BR102014033091A2

BR102014033091A2 - promotores de ubiquitina de milho

Info

Publication number: BR102014033091A2
Application number: BR102014033091A
Authority: BR
Inventors: Diaa Alabed; Doug A Smith; Manju Gupta; Sandeep Kumar; Susan M Jayne; Terry R Wright
Original assignee: Dow Agrosciences Llc
Priority date: 2013-12-31
Filing date: 2014-12-30
Publication date: 2015-11-24
Also published as: TW201527315A; RU2016131302A; CN106029882A; UY35929A; EP3090046A4; AU2014373769B2; AU2014373769A1; CA2935381A1; JP2017500875A; PH12016501293A1; WO2015103351A1; AP2016009335A0; MX2016008756A; EP3090046A1; MX362667B; KR20160099103A; CL2016001660A1; RU2016131302A3; US20150184180A1; IL246514A0

Abstract

promotores de ubiquitina de milho. o promotor de zea mays c.v. b73 ubiquitin-1 (z. mays c.v. b73 ubi-1) regula os níveis elevados de expressão de transgene constitutiva em plantas. o uso repetitivo do mesmo promotor de z.mays c.v. b73 ubi-1 em construções de múltiplos sarampo pode também induzir ao silenciamento de gene, desse modo fabricando produtos transgênicos menos eficazes. são fornecidos elementos de promotor regulatório de gene, construções e métodos para expressão de um transgene em células de planta e/ou tecido de plantas usando elementos regulatórios de gene do promotor de ubi-1 de um genótipo diferente de z. mays, z. mays c.v. lln37.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "PROMOTORES DE UBIQUITINA DE MILHO". REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS. [001] Este Pedido reivindica o benefício sob 35 USC § 119(e) do Pedido Provisório dos Estados Unidos n° de série 61/922.525, depositado em 31 de Dezembro de 2013, a descrição completa dos quais é incorporada aqui por referência.

CAMPO DA INVENÇÃO [002] Esta invenção está geralmente relacionada ao campo de biologia molecular de planta, e mais especificamente, ao campo de expressão de transgenes em plantas.

ANTECEDENTES [003] Muitas espécies de planta são capazes de ser transformadas com transgenes para introduzir traços ou características agrono-micamente desejáveis. Espécies de planta são desenvolvidas e/ou modificadas para terem traços desejáveis particulares. Geralmente, traços desejáveis incluem, por exemplo, a melhora da qualidade do valor nutricional, aumento da produção, conferência de resistência à peste ou doença, aumento de tolerância à estiagem e estresse, melhora das qualidades de horticulturas (por exemplo, pigmentação e cultivo), conferência de resistência ao herbicida, permissão da produção de compostos e/ou materiais industrialmente úteis da planta, e/ou permissão da produção de produtos farmacêuticos. [004] Espécies de planta transgênicas compreendendo múltiplos transgenes empilhados em um local genômico são produzidas por meio de tecnologias de transformação de planta. As tecnologias de transformação de planta resultam na introdução de um transgene em uma célula de planta, recuperação de uma planta transgênica que contém a cópia estavelmente integrada do transgene no genoma de planta, e expressão de transgene subsequente por meio de transcrição e translação do genoma de planta resulta em plantas transgênicas que possuem traços e fenótipos desejáveis. Entretanto, mecanismos que permitem a produção de espécie de planta transgênica altamente expressar os múltiplos transgenes criados como pilha de traço, são desejáveis. [005] Igualmente, mecanismos que permitem a expressão de um transgene dentro dos tecidos ou órgãos particulares de uma planta são desejáveis. Por exemplo, a resistência aumentada de uma planta à infecção por patógenos originados do solo pode ser realizada por transformação de genoma de planta com um gene de resistência ao patógeno de modo que a proteína de resistência a patógeno seja ro-bustamente expressa dentro das raízes da planta. Alternativamente, pode ser desejável expressar um transgene em tecido de plantas que estão em uma fase de crescimento e desenvolvimento particular tal como, por exemplo, divisão ou alongamento de célula. [006] São descritos aqui, elementos regulatórios de promotor de Ubi-1 de Zea mays incluindo promotores, promotores a montante, 5’-UTRs, e íntrons. São também descritos construções e métodos que utilizam os elementos regulatórios de gene.

SUMÁRIO [007] São descritos aqui, promotores, construções, e métodos para expressão de um transgene em células de planta, e/ou tecido de plantas. Em uma modalidade, expressão de um transgene compreende o uso de um promotor. Em uma modalidade, um promotor compreende uma sequência de polinucleotídeo. Em uma modalidade, uma sequência de polinucleotídeo promotor compreende um promotor a jusante, uma região não transladada 5’ (5’-UTR) ou sequência líder, e um íntron. Em uma modalidade, uma sequência de polinucleotídeo promotor compreende o gene Ubiquitina-1 (Ubi-1). Em uma modalidade, uma sequência de polinucleotídeo promotor compreende o gene Ubi-1 de Zea mays (Z. mays). [008] Em uma modalidade, uma construção inclui um cassete de expressão de gene compreendendo uma sequência de polinucleotídeo promotora que foi obtida do gene Ubi-1 de Z. mays. Em uma modalidade, a sequência de polinucleotídeo promotora de Ubi-1 de Z. mays compreende uma região promotora a montante, 5’-UTR ou sequências líderes, e um íntron. Em uma modalidade, uma construção inclui um cassete de expressão de gene compreendendo uma sequência de polinucleotídeo promotora obtida de gene de Ubi-1 de Z. mays a um íntron do gene que codifica Proteína Fluorescente Amarelo da espécie Phialidium (ΡΛ/YFP). Em uma modalidade, uma construção inclui um cassete de expressão de gene compreendendo uma sequência de polinucleotídeo promotora obtida de gene de Ubi-1 de Z. mays fundida com um íntron do gene que codifica a Proteína Fluorescente Amarelo da espécie Phialidium (P/7/YFP), seguido por uma região não transladada 3’ (3’-UTR) do gene de peroxidase 5 de Z. mays. (ZmPer5). A sequência de polinucleotídeo resultante compreende um novo elemento regulador de gene promotor. [009] Em uma modalidade, um cassete de expressão de gene inclui um elemento regulador promotor de gene operavelmente ligado a um transgene ou uma sequência de codificação heteróloga. Em uma modalidade, um cassete de expressão de gene inclui pelo menos um, dois, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez, ou mais transge-nes. [0010] Os métodos de desenvolver plantas que expressam um transgene usando elementos reguladores promotores de gene novos (por exemplo, um promotor a montante, 5’-UTR, e íntron) são descritos aqui. Os métodos de cultura de tecidos de plantas e células que expressam um transgene usando o novo elemento regulador de promotor de gene são também descritos aqui. Em uma modalidade, os mé- todos como descrito aqui incluem expressão de gene constitutiva em folhas de planta, raízes, calos, e pólen. Os métodos de purificação de uma sequência de polinucleotídeo compreendendo o novo elemento regulador de promotor de gene são também descritos aqui.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS [0011] A figura 1 mostra um novo promotor esquemático compreendendo o gene de Ubi-1 B73 de Zea mays c.v. O promotor é compreendido de um elemento a montante, um 5’-UTR ou sequência líder, e um íntron. O elemento a montante é localizado em 5’ a montante do Sítio de Partida de Transcrição (TSS), indicado pela seta longa. O elemento a montante é compreendido de elementos reguladores, tal como uma caixa de TATA, indicada pela seta curta, e um elemento de choque térmico, indicado pela estrela. [0012] A figura 2 mostra o mapa do plasmídeo para o vetor pDAB105714 compreendendo a sequência promotora amplificada por PCR de Gene de Ubi-1 LLN37 de Z. mays c.v. [0013] A figura 3 mostra a sequência de polinucleotídeo de promotor de controle de Ubi-1 B73 de Z. mays c.v. (SEQ ID NO: 1) com a região de promotor a montante sublinhada, um 5’-UTR/sequência líder modelada, e a região de íntron em letra minúscula. [0014] A figura 4 mostra a sequência de polinucleotídeo de promotor de Ubi-1 LLN37 de Z. mays c.v. (SEQ ID NO: 2) com a região do promotor a montante sublinhada, um 5’-UTR/sequência líder modelada, e a região de íntron em letra minúscula. [0015] A figura 5 mostra o alinhamento de sequência de polinucleotídeo das regiões do promotor a montante de LLN37 de Z. mays c.v. (SEQ ID NO: 4) comparado com a sequência de promotor a montante de controle B73 de Z. mays c.v. (SEQ ID NO: 3).

[0016] A figura 6 mostra o alinhamento de sequência de polinucleotídeo das regiões de 5’-UTR/líder de LLN37 de Z. mays c.v. (SEQ ID NO: 6) comparada com a sequência de 5’-UTR/líder de controle B73 de Z. mays c.v. (SEQ ID NO: 5). [0017] A figura 7 mostra o alinhamento de sequência de polinu-cleotídeo das regiões de íntron de LLN37 de Z. mays c.v. (SEQ ID NO: 8) em comparação com a sequência de íntron de controle B73 de Z. mays c.v. (SEQ ID NO: 7). [0018] A figura 8 mostra um mapa de vetor de construção de expressão binária, pDAB105748, compreendendo o vetor de entrada de controle, pDAB105742 (B73 de Z. mays c.v.), inserido no vetor de destino, pDAB10197. [0019] A figura 9 mostra um mapa de vetor de construção de expressão binária, pDAB105747, compreendendo o vetor de entrada, pDAB105741 (Z. mays c.v. LLN37), inserido no vetor de destino, PDAB10197. [0020] A figura 10 mostra a expressão de gene PhiYFP em calos de planta T0 para as construções de expressão binária pDAB105748 (Z. mays c.v. B73) e pDAB 105747 (Z. mays c.v. LLN37). [0021] A figura 11 mostra a expressão de gene PhiYFP em pólen de planta T-ι para construções de expressão binária pDAB105748 (Z. mays c.v. B73), pDAB 105747 (Z. mays c.v. LLN37), e um controle negativo. DESCRIÇÃO DETALHADA Definições [0022] Como usado aqui, os artigos "um/uma (a)", "um/uma (an)", e "o/a (the)" incluem referência de plural a menos que o contexto claramente e inequivocamente dite de outra forma. [0023] Como usado aqui, o termo "retrocruzamento" refere-se a um processo em que um criador cruza a progênie híbrida de volta para uma das origens, por exemplo, um primeiro F1 híbrido de geração com um dos genótipos origem do F1 híbrido. [0024] Como usado aqui, o termo "íntron" refere-se a qualquer sequência de ácido nucleico compreendida em um gene (ou sequência de nucleotídeo expressa de interesse) que é transcrito, porém não transladada. Os íntrons incluem sequência de ácido nucleico não transladada dentro de uma sequência expressa de DNA, bem como uma sequência correspondente em moléculas de RNA transcritas a partir da mesma. [0025] Uma construção descrita aqui pode também conter sequências que realçam a translação e/ou estabilidade de mRNA tais como íntrons. Um exemplo de tal íntron é o primeiro íntron de gene II da variante de histona H3 de Arabidopsis thaliana ou qualquer outra sequência de íntron geralmente conhecida. Os íntrons podem ser usados em combinação com uma sequência de promotor para realçar a translação e/ou estabilidade de mRNA. [0026] Como usado aqui, os termos "região não transladada 5’" ou "5’-UTR" referem-se a um segmento não trasladado no terminal 5’ de pré-mRNAs ou mRNAs maduros. Por exemplo, em mRNAs maduros, uma 5’-UTR tipicamente abriga em sua extremidade 5’ uma tampa de 7-metilguanosina e está envolvida em muitos processos tais como ligação, poliadenilação, exportação de mRNA para o citoplasma, identificação da extremidade 5’ do mRNA pela maquinaria translacional, e a proporção do mRNAs contra a degradação. [0027] Como usado aqui, o termo "região não transladada 3’" ou "3’-UTR" refere-se a um segmento não trasladado em um terminal 3’ dos pré-mRNAs ou mRNAs maduros. Por exemplo, em mRNAs maduros, esta região abriga a calda de poli-(A) e é conhecida por ter muitos papéis na estabilidade de mRNA, iniciação de translação, e exportação de mRNA. [0028] Como usado aqui, o termo "sinal de poliadenilação" refere-se a uma sequência de ácido nucleico presente nas transcrições de mRNA que permitem que as transcrições, quando na presença de uma poli-(A) polimerase, sejam poliadeniladas no sítio de adenilação, por exemplo, localizado 10 a 30 bases a jusante do sinal de poli-(A). Muitos sinais de poliadenilação são conhecidos na técnica e são úteis para a presente invenção. Uma sequência exemplar inclui AAUAAA e variantes da mesma, como descrito em Loke J., e outro, (2005) Plant Physiology 138(3); 1457-1468. [0029] Como usado aqui, o termo "isolado" refere-se a um componente biológico (incluindo uma proteína ou ácido nucleico) que foi separado de outros componentes biológicos na célula do organismo em que o componente de ocorrência natural (isto é, outro DNA cromos-sômico e extracromossômico). [0030] Como usado aqui, o termo "purificado" em referência a moléculas de ácido nucleico não requer pureza absoluta (tal como uma preparação homogênea). Em vez disso, "purificado" representa uma indicação de que a sequência é relativamente mais pura do que em seu ambiente celular nativo. Por exemplo, o nível "purificado" de ácidos nucleicos deve ser pelo menos 2 a 5 vezes maior em termos de concentração ou níveis de expressão de gene quando comparado com seu nível natural. [0031] As moléculas de DNA reivindicadas podem ser obtidas diretamente de DNA total ou de RN A total. Além disso, os clones de cDNA não são de ocorrência natural, porém, de preferência, são preferivelmente obtidos por meio de manipulação de uma substância de ocorrência natural parcialmente purificada (RNA mensageiro). A construção de uma biblioteca de cDNA a partir de mRNA envolve a criação de uma substância sintética (cDNA). Os clones de cDNA individuais podem ser purificados da biblioteca sintética por seleção clonal das células que transportam a biblioteca de DNA. Desse modo, o processo que inclui a construção de uma biblioteca de cDNA à partir de mRNA e pu- rificação de clones de cDNA distintos produz uma purificação de aproximadamente 106 vezes da mensagem nativa. Do mesmo modo, uma sequência de DNA promotora pode ser clonada em um plasmídeo. Tal clone não é de ocorrência natural, porém é, de preferência, obtido por meio de manipulação de uma substância de ocorrência natural parcialmente purificada, tal como uma biblioteca de DNA genômica. Desse modo, a purificação de pelo menos uma ordem de magnitude, preferivelmente duas ou três ordens, e mais preferivelmente quatro ou cinco ordens de magnitude, é favorecido nestas técnicas. [0032] Similarmente, a purificação representa uma indicação de que uma mudança química ou funcional na sequência de DNA ocorreu. As moléculas e proteínas de ácido nucleico que foram "purificadas" incluem moléculas e proteínas de ácido nucleico purificadas por métodos de purificação padrões. O termo "purificado" também abrange ácidos e proteínas de ácido nucleico preparadas por métodos de DNA recombinante em um célula hospedeira (por exemplo, células de planta), bem como moléculas, proteínas, e peptídeos de ácido nucleico quimicamente sintetizados. [0033] O termo "recombinante" significa uma célula ou organismo em que a recombinação genética ocorreu. Também inclui uma molécula (por exemplo, um vetor, plasmídeo, ácido nucleico, polipeptídeo, ou um RNA pequeno) que foi artificial mente ou sinteticamente (isto é, não naturalmente) alterada por intervenção humana. A alteração pode ser realizada na molécula dentro de, ou removida de, seu ambiente ou estado natural. [0034] Como usado aqui, o termo "expressão" refere-se ao processo pelo qual um polinucleotídeo é transcrito no mRNA (incluindo moléculas de RNA pequenas) e/ou o processo pelo qual o mRNA transcrito (também referido como "transcrição") é subsequentemente transladada em peptídeos, polipeptídeos, ou proteínas. A expressão de gene pode ser influenciada por sinais externos, por exemplo, exposição de uma célula, tecido ou organismo a um agente que aumenta ou diminui a expressão de gene. A expressão de um gene pode também ser regulada a qualquer momento na série de reações de DNA para RNA ara proteína. A regulação da expressão de gene ocorre, por exemplo, por meio de controles agindo em transcrição, translação, transporte e processamento de RNA, degradação de moléculas intermediárias, tal como mRNA, ou através da ativação, inativação, com-partimentalização, ou degradação de moléculas de proteína específicas após elas serem feitas, ou por combinações dos mesmos. A expressão de gene pode ser medida no nível de RNA ou no nível de proteína por qualquer método conhecido na técnica, incluindo, sem limitação, Northern blot, RT-PCR, Western blot, ou ensaio(s) de atividade de proteína in vitro, in situ, ou in vivo. [0035] Como usado aqui, os termos "silenciamento de gene baseado em homologia" ou "HBGS" são formas genéricas que incluem tanto silenciamento de gene transcricional quanto o silenciamento de gene pós-transcricional. O silenciamento de um local alvo por um local de silenciamento não ligado pode resultar na inibição de transcrição (por exemplo, silenciamento de gene transcricional; TGS) ou degradação de mRNA (por exemplo, silenciamento de gene pós-transcricional; PTGS), devido à produção de RNA de filamento duplo (dsRNA) que corresponde às sequências promotoras ou transcritas, respectivamente. O envolvimento de componentes celulares distintos em cada processo sugere que PTGS e TGS induzidos por dsRNA igualmente resultem na diversificação de um antigo mecanismo comum. Entretanto, uma comparação rigorosa de TGS e PTGS tem sido difícil de obter, porque ela geralmente conta com a análise de locais de silenciamento distintos. Um único local de transgene pode ser descrito para ativar tanto TGS quanto PTGS, devido à produção de dsRNA que corres- ponde às sequências promotoras e transcritas de genes alvo diferentes. [0036] Como usado aqui, os termos "molécula de ácido nucleico", "ácido nucleico" ou "polinucleotídeo" (todos os três termos sendo sinônimos um com o outro) referem-se a uma forma polimérica de nucleo-tídeos, que podem incluir ambos os filamentos de sentido e de antis-sentido de RNA, cDNA, DNA genômico, e formas sintéticas, e polímeros misturados dos mesmos. Um "nucleotídeo" pode referir-se a um ribonucleotídeo, desoxirribonucleotídeo, ou uma forma modificada de qualquer tipo de nucleotídeo. Uma molécula de ácido nucleico é geralmente pelo menos dez bases de comprimento, a menos que de outro modo especificado. Os termos podem referir-se a uma molécula de RNA ou DNA de comprimento indeterminado. Os termos incluem formas de filamento único e duplo de DNA. Uma molécula de ácido nucleico pode incluir um ou ambos os nucleotídeos modificados e de ocorrência natural ligados entre si por ligações de nucleotídeo de ocorrência natural e/ou ocorrência não natural. [0037] As moléculas de ácido nucleico podem ser modificadas quimicamente ou bioquimicamente, ou podem conter bases de nucleotídeo não naturais ou derivadas, como será facilmente apreciado por aqueles versados na técnica. Tais modificações incluem, por exemplo, rótulos, metilação, substituição de um ou mais dos nucleotídeos de ocorrência natural com um análogo, modificações de internucleotídeo (por exemplo, ligações não carregadas, tais como fosfonatos de meti-la, fosfotriésteres, fosforamidatos, carbamatos, etc.; ligações carregadas, tais como fosforotioatos, fosforoditioatos, etc.; porções pendentes, tais como peptídeos; intercaladores, tais como acridina, psoraleno, etc.; quelantes; alquiladores; e ligações modificadas, tais como ácidos nucleicos alfa-anoméricos, etc.). O termo "molécula de ácido nucleico" também inclui qualquer conformação topológica, incluindo conforma- ções de filamento único, de filamento duplo, parcialmente duplicado, triplicado, em forma de grampo de cabelo, circular, e fechadas com cadeado. [0038] A transcrição prossegue de uma maneira de 5’ para 3’ ao longo de um filamento de DNA. Isto significa que o RNA é feito por adição sequencial de ribonucleotídeo-5’-trifosfatos ao terminal 3’ da cadeia de crescimento com uma eliminação requisito do pirofosfato. Em qualquer molécula de ácido nucleico linear ou circular, os elementos discretos (por exemplo, sequências de nucleotídeo particulares) podem ser referidos como sendo "a montante" em relação a um outro elemento se ele forem ligados ou puderem ser ligados ao mesmo ácido nucleico na direção 5’ daquele elemento. Similarmente, os elementos discretos podem ser referidos como sendo "a jusante" em relação a um outro elemento se eles forem ou puderem ser ligados ao mesmo ácido nucleico na direção 3’ daquele elemento. [0039] Como usado aqui, o termo "posição base" refere-se ao local de uma determinada base ou resíduo de nucleotídeo dentro de um ácido nucleico designado. Um ácido nucleico designado pode ser definido por alinhamento com um ácido nucleico de referência. [0040] Como usado aqui, o termo "hibridização" refere-se a um processo onde oligonucleotídeos e seus análogos hibridizam por ligação de hidrogênio, que inclui Watson-Crick, Hoogsteen, ou ligação de hidrogênio Hoogsteen reversa, entre bases complementares. Geralmente, as moléculas de ácido nucleico consistem em bases nitrogena-das que são pirimidinas, tais como citosina (C), uracila (U), e timina (T), ou purinas, tais como adenina (A) e guanina (G). As bases nitro-genadas formam ligações de hidrogênio entre uma pirimidina e uma purina, e ligação de uma pirimidina a uma purina é referida como "em-parelhamento de base". Mais especificamente, A formará uma ligação de hidrogênio específica para T ou U, e G especificamente se ligará a C. "Complementar" refere-se ao emparelhamento de base que ocorre entre duas sequências de ácido nucleico distintas ou duas regiões da mesma sequência de ácido nucleico. [0041] Como usado aqui, os termos "especificamente hibridável" e "especificamente complementar" referem-se a um grau suficiente de complementaridade de tal forma que a ligação estável e específica ocorre entre um oligonucleotídeo e um DNA ou RNA alvo. Os oligonu-cleotídeos não precisam ser 100 % complementares à sequência alvo para, especificamente, se hibridizarem. Um oligonucleotídeo é especificamente hibridável quando a ligação do oligonucleotídeo à molécula de DNA ou RNA alvo interfere com a função normal do DNA ou RNA alvo, e há grau suficiente de complementaridade para evitar ligação não específica de um oligonucleotídeo às sequências não alvo sob condições onde a ligação específica é desejada, por exemplo, sob condições fisiológicas no caso de ensaios ou sistemas in vivo. Tal ligação é referida como hibridização específica. As condições de hibridi-zação que resultam em graus particulares de rigor variarão dependendo da natureza do método de hibridização escolhido e da composição e comprimento das sequências de ácido nucleico e a composição e comprimento das sequências de ácido nucleico que hibridam. Geralmente, a temperatura de hibridização e a força iônica (especialmente concentração de Na+ e/ou Mg2+) de um tampão de hibridização contribuirá com o rigor de hibridização, embora os tempos de lavagem também influencie o rigor. Os cálculos com respeito às condições de hibridização requeridas para atingir graus particulares de rigor são descritos em Sambrook, e outro, (edição), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a edição, volume 1 a 3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nova Iorque, 1989. [0042] Como usado aqui, o termo "condições rigorosas" abrange condições sob as quais a hibridização apenas ocorrerá se existir me- nos do que 50 % de pareamento incorreto entre a molécula de hibridi-zação e o DNA alvo. "Condições rigorosas" incluem outros níveis particulares de rigor. Desse modo, como usado aqui, as condições de "rigor moderado" são aquelas sob as quais as moléculas com mais de 50 % de desequilíbrio de sequência não se hibridizarão; as condições de "alto rigor" são aquelas sob as quais as sequências com mais do que 20 % de pareamento incorreto não se hibridizarão; e condições de "muito alto rigor" são aquelas sob as quais as sequências com mais do que 10 % de pareamento incorreto não se hibridizarão. [0043] Em modalidades particulares, as condições rigorosas podem incluir hibridização a 65Ό, seguida por lavage ns a 65Ό com 0,1x SSC/0,1 % de SDS durante 40 minutos. Os seguintes são condições de hibridização não limitantes, representativas: [0044] Muito alto rigor: Hibridização em tampão de 5x SSC a 65Ό durante 16 horas; lavagem de duas vezes em tampão de 2x SSC em temperatura ambiente durante 15 minutos cada; e lavagem duas vezes em tampão de 0,5x SSC a 65Ό durante 20 minutos cad a. [0045] Alto rigor: Hibridização em tampão de 5-6x SSC a 65 a 70Ό durante 16 a 20 horas; lavagem duas vezes em tampão de 2x SSC em temperatura ambiente durante 5 a 20 minutos cada; e lavagem duas vezes em tampão de 1x SSC a 55 a 70Ό dura nte 30 minutos cada. [0046] Rigor Moderado: hibridização em tampão de 6x SSC em temperatura ambiente a 55Ό durante 16 a 20 horas; lavagem pelo menos duas em tampão de 2 a 3x SSC em temperatura ambiente a 55Ό durante 20 a 30 minutos cada. [0047] Em uma modalidade, as moléculas de ácido nucleico especificamente hibridável podem permanecer ligadas sob condições de hibridização de muito alto rigor. Em uma modalidade, as moléculas de ácido nucleico especificamente hibridáveis podem permanecer ligadas sob condições de hibridização de alto rigor. Em uma modalidade, as moléculas de ácido nucleico especificamente hibridável podem permanecer ligadas sob condições de hibridização de rigor moderado. [0048] Como usado aqui, o termo "oiigonucleotídeo" refere-se a um polímero de ácido nucleico curto. Os oligonucleotídeos podem ser formados por divagem de segmentos de ácido nucleico mais longos ou polimerizando-se precursores de nucleotídeo individuais. Os sinteti-zadores automatizados permitem a síntese de oligonucleotídeos até várias centenas de pares de base no comprimento. Porque os oligonucleotídeos podem se ligar a uma sequência de nucleotídeo complementar, eles podem ser usados como sondas para detectar o DNA ou RNA. Os oligonucleotídeos compostos de DNA (oligodesoxirribonucle-otídeos) podem ser usados em Reação em Cadeia de Polimerase, uma técnica para a amplificação de sequências de DNA pequenas. Na Reação em Cadeia de Polimerase, um oiigonucleotídeo é tipicamente referido como um "iniciador" que permite um DNA polimerase para estender o oiigonucleotídeo e replicar o filamento complementar. [0049] Como usado aqui, os termos "Reação em Cadeia de Polimerase" ou "PCR" referem-se a um procedimento ou técnica em que as quantidades por minuto de ácido nucleico, RNA, e/ou DNA, são amplificadas como descrito na Patente dos Estados Unidos n° 4.683.195. Geralmente, a informação de sequência das extremidades da região de interesse ou além dela precisa estar disponível, de tal forma que os iniciadores de oiigonucleotídeo possam se planejadas. Os iniciadores de PCR serão idênticos ou similares na sequência a filamentos opostos do padrão de ácido nucleico a ser amplificado. Os nucleotídeos de terminal 5’ dos dois iniciadores podem coincidir com as extremidades do material amplificado. A PCR pode ser usada par amplificar as sequências de RNA ou sequências de DNA específicas a partir do DNA genômico total e cDNA transcrito a partir do RNA celular total, bacteriófago, ou sequências de plasmídeo, etc. Veja geralmente Mullis, e outro, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 51:263 (1987); Erlich, edição, PCR Technology, (Stockton Press, Nova Iorque 1989). [0050] Como usado aqui, o termo "iniciador" refere-se a um oligo-nucleotídeo capaz de agir como um ponto de iniciação de síntese ao longo de um filamento complementar quando as condições são adequadas para síntese de um produto de extensão de iniciador. As condições de sintetização incluem a presença de quarto trifosfatos de de-soxirribonucleotídeo diferentes (isto é, A,T,G, e C) e pelo menos um agente ou enzima de indução de polimerização tal como Transcriptase Reversa ou DNA polimerase. Estes reagentes estão tipicamente presentes em um tampão adequado que pode incluir constituintes que são cofatores ou que afetam as condições, tal como pH e similares em várias temperaturas adequadas. Um iniciador é preferivelmente uma sequência de filamento único, de tal forma que a eficácia de amplificação é otimizada, porém as sequências de filamento duplo podem ser utilizadas. [0051] Como usado aqui, o termo "sonda" refere-se a uma sequência de oligonucleotídeo ou polinucleotídeo que se hibridiza a uma sequência alvo. No procedimento de ensaio estilo TaqMan® ou TaqMan®, a sonda se hibridiza em uma porção do alvo situado entre o sítio de anelamento dos dois iniciadores. Uma sonda inclui cerca de oito nucleotídeos, cerca de dez nucleotídeos, cerca quinze nucleotí-deos, cerca vinte nucleotídeos, cerca trinta nucleotídeos, cerca quarenta nucleotídeos, ou cerca de cinquenta nucleotídeos. Em algumas modalidades, uma sonda includes de cerca de oito nucleotídeos a cerca de quinze nucleotídeos. [0052] No procedimento de ensaio de Southern blot, a sonda se hibridiza a um fragmento de DNA que é ligado a uma membrana. Uma sonda inclui cerca de dez nucleotídeos, cerca 100 nucleotídeos, cerca 250 nucleotídeos, cerca 500 nucleotídeos, cerca 1.000 nucleotídeos, cerca 2.500 nucleotídeos, ou cerca de 5.000 nucleotídeos. Em algumas modalidades, uma sonda includes de cerca de 500 nucleotídeos a cerca de 2.500 nucleotídeos. [0053] Uma sonda pode também incluir um rótulo detectável, tal como um rótulo radioativo, um rótulo biotinilado, um fluoróforo (por exemplo, Texas-Red®, isotiocianato de fluorosceína, etc.,). O rótulo detectável pode ser covalentemente ligado diretamente ao oligonu-cleotídeo sonda, de tal forma que o rótulo seja localizado na extremidade 5’ ou extremidade 3’ da sonda. Uma sonda compreendendo um fluoróforo pode incluir um corante extintor (por exemplo, Black Hole Quencher™, lowa Black™, etc.). [0054] Como usado aqui, os termos "identidade de sequência" ou "identidade" podem ser usados intercambiavelmente e se referem aos resíduos de ácido nucleico em duas sequências que são iguais quando alinhadas para correspondência máxima sobre uma janela de comparação especificada. [0055] Como usado aqui, o termo "porcentagem de identidade de sequência" ou "porcentagem de homologia de sequência" refere-se a um valor determinado comparando-se duas sequências idealmente alinhadas (por exemplo, sequências de ácido nucleico ou sequências de aminoácido) sobre uma janela de comparação, em que a porção de uma sequência na janela de comparação pode compreender adições, desequilíbrios, e/ou deleções (isto é, lacunas) quando comparada com uma sequência de referência para se obter alinhamento ideal das duas sequências. Uma porcentagem é calculada determinando-se as posições em que um ácido nucleico idêntico ou resíduo de aminoácido ocorre em ambas as sequências para produzir o membro de posições emparelhadas, dividindo o número de posições emparelhadas pelo número total de posições na janela de comparação, e multiplicando o resultado por 100 pra produzir a porcentagem de identidade de sequência. Os métodos para alinhamento de sequências para comparação são bem conhecidos. Vários programas de computador ou bioin-formáticos e algoritmos de alinhamento, tais como ClustalW e Se-quencher, são também bem conhecidos na técnica e/ou descritos em, por exemplo: Smith e Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2:482; Needleman e Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443; Pearson e Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sei. Estados Unidos da América 85:2444; Higgins e Sharp (1988) Gene 73:237-44; Higgins and Sharp (1989) CABIOS 5:151-3; Corpet, e outro, (1988) nucleico Acids Res. 16:10881-90; Huang, e outro, (1992) Comp. Appl. Biosci. 8:155-65; Pearson, e outro, (1994) Methods Mol. Biol. 24:307-31; Tatiana, e outros, (1999) FEMS Microbiol. Lett. 174:247-50. [0056] O Centro Nacional para Informação de Biotecnologia (NCBI) Basic Local Alignment Search Tool (BLAST™; Altschul, e outro, (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10) está disponível a partir de várias fontes, incluindo o Centro Nacional para Informação de Biotecnologia (Bethesda, MD), e na internet, para uso em conexão com vários programas de análise de sequência. Uma descrição de como determinar a identidade de sequência usando este programa está disponível na internet sob a sessão de "ajuda" para BLAST™. Para as comparações das sequências de ácido nucleico, uma função de "sequências de Blast 2" do programa BLAST™ (Blastn) pode ser empregada usando os parâmetros básicos. As sequências de ácido nucleico com similaridade ainda maior com as sequências de referência mostrarão aumento da identidade de porcentagem quando aliviadas por este método. [0057] Como usado aqui, o termo "operavelmente ligado" refere-se a um ácido nucleico colocado em um relacionamento funcional com outro ácido nucleico. Geralmente, "operavelmente ligado" pode significar que os ácidos nucleicos são contíguos. A ligação pode ser realiza- da por ligação em sítios de restrição convenientes. Se tais sítios não existem, adaptadores de oligonucleotídeo sintético ou ligadores são localizados ou anelados ao ácido nucleico e usados para ligar o fragmento de polinucleotídeo contíguo. Entretanto, os elementos não precisam ser contíguos para serem operavelmente ligados. [0058] Como usado aqui, o termo "promotor" refere-se a uma região de DNA que é geralmente localizada a jusante de um gene (isto é, em direção à extremidade 5’ de um gene) e é necessária para iniciar e conduzir a transcrição do gene. Um promotor pode permitir ativação ou repressão própria adequada de um gene que ele controla. Um promotor pode conter as sequências específicas que são reconhecidas por fatores de transcrição. Estes fatores podem se ligar a uma sequência de DNA promotora, o que resulta no recrutamento de RNA polimerase, uma enzima que sintetiza RNA a partir da região de codificação do gene. O promotor geralmente se refere a todos os elementos reguladores de gene localizados a jusante do gene, incluindo, 5’-UTR, íntrons, e sequências líder. [0059] Como usado aqui, o termo "promoter a montante" refere-se a uma sequência de polinucleotídeo contígua que é suficiente para iniciação direta de transcrição. Como usado aqui, um promotor a jusante abrange o sítio de iniciação de transcrição com vários motives de sequência, que incluem um TATA Box, sequência de iniciador (Intr), elementos de reconhecimento de TFIIB (BRE), e outros motives de promotor (Jennifer, E.F., e outro, (2002) Genes & Dev., 16: 2583-2592). O promotor a montante fornece o sítio de ação para RNA polimerase II, uma enzima de unidade múltipla com os fatores de transcrição basais ou gerais tipo TFIIA, B, D, E, F, e H. Estes fatores montam-se em um complexo de pré-iniciação de transcrição (PIC) que catalisa a síntese de RNA a partir de um padrão de DNA. [0060] A ativação do promotor a montante é realizada pela adição de elementos de sequência de DNA regulatórios aos quais várias proteínas se ligam e subsequentemente interagem com o complexo de iniciação de transcrição para ativar a expressão de gene. Estas sequências de elemento regulatório de gene interagem com fatores de ligação de DNA. Estes motivos de sequência podem algumas vezes ser referidos como elementos cis. Tais elementos cis, aos quais fatores de transcrição específicos de desenvolvimento ou específicos de tecido se ligam, individualmente ou em combinação, podem determinar o padrão de expressão espaço-temporal de um promotor no nível transcricional. Estes elementos cis variam amplamente no tipo de controle que eles exercem sobre os genes operavelmente ligados. Alguns elementos agem para aumentar a transcrição de genes operavelmente ligados em resposta às respostas ambientais (por exemplo, temperatura, umidade, e ferimento). Outros elementos cis podem responder a estímulos de desenvolvimento (por exemplo, germinação, maturação de semente, e florescimento) ou à informação espacial (por exemplo, especificidade de tecido). Veja, por exemplo, Langridge et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86:3219-23. Estes elementos cis estão localizados em uma distância variante transcrição. Alguns elementos cis (chamados elementos proximais) são adjacentes a uma região de promotor de núcleo mínimo, ao mesmo tempo em que outros elementos podem estar posicionadas diversas quilobases 5’ a montante ou 3’ a jusante do promotor (realçadores). [0061] Como usado aqui, o termo "transformação" abrange todas as técnicas em que uma molécula de ácido nucleico pode ser introduzida em uma célula. Exemplos incluem, porém não estão limitadas à: transfecção com vetores virais; transformação com vetores de plasmí-deo; eletroporação; lipofecção; microinjeção (Mueller et al. (1978) Cell 15:579-85); transferência mediada por Agrobacterium; captação de DNA direta DNA; transformação mediada por WHISKERS™; e bom- bardeamento de microprojétil. Estas técnicas podem ser usadas tanto para transformação estável quanto transformação transitória de uma célula de planta, "transformação estável" refere-se à introdução de um fragmento de ácido nucleico em um genoma de um organismo hospedeiro resultando em herança geneticamente estável. Uma vez esta-velmente transformado, o fragmento de ácido nucleico é estavelmente integrado no genoma do organismo hospedeiro e qualquer geração subsequente. Organismos hospedeiros contendo os fragmentos de ácido nucleico transformados são referidos como "organismos trans-gênicos". "Transformação transitória" refere-se à introdução de um fragmento de ácido nucleico no núcleo ou organela contendo DNA de um organismo hospedeiro, resultando em expressão de gene sem herança geneticamente estável. [0062] Como usado aqui, o termo "transduzir" refere-se a um processo, onde um vírus transfere ácido nucleico em uma célula. [0063] Como usado aqui, o termo "transgene" refere-se a uma sequência de ácido nucleico exógeno. Em um exemplo, um transgene é uma sequência de gene (por exemplo, um gene de resistência a herbicida), um gene codificando um composto industrialmente ou farmaceu-ticamente útil, ou um gene codificando um traço agrícola desejável. Ainda em outro exemplo, um transgene é uma sequência de ácido nucleico antissentido, em que expressão de a sequência de ácido nucleico antissentido inibe a expressão de uma sequência de ácido nucleico alvo. Um transgene pode conter sequências regulatórias operavelmen-te ligadas ao transgene (por exemplo, um promotor, íntron, 5’-UTR, ou 3’-UTR). Em algumas modalidades, um ácido nucleico de interesse é um transgene. Entretanto, em outras modalidades, um ácido nucleico de interesse é um ácido nucleico endógeno, em que as cópias genô-micas adicionais do ácido nucleico endógeno são desejadas, ou um ácido nucleico que está na orientação antissentido com respeito à se- quência de um ácido nucleico alvo em um organismo alvo. [0064] Como usado aqui, o termo "vetor" refere-se a uma molécula de ácido nucleico quando introduzida em uma célula, desse modo a produzindo uma célula transformada. Um vetor pode incluir sequências de ácido nucleico que o permite replicar-se na célula hospedeira, tal como uma origem de replicação. Exemplos incluem, porém não estão limitados a um plasmídeo, cosmídeo, bacteriófago, cromossoma artificial bacteriano (BAC), ou vírus que transporta DNA exógeno em uma célula. Um vetor pode também incluir um ou mais genes, moléculas antissentido, genes marcadores selecionáveis, e outros elementos conhecidos na técnica. Um vetor pode transduzir, transformar, ou infectar uma célula, desse modo fazendo a célula expressar proteínas e/ou moléculas de ácido nucleico codificadas pelo vetor. Um vetor pode opcionalmente incluir materiais para auxiliar na obtenção da entrada da molécula de ácido nucleico na célula (por exemplo, um lipossoma). [0065] Como usado aqui, os termos "cassete," "cassete de expressão," e "cassete de expressão de gene" referem-se a um segmento de DNA que pode ser inserido em um ácido nucleico ou polinucleo-tídeo em sítios de restrição específicos ou por recombinação homóloga. Um segmento de DNA compreende um polinucleotídeo contendo um gene de interesse que codifica um RNA pequeno ou um polipeptí-deo de interesse, e o cassete e sítios de restrição são designados para garantir a inserção do cassete na estrutura de leitura apropriada para transcrição e translação. Em uma modalidade, um cassete de expressão pode incluir um polinucleotídeo que codifica um RNA pequeno ou um polipeptídeo de interesse e pode ter elementos além do polinucleotídeo que facilita a transformação de uma célula hospedeira particular. Em uma modalidade, um cassete de expressão de gene pode também incluir elementos que provêem expressão realçada de um RNA pequeno ou um polinucleotídeo codificando um polipeptídeo de interesse em uma célula hospedeira. Estes elementos podem incluir, porém não estão limitados a: um promotor, um promotor mínimo, um realçador, um elemento de resposta, um íntron, a 5’-UTR, a 3’-UTR, uma sequência terminadora, uma sequência de poliadenilação, e similares. [0066] Como usado aqui, o termo "sequência de codificação hete-róloga" é usado para indicar qualquer polinucleotídeo que codifica, ou finalmente codifica, um peptídeo ou proteína ou sua sequência de aminoácido equivalente, por exemplo, uma enzima, que não está normalmente presente no organismo hospedeiro e pode ser expressa na célula hospedeira sob condições apropriadas. Como tal, "sequências de codificação heteróloga" podem incluir uma ou mais cópias de sequências de codificação que normalmente não estão presentes na célula hospedeira, de modo que a célula esteja expressando cópias adicionais de uma sequência de codificação que não estão normalmente presentes nas células. As sequências de codificação heteróloga podem ser RNA ou qualquer tipo do mesmo (por exemplo, mRNA), DNA ou qualquer tipo do mesmo (por exemplo, cDNA), ou um híbrido de RNA/DNA. Exemplos de sequências de codificação incluem, porém não estão limitados às unidades de transcrição de tamanho natural que compreendem tais características como a sequência de codificação, íntrons, regiões promotoras, 5’-UTR, 3’-UTR, e regiões realçado-ras. [0067] "Sequências de codificação heteróloga" também incluem a porção de codificação do peptídeo ou enzima (isto é, a sequência de cDNA ou mRNA), a porção de codificação da unidade transcricional de tamanho natural (isto é, o gene compreendendo íntrons e exons), sequências "otimizadas por códon", sequências truncadas ou outras formas de sequências alteradas que codificam a enzima ou codificam sua sequência de aminoácido equivalente, contanto que a sequência de aminoácido equivalente produza uma proteína funcional. Tais sequên- cias de aminoácido equivalentes podem ter uma deleção de um ou mais aminoácidos, com a deleção sendo de terminal N, terminal C ou interna. Formas truncadas são consideradas, contanto que elas tenham a capacidade catalítica indicada aqui. [0068] Como usado aqui, o termo "controle" refere-se a uma amostra usada em um procedimento catalítico para propósitos de comparação. Um controle pode ser "positivo" ou "negativo". Por exemplo, onde o propósito de um procedimento analítico é detector uma transcrição diferencialmente expressa ou polipeptídeo em células ou tecidos, é geralmente preferível usar um controle positivo, tal como uma amostra de uma planta conhecida que exibe a expressão desejada, e um controle negativo, tal como uma amostra de uma planta conhecida sem a expressão desejada. [0069] Como usado aqui, o termo "planta" inclui plantas e partes de plantas incluindo, porém não limitadas às células de planta e tecido de plantas, tais como folhas, calos, caules, raízes, flores, pólen, e sementes. Uma classe de plantas que pode ser usada na presente invenção é geralmente tão ampla quanto à classe de plantas maiores e menores acessíveis para mutagênese incluindo angiospérmicas, gim-nospérmicas, samambaias, e algas multicelulares. Desse modo, "planta" inclui plantas dicotiledôneas e monocotiledôneas. Exemplos de plantas dicotiledôneas incluem Tabaco, Arabidopsis, soja, tomate, papaia, canola, girassol, algodão, alfafa, batata, videira, guandu, ervilha Brassica, grão-de-bico, beterraba açucareira semente de colza, melancia, melão, pimenta, amendoim, pepino, rábano, espinafre, abóbora, brócolis, repolho, cenoura, couve-flor, aipo, couve chinesa, pepino, berinjela, e alface. Exemplos de plantas monocotiledôneas incluem milho, arroz, trigo, cana-de-açúcar, cevada, centeio, sorgo, orquídeas, bambu, banana, cattails, lírios, aveia, cebola, milho miúdo, e tríticale. [0070] Como usado aqui, o termo "material de planta" refere-se às folhas, calos, caules, raízes, flores ou partes de flores, frutas, pólen, células ovos, zigotos, sementes, incisões, culturas de célula ou tecido, ou qualquer outra parte ou produto de uma planta. Em uma modalidade, material de planta inclui cotilédone e folha. Em uma modalidade, material de planta inclui tecidos de raiz e outros tecidos de planta localizados subsolo. [0071] Como usado aqui, o termo "gene marcador selecionável" refere-se a um gene que é opcionalmente usado em transformação de planta, por exemplo, para proteger as células de planta de um agente seletivo ou fornecer resistência/tolerância. Além disso, "genes marcadores selecionáveis" destina-se abranger genes repórteres. Apenas aquelas células ou plantas que recebem um marcador selecionável funcional são capazes de dividir-se ou crescer sob condições tendo um agente seletivo. Exemplos de agentes seletivos podem incluir, por exemplo, antibióticos, incluindo espectinomicina, neomicina, canamici-na, paromomicina, gentamicina, e higromicina. Estes marcadores selecionáveis incluem neomicina fosfotransferase (npt II), que expressa uma enzima conferindo resistência ao antibiótico canamicina, e genes para os antibióticos relacionados neomicina, paromomicina, gentamicina, e G418, ou o gene para higromicina fosfotransferase (hpt), que expressa uma enzima conferindo resistência à higromicina. Outros genes marcadores selecionáveis podem incluir genes codificando resistência a herbicida incluindo bar ou pat (resistência contra amônio de glufosinato ou fosfinotricina), acetolactato synthase (ALS, resistência contra inibidores tais como sulfonilureias (SUs), imidazolinonas (IMIs), triazolopirimidinas (TPs), oxibenzoatos de pirimidinila (POBs), e sulfo-nilamino carbonil triazolinonas que impedem a primeira etapa na síntese dos aminoácidos de cadeia ramificada), glifosato, 2,4-D, e resistência ou sensibilidade de metal. Exemplos de "genes repórteres" que podem ser usados como um gene marcador selecionável, incluem a ob- servação visual de proteínas de gene repórter expressas, tais como proteínas codificando β-glicuronidase (GUS), luciferase, proteína fluorescente verde (GFP), proteína fluorescente amarela (YFP), DsRed, β-galactosidase, cloranfenicol acetiltransferase (CAT), fosfatase alcalina, e similares. A frase "positivo de marcador" refere-se às plantas que foram transformadas para incluir um gene marcador selecionável. [0072] Como usado aqui, o termo "marcador selecionável" refere-se a um rótulo capaz de detecção, tal como, por exemplo, um radioisó-topo, composto fluorescente, composto bioluminescente, um composto quimioluminescente, quelante de metal, ou enzima. Exemplos de marcadores detectáveis incluem, porém não estão limitados aos seguintes: rótulos fluorescentes (por exemplo, FITC, rodamina, fósforo de lantanida), rótulos enzimáticos (por exemplo, rábano picante peroxida-se, β-galactosidase, luciferase, fosfatase alcalina), quimioluminescente, grupos biotinila, epítopos de polipeptídeo predeterminados reconhecidos por um repórter secundário (por exemplo, sequências de pares de zíper de leucina, sítios de ligação para anticorpos secundários, domínios de ligação de metal, rótulos de epítopo). Em uma modalidade, um marcador detectável pode ser ligado por ramificações espaça-doras de vários comprimentos para reduzir impedimento estérico potencial. [0073] Como usado aqui, o termo "detecção" é usado no sentido mais amplo para incluir tanto medidas qualitativas e quantitativas de uma molécula específica, por exemplo, medidas de um polipeptídeo específico. [0074] A menos que de outro modo especificamente explicado, todos os termos técnicos e científicos usados aqui têm o mesmo significado como comumente entendido por aqueles versados na técnica à qual esta invenção pertence. Definições de termos comuns em biologia molecular podem ser encontradas em, por exemplo: Lewin, Genes V, Oxford University Press, 1994; Kendrew et al. (eds.), The Enciclopédia of Molecular Biology, Blackwell Science Ltd., 1994; e Meyers (ed.), Molecular Biology e Biotechnology: A Comprehensive Desk Reference, VCH Publishers, Inc., 1995.

Promotores como Elementos Regulatórios de Expressão de Gene [0075] Promotores de planta usados para pesquisa básica ou aplicações biotecnológicas são geralmente não direcionais, direcionando a expressão constitutiva de um transgene que foi fundida em sua extremidade 3’ (a jusante). É frequentemente necessário expressar ro-bustamente transgenes dentro de plantas para engenharia metabólica e empilhamento de traço. Além disso, novos múltiplos promotores são tipicamente requeridos nas colheitas transgênicas para regular a expressão de múltiplos genes. É descrito aqui um promotor constitutivo que pode direcionar a expressão de um transgene que foi fundido em sua extremidade 3’. [0076] O desenvolvimento de produtos transgênicos tornando-se cada vez mais complexo, que requer robustamente expressar transgenes e transgenes de múltiplos empilhamentos em um local simples. Tradicionalmente, cada transgene requer um único promotor para expressão em que múltiplos promotores são requeridos para expressar diferentes transgenes dentro de um empilhamento de gene. Com um tamanho crescente de empilhamentos de gene, este método frequentemente induz ao uso repetido do mesmo promotor para obter níveis similares de padrões de expressão de diferentes transgenes para expressão de um traço poligênico simples. [0077] Construções de múltiplos genes pelo menos promotor são conhecidas por causarem o silenciamento de gene resultando em produtos transgênicos menos eficazes no campo. O excesso de sítios de ligação de fator de transcrição (TF) devido à replicação de promotor pode causar a depleção de TFs endógenos induzindo à inativação transcricional. O silenciamento de transgenes é provável afetar indese-javelmente o desempenho de uma planta transgênica produzida para expressar transgenes. Sequências repetitivas dentro de um transgene podem induzir a recombinação homóloga intralocal de gene resultando em redisposições de polinucleotídeo. [0078] Além dos promotores constitutivos, promotores específicos de tecido, ou específicos de órgão regulam a expressão de certos tecidos tais como no cerne, raiz, folha, calo, pólen, ou tapetum da planta. Promotores específicos de estágio de desenvolvimento e tecido regulam as expressões de genes, que são expressos em tecidos particulares ou em períodos de tempo particulares durante o desenvolvimento de planta. Promotores específicos de tecido são requeridos para certas aplicações em uma indústria de planta transgênica e são desejáveis quando eles permitem expressão específica de genes heterólogos em um tecido e/ou em estágios de desenvolvimento selecionados, indicando a expressão do gene heterólogo diferencialmente em vários órgãos, tecidos, e/ou em diferentes momentos, porém não outros. [0079] Por exemplo, resistência aumentada de uma planta à infecção por patógenos originados do solo pode ser realizada transformando o genoma de planta com um gene de resistência ao patógeno de modo que a proteína de resistência a patógeno seja robustamente expressa na planta. Alternativamente, pode ser desejável expressar um transgene nos tecido de plantas que estão em uma fase de crescimento ou desenvolvimento particular tal como, por exemplo, divisão ou alongamento celular. Outra aplicação é a desejabilidade de uso de promotores específicos de tecido, de modo que os promotores possam confinar a expressão dos transgenes codificando um traço agronômico no desenvolvimento de partes de planta (isto é, raízes, calos ou pólen). [0080] Os promotores descritos aqui são ferramentas promissoras para a fabricação de construções de transgene comerciais contendo múltiplos genes. Estes promotores também fornecem estabilidade estrutural em hospedeiros bacterianos e estabilidade funcional em células de planta, tal como redução de silenciamento de transgene, para garantir a expressão de transgene. Promotores com faixas de expressão variantes podem também ser obtidos empregando os métodos descritos aqui. Em comparação às construções de transgene que usam um promotor simples, múltiplas vezes, as construções de promotor diversificadas descritas neste pedido são mais compatíveis para análises moleculares a jusante de eventos transgênicos. O uso dos promotores diversificados descrito aqui pode também aliviar as redis-posições nos locais de multigene transgênico durante o alvejamento com tecnologia de dedo de zinco (Shukla et al. 2009).

Promotores de Ubiquitina-1 de Zea mays [0081] O promotor de Ubi-1 de Zea mays foi um padrão de indústria biotecnológica predominantemente usado para expressão transgê-nica elevada, estável em milho (Christensen e Quail 1996; Christensen et al. 1992; Toki et al. 1992). Cada transgene geralmente requer um promotor específico para expressão suficiente. Múltiplos promotores são tipicamente requeridos para expressar diferentes transgenes dentro de um empilhamento de gene. Este paradigma frequentemente induz ao uso repetitivo do promotor de Ubi-1 de Z. mays devido aos seus níveis elevados desejados de expressão de proteína e padrão de expressão constitutiva. [0082] Entretanto, a introdução de sequências repetitivas em um local transgênico pode também induzir a efeitos negativos indesejáveis em expressão e estabilidade de transgene (Fladung e Kumar 2002; Kumar e Fladung 2000a; Kumar e Fladung 2000b; Kumar e Fladung 2001a; Kumar e Fladung 2001b; Kumar e Fladung 2002; Mette et al. 1999; Mourrain et al. 2007). O desafio de expressão de transgene de múltiplas coordenadas pode ser tratado usando um método de diversidade de promotor, onde diferentes promotores são usados para regular diferentes transgenes com o mesmo perfil de expressão (Peremarti et a\. 2010). Este pedido descreve uma sequência de promotor de Ubi-1 diversificado obtida identificando e purificando o novo promotor de diferentes genótipos de Zea mays. [0083] A iniciação e modulação de transcrição de expressão de gene em genes de planta são direcionadas por uma variedade de elementos de sequência de DNA coletivamente chamados de um promotor. Promotores eucarióticos tipicamente consistem em um promotor de núcleo mínimo e sequências regulatórias a montante. O promotor núcleo é um estiramento mínimo de sequência de DNA contígua que é suficiente para direcionar a iniciação exata de transcrição. Núcleos promotores em plantas geralmente compreendem regiões canônicas associadas com a iniciação de transcrição, tais como caixas CAAT e TATA (sequência de consenso TATAWAW). O elemento caixa TATA está geralmente localizado aproximadamente 20 a 35 pares de base (bp) a montante do sítio de partida de transcrição (TSS). A ativação do promotor núcleo é realizada por sequências regulatórias a montante às quais várias proteínas se ligam e subsequentemente interagem com o complexo de iniciação de transcrição para ativar a expressão de gene. Estes elementos regulatórios compreendem sequências de DNA que determinam o padrão de expressão espaço-temporal de um promotor. [0084] Referindo-se à figura 1, o promotor de gene de Ubi-1 de Z. mays é derivado da linhagem celular inata de Z. mays B73. O promotor de Ubi-1 de Z. mays é compreendido de aproximadamente 895bp de sequência de DNA localizados 5’ a montante do TSS (isto é, o elemento a montante). Além disso, o promotor de Ubi-1 Z. mays é compreendido de cerca de 1093bp de sequência de DNA localizados 3’ a jusante do TSS (veja, Patente dos Estados Unidos n° 5.510.474). Des- se modo, o promotor de Ubi-1 de Z. mays é compreendido de aproximadamente 2 pares de quilobases (kb) de sequência de DNA DNA total. [0085] O elemento a montante do promotor de Ubi-1 Z. mays compreende uma caixa TATA localizada aproximadamente 30bp 5’ a montante do TSS (figuras 1 e 3). Além disso, o elemento a montante compreende dois elementos de consenso de choque térmico de sobreposição localizados imediatamente 5’ a montante do TSS. Um 5’-UTR de 82bp ou sequência líder está localizada imediatamente 3’ a jusante do TSS e é seguida por um íntron que se estende de base 83 a 1093 (figuras 1 e 3). [0086] O trabalho anterior descreveu a expressão aumentada de expressão de genes e/ou transgenes reguladas por promotor de Ubi-1 de Z. mays. Por exemplo, a fusão de transcrição do gene Cloranfenicol Acetiltransferase (CAT) ao promotor de Ubi-1 de Z. mays produziu um nível maior do que mais de 10 vezes de atividade de CAR em proto-plastos do que a expressão regulada pelo promotor de Vírus do Mosaico de Couve-flor 35S (Christensen e Quail 1996; Christensen et al. 1992). [0087] Além do promotor de Ubi-1 de Z. mays de controle, este pedido descreve um novo promotor de Ubi-1 de milho. Ao contrário, o promotor de Ubi-1 de controle derivado de genótipo de Z. mays c.v. B73, o novo promotor de Ubi-1 foi derivado de genótipo Z. mays c.v. LLN37. São fornecidos construções e métodos que usam um promotor de Ubi-1 de Z, mays compreendendo uma sequência de polinucleotí-deo. Em uma modalidade, um promotor pode compreender uma sequência de polinucleotídeo de gene Ubi-1 de Z. mays c.v. B73 como segue: GT GCAGCGT GACCCGGTCGT GCCCCT CT CTAGAGATAAT GAG-CATT GCAT GTCTAAGTTATAAAAAATTACCACATATTTTTTTT- GT CACACTT GTTT G AAGTGC AGTTT AT CT AT CTTT AT AC AT A-T ATTT AAACTTT ACT CT AC G AAT AAT AT AAT CT AT AGT ACT AC ΑΛΤ AAT AT C AGT GTTTT AG AG AAT C AT AT AAAT G AAC AGTT AG A-C AT G GTCT AAAG G AC AATT G AGTATTTT G AC AAC AG G ACT C-T AC AGTTTT AT CTTTTT AGT GTG C AT GTGTT CT C CTTTTTTTTT -G C AAAT AG CTT C AC CT AT AT AAT ACTT C AT C C ATTTT ATT AG -T AC AT C C ATTT AG G GTTTAG GGTTAATG GTTTTTATA-G ACT AATTTTTTT AGTAC AT CT ATTTT ATT C-T ATTTT AG C CT CT AAATT AAG AAAACT AAAACT CT ATTTT AG-TTTTTTT ATTT AAT AGTTT AG AT AT AAAAT AG AAT AAAA-T AAAGT G ACT AAAAATT AAAC AAAT AC C CTTT AA-GAAATTAAAAAAACTAAGGAAACATTTTTCTTGTTTCGAGTAGA-TAATGCCAGCCTGTTAAACGCCGTCGACGAGTCTAACGGACAC-CAACCAGCGAACCAGCAGCGTCGCGTCGGGCCAAGCGAA-GCAGACGGCACGGCATCTCTGTCGCTGCCTCTG-GACCCCTCTCGAGAGTTCCGCTCCACCGTTGGACTT -GCTCCGCTGTCGGCATCCAGAAATTGCGTGGCGGAGCGG-CAGACGTGAGCCGGCACGGCAGGCGGCCTCCTCCTCCTCTCAC-GGCACCGGCAGCTACGGGGGATTCCTTTCCCAC-CGCTCCTTCGCTTTCCCTTCCTCGCCCGCCGTAATAAATAGA-CACCCCCTCCACACCCTCTTTCCCCAACCTCGTGTTGTTCG-GAGCGCACACACACACAAC-CAGAT CTCCCCCAAAT CCACCCGT CGGCAC-CTCCGCTTCAAGGTAC- GCCGCTCGTCCTCCCCCCCCCCCCCCCTCTCTACCTTCTCTA-GATCGGCGTTCCGGTCCATGCATGGTTAGGGCCCGGTAGTTC-T ACTT CT GTT C AT GTTT GT GTT AG AT CCGT GTTT GT GTT A-GAT CCGTGCT GCT AGCGTTCGT ACACGGATGCGACCT GT AC-GTCAGACACGTT CT GATT GCTAACTTGCCAGT GTTT CT CTTTGGG-GAATCCTGGGATGGCTCTAGCCGTTCCGCAGACGGGATCGAT- TT C AT G ATTTTTTTT GTTTCGTT G C AT AG G GTTT G GTTT -GCCCTTTT CCTTT ATTT C AAT AT AT GCC GT GC ACTT GTTT -G TC G G GT C AT CTTTT C AT G CTTTTTTTT G TCTTG GTT-GTGATGATGTGGTCTGGTTGGGCGGTCGTTCTAGATCGGAG-T AG AATT CT GTTT C AAACT AC CT G GTG G ATTT ATT AATTTT -G G AT CT GTAT GTGTGT G CC AT AC AT ATT C AT AGTT AC G AATT G AA-G AT G AT G G AT G G AAAT AT C G AT CT AG G AT AG GTAT AC AT G TT-GATG C G G GTTTTACTG ATG C ATATAC AG AG ATG CTTTTT-GTTCGCTTGGTT GT GAT GAT GTGGT GTGGTT -GGGCGGTCGTTCATTCGTTCTAGATCGGAGTAGAA-TACTGTTTCAAACTACCTGGTGTATTTATTAATTTTGGAACTG-T AT GT GT GT GT CAT AC AT CTT C AT AGTT ACG AGTTT AA-G ATG G ATG G AAATATCG ATCTAG GATAG GTATAC ATGTT-GATGTGGGTTTTACTGATGCATATACATGATGGCATATGCAG-C AT CT ATT CAT ATG CTCT AAC CTT G AGT ACCT AT CT ATT AT AA-T AAAC AAGT AT GTTTT AT AATT ATTT C G AT CTT GAT AT ACTT -G GAT GAT G G CAT AT G C AG C AG CT AT AT GTG GAT - TACT GTTT CTTTT GT CGATGCT CACCCT GTT GTTT -GGTGTTACTTCTGCA (SEQ ID NO: 1) [0088] Em outra modalidade, um promotor pode compreender uma sequência de polinucleotídeo de Ubi-1 de Z. mays c.v. LLN37 gene como segue: GACCCGGTCGTGCCCCTCTCTAGAGATAATGAGCATT-G CAT GTCT AAGTT AT AAAAAATT AC C AC AT ATTTTTTTT GT C AC ACTT GTTT G AAGT G C AGTTT AT CT AT CTTT AT AC AT A-T ATTT AAACTTT ACT CT AC G AAT AAT AT AAT CT AT AGT ACT AC AA-T AAT AT C AGT GTTTT AG AG AAT CAT AT AAAT G AAC AGTT AG A-CAT GGT CT AAAGG ACAATT GAGTATTTT GACAACAGG ACT C-T AC AGTTTT AT CTTTTT AGT GTG CAT GTGTT CT C CTTTTTTTTT - GCAAAT AGCTT C ACCT AT AT AAT ACTT C AT CC ATTTT ATT AG- TACATCC ATTTAG G GTTTAG GGTTAATG GTTTTTATA- G ACT AATTTTTTT AGTAC AT CT ATTTT ATT C- T ATTTT AG C CT CT AAATT AAG AAAACT AAAACT CT ATTTT AG- TTTTTTT ATTT AAT AATTT AG AT AT AAAAT AG AAT AAAA- T AAAGT G ACT AAAAATT AAAC AAAT AC C CTTT AA- GAAATTAAAAAAACTAAGGAAACATTTTTCTTGTTTCGAGTAGA- TAATGCCAGCCTGTTAAACGCCGTCGACGAGTCTAACGGACAC- CAACCAGCGAACCAGCAGCGTCGCGTCGGGCCAAGCGAA- GCAGACGGCACGGCAT CT CT GT CGCTGCCTCT G- GACCCCTCTCGAGAGTTCCGCTCCACCGTTGGACTT - GCTCCGCTGTCGGCATCCAGAAATTGCGTGGCGGAGCGG- CAGACGTGAGCCGGCACGGCAGGCGGCCTCCTCCTCCTCTCAC- GGCACCGGCAGCTACGGGGGATTCCTTTCCCAC- CGCTCCTTCGCTTTCCCTTCCTCGCCCGCCGTAATAAATAGA- CACCCCCTCCACACCCTCTTTCCCCAACCTCGTGTTGTTCG- G AG C G C AC AC AC AC AC AAC- CAGATCTCCCCCAAATCCACCCGTCGGCAC- CTCCGCTTCAAGGTACGCCGCTCGTCCTCCCCCCCCCCCTCTC- TACCTTCTCTAGATCGGCGTTCCGGTCCATGGTTAGGGCCCGG- T AGTT CT ACTT CT GTT CAT GTTTGT GTT AG ATCCGT GTTT GT GTT A- GATCCGTGCTGCTAGCGTTCGTACACGGATGCGACCTGTAC- GTCAGACACGTTCTGATTGCTAACTTGCCAGTGTTTCTCTTTGGG- GAATCCTGGGATGGCTCTAGCCGTTCCGCAGACGGGATCGAT- TT CAT GATTTTTTTT GTTT CGTTGCATAGGGTTTGGTTT- G C C CTTTT C CTTT ATTT C AAT AT AT G C C GTG C ACTT GTTT - GTCGGGT CAT CTTTTCATGCTTTTTTTT GT CTT GGTT - GTGATGATGTGGTCTGGTTGGGCGGTCGTTCTAGATCGGAG- T AG AATT CT GTTT C AAACT ACCT G GTG G ATTT ATT AATTTT - G G AT CT GT AT GT GT GT G CC AT AC AT ATT CAT AGTT AC G AATT G AA- G AT G AT G G AT G G AAAT AT C G AT CT AG G AT AG GTAT AC AT G TT-GATG C G G GTTTTACTG ATG C ATATAC AG AG ATG CTTTTT-GTTCGCTTGGTTGTGATGATGTGGTGTGGTT-GGGCGGTCGTTCATTCGTTCTAGATCGGAGTAGAA-TACTGTTTCAAACTACCTGGTGTATTTATTAATTTTGGAACTG-T AT GT GT GT GT CAT AC AT CTT C AT AGTT ACG AGTTT AA-G ATG G ATG G AAATATCG ATCTAG GATAG GT AT AC AT GTT-GAT GT GG GTTTTACTG AT GC ATATAC AT GATGGCATAT GCAG-C AT CT ATT CAT AT G CT CT AAC CTT G AGT ACCT AT CT ATT AT AA-T AAAC AAGT AT GTTTT AT AATT ATTTT G AT CTT G AT AT ACTT -G G ATG ATG G CATATG C AG C AG CTATATGTG G AT- TACT GTTT CTTTT GT CGATGCT CACCCT GTT GTTT -GGTGTTACTTCTGCAG (SEQ ID NO: 2) [0089] Os promotores descritos aqui foram caracterizados por clonagem e análise de homologia de sequência de DNA subsequente para identificar regiões específicas do promotor (isto é, o promotor a montante, 5’-UTR, e regiões de íntron). São fornecidos métodos e construções usando um promotor de Ubi-1 de Z. mays constitutivo compreendendo sequências de polinucleotídeos de uma região de promotor a jusante, 5-UTR ou região líder, e um íntron para expressar os transgenes em plantas. Em uma modalidade, um promotor pode compreender um promotor a jusante sequência de polinucleotídeo de gene Ubi-1 de Z, mays c.v. B73 como segue: GTGCAGCGTGACCCGGTCGTGCCCCTCTCTAGAGATAATGAG- GT C AC ACTT GTTT G AAGT G C AGTTT AT CT AT CTTT AT AC AT A-T ATTT AAACTTT ACT CT AC G AAT AAT AT AAT CT AT AGT ACT AC AA-T AAT AT C AGT GTTTT AG AG AAT CAT AT AAAT G AAC AGTT AG A-CAT GGT CTAAAGGACAATT GAGTATTTT GACAACAGGACT C- T ACAGTTTT AT CTTTTT AGT GTGC AT GT GTT CTCCTTTTTTTTT -GCAAAT AGCTT CACCT AT AT AAT ACTT C AT CC ATTTT ATT AG-TACATCC ATTTAG G GTTTAG GGTTAATG GTTTTTATA-G ACT AATTTTTTT AGTAC AT CT ATTTT ATT C-T ATTTT AG C CT CT AAATT AAG AAAACT AAAACT CT ATTTT AG-TTTTTTT ATTT AAT AGTTT AG AT AT AAAAT AG AAT AAAA-T AAAGT GACT AAAAATT AAACAAAT ACCCTTT AA-GAAATTAAAAAAACTAAGGAAACATTTTTCTTGTTTCGAGTAGA-TAATGCCAGCCTGTTAAACGCCGTCGACGAGTCTAACGGACAC-CAACCAGCGAACCAGCAGCGTCGCGTCGGGCCAAGCGAA-GCAGACGGCACGGCAT CT CT GT CGCTGCCTCT G-GACCCCTCTCGAGAGTTCCGCTCCACCGTTGGACTT -GCTCCGCTGTCGGCATCCAGAAATTGCGTGGCGGAGCGG-CAGACGTGAGCCGGCACGGCAGGCGGCCTCCTCCTCCTCTCAC-GGCACCGGCAGCTACGGGGGATTCCTTTCCCAC-CGCTCCTTCGCTTTCCCTTCCTCGCCCGCCGTAATAAATAGA-CACCCCCTCCACACCCTCTT (SEQ ID NO: 3) [0090] Em outra modalidade, um promotor pode compreender um promotor a jusante sequência de polinucleotídeo de Ubi-1 de Z. mays c.v. LLN37 gene como segue: GACCCGGTCGTGCCCCTCTCTAGAGATAATGAGCATTGCATGTC-T AAGTT AT AAAAAATT ACC AC ATATTTTTTTT GT C AC ACTT G-TTT G AAG T G C AG TTT AT CT AT CTTT AT AC AT AT ATTT AAACTTT AC-TCT AC G AAT AAT AT AAT CT AT AGTACT AC AAT AAT AT C AGT GTTT -T AG AG AAT C AT AT AAAT G AAC AGTT AG AC AT G GT CT AAAG G AC AA-TT GAGTATTTT GACAACAGGACT CTACAGTTTTAT CTTTTTAGTG-T G C AT GT GTT CT C CTTTTTTTTT G C AAAT AG CTT CACCT AT AT AA-T ACTT C AT CC ATTTT ATT AGT AC AT C C ATTTAG G GTTTAG G G TTAA-T G GTTTTT AT AG ACT AATTTTTTT AGT AC AT CT ATTTT ATT CT ATTT -T AGCCT CT AAATT AAG AAAACT AAAACT CT ATTTT AGTTTTTTT ATT - Τ ΑΑΤ ΑΑΤΤΤ AG AT AT ΑΑΑΑΤ AG ΑΑΤ ΑΑΑΑΤAAAGT G ACT ΑΑΑΑΑΤ - TAAACAAATACCCTTTAAGAAATTAAAAAAACTAAGGAAACA- TTTTTCTTGTTTCGAGTAGATAATGCCAGCCTGTTAAACGCCG- TCGACGAGTCTAACGGACACCAACCAGCGAACCAGCAGCGTCG- CGTCGGGCCAAGCGAAGCAGACGGCACGGCATCTCTGTCGCTG- CCT CTGGACCCCT CTCGAGAGTT CCGCTCCACCGTTGGACTT G- CTCCGCTGTCGGCATCCAGAAATTGCGTGGCGGAGCGGCAGA- CGTGAGCCGGCACGGCAGGCGGCCTCCTCCTCCTCTCACGG- CACCGGCAGCTACGGGGGATTCCTTTCCCACCGCTCCTTCG- CTTTCCCTTCCTCGCCCGCCGTAATAAATAGACACCCCCTCCA- CACCCTCTT (SEQ ID ΝΟ: 4) Elementos Regulatórios de Gene Adicional [0091] A expressão de transgene pode também ser regulada por uma região 5’-UTR e/ou íntron localizada 3’ a jusante da sequência de promotor a montante. Um promotor compreendendo uma região de promotor a jusante operavelmente ligada a um 5’-UTR e/ou íntron pode regular a expressão de transgene. Ao mesmo tempo em que um promotor a jusante é necessário para regular a transcrição, a presença de um 5’-UTR e/ou íntron pode aumentar os níveis de expressão resultando na produção de mais transcrições de mRNA para translação e síntese de proteína, A adição de um 5’-UTR e/ou íntron a uma sequência de polinucleotídeo de promotor a jusante pode auxiliar na expressão estável de um transgene. [0092] Além disso, um promotor constitutivo compreendendo um promotor a montante de sequência de polinucleotídeo pode ser seguido por um 5-UTR ou região líder para auxiliar na expressão de trans-genes em plantas. Em uma modalidade, um promotor pode compreender a 5’-UTR ou sequência líder de polinucleotídeo de gene Ubi-1 de Z. mays c.v. B73 Ubi-1 como segue: TCCCCAACCTCGTGTTGTTCGGAGCGCACACACACACAAC- CAGATCTCCCCCAAATCCACCCGTCGGCACCTCCGCTTCAAG (SEQ ID NO: 5) [0093] Em outra modalidade, um promotor pode compreender uma sequência líder ou 5’-UTR de polinucleotídeo de gene Ubi-1 de Z. ma-ys c.v. LLN37 como segue: TCCCCAACCTCGTGTTGTTCGGAGCGCACACACACACAAC-CAG AT CTCCCCCAAAT CCACCCGT CGGCACCT CCGCTT CAAG (SEQ ID NO: 6) [0094] Além disso, um promotor constitutivo compreendendo um promotor a jusante de sequência de polinucleotídeo seguido por uma região líder ou 5-UTR, pode também ser seguido por um íntron para auxiliar na expressão de transgenes em plantas. Em uma modalidade, um promotor pode compreender um uma sequência de polinucleotídeo intrônica de gene Ubi-1 de Z. mays c.v. B73 como segue: GTACGCCGCTCGTCCTCCCCCCCCCCCCCCCTCTCTAC-CTTCTCTAGATCGGCGTTCCGGTCCATGCATGGTTAGGGCCCGG-T AGTT CT ACTT CT GTT CAT GTTTGT GTT AG ATCCGT GTTT GT GTT A-GAT CCGTGCT GCTAGCGTTCGT ACACGGATGCGACCT GT AC-GTCAGACACGTTCTGATTGCTAACTTGCCAGTGTTTCTCTTTGGG-GAATCCTGGGATGGCTCTAGCCGTTCCGCAGACGGGATCGAT-TT CAT GATTTTTTTT GTTT CGTTGCATAGGGTTTGGTTT- G C C CTTTT C CTTT ATTT C AAT AT AT GCCGTGCACTT GTTT -GTC G G GT CAT CTTTT CAT G CTTTTTTTT GT CTT G GTT-GTGATGATGTGGTCTGGTTGGGCGGTCGTTCTAGATCGGAG-T AG AATT CT GTTT C AAACT AC CT G GTG G ATTT ATT AATTTT -G G AT CT GT AT GT GTGT G CC AT AC AT ATT CAT AGTT AC G AATT G AA-G AT G AT G G AT G G A AAT AT C G AT CT AG G AT AG G T AT AC AT G TT-GATGCG G GTTTTACTG ATG C ATATAC AG AG ATG CTTTTT-GTTCGCTTGGTT GT GAT GAT GTGGT GT GGTT -GGGCGGT CGTT CATT CGTT CTAG ATCG GAGTAGAA- T ACT GTTT CAAACT ACCT G GTGT ATTT ATT AATTTT GG AACT G-TAT GT GT GT GT CAT AC AT CTT CAT AGTT ACG AGTTTAA-GATG GATG G AAATATCG ATCTAG GATAG GT AT AC AT GTT-GATGTGGGTTTTACTGATGCATATACATGATGGCATATGCAG-C AT CT ATT CAT AT G CT CT AAC CTT G AGT ACCT AT CT ATT AT AA-T AAAC AAGT AT GTTTT AT AATT ATTT C G AT CTT G AT AT ACTT -G GATGATG G CATATG C AG C AG CTATATGTG G AT-TTTTTTAG C CCTG C CTTCATAC G CT ATTT ATTT G CTTG G-TACT GTTT CTTTT GT CGATGCT CACCCT GTT GTTT -GGTGTTACTTCTGCA (SEQ ID NO: 7) [0095] Em outra modalidade, um promotor pode compreender um uma sequência de polinucleotídeo intrônica de gene Ubi-1 de Z. mays c.v. LLN37 como segue: GTACGCCGCTCGTCCTCCCCCCCCCCCTCTCTACCTTCTCTAGA-TCGGCGTTCCGGTCCATGGTTAGGGCCCGGTAGTTCTACTTCTG-TT CAT GTTT GT GTTAG AT CCGT GTTT GT GTTAG ATCCGTGCT GC-TAGCGTTCGTACACGGATGCGACCTGTACGTCAGACACGTT-CTGATTGCTAACTTGCCAGTGTTTCTCTTTGGGGAATCCTGGGA-TGGCTCTAGCCGTTCCGCAGACGGGATCGATTT-C AT G ATTTTTTTT GTTT C G TTG CAT AG G G TTT G G TTT G C C CTTTT -CCTTT ATTT C AAT AT AT G CCGT G C ACTT GTTT GTCG G GT -CAT CTTTT CAT GCTTTTTTTT GT CTTGGTTGTG AT G AT GTGG-TCTGGTTGGGCGGTCGTTCTAGATCGGAGTAGAATTCTGTTT-C AAACT ACCT GGT GG ATTT ATT AATTTT G G AT CTGTAT GT GT GT G-CC AT AC AT ATT CAT AGTT AC G AATT G AAG AT G AT G G AT G G AAAT A-TCGATCTAGGATAGGTATACATGTTGATGCGGGTTTTACTGATG-CATATACAGAGATGCTTTTT GTT CG CTT GGTT GT GAT GAT GTGG-TGTGGTTGGGCGGTCGTTCATTCGTTCTAGATCGGAGTAGAAT -CT GTTT CAAACT AC CT GGT GT ATTT ATT AATTTT G G AACT GT AT G-T GT GT GT CATACAT CTT CATAGTTACGAGTTTAAGAT GGATGGAA- ATATC G ATCTAG G ATAG GTATAC ATGTTG ATGTG G GTTTTAC-T G AT G C AT AT AC AT G AT G G CATATG C AG C AT CT ATT C AT AT G CT C-T AAC CTT G AGT AC CT AT CT ATT AT AAT AAAC AAGT ATGTTTT AT AA-TT ATTTT G AT CTT G AT AT ACTT G G AT G AT G G C AT AT G C AG C AG C-T AT AT GTG G ATTTTTTT AG CC CT G CCTT C AT ACG CT ATTT ATTT G-CTTGGTACT GTTT CTTTT GTCG ATGCT C ACCCT GTT GTTTGGTGT -TACTTCTGCAG (SEQ ID NO: 8) Cassetes de Expressão de Transgene e Gene Repórter [0096] A expressão de transgene pode também ser regulada por um cassete de expressão de gene. Em uma modalidade, um cassete de expressão de gene compreende um promotor. Em uma modalidade, um cassete de expressão de gene compreende um promotor de Ubi-1. Em uma modalidade, um cassete de expressão de gene compreende um promotor de Ubi-1 de uma planta. Em uma modalidade, um cassete de expressão de gene compreende um promotor de Ubi-1 de Z. mays c.v. LLN37. [0097] Em uma modalidade, um cassete de expressão de gene compreende um promotor de Ubi-1 de Z. mays c.v. LLN37, em que o promotor é pelo menos 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5%, 99,8%, ou 100% idêntico à SEQ ID NO: 2. Em uma modalidade, um cassete de expressão de gene compreende um promotor constitutivo, tal como o promotor de Ubi-1 de Z. mays c.v. LLN37, que é operavelmente ligado a um gene repórter ou um transgene. Em uma modalidade, um cassete de expressão de gene compreende um promotor constitutivo que é operavelmente ligado a um transgene, em que o transgene pode ser um transgene de resistência a inseticida, um transgene de tolerância a herbicida, um transgene de eficiência de uso de nitrogênio, um transgene de eficiência de uso de água, um transgene de qualidade nutricional, um transgene de ligação de DNA, um transgene marcador selecionável, ou combina- ções dos mesmos. Em uma modalidade, um cassete de expressão de gene compreendendo o promotor constitutivo pode regular expressão de um ou mais transgenes ou genes de repórter. Em uma modalidade, um cassete de expressão de gene compreendendo o promotor constitutivo pode regular expressão de dois ou mais transgenes ou genes repórteres. [0098] Em uma modalidade, um cassete de expressão de gene compreende um promotor de Ubi-1 de Z. mays c.v. LLN37, em que a sequência de promotor a montante é pelo menos 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5%, 99,8%, ou 100% idêntico à SEQ ID NO: 4. Em uma modalidade, um cassete de expressão de gene compreende um promotor constitutivo, tal como o promotor a montante de Ubi-1 de Z. mays c.v. LLN37, que é opera-velmente ligado a um gene repórter ou um transgene. Em uma modalidade, um cassete de expressão de gene compreende um promotor a montante constitutivo que é operavelmente ligado a um transgene, em que o transgene pode ser um transgene de resistência a inseticida, um transgene de tolerância a herbicida, um transgene de eficiência de uso de nitrogênio, um transgene de eficiência de uso de água, um transgene de qualidade nutricional, um transgene de ligação de DNA, um transgene marcador selecionável, ou combinações dos mesmos. Em uma modalidade, um cassete de expressão de gene compreendendo o promotor a montante constitutivo pode regular a expressão de um ou mais transgenes ou genes de repórter. Em uma modalidade, um cassete de expressão de gene compreendendo o promotor a montante constitutivo pode regular expressão de dois ou mais transgenes ou genes repórteres. Em uma outra modalidade, o promotor a montante pode compreender um íntron. Em uma modalidade, o promotor a montante pode compreender uma sequência de íntron que é operavelmente ligado a um transgene ou gene repórter. Em outra modalidade o promotor a montante pode compreender um 5’-UTR ou sequência líder. Em uma modalidade o promotor a montante pode compreender um 5’-UTR ou sequência líder que é operavelmente ligado a um trans-gene ou gene repórter. Ainda em outra modalidade, o promotor a montante pode compreender um 5’-UTR ou sequência líder e uma sequência de íntron. Em uma modalidade o promotor a montante pode compreender um 5’-UTR ou sequência líder e uma sequência de íntron que são operavelmente ligados a um transgene ou gene repórter. [0099] Em uma modalidade, um cassete de expressão de gene compreende um promotor de Ubi-1 de Z. mays c.v. LLN37, em que o 5’-UTR ou sequência líder é pelo menos 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5%, 99,8%, ou 100% idêntico à SEQ ID NO: 6. Em uma modalidade, um cassete de expressão de gene compreende a 5’-UTR ou líder de um gene de milho que codifica uma proteína de Ubiquitina-1 que é operavelmente ligada a um promotor, em que o promotor é um promotor de Ubi-1 de Z. mays c.v. LLN37, ou um promotor que se origina de uma planta (por exemplo, promotor de Ubiquitina-1 de Zea mays), um vírus (por exemplo, promotor do vírus mosaico das nervuras da mandioca), ou uma bactéria (por exemplo, Agrobacterium tumefaciens delta mas). Em uma modalidade ilustrativa, um cassete de expressão de gene compreende a Z. mays c.v. LLN37 5’-UTR ou sequência líder de um gene de milho que codifica uma proteína de Ubiquitina que é operavelmente ligada a um transgene, em que o transgene pode ser um transgene de resistência a inseticida, um transgene de tolerância a herbicida, um transgene de eficiência de uso de nitrogênio, um transgene de eficiência de uso de água, um transgene de qualidade nutricional, um transgene de ligação de DNA, um transgene marcador selecionável, ou combinações dos mesmos. [00100] Em uma modalidade, um cassete de expressão de gene compreende um promotor de Ubi-1 de Z. mays c.v. LLN37, em que a sequência intrônica é de pelo menos 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5%, 99,8%, ou 100% idêntico à SEQ ID NO: 8. Em uma modalidade, um cassete de expressão de gene compreende um íntron de um gene de milho que codifica uma proteína de Ubiquitina-1 que é operavelmente ligada a um promotor, em que o promotor é um promotor de Ubi-1 de Z. mays c.v. LLN37, ou um promotor que se origina de uma planta (por exemplo, promotor de Ubiquitina-1 de Zea mays), um vírus (por exemplo, promotor do vírus mosaico das nervuras da mandioca) ou uma bactéria (por exemplo, Agrobacterium tumefaciens delta mas). Em uma modalidade ilustrativa, um cassete de expressão de gene compreende um íntron de um gene de milho que codifica uma proteína de ubiquitina que é operavelmente ligado a um transgene, em que o transgene pode ser um transgene de resistência a inseticida, um transgene de tolerância a herbicida, um transgene de eficiência de uso de nitrogênio, um transgene de eficiência de uso de água, um transgene de qualidade nutricional, um transgene de ligação de DNA, um transgene marcador sele-cionável, ou combinações dos mesmos. [00101] Em uma modalidade, um vetor pode compreender um cassete de expressão de gene como descrito aqui. Em uma modalidade, um vetor pode ser um plasmídeo, um cosmídeo, um cromossoma artificial bacteriano (BAC), um bacteriófago, um vírus, ou um fragmento de polinucleotídeo excisado para uso em transformação direta ou alveja-mento de gene, tal como um DNA doador. [00102] Em uma modalidade, uma célula ou planta compreende um cassete de expressão de gene como descrito aqui. Em uma modalidade, uma célula ou planta compreende um vetor compreendendo um cassete de expressão de gene como descrito neste Pedido. Em uma modalidade, um vetor pode ser um plasmídeo, um cosmídeo, um cro- mossoma artificial bacteriano (BAC), um bacteriófago, ou um vírus. Desse modo, uma célula ou planta compreendendo um cassete de expressão de gene é uma célula transgênica ou uma planta transgênica, respectivamente. [00103] Em uma modalidade, uma planta transgênica pode ser uma planta monocotiledônea ou uma planta dicotiledônea. Uma modalidade da planta monocotiledônea transgênica pode ser, porém não está limitada a milho, trigo, arroz, sorgo, aveia, centeio, bananas, cana-de-açúcar, e milho miúdo. Uma modalidade de uma planta transgênica dicotiledônea pode ser, porém não está limitada à soja, algodão, girassol, ou canola. Uma modalidade também inclui uma semente transgênica de uma planta transgênica, como descrita aqui.

Marcadores Selecionáveis [00104] Vários marcadores selecionáveis, também descritos como genes repórteres, podem ser incorporados em um vetor de expressão escolhido para prover identificação e seleção de plantas transformadas ("transformantes"). Muitos métodos estão disponíveis para confirmar expressão de marcadores selecionáveis em plantas transformadas, incluindo, por exemplo, sequenciamento de DNA e reação de cadeia Polimerase (PCR), Southern blotting, manchamento de RNA, métodos imunológicos para detecção de uma proteína expressa do vetor, tal como proteína precipitada que media a resistência à fosfinotricina, ou observação visual de outras proteínas tal como genes repórteres codificando β-Glucuronidase (GUS), Luciferase, proteína fluorescente verde (GFP), proteína fluorescente amarela (YFP), DsRed, β-galactosidase, Cloranfenicol Acetiltransferase (CAT), fosfatase alcalina, e similares (veja, Sambrook, et ai, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Terceira edição, Cold Spring Harbor Press, N.Y., 2001, o teor é incorporado aqui por referência em sua totalidade). [00105] Genes marcadores selecionáveis são utilizados para sele- ção de células ou tecidos transformados. Genes marcadores selecionáveis incluem genes codificando resistência antibiótica, tal como aqueles codificando neomicina fosfotransferase II (NEO) e higromicina fosfotransferase (HPT), bem como genes conferindo resistência a compostos herbicidas. Genes de resistência herbicida geralmente codificam para uma proteína alvo modificada, insensível ao herbicida ou para uma enzima que degrada ou desintoxica o herbicida na planta antes que ela possa agir. Por exemplo, resistência ao glifosato foi obtida usando genes codificando para enzimas alvo mutantes, 5-enolpiruvilchiquimato-3-fosfato sintase (EPSPS). Genes e mutantes para EPSPS são bem conhecidos, também descritos abaixo. Resistência ao amônio de glufosinato, bromoxinila, e 2,4-diclorofenoxiacetato (2,4-D) foram obtidos usando genes bacterianos codificando pat ou DSM-2, uma nitrilase, um gene aad-1 ou um aad-12, que desintoxica os respectivos herbicidas. [00106] Em uma modalidade, os herbicidas podem inibir o ponto de crescimento ou meristema, incluindo imidazolinona ou sulfonilureia, e genes para resistência/tolerância de ácido acetoidróxi sintase (AHAS) e acetolactato sintase (ALS). Genes de resistência de glifosato incluem 5-enolpiruvilchiquimato-3-fosfato sintase mutante (EPSPs) e genes dgt-28 por meio da introdução de ácidos nucleicos recombinados e/ou várias formas de mutagênese in vivo de genes nativos EPSPs, genes aroA, e glifosato acetil transferase (GAT), respectivamente. Genes de resistência para outros compostos fosfono incluem genes BAR de espécies Streptomyces, incluindo Streptomyces higroscopicus e Strep-tomyces viridichromogenes, e ácidos piridinóxi ou fenóxi propriônicos e cicloexonas (genes de codificação de inibidor de ACCase). Genes exemplares conferindo resistência às cicloexanodionas e/ou ariloxife-noxipropanoico (incluindo Haloxifop, Diclofop, Fenoxiprop, Fluazifop, Quizalofop) incluem genes de acetil coenzima A carboxilase (ACCa- se)--Acc1-S1, Acc1-S2 e Acc1-S3. Em uma modalidade, herbicidas podem inibir a fotossíntese, incluindo triazina (genes psbA e 1s+) ou benzonitrila (gene nitrilase). [00107] Em uma modalidade, genes marcadores selecionáveis incluem, porém não estão limitados a genes codificando: neomicina fos-fotransferase II; cianamida hidratase; aspartato cinase; di-hidrodipicolinato sintase; triptofano decarboxilase; di-hidrodipicolinato sintase e aspartato cinase dessensibilizada; gene de barra; triptofano decarboxilase; neomicina fosfotransferase (NEO); higromicina fosfo-transferase (HPT ou HYG); di-hidrofolato redutase (DHFR); fosfinotrici-na acetiltransferase; ácido 2,2-dicloropropiônico desalogenase; ácido acetoidróxi sintase; 5-enolpiruvil-chiquimato-fosfato sintase (aroA); ha-loarilnitrilase; acetil-coenzima A carboxilase; di-hidropteroato sintase (sul I); e polipeptídeo 32 kD fotosistema II (psbA). [00108] Uma modalidade também inclui genes codificando resistência a: cloranfenicol; metotrexato; higromicina; espectinomicina; bromo-xinila; glifosato; e fosfinotricina. [00109] A lista acima de genes marcadores selecionáveis não se destina a ser limitante. Qualquer gene repórter ou selecionável é abrangido pela presente invenção. [00110] Genes marcadores selecionáveis são sintetizados para expressão ideal na planta. Por exemplo, em uma modalidade, uma sequência de codificação de um gene foi modificada por optimização de códon para realçar a expressão em plantas. Um gene marcador selecionável pode ser otimizado para expressão em uma espécie de planta particular ou alternativamente pode ser modificado para expressão ideal em plantas dicotiledôneas ou monocotiledôneas. Códons preferidos de planta podem ser determinados de códons de maior frequência nas proteínas expressas na maior quantidade nas espécies de planta particulares de interesse. Em uma modalidade, um gene marcador se- lecionável é designado para ser expresso em plantas em um maior nível resultando em maior eficiência de transformação. Métodos para otimização de genes de planta são bem conhecidos. Orientação considerando a otimização e fabricação de sequência sintética de polinu-cleotídeos pode ser encontrada em, por exemplo, WO 2013/016546, WO2011/146524, WOI997/013402, Patente dos Estados Unidos n° 6.166.302, e Patente dos Estados Unidos n° 5.380.831, aqui incorporada por referência.

Transgenes [00111] Os métodos e composições descritos podem ser usados para expressar sequências de gene de polinucleotídeo dentro do ge-noma da planta. Consequentemente, genes codificando tolerância a herbicida, resistência a inseto, nutrientes, antibióticos, ou moléculas terapêuticas podem ser expressos pelo novo promotor. [00112] Em uma modalidade, o elemento regulatório de promotor constitutivo da invenção objeto é combinado ou operavelmente ligado com um ou mais genes codificando a sequência de polinucleotídeos que fornece resistência ou tolerância ao glifosato, 2, 4-D glufosinato, ou outro herbicida, fornece resistência a insetos selecionados ou doenças e/ou realces nutricionais, características agronômicas melhoradas, proteínas, ou outros produtos úteis em usos na alimentação, alimento, industriais, farmacêuticos ou outros. Os transgenes podem ser "empilhados" com duas ou mais sequências de ácido nucleico de interesse dentro de um genoma de planta. O empilhamento pode ser realizado, por exemplo, por meio de cruzamento convencional de planta usando dois ou mais eventos, transformação de uma planta com uma construção que contém as sequências de interesse, retransformação de uma planta transgênica, ou adição de novas características através de integração alvejada por meio de recombinação homóloga. [00113] Tais sequências de polinucleotídeos de interesse incluem, porém não estão limitadas àqueles exemplos fornecidos abaixo: Genes ou Sequência de Codificação (por exemplo, iRNA) que conferem Resistência a Pestes ou Doença [00114] (A)Genes de Resistência à Doença de Planta. Defesas de planta são frequentemente ativadas por interação específica entre o produto e um gene de resistência à doença (R) na planta e o produto de um gene de a virulência correspondente (Avr) no patógeno. Uma variedade de planta pode ser transformada com gene de resistência clonada para construir plantas que sejam resistentes a linhagens de patógeno específicas. Exemplos de tais genes incluem, o gene de tomate Cf-9 para resistência ao Cladosporium fulvum (Jones et al., 1994 Science 266:789), gene de tomate Pto, que codifica uma proteína ci-nase, para resistência do tomate a Pseudomonas syringae pv. (Martin et al., 1993 Science 262:1432), e gene Arabidopsis RSSP2 para resistência ao Pseudomonas syringae (Mindrinos et al., 1994 Cell 78:1089). [00115] (B) Uma proteína Bacillus thuringiensis, um derivado do mesmo ou um polipeptídeo sintético modelado sobre ele, tal como uma sequência de nucleotídeo de um gene de δ-endotoxina Bt (Geiser et al., 1986 Gene 48:109), e um gene inseticida vegetativo (VIP) (veja, por exemplo, Estruch et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sei. 93:5389-94). Além disso, moléculas de DNA codificadas de δ-endotoxina podem ser adquiridas da Coleta de Cultura do Tipo Americano (Rockville, Md.), sob os números de acessão ATCC 40098, 67136, 31995 e 31998. [00116] ( C ) Uma lectina, tal como, sequências de nucleotídeo de diversos genes de lectina de ligação à manose Clivia miniata (Van Damme et al., 1994 Plant Molec. Biol. 24:825). [00117] (D) Uma proteína de ligação à vitamina, tal como avidina e homólogos de avidina que são úteis como larvicidas contra pestes de inseto. Veja a Patente dos Estados Unidos n° 5.659.026. [00118] (E) Um inibidor de enzima, por exemplo, um inibidor de pro- tease ou um inibidor de amilase. Exemplos de tais genes incluem um inibidor de arroz cisteína proteinase (Abe et al., 1987 J. Biol. Chem. 262:16793), um inibidor I de tabaco proteinase (Huub et al., 1993 Plant Molec. Biol. 21:985), e um inibidor de α-amilase (Sumitani et al., 1993 Biosci. Biotech. Biochem. 57:1243). [00119] (F) Um hormônio específico de inseto ou feromona, tal como um ecdisteroide e hormônio juvenil, uma variante do mesmo, um mimético com base nele, ou um antagonista ou agonista do mesmo, tal como expressão de baculovírus de hormônio juvenil esterase clonado, um inativador de hormônio juvenil (Hammock et al., 1990 Nature 344:458). [00120] (G) Um peptídeo ou neuropeptídeo específico de inseto que, em expressão, rompe a fisiologia da peste afetada (J. Biol. Chem. 269:9). Exemplos de tais genes incluem um receptor de hormônio diu-rético de inseto (Regan, 1994), uma alostatina identificada em Diplop-tera punctata (Pratt, 1989), e neurotoxinas parasíticas, específicas de inseto (Patente dos Estados Unidos No. 5.266.361). [00121] (H) Um veneno específico de inseto em natura por uma cobra, uma vespa, etc., tal como um peptídeo insetotóxico de escorpião (Pang, 1992 Gene 116:165). [00122] (I) Uma enzima responsável por um hiperacúmulo de mono-terpeno, um sesquiterpeno, um esteroide, um ácido hidroxâmico, um derivado de fenilpropanoide ou outra molécula de não proteína com atividade inseticida. [00123] (J) Uma enzima envolvida na modificação, incluindo a modificação pós-translalcionai, de uma molécula biologicamente ativa; por exemplo, enzima glicolítica, uma enzima proteolítica, uma enzima lipo-lítica, uma nuclease, uma ciclase, uma transaminase, uma esterase, uma hidrolase, uma fosfatase, uma cinase, uma fosforilase, uma poli-merase, uma elastase, uma quitinase e uma glucanase, se natural ou sintética. Exemplos de tais genes incluem, um gele de calos (pedido publicado PCT WO93/02197), sequências de codificação de quitinase (que podem ser obtidas, por exemplo, do ATCC sob os números de acesso 3999637 e 67152), quitinase de tênia de tabaco (Kramer et al., 1993 Insect Molec. Biol. 23:691), e gene parsley ubi4-2 poli-Ubiquitina (Kawalleck et al., 1993 Plant Molec. Biol. 21:673). [00124] (K) Uma molécula que estimula a transdução de sinal. Exemplos de tais moléculas incluem sequências de nucleotídeo para clones de cDNA de calmodulina de feijão mung (Botella et al., 1994 Plant Molec. Biol. 24:757) e uma sequência de nucleotídeo de clone de cDNA de calmodulina de milho (Griess et al., 1994 Plant Physiol. 104:1467). [00125] (L) Um peptídeo de momento hidrofóbico. Veja as Patentes dos Estados Unidos n°s 5.659.026 e 5.607.914; o último ensina sobre peptídeos antimicrobianos sintéticos que conferem resistência à doença. [00126] (M) Uma membrana permease, um formador de canal ou um bloqueador de canal, tal como um análogo de peptídeo cecropin-β lítico Jaynes et al., 1993 Plant Sei. 89:43)que torna plantas de tabaco transgênicas resistentes a Pseudomonas solanacearum. [00127] (N) Uma proteína invasiva viral ou uma toxina complexa derivada da mesma. Por exemplo, o acúmulo de proteínas de revestimento viral em células de planta transformadas confere resistência à infecção viral e/ou desenvolvimento de doença realizada pelo vírus do qual o gene de proteína de revestimento é derivado, bem como por viroses relacionadas. Resistência mediada por proteína de revestimento foi conferida sob as plantas transformadas contra o vírus do mosaico de alfafa, vírus do mosaico de pepino, vírus das estriais tabaco, vírus X de batata, vírus Y de batata, vírus etch de tabaco, vírus do rattle de tabaco e vírus do mosaico do tabaco. Veja, por exemplo, Beachy et al. (1990) Ann. Rev. Phytopathol. 28:451. [00128] (O) Um anticorpo específico de inseto ou uma imunotoxina derivada do mesmo. Desse modo, um anticorpo alvejado a uma função metabólica crítica no intestine do inseto pode inativar uma enzima afetada, matando o inseto. Por exemplo, Taylor et al. (1994) Abstract #497, Seventh lnt'l. Simpósio em Interações de Planta-Micróbios moleculares mostra inativação enzimática em Tabaco transgênico por meio da produção de fragmentos de anticorpo de cadeia simples. [00129] (P) Um anticorpo específico de vírus. Veja, por exemplo, Taviadoraki et al. (1993) Nature 266:469, que mostra que plantas transgênicas expressando genes de anticorpo recombinante são protegidas de ataque de vírus. [00130] (Q) Uma proteína arrestiva de desenvolvimento produzida na natureza por um patógeno ou um parasita. Desse modo, a endo a-1,4-D poligalacturonases fúngica facilita a colonização fúngica e liberação de nutriente de planta solubilizando a parede da célula de planta homo-a-1,4-D-galacturonase (Lamb et al., 1992) Bio/Technology 10:1436. A clonagem e caracterização de um gene que codifica uma proteína de inibição de endopoligalacturonase de feijão é descrita por Toubart et al. (1992 Plant J. 2:367). [00131] (R ) Uma proteína arrestiva de desenvolvimento produzida na natureza por uma planta, tal como um gene de inativação de ribos-soma de cevada que fornece uma resistência aumentada à doença fúngica (Longemann etal., 1992). Bio/Technology 10:3305. [00132] (S) Interferência de RNA, em que uma molécula de RNA é usada para inibir a expressão de um gene alvo. Uma molécula de RNA em um exemplo é filamento parcialmente ou totalmente duplo, que aciona uma resposta de silenciamento, resultando na divagem de dsRNA em pequenos RNAs de interferência, que são em seguida incorporados em um complexo de alvejamento que destrói mRNAs ho- mólogos. Veja, por exemplo, Fire et alPatente dos Estados Unidos n° 6.506.559; Graham et al, Patente dos Estados Unidos n° 6.573.099. Genes que Conferem Resistência a um Herbicida [00133] (A)Genes que codificam resistência ou tolerância a um herbicida que inibe o ponto de crescimento ou meristema, tais como um herbicida de imidazalinona, sulfonanilida ou sulfonilureia. Genes exemplares nesta categoria codificam acetolactato sintase mutante (ALS) (Lee et al., 1988 EMBOJ. 7:1241) também conhecido como enzima acetoidroxiácido sintase (AHAS) (Miki et al., 1990 Theor. Appl. Genet. 80:449). [00134] (B) Um ou mais genes adicionais codificando resistência ou tolerância a glifosato conferida por genes de EPSP sintase e aroA mu-tantes, ou através de inativação metabólica por genes tais como DGT-28, 2mEPSPS, GAT (glifosato acetiltransferase) ou GOX (glifosato oxidase) e outros compostos de fosfono tais como glufosinato (genes de pat,bar, e dsm-2), e ácidos ariloxifenoxipropiônicos e cicloexanodi-onas (genes de codificação de inibidor de ACCase). Veja, por exemplo, Patente dos Estados Unidos n° 4.940.835, que descreve a sequência de nucleotídeo de uma forma de EPSP que pode conferir resistência a glifosato. Uma molécula de DNA codificando um gene aroA pode ser obtida sob o número de acesso de ATCC 39256, e a sequência de nucleotídeo do gene mutante é descrita na Patente dos Estados Unidos n° 4.769.061. Pedido de Patente Européia n° 0 333 033 e a Patente dos Estados Unidos n° 4.975.374 descreve as sequências de nucleotídeo de genes de glutamina sintetase que conferem resistência a herbicida tal como L-fosfinotricina. A sequência de nucleotídeo de um gene fosfinotricinacetil-transferase é fornecida no Pedido de Patente Européia n°0 242 246. De Greef et al. (1989) Bio/Technology 7:61 descreve a produção de plantas transgênicas que expressam genes bar quiméricos codificando atividade de fosfinotricina acetil transfera- se. Exemplares de genes que conferem resistência a ácidos ariloxife-noxipropiônicos e cicloexanodionas, tais como setoxidim e haloxifop, são os genes Accl-S1, Accl-S2 e Accl-S3 descritos por Marshall et al. (1992) Theor. Appl. Genet. 83:435. [00135] (c) Genes codificando resistência ou tolerância a um herbicida que inibe a fotossíntese, tal como uma triazina (genes de psbA e gs+) e uma benzonitrila (gene nitrilase). Przibilla et al. (1991) célula de planta 3:169 descreve o uso de plasmídeos que codificam genes de psbA mutante para transformar Clamidomonas. Sequências de nucleo-tídeo para genes de nitrilase são descritas na Patente dos Estados Unidos n° 4.810.648, e moléculas de DNA contendo estes genes são disponíveis sob os números de acesso de ATCC 53435, 67441 e 67442. Clonagem e expressão de DNA codificando uma glutationa S-transferase são descritas por Hayes et al. (1992) Biochem. J. 285:173. [00136] (D) Genes que codificam resistência ou tolerância a um herbicida que se liga à hidroxifenilpiruvato dioxigenases (HPPD), enzimas que catalisam a reação em que o para-hidroxifenilpiruvato (HPP) é transformado em homogentisato. Isto inclui herbicidas tais como isoxazóis (EP418175, EP470856, EP487352, EP527036, EP560482, EP682659, Patente dos Estados Unidos n° 5.424.276), em particular isoxaflutol, que é um herbicida seletivo para milho, dicetoni-trilas (EP496630, EP496631), em particular 2-ciano-3-ciclopropil-1-(2-S02CH3-4-CF3 fenil)propano-1,3-diona e 2-ciano-3-ciclopropil-1-(2-S02CH3-4-2,3CI2fenil)propano-1,3-diona, tricetonas (EP625505, EP625508, Patente dos Estados Unidos n° 5.506.195), em particular sulcotriona, e pirazolinatos. Um gene que produz uma superabundân-cia de HPPD em plantas pode fornecer tolerância ou resistência a tais herbicidas, incluindo, por exemplo, genes descritos nas Patentes dos Estados Unidos n°s 6.268.549 e 6.245.968 e Publicação de Pedido de Patente dos Estados Unidos No. 2003/0066102. [00137] (E) Genes que codificam resistência ou tolerância a herbicidas de auxina de fenóxi, tal como ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D) e que podem também conferir resistência ou tolerância a herbicidas de ariloxifenoxipropionato (AOPP). Exemplos de tais genes incluem o gene de enzima dioxigenase dependente de α-cetoglutarato (aad-1), descrito na Patente dos Estados Unidos n° 7.838.733. [00138] (F) Genes que codificam resistência ou tolerância a herbicidas de auxina, tal como ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D) e que podem também conferir resistência ou tolerância a herbicidas de auxina de piridilóxi, tais como fluroxipir ou triclopir. Exemplos de tais genes incluem o gene de enzima dioxigenase dependente de a-cetoglutarato (aad-12), descrito em W02007/053482 A2. [00139] (G) Genes que codificam resistência ou tolerância a dicam-ba (veja, por exemplo, Publicação de Patente dos Estados Unidos n° 20030135879). [00140] (H) Genes fornecendo resistência ou tolerância a herbicidas que inibem a protoporfirinogênio oxidase (PPO) (veja, Patente dos Estados Unidos n° 5.767.373). [00141] (I) Genes fornecendo resistência ou tolerância a herbicidas de triazina (tal como atrazina) e derivados de herbicida de ureia (tal como diurônio) que se ligam à proteínas núcleo de centros de reação de fotossistema II (PS II) (veja, Brussian et al., (1989) EMBO J. 1989, 8(4): 1237-1245.

Genes que Conferem ou Contribuem para um Traço Adicionado de Valor [00142] (A) Metabolismo de ácido graxo modificado, por exemplo, para transformar o milho ou Brassica com um gene antissentido ou estearoil-ACP desaturase para aumentar o teor de ácido esteárico da planta (Knultzon et al., 1992) Proc. Nat. Acad. Sei. USA 89:2624. (B) Teor de Fitase Diminuído (1) A introdução de um gene que codifica a fitase, tal como o gene Aspergillus niger fitase (Van Hartingsveldt et al., 1993 Gene 127:87), realça a quebra de fitato, adicionando fosfato mais livre à planta transformada. (2) Um gene pode ser introduzido que reduz o teor de fitato. Em milho, isto, por exemplo, pode ser realizado por clonagem e em seguida reintroduzindo o DNA associado com o alelo simples que é responsável por mutantes de milho caracterizados por baixos níveis de ácido fítico (Raboy et al., 1990 Maydica 35:383). [00143] (C ) Composição de carboidrato modificada realizada, por exemplo, por transformação de plantas com um gene codificando uma enzima que altera o padrão de ramificação de amido. Exemplos de tais enzimas incluem, gene de Streptococcus mucus fructosyltransferase (Shiroza et al., 1988) J. Bacteriol. 170:810, gene de Bacillus subtilis levansucrase (Steinmetz et al., 1985 Mol. Gen. Genel. 200:220), Bacillus licheniformis α-amilase (Pen et al., 1992 Bio/Technology 10:292), genes invertase de tomate (Elliot et al., 1993), gene amilase de cevada (Sogaard et al., 1993 J. Biol. Chem. 268:22480), e enzima II de ramificação de milho endospérmico de milho (Fisher et al., 1993 Plant Physiol. 102:10450).

Transformação [00144] Métodos adequados para transformação de planta incluem qualquer método onde o DNA pode ser introduzido em uma célula, por exemplo, e sem limitação: eletroporação {veja, por exemplo, Patente dos Estados Unidos n° 5,384,253); bombardeamento de micro-projétil (veja, por exemplo, Patentes dos Estados Unidos n°s 5.015.580; 5.550.318; 5.538.880; 6.160.208; 6.399.861; e 6.403.865); transformação mediada por Agrobacterium {veja, por exemplo, Patentes dos Estados Unidos n°s 5.635.055; 5.824.877; 5.591.616; 5.981.840; e 6.384.301); e transformação de protoplasto (veja, por exemplo, Paten- te dos Estados Unidos n° 5.508.184). Estes métodos podem ser usados para transformar estavelmente ou transformar transitoriamente uma planta. [00145] Uma construção de DNA pode ser introduzida diretamente no DNA genômico da célula de planta usando técnicas tais como agitação com fibras de carboneto de silício (Veja, por exemplo, Patentes dos Estados Unidos n°s 5.302.523 e 5.464.765). Construções de DNA podem ser introduzidas diretamente no tecido de planta usando métodos biolíticos, tal como bombardeamento de partícula de DNA (veja, por exemplo, Klein et al., (1987) Nature 327:70-73). Alternativamente, construções de DNA podem ser introduzidas na célula de planta por meio de transformação de nanopartícula (veja, por exemplo, Publicação de Patente dos Estados Unidos n° 2009/0104700, incorporada aqui por referência em sua totalidade). [00146] Além disso, a transferência de gene pode ser obtida usando g de bactérias ou vírus não de Agrobacterium, tais como Rhizobium sp. NGR234, Sinorhizoboium meliloti, Mesorhizobium loti, víruas de batta X, vírus do mosaico da couve-flor, vírus do mosaico da veia da mandioca, e/ou vírus do mosaico do tabaco, veja, por exemplo, Chung, e outro, (2006) Trends Plant Sei. 11(1):1-4. [00147] Através da aplicação de técnicas de transformação, as células de virtualmente qualquer espécie de planta podem ser estavelmente transformadas, e aquelas células podem ser desenvolvidas em plantas transgênicas por técnicas bem conhecidas. Por exemplo, as técnicas que podem ser particularmente úteis em relação à transformação de algodão são descritas nas Patentes dos Estados Unidos nos 5.846.797; 5.159.135; 5.004.863; e 6.624.344; as técnicas para transformação de Brassica, em particular, são descritas, por exemplo, na Patente dos Estados Unidos n° 5.750.871; as técnicas para transformação de soja são descritas, por exemplo, na Patente dos Estados Unidos n° 6.384.301; e as técnicas para transformação de milho são descritas, por exemplo, nas Patentes dos Estados Unidos nos 7.060.876 e 5.591.616, e Publicação de PCT Internacional WO95/06722. [00148] Após afetar a liberação de um ácido nucleico exógeno para uma célula recipiente, uma célula transformada é geralmente identificada por outro cultivo e regeneração de planta. A fim de melhorar a capacidade de identificar transformantes, alguém pode desejar empregar um gene marcador selecionável com o vetor de transformação usado para gerar o transformante. Em uma modalidade ilustrativa, uma população de célula transformada pode ser ensaiada expondo-se as células a um agente ou agentes seletivos, ou as células podem ser analisadas quanto à característica de gene marcador desejado. [00149] Células que sobrevivem à exposição a um agente seletivo, ou células que foram marcadas como positivas em um ensaio de varredura, podem ser cultivadas em meios que suportam a regeneração de plantas. Em uma modalidade, qualquer meio de cultura de tecido de planta adequado pode ser modificado incluindo-se outras substâncias, tais como reguladores de crescimento. Os tecidos de planta podem ser mantidos em um meio básico com reguladores de crescimento até o tecido suficiente ficar disponível para iniciar os esforços de regeneração da planta. Alternativamente, após as rodadas repetidas de seleção manual, até a morfologia do tecido ser adequada à regeneração (por exemplo, pelo menos 2 semanas), o tecido pode em seguida ser transferido par meios conducentes à formação de broto. As culturas são transferidas periodicamente até a formação suficiente de broto ocorrer. Uma vez que os brotos são formados, eles são transferidos para meios conducentes à formação de raiz. Uma vez que as raízes suficientes são formadas, as plantas podem ser transferidas para o solo para também desenvolvimento e maturidade. [00150] Para confirmar a presença de um ácido nucleico compreendendo as construções fornecidas na regeneração de plantas, vários ensaios podem ser realizados. Tais ensaios podem incluir: ensaios biológicos moleculares, tais como Southern e Northern blotting e PCR; ensaios bioquímicos, tal como detecção da presença de um produto de proteína por meios imunológicos, tais como ELISA, western blots, e/ou espectrofotometria de LC-MS MS) ou por função enzimática, tais como por ensaios de parte de planta, tais como ensaios de folha, calo, ou pólen; e/ou análise do fenótipo da planta regenerada inteira. [00151] Os eventos transgênicos podem ser analisados, por exemplo, por amplificação de PCR usando iniciadores de oligonucleotídeo específicos para moléculas de ácido nucleico de interesse. A genoti-pagem por PCR é entendida incluir, porém não está limitada a, amplificação por PCR de DNA genômico derivado de tecido de planta hospedeiro isolado e/ou purificado previsto para conter uma molécula de ácido nucleico de interesse integrada no genoma, seguida por clonagem padrão, e análise de sequência de produtos de amplificação por PCR. Os métodos de genotipagem por PCR foram bem descritos (veja, por exemplo, Rios, e outro, (2002) Plant J. 32:243-53) e podem ser aplicados ao DNA genômico derivado de qualquer espécie ou tipo de tecido de planta, incluindo culturas de célula. [00152] As combinações de iniciadores de oligonucleotídeo que se ligam a ambas as sequências alvo e sequência introduzida podem ser usadas sequencialmente ou multiplexadas em reações de amplificação por PCR. Os iniciadores de oligonucleotídeo planejados para se anelarem com o sítio alvo, sequências de ácido nucleico introduzidas, e/ou combinações dos dois tipos de sequências de ácido nucleico, podem ser produzidos. Desse modo, as estratégias de genotipagem por PCR podem incluir, por exemplo, e sem limitação: amplificação de sequências específicas no genoma de planta; amplificação de múltiplas se- quências específicas no genoma de planta; a amplificação de sequências não específicas no genoma de planta; e combinações de qualquer dos antecedentes. Alguém versado na técnica pode planejar combinações adicionais de iniciadores e reações de amplificação para interrogar o genoma. Por exemplo, um conjunto de iniciadores dianteiros e reversos podem ser planejados para se anelarem com a(s) sequên-cia(s) de ácido nucleico específica(s) ao alvo fora dos limites da sequência de ácido nucleico introduzida. [00153] Os iniciadores de oligonucleotídeo dianteiros e reverses podem ser planejados para se anelarem especificamente com uma molécula de ácido nucleico introduzida, por exemplo, em uma sequência que corresponde a uma região de codificação dentro de uma sequência de nucleotídeo de interesse compreendida aqui, ou outras partes da molécula de ácido nucleico. Os iniciadores podem ser usados em conjunto com os iniciadores descritos aqui. Os iniciadores de oligonucleotídeo podem ser sintetizados de acordo com uma sequência desejada e são comercialmente disponíveis (por exemplo, de Inte-grated DNA Technologies, Inc., Coralville, IA). A amplificação pode ser seguida por clonagem e sequenciamento, ou por análise de sequência direta de produtos de amplificação. Em uma modalidade, os iniciadores oligonucleotídeo específicos ao gene alvo são empregados nas amplificações por PCR. Método de Expressão de um Transgene [00154] Em uma modalidade, um método de expressão de pelo menos um transgene em uma planta compreende o cultivo de uma planta compreendendo um promotor de Ubi-1 de Z. mays c.v. LLN37 (SEQ ID NO: 2) operavelmente ligado a pelo menos um transgene. Em uma modalidade, um método de expressão de pelo menos um transgene em um tecido de planta ou célula de planta compreende cultivar um tecido de planta ou célula de planta compreendendo um promotor de Ubi-1 de Z. mays c.v. LLN37 (SEQ ID NO: 2) operavelmente ligado a pelo menos um transgene. [00155] Em uma modalidade, um método de expressão de pelo menos um transgene em uma planta compreende o cultivo de uma planta compreendendo um cassete de expressão de gene compreendendo um promotor de Ubi-1 de Z. mays c.v. LLN37 (SEQ ID NO: 2) operavelmente ligado a pelo menos um transgene. Em outra modalidade, um método de expressão de pelo menos um transgene em um tecido de planta ou célula de planta compreende cultivar um tecido de planta ou célula de planta compreendendo um cassete de expressão de gene compreendendo um promotor de Ubi-1 de Z. mays c.v. LLN37 (SEQ ID NO: 2) operavelmente ligado a pelo menos um transgene. [00156] Em uma modalidade, uma planta, tecido de planta, ou célula de planta compreende um cassete de expressão de gene compreendendo um promotor de Ubi-1 de Z. mays c.v. LLN37 (SEQ ID NO: 2) operavelmente ligado a um transgene. Em que, o promotor de Ubi-1 de Z. mays c.v. LLN37 (SEQ ID NO: 2) é compreendido de um promotor a jusante (SEQ ID NO: 4), 5’-UTR (SEQ ID NO: 6), e um íntron (SEQ ID NO: 8). Em uma modalidade, uma planta, tecido de planta, ou célula de planta compreende um cassete de expressão de gene compreendendo um promotor a montante de Ubi-1 de Z. mays c.v. LLN37 (SEQ ID NO: 4), 5’-UTR (SEQ ID NO: 6), e um íntron (SEQ ID NO: 8). Em uma modalidade, uma planta, tecido de planta, ou célula de planta compreende um cassete de expressão de gene compreendendo um promotor a montante de Ubi-1 de Z. mays c.v. LLN37 (SEQ ID NO: 4), 5’-UTR (SEQ ID NO: 6), e um íntron (SEQ ID NO: 8) de um gene de Ubi-1 de Z. mays c.v. LLN37. Em uma modalidade, uma planta, tecido de planta, ou célula de planta compreende um cassete de expressão de gene compreendendo um promotor a montante de Ubi-1 de Z. mays c.v. LLN37 (SEQ ID NO: 4), 5’-UTR (SEQ ID NO: 6), e um íntron (SEQ ID NO: 8) de um gene de Ubi-1 de Z. mays c.v. LLN37. [00157] Em uma modalidade, uma planta, tecido de planta, ou célula de planta compreende um promotor de Ubi-1 de Z. mays c.v. LLN37. Em uma modalidade, um promotor de Ubi-1 de Z. mays c.v. LLN37 pode ser SEQ ID NO: 2. Em uma modalidade, uma planta, tecido de planta, ou célula de planta compreende um cassete de expressão de gene compreendendo um promotor, em que o promotor é pelo menos 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5%, 99,8%, ou 100% idêntico à SEQ ID NO: 2. Em uma modalidade, uma planta, tecido de planta, ou célula de planta compreende um cassete de expressão de gene compreendendo um promotor de Ubi-1 de Z. mays c.v. LLN37 que é operavelmente ligado a um transgene. Em uma modalidade ilustrativa, uma planta, tecido de planta, ou célula de planta compreende um cassete de expressão de gene compreendendo um promotor de Ubi-1 de Z. mays c.v. LLN37 que é operavelmente ligado a um transgene, em que o transgene pode ser um transgene de resistência a inseticida, um transgene de tolerância a herbicida, um transgene de eficiência de uso de nitrogênio, um transgene de eficiência de uso de água, um transgene de qualidade nutricional, um transgene de ligação de DNA, um transgene marcador selecionável, ou combinações dos mesmos. [00158] Em uma modalidade, uma planta, tecido de planta, ou célula de planta compreende um promotor a montante de Ubi-1 de Z. mays c.v. LLN37. Em uma modalidade, um promotor a montante de Ubi-1 de Z. mays c.v. LLN37 pode ser SEQ ID NO: 4. Em uma modalidade, uma planta, tecido de planta, ou célula de planta compreende um cassete de expressão de gene compreendendo um promotor a jusante, em que o promotor a montante é pelo menos 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5%, 99,8%, ou 100% idêntico à SEQ ID NO: 4. Em uma modalidade, uma planta, tecido de plan- ta, ou célula de planta compreende um cassete de expressão de gene compreendendo um promotor a montante de Ubi-1 de Z. mays c.v. LLN37 que é operavelmente ligado a um transgene. Em uma modalidade ilustrativa, uma planta, tecido de planta, ou célula de planta compreende um cassete de expressão de gene compreendendo um promotor a montante de Ubi-1 de Z. mays c.v. LLN37 que é operavelmente ligado a um transgene, em que o transgene pode ser um transgene de resistência a inseticida, um transgene de tolerância a herbicida, um transgene de eficiência de uso de nitrogênio, um transgene de eficiência de uso de água, um transgene de qualidade nutricional, um transgene de ligação de DNA, um transgene marcador selecionável, ou combinações dos mesmos. [121] Em uma modalidade, uma planta, tecido de planta, ou célula de planta compreende um 5’-UTR de Ubi-1 de Z. mays c.v. LLN37 ou sequência líder. Em uma modalidade, um 5’-UTR de Ubi-1 de Z. mays c.v. LLN37 ou sequência líder pode ser um polinucleotídeo de SEQ ID NO: 6. Em uma modalidade, uma planta, tecido de planta, ou célula de planta compreende um cassete de expressão de gene compreendendo um 5’-UTR ou sequência líder, em que o 5’-UTR ou sequência líder é pelo menos 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5%, 99,8%, ou 100% idêntico à SEQ ID NO: 6. Em uma modalidade, um cassete de expressão de gene compreende a 5’-UTR de Ubi-1 de Z. mays c.v. LLN37 ou líder que é operavelmente ligado a um promotor, em que o promotor é um promotor de ubiquitina, ou um promotor que se origina de uma planta (por exemplo, promotor de Ubiquitina-1 de Zea mays), um vírus (por exemplo, promotor do vírus mosaico das nervuras da mandioca) ou uma bactéria (por exemplo, Agrobacterium tumefaciens delta mas). Em uma modalidade, uma planta, tecido de planta, ou célula de planta compreende um cassete de expressão de gene compreendendo um 5’-UTR de Ubi-1 de Z. mays c.v. LLN37 ou líder que é operavelmente ligado a um transgene. Em uma modalidade ilustrativa, uma planta, tecido de planta, ou célula de planta compreendendo um cassete de expressão de gene compreendendo um 5’-UTR de Ubi-1 de Z. mays c.v. LLN37 ou líder que é operavelmente ligado a um transgene, em que o transgene pode ser um transgene de resistência a inseticida, um transgene de tolerância a herbicida, um transgene de eficiência de uso de nitrogênio, um transgene de eficiência de uso de água, um transgene de qualidade nutricional, um transgene de ligação de DNA, um transgene marcador selecionável, ou combinações dos mesmos. [122] Em uma modalidade, uma planta, tecido de planta, ou célula de planta compreende um íntron de Ubi-1. Em uma modalidade, uma planta, tecido de planta, ou célula de planta compreende um íntron de Ubi-1 de Z. mays c.v. LLN37. Em uma modalidade, um íntron de Ubi-1 de Z. mays c.v. LLN37 pode ser um polinucleotídeo de SEQ ID NO: 8. Em uma modalidade, uma planta, tecido de planta, ou célula de planta compreende um cassete de expressão de gene compreendendo um íntron, em que o íntron é pelo menos 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5%, 99,8%, ou 100% idêntico à SEQ ID NO: 8. Em uma modalidade, um cassete de expressão de gene compreende um íntron de Ubi-1 de Z. mays c.v. LLN37 que é operavelmente ligado a um promotor, em que o promotor é um promotor de Ubiquitina, ou um promotor que se origina de uma planta (por exemplo, Ubiquitina-1 de promotor de Zea mays), um vírus (por exemplo, promotor do vírus mosaico das nervuras da mandioca) ou uma bactéria (por exemplo, Agrobacterium tumefaciens delta mas). Em uma modalidade, uma planta, tecido de planta, ou célula de planta compreende um cassete de expressão de gene compreendendo um íntron de Ubi-1 de Z. mays c.v. LLN37 que é operavelmente ligado a um transgene. Em uma modalidade ilustrativa, uma planta, tecido de planta, ou célula de planta compreendendo um cassete de expressão de gene compreendendo um íntron de Ubi-1 de Z. mays c.v. LLN37 que é operavelmente ligado a um transgene, em que o transgene pode ser um transgene de resistência a inseticida, um transgene de tolerância a herbicida, um transgene de eficiência de uso de nitrogênio, um transgene de eficiência de uso de água, um transgene de qualidade nutricional, um transgene de ligação de DNA, um transgene marcador selecionável, ou combinações dos mesmos. [123] Em uma modalidade, uma planta, tecido de planta, ou célula de planta compreende um cassete de expressão de gene compreendendo um promotor a montante de Ubi-1 de Z. mays c.v. LLN37, íntron de Ubi-1, e um 5’-UTR de Ubi-1 que são operavelmente ligados a um transgene. O promotor de Ubi-1 de Z. mays c.v. LLN37, íntron de Ubi-1, e 5’-UTR de Ubi-1 pode ser operavelmente ligado a diferentes transgenes dentro de um cassete de expressão de gene quando um cassete de expressão de gene inclui dois ou mais transgenes. Em uma modalidade ilustrativa, um cassete de expressão de gene compreende um promotor de Ubi-1 de Z. mays c.v. LLN37 que é operavelmente ligado a um transgene, em que o transgene pode ser um transgene de resistência a inseticida, um transgene de tolerância a herbicida, um transgene de eficiência de uso de nitrogênio, um transgene de eficiência de uso de água, um transgene de qualidade nutricional, um transgene de ligação de DNA, um transgene marcador selecionável, ou combinações dos mesmos. Em uma modalidade ilustrativa, um cassete de expressão de gene compreende a íntron de Ubi-1 de Z. mays c.v. LLN37 que é operavelmente ligado a um transgene, em que o transgene pode ser um transgene de resistência a inseticida, um transgene de tolerância a herbicida, um transgene de eficiência de uso de nitrogênio, um transgene de eficiência de uso de água, um transgene de qualidade nutricional, um transgene de ligação de DNA, um transgene marcador selecionável, ou combinações dos mesmos. Em uma modalidade, um cassete de expressão de gene compreende a íntron de Ubi-1 de Z. mays c.v. LLN37 que é operavelmente ligado a um promotor, em que o promotor é um promotor de ubiquitina, ou um promotor que se origina de uma planta (por exemplo, promotor de Ubi-quitina-1 de Zea mays), um vírus (por exemplo, promotor do vírus mosaico das nervuras da mandioca) ou uma bactéria (por exemplo, Agrobacterium tumefaciens delta mas). Em uma modalidade ilustrativa, um cassete de expressão de gene compreende a 5’-UTR de Ubi-1 de Z. mays c.v. LLN37 que é operavelmente ligado a um transgene, em que o transgene pode ser um transgene de resistência a inseticida, um transgene de tolerância a herbicida, um transgene de eficiência de uso de nitrogênio, um transgene de eficiência de uso de água, um transgene de qualidade nutricional, um transgene de ligação de DNA, um transgene marcador selecionável, ou combinações dos mesmos. [124] Em uma modalidade, uma planta, tecido de planta, ou célula de planta compreende um vetor compreendendo um elemento regu-latório de promotor de gene constitutivo como descrito aqui. Em uma modalidade, uma planta, tecido de planta, ou célula de planta compreende um vetor compreendendo um elemento regulatório de promotor de gene constitutivo, como descrito aqui, operavelmente ligado a um transgene. Em uma modalidade, uma planta, tecido de planta, ou célula de planta compreende um vetor compreendendo um cassete de expressão de gene, como descrito aqui. Em uma modalidade, um vetor pode ser um plasmídeo, um cosmídeo, um cromossoma artificial bac-teriano (BAC), um bacteriófago, ou um fragmento de vírus. [125] Em uma modalidade, uma planta, tecido de planta, ou célula de planta, de acordo com os métodos descritos aqui, pode ser mo-nocotiledônea. A planta monocotiledônea, tecido de planta, ou célula de planta pode ser, porém não está limitada a milho, arroz, trigo, cana- de-açúcar, cevada, centeio, sorgo, orquídeas, bambu, banana, cattails, lírios, aveia, cebola, milho, e triticale. Em outra modalidade, uma planta, tecido de planta, ou célula de planta, de acordo com os métodos descritos aqui, pode ser dicotiledônea. A planta dicotiledônea, tecido de planta, ou célula de planta pode ser, porém não está limitada à semente de colza, canola, mostarda indiana, mostarda etíope, soja, girassol, e algodão. [126] Com respeito à produção de plantas geneticamente modificadas, métodos para a engenharia genética de plantas são bem conhecidas na técnica. Por exemplo, numerosos métodos para transformação de planta foram desenvolvidos, incluindo protocolos de transformação biológica e física para plantas dicotiledôneas, bem como plantas monocotiledôneas (por exemplo, Goto-Fumiyuki et ai, Nature Biotech 17:282-286 (1999); Miki et al., Methods in Plant Molecular Bio-logy e Biotechnology, Glick, B. R. e Thompson, J. E. Eds., CRC Press, Inc., Boca Raton, pp. 67-88 (1993)). Além disso, vetores e métodos de cultura in vitro para célula de planta ou transformação e regeneração de tecido de plantas são disponíveis, por exemplo, em Gruber et al., Methods in Plant Molecular Biology e Biotechnology, Glick, B. R. e Thompson, J. E. Eds., CRC Press, Inc., Boca Raton, pp. 89-119 (1993). [127] Alguém versado na técnica reconhecerá que após a sequência exógena ser estavelmente incorporada em plantas transgêni-cas e confirmada ser operável, ela pode ser introduzida em outras plantas por cruzamento sexual. Qualquer de diversas técnicas de reprodução padrões pode ser usada, dependendo das espécies a serem cruzadas. [128] Uma célula de planta transformada, raiz, folha, calo, pólen, tecido ou planta pode ser identificada e isolada selecionando-se ou analisando-se o material de planta construído quanto às característi- cas codificadas pelos genes marcadores presentes no DNA de transformação. Por exemplo, a seleção pode ser realizada cultivando-se o material de planta construído em meio contendo uma quantidade inibi-tória de um antibiótico ou herbicida à qual a construção de gene de transformação confere resistência. Além disso, as células transformadas podem também ser identificadas por avaliação das atividades de quaisquer genes marcadores visíveis (por exemplo, os genes YFP, GFP, β-glucuronidase, Luciferase, B ou C1) que podem estar presente nas construções de ácido nucleico recombinantes. Tais metodologias de seleção e avaliação são bem conhecidas por aqueles versados na técnica aqueles versados na técnica. [129] Métodos físicos e bioquímicos podem ser usados para identificar transformantes de planta ou célula de planta contendo construções de gene inseridas. Estes métodos incluem, porém não limitados a: 1) Análise de Southern ou amplificação de PCR para detector e determinar a estrutura da inserção de DNA recombinante; 2) Northern blot, proteção de S1 RNase, extensão de iniciador, ou amplificação de PCR por transcriptase reversa para detectar e examinar transcrições de RNA das construções de gene; 3) ensaios enzimáticos para detectar a atividade de enzima ou ribozima, onde tais produtos de gene são codificados pela construção de gene; 4) em seguida geração de análise de sequenciamento (NGS); ou 5) eletroforese de gel de proteína, técnicas de western blot, imunoprecipitação, ou ensaio imunoabsor-vente ligado à enzima (ELISA), onde os produtos de construção de gene são proteínas. Técnicas adicionais, tais como hibridização in situ, manchamento de enzima, e imunomanchamento, pode também ser usado para detectar a presença ou expressão da construção recombinante em órgãos e tecidos de planta específicos. Os métodos para fazer todos estes ensaios são bem conhecidos por aqueles versados na técnica. [130] Efeitos de manipulação de gene usando os métodos descritos aqui podem ser observados, por exemplo, por Northern blots do RNA (por exemplo, mRNA) isolado dos tecidos de interesse. Tipicamente, se o mRNA estiver presente ou a quantidade de mRNA tiver aumentado, pode-se assumir que o transgene correspondente está sendo expresso. Outros métodos de medição de gene e/ou atividade de polipeptídeo codificada podem ser usados. Diferentes tipos de ensaios enzimáticos podem ser usados, dependendo do substrato usado e o método de detecção do aumento ou decréscimo de um produto ou subproduto de reação. Além disso, os níveis de polipeptídeo expressos podem ser medidos imunoquimicamente, porém empregando ELISA, RIA, EIA, e outros ensaios com base em anticorpo, bem conhecidos por aqueles versados na técnica, tal como, por ensaios de detecção eletroforética (ou com manchamento ou western blotting). Como um exemplo não limitante, a detecção das proteínas AAD-1 (ariioxial-canoato desoxigenasse; veja WO 2005/107437) e PAT (fosfinotricin-N-acetil-transferase) usando um ensaio ELISA é descrita na Publicação de Patente dos Estados Unidos n° 20090093366 que é incorporada aqui por referência em sua totalidade. O transgene pode também ser seletivamente expresso em alguns tipos ou tecidos celulares da planta ou em alguns estágios de desenvolvimento. O transgene pode também ser substancialmente expresso em todos os tecidos de planta e ao longo de todo seu ciclo de vida. Entretanto, qualquer modo de expressão combinatória é também aplicável. [131] A presente invenção também abrange sementes das plantas transgênicas descritas acima, em que a semente compreende o gene repórter, transgene, ou cassete de expressão de gene. A presente invenção também abrange a progenitura, clones, linhagens celulares, ou células das plantas transgênicas descritas acima, em que a referida progenitura, clone, linhagem celular, ou célula compreende o gene repórter, transgene, ou construção de gene. [132] Embora a invenção tenha sido descrita com referência a métodos e modalidades específicos, deve-se apreciar que várias modificações e mudanças possam ser feitas sem afastar-se da invenção descrita aqui.

EXEMPLOS

Exemplo 1: Nova Identificação e Isolamento de Promotor [00159] Uma nova sequência promotora do Ubi-1 de Zea mays c.v. LLN37 foi amplificada usando Reação de Cadeia de Polimerase (PCR). Oligonucleotídeos (Tabela 1) designados para amplificar o novo promotor, Z. mays c.v. LLN37, foram derivados de regiões conservadas da sequência promotora de Z. mays c.v. B73 Ubi-1, que serviu como o controle. Um produto de PCR foi obtido de Z. mays c.v. LLN37 e foi caracterizado. [00160] O produto PCR compreendendo o novo promotor foi ciona-do nos vetores Topo™ usando o Kit de Clonagem de PCR Invitrogen Zero Blunt® TOPO® de acordo com as instruções do fabricante. Um mapa de vetor mostrando o plasmídeo clonado compreendendo o novo produto de PCR de promotor é fornecido. O plasmídeo pDAB105712 corresponde a Z. mays c.v. LLN37 (FIG. 2). [00161] Após clonagem, a inserção de promotor contendo o produto de PCR foi sequenciada usando métodos conhecidos por aqueles versados na técnica. As sequências de polinucleotídeo promotoras de Z. mays c.v. LLN37 (FIG. 4) foram computacionalmente alinhadas e subsequentemente analisadas para homologia de sequência à sequência de controle Z. mays c.v. B73 Ubi-1 (FIG. 3). Métodos bioinformáticos e/ou programas de software conhecidos por aqueles versados na técnica, tal como ClustalW ou Sequencher, foram usados para realizar a análise de homologia de sequência.

Exemplo 2: Caracterização de Novo promotor Novel [00162] Análise de homologia de sequência (FIGS. 3-7), incluindo alinhamento de sequência e comparação à sequência de controle Z. mays c.v. B73 Ubi-1 (SEQ ID NO: 1; figura 3) revelou um novo promotor Ubi-1 para outra caracterização. Foi também observado que a nova sequência promotora Ubi-1, obtida de Z. mays c.v. LLN37 (SEQ ID NO: 2; figura 4), compreendia sequências de polinucleotídeo de três regiões distintas; 1) uma região promotor a jusante (SEQ ID NO: 4), 2) a 5’-UTR (SEQ ID NO: 6), e 3) um íntron (SEQ ID NO: 8). As regiões promotoras e elementos promotores específicos de Z. mays c.v. LLN37 foram analisados quanto à homologia de sequência à sequência de controle Z. mays c.v. B73 Ubi-1 (FIGS. 5-7). Mais especificamente, o alinhamento de sequência foi realizado para independentemente comparar o promotor a montante, 5’-UTR, e regiões intrônicas, bem como a Caixa TATA e elementos regulatórios do Elemento de Choque Térmico (HSE) do promotor Z. mays c.v. LLN37 às regiões correspondentes da sequência de controle Z. mays c.v. B73 Ubi-1 (figuras 5 a 7, Tabela 2). [00163] A figura 5 mostra as regiões de alinhamento de sequência do promotor a montante do promotor Z. mays c.v. LLN37 em comparação à região promotora a montante da sequência promotora de controle Z. mays c.v. B73 Ubi-1. A figura 6 mostra o alinhamento de sequência da 5’-UTR ou sequência líder do promotor Z. mays c.v. LLN37 em comparação à 5’-UTR ou sequência líder da sequência promotora de controle Z. mays c.v. B73 Ubi-1. A figura 7 mostra o alinhamento de sequência das regiões intrônicas do promotor Z. mays c.v. LLN37 em comparação à sequência intrônicas da sequência promotora de controle Z. mays c.v. B73 Ubi-1. [00164] Os elementos promotores obtidos de Z. mays c.v. LLN37 mostraram 99,5% de identidade de sequência (Tabela 2) para a sequência de Z. mays c.v. B73 Ubi-1. Caracterização da nova sequência promotora de Z. mays c.v. LLN37 confirmou que a maioria dos elementos regulatórios promotores (isto é, uma caixa TATA ou Elemento de Choque Térmico) tipicamente encontrados em um promotor funcional, foram também altamente conservados dentro das regiões promotoras de núcleo do promotor Z. mays c.v. LLN37 (Tabela 2). Por exemplo, a figura 5 mostra uma caixa TATA altamente conservada (pares de base 869-876 mostrados em itálicos e sublinhados) que foi identificada e descoberta ser localizada aproximadamente 50bp 5’ a montante do TSS no promotor na região a montante do novo promotor Z. mays c.v. LLN37 Ubi-1. Similarmente, a figura 5 mostra que duas sequências de Elemento de Choque Térmico em sobreposição (HSE) (pares de base 457-481 mostrados como sublinhados e 482-500 mos- trados em duplo sublinhado, respectivamente) foram conservadas no novo promotor Z. mays c.v. LLN37 Ubi-1 analisado neste estudo e foram localizados aproximadamente 200bp 5’ a montante do TSS. Além disso, um elemento regulatório promotor de 10bp localizado na região promotora a montante do promotor de Z. mays c.v. LLN37 Ubi-1 (pares de base 90-100 mostrados sublinhados) foi 100% idêntico ao mesmo elemento encontrado na região promotora a montante de Z. mays c.v. B73 Ubi-1 (Figura 5). [00165] Embora a região 5’-UTR ou líder do novo promotor Z. mays c.v. LLN37 Ubi-1 tenha sido 100% idêntica à sequência de controle Z. mays c.v. B73 Ubi-1 (FIG. 6), áreas de conservação de sequência ligeiramente menores na região promotora a montante (FIG. 5) e região de íntron (FIG. 7) foram identificadas. Por exemplo, as regiões promotoras a montante e íntron do promotor Zea mays c.v. LLN37 tiveram 99,9% e 99% de identidade de sequência ao promotor Z. mays c.v. B73 Ubi-1, respectivamente. De modo geral, todas as regiões do promotor Zea mays c.v. LLN37 foram altamente conservadas em comparação à sequência promotora de controle Z. mays c.v. B73 Ubi-1 (Tabela 2). [00166] Além disso, outros motivos regulatórios existem na região promotora a montante de Z. mays Ubi-1 que se estende 100-200bp 5’ a montante do TSS. Estes fatores de transcrição de ligação de motivos que interagem com o complexo de iniciação transcricional e facilitam sua montagem, melhoram sua estabilidade, ou aumentam a eficiência de escape de promotor visto que o mecanismo transcricional desenca-deia-se (Peremarti et al. 2010). Desse modo, deleções, substituições, e pareamentos errôneos dentro desta região regulatória poderia potencialmente afetar tanto a intensidade quanto a especificidade do promotor.

Exemplo 3: Construção de Vetor Usando os Novos Promotores para Expressão de Gene [00167] A menos que de outro modo indicado, manipulações biológicas e bioquímicas moleculares descritas neste e subsequentes exemplos foram realizadas por metodologias padrões como descrito, por exemplo, em Ausubel et al. (1995), e Sambrook et al. (1989), e atualizações dos mesmos. As construções usadas nos experimentos são descritas em maiores detalhes abaixo (Tabela 3). [00168] Os promotores Z. mays compreendendo o promotor a montante, 5’-UTR, e regiões intrônicas, como previamente descrito, foram extraídos do gene Ubi-1 da espécie Z. mays e os amplicons de PCR foram purificados por gel usando o QIAquick Gel Extraction Kit® (Qia-gen Carlsbad, CA). A sequência de polinucleotídeo promotora foi em seguida clonada em um Gateway Entry Vector® (Invitrogen) usando técnicas de clonagem padrões conhecidas na técnica. O resultante Gateway Entry Vector® compreendendo a sequência promotora Ubi-1 para Z. mays c.v. LLN37 foi confirmado por meio de digesto de restrição e sequenciamento. Um vetor de entrada de controle compreendendo a sequência promotora de Z. mays c.v. B73 Ubi-1 foi também clonada em um vetor de entrada de gateway usando técnicas de clonagem padrões na técnica. [00169] Além das sequências promotoras Ubi-1, o vetor de entrada também compreendeu o gene repórter de proteína fluorescente amarela da espécie Phialidium (P/7/YFP; Shagin, D. A., (2004) Mol Biol Evol. 21;841-50) com um íntron ST-LS1 incorporada na sequência (Vancanneyt, G., (1990) Mol Gen Genet. 220;245-50) e a região 3’-UTR do gene Zea mays Peroxidase 5 (ZmPer5; Patente dos Estados Unidos No. 6.699.984). São fornecidos os mapas vetores mostrando os vetores de entrada clonados compreendendo cada das sequências promotoras. A construção pDAB105742 corresponde ao vetor de entrada de controle compreendendo a sequência promotora Z. mays c.v. Β73 Ubi-1. A construção pDAB105741 corresponde ao vetor de entrada compreendendo sequência promotora Z. mays Ubi-1 LLN37. Desse modo, vetores de entrada compreendendo cassetes de expressão de gene compreendendo um promotor Z. mays Ubi-1, o gene PhiYFP, e o ZmPerS 3’-UTR foram estabelecidos. [00170] Como descrito na tabela 3, uma construção de vetor de expressão binário, compreendendo o gene repórter ΡΛ/YFP orientado pela nova sequência promotora e terminada pela ZmPerõ 3’-UTR, foi construída. Vetores de transformação ou expressão para transformação de embrião de milho mediada por Agrobacterium foram construídas pelo uso de métodos de clonagem padrão e reações de recombi-nação de Gateway® empregando um vetor binário de destinação padrão, pDAB101917, e os vetor de entrada compreendendo o cassete de expressão de genes, como descrito acima. [00171] O vetor de destinação binário, pDAB101917, compreendeu um gene de tolerância a herbicida, fosfinotricin acetiltransferase (PAT; Wehrmann et al., 1996, Nature Biotechnology 14:1274-1278). No vetor pDAB101917, expressão de gene PAT ficou sob o controle de um promotor Z. mays Ubi-1, 5’-UTR, e íntron. O vetor pDAB101917 também compreendeu uma região 3'-UTR do gene Z. mays lipase (ZmLip; Patente U.S. No. 7.179.902). O ZmLip 3-UTR foi usado para terminar a transcrição do mRNA PAT. A reação de recombinação Gateway® possibilitou a inserção de cada vetor de entrada compreendendo o cassete de expressão de gene (isto é, um promotor Z. mays c.v. LLN37 ou Z. mays c.v. B73 Ubi-1, o gene PhiYFP, e o ZmPer5 3’-UTR) no vetor binário de destinação pDAB101917. Os vetores de entrada foram inseridos no vetor de destinação pDAB101917 entre as fronteiras de T-DNA A e B, e a montante do cassete de expressão PAT. [00172] São fornecidos mapas vetores mostrando a construção de expressão binária, pDAB101917, com o cassete de expressão de genes compreendido de um promotor Z. mays Ubi-1, o gene P/í/YFP, e a ZmPerS 3’-UTR incorporada. A construção de controle, pDAB105748, corresponde ao cassete de expressão de gene compreendendo o promotor Z. mays c.v. B73 Ubi-1 (FIG. 8). Além disso, a construção pDAB105747 corresponde ao cassete de expressão de gene compreendendo a sequência promotora Z. mays c.v. LLN37 Ubi-1 (FIG. 9). Exemplo 4: Transformação de Planta [00173] As Construções de Vetor Binário, pDAB105748 (Z. mays c.v. B73) e pDAB105747 (Z. mays c.v. LLN37), foram cada uma transformada na linhagem Agrobacterium tumefaciens, EHA101, usando técnicas de transformação padrões conhecidas na arte. Colônias bac-terianas foram isoladas e DNA de plasmídeo binário foi extraído, purificado, e confirmado por meio de digestão de enzima de restrição. [00174] Transformação de plantas de milho foi realizada de acordo com o protocolo descrito em Vega et al., 2008, Plant Cell Rep 27:297-305 que empregou a transformação mediada por Agrobacterium e o gene fosfinotricin acetiltransferase (PAT; Wehrmann et al., 1996, Natu-re Biotechnology 14:1274-1278) como um marcador de planta selecio-nável. Culturas de Agrobacterium tumefaciens compreendendo as Construções de Vetor Binário (descritas acima) foram usadas para transformar plantas Hi-ll Z. mays c.v. e produzir eventos de milho transgênicos de primeiro ciclo, T0 (Tabela 4). Os embriões zigóticos imaturos foram produzidos, preparados, e colhidos 2,5 meses após a transformação. [00175] Os resultados de transformação para as construções de expressão de gene individuais são também descritas na Tabela 4. O número total de embriões produzidos, o número total de eventos transgênicos no estágio de calo e na planta total, bem como a percentagem de eficiência de transformação total são descritos. A eficiência de transformação total das construções de expressão binárias é menor do que anteriormente reportado (Vega et al., 2008) devido ao pobre vigor do embrião em muitos experimentos.

Exemplo 5: Análise de Número de Copias de Transgene [00176] Integração estável do transgene P/7/YFP dentro do genoma das plantas Z. mays transgênicas foi confirmada por meio de um ensaio de sonda de hidrólise. Mudas de Z. mays transgênicas estavel-mente transformadas que se desenvolveram a partir do calo foram obtidas e analisadas para identificar eventos que continham um pequeno número de cópias (isto é, 1 a 2 cópias) de inserções de filamento T de tamanho natural. [00177] O Sistema Roche Light Cycler 480™ foi usado para determinar o número de cópias de transgene de acordo com as instruções do fabricante. O método utilizou uma reação de PCR biplexada TaqMan® que empregou oligonucleotídeos específicos para o gene PhiYFP e para o gene de referência endógeno, Z. mays Invertase (Zmlnv; Acessão Genbank No: U16123.1), em um único ensaio. O número de cópias e zigosidade foi determinado medindo-se a intensidade de fluorescência específica de PhiYFP, com relação à fluorescência específica de Zmlnv, como comparado a padrões de número de cópia conhecidos. [00178] Um fragmento de DNA específico de gene PhiYFP foi amplificado com um conjunto de iniciador/sonda TaqMan® contendo uma sonda rotulada com pigmento fluorescente FAM™, e Zmlnv foi amplificado com um segundo conjunto de iniciador/sonda TaqMan® contendo uma sonda rotulada com fluorescência HEX™ (Tabela 5). Os iniciado-res e sondas para análise de número de cópia foram comercialmente sintetizados por Tecnologias de DNA Integradas (Coralville, IA). A porção fluorescente FAM™ foi excitada em uma densidade ótica de 465/510 nm, e a porção fluorescente HEX™ foi excitada em uma densidade ótica de 533/580 nm. [00179] Reações de PCR foram preparadas em um volume de reação de 10 μΙ final usando reagentes, como descrito na Tabela 6. Fragmentos de DNA específico de gene foram amplificados de acordo com as condições de termociclagem mencionadas na tabela 7. O número de cópias e zigosidade das amostras foram determinados me-dindo-se a intensidade relativa de fluorescência específica para o Gene Repórter, PhiYFP, para fluorescência específica para o gene de referência, Zmlnv, quando comparado a padrões de número de cópia conhecidos. [00180] Padrões de número de cópia foram criados diluindo-se o vetor, pDAB108706, em DNA genômico de Z. mays c.v. LLN37 (gDNA) para obter padrões com uma proporção conhecida de pDAB108706:gDNA. Por exemplo, amostras tendo uma, duas, e quarto cópias de DNA vetor por uma cópia do gDNA de Z. mays c.v. LLN37 gDNA foram preparadas. Uma e duas diluições de cópia do pDAB108706 misturadas com o padrão de gDNA de Z. mays c.v. LLN37 foram validadas contra um evento de Z. mays de controle que foi conhecido ser hemizigoto, e um evento de Z. mays de controle que foi conhecido ser homozigoto (isto é, evento 278 de Z. mays; veja a Publicação de Patente Internacional PCT No. WO 2011/022469 A2). [00181] Um ensaio de amplificação de PCR biplexado TaqMan® utilizando oligonucleotídeos específicos para o gene PAT e o gene de referência endógeno Zmlnv, respectivamente, foi realizado. Amplificação de PCR para detectar um fragmento de DNA específico do gene para PAT com um conjunto iniciador TaqMan® e uma sonda rotulada com pigmento fluorescente FAM™ foi empregada (Tabela 5). Um segundo conjunto iniciador e uma sonda rotulada com pigmento fluorescente HEX™ foi também usado para amplificar e detectar o gene de controle/referência endógeno Zmlnv (Tabela 5). A mistura de reação PAT TaqMan® foi preparada como mencionado na Tabela 6 e os fragmentos específicos foram amplificados de acordo com as condições mencionadas na Tabela 7. [00182] Resultados de uma análise de número de cópia de trans-gene de plantas transgênicas obtidos por meio de transformação com diferentes construções promotoras são mostrados na Tabela 8. Apenas plantas com 1 a 2 cópias do transgene PhiYFP foram transferidas para a estufa e desenvolvidas para outras análises de expressão.

Exemplo 6: Quantificação de ELISA de Proteínas de PhiYFP e PAT [00183] As plantas foram amostradas no estágio V4-5 de desenvolvimento usando um ensaio ELISA de folha. As amostram foram coletadas em placas de tubo de coleta de 96 cavidades e 4 discos de folha (tamanho de perfuração de orifício em papel) foram tiradas para cada amostra. Dois BBs de 4,5 mm (Daisy Corporation, Roger, AR) e 200 pL de tampão de extração [1x PBS suplementado com 0,05% de Tween®-20 e 0,05% de BSA (Millipore Probumin®, EMD Millipore Corp., Billerica, MA)] foram adicionados a cada tubo. Mais 200 pL de tampão de extração foram adicionados a cada tubo seguido por inversão para misturar. As placas foram centrifugadas durante 5 minutos a 3000 rpm. O sobrenadante foi transferido para as cavidades correspondentes em placa de 96 cavidades profundas armazenada em gelo. As placas Maxi-Sorp de 96 cavidades Nunc® (Thermo Fisher Scientífic Inc., Rockford, IL) foram usadas para ELISA. As placas foram revestidas com anticorpo de captura anti-YFP monoclonal de camundongo (OriGene Technologies Inc., Rockville, MD). O anticorpo foi diluído em PBS (1 pg/mL) e 150 pL de PBS diluído foram adicionados por cavidade. As placas foram incubadas durante a noite a 4Ό . Durante a noite, as placas foram mantidas em temperatura ambiente durante 20 a 30 minutos, antes de lavar 4x com 350 pL do tampão de lavagem [1x PBS suplementado com 0,05% de Tween®-20 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)]. [00184] As placas foram bloqueadas com 200 pL por cavidade de tampão de bloqueio [1x PBS suplementado com 0,05% de Tween®-20 mais 0,5% de BSA (Millipore Probumin®)] durante um mínimo de 1 hora a +37Ό seguido por lavagem 4x com 350 pL de tampão de lavagem (Tomtec QuadraWash™ 2, Tomtec, Inc., Hamden, CT). [00185] Para o ELISA de YFP, Evrogen recombinante Phi-YFP 1mg/mL (Axxora LLC, Farmingdale, NY) foi usado como um padrão.

Uma curva padrão de ajuste de parâmetro 5 (entre o 1 ng/ml e 0,125 ng/ml de padrões) foi usada para garantir que todos os dados se incluíssem na porção linear da curva. 100 pL de padrão ou amostra foram adicionados à cavidade. Uma diluição mínima de 1:4 de amostra no tampão de ensaio foi usada. As placas foram incubadas durante 1 hora em temperatura ambiente no agitador de placa (250 rpm; agitador de placa de título) seguido por lavagem 4x com 350 pL de tampão de lavahem (Tomtec QuadraWash™ 2). Cerca de 100 pL de 1 pg/mL de Anticorpo primário anti-PhiYFP policlonal de Coelho Evrogen (Axxora) foram adicionados a cada cavidade. As placas foram incubadas durante 1 hora em temperatura ambiente em um agitador de placa a 250 rpm seguido por lavagem 4x com 350 pL de tampão de lavagem (Tomtec QuadraWash™ 2). A seguir, 100 pL de anticorpo secundário de HRP de IgG anticoelho (Thermo Scientific) diluídos 1:5000 em tampão de bloqueio/ensaio, cujas proteínas de PAT foram quantificadas usando kit de Envirologix (Portland, ME). Os ELISAs foram realizados usando múltiplas diluições de extratos de planta e os reagentes e instruções essencialmente como fornecido pelos fornecedores.

Exemplo 7: Expressão de Planta Estável de Transgene Operavel-mente Ligado a Novos Promotores [00186] Expressão de proteína foi observada em tecido de plantas transgênicas. Por exemplo, expressão de P/7/YFP foi observada em calos de plantas T0 que foram estavelmente transformados por coculti-vo com Agrobacterium. As plantas transgênicas foram cultivadas de embriões de Z. mays transformadas usando as construções de vetor binário compreendendo o novo promotor, pDAB105747 (Z. mays c.v. LLN37, figura 9) e o promotor de controle, pDAB105748 (Z. mays c.v. B73, figura 8). Os calos de planta foram observados sob um estereo-microscópio (Leica Microsystems, Buffalo Grove, IL) usando um filtro YFP e uma fonte de luz de 500 nm. Exemplos representativos na ex- pressão estável de PhiYFP observados no tecido do calo das plantas de milho T0 transgênicas compreendendo pDAB105747 como comparado ao controle, pDAB105748, são mostradas na figura 10. Os dados confirmam que o novo promotor compreendendo pDAB105747 (Z. ma-ys c.v. LLN37), como descrito aqui, é capaz de regular a expressão robusta do gene PhiYFP em tecido de calo de plantas transgênicas T0. [00187] Como descrito na tabela 8, plantas inteiras que continham um baixo número de cópia (isto é, 1 a 2 cópias) do transgene PhiYFP transgene foram cultivadas em uma estufa. Em geral, cerca de cinco (5) a cerca de dez (10) eventos por construção e cerca de cinco (5) plantas por evento foram usadas para análise de expressão de T-,. Os dados de ELISA revelaram expressão consistente da proteína de PhiYFP nas folhas de plantas de milho usando construções de vetor compreendendo o novo promotor, pDAB 105747 (Z. mays c.v. LLN37), em comparação à construção de controle, pDAB105748 (Z. mays c.v. B73). [00188] Uma expressão de proteína PhiYFP média de aproximadamente 153,7 ng/mg (+/- 20,9 ng/mg) de PhiYFP foi observada quanto as plantas T-ι compreendendo a nova construção de promotor, pDAB105747 (Z. mays c.v. LLN37, figura 9), como comparado a aproximadamente 285,3 ng/mg (+/- 22,7 ng/mg) de proteína PhiYFP produzida pela planta de controle compreendendo a construção de controle, pDAB105748 (Z. mays c.v. B73, figura 8). Estes resultados confirmam que o novo promotor de Z. mays c.v. LLN37, como descrito aqui, foi útil na produção de traços transgênicos em níveis elevados da produção de proteína. [00189] Além disso, a expressão de PAT média para todas as plantas T-ι compreendendo pDAB105747 (Z. mays c.v. LLN37) foi de aproximadamente 73,2 ng/mg (+/- 6,8) como comparado a aproximadamente 105,8 ng/mg (+/- 7,4 ng/mg) de proteína PAT produzidos pela planta de controle compreendendo pDAB105748 do promotor de Z. mays c.v. B73. Em geral, a expressão de proteína PAT para todas as plantas de milho foi significantemente menor do que a expressão observada quanto ao gene PhiYFP em plantas de milho.

Expressão de proteína PhiYFP foi também medida em pólen derivado das bandeiras de plantas transgênicas T-, selecionadas das novas construções de promotor descritas aqui. Como mostrado na figura 11, a análise de imagem do pólen transgênico confirma que o novo promotor compreendendo pDAB 105747 (Z. mays c.v. LLN37), como descrito neste pedido, regula a expressão elevada de proteína PhiYFP em pólen.

Claims

1. Cassete de expressão de gene, caracterizado pelo fato de que compreende um promotor operavelmente ligado a um transge-ne, em que o promotor compreende um polinucleotídeo com pelo menos 90% de identidade de sequência à SEQ ID NO: 2.

2. Cassete de expressão de gene de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o promotor se hibridiza sob condições rigorosas em uma sonda de polinucleotídeo compreendendo uma identidade de sequência de pelo menos 90% a um complemento de SEQ ID NO: 2.

3. Cassete de expressão de gene de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o transgene operavelmente ligado codifica um polipeptídeo ou RNA pequeno.

4. Cassete de expressão de gene de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o transgene é selecionado do grupo que consiste em um transgene de resistência a inseticida, um transgene de tolerância a herbicida, um transgene de eficiência de uso de nitrogênio, um transgene de eficiência de uso de água, um transgene de qualidade nutricional, um transgene de ligação de DNA, e um transgene marcador selecionável.

5. Cassete de expressão de gene de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de também compreender uma região não transladada 3’.

6. Vetor recombinante, caracterizado pelo fato de compreender o cassete de expressão de gene como definido na reivindicação 1.

7. Vetor recombinante de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o vetor é selecionado do grupo que consiste em um plasmídeo, um cosmídeo, um cromossoma artificial bacte-riano, um vírus, e um bacteriófago.

8. Célula transgênica, caracterizada pelo fato de compreender o cassete de expressão de gene de acordo com a reivindicação 1.

9. Célula transgênica de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de que a célula transgênica é uma célula de planta transgênica.

10. Planta transgênica, caracterizada pelo fato de compreender uma célula de planta transgênica como definida na reivindicação 9.

11. Planta transgênica de acordo com a reivindicação 10, caracterizada pelo fato de que uma planta transgênica é uma planta monocotiledônea ou dicotiledônea.

12. Planta transgênica de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo fato de que a planta monocotiledônea é selecionada do grupo que consiste em uma planta de milho, uma planta de arroz, e uma planta de trigo.

13. Semente transgênica, caracterizada pelo fato de que é de uma planta transgênica como definida na reivindicação 10.

14. Célula transgênica caracterizada pelo fato de compreender um polinucleotídeo sintético com pelo menos 90% de identidade de sequência à SEQ ID NO: 2.

15. Célula transgênica de acordo com a reivindicação 14, caracterizada pelo fato de que o polinucleotídeo sintético se hibridiza sob condições rigorosas em uma sonda de polinucleotídeo compreendendo uma identidade de sequência de pelo menos 90% a um complemento de SEQ ID NO: 2.

16. Célula transgênica de acordo com a reivindicação 14, caracterizada pelo fato de que a célula transgênica é uma célula de planta transgênica.

17. Célula transgênica de acordo com a reivindicação 16, caracterizada pelo fato de que uma célula de planta transgênica é produzida por um método de transformação de planta.

18. Célula transgênica de acordo com a reivindicação 17, caracterizada pelo fato de que o método de transformação de planta é selecionado do grupo que consiste em um método de transformação mediado por Agrobacterium, um método de transformação de biolíti-cos, um método de transformação de carboneto de silício, um método de transformação de protoplasto, e um método de transformação de lipossoma.

19. Planta transgênica caracterizada pelo fato de compreender uma célula de planta transgênica como definida na reivindicação 14.

20. Planta transgênica de acordo com a reivindicação 19, caracterizada pelo fato de que uma planta transgênica é uma planta monocotiledônea.

21. Planta transgênica de acordo com a reivindicação 20, caracterizada pelo fato de que a planta monocotiledônea é selecionada do grupo que consiste em uma planta de milho, uma planta de arroz, e uma planta de trigo.

22. Semente transgênica, caracterizada pelo fato de que é de uma planta transgênica como definida na reivindicação 21.

23. Vetor recombinante, caracterizado pelo fato de compreender o cassete de expressão de gene como definido na reivindicação 14.

24. Vetor recombinante de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que o vetor é selecionado do grupo que consiste em um plasmídeo, um cosmídeo, um cromossoma artificial bacteriano, um vírus, e um bacteriófago.

25. Método para expressão de uma sequência de codificação heteróloga em uma planta transgênica, o método caracterizado pelo fato de compreender: a) Transformação da célula de planta com um cassete de expressão de gene compreendendo uma sequência de polinucleotídeo compreendendo SEQ ID NO: 2 operavelmente ligado à sequência de codificação heteróloga, que é operavelmente ligado a uma região não transladada 3’; b) Isolamento da célula de planta transformada compreendendo o cassete de expressão de gene; c) Regeneração da célula de planta transformada em uma planta transgênica; e, d) Obtenção da planta transgênica, em que uma planta transgênica compreende o cassete de expressão de gene compreendendo a sequência de polinucleotídeo compreendendo SEQ ID NO: 2.

26. Método de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que a sequência de codificação heteróloga é selecionada do grupo que consiste em uma sequência de codificação de resistência a inseticida, uma sequência de codificação de tolerância a herbicida, uma sequência de codificação de eficiência de uso de nitrogênio, uma sequência de codificação de eficiência de uso de água, uma sequência de codificação de qualidade nutricional, uma sequência de codificação de ligação de DNA, e uma sequência de codificação de marcador selecionável.

27. Método de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que a transformação da célula de planta é um método de transformação de planta.

28. Método de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que o método de transformação de planta é selecionado do grupo que consiste em um método de transformação mediado por Agrobacteríum, um método de transformação de biolíticos, um método de transformação de carboneto de silício, um método de trans- formação de protoplasto, e um método de transformação de liposso-ma.

29. Método de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que uma planta transgênica é uma planta transgênica monocotiledônea ou dicotiledônea.

30. Método de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pelo fato de que a planta transgênica monocotiledônea é selecionada do grupo que consiste em uma planta de milho, uma planta de trigo, e uma planta de arroz.

31. Semente transgênica, caracterizada pelo fato de que é de uma planta transgênica como definida na reivindicação 25.

32. Método de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que a sequência de codificação heteróloga é expressa em um tecido de planta transgênica.

33. Método de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que um tecido de planta transgênica é um tecido de raiz, broto, caule ou pólen de planta transgênica.

34. Método para isolamento de uma sequência de polinu-cleotídeo, caracterizado pelo fato de compreender uma identidade de sequência de pelo menos 90% à SEQ ID NO: 2, o método compreendendo: a) Identificação da sequência de polinucleotídeo compreendendo uma identidade de sequência de pelo menos 90% à SEQ ID; b) Produção de uma pluralidade de sequências de iniciadores de oligonucleotídeo, em que as sequências de iniciadores de oligonu-cleotídeo se ligam à sequência de polinucleotídeo compreendendo uma identidade de sequência de pelo menos 90% à SEQ ID; c) Amplificação da sequência de polinucleotídeo compreendendo uma identidade de sequência de pelo menos 90% à SEQ ID de uma amostra de DNA com sequências de iniciador de oligonucleotídeo selecionadas de sequências de iniciador de oligonucleotídeo; e, d) Isolamento da sequência de polinucleotídeo compreenden- do uma identidade de sequência de pelo menos 90% à SEQ ID.

35. Método de acordo com a reivindicação 34, caracterizado pelo fato de que a sequência de polinucleotídeo isolada compreendendo uma identidade de sequência de pelo menos 90% à SEQ ID NO: 2 é operavelmente ligada a um transgene.

36. Método de acordo com a reivindicação 35, caracterizado pelo fato de que o transgene operavelmente ligado codifica um po-lipeptídeo ou um RNA pequeno.

37. Sequência de polinucleotídeo purificada, caracterizada pelo fato de compreender pelo menos 90% de identidade de sequência à SEQ ID NO: 2, em que a sequência de polinucleotídeo purificada promove a expressão de um transgene.

38. Sequência de polinucleotídeo purificada de acordo com a reivindicação 37, caracterizada pelo fato de que uma sequência de sonda de polinucleotídeo compreendendo uma identidade de sequência de pelo menos 90% ao complemento de SEQ ID NO: 2 se hibridiza sob condições rigorosas na sequência de polinucleotídeo purificada de acordo com a reivindicação 37.

39. Sequência de polinucleotídeo purificada de acordo com a reivindicação 37, caracterizada pelo fato de que a sequência de polinucleotídeo purificada é operavelmente ligada a um transgene.

40. Transgene operavelmente ligado como definido na reivindicação 39, caracterizado pelo fato de que o transgene operavelmente ligado codifica um polipeptídeo.

41. Cassete de expressão de gene, caracterizado pelo fato de compreender a sequência de polinucleotídeo purificada operavelmente ligado a o transgene como definido na reivindicação 37, que é operavelmente ligado a uma região não transladada 3'.

42. Cassete de expressão de gene de acordo com a reivindicação 41, caracterizado pelo fato de que o transgene é selecionado do grupo que consiste em transgene de resistência a inseticida, transgene de tolerância a herbicida, transgene de eficiência de uso de nitrogênio, transgene de eficiência de uso de água, transgene de qualidade nutricional, transgene de ligação de DNA, e transgene de marcador selecionável.

43. Vetor recombinante, caracterizado pelo fato de compreender o cassete de expressão de gene como definido na reivindicação 41.

44. Vetor recombinante de acordo com a reivindicação 43, caracterizado pelo fato de que o vetor é selecionado do grupo que consiste em um vetor de plasmídeo, um vetor de cosmídeo, e um vetor de BAC.

45. Célula transgênica, caracterizada pelo fato de compreender a sequência de polinucleotídeo purificada de acordo com a reivindicação 37.

46. Célula transgênica de acordo com a reivindicação 45, caracterizada pelo fato de que as células transgênicas é uma célula de planta transgênica.

47. Planta transgênica, caracterizada pelo fato de compreender uma célula de planta transgênica como definida na reivindicação 46.

48. Planta transgênica de acordo com a reivindicação 47, caracterizada pelo fato de que uma planta transgênica é uma planta monocotiledônea.

49. Planta transgênica de acordo com a reivindicação 48, caracterizada pelo fato de que a planta monocotiledônea é selecionada do grupo que consiste em uma planta de milho, uma planta de trigo, e uma planta de arroz.

50. Semente transgênica, caracterizada pelo fato de que é de uma planta transgênica como definida na reivindicação 49.