C1-C10 alquileno-(heterociclo)- , -C2-C10 alquenileno-(heterociclo)-, -C2-C10 alquinileno- (heterociclo)-, -(heterociclo)-C1-C10 alquileno-, - (heterociclo)-C2-C10 alquenileno-, -(heterociclo)-C1-C10 alquinileno-, -(CH2CH2O)r-, ou -(CH2CH2O)r-CH2-, e r é um número inteiro que varia de 1-10, em que os referidos radicais alquil, alquenil, alquinil, alquileno, alquenileno, alquinileno, aril, carbociclo, carbociclo, heterociclo e arileno, isoladamente ou como parte de outro grupo, são opcionalmente substituídos. Em algumas modalidades, os referidos radicais alquil, alquenil, alquinil, alquileno, alquenileno, alquinileno, aril, carbociclo, carbociclo, heterociclo e arileno, isoladamente ou como parte de outro grupo, são não-substituídos. Em algumas modalidades, R17 é selecionado de -C1-C10 alquileno- , - carbociclo-, -O-(C1-C8 alquileno)-, -arileno-, -C1-C10 alquileno-arileno-, -arileno-C1-C10 alquileno-, -C1-C10 alquileno-(carbociclo)-, -(carbociclo)-C1-C10 alquileno-, - C1-C8 heterociclo-, -C1-C10 alquileno-(heterociclo)-, - (heterociclo)-C1-C10 alquileno-, -(CH2CH2O)r- e -(CH2CH2O)r- CH2-; e r é um número inteiro que varia de 1- 10, em que os referidos grupos alquileno são não-substituídos e o restante dos grupos é opcionalmente substituído.
[216] Deve ser subentendido a partir de todas as modalidades exemplares que, até mesmo quando não representado expressamente, de 1 a 20 porções farmacológicas podem ser ligadas a um anticorpo (p = 1-20).
Figure img0005
Figure img0006
[217] Uma unidade esticadora ilustrativa é aquela de Fórmula IIIa em que R17 é -(CH2)5-:
Figure img0007
[218] Outra unidade esticadora ilustrativa é aquela de Fórmula IIIa, em que R17 é -(CH2CH2O)r-CH2-; e r é 2:
Figure img0008
[219] Uma unidade esticadora ilustrativa é aquela de Fórmula IIIa, em que R17 é arileno- ou arileno-C1-C10 alquileno-. Em algumas modalidades, o grupo aril é um grupo fenil não-substituído.
[220] Ainda outra unidade esticadora ilustrativa é aquela de Fórmula IIIb, em que R17 é -(CH2)5-:
Figure img0009
[221] Em certas modalidades, a unidade esticadora está ligada à unidade de anticorpo por meio de uma ligação dissulfeto entre um átomo de enxofre da unidade de anticorpo e um átomo de enxofre da unidade esticadora. Uma unidade esticadora representativa dessa modalidade é revelada dentro de colchetes da Fórmula IV, em que R17, L-,-W-, -Y-, -D, w e y são como definidos acima.
Figure img0010
[222] Deve ser observado que ao longo desse pedido, a porção S na fórmula abaixo se refere a um átomo de enxofre da unidade de anticorpo, a menos que indicado de forma diferente pelo contexto.
Figure img0011
[223] Ainda em outras modalidades, o esticador contém um sítio reativo que pode formar uma ligação com um grupo amino primário ou secundário de um anticorpo. Exemplos desses sítios reativos incluem, sem limitação, ésteres ativados como, por exemplo, succinimida ésteres, 4- nitrofenil ésteres, pentafluorfenil ésteres, tetrafluorfenil ésteres, anidridos, cloretos ácidos, cloretos de sulfonila, isocianatos e isotiocianatos. Unidades esticadoras representativas dessa modalidade são reveladas dentro de colchetes das Fórmulas Va e Vb, em que -R17-, L-, -W-, -Y-, -D, w e y são como definidos acima;
Figure img0012
[224] Em algumas modalidades, o esticador contém um sítio reativo que é reativo a um grupo de carboidrato (-CHO) modificado que pode estar presente em um anticorpo. Por exemplo, um carboidrato pode ser levemente oxidado usando um reagente como, por exemplo, periodato de sódio, e a unidade resultante (-CHO) do carboidrato oxidado pode ser condensada com um esticador que contém uma funcionalidade como, por exemplo, uma hidrazida, uma oxima, uma amina primária ou secundária, uma hidrazina, uma tiossemicarbazona, um carboxilato de hidrazina e uma aril- hidrazida como, por exemplo, aquelas descritas por Kaneko e cols., 1991, Bioconjugate Chem. 2: 133-41. Unidades esticadoras representativas dessa modalidade são reveladas dentro de colchetes das Fórmulas VIa, VIb e VIc, em que - R17-, L-, -W-, -Y-, -D, w e y são como definidos as acima.
Figure img0013
VII) A unidade de aminoácido
[225] A unidade de aminoácido (-W-), quando presente, liga a unidade esticadora à unidade espaçadora, se a unidade espaçadora está presente, liga a unidade esticadora à porção de fármaco, se a unidade espaçadora está ausente, e liga a unidade de anticorpo à unidade de fármaco, se a unidade esticadora e a unidade espaçadora estão ausentes.
[226] Ww- pode ser, por exemplo, uma unidade de monopeptídeo, dipeptídeo, tripeptídeo, tetrapeptídeo, pentapeptídeo, hexapeptídeo, heptapeptídeo, octapeptídeo, nonapeptídeo, decapeptídeo, undecapeptídeo ou dodecapeptídeo. Cada unidade -W- independentemente possui a fórmula representada abaixo entre colchetes, e w é um número inteiro que varia de 0 a 12:
Figure img0014
em que R19 é hidrogênio, metil, isopropil, isobutil, sec-butil, benzil, p-hidroxibenzil, -CH2OH, -CH(OH)CH3, - CH2CH2SCH3, -CH2CONH2, -CH2COOH, -CH2CH2CONH2, -CH2CH2COOH, - (CH2)3NHC(=NH)NH2, -(CH2)3NH2, -(CH2)3NHCOCH3, -(CH2)3NHCHO, - (CH2)4NHC(=NH)NH2, -(CH2)4NH2, -(CH2)4NHCOCH3, -(CH2)4NHCHO, - (CH2)3NHCONH2, -(CH2)4NHCONH2, -CH2CH2CH(OH)CH2NH2, 2- piridilmetil-, 3-piridilmetil-, 4-piridilmetil-, fenil, ciclohexil,
Figure img0015
Figure img0016
[227] Em algumas modalidades, a unidade de aminoácido pode ser enzimaticamente clivada por uma ou mais enzimas, incluindo uma protease associada a um câncer ou tumor, para liberar a unidade de fármaco (-D) que, em uma modalidade, é protonada in vivo mediante liberação para fornecer um fármaco (D).
[228] Em certas modalidades, a unidade de aminoácido pode compreender aminoácidos naturais. Em outras modalidades, a unidade de aminoácido pode compreender aminoácidos não naturais. Unidades Ww ilustrativas são representadas pelas fórmulas (VII)-(IX):
Figure img0017
em que R20 e R21 são como a seguir:
Figure img0018
Figure img0019
Figure img0020
em que R20, R21 e R22 são como a seguir:
Figure img0021
Figure img0022
em que R20, R21, R22 e R23 são como a seguir:
Figure img0023
[229] Unidades de aminoácido exemplares incluem, sem limitação, unidades de fórmula VII NAS QUAIS: R20 é benzil e R21 é -(CH2)4NH2; R20 é isopropil e R21 é -(CH2)4NH2; ou R20 é isopropil e R21 é -(CH2)3NHCONH2. Outra unidade de aminoácido exemplar é uma unidade de fórmula VIII, em que R20 é benzil, R21 é benzil e R22 é -(CH2)4NH2.
[230] Unidades -Ww- úteis podem ser projetadas e otimizadas em sua seletividade para clivagem enzimática por uma enzima particular, por exemplo, uma protease associada a um tumor. Em uma modalidade, uma unidade -Ww- é aquela cuja clivagem é catalisada por catepsina B, C e D, ou uma plasmina-protease.
[231] Em uma modalidade, -Ww- é um dipeptídeo, tripeptídeo, tetrapeptídeo ou pentapeptídeo. Quando R19, R20, R21, R22 ou R23 é diferente de hidrogênio, o átomo de carbono ao qual R19, R20, R21, R22 ou R23 está anexado é quiral.
[232] Cada átomo de carbono ao qual R19, R20, R21, R22 ou R23 está anexado está independentemente na configuração (S) ou (R).
[233] Em um aspecto da unidade de aminoácido, a unidade de aminoácido é valina-citrulina (vc ou val-cit). Em outro aspecto, a unidade de aminoácido é fenilalanina-lisina (ou seja, fk). Ainda em outro aspecto da unidade de aminoácido, a unidade de aminoácido é N-metilvalina-citrulina. Ainda em outro aspecto, a unidade de aminoácido é ácido 5- aminovalérico, homofenilalanina-lisina, tetraisoquinolinacarboxilato-lisina, ciclohexilalanina- lisina, ácido isonepecótico-lisina, beta-alanina-lisina, glicina-serina-valina-glutamina e ácido isonepecótico.
VIII) A unidade espaçadora
[234] A unidade espaçadora (-Y-), quando presente, liga uma unidade de aminoácido à unidade de fármaco, quando uma unidade de aminoácido está presente. Alternativamente, a unidade espaçadora liga a unidade esticadora à unidade de fármaco quando a unidade de aminoácido está ausente. A unidade espaçadora também liga a unidade de fármaco à unidade de anticorpo quando tanto a unidade de aminoácido quanto a unidade esticadora estão ausentes.
[235] Unidades espaçadoras são de dois tipos gerais: não auto-imoladoras ou auto-imoladoras. Uma unidade espaçadora não auto-imoladora é aquela na qual parte ou toda a unidade espaçadora permanece ligada à porção de fármaco após clivagem, particularmente enzimática, de uma unidade de aminoácido do conjugado anticorpo-fármaco. Exemplos de uma unidade espaçadora não auto-imoladora incluem, sem limitação, uma unidade espaçadora de (glicina- glicina) e uma unidade espaçadora de glicina (ambas reveladas no Esquema 1) (infra). Quando um conjugado que contém uma unidade espaçadora de glicina-glicina ou uma unidade espaçadora de glicina passa por clivagem enzimática por meio de uma enzima (por exemplo, a protease associada a uma célula tumoral, uma protease associada a uma célula de câncer ou uma protease associada a um linfócito), uma porção de glicina-glicina-fármaco ou uma porção de glicina- fármaco é clivada de L-Aa-Ww-. Em uma modalidade, uma reação de hidrólise independente ocorre dentro da célula- alvo, clivando a porção de glicina-fármaco ligada e liberando o fármaco. Esquema 1
Figure img0024
[236] Em algumas modalidades, uma unidade espaçadora não auto-imoladora (-Y-) é -Gly-. Em algumas modalidades, uma unidade espaçadora não auto-imoladora (-Y-) é -Gly-Gly-.
[237] Em uma modalidade, é fornecido um conjugado fármaco-vinculador no qual a unidade espaçadora está ausente (y=0), ou um sal farmaceuticamente aceitável ou solvato desta.
[238] Alternativamente, um conjugado que contém uma unidade espaçadora auto-imoladora pode liberar -D. Como aqui usado, o termo “espaçador auto-imolador” se refere a uma porção química bifuncional que é capaz de ligar covalentemente juntas duas porções químicas espaçadas em uma molécula tripartite estável. Ele irá se separar espontaneamente da segunda porção química se sua ligação à primeira porção for clivada.
[239] Em algumas modalidades, -Yy- é uma unidade de álcool p-aminobenzílico (PAB) (veja os Esquemas 2 e 3), cuja porção fenileno é substituída com Qm, em que Q é -C1-C8 alquil, -C1-C8 alquenil, - C1-C8 alquinil, -O-(C1-C8 alquil), -O-(C1-C8 alquenil), -O-(C1-C8 alquinil), -halogênio, -nitro ou -ciano; e m é um número inteiro que varia de 0-4. Os grupos alquil, alquenil e alquinil, isoladamente ou como parte de outro grupo, podem ser opcionalmente substituídos.
[240] Em algumas modalidades, -Y- é um grupo PAB que está ligado a -Ww- por meio do átomo de nitrogênio de amino do grupo PAB, e conectado diretamente ao -D por meio de umgrupo carbonato, carbamato ou éter. Sem se prender a uma teoria ou mecanismo em particular, o Esquema 2 revela um possível mecanismo de liberação de fármaco de um grupo PAB que está anexado diretamente ao -D por meio de um grupo carbamato ou carbonato, como descrito por Toki e cols., 2002, J. Org. Chem. 67: 1.866-1.872. Esquema 2
Figure img0025
[241] No Esquema 2, Q é -C1-C8 alquil, -C1-C8 alquenil, -C1-C8 alquinil, -O-(C1-C8 alquil), -O-(C1-C8 alquenil), -O- (C1-C8 alquinil), -halogênio, -nitro ou -ciano; m é um número inteiro que varia de 0- 4; e p varia de 1 a cerca de 20. Os grupos alquil, alquenil e alquinil, isoladamente ou como parte de outro grupo, podem ser opcionalmente substituídos.
[242] Sem se prender a uma teoria ou mecanismo em particular, o Esquema 3 revela um possível mecanismo de liberação de fármaco de um grupo PAB que está anexado diretamente ao -D via uma ligação éter ou amina, em que D inclui o grupo oxigênio ou nitrogênio que é parte da unidade de fármaco.Esquema 3
Figure img0026
[243] No Esquema 3, Q é -C1-C8 alquil, -C1-C8 alquenil, -C1-C8 alquinil, -O-(C1-C8 alquil), -O(C1-C8 alquenil), -O- (C1-C8 alquinil), -halogênio, -nitro ou -ciano; m é um número inteiro que varia de 0- 4; e p varia de 1 a cerca de 20. Os grupos alquil, alquenil e alquinil, isoladamente ou como parte de outro grupo, podem ser opcionalmente substituídos.
[244] Outros exemplos de espaçadores auto-imoladores incluem, sem limitação, compostos aromáticos que são eletronicamente similares ao grupo PAB como, por exemplo, derivados de 2-aminoimidazol-5-metanol (Hay e cols., 1999, Bioorg. Med. Chem. Lett. 9:2237) e orto ou para- aminobenzilacetais. Podem ser usados espaçadores que passam por ciclização mediante hidrólise da ligação amida, por exemplo, amidas de ácido 4-aminobutírico substituídas e não-substituídas (Rodrigues e cols., 1995, Chemistry Biology 2:223), sistemas de anel biciclo[2.2.1] e biciclo[2.2.2] apropriadamente substituído (Storm e cols., 1972, J. Amer. Chem. Soc. 94: 5.815) e amidas de ácido 2- aminofenilpropiônico (Amsberry e cols., 1990, J. Org. Chem. 55: 5.867), A eliminação de fármacos que contêm amina que são substituídos na posição α de glicina (Kingsbury e cols., 1984, J. Med. Chem. 27: 1.447) também são exemplos de espaçadores auto-imoladores.
[245] Em uma modalidade, a unidade espaçadora é uma unidade de bis(hidroximetil)-estireno ramificado (BHMS), como revelado no Esquema 4, que pode ser usada para incorporar e liberar múltiplos fármacos. Esquema 4
Figure img0027
[246] No Esquema 4, Q é -C1-C8 alquil, -C1-C8 alquenil, -C1-C8 alquinil, -O-(C1-C8 alquil), -O(C1-C8 alquenil), - O(C1-C8 alquinil), -halogênio, -nitro ou -ciano; m é um número inteiro que varia de 0- 4; n é 0 ou 1; e p varia de 1 a cerca de 20. Os grupos alquil, alquenil e alquinil, isoladamente ou como parte de outro grupo, podem ser opcionalmente substituídos.
[247] Em algumas modalidades, as porções -D são iguais. Ainda em outra modalidade, as porções -D são diferentes.
[248] Em um aspecto, unidades espaçadoras (-Yy-) são representadas pelas Fórmulas (X)-(XII):
Figure img0028
em que Q é -C1-C8 alquil, -C1-C8 alquenil, -C1-C8 alquinil, -O-(C1-C8 alquil), -O-(C1-C8 alquenil), O-(C1-C8 alquinil), -halogênio, -nitro ou -ciano; e m é um número inteiro que varia de 0-4. Os grupos alquil, alquenil e alquinil, isoladamente ou como parte de outro grupo, podem ser opcionalmente substituídos.
Figure img0029
[249] Modalidades da Fórmulas I e II que compreendem anticorpo-fármaco podem incluir:
Figure img0030
em que w e y são, cada um, 1 ou 2 e,
Figure img0031
em que w e y são, cada um, 0
Figure img0032
IX) A unidade de fármaco
[250] A porção de fármaco (D) pode ser qualquer citotóxico, citostático ou imunomodulador (por exemplo, imunossupressor) ou fármaco. D é uma unidade de fármaco (porção) que possui um átomo que pode formar uma ligação com a unidade espaçadora, com a unidade de aminoácido, com a unidade esticadora ou com a unidade de anticorpo. Em algumas modalidades, a unidade de fármaco D possui um átomo de nitrogênio que pode formar uma ligação com a unidade espaçadora. Como aqui usados, os termos “unidade de fármaco” e “porção de fármaco” são sinônimos e usados de forma intercambiável.
[251] Classes úteis de agentes citotóxicos ou imunomoduladores incluem, por exemplo, agentes antitubulina, aglutinantes do sulco menor de DNA, inibidores da replicação de DNA e agentes alquilantes.
[252] Em algumas modalidades, o fármaco é uma auristatina, por exemplo, auristatina E (também conhecida na técnica como um derivado de dolastatina-10) ou um derivado desta. A auristatina pode ser, por exemplo, um éster formado entre auristatina E e um ceto ácido. Por exemplo, auristatina E pode ser reagida com ácido para- acetil-benzóico ou ácido benzoilvalérico para produzir AEB e AEVB, respectivamente. Outras auristatinas típicas incluem AFP, MMAF e MMAE. A síntese e estrutura de auristatinas exemplares são descritas nas Publicações de Pedidos de Patente U.S. Nos 2003-0083263, 2005-0238649 e 2005-0009751; Publicação de Patente International N° WO 04/010957, Publicação de Patente International N° WO 02/088172, e Patentes U.S. Nos 6.323.315, 6.239. 104, 6.034.065, 5.780.588, 5.665.860, 5.663.149, 5.635.483, 5.599.902, 5.554.725, 5.530.097, 5.521.284, 5.504.191, 5.410.024, 5. 138.036, 5.076.973, 4.986.988, 4.978.744, 4.879.278, 4.816.444 e 4.486.414, cada uma delas sendo aqui incorporada por referência em sua totalidade e para todas as finalidades.
[253] Foi demonstrado que auristatinas interferem com a dinâmica do microtúbulo e divisão nuclear e celular e possuem atividade anticâncer. Auristatinas se ligam à tubulina e podem exercer um efeito citotóxico ou citostático em uma célula que expressa 158P1D7. Há diversos ensaios diferentes, conhecidos na técnica, que podem ser usados para determinar se uma auristatina ou o conjugado anticorpo-fármaco resultante exerce um efeito citostático ou citotóxico em uma linhagem de células desejada.
[254] Métodos para determinar se um composto se liga à tubulina são conhecidos na técnica. Veja, por exemplo, Muller e cols., Anal. Chem. 2006, 78, 4.390-4.397; Hamel e cols., Molecular Pharmacology, 1995 47: 965-976; e Hamel e cols., The Journal of Biological Chemistry, 1990 265: 28, 17.141-17.149. Para os objetivos da presente invenção, a afinidade relativa de um composto para tubulina pode ser determinada. Algumas auristatinas preferidas da presente invenção se ligam à tubulina com uma afinidade que varia de 10 vezes menor (afinidade mais fraca) do que a afinidade de ligação de MMAE à tubulina até 10 vezes, 20 vezes ou até mesmo 100 vezes maior (afinidade maior) do que a afinidade de ligação de MMAE à tubulina.
[255] Em algumas modalidades, -D é uma auristatina da Fórmula DE ou DF:
Figure img0033
ou um sal farmaceuticamente aceitável ou forma de solvato deste; em que, independentemente em cada localização: a linha ondulada indica uma ligação; R2 é -C1-C20 alquil, -C2-C20 alquenil ou -C2-C20 alquinil; R3 é -H, -C1-C20 alquil, -C2-C20 alquenil, -C2-C20 alquinil, -carbociclo, -C1-C20 alquileno (carbociclo), -C2C20 alquenileno(carbociclo), -C2-C20 alquinileno(carbociclo), -aril, -C1-C20 alquileno(aril), - C2-C20 alquenileno(aril), -C2-C20 alquinileno(aril), heterociclo, -C1-C20 alquileno(heterociclo), -C2-C20 alquenileno (heterociclo) ou -C2-C20 alquinileno(heterociclo); R4 é -H, -C1-C20 alquil, -C2-C20 alquenil, -C2-C20 alquinil, carbociclo, -C1-C20 alquileno (carbociclo), -C2-C20 alquenileno(carbociclo), -C2-C20 alquinileno(carbociclo), aril, -C1-C20 alquileno(aril), -C2-C20 alquenileno(aril), - C2-C20 alquinileno(aril), -heterociclo, -C1-C20 alquileno(heterociclo), -C2-C20 alquenileno (heterociclo), ou -C2-C20 alquinileno(heterociclo); R5 é -H ou -C1-C8 alquil; ou R4 e R5 em conjunto formam um anel carbocíclico e possuem a fórmula -(CRaRb)s-, em que Ra e Rb são independentemente -H, -C1-C20 alquil, -C2-C20 alquenil, -C2C20 alquinil ou -carbociclo e s é 2, 3, 4, 5 ou 6, R6 é -H, -C1-C20 alquil, -C2-C20 alquenil ou -C2-C20 alquinil; R7 é -H, -C1-C20 alquil, -C2-C20 alquenil, -C2-C20 alquinil, carbociclo, -C1-C20 alquileno (carbociclo), -C2-C20 alquenileno(carbociclo), -C2-C20 alquinileno(carbociclo), - aril, -C1-C20 alquileno(aril), -C2-C20 alquenileno(aril), - C2-C20 alquinileno(aril), heterociclo, -C\-C20 alquileno(heterociclo), -C2-C20 alquenileno (heterociclo), ou -C2-C20 alquinileno(heterociclo); cada R8 é independentemente -H, -OH, -C1-C20 alquil, - C2-C20 alquenil, -C2-C20 alquinil, -O- (C1-C20 alquil), -O- (C2-C20 alquenil), -O-(C1-C20 alquinil) ou -carbociclo; R9 é -H, -C1-C20 alquil, -C2-C20 alquenil ou -C2-C20 alquinil; R24 é -aril, -heterociclo ou -carbociclo; R25 é -H, C1-C20 alquil, -C2-C20 alquenil, -C2-C20 alquinil, -carbociclo, -O-(C1-C20 alquil), -O-(C2-C20 alquenil), -O-(C2-C20 alquinil), ou OR18, em que R18 é -H, um grupo de proteção de hidroxila, ou uma ligação direta, em que OR18 representa =O; R26 é -H, -C1-C20 alquil, -C2-C20 alquenil ou -C2-C20 alquinil, -aril, -heterociclo ou -carbociclo; R10 é -aril ou -heterociclo; Z é -O, -S, -NH, ou -NR12, em que R12 é -C1-C20 alquil, -C2-C20 alquenil ou -C2-C20 alquinil; R11 é -H, -C1-C20 alquil, -C2-C20 alquenil, -C2-C20 alquinil, -aril, -heterociclo, -(R13O)m-R14, ou -(R13O)m- CH(R15)2; m é um número inteiro que varia de 1-1.000; R13 é -C2-C20 alquileno, -C2-C20 alquenileno ou -C2-C20 alquinileno; R14 é -H, -C1-C20 alquil, -C2-C20 alquenil ou -C2-C20 alquinil; cada ocorrência de R15 é independentemente -H, -COOH, -(CH2)n-N(R16)2, -(CH2)n-SO3H, -(CH2)n-SO3-C1-C20 alquil, - (CH2)n-SO3-C2-C20 alquenil ou -(CH2)n-SO3-C2-C20 alquinil; cada ocorrência de R16 é independentemente -H, -C1-C20 alquil, -C2-C20 alquenil, -C2-C20 alquinil ou -(CH2)n-COOH; e n é um número inteiro que varia de 0 a 6; em que os referidos radicais alquil, alquenil, alquinil, alquileno, alquenileno, alquinileno, aril, carbociclo e heterociclo, isoladamente ou como parte de outro grupo, são opcionalmente substituídos.
[256] Auristatinas da Fórmula DE incluem aquelas nas quais os referidos radicais alquil, alquenil, alquinil, alquileno, alquenileno, alquinileno, aril, carbociclo e heterociclo são não-substituídos.
[257] Auristatinas da Fórmula DE incluem aquelas nas quais os grupos de R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8 e R9 são não- substituídos e os grupos de R19, R20 e R21 são opcionalmente substituídos como aqui descrito.
[258] Auristatinas da Fórmula DE incluem aquelas nas quais: R2 é C1-C8 alquil; R3, R4 e R7 são selecionados independentemente de -H, -C1-C20 alquil, -C2-C20 alquenil, -C2-C20 alquinil, C3-C6 carbociclo monocíclico, -C1-C20 alquileno(C3-C6 carbociclo monocíclico), -C2-C20 alquenileno(C3-C6 carbociclo monocíclico), -C2-C20 alquinileno(C3-C6 carbociclo monocíclico), C6-C10 aril, -C1-C20 alquileno(C6-C10 aril), - C2-C20 alquenileno(C6-C10 aril), -C2-C20 alquinileno(C6-C10 aril), heterociclo, -C1-C20 alquileno(heterociclo), -C2-C20 alquenileno(heterociclo), ou -C2-C20 alquinileno(heterociclo); em que os referidos radicais alquil, alquenil, alquinil, alquileno, alquenileno, alquinileno, carbociclo, aril e heterociclo são opcionalmente substituídos; R5 é -H; R6 é -C1-C8 alquil; cada R8 é selecionado independentemente de -OH, -O- (C1-C20 alquil), -O-(C2-C20 alquenil), ou -O-(C2-C20 alquinil), em que os referidos radicais alquil, alquenil e alquinil são opcionalmente substituídos; R9 é -H ou -C1-C8 alquil; R24 é -fenil opcionalmente substituído; R25 é -OR18; em que -OR18 é H, um grupo de proteção de hidroxila, ou uma ligação direta em que OR18 representa =O; R26 é selecionado de -H, -C1-C20 alquil, -C2-C20 alquenil, -C2-C20 alquinil ou -carbociclo; em que os referidos radicais alquil, alquenil, alquinil e carbociclo são opcionalmente substituídos; ou um sal farmaceuticamente aceitável ou forma de solvato deste.
[259] Auristatinas da Fórmula DE incluem aquelas nas quais: R2 é metil; R3 é -H, -C1-C8 alquil, -C2-C8 alquenil ou C2-C8 alquinil, em que os referidos radicais alquil, alquenil e alquinil são opcionalmente substituídos; R4 é -H, -C1-C8 alquil, -C2-C8 alquenil, -C2-C8 alquinil, C3-C6 carbociclo monocíclico, -C6-C10 aril, -C1-C8 alquileno(C6-C10 aril), -C2-C8 alquenileno(C6-C10 aril), -C2C8 alquinileno(C6-C10 aril), -C1-C8 alquileno (C3-C6 carbociclo monocíclico), -C2-C8 alquenileno (C3-C6 carbociclo monocíclico), -C2-C8 alquinileno(C3-C6 carbociclo monocíclico); em que os referidos radicais alquil, alquenil, alquinil, alquileno, alquenileno, alquinileno, aril e carbociclo isoladamente ou como parte de outro grupo são opcionalmente substituídos; R5 é -H; R6 é metil; R7 é -C1-C8 alquil, -C2-C8 alquenil ou -C2-C8 alquinil; cada R8 é metóxi; R9 é -H ou -C1-C8 alquil; R24 é -fenil; R25 é -OR18; em que R18 é H, um grupo de proteção de hidroxila, ou uma ligação direta em que OR18 representa =O; R26 é metil; ou uma forma de sal farmaceuticamente aceitável deste.
[260] Auristatinas da Fórmula DE incluem aquelas nas quais: R2 é metil; R3 é -H ou -C1-C3 alquil; R4 é -C1-C5 alquil; R5 é -H; R6 é metil; R7 é isopropil ou sec-butil; R8 é metóxi; R9 é -H ou -C1-C8 alquil; R24 é fenil; R25 é -OR18; em que R18 é -H, um grupo de proteção de hidroxila, ou uma ligação direta em que OR18 representa =O; e R26 é metil; ou um sal farmaceuticamente aceitável ou forma de solvato deste.
[261] Auristatinas da Fórmula DE incluem aquelas nas quais: R2 é metil ou C1-C3 alquil, R3 é -H ou -C1-C3 alquil; R4 é -C1-C5 alquil; R5 é H; R6 é C1-C3 alquil; R7 é -C1-C5 alquil; R8 é -C1-C3 alcóxi; R9 é -H ou -C1-C8 alquil; R24 é fenil; R25 é -OR18; em que R18 é -H, um grupo de proteção de hidroxila, ou uma ligação direta em que OR18 representa =O; e R26 é -C1-C3 alquil; ou uma forma de sal farmaceuticamente aceitável deste.
[262] Auristatinas da Fórmula DF incluem aquelas nas quais: R2 é metil; R3, R4 e R7 são selecionados independentemente de -H, - C1-C20 alquil, -C2-C20 alquenil, -C2-C20 alquinil, C3-C6 carbociclo monocíclico, -C1-C20 alquileno(C3-C6 carbociclo monocíclico), -C2-C20 alquenileno(C3-C6 carbociclo monocíclico), -C2-C20 alquinileno(C3-C6 carbociclo monocíclico), -C6-C10 aril, -C1-C20 alquileno(C6-C10 aril), - C2-C20 alquenileno(C6-C10 aril), -C2-C20 alquinileno(C6-C10 aril), heterociclo, -C1-C20 alquileno(heterociclo), -C2-C20 alquenileno(heterociclo) ou -C2-C20 alquinileno(heterociclo); em que os referidos radicais alquil, alquenil, alquinil, alquileno, alquenileno, alquinileno, carbociclo, aril e heterociclo isoladamente ou como parte de outro grupo são opcionalmente substituídos; R5 é -H; R6 é metil; cada R8 é metóxi; R9 é -H, -C1-C20 alquil, -C2-C20 alquenil ou -C2-C20 alquinil; em que os referidos radicais alquil, alquenil e alquinil são opcionalmente substituídos; R10 é aril opcionalmente substituído ou heterociclo opcionalmente substituído; Z é -O-, -S-, -NH- ou -NR, em que R12 é -C1-C20 alquil, -C2-C20 alquenil ou -C2-C20 alquinil, cada um deles sendo opcionalmente substituído; R11 é -H, -C1-C20 alquil, -C2-C20 alquenil, -C2-C20 alquinil, -aril, -heterociclo, -(R13O)m- R14 ou -(R13O)m- CH(R15)2, em que os referidos radicais alquil, alquenil, alquinil, aril e heterociclo são opcionalmente substituídos; m é um número inteiro que varia de 1-1.000 ou m = 0; R13 é -C2-C20 alquileno, -C2-C20 alquenileno ou -C2-C20 alquinileno, cada um deles sendo opcionalmente substituído; R14 é -H, -C1-C20 alquil, -C2-C20 alquenil ou -C2-C20 alquinil em que os referidos radicais alquil, alquenil e alquinil são opcionalmente substituídos; cada ocorrência de R15 é independentemente -H, -COOH, -(CH2)n-N(R16)2, -(CH2)n-SO3H, -(CH2)n-SO3-C1-C20 alquil, - (CH2)n-SO3-C2-C20 alquenil ou -(CH2)n-SO3-C2-C20 alquinil, em que os referidos radicais alquil, alquenil e alquinil são opcionalmente substituídos; cada ocorrência de R16 é independentemente -H, -C1-C20 alquil, -C2-C20 alquenil, -C2-C20 alquinil ou -(CH2)n-COOH, em que os referidos radicais alquil, alquenil e alquinil são opcionalmente substituídos; n é um número inteiro que varia de 0 a 6; ou um sal farmaceuticamente aceitável deste.
[263] Em algumas dessas modalidades, R10 é fenil opcionalmente substituído.
[264] Auristatinas da Fórmula DF incluem aquelas nas quais os grupos de R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8 e R9 são não- substituídos e os grupos de R10 e R11 são como aqui descritos.
[265] Auristatinas da Fórmula DF incluem aquelas nas quais os referidos radicais alquil, alquenil, alquinil, alquileno, alquenileno, alquinileno, aril, carbociclo e heterociclo são não-substituídos.
[266] Auristatinas da Fórmula DF incluem aquelas nas quais: R2 é -C1-C3 alquil; R3 é -H ou -C1-C3 alquil; R4 é -C1-C5 alquil; R5 é -H; R6 é -C1-C3 alquil; R7 é -C1-C5 alquil; R8 é — C1-C3 alcóxi; R9 é -H ou -C1-C8 alquil; R10 é fenil opcionalmente substituído; Z é -O-, -S- ou -NH-; R11 é como aqui definido; ou um sal farmaceuticamente aceitável deste.
[267] Auristatinas da Fórmula DF incluem aquelas nas quais: R2 é metil; R3 é -H ou -C1-C3 alquil; R4 é -C1-C5 alquil; R5 é -H; R6 é metil; R7 é isopropil ou sec-butil; R8 é metóxi; R9 é -H ou -C1-C8 alquil; R10 é fenil opcionalmente substituído; Z é -O-, -S- ou -NH-; e R11 é como aqui definido; ou um sal farmaceuticamente aceitável deste.
[268] Auristatinas da Fórmula DF incluem aquelas nas quais: R2 é metil; R3 é -H ou -C1-C3 alquil; R4 é -C1-C5 alquil; R5 é -H; R6 é metil; R7 é isopropil ou sec-butil; R8 é metóxi; R9 é -H ou C1-C8 alquil; R10 é fenil; e Z é -O- ou - NH- e R11 é como aqui definido, preferivelmente hidrogênio; ou uma forma de sal farmaceuticamente aceitável deste.
[269] Auristatinas da Fórmula DF incluem aquelas nas quais: R2 é -C1-C3 alquil; R3 é -H ou -C1-C3 alquil; R4 é -C1-C5 alquil; R5 é -H; R6 é -C1-C3 alquil; R7 é -C1-C5 alquil; R8 é - C1-C3 alcóxi; R9 é -H ou -C1-C8 alquil; R10 é fenil; e Z é -O- ou -NH- e R11 é como aqui definido, preferivelmente hidrogênio; ou uma forma de sal farmaceuticamente aceitável deste.
[270] Auristatinas da Fórmula DE ou DF incluem aquelas nas quais R3, R4 e R7 são independentemente isopropil ou sec-butil e R5 é -H. Em uma modalidade exemplar, R3 e R4 são, cada um, isopropil, R5 é H, e R7 é sec-butil. O restante dos substituintes é como aqui definido.
[271] Auristatinas da Fórmula DE ou DF incluem aquelas nas quais R2 e R6 são, cada um, metil, e R9 é H. O restante dos substituintes é como aqui definido.
[272] Auristatinas da Fórmula DE ou DF incluem aquelas nas quais cada ocorrência de R8 é -OCH3. O restante dos substituintes é como aqui definido.
[273] Auristatinas da Fórmula DE ou DF incluem aquelas nas quais R3 e R4 são, cada um, isopropil, R2 e R6 são, cada um, metil, R5 é H, R7 é sec-butil, cada ocorrência de R8 é - OCH3, e R9 é H. O restante dos substituintes é como aqui definido.
[274] Auristatinas da Fórmula DF incluem aquelas nas quais Z é -O- ou -NH-. O restante dos substituintes é como aqui definido.
[275] Auristatinas da Fórmula DF incluem aquelas nas quais R10 é aril. O restante dos substituintes é como aqui definido.
[276] Auristatinas da Fórmula DF incluem aquelas nas quais R10 é -fenil. O restante dos substituintes é como aqui definido.
[277] Auristatinas da Fórmula DF incluem aquelas nas quais Z é -O-, e R11 é H, metil ou t-butil. O restante dos substituintes é como aqui definido.
[278] Auristatinas da Fórmula DF incluem aquelas nas quais, quando Z é -NH-, R11 é -(R13O)m-CH(R15)2, em que R15 é -(CH2)n-N(R16)2 e R16 é -C1-C8 alquil ou -(CH2)n-COOH. O restante dos substituintes é como aqui definido.
[279] Auristatinas da Fórmula DF incluem aquelas nas quais quando Z é -NH-, R11 é -(R13O)m-CH(R15)2, em que R15 é - (CH2)n-SO3H. O restante dos substituintes é como aqui definido.
[280] Em modalidades preferidas, quando D é uma auristatina de Fórmula DE, W é um número inteiro que varia de 1 a 12, preferivelmente 2 a 12, y é 1 ou 2, e a é preferivelmente 1.
[281] Em algumas modalidades, em que D é uma auristatina de Fórmula DF, a é 1 e w e y são 0.
[282] Unidades de fármaco ilustrativas (-D) incluem as unidades de fármaco que possuem as seguintes estruturas:
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ou sais farmaceuticamente aceitáveis ou solvatos destas.
[283] Em um aspecto, grupos hidrofílicos como, por exemplo, sem limitação, ésteres de trietileno glicol (TEG), podem ser anexados à unidade de fármaco em R11. Sem se prender a uma teoria, os grupos hidrofílicos ajudam na internalização e não aglomeração da unidade de fármaco.
[284] Em algumas modalidades, a unidade de fármaco não é TZT-1027. Em algumas modalidades, a unidade de fármaco não é auristatina E, dolastatina 10 ou auristatina PE.
[285] Compostos exemplares de conjugado anticorpo- fármaco possuem as seguintes estruturas, em que “L” ou “mAb-s-” representa um MAb para 158P1D7 designado Ha15-10ac12 aqui descrito:
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ou um sal farmaceuticamente aceitável destes.
[286] Em algumas modalidades, a unidade de fármaco é uma caliqueamicina, camptotecina, um maitansinóide ou uma antraciclina. Em algumas modalidades, o fármaco é um taxano, um inibidor da topoisomerase, um alcalóide da vinca, ou semelhantes.
[287] Em algumas modalidades típicas, agentes citotóxicos adequados incluem, por exemplo, aglutinantes do sulco menor de DNA (por exemplo, enediinas e lexitropsinas, um composto de CBI; veja também a Patente U.S. N° 6.130.237), duocarmicinas, taxanos (por exemplo, paclitaxel e docetaxel), puromicinas e alcalóides da vinca. Outros agentes citotóxicos incluem, por exemplo, CC-1065, SN-38, topotecan, morfolino-doxorrubicina, rizoxina, cianomorfolino-doxorrubicina, equinomicina, combretastatina, netropsina, epotilona A e B, estramustina, criptofisinas, cemadotina, maitansinóides, discodermolida, eleuterobina e mitoxantrona.
[288] Em algumas modalidades, o fármaco é um agente anti-tubulina. Exemplos de agentes anti-tubulina incluem, auristatinas, taxanos (por exemplo, Taxol® (paclitaxel), Taxotere® (docetaxel)), T67 (Tularik) e alcalóides da vinca (por exemplo, vincristina, vinblastina, vindesina e vinorelbina). Outros agentes antitubulina incluem, por exemplo, derivados de bacatina, análogos de taxano (por exemplo, epotilona A e B), nocodazol, colchicina e colcimid, estramustina, criptoficinas, cemadotina,maitansinóides, combretastatinas, discodermolida e eleuterobina.
[289] Em certas modalidades, o agente citotóxico é um maitansinóide, outro grupo de agentes anti-tubulina. Por exemplo, em modalidades específicas, o maitansinóide é maitansina ou DM- 1 (ImmunoGen, Inc.; veja também Chari e cols., 1992, Cancer Res. 52: 127-131).
[290] Em certas modalidades, o agente citotóxico ou citostático é uma dolastatina. Em certas modalidades, o agente citotóxico ou citostático é da classe de auristatina. Dessa forma, em uma modalidade específica, o agente citotóxico ou citostático é MMAE (Formula XI). Em outra modalidade específica, o agente citotóxico ou citostático é AFP (Formula XVI).
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[291] Em certas modalidades, o agente citotóxico ou citostático é um composto de fórmulas XII-XXI ou um sal farmaceuticamente aceitável deste:
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X) Carregamento de fármaco
[292] O carregamento de fármaco é representado por p e é o número médio de porções de fármaco por anticorpo em uma molécula. O carregamento de fármaco pode variar de 1 a 20 porções farmacológicas (D) por anticorpo. Os ADCs da invenção incluem coleções de anticorpos conjugados com uma gama de porções farmacológicas, de 1 a 20. O número médio de porções farmacológicas por anticorpo em preparações de ADC de reações de conjugação pode ser caracterizado por meios convencionais como, por exemplo, espectroscopia de massa e ensaio de ELISA. A distribuição quantitativa de ADC em termos de p também pode ser determinada. Em alguns casos, a separação, purificação e caracterização de ADC homogêneo em que p é certo valor de ADC com outros carregamentos de fármaco podem ser obtidas por meios como, por exemplo, eletroforese.
[293] Para alguns conjugados anticorpo-fármaco, p pode ser limitado pelo número de sítios de adesão no anticorpo. Por exemplo, quando a adesão é um tiol de cisteína, como nas modalidades exemplares acima, um anticorpo pode ter apenas um ou vários grupos tiol de cisteína, ou pode ter apenas um ou vários grupos tiol suficientemente reativos através dos quais um vinculador pode ser anexado. Em certas modalidades, um carregamento de fármaco maior, por exemplo, p > 5, pode causar agregação, insolubilidade, toxicidade, ou perda de permeabilidade celular de certos conjugados anticorpo-fármaco. Em certas modalidades, o carregamento de fármaco for um ADC da invenção varia de 1 a cerca de 8; de cerca de 2 a cerca de 6; de cerca de 3 a cerca de 5; de cerca de 3 a cerca de 4; de cerca de 3,1 a cerca de 3,9; de cerca de 3,2 a cerca de 3,8; de cerca de 3,2 a cerca de 3,7; de cerca de 3,2 a cerca de 3,6; de cerca de 3,3 a cerca de 3,8; ou de cerca de 3,3 a cerca de 3,7. Na verdade, foi demonstrado que, para certos ADCs, a proporção ótima de porções farmacológicas por anticorpo pode ser menos do que 8, e pode ser cerca de 2 a cerca de 5. Veja US 2005-0238649 Al (aqui incorporada por referência em sua totalidade).
[294] Em certas modalidades, menos do que o máximo teórico de porções farmacológicas é conjugado a um anticorpo durante uma reação de conjugação. Um anticorpo pode conter, por exemplo, resíduos de lisina que não reagem com o fármaco-vinculador intermediário ou reagente vinculador, como discutido abaixo. Geralmente, anticorpos não contêm muitos grupos tiol de cisteína livres e reativos que podem estar ligados a uma porção farmacológica; na verdade, a maioria dos resíduos tiol de cisteína em anticorpos existe como pontes dissulfeto. Em certas modalidades, um anticorpo pode ser reduzido com um agente redutor como, por exemplo, ditiotreitol (DTT) ou tricarboniletilfosfina (TCEP), sob condições redutoras parciais ou totais, para gerar grupos tiol de cisteína reativos. Em certas modalidades, um anticorpo é submetido às condições desnaturantes para revelar grupos nucleofílicos reativos como, por exemplo, lisina ou cisteína.
[295] O carregamento (proporção fármaco/anticorpo) de um ADC pode ser controlado de diferentes formas, por exemplo, por: (i) limitação do excesso molar de fármaco-vinculador intermediário ou reagente vinculador em relação ao anticorpo, (ii) limitação do tempo ou temperatura da reação de conjugação, (iii) condições redutoras parciais ou limitantes para modificação do tiol de cisteína, (iv) modificação genética por técnicas recombinantes da seqüência de aminoácidos do anticorpo de tal forma que o número e as posição de resíduos de cisteína sejam modificados para controle do número e/ou da posição de adesões vinculador-fármaco (por exemplo, tioMab ou tioFab preparado como aqui revelado e em WO 2006/034488 (aqui incorporado por referência em sua totalidade)).
[296] Deve ser subentendido que, quando mais do que um grupo nucleofílico reage com um fármaco-vinculador intermediário ou reagente vinculador, seguido por reagente da porção farmacológica, então o produto resultante é uma mistura de compostos de ADC com uma distribuição de uma ou mais porções farmacológicas anexadas a um anticorpo. O número médio de fármacos por anticorpo pode ser calculado pela mistura por um ensaio de anticorpo ELISA duplo, que é específico para anticorpo e específico para o fármaco. Moléculas de ADC individuais podem ser identificadas na mistura por espectroscopia de massa e separadas por HPLC, por exemplo, cromatografia por interação hidrofóbica (veja, por exemplo, Hamblett, K.J., e cols. “Effect of Drug Loading on the Pharmacology, Pharmacokinetics, and Toxicity of an Anti-CD30 Antibody-Drug Conjugate”, Resumo N° 624, “American Association for Cancer Research”, “2004 Annual Meeting”, 27-31 de março de 2004, “Proceedings of the AACR”, Volume 45, Março de 2004; Alley, S.C., e cols. “Controlling the Location of Drug Attachment in Antibody-Drug Gonjugates”, Resumo N° 627, "American Association for Cancer Research”, “2004 Annual Meeting”, 27-31 de março de 2004, “Proceedings of the AACR”, Volume 45, Março de 2004). Em certas modalidades, um ADC homogêneo com um único valor de carregamento pode ser isolado da mistura de conjugação por eletroforese ou cromatografia.
XI) Métodos de determinação do efeito citotóxico de ADCs
[297] Métodos para determinar se um fármaco ou conjugado anticorpo-fármaco exerce um efeito citostático e/ou citotóxico em uma célula são conhecidos. Geralmente, a atividade citotóxica ou citostática de um conjugado anticorpo-fármaco pode ser medida por: exposição de células mamíferas que expressam uma proteína-alvo do conjugado anticorpo-fármaco em um meio de cultura de células; cultivo das células por um período de cerca de 6 horas a cerca de 5 dias; e medição da viabilidade celular. Ensaios in vitro à base de células podem ser usados para medir a viabilidade (proliferação), citotoxicidade e indução de apoptose (ativação de caspase) do conjugado anticorpo-fármaco.
[298] Para determinar se um conjugado anticorpo-fármaco exerce um efeito citostático, um ensaio de incorporação de timidina pode ser usado. Por exemplo, células de câncer que expressam um antígeno-alvo em uma densidade de 5.000 células/poço de uma placa de 96 poços podem ser cultivadas por um período de 72 horas e expostas a 0,5 μCi de H- timidina durante as 8 horas finais do período de 72 horas. A incorporação de H-timidina nas células da cultura é medida na presença e ausência do conjugado anticorpo- fármaco.
[299] Para determinação da citotoxicidade, necrose ou apoptose (morte celular programada) pode ser medida. A necrose é tipicamente acompanhada por permeabilidade aumentada da membrana plasmática, edema da célula e ruptura da membrana plasmática. A apoptose é tipicamente caracterizada por formação de bolhas na membrana, condensação do citoplasma e a ativação de endonucleases endógenas. A determinação de qualquer um desses efeitos em células de câncer indica que um conjugado anticorpo-fármaco é útil no tratamento de cânceres.
[300] A viabilidade celular pode ser medida por determinação em uma célula da captação de um corante como, por exemplo, vermelho neutro, azul tripano ou azul ALAMAR™ (veja, por exemplo, Page e cols., 1993, Intl. J. Oncology 3: 473-476). Em um ensaio desse tipo, as células são incubadas em meios que contêm o corante, as células são lavadas, e o corante restante, que reflete a captação celular do corante, é medido espectrofotometricamente. O corante de ligação de proteína sulforrodamina B (SRB) também pode ser usado para medir a citotoxicidade (Skehan e cols., 1990, J. Natl. Cancer Inst. 82: 1.107-12).
[301] Alternativamente, um sal tetrazólio, por exemplo, MTT, é usado em um ensaio colorimétrico quantitativo para sobrevida e proliferação de células mamíferas por detecção de células vivas, mas não mortas (veja, por exemplo, Mosmann, 1983, J. Immunol. Methods 65: 55-63).
[302] A apoptose pode ser quantificada por medição, por exemplo, da fragmentação de DNA. Métodos fotométricos comerciais para a determinação quantitativa in vitro da fragmentação de DNA estão disponíveis. Exemplos desses ensaios, incluindo TUNEL (que detecta a incorporação de nucleotídeos marcados em DNA fragmentado) e ensaios baseados em ELISA, são descritos em Biochemica, 1999, N° 2,páginas 34-37 (Roche Molecular Biochemicals).
[303] A apoptose também pode ser determinada por medição de alterações morfológicas em uma célula. Por exemplo, como com a necrose, a perda da integridade da membrana plasmática pode ser determinada por medição da captação de certos corantes (por exemplo, um corante fluorescente como, por exemplo, laranja acridina ou brometo de etídio). Um método para medição do número de células apoptóticas foi descrito por Duke e Cohen, “Current Protocols in Immunology” (Coligan e cols. eds., 1992, páginas 3.17.1-3.17.16). As células também podem ser marcadas com um corante de DNA (por exemplo, laranja acridina, brometo de etídio ou iodeto de propídio) e as células observadas quanto à condensação e marginação de cromatina, ao longo da membrana nuclear interna. Outras alterações morfológicas que podem ser medidas para determinar a apoptose incluem, por exemplo, condensação citoplasmática, formação aumentada de bolhas na membrana e encolhimento celular.
[304] A presença de células apoptóticas pode ser medida tanto nos compartimentos anexados quanto nos “flutuantes” das culturas. Por exemplo, ambos os compartimentos podem ser coletados por remoção do sobrenadante, tripsinização das células anexadas, combinação das preparações após uma etapa de lavagem por centrifugação (por exemplo, 10 minutos a 2.000 rpm), e detecção de apoptose (por exemplo, por medição de fragmentação de DNA) (veja, por exemplo, Piazza e cols., 1995, Cancer Research 55: 3.110-16).
[305] In vivo, o efeito de uma composição terapêutica de 158P1D7 pode ser avaliado em um modelo animal adequado. Por exemplo, modelos xenogênicos de câncer podem ser usados, em que explantes de câncer ou tecidos de xenoenxerto passados são introduzidos em animais com sistema imune comprometido, por exemplo, camundongos desnudos (nude) ou SCID (Klein e cols., 1997, Nature Medicine 3: 402-408). Por exemplo, o Pedido de Patente PCT WO 98/16628 e a Patente U.S. 6.107.540 descrevem vários modelos de xenoenxerto de câncer de próstata humano capazes de recapitular o desenvolvimento de tumores primários, micrometástase e a formação de metástases osteoblásticas características de doença em estágio tardio. A eficácia pode ser prevista com o uso de ensaios que medem a inibição da formação tumoral, regressão do tumor ou metástase, e semelhantes.
[306] Ensaios in vivo que avaliam a promoção de apoptose são úteis na avaliação de composições terapêuticas. Em uma modalidade, xenoenxertos de camundongos com tumor tratados com a composição terapêutica podem ser examinados quanto à presença de focos apoptóticos e comparados com camundongos com xenoenxerto não tratados de controle. A extensão em que os focos apoptóticos são encontrados nos tumores dos camundongos tratados fornece uma indicação da eficácia terapêutica da composição.
[307] As composições terapêuticas usadas na prática dos métodos citados anteriormente podem ser formuladas em composições farmacêuticas que compreendem um veículo adequado ao método de liberação desejado. Veículos adequados incluem qualquer material que, quando combinado com a composição terapêutica, retenha a função antitumoral da composição terapêutica e seja geralmente não reativo com o sistema imune do paciente. Exemplos incluem, sem limitação, qualquer um entre diversos veículos farmacêuticos padronizados como, por exemplo, soluções salinas estéreis tamponadas com fosfato, água bacteriostática, e semelhantes (veja, geralmente, “Remington’s Pharmaceutical Sciences”, 16a Edição, A. Osal., Ed., 1980).
[308] As formulações terapêuticas podem ser solubilizadas e administradas por meio de qualquer via capaz de liberar a composição terapêutica ao local do tumor. Vias de administração potencialmente eficazes incluem, sem limitação, a via intravenosa, parenteral, intraperitoneal, intramuscular, intratumoral, intradérmica, intra-órgão, ortotópica, e semelhantes. Uma formulação preferida para injeção intravenosa compreende a composição terapêutica em uma solução de água bacteriostática conservada, água não conservada estéril, e/ou diluída em bolsas de cloreto de polivinila ou de polietileno contendo cloreto de sódio estéril 0,9% para injeção, USP. Preparações terapêuticas de proteína podem ser liofilizadas e armazenadas como pós estéreis, preferivelmente sob vácuo, e depois reconstituídas em água bacteriostática (contendo, por exemplo, conservante de álcool benzílico) ou em água estéril antes da injeção.
[309] Dosagens e protocolos de administração para o tratamento de cânceres com uso dos métodos citados anteriormente irão variar com o método e o câncer-alvo, e geralmente dependerão de vários outros fatores observados na técnica.
XII) Tratamento de cânceres que expressam 158P1D7
[310] A identificação de 158P1D7 como uma proteína que é normalmente expressa em um conjunto restrito de tecidos, mas que também é expressa em cânceres como, por exemplo, aqueles listados na Tabela I, abre diversas abordagens terapêuticas para o tratamento desses cânceres.
[311] Notavelmente, terapias antitumorais direcionadas têm sido úteis até mesmo quando a proteína direcionada é expressa em tecidos normais, inclusive tecidos normais de órgãos vitais. Um órgão vital é aquele que é necessário para manter a vida, por exemplo, o coração ou cólon. Um órgão não vital é aquele que pode ser removido e o indivíduo ainda é capaz de sobreviver. Exemplos de órgãos não vitais são ovário, mama e próstata.
[312] A expressão de uma proteína-alvo em tecido normal, até mesmo tecido normal vital, não impede a utilidade de um agente de direcionamento para a proteína como uma substância terapêutica para certos tumores nos quais a proteína também é superexpressa. Por exemplo, a expressão em órgãos vitais não é, por si só, prejudicial. Além disso, órgãos considerados como dispensáveis, por exemplo, a próstata e o ovário, podem ser removidos sem afetar a mortalidade. Finalmente, alguns órgãos vitais não são afetados por expressão em órgão normal, por causa de um privilégio imunológico. Órgãos com privilégio imunológico são órgãos que são protegidos do sangue por uma barreira sangue-órgão e, dessa forma, não são acessíveis à imunoterapia. Exemplos de órgãos com privilégio imunológico são o cérebro e os testículos.
[313] Conseqüentemente, abordagens terapêuticas que inibem a atividade de uma proteína 158P1D7 são úteis para pacientes que sofrem de um câncer que expressa 158P1D7. Essas abordagens terapêuticas geralmente se enquadram em três classes. A primeira classe modula a função de 158P1D7, na medida em que ela está relacionada ao crescimento da célula tumoral, levando à inibição ou ao retardo do crescimento da célula tumoral ou induzindo sua morte. A segunda classe compreende vários métodos para inibição da ligação ou associação de uma proteína 158P1D7 com seu parceiro de ligação ou com outras proteínas. A terceira classe compreende diversos métodos para inibição da transcrição de um gene de 158P1D7 ou da tradução de mRNA de 158P1D7.
[314] Conseqüentemente, pacientes com câncer podem ser avaliados quanto à presença e nível de expressão de 158P1D7, preferivelmente usando avaliações imunoistoquímicas do tecido tumoral, imageamento quantitativo de 158P1D7, ou outras técnicas que indicam confiavelmente a presença e o grau de expressão de 158P1D7. A análise imunoistoquímica de biópsias de tumores ou de amostras cirúrgicas é preferida para essa finalidade. Métodos para análise imunoistoquímica de tecidos tumorais são bem conhecidos na técnica.
XIII) 158P1D7 como um alvo para terapia à base de anticorpo
[315] 158P1D7 é um alvo atrativo para estratégias terapêuticas à base de anticorpos. Diversas estratégias de anticorpos são conhecidas na técnica para o direcionamento de moléculas tanto extracelulares quanto intracelulares (veja, por exemplo, morte mediada por complemento e ADCC, bem como o uso de intrabodies). Como 158P1D7 é expressa por células de câncer de várias linhagens em relação às células normais correspondentes, são preparadas composições imunorreativas de 158P1D7 que exibem excelente sensibilidade sem efeitos tóxicos, não específicos e/ou não-alvo causados por ligação da composição imunorreativa ao órgãos e tecidos não-alvo para administração sistêmica. Anticorpos especificamente reativos com domínios de 158P1D7 são úteis para tratar cânceres que expressam 158P1D7 sistemicamente, preferivelmente como conjugados anticorpo- fármaco (ou seja, ADCs), em que o conjugado é com uma toxina ou um agente terapêutico.
[316] Aqueles habilitados na técnica sabem que anticorpos podem ser usados para visar e se ligar especificamente a moléculas imunogênicas como, por exemplo, uma região imunogênica de uma seqüência de 158P1D7 mostrada na Figura 1. Além disso, aqueles habilitados na técnica sabem que é rotineira a conjugação de anticorpos com agentes citotóxicos (veja, por exemplo, Slevers e cols. Blood 93: 11, 3.678-3.684 (1° de junho de 1999)). Quando agentes citotóxicos e/ou terapêuticos são liberados diretamente às células, por exemplo, por sua conjugação com anticorpos específicos para uma molécula expressa por aquela célula (por exemplo, 158P1D7), o agente citotóxico exercerá seu efeito biológico conhecido (ou seja, citotoxicidade) naquelas células.
[317] É conhecida na técnica uma ampla variedade de composições e métodos para utilização de conjugados anticorpo-agente citotóxico para matar células. No contexto de cânceres, métodos típicos envolvem a administração a um mamífero que possui um tumor de uma quantidade biologicamente eficaz de um conjugado que compreende um agente citotóxico e/ou terapêutico selecionado ligado a um agente de direcionamento (por exemplo, um MAb para 158P1D7, preferivelmente Ha15-10ac12) que se liga a um antígeno (por exemplo, 158P1D7) expresso, acessível à ligação ou localizado nas superfícies celulares. Uma modalidade típica é um método de liberação de um agente citotóxico e/ou terapêutico a uma célula que expressa 158P1D7, que compreende a conjugação do agente citotóxico a um anticorpo que se liga de forma imunologicamente específica a um epitopo de 158P1D7, e exposição da célula ao conjugado anticorpo-fármaco (ADC). Outra modalidade ilustrativa é um método de tratamento de um indivíduo suspeito de sofrer de câncer metastizado, que compreende uma etapa de administração parenteral ao referido indivíduo de uma composição farmacêutica que compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo conjugado a um agente citotóxico e/ou terapêutico.
[318] A imunoterapia do câncer com o uso de anticorpos para 158P1D7 pode ser feita de acordo com várias abordagens que foram empregadas com sucesso no tratamento de outros tipos de câncer incluindo, sem limitação, câncer de cólon (Arlen e cols., 1998, Crit. Rev. Immunol. 18: 133-138), mieloma múltiplo (Ozaki e cols., 1997, Blood 90: 3.179-3.186, Tsunenari e cols., 1997, Blood 90: 2.437-2.444), câncer gástrico (Kasprzyk e cols., 1992, Cancer Res. 52: 2.771-2.776), linfoma de célula B (Funakoshi e cols., 1996, J. Immunother. Emphasis Tumor Immunol. 19: 93-101), leucemia (Zhong e cols., 1996, Leuk. Res. 20: 581-589), câncer cólon-retal (Moun e cols., 1994, Cancer Res. 54: 6.160- 6.166; Velders e cols., 1995, Cancer Res. 55: 4.3984.403) e câncer de mama (Shepard e cols., 1991, J. Clin. Immunol. 11: 117-127). Algumas abordagens terapêuticas envolvem a conjugação de anticorpo desnudo (naked) a uma toxina ou radioisótopo, por exemplo, a conjugação de Y91 ou I131 aos anticorpos anti-CD20 (por exemplo, ZevalinTM, IDEC Pharmaceuticals Corp. ou Bexxar™, Coulter Pharmaceuticals), respectivamente, enquanto outras envolvem a co- administração de anticorpos e outros agentes terapêuticos, por exemplo, Herceptin™ (trastuzu MAb) com paclitaxel (Genentech, Inc.). Em uma modalidade preferida, os anticorpos serão conjugados a um agente citotóxico, supra, preferivelmente um derivado de auristatina designado MMAE (Seattle Genetics).
[319] Embora a terapia com anticorpo para 158P1D7 seja útil para todos os estágios de câncer, a terapia com anticorpo pode ser particularmente apropriada em cânceres avançados ou metastáticos. O tratamento com a terapia com o anticorpo da invenção está indicado para pacientes que receberam uma ou mais rodadas de quimioterapia. Alternativamente, a terapia com o anticorpo da invenção é combinada com um regime quimioterápico ou com radiação para pacientes que não receberam tratamento quimioterápico. Adicionalmente, a terapia com anticorpo pode permitir o uso de dosagens reduzidas de quimioterapia concomitante, particularmente para pacientes que não toleram muito bem a toxicidade do agente quimioterápico. Fan e cols. (Cancer Res. 53: 4.637-4.642, 1993), Prewett e cols. (International J. of Onco. 9: 217-224, 1996) e Hancock e cols. (Cancer Res. 51:4575-4580, 1991) descrevem o uso de vários anticorpos em conjunto com agentes quimioterápicos.
[320] Conseqüentemente, anticorpos monoclonais preferidos usados nos métodos terapêuticos da invenção são aqueles que são totalmente humanos e que se ligam especificamente ao antígeno de 158P1D7-alvo com afinidade elevada. Embora o conjugado anticorpo-fármaco da invenção seja útil para o tratamento de cânceres nos quais a 158P1D7 é expressa, o conjugado anticorpo-fármaco da invenção pode ser particularmente terapeuticamente útil no tratamento de cânceres de bexiga.
XIV) Coquetéis de 158P1D7-ADC
[321] Os métodos terapêuticos da invenção contemplam a administração de ADCs de 158P1D7 únicos, bem como as combinações, ou coquetéis, de MAbs diferentes (ou seja, MAbs para 158P1D7 ou MAbs que se ligam a outra proteína) Esses coquetéis de MAb podem ter certas vantagens, na medida em que contêm MAbs que visam epitopos diferentes, exploram mecanismos efetores diferentes ou combinam MAbs diretamente citotóxicos com MAbs que se baseiam na funcionalidade imune efetora. Esses MAbs em combinação podem exibir efeitos terapêuticos sinérgicos. Além disso, MAbs para 158P1D7 podem ser administrados concomitantemente com outras modalidades terapêuticas incluindo, sem limitação, vários agentes quimioterápicos e biológicos, bloqueadores de erógenos, moduladores imunes (por exemplo, IL-2, GM-CSF), cirurgia ou radiação. Em uma modalidade preferida, os MAbs para 158P1D7 são administrados em forma conjugada.
[322] As formulações de ADC de 158P1D7 são administradas por meio de qualquer via capaz de liberar os anticorpos às células tumorais. As vias de administração incluem, sem limitação, a via intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, intratumoral, intradérmica, e semelhantes. O tratamento geralmente envolve a administração repetida da preparação de ADC de 158P1D7, por meio de uma via de administração aceitável como, por exemplo, injeção intravenosa (IV), tipicamente em uma dose na faixa que inclui, sem limitação, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 ou 25 mg/kg de peso corporal. Em geral, doses na faixa de 10-1.000 mg MAb por semana são eficazes e bem toleradas.
[323] Com base na experiência clínica com o Herceptin® (Trastuzumab) no tratamento de câncer metastático de mama, uma dose de carregamento inicial de aproximadamente 4 mg/kg IV por peso corporal do paciente, seguida por doses semanais de cerca de 2 mg/kg IV do da preparação de MAb, representam um regime de dosagem aceitável. De preferência, a dose de carregamento inicial é administrada como uma infusão em 90 minutos ou mais longa. A dose de manutenção periódica é administrada como uma infusão de 30 minutos ou mais longa, desde que a dose inicial tenha sido bem tolerada. Como observado por aqueles habilitados na técnica, vários fatores podem influenciar o regime de dose ideal em um caso particular. Esses fatores incluem, por exemplo, a afinidade de ligação e meia-vida dos MAbs usados, o grau de expressão de 158P1D7 no paciente, a extensão de antígeno de 158P1D7 extravasado circulante, o nível de concentração de anticorpo no estado de equilíbrio desejado, a freqüência de tratamento, e a influência de agentes quimioterápicos ou outros agentes usados em combinação com o método de tratamento da invenção, bem como o estado de saúde de um paciente em particular.
[324] Opcionalmente, os pacientes devem ser avaliados quanto aos níveis de 158P1D7 em certa amostra (por exemplo, quanto aos níveis de antígeno de 158P1D7 circulante e/ou células que expressam 158P1D7) a fim de auxiliar na determinação do regime de dosagem mais eficaz etc. Essas avaliações também são usadas para fins de monitoramento por toda a terapia, e são úteis para graduar o sucesso terapêutico em combinação com a avaliação de outros parâmetros (por exemplo, citologia da urina e/ou níveis de ImmunoCyt na terapia do câncer da bexiga ou, por analogia, os níveis séricos de PSA na terapia do câncer de próstata).
[325] Um objetivo da presente invenção é fornecer ADCs de 158P1D7 que inibem ou retardam o crescimento de células tumorais que expressam 158P1D7. Um objetivo adicional dessa invenção é fornecer métodos para inibição da angiogênese e outras funções biológicas e, assim, reduzir o crescimento tumoral em mamíferos, preferivelmente humanos, usando esses ADCs de 158P1D7 e, em particular, usando esses ADCs de 158P1D7 combinados com outros fármacos ou tratamentos imunologicamente ativos.
XV) Terapia combinada
[326] Em uma modalidade, há sinergia quando tumores, incluindo tumores humanos, são tratados com ADCs de 158P1D7 em conjunto com agentes quimioterápicos ou radiação ou combinações destes. Em outras palavras, a inibição do crescimento tumoral por um ADC de 158P1D7 é aumentada mais do que esperado quando ele é combinado com agentes quimioterápicos ou radiação ou combinações destes. A sinergia pode ser demonstrada, por exemplo, por maior inibição do crescimento tumoral com tratamento combinado do que seria esperada por tratamento apenas com ADC de 158P1D7, ou o efeito aditivo de tratamento com um ADC de 158P1D7 e um agente quimioterápico ou radiação. De preferência, a sinergia é demonstrada por remissão do câncer quando a remissão não é esperada pelo tratamento por um ADC de 158P1D7 ou com tratamento usando uma combinação aditiva de um ADC de 158P1D7 e um agente quimioterápico ou radiação.
[327] O método para inibição do crescimento de células tumorais usando um ADC de 158P1D7 e uma combinação de quimioterapia ou radiação, ou ambos, compreende a administração do ADC de 158P1D7 antes, durante ou depois do começo de quimioterapia ou radioterapia, bem como qualquer combinação destes (ou seja, antes e durante, antes e depois, durante e depois, ou antes, durante e depois do começo da quimioterapia e/ou radioterapia). Por exemplo, o ADC de 158P1D7 é tipicamente administrado entre 1 e 60 dias, preferivelmente entre 3 e 40 dias, mais preferivelmente entre 5 e 12 dias antes do começo de radioterapia e/ou quimioterapia. No entanto, dependendo do protocolo de tratamento e das necessidades específicas do paciente, o método é realizado de uma forma que fornecerá o tratamento mais eficaz e, por fim, prolongará a vida do paciente.
[328] A administração de agentes quimioterápicos pode ser obtida de diversas formas, incluindo sistemicamente pelas vias parenteral e enteral. Em uma modalidade, os ADCs de 158P1D7 e o agente quimioterápico são administrados como moléculas separadas. Exemplos particulares de agentes quimioterápicos ou quimioterapia incluem cisplatina, dacarbazina (DTIC), dactinomicina, mecloretamina (mostarda nitrogenada), estreptozocina, ciclofosfamida, carmustina (BCNU), lomustina (CCNU), doxorrubicina (adriamicina), daunorrubicina, procarbazina, mitomicina, citarabina, etoposida, metotrexato, 5-fluoruracil, vinblastina, vincristina, bleomicina, paclitaxel (taxol), docetaxel (taxotere), aldesleucina, asparaginase, bussulfan, carboplatina, cladribina, dacarbazina, floxuridina, fludarabina, hidroxiuréia, ifosfamida, interferon alfa, leuprolida, megestrol, melfalan, mercaptopurina, plicamicina, mitotano, pegaspargase, pentostatina, pipobroman, plicamicina, estreptozocina, tamoxifeno, teniposida, testolactona, tioguanina, tiotepa, uracil mostarda, vinorelbina, gencitabina, clorambucil, taxol e combinações destes.
[329] A fonte de radiação, usada em combinação com um ADC de 158P1D7, pode ser externa ou interna ao paciente que está sendo tratado. Quando a fonte é externa ao paciente, a terapia é conhecida como radioterapia de feixe externo (EBRT). Quando a fonte de radiação é interna ao paciente, o tratamento é denominado braquiterapia (BT).
[330] Os regimes terapêuticos descritos acima podem ainda ser combinadas com agentes e/ou regimes de tratamento de câncer adicionais, por exemplo, quimioterapia adicional, vacinas contra o câncer, inibidores da transdução de sinal, agentes úteis no tratamento de crescimento celular anormal ou câncer, anticorpos (por exemplo, anticorpos anti-CTLA-4 como descritos em WO/2005/092380 (Pfizer)) ou outros ligantes que inibem o crescimento tumoral por ligação à IGF-1R, e citocinas.
[331] Quando o mamífero é submetido à quimioterapia adicional, agentes quimioterápicos descritos acima podem ser usados. Adicionalmente, inibidores de fator de crescimento, modificadores da resposta biológica, terapia anti-hormonal, moduladores seletivos do receptor de estrogênio (SERMs), inibidores da angiogênese e antiandrogênios podem ser usados. Por exemplo, anti- hormonais, por exemplo, antiestrogênios como, por exemplo, Nolvadex (tamoxifeno) ou antiandrogênios como, por exemplo, Casodex (4’-ciano-3-(4-fluorfenilsulfonil)-2-hidróxi-2-metil-3-‘-(trifluormetil)propionanilida), podem ser usados.
[332] As abordagens terapêuticas acima podem ser combinadas com qualquer uma de uma ampla variedade de regimes cirúrgicas, quimioterapia ou radioterapia. As abordagens terapêuticas da invenção podem permitir o uso de dosagens reduzidas de quimioterapia (ou outras terapias) e/ou administração menos freqüente, uma vantagem para todos os pacientes e particularmente para aqueles que não toleram bem a toxicidade do agente quimioterápico.
XVI) Kits/ artigos manufaturados
[333] Para uso no laboratório, as aplicações prognósticas, profiláticas, diagnósticas e terapêuticas aqui descritas, kits estão dentro do escopo da invenção. Esses kits podem compreender um veículo, embalagem ou recipiente que é compartimentalizado para receber um ou mais recipientes como, por exemplo, frascos, tubos, e semelhantes, cada um dos recipientes compreendendo um dos elementos separados a serem usados no método, juntamente com um rótulo ou bula que compreende instruções para uso, por exemplo, um uso aqui descrito. Por exemplo, o(s) recipiente(s) pode compreender um anticorpo que é ou pode ser marcado de forma detectável. Os kits podem compreender um recipiente que compreende uma unidade de fármaco. O kit pode incluir todas ou parte das seqüências de aminoácidos na Figura 2, ou Figura 3 ou análogos destas, ou uma molécula de ácido nucléico que codifica essas seqüências de aminoácidos.
[334] O kit da invenção tipicamente compreenderá o recipiente descrito acima e um ou mais outros recipientes a ele associados que compreendem materiais desejáveis do ponto de vista comercial e do usuário, incluindo tampões, diluentes, filtros, agulhas, seringas; veículo, embalagem, recipiente, frasco e/ou rótulos de tubos que listam o conteúdo e/ou instruções para uso, e bulas com instruções para uso.
[335] Um rótulo pode estar presente no ou com o recipiente para indicar que a composição é usada para uma terapia ou aplicação não terapêutica específica, por exemplo, uma aplicação prognóstica, profilática, diagnóstica ou laboratorial, e também pode indicar instruções para uso in vivo ou in vitro, tais como aqueles aqui descritos. Instruções ou outras informações também podem ser incluídas na(s) bula(s) ou rótulo(s) que é incluído com ou no kit. O rótulo também pode estar em ou associado ao recipiente. Um rótulo pode estar em um recipiente quando letras, números ou outros caracteres que formam o rótulo são moldados ou entalhados no próprio recipiente; um rótulo pode estar associado com um recipiente quando ele está presente dentro de um receptáculo ou transportador que também contém o recipiente, por exemplo, como uma bula. O rótulo pode indicar que a composição é usada para o diagnóstico, tratamento, profilaxia ou prognóstico de uma condição, por exemplo, um câncer de um tecido descrito na Tabela I.
[336] Os termos “kit” e “artigo manufaturado” podem ser usados como sinônimos.
[337] Em outra modalidade da invenção, é fornecido um artigo (ou artigos) manufaturado que contém composições, por exemplo, anticorpo(s), ou conjugados anticorpo-fármaco (ADCs), por exemplo, materiais úteis para o diagnóstico, prognóstico, profilaxia e/ou tratamento de cânceres de tecidos, tais como aqueles descritos na Tabela I. O artigo manufaturado tipicamente compreende pelo menos um recipiente e pelo menos um rótulo. Recipientes adequados incluem, por exemplo, garrafas, frascos, seringas, e tubos de ensaio. Os recipientes podem ser formados por diversos materiais como, por exemplo, vidro, metal ou plástico. O recipiente pode conter seqüência(s) de aminoácidos, pequena(s) molécula(s), seqüência(s) de ácidos nucléicos, população (ou populações) de células e/ou anticorpo(s) Em outra modalidade, um recipiente compreende um anticorpo, fragmento de ligação deste ou proteína de ligação específica para uso na avaliação da expressão de proteína de 158P1D7 em células e tecidos, ou para fins laboratoriais, prognósticos, diagnósticos, profiláticos e terapêuticos relevantes; indicações e/ou instruções para esses usos podem ser incluídas no ou com esse recipiente, bem como reagentes e outras composições ou ferramentas usadas para essas finalidades.
[338] O recipiente pode alternativamente conter uma composição que é eficaz para o tratamento, diagnóstico, prognóstico ou profilaxia de uma condição e pode ter uma entrada de acesso estéril (por exemplo, o recipiente pode ser uma bolsa de solução intravenosa ou um frasco que possui uma tampa perfurável por uma agulha de injeção hipodérmica). Os agentes ativos na composição podem ser um anticorpo capaz de se ligar especificamente à 158P1D7 ou um conjugado anticorpo-fármaco que se liga especificamente à 158P1D7.
[339] O artigo manufaturado pode ainda compreender um segundo recipiente que compreende um tampão farmaceuticamente aceitável, por exemplo, solução salina tamponada com fosfato, solução de Ringer e/ou solução de dextrose. Ele pode ainda incluir outros materiais desejáveis do ponto de vista comercial e do usuário, incluindo outros tampões, diluentes, filtros, agitadores, agulhas, seringas e/ou bulas com indicações e/ou instruções para uso.
EXEMPLOS
[340] Vários aspectos da invenção são ainda descritos e ilustrados por meio de vários exemplos apresentados a seguir, nenhum deles tendo a intenção de limitar o escopo da invenção.
Exemplo 1 O antígeno de 158P1D7
[341] A seqüência do gene de 158P1D7 foi descoberta usando métodos de hibridização por supressão subtrativa (SSH) conhecidos na técnica. A seqüência de 158P1D7 por SSH de 223 bp foi identificada de um pool de câncer da bexiga menos subtração de cDNA da bexiga normal. Um clone de cDNA de comprimento total para 158P1D7 foi isolado de um pool de tecido de câncer da bexiga. O cDNA possui 2.555 bp de comprimento e codifica um ORF de 841 aminoácidos (veja a Figura 1). O gene de 158P1D7 mostra homologia para o gene de SLITRK6. Para referência adicional, veja US 6.863.892 (Agensys, Inc., Santa Monica, CA), US 7.358.353 (Agensys, Inc., Santa Monica, CA) e EP 1.311.675 (Agensys, Inc., Santa Monica, CA). Para modalidades exemplares do antígeno de 158P1D7, veja a Figura 1.
Exemplo 2 Geração de anticorpos monoclonais (MAbs) para 158P1D7
[342] Em uma modalidade, anticorpos monoclonais terapêuticos (“MAbs”) para 158P1D7 e variantes de 158P1D7 compreendem aqueles que reagem com epitopos específicos para cada proteína ou específicos para seqüências em comum entre as variantes que ligariam, internalizariam, romperiam ou modulariam a função biológica de 158P1D7 ou de variantes de 158P1D7, por exemplo, aquelas que romperiam a interação com ligantes, substratos e parceiros de ligação. Imunógenos para a geração desses MAbs incluem aqueles projetados para codificar ou conter os domínios extracelulares ou toda a seqüência da proteína 158P1D7, regiões previstas para conter motivos funcionais, e regiões das variantes da proteína de 158P1D7 previstas para serem antigênicas a partir de análise em computador da seqüência de aminoácidos. Imunógenos incluem peptídeos e proteínas recombinantes como, por exemplo, tag5-158P1D7, uma proteína com tag His purificada derivada de célula mamífera. Além disso, células modificadas geneticamente para expressar níveis elevados de 158P1D7, por exemplo, UMUC-158P1D7 ou 3T3-158P1D7, são usadas para a imunização de camundongos.
[343] MAbs para 158P1D7 foram gerados usando XenoMouse Technology® (Amgem Fremont), em que os loci de cadeia pesada e leve kappa murídeas foram inativados e a maioria dos loci da cadeia pesada e leve kappa de imunoglobulina humana foi inserida. O MAb designado Ha15-10ac12 foi gerado por imunização de XenoMice produtores de Y2 humana com células 3T3 recombinantes que expressam 158P1D7.
[344] O MAb para 158P1D7 Ha15-10ac12 se liga especificamente às células que expressam 158P1D7 (recombinante e endógena), bem como proteína recombinante 158P1D7, por ELISA.
[345] As seqüências de DNA codificadoras para MAb para 158P1D7 Ha15-10ac12 foram determinadas após o isolamento de mRNA pelas respectivas células de hibridoma com reagente Trizol (Life Technologies, Gibco BRL).
[346] As seqüências de ácidos nucléicos da cadeia pesada e leve variável de anti-158P1D7 Ha15-10ac12 foram seqüenciadas das células de hibridoma usando o protocolo seguinte. Células de hibridoma que secretam Ha15-10ac12 foram lisadas com reagente Trizol (Life Technologies, Gibco BRL). RNA total foi purificado e quantificado. cDNAs de primeira fita foram gerados do RNA total com sensibilização de óligo (dT)12-18 usando o sistema de pré-amplificação Gibco-BRL Superscript. cDNA de primeira fita foi amplificado usando iniciadores de cadeia pesada variável de imunoglobulina humana, e iniciadores de cadeia leve variável de imunoglobulina humana. Os produtos de PCR foram seqüenciados e as regiões variáveis da cadeia pesada e leve determinadas.
[347] As seqüências de ácidos nucléicos e de aminoácidos das regiões variáveis da cadeia pesada e leve estão listadas na Figura 2 e na Figura 3. O alinhamento de MAb Ha15-10ac12 para linhagem germinativa de Ig humana é apresentado na Figura 4A-4B.
Exemplo 3 Expressão de Ha15-10ac12 usando métodos de DNA recombinante
[348] Para expressar MAb Ha15-10ac12 de forma recombinante em células transfectadas, seqüências da cadeia pesada e leve variáveis de MAb Ha15-10ac12 foram clonadas upstream das regiões constantes da cadeia pesada de IgG2 humana e cadeia leve de IgK humana, respectivamente. Os cassetes completos da cadeia pesada humana e cadeia leve de MAb Ha15-10ac12 foram clonados downstream do promotor/intensificador de CMV em um vetor de clonagem. Um sítio de poliadenilação foi incluído downstream da seqüência codificadora do MAb. As construções que expressam o MAb recombinante Ha15-10ac12 foram transfectadas em células CHO-K1SV. O MAb relacionado Ha15-10ac12 secretado por células CHO recombinantes foi avaliado quanto à ligação à 158P1D7 da superfície celular por citometria de fluxo. Células UMUC-controle e UMUC-158P1D7 foram coradas com MAb Ha15-10ac12 de hibridoma ou de células CHO transfectadas com construções de vetor de cadeia pesada e leve Ha15- 10ac12. A ligação foi detectada por citometria de fluxo.
[349] Os resultados mostram que a Ha15-10ac12 expressa de forma recombinante expressa em células CHO se liga à 158P1D7 similarmente à Ha15-10ac12 purificada de hibridoma. O MAb Ha15-10ac12 secretado por células recombinantes também foi avaliado quanto à ligação à proteína 158P1D7 recombinante por ELISA. A ligação de Ha15-10ac12 à proteína 158P1D7 foi idêntica entre o material de MAb derivado de CHO e de células de hibridoma.
[350] A célula de ovário de hamster chinês (CHO) que produz um anticorpo designado Ha15-10ac12 foi enviada (por meio do Federal Express) para a “American Type Culture Collection” (ATCC), P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108 em 25 de julho de 2012 e recebeu o Número de Acesso PTA-13102.
Exemplo 4 Conjugação anticorpo-fármaco de MAb Ha15-10ac12
[351] O MAb Ha15-10ac12 (Figura 2) foi conjugado a um derivado de auristatina designado MMAE (Formula XI) usando um vinculador de vc (Val-Cit) aqui descrito para criar o conjugado anticorpo-fármaco (ADC) da invenção designado Ha15-10ac12vcMMAE usando os protocolos seguintes. A conjugação do vinculador de vc (Val-Cit) à MMAE (Seattle Genetics, Seattle, WA) foi completada usando o método geral apresentado na Tabela IV para criar o vcMMAE citotóxico (veja, US/2006/0074008).
[352] A seguir, o conjugado anticorpo-fármaco (ADC) da invenção designado Ha15-10ac12vcMMAE foi feito usando os protocolos seguintes.
[353] Resumidamente, o MAb Ha15-10ac12 em tampão de formulação (10 mM de acetato pH 5,0 com sorbitol 5%) tem o tampão trocado por tampão de redução (25 mM de borato de sódio, 300 mM de cloreto de sódio, pH de 9,0 ± 0,1). O MAb Ha15-10ac12 é então parcialmente reduzido por adição de 5 mM de EDTA e 2,65 equivalentes molares de TCEP (em relação aos moles de MAb Ha15-10ac12). Essa mistura é então agitada a 37°C por três (3) horas. Após redução de dissulfeto, a mistura é resfriada até uma temperatura-alvo de 15-17°C e cinco (5) equivalentes de fármaco de vcMMAE por mole são adicionados como uma solução a 4% (v/v) de DMSO. Após 60 a 75 minutos, o vc em excesso não reagido é extinto por adição de N-Acetil-L-cisteína na quantidade de 1 mole por mole de vcMMAE adicionado no começo da conjugação. Após 15 minutos, o Ha15-10ac12vcMMAE é ajustado até um pH-alvo de 6,0-6,4 usando um estoque de tampão de histidina concentrado pH 5,2 e filtrado através de uma membrana de PES de 0,5/0,2 μm para remover conjugado anticorpo-fármaco agregado. Imediatamente após filtração, a filtração por fluxo tangencial é realizada para remover DMSO e vinculador de fármaco extinto e para permutar o conjugado anticorpo- fármaco para o tampão, 20 mM de histidina (pH 6,0 ± 0,1) contendo desidrato de trehalose 5,5%. Após filtração por fluxo tangencial, o Ha15-10ac12vcMMAE é diluído até uma concentração final de 6 ± 1 mg/ml e polissorbato 20 é adicionado até uma concentração final de 0,01%.
[354] O conjugado anticorpo-fármaco (ADC) resultante é designado Ha15-10ac12vcMMAE e possui a seguinte fórmula:
Figure img0042
em que MAb é Ha15-10ac12 (Figura 2 e Figura 3) e p é de 1 a 12. O valor de p preferido do conjugado anticorpo- fármaco apresentado nesse Exemplo está entre 3,5 e 3,7.
Exemplo 5 Caracterização de Ha15-10ac12vcMMAE
[355] Conjugados anticorpo-fármaco que se ligam à 158P1D7 foram gerados usando os procedimentos descritos no exemplo intitulado “Conjugação de anticorpo-fármaco de MAb Ha15-10ac12” e foram avaliados, identificados e caracterizados usando uma combinação de ensaios conhecidos na técnica.
A. Determinação de afinidade por FACS
[356] Ha15-10ac12vcMMAE foi testado quanto à sua afinidade de ligação à 158P1D7 expressa na superfície de células SW780. Resumidamente, onze (11) diluições de Ha15- 10ac12vcMMAE são incubadas com células SW780 (50.000 células por poço) de um dia para o outro a 4°C em uma concentração final de 6,67 nM a 0,0001 nM. Ao final da incubação, as células são lavadas e incubadas com anticorpo de detecção anti-hIgG-PE por 45 min a 4°C. Após lavagem dos anticorpos de detecção não ligados, as células são analisadas por FACS. Os valores da intensidade de fluorescência média (MFI) foram obtidos como listados na Tabela VI. Os valores da MFI foram inseridos no software Graphpad Prism e analisados usando a equação de ligação de um sítio (hipérbole) de Y = Bmax * X / (Kd + X) para gerar a Curva de saturação de Ha15-10ac12vcMMAE mostrada na Figura 13. Bmax é o valor da MFI na ligação máxima de Ha15- 10ac12vcMMAE à 158P1D7; Kd é a afinidade de ligação de Ha15-10ac12vcMMAE que é a concentração de Ha15-10ac12vcMMAE necessária para alcançar metade da ligação máxima.
[357] A afinidade (Kd) calculada de Ha15-10ac12vcMMAE para 158P1D7 expressa na superfície da célula SW780 é de 0,005 nM.
B. Ligação por FACS
[358] Ha15-10ac12vcMMAE foi testado por quanto à sua ligação à 158P1D7 expressa na superfície de Células UMUC, SW780 e CHP-212. Resumidamente, as células foram coletadas e plaqueadas em uma concentração de 50.000 células por poço. Ha15-10ac12vcMMAE foi diluído até 3 μg/ml (para células UMUC e SW780) ou 10 μg/ml (for células CHP-212) e incubado com as células (1 hora a 4°C). Ao final da incubação, as células são lavadas e incubadas com anticorpo de detecção anti-hIgG-PE por 1 hora a 4°C. Após lavagem dos anticorpos de detecção não ligados, as células são analisadas por FACS. Os valores da intensidade de fluorescência média (MFI) foram obtidos (Tabela VII) e histogramas são mostrados (Figura 14).
Exemplo 6 Citotoxicidade celular in vitro mediada por Ha15- 10ac12vcMMAE
[359] A habilidade de Ha15-10ac12vcMMAE para mediar Citotoxicidade dependente de SLITRK-6 foi avaliada usando a linhagem de células de neuroblastoma humana CHP-212, que expressam endogenamente SLITRK-6 e a linhagem de células de câncer ovariano humano, IGROV-1, que não expressam SLITRK- 6.
[360] Resumidamente, as células CHP-212 e IGROV-1 foram semeadas em 50 μl de meio completo, em uma densidade de 1.000 célula/poço, sobre placas de 96 poços e colocadas em uma incubadora de cultura de tecido a 37°C; CO2 5%. No dia seguinte, uma solução de estoque de 2x de Ha15-10ac12vcMMAE e anticorpo de controle de isótipo conjugado a vcMMAE foram preparados em meio completo e 50 μl das diluições seriais dos ADCs foram adicionados aos poços apropriadas. As células foram tratadas com Ha15-10ac12vcMMAE e o anticorpo de controle de isótipo conjugado a vcMMAE por seis (6) dias em uma incubadora de cultura de tecido a 37°C; CO2 5%. Ao final do período de incubação, 12 μl de azul Alamar ou azul Presto foram adicionados a cada poço e incubados por quatro (4) horas. As placas foram lidas usando uma leitora de placas BioTek Synergy H4 usando comprimentos de onda de 540 de excitação e 590 de emissão.
[361] Esses dados demonstram que o ADC intitulado Ha15- 10ac12vcMMAE pode induzir seletivamente a citotoxicidade da linhagem de célula CHP-212 que expressa SLITRK-6, enquanto é incapaz de induzir a citotoxicidade da linhagem de célula IGROV-1 que não expressa SLITRK-6. Dessa forma, esses resultados indicam que Ha15-10ac12vcMMAE pode liberar seletivamente um fármaco citotóxico às células que expressam 158P1D7 levando à sua morte (Figura 15).
[362] Em outro experimento, células de neuroblastoma humano, CHP-212, que expressam SLITRK6 (alvo para MAb Ha15- 10ac12 e M15-68(2)18) (também conhecido como MAb 68(18)1.1; veja, WO 2004/072263), foram incubadas com os artigos de teste, Ha15-10ac12vcMMAE e M15-68(2)18, para demonstrar qualquer atividade de morte celular in vitro (citotoxicidade) desses artigos. Resumidamente, placas de ensaio de noventa e seis (96) poços foram semeadas com 4.000 células CHP-212/ml e anticorpos de teste foram adicionados em uma série de diluições de 10.000 ng/ml até 0,006 ng/ml usando uma diluição de seis (6) vezes sobre nove (9) pontos, mais um poço de teste final de 0,0 ng/ml. Os poços foram configurados em triplicata. Além disso, anticorpos de controle e células de controle (IGROV-1) foram configurados de forma similar para comparação com os artigos de teste. Foi permitido que o ensaio fosse executado por quatro (4) dias antes que azul Presto (pigmento que cora células vivas) fosse adicionado aos poços para gerar uma leitura colorimétrica de viabilidade celular. A percentagem de sobrevida celular foi então calculada em cada poço e os dados foram analisados usando um ajuste não linear da dose-resposta sigmóide. Os valores da IC50 foram calculados usando o software de gráficos Prism e os efeitos citotóxicos de Ha15-10ac12vcMMAE foram comparados com M15-68(2)18 e outros controles usados no experimento.
[363] Os resultados mostram que Ha15-10ac12vcMMAE possui citotoxicidade in vitro superior quando comparado com o anticorpo M15-68(2)18 e outros controles (Figura 11). Foi demonstrado que a IC50 para Ha15-10ac12vcMMAE é de 0,9076 e a IC50 para M15-68(2)18 não pode ser calculada.
Exemplo 7 Ha15-10ac12vcMMAE inibe o crescimento de Tumores in vivo
[364] A expressão significante de 158P1D7 na superfície celular de tecidos tumorais, junto com sua expressão restritiva em tecidos normais, tornam 158P1D7 um bom alvo para terapia com anticorpo e, similarmente, terapia por meio de ADC. Dessa forma, a eficácia terapêutica de Ha15- 10ac12vcMMAE nos modelos em camundongos de xenoenxerto de câncer da bexiga, pulmão, mama e glioblastoma humanos é avaliada.
[365] A eficácia do conjugado anticorpo-fármaco sobre o crescimento tumoral e a formação de metástases é estudada em modelos de xenoenxerto de câncer em camundongos (por exemplo, por via subcutânea e de forma ortotópica).
[366] Tumores subcutâneos (s.c) são gerados por injeção de 5 x 104-106 células de câncer misturadas em uma diluição de 1:1 com Matrigel (Collaborative Research) no flanco direito de machos de camundongos SCID. Para testar a eficácia de ADC sobre a formação de tumor, injeções de ADC são iniciadas no mesmo dia que as injeções de células tumorais. Como controle, camundongos são injetados com IgG humana purificada ou PBS; ou um MAb purificado que reconhece um antígeno irrelevante não expresso em células humanas. Em estudos preliminares, nenhuma diferença é encontrada entre IgG de controle ou PBS sobre o crescimento tumoral. Os tamanhos do tumor são determinados por medições com compasso de calibre, e o volume do tumor é calculado como largura x comprimento/2, em que a largura é a menor dimensão e o comprimento é a maior dimensão. Camundongos com tumores subcutâneos maiores do que 1,5 cm de diâmetro são sacrificados.
[367] Uma vantagem dos modelos de xenoenxerto de câncer é a habilidade para estudar a neovascularização e a angiogênese. O crescimento do tumor é parcialmente dependente do desenvolvimento de novos vasos sangüíneos. Embora o sistema capilar e a rede sangüínea em desenvolvimento se originem do hospedeiro, a iniciação e arquitetura da neovasculatura são reguladas pelo tumor de xenoenxerto (Davidoff e cols., Clin. Cancer Res. (2001) 7: 2.870; Solesvik e cols., Eur. J. Cancer Clin. Oncol. (1984) 20: 1.295) O efeito do anticorpo e pequena molécula sobre a neovascularização é estudado de acordo com procedimentos conhecidos na técnica, por exemplo, por análise por IHC de tecidos tumorais e seu microambiente circundante.
ADCs de 158P1D7:
[368] Anticorpos monoclonais foram despertados contra 158P1D7 como descrito no exemplo intitulado “Geração de anticorpos monoclonais (MAbs) para 158P1D7”. Além disso, os MAbs são conjugados a uma toxina, como descrito no exemplo intitulado “Conjugação de anticorpo-fármaco de MAb Ha15- 10ac12”, para formar Ha15-10ac12vcMMAE. O Ha15-10ac12vcMMAE é caracterizado por FACS e outros métodos conhecidos na técnica para determinar sua capacidade de se ligar à 158P1D7.
Linhagens de células e xenoenxertos:
[369] As células são mantidas em DMEM, suplementado com L-glutamina e FBS 10%, como conhecido na técnica. Os xenoenxertos de AG-B7, RT-4-XCL e NCI-H322M-XCL são mantidos por propagação serial em camundongos SCID. SW780 e RT-4-XCL são linhagens de células derivadas de câncer da bexiga que foram obtidas da ATCC (Manassas, VA). AG-B7 e AG-B8 são xenoenxertos derivados de pacientes de amostras de câncer da bexiga humano. Aqueles habilitados na técnica observarão que diversos experimentos são realizados in vivo nos ADCs da invenção. Isso é causado, em parte, pelo fato de que cada modelo in vivo, mesmo se na mesma indicação de doença, exibe um nível de imprevisibilidade para aqueles habilitados na técnica. Dessa forma, aqueles habilitados na técnica observarão que a utilização de vários tipos de modelos in vivo permitirá aqueles habilitados na técnica avaliar melhor os ADCs da invenção.
Avaliação de Ha15-10ac12vcMMAE no modelo de xenoenxerto subcutâneo estabelecido de câncer da bexiga humano AG-B7 em camundongos SCID
[370] Nesse experimento, células de câncer da bexiga humano AG-B7 (5 x 106 células por camundongo) foram injetadas nos flancos de camundongos SCID individuais e foi permitido que os tumores crescessem sem tratamento até que alcançassem um volume aproximado de 250 mm. Nesse ponto, os animais foram alocados em cada grupo com base no volume do tumor no momento do início do tratamento para assegurar tamanho médio do tumor e variação similares em cada grupo usando o Software Study Director (versão 1.7; Studilog Systems, Inc., South San Francisco, CA). Todos os grupos tratados com ADC receberam uma dose única a 10 mg/kg por injeção intravenosa em bolo. O crescimento do tumor em cada grupo foi monitorado duas vezes por semana usando medições com compasso de calibre até o término do estudo. A análise estatística dos volumes tumorais foi realizada no último ponto do tempo quando dados de todos os grupos estavam disponíveis usando uma análise de variância não paramétrica (ANOVA) nos dados ranqueados.
[371] Os resultados mostram que Ha15-10ac12vcMMAE demonstrou um efeito inibidor potente, quando comparado com o controle não tratado (p<0,0001) (Figura 5).
Avaliação de Ha15-10ac12vcMMAE no RT-4-XCL câncer da bexiga humano subcutâneo estabelecido implantado em camundongos SCID
[372] Em outro experimento, tumores de estoque de xenoenxerto de câncer da bexiga humano AG-B7 foram coletados de forma estéril e picados em pequenos pedaços (aproximadamente 1 mm). Seis pedaços foram implantados por via subcutânea nos flancos de camundongos SCID individuais. Quando os volumes tumorais médios alcançavam um tamanho predeterminado de 100 mm em volume, os animais foram randomizados em grupos tratados com ADC e um grupo de controle não tratado (veja gráfico do volume tumoral) com tamanho médio do tumor e variação similares em cada grupo usando o Software Study Director (versão 1.7; Studilog Systems, Inc., South San Francisco, CA). Todos os grupos tratados com ADC, incluindo dois ADCs de controle, receberam uma dose única de 5 mg/kg por injeção intravenosa em bolo. O crescimento do tumor em cada grupo foi monitorado duas vezes por semana usando medições com compasso de calibre até o término do estudo. A análise estatística dos volumes tumorais foi realizada no último ponto do tempo quando dados de todos os grupos estavam disponíveis usando uma análise de variância não paramétrica (ANOVA) nos dados ranqueados.
[373] Os resultados mostram que Ha15-10ac12vcMMAE demonstrou um efeito inibidor tumoral potente quando comparado com o controle não tratado ou com o controle de ADC correspondente H3-1.4.1.2vcMMAE (ambos p<0,0001) (Figura 6).
Avaliação de Ha15-10ac12vcMMAE no xenoenxerto subcutâneo estabelecido de câncer de pulmão humano NCI-H322M-XCL implantado em camundongos SCID
[374] Em outro experimento, células de câncer de pulmão humano NCI-H322M-XCL (2,5 x 106 células por camundongo) foram injetadas nos flancos de camundongos SCID individuais e foi permitido que os tumores crescessem sem tratamento até que alcançassem um volume aproximado de 200 mm. Nesse ponto, os animais foram alocados em cada grupo com base no volume do tumor no momento do início do tratamento para assegurar tamanho médio do tumor e variação similares em cada grupo usando o Software Study Director (versão 1.7; Studilog Systems, Inc., South San Francisco, CA). Todos os grupos de ADC, incluindo os dois ADCs de controle, foram dosados a 3 mg/kg duas vezes por semana por um total de cinco doses por injeção intravenosa em bolo. O crescimento do tumor em cada grupo foi monitorado duas vezes por semana usando medições com compasso de calibre até o término do estudo. A análise estatística dos volumes tumorais foi realizada no último ponto do tempo quando dados de todos os grupos estavam disponíveis usando uma análise de variância não paramétrica (ANOVA) nos dados ranqueados.
[375] Os resultados mostram que Ha15-10ac12vcMMAE demonstrou um efeito inibidor potente, quando comparado com o controle de veículo (p<0,0001) ou com o controle de ADC correspondente Ha3-12bc1.1vcMMAE (p=0,0041) (Figura 7).
Eficácia de Ha15-10ac12vcMMAE em modelo de xenoenxerto subcutâneo estabelecido de câncer da bexiga humano AG-B7 em camundongos SCID
[376] Em outro experimento, tumores de estoque de xenoenxerto de câncer da bexiga humano AG-B7 foram coletados de forma estéril e picados em pequenos pedaços (aproximadamente 1 mm). Cinco pedaços foram implantados por via subcutânea nos flancos de camundongos SCID individuais. Foi permitido que os tumores crescessem sem tratamento até que alcançassem um volume aproximado de 200 mm. Nesse ponto, os animais foram alocados em cada grupo com base no volume do tumor no momento do início do tratamento para assegurar tamanho médio do tumor e variação similares em cada grupo usando o Software Study Director (versão 1.7; Studilog Systems, Inc., South San Francisco CA). Todos os grupos de ADC, incluindo os dois ADCs de controle, foram dosados a 0,5 mg/kg duas vezes por semana por um total de sete doses por injeção intravenosa em bolo. O crescimento do tumor em cada grupo foi monitorado duas vezes por semana usando medições com compasso de calibre até o término do estudo. A análise estatística dos volumes tumorais foi realizada no último ponto do tempo quando dados de todos os grupos estavam disponíveis usando uma análise de variância não paramétrica (ANOVA) nos dados ranqueados.
[377] Os resultados mostram que Ha15-10ac12vcMMAE tanto produzido por hibridoma (Ha15-10ac12.1vcMMAE) quanto por células CHO (Ha15-10ac12vcMMAE) demonstraram um efeito inibidor tumoral potente quando comparado com o controle de veículo (p<0,0001) ou com o controle de ADC correspondente Ha3-12abc1vcMMAE (p<0,0001) (Figura 8).
Eficácia de Ha15-10ac12vcMMAE em modelo de xenoenxerto subcutâneo estabelecido de câncer da bexiga humano SW780 em camundongos SCID
[378] Em outro experimento, células de xenoenxerto de câncer da bexiga humano SW780 foram implantadas nos flancos de camundongos SCID e foi permitido que os tumores crescessem até que alcançassem um volume aproximado de 200 mm. Nesse ponto, os animais foram alocados para os grupos de tratamento de acordo com volume do tumor no momento do início do tratamento para assegurar tamanho médio do tumor e variação similares em cada grupo. A alocação dos camundongos em grupos de tratamento foi auxiliada pelo Software Study Director (versão 1.7; Studilog Systems, Inc., South San Francisco CA) para ajudar na compatibilização dos camundongos. Todos os grupos de ADC, incluindo os dois ADCs de controle, foram dosados por injeção intravenosa em bolo a 1 mg/kg no começo do estudo. O crescimento do tumor em cada grupo foi monitorado duas vezes por semana usando medições com compasso de calibre até o término do estudo. A análise estatística dos volumes tumorais foi realizada no último ponto do tempo quando dados de todos os grupos estavam disponíveis usando uma análise de variância não paramétrica (ANOVA) nos dados ranqueados.
[379] Os resultados mostram que Ha15-10ac12vcMMAE possui atividade inibidora tumoral superior ao MAb Ha15- 10ac12. Além disso, pode ser concluído que MAb Ha15-10ac12 não possui efeito inibidor tumoral, na medida em que a dinâmica de crescimento do tumor nesse grupo de tratamento acompanha a dos anticorpos de controle de isótipo. Além disso, após uma dose única de 1 mg/kg, Ha15-10ac12vcMMAE mostrou inibição do crescimento estatisticamente significante quando comparado com o ADC de controle de isótipo (p<0,001) (Figura 10).
Eficácia de Ha15-10ac12vcMMAE em modelo de xenoenxerto subcutâneo estabelecido de câncer da bexiga humano AG-B8 derivado de pacientes em camundongos SCID
[380] Em outro experimento, pedaços de tumor de câncer da bexiga humano AG-B8 derivado de pacientes foram implantados nos flancos de camundongos SCID e foi permitido que os tumores crescessem até que alcançassem um volume aproximado de 200 mm. Nesse ponto, os animais foram alocados para os grupos de tratamento de acordo com volume do tumor no momento do início do tratamento para assegurar tamanho médio do tumor e variação similares em cada grupo.A alocação dos camundongos em grupos de tratamento foi auxiliada pelo Software Study Director (versão 1.7; Studilog Systems, Inc., South San Francisco CA) para ajudar na compatibilização dos camundongos. Todos os grupos de ADC, incluindo os dois ADCs de controle, foram dosados por injeção intravenosa em bolo a 5 mg/kg no começo do estudo (dia zero (0)). O crescimento do tumor em cada grupo foi monitorado duas vezes por semana usando medições com compasso de calibre até o término do estudo. A análise estatística dos volumes tumorais foi realizada no último ponto do tempo quando dados de todos os grupos estavam disponíveis usando uma análise de variância não paramétrica (ANOVA) nos dados ranqueados.
[381] Os resultados mostram que Ha15-10ac12vcMMAE possui atividade inibidora tumoral superior a qualquer um dos controles não tratados (p<0,0001) ou a outros controles de ADC gama-2 correspondentes (p<0,0001). Adicionalmente, Ha15ac12vcMMAE também demonstrou efeito estatisticamente significante superior quando comparado com Ha15- 10ac12mcMMAF (p<0,0458) (Figura 12).
Conclusão
[382] Em resumo, as Figuras 5-8, 10 e 12 mostram que o ADC de 158P1D7 intitulado Ha15-10ac12vcMMAE inibiu significantemente o crescimento de células tumorais que expressam 158P1D7, quando comparado com ADCs de controle. Dessa forma, o Ha15-10ac12vcMMAE pode ser usado para fins terapêuticos para tratar e gerenciar os cânceres descritos na Tabela I. Especificamente, esses resultados indicam que Ha15-10ac12vcMMAE possuía efeito inibidor em vários tipos de modelos de câncer da bexiga, o que mostra ele pode ser particularmente terapeuticamente útil no tratamento de câncer da bexiga.
Exemplo 8 Experimentos clínicos humanos para o tratamento e diagnóstico de carcinomas humanos por meio do uso de ADCs de 158P1D7
[383] ADCs de 158P1D7 são usados de acordo com a presente invenção, que se ligam especificamente à 158P1D7, e são usados no tratamento de certos tumores, preferivelmente aqueles listados na Tabela I. Em conexão com cada uma dessas indicações, duas abordagens clínicas são buscadas com sucesso.
[384] I) Terapia auxiliar: Em terapia auxiliar, pacientes são tratados com ADCs de 158P1D7 em combinação com um agente quimioterápico ou antineoplásico e/ou radioterapia ou uma combinação destes. Alvos de cânceres primários, tais como aqueles listados na Tabela I, são tratados sob protocolos padronizados pela adição de ADCs de 158P1D7 à terapia padronizada de primeira e segunda linha. O design do protocolo aborda a efetividade, como avaliada pelos exemplos seguintes incluindo, sem limitação, redução na massa tumoral de lesões primárias ou metastáticas, sobrevida livre de progressão aumentada, sobrevida global, melhora da saúde dos pacientes, estabilização da doença, bem como a habilidade para reduzir doses usuais de quimioterapia-padrão e outros agentes biológicos. Essas reduções de dosagem permitem terapia adicional e/ou prolongada por redução da toxicidade dose-relacionada do agente quimioterápico ou biológico. ADCs de 158P1D7 são utilizados em vários experimentos clínicos secundários em combinação com os agentes quimioterápicos ou antineoplásicos.
[385] II) Monoterapia: Em conexão com o uso dos ADCs de 158P1D7 na monoterapia de tumores, os ADCs de 158P1D7 são administrados aos pacientes sem um agente quimioterápico ou antineoplásico. Em uma modalidade, a monoterapia é realizada clinicamente em pacientes em estágio final com câncer com doença metastática extensa. O design do protocolo aborda a efetividade, como avaliada pelos exemplos seguintes incluindo, sem limitação, redução na massa tumoral de lesões primárias ou metastáticas, sobrevida livre de progressão aumentada, sobrevida global, melhora da saúde dos pacientes, estabilização da doença, bem como a habilidade para reduzir doses usuais de quimioterapia-padrão e outros agentes biológicos.
Dosagem
[386] Os regimes de dosagem podem ser ajustados para fornecer resposta desejada ótima. Por exemplo, um bolo único pode ser administrado, várias doses divididas podem ser administradas ao longo do tempo ou a dose pode ser proporcionalmente reduzida ou aumentada, como indicado pelas exigências da situação terapêutica. É especialmente vantajoso formular composições parenterais em forma de unidade de dosagem para facilitar a administração e uniformidade de dosagem. O termo “forma de unidade de dosagem”, como aqui usado, se refere às unidades fisicamente distintas adequadas como dosagens unitárias para indivíduos mamíferos a serem tratados; cada unidade contendo uma quantidade predeterminada de composto ativo calculada para produzir o efeito terapêutico desejado em associação com o veículo farmacêutico necessário. As especificações para as formas de unidade de dosagem da invenção são ditadas e dependem diretamente: (a) das características únicas do anticorpo e/ou ADC e do efeito terapêutico ou profilático particular a ser obtido, e (b) das limitações inerentes na técnica de composição desse composto ativo para o tratamento de sensibilidade em indivíduos.
[387] Uma faixa exemplar, não limitante, para uma quantidade terapeuticamente eficaz de um ADC de 158P1D7 administrado em combinação de acordo com a invenção é cerca de 0,5 a cerca de 10 mg/kg, cerca de 1 a cerca de 5 mg/kg, pelo menos 1 mg/kg, pelo menos 2 mg/kg, pelo menos 3 mg/kg, ou pelo menos 4 mg/kg. Outras faixas não limitantes exemplares são, por exemplo, cerca de 0,5 a cerca de 5 mg/kg ou, por exemplo, cerca de 0,8 a cerca de 5 mg/kg ou, por exemplo, cerca de 1 a cerca de 7,5 mg/kg. A modalidade de dose elevada da invenção está relacionada a uma dosagem de mais do que 10 mg/kg. Deve ser observado que os valores de dosagem podem variar com o tipo e gravidade da condição a ser aliviada, e podem incluir doses únicas ou múltiplas. Deve ainda ser subentendido que para qualquer indivíduo em particular, regimes de dosagem específicos devem ser ajustados ao longo do tempo de acordo com a necessidade individual e com a avaliação profissional da pessoa que administra ou supervisiona a administração das composições, e que as faixas de dosagem aqui descritas são apenas exemplares, e não visam limitar o escopo ou a prática da composição reivindicada.
Planejamento de desenvolvimento clínico (CDP)
[388] O CDP acompanha e desenvolve tratamentos de ADCs de 158P1D7 em conexão com terapia auxiliar ou monoterapia. Os experimentos inicialmente demonstram segurança e posteriormente confirmam eficácia em doses repetidas. Os experimentos são de rótulo aberto que comparam quimioterapia-padrão com terapia-padrão mais ADCs de 158P1D7. Como será observado, um critério não limitante que pode ser utilizado em conexão com a inclusão de pacientes consiste nos níveis de expressão de 158P1D7 em seus tumores, como determinado por biópsia.
[389] Como ocorre com qualquer terapêutica à base de infusão de proteína ou anticorpo, as preocupações de segurança estão relacionadas primariamente: (i) à síndrome de liberação de citocina, ou seja, hipotensão, febre, agitação, calafrios; (ii) ao desenvolvimento de uma resposta imunogênica ao material (ou seja, desenvolvimento de anticorpos humanos pelo paciente ao anticorpo terapêutico, ou resposta de HAMA); e, (iii) à toxicidade para as células normais que expressam 158P1D7. Testes e acompanhamento padronizados são utilizados para monitorar cada uma dessas preocupações de segurança. Foi constatado que ADCs de 158P1D7 são seguros após administração humana.
Exemplo 9 Detecção de proteína 158P1D7 em amostras de paciente com câncer por IHC
[390] A expressão de proteína 158P1D7 por imunoistoquímica foi testada em amostras tumorais de paciente de pacientes com câncer (i) da bexiga, (ii) da mama, (iii) do pulmão e (iv) glioblastoma. Resumidamente, tecidos fixados em formalina embebidos em cera de parafina foram cortados em cortes de quatro (4) mícrons e montados em lâminas de vidro. Os cortes foram retirados da cera, reidratados e tratados com solução de recuperação de antígeno citra (Biogenex, San Ramon, CA) no microondas EZ- Retriever (Biogenex, San Ramon, CA) por 15 minutos a 95°C. Os cortes foram então tratados com solução de peróxido de hidrogênio 3% para inativar a atividade de peroxidase endógena. O bloqueio de proteína livre de soro (Dako, Carpenteria, CA) foi usado para inibir a ligação não específica antes da incubação com anticorpo monoclonal anti-158P1D7 de camundongo ou um controle de isótipo. Subseqüentemente, os cortes foram tratados com o Sistema de Detecção Super Sensitive™ Polímero-Peroxidase de raiz forte (HRP) que consiste em uma incubação em reagente Super Enhancer™, seguida por uma incubação com conjugado de anticorpo secundário polímero-HRP (BioGenex, San Ramon, CA). Os cortes foram então desenvolvidos usando o kit DAB (BioGenex, San Ramon, CA). Os núcleos foram corados usando hematoxilina, e analisados por microscopia de campo brilhante. A coloração específica foi detectada em amostras de pacientes usando o anticorpo imunorreativo 158P1D7, como indicado pela coloração marrom (veja as Figuras 9(A), 9(C), 9(E) e 9(G)). Em contraste, o anticorpo de controle não corou nenhuma amostra de paciente (veja as Figuras 9(B), 9(D), 9(F) e 9(H)).
[391] Os resultados mostram a expressão de 158P1D7 nas células tumorais de paciente com tecidos de câncer da bexiga, da mama, do pulmão e glioblastoma. Esses resultados indicam que 158P1D7 é expressa em cânceres humanos e que anticorpos dirigidos a esse antígeno e o conjugado anticorpo-fármaco designado Ha15-10ac12vcMMAE são úteis para fins diagnósticos e terapêuticos (Figura 9).
[392] Ao longo desse esse pedido, os dados do conteúdo de várias páginas da Internet, publicações, pedidos de patente e patentes são citados (as páginas da Internet são citadas por seu Localizador Uniforme de Recursos, ou URL, endereços na Internet). As revelações de cada uma dessas referências são aqui incorporadas por referência em suas totalidades.
[393] A presente invenção não deve ter seu escopo limitado pelas modalidades aqui reveladas, que representam apenas ilustrações de aspectos individuais da invenção, e qualquer equivalente funcional está dentro do escopo da invenção. Várias modificações aos modelos e métodos da invenção, além daquelas aqui descritas, ficarão evidentes para aqueles habilitados na técnica a partir da descrição e ensinamentos anteriores e, da mesma forma, visam ser englobados dentro do escopo da invenção. Essas modificações ou outras modalidades podem ser praticadas sem se afastar do verdadeiro escopo e espírito da invenção. Tabelas Tabela I: Tecidos que expressam 158P1D7 quando malignos. Glioblastoma Pulmão Bexiga Mama TABELA II: Abreviações de aminoácidos
Figure img0043
Figure img0044
TABELA III: Matriz de substituição de aminoácidos. Adaptada do Software dE matriz de substituição de aminoácidos GCG 9.0 BLOSUM62 (matriz de substituição em bloco). Quanto maior o valor, maior a probabilidade de uma substituição ser encontrada em proteínas naturais relacionadas.
Figure img0045
Tabela IV. Método geral para a síntese de vcMMAE. Em que: AA1 = Aminoácido 1 AA2 = Aminoácido 2 AA5 = Aminoácido 5 D/L = Dolaisoleucina DAP = Dolaproína Vinculador = Val-Cit (vc)
Figure img0046
H2, CDR-H3, como identificadas pelos esquemas de Kabat, Chotia e Contact, respectivamente. Para CDR-H1, a numeração do resíduo é dada listada usando tanto o esquema de numeração de Kabat quanto o de Chotia.
Figure img0047
Figure img0048
Tabela VI. Valores da intensidade de fluorescência media (MFI) valores no ensaio de FACS.
Figure img0049
Tabela VII. Valores de MFA por FACS de Ha15-10ac12vcMMAE para ensaio de ligação.
Figure img0050

Claims (36)

1. Conjugado anticorpo-fármaco caracterizado pelo fato de que compreende um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga a 158P1D7 conjugado a uma ou mais unidades de monometil-auristatina E (MMAE), cada MMAE sendo conjugada através de um ligante, em que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma região variável da cadeia pesada compreendendo CDR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos que varia da posição 31 à 35 da SEQ ID NO: 7, CDR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos que varia da posição 50 à 66 da SEQ ID NO: 7, e CDR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos que varia da posição 99 à 109 da SEQ ID NO: 7, e uma região variável da cadeia leve compreendendo CDR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos que varia da posição 24 à 39 da SEQ ID NO: 8, CDR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos que varia da posição 55 à 61 da SEQ ID NO: 8 e CDR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos que varia da posição 94 à 102 da SEQ ID NO: 8.
2. Conjugado anticorpo-fármaco, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma região variável da cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos que varia da posição 1 à posição 120 da SEQ ID NO: 7 e uma região variável da cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos que varia da posição 1 à posição 113 da SEQ ID NO: 8.
3. Conjugado anticorpo-fármaco, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos que varia da posição 1 à posição 446 da SEQ ID NO: 7 e uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos que varia da posição 1 à posição 219 da SEQ ID NO: 8.
4. Conjugado anticorpo-fármaco, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende: (i) uma região variável da cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada de um anticorpo produzido por uma célula de ovário de hamster chinês (CHO) depositada sob o N° de Acesso na ATCC PTA-13102, e uma região variável da cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve de um anticorpo produzido pela célula de ovário de hamster chinês (CHO) depositada sob o N° de Acesso na ATCC PTA-13102; ou (ii) uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos da cadeia pesada de um anticorpo produzido pela célula de ovário de hamster chinês (CHO) depositada sob o N° de Acesso na ATCC PTA-13102, e uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos da cadeia leve de um anticorpo produzido pela célula de ovário de hamster chinês (CHO) depositada sob o N° de Acesso na ATCC PTA- 13102.
5. Conjugado anticorpo-fármaco, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que compreende uma região constante de IgG humano e uma região constante de cadeia leve humana.
6. Conjugado anticorpo-fármaco, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo totalmente humano.
7. Conjugado anticorpo-fármaco, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é produzido de forma recombinante.
8. Conjugado anticorpo-fármaco, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 4, 6 e 7, caracterizado pelo fato de que o fragmento é um Fab, F(ab')2, Fv ou scFv.
9. Conjugado anticorpo-fármaco, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que o conjugado anticorpo-fármaco compreende de 1 a 10 unidades de MMAE por anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo.
10. Conjugado anticorpo-fármaco, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que o conjugado anticorpo-fármaco compreende de 2 a 5 unidades de MMAE por anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo.
11. Conjugado anticorpo-fármaco, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que o ligante compreende valina-citrulina (Val- Cit).
12. Conjugado anticorpo-fármaco, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que o conjugado anticorpo-fármaco possui a seguinte estrutura:
Figure img0051
em que L representa o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo e p varia de 1 a 10.
13. Conjugado anticorpo-fármaco, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que p varia de 2 a 5.
14. Conjugado anticorpo-fármaco, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que o ligante possui a fórmula: -Aa-Ww-Yy-; em que -A- é uma unidade esticadora, a é 0 ou 1; -W- é uma unidade de aminoácido, w é um número inteiro variando de 0 a 12; e -Y- é uma unidade espaçadora; e y é 0, 1 ou 2.
15. Conjugado anticorpo-fármaco, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que a unidade esticadora possui a estrutura da Fórmula I abaixo; a unidade de aminoácido é Val-Cit; e a unidade espaçadora é um grupo PAB possuindo a estrutura da Fórmula II abaixo:
Figure img0052
16. Conjugado anticorpo-fármaco, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que a unidade esticadora forma uma ligação com um átomo de enxofre do anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo; e em que a unidade espaçadora é ligada ao MMAE através de um grupo carbamato.
17. Composição farmacêutica caracterizada pelo fato de que compreende uma quantidade terapeuticamente efetiva do conjugado anticorpo-fármaco, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 16, e um excipiente farmaceuticamente aceitável.
18. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 17, caracterizada pelo fato de que a composição é no tratamento de câncer da bexiga, glioblastoma, câncer de pulmão e câncer de mama.
19. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 17 ou 18, caracterizada pelo fato de que a composição ainda compreende um agente quimioterápico.
20. Uso do conjugado anticorpo-fármaco, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 16, caracterizado pelo fato de ser na preparação de um medicamento para o tratamento de um câncer selecionado de um grupo que consiste em glioblastoma, câncer de pulmão, câncer de bexiga e câncer de mama em um indivíduo.
21. Uso, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que o conjugado anticorpo- fármaco é usado em combinação com um agente quimioterapêutico.
22. Uso, de acordo com a reivindicação 20 ou 21, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é um indivíduo humano.
23. Uso, de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que o câncer é glioblastoma.
24. Uso, de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que o câncer é câncer de pulmão.
25. Uso, de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que o câncer é câncer de bexiga.
26. Uso, de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que o câncer é câncer de mama.
27. Uso, de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que o conjugado anticorpo- fármaco é usado em uma quantidade de 1 a 5 mg/kg no indivíduo humano.
28. Vetor caracterizado pelo fato de que compreende um polinucleotídeo compreendendo: (i) uma região variável da cadeia pesada codificada pela SEQ ID NO: 3 que codifica a região variável de cadeia pesada da SEQ ID NO: 4; e (ii) um polinucleotídeo compreendendo uma região variável da cadeia leve codificada pela SEQ ID NO: 5 que codifica a região variável de cadeia leve da SEQ ID NO: 6.
29. Método para produzir um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo caracterizado pelo fato de que compreende transfectar uma célula hospedeira com o vetor, conforme definido na reivindicação 28.
30. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga a 158P1D7 caracterizado pelo fato de que compreende uma região variável da cadeia pesada compreendendo CDR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos que varia da posição 31 à 35 da SEQ ID NO: 7, CDR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos que varia da posição 50 à 66 da SEQ ID NO: 7, e CDR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos que varia da posição 99 à 109 da SEQ ID NO: 7, e uma região variável da cadeia leve compreendendo CDR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos que varia da posição 24 à 39 da SEQ ID NO: 8, CDR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos que varia da posição 55 à 61 da SEQ ID NO: 8, e CDR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos que varia da posição 94 à 102 da SEQ ID NO: 8.
31. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos que varia da posição 1 à posição 120 da SEQ ID NO: 7 e uma região variável da cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos que varia da posição 1 à 113 da SEQ ID NO: 8.
32. Anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende uma cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos que varia da posição 1 à 446 da SEQ ID NO: 7 e uma cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos que varia da posição 1 à 219 da SEQ ID NO: 8.
33. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelo fato de que compreende ainda: (i) uma região variável da cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada de um anticorpo produzido por uma célula de ovário de hamster chinês (CHO) depositada sob o N° de Acesso na ATCC PTA-13102, e uma região variável da cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve de um anticorpo produzido pela célula de ovário de hamster chinês (CHO) depositada sob o N° de Acesso na ATCC PTA-13102; ou (ii) uma cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos da cadeia pesada de um anticorpo produzido pela célula de ovário de hamster chinês (CHO) depositada sob o N° de Acesso na ATCC PTA-13102, e uma cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos da cadeia leve de um anticorpo produzido pela célula de ovário de hamster chinês (CHO) depositada sob o N° de Acesso na ATCC PTA-13102.
34. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 30 a 33, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo totalmente humano.
35. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 30 a 33, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é produzido de forma recombinante.
36. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 30, 31, e 33 a 35, caracterizado pelo fato de que o fragmento de ligação ao antígeno é um Fab, F(ab’)2, Fv ou scFv.
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