ES2694285T3 - Dispositivo y procedimiento para el aislamiento de ácidos nucleicos de sangre entera - Google Patents

Dispositivo y procedimiento para el aislamiento de ácidos nucleicos de sangre entera Download PDF

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Abstract

Uso de una composición como agente de disgregación para células contenidas en sangre entera, como agente de estabilización para el ARN completo de la sangre entera y para el aislamiento mediante adsorción del ARN de una mezcla de la sangre entera con la composición a un agente de adsorción para ácidos nucleicos, caracterizado por que la composición en solución acuosa se compone de a. al menos una sal de guanidinio, b. al menos una sustancia tampón para el tamponamiento en un pH de 5,0 a 8,0, c. al menos un detergente no iónico y d. al menos un formador de complejos para cationes divalentes, e. y, opcionalmente, proteinasa y/o DNasa, y f. está exenta de agentes reductores, que impide la degradación y la síntesis renovada de ARN en la sangre entera, y porque el uso comprende el aislamiento de ARN directamente a partir de la mezcla, que se compone de sangre entera y de la composición, estando prevista la composición en una relación en volumen variable de la sangre entera a la composición de hasta 1:13 en la mezcla, mediante la puesta en contacto en la mezcla con un agente de adsorción para ácidos nucleicos, en donde a partir de la mezcla no se separa componente alguno, opcionalmente a la mezcla se añade proteinasa y/o DNasa, y el ARN no precipita de la mezcla y se separa antes de que la misma se ponga en contacto con el agente de adsorción.

Description

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DESCRIPCION
Dispositivo y procedimiento para el aislamiento de acidos nucleicos de sangre entera
La presente invencion se refiere al uso de una composicion y a un procedimiento para la estabilizacion de ARN, incluido el ARN contenido en celulas, de sangre entera, preferiblemente con el aislamiento subsiguiente del ARN. Asimismo se describe un dispositivo para uso como tubo de extraccion de sangre, que contiene la composicion adecuada para la estabilizacion del ARN completo y para el subsiguiente aislamiento. La composicion para la estabilizacion del ARN de sangre entera, el procedimiento y el tubo de extraccion de sangre utilizable para el procedimiento, que contiene la composicion, se caracterizan porque se alcanza una estabilizacion efectiva de ARN en sangre entera y se posibilita un procedimiento rapido y eficaz para el aislamiento. En este caso, la estabilizacion comprende el ARN completo, incluido el ARN contenido en plasma exento de celulas, y el ARN contenido en celulas presentes en la sangre.
Estado de la tecnica
El documento WO 2009/018034 A1 se refiere al aumento de la solubilidad de SDS en tampon de lisis para celulas mediante la adicion de un detergente no ionico y un procedimiento para el aislamiento de ADN a partir de tejido animal con la adicion de un tampon de lisis a base de NaCl 2M, SdS al 1,2%, EDTA 12 mM, Tris-HCl 24 mM, pH 8,0, con Tween al 2% y subsiguiente adicion del volumen decuplo de un tampon de extraccion a base de Tris-HCl 50 mM, pH 7, EDTA 10 mM, guanidina-HCl 7M, Tween 20 al 5%.
El documento WO 2007/060248 A1 se dirige a la lisis de celulas con sal caotropica y subsiguiente adicion de sal no caotropica para la union de acidos nucleicos a material de soporte. Para el aislamiento de ADN de tejido del tngado se describe, p. ej., un tampon de lisis a base de tiocianato de guanidina 4M, N-laurilsarcosina al 1% y EDTA 2 mM con subsiguiente contacto de la mezcla con material de fibras de vidrio para la adsorcion del ADN.
El documento CN 103820431 A no describe, segun el resumen en ingles, composicion alguna para la lisis de celulas.
El documento DE 101 47 439 A1 describe para el aislamiento de ADN de sangre que se anade un reactivo de lisis y, a continuacion, se separan mediante centrifugacion los componentes celulares con contenido en ADN. El ADN sedimentado se purifica, p. ej., de protema mediante resuspension con hidrocloruro de guanidinio y separacion de impurezas, y se precipita mediante la adicion de alcohol y se separa.
El documento DE 10 2014 220 090 B3 describe para la recogida de muestras biologicas con contenido en acidos nucleicos un recipiente en el que se puede incorporar un frotis, conteniendo el recipiente un lfquido de lisis.
El documento CN 104673623 A describe, segun el resumen en ingles, para un recipiente de muestra con tapa una composicion para la estabilizacion de acidos nucleicos de hematocitos y de ADN exento de celulas.
El documento WO 2006/052680 A1 describe el aislamiento de acidos nucleicos a partir de muestras de sangre con un procedimiento en el que primeramente se separa mediante centrifugacion un sedimento, el cual es purificado mediante lavado de componentes de la sangre y, a continuacion, se separa de nuevo por centrifugacion para formar un sedimento. A continuacion, los sedimentos se disuelven en tampon de lisis a base de LiCl 6 M, Triton X-100 al 5%, DGME al 5%, EDTA 10 mM, TRIZMA 100 mM, pH 8,8, con adicion de coadyuvantes de disolucion (TRIZMA base 38 mM, TRIZMA HCl 12 mM, EDTA 10 mM, Triton X-100 al 5%), opcionalmente mediante la adicion de Triton X-100 adicional. A continuacion, esta mezcla se puso en contacto con el agente de adsorcion para acidos nucleicos.
El documento US 2016/0032277 A1 describe para el aislamiento de microARNs un procedimiento en el que primeramente se realiza una extraccion con fenol-cloroformo y, a continuacion, la fase acuosa se separa por centrifugacion y se pone en contacto con un soporte para acidos nucleicos. Como tampon de lisis puede utilizarse una mezcla acuosa a base de detergente, p. ej., Triton o Tween, guanidina-HCl, EDTA y TRIS, que tambien puede estar exenta de agentes reductores (p-mercaptoetanol).
El documento WO 02/056030 A2 describe para la estabilizacion del contenido en ARN en una muestra un recipiente con un vacfo predeterminado para absorber un volumen de muestra predeterminado, estando dispuesto en el recipiente un agente para la inhibicion de la induccion genica y contra la degradacion enzimatica de acidos nucleicos, en particular mercaptoetanol, ditiotreitol (DTT) y una sal caotropica, en particular isotiocianato de guanidinio o hidrocloruro de guanidinio.
El documento WO 00/09746 A1 describe un recipiente para la extraccion de sangre que, para la lisis de celulas y para la estabilizacion de acidos nucleicos, contiene una solucion con una sal de guanidinio, tampon, detergente y un agente reductor, en particular DTT, p-mercaptoetanol y TCEP (Tris(2-carboxietil)fosfina). El agente reductor, en particular p-mercaptoetanol o DTT, se considera en el mismo esencial para la estabilizacion de ARN en suero.
Mision de la invencion
La invencion establece como mision proporcionar un uso alternativo de la composicion y, preferiblemente, un procedimiento alternativo para la estabilizacion y el subsiguiente aislamiento del ARN completo de sangre entera. Preferiblemente, la composicion debe estabilizar el ARN completo de sangre entera y permitir un rapido 5 procedimiento para el aislamiento del ARN completo. Mas preferiblemente, la composicion debe permitir la estabilizacion del ARN para un volumen variable de sangre, de modo que para filtrar un volumen de sangre predeterminado no tenga necesariamente que disponerse un tubo de extraccion de sangre que contenga la composicion.
Descripcion de la invencion
10 La invencion resuelve el problema con las caractensticas de las reivindicaciones, en particular mediante el uso de una composicion para la estabilizacion del ARN completo y un procedimiento para la estabilizacion del ARN completo de sangre entera para el subsiguiente aislamiento y sirve al mismo tiempo para la disgregacion de celulas, de modo que acidos nucleicos celulares en el estado en el caso del contacto con la composicion, en particular en el momento de la extraccion de sangre, se liberan y se mantienen estables en relacion con la naturaleza y 15 concentracion y, a continuacion, se pueden aislar. En este caso, la composicion se caracteriza porque impide, en particular, la degradacion y la smtesis nueva de ARN en sangre entera en la que se incorporo por mezcladura. De manera correspondiente, la invencion se refiere al uso de la composicion, contenida preferiblemente en un tubo de extraccion de sangre, para el procedimiento, en particular como medio para la estabilizacion y el aislamiento del ARN completo de la sangre sin la etapa de la precipitacion y separacion de ARN antes de la adsorcion del ARN a un 20 agente de adsorcion. Para el aislamiento, la mezcla a base de sangre y de la composicion acuosa puede ponerse en contacto, sin precipitacion del ARN, con un agente de adsorcion. El aislamiento del ARN mediante el contacto de la mezcla a base de la composicion acuosa y sangre con un agente de adsorcion puede tener lugar directamente a partir de la mezcla completa de la composicion acuosa, es decir, p. ej., sin precipitacion y separacion de acidos nucleicos de la mezcla, opcionalmente despues de un almacenamiento durante el cual la mezcla es transportada, p. 25 ej., desde el lugar de la extraccion de sangre al lugar del procedimiento de analisis.
La muestra biologica es sangre entera, tambien denominada sangre.
La composicion presenta en solucion acuosa al menos una sal de guanidinio,
preferiblemente tiocianato de guanidinio, al menos una sustancia tampon, preferiblemente acido 2-(N- morfolino)etanosulfonico (MES),
30 un detergente no ionico, preferiblemente Triton X-100, y
un formador de complejos para cationes divalentes, preferiblemente tetra-acetato de etilendiamina (EDTA)
o se compone de los mismos,
y esta particularmente exenta de agentes reductores, p. ej., exenta de compuestos de tiol o sus compuestos precursores, en particular exenta de p-mercaptoetanol y ditiotreitol (DTT).
35 En solucion acuosa, la composicion se compone de la al menos una sal de guanidinio, p. ej., 1,8 a 2,6 M, preferiblemente 2,0 a 2,4 M, mas preferiblemente 2,2 M,
la al menos una sustancia tampon en una concentracion que tampona un volumen de sangre a un pH de 5,0 a 8,0, p. ej., de pH 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9 o 6,0 a 7,5, 7,6, 7,7, 7,8, 7,9, preferiblemente pH 6,5 a 7,3, p. ej., MES al menos 50 mM, preferiblemente al menos 70 mM, p. ej., hasta 100 mM o hasta 74 mM,
40 el detergente no ionico, p. ej., Triton X-100, en 10 a 20% en peso/vol., preferiblemente 12 a 18% en peso/vol.,
un formador de complejos para cationes divalentes, en particular EDTA, de, p. ej., 50 a 100 mM, preferiblemente 70 a 80 mM, mas preferiblemente aprox. 72 mM,
p. ej., para un volumen de sangre en una relacion al volumen de la composicion acuosa de 1:13 a 1:3 o hasta 1:2, preferiblemente hasta 1:2,6 o hasta 1:2,5 o 1:2,4.
45 La sustancia tampon se elige, p. ej., de Tris(Tris(hidroximetil)-aminometano), citrato o fosfato(di-hidrogeno-fosfato de sodio)dihidrato o bien fosfato(hidrogeno-fosfato de sodio)dihidrato, tampon BisTris (bis-(2-hidroximetil)-imino-tris- (hidroximetil)-metano), ACES (acido N-(2-acetamido)-2-aminometanosulfonico), hidrogeno-carbonato de sodio, preferiblemente acido 2-(N-morfolino)etanosulfonico (MES).
El detergente no ionico se elige, p. ej., de Tween 20 (monolaurato de polioxietilen(20)-sorbitan), Nonidet P40 (450 nonilfenol-polietilenglicol), Tween 80 (monooleato de polioxietilensorbitan), Brij 58 (polietilenglicol-hexadecileter), Triton X-114 (octilfenolpolietilenglicoleter), preferiblemente Triton X-100 (polietilenglicol-p-(1,1,3,3- tetrametilbutil)fenileter).
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La composicion tiene la ventaja de disgregar las celulas humanas contenidas en la sangre entera y estabilizar todos los acidos nucleicos, en particular ARN, de la sangre entera, pudiendo presentarse la sangre entera y la composicion en una relacion en volumen variable. Un tubo de extraccion de sangre que contiene la composicion puede por lo tanto disponerse para absorber un volumen de sangre variable, p. ej., el tubo de extraccion de sangre puede disponerse para absorber sangre hasta una relacion volumetrica de 1:13 a 1:3, preferiblemente de hasta 1:2 o de hasta 1:2,6 a la composicion. Para la absorcion de un volumen de sangre variable, el tubo de extraccion de sangre en el que esta contenida la composicion puede presentar, p. ej., un embolo extrafble manualmente de un tubo.
La composicion se caracteriza porque no requiere precipitacion alguna de los acidos nucleicos a partir de la mezcla a base de sangre entera y de la composicion con el fin de estabilizar y aislar el ARN de la sangre entera. Por lo tanto, el procedimiento de acuerdo con la invencion presenta el aislamiento de ARN a partir de la mezcla de sangre entera y de la composicion sin una etapa de la precipitacion de acidos nucleicos, en particular ARN o bien sin una etapa de la centrifugacion para la separacion de los acidos nucleicos precipitados antes de la union del ARN a un agente de adsorcion.
De acuerdo con la invencion, el ARN completo se afsla de la mezcla a base de sangre entera y de la composicion debido a que la mezcla a base de sangre entera y de la composicion,
opcionalmente despues de la adicion de proteinasa, p. ej., proteinasa K, e incubacion, p. ej., a la temperatura ambiente durante aprox. 15 min, opcionalmente antes o despues de la adicion de la proteinasa y adicion de DNasa,
se pone en contacto con un agente de adsorcion para acidos nucleicos,
en donde a partir de la mezcla, opcionalmente incluida la proteinasa y/o DNAsa anadida, no se separa antes del contacto con el agente de adsorcion sustancia constitutiva alguna,
a continuacion, se separan las sustancias no unidas al agente de adsorcion, p. ej., mediante lavado del agente de adsorcion, y
se eluyen los acidos nucleicos unidos al agente de adsorcion, p. ej., mediante contacto del agente de adsorcion con un tampon acuoso con un valor del pH, un contenido en alcohol y/o una concentracion de iones que disuelve los acidos nucleicos unidos al agente de adsorcion.
La mezcla a base de sangre entera y de la composicion puede ponerse en contacto por completo y directamente en el tiempo despues de la preparacion de la mezcla con el agente de adsorcion para acidos nucleicos. De ello resulta la ventaja de que el procedimiento para el aislamiento del ARN no requiere incubacion alguna para la precipitacion y centrifugacion alguna antes de la puesta en contacto de la mezcla con el agente de adsorcion y adicion alguna de otras sustancias y, por lo tanto, se puede llevar a cabo de forma sencilla y rapida.
Despues de la puesta en contacto de la mezcla a base de sangre entera y de la composicion, que contiene opcionalmente proteinasa anadida, puede anadirse opcionalmente DNasa, de modo que se digiere ADN y se afsla en esencia ARN.
El agente de adsorcion para acidos nucleicos es, p. ej., una superficie de sflice, en particular una membrana de (gel de) sflice, suspension de (gel de) sflice o partfculas magneticas revestidas con sflice tal como se puede obtener, p. ej., bajo la denominacion PAXgene de la razon social PreAnalytiX, bajo la denominacion NucleoSpin de la razon social Macherey-Nagel, bajo la denominacion mRNA Isolation Kit for Blood/Bone Marrow o bajo la denominacion High Pure Viral Nucleic Acid Large Volume Kit de la razon social Roche para el aislamiento de acidos nucleicos.
Si el agente de adsorcion se compone de partfculas revestidas con sflice, preferiblemente partfculas magneticas, se prefiere la adicion de un diluyente en un volumen eficaz a la mezcla a base de sangre entera y la composicion. El diluyente puede ser, p. ej., el reactivo de estabilizacion de ADN/ARN adquirible de la razon social Roche para sangre/medula osea (Roche artfculo N° 11 934 317 001) o la composicion de acuerdo con la invencion, en cada caso opcionalmente con un contenido de hasta 30% vol./vol. de etanol, preferiblemente 10 a 30% vol./vol. de etanol, p. ej., 20% vol./vol. de etanol. Un volumen eficaz puede determinarse como tal, en el que el ARN es adsorbido esencialmente en al menos un 80% de la cantidad total, preferiblemente en esencia por completo a las partfculas revestidas con sflice. El volumen eficaz con el que se anade el diluyente a la mezcla de sangre entera y la composicion asciende preferiblemente a 50 hasta 150% el volumen de la mezcla, p. ej., 80 a 120%, preferiblemente 100% el volumen de la mezcla, antes o despues de la adicion por mezcladura de las partfculas revestidas con sflice a la mezcla, que preferiblemente son partfculas magneticas. En particular en esta forma de realizacion, se prefiere la adicion a la mezcla de proteinasa.
Partfculas revestidas con sflice pueden ser, p. ej., aquellas de la razon social Chemagen o de la razon social Applied Biosystems (perlas de union a ARN, Art. N° 100191) o de la razon social Roche del kit de aislamiento de ARNm para sangre/medula osea, Art. No. 11 934 333 001) o aquellas de acuerdo con Hai N.H., Phu N.D., Luong N.H., Chau N., Chinh H.D., Hoang L.H., Leslie-Pelecky D.L. (2008), Mechanism for Sustainable Magnetic Nanoparticles under Ambient Conditions, Journal of the Korean Physical Society, 52(5), 1327-1331 o aquellas de acuerdo con Quy D.V., Hieu N.M., Tra P.T., Nam N.H., Hai N.H., Son N.T., Nghia P.T., Anh N.T.V., HongT.T., Luong N.H. (2013) Synthesis
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of Silica-Coated Magnetic Nanoparticles and Application in the Detection of Pathogenic Viruses, Journal of Nanomaterials, DOI:10.1155/2013/603940.
Tambien en el caso de un agente de adsorcion a base de partfculas revestidas con sflice que preferiblemente son partfculas magneticas revestidas con s^lice, la mezcla completa a base de sangre entera y la composicion con el agente de adsorcion se pone en contacto con el diluyente anadido, es decir, inmediatamente o bien por completo o bien sin una separacion previa de un componente de la mezcla.
De acuerdo con la invencion, la mezcla completa puede ser puesta en contacto directamente con el agente de adsorcion, dado que a partir de la mezcla de sangre entera y de la composicion no se separa sustancia constitutiva alguna o bien fraccion alguna, en particular no se requiere centrifugacion alguna de esta mezcla para la separacion de una sustancia constitutiva precipitada, p. ej., separacion por centrifugacion alguna de acidos nucleicos precipitados con subsiguiente separacion de la fase lfquida y disolucion de los acidos nucleicos. Esto se atribuye actualmente a que la composicion no precipita acidos nucleicos, en particular ARN, en mezcla con sangre entera. La composicion tiene mas bien la ventaja de que una mezcla a base de sangre entera y de la composicion, opcionalmente con proteinasa y/o DNasa anadida, puede ponerse en contacto sin etapas de tratamiento adicionales
0 bien sin adiciones con un agente de adsorcion para acidos nucleicos, en particular superficies de sflice, con el fin de unir los acidos nucleicos al agente de adsorcion. Por lo tanto, la composicion permite un procedimiento para el aislamiento de acidos nucleicos que se lleva a cabo sin separacion de una fraccion con contenido en acidos nucleicos antes de la puesta en contacto con el agente de adsorcion, p. ej., sin precipitacion mediante centrifugacion con subsiguiente disolucion.
La composicion estabiliza el ARN en la mezcla a base de sangre entera y de la composicion (p. ej., en el caso de almacenamiento durante al menos 3 dfas, preferiblemente durante al menos 5 dfas, p. ej., durante hasta 4 dfas, en particular sin congelacion, p. ej., almacenamiento a al menos 0°C, p. ej., a la temperatura ambiente hasta 22,5°C. De manera correspondiente, el procedimiento presenta preferiblemente el aislamiento del ARN a partir de la mezcla, p. ej., despues de un almacenamiento sin congelacion o bien a al menos 0°C, p. ej., a 15 hasta 25°C, en particular hasta 22,5°C. Alternativa o adicionalmente, la mezcla puede congelarse para el almacenamiento, p. ej., a -40°C o inferior.
La invencion se describe ahora con mayor precision con ayuda de ejemplos con referencia a las figuras, en las que muestran
- la Figura 1, la integridad del ARN que se aislo a partir de sangre entera en mezcla con una composicion de acuerdo con la invencion en diferentes relaciones volumetricas,
- la Figura 2, las concentraciones del ARN que se aislaron a partir de sangre entera en mezcla con una composicion de acuerdo con la invencion en diferentes relaciones volumetricas,
- las Figuras 3 y 4, la comparacion de la integridad de ARN a base de muestras de sangre entera (Sp.1, donante N°
1 y Sp. 2, donante N° 2) despues de almacenamiento en un estabilizador de acuerdo con el documento WO 00/09746 con respecto a un almacenamiento en una composicion de acuerdo con la invencion,
- la Figura 5, un analisis de grupos de la concentracion de diferentes ARNms en el ARN total que se aislo de sangre entera en mezcla con una composicion de acuerdo con la invencion,
- la Figura 6, una matriz de correlacion para la representacion de diferencias de expresion dependientes del almacenamiento,
- las Figuras 7 y 8, las cantidades relativas mediante RT-PCR de determinados ARNms en muestras de dos donantes, las cuales se aislaron despues del almacenamiento de sangre entera a lo largo de 5 dfas en mezcla con una composicion de acuerdo con la invencion.
La composicion de acuerdo con la invencion se dispuso en forma de una solucion acuosa en un tubo de extraccion de sangre en el que se absorbio una muestra de sangre. El tubo de extraccion de sangre puede utilizarse directamente para la extraccion de sangre. Alternativamente, la composicion puede mezclarse con sangre entera que procede preferiblemente de una muestra de sangre entera tomada directamente con antelacion. La disgregacion de celulas de la muestra de sangre y la estabilizacion de los acidos nucleicos, en particular del ARN, tiene lugar generalmente mediante la mezcladura de la muestra de sangre entera con la composicion.
Ejemplo 1: Aislamiento de ARN de sangre entera
Como composicion de acuerdo con la invencion se utilizo una solucion acuosa que se compoma de tiocianato de guanidinio 2,2 M, MES 72 mM, Triton X-100 al 14,4% (peso/vol.) y EDTA 72 mM en agua. De esta composicion, 6,5 mL estaban contenidos en un tubo de extraccion de sangre habitual en el que se absorbio sangre directamente, extrafda con antelacion, que no habfa sido tratada ulteriormente y que no contema aditivo alguno. Esta sangre entera se absorbio en cada caso en un tubo de extraccion de sangre en un volumen de 0,5 mL, 1,0 mL, 1,5 mL, 2,0
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25
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40
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55
mL y 2,5 mL. La mezcladura a fondo tiene lugar mediante la absorcion del volumen de sangre, de manera opcional adicionalmente mediante agitacion, en particular despues de la absorcion de una burbuja de aire.
La mezcla a base de la composicion y sangre entera se combino con proteinasa K (250 jL, 18 jg/mL). La mezcla se incubo durante aprox. 15 min a la temperatura ambiente. A continuacion, la mezcla se hizo pasar a traves de una columna con agente de adsorcion (High Pure Viral Nucleic Acid Large Volume Kit, adquirible de Roche) para acidos nucleicos. El agente de adsorcion se lavo con tampon de lavado de acuerdo con las instrucciones del fabricante y a continuacion los acidos nucleicos unidos se eluyeron con 100 jL de tampon de elucion.
La calidad del ARN eluido se evaluo mediante electroforesis en un sistema Nano Chip de ARN (Agilent Technology, EE.UU.), deteccion mediante bioanalizador Agilent 2100, indicandose un denominado RIN (siglas inglesas de numero de integridad de ARN) que se determina en el analisis mediante el bioanalizador 2100, como medida para la integridad de ARN. La Figura 1 muestra el resultado del analisis para las distintas relaciones en volumen de sangre entera a composicion (ARN Exact) que la integridad del ARN no depende de la relacion en volumen, o bien que la composicion de ARN de igual calidad se estabiliza para diferentes relaciones en volumen con sangre entera y el ARN se puede aislar de su mezcla.
La Figura 2 muestra la concentracion medida de ARN en el material eluido que se aislo para las diferentes relaciones en volumen. Los resultados demuestran mediante la concentracion de ARN creciente proporcional al volumen de sangre en 100 jL de material eluido que la composicion (ARN Exact) estabiliza en igual medida las distintas relaciones en volumen y de ellas se afsla en la misma medida. Esto demuestra que la composicion para la lisis de celulas en sangre entera y la estabilizacion de los acidos nucleicos en sangre entera es adecuada en diferentes relaciones en volumen.
Ejemplo 2: Comparacion del rendimiento de estabilizacion de la composicion de acuerdo con la invencion con una solucion comparativa
Como composicion de acuerdo con la invencion (ARN Exact) se utilizo la del Ejemplo 1, en cada caso en 6,5 mL, y se mezclo con 2,5 mL de sangre extrafda directamente con antelacion, que no contema otros aditivos, con el fin de preparar la mezcla a base de composicion y sangre entera. Para fines comparativos se utilizo una solucion que se compoma de tiocianato de guanidinio 4,0 M, Tris/HCl 45 mM, Triton X-100 al 18,0% (peso/vol.) y DTT al 0,8% (peso/vol.) en agua y se ajusto a un valor del pH de 6,0 (comparacion, correspondiente al documento WO 00/09746 A1). 2,5 mL de la solucion comparativa se mezclaron, tal como se describe en el documento WO 00/09746 A1 (relacion 1 + 1), asimismo con 2,5 mL de la muestra de sangre extrafda directamente con antelacion. Las mezclas se almacenaron a 22,5°C, y el ARN se aislo con el kit NucleoSpin RNA Blood Midi de la razon social Macherey-Nagel a partir de las mezclas. En la solucion comparativa se anadio, tal como se preve en el protocolo de Macherey-Nagel, 1/3 del volumen de etanol al 70%. Esto no es necesario para la mezcla con la composicion de acuerdo con la invencion. La Figura 3 y la Figura 4 muestran los resultados de la separacion electroforetica capilar de los materiales eluidos en un nano-chip de ARN en el bioanalizador 2100. Mientras que de la mezcla de muestras con la composicion de acuerdo con la invencion se puede aislar tambien despues de 3 dfas y despues de 5 dfas ARN con una elevada integridad, esto solo es posible, con el uso de la solucion comparativa, el dfa 0, es decir, directamente despues de la mezcladura con sangre.
Ejemplo 3: Estabilizacion del ARN de sangre entera y aislamiento
Como composicion de acuerdo con la invencion se utilizo la del Ejemplo 1, en cada caso en 6,5 mL y se mezclo con 2,5 mL de sangre extrafda directamente con antelacion, que no contema otros aditivos, con el fin de preparar la mezcla a base de la composicion y sangre entera. Para fines comparativos, se absorbio sangre en tubitos de extraccion de sangre que conteman EDTA para la inhibicion de la coagulacion (S-Monovetten EDTA-K3, adquiribles de la razon social Sarstedt). La sangre procedfa en cada caso de tres donantes distintos.
Las mezclas de acuerdo con la invencion y las muestras comparativas se incubaron a 22,5°C, extrayendose inmediatamente una parte alfcuota (T0, dfa cero), despues de 1 dfa de incubacion (T1) y despues de 3 dfas de incubacion (T3). A partir de las partes alfcuotas extrafdas se aislo directamente y de inmediato el acido nucleico tal como se describe en el Ejemplo 1.
Los acidos nucleicos eluidos se trataron para la separacion de ADN con DNasa (Thermo Fisher Scientific, Artfculo N° EN0521) y se sometieron a ensayo mediante un analisis de micro-matrices en cuanto a la concentracion de aprox. 47000 transcritos (ARNm) (humanHT-12 v4.0 Expression Bead Chip, de la razon social Agilent). En el caso de la evaluacion, solo diferencias de la cantidad en transcritos mayores que el factor 2 se mostraron en el caso de una cantidad total de ARN igual. En la Fig. 5, las cantidades iguales en la matriz muestran, por lo tanto, cantidades de transcrito equiparables. La Fig. 5 muestra las cantidades de transcrito para los grupos de muestras estable (composicion de acuerdo con la invencion), no tratado (solo mezclados con EDTA) y T0 (sin adicion, aislado inmediatamente despues de la extraccion de sangre) en cada caso para las muestras de los donantes 1, 2 y 3, en los momentos indicados.
Las partes alfcuotas que se analizan en la Figura 5 son
5
10
15
20
25
30
35
40
Donante
1 2 3
Muestra
1T0 2T0 3T0
Muestra
1T1 1KT1 2T1 2KT1 3T1 3KT1
Muestra
1T3 1KT3 2T3 2KT3 3T3 3KT3
estando las muestras comparativas de EDTA caracterizadas con una “K”.
El analisis de grupos en 199 transcritos elegidos a modo de ejemplo, mostrado en la Figura 5, pone de manifiesto que las muestras de sangre que se mezclaron con la composicion de acuerdo con la invencion (estable) muestran para un donante en los distintos momentos de la incubacion, en cada caso un modelo equiparable de transcritos, mientras que las muestras comparativas (no tratado), que solo se mezclaron con EDTA, mostraron en los diferentes momentos de la incubacion grandes diferencias dentro de cada uno de los donantes, lo cual apunta a una modificacion de las cantidades de transcrito a lo largo del tiempo y con respecto a T0.
Para las muestras de sangre mezcladas solo con EDTA, el dfa 3 se encontraron con respecto al dfa 0, 768 diferencias en la concentracion de los transcritos, mientras que, por el contrario, en el caso de las muestras que se mezclaron con la composicion de acuerdo con la invencion, dentro de cada uno de los donantes se encontraron diferencias esencialmente menores hasta ninguna en la concentracion de los ARNs individuales de las muestras analizadas en momentos posteriores en comparacion con T0 (vease la matriz de correlacion de la Figura 6, muestras comparativas = K, en cada caso en los momentos KT0, KT1, KT3, con la composicion de acuerdo con la invencion T0, T1, T3).
Este resultado muestra, con ayuda de las cantidades constantes de transcritos para donantes individuales a lo largo de un tiempo de 3 dfas en las partes alfcuotas mezcladas con la composicion de las muestras de sangre, que la composicion de la invencion estabiliza las moleculas de ARN individuales a base de sangre entera a lo largo de la incubacion y que la composicion reduce significativamente, p. ej., en comparacion con las muestras comparativas de EDTA, la degeneracion y/o induccion de ARNm.
Ejemplo 4: Transcripcion inversa y PCR a base del ARN de sangre entera
En cada caso 2,5 mL de sangre entera procedente de dos donantes se mezclaron directamente despues de la extraccion con 6,5 mL de la composicion de acuerdo con la invencion a base de tiocianato de guanidinio 2,2 M, MES 72 mM, Triton X-100 al 14,4% (peso/vol.) y EDTA 72 mM en agua y se incubaron a 22,5°C. A partir de estas mezclas se tomaron inmediatamente (T0) y al cabo de 3 dfas (T3), de 4 dfas (T4) y de 5 dfas (T5) en cada caso partes alfcuotas y se congelaron a -80°C. A continuacion, todas las muestras se descongelaron en paralelo y se anadieron a agente de adsorcion de acidos nucleicos (NucleoSpin RNA Blood, Macherey-Nagel) El agente de adsorcion se lavo conforme a las instrucciones del fabricante y los acidos nucleicos se eluyeron. Al material eluido se anadio DNasa (DNasa I, exenta de RNasa, Artfculo N° EN0521, Thermo Fisher Scientific). ARN se transcribio de forma inversa con el kit “first strand cDNA synthesis” (Artfculo N° K1612, Thermo Fisher Scientific) con el fin de obtener ADNc. Este producto se amplifico con cebadores que eran espedficos para las secuencias de nucleotidos de los genes para p-actina, GAPDH, IL-8, c-Fos, IL-1B y TNF-a, mediante PCR en tiempo real, utilizando la mezcla Maxima SYBR Green/ROX qPCR Master Mix (Artfculo N° K0222, Thermo Fisher Scientific) como tanda doble.
Para la evaluacion, los valores Ct obtenidos para el ADNc de p-actina y GAPDH, se utilizaron como patron interno y despues se normalizaron los valores Ct medidos para IL-8, c-Fos, IL-lB y TNF-a. Estas concentraciones relativas de los ADNcs para IL-8, c-Fos, IL-1B y TNF-a a T3, T4 y T5 se refirieron adicionalmente en cuanto a su concentracion respectiva a T0. Estos resultados se designan como ddCt y se muestran en la Figura 7 para la sangre de uno de los donantes y en la Figura 8 para la sangre del otro donante. Los resultados de ambas muestras ponen de manifiesto que la composicion de acuerdo con la invencion adquiere de forma estable las concentraciones relativas de los ARNms celulares espedficamente detectados en la sangre entera a lo largo del tiempo de incubacion a 22,5°C.

Claims (9)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    45
    REIVINDICACIONES
    1. Uso de una composicion como agente de disgregacion para celulas contenidas en sangre entera, como agente de estabilizacion para el ARN completo de la sangre entera y para el aislamiento mediante adsorcion del ARN de una mezcla de la sangre entera con la composicion a un agente de adsorcion para acidos nucleicos, caracterizado por que la composicion en solucion acuosa se compone de
    a. al menos una sal de guanidinio,
    b. al menos una sustancia tampon para el tamponamiento en un pH de 5,0 a 8,0,
    c. al menos un detergente no ionico y
    d. al menos un formador de complejos para cationes divalentes,
    e. y, opcionalmente, proteinasa y/o DNasa, y
    f. esta exenta de agentes reductores,
    que impide la degradacion y la smtesis renovada de ARN en la sangre entera, y porque el uso comprende el aislamiento de ARN directamente a partir de la mezcla, que se compone de sangre entera y de la composicion, estando prevista la composicion en una relacion en volumen variable de la sangre entera a la composicion de hasta 1:13 en la mezcla, mediante la puesta en contacto en la mezcla con un agente de adsorcion para acidos nucleicos, en donde a partir de la mezcla no se separa componente alguno, opcionalmente a la mezcla se anade proteinasa y/o DNasa, y el ARN no precipita de la mezcla y se separa antes de que la misma se ponga en contacto con el agente de adsorcion.
  2. 2. Uso segun la reivindicacion 1, caracterizado por que la sal de guanidinio es tiocianato de guanidinio, la sustancia tampon es acido 2-(W-morfolino)etanosulfonico (MES), Tris(Tris(hidroximetil)-aminometano), citrato, fosfato(di- hidrogeno-fosfato de sodio)dihidrato, tampon BisTris (bis-(2-hidroximetil)-imino-tris-(hidroximetil)-metano), ACES (acido N-(2-acetamido)-2-aminometanosulfonico), hidrogeno-carbonato de sodio o fosfato(hidrogeno-fosfato de sodio)dihidrato, el detergente no ionico es Triton X-100, Tween 20, Tween 80 (monooleato de polioxietilensorbitan), Brij 58 (polietilenglicol-hexadecileter), Triton X-114 (octilfenolpolietilenglicoleter) o Nonidet P40, y el formador de complejos es tetra-acetato de etilendiamina (EDTA) y esta exenta de compuestos de tiol o sus compuestos precursores.
  3. 3. Uso segun una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado por que la composicion esta contenida en un tubo de extraccion de sangre.
  4. 4. Uso segun la reivindicacion 3, caracterizado por que el tubo de extraccion de sangre esta dispuesto para absorber un volumen variable de la sangre entera.
  5. 5. Procedimiento para el aislamiento del ARN completo de sangre entera, caracterizado por mezclar la sangre entera con una composicion que, en solucion acuosa, se compone de
    a. al menos una sal de guanidinio,
    b. al menos una sustancia tampon,
    c. al menos un detergente no ionico y
    d. al menos un formador de complejos,
    e. opcionalmente, proteinasa y/o DNasa, y
    esta exenta de agentes reductores, que impide la degradacion y la smtesis renovada de ARN en la sangre entera, preparacion de una mezcla que se compone de la sangre entera y de la composicion en unarelacion en volumen de hasta 1:13, opcionalmente con almacenamiento de la mezcla obtenida por encima de 0°C, opcionalmente con la adicion de proteinasa y/o DNasa a la mezcla, puesta en contacto de la mezcla con un agente de adsorcion para acidos nucleicos, no separandose de la mezcla, antes de la puesta en contacto con el agente de adsorcion, sustancia constitutiva alguna, separacion de las sustancias no ligadas del agente de adsorcion y elucion de ARN del agente de adsorcion.
  6. 6. Procedimiento segun la reivindicacion 5, caracterizado por que la puesta en contacto de la mezcla con el agente de adsorcion tiene lugar sin previa precipitacion, separacion y disolucion de acidos nucleicos de la mezcla.
  7. 7. Procedimiento segun una de las reivindicaciones 5 a 6, caracterizado por que el almacenamiento de la mezcla tiene lugar durante al menos 3 dfas a como maximo 25°C.
  8. 8. Procedimiento segun una de las reivindicaciones 5 a 7, caracterizado por que la mezcladura de la sangre entera con la composicion tiene lugar en una relacion en volumen de hasta 1:2.
  9. 9. Procedimiento segun una de las reivindicaciones 5 a 8, caracterizado por que el agente de adsorcion son partfculas revestidas con sflice, y a la mezcla de la sangre entera y de la composicion se anade un diluyentes en un
    5 volumen de al menos 50% el volumen de la mezcla.
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