ES2672095T3 - Polipéptidos bifuncionales - Google Patents

Polipéptidos bifuncionales Download PDF

Info

Publication number
ES2672095T3
ES2672095T3 ES16176249.7T ES16176249T ES2672095T3 ES 2672095 T3 ES2672095 T3 ES 2672095T3 ES 16176249 T ES16176249 T ES 16176249T ES 2672095 T3 ES2672095 T3 ES 2672095T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
tcr
polypeptide
chain
seq
binding partner
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES16176249.7T
Other languages
English (en)
Inventor
Bent Karsten Jakobsen
Annelise Brigitte Vuidepot
Yi Li
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Immunocore Ltd
Original Assignee
Immunocore Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=40834242&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=ES2672095(T3) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Immunocore Ltd filed Critical Immunocore Ltd
Application granted granted Critical
Publication of ES2672095T3 publication Critical patent/ES2672095T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6849—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a receptor, a cell surface antigen or a cell surface determinant
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A61K39/001136—Cytokines
    • A61K39/00114—Interleukins [IL]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/6425—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent the peptide or protein in the drug conjugate being a receptor, e.g. CD4, a cell surface antigen, i.e. not a peptide ligand targeting the antigen, or a cell surface determinant, i.e. a part of the surface of a cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/7051—T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2809—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against the T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/33—Fusion polypeptide fusions for targeting to specific cell types, e.g. tissue specific targeting, targeting of a bacterial subspecies

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Nitrogen Condensed Heterocyclic Rings (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

Una molécula bifuncional que comprende un compañero de unión polipeptídico específico para un epítopo de pMHC dado, y un polipéptido efector inmunológico, estando el extremo N-terminal del compañero de unión a pMHC unido al extremo C-terminal del polipéptido efector inmunológico, CON LA CONDICIÓN DE QUE dicho compañero de unión polipeptídico no sea un receptor de linfocitos T que comprenda la cadena alfa de SEQ ID No: 7 y la cadena beta de SEQ ID No: 9 y en la que el polipéptido efector inmunológico es una citocina.

Description

5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
DESCRIPCION
Polipéptidos bifuncionales
La presente invención se refiere a un polipéptido bifuncional que comprende un compañero de unión específico para un epítopo de péptido-MHC, tal como un anticuerpo o un receptor de linfocitos T ("TCR"), y un efector inmunológico que es una citocina, con la parte del efector inmunológico estando unida al extremo N-terminal de la parte de unión al péptido-MHC.
Antecedentes de la invención
Los TCR median el reconocimiento de complejos de Complejo Específico de Histocompatibilidad Principal (MHC)- péptido ("complejos de pMHC") que se presentan como epítopos en células de presentación de antígenos (APC), y los TCR median el reconocimiento de tales epítopos de pMHC por linfocitos T. Como tal, los TCR son esenciales para el funcionamiento de la rama celular del sistema inmunológico.
También se conocen anticuerpos que se unen de forma específica para epítopos de pMHC presentados por células de presentación de antígenos (véase por ejemplo: Neethling FA. et al., Vaccine (2008) 26 (25): 3092-102). Existen anticuerpos de fragmento de unión antígeno (Fab) (véase por ejemplo: Chames P. et al., Proc Natl Acad Sci U S A (2000) 97 (14): 7969-74; Willemsen RA. et al., J Immunol (2005) 174 (12): 7853-8; Willemsen R. et al., Cytometry A (2008) 73 (11): 1093-9) o fragmentos de anticuerpo de una sola cadena (scFv) (véase por ejemplo: Denkberg G. et al., J Immunol (2003) 171 (5): 2197-207; Marget M. et al., Mol Immunol (2005) 42 (5): 643-9) que se unen de forma específica a epítopos de pMHC.
El TCR nativo es una proteína de superficie celular heterodimérica de la superfamilia de inmunoglobulina que está asociada con proteínas invariantes del complejo CD3 implicado en la mediación de la transducción de señales. Los TCR existen en las formas ap y y§, que son estructuralmente similares, pero que tienen ubicaciones anatómicas y probablemente funciones muy distintas. Los ligandos de clase I y clase II de MHC también son proteínas de superfamilia de inmunoglobulina, pero están especializados para presentación de antígenos, con un sitio de unión de péptido altamente polimórfico que les permite presentar una diversidad de fragmentos peptídicos cortos en la superficie celular aPc.
La porción extracelular de los TCR ap heterodiméricos nativos consiste en dos polipéptidos (las cadenas a y p), cada uno de los cuales tiene un dominio constante proximal a la membrana y un dominio variable distal de la membrana. Cada uno de los dominios constante y variable incluye un puente disulfuro intracadena. Los dominios variables contienen los bucles altamente polimórficos análogos a las regiones determinantes de complementariedad (CDR) de los anticuerpos. CDR3 de los TCR ap interactúan con el péptido presentado por MHC, y las CDR 1 y 2 de los TCR ap interactúan con el péptido y el MHC. La diversidad de las secuencias de TCR se genera a través de la reorganización somática de la variable ligada (V), diversidad (D), unión (J), y genes constantes (C).
Los polipéptidos de cadena a funcionales están formados por regiones V-J-C reordenadas, mientras que las cadenas p consisten en regiones V-D-J-C. El dominio constante extracelular tiene una región proximal de membrana y una región de inmunoglobulina. Hay un solo dominio de cadena constante, conocido como TRAC. El dominio constante de la cadena p está formado por uno de los dos dominios constantes p diferentes, conocidos como TRBC1 y TRBC2 (nomenclatura IMGT). Hay cuatro cambios de aminoácidos entre estos dominios p constantes. Todos estos cambios están dentro del exón 1 de TRBC1 y TRBC2: N4K5->K4N5 y F37->Y (numeración IMGT, diferencias de TRBC1->TRBC2 siendo el cambio final de aminoácidos entre las dos regiones constantes de cadena p de TCR en el exón 3 de TRBC1 y TRBC2: V1->E.
Hasta la fecha se han ideado un número de construcciones para la producción de los TCR recombinantes. Estas construcciones se dividen en dos clases amplias, los TCR de cadena sencilla y los TCR diméricos. Los TCR de cadena sencilla (scTCR) son construcciones artificiales que consisten en una única cadena de aminoácidos, que al igual que los TCR heterodiméricos nativos se unen a complejos de MHC-péptido. Los scTCR pueden consistir en una combinación de regiones variables de TCR a y p (Va y Vp respectivamente) y regiones constantes de TCR a y p (Ca y Cp respectivamente), unidas por una secuencia conectora (L) en varias orientaciones posibles, por ejemplo, pero que no se limitan a, las siguientes Va-L-Vp, Vp-L-Va, Va-Ca-L-Vp o Vp-Cp-L-Va.
Un número de artículos describe la producción de heterodímeros de TCR que incluyen el puente disulfuro nativo que conecta las subunidades respectivas. Sin embargo, aunque tales TCR pueden ser reconocidos por anticuerpos específicos de TCR, no se ha demostrado que ninguno de ellos reconozca su ligando nativo en nada que no sea concentraciones relativamente elevadas y/o no sean estables.
En el documento WO 03/020763 se describe un TCR soluble que está plegado correctamente de manera que es capaz de reconocer su ligando nativo, es estable durante un periodo de tiempo y se puede producir en cantidades razonables. Este TCR comprende un dominio extracelular de cadena a de tCr dimerizado con respecto a un
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
dominio extracelular de cadena p de TCR respectivamente, por medio de un puente disulfuro intercadena entre cisteínas introducidas en las regiones constantes de las respectivas cadenas.
Los compañeros de unión a pMHC específicos, es decir, anticuerpos específicos para epítopos de pMHC, y los TCR de ambos tipos tanto heterodimérico como de una sola cadena, se han propuesto como vectores diana para la administración de agentes terapéuticos para células de presentación de antígeno. Para ese fin, se requiere que el agente terapéutico se asocie de algún modo con el compañero de unión a pMHC. Los agentes terapéuticos que se han sugerido para dicha administración dirigida en asociación con los compañeros de unión a pMHC incluyen anticuerpos (véase, por ejemplo: Mosquera LA. et al., J Immunol (2005) 174 (7): 4381-8), citocinas (véase por ejemplo: Belmont HJ. et al., Clin Immunol (2006) 121 (1): 29-39; Wen J. et al., Cancer Immunol Immunother (2008) 57 (12): 1781-94), y agentes citotóxicos. Cuando el agente terapéutico es un polipéptido, los medios de asociación con el compañero de unión a pMHC pueden ser por fusión peptídica, ya sea fusión directa o fusión a través de una secuencia conectora, al compañero de unión a pMHC. En estos casos, hay esencialmente solamente dos posibilidades de fusión. En el caso de anticuerpos de una sola cadena o los TCR, la fusión puede estar en principio en el extremo C- o N-terminal de la cadena de TCR; en el caso de anticuerpos heterodiméricos o los TCR, la fusión puede estar en principio en el extremo C- o N-terminal de cualquier cadena. Sin embargo, en la práctica, parece que todos los ejemplos conocidos de fusiones de agentes de unión ha pMHC-agente terapéutico han sido con el agente terapéutico fusionado en el extremo C-terminal (véase por ejemplo: Mosquera LA. et al., J Immunol (2005) 174 (7): 4381-8; Belmont HJ. et al., Clin lmmunol (2006) 121 (1): 29-39; Wen J. et al., Cancer Immunol Immunother (2008) 57 (12): 1781-94). Esto se produce por funcionalidad de un anticuerpo o TCR, ya sea heterodimérico o de una sola cadena, depende del plegamiento y la orientación correctos de las regiones variables. La fusión del agente terapéutico en el extremo N-terminal del compañero de unión a pMHC le coloca más allá de una de las regiones variables, y se ha producido una suposición en la técnica de que el agente terapéutico situado en el extremo N- terminal interferirá con la unión del anticuerpo o TCR con el complejo de pMHC, reduciendo de ese modo su eficacia de unión.
Descripción de la invención
La presente invención proporciona una molécula bifuncional que comprende un compañero de unión polipeptídico específico para un epítopo de pMHC dado y un polipéptido efector inmunológico, estando el extremo N del compañero de unión a pMHC unido al extremo C del polipéptido efector inmunológico, siempre que dicho compañero de unión polipeptídico no sea un receptor de linfocitos T que comprenda la cadena alfa SEQ ID NO: 7 y la cadena beta SEQ ID NO: 9, en el que el polipéptido efector inmunológico es una citocina.
Al contrario de la suposición en la técnica, ahora se ha encontrado que las moléculas bifuncionales en las que una parte de efecto inmunológico está fusionada con el extremo N-terminal de un compañero de unión a pMHC son más eficaces en su introducción de la respuesta inmunológica relevante que la de la construcción correspondiente en la que la fusión se produce en el extremo C- terminal del compañero de unión a pMHC. Este aumento de la respuesta inmunológica de la construcción fusionada en N se consigue a pesar de las afinidades de unión a pMHC similares de las versiones N- y C-fusionadas.
El compañero de unión polipeptídico pMHC puede ser un TCR. El compañero de unión a pMHC puede ser un par de polipéptidos TCR ap heterodiméricos, o un polipéptido TCR ap de una sola cadena, y el extremo N-terminal de la cadena a o p del par de polipéptidos TCR heterodiméricos, o el extremo N-terminal del polipéptido scTCR, puede estar unido a un aminoácido C-terminal del polipéptido efector inmunológico.
La unión del compañero de unión a pMHC y el polipéptido efector inmunológico puede ser directa, o indirecta a través de una secuencia conectora. Las secuencias conectoras normalmente son simples, porque están formadas por aminoácidos tales como glicina, alanina y serina que no tienen cadenas laterales voluminosas que probablemente limitan la flexibilidad. Las longitudes utilizables u óptimas de secuencias conectoras se determinan fácilmente en el caso de cualquier construcción dada de compañero de unión a pMHC-efector inmunológico. A menudo la secuencia conectora tendrá una longitud de menos de aproximadamente 12, tal como menos de 10, o de 5-10 aminoácidos.
En algunas realizaciones de la invención, el compañero de unión a pMHC es un par de polipéptidos TCR ap heterodiméricos en el que cada uno de los polipéptidos a y p tienen regiones TCR variables y constantes, pero carecen de regiones TCR transmembrana y citoplasmática. En tales casos, la parte de TCR es soluble. En moléculas bifuncionales particularmente precedentes de este tipo, está presente un puente disulfuro no nativo entre restos de las regiones constantes de los polipéptidos a y p de TCR. En particular, las regiones constantes de los polipéptidos a y p pueden estar unidas mediante un puente disulfuro entre restos de cisteína sustituidos por Thr 48 del exón 1 de TRAC1 y Ser 57 del exón 1 de TRBC1 o TRBC2, o por el puente disulfuro nativo entre Cys4 del exón 2 de TRAC*01 y Cys2 del exón 2 de TRBC1 o TRBC2.
En otras realizaciones de la invención, el compañero de unión a pMHC es un polipéptido TCR ap de una sola cadena, preferentemente del tipo Va-L-Vp, Vp-L-Va, Va-Ca-L-Vp o Vp-Cp-L-Va en el que Va y Vp son regiones
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
variables a y p de TCR respectivamente, Ca y Cp son regiones constantes a y p de TCR respectivamente, y L es una secuencia conectora.
Se conocen polipéptidos efectores inmunológicos. Son moléculas que inducen o estimulan una respuesta inmunológica, a través de activación directa o indirecta de la rama humoral o celular del sistema inmunológico, tal como mediante activación de los linfocitos T. Los ejemplos incluyen: anticuerpo Anti-CD2, anticuerpo Anti-CD3, anticuerpo Anti-CD4, anticuerpo Anti-CD8, anticuerpo Anti-CD44, anticuerpo Anti-CD45RA, anticuerpo Anti-CD45RB, anticuerpo Anti-CD45RO, anticuerpo Anti-CD49a, anticuerpo Anti-CD49b, anticuerpo Anti-CD49c, anticuerpo Anti- CD49d, anticuerpo Anti-CD49e, anticuerpo Anti-CD49f, anticuerpo Anti-CD16, anticuerpo Anti-CD28, anticuerpos Anti-IL-2R. El polipéptido efector inmunológico es un anticuerpo que puede ser un anticuerpo scFv, siendo uno de los mencionados un anticuerpo scFv anti-CD3. Los ejemplos de anticuerpos anti-CD3 incluyen, pero no se limitan a, OKT3, UCHT-1, BMA031 y 12F6. En la presente invención, el polipéptido efector inmunológico es una citocina, tal como IL-1, IL-1a, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-15, IL-21, IL-23, TGF-p, IFN-y o TNFa.
Los principios de la invención se ilustran en los Ejemplos que siguen a continuación.
Ejemplo A. Preparación de los TCR ap solubles que tienen polipéptidos efectores fusionados al extremo C- o N- terminal de la cadena p de TCR
Ejemplo de referencia A1. TCR de NY-ESO soluble con Anticuerpo Anti-CD3 como Polipéptido Efector
El TCR de NY-ESO soluble de este ejemplo tiene la propiedad de unirse al péptido SLLMWITQV cuando está presente en una molécula de HLA-A2.
La SEQ ID No: 1 (Figura 1) es la secuencia de aminoácidos de la cadena alfa de un TCR de NY-ESO, en el que C162 (usando la numeración de SEQ ID No: 1) sustituye a T48 de su región constante TRAC.
La SEQ ID No: 2 (Figura 2) es la secuencia de aminoácidos de la cadena beta de TCR de NY-ESO, en la que C170 (usando la numeración de SEQ ID No: 2) que incluye a S57 de su región constante TRBC2.
La SEQ ID No: 3 (Figura 3) es la secuencia de aminoácidos de un anticuerpo de scFv anti CD3 UCHT-1, que es la secuencia intra conector subrayada.
La Figura 4 muestra en forma de diagrama de bloques la estructura de un TCR de ap de NY-ESO soluble que tiene la cadena a de SEQ ID No: 1 y la cadena p de SeQ ID No: 2, y que tiene el anticuerpo de scFv anti CD3 UCHT-1 de SEQ ID No: 3 fusionado en el extremo N-terminal de la cadena p de TCR de SEQ ID No: 2 a través de una secuencia conectora L1, en particular GGEGS (SEQ ID No: 4).
La SEQ ID No: 14 (Figura 16) es la secuencia de aminoácidos de la cadena beta de la figura 2 con el extremo N- terminal de un anticuerpo scFv anti-CD3 fusionado con el extremo C-terminal de la cadena beta de TCR a través de otra secuencia conectora peptídica (subrayada).
La SEQ ID No: 15 (Figura 17) es la secuencia de aminoácidos de la cadena beta de la figura 2 con el extremo C- terminal de un anticuerpo scFv anti-CD3 fusionado con el extremo N-terminal de la cadena beta de TCR a través de la misma secuencia conectora peptídica que en la SEQ ID No: 14 (de nuevo subrayada).
La construcción de la Figura 4 se preparó como sigue a continuación:
Ligación
Los genes sintéticos que codifican (a) la cadena a de TCR de SEQ ID No: 1 y (b) la secuencia de fusión de SEQ ID No: 2 y SEQ ID No: 3, se ligaron por separado en plásmidos de expresión basados en pGMT7, que contienen el promotor T7 para expresión de nivel elevado en la cepa BL21-DE3(pLysS) de E. coli (Pan et al., Biotechniques (2000) 29 (6): 1234-8).
Expresión
Los plásmidos de expresión se transformaron por separado en la cepa BL21 (DE3) Rosetta pLysS de E. coli, y las colonias resistentes a ampicilina individuales se cultivaron a 37 °C en medio TYP (100 pg/ml de ampicilina) con una DO60o de ~0,6-0,8 antes de inducir la expresión de proteína con IPTG 0,5 mM. Las células se cosecharon tres horas después de la inducción por centrifugación durante 30 minutos a 4000 rpm en una centrifugadora J-6B de Beckman. Los sedimentos celulares se lisaron con 25 ml de Bug Buster (NovaGen) en presencia de MgCh y DNasa. Los sedimentos de cuerpos de inclusión se recuperaron por centrifugación durante 30 minutos a 13OO0 rpm en una centrifugadora J2-21 de Beckman. A continuación, se realizaron tres lavados con detergente para retirar los residuos celulares y los componentes de la membrana. Cada vez, el sedimento de cuerpos de inclusión se homogeneizaba en un tampón Triton (Tris-HCl 50 mM a pH 8,O, Triton-X1OO al O,5 %, NaCl 2OO mM, NaEDTA 1 mM,) antes de
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
sedimentar mediante centrifugación durante 15 minutos a 13000 rpm en una centrifugadora J2-21 de Beckman. A continuación, se retiró el detergente y la sal mediante un lavado similar en el siguiente tampón: Tris-HCl 50 mM a pH 8,0, NaEDTA 1 mM. Por último, los cuerpos de inclusión se dividieron en alícuotas de 30 mg y se congelaron a - 70 °C.
Replegamiento
Aproximadamente 20 mg de cadena a de TCR y 40 mg cuerpos de inclusión solubilizados de cadena p de scFv-TCR se descongelaron a partir de soluciones de reserva congeladas, diluidos en 20 ml de una solución de guanidina (clorhidrato de guanidina 6 M, Tris HCl 50 mM a pH 8,1, NaCl 100 mM, EDTA 10 mM, DTT 20 mM), y se incubó en un baño de agua a 37 °C durante 30 min-1 hr para asegurar la desnaturalización completa de la cadena. A continuación, la solución de guanidina que contenía cadenas de TCR totalmente reducidas y desnaturalizadas se inyectó en 1 litro del siguiente tampón de replegamiento: Tris 100 mM a pH 8,1, L-Arginina 400 mM, EDTA 2 mM, Urea 5 M. El par redox (clorhidrato de cistamina y diclorhidrato de cistamina (a concentraciones finales de 16 mM y 1,8 mM, respectivamente)) se añadieron aproximadamente 5 minutos antes de la adición de las cadenas a de TCR y p de scFv-TCR desnaturalizadas. La solución se dejó durante ~30 minutos. El scFv-TCR replegado se dializó en membranas de celulosa con tubo de diálisis (Sigma-Aldrich; Producto N.° D9402) frente a 10 l de H2O durante 18-20 horas. Después de este tiempo, el tampón de diálisis se cambió dos veces a Tris 10 mM recién preparado a pH 8,1 (10 l) y la diálisis continuó a 5 °C ± 3 °C durante otras ~8 horas. El scFv-TCR soluble y correctamente plegado se separó de los productos de degradación legados de forma errónea e impurezas con un método de purificación de 3 etapas como se describe a continuación. La segunda etapa de purificación puede ser cualquiera de una cromatografía de intercambio iónico o una cromatografía por afinidad, dependiendo del pl de la fusión anti-CD3 scFv- TCR soluble.
Primera etapa de purificación
El replegamiento dializado (en Tris 10 mM a pH 8,1) se cargó en una columna de intercambio aniónico POROS 50HQ y eluyendo la proteína unida con un gradiente de NaCl 0-500 mM sobre 6 volúmenes de columna usando un purificador Akta (GE Healthcare). Las fracciones del pico (que eluyen a una conductividad ~20 mS/cm) se almacenaron a 4 °C. Las fracciones del pico se analizaron con SDS-PAGE teñido con Colorante Instant Blue (Novexin) antes de su combinación.
Segunda etapa de purificación
Cromatografía de intercambio iónico
Purificación por intercambio catiónico
El tampón de las fracciones combinadas por intercambio aniónico se intercambió mediante dilución con MES 20 mM a pH 6-6,5, dependiendo del pl de la fusión de scFv-TCR. El scFv-TCR soluble y correctamente plegado se separó de los productos de degradación plegados de manera errónea cargando las fracciones combinadas diluidas (en MES 20 mM a pH 6-6,5) en una columna de intercambio catiónico POROS 50HS y eluyendo la proteína unida con un gradiente de NaCl 0-500 mM sobre 6 volúmenes de columna usando un purificador Akta (GE Healthcare). Las fracciones del pico (que eluyen a una conductividad ~10 mS/cm) se almacenaron a 4 °C.
Como alternativa, la purificación de intercambio iónico usando matriz de hidroxiapatita se puede usar como se explica a continuación.
Cromatografía de hidroxiapatita
El tampón de las fracciones combinadas por intercambio aniónico se intercambió mediante dilución con NaH2PO4 10 mM a pH 6,0. El scFv-TCR soluble y correctamente plegado se separó de los productos de degradación plegados de manera errónea cargando las fracciones combinadas diluidas (en NaH2PO4 10 mM a pH 6,0) en una columna de hidroxiapatita y eluyendo la proteína unida con un gradiente de NaH2PO4 10-500 mM/NaCl 1 M sobre 6 volúmenes de columna usando un purificador Akta (GE Healthcare). Las fracciones del pico (que eluyen a una conductividad ~20 mS/cm) se almacenaron a 4 °C.
Cromatografía por afinidad
Para algunas fusiones de scFv-TCR con un pl cercano a 6-6,5, la etapa de intercambio iónico no se puede usar pero se puede sustituir por una etapa de cromatografía por afinidad. La columna de cromatografía por afinidad hacia proteína L (Pierce, número de producto 89928) aísla y purifica ciertas clases de inmunoglobulina a través de sus cadenas ligeras kappa. La proteína L también se puede unir a fragmentos variables de una sola cadena (scFv). El tampón de las fracciones combinadas por intercambio aniónico se intercambió mediante dilución con PBS/azida sódica al 0,02 %. El scFv-TCR soluble y correctamente plegado se separó de los productos de degradación plegados de manera errónea cargando las fracciones combinadas diluidas en una columna de Proteína L y eluyendo
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
la proteína unida con un gradiente de Glicina 0-25 mM a pH 2,3/azida sódica al 0,02 % sobre 3 volúmenes de columna usando un purificador Akta (GE Healthcare). El scFv-TCR eluyó muy tarde en el gradiente y el pH de las fracciones eluidas se neutralizó mediante adición de Tris a pH 8,1 (concentración final de Tris 100 mM a pH 8,1). Las fracciones del pico se almacenaron a 4 °C.
Etapa final de purificación
Las fracciones del pico de la segunda etapa de purificación se analizaron con SDS-PAGE teñido con Colorante Instant Blue (Novexin) antes de su combinación. A continuación, las fracciones combinadas se concentraron para la etapa de purificación final, cuando el scFv-TCR soluble se purificó y se caracterizó usando una columna de filtración en gel Superdex S200 (GE Healthcare) equilibrada previamente en tampón de PBS (Sigma). El pico que eluye a un peso molecular relativo de aproximadamente 78 kDa se analizó con SDS-PAGE teñido con Colorante Instant Blue (Novexin) antes de su combinación.
Las construcciones de las Figuras 5, 6 y 7 se prepararon de una manera similar a la que se ha descrito para la construcción de la Figura 4:
La Figura 5 muestra en forma de diagrama de bloques la estructura de un TCR ap de NY-ESO soluble que tiene la cadena a de SEQ ID No: 1 y la cadena p de SEQ iD No: 2, y que tiene el anticuerpo scFv anti CD3 UCHT-1 de SEQ ID No: 3 fusionado en el extremo N terminal de la cadena p de TCR de SEQ ID No: 2 a través de una secuencia conectora L2, en particular AHHSEDPSSKAPKAP (SEQ ID No: 5).
La Figura 6 muestra en forma de diagrama de bloques la estructura de un TCR ap de NY-ESO soluble que tiene la cadena a de SEQ ID No: 1 y la cadena p de SEQ iD No: 2, y que tiene el anticuerpo scFv anti CD3 UCHT-1 de SEQ ID No: 3 fusionado en el extremo N terminal de la cadena p de TCR de SEQ ID No: 2 a través de una secuencia conectora L3, en particular GGEGGGSEGGGS (SEQ ID No: 6).
La Figura 7 muestra en forma de diagrama de bloques la estructura de un TCR ap de NY-ESO soluble que tiene la cadena a de SEQ ID No: 1 y la cadena p de SEQ iD No: 2, y que tiene el anticuerpo scFv anti CD3 UCHT-1 de SEQ ID No: 3 fusionado en el extremo C terminal de la cadena p de TCR de SEQ ID No: 2 a través de una secuencia conectora L4 que en este caso es el aminoácido individual S.
Las proteínas de fusión que tienen la cadena a de TCR de SEQ ID No: 1 y la cadena p de TCR de scFv anti-CD3 de SEQ ID No: 14, en la que el anti-CD3 scFv se fusiona con el extremo C-terminal de la cadena beta de TCR, o la cadena a de TCR de SEQ ID No: 1 y la cadena p de TCR de scFv anti-CD3 de SEQ ID No: 15, en la que el scFv anti-CD3 se fusiona con el extremo N-terminal de la cadena beta de TCR se prepararon de una manera similar a la que se ha descrito para las construcciones de las Figuras 4, 5, 6 y 7.
Ejemplo A2. TCR quimérico soluble con Citocinas como Polipéptidos Efectores
La SEQ ID No: 7 (Figura 8) es la secuencia de aminoácidos de la cadena alfa de un TCR que tiene la propiedad de unirse a un péptido obtenido a partir de insulina de murino, LYLVCGERG (SEQ ID NO: 8), presentado por el complejo H-2Kd de murino. (LYLVCGERG- H-2Kd), en el que C158 (usando la numeración de SEQ ID No: 7) sustituye a T48 de su región constante TRAC.
La SEQ ID No: 9 (Figura 9) es la secuencia de aminoácidos de la cadena beta del mismo TCR que se une al complejo LYLVCGERG- H-2Kd de murino, en el que C171 (usando la numeración de SEQ ID No: 9) sustituye a S57 de su región constante TRBC2.
El TCR de SEQ ID No: 7 y 9 es un TCR quimérico que consiste en una cadena alfa y beta de TCR, cada una comprendiendo una región variable de murino una región constante humana. La versión quimérica del TCR se construyó para mejorar los problemas de replegamiento encontrados con el TCR totalmente murino, y se mostró que el TCR quimérico tenía la misma afinidad que el TCR murino para el complejo H-2Kd de péptido-murino obtenido a partir de insulina de murino.
La SEQ ID No: 10 (Figura 10) es la secuencia de aminoácidos de un polipéptido IL-4 de murino.
La SEQ ID No: 11 (Figura 11) es la secuencia de aminoácidos de un polipéptido IL-13 de murino.
La Figura 12 muestra en forma de diagrama de bloques la estructura de un TCR ap de de insulina quimérico que tiene la cadena a de SEQ ID No: 7 y la cadena p de SEQ ID No: 9, y que tiene el IL-4 de murino de SEQ ID No: 10 fusionado en el extremo N terminal de la cadena p de TCR de SEQ ID No: 9 a través de la secuencia conectora L5, en particular GGEGGGP (SEQ ID No: 12).
La Figura 13 muestra en forma de diagrama de bloques la estructura de un TCR ap de de insulina quimérico que tiene la cadena a de SEQ ID No: 7 y la cadena p de SEQ ID No: 9, y que tiene el IL-4 de murino de SEQ ID No: 10
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
fusionado en el extremo C terminal de la cadena p de TCR de SEQ ID No: 9 a través de la secuencia conectora L6, en particular GSGGP (SEQ ID No: 13).
La Figura 14 muestra en forma de diagrama de bloques la estructura de un TCR ap de de insulina quimérico que tiene la cadena a de SEQ ID No: 7 y la cadena p de SeQ ID No: 9, y que tiene el IL-13 de murino de SEQ ID No: 11 fusionado en el extremo N terminal de la cadena p de TCR de SEQ ID No: 9 a través de la secuencia conectora L5, en particular GGEGGGP (SEQ ID No: 12).
La Figura 15 muestra en forma de diagrama de bloques la estructura de un TCR ap de de insulina quimérico que tiene la cadena a de SEQ ID No: 7 y la cadena p de SeQ ID No: 9, y que tiene el IL-13 de murino de SEQ ID No: 11 fusionado en el extremo C terminal de la cadena p de TCR de SEQ ID No: 9 a través de la secuencia conectora L6, en particular GSGGP (SEQ ID No: 13).
Las construcciones de las Figuras 12 - 15 se prepararon como sigue a continuación.
Ligación
Los genes sintéticos que codifican (a) la cadena a de TCR de SEQ ID No: 7 y (b) la secuencia de fusión de SEQ ID No: 9 y SEQ ID No: 10 o 11, se ligaron por separado en plásmidos de expresión basados en pGMT7, que contienen el promotor T7 para expresión de nivel elevado en la cepa BL21-DE3(pLysS) de E. coli (Pan et al., Biotechniques (2000) 29 (6): 1234-8).
Expresión
Los plásmidos de expresión que contienen la cadena a de TCR y citocina - cadena p, respectivamente se transformaron por separado en la cepa BL21 (DE3) Rosetta pLysS de E. coli, y las colonias resistentes a ampicilina individuales se cultivaron a 37 °C en medio TYP (100 pg/ml de ampicilina) con una DO60o de ~0,6-0,8 antes de inducir la expresión de proteína con IPTG 0,5 mM. Las células se cosecharon tres horas después de la inducción por centrifugación durante 30 minutos a 4000 rpm en una centrifugadora J-6B de Beckman. Los sedimentos celulares se lisaron con 25 ml de Bug Buster (NovaGen) en presencia de MgCh y DNasa. Los sedimentos de cuerpos de inclusión se recuperaron por centrifugación durante 30 minutos a 13000 rpm en una centrifugadora J2-21 de Beckman. A continuación, se realizaron tres lavados con detergente para retirar los residuos celulares y los componentes de la membrana. Cada vez, el sedimento de cuerpos de inclusión se homogeneizaba en un tampón Triton (Tris-HCl 50 mM a pH 8,0, Triton-X100 al 0,5 %, NaCl 200 mM, NaEDTA 10 mM,) antes de sedimentar mediante centrifugación durante 15 minutos a 13000 rpm en una centrifugadora J2-21 de Beckman. A continuación, se retiró el detergente y la sal mediante un lavado similar en el siguiente tampón: Tris-HCl 50 mM a pH 8,0, NaEDTA 1 mM. Por último, los cuerpos de inclusión se dividieron en alícuotas de 30 mg y se congelaron a -70 °C. El rendimiento de la proteína de cuerpos de inclusión se cuantificó por solubilización con guanidina-HCl 6 M y se tomó una medición de la DO en un espectrofotómetro U-2001 de Hitachi. A continuación, la concentración de proteínas se calculó usando el coeficiente teórico de extinción.
Replegamiento
Aproximadamente 20 mg de cadena a de TCR y 40 mg cuerpos de inclusión solubilizados de cadena p de citocina- TCR se descongelaron a partir de soluciones de reserva congeladas, diluidos en 20 ml de una solución de guanidina (clorhidrato de guanidina 6 M, Tris HCl 50 mM a pH 8,1, NaCl 100 mM, EDTA 10 mM, DTT 20 mM), y se incubó en un baño de agua a 37 °C durante 30 min-1 hr para asegurar la desnaturalización completa de la cadena. A continuación, la solución de guanidina que contenía cadenas de TCR totalmente reducidas y desnaturalizadas se inyectó en 1 litro de tampón de replegamiento frío (5-10 °C): Tris 100 mM a pH 8,1, L-Arginina 400 mM, EDTA 2 mM, Urea 5 M. El par redox (clorhidrato de cistamina y diclorhidrato de cistamina (a concentraciones finales de 10 mM y 2,5 mM, respectivamente)) se añadieron aproximadamente 5 minutos antes de la adición de las cadenas a de TCR y p de citocina-TCR desnaturalizadas. La solución se dejó durante ~30 minutos. El citocina-TCR replegado se dializó en membranas de celulosa con tubo de diálisis (Sigma-Aldrich; Producto N.° D9402) frente a 10 l de H2O durante 1820 horas. Después de este tiempo, el tampón de diálisis se cambió dos veces a Tris 10 mM recién preparado a pH 8,1 (10 l) y la diálisis continuó a 5 °C ± 3 °C durante otras ~8 horas.
Purificación
La fusión de citocina-TCR solubles se separó a partir de productos de degradación e impurezas mediante un método de purificación de 3 etapas a TA como se describe a continuación.
Primera etapa de purificación
El replegamiento dializado se filtró usando una cápsula Sartopore de 0,2 pm (Sartorius) antes de purificación en columna. El replegamiento filtrado se cargó en una columna de intercambio aniónico POROS 50HQ y eluyendo la proteína unida con un gradiente de NaCl 0-500 mM sobre 6 volúmenes de columna usando un purificador Akta (GE
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Healthcare). Las fracciones del pico que eluyen a NaCI 250 mM, que consisten en la proteína plegada correctamente, se almacenaron a 4 °C. Las fracciones del pico se analizaron con SDS-PAGE teñido con Colorante Instant Blue (Novexin) antes de su combinación.
Segunda etapa de purificación
Las fracciones combinadas que contienen citocina-TCR soluble se mezclaron con un volumen equivalente de Tris 50 mM/(NH4)2SO4 1 M a pH 8 para dar una concentración final de (NH4)2SO4 0,5 M y una conductividad de 75-80 mS/cm a TA. La citocina-TCR soluble se separó de los productos de degradación impurezas cargando esta muestra en una columna de interacción hidrófoba de butilo (5 ml de HiTrap de GE Healthcare) equilibrada previamente (Tris 50 mM/(NH4)2SO4 0,5 M a pH 8) y recogiendo el flujo continuo usando un purificador Akta (GE-Healthcare). La muestra de flujo continuo que contenía la citocina-TCR soluble se analizó con SDS-PAGE teñido con Colorante Instant Blue (Novexin) antes de su combinación y se almacenó a 4 °C.
Etapa final de purificación
Las fracciones combinadas se diluyeron con un volumen equivalente de Tris 10 mM a pH 8 y se concentraron a 10 ml (concentración de <3 mg/ml). La citocina-TCR soluble se purificó usando una columna de filtración en gel Superdex S200 (GE Healthcare) equilibrada previamente en tampón de PBS (Sigma). El pico que eluye a un peso molecular relativo de aproximadamente 63 kDa se analizó con SDS-PAGE teñido con Colorante Instant Blue (Novexin) antes de su combinación.
Ejemplo B. Propiedades de los TCR ap solubles que tienen polipéptidos efectores fusionados con el extremo C- o N- terminal de la cadena p de TCR
Ejemplo de referencia B1. TCR de NY-ESO soluble con Anticuerpo Anti-CD3 como Polipéptido Efector
a. Redirección y activación de linfocitos CD8+ T por el TCR de NY-ESO soluble fusionado con anticuerpo anti-CD3 frente a células de presentación de péptido NY-ESO
El siguiente ensayo se realizó para demostrar la activación de linfocitos T citotóxicos (CTL) mediante una fusión de scFv-TCR anti-CD3 a través de un complejo específico de péptido-MHC. La producción de IFN-y, tal como se mide usando el ensayo ELISPOT, se usó como una lectura para activación de linfocitos T citotóxicos (CTL) y la evaluación de la potencia de la porción de scFv anti-CD3 de la fusión.
Reactivos
Medio de ensayo: FCS al 10 % (Gibco, N.° de Cat 2011-09), 88 % RPMI 1640 (Gibco, N.° de Cat 42401), glutamina al 1 % (Gibco N.° de Cat 25030) y penicilina/estreptomicina al 1 % (Gibco N.° de Cat 15070-063).
Péptido: (SLLMWITQV) disuelto inicialmente en DMSO (Sigma, N.° de cat D2650) a 4 mg/ml y congelado. Las células T2 se expulsaron con el péptido descrito y se usaron como células diana.
Tampón de lavado: PBS 0,01 M PBS/Tween 20 al 0,05 %
PBS (Gibco N.° de Cat 10010)
El kit Enzimático de ELISPOT de PVDF de IFNy Humano (Diaclone, Francia; N.° de Cat 856.051.020) contiene todos los otros reactivos requeridos. (Solución de anticuerpos de captura y detección, leche en polvo desnatada, BSA, estreptavidina-fosfatasa alcalina y BCIP/NBT así como las placas de 96 pocillos de de ELISPOT de PVDF de IFN-y Humano).
Método
Preparación de células diana
Las células diana usadas en este método eran cualquiera de (1) células naturales de presentación de epítopo (tales como células Mel624 o Mel526) o (2) células T2 pulsadas con el péptido de interés, descritas en la sección de reactivos. Las suficientes células diana (50 000 células/pocillo) se lavaron mediante centrifugación tres veces a 1200 rpm, 10 min en una Megafuge 1.0 (Heraeus). A continuación, las células se volvieron a suspender en medio de ensayo a 106 células/ml.
Preparación de células efectoras
Las células efectoras (linfocitos T) usadas en este método fueron cualquiera de linfocitos CD8+ T (obtenidos por selección negativa (usando el Kit de Aislamiento Negativo de CD8, Dynal, N.° de Cat 113.19) de PBL), linfocitos T de una línea de células EBV o las PBMC. Las células efectoras se descongelaron y se colocaron en medio de ensayo antes de su lavado mediante centrifugación a 1200 rpm, 10 min en una Megafuge 1.0 (Heraeus). A continuación, las células se volvieron a suspender en medio de ensayo a una concentración final requerida de 4X.
Preparación de reactivo/compuesto de ensayo
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Las concentraciones variables de compuestos de ensayo (las fusiones TCR-anti-CD3; de 10 nM a 0,03 pM) se prepararon por dilución en medio de ensayo para dar una concentración final de 4X.
ELISPOT
Las placas se prepararon como sigue a continuación: 100 jl de anticuerpo de captura anti-IFN-Y se diluyeron en 10 ml de PBS estéril por placa. A continuación, se tomaron alícuotas de 100 jl del anticuerpo de captura diluido en cada pocillo. A continuación, las placas se incubaron durante la noche a 4 °C. Después de la incubación, las placas se lavaron (programa 1, placa de tipo 2, lavador de placas de 96 pocillos Ultrawash Plus; Dynex) para retirar el anticuerpo de captura. A continuación, las placas se bloquearon mediante la adición de 100 jl de leche desnatada al 2 % en PBS estéril a cada pocillo y las placas se incubaron a temperatura ambiente durante dos horas. A continuación, la leche desnatada se lavó de las placas (programa 1, placa de tipo 2, lavador de placas de 96 pocillos Ultrawash Plus, Dynex) y cualquier tampón de lavado restante se retiró girando rápidamente y dando golpecitos a las placas ELISPOT en una toalla de papel.
A continuación, los componentes del ensayo se añadieron a la placa ELISPOT en el siguiente orden:
50 jl de células diana 106 células/ml (dando un total de 50 000 células diana/pocillo)
50 jl de reactivo (las fusiones de scFv-TCR anti-CD3; concentraciones variables)
50 jl de medio (medio de ensayo)
50 jl de células efectoras (entre 1000 y 50000 células CD8+/pocillo; entre 500 y 1000 células EBV/pocillo; entre
1000 y 50000 PBMC/pocillo).
A continuación, las placas se incubaron durante la noche (37 °C / CO2 al 5 %). Al día siguiente, las placas se lavaron tres veces (programa 1, placa de tipo 2, lavador de placas de 96 pocillos Ultrawash Plus, Dynex) con tampón de lavado y se dan golpecitos en la toalla de papel para retirar el exceso de tampón de lavado. A continuación, se añaden a cada pocillo 100 jl de anticuerpo de detección primario. El anticuerpo de detección primario se preparó mediante la adición de 550 jl de agua destilada a un vial de anticuerpo de detección suministrado con el kit Diaclone. A continuación, se diluyeron 100 jl de esta solución en 10 ml de PBS/BSA al 1 % (el volumen requerido para una sola placa). A continuación, las placas se incubaron a temperatura ambiente durante al menos 2 hr antes de ser lavadas tres veces (programa 1, placa de tipo 2, lavador de placas de 96 pocillos Ultrawash Plus, Dynex) con tampón de lavado, el exceso de tampón de lavado se retiró dando golpecitos a la placa en una toalla de papel.
la detección secundaria se realizó mediante la adición de 100 jl de estreptavidina-fosfatasa alcalina diluida a cada pocillo e incubando la placa a temperatura ambiente durante 1 hora. La estreptavidina-fosfatasa alcalina se preparó mediante la adición de 10 jl de estreptavidina-fosfatasa alcalina a 10 ml de PBS/BSA al 1 % (el volumen requerido para una sola placa). A continuación, las placas se lavaron tres veces (programa 1, placa de tipo 2, lavador de placas de 96 pocillos Ultrawash Plus, Dynex) con tampón de lavado y se dieron golpecitos en una toalla de papel de aluminio para retirar el exceso de tampón de lavado. A continuación, se añadieron 100 jl de solución de BCIP/NBT, tal como se suministra con el kit Diaclone, a cada pocillo. Durante el desarrollo, las placas se cubrieron en papel de aluminio y se dejaron durante 5 - 15 min. Las placas en desarrollo se comprobaron regularmente para aplicaciones puntuales durante este periodo de tiempo para determinar el tiempo óptimo para terminar la reacción. Las placas se lavaron en un fregadero de agua corriente para terminar el desarrollo de la reacción, y se secan agitando antes de su desmontaje en sus tres partes componentes. A continuación, las placas se secaron a 50 °C durante 1 hr antes de hacer el recuento de las aplicaciones puntuales que se han formado en la membrana usando un lector de placas Immunospot (CTL; Cellular Technology Limited).
RESULTADOS
Las construcciones de fusión de scFv-TCR anti-CD3 de las Figuras 4-7 se sometieron a ensayo con el ensayo ELISPOT (como se ha descrito anteriormente). El número de aplicaciones puntuales de ELISPOT observadas en cada pocillo se representó frente a la concentración de la construcción de ensayo usando Prism (Graph Pad). A partir de estas curvas de dosis-respuesta, se determinaron los valores de CE50 (los valores de CE50 se determinan a la concentración de la fusión de scFv-TCR anti-CD3 que induce un 50 % de la respuesta máxima).
Construcción de Ensayo
CE50 CE50 CE50
Fig 7 Fusión C-terminal
5,044e-9 1,864e-9 2,383e-9
Fig 5 Fusión N-terminal
8,502e-11
Fig 4 Fusión N-terminal
4,825e-11
Fig 6 Fusión N-terminal
3,95e-11
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Estos resultados muestran que las construcciones N-fusionadas de las Figuras 4, 5 y 6 eran al menos 2 veces más potentes en su capacidad para activar los linfocitos T citotóxicos que la construcción C-fusionada de la Figura 7.
b. Redirección de linfocitos CD8+ T por el TCR de NY-ESO soluble fusionado un anticuerpo anti-CD3 para eliminar la línea de linfocitos B transformados por IM9 EBV (ensayo de citotoxicidad no radiactivo)
El siguiente ensayo se realizó para demostrar la activación de linfocitos T citotóxicos (CTL) mediante una fusión TCR-anti-CD3 a través de un complejo específico de péptido-MHC y la evaluación de la potencia de la porción de scFv anti-CD3 de la fusión para activar los CTL para eliminar las células IM9. Este ensayo es una alternativa colorimétrica para los ensayos de citotoxicidad de liberación de 51Cr y mide de forma cuantitativa la lactato deshidrogenasa (LDH) que es una enzima que se libera después de la lisis celular. La LDH liberada en sobrenadantes de cultivo se mide con un ensayo enzimático acoplado de 30 minutos, que da como resultado la conversión de una sal de tetrazolio (INT) en un producto de rojo formazán. La cantidad de color formada es proporcional al número de células plisadas. Los datos de absorbancia se recogen usando un lector de placas de 96 pocillos convencional a 490 nm.
Materiales
- Ensayo de Citotoxicidad No Radiactivo CytoTox96® (Promega) (G1780) contiene Mezcla de Sustrato, Tampón de Ensayo, Solución de Lisis, y Solución de Parada
- Medio de ensayo: FCS al 10 % (inactivado por calor, Gibco, N.° de cat 10108-165), RPMI 1640 al 88 % sin rojo fenol (Invitrogen, N.° de cat 32404014), glutamina al 1 %, 200 mM (Invitrogen, N.° de cat 25030024), penicilina/estreptomicina al 1 % (Invitrogen N.° de cat 15070063)
- Placa de cultivo tisular de 96 pocillos de fondo redondo de micropocillo Nunc (Nunc, N.° de cat 163320)
- Placas Maxisorb Nunc-Immuno (Nunc, N.° de cat 442404).
Método
Preparación de células diana
Las células diana usadas en este método eran la línea de linfocitos B transformada por IM9 EBV obtenida a partir de un paciente de mieloma múltiple (HLA-A2+ NY-ESO+). La línea de células de melanoma Mel526 se usó como un control y es HLA-A2+ NY-ESO-. Las células diana se prepararon en medio de ensayo: la concentración de células diana se ajustó a 2 x 105 células/ml para dar 1 x 104 células/pocillo 50 pl.
Preparación de células y efectoras
Las células efectoras usadas en este ensayo eran linfocitos CD8+ T. La proporción de efector con respecto a diana usada era 10:1 (2 x 106 células/ml para dar 1 x 105 células/pocillo en 50 pl).
Preparación de reactivo/compuesto de ensayo
Las concentraciones variables de las fusiones de of the NY-ESO TCR-anti-CD3, que tienen la cadena alfa de TCR de SEQ ID No: 1 y la fusión de scFv anti-CD3 de cadena beta de TCR de SEQ ID No: 14, o que tienen la cadena alfa de TCR de SEQ ID No: 1 y la fusión de scFv anti-CD3 de cadena beta de TCR de SEQ iD No: 15, se prepararon como se ha descrito en el ejemplo A1 y se prepararon para este ensayo por dilución (concentración final de 10-13 a 10-8 M) en medio de ensayo.
Preparación del ensayo
Los componentes del ensayo se añadieron a la placa en el siguiente orden:
- 50 pl de células diana, IM9 o Mel526 (preparadas como se ha explicado anteriormente), a cada pocillo.
- 50 pl de reactivo (preparado como se ha explicado anteriormente) a cada pocillo.
- 50 pl de células efectoras (preparadas como se ha explicado anteriormente) a cada pocillo.
Varios controles se prepararon cómo se explica a continuación:
- Liberación espontánea del efector: 50 pl de células efectoras solo.
- Liberación espontánea de células diana: 50 pl de células diana solo.
- Liberación máxima de diana: 50 pl de células diana más 80 ug/ml de digitonina al comienzo del ensayo para lisar las células
- Control del medio de ensayo: 105 pl de medio solo.
Los pocillos experimentales se preparan por triplicado y los pocillos de control por duplicado en un volumen final de 150 pl.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
La placa se centrifugó a 250 x g durante 4 minutos y a continuación se incubó a 37 °C durante 24 horas.
La placa se centrifugó a 250 x g durante 4 minutos. A continuación, 37,5 |jl del sobrenadante de cada pocilio de la placa de ensayo se transfirieron al pocillo correspondiente de una placa Nunc Maxisorb de 96 pocillos de fondo plano. La mezcla de sustrato se reconstituyó usando tampón de ensayo (12 ml). 3 a continuación, se añadieron 37,5 jl de la mezcla de sustrato a cada pocillo de la placa. La placa se cubrió con papel de aluminio y se incubó a temperatura ambiente durante 30 minutos. Se añadieron 37,5 jl de solución de parada a cada pocillo de la placa para parar la reacción. La absorbancia a 490 nm se registró en un lector de placas de ELISA en una hora después de la adición de la solución de parada.
Cálculo de resultados
El promedio de los valores de la absorbancia del fondo del medio de cultivo se resto de todos los valores de absorbancia de Liberación Experimental, Liberación Espontánea de Células Diana y Liberación Espontánea de Células Efectoras y Liberación Máxima de Diana.
Los valores corregidos obtenidos en las primeras dos etapas se usaron en la siguiente fórmula para calcular el porcentaje de toxicidad:
% de citotoxicidad = 100x (Experimental - Espontánea Efectora - Espontánea Diana) / (Liberación Máxima de Diana - Espontánea de Diana)
Resultados
Las construcciones de fusión de scFv-TCR anti-CD3 de NY-ESO que tienen (i) la cadena alfa de TCR de SEQ ID No: 1 y la fusión de scFv anti-CD3 de cadena beta TCR de SEQ ID No: 14 (fusión C-terminal) o (ii) la cadena alfa de TCR de SEQ ID No: 1 y la fusión de scFv anti-CD3 de cadena beta TCR de SEQ ID No: 15 (fusión N-terminal) se sometieron a ensayo mediante el ensayo de liberación de LDH (como se ha descrito anteriormente). El % de citotoxicidad observado en cada pocillo se representó frente a la concentración de la construcción de ensayo usando Prism (Graph Pad). A partir de estas curvas de dosis-respuesta, se determinaron los valores de CE50 (los valores de CE50 se determinan a la concentración de la fusión de TCR que induce un 50 % de la respuesta máxima).
Construcción de Ensayo
O m en 0
fusión C-terminal (SEQ ID No: 1 y SEQ ID No: 14)
1,2e-9
fusión N-terminal (SEQ ID No: 1 y SEQ ID No: 15)
3,2e-11
Estos resultados muestran que la fusión N-terminal que comprende la cadena alfa de TCR de SEQ ID No: 1 y la fusión de scFv anti-CD3 de cadena beta TCR de SEQ ID No: 15 era al menos 2 veces más potente en su capacidad para redirigir los linfocitos T citotóxicos para eliminar las células diana que la construcción de fusión C-terminal que comprende la cadena alfa de TCR de SEQ ID No: 1 y la fusión de scFv anti-CD3 de cadena beta TCR de SEQ ID No: 14.
Ejemplo B2. TCR quimérico soluble con Citocinas como Polipéptidos Efectores a. Citocina de IL-4 murino como polipéptido efector
El siguiente ensayo se usó para someter a ensayo la actividad biológica de la porción de citocina de las construcciones de fusión de I L-4 -TCR de murino de las Figuras 12-13. Se trata de un bio ensayo que usa la línea de células de murino, CTLL-2, que son dependientes de IL-4 de murino para su crecimiento y en el presente documento se usan para demostrar la actividad biológica de la porción de citocina de una fusión IL-4 - TCR de murino.
Materiales
Células CTLL-2, ensayo de viabilidad celular luminiscente CellTiter-Glo® de Promega (N.° de Cat G7572) que incluye Tampón CellTiter-Glo® y Sustrato CellTiter-Glo® (liofilizado)
Medio de ensayo: RPMi suplementado con un 10 % de suero bovino fetal inactivado por calor (Gibco, N.° de cat 10108-165), RPMI 1640 al 88 % (Gibco, N.° de cat 42401-018), glutamina al 1 % (Gibco, N.° de cat 25030-024), penicilina/estreptomicina al 1 % (Gibco, N.° de cat 15070-063).
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
Las células CTLL-2 se cosecharon, se lavaron una vez en medio de ensayo (se centrifugaron a 1200 rpm durante 5 mins), se hizo su recuento y la viabilidad se evaluó usando solución de azul de Tripano. Si la viabilidad será inferior a un 80 %, se realizaba un gradiente de ficoll para retirar las células muertas (800 x g durante 15 mins con desprendimiento). Las células se lavaron dos veces más y el volumen sea justo para dar un volumen final de 1 x 105 células/ml. Las células CTLL-2 se añadieron a una placa Nunc de 96 pocillos de fondo plano de color blanco (5000 células/pocillo), seguido por 50 pl de concentraciones valoradas de IL-4 murino patrón (Peprotech), o construcciones de fusión IL-4 -TCr quimérico de murino de las Figuras 12 y 13 (7 puntos de 1 en 10 dilución es, de 10"8 a 10"14 M). Los controles incluían solo células, solo medio de ensayo, y células con 200 U/ml de Proleuquina (Chiron). La placa se incubó a 37 °C, CO2 al 5 % durante la noche. Siguiendo las instrucciones del fabricante, el reactivo CellTiter-Glo se descongeló y se añadió a la placa (100 pl por pocillo). La placa se incubó durante 10 minutos para estabilizar la señal luminiscente y a continuación se registró usando el lector de luminiscencia. La señal de fondo (solo células) se restó de las lecturas y un gráfico representado en Prism (Graph Pad) de modo que las CE50 de las construcciones de fusión de IL-4 - TCR de murino de las Figuras 12 y 13 se pueden comparar con el IL-4 de murino recombinante 'libre'.
Resultados
Construcción de Ensayo
CE50 CE50 CE50
m-IL4
4,984e-13 3,767e-13 5,148e-13
Figura 13 fusión C-term
7,464e-12
Figura 12 fusión N-term
5,913e-13 8,897e-13
Estos resultados muestran que la construcción N-fusionada de la Figura 12 era al menos 2 veces más potente en su capacidad para activar la proliferación celular de la construcción C-fusionada de la Figura 13.
b. Citocina IL-13 de murino como polipéptido efector
El siguiente ensayo se usó para someter a ensayo la actividad biológica de la porción de citocina de las construcciones de fusión de IL-13 - TCR de murino de las Figuras 14-15.
Este ensayo se realizó para demostrar la actividad de la porción de citocina de una fusión de citocina-TCR, es decir, la inhibición de la producción de IL-1p por monocitos humanos. Este ensayo se puede usar para someter a ensayo las fusiones de citocina-TCR en las que la citocina es IL-13 de murino.
Materiales
Monocitos obtenidos a partir de capas leucocíticas (capas leucocíticas del Servicio de Transfusión de NBS Bristol)
Kit 2 de Monocitos Dynabeads MyPure de Dynal para células humanas intactas (113.35)
Medio de ensayo: suero bovino fetal al 10 % (inactivado por calor, Gibco, N.° de cat 10108-165), RPMI 1640 al 88 % (Gibco, N.° de cat 42401-018), glutamina al 1 % (Gibco, N.° de cat 25030-024), penicilina/estreptomicina al 1 % (Gibco, N.° de cat 15070-063)
Tampón de lavado: PBS 0,01 M/Tween 20 al 0,05 % (1 sobrecito de solución salina tamponada con fosfato con Tween 20, pH 7,4 de Sigma, N.° de cat P-3563 disuelto en 1 litro de agua destilada da una composición final de PBS 0,01 M, NaCl 0,138 M, KCI 0,0027 M, Tween 20 al 0,05 %). PBS (Gibco, N.° de cat 10010-015).
HBSS sin Ca2+ ni Mg2+ (Gibco, N.° de cat 1018-165)
Kits para ELISA Eli-pair de Citocina: IL-1p (Diaclone N.° de cat DC-851.610.020) estos kits contienen los otros reactivos necesarios, es decir, anticuerpo de captura, anticuerpo biotinilado de detección, estreptavidina-HRP, patrones de IL-1p, TMB listo para usar. El siguiente método se basa en las instrucciones proporcionadas con cada kit.
Placas Maxisorb Nunc-Immuno (Nunc, N.° de cat 442404).
Placa de cultivo tisular de 96 pocillos de fondo redondo de micropocillos Nunc (Nunc, N.° de cat 163320)
BSA (Sigma, N.° de cat A3059)
H2SO4 (Sigma N.° de cat S1526)
Azul de Tripano (Sigma N.° de cat T8154)
Lipopolisacáridos (LPS) obtenidos a partir de la cepa 0111:B4 de E. coli (Sigma, N.° de cat L4391), patrón de IL-13 de murino recombinante (Peprotech, N.° de cat 210-13) usado cuando los reactivos de fusión de IL-13-TCR de murino se someten a ensayo.
Aislamiento de monocitos
Las PBMC se aislaron a partir de capas leucocíticas: una capa leucocítica se diluyó 1 en 2 con HBSS (sin Ca2+ ni Mg2+), la sangre diluida se depositó en capas en Lymphoprep (hasta 35 ml de sangre con respecto a 15 ml de Lymphoprep) y se centrifugó durante 15 min a 800 x g (temp ambiente) con el desprendimiento; las células en la
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
superficie de contacto se retiraron y se lavaron cuatro veces con HBSS y se centrifugaron a 1200 rpm durante 10 min. Después del lavado final, las células se volvieron a suspender en 50 ml de medio de ensayo y se hizo su recuento y la viabilidad se evaluó usando una solución de azul de T ripano. Kit 2 de Monocitos Dynabeads MyPure de Dynal se usó para aislar los monocitos. Las PBMC se volvieron a suspender en PBS/BSA al 0,1 % en 100 pl de tampón por 107 células, 20 pl de Reactivo de Bloqueo por 107 células y se añadieron 20 pl de Mezcla de Anticuerpos por 107 células y las células se incubaron durante 20 min a 4 °C. Las células se lavaron y se volvieron a suspender en 0,9 ml de PBS/BSA al 0,1 % por 107 células. Las perlas lavadas previamente se añadieron (100 pl por 107 células), se mezclaron y se incubaron durante un periodo adicional de 15 min a 20 °C con rotación suave. Las rosetas se volvieron a suspender mediante pipeteo con cuidado y se añadió 1 ml de de PBS/BSA al 0,1 % por 107 células. El tubo se colocó en el imán Dynal durante 2 minutos. El sobrenadante que contenía células aisladas de forma negativa se transfirió a un tubo fresco y se hizo el recuento. Las células se usaron inmediatamente o se congelaron en FCS al 90 %/DMSO al 10 % para su uso en el futuro.
Preparación de ensayo celular
La placa de ensayo ELISA se revistió con 100 pl/pocillo de anticuerpo de captura de IL-1p en PBS y se dejó a 4 °C durante la noche. Los monocitos se descongelaron, se lavaron dos veces en medio de ensayo y se volvieron a suspender a 5 x 105 células/ml. Los monocitos se sembraron en una placa de 96 pocillos de fondo redondo (100 pl por pocillo, es decir, 5 x 104 por pocillo). LPS, citocina recombinante de Peprotech y proteínas de fusión de citocina- TCR de ensayo se prepararon por dilución en medio de ensayo para dar una concentración final de 4X. En cada pocillo se añadió LPS (10 ng/ml final) seguido por 50 pl de concentraciones valoradas (6 puntos de 1 en 10 dilución es en serie7 de IL-13 recombinante de Peprotech (10-8 a 10"13 M final) o proteínas de fusión de citocina -TCR de ensayo (10-7 a 10"13 M final) en pocillos por triplicado. La placa se incubó a 37 °C, CO2 al 5 % durante la noche.
ELISA de IL-1p
La placa de ELISA de IL-1p revestida con anticuerpo se lavó tres veces en tampón de lavado y se bloqueó con 250 pl de PBS/BSA al 5 %/pocillo durante al menos 2 horas a temperatura ambiente (o durante la noche a 4 °C). La placa de ELISA se lavó tres veces en tampón de lavado y se secó con golpecitos. Los patrones de IL-1 p se diluyeron en PBS/BSA al 0,1 %. La placa que contenía las células se centrifugó a 1200 rpm durante 5 mins. El sobrenadante de cada pocillo se transfirió a continuación a la placa de ELISA de IL-1p revestida previamente. Se añadieron 100 pl de sobrenadante celular (diluido a 1 en 3 con pBs/BSA al 0,1 %) o patrón a los pocillos relevantes y se añadieron 50 pl de anticuerpo de detección/pocillo (dilución de acuerdo con las instrucciones del kit). La placa se incubó durante 2 horas a temperatura ambiente. Las placas se lavaron tres veces en tampón de lavado. Se añadieron 100 pl de estreptavidina-HRP por pocillo (dilución de acuerdo con las instrucciones del kit) y las placas se incubaron a temp ambiente durante 20 min. Las placas se lavaron tres veces en tampón de lavado. Se añadieron 100 pl TMB de listo para usar por pocillo y se dejó que las placas se desarrollarán durante 5 - 20 min (dependiendo de la fuerza de la señal) en la oscuridad (con papel de aluminio). La reacción se detuvo mediante la adición de 100 pl/pocillo de H2SO4 1 M.
La absorbancia de las placas se leyó en un lector de microplacas a 450 nm y con filtro de referencia ajustado a 650 nm. La cantidad de inhibición para cada punto de valoración se calcula como un porcentaje de la muestra que contiene monocitos y LPS sin proteína de fusión de citocina - TCR que da la señal máxima, produciendo de este modo una curva de dosis-respuesta.
Resultados
Construcción de Ensayo
CE50 CE50
m-IL13
1,535e-10 9,534e-11
Figura 15 fusión C-term
6,21e-10
Figura 14 fusión N-term
1,493e-10
Estos resultados muestran que la construcción N-fusionada de la Figura 14 era al menos 2 veces más potente en su capacidad para inhibir la producción de IL-1p por monocitos humanos que la construcción C-fusionada de la Figura 15.

Claims (9)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    REIVINDICACIONES
    1. Una molécula bifuncional que comprende un compañero de unión polipeptídico específico para un epítopo de pMHC dado, y un polipéptido efector inmunológico, estando el extremo N-terminal del compañero de unión a pMHC unido al extremo C-terminal del polipéptido efector inmunológico, CON LA CONDICIÓN DE QUE dicho compañero de unión polipeptídico no sea un receptor de linfocitos T que comprenda la cadena alfa de SEQ ID No: 7 y la cadena beta de SEQ ID No: 9 y en la que el polipéptido efector inmunológico es una citocina.
  2. 2. Una molécula bifuncional como se reivindica en la reivindicación 1 en la que el compañero de unión a pMHC es un par de polipéptidos TCR ap heterodiméricos, o un polipéptido TCR ap de una cadena, y el extremo N de la cadena a o p del par de polipéptidos TCR heterodiméricos, o el extremo N del polipéptido scTCR, está unido a un aminoácido C terminal del polipéptido efector inmunológico.
  3. 3. Una molécula bifuncional como se reivindica en la reivindicación 2 en la que el compañero de unión a pMHC es un par de polipéptidos TCR ap heterodiméricos en el que los polipéptidos a y p tienen cada uno regiones variables y constantes de TCR, pero carecen de regiones transmembrana y citoplasmáticas de TCR.
  4. 4. Una molécula bifuncional como se reivindica en la reivindicación 3 en la que las regiones constantes de los polipéptidos a y p están unidas por un puente disulfuro entre restos de cisteína sustituidos por Thr 48 del exón 1 de TRAC1 y Ser 57 del exón 1 de TRBC1 o TRBC2, o mediante el puente disulfuro nativo entre Cys4 del exón 2 de TRAC1 y Cys2 del exón 2 de TRBC1 o TRBC2.
  5. 5. Una molécula bifuncional como se reivindica en la reivindicación 1 en la que el compañero de unión a pMHC es un polipéptido TCR ap de una sola cadena.
  6. 6. Una molécula bifuncional como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que el polipéptido efector inmunológico es IL-1, IL-1a, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-15, IL-21, IL- 23, TGF-p, IFN-y o TNFa.
  7. 7. Una molécula bifuncional como se reivindica en cualquier reivindicación precedente, en la que el compañero de unión polipeptídico y polipéptido efector inmunológico están unidos directamente.
  8. 8. Una molécula bifuncional como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en la que el compañero de unión polipeptídico y polipéptido efector inmunológico están unidos indirectamente mediante una secuencia enlazadora.
  9. 9. Una molécula bifuncional como se reivindica en la reivindicación 8 en la que la secuencia enlazadora es de menos de 12, menos de 10 o de 5-10 aminoácidos de longitud.
ES16176249.7T 2009-05-20 2010-05-19 Polipéptidos bifuncionales Active ES2672095T3 (es)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GBGB0908613.3A GB0908613D0 (en) 2009-05-20 2009-05-20 T Cell Reseptors
GB0908613 2009-05-20

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2672095T3 true ES2672095T3 (es) 2018-06-12

Family

ID=40834242

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES10720803.5T Active ES2608653T3 (es) 2009-05-20 2010-05-19 Polipéptidos bifuncionales
ES16176246T Active ES2721058T3 (es) 2009-05-20 2010-05-19 Polipéptidos bifuncionales
ES16176249.7T Active ES2672095T3 (es) 2009-05-20 2010-05-19 Polipéptidos bifuncionales

Family Applications Before (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES10720803.5T Active ES2608653T3 (es) 2009-05-20 2010-05-19 Polipéptidos bifuncionales
ES16176246T Active ES2721058T3 (es) 2009-05-20 2010-05-19 Polipéptidos bifuncionales

Country Status (21)

Country Link
US (6) US10130721B2 (es)
EP (3) EP3112377B1 (es)
JP (4) JP5667171B2 (es)
CN (1) CN102439034B (es)
AU (1) AU2010250951B2 (es)
BR (1) BRPI1013029A2 (es)
CA (2) CA2762604C (es)
CY (3) CY1118405T1 (es)
DK (3) DK3112377T3 (es)
EA (1) EA020841B1 (es)
ES (3) ES2608653T3 (es)
GB (1) GB0908613D0 (es)
HR (3) HRP20170086T1 (es)
HU (3) HUE032929T2 (es)
LT (3) LT2432802T (es)
MX (1) MX340168B (es)
PL (3) PL3112377T3 (es)
PT (3) PT2432802T (es)
SI (3) SI2432802T1 (es)
TR (2) TR201905437T4 (es)
WO (1) WO2010133828A1 (es)

Families Citing this family (96)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB0908613D0 (en) * 2009-05-20 2009-06-24 Immunocore Ltd T Cell Reseptors
WO2015089217A2 (en) 2013-12-10 2015-06-18 Bionz, Llc Methods of developing selective peptide antagonists
LT2665486T (lt) 2011-01-18 2020-04-10 Bioniz, Llc Kompozicijos, skirtos gama-c-citokino aktyvumui moduliuoti
PT2755997T (pt) * 2011-09-15 2018-10-30 Us Health Recetores de célula t que reconhecem mage restrito a hlaa1 ou hla-cw7
WO2013048243A1 (en) * 2011-09-29 2013-04-04 Apo-T B.V. Multi-specific binding molecules targeting aberrant cells
US20130273089A1 (en) 2011-11-03 2013-10-17 Tolera Therapeutics, Inc. Antibody and methods for selective inhibition of t-cell responses
US8524234B2 (en) 2011-11-03 2013-09-03 Tolera Therapeutics, Inc Antibody for selective inhibition of T-cell responses
EP2802356A1 (en) 2012-01-13 2014-11-19 Apo-T B.V. Aberrant cell-restricted immunoglobulins provided with a toxic moiety
GB201223172D0 (en) 2012-12-21 2013-02-06 Immunocore Ltd Method
GB201313377D0 (en) * 2013-07-26 2013-09-11 Adaptimmune Ltd T cell receptors
CN106164091A (zh) 2014-03-14 2016-11-23 英美偌科有限公司 Tcr文库
CA2955984A1 (en) 2014-07-22 2016-01-28 The University Of Notre Dame Du Lac Molecular constructs and uses thereof
JP6415716B2 (ja) 2014-11-07 2018-10-31 グアンドン シャンスエ ライフ サイエンス， リミテッド． 可溶性のヘテロ二量体ｔ細胞受容体およびその製法と使用
GB201516269D0 (en) 2015-09-15 2015-10-28 Adaptimmune Ltd And Immunocore Ltd TCR Libraries
GB201516265D0 (en) 2015-09-15 2015-10-28 Adaptimmune Ltd And Immunocore Ltd TCR Libraries
GB201516272D0 (en) 2015-09-15 2015-10-28 Adaptimmune Ltd And Immunocore Ltd TCR Libraries
GB201516270D0 (en) 2015-09-15 2015-10-28 Adaptimmune Ltd And Immunocore Ltd TCR Libraries
GB201516275D0 (en) 2015-09-15 2015-10-28 Adaptimmune Ltd And Immunocore Ltd TCR Libraries
GB201516277D0 (en) 2015-09-15 2015-10-28 Adaptimmune Ltd And Immunocore Ltd TCR libraries
GB201516274D0 (en) 2015-09-15 2015-10-28 Adaptimmune Ltd And Immunocore Ltd TCR Libraries
US11400134B2 (en) 2015-10-09 2022-08-02 Bioniz, Llc Modulating gamma-c-cytokine activity
GB201520583D0 (en) 2015-11-23 2016-01-06 Immunocore Ltd & Adaptimmune Ltd Peptides
GB201520548D0 (en) 2015-11-23 2016-01-06 Immunocore Ltd & Adaptimmune Ltd Peptides
GB201520595D0 (en) 2015-11-23 2016-01-06 Immunocore Ltd & Adaptimmune Ltd Peptides
GB201607535D0 (en) 2016-04-29 2016-06-15 Immunocore Ltd & Adaptimmune Ltd Peptides
GB201520562D0 (en) 2015-11-23 2016-01-06 Immunocore Ltd & Adaptimmune Ltd Peptides
GB201520543D0 (en) 2015-11-23 2016-01-06 Immunocore Ltd & Adaptimmune Ltd Peptides
GB201520597D0 (en) 2015-11-23 2016-01-06 Immunocore Ltd & Adaptimmune Ltd Peptides
GB201520559D0 (en) 2015-11-23 2016-01-06 Immunocore Ltd & Adaptimmune Ltd Peptides
WO2018083505A1 (en) 2016-11-07 2018-05-11 Immunocore Limited Peptides
GB201520539D0 (en) 2015-11-23 2016-01-06 Immunocore Ltd & Adaptimmune Ltd Peptides
GB201604468D0 (en) 2016-03-16 2016-04-27 Immunocore Ltd & Adaptimmune Ltd Peptides
GB201607534D0 (en) 2016-04-29 2016-06-15 Immunocore Ltd & Adaptimmune Ltd Peptides
GB201520575D0 (en) 2015-11-23 2016-01-06 Immunocore Ltd & Adaptimmune Ltd Peptides
GB201520589D0 (en) 2015-11-23 2016-01-06 Immunocore Ltd & Adaptimmune Ltd Peptides
WO2017089786A1 (en) 2015-11-23 2017-06-01 Immunocore Limited Peptides
GB201520567D0 (en) 2015-11-23 2016-01-06 Immunocore Ltd & Adaptimmune Ltd Peptides
GB201520536D0 (en) 2015-11-23 2016-01-06 Immunocore Ltd & Adaptimmune Ltd Peptides
GB201520542D0 (en) 2015-11-23 2016-01-06 Immunocore Ltd & Adaptimmune Ltd Peptides
GB201520550D0 (en) 2015-11-23 2016-01-06 Immunocore Ltd & Adaptimmune Ltd Peptides
GB201520546D0 (en) 2015-11-23 2016-01-06 Immunocore Ltd & Adaptimmune Ltd Peptides
GB201520563D0 (en) 2015-11-23 2016-01-06 Immunocore Ltd & Adaptimmune Ltd Peptides
GB201520545D0 (en) 2015-11-23 2016-01-06 Immunocore Ltd & Adaptimmune Ltd Peptides
GB201520558D0 (en) 2015-11-23 2016-01-06 Immunocore Ltd & Adaptimmune Ltd Peptides
GB201520603D0 (en) 2015-11-23 2016-01-06 Immunocore Ltd & Adaptimmune Ltd Peptides
GB201520565D0 (en) 2015-11-23 2016-01-06 Immunocore Ltd & Adaptimmune Ltd Peptides
GB201520592D0 (en) 2015-11-23 2016-01-06 Immunocore Ltd & Adaptimmune Ltd Peptides
GB201520579D0 (en) 2015-11-23 2016-01-06 Immunocore Ltd & Adaptimmune Ltd Peptides
GB201520568D0 (en) 2015-11-23 2016-01-06 Immunocore Ltd Peptides
GB201520566D0 (en) 2015-11-23 2016-01-06 Immunocore Ltd & Adaptimmune Ltd Peptides
GB201520557D0 (en) 2015-11-23 2016-01-06 Immunocore Ltd & Adaptimmune Ltd Peptides
GB201520541D0 (en) 2015-11-23 2016-01-06 Immunocore Ltd & Adaptimmune Ltd Peptides
GB201520544D0 (en) 2015-11-23 2016-01-06 Immunocore Ltd & Adaptimmune Ltd Peptides
GB201520570D0 (en) 2015-11-23 2016-01-06 Immunocore Ltd & Adaptimmune Ltd Peptides
GB201520564D0 (en) 2015-11-23 2016-01-06 Immunocore Ltd & Adaptimmune Ltd Peptides
GB201522592D0 (en) * 2015-12-22 2016-02-03 Immunocore Ltd T cell receptors
LT3430037T (lt) * 2016-03-16 2022-12-12 Immatics Biotechnologies Gmbh Transfekuotos t ląstelės ir t ląstelių receptoriai, skirti naudoti vėžio gydymui taikant imunoterapiją
GB201604953D0 (en) 2016-03-23 2016-05-04 Immunocore Ltd T cell receptors
ES2914648T3 (es) 2016-04-08 2022-06-15 Immunocore Ltd Receptores de células T
WO2017192536A1 (en) 2016-05-02 2017-11-09 University Of Kansas Eliminating mhc restriction from the t cell receptor as a strategy for immunotherapy
MX2018014863A (es) 2016-06-02 2019-09-11 Immunocore Ltd Régimen de dosificación para proteína de fusión de tcr especifico de gp100 - scfv anti - cd3.
WO2018081784A1 (en) * 2016-10-31 2018-05-03 H. Lee Moffitt Cancer Center And Research Institute, Inc. Artificial antigen presenting cells for expanding immune cells for immunotherapy
CN108203459A (zh) * 2016-12-19 2018-06-26 广东香雪精准医疗技术有限公司 源自于prame的肿瘤抗原短肽
GB201709866D0 (en) 2017-06-20 2017-08-02 Immunocore Ltd T cell receptors
CA3100253A1 (en) 2018-05-14 2019-11-21 Immunocore Limited Bifunctional binding polypeptides
GB201815041D0 (en) 2018-09-14 2018-10-31 Scancell Ltd Epitopes
KR20210116478A (ko) * 2019-01-14 2021-09-27 난징 레전드 바이오테크 씨오., 엘티디. 키메라 수용체 폴리펩티드 및 이의 용도
WO2020148372A1 (en) 2019-01-17 2020-07-23 Immunocore Limited Formulations
GB201901306D0 (en) 2019-01-30 2019-03-20 Immunocore Ltd Multi-domain binding molecules
GB201901305D0 (en) 2019-01-30 2019-03-20 Immunocore Ltd Specific binding molecules
CN113396230A (zh) 2019-02-08 2021-09-14 豪夫迈·罗氏有限公司 癌症的诊断和治疗方法
GB201902277D0 (en) 2019-02-19 2019-04-03 King S College London Therapeutic agents
CN113811549A (zh) 2019-02-21 2021-12-17 Xencor股份有限公司 非靶向和靶向性il-10 fc融合蛋白
CN113906140A (zh) 2019-03-18 2022-01-07 路德维格癌症研究院 A2/ny-eso-1特异性t细胞受体及其用途
GB201904328D0 (en) 2019-03-28 2019-05-15 Immunocore Ltd Specific binding molecules
WO2020227019A1 (en) 2019-05-03 2020-11-12 Bioniz, Llc Modulating the effects of gamma-c-cytokine signaling for the treatment of alopecia and alopecia associated disorders
GB201915282D0 (en) 2019-10-22 2019-12-04 Immunocore Ltd Specific binding molecules
GB202005779D0 (en) 2020-04-21 2020-06-03 Scancell Ltd Anti-tumour immune responses
GB202006629D0 (en) 2020-05-05 2020-06-17 Immunocore Ltd Specific binding molecules
GB202010329D0 (en) 2020-07-06 2020-08-19 Immunocore Ltd Specific binding molecules
EP4196612A1 (en) 2020-08-12 2023-06-21 Genentech, Inc. Diagnostic and therapeutic methods for cancer
WO2022184805A1 (en) 2021-03-03 2022-09-09 Immatics Biotechnologies Gmbh Antigen binding proteins specifically binding sars-cov-2 antigenic peptides in complex with a major histocompatibility complex protein
EP4113120A1 (en) 2021-06-28 2023-01-04 Immatics Biotechnologies GmbH Method of characterizing the binding characteristics between a peptide of interest and mhc molecules
US20230024554A1 (en) 2021-06-28 2023-01-26 Immatics Biotechnologies Gmbh Method of characterizing the binding characteristics between a peptide of interest and mhc molecules
US20240327491A1 (en) 2021-07-12 2024-10-03 Ludwig Institute For Cancer Research Ltd T cell receptors specific for tumor-associated antigens and methods of use thereof
CN115724988B (zh) * 2021-08-26 2023-11-17 瑅安生物医药（杭州）有限公司 一种接近天然分子的多肽融合分子
EP4198052A1 (en) 2021-12-15 2023-06-21 Eberhard Karls Universität Tübingen Medizinische Fakultät Peptides and antigen binding proteins for use in immunotherapy against fibrolamellar hepatocellular carcinoma (fl-hcc) and other cancers
AU2023222190A1 (en) 2022-02-20 2024-08-29 Immunocore Limited Hiv-specific binding molecules and tcr
WO2024038198A1 (en) 2022-08-18 2024-02-22 Immunocore Limited Multi-domain binding molecules
TW202417476A (zh) 2022-08-18 2024-05-01 英商英美偌科有限公司 Ｔ細胞受體及其融合蛋白
WO2024038183A1 (en) 2022-08-18 2024-02-22 Immunocore Limited Multi-domain binding molecules
WO2024038193A1 (en) 2022-08-18 2024-02-22 Immunocore Limited Multi-domain binding molecules
WO2024067821A1 (zh) * 2022-09-30 2024-04-04 瑅安生物医药（杭州）有限公司 一种修饰细胞及其用途
WO2024130179A1 (en) 2022-12-16 2024-06-20 Repertoire Immune Medicines, Inc. T cell receptors binding hpv-16 epitopes
WO2024146936A1 (en) 2023-01-06 2024-07-11 Immunocore Limited Binding molecules against a piwil1 peptide-hla complex
WO2024146951A1 (en) 2023-01-06 2024-07-11 Immunocore Limited Binding molecules against a prame peptide-hla complex

Family Cites Families (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1992022653A1 (en) * 1991-06-14 1992-12-23 Genentech, Inc. Method for making humanized antibodies
CA2328144A1 (en) * 1998-05-19 1999-11-25 Avidex Limited Multivalent t cell receptor complexes
ES2293748T3 (es) * 1998-10-21 2008-03-16 Altor Bioscience Corporation Moleculas de fijacion poliespecificas y usos de las mismas.
US20040253632A1 (en) * 2000-05-25 2004-12-16 Sunol Molecular Corporation Modulation of T -cell receptor interactions
CN101712721A (zh) * 2000-06-05 2010-05-26 阿尔托生物科学有限公司 T细胞受体融合物及共轭物以及其使用方法
US20030017134A1 (en) 2001-06-19 2003-01-23 Technion Research And Development Foundation Ltd. Methods and pharmaceutical compositions for immune deception, particularly useful in the treatment of cancer
CA2457652C (en) 2001-08-31 2012-08-07 Avidex Limited Soluble t cell receptor
CA2476625A1 (en) * 2002-02-20 2003-08-28 Dyax Corp. Mhc-peptide complex binding ligands
JP4436319B2 (ja) 2002-10-09 2010-03-24 メディジーン リミテッド 単鎖組換えｔ細胞レセプター
GB0304068D0 (en) * 2003-02-22 2003-03-26 Avidex Ltd Substances
NZ550810A (en) 2004-05-19 2009-05-31 Immunocore Ltd High affinity NY-ESO T cell receptor
US20090042285A1 (en) 2004-05-27 2009-02-12 Weidanz Jon A Antibodies at T cell receptor mimics, methods of production and uses thereof
EP1773383B1 (en) 2004-05-27 2012-09-12 Jon A. Weidanz Antibodies as t cell receptor mimics, methods of production and uses thereof
EP1763365B1 (en) 2004-06-09 2016-08-10 Technion Research And Development Foundation, Ltd. Antibodies for selective apoptosis of cells
CA2582963A1 (en) * 2004-10-01 2006-04-13 Avidex Ltd T-cell receptors containing a non-native disulfide interchain bond linked to therapeutic agents
EP2527370A1 (en) * 2005-12-21 2012-11-28 Amgen Research (Munich) GmbH Compounds having resistance to soluble CEA
RU2008129827A (ru) * 2005-12-21 2010-01-27 МЕДИММЬЮН, ЭлЭлСи (US) МОЛЕКУЛЫ EphA2-BiTE И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ
GB0708585D0 (en) 2007-05-03 2007-06-13 Queen Mary & Westfield College Novel antibody and use in diagnosis and therapy of arthropathies
GB0816096D0 (en) 2008-09-04 2008-10-15 Medigene Ltd Diabetes t cell receptors
GB0908613D0 (en) 2009-05-20 2009-06-24 Immunocore Ltd T Cell Reseptors
GB0911566D0 (en) * 2009-07-03 2009-08-12 Immunocore Ltd T cell receptors

Also Published As

Publication number Publication date
BRPI1013029A2 (pt) 2016-04-05
CN102439034A (zh) 2012-05-02
US20190231895A1 (en) 2019-08-01
EA201101660A8 (ru) 2014-09-30
US10576162B2 (en) 2020-03-03
CA2762604A1 (en) 2010-11-25
WO2010133828A1 (en) 2010-11-25
EP2432802B1 (en) 2016-11-02
ES2721058T3 (es) 2019-07-26
CY1120439T1 (el) 2019-07-10
US20190275165A1 (en) 2019-09-12
US10517960B2 (en) 2019-12-31
JP2012527439A (ja) 2012-11-08
US20190247512A1 (en) 2019-08-15
PL2432802T3 (pl) 2017-07-31
CA2968393A1 (en) 2010-11-25
US20190231896A1 (en) 2019-08-01
HRP20170086T1 (hr) 2017-06-02
US10130721B2 (en) 2018-11-20
PL3112376T3 (pl) 2019-07-31
SI2432802T1 (sl) 2017-01-31
US10420846B2 (en) 2019-09-24
US20230241238A1 (en) 2023-08-03
CN102439034B (zh) 2015-01-28
SI3112377T1 (en) 2018-06-29
CY1118405T1 (el) 2017-06-28
LT3112377T (lt) 2018-05-25
EA201101660A1 (ru) 2012-05-30
DK2432802T3 (en) 2017-02-13
AU2010250951A1 (en) 2011-12-08
MX2011012184A (es) 2012-03-26
ES2608653T3 (es) 2017-04-12
HRP20190674T1 (hr) 2019-08-09
LT2432802T (lt) 2017-01-10
PT3112376T (pt) 2019-05-20
DK3112377T3 (en) 2018-07-30
TR201905437T4 (tr) 2019-05-21
EP3112376B1 (en) 2019-01-23
CA2968393C (en) 2019-07-23
EP2432802A1 (en) 2012-03-28
JP2017110019A (ja) 2017-06-22
EP3112376A2 (en) 2017-01-04
EP3112376A3 (en) 2017-03-29
PL3112377T3 (pl) 2018-10-31
HRP20180757T1 (hr) 2018-07-27
HUE032929T2 (hu) 2017-11-28
DK3112376T3 (en) 2019-04-29
GB0908613D0 (en) 2009-06-24
US20120190828A1 (en) 2012-07-26
JP5667171B2 (ja) 2015-02-12
CY1121558T1 (el) 2020-05-29
EP3112377A1 (en) 2017-01-04
HUE038342T2 (hu) 2018-10-29
EA020841B1 (ru) 2015-02-27
PT2432802T (pt) 2017-02-13
EP3112377B1 (en) 2018-04-18
HUE043245T2 (hu) 2019-08-28
TR201809945T4 (tr) 2018-08-27
PT3112377T (pt) 2018-07-13
LT3112376T (lt) 2019-05-10
MX340168B (es) 2016-06-29
AU2010250951B2 (en) 2015-04-30
JP2019172678A (ja) 2019-10-10
SI3112376T1 (sl) 2019-08-30
CA2762604C (en) 2018-01-16
JP2015096527A (ja) 2015-05-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2672095T3 (es) Polipéptidos bifuncionales
ES2891321T3 (es) Receptores de células T
ES2912743T3 (es) Receptores de linfocitos T
HU229204B1 (hu) Rekombináns fúziós fehérjék dimerje, trimerje, tetramerje vagy pentamerje által alkotott bimer vagy oligomer
JP6980196B2 (ja) Ｈｌａ−ｂ５７オープンコンフォーマー
WO2021170117A1 (zh) 一种识别afp抗原短肽的t细胞受体及其编码序列
WO2021170116A1 (zh) 一种识别afp的t细胞受体
TW202140532A (zh) 一種辨識afp的t細胞受體及其編碼序列
WO2023005859A1 (zh) 针对抗原ssx2的高亲和力t细胞受体
WO2022262835A1 (zh) 一种识别afp抗原的tcr及其编码序列
WO2022206860A1 (zh) 针对afp的t细胞受体