ES2691941T3 - Elementos reguladores de plantas y usos de los mismos - Google Patents
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Abstract
Una molécula de ADN recombinante que comprende una secuencia de ADN seleccionada del grupo que consiste en: a) una secuencia de ADN que comprende la SEQ ID NO: 17; b) un fragmento que comprende al menos 50 nucleótidos contiguos de la SEQ ID NO: 17, en el que el fragmento tiene actividad reguladora de genes; y c) una secuencia de ADN que comprende al menos un 90 % de identidad de secuencia con la secuencia de ADN de la SEQ ID NO: 16 o 18, cuya secuencia de ADN tiene actividad reguladora de genes; en la que dicha secuencia de ADN está unida operativamente a una molécula de ADN transcribible heteróloga.
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es decir, unidas operativamente. Como se usa en el presente documento, el término "vector" significa cualquier construcción que puede utilizarse para el fin de la transformación, es decir, la introducción de ADN o ARN heterólogo en una célula huésped. Una construcción normalmente incluye uno o más casetes de expresión. Como se usa en el presente documento, un "casete de expresión" se refiere a una molécula de ADN que comprende al menos una molécula de ADN transcribible unida operativamente a uno o más elementos reguladores, normalmente al menos un promotor y una 3’ UTR.
Como se usa en el presente documento, la expresión "unida operativamente" se refiere a una primera molécula de ADN unida a una segunda molécula de ADN, en la que la primera y la segunda molécula de ADN están dispuestas de manera que la primera molécula de ADN altera la función de la segunda molécula de ADN. Las dos moléculas de ADN pueden ser o no parte de una única molécula de ADN contigua y pueden ser o no adyacentes. Por ejemplo, un promotor está unido operativamente a una molécula de ADN transcribible si el promotor modula la transcripción de la molécula de ADN transcribible de interés en una célula. Un líder, por ejemplo, está unido operativamente a la secuencia de ADN cuando es capaz de alterar la transcripción o traducción de la secuencia de ADN.
Las construcciones de la invención pueden proporcionarse, en una realización, como construcciones del borde de plásmidos inductores de tumores (Ti) que tienen las regiones del borde derecho (RB o AGRtu.RB) y del borde izquierdo (LB o AGRtu.LB) del plásmido Ti aislado del proporcionado por las células de A. tumefaciens, que permiten la integración del ADN-T en el genoma de una célula vegetal (véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos n.º 6.603.061). Las construcciones pueden contener también segmentos de ADN de la cadena principal del plásmido que proporcionan función de replicación y selección antibiótica en células bacterianas, por ejemplo, un origen de replicación de Escherichia coli tal como ori322, un origen de replicación de amplio rango de huésped como oriV u oriRi, y una región codificante para un marcador seleccionable como Spec/Strp que codifica la aminoglucósido adeniltransferasa (aadA) de Tn7 que confiere resistencia a la espectinomicina o estreptomicina o un gen marcador seleccionable de gentamicina (Gm, Gent). Para la transformación de plantas, la cepa bacteriana del huésped es a menudo A. tumefaciens ABI, C58 o LBA4404; sin embargo, otras cepas conocidas por los expertos en la materia de la transformación de plantas pueden funcionar en la invención.
Se conocen en la materia procedimientos para ensamblar e introducir construcciones en una célula de tal manera que la molécula de ADN transcribible se transcriba en una molécula de ARNm funcional que se traduce y expresa como una proteína. Para la práctica de la invención, las composiciones y procedimientos convencionales para preparar y utilizar construcciones y células huésped son bien conocidos por los expertos en la materia. Los vectores típicos útiles para la expresión de ácidos nucleicos en plantas superiores son bien conocidos en la materia e incluyen vectores procedentes del plásmido Ti de Agrobacterium tumefaciens y el vector de control de transferencia pCaMVCN.
Pueden incluirse varios elementos reguladores en una construcción, incluyendo cualquiera de los proporcionados en el presente documento. Cualquiera de dichos elementos reguladores puede proporcionarse en combinación con otros elementos reguladores. Dichas combinaciones se pueden diseñar o modificar para producir características reguladoras deseables. En una realización, las construcciones de la invención comprenden al menos un elemento regulador unido operativamente a una molécula de ADN transcribible unida operativamente a una 3’ UTR.
Las construcciones de la invención pueden incluir cualquier promotor o líder proporcionado en el presente documento o conocido en la materia. Por ejemplo, un promotor de la invención puede estar unido operativamente a un líder heterólogo no traducido en 5’ tal como uno derivado de un gen de la proteína de choque térmico. Como alternativa, un líder puede estar unido operativamente a un promotor heterólogo, tal como el promotor de la transcripción del virus de mosaico de la coliflor 35S.
Los casetes de expresión también pueden incluir una secuencia codificante de péptidos de tránsito que codifica un péptido que es útil para la orientación subcelular de una proteína unida operativamente, particularmente a un cloroplasto, leucoplasto u otro orgánulo plastídico; mitocondria; peroxisoma; vacuola; o una localización extracelular. Muchas proteínas localizadas en cloroplastos se expresan a partir de genes nucleares como precursores y se dirigen al cloroplasto mediante un péptido de tránsito del cloroplasto (CTP, de sus siglas en inglés). Los ejemplos de tales proteínas de cloroplasto aisladas incluyen, pero sin limitación, las asociadas con la subunidad pequeña (SSU, de sus siglas en inglés) de la ribulosa-1,5,-bisfosfato carboxilasa, ferredoxina, ferredoxina oxidorreductasa, la proteína I y la proteína II del complejo recolector de luz, tiorredoxina F y enolpiruvil shikimato fosfato sintasa (EPSPS, de sus siglas en inglés). Los péptidos de tránsito de cloroplastos se describen, por ejemplo, en la Patente de los Estados Unidos n.º 7.193.133. Se ha demostrado que las proteínas no cloroplásticas pueden dirigirse al cloroplasto mediante la expresión de un CTP heterólogo unido operativamente al transgén que codifica proteínas no cloroplásticas.
Moléculas de ADN transcribibles
Como se usa en el presente documento, la expresión "molécula de ADN transcribible" se refiere a cualquier molécula de ADN capaz de transcribirse en una molécula de ARN, que incluye, pero sin limitación, las que tienen secuencias codificantes de proteínas y las que producen moléculas de ARN que tienen secuencias útiles para la supresión génica. El tipo de molécula de ADN puede incluir, aunque no de forma limitante, una molécula de ADN de la misma planta, una molécula de ADN de otra planta, una molécula de ADN de un organismo diferente o una
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molécula de ADN sintética, tal como una molécula de ADN que contiene una mensaje antisentido de un gen o una molécula de ADN que codifica una versión artificial, sintética o modificada de otro modo de un transgén. Las moléculas de ADN transcribibles ejemplares para la incorporación en construcciones de la invención incluyen, por ejemplo, moléculas de ADN o genes de una especie distinta de la especie en la que se incorpora la molécula de ADN o genes que se originan a partir de, o están presentes en, la misma especie, pero que se incorporan en células receptoras mediante procedimientos de ingeniería genética en lugar de técnicas de reproducción clásicas.
Un "transgén" se refiere a una molécula de ADN transcribible heteróloga para una célula huésped al menos con respecto a su localización en el genoma de la célula huésped y/o una molécula de ADN transcribible incorporada artificialmente en el genoma de una célula huésped en la generación actual o cualquier generación anterior de la célula.
Un elemento regulador, tal como un promotor de la invención, puede unirse operativamente a una molécula de ADN transcribible que es heteróloga con respecto al elemento regulador. Como se usa en el presente documento, el término "heterólogo" se refiere a la combinación de dos o más moléculas de ADN cuando dicha combinación no se encuentra normalmente en la naturaleza. Por ejemplo, las dos moléculas de ADN pueden proceder de diferentes especies y/o las dos moléculas de ADN pueden proceder de diferentes genes, por ejemplo, diferentes genes de la misma especie o los mismos genes de diferentes especies. Por lo tanto, un elemento regulador es heterólogo con respecto a una molécula de ADN transcribible unida operativamente si tal combinación normalmente no se encuentra en la naturaleza, es decir, la molécula de ADN transcribible no se produce de manera natural unida operativamente al elemento regulador.
La molécula de ADN transcribible puede ser en general cualquier molécula de ADN para la cual se desea la expresión de un transcrito. Dicha expresión de un transcrito puede dar como resultado la traducción de la molécula de ARNm resultante y, por lo tanto, la expresión de proteínas. Como alternativa, por ejemplo, una molécula de ADN transcribible puede diseñarse para provocar en última instancia una expresión disminuida de un gen o proteína específico. En una realización, esto puede lograrse utilizando una molécula de ADN transcribible que esté orientada en la dirección antisentido. Un experto en la materia está familiarizado con la utilización de dicha tecnología antisentido. Cualquier gen puede regularse negativamente de esta manera, y, en una realización, una molécula de ADN transcribible puede diseñarse para la supresión de un gen específico mediante la expresión de una molécula de ARNbc, ARNip o miARN.
En el presente documento se desvela una molécula de ADN recombinante que comprende un elemento regulador, como los que se proporcionan como las SEQ ID NO: 1-98 y 168-171, unido operativamente a una molécula de ADN transcribible heteróloga para modular la transcripción de la molécula de ADN transcribible a una nivel deseado o en un patrón deseado cuando la construcción se integra en el genoma de una célula vegetal transgénica. En una realización, la molécula de ADN transcribible comprende una región codificadora de proteínas de un gen y, en otra realización, la molécula de ADN transcribible comprende una región antisentido de un gen.
Genes de interés agronómico
Una molécula de ADN transcribible puede ser un gen de interés agronómico. Como se usa en el presente documento, la expresión "gen de interés agronómico" se refiere a una molécula de ADN transcribible que, cuando se expresa en un tejido, célula o tipo celular vegetal particular, confiere una característica deseable. El producto de un gen de interés agronómico puede actuar dentro de la planta para causar un efecto en la morfología, la fisiología, el crecimiento, el desarrollo, el rendimiento, la composición del grano, el perfil nutricional, la resistencia a plagas o enfermedades y/o la tolerancia ambiental o química de las plantas o puede actuar como un agente pesticida en la dieta de una plaga que se alimenta de la planta. En una realización de la invención, un elemento regulador de la invención se incorpora a una construcción de tal manera que el elemento regulador está unido operativamente a una molécula de ADN transcribible que es un gen de interés agronómico. En una planta transgénica que contiene tal construcción, la expresión del gen de interés agronómico puede conferir un rasgo agronómico beneficioso. Un rasgo agronómico beneficioso puede incluir, por ejemplo, aunque no de forma limitante, tolerancia a herbicidas, control de insectos, rendimiento modificado, resistencia a enfermedades, resistencia a patógenos, crecimiento y desarrollo de la planta modificada, contenido de almidón modificado, contenido de aceite modificado, contenido de ácidos grasos modificado, contenido de proteína modificado, maduración del fruto modificado, nutrición animal y humana potenciada, producciones de biopolímeros, resistencia al estrés ambiental, péptidos farmacéuticos, cualidades de procesamiento mejoradas, sabor mejorado, utilidad de producción de semillas híbridas, producción de fibra mejorada y producción de biocombustible deseable.
Los ejemplos de genes de interés agronómico conocidos en la materia incluyen aquellos para la resistencia a herbicidas (patentes de Estados Unidos nº 6.803.501; 6.448.476; 6.248.876; 6.225.114; 6.107.549; 5.866.775; 5.804.425; 5.633.435; y 5.463.175), el rendimiento aumentado (patentes de Estados Unidos nº USRE38.446; 6.716.474; 6.663.906; 6.476.295; 6.441.277; 6.423.828; 6.399.330; 6.372.211; 6.235.971; 6.222.098; y 5.716.837), el control de insectos (patentes de Estados Unidos nº 6.809.078; 6.713.063; 6.686.452; 6.657.046; 6.645.497; 6.642.030; 6.639.054; 6.620.988; 6.593.293; 6.555.655; 6.538.109; 6.537.756; 6.521.442; 6.501.009; 6.468.523; 6.326.351; 6.313.378; 6.284.949; 6.281.016; 6.248.536; 6.242.241; 6.221.649; 6.177.615; 6.156.573; 6.153.814; 6.110.464; 6.093.695; 6.063.756; 6.063.597; 6.023.013; 5.959.091; 5.942.664; 5.942.658, 5.880.275; 5.763.245; y
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5.763.241), la resistencia a enfermedades fúngicas,(patentes de Estados Unidos nº 6.653.280; 6.573.361; 6.506.962; 6.316.407; 6.215.048; 5.516.671; 5.773.696; 6.121.436; 6.316.407; y 6.506.962), la resistencia a virus (patentes de Estados Unidos nº 6.617.496; 6.608.241; 6.015.940; 6.013.864; 5.850.023; y 5.304.730), la resistencia a nemátodos (Patente de Estados Unidos nº 6.228.992), la resistencia a enfermedades bacterianas (Patente de Estados Unidos nº 5.516.671), el crecimiento y desarrollo de plantas (Patentes de Estados Unidos nº 6.723.897 y 6.518.488), la producción de almidón (patentes de Estados Unidos nº 6.538.181; 6.538.179; 6.538.178; 5.750.876; 6.476.295), la producción de aceites modificada (patentes de Estados Unidos nº 6,444,876; 6.426.447; y 6.380.462), la producción elevada de aceite (patentes de Estados Unidos nº 6.495.739; 5.608.149; 6.483.008; y 6.476.295), el contenido de ácidos grasos modificado (patentes de Estados Unidos nº 6.828.475; 6.822.141; 6.770.465; 6.706.950; 6.660.849; 6.596.538; 6.589.767; 6.537.750; 6.489.461; y 6.459.018), la producción elevada de proteínas (patente de Estados Unidos nº 6.380.466), la maduración del fruto (patente de Estados Unidos nº 5.512.466), la nutrición animal y humana potenciada (patentes de Estados Unidos nº 6.723.837; 6.653.530; 6.5412.59; 5.985.605; y 6.171.640), los biopolímeros (patentes de Estados Unidos nº USRE37,543; 6.228.623; y 5.958.745, y 6.946.588), la resistencia al estrés ambiental (Patente de Estados Unidos nº 6,072,103), los péptidos farmacéuticos y péptidos secretables (Patentes de Estados Unidos nº 6,812,379; 6.774.283; 6.140.075; y 6.080.560), los rasgos de procesamiento mejorados (Patente de Estados Unidos nº 6.476.295), la digestibilidad mejorada (Patente de Estados Unidos nº 6.531.648), la baja en rafinosa (Patente de Estados Unidos nº 6.166.292), la producción de enzimas industriales (Patente de Estados Unidos nº 5.543.576), el sabor mejorado (Patente de Estados Unidos nº. 6.011.199), la fijación de nitrógeno (Patente de Estados Unidos nº. 5.229.114), la producción de semillas híbridas (Patente de Estados Unidos nº. 5.689.041), la producción de fibra (Patentes de Estados Unidos nº. 6.576.818; 6.271.443; 5.981.834; y 5.869.720) y la producción de biocombustible (patente de Estados Unidos nº 5.998.700).
Como alternativa, un gen de interés agronómico puede alterar las características o el fenotipo de las plantas anteriormente mencionado mediante la codificación de una molécula de ARN que produce la modulación dirigida de la expresión génica de un gen endógeno, por ejemplo, por antisentido (véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos nº 5.107.065); ARN inhibidor ("ARNi", que incluye la modulación de la expresión génica mediante mecanismos mediados por miARN, ARNip, ARNip de acción trans y ARNs en fase, por ejemplo, como se describe en las solicitudes publicadas US 2006/0200878 y US 2008/0066206, y en la solicitud de patente estadounidense 11/974.469); o mecanismos mediados por cosupresión. El ARN podría ser también una molécula de ARN catalítico (por ejemplo, una ribozima o un riboswitch; véase, por ejemplo, el documento U.S. 2006/0200878) diseñado mediante ingeniería genética para escindir un producto de ARNm endógeno deseado. Se conocen en la materia procedimientos para construir e introducir construcciones en una célula de tal manera que la molécula de ADN transcribible se transcriba en una molécula que sea capaz de provocar supresión génica.
La expresión de una molécula de ADN transcribible en una célula vegetal también se puede utilizar para suprimir plagas de plantas que se alimentan de la célula vegetal, por ejemplo, composiciones aisladas de plagas de coleópteros y composiciones aisladas de plagas de nemátodos. Las plagas de las plantas incluyen, pero sin limitación, plagas de artrópodos, plagas de nemátodos y plagas fúngicas o microbianas.
Marcadores seleccionables
Los transgenes marcadores seleccionables también se pueden utilizar con los elementos reguladores de la invención. Como se usa en el presente documento, la expresión "transgén marcador seleccionable" se refiere a cualquier molécula de ADN transcribible cuya expresión en una planta, tejido o célula transgénica, o la falta de la misma, puede ser evaluada o puntuada de alguna manera. Los genes marcadores seleccionables, y sus técnicas de selección y cribado asociadas, para su uso en la práctica de la invención son conocidos en la materia e incluyen, pero sin limitación, moléculas de ADN transcribible que codifican β-glucuronidasa (GUS), proteína fluorescente verde (GFP), proteínas que confieren resistencia a antibióticos y proteínas que confieren tolerancia a herbicidas.
Transformación celular
La invención también está dirigida a un procedimiento para producir células y plantas transformadas que comprenden uno o más elementos reguladores unidos operativamente a una molécula de ADN transcribible.
El término "transformación" se refiere a la introducción de una molécula de ADN en un huésped receptor. Como se usa en el presente documento, el término "huésped" se refiere a bacterias, hongos o plantas, incluyendo cualquier célula, tejidos, órgano o descendencia de las bacterias, hongos o plantas. Los tejidos y células vegetales de particular interés incluyen protoplastos, callos, raíces, tubérculos, semillas, tallos, hojas, plántulas, embriones y polen.
Como se usa en el presente documento, el término "transformado" se refiere a una célula, tejido, órgano u organismo en el que se ha introducido una molécula de ADN extraña, como una construcción. La molécula de ADN introducida puede integrarse en el ADN genómico de la célula, tejido, órgano u organismo receptor, de modo que la progenie posterior hereda la molécula de ADN introducida. Un célula u organismo "transgénico" o "transformado" puede incluir también la progenie de la célula u organismo y la progenie producida a partir de un programa de cultivo que emplea dicho organismo transgénico como un precursor en un cruce y que presenta un fenotipo alterado que resulta de la presencia de una molécula de ADN extraña. La molécula de ADN introducida también puede
11
(continuación)
- Descripción
- SEQ ID NO: Tamaño (pb) Género/Especie Descripción y/o elementos reguladores de EXP unidos en la dirección 5’→ 3’ (SEQ ID NO):
- EXP-AGRne.Ubq1:1:8
- 5 2137 A. nebulosa EXP: P-AGRne.Ubq1-1:1:4 (SEQ ID NO: 6); LAGRne.Ubq1-1:1:1 (SEQ ID NO: 3); I-AGRne.Ubq11:1:3 (SEQ ID NO: 4)
- P-AGRne.Ubq1-1:1:4
- 6 999 A. nebulosa Promotor
- EXP-AGRne.Ubq1:1:9
- 7 1900 A. nebulosa EXP: P-AGRne.Ubq1-1:1:6 (SEQ ID NO: 8); LAGRne.Ubq1-1:1:1 (SEQ ID NO: 3); I-AGRne.Ubq11:1:3 (SEQ ID NO: 4)
- P-AGRne.Ubq1-1:1:6
- 8 762 A. nebulosa Promotor
- EXP-ARUdo.Ubq1:1:4
- 9 5068 A. donax EXP: P-ARUdo.Ubq1-1:1:4 (SEQ ID NO: 10); LARUdo.Ubq1-1:1:1 (SEQ ID NO: 11); I-ARUdo.Ubq11:1:2 (SEQ ID NO: 12)
- P-ARUdo.Ubq1-1:1:4
- 10 4114 A. donax Promotor
- L-ARUdo.Ubq1-1:1:1
- 11 85 A. donax Líder
- I-ARUdo.Ubq1-1:1:2
- 12 869 A. donax Intrón
- EXP-ARUdo.Ubq1:1:8
- 13 2969 A. donax EXP: P-ARUdo.Ubq1-1:1:5 (SEQ ID NO: 14); LARUdo.Ubq1-1:1:1 (SEQ ID NO: 11); I-ARUdo.Ubq11:1:3 (SEQ ID NO: 15)
- P-ARUdo.Ubq1-1:1:5
- 14 2012 A. donax Promotor
- I-ARUdo.Ubq1-1:1:3
- 15 872 A. donax Intrón
- EXP-ARUdo.Ubq1:1:6
- 16 1954 A. donax EXP: P-ARUdo.Ubq1-1:1:6 (SEQ ID NO: 17); LARUdo.Ubq1-1:1:1 (SEQ ID NO: 11); I-ARUdo.Ubq11:1:2 (SEQ ID NO: 12)
- P-ARUdo.Ubq1-1:1:6
- 17 1000 A. donax Promotor
- EXP-ARUdo.Ubq1:1:9
- 18 1957 A. donax EXP: P-ARUdo.Ubq1-1:1:6 (SEQ ID NO: 17); LARUdo.Ubq1-1:1:1 (SEQ ID NO: 11); I-ARUdo.Ubq11:1:3 (SEQ ID NO: 15)
- EXPARUdo.Ubq1:1:12
- 19 1957 A. donax EXP: P-ARUdo.Ubq1-1:1:6 (SEQ ID NO: 17); LARUdo.Ubq1-1:1:1 (SEQ ID NO: 11); I-ARUdo.Ubq11:1:4 (SEQ ID NO: 20)
14
(continuación)
- Descripción
- SEQ ID NO: Tamaño (pb) Género/Especie Descripción y/o elementos reguladores de EXP unidos en la dirección 5’→ 3’ (SEQ ID NO):
- I-ARUdo.Ubq1-1:1:4
- 20 872 A. donax Intrón
- EXPARUdo.Ubq1:1:11
- 21 1712 A. donax EXP: P-ARUdo.Ubq1-1:1:8 (SEQ ID NO: 22); LARUdo.Ubq1-1:1:1 (SEQ ID NO: 11); I-ARUdo.Ubq11:1:3 (SEQ ID NO: 15)
- P-ARUdo.Ubq1-1:1:8
- 22 755 A. donax Promotor
- EXP-ARUdo.Ubq2:1:4
- 23 3276 A. donax EXP: P-ARUdo.Ubq2-1:1:4 (SEQ ID NO: 24); LARUdo.Ubq2-1:1:1 (SEQ ID NO: 25); I-ARUdo.Ubq21:1:1 (SEQ ID NO: 26)
- P-ARUdo.Ubq2-1:1:4
- 24 2033 A. donax Promotor
- L-ARUdo.Ubq2-1:1:1
- 25 88 A. donax Líder
- I-ARUdo.Ubq2-1:1:1
- 26 1155 A. donax Intrón
- EXP-ARUdo.Ubq2:1:8
- 27 3250 A. donax EXP: P-ARUdo.Ubq2-1:1:6 (SEQ ID NO: 28); LARUdo.Ubq2-1:1:1 (SEQ ID NO: 25); I-ARUdo.Ubq21:1:2 (SEQ ID NO: 29)
- P-ARUdo.Ubq2-1:1:6
- 28 2004 A. donax Promotor
- I-ARUdo.Ubq2-1:1:2
- 29 1158 A. donax Intrón
- EXP-ARUdo.Ubq2:1:9
- 30 2247 A. donax EXP: P-ARUdo.Ubq2-1:1:5 (SEQ ID NO: 31); LARUdo.Ubq2-1:1:1 (SEQ ID NO: 25); I-ARUdo.Ubq21:1:2 (SEQ ID NO: 29)
- P-ARUdo.Ubq2-1:1:5
- 31 1001 A. donax Promotor
- EXPARUdo.Ubq2:1:10
- 32 1942 A. donax EXP: P-ARUdo.Ubq2-1:1:7 (SEQ ID NO: 33); LARUdo.Ubq2-1:1:1 (SEQ ID NO: 25); I-ARUdo.Ubq21:1:2 (SEQ ID NO: 29)
- P-ARUdo.Ubq2-1:1:7
- 33 696 A. donax Promotor
- EXP-BOUgr.Ubq1:1:1
- 34 3511 B. gracilis EXP: P-BOUgr.Ubq1-1:1:2 (SEQ ID NO: 35); LBOUgr.Ubq1-1:1:1 (SEQ ID NO: 36); I-BOUgr.Ubq11:1:2 (SEQ ID NO: 37)
15
(continuación)
- Descripción
- SEQ ID NO: Tamaño (pb) Género/Especie Descripción y/o elementos reguladores de EXP unidos en la dirección 5’→ 3’ (SEQ ID NO):
- P-BOUgr.Ubq1-1:1:2
- 35 2371 B. gracilis Promotor
- L-BOUgr.Ubq1-1:1:1
- 36 86 B. gracilis Líder
- I-BOUgr.Ubq1-1:1:2
- 37 1054 B. gracilis Intrón
- EXP-BOUgr.Ubq1:1:6
- 38 3142 B. gracilis EXP: P-BOUgr.Ubq1-1:1:3 (SEQ ID NO: 39); LBOUgr.Ubq1-1:1:1 (SEQ ID NO: 36); I-BOUgr.Ubq11:1:3 (SEQ ID NO: 40)
- P-BOUgr.Ubq1-1:1:3
- 39 1999 B. gracilis Promotor
- I-BOUgr.Ubq1-1:1:3
- 40 1057 B. gracilis Intrón
- EXP-BOUgr.Ubq1:1:7
- 41 2165 B. gracilis EXP: P-BOUgr.Ubq1-1:1:5 (SEQ ID NO: 42); LBOUgr.Ubq1-1:1:1 (SEQ ID NO: 36); I-BOUgr.Ubq11:1:3 (SEQ ID NO: 40)
- P-BOUgr.Ubq1-1:1:5
- 42 1022 B. gracilis Promotor
- EXP-BOUgr.Ubq1:1:8
- 43 1903 B. gracilis EXP: P-BOUgr.Ubq1-1:1:6 (SEQ ID NO: 44); LBOUgr.Ubq1-1:1:1 (SEQ ID NO: 36); I-BOUgr.Ubq11:1:3 (SEQ ID NO: 40)
- P-BOUgr.Ubq1-1:1:6
- 44 760 B. gracilis Promotor
- EXPBOUgr.Ubq2:1:11
- 45 3234 B. gracilis EXP: P-BOUgr.Ubq2-1:1:4 (SEQ ID NO: 46); LBOUgr.Ubq2-1:1:1 (SEQ ID NO: 47); I-BOUgr.Ubq21:1:3 (SEQ ID NO: 48)
- P-BOUgr.Ubq2-1:1:4
- 46 2100 B. gracilis Promotor
- L-BOUgr.Ubq2-1:1:1
- 47 91 B. gracilis Líder
- I-BOUgr.Ubq2-1:1:3
- 48 1043 B. gracilis Intrón
- EXP-BOUgr.Ubq2:1:7
- 49 3176 B. gracilis EXP: P-BOUgr.Ubq2-1:1:7 (SEQ ID NO: 50); LBOUgr.Ubq2-1:1:1 (SEQ ID NO: 47); I-BOUgr.Ubq21:1:1 (SEQ ID NO: 51)
16
(continuación)
- Descripción
- SEQ ID NO: Tamaño (pb) Género/Especie Descripción y/o elementos reguladores de EXP unidos en la dirección 5’→ 3’ (SEQ ID NO):
- P-BOUgr.Ubq2-1:1:7
- 50 2043 B. gracilis Promotor
- I-BOUgr.Ubq2-1:1:1
- 51 1042 B. gracilis Intrón
- EXPBOUgr.Ubq2:1:14
- 52 3139 B. gracilis EXP: P-BOUgr.Ubq2-1:1:5 (SEQ ID NO: 53); LBOUgr.Ubq2-1:1:1 (SEQ ID NO: 47); I-BOUgr.Ubq21:1:4 (SEQ ID NO: 54)
- P-BOUgr.Ubq2-1:1:5
- 53 2002 B. gracilis Promotor
- I-BOUgr.Ubq2-1:1:4
- 54 1046 B. gracilis Intrón
- EXPBOUgr.Ubq2:1:15
- 55 2160 B. gracilis EXP: P-BOUgr.Ubq2-1:1:6 (SEQ ID NO: 56); LBOUgr.Ubq2-1:1:1 (SEQ ID NO: 47); I-BOUgr.Ubq21:1:5 (SEQ ID NO: 57)
- P-BOUgr.Ubq2-1:1:6
- 56 1024 B. gracilis Promotor
- I-BOUgr.Ubq2-1:1:5
- 57 1045 B. gracilis Intrón
- EXPBOUgr.Ubq2:1:16
- 58 2160 B. gracilis EXP: P-BOUgr.Ubq2-1:1:6 (SEQ ID NO: 56); LBOUgr.Ubq2-1:1:1 (SEQ ID NO: 47); I-BOUgr.Ubq21:1:6 (SEQ ID NO: 59)
- I-BOUgr.Ubq2-1:1:6
- 59 1045 B. gracilis Intrón
- EXPBOUgr.Ubq2:1:17
- 60 1885 B. gracilis EXP: P-BOUgr.Ubq2-1:1:8 (SEQ ID NO: 61); LBOUgr.Ubq2-1:1:1 (SEQ ID NO: 47); I-BOUgr.Ubq21:1:6 (SEQ ID NO: 59)
- P-BOUgr.Ubq2-1:1:8
- 61 749 B. gracilis Promotor
- EXP-MISsi.Ubq1:1:2
- 62 6813 M. sinesis EXP: P-MISsi.Ubq1-1:1:2 (SEQ ID NO: 63); LMISsi.Ubq1-1:1:1 (SEQ ID NO: 64); I-MISsi.Ubq11:1:1 (SEQ ID NO: 65)
- P-MISsi.Ubq1-1:1:2
- 63 5359 M. sinesis Promotor
- L-MISsi.Ubq1-1:1:1
- 64 63 M. sinesis Líder
- I-MISsi.Ubq1-1:1:1
- 65 1391 M. sinesis Intrón
17
(continuación)
- Descripción
- SEQ ID NO: Tamaño (pb) Género/Especie Descripción y/o elementos reguladores de EXP unidos en la dirección 5’→ 3’ (SEQ ID NO):
- EXP-MISsi.Ubq1:1:9
- 66 4402 M. sinesis EXP: P-MISsi.Ubq1-1:1:11 (SEQ ID NO: 67); LMISsi.Ubq1-1:1:2 (SEQ ID NO: 68); I-MISsi.Ubq11:1:3 (SEQ ID NO: 69)
- P-MISsi.Ubq1-1:1:11
- 67 2423 M. sinesis Promotor
- L-MISsi.Ubq1-1:1:2
- 68 55 M. sinesis Líder
- I-MISsi.Ubq1-1:1:3
- 69 1924 M. sinesis Intrón
- EXP-MISsi.Ubq1:1:8
- 70 3426 M. sinesis EXP: P-MISsi.Ubq1-1:1:10 (SEQ ID NO: 71); LMISsi.Ubq1-1:1:2 (SEQ ID NO: 68); I-MISsi.Ubq11:1:3 (SEQ ID NO: 69)
- P-MISsi.Ubq1-1:1:10
- 71 1447 M. sinesis Promotor
- EXP-MISsi.Ubq1:1:10
- 72 2878 M. sinesis EXP: P-MISsi.Ubq1-1:1:13 (SEQ ID NO: 73); LMISsi.Ubq1-1:1:2 (SEQ ID NO: 68); I-MISsi.Ubq11:1:3 (SEQ ID NO: 69)
- P-MISsi.Ubq1-1:1:13
- 73 899 M. sinesis Promotor
- EY,P-MISsi.Ubq1:1:11
- 74 2670 M. sinesis EXP: P-MISsi.Ubq1-1:1:14 (SEQ ID NO: 75); LMISsi.Ubq1-1:1:2 (SEQ ID NO: 68); I-MISsi.Ubq11:1:3 (SEQ ID NO: 69)
- P-MISsi.Ubq1-1:1:14
- 75 691 M. sinesis Promotor
- EXP-MISsi.Ubq1:1:7
- 76 2485 M. sinesis EXP: P-MISsi.Ubq1-1:1:9 (SEQ ID NO: 77); LMISsi.Ubq1-1:1:2 (SEQ ID NO: 68); I-MISsi.Ubq11:1:3 (SEQ ID NO: 69)
- P-MISsi.Ubq1-1:1:9
- 77 506 M. sinesis Promotor
- EXP-SCHsc.Ubq1:1:9
- 78 4079 S. scoparium EXP: P-SCHsc.Ubq1-1:1:12 (SEQ ID NO: 79); LSCHsc.Ubq1-1:1:3 (SEQ ID NO: 80); I-SCHsc.Ubq11:1:2 (SEQ ID NO: 81)
- P-SCHsc.Ubq1-1:1:12
- 79 2831 S. scoparium Promotor
- L-SCHsc.Ubq1-1:1:3
- 80 95 S. scoparium Líder
- I-SCHsc.Ubq1-1:1:2
- 81 1153 S. scoparium Intrón
- EXP-SCHsc.Ubq1:1:8
- 82 3281 S. scoparium EXP: P-SCHsc.Ubq1-1:1:11 (SEQ ID NO: 83); LSCHsc.Ubq1-1:1:3 (SEQ ID NO: 80); I-SCHsc.Ubq11:1:2 (SEQ ID NO: 81)
18
(continuación)
- Descripción
- SEQ ID NO: Tamaño (pb) Género/Especie Descripción y/o elementos reguladores de EXP unidos en la dirección 5’→ 3’ (SEQ ID NO):
- P-SCHsc.Ubq1-1:1:11
- 83 2033 S. scoparium Promotor
- EXP-SCHsc.Ubq1:1:7
- 84 2294 S. scoparium EXP: P-SCHsc.Ubq1-1:1:10 (SEQ ID NO: 85); LSCHsc.Ubq1-1:1:3 (SEQ ID NO: 80); I-SCHsc.Ubq11:1:2 (SEQ ID NO: 81)
- P-SCHsc.Ubq1-1:1:10
- 85 1046 S. scoparium Promotor
- EXPSCHsc.Ubq1:1:10
- 86 1795 S. scoparium EXP: P-SCHsc.Ubq1-1:1:14 (SEQ ID NO: 87); LSCHsc.Ubq1-1:1:3 (SEQ ID NO: 80); I-SCHsc.Ubq11:1:2 (SEQ ID NO: 81)
- P-SCHsc.Ubq1-1:1:14
- 87 547 S. scoparium Promotor
- EXP-SORnu.Ubq1:1:2
- 88 3357 S. nutans EXP: P-SORnu.Ubq1-1:1:4 (SEQ ID NO: 89); LSORnu.Ubq1-1:1:1 (SEQ ID NO: 90); I-SORnu.Ubq11:1:1 (SEQ ID NO: 91)
- P-SORnu.Ubq1-1:1:4
- 89 2218 S. nutans Promotor
- L-SORnu.Ubq1-1:1:1
- 90 86 S. nutans Líder
- I-SORnu.Ubq1-1:1:1
- 91 1053 S. nutans Intrón
- EXP-SORnu.Ubq1:1:6
- 92 3106 S. nutans EXP: P-SORnu.Ubq1-1:1:5 (SEQ ID NO: 93); LSORnu.Ubq1-1:1:1 (SEQ ID NO: 90); I-SORnu.Ubq11:1:2 (SEQ ID NO: 94)
- P-SORnu.Ubq1-1:1:5
- 93 1964 S. nutans Promotor
- I-SORnu.Ubq1-1:1:2
- 94 1056 S. nutans Intrón
- EXP-SORnu.Ubq1:1:7
- 95 2165 S. nutans EXP: P-SORnu.Ubq1-1:1:6 (SEQ ID NO: 96); LSORnu.Ubq1-1:1:1 (SEQ ID NO: 90); I-SORnu.Ubq11:1:2 (SEQ ID NO: 94)
- P-SORnu.Ubq1-1:1:6
- 96 1023 S. nutans Promotor
- EXP-SORnu.Ubq1:1:8
- 97 1866 S. nutans EXP: P-SORnu.Ubq1-1:1:7 (SEQ ID NO: 98); LSORnu.Ubq1-1:1:1 (SEQ ID NO: 90); I-SORnu.Ubq11:1:2 (SEQ ID NO: 94)
19
(continuación)
- Descripción
- SEQ ID NO: Tamaño (pb) Género/Especie Descripción y/o elementos reguladores de EXP unidos en la dirección 5’→ 3’ (SEQ ID NO):
- P-SORnu.Ubq1-1:1:7
- 98 724 S. nutans Promotor
- EXP-SETit.Ubq1:1:10
- 99 2625 S. italica EXP: P-SETit.Ubq1-1:1:4 (SEQ ID NO: 100); L-SETit. Ubq1-1:1:1 (SEQ ID NO: 101); I-SETit.Ubq1-1:1:3 (SEQ ID NO: 102)
- P-SETit.Ubq1-1:1:4
- 100 1492 S. italica Promotor
- L-SETit.Ubq1-1:1:1
- 101 127 S. italica Líder
- I-SETit.Ubq1-1:1:3
- 102 1006 S. italica Intrón
- EXP-SETit.Ubq1:1:5
- 103 2625 S. italica EXP: P-SETit. Ubq1-1:1:1 (SEQ ID NO: 104); L-SETit. Ubq1-1:1:1 (SEQ ID NO: 101); I-SETit.Ubq11:1:2 (SEQ ID NO: 105)
- P-SETit.Ubq1-1:1:1
- 104 1492 S. italica Promotor
- I-SETitUbq1-1:1:2
- 105 1006 S. italica Intrón
- EXP-SETit.Ubq1:1:7
- 106 2167 S. italica EXP: P-SETitUbq1-1:1:2 (SEQ ID NO: 107); L-SETit. Ubq1-1:1:1 (SEQ ID NO: 101); I-SETitUbq1-1:1:2 (SEQ ID NO: 105)
- P-SETitUbq1-1:1:2
- 107 1034 S. italica Promotor
- EXP-SETit.Ubq1:1:6
- 108 1813 S. italica EXP: P-SETit.Ubq1-1:1:3 (SEQ ID NO: 109); L-SETit. Ubq1-1:1:1 (SEQ ID NO: 101); I-SETitUbq1-1:1:2 (SEQ ID NO: 105)
- P-SETitUbq1-1:1:3
- 109 680 S. italica Promotor
- EXP-Sv.Ubq1:1:7
- 110 2634 S. viridis EXP: P-Sv.Ubq1-1:1:1 (SEQ ID NO: 111); L-Sv.Ubq11:1:2 (SEQ ID NO: 112); I-Sv.Ubq1-1:1:2 (SEQ ID NO: 113)
- P-Sv.Ubq1-1:1:1
- 111 1493 S. viridis Promotor
- L-Sv.Ubq1-1:1:2
- 112 127 S. viridis Líder
- I-Sv.Ubq1-1:1:2
- 113 1014 S. viridis Intrón
- EXP-Sv.Ubq1:1:11
- 114 2634 S. viridis EXP: P-Sv.Ubq1-1:1:1 (SEQ ID NO: 111); L-Sv.Ubq11:1:2 (SEQ ID NO: 112); I-Sv.Ubq1-1:1:3 (SEQ ID NO: 115)
- I-Sv.Ubq1-1:1:3
- 115 1014 S. viridis Intrón
- EXP-Sv.Ubq1:1:8
- 116 2176 S. viridis EXP: P-Sv.Ubq1-1:1:2 (SEQ ID NO: 117); L-Sv.Ubq11:1:2 (SEQ ID NO: 112); I-Sv.Ubq1-1:1:2 (SEQ ID NO: 113)
20
(continuación)
- Descripción
- SEQ ID NO: Tamaño (pb) Género/Especie Descripción y/o elementos reguladores de EXP unidos en la dirección 5’→ 3’ (SEQ ID NO):
- P-Sv.Ubq1-1:1:2
- 117 1035 S. viridis Promotor
- EXP-Sv.Ubq1:1:10
- 118 1822 S. viridis EXP: P-Sv.Ubq1-1:1:4 (SEQ ID NO: 119); L-Sv.Ubq11:1:2 (SEQ ID NO: 112); I-Sv.Ubq1-1:1:2 (SEQ ID NO: 113)
- P-Sv.Ubq1-1:1:4
- 119 681 S. viridis Promotor
- EXP-Sv.Ubq1:1:12
- 120 1822 S. viridis EXP: P-Sv.Ubq1-1:1:3 (SEQ ID NO: 121); L-Sv.Ubq11:1:2 (SEQ ID NO: 112); I-Sv.Ubq1-1:1:3 (SEQ ID NO: 115)
- P-Sv.Ubq1-1:1:3
- 121 681 S. viridis Promotor
- EXP-Zm.UbqM1:1:6 (Alelo-1)
- 122 1925 Z. mays subsp. Mexicana EXP: P-Zm.UbqM1-1:1:1 (SEQ ID NO: 123); LZm.UbqM1-1:1:1 (SEQ ID NO: 124); I-Zm.UbqM11:1:13 (SEQ ID NO: 125)
- P-Zm.UbqM1-1:1:1 (Alelo-1)
- 123 850 Z. mays subsp. Mexicana Promotor
- L-Zm.UbqM1-1:1:1 (Alelo-1)
- 124 78 Z. mays subsp. Mexicana Líder
- I-Zm.UbqM1-1:1:13 (Alelo-1)
- 125 997 Z. mays subsp. Mexicana Intrón
- EXP-Zm.UbqM1:1:10 (Alelo-1)
- 126 1925 Z. mays subsp. Mexicana EXP: P-Zm.UbqM1-1:1:1 (SEQ ID NO: 123); LZm.UbqM1-1:1:1 (SEQ ID NO: 124); I-Zm.UbqM11:1:17 (SEQ ID NO: 127)
- I-Zm.UbqM1-1:1:17 (Alelo-1)
- 127 997 Z. mays subsp. Mexicana Intrón
- EXP-Zm.UbqM1:1:7 (Alelo-2)
- 128 1974 Z. mays subsp. Mexicana EXP: P-Zm.UbqM1-1:1:4 (SEQ ID NO: 129); LZm.UbqM1-1:1:5 (SEQ ID NO: 130); I-Zm.UbqM11:1:14 (SEQ ID NO: 131)
- P-Zm.UbqM1-1:1:4 (Alelo-2)
- 129 887 Z. mays subsp. Mexicana Promotor
- L-Zm.UbqM1-1:1:5 (Alelo-2)
- 130 77 Z. mays subsp. Mexicana Líder
- I-Zm.UbqM1-1:1:14 (Alelo-2)
- 131 1010 Z. mays subsp. Mexicana Intrón
- EXP-Zm.UbqM1:1:12 (Alelo-2)
- 132 1974 Z. mays subsp. Mexicana EXP: P-Zm.UbqM1-1:1:4 (SEQ ID NO: 129); LZm.UbqM1-1:1:5 (SEQ ID NO: 130); I-Zm.UbqM11:1:19 (SEQ ID NO: 133)
21
(continuación)
- Descripción
- SEQ ID NO: Tamaño (pb) Género/Especie Descripción y/o elementos reguladores de EXP unidos en la dirección 5’→ 3’ (SEQ ID NO):
- I-Zm.UbqM1-1:1:19 (Alelo-2)
- 133 1010 Z. mays subsp. Mexicana Intrón
- EXP-Zm.UbqM1:1:8 (Alelo-2)
- 134 2008 Z. mays subsp. Mexicana EXP: P-Zm.UbqM1-1:1:5 (SEQ ID NO: 135); LZm.UbqM1-1:1:4 (SEQ ID NO: 136); I-Zm.UbqM11:1:15 (SEQ ID NO: 137)
- P-Zm.UbqM1-1:1:5 (Alelo-2)
- 135 877 Z. mays subsp. Mexicana Promotor
- L-Zm.UbqM1-1:1:4 (Alelo-2)
- 136 78 Z. mays subsp. Mexicana Líder
- I-Zm.UbqM1-1:1:15 (Alelo-2)
- 137 1053 Z. mays subsp. Mexicana Intrón
- EXP-Zm.UbqM1:1:11 (Alelo-2)
- 138 2008 Z. mays subsp. Mexicana EXP: P-Zm.UbqM1-1:1:5 (SEQ ID NO: 135); LZm.UbqM1-1:1:4 (SEQ ID NO: 136); I-Zm.UbqM11:1:18 (SEQ ID NO: 139)
- I-Zm.UbqM1-1:1:18 (Alelo-2)
- 139 1053 Z. mays subsp. Mexicana Intrón
- EXP-Sb.Ubq4:1:2
- 140 1635 S. bicolor EXP: P-Sb.Ubq4-1:1:1 (SEQ ID NO: 141); L-Sb.Ubq41:1:1 (SEQ ID NO: 142); I-Sb.Ubq4-1:1:2 (SEQ ID NO: 143)
- P-Sb.Ubq4-1:1:1
- 141 401 S. bicolor Promotor
- L-Sb.Ubq4-1:1:1
- 142 154 S. bicolor Líder
- I-Sb.Ubq4-1:1:2
- 143 1080 S. bicolor Intrón
- EXP-Sb.Ubq6:1:2
- 144 2067 S. bicolor EXP: P-Sb.Ubq6-1:1:1 (SEQ ID NO: 145); L-Sb.Ubq61:1:1 (SEQ ID NO: 146); I-Sb.Ubq6-1:1:2 (SEQ ID NO: 147)
- P-Sb.Ubq6-1:1:1
- 145 855 S. bicolor Promotor
- L-Sb.Ubq6-1:1:1
- 146 136 S. bicolor Líder
- I-Sb.Ubq6-1:1:2
- 147 1076 S. bicolor Intrón
- EXP-Sb.Ubq6:1:3
- 148 2067 S. bicolor EXP: P-Sb.Ubq6-1:1:1 (SEQ ID NO: 145); L-Sb.Ubq61:1:1 (SEQ ID NO: 146); I-Sb.Ubq6-1:1:3 (SEQ ID NO: 149)
- I-Sb.Ubq6-1:1:3
- 149 1076 S. bicolor Intrón
- EXP-Sb.Ubq7:1:2
- 150 2003 S. bicolor EXP: P-Sb.Ubq7-1:1:1 (SEQ ID NO: 151); L-Sb.Ubq71:1:1 (SEQ ID NO: 152); I-Sb.Ubq7-1:1:2 (SEQ ID NO: 153)
22
5
10
15
20
25
30
GUS que comprenden vectores de expresión de plantas para comparar la expresión de un transgén (GUS) dirigido por uno de EXP-AGRne.Ubq1:1:7 (SEQ ID NO: 1), EXP-AGRne.Ubq1:1:8 (SEQ ID NO: 5), EXP-AGRne.Ubq1:1:9 (SEQ ID NO: 7), EXP-ARUdo.Ubq1:1:8 (SEQ ID NO: 13), EXP-ARUdo.Ubq1:1:9 (SEQ ID NO: 16), EXPARUdo.Ubq1:1:11 (SEQ ID NO: 20), EXP-ARUdo.Ubq2:1:8 (SEQ ID NO: 26), EXP-ARUdo.Ubq2:1:9 (SEQ ID NO: 29), EXP-ARUdo.Ubq2:1:10 (SEQ ID NO: 31), EXP-BOUgr.Ubq1:1:6 (SEQ ID NO: 37), EXP-BOUgr.Ubq1:1:7 (SEQ ID NO: 40), EXP-BOUgr.Ubq1:1:8 (SEQ ID NO: 42), EXP-BOUgr.Ubq2:1:14 (SEQ ID NO: 51), EXPBOUgr.Ubq2:1:16 (SEQ ID NO: 57), EXP-BOUgr.Ubq2:1:17 (SEQ ID NO: 59), EXP-MISsi.Ubq1:1:8 (SEQ ID NO: 69), EXP-MISsi.Ubq1:1:10 (SEQ ID NO: 71), EXP-MISsi.Ubq1:1:11 (SEQ ID NO: 73), EXP-MISsi.Ubq1:1:7 (SEQ ID NO: 75), EXP-SCHsc.Ubq1:1:9 (SEQ ID NO: 77), EXP-SCHsc.Ubq1:1:7 (SEQ ID NO: 83), EXP-SCHsc.Ubq1:1:10 (SEQ ID NO: 85), EXP-SORnu.Ubq1:1:6 (SEQ ID NO: 91), EXP-SORnu.Ubq1:1:7 (SEQ ID NO: 94), EXPSORnu.Ubq1:1:8 (SEQ ID NO: 96), EXP-SETit.Ubq1:1:5 (SEQ ID NO: 102), EXP-SETit.Ubq1:1:7 (SEQ ID NO: 105), EXP-SETit.Ubq1:1:6 (SEQ ID NO: 107), EXP-Sv.Ubq1:1:7 (SEQ ID NO: 109), EXP-Sv.Ubq1:1:8 (SEQ ID NO: 115), EXP-Sv.Ubq1:1:10 (SEQ ID NO: 117), EXP-Zm.UbqM1:1:6 (SEQ ID NO: 121), EXP-Zm.UbqM1:1:7 (SEQ ID NO: 127), EXP-Zm.UbqM1:1:8 (SEQ ID NO: 133), Exp-Sb.Ubq4:1:2 (SEQ ID NO: 139) y Exp-Sb.Ubq6:1:2 (SEQ ID NO: 143) con la de promotores constitutivos conocidos. Cada secuencia EXP que comprende la plantilla de amplificación a partir de la cual se produce el amplicón del casete de expresión se clonó utilizando procedimientos conocidos en la materia en un vector de expresión de planta que se muestra en la Tabla 2 a continuación bajo el encabezado "Plantilla de amplicón". Los vectores de expresión de plantas resultantes comprenden un casete de expresión que comprende una secuencia EXP, unida operativamente en el 5’ a una secuencia codificante para GUS que contiene un intrón procesable ("GUS-2", SEQ ID NO: 154) o una secuencia codificante para GUS contigua ("GUS-1", SEQ ID NO: 153), unida operativamente en el 5’ a una 3’ UTR T-AGRtu.nos-1:1:13 (SEC ID NO: 157) o T-Ta.Hsp17-1:1:1 (SEQ ID NO: 158). Los amplicones se produjeron utilizando procedimientos conocidos por los expertos en la materia utilizando las plantillas de construcción de plásmidos que se presentan en la Tabla 2 a continuación. En resumen, se diseñó un cebador de oligonucleótidos 5’ para hibridar con la secuencia promotora y se utilizó un cebador de oligonucleotídicos 3’, que se hibrida con el extremo 3’ de la 3’ UTR, para la amplificación de cada casete de expresión. Se introdujeron supresiones en 5’ sucesivas en las secuencias promotoras que comprenden los casetes de expresión, dando lugar a diferentes secuencias EXP, mediante la utilización de diferentes cebadores de oligonucleótidos que se diseñaron para hibridar en diferentes posiciones dentro de la secuencia promotora que comprende cada plantilla de amplicón.
Tabla 2. Amplicones de expresión en plantas de GUS y las correspondientes plantillas de amplicones de construcciones de plásmidos, secuencia EXP, secuencia codificante GUS y 3’ UTR utilizadas para latransformación de protoplastos de la hoja de maíz.
- ID de amplicón
- Molde del amplicón Secuencia EXP SEQ ID NO: Secuencia codificante de GUS 3’ UTR
- PCR0145942
- pMON25455 EXP-Os.Act1:1:9 162 GUS-1 T-AGRtu.nos1:1:13
- PCR0145943
- pMON65328 EXP-CaMV.35Senh+Ta.Lhcb1+Os.Act1:1:1 161 GUS-2 T-Ta.Hsp17-1:1:1
- PCR0145935
- pMON140890 EXP-AGRne.Ubq1:1:7 1 GUS-1 T-AGRtu.nos1:1:13
- PCR0145827
- pMON140890 EXP-AGRne.Ubq1:1:8 5 GUS-1 T-AGRtu.nos1:1:13
- PCR0145828
- pMON140890 EXP-AGRne.Ubq1:1:9 7 GUS-1 T-AGRtu.nos1:1:13
- PCR0145939
- pMON140894 EXP-ARUdo.Ubq1:1:8 13 GUS-1 T-AGRtu.nos1:1:13
- PCR0145837
- pMON140894 EXP-ARUdo.Ubq1:1:9 18 GUS-1 T-AGRtu.nos1:1:13
- PCR0145838
- pMON140894 EXP-ARUdo.Ubq1:1:11 21 GUS-1 T-AGRtu.nos1:1:13
- PCR0145940
- pMON140895 EXP-ARUdo.Ubq2:1:8 27 GUS-1 T-AGRtu.nos1:1:13
24
(continuación)
- ID de amplicón
- Molde del amplicón Secuencia EXP SEQ ID NO: Secuencia codificante de GUS 3’ UTR
- PCR0145841
- pMON140895 EXP-ARUdo.Ubq2:1:9 30 GUS-1 T-AGRtu.nos1:1:13
- PCR0145842
- pMON140895 EXP-ARUdo.Ubq2:1:10 32 GUS-1 T-AGRtu.nos1:1:13
- PCR0145936
- pMON140891 EXP-BOUgr.Ubq1:1:6 38 GUS-1 T-AGRtu.nos1:1:13
- PCR0145829
- pMON140891 EXP-BOUgr.Ubq1:1:7 41 GUS-1 T-AGRtu.nos1:1:13
- PCR0145831
- pMON140891 EXP-BOUgr.Ubq1:1:8 43 GUS-1 T-AGRtu.nos1:1:13
- PCR0145937
- pMON140892 EXP-BOUgr.Ubq2:1:14 52 GUS-1 T-AGRtu.nos1:1:13
- PCR0145833
- pMON140892 EXP-BOUgr.Ubq2:1:16 58 GUS-1 T-AGRtu.nos1:1:13
- PCR0145836
- pMON140892 EXP-BOUgr.Ubq2:1:17 60 GUS-1 T-AGRtu.nos1:1:13
- PCR0145898
- pMON136265 EXP-MISsi.Ubq1:1:8 70 GUS-1 T-AGRtu.nos1:1:13
- PCR0145823
- pMON136265 EXP-MISsi.Ubq1:1:10 72 GUS-1 T-AGRtu.nos1:1:13
- PCR0145824
- pMON136265 EXP-MISsi.Ubq 1:1:11 74 GUS-1 T-AGRtu.nos1:1:13
- PCR0145899
- pMON136260 EXP-MISsi.Ubq 1:1:7 76 GUS-1 T-AGRtu.nos1:1:13
- PCR0145894
- pMON136262 EXP-SCHsc.Ubq1:1:9 78 GUS-1 T-AGRtu.nos1:1:13
- PCR0145895
- pMON136257 EXP-SCHsc.Ubq1:1:7 84 GUS-1 T-AGRtu.nos1:1:13
- PCR0145813
- pMON136257 EXP-SCHsc.Ubq 1:1:10 86 GUS-1 T-AGRtu.nos1:1:13
- PCR0145938
- pMON140893 EXP-SORnu.Ubq1:1:6 92 GUS-1 T-AGRtu.nos1:1:13
- PCR0145839
- pMON140893 EXP-SORnu.Ubq1:1:7 95 GUS-1 T-AGRtu.nos1:1:13
- PCR0145840
- pMON140893 EXP-SORnu.Ubq1:1:8 97 GUS-1 T-AGRtu.nos1:1:13
- PCR0145900
- pMON140877 EXP-SETit.Ubq1:1:5 103 GUS-1 T-AGRtu.nos1:1:13
- PCR0145928
- pMON140877 EXP-SETit.Ubq1:1:7 106 GUS-1 T-AGRtu.nos1:1:13
25 5
10
15
20
25
30
(continuación)
- ID de amplicón
- Molde del amplicón Secuencia EXP SEQ ID NO: Secuencia codificante de GUS 3’ UTR
- PCR0145905
- pMON140877 EXP-SETit.Ubq1:1:6 108 GUS-1 T-AGRtu.nos1:1:13
- PCR0145909
- pMON140878 EXP-Sv.Ubq1:1:7 110 GUS-1 T-AGRtu.nos1:1:13
- PCR0145929
- pMON140878 EXP-Sv.Ubq1:1:8 116 GUS-1 T-AGRtu.nos1:1:13
- PCR0145911
- pMON140878 EXP-Sv.Ubq1:1:10 118 GUS-1 T-AGRtu.nos1:1:13
- PCR0145914
- pMON140881 EXP-Zm.UbqM1:1:6 122 GUS-1 T-AGRtu.nos1:1:13
- PCR0145916
- pMON140883 EXP-Zm.UbqM1:1:7 128 GUS-1 T-AGRtu.nos1:1:13
- PCR0145915
- pMON140882 EXP-Zm.UbqM1:1:8 134 GUS-1 T-AGRtu.nos1:1:13
- PCR0145921
- pMON140887 Exp-Sb.Ubq4:1:2 140 GUS-1 T-AGRtu.nos1:1:13
- PCR0145920
- pMON140886 Exp-Sb.Ubq6:1:2 144 GUS-1 T-AGRtu.nos1:1:13
Las construcciones de plásmidos enumeradas como plantillas de amplicón en la Tabla 2 sirvieron como plantillas para la amplificación de casetes de expresión transgénicos que comprenden las secuencias EXP enumeradas de la Tabla 2. Se construyeron plásmidos de control utilizados para generar amplicones transgénicos GUS para la comparación como se describió previamente con las secuencias EXP constitutivas EXP-Os.Act1:1:9 (SEQ ID NO: 162) y EXP-CaMV.35S-enh+Ta.Lhcb1+Os.Act1:1:1 (SEQ ID NO: 161). Se utilizó un vector vacío no diseñado para la expresión transgénica como control negativo para evaluar la expresión de luciferasa y GUS de origen.
También se construyeron dos plásmidos, para su uso en cotransformación y normalización de datos, utilizando procedimientos conocidos en la materia. Cada plásmido contenía una secuencia codificante de luciferasa específica que fue dirigida por una secuencia EXP constitutiva. El vector vegetal pMON19437 comprende un casete de expresión con un promotor constitutivo unido operativamente en el 5’ a un intrón, (EXP-CaMV.35Senh+Zm.DnaK:1:1, SEQ ID NO: 163), unido operativamente en el 5’ a una secuencia codificante de luciferasa de luciérnaga (Photinus pyralis) (LUCIFERASA: 1:3, SEQ ID NO: 156), unido operativamente en el 5’ a una 3’ UTR desde el gen de la nopalina sintasa de Agrobacterium tumefaciens (T-AGRtu.nos-1:1:13, SEQ ID NO: 158). El vector vegetal pMON63934 comprende un casete de expresión con una secuencia EXP constitutiva (EXP-CaMV.35S-enh-Lhcbl, SEQ ID NO: 164), unido operativamente en el 5’ a una secuencia codificante de luciferasa de pensamiento de mar (Renilla reniformis) (CR-Ren.hRenilla Lucife-0:0:1, SEQ ID NO: 157), unido operativamente en el 5’ a una 3’ UTR desde el gen de la nopalina sintasa de Agrobacterium tumefaciens (T-AGRtu.nos-1:1:13, SEQ ID NO: 158).
Se transformaron los protoplastos de la hoja de maíz utilizando un procedimiento de transformación basado en PEG, que es bien conocido en la materia. Se transformaron las células de protoplasto con ADN de plásmido pMON19437, ADN de plásmido pMON63934 y los amplicones presentados en la Tabla 2, y se incubaron durante la noche en oscuridad total. Se llevaron a cabo mediciones tanto de GUS como de luciferasa mediante la colocación de alícuotas de una preparación lisada de células transformadas como anteriormente en dos bandejas de pocillos pequeños diferentes. Una bandeja se utilizó para mediciones de GUS y una segunda bandeja se utilizó para llevar a cabo un doble ensayo de luciferasa utilizando el sistema de doble ensayo indicador de la luciferasa (Promega Corp., Madison, WI; véase, por ejemplo, Promega Notes Magazine, N.º: 57, 1996, p.02). Se realizaron una o dos transformaciones para cada secuencia EXP y los valores medios de expresión para cada secuencia EXP se determinaron a partir de varias muestras de cada experimento de transformación. Se realizaron las mediciones de la muestra utilizando cuatro réplicas de cada transformación de construcción de secuencia EXP, o alternativamente, tres réplicas de cada amplicón de secuencia EXP por uno de dos experimentos de transformación. Los niveles medios de expresión de GUS y luciferasa se proporcionan en la Tabla 3. En esta tabla, los valores de luciferasa de
26
luciérnaga (por ejemplo, de la expresión de pMON19437) se proporcionan en la columna marcada con "FLuc" y los valores de luciferasa de Renilla se proporcionan como en la columna marcada con "RLuc".
Tabla 3. Actividad media de GUS y luciferasa en protoplastos de hojas de maíz transformadas.
- Secuencia EXP
- SEQ ID NO: GUS FLuc RLuc
- VACIO
- 5 7840,58 205661
- EXP-Os.Act1:1:9
- 162 1540,25 2671,83 105417
- EXP-CaMV.35S-enh+Ta.Lhcb1+Os.Act1:1:1
- 161 12530,8 3067,08 137723
- EXP-AGRne.Ubq 1:1:7
- 1 39665 3645,83 137384
- EXP-AGRne.Ubq1:1:8
- 5 22805,5 4183,58 140991
- EXP-AGRne.Ubq1:1:9
- 7 5861,5 887,08 34034,3
- EXP-ARUdo.Ubq1:1:8
- 13 26965,5 1052,33 37774,8
- EXP-ARUdo.Ubq1:1:9
- 18 66126 3251,08 114622
- EXP-ARUdo.Ubq1:1:11
- 21 136163 453851
- EXP-ARUdo.Ubq2:1:8
- 27 13222,3 2203,58 72339,1
- EXP-ARUdo.Ubq2:1:9
- 30 30095 6538,58 229201
- EXP-ARUdo.Ubq2:1:10
- 32 16448,5 1842,58 65325,1
- EXP-BOUgr.Ubq1:1:6
- 38 32544,3 2765,08 80330,8
- EXP-BOUgr.Ubq1:1:7
- 41 3826,33 697,11 20709
- EXP-BOUgr.Ubq1:1:8
- 43 9935,5 3372,58 110965
- EXP-BOUgr.Ubq2:1:14
- 52 17828 1575,83 62286,8
- EXP-BOUgr.Ubq2:1:16
- 58 54970,3 3389,08 117616
- EXP-BOUgr.Ubq2:1:17
- 60 48601,3 7139,08 245785
- EXP-MISsi.Ubq1:1:8
- 70 11788,3 3264,58 87751,6
- EXP-MISsi.Ubq1:1:10
- 72 33329,5 2388,58 81000,6
- EXP-MISsi.Ubq 1:1:11
- 74 4723,75 3135,33 98059,1
- EXP-MISsi.Ubq 1:1:7
- 76 4499 3073,58 84015,1
- EXP-SCHsc.Ubq1:1:9
- 78 5972 1703,33 62310,6
- EXP-SCHsc.Ubq 1:1:7
- 84 24173,5 5306,08 155122
- EXP-SCHsc.Ubq 1:1:10
- 86 7260 1171,08 38698,1
- EXP-SORnu.Ubq1:1:6
- 92 3966,5 4175,08 129365
- EXP-SORnu.Ubq1:1:7
- 95 23375,5 616,83 25125,3
- EXP-SORnu.Ubq1:1:8
- 97 8431,75 1630,08 55095,6
- EXP-SETit.Ubq1:1:5
- 103 20496,5 2358,83 88695,8
- EXP-SETit.Ubq1:1:7
- 106 75728,5 4723,08 185224
- EXP-SETit.Ubq1:1:6
- 108 44148,3 4962,08 161216
27
(continuación)
- Secuencia EXP
- SEQ ID NO: GUS FLuc RLuc
- EXP-Sv.Ubq1:1:7
- 110 15043,8 1888,33 74670,6
- EXP-Sv.Ubq1:1:8
- 116 31997,8 3219,83 113787
- EXP-Sv.Ubq1:1:10
- 118 38952,8 7011,33 220209
- EXP-Zm.UbqM1:1:6
- 122 30528,3 2453,58 90113,1
- EXP-Zm.UbqM1:1:8
- 134 34986,3 2553,78 105725
- Exp-Sb.Ubq4:1:2
- 140 9982,25 2171,58 72593,8
- Exp-Sb.Ubq6:1:2
- 144 33689 3879,58 114710
Para comparar la actividad relativa de cada secuencia EXP, se expresaron los valores de GUS como una relación de GUS a la actividad de luciferasa y se normalizaron con respecto a los niveles de expresión observados para EXPOs.Act1:1:1 y EXP-CaMV.35S-enh+Ta.Lhcb1+Os.Act1:1:1. La tabla 4 a continuación muestra las relaciones GUS/RLuc de expresión normalizada con respecto a la expresión dirigida de EXP-Os.Act1:1:1 y EXP-CaMV.35Senh+Ta.Lhcb1+Os.Act1:1:1 en protoplastos de maíz. La tabla 5 a continuación muestra las relaciones GUS/FLuc de expresión normalizada con respecto a la expresión dirigida de EXP-Os.Act1:1:1 y EXP-CaMV.35Senh+Ta.Lhcb1+Os.Act1:1:1 en protoplastos de maíz.
Tabla 4. Relaciones de expresión de GUS/RLuc y GUS/FLuc normalizada con respecto a EXP-CaMV.35Senh+Ta.Lhcb1+Os.Act1:1:1 (SEQ ID NO: 161) en protoplastos de maíz.
- Secuencia EXP
- SEQ ID NO: GUS/FLuc con respecto a EXPCaMV.35S-enh+Ta.Lhcb1 + Os.Act1:1:1 GUS/RLuc con respecto a EXPCaMV.35S-enh+Ta.Lhcb1 + Os.Act1:1:1
- EXP-Os.Act1:1:9
- 162 0,14 0,16
- EXP-CaMV.35Senh+Ta.Lhcb1+Os.Act1:1:1
- 161 1 1
- EXP-AGRne.Ubq1:1:7
- 1 2,66 3,17
- EXP-AGRne.Ubq 1:1:8
- 5 1,33 1,78
- EXP-AGRne.Ubq1:1:9
- 7 1,62 1,89
- EXP-ARUdo.Ubq1:1:8
- 13 6,27 7,85
- EXP-ARUdo.Ubq1:1:9
- 18 4,98 6,34
- EXP-ARUdo.Ubq 1:1:11
- 21 3,3
- EXP-ARUdo.Ubq2:1:8
- 27 1,47 2,01
- EXP-ARUdo.Ubq2:1:9
- 30 1,13 1,44
- EXP-ARUdo.Ubq2:1:10
- 32 2,18 2,77
- EXP-BOUgr.Ubq1:1:6
- 38 2,88 4,45
- EXP-BOUgr.Ubq1:17
- 41 1,34 2,03
- EXP-BOUgr.Ubq1:1:8
- 43 0,72 0,98
- EXP-BOUgr.Ubq2:1:14
- 52 2,77 3,15
- EXP-BOUgr.Ubq2:1:16
- 58 3,97 5,14
28
(continuación)
- Secuencia EXP
- SEQ ID NO: GUS/FLuc con respecto a EXPCaMV.35S-enh+Ta.Lhcb1 + Os.Act1:1:1 GUS/RLuc con respecto a EXPCaMV.35S-enh+Ta.Lhcb1 + Os.Act1:1:1
- EXP-BOUgr.Ubq2:1:17
- 60 1,67 2,17
- EXP-MISsi.Ubq1:1:8
- 70 0,88 1,48
- EXP-MISsi.Ubq1:1:10
- 72 3,42 4,52
- EXP-MISsi.Ubq1:1:11
- 74 0,37 0,53
- EXP-MISsi.Ubq1:1:7
- 76 0,36 0,59
- EXP-SCHsc.Ubq1:1:9
- 78 0,86 1,05
- EXP-SCHsc.Ubq1:1:7
- 84 1,12 1,71
- EXP-SCHsc.Ubq 1:1:10
- 86 1,52 2,06
- EXP-SORnu.Ubq1:1:6
- 92 0,23 0,34
- EXP-SORnu.Ubq1:1:7
- 95 9,28 10,23
- EXP-SORnu.Ubq1:1:8
- 97 1,27 1,68
- EXP-SETit.Ubq1:1:5
- 103 2,13 2,54
- EXP-SETit.Ubq1:1:7
- 106 3,92 4,49
- EXP-SETit.Ubq1:1:6
- 108 2,18 3,01
- EXP-Sv.Ubq1:1:7
- 110 1,95 2,21
- EXP-Sv.Ubq 1:1:8
- 116 2,43 3,09
- EXP-Sv.Ubq 1:1:10
- 118 1,36 1,94
- EXP-Zm.UbqM1:1:6
- 122 3,05 3,72
- EXP-Zm.UbqM1:1:8
- 134 3,35 3,64
- Exp-Sb.Ubq4:1:2
- 140 1,13 1,51
- Exp-Sb.Ubq6:1:2
- 144 2,13 3,23
Tabla 5. Relaciones de expresión de GUS/RLuc y GUS/FLuc normalizada con respecto a EXP-Os.Act1:1:9 (SEQ ID NO: 162) en protoplastos de hojas de maíz.
- Secuencia EXP
- SEQ ID NO: GUS/FLuc con respecto a EXP-Os.Act1:1:9 GUS/RLuc con respecto a EXP-Os.Act1:1:9
- EXP-Os.Act1:1:9
- 162 1 1
- EXP-CaMV.35Senh+Ta.Lhcb1+Os.Act1:1:1
- 161 7,09 6,23
- EXP-AGRne.Ubq1:1:7
- 1 18,87 19,76
- EXP-AGRne.Ubq 1:1:8
- 5 9,46 11,07
- EXP-AGRne.Ubq 1:1:9
- 7 11,46 11,79
29
(continuación)
- Secuencia EXP
- SEQ ID NO: GUS/FLuc con respecto a EXP-Os.Act1:1:9 GUS/RLuc con respecto a EXP-Os.Act1:1:9
- EXP-ARUdo. Ubq 1:1:8
- 13 44,45 48,86
- EXP-ARUdo. Ubq 1:1:9
- 18 35,28 39,48
- EXP-ARUdo.Ubq 1:1:11
- 21 20,53
- EXP-ARUdo.Ubq2:1:8
- 27 10,41 12,51
- EXP-ARUdo.Ubq2:1:9
- 30 7,98 8,99
- EXP-ARUdo.Ubq2:1:10
- 32 15,49 17,23
- EXP-BOUgr.Ubq1:1:6
- 38 20,42 27,73
- EXP-BOUgr.Ubq 1:1:7
- 41 9,52 12,65
- EXP-BOUgr.Ubq1:1:8
- 43 5,11 6,13
- EXP-BOUgr.Ubq2:1:14
- 52 19,63 19,59
- EXP-BOUgr.Ubq2:1:16
- 58 28,14 31,99
- EXP-BOUgr.Ubq2:1:17
- 60 11,81 13,53
- EXP-MISsi.Ubq 1:1:8
- 70 6,26 9,19
- EXP-MISsi.Ubq1:1:10
- 72 24,21 28,16
- EXP-MISsi.Ubq 1:1:11
- 74 2,61 3,3
- EXP-MISsi.Ubq 1:1:7
- 76 2,54 3,67
- EXP-SCHsc.Ubq1:1:9
- 78 6,08 6,56
- EXP-SCHsc.Ubq1:1:7
- 84 7,9 10,67
- EXP-SCHsc.Ubq 1:1:10
- 86 10,75 12,84
- EXP-SORnu.Ubq 1:1:6
- 92 1,65 2,1
- EXP-SORnu.Ubq1:1:7
- 95 65,74 63,67
- EXP-SORnu.Ubq1:1:8
- 97 8,97 10,47
- EXP-SETit.Ubq1:1:5
- 103 15,07 15,82
- EXP-SETit.Ubq1:1:7
- 106 27,81 27,98
- EXP-SETit.Ubq1:1:6
- 108 15,43 18,74
- EXP-Sv.Ubq1:1:7
- 110 13,82 13,79
- EXP-Sv.Ubq1:1:8
- 116 17,24 19,25
- EXP-Sv.Ubq1:1:10
- 118 9,64 12,11
- EXP-Zm. UbqM1:1:6
- 122 21,58 23,19
- EXP-Zm. UbqM1:1:8
- 134 23,76 22,65
- Exp-Sb.Ubq4:1:2
- 140 7,97 9,41
- Exp-Sb.Ubq6:1:2
- 144 15,06 20,1
30
utilizados para el ensayo en maíz en el Ejemplo 2 anterior. Los amplicones de casete de expresión de GUS de control y los plásmidos de luciferasa utilizados para la transformación de protoplastos de trigo también fueron los mismos que los presentados en el ejemplo anterior y proporcionados en la Tabla 3 anterior en el Ejemplo 2. Análogamente, se utilizaron controles negativos para la determinación del origen de GUS y luciferasa, como se
5 describe anteriormente. Se transformaron los protoplastos de la hoja de trigo utilizando un procedimiento de transformación basado en PEG, como se describe en el Ejemplo 2 anterior. La Tabla 8 enumera la actividad media de GUS y LUC observada en las células de protoplastos de la hoja de trigo transformadas, y la Tabla 9 y 10 muestra las relaciones de expresión normalizadas de GUS/FLuc y GUS/RLuc en protoplastos de trigo en relación con los controles constitutivos de EXP.
10 Tabla 8. Actividad media de GUS y luciferasa en protoplastos de hojas de trigo transformadas.
- Secuencia EXP
- SEQ ID NO: GUS FLuc RLuc
- VACIO
- 262,56 1109,78 61422,1
- EXP-Os.Act1:1:9
- 162 2976,33 730,11 53334,8
- EXP-CaMV.35S-enh+Ta.Lhcb1+Os.Act1:1:1
- 161 29299,3 741,78 50717,4
- EXP-AGRne.Ubq1:1:7
- 1 27078,3 754,44 44235,8
- EXP-AGRne.Ubq 1:1:8
- 5 22082,7 958,11 55774,8
- EXP-AGRne.Ubq 1:1:9
- 7 13882,7 699,78 49273,4
- EXP-ARUdo.Ubq 1:1:8
- 13 65628 791,44 56358,8
- EXP-ARUdo.Ubq 1:1:9
- 18 87615 801,44 53246,4
- EXP-ARUdo.Ubq1:1:11
- 21 19224,3 143,44 14104,1
- EXP-ARUdo.Ubq2:1:8
- 27 25453,3 835,11 57679,4
- EXP-ARUdo.Ubq2:1:9
- 30 26720,7 702,44 47455,4
- EXP-ARUdo.Ubq2:1:10
- 32 37089,3 859,11 57814,4
- EXP-BOUgr.Ubq1:1:6
- 38 35146 995,44 64418,8
- EXP-BOUgr.Ubq1:1:7
- 41 18077 857,78 55793,4
- EXP-BOUgr.Ubq1:1:8
- 43 11723,7 938,44 59362,1
- EXP-BOUgr.Ubq2:1:14
- 52 38109,3 875,11 58048,1
- EXP-BOUgr.Ubq2:1:16
- 58 37384 860,44 52447,8
- EXP-BOUgr.Ubq2:1:17
- 60 24090,7 968,78 53057,8
- EXP-MISsi.Ubq 1:1:8
- 70 16456,7 1021,78 61684,1
- EXP-MISsi.Ubq1:1:10
- 72 42816,7 839,78 46688,1
- EXP-MISsi.Ubq 1:1:11
- 74 20625,7 987,78 61842,1
- EXP-MISsi.Ubq 1:1:7
- 76 4913,67 764,78 64720,1
- EXP-SCHsc.Ubq1:1:9
- 78 9726 937,11 54725,4
- EXP-SCHsc.Ubq1:1:7
- 84 13374,7 1112,44 73815,4
- EXP-SCHsc.Ubq 1:1:10
- 86 13650 936,78 62242,1
- EXP-SORnu.Ubq1:1:6
- 92 8188,17 753,83 50572,5
- EXP-SORnu.Ubq1:1:7
- 95 83233,7 854,44 54410,1
32
(continuación)
- Secuencia EXP
- SEQ ID NO: GUS FLuc RLuc
- EXP-SORnu.Ubq1:1:8
- 97 21904,7 1011,83 60852
- EXP-SETit.Ubq1:1:5
- 103 39427,7 908,78 57463,1
- EXP-SETit.Ubq1:1:7
- 106 108091 809,44 49330,4
- EXP-SETit.Ubq1:1:6
- 108 58703 809,11 46110,1
- EXP-Sv.Ubq1:1:7
- 110 29330 684,11 43367,1
- EXP-Sv.Ubq1:1:8
- 116 53359 698,11 40076,4
- EXP-Sv.Ubq1:1:10
- 118 49122,7 901,44 53180,8
- EXP-Zm. UbqM1:1:6
- 122 37268 945,78 54088,1
- EXP-Zm. UbqM1:1:8
- 134 51408 677,78 47297,4
- Exp-Sb.Ubq4:1:2
- 140 35660,3 1114,11 62591,1
- Exp-Sb.Ubq6:1:2
- 144 27543 915,11 57826,4
Tabla 9. Relaciones de expresión de GUS/RLuc y GUS/FLuc normalizada con respecto a EXP-CaMV.35Senh+Ta.Lhcb1+Os.Act1:1:1 (SEQ ID NO: 161) en protoplastos de trigo.
- Secuencia EXP
- SEQ ID NO: GUS FLuc RLuc
- VACIO
- 262,56 1109,78 61422,1
- EXP-Os.Act1:1:9
- 162 2976,33 730,11 53334,8
- EXP-CaMV.35Senh+Ta.Lhcb1+Os.Act1:1:1
- 161 29299,3 741,78 50717,4
- EXP-AGRne.Ubq1:1:7
- 1 27078,3 754,44 44235,8
- EXP-AGRne.Ubq 1:1:8
- 5 22082,7 958,11 55774,8
- EXP-AGRne.Ubq 1:1:9
- 7 13882,7 699,78 49273,4
- EXP-ARUdo.Ubq 1:1:8
- 13 65628 791,44 56358,8
- EXP-ARUdo.Ubq 1:1:9
- 18 87615 801,44 53246,4
- EXP-ARUdo.Ubq1:1:11
- 21 19224,3 143,44 14104,1
- EXP-ARUdo.Ubq2:1:8
- 27 25453,3 835,11 57679,4
- EXP-ARUdo.Ubq2:1:9
- 30 26720,7 702,44 47455,4
- EXP-ARUdo.Ubq2:1:10
- 32 37089,3 859,11 57814,4
- EXP-BOUgr.Ubq1:1:6
- 38 35146 995,44 64418,8
- EXP-BOUgr.Ubq1:1:7
- 41 18077 857,78 55793,4
- EXP-BOUgr.Ubq1:1:8
- 43 11723,7 938,44 59362,1
- EXP-BOUgr.Ubq2:1:14
- 52 38109,3 875,11 58048,1
- EXP-BOUgr.Ubq2:1:16
- 58 37384 860,44 52447,8
- EXP-BOUgr.Ubq2:1:17
- 60 24090,7 968,78 53057,8
33
(continuación)
- Secuencia EXP
- SEQ ID NO: GUS FLuc RLuc
- EXP-MISsi.Ubq 1:1:8
- 70 16456,7 1021,78 61684,1
- EXP-MISsi.Ubq1:1:10
- 72 42816,7 839,78 46688,1
- EXP-MISsi.Ubq 1:1:11
- 74 20625,7 987,78 61842,1
- EXP-MISsi.Ubq 1:1:7
- 76 4913,67 764,78 64720,1
- EXP-SCHsc.Ubq1:1:9
- 78 9726 937,11 54725,4
- EXP-SCHsc.Ubq1:1:7
- 84 13374,7 1112,44 73815,4
- EXP-SCHsc.Ubq 1:1:10
- 86 13650 936,78 62242,1
- EXP-SORnu.Ubq1:1:6
- 92 8188,17 753,83 50572,5
- EXP-SORnu.Ubq 1:1:7
- 95 83233,7 854,44 54410,1
- EXP-SORnu.Ubq1:1:8
- 97 21904,7 1011,83 60852
- EXP-SETit.Ubq1:1:5
- 103 39427,7 908,78 57463,1
- EXP-SETit.Ubq1:1:7
- 106 108091 809,44 49330,4
- EXP-SETit.Ubq1:1:6
- 108 58703 809,11 46110,1
- EXP-Sv.Ubq1:1:7
- 110 29330 684,11 43367,1
- EXP-Sv.Ubq 1:1:8
- 116 53359 698,11 40076,4
- EXP-Sv.Ubq 1:1:10
- 118 49122,7 901,44 53180,8
- EXP-Zm. UbqM1:1:6
- 122 37268 945,78 54088,1
- EXP-Zm. UbqM1:1:8
- 134 51408 677,78 47297,4
- Exp-Sb.Ubq4:1:2
- 140 35660,3 1114,11 62591,1
- Exp-Sb.Ubq6:1:2
- 144 27543 915,11 57826,4
Tabla 10. Relaciones de expresión de GUS/RLuc y GUS/FLuc normalizada con respecto a EXP-Os.Act1:1:9 (SEQ ID NO: 162) en protoplastos de hojas de maíz.
- Secuencia EXP
- SEQ ID NO: GUS/FLuc con respecto a EXP-Os.Act1:1:9 GUS/RLuc con respecto a EXP-Os.Act1:1:9
- EXP-Os.Act1:1:9
- 162 1 1
- EXP-CaMV.35Senh+Ta.Lhcb1+Os.Act1:1:1
- 161 9,69 10,35
- EXP-AGRne.Ubq 1:1:7
- 1 8,8 10,97
- EXP-AGRne.Ubq 1:1:8
- 5 5,65 7,09
- EXP-AGRne.Ubq 1:1:9
- 7 4,87 5,05
- EXP-ARUdo.Ubq1:1:8
- 13 20,34 20,87
- EXP-ARUdo.Ubq1:1:9
- 18 26,82 29,49
- EXP-ARUdo.Ubq 1:1:11
- 21 32,88 24,43
34
(continuación)
- Secuencia EXP
- SEQ ID NO: GUS/FLuc con respecto a EXP-Os.Act1:1:9 GUS/RLuc con respecto a EXP-Os.Act1:1:9
- EXP-ARUdo.Ubq2:1:8
- 27 7,48 7,91
- EXP-ARUdo.Ubq2:1:9
- 30 9,33 10,09
- EXP-ARUdo.Ubq2:1:10
- 32 10,59 11,5
- EXP-BOUgr.Ubq1:1:6
- 38 8,66 9,78
- EXP-BOUgr.Ubq1:1:7
- 41 5,17 5,81
- EXP-BOUgr.Ubq1:1:8
- 43 3,06 3,54
- EXP-BOUgr.Ubq2:1:14
- 52 10,68 11,76
- EXP-BOUgr.Ubq2:1:16
- 58 10,66 12,77
- EXP-BOUgr.Ubq2:1:17
- 60 6,1 8,14
- EXP-MISsi.Ubq 1:1:8
- 70 3,95 4,78
- EXP-MISsi.Ubq1:1:10
- 72 12,51 16,43
- EXP-MISsi.Ubq 1:1:11
- 74 5,12 5,98
- EXP-MISsi.Ubq 1:1:7
- 76 1,58 1,36
- EXP-SCHsc.Ubq1:1:9
- 78 2,55 3,18
- EXP-SCHsc.Ubq1:1:7
- 84 2,95 3,25
- EXP-SCHsc.Ubq 1:1:10
- 86 3,57 3,93
- EXP-SORnu.Ubq 1:1:6
- 92 2,66 2,9
- EXP-SORnu.Ubq1:1:7
- 95 23,9 27,41
- EXP-SORnu.Ubq1:1:8
- 97 5,31 6,45
- EXP-SETit.Ubq 1:1:5
- 103 10,64 12,3
- EXP-SETit.Ubq1:1:7
- 106 32,76 39,26
- EXP-SETit.Ubq1:1:6
- 108 17,8 22,81
- EXP-Sv.Ubq1:1:7
- 110 10,52 12,12
- EXP-Sv.Ubq1:1:8
- 116 18,75 23,86
- EXP-Sv.Ubq1:1:10
- 118 13,37 16,55
- EXP-Zm.UbqM1:1:6
- 122 9,67 12,35
- EXP-Zm.UbqM1:1:8
- 134 18,61 19,48
- Exp-Sb.Ubq4:1:2
- 140 7,85 10,21
- Exp-Sb.Ubq6:1:2
- 144 7,38 8,54
Como se puede ver en las Tablas 9 y 10 anteriores, todas las secuencias EXP fueron capaces de dirigir la expresión del transgén de GUS en células de trigo. Todas las secuencias EXP condujeron a la expresión de GUS a niveles más altos que los de EXP-Os.Act1:1:9 en células de trigo. Las secuencias EXP EXP-ARUdo.Ubq1:1:8 (SEQ ID NO: 13), EXP-ARUdo.Ubq1:1:9 (SEQ ID NO: 18), EXP-ARUdo.Ubq1:1:11 (SEQ ID NO: 21), EXP-ARUdo.Ubq2:1:10 (SEQ ID NO: 32), EXP-BOUgr.Ubq2:1:14 (SEQ ID NO: 52), EXP-BOUgr.Ubq2:1:16 (SEQ ID NO: 58), EXP
35
tumefaciens. Los plásmidos resultantes se utilizaron para transformar plantas de maíz. La Tabla 18 enumera las designaciones de plásmidos, las secuencias EXP y las SEQ ID NO, que también se describen en la Tabla 1.
Tabla 18. Plásmidos de transformación de plantas binarias y las secuencias EXP asociadas.
- Construcción del plásmido
- Secuencia EXP SEQ ID NO:
- pMON140869
- EXP-AGRne.Ubq1:1:7 1
- pMON140870
- EXP-AGRne.Ubq 1:1:8 5
- pMON142650
- EXP-ARUdo.Ubq1:1:8 13
- pMON142651
- EXP-ARUdo.Ubq1:1:9 18
- pMON142652
- EXP-ARUdo.Ubq2:1:8 27
- pMON142653
- EXP-ARUdo.Ubq2:1:9 30
- pMON140871
- EXP-BOUgr.Ubq1:1:6 38
- pMON140872
- EXP-BOUgr.Ubq1:1:7 41
- pMON140873
- EXP-BOUgr.Ubq2:1:14 52
- pMON140874
- EXP-BOUgr.Ubq2:1:15 55
- pMON142887
- EXP-MISsi.Ubq 1:1:7 76
- pMON140875
- EXP-SORnu.Ubq1:1:6 92
- pMON140876
- EXP-SORnu.Ubq 1:1:7 95
- pMON132037
- EXP-SETit.Ubq 1:1:10 99
- pMON131958
- EXP-Sv.Ubq1:1:11 114
- pMON131959
- EXP-Sv.Ubq1:1:12 120
- pMON131961
- EXP-Zm.UbqM1:1:10 126
- pMON131963
- EXP-Zm.UbqM1:1:12 132
- pMON131962
- EXP-Zm.UbqM1:1:11 138
- pMON132932
- EXP-Sb.Ubq4:1:2 140
- pMON132931
- EXP-Sb.Ubq6:1:3 148
- pMON132974
- EXP-Sb.Ubq7:1:2 150
- pMON142738
- EXP-Cl.Ubq10 168
Se transformaron las plantas utilizando transformaciones mediadas por Agrobacterium, por ejemplo, como se 5 describe en la Publicación de Solicitud de Patente de Estados Unidos 2009/0138985.
El análisis histoquímico de GUS se utilizó para el análisis de expresión cualitativa de plantas transformadas. Se incubaron secciones de tejido completo con solución de tinción GUS X-Gluc (5-bromo-4-cloro-3-indolil-b-glucurónido) (1 mg/ml) durante un período de tiempo apropiado, se enjuagaron y se inspeccionó visualmente para determinar la coloración azul. La actividad GUS se determinó cualitativamente mediante inspección visual directa o inspección 10 bajo un microscopio utilizando órganos y tejidos de plantas seleccionadas. Se inspeccionan las plantas R0 para determinar su expresión en las raíces y hojas, así como en la antera, el estigma y las semillas y embriones en desarrollo, 21 días después de la polinización (21 DAP, de sus siglas en inglés).
Para el análisis cuantitativo, se extrajo la proteína total de tejidos seleccionados de plantas de maíz transformadas. Se utilizó un microgramo de proteína total con el sustrato fluorógeno 4-metileumbeliferil-β-D-glucurónido (MUG) en 15 un volumen de reacción total de 50 µl. El producto de reacción, 4-metilumbeliferona (4-MU), tiene fluorescencia máxima a pH elevado, cuando el grupo hidroxilo está ionizado. La adición de una solución básica de carbonato de sodio detiene simultáneamente el ensayo y ajusta el pH para cuantificar el producto fluorescente. La fluorescencia se
39
midió con excitación a 365 nm, emisión a 445 nm utilizando un Fluoromax-3 (Horiba; Kioto, Japón) con un lector Micromax, con una anchura de rendija configurada para una excitación de 2 nm y una emisión de 3 nm.
La expresión de R0 GUS promedio observada para cada transformación se presenta en las Tablas 19 y 20 a continuación.
Tabla 19. Expresión de R0 GUS promedio en tejido de la raíz y la hoja.
- Secuencia EXP
- SEQ ID NO: Raíz V3 Raíz V4 Raíz V7 Raíz VT Hoja V3 Hoja V4 Hoja V7 Hoja VT
- EXP-AGRne.Ubq1:1:7
- 1 16 25 14 49 60 48
- EXP-AGRne.Ubq1:1:8
- 5 13 20 22 38 38 52
- EXP-ARUdo.Ubq1:1:8
- 13 18 34 89 117 48 106
- EXP-ARUdo.Ubq1:1:9
- 18 19 20 68 105 33 69
- EXP-ARUdo.Ubq2:1:8
- 27 14 19 27 58 57 47
- EXP-ARUdo.Ubq2:1:9
- 30 14 15 25 40 38 40
- EXP-BOUgr.Ubq1:1:6
- 38 12 28 16 43 46 27
- EXP-BOUgr.Ubq1:1:7
- 41 14 24 114 51 48 48
- EXP-BOUgr.Ubq2:1:14
- 52 17 13 28 46 33 41
- EXP-BOUgr.Ubq2:1:15
- 55 11 67 36 86 72 36
- EXP-MISsi.Ubq1:1:7
- 76 17 28 13 18 12 18
- EXP-SORnu.Ubq1:1:6
- 92 14 45 33 44 64 55
- EXP-SORnu.Ubq1:1:7
- 95 11 18 20 31 36 48
- EXP-SETit.Ubq1:1:10
- 99 0 29 57 58 37 46
- EXP-Sv.Ubq1:1:11
- 114 nd nd 9 20 55 29
- EXP-Sv.Ubq1:1:12
- 120 63 0 28 184 27 16
- EXP-Zm.UbqM1:1:10
- 126 0 237 18 221 272 272
- EXP-Zm.UbqM1:1:12
- 132 0 21 43 234 231 196
- EXP-Zm.UbqM1:1:11
- 138 124 103 112 311 369 297
- EXP-Sb.Ubq4:1:2
- 140 125 0 95 233 150 88
- EXP-Sb.Ubq6:1:3
- 148 154 13 128 53 39 55
- EXP-Sb.Ubq7:1:2
- 150 37 22 18 165 89 177
- EXP-Cl.Ubq10
- 168 61 67 32 111 58 115
40
Tabla 20. Expresión de R0 GUS promedio en los órganos reproductivos de maíz (antera, estigma) y semillasen desarrollo (embrión y endospermo).
- Secuencia EXP
- SEQ ID NO: Antera VT Estigma VT/R1 Embrión 21 DAP Endospermo 21 DAP
- EXP-AGRne.Ubq1:1:7
- 1 149 36 59 59
- EXP-AGRne.Ubq1:1:8
- 5 73 66 33 58
- EXP-ARUdo.Ubq1:1:8
- 13 321 253 177 355
- EXP-ARUdo.Ubq1:1:9
- 18 242 268 97 266
- EXP-ARUdo.Ubq2:1:8
- 27 104 99 79 157
- EXP-ARUdo.Ubq2:1:9
- 30 78 71 82 139
- EXP-BOUgr.Ubq1:1:6
- 38 58 250 43 63
- EXP-BOUgr.Ubq1:1:7
- 41 58 77 40 49
- EXPBOUgr.Ubq2:1:14
- 52 236 377 48 137
- EXPBOUgr.Ubq2:1:15
- 55 203 134 47 180
- EXP-MISsi.Ubq1:1:7
- 76 24 16 29 32
- EXP-SORnu.Ubq1:1:6
- 92 361 80 37 94
- EXP-SORnu.Ubq1:1:7
- 95 195 114 20 55
- EXP-SETit.Ubq1:1:10
- 99 132 85 50 63
- EXP-Sv.Ubq1:1:11
- 114 217 3 45 92
- EXP-Sv.Ubq1:1:12
- 120 120 21 49 112
- EXP-Zm.UbqM1:1:10
- 126 261 506 403 376
- EXP-Zm.UbqM1:1:12
- 132 775 362 253 247
- EXP-Zm.UbqM1:1:11
- 138 551 452 234 302
- EXP-Sb.Ubq4:1:2
- 140 213 0 25 79
- EXP-Sb.Ubq6:1:3
- 148 295 87 51 61
- EXP-Sb.Ubq7:1:2
- 150 423 229 274 90
- EXP-Cl.Ubq10
- 168 237 82 91 210
41
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-
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