TR201809945T4 - İki işlevli polipeptidler. - Google Patents

İki işlevli polipeptidler. Download PDF

Info

Publication number
TR201809945T4
TR201809945T4 TR2018/09945T TR201809945T TR201809945T4 TR 201809945 T4 TR201809945 T4 TR 201809945T4 TR 2018/09945 T TR2018/09945 T TR 2018/09945T TR 201809945 T TR201809945 T TR 201809945T TR 201809945 T4 TR201809945 T4 TR 201809945T4
Authority
TR
Turkey
Prior art keywords
tcr
polypeptide
chain
binding partner
terminus
Prior art date
Application number
TR2018/09945T
Other languages
English (en)
Inventor
Karsten Jakobsen Bent
Brigitte Vuidepot Annelise
Li Yi
Original Assignee
Immunocore Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=40834242&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=TR201809945(T4) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Immunocore Ltd filed Critical Immunocore Ltd
Publication of TR201809945T4 publication Critical patent/TR201809945T4/tr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6849—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a receptor, a cell surface antigen or a cell surface determinant
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A61K39/001136—Cytokines
    • A61K39/00114—Interleukins [IL]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/6425—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent the peptide or protein in the drug conjugate being a receptor, e.g. CD4, a cell surface antigen, i.e. not a peptide ligand targeting the antigen, or a cell surface determinant, i.e. a part of the surface of a cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/7051—T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2809—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against the T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/33—Fusion polypeptide fusions for targeting to specific cell types, e.g. tissue specific targeting, targeting of a bacterial subspecies

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Nitrogen Condensed Heterocyclic Rings (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

Bir antikor veya bir T hücre reseptörü ("TCR") gibi bir peptid-MHC epitopuna ve bir antikor veya bir sitokin gibi bir immün efektöre yönelik spesifik bir bağlanma partnerini içeren bir iki işlevli polipeptiddir, immün efektör kısım peptid-MHC bağlayıcı kısmın N- terminusuna bağlıdır.

Description

TARIFNAME IKI ISLEVLI POLIPEPTIDLER Bu bulus, bir antikor veya bir T hücre reseptörü (“TCR") gibi bir peptid-MHC epitopuna ve bir sitokin olan bir immün efektöre yönelik spesifik bir baglanma partnerini içeren bir iki islevli polipeptid ile ilgilidir, immün efektör kisim peptid-MHC baglayici kismin N- terminusuna baglidir.
Bulusun Altyapisi TCR'ler, antijen sunucu hücreler (APC) üzerinde epitoplar olarak gösterilen Spesifik Majör Histokompatibilite Kompleksi (MHC)- peptid komplekslerinin ("pMHC kompleksleri") taninmasina aracilik eder ve TCR'Ier T hücreleri ile bu tür pMHC epitoplarinin taninmasina aracilik eder. Böylece, TCR'Ier immün sistemin hücresel kolunun isleyisinde esansiyeldir.
Ayrica, özellikle antijen ifade eden hücreler (bakiniz örnegin: Neethling FA. et al., antikorlar bilinir. Bunlar, özellikle pMHC epitoplarini baglayan antijen-baglayici kisim (Fab) antikorlari (bakiniz örnegin: Chames P. et al., Proc Natl Acad Sci U 8 A (2000) Dogal TCR, sinyal iletimine aracilik etmeye katilan CD3 kompleksinin sabit proteinleri ile baglantili olan immünoglobulin süper ailesine ait bir heterodimerik hücre yüzey proteinidir. TCR`Ier, yapisal olarak benzer olan ancak oldukça farkli anatomik konumlara ve muhtemelen fonksiyonlara sahip olan oiß ve yö formlarinda bulunur.
MHC sinif I ve sinif II Iigandlari da, immünoglobulin süper aile proteinlerdir, ancak APC hücre yüzeyinde bir çesitli kisa peptit parçalari dizisini sunmalarini saglayan bir yüksek oranda polimorfik peptit baglama bölgesi ile antijen sunumuna yönelik uzmanlasmistir.
Dogal heterodimerik dß TCR'Ierin hücre disi kismi. her biri, bir membran-proksimal sürekli domenine ve bir membran-distal degisken domenine sahip iki polipeptitten (o ve B zincirleri) olusur. Sürekli ve degisken domenlerden her biri, bir zincir içi disülfit bagini içerir. Degisken domenler antikorlarin tamamlayicilik belirleme bölgelerine (CDR'Ier) analog olan yüksek polimorfik kivrimlari içerir. aß TCR`Ierin CDR3'ü MHC tarafindan sulunan peptid ile etkilesimde bulunur ve aß TCR`Ierin CDR'Ier 1 ve 2'si peptid ve MHC ile etkilesimde bulunur. TCR dizilerinin çesitliligi, bagli degiskenin (V) somatik yeniden düzenlemesi, çesitlilik (D), birlesme (J) ve sürekli genler (C) tarafindan üretilir.
Fonksiyonel o zinciri polipeptitleri, yeniden düzenlenen V-J-C bölgeleri ile olusturulurken, ß zincirleri, V-D-J-C bölgelerinden olusur. Hücre disi sürekli domeni, bir membran proksimal bölgesine ve bir immünoglobulin bölgesine sahiptir. TRAC olarak bilinen, tek 0( zincirli bir sürekli domen mevcuttur. ß zinciri sürekli domeni, TRBC1 ve TRBCZ (IMGT terminolojisi) olarak bilinen iki farkli [3 sürekli domeninden birinden olusur. Bu ß sürekli domenleri arasinda dört amino asit degisikligi mevcuttur. Bu degisiklikler, TRBC1 ve TRBCZ: N4K5->K4N5 ve F37->Y'nin (IMGT numaralandirmasi, farkliliklar TRBC1->TRBC2) okson 1'i içinde yer alir, iki TCR ß sürekli zincir bölgesi arasindaki son amino asit degisikligi TRBC1 ve TRBC2: V1->E'nin ekson 3”ü içinde Rekombinant TCR'Ierin üretimine yönelik olarak bugüne kadar çok sayida yapi planlanmistir. Bu yapilar, tek -zincirli TCR`Ier ve dimerik TCR'Ier olmak üzere iki genis sinifta yer alir. Tek -zincirli TCR'Ier (scTCR'Ier), MHC-peptid komplekslerine baglanan yerel heterodimerik TCR'Ier gibi tek bir amino asit dizisinden olusan suni yapilardir. scTCRller, birtakim olasi yönelimlerde bir baglayici dizi (L) örnegin, bunlarla sinirli olmamakla birlikte izleyen Vd-L-Vß, Vß-L-Vd, Voi-Coi-L-Vß veya Vß-Cß-L-Vd ile baglanan bir TCR a ve B degisken bölgeler (sirasiyla Voi ve Vß) ve TCR o ve B sürekli bölgeler (sirasiyla Cd ve Cß) kombinasyonundan olusabilir.
Birtakim kagitlar, ilgili alt birimleri baglayan yerel disülfit köprüsünü içeren TCR'lerin üretimini açiklar. Bununla birlikte, bu tür TCR'Ierin TCR-spesifik antikorlar ile taninabilmesine ragmen, hiçbiri nispeten yüksek konsantrasyonlardan baska hiçbir yerde bunun yerel ligandini tanimak üzere gösterilmemistir ve/veya stabil degildir.
WO 03/020763'te, bunun yerel ligandini taniyabilecek sekilde dogru sekilde katlanan, bir süre boyunca stabil olan ve makul miktarlarda üretilebilen bir çözünür TCR açiklanir. Bu TCR, ilgili zincirlerin sürekli bölgelerine uygulanan sisteinler arasinda bir inter-zincir bagi araciligiyla sirasiyla bir TCR ß zinciri hücre disi domene dimerlenen bir hücre disi TCR ci zincirini içerir.
Spesifik pMHC baglayici partnerler, diger bir deyisle pMHC epitoplarina yönelik spesifik antikorlar ve heterodimerik ve tek zincir türünün her ikisinin TCR'Ieri, antijen sunan hücrelere terapötik ajanlarin dagitilmasina yönelik hedefleme vektörleri olarak ileri sürülmüstür. Bu amaçla, terapötik ajanin bir sekilde pMHC-baglayici partner ile iliskili olmasi gerekir. pMHC-baglayici partnerler ile iliskili bu tür hedeflenen dagitima yönelik ileri önerilen terapötik ajanlari antikorlari (bakiniz örnegin: Mosquera LA. et al., J (12): 1781-94) ve sitotoksik ajanlari içerir. Terapötik ajan polipeptid oldugunda, pMHC- baglayici partner ile iliskili biçim peptidik füzyon veya direkt füzyon veya pMHC baglayici partnere bir baglayici dizi ile füzyon araciligiyla olabilir. Bu durumlarda, esansiyel olarak yalnizca iki füzyon olanagi mevcuttur. Tek zincir antikor veya TCR'ler durumunda, füzyon prensip olarak, TCR zincirinin C- veya N- terminusunda olabilir; heterodimerik antikorlar veya TCR'Ier durumunda, füzyon prensip olarak her iki zincirin C- veya N- terminusunda olabilir. Bununla birlikte uygulamada, pMHC baglayici partner-terapötik ajan füzyonlarinin bilinen bütün örnekleri, C-terminusa kaynasan terapötik ajan ile birlikte oldugu görünür (bakiniz örnegin: Mosquera LA. et al., J nedeni, tek zincirli veya heterodimerik, bir antikor veya TCR fonksiyonelliginin dogru katlama ve degisken bölgelerin yönelimine bagli olmasidir. Terapötik ajanin, pMHC baglayici partnerin N- terminusuna füzyonu, degisken bölgelerin birinin önünde yer alir ve burada teknikte, N-terminusta bulunan terapötik ajanin, antikor veya TCR'nin pMHC kompleksine baglayicisi ile karistigi, böylelikle bunun baglayici etkisini azalttigi bir varsayim mevcuttur.
Bulusun Açiklamasi Mevcut bulus, belirli bir pMHC epitopuna yönelik spesifik bir partner baglayiciyi ve bir immün efektör polipeptidi içeren bir iki islevli molekül saglar, pMHC baglayici partnerin N-terminusu, söz konusu polipeptid baglayici partnerin, alfa zinciri SEQ lD No: 7 ve beta zinciri SEQ ID No: 9'u içeren bir T-hücre reseptörü olmamasi SARTI ILE immün efektör polipeptidin C- terminusuna baglanabilir, burada immün efektör polipeptid bir sitokindir.
Teknikteki varsayima karsin, bir immün efektör kismin bir pMHC-baglayici partnerin N- terminusuna kaynastigi iki islevli moleküllerin, füzyonun bir pMHC-baglayici partnerin C- terminusuna oldugu karsilik gelen yapi olan, bunlarin ilgili immün yanitin baslatilmasinda daha etkili oldugu bulunmustur. N-kaynastirilmis yapinin bu arttirilmis immün yaniti, N- ve C-füzyonlu versiyonlarin benzer pMHC baglayici afinitelerine ragmen elde edilir.
Polipeptid pMHC baglayici partner bir TCR olabilir. pMHC baglayici partner, bir heterodimerik dß TCR polipeptid çifti veya tek zincirli bir dß TCR polipeptit olabilir ve heterodimerik TCR polipeptid çiftinin Ol veya [3 zincirinin N-terminusu veya scTCR polipeptidinin N-terminusu, immün efektör polipeptidin bir C-terminal amino asidine bagli olabilir. pMHC baglayici partner ve immün efektör polipeptidin baglantisi, direkt veya baglayici dizi ile indirekt olabilir. Baglayici diziler, genellikle esnektir, yani, esnekligi sinirlama egilimindeki hantal yari zincirlere sahip olmayan glisin alanin ver serin gibi amino asitlerden yapilir. Baglayici dizilerin kullanilabilir veya optimum uzunluklari, herhangi bir belirli pMHC baglayici partner-immün efektör yapisi durumunda kolaylikla belirlenebilir.
Genellikle, baglayici dizi, uzunluk bakimindan yaklasik 12'den az, örnegin 10ldan az veya 5-10 amino asit olacaktir.
Bulusun bazi düzenlemelerinde, pMHC baglayici partner, a ve B polipeptidlerin her birinin degisken ve sürekli TCR bölgelerine sahip oldugu ancak TCR transmabran ve sitoplazmik bölgelerden yoksun oldugu bir heterodimerik dß TCR polipeptid çiftidir.
TCR kismi bu tür durumlarda çözünürdür. Özellikle tercih edilen bu tür iki islevli moleküllerde, TCR o ve [3 polipeptidlerinin sürekli bölgelerinin kalintilari arasinda yerel olmayan disülfid bagi mevcuttur. Özellikle, 0 ve B polipeptidlerinin sürekli bölgeleri, TRAC1'in ekson 2'inin Thr 48'i ve TRBC1 veya TRBCZ'nin ekson 1`inin Ser 57'sine yönelik sübstitüe edilen sistein kalintilari arasinda bir disülfid bagi ile baglanabilir.
Bulusun baska düzenlemelerinde, pMHC baglayici partner, Voi ve Vßinin sirasiyla TCR oi ve B degisken bölgeleri, Cd ve Cß d'nin sirasiyla TCR a ve B sürekli bölgeleri ve Llnin bir baglayici dizi oldugu tercihen Va-L-Vß, Vß-L-Voi, Voi-Ca-L-Vß veya Voi-L-Vß- CB türde bir tek zincir oiß TCR polipeptittir. immün efektör polipeptidler bilinir. Bunlar. T-hücrelerinin aktivasyonu gibi immün sistemin hümoral veya hücresel kolunun dirtekt veya indirekt aktivasyonundan bir immün yanit baslatan veya stimüle eden moleküllerdir. Örnekler asagidakileri içerir: Anti-CD2 antikoru, Anti-CD3 antikoru, Anti-CD4 antikoru, Anti-CD8 antikoru, Anti-CD44 antikoru, Anti-CD45RA antikoru, Anti-CD45RB antikoru, Anti-CD45RO antikoru, Anti- CD49a antikoru, Anti-CD49b antikoru, Anti-CD49c antikoru,Anti-CD49d antikoru,Anti- CD49e antikoru,Anti-CD49f antikoru, Anti-CD16 antikoru, Anti-CD28 antikoru, Anti-IL- 2R antikorlari. immün efektör polipeptid bir antikordur, bu bir anti-CD3 scFv olan biri gibi bir scFv antikoru olabilir. Anti-CD3 antikorlarinin örnekleri bunlarla sinirli olmamakla birlikte OKT3, UCHT-1, BMA031 ve 12F6'yi içerir. Mevcut bulusta, immün Bulusun prensipleri asagidaki Örnekler ile gösterilir. Örnek A. TCR ß zincirinin 0- veya N-terminusuna kaynastirilan efektör polipeptidlere sahip çözünür aß TCR'Ierin hazirlanisi Referans Örnek A1: Efektör Polipeptid olarak Anti-CDS Antikoru ile Çözünür NY- Bu örnegin çözünür NY-ESO TCR'si bir HLA-A2 molekülü üzerinde sunuldugunda SLLMWITQV peptidine baglanma özelligine sahiptir.
SEQ ID No: 1 (Sekil 1), bir NY-ESO TCR'nin alfa zincirinin amino asit dizisidir, burada T48'ini degistirir.
SEQ ID No: 2 (Sekil 2), NY ESO-TCR beta zincirinin amino asit dizisidir, burada TRBCZ sürekli bölgesinin 857'sini degistirir.
SEQ ID No: 3 (Sekil 3), bunun alti çizgili intrabaglayici dizisi ile bir anti CD3 UCHT-1 scFv antikorunun bir amino asit dizisidir.
Sekil 4, ci zinciri SEQ ID No: 1 ve B zinciri SEQ ID No: 2'ye sahip olan ve GGEGS (SEQ ID No: 4) olarak adlandirilan bir baglayici dizi araciligiyla TCR ß zinciri SEQ ID No: 2'nin N-terminusunda kaynasan anti CD3 UCHT-1 scFv antikoru SEQ ID No: 3'e sahip olan bir çözünür NY-ESO aß TCR yapisini blok diyagram formunda gösterir.
SEQ ID No: 14 (Sekil 16), baska bir peptid baglayici dizi (alti çizili) araciligiyla TCR beta zincirinin C-terminusuna kaynasan bir anti-CD3 scFv'nin N-terminusu ile sekil 2'nin beta zincirinin amino asit dizisidir.
SEO ID No: 15 (Sekil 17), SEQ ID No 14lteki (tekrar alti çizili) ile ayni peptid baglayici dizi araciligiyla TCR beta zincirinin N-terminusuna kaynasan bir anti-CD3 scFv'nin C- terminusu ile sekil 2'nin beta zincirinin amino asit dizisidir.
Sekil 4'ün yapisi asagidaki gibi hazirlanmistir: Ligasyon (a) TCR ci zinciri SEQ ID No: 1 ve (b) SEQ ID No: 2 ve SEO ID No: 3lün füzyon dizisini kodlayan sentetik genler, ayri ayri, E.coli susu BL21-DE3'te (pLysS) (Pan et al., kolaylastiricisini içeren, pGMT7-dayali ekspresyon plazmitlerine baglanir.
Ekspresyon plazmitleri ayri ayri, Eco/isusu BL21 (DE3) Rosetta pLysS'ye dönüstürülmüstür ve tekil ampisilin-dirençli koloniler, 0.5mM IPTG ile protein ekspresyonunun baslatilmasindan önce ~0.6-0.8`lik bir ODsoo degerine TYP (ampisilin 100pg/ml) ortaminda 37°Cide büyümüstür. Hücreler, indüksiyondan üç saat sonra bir Beckman J-SB içinde 4000rpm'de 30 dakika santrifüjleme ile hasat edilmistir. Hücre peletleri, MgCl2 ve Dnaz varliginda 25ml Bug Buster (NovaGen) ile çözünmüstür. santrifüjleme ile geri kazanilmistir. Üç deterjan yikamasi akabinde, hücre debrisi ve membran bilesenlerini uzaklastirmak üzere yürütülmüstür. Her seferde inzlüsyon gövde 10mM NaEDTA,) içinde homojenize edilmistir. Deterjan ve tuz, asagidaki tampon içinde benzer bir yikama ile uzaklastirilmistir: 50mM Tris-HCI pH 8.0, 1mM NaEDTA.
Nihai olarak inklüzyon gövdesi 30 mg bölüntülere bölünmüstür ve -70°C'de dondurulmustur.
Dogal/asim Yaklasik 20mg TCR o zinciri ve 40mg scFv-TCR ß zinciri çözünmüs inklüzyon gövdeleri, dondurulmus stoklardan çözdürülmüstür, 20ml'lik bir guanidin solüsyonuna DTT) seyreltilmistir ve zincirin tamamen denatürasyonunu saglamak üzere 37°C'Iik bir su banyosunda 30 dakika-1 saat inkübe edilmistir. Tamamen indirgenmis ve denatüre edilmis TCR zincirleri içeren guanidin solüsyonu akabinde, asagidaki dogallasim EDTA, 5M Üre. Redoks çifti (sisteamin hidroklorid ve sistemin dihidroklorid (sirasiyla 16mM ve 1.8mM'Iik nihai konsantrasyonlara,)) denatüre TCR o ve scFv-TCR ß zincirlerinin eklenmesinden yaklasik 5 dakika önce eklenmistir. Solüsyon ~30 dakika birakilmistir. Yeniden katlanan scFv-TCR, 10 L H20'ya karsi 18-20 saat diyalize boru hatti selüloz membran (Sigma-Aldrich; Ürün No. D9402) içinde diyalize edilmistir. Bu süreden sonra, diyaliz tamponu, taze 10 mM Tris pH 8.1'e (10 L) iki kez degistirilmistir ve diyaliz 5°C ± 3°C'de ~8 daha devam ettirilmistir. Çözünür ve dogru sekilde katlanmis scFv-TCR, asagida açiklandigi üzere bir 3-adimli saflastirma yöntemi ile yanlis katlanan, bozunma ürünlerinden ve kirliliklerden ayrilmistir. Ikinci saflastirma adimi, çözünür anti-CD3 scFv-TCR füzyonunun pl'sine bagli olarak bir iyon degisim kromatografisi veya bir afinite kromatografisi olabilir.
Birinci Safiastirma Adimi Diyalize yeniden katlanmis (10mM Tris pH8.1 içinde), bir POROS 50HQ anyon degisim kolonu üzerine yüklenmistir ve bag proteini bir Akta saflastirici (GE Healthcare) kullanilarak 6 kolon hacmi üzerinde 0-500mM NaCI'Iik bir gradyan ile ayristirilmistir. Pik fraksiyonlari (~ 20mS / cm'lik bir iletkenlikte ayristirma) 4 ° C'de depolanmistir. Pik fraksiyonlari birlestirilmeden önce Hizli Mavi Boya (Novexin) ile boyanan SDS-PAGE ile analiz edilmistir.
Ikinci saflastirma adimi iyon degisim kroma tografisi Katyon degisim saflastirmasi: Anyon degisim birlesim fraksiyonlarinin, scFv-TCR füzyonunun pl”sine bagli olarak 20mM MES pH6-6.5 ile seyreltme ile tamponu degistirilmistir. Çözünür ve dogru sekilde katlanan scFv-TCR, ayristirilmis birlesmis fraksiyonlar (20mM MES pH6-6.5 içinde), bir POROS 50HS katyon degisim kolunu üzerine yüklenerek ve Akta saflastirici (GE Healthcare) kullanilarak 6 kolon hacmi üzerinde 0-500mM NaCI'Iik bir gradyan ile ayristirilarak yanlis katlanan, bozunma ürünleri ve kirliliklerden ayrilmistir. Pik fraksiyonlari(~10mS/cm'lik bir iletkenlikte ayristirma) 4°C”de depolanmistir.
Alternatif olarak, asagida açiklandigi üzere hidroksiapatit matrisi kullanan iyon degisim saflastirmasi kullanilabilir.
Hidroksiapatit kromatografisi: Anyon degisim birlesmis fraksiyonlarinin, ayrica 10mM NaHzPO4 pH6.0 ile seyreltme ile tamponu degistirilmistir. Çözünür ve dogru sekilde katlanan scFv-TCR, ayristirilmis birlesmis fraksiyonlar (10mM NaHzPO4pH6.O içinde), bir hidroksiapatit kolunu üzerine yüklenerek ve Akta saflastirici (GE Healthcare) kullanilarak 6 kolon hacmi üzerinde 10- 500mM NaH2P04/1M NaCI'lik bir gradyan ile bag proteini ayristirilarak, yanlis katlanan, bozunma ürünleri ve kirliliklerden ayrilmistir. Pik fraksiyonlari(~20mS/cm'lik bir iletkenlikte ayristirma) 4°C'de depolanmistir.
Afinite kromatografisi 6-6.5'ya yakin bir pI'Ii bazi scFv-TCR füzyonlarina yönelik olarak, iyon degisim adimi kullanilamaz ancak bir afinite kromatografisi adimi ile yer degistirilebilir. Protein L afinite kromatografi kolonu (Pierce, ürün numarasi 89928) bunlarin kappa hafif zincirleri araciligiyla belirli immünoglobulin siniflarini izole eder ve saflastirir. Protein L, ayrica tek zincir degisebilen fragmentleri (scFv) baglayabilir. Anyon degisim birlesmis fraksiyonlarin, PBS/%002 sodyum ile seyreltme ile tamponu degistirilmistir. Çözünür ve dogru sekilde katlanan scFv-TCR, ayristirilmis birlesmis fraksiyonlar, bir Protein L kolunu üzerine yüklenerek ve bir Akta saflastirici (GE Healthcare) kullanilarak 3 kolon hacmi üzerinde bir 0-25mM Glisin pH2.3/%0.02 sodyum azid gradyani ile ayristirilarak yanlis katlanan, bozunma ürünleri ve kirliliklerden ayrilmistir. scFv-TCR gradyanda oldukça geç ayrisir ve ayristirilan fraksiyonlar Tris pH8.1 (100mM Tris pH8.1 nihai konsantrasyon) eklenmesi araciligiyla nötr hale getirilmistir. Pik fraksiyonlari 4°C`de depolanmistir.
Nihai saflastirma adimi Ikinci saflastirma adimindan pik fraksiyonlari, birlestirilmeden önce Hizli Mavi Boya (Novexin) ile boyanan SDS-PAGE ile analiz edilmistir. Birlestirilen fraksiyonlar çözünür scFv-TCR saflastirildiginda ve PBS tamponunda (Sigma) önceden dengelendirilen bir Superdex 8200 jel filtrasyon kolonu (GE Healthcare) kullanilarak karakterize edildiginde akabinde, nihai saflastirma adimina yönelik olarak konsantre edilmistir.
Yaklasik 78 kDa'Iik ilgili bir moleküler agirlikta pik ayristirmasi, birlestirilmeden önce Hizli Mavi Boya (Novexin) ile boyanan SDS-PAGE ile analiz edilmistir.
Sekil 4'ün yapisina yönelik olarak açiklanana benzer bir biçimde, Sekil 5, 6 ve 7'nin yapilari hazirlanmistir: Sekil 5, ci zinciri SEO ID No: 1 ve B zinciri SEQ ID No: 2`ye sahip olan ve AHHSEDPSSKAPKAP (SEQ ID No: 5) olarak adlandirilan bir baglayici dizi L2 araciligiyla TCR ß zinciri SEQ ID No: 2`nin N-terminusunda kaynasan anti CD3 UCHT- 1 scFv antikoru SEQ ID No: 3'e sahip olan bir çözünür NY-ESO orß TCR yapisini blok diyagram formunda gösterir.
Sekil 6, or zinciri SEQ ID No: 1 ve B zinciri SEQ ID No: 2'ye sahip olan ve GGEGGGSEGGGS (SEO ID No: 6) olarak adlandirilan bir baglayici dizi L3 araciligiyla TCR ß zinciri SEQ lD No: 2inin N-terminusunda kaynasan anti CD3 UCHT-1 scFv antikoru SEO ID No: 3'e sahip olan bir çözünür NY-ESO oiß TCR yapisini blok diyagram formunda gösterir.
Sekil 7, 0( zinciri SEO ID No: 1 ve B zinciri SEO lD No: 2lye sahip olan ve bu durumda tek amino asit (S) olan bir baglayici dizi (L4) araciligiyla TCR ß zinciri SEO ID No: 2'nin N terminusunda kaynastirilan anti CD3 UCHT-1 scFv antikoru SEO ID No: 3'e sahip olan bir çözünür NY-ESO aß TCR yapisini blok diyagram formunda gösterir.
Sekiller 4, 5, 6 ve 7'nin yapilarina yönelik açiklanana benzer bir biçimde, anti-CD3 scFv TCR beta zincirinin C-terminusuna kaynastirildiginda, TCR d zinciri SEO ID No: 1 ve TCR ß zinciri-anti-CD3 scFv SEO ID No: 14'e veya anti-CD3 scFv, TCR beta zincirinin N-terminusuna kaynastirildiginda TCR oi zinciri SEO ID No: 1 ve the TCR ß zinciri-anti- CD3 scFv SEO ID No: 15'e sahip olan füzyon proteinleri hazirlanmistir. Örnek A2. Efektör Polipeptidler olarak Sitokinler ile Çözünür kimerik TCR SEO ID No: 7 (Sekil 8), murin H-2Kd kompleksi ile gösterilen bir murin insülin-derive peptide (LYLVCGERG (SEO ID NO: 8)) baglanma özelligine sahip bir TCR'nin alfa zincirinin amino asit dizisidir. (LYLVCGERG- H-2Kd), burada 0158 (SEO ID No: 7 numaralandirmasini kullanarak) bunun TRAC sürekli bölgesinin T48'ini degistirir.
SEO ID No: 9 (Sekil 9), murin LYLVCGERG- H-2Kd kompleksine baglanan ayni TCR'nin beta zincirinin amino asit dizisidir, burada C171 (SEO ID No: 9 numaralandirmasini kullanarak), TRBCZ sürekli bölgesinin S57*sini degistirir.
SEO ID No: 7 ve 9 TCR, her biri bir murin degisebilir bölge ve bir insan sürekli bölgesini içeren bir alfa ve bir beta TCR zincirinden olusan bir kimerik TCR'dir. TCR'nin kimerik versiyonu, tamamiyla murin TCR'Ieri ile karsilasilan dogallasim problemlerini gelistirmek üzere yapilmistir ve kimerik TCR'nin murin insülin-derive peptid-murin H- 2Kd kompleksine yönelik murin TCRlsi ile ayni afiniteye sahip oldugu gösterilmistir.
SEO ID No: 10 (Sekil 10), bir murin lL-4 polipeptidinin amino asit dizisidir.
SEO ID No: 11 (Sekil 11), bir murin IL-13 polipeptidinin amino asit dizisidir.
Sekil 12, oi zinciri SEQ ID No: 7 ve B zinciri SEQ ID No: 9'a ve GGEGGGP (SEQ ID No: 12) olarak adlandirilan baglayici dizi (L5) araciligiyla TCR ß zinciri SEQ ID No: 9'un N terminusunda kaynastirilan murin IL-4 SEQ ID No: 10'a sahip olan çözünür bir kimerik insülin dß TCR'nin yapisini blok diyagram halinde gösterir.
Sekil 13, oi zinciri SEQ ID No: 7 ve [3 zinciri SEQ ID No: 9'a ve GSGGP (SEQ ID No: 13) olarak adlandirilan baglayici dizi (LG) araciligiyla TCR ß zinciri SEQ ID No: 9'un C terminusunda kaynastirilan murin lL-4 SEQ ID No: 10'a sahip olan çözünür bir kimerik insülin dß TCR'nin yapisini blok diyagram halinde gösterir.
Sekil 14, oi zinciri SEQ ID No: 7 ve B zinciri SEO ID No: 9'a ve GGEGGGP (SEQ ID No: 12) olarak adlandirilan baglayici dizi (L5) araciligiyla TCR ß zinciri SEQ ID No: 9'un N terminusunda kaynastirilan murin IL-13 SEQ ID No: 11'a sahip olan çözünür bir kimerik insülin dß TCR'nin yapisini blok diyagram halinde gösterir.
Sekil 15, 0( zinciri SEQ ID No: 7 ve B zinciri SEQ ID No: 9,a ve GSGGP (SEQ ID No: 13) olarak adlandirilan baglayici dizi (L6) araciligiyla TCR ß zinciri SEQ ID No: 9'un C terminusunda kaynastirilan murin lL-13 SEQ ID No: 11'a sahip olan çözünür bir kimerik insülin ciß TCR'nin yapisini blok diyagram halinde gösterir.
Sekiller 12 -15'in yapilari asagidaki gibi hazirlanmistir.
Ligasyon (a) the TCR ci zinciri SEO ID No: 7 ve (b) SEQ ID No: 9 ve SEO ID No: 10 veya 11'in füzyon dizilerini kodlayan sentetik genler, ayri ayri, E.coli susunda BL21-DE3(pLysS) kolaylastirici içeren pGMT7-bazli ekspresyon plazmidlerine baglanmistir.
Sirasiyla TCR d-zinciri ve sitokin - ß-zincirini içeren ekspresyon plazmidleri, ayri ayri, Eco/i'susuna BL21 (DE3) Rosetta pLysS dönüstürülmüstür ve tekil ampisilin-dirençli koloniler, 0.5mM IPTG ile protein ekspresyonu baslatilmadan önce ~-0.6-0.8'Iik OD ortaminda 37°Ctde büyütülmüstür. Hücreler, indüksiyondan üç saat sonra bir Beckman J-GB içinde 4000rpm'de 30 dakika santrifüjleme ile hasat edilmistir. Hücre peletleri, MgCI2 ve Dnaz varliginda 25ml Bug Buster (NovaGen) ile çözünmüstür. Inklüzyon gövde peletleri Beckman J2-21 santrifüjünde 13000rpm'de 30 dakika santrifüjleme ile geri kazanilmistir. Üç deterjan yikamasi akabinde, hücre debrisi ve membran bilesenlerini uzaklastirmak üzere yürütülmüstür. Her seferde inzlüsyon gövde peleti, bir Beckman J2-21'de 13000rpm'de dakika santrifüjleme ile peletlenmeden önce bir Triton tamponu (50mM Tris-HCI pH içinde homojenize edilmistir.
Deterjan ve tuz, asagidaki tampon içinde benzer bir yikama ile uzaklastirilmistir: 50mM Tris-HCI pH 8.0, 1mM NaEDTA. Nihai olarak inklüzyon gövdesi 30 mg bölüntülere bölünmüstür ve -70°C,de dondurulmustur. Inklüzyon gövde proteini, 6M guanidin-HCI ile çözündürülerek miktari belirlenmistir ve bir 0D ölçümü bir Hitachi U-2001 Spektrofotometresi üzerinde alinmistir. Protein konsantrasyonu akabinde, teorik sönüm katsayisi kullanilarak hesaplanmistir.
Dogallasim Yaklasik 20mg TCR a zinciri ve 40mg sitokin-TCR ß zinciri çözünmüs inklüzyon gövdeleri, dondurulmus stoklardan çözdürülmüstür, 20ml“lik bir guanidin solüsyonuna DTT) seyreltilmistir ve zincirin tamamen denatürasyonunu saglamak üzere 37°C'Iik bir su banyosunda 30 dakika-1 saat inkübe edilmistir. Tamamen indirgenmis ve denatüre edilmis TCR zincirleri içeren guanidin solüsyonu akabinde, asagidaki soguk ( dogallasim tamponunun 1 Iitresine enjekte edilmistir: 100mM Tris pH 8.1, 400mM L- Arginin, 2mM EDTA, SM Üre. Redoks çifti (sisteamin hidroklorid ve sistamin dihidroklorid (sirasiyla 10 mM ve denatüre TCR 0 ve sitokin-TCR ß zincirlerinin eklenmesinden yaklasik 5 dakika önce eklenmistir.
Solüsyon ~30 dakika birakilmistir. Yeniden katlanan sitokin-TCR, 10 L HZO'ya karsi 18-20 saat diyalize boru hatti selüloz membran (Sigma-Aldrich; Ürün No. D9402) içinde diyalize edilmistir. Bu süreden sonra, diyaliz tamponu, taze 10 mM Tris pH 8.1'e (10 L) iki kez degistirilmistir ve diyaliz 5°C ± 3°C`de ~8 daha devam ettirilmistir.
Saf/astirma Çözünür sitokin-TCR füzyon, asagida açiklandigi üzere oda sicakliginda bir 3-adimli saflastirma yöntemi ile bozunma ürünlerinden ve kirliliklerden ayrilmistir.
Birinci Safiastirma Adimi Diyalize yeniden katlanmis, kolon saflastirmasindan önce bir Sartopore 0.2 pm kapsül (sartorius) kullanilarak filtrelenmistir. Filtrelenen yeniden katlanmis, bir POROS 50HQ anyon degisim kolonu üzerine yüklenmistir ve bag proteini bir Akta saflastirici (GE Healthcare) kullanarak 6 kolon hacmi üzerinde of 0-500mM NaCI'Iik bir lineer gradyan ile ayristirilmistir. 250 mM NaCI'de ayristirilan, dogru sekilde katlanan proteinlerden olusan pik fraksiyonlari 4°Cide depolanmistir. Pik fraksiyonlari, birlestirilmeden önce Hizli Mavi Boya (Novexin) ile boyanan SDS-PAGE ile analiz edilmistir.
Ikinci saflastirma adimi Çözünür sitokin-TCR içeren birlestirilmis pik fraksiyonlari, oda sicakliginda 2SO4'Iük bir nihai konsantrasyonu vermek üzere 50mM Tris/1M (NH4)ZSO4 pH 8'Iik bir es deger hacim ile karistirilmistir. Çözünür sitokin-TCR, bu örnek, ön-dengelendirilmis (50mM Tris/0.5M (NH4)2SO4 pH 8) bütil hidrofobik interaksiyon kolon (5ml HiTrap GE Healthcare) üzerine yüklenerek ve bir Akta saflastirici (GE- Healthcare) kullanilarak sürekli akisin toplanmasi ile bozunma ürünlerinden ve kirliliklerden ayrilmistir. Çözünür sitokin-TCR içeren sürekli akis örnegi, birlestirilmeden önce Hizli Mavi Boya (Novexin) ile boyanan SDS-PAGE ile analiz edilmistir ve 4°C`de depolanmistir.
Nihai saflastirma adimi Birlestirilmis fraksiyonlar, 10mM Tris pH8'Iik bir es deger hacim ile seyreltilmistir ve 10 ml'ye (53 mgiml'lik konsantrasyon) konsantre edilmistir. Çözünür sitokin-TCR, PBS tamponunda (Sigma) ön-dengelendirilmis bir Superdex 8200 jel filtrasyon colonu (GE Healthcare) kullanilarak saflastirilmistir. Yaklasik 63 kDa,Iik ilgili bir moleküler agirlikta pik ayristirmasi, birlestirilmeden önce Hizli Mavi Boya (Novexin) ile boyanan SDS- PAGE ile analiz edilmistir. Örnek B. TCR ß zincirinin C- veya N-terminusuna kaynastirilan efektör polipeptidlere sahip çözünür dß TCR'Ierin özellikleri Referans Örnek B1: Efektör Polipeptid olarak Anti-CD3 Antikoru ile Çözünür NY- a. CD8+T hücrelerinin, NY-ESO peptid sunan hücrelere karsi bir anti-CD3 antikoruna kaynastirilarak yeniden yönlendirilmesi be aktivasyonu Asagidaki deney, spesifik peptid-MHC kompleksi araciligiyla bir anti-CD3 scFv-TCR füzyonu ile sitotoksik T Ienfositlerin (CTLs) aktivasyonunu göstermek üzere yürütülmüstür. IFN-y üretimi, ELISPOT deneyi kullanilarak ölçüldügü üzere, sitotoksik T degerlendirilmesine yönelik bir deger olarak kullanilmistir.
Reaktifler Deney ortami: %10 FCS (Gibco, Cat# , Peptid: Ilk olarak 4mg/ml'de DMSO (Sigma, cat# D2650) içinde çözünen ve dondurulan (SLLMWITQV). T2 hücreleri, açiklanan peptid ile pulslanir ve hedef hücreler olarak kullanilir.
Yikama tamponu: 0.01 M PBS/%005 Tween 20 PBS (Gibco Cat# 10010) Insan IFNy ELISPOT PVDF-Enzimatik kit (Diaclone, Fransa; Cat# 856051020) gerekli olan tüm diger reaktifleri içerir. (Insan IFN-y PVDF ELISPOT 96 gözlü plakalarinin yanisira yakalama ve saptama antikorlari, yagsiz süt tozu, BSA, streptavidin-alkalin fosfataz ve BCIP/NBT solüsyonu) Yöntem Hedef hücre hazirlanisi Bu yöntemde kullanilan hedef hücreler, (1) dogal epitop-sunan hücreler (Mel624 veya Mel526 hücreleri gibi) veya (2) reaktifler bölümünde açiklanan ilgili peptid ile pulse akabinde deney ortaminda 106 hücreler/mide yeniden süspanse edilmistir.
Efektör Hücre Hazirlanisi Bu yöntemde kullanilan efektör hücreler (T hücreleri), CD8+ T hücreleri ((CD8 Negatif Izolasyon Kiti, Dynal, Cat# 113.19 kullanilarak) PBL'den negatif seleksiyon ile elde edilen) veya EBV hücre hatti veya PBMCs'den T hücreleridir. Efektör hücreler, (Heraeus) içinde 1200 rpm'de 10 dakika santrifüjleme ile yikanmadan önce, buzu eritilmistir ve deney ortamina yerlestirilmistir. Hücreler akabinde, deney ortaminda bir 4X istenen nihai konsantrasyonda yeniden süspanse edilmistir.
Reaktif/Test Bilesigi Hazirlanisi Test bilesikleriniin degisen konsantrasyonlari (TCR-anti-CD3 füzyonlar; 10 nM ila , 4X nihai konsantrasyonu vermek üzere deney ortamina seyreltilerek hazirlanmistir.
ELISPOT'LAR Plakalar asagidaki gibi hazirlanmistir: 10 ml steril PBS plakasi basina 100 ul anti-lFN-y yakalama antikoru seyreltilmistir. 100 pl seyreltik yakalama antikoru akabinde her bir göze bölünmüstür. Plakalar akabinde 4°Ctde bir gece inkübe edilmistir. Inkübasyonun ardindan, plakalar, yakalama antikorunu uzaklastirmak üzere yikanmistir (program 1, plaka türü 2, Ultrawash Plus 96-gözlü plaka yikayici; Dynex). Plakalar akabinde. her bir göze 100 pl %2 steril yagsiz süt eklenerek ve plakalar oda sicakliginda iki saat daha inkübe edilerek bloke edilmistir. Yagsiz süt akabinde, plakalardan (program 1, plaka türü 2, Ultrawash Plus 96- gözlü plaka yikayici, Dynex) yikanmistir ve arta kalan herhangi bir yikama tamponu ELISPOT plaklar bir kagit havlu üzerinde fiskeleyerek ve hafifçe vurarak uzaklastirilmistir.
Deneyin bilesenleri akabinde ELISPOT plakasina asagidaki sira ile eklenmistir: 50 ul reaktif (anti-CD3 scFv-TCR füzyonlar; degisen konsantrasyonlar) 50 pl ortam (deney ortami) arasinda EBV hücre/göz; .
Plakalar akabinde bir gece (37°C / %5C02) inkübe edilmistir. Sonraki gün plakalar yikama tamponu ile üç kez (program 1, plaka türü 2, Ultrawash Plus 96-gözlü plaka yikayici, Dynex) yikanmistir ve fazlalik yikama tamponunu uzaklastirmak üzere kagit havlu üzerinde hafifçe vurulmustur. 100 pl birincil saptama antikoru akabinde her bir göze eklenmistir. Birincil saptama antikoru, Diaclone kiti ile uygulanan saptama antikoru viyaline 550 pl distile su eklenerek hazirlanmistir. Bu solüsyonun 100 pl`si akabinde, 10 ml PES/%1 BSA'da (tekil plakaya yönelik gerekli hacim) seyreltilmistir.
Plakalar, akabinde yikama tamponu ile üç kez yikanmadan Önce (program 1, plaka türü 2, Ultrawash Plus 96-gözlü plaka yikayici, Dynex) oda sicakliginda en az 2 saat inkübe edilmistir, fazlalik yikama tamponu plakaya kagit havlu üzerinde hafifçe vurularak uzaklastirilmistir.
Ikincil saptama, her bir göze 100 pl seyreltik streptavidin-Alkalin fosfataz eklenerek ve plaka, oda sicakliginda 1 saat daha inkübe edilerek gerçeklestirilmistir. Streptavidin- Alkalin fosfataz, 10 ml PES/%1 BSAiya (bir tekil plakaya yönelik gerekli hacim) 10 pl streptavidin-Alkalin fosfataz eklenerek hazirlanmistir. Plakalar akabinde yikama tamponu (program 1, plaka türü 2, Ultrawash Plus 96-gözlü plaka yikayici, Dynex) with ile üç kez yikanmistir. Diaclone kiti ile tedarik edilen 100 pl BCIP/NBT solüsyonu akabinde her bir göze eklenmistir. Gelisme esnasinda plakalar folyo kaplanmistir ve 5 - 15 dakika birakilmistir. Gelisen plakalar, reaksiyonu bitirmek üzere optimal zamani belirlemek üzere bu süre boyunca noktalara yönelik olarak düzenli sekilde kontrol edilmistir. Plakalar, gelisim reaksiyonunu bitirmek üzere agzina kadar su ile dolu bir lavabo içinde yikanmistir ve bunlarin, bunlarin üç bilesenine ayrilmasindan önce çalkalanarak kurutulmustur. Plakalar akabinde, bir Immünospot Plaka okuyucu (CTL; Cellular Technology Limited) kullanilarak membran üzerinde olusturulan noktalarin sayilmasindan 1 saat önce 50°C'de kurutulmustur.
SONUÇLAR Sekiller 4-7'nin anti-CD3 scFv-TCR füzyon yapilari, ELISPOT deneyi (yukarida tarif edildigi üzere) ile test edilmistir. Her bir gözde gözlenen ELISPOT noktalarinin sayisi, Prism (Graph Pad) kullanilan test yapisinin konsantrasyonuna karsi planlanmistir. Bu doz cevap egrilerinden, E050 degerleri (E050, maksimum yanitin %50'sine neden olan anti-CD3 scFv-TCR füzyonun konsantrasyonunda saptanir) saptanmistir.
Test Yapisi EC50 E050 EC50 C-terminal füzyon 8.502e-1 1 N-terminal füzyon 4.825e-1 1 N-terminal füzyon 3.95e-1 1 N-terminal füzyon Bu sonuçlar, Sekiller 4, 5 ve 6 'nin N-füzyonlu yapilarinin, sitotoksik T Ienfositlerini aktive etme yetenegi bakimindan bunlarin Sekil 7'nin C-füzyonlusundan en az iki kat daha kuvvetli oldugunu gösterir. b. IM9 EBV transforme B hücre hattini (radyoaktif olmayan sitotoksisite deneyi) öldürmek üzere bir anti-CDS antikoruna kaynastirilan çözünür NY-ESO TCR ile CDB+ T hücrelerinin yeniden yönlendirilmesi Asagidaki deney, spesifik peptid-MHC kompleksi araciligiyla bir TCR- anti-CD3 scFv füzyonu ve IM9 hücrelerini öldürmek üzere CTL'leri aktive etmek üzere füzyonun anti- CD3 scFv kisminin potansiyelinin degerlendirilmesi ile sitotoksik T Ienfositlerin (CTL'Ier) aktivasyonunu göstermek üzere yürütülmüstür. Bu deney, 51Cr salinim sitotoksisite deneylerine alternatif bir kolorimetriktir ve hücrenin Iizisinden sonra salinan bir enzim olan laktat dehidrojenazi (LDH) kantitatif olarak ölçer. Kültür süpernatantlari içinde salinan LDH, bir tetrazolyum tuzunun (INT) bir kirmizi formazan ürününe dönüsümü ile sonuçlanan bir 30-dakikalik birlesik enzimatik deney ile ölçülür. Olusan renk miktari, parçalanan hücrelerin sayisina orantilidir. Abzorbans verisi, 490nm'de standart bir 96-gözlü plaka okuyucu kullanilarak toplanmistir.
Materyaller - Substrat Karisimi, Deney Tamponu, Parçalama Solüsyonu ve Durdurucu Solüsyonu içeren CytoT0x96® Radyoaktif Olmayan Sitotoksisite Deneyi (Promega) (G1780) 15070063) - Nunc mikrogöz yuvarlak tabanli 96 gözlü doku kültür plakasi (Nunc, cat# 163320) - Nunc-Immüno Plakalar Maxisorb (Nunc, cat# 442404) Yöntem Hedef hücre hazirlanisi Bu deneyde kullanilan hedef hücreler, bir çoklu melanom hastasindan (HLA-A2* NY- ESO+) derive edilen IM9 EBV transforme B hücre hattidir. Mel526 melanom hücre hatti bir kontrol olarak kullanilmistir ve HLA-A2+ NY-ESO'*dur. Hedef hücreler deney ortaminda hazirlanmistir: hedef hücre konsantrasyonu 50 ul'de 1 x 104 hücreler/ gözü vermek üzere 2 x 105 hücreler/ml'ye ayarlanmistir.
Efektör hücre hazirlanisi Bu deneyde kullanilan hücreler CD8"T hücreleridir. Kullanilan efektör, hedef orani Reaktifî test bilesigi hazirlanisi TCR alfa zinciri SEQ ID No: 1 ve TCR beta zinciri-anti-CD3 scFv füzyon SEQ ID No: 14'e sahip olan veya TCR alfa zinciri SEQ lD No: 1 ve TCR beta zinciri-anti-CD3 scFv füzyon SEQ ID No: 15*e sahip olan NY-ESO TCR-anti-CD3 füzyonlarin degisen konsantrasyonlari, örnek A1'de açiklandigi üzere hazirlanmistir ve deney ortamina seyreltme (10-13 ila 10-8 M nihai konsantrasyon) ile bu deneye yönelik olarak hazirlanmistir.
Deney hazirlanisi Deneyin bilesenleri asagidaki düzende plakaya eklenmistir: - her bir göze 50 pl hedef hücreler, IM9 veya Mel526 (daha önceden açiklandigi üzere hazirlanan). - her bir göze 50 pl reaktif (daha önceden açiklandigi üzere hazirlanan). - her bir göze 50 pl efektör hücre (daha önceden açiklandigi üzere hazirlanan).
Birkaç kontrol asagida açiklandigi sekilde hazirlanmistir: - Efektör spontane salinim: 50 pl yalniz efektör hücreler.
- Hedef hücreler spontane salinim: 50 pl yalniz hedef hücreler. e Hedef maksimum salinim: 50 pl hedef hücreler arti hücreleri parçalamak üzere deneyin baslangicinda 80ug/ml digitonin - Deney ortami kontrol: 150 pl yalniz ortam.
Deneye yönelik gözler üç seri halinde ve kontrol gözleri iki seri halinde 150 ulilik bir nihai hacimde hazirlanir.
Plaka 4 dakika 250 x g'da santrifüjlenmistir akabinde 37°C'de 24 saat inkübe edilmistir.
Plaka 4 dakika 250 x g'da santrifüjlenmistir. Deney plakasinin her bir gözünden 37.5 pl süpernatant, bir düz-tabanli 96 gözlü Nunc Maxisorb plakasinin karsilik gelen gözüne aktarilmistir. Substrat Karisimi. Deney Tamponu (12ml) kullanilarak yeniden yapilandirilmistir. Yeniden yapilandirilan 37.5 pl Substrat Karisimi akabinde plakanin her bir gözüne eklenmistir. Plaka alüminyum folyo ile kaplanmistir ve oda sicakliginda dakika inkübe edilmistir. 37.5 ul Durdurucu Solüsyon, reaksiyonu durdurmak üzere plakanin her bir gözüne eklenmistir. Durdurucu Solüsyonun eklenmesinden sonra 1 saat içinde ELISA plaka okuyucu üzerinde 490nm'de abzorbans kaydedilmistir.
Sonuçlarin Hesaplanisi Kültür ortami altyapisinin abzorbans degerlerinin ortalamasi, Deneyin (Hedef Hücre Spontane Salinim ve Efektör Hücre Spontane Salinim ve Hedef maksimum salinim) bütün degerlerinden çikartilmistir.
Dogrulanmis degerler, sitotoksisite yüzdesini hesaplamak üzere asagidaki formülde kullanilan ilk iki adimda elde edilmistir.
Sonuçlar (i) TCR alfa zinciri SEQ ID No: 1 ve the TCR beta zinciri-anti-CD3 scFv füzyon SEQ ID No: 14'e (C-terminal füzyon) sahip olan veya (ii) TCR alfa zinciri SEQ ID No: 1 ve TCR beta zinciri-anti-CDB scFv füzyon SEQ lD No: 15'e (N-terminal füzyon) sahip olan NY- ESO TCR-anti-CD3 scFv füzyon yapilari, LDH salinim deneyi (yukarida açiklandigi üzere) ile test edilmistir. Her bir gözde gözlenen % sitotoksisite, Prism (Graph Pad) kullanilan test yapisinin konsantrasyonuna karsi planlanmistir. Bu doz-cevap egrisinden, E050 degerleri (EC50, maksimum yanitin %50`sine neden olan TCR füzyon konsantrasyonunda saptanir) saptanmistir.
Test Yapisi EC50 C-terminal füzyon (SEQ ID No: 1 ve SEO ID No: 14) 1.29'9 N-terminal füzyon (SEQ ID No: 1 ve SEO ID No: 15) 3.2e`11 Bu sonuçlar, TCR alfa zinciri SEQ ID No: 1 ve TCR beta zinciri-anti-CD3 scFv füzyon SEQ ID No: 15'i içeren N-terminal füzyonun, hedef hücreleri öldürmek üzere sitotoksik T Ienfositleri yönlendirme yetenegi bakimindan, TCR alfa zinciri SEQ ID No: 1 ve TCR beta zinciri-anti-CD3 scFv füzyon SEQ ID No: 14'ü içeren C-terminal füzyon yapisindan en az 2-kat daha kuvvetli oldugunu gösterir. Örnek BZ. Efektör Polipeptidler olarak Sitokinler ile Çözünür kimerik TCR a. Efektör polipeptid olarak Murin IL-4 sitokin Asagidaki deneyi Sekiller 12-13iün murin IL-4 -TCR füzyon yapilarinin sitokin kisminin biyolojik aktivitesini test etmek üzere kullanilmistir. Bu, murin hücre hattini (CTLL-2) kullanan biyolojik deneydir, bunlar, büyümeye yönelik olarak murin lL-4'e baglidir ve bir murin IL-4 - TCR füzyonun sitokin kisminin biyolojik aktivitesini göstermek üzere burada kullanilir.
Materyaller CTLL-2 hücreleri, CeIlTiter-Glo® Tamponu ve CeIITiter-Glo® Substrat (Iiyofilize) dahil olmak üzere Promega CeIITiter-Glo®lüminesan hücre canliligi deneyi (Cat# G7572) penisilin/streptomisin (Gibco, cat# 15070-063) ile tamamlanan RPMI CTLL-2 hücreleri hasat edilmistir, deney ortaminda (1200rpm'de 5 dakika santrifüjlenmistir) bir kez yikanmistir, sayilmistir ve Tripan mavi solüsyonu kullanilarak canlilik tayin edilmistir. Canliligin %80tin altinda olmasi halinde, ölü hücreleri uzaklastirmak üzere (800xg fren kapali 15 dakika) bir ficoll gradyani gerçeklestirilmistir.
Hücreler ayrica iki kez daha yikanmistir ve hacim 1 x 105 hücreler/ml sonucu vermek üzere ayarlanmistir. CTLL-2 hücreleri, akabinde standart murin lL-4 (Peprotech) veya TCR füzyon yapilarinin titre edilen 50ul konsantrasyonlari bir Nunc beyaz düz-tabanli 96-gözlü plakaya (5000hücreler/göz) eklenmistir. Kontroller, yalniz hücreleri (yalniz deney ortami) ve 200U/ml Proleukin (Chiron) ile hücreleri içerir. Plaka 37°C'de, reaktifi çözdürülmüstür ve plakaya (göz basina 100 ul) eklenmistir. Plaka lüminesan sinyali stabilize etmek üzere 10 dakika inkübe edilmistir ve akabinde lüminesan okuyucu kullanilarak kaydedilmistir. Altyapi sinyalleri (yalniz hücreler), okumalardan elde edilmistir ve Prism (Graph Pad) kullanilarak grafik haline getirilmistir, böylece Sekiller 12 ve 13'ün murin IL-4 - TCR füzyon yapilarinin ECSO'Ieri, “serbest” rekombinant murin IL-4 ile karsilastirilabilir.
Sonuçlar Test Yapisi E050 E050 E050 7.464e-1 2 C-terminal füzyon N-terminal füzyon Bu sonuçlar, Sekil 12`nin N-füzyonlu yapisinin, bunun, hücre proliferasyonunu aktive etme yeteneginde, Sekil 13'ün C-füzyonlu yapisindan en az 2-kat daha kuvvetli oldugunu gösterir. b. Efektör polipeptid olarak Murin lL-13 sitokin Asagidaki deney, Sekiller 14-15'in murin IL-13 - TCR füzyon yapilarinin sitokin kisminin biyolojik aktivitesini test etmek üzere kullanilmistir.
Bu deney, bir sitokin-TCR füzyonundan sitokin kisminin aktivitesini, diger bir deyisle insan monositleri ile IL-1i3 üretiminin inhibisyonunu göstermek üzere yürütülmüstür. Bu deney, sitokinin, murin IL-13 oldugunda, sitokin-TCR füzyonlarini test etmek üzere kullanilabilir.
Materyaller Monositler beyaz kari hücrelerinden (NBS Bristol Transfüzyon Servisinden beyaz kan hücreleri) derive edilir Bozulmamis insan hücrelerine (113.35) yönelik Dynal penisilin/streptomisin (Gibco, cat# 15070-063) salinin 1 kesesi, pH7.4 Sigma'dan, 1 litre distile su içinde çözünen cat# P-3563 nihai bilesigi verir . PBS (Gibco, HBSS Caz* ve Mg” serbest (Gibco, cat# 1018-165) tüm diger reaktifleri içerir diger bir deyisle yakalama antikoru, saptama biyotinlenmis antikor, streptavidin-HRP, lL-1ß standartlari, kullanima hazir TMB. Asagidaki yöntem, her bir kit ile tedarik edilen talimatlara dayalidir.
Nunc-Immüno Plakalar Maxisorb (Nunc, cat# 442404).
Nunc mikrogöz yuvarlak tabanli 96 gözlü doku kültür plakasi (Nunc, cat# 163320) BSA (Sigma, cat# A3059) Trypan mavisi (Sigma cat# T8154) E.c0li Rekombinant murin IL-13 (Peprotech, cat# 210-13), murin IL-13-TCR füzyon reaktifleri test edildiginde standart kullanilir.
Monosi't izolasyonu PBMC'Ier beyaz kan hücrelerinden izole edilmistir: bir beyaz kan hücresi HBSS (Ca2+ ve Mg2+ serbest) ile 2'ye 1 oraninda seyreltilmistir, seyreltik kan Ienfoprep (15ml 800 x g'da (oda sicakligi) 15 dakika santrifüjlenmistir; arayüzdeki hücreler uzaklastirilmistir ve HBSS ile dört kez yikanmistir ve 1200 rpm'de 10 dakika santrifüjlenmistir. Nihai yikamadan sonra, hücreler 50ml deney ortaminda süspanse edilmistir, sayilmistir ve Tripan mavisi solüsyonu kullanilarak canlilik tayin edilmistir.
Dynal Dynabeads MyPure Monosit Kit 2 monositleri izole etmek üzere kullanilmistir.
PBMC, 107 hücre basina 100 ul tampon içinde PES/%01 BSA içine geri süspanse edilmistir ve 107 hücre basina 20ul Antikor Karisimi eklenmistir ve hücreler 4°C”de 20 dakika inkübe edilmistir. Hücreler, yikanmistir ve 107 hücre basina 0.9ml PES/%01 BSA içinde yeniden süspanse edilmistir. Önceden yikanan boncuklar (107 hücre basina 100 ul) eklenmistir, karistirilmistir ve 20°C'de 15 dakika daha hafifçe rotasyon ile inkübe edilmistir. Rozetler, dikkatli pipetlenme ile yeniden süspanse edilmistir ve 107 hücre basina 1 ml PES/%01 BSA eklenmistir. Tüp, 2 dakika Dynal magnet içine koyulmustur. Negatif olarak izole hücreleri içeren süpernatant yeni bir tüpe aktarilmistir ve sayilmistir. Hücreler hemen kullanilmistir veya ileriki kullanima yönelik olarak %90 FCS/%1O DMSO içinde dondurulmustur.
Hücre deneyi hazirlanisi ELISA plakasi, PBS içinde 100ul/göz IL-1ß yakalama antikoru ile kaplanmistir ve 4°Cide bir gece birakilmistir. Monositler çözdürülmüstür, deney ortaminda iki kez yikanmistir ve 5 x 105 hücreler/ml'de yeniden süspanse edilmistir. Monositler, bir yuvarlak tabanli 96 gözlü plakanin içine (göz basina 100uI, diger bir deyisle göz basina x 104) kaplanmistir. LPS, Peprotech rekombinant sitokin ve test sitokin-TCR füzyon proteinleri, 4X nihai konsantrasyonu vermek üzere deney ortamina seyreltme ile hazirlanmistir. LPS, her bir göze (long/ml son) akabinde, Peprotech rekombinant lL-13 edilmis konsantrasyonlari (10 seri seyreltmede 1'e 6 oraninda) üç kopya gözlere eklenmistir. Plakalar, 37°C'de, %5 COZ'de bir gece inkübe edilmistir.
Antikor kapli IL-1ß ELISA plaka, yikama tamponu içinde üç kez yikanmistir ve oda sicakliginda en az 2 saat (veya 4°C'de bir gece) 250ul PES/%5 BSA/göz ile bloke edilmistir. ELISA plakasi yikama tamponu içinde üç kez yikanmistir ve kuruyana kadar çalkalanmistir. IL-1ß standartlari PBS/%1BSA içinde seyreltilmistir. Hücreleri içeren plaka 5 dakika 1200rpm'de santrifüjlenmistir. Her bir gözden süpernatant akabinde, önceden kaplanan IL-1i3 ELISA plakasina aktarilmistir. 100ul hücre süpernatanti (PES/%1 BSA ile 3'e 1 oraninda seyreltilen) veya standart, ilgili gözlere eklenmistir ve 50ul saptama antikoru/göz (kit talimatlarina göre seyreltme) eklenmistir. Plaka oda sicakliginda 2 saat inkübe edilmistir. Plakalar, yikama tamponu içinde üç kez yikanmistir. Göz basina (kit talimatlarina göre seyreltme) 100ul streptavidin-HRP eklenmistir ve plakalar oda sicakliginda 20 dakika inkübe edilmistir. Plaklar, yikama tamponu içinde üç kez yikanmistir. Göz basina 100u| kullanima hazir TMB eklenmistir ve plakalar 5 - 20 dakika karanlikta (folyo altinda) gelismeye (sinyal gücüne bagli olarak) birakilmistir. Reaksiyon, 100pI/göz 1 M H2804 eklenerek durdurulmustur.
Plakalarin abzorbanslari, 450 nm'de bir mikroplaka okuyucusu üzerinde okunmustur ve bir referans filtresi 650 nm'ye ayarlanmistir. Her bir titrasyon onoktasina yönelik inhibisyon miktari, maksimum sinyal veren böylelikle bir doz cevap egrisini olusturan sitokin - TCR füzyon proteini olmadan monosit ve LPS içeren örnegin bir yüzdesi olarak hesaplanir.
Sonuçlar Test Yapisi E050 E050 6.21e-10 C-terminal füzyon 1 .493e-10 N-terminal füzyon Sonuçlar, Sekil 14'ün N-füzyonlu yapisinin, bunun, insan monositleri ile IL-1ß üretimini inhibe etme yeteneginde Sekil 15'in C-füzyonlu yapisindan en az 2 kat daha kuvvetli oldugunu gösterir.

Claims (1)

  1. ISTEMLER . Belirli bir pMHC epitopuna yönelik spesifik bir polipeptid baglayici partner ve bir immün efektör polipeptidi içeren bir iki islevli molekül olup, pMHC baglayici partnerin N-terminusu, söz konusu polipeptid baglayici partnerin, alfa zinciri SEQ ID No: 7 ve beta zinciri SEQ ID No: 9'u içeren bir T-hücre reseptörü olmamasi SARTl ILE immün efektör polipeptidin C- terminusuna baglanabilir ve özelligi immün efektör polipeptid bir sitokin olmasidir. . Istem 1'de tanimlandigi üzere bir iki islevli molekül olup, özelligi pMHC baglayici partnerin, bir heterodimerik oiß TCR polipeptid çifti veya tek zincirli bir dß TCR polipeptit olmasidir ve heterodimerik TCR polipeptid çiftinin Ol veya [3 zincirinin N-terminusu veya scTCR polipeptidinin N-terminusunun, immün efektör polipeptidin bir C-terminal amino asidine bagli olmasidir. Istem 2'de tanimlanan bir iki islevli molekül olup, özelligi pMHC baglayici partnerin, 0( ve [3 polipeptidlerin her birinin TCR degisken ve sürekli bölgelere sahip oldugu ancak TCR transmembran ve sitoplazmik bölgelerden yoksun oldugu bir heterodimerik oiß TCR polipeptid çifti olmasidir. . Istem 3`te tanimlanan bir iki islevli molekül olup, özelligi 0( ve B polipeptitlerinin sürekli bölgelerinin, TRAC1'in ekson 1'inin Thr 48'ine ve TRBC1 veya TRBC2'nin ekson 1'inin Ser 57'sine yönelik sübstitüe edilen sistein kalintilarinin arasindaki bir disülfid bagi veya TRACi'in ekson 2'sinin Cys4'ü ve TRBC1 veya TRBCZ'nin ekson 2'sinin Cys2'si arasindaki bir dogal disülfid bagi ile baglanmasidir. . Istem 17de tanimlanan bir iki islevli molekül olup, özelligi pMHC baglayici partnerin, bir tek zincirli oiß TCR polipeptid olmasidir. . Önceki herhangi bir istemde tanimlandigi üzere bir iki islevli molekül olup, özelligi immün efektör polipeptidin IL-1, lL-1a, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, lL-7, IL-10, 7. Önceki herhangi bir istemde tanimlandigi üzere bir iki islevli molekül olup, özelligi polipeptid baglanma partneri ve immün efektör polipeptidin dogrudan baglanmasidir. 8. Istemler 1 ila 6'dan herhangi birinde tanimlandigi üzere bir iki islevli molekül olup, özelligi polipeptid baglanma partneri ve immün efektör polipeptidin bir baglayici dizi vasitasiyla dolayli olarak baglanmasidir. 9. Istem 8'de tanimlandigi üzere bir iki islevli molekül olup, özelligi baglayici dizinin uzunluk bakimindan 12'den az, 10'dan az veya 5-10 amino asit uzunlugunda olmasidir.
TR2018/09945T 2009-05-20 2010-05-19 İki işlevli polipeptidler. TR201809945T4 (tr)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GBGB0908613.3A GB0908613D0 (en) 2009-05-20 2009-05-20 T Cell Reseptors

Publications (1)

Publication Number Publication Date
TR201809945T4 true TR201809945T4 (tr) 2018-08-27

Family

ID=40834242

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TR2018/09945T TR201809945T4 (tr) 2009-05-20 2010-05-19 İki işlevli polipeptidler.
TR2019/05437T TR201905437T4 (tr) 2009-05-20 2010-05-19 İki işlevli polipeptidler.

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TR2019/05437T TR201905437T4 (tr) 2009-05-20 2010-05-19 İki işlevli polipeptidler.

Country Status (21)

Country Link
US (6) US10130721B2 (tr)
EP (3) EP2432802B1 (tr)
JP (4) JP5667171B2 (tr)
CN (1) CN102439034B (tr)
AU (1) AU2010250951B2 (tr)
BR (1) BRPI1013029A2 (tr)
CA (2) CA2968393C (tr)
CY (3) CY1118405T1 (tr)
DK (3) DK3112377T3 (tr)
EA (1) EA020841B1 (tr)
ES (3) ES2608653T3 (tr)
GB (1) GB0908613D0 (tr)
HR (3) HRP20170086T1 (tr)
HU (3) HUE032929T2 (tr)
LT (3) LT2432802T (tr)
MX (1) MX340168B (tr)
PL (3) PL2432802T3 (tr)
PT (3) PT2432802T (tr)
SI (3) SI3112376T1 (tr)
TR (2) TR201809945T4 (tr)
WO (1) WO2010133828A1 (tr)

Families Citing this family (92)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB0908613D0 (en) 2009-05-20 2009-06-24 Immunocore Ltd T Cell Reseptors
WO2012099886A1 (en) 2011-01-18 2012-07-26 Bioniz, Llc Compositions and mehthods for modulating gamma-c-cytokine activity
CA2848209C (en) * 2011-09-15 2021-06-01 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services T cell receptors recognizing hla-a1- or hla-cw7-restricted mage
EP2760892A1 (en) * 2011-09-29 2014-08-06 Apo-T B.V. Multi-specific binding molecules targeting aberrant cells
US20130273089A1 (en) 2011-11-03 2013-10-17 Tolera Therapeutics, Inc. Antibody and methods for selective inhibition of t-cell responses
MX2014005358A (es) 2011-11-03 2014-09-12 Tolera Therapeutics Inc Anticuerpo y metodos para la inhibicion selectiva de respuestas mediadas por celulas t.
US20130183307A1 (en) 2012-01-13 2013-07-18 Johan Renes Aberrant cell-restricted immunoglobulins provided with a toxic moiety
GB201223172D0 (en) 2012-12-21 2013-02-06 Immunocore Ltd Method
GB201313377D0 (en) * 2013-07-26 2013-09-11 Adaptimmune Ltd T cell receptors
US9959384B2 (en) 2013-12-10 2018-05-01 Bioniz, Llc Methods of developing selective peptide antagonists
BR112016021004A2 (pt) 2014-03-14 2018-01-23 Immunocore Limited biblioteca de partículas; receptor de células t (tcr) isolado não natural; uso de uma biblioteca; método de obtenção de um receptor de células t que se liga especificamente a um antígeno de peptídeo; ácido nucleico; método de construção de uma biblioteca de partículas; método de obtenção de um receptor de células t que se liga especificamente a um antígeno de peptídeo; e partícula
CA2955984A1 (en) 2014-07-22 2016-01-28 The University Of Notre Dame Du Lac Molecular constructs and uses thereof
EP3216801B1 (en) 2014-11-07 2020-01-01 Guangdong Xiangxue Life Sciences, Ltd. Soluble heterodimeric t cell receptor, and preparation method and use thereof
GB201516274D0 (en) 2015-09-15 2015-10-28 Adaptimmune Ltd And Immunocore Ltd TCR Libraries
GB201516265D0 (en) 2015-09-15 2015-10-28 Adaptimmune Ltd And Immunocore Ltd TCR Libraries
GB201516275D0 (en) 2015-09-15 2015-10-28 Adaptimmune Ltd And Immunocore Ltd TCR Libraries
GB201516272D0 (en) 2015-09-15 2015-10-28 Adaptimmune Ltd And Immunocore Ltd TCR Libraries
GB201516270D0 (en) 2015-09-15 2015-10-28 Adaptimmune Ltd And Immunocore Ltd TCR Libraries
GB201516269D0 (en) 2015-09-15 2015-10-28 Adaptimmune Ltd And Immunocore Ltd TCR Libraries
GB201516277D0 (en) 2015-09-15 2015-10-28 Adaptimmune Ltd And Immunocore Ltd TCR libraries
AU2016334085B2 (en) 2015-10-09 2019-11-21 Bioniz Therapeutics, Inc. Modulating gamma - c -cytokine activity
GB201520559D0 (en) 2015-11-23 2016-01-06 Immunocore Ltd & Adaptimmune Ltd Peptides
GB201520550D0 (en) 2015-11-23 2016-01-06 Immunocore Ltd & Adaptimmune Ltd Peptides
GB201520589D0 (en) 2015-11-23 2016-01-06 Immunocore Ltd & Adaptimmune Ltd Peptides
GB201520544D0 (en) 2015-11-23 2016-01-06 Immunocore Ltd & Adaptimmune Ltd Peptides
GB201520546D0 (en) 2015-11-23 2016-01-06 Immunocore Ltd & Adaptimmune Ltd Peptides
GB201520536D0 (en) 2015-11-23 2016-01-06 Immunocore Ltd & Adaptimmune Ltd Peptides
GB201520539D0 (en) 2015-11-23 2016-01-06 Immunocore Ltd & Adaptimmune Ltd Peptides
GB201607534D0 (en) 2016-04-29 2016-06-15 Immunocore Ltd & Adaptimmune Ltd Peptides
GB201520557D0 (en) 2015-11-23 2016-01-06 Immunocore Ltd & Adaptimmune Ltd Peptides
GB201520563D0 (en) 2015-11-23 2016-01-06 Immunocore Ltd & Adaptimmune Ltd Peptides
GB201520558D0 (en) 2015-11-23 2016-01-06 Immunocore Ltd & Adaptimmune Ltd Peptides
WO2017089786A1 (en) 2015-11-23 2017-06-01 Immunocore Limited Peptides
GB201520564D0 (en) 2015-11-23 2016-01-06 Immunocore Ltd & Adaptimmune Ltd Peptides
GB201520597D0 (en) 2015-11-23 2016-01-06 Immunocore Ltd & Adaptimmune Ltd Peptides
GB201520570D0 (en) 2015-11-23 2016-01-06 Immunocore Ltd & Adaptimmune Ltd Peptides
GB201520545D0 (en) 2015-11-23 2016-01-06 Immunocore Ltd & Adaptimmune Ltd Peptides
GB201520592D0 (en) 2015-11-23 2016-01-06 Immunocore Ltd & Adaptimmune Ltd Peptides
GB201520567D0 (en) 2015-11-23 2016-01-06 Immunocore Ltd & Adaptimmune Ltd Peptides
GB201520595D0 (en) 2015-11-23 2016-01-06 Immunocore Ltd & Adaptimmune Ltd Peptides
GB201520568D0 (en) 2015-11-23 2016-01-06 Immunocore Ltd Peptides
GB201520583D0 (en) 2015-11-23 2016-01-06 Immunocore Ltd & Adaptimmune Ltd Peptides
GB201604468D0 (en) 2016-03-16 2016-04-27 Immunocore Ltd & Adaptimmune Ltd Peptides
GB201607535D0 (en) 2016-04-29 2016-06-15 Immunocore Ltd & Adaptimmune Ltd Peptides
GB201520542D0 (en) 2015-11-23 2016-01-06 Immunocore Ltd & Adaptimmune Ltd Peptides
GB201520541D0 (en) 2015-11-23 2016-01-06 Immunocore Ltd & Adaptimmune Ltd Peptides
GB201520566D0 (en) 2015-11-23 2016-01-06 Immunocore Ltd & Adaptimmune Ltd Peptides
GB201520575D0 (en) 2015-11-23 2016-01-06 Immunocore Ltd & Adaptimmune Ltd Peptides
GB201520543D0 (en) 2015-11-23 2016-01-06 Immunocore Ltd & Adaptimmune Ltd Peptides
GB201520562D0 (en) 2015-11-23 2016-01-06 Immunocore Ltd & Adaptimmune Ltd Peptides
GB201520548D0 (en) 2015-11-23 2016-01-06 Immunocore Ltd & Adaptimmune Ltd Peptides
GB201520565D0 (en) 2015-11-23 2016-01-06 Immunocore Ltd & Adaptimmune Ltd Peptides
GB201520579D0 (en) 2015-11-23 2016-01-06 Immunocore Ltd & Adaptimmune Ltd Peptides
GB201520603D0 (en) 2015-11-23 2016-01-06 Immunocore Ltd & Adaptimmune Ltd Peptides
GB201522592D0 (en) * 2015-12-22 2016-02-03 Immunocore Ltd T cell receptors
PL3430037T3 (pl) * 2016-03-16 2022-12-19 Immatics Biotechnologies Gmbh Transfekowane komórki t oraz receptory komórek t do stosowania w immunoterapii przeciwnowotworowej
GB201604953D0 (en) 2016-03-23 2016-05-04 Immunocore Ltd T cell receptors
KR102473964B1 (ko) 2016-04-08 2022-12-06 이뮤노코어 리미티드 T 세포 수용체
WO2017192536A1 (en) 2016-05-02 2017-11-09 University Of Kansas Eliminating mhc restriction from the t cell receptor as a strategy for immunotherapy
CA3025894A1 (en) 2016-06-02 2017-12-07 Immunocore Limited Dosing regimen for gp100-specific tcr - anti-cd3 scfv fusion protein
WO2018081784A1 (en) * 2016-10-31 2018-05-03 H. Lee Moffitt Cancer Center And Research Institute, Inc. Artificial antigen presenting cells for expanding immune cells for immunotherapy
US20210115099A1 (en) 2016-11-07 2021-04-22 Immunocore Limited Peptides
CN108203459A (zh) * 2016-12-19 2018-06-26 广东香雪精准医疗技术有限公司 源自于prame的肿瘤抗原短肽
GB201709866D0 (en) 2017-06-20 2017-08-02 Immunocore Ltd T cell receptors
US20210363216A1 (en) 2018-05-14 2021-11-25 Immunocore Limited Bifunctional binding polypeptides
GB201815041D0 (en) 2018-09-14 2018-10-31 Scancell Ltd Epitopes
AU2020208110A1 (en) * 2019-01-14 2021-07-15 Nanjing Legend Biotech Co., Ltd. Chimeric receptor polypeptides and uses thereof
HRP20240176T1 (hr) 2019-01-17 2024-04-12 Immunocore Limited Formulacije
GB201901305D0 (en) 2019-01-30 2019-03-20 Immunocore Ltd Specific binding molecules
GB201901306D0 (en) 2019-01-30 2019-03-20 Immunocore Ltd Multi-domain binding molecules
EP3921443A1 (en) 2019-02-08 2021-12-15 F. Hoffmann-La Roche AG Diagnostic and therapeutic methods for cancer
GB201902277D0 (en) 2019-02-19 2019-04-03 King S College London Therapeutic agents
CN113811549A (zh) 2019-02-21 2021-12-17 Xencor股份有限公司 非靶向和靶向性il-10 fc融合蛋白
WO2020188348A2 (en) 2019-03-18 2020-09-24 Ludwig Institute For Cancer Research Ltd A2/ny-eso-1 specific t cell receptors and uses thereof
GB201904328D0 (en) 2019-03-28 2019-05-15 Immunocore Ltd Specific binding molecules
GB201915282D0 (en) 2019-10-22 2019-12-04 Immunocore Ltd Specific binding molecules
GB202005779D0 (en) 2020-04-21 2020-06-03 Scancell Ltd Anti-tumour immune responses
GB202006629D0 (en) 2020-05-05 2020-06-17 Immunocore Ltd Specific binding molecules
GB202010329D0 (en) 2020-07-06 2020-08-19 Immunocore Ltd Specific binding molecules
EP4196612A1 (en) 2020-08-12 2023-06-21 Genentech, Inc. Diagnostic and therapeutic methods for cancer
WO2022184805A1 (en) 2021-03-03 2022-09-09 Immatics Biotechnologies Gmbh Antigen binding proteins specifically binding sars-cov-2 antigenic peptides in complex with a major histocompatibility complex protein
EP4113120A1 (en) 2021-06-28 2023-01-04 Immatics Biotechnologies GmbH Method of characterizing the binding characteristics between a peptide of interest and mhc molecules
US20230024554A1 (en) 2021-06-28 2023-01-26 Immatics Biotechnologies Gmbh Method of characterizing the binding characteristics between a peptide of interest and mhc molecules
WO2023288203A2 (en) 2021-07-12 2023-01-19 Ludwig Institute For Cancer Research Ltd T cell receptors specific for tumor-associated antigens and methods of use thereof
CN117964777A (zh) * 2021-08-26 2024-05-03 瑅安生物医药（杭州）有限公司 一种接近天然分子的多肽融合分子
EP4198052A1 (en) 2021-12-15 2023-06-21 Eberhard Karls Universität Tübingen Medizinische Fakultät Peptides and antigen binding proteins for use in immunotherapy against fibrolamellar hepatocellular carcinoma (fl-hcc) and other cancers
WO2023156663A1 (en) 2022-02-20 2023-08-24 Immunocore Limited Hiv-specific binding molecules and tcr
WO2024038193A1 (en) 2022-08-18 2024-02-22 Immunocore Limited Multi-domain binding molecules
WO2024038183A1 (en) 2022-08-18 2024-02-22 Immunocore Limited Multi-domain binding molecules
WO2024038198A1 (en) 2022-08-18 2024-02-22 Immunocore Limited Multi-domain binding molecules
WO2024067821A1 (zh) * 2022-09-30 2024-04-04 瑅安生物医药（杭州）有限公司 一种修饰细胞及其用途
WO2024130179A1 (en) 2022-12-16 2024-06-20 Repertoire Immune Medicines, Inc. T cell receptors binding hpv-16 epitopes

Family Cites Families (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1400536A1 (en) * 1991-06-14 2004-03-24 Genentech Inc. Method for making humanized antibodies
IL139344A0 (en) * 1998-05-19 2001-11-25 Avidex Ltd Soluble t cell receptor
US6534633B1 (en) * 1998-10-21 2003-03-18 Altor Bioscience Corporation Polyspecific binding molecules and uses thereof
JP2004501364A (ja) 2000-05-25 2004-01-15 スノル・モレキュラー・コーポレーション Ｔ−細胞レセプター相互作用のモジュレーション
CN1464790A (zh) * 2000-06-05 2003-12-31 苏诺尔分子公司 T细胞受体融合物及共轭物以及其使用方法
US20030017134A1 (en) * 2001-06-19 2003-01-23 Technion Research And Development Foundation Ltd. Methods and pharmaceutical compositions for immune deception, particularly useful in the treatment of cancer
DE60203125T2 (de) * 2001-08-31 2006-04-06 Avidex Ltd., Abingdon Löslicher t zell rezeptor
WO2003070752A2 (en) 2002-02-20 2003-08-28 Dyax Corporation Mhc-peptide complex binding ligands
NZ539225A (en) 2002-10-09 2006-09-29 Avidex Ltd Single chain recombinant T cell receptors
GB0304068D0 (en) * 2003-02-22 2003-03-26 Avidex Ltd Substances
EP1765860B1 (en) 2004-05-19 2008-12-10 MediGene Ltd. High affinity ny-eso t cell receptor
US20090042285A1 (en) 2004-05-27 2009-02-12 Weidanz Jon A Antibodies at T cell receptor mimics, methods of production and uses thereof
EP1773383B1 (en) * 2004-05-27 2012-09-12 Jon A. Weidanz Antibodies as t cell receptor mimics, methods of production and uses thereof
US20100062001A1 (en) 2004-06-09 2010-03-11 Technion Research & Development Antibodies for selective apoptosis of cells
JP2008514685A (ja) 2004-10-01 2008-05-08 メディジーン リミテッド 治療剤に連結した、非天然型ジスルフィド鎖間結合を含有するｔ細胞レセプター
PL1976880T3 (pl) * 2005-12-21 2017-01-31 Amgen Research (Munich) Gmbh Kompozycje farmaceutyczne odporne na rozpuszczalny cea
MX2008008046A (es) * 2005-12-21 2009-03-04 Micromet Ag Moleculas de epha2-bite y usos de las mismas.
GB0708585D0 (en) 2007-05-03 2007-06-13 Queen Mary & Westfield College Novel antibody and use in diagnosis and therapy of arthropathies
GB0816096D0 (en) 2008-09-04 2008-10-15 Medigene Ltd Diabetes t cell receptors
GB0908613D0 (en) 2009-05-20 2009-06-24 Immunocore Ltd T Cell Reseptors
GB0911566D0 (en) * 2009-07-03 2009-08-12 Immunocore Ltd T cell receptors

Also Published As

Publication number Publication date
ES2721058T3 (es) 2019-07-26
PL3112377T3 (pl) 2018-10-31
EP2432802B1 (en) 2016-11-02
AU2010250951B2 (en) 2015-04-30
EP2432802A1 (en) 2012-03-28
HUE032929T2 (hu) 2017-11-28
CA2762604A1 (en) 2010-11-25
CA2968393A1 (en) 2010-11-25
US20190231896A1 (en) 2019-08-01
US10517960B2 (en) 2019-12-31
EP3112377B1 (en) 2018-04-18
DK3112376T3 (en) 2019-04-29
US20120190828A1 (en) 2012-07-26
WO2010133828A1 (en) 2010-11-25
US10130721B2 (en) 2018-11-20
JP5667171B2 (ja) 2015-02-12
EP3112376A3 (en) 2017-03-29
EA020841B1 (ru) 2015-02-27
PT2432802T (pt) 2017-02-13
DK2432802T3 (en) 2017-02-13
EP3112376A2 (en) 2017-01-04
US10576162B2 (en) 2020-03-03
BRPI1013029A2 (pt) 2016-04-05
DK3112377T3 (en) 2018-07-30
LT3112376T (lt) 2019-05-10
CA2762604C (en) 2018-01-16
JP2017110019A (ja) 2017-06-22
SI3112376T1 (sl) 2019-08-30
CY1121558T1 (el) 2020-05-29
CN102439034B (zh) 2015-01-28
EA201101660A8 (ru) 2014-09-30
US20190275165A1 (en) 2019-09-12
ES2608653T3 (es) 2017-04-12
EA201101660A1 (ru) 2012-05-30
AU2010250951A1 (en) 2011-12-08
PL2432802T3 (pl) 2017-07-31
US20230241238A1 (en) 2023-08-03
US20190231895A1 (en) 2019-08-01
LT2432802T (lt) 2017-01-10
HUE038342T2 (hu) 2018-10-29
JP2012527439A (ja) 2012-11-08
GB0908613D0 (en) 2009-06-24
HUE043245T2 (hu) 2019-08-28
EP3112376B1 (en) 2019-01-23
CY1120439T1 (el) 2019-07-10
HRP20190674T1 (hr) 2019-08-09
TR201905437T4 (tr) 2019-05-21
JP2019172678A (ja) 2019-10-10
US20190247512A1 (en) 2019-08-15
CN102439034A (zh) 2012-05-02
MX340168B (es) 2016-06-29
EP3112377A1 (en) 2017-01-04
PT3112376T (pt) 2019-05-20
JP2015096527A (ja) 2015-05-21
CA2968393C (en) 2019-07-23
SI3112377T1 (en) 2018-06-29
PT3112377T (pt) 2018-07-13
CY1118405T1 (el) 2017-06-28
PL3112376T3 (pl) 2019-07-31
SI2432802T1 (sl) 2017-01-31
MX2011012184A (es) 2012-03-26
HRP20180757T1 (hr) 2018-07-27
US10420846B2 (en) 2019-09-24
LT3112377T (lt) 2018-05-25
ES2672095T3 (es) 2018-06-12
HRP20170086T1 (hr) 2017-06-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US10576162B2 (en) Bifunctional polypeptides
JP7452880B2 (ja) Ｓｓｘ２抗原を識別するｔ細胞受容体
CN106478809B (zh) 识别prame抗原短肽的tcr
CA2963332A1 (en) T cell receptors
CA2920444A1 (en) T cell receptors
NZ541596A (en) Modified soluble T Cell receptor
WO2021016887A1 (zh) 识别ssx2抗原短肽的t细胞受体
WO2021170117A1 (zh) 一种识别afp抗原短肽的t细胞受体及其编码序列
WO2021170116A1 (zh) 一种识别afp的t细胞受体
WO2021139699A1 (zh) 一种识别afp的t细胞受体及其编码序列
WO2022262835A1 (zh) 一种识别afp抗原的tcr及其编码序列
WO2021035446A1 (zh) 一种识别afp抗原短肽的t细胞受体及其编码序列