ES2658342T3 - Tratamiento de tumores usando anticuerpos anti-L1 específicos - Google Patents

Tratamiento de tumores usando anticuerpos anti-L1 específicos Download PDF

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Abstract

Una molécula de unión capaz de unirse a L1, (a) siendo seleccionada del grupo que consiste en anticuerpos monocatenarios, scFv, multímeros de scFv como diacuerpos, triacuerpos o tetracuerpos, fragmentos de anticuerpos, Fab, Tandabs, Flexibodies, anticuerpos biespecíficos y anticuerpos quiméricos, y/o (b) que comprende al menos un dominio lg, y en el que la molécula de unión capaz de unirse a L1: (i) se caracteriza porque sus regiones determinantes de complementariedad (CDR) tienen las siguientes secuencias: LCDR1: RASQDISNYLN (SEQ ID No.: 24), LCDR2: YTSRLHS (SEQ ID No.: 25), LCDR3: QQGNTLPWT (SEQ ID No.: 26), HCDR1: RYWML (SEQ ID No.: 27), HCDR2: EINPRNDRTNYNEKFKT (SEQ ID No.: 28) y HCDR3: GGGYAMDY (SEQ ID No.: 29), y cuya molécula de unión se une a L1 con una afinidad (KD) de al menos 10-10 M, o (ii) se caracteriza porque sus regiones determinantes de complementariedad (CDR) tienen las siguientes secuencias: LCDR1: QDISNY (SEQ ID No.: 30), LCDR2: YTS, LCDR3: QQGNTLPWT (SEQ ID No.: 31), HCDR1: GYTFTRYW (SEQ ID No.: 32), HCDR2: INPRNDRT (SEQ ID No.: 33), y HCDR3: ALGGGYAMDY (SEQ ID No.: 34), y cuya molécula de unión se une a L1 con una afinidad (KD) de al menos 10-10 M.

Description

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dos tipos diferentes de anticuerpos contra dos antígenos diferentes (Kurokawa, T. et al., Biotechnology 7,1163 (1989)).
En una realización preferida de la invención, la molécula de unión de la invención está unida a una sustancia activa, preferiblemente una toxina, una nanopartícula, una citocina o un radionucléido. En la técnica se conocen tales conjugados de anticuerpo (Wu AM, Senter PD. Arming antibodies: prospects and challenges for immunoconjugates. Nature Biotechnol. 23:1137-1146, 2005, Pastan I, Hassan R, FitzGerald DJ, Kreitman RJ. Immunotoxin treatment of cancer. Annu. Rev. Med. 58:221-237, 2007, documentos WO 90/12592, WO 2007/030642, WO 2004/067038, WO 2004/003183, US 2005/0074426, WO 94/04189).
La molécula de unión de la invención se une a L1 con una afinidad (KD) de al menos 10-10 ó 10-11 M.
Preferiblemente, el anticuerpo no se une significativamente a otros miembros de la familia de proteínas de L1, tales como, por ejemplo, CHL1 (homólogo cercano de L1, número de registro NM_006614), NrCAM (proteína de adhesión a células neuronales, número de registro NM_001037132 o NM_005010) y/o NFASC (neurofascina, número de registro NM_015090). Preferiblemente, el anticuerpo se une a los otros miembros de la familia de L1 con una afinidad al menos 100 veces menor, más preferiblemente una afinidad al menos 1000 veces menor en comparación con la afinidad por L1. La afinidad del anticuerpo por las diferentes proteínas puede determinarse, por ejemplo, midiendo la afinidad de unión a proteínas recombinantes, tal como se describe en el ejemplo 6. La unión del anticuerpo a los diferentes miembros de la familia de L1 de la familia de L1 también puede determinarse expresando dichas proteínas en células CHO y midiendo la unión del anticuerpo mediante análisis de FACS, tal como se describe en el ejemplo 1.2 y el ejemplo 7.
Se describe que el anticuerpo no aumenta significativamente la liberación de citocinas, por ejemplo, el factor de necrosis tumoral-alfa o interferón gamma. Preferiblemente, la liberación no se aumenta en más del 30%, más preferiblemente no más del 20% y lo más preferiblemente no más del 10%. La liberación de citocinas puede someterse a prueba tal como se describe en el ejemplo 8. Alternativamente, la concentración de citocinas puede determinarse en la sangre de un animal antes y después de la administración del anticuerpo. La concentración de citocinas puede determinarse mediante un ensayo ELISA u otros métodos conocidos en la técnica.
Se describe que el anticuerpo no induce significativamente la proliferación de células T ni inhibe la proliferación de células T. El efecto de un anticuerpo sobre la proliferación de células T puede determinarse tal como se describe en el ejemplo 9.
Se da a conocer además una molécula de unión que puede unirse al mismo epítopo de L1 reconocido por el anticuerpo monoclonal 9.3, producido por la célula de hibridoma depositada como DSMZ ACC2841. Con respecto a esta molécula de unión dada a conocer, también se aplican a esta molécula de unión las mismas realizaciones definidas con respecto a la estructura de la molécula de unión descrita anteriormente.
Preferiblemente, la unión del anticuerpo al epítopo no se aumenta ni disminuye significativamente por el estado de glicosilación de la proteína L1. La influencia del estado de glicosilación sobre la unión del anticuerpo puede determinarse tal como se describe en el ejemplo 10.
Además, la descripción se refiere a una célula de hibridoma que produce el anticuerpo monoclonal.
Además, la descripción se refiere a la célula de hibridoma depositada como DSMZ ACC2841.
Tal como se explicó anteriormente y tal como se describe en la sección de ejemplos, el anticuerpo monoclonal descrito o la molécula de unión de la invención es especialmente adecuado para el tratamiento de enfermedades tumorogénicas.
Por tanto, en otro aspecto, la invención se refiere a la molécula de unión de la invención para su uso en un método de tratamiento de una enfermedad tumorogénica.
Además, la descripción también se refiere a un método para tratar una enfermedad tumorogénica, en el que un anticuerpo o molécula de unión se administra a un sujeto en una cantidad eficaz para tratar dicha enfermedad.
Tal como se mencionó anteriormente, en la técnica se ha sugerido el uso de anticuerpos anti-L1 para sensibilizar células tumorales para el tratamiento con un fármaco quimioterapéutico o con radioterapia (véase Sebens Müerkoster et al., Oncogene. 26 de abril de 2007; 26(19):2759-68, Epub 6 de noviembre de 2006). Por consiguiente, en otro aspecto, la presente invención se refiere a la molécula de unión de la invención para su uso en un método para sensibilizar células tumorales en un paciente para el tratamiento con un fármaco quimioterapéutico o con radioterapia.
Este aspecto de la presente invención es especialmente útil en casos en los que las células tumorales son al menos parcialmente resistentes a quimioterapia o a radioterapia.
Por tanto, en una realización preferida de la invención, las células que van a sensibilizarse son al menos parcialmente resistentes al tratamiento con dicho fármaco quimioterapéutico o a radioterapia.
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En el contexto de la presente invención, el término "sensibilizar" debe entenderse como que tras el tratamiento con la molécula de unión de la invención, las células tumorales son más sensibles al tratamiento con un fármaco quimioterapéutico o con radioterapia que antes de dicho tratamiento. Esto puede someterse a prueba, por ejemplo, aislando células tumorales del paciente y sometiéndolas a prueba in vitro para observar si el tratamiento con dicha molécula de unión de la invención da como resultado una sensibilización de las células. Esta prueba puede realizarse tal como se describe en la referencia (Sebens Müerkoster et al., Oncogene. 26 de abril de 2007; 26(19):2759-68, Epub 6 de noviembre de 2006).
En una realización preferida, las células, antes de la administración de la molécula de unión de la invención, no eran sensibles al tratamiento o sólo eran sensibles hasta un grado en que el tratamiento con un fármaco quimioterapéutico o con radioterapia no daba como resultado el efecto terapéutico deseado.
Preferiblemente, con la ayuda de la molécula de unión de la invención, se aumenta la sensibilidad en al menos el 20%, más preferiblemente en al menos el 40% e incluso más preferiblemente en al menos el 100%.
En Remmingtons Pharmaceutical Sciences, 5ª ed., capítulo 33, en particular las páginas 624 a 652, por ejemplo, se facilita un resumen de fármacos quimioterapéuticos y radioterapia.
Puede usarse cualquiera de los numerosos fármacos quimioterapéuticos en los usos de la invención. Estos compuestos se encuentran dentro de diversas categorías diferentes, incluyendo, por ejemplo, agentes alquilantes, antibióticos antineoplásicos, antimetabolitos y derivados de una fuente natural.
Los ejemplos de agentes alquilantes que pueden usarse en la invención incluyen busulfano, carboplatino, carmustina, clorambucilo, cisplatino, ciclofosfamida (es decir, Cytoxan), dacarbazina, ifosfamida, lomustina, mecloretamina, melfalán, procarbazina, estreptozocina y tiotepa.
Los ejemplos de antibióticos antineoplásicos incluyen bleomicina, dactinomicina, daunorubicina, doxorubicina, idarubicina, mitomicina (por ejemplo, mitomicina C), mitoxantrona, pentostatina y plicamicina.
Los ejemplos de antimetabolitos incluyen fluorodesoxiuridina, cladribina, citarabina, floxuridina, fludarabina, fluorouracilo (por ejemplo, 5-fluorouracilo (5FU)), gemcitabina, hidroxiurea, mercaptopurina, metotrexato y tioguanina.
Los ejemplos de derivados de una fuente natural incluyen docetaxel, etopósido, irinotecán, taxanos (por ejemplo, paclitaxel), tenipósido, topotecán, vinblastina, vincristina, vinorelbina, prednisona y tamoxifeno.
Ejemplos adicionales de agentes quimioterapéuticos que pueden usarse en la invención incluyen asparaginasa y mitotano.
Además, también puede usarse ceramida C2.
En una realización especialmente preferida, el fármaco quimioterapéutico se selecciona del grupo que consiste en actinomicina D, mitomicina C, cisplatino, doxorubicina, etopósido, verapamilo, podofilotoxina, 5-FU, taxanos tales como paclitaxel y carboplatino.
Según la invención, el término "radioterapia" se refiere a cada terapia con radiación que se usa comúnmente para tratar células tumorales. En una realización preferida, esta terapia incluye rayos γ, rayos X, microondas, radiación UV así como la administración directa de radioisótopos a células tumorales o cerca de éstas (braquiterapia).
Tal como se mencionó anteriormente, el objetivo de este aspecto de la invención es sensibilizar células tumorales para el tratamiento con un fármaco quimioterapéutico o con radioterapia. Por consiguiente, en una realización preferida, tras la sensibilización con la molécula de unión de la invención, al paciente se le trata adicionalmente con dicho fármaco quimioterapéutico o con dicha radioterapia.
En el contexto de la presente invención, se prevé sensibilizar células tumorales de cualquier tipo celular o tratar cualquier enfermedad tumorogénica. Preferiblemente, las células tumorales o la enfermedad tumorogénica son de un tipo seleccionado del grupo que consiste en astrocitoma, oligodendroglioma, meningioma, neurofibroma, glioblastoma, ependimoma, Schwannoma, neurofibrosarcoma, meduloblastoma, melanoma, cáncer de páncreas, carcinoma de próstata, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de mama, cáncer de pulmón, cáncer de ovarios, cáncer endometrial, cáncer renal, neuroblastomas, carcinomas de células escamosas, meduloblastomas, hepatoma, cáncer de colon y mesotelioma y carcinoma epidermoide.
Además, se prefiere que las células tumorales sean de un tumor epitelial o la enfermedad tumorogénica sea un tumor epitelial, preferiblemente en el que el tumor epitelial es cáncer de páncreas, cáncer de colon, cáncer de ovarios o cáncer endometrial.
En una descripción, el anticuerpo no induce efectos secundarios neuronales cuando se administra en una cantidad terapéuticamente eficaz.
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Tal como se mencionó anteriormente, la molécula de unión se usa para la preparación de una composición farmacéutica.
En general, las composiciones farmacéuticas de la presente invención comprenden una cantidad terapéuticamente eficaz de un producto terapéutico y un vehículo farmacéuticamente aceptable. En una realización específica, la expresión "farmacéuticamente aceptable" significa aprobado por una agencia reguladora del gobierno federal o estatal o mencionado en la Farmacopea de los Estados Unidos u otra farmacopea reconocida de manera general para su uso en animales, y más particularmente, en seres humanos. El término "vehículo" se refiere a un diluyente, adyuvante, excipiente o vehículo con el que se administra el producto terapéutico. Tales vehículos farmacéuticos pueden ser líquidos estériles, tales como agua y aceites, incluyendo los de origen de petróleo, animal, vegetal o sintético, incluyendo, pero sin limitarse a, aceite de cacahuete, aceite de semilla de soja, aceite mineral, aceite de sésamo y similares. El agua es un vehículo preferido cuando la composición farmacéutica se administra por vía oral. Solución salina y disolución acuosa de dextrosa son vehículos preferidos cuando la composición farmacéutica se administra por vía intravenosa. Preferiblemente se emplean soluciones salinas y disoluciones acuosas de dextrosa y glicerol como vehículos líquidos para disoluciones inyectables. Los excipientes farmacéuticos adecuados incluyen almidón, glucosa, lactosa, sacarosa, gelatina, malta, arroz, harina, yeso, gel de sílice, estearato de sodio, monoestearato de glicerol, talco, cloruro de sodio, leche desnatada en polvo, glicerol, propileno, glicol, agua, etanol y similares. La composición, si se desea, también puede contener cantidades minoritarias de agentes humectantes o emulsionantes, o agentes de tamponamiento del pH. Estas composiciones pueden adoptar la forma de disoluciones, suspensiones, emulsiones, comprimidos, pastillas, cápsulas, polvos, formulaciones de liberación sostenida y similares. La composición puede formularse como supositorio, con aglutinantes tradicionales y vehículos tales como triglicéridos. La formulación oral puede incluir vehículos convencionales tales como calidades farmacéuticas de manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina sódica, celulosa, carbonato de magnesio, etc. Se describen ejemplos de vehículos farmacéuticos adecuados en "Remington’s Pharmaceutical Sciences" de E.W. Martin. Tales composiciones contendrán una cantidad terapéuticamente eficaz del producto terapéutico, preferiblemente en forma purificada, junto con una cantidad adecuada del vehículo para proporciona la forma para la administración apropiada al paciente. La formulación debe ser adecuada para el modo de administración.
En una realización preferida, la composición se formula, según procedimientos de rutina, como una composición farmacéutica adaptada para la administración intravenosa a seres humanos. Normalmente, las composiciones para la administración intravenosa son disoluciones en tampón acuoso isotónico estéril. Cuando sea necesario, la composición también puede incluir un agente de solubilización y un anestésico local, tal como lidocaína, para aliviar el dolor en el sitio de la inyección. Generalmente, los componentes se suministran o bien por separado o bien mezclados juntos en forma de dosificación unitaria, por ejemplo, como un polvo liofilizado seco o concentrado libre de agua en un recipiente sellado herméticamente tal como una ampolla o sobre indicando la cantidad de agente activo. Cuando la composición va a administrase mediante infusión, puede dispensarse con una botella de infusión que contiene agua o solución salina de calidad farmacéutica estéril. Cuando la composición se administra mediante inyección, puede proporcionarse una ampolla de agua o solución salina estéril para inyección de manera que los componentes puedan mezclarse antes de la administración.
Los productos terapéuticos de la invención pueden formularse como formas neutras o de sal. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen aquéllas formadas con grupos carboxilo libres tales como aquéllas derivados de ácidos clorhídrico, fosfórico, acético, oxálico, tartárico, etc., aquéllas formadas con grupos amina libre tales como aquéllas derivadas de isopropilamina, trietilamina, 2-etilaminoetanol, histidina, procaína, etc., y aquéllas derivadas de hidróxidos de sodio, de potasio, de amonio, de calcio y férricos, etc.
La cantidad del producto terapéutico de la invención, que será eficaz en el tratamiento de un trastorno o estado particular, dependerá de la naturaleza del trastorno o estado, y puede determinarse mediante técnicas clínicas convencionales. Además, opcionalmente pueden emplearse ensayos in vitro para ayudar a identificar intervalos de dosificación óptimos. La dosis precisa que va a emplearse en la formulación también dependerá de la vía de administración, y la gravedad de la enfermedad o el trastorno, y debe decidirse según el criterio del médico y las circunstancias de cada paciente. Sin embargo, intervalos de dosificación adecuados para la administración intravenosa son, de manera general, de aproximadamente 20-500 microgramos de compuesto activo por kilogramo de peso corporal. Intervalos de dosificación adecuados para la administración intranasal son, de manera general, de aproximadamente 0,01 pg/kg de peso corporal a 1 mg/kg de peso corporal. Pueden extrapolarse dosis eficaces a partir de curvas de dosis-respuesta derivadas de sistemas de prueba en modelos in vitro o animales. En general, los supositorios pueden contener el principio activo en el intervalo del 0,5% al 10% en peso; las formulaciones orales contienen preferiblemente del 10% al 95% de principio activo.
Se conocen diversos sistemas de administración y pueden usarse para administrar un producto terapéutico de la invención, por ejemplo, encapsulación en liposomas, micropartículas y microcápsulas: uso de células recombinantes que pueden expresar el producto terapéutico, uso de endocitosis mediada por receptor (por ejemplo, Wu y Wu, 1987, J. Biol. Chem. 262:4429-4432); construcción de un ácido nucleico terapéutico como parte de un vector retroviral u otro vector, etc. Los métodos de introducción Incluyen, pero no se limitan a, vías intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, subcutánea, intranasal, epidural y oral. Los compuestos pueden administrarse mediante cualquier vía conveniente, por ejemplo mediante infusión, mediante inyección en bolo, mediante absorción a través de revestimientos epiteliales o mucocutáneos (por ejemplo, mucosa oral, rectal e
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intestinal, etc.), y pueden administrarse junto con otros agentes biológicamente activos. La administración puede ser sistémica o local. Además, puede ser deseable introducir las composiciones farmacéuticas de la invención en el sistema nervioso central mediante cualquier vía adecuada, incluyendo inyección intraventricular e intratecal; la inyección intraventricular puede facilitarse mediante un catéter intraventricular, por ejemplo, unido a un depósito, tal como un depósito Ommaya. También puede emplearse administración pulmonar, por ejemplo, mediante el uso de un inhalador o nebulizador y la formulación con un agente de aerosolización.
En una realización específica, puede ser deseable administrar las composiciones farmacéuticas de la invención localmente a la zona que necesita el tratamiento. Esto puede lograrse, por ejemplo, y no a modo de limitación, mediante infusión local durante una cirugía, aplicación tópica, por ejemplo, junto con un apósito para heridas tras la cirugía, mediante inyección, por medio de un catéter, por medio de un supositorio, o por medio de un Implante, siendo dicho implante de un material poroso, no poroso o gelatinoso, incluyendo membranas, tales como membranas sialásticas, o fibras. En una realización, la administración puede ser mediante inyección directa en el sitio (o sitio anterior) de un tumor maligno o tejido neoplásico o preneoplásico.
En otra realización, el producto terapéutico puede administrarse en una vesícula, en particular un liposoma (Langer, 1990, Science 249:1527-1533), más particular un liposoma catiónico (documento WO 98/40052).
En aún otra realización, el producto terapéutico puede administrarse mediante un sistema de liberación controlada. En una realización, puede usarse una bomba (Langer, citado anteriormente). En aún otra realización, un sistema de liberación controlada puede colocarse cerca de la diana terapéutica, requiriendo así sólo una fracción de la dosis sistémica.
También se da a conocer un método para sensibilizar células tumorales en un paciente para el tratamiento con un fármaco quimioterapéutico o con radioterapia, que comprende administrar al paciente una cantidad eficaz de un anticuerpo anti-L1 o molécula de unión. Todas las realizaciones descritas anteriormente también se aplican a este método.
A lo largo de toda la invención, la expresión "cantidad eficaz" significa que una molécula o compuesto dados se administran en una cantidad suficiente para obtener un efecto terapéutico deseado. En el caso en el que, a lo largo de toda la Invención, se administren dos compuestos en una cantidad eficaz terapéutica, esto incluye que uno o cada uno de los compuestos se administre en una cantidad inferior a la terapéutica, es decir que la cantidad de cada compuesto por sí misma no sea suficiente para proporcionar un efecto terapéutico, pero que la combinación de los compuestos dé como resultado el efecto terapéutico deseado. Sin embargo, también se incluye dentro de la presente invención que cada uno de los compuestos por sí mismo se administre en una cantidad terapéuticamente eficaz.
En otro aspecto de la invención, la invención se refiere a la molécula de unión de la invención para su uso en un método de tratamiento de células tumorales en un paciente tratado anteriormente con un fármaco quimioterapéutico
o con radioterapia.
Tal como se mencionó anteriormente, el tratamiento de células tumorales con anticuerpos anti-L1 ya se ha descrito en los documentos WO 02/04952 y WO 06/013051.
En el contexto de la presente invención, la expresión "tratado anteriormente" puede incluir pacientes que ya se han tratado con un fármaco quimioterapéutico o con radioterapia en el transcurso de un régimen separado que ha tenido lugar, por ejemplo, en el plazo de los últimos seis u ocho meses.
En el transcurso del tratamiento anti-tumoral con fármacos quimioterapéuticos o radioterapia, en la mayoría de los casos se observa que, tras una respuesta inicial del tumor a tal terapia (reducción de la masa tumoral o estabilización de la enfermedad), los tumores comienzan a progresar de nuevo. Habitualmente, tal progresión comienza semanas o meses tras tal terapia. Normalmente estos tumores son entonces resistentes a tratamientos adicionales con el fármaco quimioterapéutico aplicado anteriormente y se desean otras modalidades de tratamiento. Tal como se describió anteriormente, se ha encontrado que tales tumores resistentes expresan L1 y, por tanto, se convierten en una diana para anticuerpos anti-L1.
Por tanto, según esta realización de la invención, la expresión "tratado anteriormente" significa preferiblemente que el paciente recibió anteriormente tal tratamiento, tal tratamiento mostró un efecto inicial y, en el momento de la terapia con el anticuerpo anti-L1 o la molécula de unión, el tumor está progresando de nuevo.
Además, la expresión "tratado anteriormente" también puede observarse en un contexto en el que el anticuerpo L1 anti-L1 o la molécula de unión y el fármaco quimioterapéutico o la radioterapia se usan dentro del mismo régimen, lo que significa que los tratamientos se administran dentro de un calendario de tratamiento. En este contexto "en un calendario de tratamiento" significa que los tratamientos se aplican al mismo tiempo, uno tras otro o de manera intermitente, pero, al contrario que lo anterior, las distancias en el tiempo entre los tratamientos individuales son cortas (en el plazo de una semana o en el plazo de 2-4 días) y, si se observa éxito en un tratamiento, no se espera a la progresión tumoral antes de aplicarse el siguiente tratamiento.
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Preferiblemente, en este contexto, la invención incluye el caso en el que se trata a un paciente con un fármaco quimioterapéutico o con radioterapia y posteriormente, de manera preferible en el plazo de una semana o menos y más preferiblemente en el plazo de 2-4 días, se comienza un tratamiento con la molécula de unión de la invención. En una realización adicionalmente preferida, se llevan a cabo varios ciclos de quimioterapia o radioterapia por un lado y tratamiento con el anticuerpo anti-L1 o la molécula de unión, con intervalos preferiblemente de una semana o menos y más preferiblemente en el plazo de 2-4 días.
En una realización preferida, el paciente es, al menos, parcialmente resistente al tratamiento con dicho fármaco quimioterapéutico o con radioterapia, un efecto observado a menudo en el transcurso de dichos tipos de tratamiento (véase anteriormente).
En un aspecto adicional, la invención se refiere a una molécula de unión de la invención para su uso en un método de tratamiento de células tumorales en un paciente al menos parcialmente resistente a un tratamiento con un fármaco quimioterapéutico o con radioterapia dados.
En el contexto de la presente invención, la expresión "resistente al tratamiento" significa que la célula tumoral respectiva no reacciona al tratamiento con un fármaco quimioterapéutico o con radioterapia de manera completa. En vez de eso, con respecto a estas células tumorales, el tratamiento con dicho fármaco quimioterapéutico o radioterapia es más bien ineficaz o incluso no muestra efectos.
En un aspecto adicional de la invención, la invención se refiere a la molécula de unión de la invención para su uso en un método de tratamiento de una enfermedad tumorogénica, en el que la molécula de unión se administra en combinación con un fármaco quimioterapéutico o con radioterapia, preferiblemente en el que el fármaco quimioterapéutico o la radioterapia se administran antes que la molécula de unión de la invención.
Según la invención, la expresión "tratamiento de enfermedad tumorogénica" incluye tanto la destrucción de células tumorales, la reducción de la proliferación de células tumorales (por ejemplo en al menos el 30%, al menos el 50% o al menos el 90%) así como la inhibición completa de la proliferación de células tumorales. Además, esta expresión incluye la prevención de una enfermedad tumorogénica, por ejemplo, destruyendo células que pueden o son propensas a convertirse en células tumorales en el futuro así como la formación de metástasis.
Según la invención, la expresión "en combinación con" incluye cualquier administración combinada de la molécula de unión y el fármaco quimioterapéutico o la radioterapia. Esto puede incluir la aplicación simultánea de los fármacos
o la radioterapia o, preferiblemente, una administración separada. En el caso en el que se prevé una administración separada, preferiblemente se garantizará que no transcurrirá un periodo de tiempo significativo entre el momento de administración, de manera que la molécula de unión y el fármaco quimioterapéutico o la radioterapia todavía podrán ejercer un efecto ventajosamente combinado sobre la célula. En tales casos, se prefiere que se ponga en contacto la célula con ambos agentes en el plazo de aproximadamente una semana, preferiblemente en el plazo de aproximadamente 4 días, más preferiblemente en el plazo de aproximadamente 12-36 horas entre sí.
El fundamento tras este aspecto de la invención es que la administración de fármacos quimioterapéuticos o el tratamiento con radioterapia conducen a un aumento de la expresión de L1 sobre la superficie de las células tumorales que a su vez hace que las células tumorales sean una mejor diana para la molécula de unión.
Por tanto, este aspecto de la invención también abarca regímenes de tratamiento en los que se administra la molécula de unión en combinación con el fármaco quimioterapéutico o la radioterapia en diversos ciclos de tratamiento en los que cada ciclo puede estar separado por un periodo de tiempo sin tratamiento que puede durar, por ejemplo, dos semanas y en los que cada ciclo puede implicar la administración repetida de la molécula de unión y/o el fármaco quimioterapéutico o la radioterapia. Por ejemplo, tal ciclo de tratamiento puede abarcar el tratamiento con un fármaco quimioterapéutico o con radioterapia, seguido, por ejemplo, por aplicar dos veces la molécula de unión en el plazo 2 días.
A lo largo de toda la invención, el experto entenderá que la terapia individual que va a aplicarse dependerá, por ejemplo, de las condiciones físicas del paciente o de la gravedad de la enfermedad y, por tanto, tendrá que ajustarse en cada caso.
Especialmente en el transcurso de tales ciclos de tratamiento repetidos, también se prevé dentro de la presente invención que la molécula de unión se administre antes que el fármaco quimioterapéutico o la radioterapia.
También se da a conocer un método para tratar células tumorales en un paciente tratado anteriormente con un fármaco quimioterapéutico o con radioterapia, que comprende administrar al paciente una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo anti-L1 o la molécula de unión. Además, la descripción se refiere a un método para tratar células tumorales en un paciente, al menos, parcialmente resistente al tratamiento con un fármaco quimioterapéutico
o con radioterapia dados, que comprende administrar al paciente una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo anti-L1 o molécula de unión. Además, la descripción se refiere a un método para tratar células tumorales en un paciente, que comprende administrar al paciente una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo anti-L1
o la molécula de unión en combinación con un fármaco quimioterapéutico o con radioterapia. Además, la descripción
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usando reactivo de transfección Jet PEI®, tal como se describe. Tras 3 días, se purificaron los sobrenadantes usando SepharoseA y se analizaron mediante inmunotransferencla de tipo Western usando mAb L1-9.3.
Figura 7 Ensayo de adhesión homófila de células. (A) Se analizó la unión de células J558-L1 mediante microscopía de campo brillante. En este caso, se muestra un ejemplo de cada tratamiento. En el cuadro rojo se destaca el recubrimiento con L1-Fc (10 μg/ml) y en el cuadro negro se muestran ambos controles, fibronectina (10 μg/ml) y BSA. (B) El gráfico muestra la media + DE de células unidas tras el tratamiento con anticuerpo o control indicado.
Figura 8
En las figuras 8a y 8b, respectivamente, se proporcionan las secuencias de ADN de cadena ligera y cadena pesada de anticuerpo usadas para construir los anticuerpos humanizados. Figura 9 Secuencias de aminoácidos del scFv murino de L1_9.3 (a) y de los scFv humanizados de L1_9.3Hu (b) y L1_9.3Hu3
(c). Figura 10 Secuencias de ADN y de aminoácidos de las partes expresadas de constructos de scFv de L1_9.3 (a), L1-9.3Hu (b)
y L1_9.3Hu3 (c). Figura 11 Unión de los scFv de L1_9.3, L1-9.3Hu y L1_9.3Hu3 al antígeno de cáncer L1 humano. Las filas A, B y C están
recubiertas con L1 y las filas D, E y F están recubiertas con estreptavidina. El color azul en los pocillos indica la unión del scFv individual al L1 en la placa. La ausencia de color en las filas recubiertas con estreptavidina muestra que los anticuerpos de cadena sencilla se unen específicamente a L1.
Figura 12 Secuencias genómicas de los dominios variables del anticuerpo monoclonal 9.3.
a) Secuencia de la región variable de cadena kappa (líneas de puntos: CDR1, líneas discontinuas: CDR2, subrayado: CDR3). b) Secuencia de la región variable de cadena pesada (líneas de puntos: CDR1, líneas discontinuas: CDR2,
subrayado: CDR3). Figura 13
A) Se Incubaron PBMC y células tumorales OVMZ positivas para L1 humanas con mAb L1-9.3 durante 24 h y se determinó la cantidad de anticuerpo unido mediante análisis de FACS. B) Se estimaron las constantes de disociación KD a partir de las curvas de regresión usando la
concentración a la mitad de la unión máxima. Figura 14 L1-9.3 no tiene ningún efecto sobre la liberación de citocinas por PBMC humanas en reposo y activadas. Se
determinaron los niveles de citocinas de PBMC en reposo y activadas por OKT3 a partir de tres donantes diferentes tras una incubación durante 24 h en presencia o ausencia de L1-9.3 a 20 μg/ml. Se usaron ionomicina/PMA y LPS como controles de estimulación. Se muestran los resultados para IFN-γ (A) y TNF-α (B).
Figura 15 L1-9.3 no induce la proliferación de células T y no tiene ningún efecto sobre la proliferación de células T inducida por OKT3. Se determinó la proliferación de PBMC activadas por OKT3 a partir de dos donantes diferentes en presencia
o ausencia de L1-9.3 a 20 μg/ml usando un ensayo de incorporación de BrdU 48 h tras la estimulación. No hubo diferencia en si el anticuerpo se añadió antes de, en paralelo con o tras la estimulación con OKT3 a 75 ng/ml. L1-9.3 por sí mismo no dio como resultado la activación de células T.
Figura 16
L1-9-3 no se vio afectado por la desglicosilación de L1. Se muestra la tinción de inmunotransferencia de tipo Western de L1 en lisado celular no tratado y desglicosilado usando varios mAb anti-L1 diferentes. Los anticuerpos sometidos a prueba pueden dividirse en tres clases con respecto a su dependencia de la glicosilación: primera clase
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(no afectada por la glicosilación): L1-9.3. Segunda clase (la unión en WB se vio afectada de manera negativa por la desglicosilación): 11A, 14.10, OV52.24 y OV549.20. Tercera clase (la unión en WB se vio afectada de manera positiva por la desglicosilación): 35.9 y 38.12.
Figura 17
La figura muestra la unión in vivo de L1-9.3 aplicado por vía intravenosa a túbulos colectores del riñón. La unión in vivo sólo fue detectable usando el sistema de amplificación de CSA (figura 17A), mientras que usando el método de ABC convencional no podía verse ninguna señal (figura 17B). Por tanto, se detectó L1-9.3 en un intervalo de 30-300 pmol en el tejido (se supone que la concentración de L1-9.3 es superior a 5 ng/ml e inferior a 50 ng/ml). El control negativo no mostró tinción, por tanto, puede descartarse la tinción no específica (figura 17C). El patrón de tinción del L1-9.3 unido in vivo (figura 17A) corresponde al patrón de expresión de L1 en el riñón cuando se tiñen directamente secciones de tejido con L1-9.3 (figura 17D).
Figura 18
Análisis de FACS de mAb L1-9.3 humanizados
Análisis de citometría de flujo de células SKOV3ip con pcDNA3.1-luciferasa. Se tiñeron las células con los mAb humanizados indicados (10 μg/ml) durante 30 min, 4°C, seguido por un mAb conjugado con PE secundario.
Figura 19
Modelo de xenoinjerto de SKOV3ip de ratón
Se inyectaron por vía intraperitoneal 7*106 células SKOV3ip con pcDNA3.1-luciferasa en ratones CD1 nu/nu hembra de 6 semanas de edad. Tras 24 h se aleatorizaron los ratones en grupos de 10 ratones. A cada grupo de ratones se le inyectó por vía intraperitoneal tres veces por semana 300 μg de o bien mAb L1-chi9.3, o bien mAb L1-hu3 o bien PBS.
En el día 33 se obtuvieron imágenes de los ratones (figura 2). Se determinó el volumen tumoral usando el sistema XENOGEN IVIS 200. En resumen, se anestesió a los ratones y se les inyectaron por vía intraperitoneal 100 μl de luciferina D (3 μg/ratón). Tras esto, se midió la actividad luciferasa de las células tumorales detectando la emisión de luz. El volumen tumoral se muestra como fotones por segundo (flujo total). Se realizó el análisis estadístico usando la prueba de la t de Student.
Figura 20
Masa tumoral total in vivo
Tras 36 días se sacrificaron los ratones y se determinó la masa tumoral. El crecimiento tumoral se facilita como una razón de la masa tumoral con respecto al peso corporal. (A ratones individuales, B valor medio). Se realizó el análisis estadístico usando la prueba de la t de Student. Por tanto, el tratamiento de ratones inmunodeficientes con anticuerpo L1 9.3 pudo reproducirse con formas quimerizadas y humanizadas del mAb L1 9.3.
Figura 21
Las células PT45-P1res o bien se dejaron sin tratar (sin) o bien se trataron con gemcitabina a 20 μg/ml (A) o etopósido (B) en ausencia (sin) o presencia de o bien anticuerpo 9.3 anti-L1CAM a 1 ó 10 μg/ml o bien anticuerpo de control de isotipo coincidente a 1 ó 10 μg/ml. Tras 24 horas, se analizaron las células mediante ensayo de caspasa3/-7. Se muestran las medias ± DE de tres experimentos independientes. * indica p< 0,05.
Figura 22
Las células Colo357 o bien se dejaron sin tratar (sin) o bien se trataron con gemcitabina a 20 μg/ml (A) o etopósido
(B) en ausencia (sin) o presencia de o bien anticuerpo 9.3 anti-L1CAM a 1 ó 10 μg/ml o bien anticuerpo de control de isotipo coincidente a 1 ó 10 μg/ml. Tras 24 horas, se analizaron las células mediante ensayo de caspasa-3/-7. Se muestran las medias ± DE de tres experimentos independientes. * indica p < 0,05.
Tabla 1
La tabla muestra un resumen de los anticuerpos sometidos a prueba en los ensayos indicados.
EJEMPLOS
1. Ejemplo 1
1.1 Resumen del ejemplo 1
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La molécula de adhesión L1 (L1-CAM) es una molécula de adhesión celular transmembrana implicada en la migración celular y orientación de axones en el sistema nervioso en desarrollo. L1 también se sobreexpresa en carcinomas de ovarios y endometriales. En este caso la expresión de L1 está asociada con un mal pronóstico. En líneas celulares de carcinoma, la sobreexpresión de L1 aumenta la motilidad celular, el crecimiento tumoral en ratones e induce la expresión de genes dependientes de Erk. En este caso, se muestra que el tratamiento con anticuerpos frente a L1 suprime la activación de Erk, bloquea la invasión de células a Matrigel y disminuye el crecimiento tumoral en ratones desnudos. En células tratadas con anticuerpos contra L1 la inducción de genes dependientes de Erk, tales como HOX A9, β3-integrina e IER 3 se invierte in vitro e in vivo. En este informe, se demuestra que el anticuerpo L1-9.3 es el mejor anticuerpo terapéutico de todos los anticuerpos contra L1 sometidos a prueba. En todos los casos, L1-9.3 mostró los mejores resultados referentes al fenotipo invasivo o al efecto terapéutico sobre el crecimiento tumoral. Pudo mostrarse que L1-9.3 se une al primer dominio similar a Ig de L1 y puede bloquear la unión homófila L1-L1. El bloqueo de la unión homófila sólo se observó con L1-9.3. Se concluye que L1-9.3 es superior en la terapia ya que combina dos funciones: bloquea la activación de erk e interfiere con la función de unión de L1.
1.2 Resultados del ejemplo 1
1.2.1 Análisis de FACS de los nuevos anticuerpos contra L1
Usando inmunización con una proteína de fusión L1-Fc recombinante, se generaron anticuerpos contra L1 novedosos L1-9.3, L1-14.10, L1-35.9 y L1-38.12. Para esclarecer la especificidad por L1 se sometieron a prueba los nuevos mAb contra L1 estos anticuerpos en las líneas celulares de carcinoma de ovarios que expresan L1 endógena OVMz y SKOV3ip y las células de ovarlo de hámster chino CHO y se transdujeron de manera estable células CHO-L1 mediante tinción fluorescente (figura 1A) y análisis mediante inmunotransferencia de tipo Western (figura 1B). Todos los anticuerpos sometidos a prueba mostraron una tinción positiva de L1 en células CHO-L1 (figura 1A). El patrón de tinción para las células OVMz y SKOV3ip fue diferente para los anticuerpos. De manera interesante, el anticuerpo L1-9.3 mostró una tinción brillante de ambas líneas celulares de carcinoma de ovarios OVMz y SKOV3ip, mientras que L1-14.10 mostró una tinción muy débil (figura 1A). Ninguno de los dos anticuerpos contra L1, L1-35.9 y L1-38.12, pudo unirse a la L1 endógena de estas células (figura 1A). Tal como se esperaba, no pudo observarse ninguna tinción para L1 en células CHO que se usaron como control negativo. Todos los nuevos anticuerpos detectaron L1 de longitud completa en lisados de células CHO-L1, OVMz y SKOV3ip mediante análisis mediante inmunotransferencia de tipo Western. Las células CHO negativas para L1 sirvieron de nuevo como control negativo.
1.2.2 La fosforilación de Erk disminuye tras el tratamiento con anticuerpos
Un informe reciente ha mostrado que la expresión de L1 en colaboración con factores de crecimiento derivados de suero condujo a una activación de Erk sostenida y la inducción de genes dependientes de Erk (Silletti et al, 2004). Se investigó si el efecto supresor de anticuerpos contra L1 podía deberse a interferencia con la regulación génica mediada por L1. Por tanto, se examinó el modo de acción de anticuerpos contra L1 usando células SKOV3ip. Los mAb L1-11A, L1-9.3 y L1-14.10 bloquearon eficazmente la fosforilación de Erk (figura 2A) in vitro. No hubo ninguna inhibición con mAb de control de isotipo coincidente, DMSO como vehículo o el anticuerpo contra L1, L1-38.12 (figura 2A) que sólo puede unirse a la isoforma neuronal de L1. El análisis fluorescente con el anticuerpo contra Erk específico de fosfo confirmó una clara reducción de Erk activado. También pudo observarse un agotamiento a partir del núcleo en células tratadas con mAb contra L1 (L1-11A, L1-9.3 y L1-14.10) (figura 2B).
1.2.3 El tratamiento con anticuerpos contra L1 redujo la invasión de células
Anteriormente se demostró que el tratamiento con un anticuerpo frente a L1 (L1-11A) redujo la migración celular haptotáctica sobre fibronectina y la invasión de Matrigel de diferentes líneas celulares (Arlt et al, 2006). Se comparó la capacidad de invasión de células SKOV3ip tratadas con los diferentes anticuerpos contra L1. Los anticuerpos L111A, L1-14.10 y especialmente L1-9.3 redujeron la invasión de SKOV3ip (figura 3). En marcado contraste, las células tratadas con los anticuerpos L1-35.9 o L1-38.12 no mostraron una reducción de la invasión (figura 3).
1.2.4 Los anticuerpos frente a L1 afectan a la expresión génica in vitro e in vivo
Se examinó adicionalmente si los anticuerpos frente a L1 afectaban al perfil de expresión génica en células SKOV3ip in vitro de una manera similar a la observada para el agotamiento mediado por ARNip de L1 (figura 4A). De hecho, el análisis mediante qRT-PCR de células tratadas con L1-9.3 o L1-11A frente a anticuerpo de control mostró cambios significativos en la expresión de genes regulados por L1 tales como β 3-integrina, los factores de transcripción HOXA9 y los genes relacionados con la apoptosis IER 3 y STK 39 (figura 4A). El mismo conjunto de genes se reguló por disminución en células SKOV3ip transducidas con un ARNip específico de L1 (figura 4B).
Se sometió a prueba si el mAb L1-9.3 también podía influir sobre el perfil de expresión génica de células SKOV3ip in vivo de manera similar a lo observado in vitro. Para ello, se aislaron ARNm de tumores residuales de ratones tratados con L1-9.3 o ratones tratados con control de IgG y se sometieron a análisis mediante qRT-PCR. El tratamiento con L1-9.3 condujo a una regulación significativa de genes dependientes de L1 tal como se demuestra para HOXA9, β3-integrina e IER 3 (figura 4C).
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1.2.5 Análisis de la tumorigenicidad en ratones desnudos
A continuación, se investigó si el crecimiento intraperitoneal de SKOV3ip en ratones podía inhibirse mediante tratamiento con los mAb L1-11A, L1-9.3 o L1-14.10. Se inyectaron células SKOV3ip-lacZ en la cavidad peritoneal de ratones desnudos hembra 2 días antes del comienzo de la terapia. De manera bisemanal, se realizaron tratamientos
i.p. usando la concentración de anticuerpo de 10 mg/kg. Se trataron ratones control con PBS o HEA125 (anticuerpo anti EpCAM) como anticuerpo de control (10 mg/kg i.p. de manera bisemanal). En todos los grupos de tratamiento con mAb anti-L1, pudo observarse una disminución sustancial en la cantidad de masa tumoral en comparación con PBS o el anticuerpo de control HEA-125 (figura 5). En comparación con el control, todos los mAb anti-L1 condujeron a una reducción dependiente de la dosis de la carga tumoral i.p. [L1-11A (10 mg/kg), -40%; L1-14.10 (10 mg/kg), 30%; L1-9.3 (10 mg/kg), -60%; figura 5]. La reducción del tumor en el grupo tratado con L1-9.3 (10 mg/kg) fue estadísticamente significativa (PL1-9.3 (10 mg/kg) = 0,004) en comparación con el control de PBS. Los ratones tratados con el anticuerpo de control HEA125 no revelaron ninguna reducción detectable de la carga tumoral i.p. de SKOV3ip-lacZ en comparación con el grupo tratado con PBS (figura 5), aunque EpCAM está presente en las células SKOV3ip y HEA125 puede unirse a las células tumorales. No se observaron efectos secundarios ni toxicidad grave del tratamiento con mAb contra L1, L1-11A, L1-9.3 o L1-14.10, durante todo el transcurso del tratamiento.
Por tanto, el tratamiento con anticuerpos frente a L1 redujo el crecimiento tumoral de células SKOV3ip (figura 5) lo que sugiere que los anticuerpos frente a L1 pueden regular la expresión génica pero también afectar in vivo al crecimiento tumoral.
1.2.6 Estudio de Biacore de los nuevos anticuerpos contra L1
Este estudio lo realizó Avidex (Oxford) tal como se describe en el ejemplo 6. La tabla 1 resume estos resultados referentes a la cinética de unión de los nuevos anticuerpos contra L1 (ka, kd y KD).
1.2.7 Mapeo de epítopos del sitio de unión de L1-9.3
Un factor importante para la caracterización de anticuerpos contra L1 novedosos es examinar sus sitios de unión en L1. Por tanto, se construyó una variedad de proteínas de fusión L1-Fc que cubrían diferentes partes de la molécula. Se amplificaron los productos de PCR que codificaban para diferentes longitudes de regiones de ectodominio de L1. Se clonaron estos constructos en el vector plg, y se expresaron como proteínas de fusión de Fe. Tras la purificación, se usaron los productos para el análisis mediante inmunotransferencia de tipo Western. Para comparar los resultados, se analizaron otros fragmentos de proteína L1 recombinante (obtenidos de Ricardo Gouveia, Oeiras, Portugal). Se encontró que L1-9.3 se unía al primer dominio de Ig de L1 (figura 6). L1-14.10 se une al tercer dominio de Ig mientras que L1-11A se une entre el sitio FN3-5 (figura 6).
1.2.8 mAB L1-9.3 bloquea la unión homófila L1-L1
Se planteó la cuestión de si los anticuerpos contra L1 podían interferir con la función de unión homófila de L1. Para tratar esta cuestión, se usó un ensayo de adhesión celular en el que se dejó que células transfectadas con L1 se unieran a L1 inmovilizada. Tras un recubrimiento Inicial de portaobjetos de vidrio con una proteína de fusión L1-Fc recombinante, fibronectina para control positivo (a la que se unen las células de una manera dependiente de integrina) o BSA como control negativo, se incubaron células J558-L1 con anticuerpo L1-11A, L1-9.3 o L1-14.10. Para el control, se usó un control de IgG, PBS o un anticuerpo frente a CD24 (SWA11). El mAb L1-9.3 podía bloquear completamente la unión homófila L1-L1, mientras que ninguno de los demás anticuerpos sometidos a prueba pudo interferir con la capacidad de unión homófila. Ninguno de los anticuerpos interfirió con la unión a fibronectina (datos no mostrados).
1.3 Materiales y métodos
1.3.1 Líneas celulares y cultivo celular
Se hicieron crecer las líneas celulares de carcinoma de ovarios humanas SKOV3ip (amablemente proporcionada por Ellen Vitetta, University of Texas, Dallas, TX) y OVMz en DMEM (Biochrom, Berlín, Alemania) con FCS al 10% en condiciones de cultivo celular (CO2 al 5%, humedad relativa al 95%, 37°C). Para la identificación y cuantificación de la masa tumoral, se transdujeron las células SKOV3ip de manera estable con un vector retroviral que codificaba para lacZ (sistema retroviral GeneSuppressor, Biocarta, Hamburgo, Alemania). Se estableció la línea celular de ovario de hámster chino CHO que expresa de manera estable L1 humana (-hL1) mediante transfección con Superfect (Stratagene, Heidelberg, Alemania) y selección para determinar la expresión de L1 con mAb L1-11A y perlas magnéticas (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Alemania) o clasificación con un instrumento FACS Calibur. Se cultivaron todas las células en DMEM complementado con FCS al 10% a 37°C, CO2 al 5% y humedad del 100%. Se obtuvieron plásmidos que codificaban para L1 humana y células J558-L1 del Dr. Vanee Lemmon (University of Miami, Miami, FL, EE.UU.).
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scFv Par de cebadores
L1_9.3
Yol811 y Yol812
L1-9.3Hu
Yol813 y Yol814
L1_9.3Hu3
Yol813 y Yol814
A continuación se muestran las secuencias de cebadores.
Yol811 AGCCGGCCATGGCCGATATTCAGATGACCCAGAC
Yol812 TCTATGCAGCGGCGGCACCGCCGCTGCTCACGGTAACGCTG
Yol813 AGCCGGCCATGGCCGATATTCAGATGACCCAGAG
Yol814 TCTATGCAGCGGCCGCACCGCCGCTGCTCACGGTAACCAGGGTG
Se corrieron los productos de PCR en un gel de agarosa al 1,6% y se escindieron y purificaron las bandas de tamaño correcto. Se sometieron los productos de PCR a digestión doble con enzimas de restricción Nco1 y Not1 en condiciones convencionales seguido por nueva purificación. Se ligaron los productos de PCR en un vector de expresión periplasmática inducible por IPTG que contenía:
-una secuencia líder pelB para dirigir los polipéptidos codificados al periplasma en el que entonces se escinde esta secuencia líder
-sitios de clonación Nco1/Not1
-la región constante de cadena kappa de anticuerpo humano.
Se transformaron los vectores ligados en células de E. coli TG1 y se sembraron en placas sobre 2xTY agar (Bacto triptona 16 g/l, extracto de levadura 10 g/l, Bacto agar 15 g/l y NaCl 5 g/l) complementado con ampicilina 100 μg/ml y glucosa al 2%. En las figuras 10a, 10b y 10c, respectivamente, se muestran las secuencias de ADN y de aminoácidos de las porciones expresadas de constructos de scFv de L1_9.3, L1-9.3Hu y L1_9.3Hu3.
4. Ejemplo 4
Expresión de anticuerpos de cadena sencilla L1_9.3, L1-9.3Hu y L1_9.3Hu3 en E. coli
Los polipéptidos expresados por estos vectores incluyen la región constante c kappa de anticuerpo humano fusionada con los extremos C-terminales de los scFv. Estos constructos que contienen cadena constante c kappa se denominan en el presente documento anticuerpos de cadena sencilla.
Se escogieron ocho clones de E. coli por cada constructo de anticuerpo de cadena sencilla, L1_9.3, L1_9.3Hu y L1_9Hu3, (24 clones en total) en pocillos separados de una placa de 96 pocillos que contenía 300 μl de 2xTY (Bacto triptona 16 g/l, extracto de levadura 10 g/l y NaCl 5 g/l) complementado con ampicilina 100 μg/ml y glucosa al 2%. Cada pocillo tenía un volumen de 1 ml. Se hicieron crecer los cultivos con agitación (200 rpm) a 37°C hasta que los cultivos alcanzaron una DO600 de aproximadamente 0,5. Entonces se centrifugaron las placas de 96 pocillos a 3200 rpm durante 10 min y se aspiró el sobrenadante y se descartó. Se resuspendieron los sedimentos bacterianos en 400 μl de 2XTY nuevo complementado con ampicilina 100 μg/ml e IPTG 1 mM para inducir la expresión de los anticuerpos de cadena sencilla. Se agitaron los cultivos a 200 rpm durante la noche a 25°C.
Al día siguiente se centrifugó la placa de 96 pocillos a 3200 rpm durante 10 min para sedimentar las células. Se conservó el sobrenadante que contenía los anticuerpos de cadena sencilla contra L1 expresados para el análisis mediante ELISA.
5. Ejemplo 5
Ensayo ELISA de unión de los scFv de L1_9.3, L1-9.3Hu y L1_9.3Hu3 a antígeno de cáncer L1 humano
Se llevó a cabo este ensayo ELISA con el fin de confirmar que el procedimiento de humanización no había conducido a una pérdida de unión de anticuerpo al antígeno de cáncer L1 y para identificar cuáles de los clones escogidos expresaban correctamente los constructos de anticuerpo de cadena sencilla.
Se recubrieron tres filas de una placa de 96 pocillos con 100 μl de antígeno L1 que comprendía el dominio extracelular de la proteína L1 fusionado con un fragmento Fc (5 μg/ml) en PBS durante 1 h a temperatura ambiente. Se recubrieron tres filas adicionales con estreptavidina (5 μg/ml) en PBS como control.
Se lavaron los pocillos tres veces con 370 μl de PBS y se bloquearon con leche en polvo al 3% en PBS durante 1 h a temperatura ambiente.
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Se mezclaron 50 μl de cada sobrenadante bacteriano durante la noche con 50 μl de leche en polvo al 6% en PBS durante 1 hora.
Se lavó la placa de ELISA bloqueada dos veces con PBS, tal como se describió anteriormente, y se añadieron los sobrenadantes bloqueados que contenían el anticuerpo de cadena sencilla y se incubaron durante 1 h a temperatura ambiente.
Se lavó la placa de 96 pocillos cuatro veces con PBS/tween al 0,1% seguido por la adición de 100 μl de una dilución de 1:5000 de conjugado de HRP y anticuerpo unido y libre a cadenas ligeras kappa anti-humanas (Sigma A7164) en PBS/BSA al 1%. Se incubó el conjugado durante 1 h a temperatura ambiente seguido por cinco lavados con PBS/tween al 0,1%.
Se reveló el ensayo ELISA mediante la adición de kit de sustrato de peroxidasa para micropocillos de 2 componentes TMB (Kirkegaard and Perry Laboratories Inc., EE.UU.) según el protocolo del fabricante. En la figura 4 se muestra una imagen de la placa de ELISA. Se observaron al menos cuatro clones de unión a L1 para cada una de las tres versiones de anticuerpo de cadena sencilla. Estos clones de anticuerpo de cadena sencilla de unión a L1 no se unen a estreptavidina.
La figura 11 muestra la unión de los scFv de L1_9.3, L1-9.3Hu y L1_9.3Hu3 al antígeno de cáncer L1 humano. Se recubren las filas A, B y C con L1 y se recubren las D, E y F con estreptavidina. El color azul en los pocillos indica unión del scFv individual al L1 en la placa. La ausencia de color en las filas recubiertas con estreptavidina muestra que los anticuerpos de cadena sencilla se unen específicamente a L1.
6. Ejemplo 6
Determinación de la afinidad de unión
Se sometieron a ensayo anticuerpo de ratón L1-9.3 y anticuerpo humanizado L1-hu3 mediante análisis Biacore (Biacore AB, Uppsala, Suecia) para determinar la cinética de unión.
Se activó un chip sensor CM5 de BIAcore con EDC/NHS y se acopló fragmento extracelular de L1-Fc recombinante purificado (515 μg/ml en PBS) al chip sensor CM5 a entre 200 y 3000 UR. Se bloquearon los sitios activos restantes mediante etanolamina/HCI. Se midió la unión de anticuerpo añadiendo anticuerpo a concentraciones de desde 6 hasta 3333 nM a una velocidad de flujo de 10 ul/min usando la función Kinject. Se regeneró el chip con glicina 10 mM, pH 2,0 con NaCl 500 mM para retirar los anticuerpos unidos.
Se ajustaron las curvas de unión a un modelo de unión de Langmuir usando software BIAevaluation (Biacore AB, Uppsala, Suecia). En la tabla 2 se muestran los valores de KD determinados.
Tabla 2
Anticuerpo
L1-9.3 L1-hu3
Ka [1/Ms]
2,6 x 105 8,0 x 105
Kd [1/s]
2,2 x 10-5 6,5 x 10-5
KD [M]
8,5 x 10-11 8,1 x 10-11
Tabla 2: La variante humanizada L1-hu3 presenta una alta afinidad por diana similar al anticuerpo original L1-9.3.
7. Ejemplo 7
Unión de anticuerpo a PBMC y células cancerosas
Se obtuvieron PBMC mediante centrifugación por gradiente de densidad a partir de sangre completa con EDTA de donantes humanos sanos. Se recogieron células tumorales OVMZ cultivadas mediante tripsinación. Se sembraron 1 x 105 células/pocillo (75 μl) en tubos de FACS. Se prepararon diluciones de mAb L1-9.3 en medio de cultivo con EDTA 10 mM y se añadieron 75 μl/pocillo de dilución de mAb contra L1, a células PBMC y OVMZ para dar como resultado concentraciones finales de entre 6,6x10-13 y 6,6x10-8 M. Posteriormente, se incubaron las células durante la noche (~24 h) a 37°C/CO2 al 5% en una incubadora. Se lavaron las células directamente en tubos de FACS usando 2 ml de tampón de FACS seguido por centrifugación a 300 g/5 min/4°C. Se retiró el sobrenadante mediante pipeteado. Para la tinción, se añadió un anticuerpo secundario de burro marcado con PE anti-ratón (Dako) a un volumen de 150 μl/pocillo seguido por incubación durante 30 min a 4°C. Se repitieron etapas de lavado como anteriormente y se fijaron las células en 200 μl de PBS/formaldehído al 1%. Entonces se midió la fluorescencia media de la muestra mediante análisis de FACS.
Tal como se muestra en la figura 13, el mAb L1-9.3 presenta una afinidad fuertemente reducida por L1 en PBMC en comparación con L1 tumoral. Se detectó unión de L1-9.3 a PBMC en el intervalo nanomolar (línea discontinua),
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mientras que pudo observarse unión a células tumorales a concentraciones picomolares (línea continua). B) Se estimaron las constantes de disociación Kd a partir de las curvas de regresión usando la concentración a la mitad de la unión máxima. KD de L1-9.3 en CMSP fue al menos 400 veces inferior a aquella en células tumorales.
8. Ejemplo 8
Determinación de liberación de citocina
Se obtuvieron PBMC mediante centrifugación por gradiente de densidad a partir de sangre completa con citrato de donantes humanos sanos. Se resuspendieron las células en RPMI 1640/suero humano al 5%/5 ml de NEAA/5 ml de L-glutamina/5 ml de piruvato de sodio. Se sembraron 1x105 células por 100 μl en placas de 96 pocillos de fondo redondo. En una segunda etapa, se añadieron 100 μl de medio que contenía LPS (10 ng/ml), mAb L1-9.3 (20 μg/ml), mAb OKT3 (Ebioscience) (75 ng/ml) o ionomicina/PMA (1 μg/ml/5 ng/ml) por triplicado seguido por una incubación durante 24 h at 37°C, CO2 al 5%. Como control negativo, se usaron PBMC sin tratar. Tras 24 h, se midieron los nivelesdel interferón-gamma de las citocinas y el factor de necrosis tumoral mediante análisis de FACS usando los conjuntos flexibles para citocinas CBA (BD) según la información del fabricante.
En la figura 14 se representan los niveles de citocinas resultantes. Al contrario que el mAb OKT3, ionomicina/PMA y LPS, L1-9.3 no aumentó significativamente la liberación de TNF o IFN-gamma por PBMC.
9. Ejemplo 9
Ensayo de proliferación de células T
Se obtuvieron PBMC mediante centrifugación por gradiente de densidad a partir de sangre completa con citrato de dos donantes humanos sanos. Se sembraron 1x105 células por pocillo en placas de 96 pocillos de fondo plano. En una segunda etapa, se añadieron 100 μl de medio que contenía o bien mAb L1-9.3 (20 μg/ml) y OKT3 (Ebioscience, 75 ng/ml) o bien mAb L1-9.3 (20 μg/ml) u OKT3 (75 ng/ml) por triplicado. Tras 1 h, los dos últimos se complementaron con OKT3 o L1-9.3, respectivamente. Para excluir cualquier activación relacionada con el anticuerpo, se incubaron PBMC con o sin L1-9.3 en ausencia de OKT3. Tras una incubación durante 24 h a 37°C, CO2 al 5%, se evaluó la proliferación de células T usando un ensayo de incorporación de BrdU (Roche) según la información del fabricante.
A partir de los resultados mostrados en la figura 15, puede concluirse que el mAb L1-9.3 no induce la proliferación de células T ni inhibe la proliferación de células T inducida por OKT3.
10. Ejemplo 10
Dependencia de la glicosilación de la unión de anticuerpo
Se sembraron 2x106 células SKOV3ip en una placa de Petri de 10 cm y se incubaron durante 24 h a 37°C, CO2 al 5%. Tras 24 h, se lavaron las células con PBS y se sometieron a lisis con 500 μl de reactivo M-PER (Pierce) según el protocolo descrito en el kit de inmunoprecipitación de mamíferos clásico Seize (Pierce). Se desglicosilaron los lisados de células SkOv3ip tal como se describe en el kit Enzymatic CarboRelease (QA_Bio). En resumen, se añadieron 2,5 μl de disolución de desnaturalización a 35 μl de lisado celular. Se incubó la muestra en un termobloque a 100°C durante 5 min y después se enfrió en hielo. Finalmente se añadieron 2,5 μl de Triton-X y 1 μl de cada glicosidasa contenida en el kit Enzymatic CarboRelease (QA_Bio) (PGNasa F, O-glicosidasa, sialidasa, (βgalactosidasa, glucoaminidasa) según el protocolo del fabricante seguido por una incubación a 37°C durante 3 h. Se sometieron productos glicosilados y desglicosilados a SDS PAGE y posterior inmunotransferencia de tipo Western. Se incubaron las inmunotransferencias de tipo Western con diferentes anticuerpos contra L1 dependiendo de su rendimiento de tinción. Se usaron concentraciones de 1 μg/ml (9.3, 11A y 14.10), 5 μg/ml (35.9) o 10 μg/ml (OV52.24, OV543.18, 38.12, OV549.20). Se detectó la unión de anticuerpo contra L1 a la inmunotransferencia de tipo Western con anticuerpo marcado con HRP anti-ratón (Dianova).
Tal como se muestra en la figura 16, los anticuerpos anti-L1 sometidos a prueba pueden dividirse en tres clases con respecto a su dependencia de la glicosilación: Primera clase (no afectada por la glicosilación): L1-9.3. Segunda clase (la unión en WB se vio afectada de manera negativa por la desglicosilación): 11 A, 14.10, OV52.24 y OV549.20. Tercera clase (la unión en WB se vio afectada de manera positiva por la desglicosilación): 35.9 y 38.12.
11. Ejemplo 11
Biodistribución de L1-9.3 en conejo
A un conejo hembra (blanco del Himalaya) se le inyectó dos veces L1-9.3 (0 h, 24 h) mediante la vía de aplicación intravenosa a una dosis de 10 mg/kg. 1 animal de control recibió un volumen comparable de PBS. Se realizó la autopsia de los animales 72 h tras la primera aplicación. Se fijaron los órganos en formalina tamponada al 4% y se incrustaron en parafina. Se prepararon cortes histológicos y se realizó la inmunohistoquímica. Se tiñeron secciones tisulares del animal tratado con L1-9.3 y el control con un anticuerpo anti-ratón para detectar la unión de L1-9.3 tras la aplicación intravenosa. Se visualizaron señales mediante DAB (Sigma). Se usaron dos sistemas de detección
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mAb
FACS Inmunotransferencia de tipo Western IP L1-Fc Invasión fosfo-Erk ka (1/Ms) kd (1/s) KD (M) Crecimiento tumoral
L1-35.9
+ + + + + + + + 0 0 4,0E+04 1,2E-05 3,0E-10
L1N15.17
+ + - + + + + 0 0 5,3E+04 1,0E-03 1,9E-08
L11D12.22
- - + + + 0 -20% 2,3E+04 1,0E-04 4,3E-09
L11D17.3
- - + + + 0 0 2,3E+04 1,0E-04 4,3E-09
L11D64.8
- + + + + + + + 0 0 8,5E+04 1,5E-04 1,8E-09
L11D74.8
- + + + + + + + -10% 0 3,0E+04 2,0E-03 6,7E-08
Se describe lo siguiente:
1. Un anticuerpo monoclonal anti-L1 que puede unirse al mismo epítopo de L1 reconocido por el anticuerpo monoclonal 9.3, producido por la célula de hibridoma depositada como DSMZ ACC2841.
5 2. El anticuerpo monoclonal anti-L1 según el punto 1, en el que el epítopo está dentro del primer dominio similar a inmunoglobulina de L1.
3. Un anticuerpo monoclonal anti-L1, que tiene la misma capacidad para inhibir el crecimiento tumoral que el anticuerpo monoclonal 9.3, producido por la célula de hibridoma depositada bajo DSMZ ACC2841.
4. Un anticuerpo monoclonal anti-L1, caracterizado porque al menos una de sus regiones determinantes de 10 complementariedad (CDR):
a) tiene una de las siguientes secuencias RASQDISNYLN, YTSRLHS, QQGNTLPWT, RYWML, EINPRNDRTNYNEKFKT o GGGYAMDY o
b) tiene una secuencia que, en comparación con las secuencias mencionadas en a) tiene al menos un intercambio de aminoácidos conservador.
15 5. Un anticuerpo monoclonal, producido por la célula de hibridoma depositada bajo DSMZ ACC2841.
6.
Un anticuerpo humanizado basado en el anticuerpo monoclonal de cualquiera de los puntos 1 a 5.
7.
El anticuerpo humanizado del punto 6, que tiene al menos un residuo de CDR no humana y región de marco humano (FR).
8. El anticuerpo humanizado según cualquiera de los puntos 6 ó 7, que comprende la secuencia de L1_9.3hu o 20 L1_9.3hu3, como se muestra en la figura 8 a) y b).
9. Una molécula de unión que comprende
a) al menos una de las siguientes secuencias RASQDISNYLN, YTSRLHS, QQGNTLPWT, RYWML, EINPRNDRTNYNEKFKT o GGGYAMDY o
b) al menos una secuencia que tiene, en comparación con las secuencias dadas en a), al menos un 25 intercambio de aminoácidos conservativo.
10. La molécula de unión del punto 9, que se selecciona del grupo que consiste en anticuerpos monocatenarios (por ejemplo scFv, multímeros de scFv como diacuerpos, triacuerpos o tetracuerpos, fragmentos de anticuerpos (por ejemplo, Fab), Tandab, Flexibodies, anticuerpos biespecíficos y anticuerpos quiméricos.
11. El anticuerpo de cualquiera de los puntos 1 a 8 o la molécula de unión de cualquiera de los puntos 9 ó 10, unidas 30 a una sustancia activa, preferiblemente una toxina, una citoquina, una nanopartícula o un radionucleótido.
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  1. imagen1
    imagen2
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