EA020841B1 - Бифункциональные полипептиды - Google Patents

Бифункциональные полипептиды Download PDF

Info

Publication number
EA020841B1
EA020841B1 EA201101660A EA201101660A EA020841B1 EA 020841 B1 EA020841 B1 EA 020841B1 EA 201101660 A EA201101660 A EA 201101660A EA 201101660 A EA201101660 A EA 201101660A EA 020841 B1 EA020841 B1 EA 020841B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
tsc
polypeptide
antibody
bifunctional molecule
chain
Prior art date
Application number
EA201101660A
Other languages
English (en)
Other versions
EA201101660A8 (ru
EA201101660A1 (ru
Inventor
Бент Карстен Якобсен
Аннелис Бриджит Вьюдепо
Йи Ли
Original Assignee
Иммунокор Лтд.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=40834242&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=EA020841(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Иммунокор Лтд. filed Critical Иммунокор Лтд.
Publication of EA201101660A1 publication Critical patent/EA201101660A1/ru
Publication of EA201101660A8 publication Critical patent/EA201101660A8/ru
Publication of EA020841B1 publication Critical patent/EA020841B1/ru

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6849—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a receptor, a cell surface antigen or a cell surface determinant
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A61K39/001136—Cytokines
    • A61K39/00114—Interleukins [IL]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/6425—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent the peptide or protein in the drug conjugate being a receptor, e.g. CD4, a cell surface antigen, i.e. not a peptide ligand targeting the antigen, or a cell surface determinant, i.e. a part of the surface of a cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/7051—T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2809—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against the T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/33—Fusion polypeptide fusions for targeting to specific cell types, e.g. tissue specific targeting, targeting of a bacterial subspecies

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Nitrogen Condensed Heterocyclic Rings (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

Бифункциональный полипептид, содержащий специфический партнер связывания для элитопа пептида-МНС, такой как антитело или Т клеточный рецептор (TCR), и иммунный эффектор, такой как антитело или цитокин, при этом имунноэффекторная часть слита с N-концом связывающейся части пептида-МНС.

Description

Изобретение относится к бифункциональному полипептиду, содержащему специфический партнер связывания для эпитопа пептида-МНС, такой как антитело или Т клеточный рецептор (ТСК), и иммунный эффектор, такой как антитело или цитокин, иммунноэффекторная часть которых связывается с Νконцом пептид-МНС связывающей части.
Уровень техники
ТСКк непосредственно распознают Специфический Главный Комплекс Гистосовместимости (МНС) - пептидные комплексы (рМНС комплексы), которые представлены в виде эпитопов на антигенпрезентирующих клетках (АРС), и ТСК непосредственно распознают подобные эпитопы рМНС Т клеток. В связи с этим, ТСК необходимы для функционирования клеточного звена иммунной системы.
Также известно, что антитела специфически связываются с эпитопами рМНС, представленных на антиген-презентирующих клетках (см., например: №е!Ыш§ Р.А. с1 а1., Уаееше (2008) 26 (25): 3092-102). Существуют антиген-связывающие фрагментные антитела (РаЬ) (см., например: Сйатек Р. е1 а1., Ргос №й1Асаб 8с1 И8А (2000) 97 (14): 7969-74; ^Шеткеи КА. е! а1., 1 1ттипо1 (2005) 174 (12): 7853-8; №Шеткеи К. е! а1., Су!оте!гу А (2008) 73 (11): 1093-9) или одноцепочечные фрагменты антител (ксРу) (см., например: ЭеикЬегд С. е! а1., 1 1ттиио1 (2003) 171 (5): 2197-207; Магде! М. е! а1., Мо1 1ттиио1 (2005) 42 (5): 643-9), которые специфически связывают элитопы рМНС.
Нативные ТСК - это гетеродимерные поверхностные клеточные белки суперсемейства иммунноглобулинов, которые ассоциированы с инвариантными белками комплекса СЭ3. учавствующих в опосредованной сигнальной трансдукции. ТСК могут быть в αβ и γδ формах, которые структурно похожи, но имеют совершенно разные анатомические локализации и, возможно, функции. Лиганды МНС I и II классов также представляют собой белки суперсемейства иммуноглобулинов, но они специализированы для презентации антигена с высокополиморфным сайтом связывания пептидов, который дает им возможность представлять разнообразную матрицу коротких пептидных фрагментов на поверхности антигенпрезентирующей клетки (АРС).
Внеклеточная часть нативных гетеродимерных αβ ТСК состоит из двух полипептидов (α и β цепей), каждая из которых имеет мембранно-проксимальный константный домен и мембранно-дистальный вариабельный домен. Каждый константный и вариабельный домены включают внутрицепочечные дисульфидные связи. Вариабельные домены содержат высоко полиморфные петли соответствующие гипервариабельному участку (СОК) антител. СОК3 αβ ТСК взаимодействует с пептидом, представленным МНС, а 1 и 2 СИК αβ ТСК взаимодействуют с пептидом и с МНС. Разнообразие последовательностей ТСК образуется через соматическую перестройку взаимосвязанных вариабельных (V), разнообразных (Ό), соединенных (I) и постоянных генов (С).
Функциональная α цепь полипептидов формируется путем перестройки ν-Ι-С областей, в то время как β цепи состоят из ν-Ό-Ι-С областей. Внеклеточный константный домен имеет мембранную проксимальную область и иммуноглобулиновую область. При этом одна α цепь константного домена известна как ТКАС. β цепь константного домена состоит из двух различных β константных доменов, известных как ТКВС1 и ТКВС2 (1МСТ номенклатура). Встречается четыре аминокислотных замены между этими β константными доменами. Эти замены все находятся внутри экзона 1 ТКВС1 и ТКВС2: Ν4Κ5 -> Κ4Ν5 и Р37 -> Υ (1МСТ нумерация, различие ТКВС1 -> ТКВС2), конечная аминокислотная замена между двумя β цепями константной области ТСК находятся в экзоне 3 ТКВС1 и ТКВС2: VI -> Е.
Многие конструкции были изобретены на сегодняшний день для производства рекомбинантных ТСК. Эти конструкции делятся на два больших класса: одноцепочечные ТСК и димерные ТСК. Одноцепочечные ТСК (ксТСКк) являются искусственными конструкциями, состоящими из одной аминокислотной нити, которая, подобно нативному гетеродимерному ТСК, связывается с МНС-пептидным комплексом. ксТСКк может состоять из комбинации α и β вариабельных областей ТСК (να и νβ, соответственно) и α и β константных областей ТСК (Τ'α и Сβ, соответственно), связанных линкерной последовательностью (Ь) в нескольких возможных ориентациях, например, но не ограничиваясь этим, следующих να-Κνβ, νβ-Κνα, \ α-(α-Ι.-νβ или νβΥβ-Ι.Λ α.
Многие статьи описывают получение гетеродимерных ТСК, которые включают нативный дисульфидный мостик, соединяющий соответствующие субъединицы. Однако хотя такие ТСК могут распознаваться ТСК-специфичными антителами, было показано, что ни одно из них не распознает его нативный лиганд в какой либо мере, за исключением относительно высоких концентраций и/или были нестабильны.
В \νϋ 03/020763 описан растворимый ТСК с правильной укладкой, так что он обладает способностью распознавать его нативный лиганд, является стабильным на протяжении периода времени и может быть получен в разумных количествах. Эти ТСК состоят из внеклеточного домена α цепи димеризованного ТСК к внеклеточному домену β цепи ТСК соответственно, посредством межцепочечной дисульфидной связи между цистеинами, введенными в константные области соотвествующих цепей.
Специфический рМНС партнер связывания, то есть антитела специфические для эпитопов рМНС, и оба типа гетеродимерного и одноцепочечного ТСКк были предложены в качестве направленности векторов для доставки терапевтического средства к антиген-презентирующим клеткам. С этой целью терапев- 1 020841 тический агент должен быть связан с рМНС-партнером связывания каким-либо образом. Терапевтические агенты, которые были предложены для такой направленной доставки, совместно с рМНСпартнерами связывания, включают антитела (см., например: Моксщега Ь.Л. с1 а1., 1 1ттипо1 (2005) 174 (7): 4381-8), су!октек (см., например: Ве1топ! Н.Т е! а1., С1ш 1ттипо1 (2006) 121 (1): 29-39; \Усп 1. е! а1., Сапсег 1ттипо1 1ттнпо1Ьег (2008) 57 (12): 1781-94), и цитотоксические агенты. В случае, если терапевтическим агентом представляет собой полипептид, способом связывания с рМНС-партнером связывания может быть пептидное слияние, либо прямое слияние или слияние посредством линкерной последовательности к рМНС партнеру связывания. В тех случаях существует в основном только две возможности слияния. Относительно одноцепочечных антител или ТСКк, слияние возможно в основном С- или Νконцом цепи ТСК; относительно гетеродимерных антител или ТСКк, слияние возможно в основном Сили Ν-концом любой цепи. На практике, тем не менее, получается из всех известных примеров рМНС партнер связывания - терапевтический агент слияний, с терапевтическим агентом слияние было Сконцом (см., например Мокднега Ь.Л. е! а1., 1 1ттипо1 (2005) 174 (7): 4381-8; Ве1топ! НТ е! а1., СПп 1ттипо1 (2006) 121 (1): 29-39; \Уеп 1. е! а1., Сапсег 1ттипо1 1ттипо!Ьег (2008) 57 (12): 1781-94). Это потому, что функциональное назначение антител или ТСК, любого из одноцепочечного или гетеродимерного, зависит от правильной укладки и ориентации вариабельной области. Слияние терапевтического средства с Ν-концом рМНС партнера связывания располагает его впереди одной из вариабельных областей, и в данной области существует предположение, что терапевтическое средство, расположенное на Ν-конце будет мешать связыванию антитела или ТСК с комплексом рМНС, тем самым снижая его эффективность связывания.
Сущность изобретения
В отличие от предположения в данной области, в настоящее время обнаружено, что бифункциональные молекулы, в которых иммуноэффекторная часть слита с Ν-концом рМНС-партнером связывания, являются более эффективными в индукции ими релевантного иммунного ответа, чем соответствующая конструкция, в которой слияние осуществляется с С-концом рМНС партнером связывания. Этот усиленный иммунный ответ конструкции Ν-слияния обеспечивается, несмотря на похожую рМНС связывающую способность версий Ν- и С-слияния.
Подробное описание изобретения
Таким образом, в настоящем изобретении предложена бифункциональная молекула, содержащая полипептидный партнер связывания, специфический для данного эпитопа рМНС, и полипептид иммунного эффектора, Ν-конец рМНС партнера связывания связывается с С-концом полипептида иммунного эффектора, при условии, что вышеуказанный полипептидный партнер связывания не является Тклеточным рецептором, содержащим альфа цепь 5>ЕО ГО №:7 и бета цепь 5>ЕО ГО №:9.
Как указано, полипептидный рМНС партнер связывания может быть антителом или ТСК. Таким образом, в одном из вариантов осуществления настоящего изобретения рМНС партнер связывания представляет собой гетеродимерную полипептидную пару αβ ТСК, или одноцепочечный αβ полипептид ТСК, и Ν-конец α или β цепи гетеродимерной полипептидной пары ТСК, или Ν-конец полипептида ксТСК связывается с С-концевой аминокислотой полипептида иммунного эффектора.
Соединение рМНС партнера связывания и полипептида иммунного эффектора может быть прямым или косвенным посредством последовательности линкера. Последовательности линкера обычно легко приспосабливаются, в том отношении, что они состоят из аминокислот, таких как глицин, аланин и серин, которые не имею больших боковых цепей, способных ограничивать пластичность. Применяемую или оптимальную длину последовательности линкера не трудно определить в отношении той или иной конструкции рМНС партнера связывания - иммунного эффектора. Обычно последовательность линкера менее чем примерно 12, как например менее чем 10, или из 5-10 аминокислот в длину.
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения рМНС партнер связывания представляет собой гетеродимерную αβ полипептидную пару ТСК, в которой каждый α и β полипептиды имеет вариабельную и константную области ТСК, но не имеют трансмембранной и цитоплазматической областей ТСК. Часть ТСК в таких случаях являются растворимыми. В особенности предпочтительны бифункциональные молекулы этого типа с ненативными дисульфидными связями между остатками, находящимися в константных областях α и β полипептидов ТСК. В особенности, константные области α и β полипептидов могут быть связаны дисульфидными связями между остатками цистеина, заменяющего ТЬг 48 экзона 1 ТКАС1 и §ет 57 экзона 1 ТКВС1 или ТКВС2, или нативные дисульфидные связи между Сук4 экзона 2 ТКАС*01 и Сук2 экзона 2 ТКВС1 или ТКВС2.
В других вариантах осуществления настоящего изобретения рМНС партнер связывания представляет собой одноцепочечный αβ полипептид ТСК να-Ε-νβ, νβ-Ε-να, να-Όα-Ε-νβ или νβ-Ε'β-Ε-να типов, где να и νβ это вариабельные области α и β ТСК соответственно, Сα и Сβ это константные области а и Р ТСК соответственно, и Ь это последовательность линкера.
Иммунные эффекторные полипептиды известны. Они являются молекулами, которые вызывают или стимулируют иммунный ответ путем прямой или косвенной активации гуморального или клеточного звена иммунной системы, как например активация Т-клеток. Примеры включают: 1Ь-1, ]Ε-1α, 1Ь-3, 1Ь- 2 020841
4, Ш-5, 1Ь-6, Ш-7, 1Ь-10, 1Ь-11, 1Ь-12, 1Ь-13, 1Ь-15, 1Ь-21, 1Ь-23, ТОЕ-β, ΙΡΝ-γ, ΤΝΡα, Анти-СО2 антитело, Анти-СБ3 антитело, Анти-СБ4 антитело, Анти-СБ8 антитело, Анти-СБ44 антитело, Анти-СБ45КА антитело, Анти-СБ45КВ антитело, Анти-СБ45РО антитело, Анти-СБ49а антитело, АНТИ-СБ49В антитело, Анти-СБ49С антитело, Анти-СБ49б антитело, Анти-СБ49е антитело, Анти-СБ49Г антитело, Анти-СБ16 антитело, Анти-СБ28 антитело, Анти-1Ь-2К антитела, вирусные белки и пептиды, и бактериальные белки или пептиды. В случае, если иммунный эффекторный полипептид представляет собой антитело, оно может быть 8сРу антителом, одним из которых является анти-СБ3 8сЕу. Примеры анти-СБ3 антител включают, но не ограничеваются ими, ОКТ3, ИСНТ-1, ВМА031 и 12Ρ6.
Сущность настоящего изобретения иллюстрируется следующими примерами.
Примеры
Пример Ά. Получение растворимого αβ ТСК, имеющего эффекторные полипептиды, сливающиеся с С- или Ν-концами β цепи ТСК.
Ά1. Растворимый ΝΥ-ΕδΟ ТСК с анти-СБ3 антителом как эффекторный полипептид.
Растворимый ΝΥ-ΕδΟ ТСК в этом примере обладает свойством связываться с δΕΕΜ\νΐΤρν пептидом, находящимся на НЬА-А2 молекуле.
δΕΟ ΙΌ Νο: 1 (фиг. 1) представляет собой аминокислотную последовательность альфа цепи ΝΥΕδΟ ТСК, в которой С162 (использование нумерации δΕΟ ΙΌ Νο: 1) заменяет Т48 ее ТКАС константной области.
δΕΟ ΙΌ Νο: 2 (фиг. 2) представляет собой аминокислотную последовательность бета цепи ΝΥ-ΕδΟ ТСК, в которой С170 (использование нумерации δΕΟ ΙΌ Νο: 2) заменяет δ57 ее ТКВС2 константной области.
δΕΟ ΙΌ Νο: 3 (фиг. 3) представляет собой аминокислотную последовательность анти СБ3 ИСНТ-1 ксРу антитела, с подчеркнутой последовательностью внутри линкера.
Фиг. 4 показывает в стуктурной схеме форму структуры растворимого ΝΥ-ΕδΟ αβ ТСК, имеющего а цепь δΕΟ ΙΌ Νο: 1 и β цепь δΕΟ ΙΌ Νο: 2, и имеющего анти СБ3 ИСНТ-1 8сЕу антитела δΕΟ ΙΌ Νο: 3 сливающегося в Ν конце β цепи δΕΟ ΙΌ Νο: 2 ТСК посредством линкерной последовательности Ь1, а именно ΟΟΕΟδ (δΕΟ ΙΌ Νο: 4).
δΕΟ ΙΌ Νο: 14 (фиг. 16) представляет собой аминокислотную последовательность бета цепи на фиг. 2 с Ν-концом анти-СБ3 8сЕу сливается С-конец бета цепи ТСК посредством других пептидных линкерных последовательностей (подчеркнута).
δΕΟ ΙΌ Νο: 15 (фиг. 17) представляет собой аминокислотную последовательность бета цепи на фиг. 2 с С-концом анти-СБ3 8сЕу сливается Ν-конец бета цепи ТСК посредством одинаковых пептидных линкерных последовательностей, а именно δΕΟ ΙΌ Νο: 14 (вновь подчеркнута).
Конструкцию на фиг. 4 приготавливали следующим образом.
Лигирование
Синтетические гены кодируют (а) α цепь δΕΟ ΙΌ Νο: 1 ТСК и (б) слияние последовательности δΕΟ ΙΌ Νο: 2 и δΕΟ ΙΌ Νο: 3, по отдельности лигированных в рОМТ7 - основные экспресснные плазмиды, которые содержат Т7 промотер для высокого уровня экспрессии в Е. той штамма ΒΕ21-ΌΕ3(ρΕ·Υ5δ) (Рап е1 а1., ВюЮскпкщез (2000) 29 (6): 1234-8).
Экспрессия
Экспрессионные плазмиды трансформировали раздельно в Εοοίί штамма ΒΕ21-ΌΕ3 ^зеИа ρΕνδδ и отобранные ампицилин-резистентные колонии выращивали при 37°С в ТУР (ампициллина 100 мкг/мл) среде при ΟΌ600 ~0.6-0.8 перед индуктированием экспрессии белка с 0.5 мМ РТО. Клетки собирали после трехчасового индуктирования с помощью центрифугирования в течение 30 мин при 4000 об/мин в Весктап И6В. Клеточную массу лизировали с 25 мл Вид ВиЩег (NονаΟеη) в присутствии МдС12 и ДНКазы. Осадок внутриклеточных включений извлекали с помощью центрифугирования в течение 30 мин при 13000 об/мин в центрифуге Весктап 1-6В. Затем проводили тройное промывание детергентом для удаления клеточных остатков и мембранных компонентов. Каждый раз осадок внутриклеточных включений гомогенизировали в Тритон буфере (50 мМ Тп5-НС1 рН 8.0, 0,5% Тритон-Х100, 200 мМ ИаС1, 10 мМ Ν;·ι ЭДТА) перед центрифугированием осдака в течение 15 мин при 13000 об/мин в Весктап И6В. Детергент и соли удаляли подобным промыванием в следующем буфере: 50 мМ Тп5-НС1 рН 8.0, 1 мМ Ν;·ι ЭДТА. В заключении, внутриклеточные включения подразделяли на 30 мг аликвоты и замораживают при -70°С.
Рефолдинг
Примерно 20 мг α цепи ТСК и 40 мг β цепи 5сЕу-ТСК растворяли внутриклеточными включениями, оттаившими от низкотемпературного хранения, разводили в 20 мл раствора гуанидина (6М гуанидингидрохлорида, 50 мМ Тп5-НС1 рН 8.1, 100 мМ ИаС1, 10 мМ ЭДТА, 20 мМ ДТТ) и инкубировали при 37°С в водяной бане в течение 30 мин - 1 ч до полной денатурации цепи. Раствор гуанидина, содержащий полностью редуцированные и денатурированные цепи ТСК, затем вводили в 1 л следующего буфера для рефолдинга: 100 мМ Тп5 рН 8.1, 400 мМ Ь-Аргинина, 2 мМ ЭДТА, 5М мочевины. Редокс пару (гидрохлорид цистамина и дигидрохлорид цистамина (конечной концентрации 16 мМ и 1.8 мМ, соответственно) добавляли приблизительно за 5 мин перед добавлением денатурированных а ТСК и β 8сЕу-ТСК це- 3 020841 пей. Раствор оставляли на ~30 мин. Рефолдинговые 8сРу-ТСК диализировали в диализной трубке с целлюлозной мембраной (§1§та-Л1бпсЬ; Товар Νο. Ό9402) против 10 л Н2О в течение 18-20 ч. После этого времени диализный буфер меняют дважды на свежий 10 мМ Τήδ рН 8.1 (10 л) и диализирование продолжают при 5°С ± 3°С в течение ~8 ч. Растворимые и правильной укладки 8сРу-ТСК отделяют от неправильно свернутых продуктов распада и примесей методом 3-ступенчатой очистки, описанным ниже. Второй этап очистки может быть ионнообменной хроматографией или аффинной хроматографией, в зависимости от р1 растворенного анти-СПЗ 8сРу-ТСК слияния.
Первый этап очистки
Диализированный свернутый белок (в 10 мМ Тгщ. рН 8.1) погружают на анионобменную колонку ΡΘΚΌδ 50НР и элюируют связанный белок градиентом 0-500 мМ Ναί'Ί 6 объемами колонки с использованием очистителя Ака (СЕ НеаЙЬсаге). Пиковые фракции (элюирование при проводимости ~20 м См/см) хранили при 4°С. Пиковые фракции изучали путем 1и51аи1 В1ие δίαίη (Νο\Ό.\ίη) окрашивания δΌδПЭГ перед объединением.
Второй этап очистки
Ионообменная хроматография.
Катионообменная очистка.
Анионообменные смешанные фракции буфера обмена разводили с 20 мМ МЕ§ рН 6-6.5, в зависимости от р1 5сРу-Т СК слияния. Растворимые и правильной укладки 8сРу-ТСК отделяли от неправильно свернутых продуктов разложения и примесей путем загрузки растворимых смешанных фракций (в 20 мМ МЕ§ рН 6-6.5) на катионнообменную колонку ΡΘΚΟδ 50Н8 и элюировали связанный белок градиентом 0-50 мМ Ναί'Ί 6 объемами колонки с использованием очистителя Ак1а (СЕ НеаЙЬсаге). Пиковые фракции (элюирование при проводимости ~10 мСм/см) хранили при 4°С.
Кроме того, ионнообменная очистка с использованием матриксного гидроксиапатита может быть использована как описано ниже.
Гидроксоапатитовая хроматография
Анионообменные смешанные фракции буфера обмена разводили с 10 мМ NаН2ΡΟ4 рН 6.0. Растворимые и правильной укладки 5сРу-ТСР отделяли от неправильно свернутых продуктов разложения и примесей путем загрузки разведенных смешанных фракций (в 10 мМ NаН2ΡΟ4 рН 6.0) на гидроксиапатитную колонку и элюировали связанный белок с градиентом 10-500 мМ NаН2ΡΟ4/1М №С1 6 объемами колонки с использованием очистителя Ака (СЕ НеаЙЬсаге). Пиковые фракции (элюирование при проводимости ~20 мСм/см) хранили при 4°С.
Аффинная хроматография
Для некоторых 5сРу-ТСР слияний с р1, близкой к 6-6.5, ионообменный этап не может быть использован, но его можно заменить этапом аффинной хроматографии. Белок Ь аффинной хроматографической колонки (Р1етсе, продукт номер 89928) выделяет и очищает определенные классы иммуноглобулинов посредством их каппа легкой цепи. Белок Ь также связывает одноцепоченые различные фрагменты (бсРу). Анионообменные смешанные фракции обменного буфера разбавляли с ΡΒδ /0.02% азида натрия. Растворимые и правильной укладки 5сРу-ТСР отделяли от неправильно свернутых продуктов разложения и примесей путем загрузки разведенных смешанных фракций на колонку белка Ь и элюировали связанный белок градиентом 0-25мМ глицина рН 2.3/0.02% азида натрия 6 объемами колонки с использованием очистителя Ака (СЕ НеаЙЬсаге). 5сРу элюировали в самом конце градиента и рН элюирования фракций нейтрализовали добавлением Τήδ рН 8.1 (100 мМ Τήδ рН 8.1 конечной концентрации). Пиковые фракции хранили при 4°С.
Окончательная очистка
Пиковые фракции из второго этапа очистки изучали путем 1п51ап1 В1ие δΚιίη (Νο\Ό.\ίη) окрашивания δΌδ-ПЭГ перед объединением. Смешанные фракции затем концентрировали для стадии окончательной очистки, в то время как растворимые 5сРу-ТСР очищали и отличали, используя δире^άеx δ200 гельфильтрационную колонку (СЕ НеаЙЬсаге), предварительно уравновешенную в ΡΒδ буфере (δίβίικι). Пиковое элюирование с относительной молекулярной массой приблизительно 78 кДа исследовали путем 1и81аи1 В1ие δΠιίη (Νο\Ό.χίη) окрашивания δΌδ-ПЭГ перед объединением.
Аналогично, как описано для конструкции на фиг. 4, конструкции на фиг. 5, 6 и 7 были подготовлены.
На фиг. 5 показана в структурной схеме форма структуры растворимого ΝΥ-ΞδΟ αβ ТСК, имеющего а цепь δερ ΙΌ Νο: 1 и β цепь δερ ΙΌ Νο: 2, и имеющего анти СП3 иСНТ-1 5сРу антитела δερ ΙΌ Νο: 3 слитые в Ν конце β цепи δερ ΙΌ Νο: 2 ТСК посредством последовательности линкера Ь2, а именно АННδΕ^ΡδδΚАΡΚАΡ (δΙΤ) ΙΌ Νο: 5).
На фиг. 6 показана в структурной схеме форма структуры растворимого ΝΥ-ΞδΟ αβ ТСК, имеющего а цепь δερ ΙΌ Νο: 1 и β цепь δερ ΙΌ Νο: 2, и имеющего анти СО3 иСНТ-1 5сРу антитела δερ ΙΌ Νο: 3 слитые в Ν конце β цепи δΕρ ΙΌ Νο: 2 ТСК посредством последовательности линкера Ь3, а именно ССΕСССδΕСССδ (δΕρ ΙΌ Νο: 6).
На фиг. 7 показана в структурной схеме форма структуры растворимого ΝΥΠδΟ αβ ТСК, имеюще- 4 020841 го α цепь δΕΟ ΙΌ Νο: 1 и β цепь δΕΟ ΙΌ Νο: 2, и имеющего анти ΕΌ3 ИСНТ-1 8сРу антитела δΕΟ ΙΌ Νο: 3 слитых в С конце β цепи δΕΟ ΙΌ Νο: 2 ТСК посредством последовательности линкера Ь4, которая в данном случае является одной аминокислотой δ.
Аналогично, как описано для конструкций на фиг. 4, 5, 6 и 7, белки слияния, имеющие α цепь δΕΟ ΙΌ Νο: 1 ТСК и β цепь - анти-СЭЗ 8сЕу δΕΟ ΙΌ Νο: 14ТСК, где анти- ΕΌ3 8сЕу сливается в С-конце бета цепи ТСК, или а цепь δΕΟ ΙΌ Νο:1 ТСК и β цепь - анти-СЭЗ 8сЕу δΕΟ ΙΌ Νο: 15 ТСК, где анти-СОЗ 8сЕу сливается в Ν-конце бета цепи ТСК, были получены.
А2. Растворимые химерные ТСК с цитокинами как эффекторные полипептиды.
δΕΟ ΙΌ Νο: 7 (фиг. 8) представляет собой аминокислотную последовательность альфа цепи ТСК, обладающая свойством связывать мышиный инсулин-производный пептид, ^Υ^VСΟΕКΟ (δΕΟ ΙΌ ΝΟ: 8), представляющий собой мышиный Н-2К'1 комплекс. (^Υ^VСΟΕКΟ- Н-2К'1), в котором С159 (использование нумерации δΕΟ ΙΌ Νο: 7) заменяет ее Т48 ТКАС константной области.
δΕΟ ΙΌ Νο: 9 (фиг. 9) представляет собой аминокислотную последовательность бета цепи из числа ТСК, которая связывает мышиный ΕΥΕνΕΌΕΡΟ- Н-2К'1 комплекс, в котором С171 (использование нумерации δΕΟ ΙΌ Νο: 9) заменяет δ57 ее ТКВС2 константной области.
δΕΟ ΙΌ Νο: 7 и 9 ТСК представляет собой химерный ТСК, состоящий из альфа и бета цепи ТСК, каждый из которых содержит вариабельную область мыши и константную область человека. Химерный вариант ТСК конструировали для решения проблем рефолдинга, встречающихся с полностью мышиным ТСК, и было показано, что химерный ТСК обладает такой же аффинностью, как и мышиный ТСК в отношении комплекса мышиного белка, прозводного инсулина и мышиного Н-2К'1.
δΕΟ ΙΌ Νο: 10 (фиг. 10) представляет собой аминокислотную последовательность ΙΌ-4 полипептида мыши.
δΕΟ ΙΌ Νο: 11 (фиг. 11) представляет собой аминоксилотную поледовательность ΙΌ-13 полипептида мыши.
На фиг. 12 показана в структурной схеме форма структуры растворимого химерного инсулина αβ ТСК, имеющего α цепь δΕΟ ΙΌ Νο:7 и β цепь δΕΟ ΙΌ Νο: 9 и имеющего мышиный ΙΌ-4 δΕΟ ΙΌ Νο: 10 слитый в Ν- конце β цепи δΕΟ ΙΌ Νο: 9 ТСК посредством последовательности ленкера Ь5, а именно ΟΟΕΟΟΟΡ (δΕΟ ΙΌ Νο: 12).
На фиг. 13 показана в структурной схеме форма структуры растворимого химерного инсулина αβ ТСК, имеющего α цепь δΕΟ ΙΌ Νο:7 и β цепь δΕΟ ΙΌ Νο: 9 и имеющего мышиный ΙΌ-4 δΕΟ ΙΌ Νο: 10 слитый в С конце β цепи δΕΟ ΙΌ Νο: 9 ТСК посредством линкерной последовательности Ь6, а именно ΟδΟΟΡ (δΕΟ ΙΌ Νο: 13).
На фиг. 14 показана в структурной схеме форма структуры растворимого химерного инсулина αβ ТСК, имеющего α цепь δΕΟ ΙΌ Νο:7 и β цепь δΕΟ ΙΌ Νο: 9 и имеющего мышиный ΙΌ-13 δΕΟ ΙΌ Νο: 11 слитый в Ν- конце р цепи δΕΟ ΙΌ Νο: 9 ТСК посредством линкерной последовательности Ь5, а именно ΟΟΕΟΟΟΡ (δΕΟ ΙΌ Νο: 12).
На фиг. 15 показана в структурной схеме форма структуры растворимого химерного инсулина αβ ТСК, имеющего α цепь δΕΟ ΙΌ Νο:7 и β цепь ΌΕΟ ΙΌ Νο: 9 и имеющего мышиный ΙΌ-13 δΕΟ ΙΌ Νο: 11 слитый в С конце β цепи δΕΟ ΙΌ Νο: 9 ТСК посредством линкерной последовательности Ь6, а именно ΟδΟΟΡ (δΕΟ ΙΌ Νο: 13).
Конструкции на фиг. 12-15 были получены следующим образом.
Лигирование
Синтетические гены кодируют (а) α цепь δΕΟ ΙΌ Νο:7 ТСК и (б) слияние последовательности δΕΟ ΙΌ Νο: 9 и δΕΟ ΙΌ Νο: 10 или 11, по отдельности лигированных в ρΟΜТ7-основные экспрессионные плазмиды, которые содержат промотер Т7 для высокого уровня экспресии в Εχοΐί штамма ВЬ21^Ε3(р^у8δ) (Ραη е1 а1, ВюЩскпщиез (2000) 29 (6): 1234-8).
Экспрессия
Экспрессионные плазмиды, содержащие α-цепь ТСК и β-цепь цитокина, соответственно были трансформированы по отдельности в Ε^οΐί штамма ВЬ21 (ΌΕ3) ^зейа ρΕνδδ и отобранные ампицилинрезистентные колонии выращивали при 37°С в ТΥΡ (ампицилин 100 цг/мл) среды ΟΌ600~0.6-0.8 перед стимуляцией экспресии белка с 0.5 мМ IΡТΟ. Клетки собирали после трех часовой индукции методом центрифугирования в течении 30 мин при 4000 об/мин на Весктап 1-6В. Клеточную массу лизировали с 25мл Вид Ви81ег (NονаΟеη) в присутствии МдС12 и ДНКазы. Осадок внутриклеточных включений получали методом центрифугирования в течение 30 мин при 13000 об/мин в центрифуге Весктап 12-21. Тройным промыванием детергентом проводили удаление клеточных остатков и мембранных компонентов. Каждый раз осадок клеточных включений гомогенизировали в Тритон буфере (50 мМ ТГ18-НС1 рН 8.0, 0.5% Тритон-Х100, 200 мМ №С1, 10 мМ №ЭДТА), предварительно центрифугировали в течении 15 мин при 13000 об/мин в Весктап 12-21. Детергент и соли удаляли подобным промыванием в следующем буфере: 50 мМ ТП8-НС1 рН 8.0, 1 мМ № ЭДТА. В заключении, внутриклеточные включения разделяли на 30 мг аликвоты и замораживали при -70°С. Выход белковых телец включений подсчитывали путем
- 5 020841 растворения с 6М гуанидин- НС1 и при ΘΌ измеряли на Нйаск И-200 спектрофотометре. Концентрацию белка затем подсчитывали с использованием теоретического коэффициента поглощения.
Рефолдинг
Приблизительно 20 мг а цепи ТСК и 40 мг 3 цепи цитокина-ТСК растворяли клеточными включениями, оттаившими от низкотемпературной заморозки, и разводили в 20 мл раствора гуанидина (6М гуанидин-гидрохлорид, 50 мМ Ττΐδ НС1 рН 8.1, 100 мМ ЫаС1, 10 мМ ЭДТА, 10 мМ ДТТ) и инкубировали при 37°С в водяной бане в течение 30 мин - 1 ч для обеспечения полной цепочечной денатурации. Раствор гуанидина, содержащий полностью редуцированные и денатурированные цепи ТСК, был введен в 1 л холодного (5-10°С) рефолдингового буфера: 100 мМ ТгЕ рН 8.1, 400 мМ Ь-Аргинина, 2 мМ ЭДТА, 5М мочевины. Редокс пары (цистамина гидрохлорид и цистамина дигидрохлорид (в конечной концентрации 10 мМ и 2.5 мМ. соответственно)) добавляли приблизительно за 5 мин до добавления денатурированных α ТСК и 40 мг β цепей цитокина-ТСК. Раствор оставляли на ~30 мин. Рефолдинговые цитокин-ТСК диализировали в диализной трубке с целлюлозной мембраной (§1§та-А1бпсй; продукт Νο. И9402) против 10 л Н2О в течение 18-20 ч. После этого диализный буфер дважды меняли на свежий 10 мМ ТгЕ рН 8.1 (10 л) и продолжали длительный диализ при 5°С±3°С в течение следующих ~8 ч.
Очистка
Растворимые цитокин-ТСК слияния отделяли от продуктов распада и примесей путем 3-этапной очистки методом КТ, описанным ниже.
Первый этап очистки
Диализированный свернутый белок фильтровали с использованием 0.2 мкм капсул 8ат1о&ге (8ат1оти18) перед колоночной очисткой. Фильтрованный рефолдинг загружали на анионообменную колонку РОКО8 50НО и элюировали связанный белок линейным градиентом 0-500 мМ №С1 6 объемами колонки с использованием очистителя Лк1а (ОБ НеаНЪсате). Пиковые фракции элюировали 250 мМ ИаС1, содержащие белки правильной укладки, и хранили при 4°С. Пиковые фракции изучали с помощью 1п51ап1 В1ие 81ат (Шуехт) окрашивания δΌδ-ПЭГ перед объединением.
Второй этап очистки
Объединенные фракции, содержащие растворимый цитокин-ТСК, смешивают с эквивалентным объемом 50 мМ ТгЕ/1М (ΝΉ4)2δΟ4 рН 8 до конечной концентрации 0.5М (ΝΉ4)2δΟ4 и проводимостью 7580 сМс/см при КТ. Растворимый цитокин-ТСК отделяли от продуктов распада и примесей путем загрузки этого образца на предварительно уравновешенную (50 мМ Тп5/0.5М (ΝΉ4)2δΟ4 рН8) колонку бутил гидрофобного взаимодействия и собирали элюат с использованием очистителя Ака (ОЕ Неаййсате). Образец элюата, содержащий растворимые цитокин-ТСК, изучали с помощью 1и81аи1 В1ие δίπίη (Шуехт) окрашивания δΟδ-ПЭГ перед объединением и хранили при 4°С.
Окончательная очистка
Смешанные фракции разводили с эквивалентным объемом 10 мМ ТгЕ рН8 и концентрировали до 10 мл (концентрация <3 мг/мл). Растворимые цитокин-ТСК очищали с использованием гельфильтрационной колонки §иретбех δ200 (ОЕ НеаИйсате) предварительно уровновешанной в буфере ΡΒδ (δίβίικι). Пиковое элюирование при относительной молекулярной массе около 63 кДа исследовали с помощью 1и81аи1 В1ие δίπίη (Шуехт) окрашивания δΌδ-ЛЭГ перед объединением.
Пример Б. Свойства растворимого αβ ТСК, имеющего эффекторное полипептидное слияние в Сили Ν-конце β цели ТСК
Б1. Растворимый ΝΥ-ΕδΟ ТСК с анти-СЭ3 антителами как эффекторный полипептид. а. Перенаправление и активация СЭ8' Т клеток растворимым ΝΥ-ΕδΟ ТСК, слитым с анти-СЭ3 антителом, против ΝΥ-ΕδΟ пептид-презентирующих клеток.
Следующее исследование проводилось для демонстрации активации цитотоксических Т лимфоцитов (СТЬк) анти-СЭ3 всРу-ТСК слиянием посредством специфического пептид-МНС комплекса. Выработку ΙΡΝ-γ, измеренную с использованием анализа ΕΜδΡΟΕ использовали в качестве считывания для активации цитотоксических Т лимфоцитов (СЬТ) и для оценки активности анти-СЭ3 всРу части слияния.
Реагенты
Испытательная среда: 10% ΡСδ (ОФсо, Са1# 2011-09), 88% КРМ1 1640 (ОФсо, Са1#42401), 1% глютамина (ОФсо, Са1# 25030) и 1% пеницилин/стрептомицин (ОФсо, Са1# 15070-063).
Пептид: ^Б-БМ\У1ТРУ) первоначально растворяли в ΌΜδΟ (δίβΗκτ са1# И2650) на 4 мг/мл и замораживали. Т2 клетки активируются с описанным пептидом и используются в качестве клеток-мишеней.
Промывочный буфер: 0.01 М ΡΒδ/0.05% Т\\ееп 20 ΡΒδ (Оксо Са1# 10010).
ΙΡΝγ человека Ε^IδΡΟΤ РУИР-ферментный набор (И1ас1опе, Ргапсе:Са1# 856.051.020) содержит все другие необходимые реагенты. (Сбор и обнаружение антител, сухое обезжиренное молоко, ΒδΑ, стрептавидин-щелочная фосфатаза и раствор ВС1Р/ИВТ, а также ΙΡΝγ человека РУИР Ε^IδΡΟΤ 96 луночные планшеты.
- 6 020841
Метод
Получение клеток-мишеней.
Клетки-мишени, используемые в данном методе, были либо (1) натуральные эпитоппрезентирующие клетки (например, клетки Ме1624 или Ме1526) или (2) Т2 клетки, активированные с пептидом, представляющим интерес, описанным в части реагентов. Достаточное количество клетокмишеней (50 000 клеток/лунка) промывали путем центрифугирования три раза при 1200 об/мин, 10 мин в Меда&де 1.0 (Негаеик). Клетки затем ресуспендировали в испытательной среде при 105 клетка/мл.
Получение эффекторной клетки.
Эффекторная клетка (Т клетка) используется в этом методе как СИ8+ Т клетки (полученные путем негативной селекции (с помощью набора Негативного выделения СЭ8. Эупа1. Са!# 133.19) из РВЬ), Т клетки из клеточной линии ЕВУ или РВМС8. Эффекторные клетки размораживали и помещали в испытательную среду, предварительно промывали с помощью центрифугирования при 1200 об/мин 10 мин в Меда&де 1.0 (Негаеик). Клетки затем ресуспендировали в испытательной среде при 4Х конечной требуемой концентрации.
Получение реагента/тестируемого состава.
Различные концентрации тестируемого состава (ТСК-Анти-СИ3 слияние; от 10 нМ до 0.03 пМ) получали путем разведения в испытательной среде при конечной концентрации 4Х.
ЕЬ18РОТ5.
Планшеты получали следующим образом: 100 мкл иммобилизированых антител анти-ΙΡΝ-γ разводили в 10 мл стерильного РВ8 на планшет. 100 мкл разведенных иммобилизированных антител вносили в каждую лунку. Планшеты инкубировали всю ночь при 4°С. После инкубации планшеты промывали (программа 1, планшет 2 типа, иПгахуаяП Р1и8 промывка 96-луночной планшеты; Иупех) для удаления иммобилизированных антител. Планшеты блокировали путем добавления 100 мкл 2% обезжиренного молока в стерильный РВ8 в каждую лунку и инкубировали планшеты при комнатной температуре в течение двух часов. Обезжиренное молоко затем вымывали из планшет (программа 1, планшет 2 типа, И11га\уа5Й Р1и8 промывка 96-луночной планшеты; Иупех) и какие-либо остатки промывочного буфера удаляли путем стряхивания и постукивания планшет ЕЬРЗРОТ на бумажной салфетке.
Составляющие анализа затем добавляли в ЕЬРЗРОТ плашету в следующем порядке:
мкл клеток-мишеней 106 клеток/мл (что в общей сложности 50000 клеток-мишеней/лунка);
мкл реагента (слияние анти-СИ3 8сРу-ТСК; различной концентрации) 50 мкл среды (исследовательская среда);
мкл эффекторных клеток (между 1000 и 50000 СИ8+ ктеток/лунка; между 500 и 1000 ЕВУ клеток/лунка; между 1000 и 50000 РВМС/лунка).
Затем планшеты инкубировали в течение ночи (37°С/5% СО2). На следующий день планшеты промывают трижды (программа 1, планшет 2 типа, ШОатазЬ Р1и8 промывка 96-луночной планшеты, Иупех) с промывочным буфером и постукивали над бумажным полотенцем для удаления лишнего промывочного буфера. 100 мкл первично детектируемых антител добавляли в каждую лунку. Первично детектируемые антитела получали путем добавления 500 мкл дистилированной воды в сосуд для детекции антител, снабженный набором И1ас1опе. 100 мкл этого раствора разводили в 10 мл РВ§/1% В8А (объем, необходимый для одной планшеты). Затем планшеты инкубировали при комнатной температуре в течение по меньшей мере 2 ч до того, как трижды промывали (программа 1, планшет 2 типа, НОгатакЬ Р1и8 промывка 96-луночной планшеты,Пупех) с промывочным буфером, избыток промывочного буфера удаляли постукиванием над бумажным полотенцем.
Вторая детекция осуществлялась путем добавления 100 мкл разведенной стрептавидин-щелочной фосфатазы в каждую лунку и инкубирования планшеты при комнатной температуры в течение 1 ч. Стрептавидин-щелочная фосфатаза получена путем добавления 10 мкл стрептавидин-щелочной фосфатазы к 10 мл РВ§/1% В8А (объем, необходимый для одной планшеты). Планшеты трижды промывали (программа 1, планшет 2 типа, и11га\уа5Й Р1и8 промывка 96-луночной планшеты, Иупех) с промывочным буфером и удаляли избыток промывочного буфера постукиванием над бумажным полотенцем. 100 мкл раствора ВСIР/NВТ, как есть в наборе И1ас1опе, добавляли в каждую лунку. В процессе проявления, планшеты покрывали фольгой, и оставляли на 5-15 мин. Проявление планшет регулярно проверяли на пятна в течении этого времени для определения оптимального времени завершения реакции. Планшеты промывали в раковине под водопроводной водой для прекращения развитии реакции и встряхивали насухо прежде, чем их разобрать на три составные части. Затем планшеты высушивали при 50°С в течение 1 ч перед тем, как посчитывать пятна, которые формируются на мембране при использовании спектрофотометра 1тшипо8ро1 (СЬТ; Се11и1аг ТесЬпо1о§у Ытйеб).
Результаты
Конструкции анти-СИ3 8сРу-ТСК слияния на фиг. 4-7 были протестированы с помощью исследования ЕЬРЗРОТ (как описано выше). Количество пятен ЕЬРЗРОТ, наблюдаемых в каждой лунке, наносили на график в зависимости от концентрации тестируемой конструкции, используя Рпмн (Огарй Раб). Из этих кривых доза-эффект ЕС50 значения были определены (ЕС50 определяют при концентрации анти-СИ3 8сРу-ТСК слияния, которое вызывает 50% максимального ответа).
- 7 020841
Тестируемая конструкция ЕС50 ЕС50 ЕС50
Фиг 7 С-концевое слияние 5.044е-9 1.864е-9 2.383е-9
Фиг 5 Ν-концевое слияние 8.5026-11
Фиг 4 Ы-нонцевое слияние 4,8256-11
Фиг 6 Ы-концевое слияние 3.95е-11
Эти результаты показывают, что конструкции Ν-слияния на фиг. 4, 5 и 6 по меньшей мере в 2 раза более сильные в способности активации цитотоксических Т лимфоцитов, чем конструкции С-слияния на фиг. 7.
б. Перенаправление ΘΌ8+ Т клеток растворимым ΝΥ-ΕδΟ ТСК слиянием с анти-СО3 антител для уничтожения ΙΜ9 ЕВУ трасформированной В клеточной линией (нерадиоактивный цитотоксический анализ).
Следующий анализ осуществляется для демонстрации активации цитотоксических Т лимфоцитов (СЬТк) ТСК-анти-СЭ3 ксРу слиянием посредством специфического пептид-МНС комплекса и оценки эффективности анти-СПЗ ксРу части слияния, активирующей СЬТк для уничтожения ΙΜ9 клеток. Это исследование представляет собой колориметрическую альтернативу исследованиям цитотоксичности с высвобождением 51Сг и количественно измеряет лактатдегидрогеназу (ЬЭН), которая является ферментом, высвобождаемым при лизисе клеток. Высвобожденную ЬЭН в культуральных супернатантах измеряют с помощью 30-минутного объединенного ферментатативного анализа, результатом которого является превращение соли тетразолия (ЮТ) в формазановый продукт красного цвета. Количество цвета формируется пропорционально количеству лизированных клеток. Данные поглощения собирают, используя стандартные 96-луночные планшеты для чтения при 490 нм.
Материалы
Су!оТох96® №и-КабюасЙуе Су!о!охюйу Аккау (Рготеда) (01780) содержит субстрат Μίχ, испытуемый буфер, лизирующий раствор и стоп-реагент.
Испытательная среда: 10% РС8 (термоинактивированная, С1Ьсо, са!# 10108-165), 88% ΚΡΜΙ 1640 без фенолового красного Диуйтодеи, са!# 32404014),1% глютамин, 200 мΜ Диуйтодеи, са!# 25030024), 1% пеницилин/стрептомицин (1иуйтодеи са!# 15070063).
№ис микролуночный с круглым дном 96 лунок для культуры ткани (Νιιικ. са!# 163320).
№ис-иммунопластины Μаx^ко^Ь (№ис, са!# 442404).
Метод
Получение клеток-мишеней.
Клетки-мишени, использованные в этом исследовании, были ΙΜ9 ЕВУ трансформированной В клеточной линии, полученной от многоклеточной миеломы пациентов (НЬА-А2+ ΝΥ-ΕδΘ'). Μе1526 клеточную линию миеломы использовали в качестве контроля и НЬА-А2+ ΝΥ -ΕδΟ-. Клетки-мишени готовили в испытательной среде: клетки-мишени концентрировали, доводя от 2х105 клеток/мл до 1х104 клеток/лунку в 50 мкл.
Получения эффекторных клеток.
Эффекторными клетками, используемые в этом анализе, были ΘΌ8+ Т клетки. Соотношение эффектор-мишень использовали 10:1 (2х106 клеток/мл до 1х105 клеток/лунка в 50 мкл).
Получение реагента/тестируемого состава.
Различные концентрации ΝΥ-ΕδΟ ТСК-анти-СЭ3 слияния, имеющие альфа цепь δΕΘ ΙΌ №:1 ТСК и бета цепь анти-СЭ3 ксРу слияния δΕΘ ΙΌ №:14 ТСК, или имеющие альфа цепь δΕΘ ΙΌ №: 1 ТСК и бета цепь анти-СО3 ксРу слияния δΕΘ ΙΌ №:15 ТСК, были получены как описано в примере А1 и получены для этого исследования путем разведения (10-13 до 10-8 М конечной концентрации) в испытательной среде.
Подготовка анализа.
Составляющие анализа добавляли в планшет в следующем порядке:
мкл клеток-мишеней, ΙΜ9 или Μе1526 (полученных, как объяснялось выше), в каждую лунку.
мкл реагента (полученного, как объяснялось выше) в каждую лунку.
мкл эффекторных клеток (полученных, как объяснялось выше) в каждую лунку.
Несколько контролей, полученных, как объясняется ниже.
Спонтанное освобождение эффектора: 50 мкл эффекторные клетки в чистом виде.
- 8 020841
Спонтанное освобождение клеток-мишеней: 50 мкл клетки-мишени в чистом виде.
Максимальное освобождение мишени: 50 мкл клеток-мишеней плюс 80 мкг/мл дигитонина в начале исследования лизиса клеток.
Контрольная испытуемая среда: 150 мкл только среда.
Экспериментальные лунки готовят в трех экземплярах, а контрольные лунки в двух экземплярах в конечном объеме 150 мкл.
Планшет центрифугировали при 250х г в течение 4 мин, затем инкубировали при 37°С в течение 24 часов.
Планшет центрифугировали при 250х г в течение 4 мин, 37.5 мкл супернатанта из каждой лунки испытуемого планшета переносили в соответствующую лунку с плоским дном 96 луночного Пипс Мах150тЪ планшета. Субстрат Μίχ растворяли с использованием испытательного буфера (12 мл). 37.5 мкл растворенного субстрата Μίχ добавляли в каждую лунку планшета. Планшет покрывали алюминиевой фольгой и инкубировали при комнатной температуре в течение 30 мин, 37.5 мкл стоп-реагента добавляли в каждую лунку планшета для прекращения реакции. Поглощение при 490 нм регистрировалось на ИФА планшете для чтения не позднее часа после добавления стоп-реагента.
Подсчет результатов.
Средняя величина значения поглощения культуральной среды вычиталась из всего значения поглощения экспериментального, спонтанного освобождения клеток-мишеней и спонтанного освобождения эффекторных клеток и максимального освобождения мишеней.
Скорректированные значения, полученные в первых двух этапах, использовались в следующей формуле вычисления процента цитотоксичности: % цитотоксичности = 100х (Экспериментальная Спонтанный эффектор - Спонтанная мишень)/(Масимальное освобождение мишени - Спонтанная мишень).
Результаты
Конструкции ΝΥ-ΕδΟ ТСК-Анти-СЭ3 ксЕу слияния имеют (ί) альфа цепь δΕΟ ГО N0: 1 ТСК и бета цепь - анти-СЭ3 ксРу слияния δΕΟ ГО Νο: 14 ТСК (С-концевое слияние) или (ίί) альфа цепь δΕΟ ГО Νο: 1 ТСК и бета цепь - анти-СЭ3 ксЕу слияния δΕΟ ГО Νο: 15 ТСК (Ν-концевое слияние) исследовали путем анализа освобождения ЬЭН (как описано выше). % цитотоксичности наблюдали в каждой лунке в зависимости от концентрации тестируемой конструкции, используя Рпкт (Отарй Раб). Из этих кривых дозаэффект значение ЕС50 были определено (ЕС50 определяли концентрацией слияния ТСК, что вызывало 50% максимального ответа).
Тестируемая конструкция ЕС50
С-концевое слияние (5Е0 Ю Νο: 1 и ЗЕ(2 Ю Νο: 14) 1.2е'®
Ν-концевое слияние (5ЕО ГО №: 1 и ЗЕО ГО Νο: 15) 3.2е”
Эти результаты показывают, что Ν-концевое слияние, включающее альфа цепь δΕΟ ГО Νο: 1 ТСК и бета цепь- анти-СЭ3 ксЕу слияния δΕΟ ГО Νο: 15 ТСК по меньшей мере в 2 раза более сильное в своей способности перенаправления цитотоксических Т лимфоцитов для уничтожения клеток-мишеней, чем Сконцевое слияние конструкции, содержащей альфа цепь δΕΟ ГО Νο: 1 ТСК и бета цепь-анти-СЭ3 ксЕу слияния δΕΟ ΙΌ Νο: 14 ТСК.
Б2. Растворимый химерный ТСК с цитокинами как эффекторными полипептидами. а. Мышиный цитокин 1Ь-4 как эффекторный полипептид.
Следующий анализ использовали для тестирования биологической активности цитокинов в части мышиного ГО-3-ТСК слияния конструкций на фиг. 12-13. В этом биотесте используют мышиную клеточную линию СТЕЬ-2, которая зависит от мышиного 1Ь-4 для роста, и используют демонстрацию биологической активности цитокинов в части мышиного ГО-4-ТСК слияния.
Материалы.
Клетки СТЬЬ-2, Рготеда СеПТйег-Ок® люминисцентный анализ жизнеспособности клеток (Са!# 07572), включая СеПТйег-Ок® Буфер и СеПТйег-Ок® Субстрат (лиофилизированный).
Испытательная среда: КРМ1 дополненная 10% термоинактивированной фетальной бычей сывороткой (Окот, са!# 10108-165), 88% КРМ1 1640 (Окот, са!# 42401-018), 1% глютамин (Окот, са!# 25030024), 1% пеницилин/стрептомицин (Окот, са!#15070-063)
СТЬЬ-2 клетки собирают, один раз промывают в испытательной среде (центрифугируют при 1200 об/мин в течение 5 мин), подсчитывают и оценивают жизнеспособность, используя раствор триптанового синего. Если жизнеспособность менее чем 80%, осуществляли градиет фиколла для удаления умерших клеток (800х г в течение 15 мин с растормаживанием). Клетки промывают еще два раза и доводят объем до конечного 1х105 клеток/мл. Клетки СТЬЬ-2 добавляют в №шс белые плоскодонные 96-луночные планшеты (5000 клеток/лунка), затем 50 мкл титруют концентрированные стандартный 1Ь-4 мыши (Рерго1есй) или мышиный 1Ь-4-химерный ТСК слияние конструкции на фиг. 12 и 13 (7 точек 1 в 10 раз- 9 020841 ведениях, от 10-8 до 10-14 М). Контроля включают только клетки, только испытательную среду и клетки с 200 ед/мл Рго1еикш (СПгоп). Планшеты инкубировали при 37°С, 5% СО2 всю ночь. Далее, по инструкции производителя, реагент С'.'е11ТПег-С1о размораживали и добавляли в планшет (100 мкл на лунку). Планшет инкубировали в течение 10 мин для стабилизации люминесцентного сигнала и затем записывали, используя люминисцентный считыватель. Фоновый сигнал (только клеток) вычитывают из показаний и наносятся на график в Рпкт (Сгарй Рай) так, что ЕС50 мышиного 1Ь-4-ТСК слияния конструкции на фиг. 12 и 13 можно сравнить с свободным рекомбинантным мышиным 1Ь-4.
Результаты
Тестирувмая конструкция ЕС50 ЕС50 ЕС50
т-11.4 4.9846-13 3,7676-13 5.1486-13
Фигура 33 С-концевое слияние 7.464е-12
Фигура 32 М-концевое слияние 5.9136-13 8.897е-13
Эти результаты показывают, что Ν-слияние конструкции на фиг. 12 по крайней мере в 2 раза сильнее в способности активировать клеточную пролиферацию, чем С-слияние конструкции на фиг. 13.
б. Цитокин 1Ь-13 мыши как эффекторный полипептид.
Следующее исследование было использовано для тестирования биологической активности цитокина в части мышиного 1Ь-13-ТСК слияния конструкции на фиг. 14, 15.
Этот анализ проводили для демонстрации активности цитокинов части из цитокин-ТСК слияния, т.е. ингибирование продукции ΣΠ-1β моноцитами человека. Этот анализ можно использовать для тестирования цитокин-ТСК слияния, где цитокин это 1Ь-13 мыши.
Материалы
Моноциты, полученные из моноцитарной пленки (лейкоцитарная пленка из ΝΒ8 Впк1о1 ТгапкГикюп 8егу1ее) Эупа1 ИупаЬеайк МуРиге Моноцитарный набор 2 для нетронутых клеток человека (113.35).
Испытательная среда: 10% эмбриональной телячьей сыворотки (термоинактивированная, СФсо. са!# 10108-165), 88% КРМ1 1640 (ШЬсо, са!# 42401-018), 1% глютамина (С&со, са!# 25030-024), 1% пеницилин/стрептомицин (ШЬсо, са!# 15070-063).
Промывочный буфер: 0.01 М РВ8/0.05% Т\\ееп 20 (1 пакетик фосфатно-буферного солевого раствора с Т\уееп 20, рН7.4 из 81дта, са!# Р-3563 растворенный в литре дистиллированной воды до конечного состава 0.01 М РВ8, 0.138М №С1, 0.0027М КС1, 0.05% Тмееп 20).
РВ8 (С&со, са!# 10010-015).
ΗΒ88 Са2' и Мд24 свободный (ШЬсо, са!# 1018-165).
Су!окше ЕБ-рап ИФА набор: ΣΠ-1β (И1ас1опе са!# ИС-851.610.020) этот набор содержит все остальные необходимые реагенты, т.е. иммобилизированные антитела, определяемые биотинилированием антитела, стрептавидин-НКР, стандарты ΣΠ-1β, готовый к использованию ТМВ. Следующий метод основан на инструкциях, прилагаемых в каждом комплекте.
Шпс-иммуно пластины Мах1когЬ (Шпс, са!# 442404).
№тс микролуночные круглым дном 96 лунок для культуры ткани планшеты (Жшс, са!# 163320).
Β8Α (81дта, са!#А3059).
Н2804 (§1дта са! # 81526).
Триптановый синий (81дта са! # Т8154).
Липополисхариды (ЬР8), полученные из Е.соП 0111:Β4 (81дта, са!# Б4391).
Рекомбинантный 1Ь-13 мыши (Рерго!есБ, са!# 210-13) стандарт, используемый, когда мышиные 1Ь13-ТСК реагенты слияния тестируются.
Выделение моноцитов
РВМС выделяли из лейкоцитарной пленки: лейкоцитарную пленку разводили 1 к 2 в ΗΒ88 (Са2' и Мд2' свободный), разведенную кровь наслаивали на лифопреп (до 35 мл крови на 15 мл лимфопрела) и центрифугировали 15 мин при 800х г (комнатная температура) с затормаживанием; клетки на границе удаляли и промывали четыре раза с ΗΒ88 и центрифугировали при 1200 об/мин в течение 10 мин. После последнего промывания клетки ресуспендировали в 50 мл испытательной среды и жизнеспособность оценивали с помощью раствора триптанового синего. Иупа1 ИупаЬеайк МуРиге Моноцитарный набор 2 использовали для выделения моноцитов. РВМС ресуспендировали в РВ8/0.1% Β8Α в 100 мкл буфера на 107 клеток, 20 мкл стоп-реагента на 107 клеток и 20 мкл смеси антител на 107 клеток добавляли и клетки инкубировали в течение 20 мин при 4°С. Клетки промывали и ресуспендировали в 0.9 мл РВ8/0.1% Β8Α в среднем на 107 клеток. Предварительно вымытые гранулы добавляли (100 мкл на 107 клеток), смешивали и инкубировали в течение еще 15 мин при 20°С с легким вращением. Кокейек тщательно ресуспеди- 10 020841 ровали пипеткой и добавляли 1 мл РВ8/0.1% В8А на 107 клеток. Пробирку помещали на магнит Бупа1 на 2 мин. Супернатант, содержащий негативные выделенные клетки, переносили в чистую пробирку и подсчитывали. Клетки использовали сразу или замораживали в 90% РС8/10% ΌΜ8Θ для дальнейшего использования.
Подготовка клеточного анализа
Планшеты ИФА покрывали с 100 мкл/лунку иммобилизированными антителами 1Ь-1 β в ΡΒ8 и оставляли на всю ночь при 4°С. Моноциты оттаивали, промывали дважды в испытательной среде и ресуспендировали в 5х105 клеток/мл. Моноциты высеивали в 96-луночный планшет с плоским дном (100 мкл на лунку, т.е. 5х104 на лунку). ЬР8, рекомбинантные цитиконы РсргоЮсН и тестируемое цитокин-ТСК белков слияние получали путем разведения в испытательной среде до получения конечной концентрации 4Х. ЬР8 доваляли в каждую лунку (10нг/мл конечная), затем 50 мкп титровали концентрированные (6 точек от 1 до 10 серий разведений) рекомбинантный 1Ь-13 РсргоЮсН (10-8 до 10-13 М конечная) или тестируемый цитокин-ТСК белка слияния (10-7 до 10-13 М конечная) в трех экземплярах лунок. Планшеты инкубировали при 37°С, 5% СО2 всю ночь.
ИФА 1Ε-1β.
Покрытые антителами 1Ь-1 β ИФА планшеты промывали трижды промывочным буфером и блокировали с 250 мкл РВ8/5% В8А/лунка в течение не менее 2 ч при комнатной температуре (или всю ночь при 4°С). ИФА планшеты промывали трижды в промывочном буфере и постукиванием высушивали. Стандартный ΣΠ-1β разводили в РВ8/1% В8А. Планшеты, содержащие клетки, центрифугировали при 1200 об/мин в течение 5 мин. Супернатант из каждой лунки переносили в предварительно покрытые 1Ь1β ИФА планшеты. 100 мкл клеточного супернатанта (разведенного 1 к 3 с РВ8/1% В8А) или стандарта добавляли в соответствующие лунки и добавляли 50 мкл идентифицирующего антитела/лунка (разведенные, согласно инструкциям набора). Планшет инкубировали в течение 2 ч при комнатной температуре. Планшеты промывали трижды в промывочном буфере. 100 мкл стрептавидин-НКР добавляли в каждую лунку (разведенные, согласно инструкциям набора) и планшеты инкубировали при комнатной температуре в течение 20 мин. Планшеты промывали трижды в промывочном буфере. 100 мкл готового ТМВ добавляли в каждую лунку и планшеты оставляли проявляться на 5-20 мин (в зависимости от уровня сигнала) в темноте (под пленкой). Реакцию останавливали добавлением 100 мкл/лунка 1М Н28О4.
Поглощение планшетов считывали на микропланшетном ридере при 450 нм и эталонном фильтре, установленном на 650 нм. Количество ингибирования в каждой точке титрования пересчитывали как процент образца, содержащего моноциты и ЬР8 без цитокин-ТСК белка слияния, который дает максимальный сигнал, таким образом производя кривую дозу-эффекта.
Результаты
Тестируемэя конструкция ЕС50 ЕС50
т-11.13 1.535е-10 9.534е-11
Фигура 15 С-концевое слияние 6.21е-10
Фигура 14 Ν-концееое слияние 1.493е-10
Эти результаты показывают, что Ν-слияние конструкции на фиг. 14, по меньшей мере, способно в 2 раза сильнее ингибровать продукцию ΣΠ-1β моноцитами человека, чем С-слияние конструкции на фиг. 15.

Claims (13)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Бифункциональная молекула, содержащая полипептидный партнер связывания, специфический для данного эпитопа рМНС, и полипептид иммунного эффектора, при этом Ν-конец рМНС партнера связывания связывается с С-концом полипептида иммунного эффектора, при условии, что вышеуказанный полипептидный партнер связывания не является Т-клеточным рецептором, содержащим альфа цепь 8ЕС ГО Νο:7 и бета цепь 8ЕС ГО Νο:9.
  2. 2. Бифункциональная молекула по п.1, отличающаяся тем, что рМНС партнер связывания представляет собой гетеродимерную αβ полипептидную пару ТСК, или одноцепочечный αβ полипептид ТСК, и Ν-конец α или β цепей гетеродимерной полипептидной пары ТСК, или Ν-конец 8сТСК полипептида, связывается с С-концом аминокислоты иммунного эффекторного полипептида.
  3. 3. Бифункциональная молекула по п.2, отличающаяся тем, что рМНС партнер связывания представляет собой гетеродимерную αβ полипептидную пару ТСК, в которой α и β каждого полипептида имеют вариабельную и константную области ТСК, но не имеют трансмембранной и цитоплазматической областей ТСК.
    - 11 020841
  4. 4. Бифункциональная молекула по п.3, отличающаяся тем, что константные области α и β полипептидов связаны дисульфидными мостиками между остатками цистеина, заменяющего ТгИ 48 экзона 1 ТЕАС1 и Зег 57 экзона 1 ТЕАС1 или ТЕАС2, или нативными дисульфидными связями между Сув4 экзона 2 ТЕАС1 и Сув2 экзона 2 ТЕАС1 или ТКЛС2.
  5. 5. Бифункциональная молекула по п.1, отличающаяся тем, что рМНС партнер связывания представляет собой одноцепочечный αβ полипептид ТСЕ.
  6. 6. Бифункциональная молекула по любому из предшествующих пунктов, отличающаяся тем, что иммунный эффекторный полипептид представляет собой антитело, которое специфически связывается с антигеном, презентированным Т-клеткой.
  7. 7. Бифункциональная молекула по п.6, отличающаяся тем, что антитело представляет собой веру антитело.
  8. 8. Бифункциональная молекула по п.6 или 7, отличающаяся тем, что антитело представляет собой аити-СГ)3 антитело.
  9. 9. Бифункциональная молекула по п.8, отличающаяся тем, что антитело представляет собой ОКТ3.
  10. 10. Бифункциональная молекула по п.8, отличающаяся тем, что антитело представляет собой ИСНТ-1.
  11. 11. Бифункциональная молекула по п.8, отличающаяся тем, что антитело представляет собой ВМА031.
  12. 12. Бифункциональная молекула по п.8, отличающаяся тем, что антитело представляет собой 12Р6.
  13. 13. Бифункциональная молекула по любому из предшествующих пунктов, отличающаяся тем, что эффекторный полипептид представляет собой цитокин, который модулирует иммуносупрессорную или иммуностимулирующую активность лимфоцитов.
EA201101660A 2009-05-20 2010-05-19 Бифункциональные полипептиды EA020841B1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GBGB0908613.3A GB0908613D0 (en) 2009-05-20 2009-05-20 T Cell Reseptors
PCT/GB2010/000988 WO2010133828A1 (en) 2009-05-20 2010-05-19 Bifunctional polypeptides

Publications (3)

Publication Number Publication Date
EA201101660A1 EA201101660A1 (ru) 2012-05-30
EA201101660A8 EA201101660A8 (ru) 2014-09-30
EA020841B1 true EA020841B1 (ru) 2015-02-27

Family

ID=40834242

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201101660A EA020841B1 (ru) 2009-05-20 2010-05-19 Бифункциональные полипептиды

Country Status (21)

Country Link
US (6) US10130721B2 (ru)
EP (3) EP3112377B1 (ru)
JP (4) JP5667171B2 (ru)
CN (1) CN102439034B (ru)
AU (1) AU2010250951B2 (ru)
BR (1) BRPI1013029A2 (ru)
CA (2) CA2762604C (ru)
CY (3) CY1118405T1 (ru)
DK (3) DK3112377T3 (ru)
EA (1) EA020841B1 (ru)
ES (3) ES2608653T3 (ru)
GB (1) GB0908613D0 (ru)
HR (3) HRP20170086T1 (ru)
HU (3) HUE032929T2 (ru)
LT (3) LT2432802T (ru)
MX (1) MX340168B (ru)
PL (3) PL3112377T3 (ru)
PT (3) PT2432802T (ru)
SI (3) SI2432802T1 (ru)
TR (2) TR201905437T4 (ru)
WO (1) WO2010133828A1 (ru)

Families Citing this family (96)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB0908613D0 (en) * 2009-05-20 2009-06-24 Immunocore Ltd T Cell Reseptors
WO2015089217A2 (en) 2013-12-10 2015-06-18 Bionz, Llc Methods of developing selective peptide antagonists
LT2665486T (lt) 2011-01-18 2020-04-10 Bioniz, Llc Kompozicijos, skirtos gama-c-citokino aktyvumui moduliuoti
PT2755997T (pt) * 2011-09-15 2018-10-30 Us Health Recetores de célula t que reconhecem mage restrito a hlaa1 ou hla-cw7
WO2013048243A1 (en) * 2011-09-29 2013-04-04 Apo-T B.V. Multi-specific binding molecules targeting aberrant cells
US20130273089A1 (en) 2011-11-03 2013-10-17 Tolera Therapeutics, Inc. Antibody and methods for selective inhibition of t-cell responses
US8524234B2 (en) 2011-11-03 2013-09-03 Tolera Therapeutics, Inc Antibody for selective inhibition of T-cell responses
EP2802356A1 (en) 2012-01-13 2014-11-19 Apo-T B.V. Aberrant cell-restricted immunoglobulins provided with a toxic moiety
GB201223172D0 (en) 2012-12-21 2013-02-06 Immunocore Ltd Method
GB201313377D0 (en) * 2013-07-26 2013-09-11 Adaptimmune Ltd T cell receptors
CN106164091A (zh) 2014-03-14 2016-11-23 英美偌科有限公司 Tcr文库
CA2955984A1 (en) 2014-07-22 2016-01-28 The University Of Notre Dame Du Lac Molecular constructs and uses thereof
JP6415716B2 (ja) 2014-11-07 2018-10-31 グアンドン シャンスエ ライフ サイエンス， リミテッド． 可溶性のヘテロ二量体ｔ細胞受容体およびその製法と使用
GB201516269D0 (en) 2015-09-15 2015-10-28 Adaptimmune Ltd And Immunocore Ltd TCR Libraries
GB201516265D0 (en) 2015-09-15 2015-10-28 Adaptimmune Ltd And Immunocore Ltd TCR Libraries
GB201516272D0 (en) 2015-09-15 2015-10-28 Adaptimmune Ltd And Immunocore Ltd TCR Libraries
GB201516270D0 (en) 2015-09-15 2015-10-28 Adaptimmune Ltd And Immunocore Ltd TCR Libraries
GB201516275D0 (en) 2015-09-15 2015-10-28 Adaptimmune Ltd And Immunocore Ltd TCR Libraries
GB201516277D0 (en) 2015-09-15 2015-10-28 Adaptimmune Ltd And Immunocore Ltd TCR libraries
GB201516274D0 (en) 2015-09-15 2015-10-28 Adaptimmune Ltd And Immunocore Ltd TCR Libraries
US11400134B2 (en) 2015-10-09 2022-08-02 Bioniz, Llc Modulating gamma-c-cytokine activity
GB201520583D0 (en) 2015-11-23 2016-01-06 Immunocore Ltd & Adaptimmune Ltd Peptides
GB201520548D0 (en) 2015-11-23 2016-01-06 Immunocore Ltd & Adaptimmune Ltd Peptides
GB201520595D0 (en) 2015-11-23 2016-01-06 Immunocore Ltd & Adaptimmune Ltd Peptides
GB201607535D0 (en) 2016-04-29 2016-06-15 Immunocore Ltd & Adaptimmune Ltd Peptides
GB201520562D0 (en) 2015-11-23 2016-01-06 Immunocore Ltd & Adaptimmune Ltd Peptides
GB201520543D0 (en) 2015-11-23 2016-01-06 Immunocore Ltd & Adaptimmune Ltd Peptides
GB201520597D0 (en) 2015-11-23 2016-01-06 Immunocore Ltd & Adaptimmune Ltd Peptides
GB201520559D0 (en) 2015-11-23 2016-01-06 Immunocore Ltd & Adaptimmune Ltd Peptides
WO2018083505A1 (en) 2016-11-07 2018-05-11 Immunocore Limited Peptides
GB201520539D0 (en) 2015-11-23 2016-01-06 Immunocore Ltd & Adaptimmune Ltd Peptides
GB201604468D0 (en) 2016-03-16 2016-04-27 Immunocore Ltd & Adaptimmune Ltd Peptides
GB201607534D0 (en) 2016-04-29 2016-06-15 Immunocore Ltd & Adaptimmune Ltd Peptides
GB201520575D0 (en) 2015-11-23 2016-01-06 Immunocore Ltd & Adaptimmune Ltd Peptides
GB201520589D0 (en) 2015-11-23 2016-01-06 Immunocore Ltd & Adaptimmune Ltd Peptides
WO2017089786A1 (en) 2015-11-23 2017-06-01 Immunocore Limited Peptides
GB201520567D0 (en) 2015-11-23 2016-01-06 Immunocore Ltd & Adaptimmune Ltd Peptides
GB201520536D0 (en) 2015-11-23 2016-01-06 Immunocore Ltd & Adaptimmune Ltd Peptides
GB201520542D0 (en) 2015-11-23 2016-01-06 Immunocore Ltd & Adaptimmune Ltd Peptides
GB201520550D0 (en) 2015-11-23 2016-01-06 Immunocore Ltd & Adaptimmune Ltd Peptides
GB201520546D0 (en) 2015-11-23 2016-01-06 Immunocore Ltd & Adaptimmune Ltd Peptides
GB201520563D0 (en) 2015-11-23 2016-01-06 Immunocore Ltd & Adaptimmune Ltd Peptides
GB201520545D0 (en) 2015-11-23 2016-01-06 Immunocore Ltd & Adaptimmune Ltd Peptides
GB201520558D0 (en) 2015-11-23 2016-01-06 Immunocore Ltd & Adaptimmune Ltd Peptides
GB201520603D0 (en) 2015-11-23 2016-01-06 Immunocore Ltd & Adaptimmune Ltd Peptides
GB201520565D0 (en) 2015-11-23 2016-01-06 Immunocore Ltd & Adaptimmune Ltd Peptides
GB201520592D0 (en) 2015-11-23 2016-01-06 Immunocore Ltd & Adaptimmune Ltd Peptides
GB201520579D0 (en) 2015-11-23 2016-01-06 Immunocore Ltd & Adaptimmune Ltd Peptides
GB201520568D0 (en) 2015-11-23 2016-01-06 Immunocore Ltd Peptides
GB201520566D0 (en) 2015-11-23 2016-01-06 Immunocore Ltd & Adaptimmune Ltd Peptides
GB201520557D0 (en) 2015-11-23 2016-01-06 Immunocore Ltd & Adaptimmune Ltd Peptides
GB201520541D0 (en) 2015-11-23 2016-01-06 Immunocore Ltd & Adaptimmune Ltd Peptides
GB201520544D0 (en) 2015-11-23 2016-01-06 Immunocore Ltd & Adaptimmune Ltd Peptides
GB201520570D0 (en) 2015-11-23 2016-01-06 Immunocore Ltd & Adaptimmune Ltd Peptides
GB201520564D0 (en) 2015-11-23 2016-01-06 Immunocore Ltd & Adaptimmune Ltd Peptides
GB201522592D0 (en) * 2015-12-22 2016-02-03 Immunocore Ltd T cell receptors
LT3430037T (lt) * 2016-03-16 2022-12-12 Immatics Biotechnologies Gmbh Transfekuotos t ląstelės ir t ląstelių receptoriai, skirti naudoti vėžio gydymui taikant imunoterapiją
GB201604953D0 (en) 2016-03-23 2016-05-04 Immunocore Ltd T cell receptors
ES2914648T3 (es) 2016-04-08 2022-06-15 Immunocore Ltd Receptores de células T
WO2017192536A1 (en) 2016-05-02 2017-11-09 University Of Kansas Eliminating mhc restriction from the t cell receptor as a strategy for immunotherapy
MX2018014863A (es) 2016-06-02 2019-09-11 Immunocore Ltd Régimen de dosificación para proteína de fusión de tcr especifico de gp100 - scfv anti - cd3.
WO2018081784A1 (en) * 2016-10-31 2018-05-03 H. Lee Moffitt Cancer Center And Research Institute, Inc. Artificial antigen presenting cells for expanding immune cells for immunotherapy
CN108203459A (zh) * 2016-12-19 2018-06-26 广东香雪精准医疗技术有限公司 源自于prame的肿瘤抗原短肽
GB201709866D0 (en) 2017-06-20 2017-08-02 Immunocore Ltd T cell receptors
CA3100253A1 (en) 2018-05-14 2019-11-21 Immunocore Limited Bifunctional binding polypeptides
GB201815041D0 (en) 2018-09-14 2018-10-31 Scancell Ltd Epitopes
KR20210116478A (ko) * 2019-01-14 2021-09-27 난징 레전드 바이오테크 씨오., 엘티디. 키메라 수용체 폴리펩티드 및 이의 용도
WO2020148372A1 (en) 2019-01-17 2020-07-23 Immunocore Limited Formulations
GB201901306D0 (en) 2019-01-30 2019-03-20 Immunocore Ltd Multi-domain binding molecules
GB201901305D0 (en) 2019-01-30 2019-03-20 Immunocore Ltd Specific binding molecules
CN113396230A (zh) 2019-02-08 2021-09-14 豪夫迈·罗氏有限公司 癌症的诊断和治疗方法
GB201902277D0 (en) 2019-02-19 2019-04-03 King S College London Therapeutic agents
CN113811549A (zh) 2019-02-21 2021-12-17 Xencor股份有限公司 非靶向和靶向性il-10 fc融合蛋白
CN113906140A (zh) 2019-03-18 2022-01-07 路德维格癌症研究院 A2/ny-eso-1特异性t细胞受体及其用途
GB201904328D0 (en) 2019-03-28 2019-05-15 Immunocore Ltd Specific binding molecules
WO2020227019A1 (en) 2019-05-03 2020-11-12 Bioniz, Llc Modulating the effects of gamma-c-cytokine signaling for the treatment of alopecia and alopecia associated disorders
GB201915282D0 (en) 2019-10-22 2019-12-04 Immunocore Ltd Specific binding molecules
GB202005779D0 (en) 2020-04-21 2020-06-03 Scancell Ltd Anti-tumour immune responses
GB202006629D0 (en) 2020-05-05 2020-06-17 Immunocore Ltd Specific binding molecules
GB202010329D0 (en) 2020-07-06 2020-08-19 Immunocore Ltd Specific binding molecules
EP4196612A1 (en) 2020-08-12 2023-06-21 Genentech, Inc. Diagnostic and therapeutic methods for cancer
WO2022184805A1 (en) 2021-03-03 2022-09-09 Immatics Biotechnologies Gmbh Antigen binding proteins specifically binding sars-cov-2 antigenic peptides in complex with a major histocompatibility complex protein
EP4113120A1 (en) 2021-06-28 2023-01-04 Immatics Biotechnologies GmbH Method of characterizing the binding characteristics between a peptide of interest and mhc molecules
US20230024554A1 (en) 2021-06-28 2023-01-26 Immatics Biotechnologies Gmbh Method of characterizing the binding characteristics between a peptide of interest and mhc molecules
US20240327491A1 (en) 2021-07-12 2024-10-03 Ludwig Institute For Cancer Research Ltd T cell receptors specific for tumor-associated antigens and methods of use thereof
CN115724988B (zh) * 2021-08-26 2023-11-17 瑅安生物医药（杭州）有限公司 一种接近天然分子的多肽融合分子
EP4198052A1 (en) 2021-12-15 2023-06-21 Eberhard Karls Universität Tübingen Medizinische Fakultät Peptides and antigen binding proteins for use in immunotherapy against fibrolamellar hepatocellular carcinoma (fl-hcc) and other cancers
AU2023222190A1 (en) 2022-02-20 2024-08-29 Immunocore Limited Hiv-specific binding molecules and tcr
WO2024038198A1 (en) 2022-08-18 2024-02-22 Immunocore Limited Multi-domain binding molecules
TW202417476A (zh) 2022-08-18 2024-05-01 英商英美偌科有限公司 Ｔ細胞受體及其融合蛋白
WO2024038183A1 (en) 2022-08-18 2024-02-22 Immunocore Limited Multi-domain binding molecules
WO2024038193A1 (en) 2022-08-18 2024-02-22 Immunocore Limited Multi-domain binding molecules
WO2024067821A1 (zh) * 2022-09-30 2024-04-04 瑅安生物医药（杭州）有限公司 一种修饰细胞及其用途
WO2024130179A1 (en) 2022-12-16 2024-06-20 Repertoire Immune Medicines, Inc. T cell receptors binding hpv-16 epitopes
WO2024146936A1 (en) 2023-01-06 2024-07-11 Immunocore Limited Binding molecules against a piwil1 peptide-hla complex
WO2024146951A1 (en) 2023-01-06 2024-07-11 Immunocore Limited Binding molecules against a prame peptide-hla complex

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1999060120A2 (en) * 1998-05-19 1999-11-25 Avidex Limited Soluble t cell receptor
WO2001093913A2 (en) * 2000-06-05 2001-12-13 Sunol Molecular Corporation T cell receptor fusions and conjugates and methods of use thereof
WO2003020763A2 (en) * 2001-08-31 2003-03-13 Avidex Limited Soluble t cell receptor
WO2004074322A1 (en) * 2003-02-22 2004-09-02 Avidex Ltd Modified soluble t cell receptor
US20040253632A1 (en) * 2000-05-25 2004-12-16 Sunol Molecular Corporation Modulation of T -cell receptor interactions
WO2005113595A2 (en) * 2004-05-19 2005-12-01 Avidex Ltd High affinity ny-eso t cell receptor
WO2006037960A2 (en) * 2004-10-01 2006-04-13 Avidex Ltd. T-cell receptors containing a non-native disulfide interchain bond linked to therapeutic agents

Family Cites Families (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1992022653A1 (en) * 1991-06-14 1992-12-23 Genentech, Inc. Method for making humanized antibodies
ES2293748T3 (es) * 1998-10-21 2008-03-16 Altor Bioscience Corporation Moleculas de fijacion poliespecificas y usos de las mismas.
US20030017134A1 (en) 2001-06-19 2003-01-23 Technion Research And Development Foundation Ltd. Methods and pharmaceutical compositions for immune deception, particularly useful in the treatment of cancer
CA2476625A1 (en) * 2002-02-20 2003-08-28 Dyax Corp. Mhc-peptide complex binding ligands
JP4436319B2 (ja) 2002-10-09 2010-03-24 メディジーン リミテッド 単鎖組換えｔ細胞レセプター
US20090042285A1 (en) 2004-05-27 2009-02-12 Weidanz Jon A Antibodies at T cell receptor mimics, methods of production and uses thereof
EP1773383B1 (en) 2004-05-27 2012-09-12 Jon A. Weidanz Antibodies as t cell receptor mimics, methods of production and uses thereof
EP1763365B1 (en) 2004-06-09 2016-08-10 Technion Research And Development Foundation, Ltd. Antibodies for selective apoptosis of cells
EP2527370A1 (en) * 2005-12-21 2012-11-28 Amgen Research (Munich) GmbH Compounds having resistance to soluble CEA
RU2008129827A (ru) * 2005-12-21 2010-01-27 МЕДИММЬЮН, ЭлЭлСи (US) МОЛЕКУЛЫ EphA2-BiTE И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ
GB0708585D0 (en) 2007-05-03 2007-06-13 Queen Mary & Westfield College Novel antibody and use in diagnosis and therapy of arthropathies
GB0816096D0 (en) 2008-09-04 2008-10-15 Medigene Ltd Diabetes t cell receptors
GB0908613D0 (en) 2009-05-20 2009-06-24 Immunocore Ltd T Cell Reseptors
GB0911566D0 (en) * 2009-07-03 2009-08-12 Immunocore Ltd T cell receptors

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1999060120A2 (en) * 1998-05-19 1999-11-25 Avidex Limited Soluble t cell receptor
US20040253632A1 (en) * 2000-05-25 2004-12-16 Sunol Molecular Corporation Modulation of T -cell receptor interactions
WO2001093913A2 (en) * 2000-06-05 2001-12-13 Sunol Molecular Corporation T cell receptor fusions and conjugates and methods of use thereof
WO2003020763A2 (en) * 2001-08-31 2003-03-13 Avidex Limited Soluble t cell receptor
WO2004074322A1 (en) * 2003-02-22 2004-09-02 Avidex Ltd Modified soluble t cell receptor
WO2005113595A2 (en) * 2004-05-19 2005-12-01 Avidex Ltd High affinity ny-eso t cell receptor
WO2006037960A2 (en) * 2004-10-01 2006-04-13 Avidex Ltd. T-cell receptors containing a non-native disulfide interchain bond linked to therapeutic agents

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BIBOLLET-RUCHE FREDERIC ET AL.: "The Quality of Chimpanzee T-Celi Activation and Simian Immunodeficiency Virus/Human Immunodeficiency Virus Susceptibility Achieved via Antibody-Mediated T-Cell Receptor/CD3 Stimulation Is a Function of the Anti-CD3 Antibody Isotype" JOURNAL OF VIROLOGY, vol. 82, no. 20, October 2008 (2008-10), pages 10271-10278, XP002600945 ISSN: 0022-538X * abstract page 10272, column 1, paragraph 4 *
LI BOHUA ET AL.: "Construction and characterization of a humanized anti-human CD3 monoclonal antibody 12F6 with effective immunoregulation functions" IMMUNOLOGY, vol. 116, no. 4, December 2005 (2005-12), pages 487-498, XP002600947 ISSN: 0019-2805 * abstract *
SCHLITT H. J. ET AL.: "DIFFERENT ACTIVATION STATES OF HUMAN LYMPHOCYTES AFTER ANTIBODY-MEDIATED STIMULATION VIA CD3 AND THE ALPHA-BETA T CELL RECEPTOR-SCANDINAVIAN JOURNAL OF IMMUNOLOGY, vol. 32, no. 6, 1990, pages 717-726, XP002600946 ISSN: 0300-9475 * abstract *

Also Published As

Publication number Publication date
BRPI1013029A2 (pt) 2016-04-05
CN102439034A (zh) 2012-05-02
US20190231895A1 (en) 2019-08-01
EA201101660A8 (ru) 2014-09-30
US10576162B2 (en) 2020-03-03
CA2762604A1 (en) 2010-11-25
ES2672095T3 (es) 2018-06-12
WO2010133828A1 (en) 2010-11-25
EP2432802B1 (en) 2016-11-02
ES2721058T3 (es) 2019-07-26
CY1120439T1 (el) 2019-07-10
US20190275165A1 (en) 2019-09-12
US10517960B2 (en) 2019-12-31
JP2012527439A (ja) 2012-11-08
US20190247512A1 (en) 2019-08-15
PL2432802T3 (pl) 2017-07-31
CA2968393A1 (en) 2010-11-25
US20190231896A1 (en) 2019-08-01
HRP20170086T1 (hr) 2017-06-02
US10130721B2 (en) 2018-11-20
PL3112376T3 (pl) 2019-07-31
SI2432802T1 (sl) 2017-01-31
US10420846B2 (en) 2019-09-24
US20230241238A1 (en) 2023-08-03
CN102439034B (zh) 2015-01-28
SI3112377T1 (en) 2018-06-29
CY1118405T1 (el) 2017-06-28
LT3112377T (lt) 2018-05-25
EA201101660A1 (ru) 2012-05-30
DK2432802T3 (en) 2017-02-13
AU2010250951A1 (en) 2011-12-08
MX2011012184A (es) 2012-03-26
ES2608653T3 (es) 2017-04-12
HRP20190674T1 (hr) 2019-08-09
LT2432802T (lt) 2017-01-10
PT3112376T (pt) 2019-05-20
DK3112377T3 (en) 2018-07-30
TR201905437T4 (tr) 2019-05-21
EP3112376B1 (en) 2019-01-23
CA2968393C (en) 2019-07-23
EP2432802A1 (en) 2012-03-28
JP2017110019A (ja) 2017-06-22
EP3112376A2 (en) 2017-01-04
EP3112376A3 (en) 2017-03-29
PL3112377T3 (pl) 2018-10-31
HRP20180757T1 (hr) 2018-07-27
HUE032929T2 (hu) 2017-11-28
DK3112376T3 (en) 2019-04-29
GB0908613D0 (en) 2009-06-24
US20120190828A1 (en) 2012-07-26
JP5667171B2 (ja) 2015-02-12
CY1121558T1 (el) 2020-05-29
EP3112377A1 (en) 2017-01-04
HUE038342T2 (hu) 2018-10-29
PT2432802T (pt) 2017-02-13
EP3112377B1 (en) 2018-04-18
HUE043245T2 (hu) 2019-08-28
TR201809945T4 (tr) 2018-08-27
PT3112377T (pt) 2018-07-13
LT3112376T (lt) 2019-05-10
MX340168B (es) 2016-06-29
AU2010250951B2 (en) 2015-04-30
JP2019172678A (ja) 2019-10-10
SI3112376T1 (sl) 2019-08-30
CA2762604C (en) 2018-01-16
JP2015096527A (ja) 2015-05-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA020841B1 (ru) Бифункциональные полипептиды
Rich et al. Survey of the 1999 surface plasmon resonance biosensor literature
Segal et al. The subclass specificity for the binding of murine myeloma proteins to macrophage and lymphocyte cell lines and to normal spleen cells
DE3854300T2 (de) Lymphocyteninhibierung durch hla-peptide.
Murakami et al. Characterization of C3a anaphylatoxin receptor on guinea-pig macrophages.
CN105504015B (zh) 一种mhc-i类限制性抗肿瘤ctl表位肽
Das et al. The main immunogenic region of the nicotinic acetylcholine receptor: interaction of monoclonal antibodies with synthetic peptides
Yamashita et al. A dimeric form of soluble recombinant sheep LFA-3 (CD58) inhibits human T-cell proliferation by generating regulatory T cells
JP3032822B1 (ja) 新規ペプチド、血圧降下剤および生理活性物質
Chun et al. Two different forms of human CTLA-4 proteins following peripheral T cell activation
La Manna et al. Triple-negative breast cancer: new potential therapeutics derived from SOCS3 protein
YAN MULTIVALENT MHC BLOCKERS TARGETING HLA-DQ2 ANTIGEN-PRESENTATION
COX et al. Production and characterization of monoclonal antibodies to fibrinogen

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM