ES2651124T3 - Variante de GP-120 de VIH - Google Patents

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Carolina Ferreira
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IrsiCaixa Institut de Recerca de la Sida
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Abstract

Un polipéptido capaz de inducir anticuerpos neutralizantes contra un virus que comprende una variante de gp120 de VIH-1 o un fragmento inmunogénico de la misma en donde el polipéptido o el fragmento inmunogénico del mismo comprende la secuencia SEQ ID NO:4.

Description

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varía con la temperatura, pero típicamente es entre 1 hora y 1 día. En un aspecto, poner en contacto un pocillo de una placa de microtitulación de plástico (tal como poliestireno o cloruro de polivinilo) con una cantidad de anticuerpo que varía desde alrededor de 10 ng hasta alrededor de 1 µg, y preferiblemente alrededor de 100-200 ng, es suficiente para inmovilizar una cantidad adecuada de polipéptido.
La unión covalente de un anticuerpo a un soporte sólido también se puede alcanzar haciendo reaccionar primero el soporte con un reactivo bifuncional que reaccionará tanto con el soporte como con un grupo funcional, tal como un grupo hidroxilo o amino, en el anticuerpo. Por ejemplo, se puede unir covalentemente el anticuerpo a soportes que tienen un recubrimiento polimérico apropiado usando benzoquinona o por condensación de un grupo aldehído en el soporte con una amina y un hidrógeno activo en el compañero de unión, usando técnicas bien conocidas.
De forma alternativa, en lugar de inmovilizar el anticuerpo neutralizante a un soporte de forma covalente o no covalente, la divulgación contempla la posibilidad de inmovilizar el anticuerpo mediante unión a un primer anticuerpo específico para Fc o un fragmento de anticuerpo anti-Fc; que se ha inmovilizado previamente al soporte. Además de ayudar a capturar el anticuerpo, el primer anticuerpo orienta el anticuerpo neutralizante para aumentar el porcentaje de anticuerpo inmovilizado que es activo para unirse a miembros de la librería vírica. Por ejemplo, la inmovilización se puede llevar a cabo poniendo primero en contacto un anticuerpo que se ha inmovilizado en un soporte sólido, comúnmente el pocillo de una placa de microtitulación, con la librería, de modo que se permite que esos virus en la librería que muestran afinidad hacia la muestra de anticuerpo neutralizante se unan al anticuerpo inmovilizado. La muestra no unida se elimina luego de los complejos anticuerpo-virus inmovilizados. Más específicamente, una vez que el anticuerpo está inmovilizado en el soporte como se describe anteriormente, el resto de los sitios de unión de la proteína en el soporte típicamente se bloquean.
A.2. Etapa de separación
En una segunda etapa, el método RIS de la divulgación comprende separar esos miembros de la librería de virus recombinantes que se unen al anticuerpo neutralizante de miembros que no se unen en base a su capacidad de unirse al anticuerpo neutralizante.
Dicha etapa de separación se puede referir a una separación física (por ejemplo, en bolas o FACS) o eliminación de la fase sólida de la mezcla de reacción, o se puede referir a una etapa en la que la fase sólida se somete a una o más etapas de lavado para eliminar los otros componentes de la mezcla de reacción. En aspectos donde se lleva a cabo la separación física o la eliminación de la fase sólida, preferiblemente, la fase sólida también se somete a una o más etapas de lavado.
Las etapas de lavado se pueden llevar a cabo de cualquier modo apropiado dependiendo de la naturaleza de la fase sólida y los compañeros de unión que interaccionan unidos a la misma. Los métodos apropiados de lavar fases sólidas particuladas los conoce bien el experto en la materia. Por ejemplo, si la fase sólida es particulada, las etapas de lavado pueden tener lugar centrifugando las partículas en tales condiciones que formen un precipitado mientras se elimina el sobrenadante. Después, las partículas se pueden resuspender en un medio acuoso apropiado (por ejemplo, el mismo utilizado en la etapa de poner en contacto). La rigurosidad de los lavados (o realmente, la etapa de poner en contacto) se puede modificar añadiendo reactivos apropiados que conocen bien los expertos en la materia (por ejemplo, Tween) para, por ejemplo, disminuir el fondo o la unión inespecífica. Tales etapas de precipitar y resuspender constituirían un lavado. Se puede llevar a cabo cualquier número apropiado de lavados. Sin embargo, si la fase sólida fuera magnética, las etapas de lavado se podrían llevar a cabo de forma conveniente aplicando un campo magnético al recipiente en el que se ha llevado a cabo la etapa de poner en contacto, eliminando el sobrenadante y resuspendiendo la fase sólida en un medio acuoso apropiado. Tales etapas de separación magnética y resuspensión constituirían una etapa de lavado y se podrían llevar a cabo cualquier número apropiado de lavados. Si el soporte sólido es no particulado (por ejemplo, es una superficie plana tal como una placa, un disco
o un filtro), de nuevo los expertos en la materia conocen bien métodos apropiados de lavar tales fases sólidas.
Además de las etapas de lavado opcionales descritas anteriormente, se debe advertir que también se pueden llevar a cabo una o más etapas de lavado en cualquier otra fase apropiada en el método RIS. Por ejemplo, también se podrían llevar a cabo una o más etapas de lavado de fases sólidas después haber realizado cualquier etapa de inmovilización, por ejemplo, para eliminar anticuerpos neutralizantes que no se han unido a la fase sólida. En efecto, tales etapas de lavado son preferidas. Además, se pueden llevar a cabo una o más etapas de lavado en fases sólidas a otros tiempos apropiados durante el curso del método para eliminar, por ejemplo, entidades no unidas. El experto en la materia puede determinar fácilmente el número de lavados requeridos.
Una vez eliminados los componentes de la mezcla de reacción que se unen débilmente o se unen de forma no específica a los anticuerpos neutralizantes, la etapa de separación finalmente se lleva a cabo eluyendo esos miembros de la librería de virus recombinantes que se han unido específicamente a los anticuerpos neutralizantes. Dependiendo del tipo de inmovilización, dicha etapa de elución se podría llevar a cabo por cualquier método adecuado, tal como, por ejemplo, utilizando un álcali, detergente o agente similar que rompe enlaces no covalentes, seguido por neutralización, para dejar que los compañeros que interaccionan se replieguen y se unan entre sí. En el caso de etiquetas de biotina, en general, las construcciones de la librería que contienen tales etiquetas se manipulan
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incluyen las que tienen actividad RNasa H reducida, sustancialmente reducida o completamente eliminada. Mediante una enzima con “actividad RNasa H sustancialmente reducida” se quiere decir una enzima que tiene menos del alrededor del 20%, preferiblemente menos de alrededor del 15%, el 10% o el 5%, y lo más preferiblemente menos de alrededor del 2%, de la actividad RNasa H de la correspondiente enzima tipo salvaje o RNasa H+, tal como virus de la leucemia murina de Moloney de tipo salvaje (M-MLV), transcriptasas inversas de virus de la mieloblastosis aviar (AMV) o del virus del sarcoma de Rous (RSV). La actividad RNasa H de cualquier enzima se puede determinar mediante una variedad de ensayos conocidos. Véase, Kotewicz M, et al., Nucl. Acids Res. 1988; 16:265-277, Gerard G, et al., Focus 1992; 14(5):91-93, y Kotewicz M, et al., US 5.244.797. Polipéptidos particularmente preferidos para uso en la divulgación incluyen, pero no están limitados a la transcriptasa inversa de M-MLV, transcriptasa inversa de RSV, transcriptasa inversa de AMV, transcriptasa inversa de RAV (virus asociado a Rous), transcriptasa inversa de MAV (virus asociado a mieloblastosis) y transcriptasa inversa de VIH. Véase Kotewicz M, et al., US 5.244.797 y Gerard G, et al., WO1998047912. Sin embargo, el experto en la materia entenderá que se puede usar de forma equivalente cualquier enzima capaz de producir una molécula de ADN a partir de una molécula de ácido ribonucleico (es decir, que tiene actividad transcriptasa inversa) en las composiciones, métodos y kits de la divulgación.
El ADNc monocatenario se puede tratar de modo que se obtenga un ADN bicatenario usando cualquier método conocido en la técnica. Preferiblemente, la conversión del ADNc monocatenario a ADN bicatenario se lleva a cabo usando tecnologías de amplificación in vitro tales como reacción en cadena de la polimerasa (PCR), reacción en cadena de la ligasa (LCR), amplificación basada en secuencia de ácidos nucleicos (NASBA), amplificación por desplazamiento de la hebra (SDA), amplificación mediada por transcripción (TMA), tecnología de ADN ramificado (bDNA), amplificación de ADN auxiliada por enlazador (LADA), amplificación por replicasa Q-beta (Q-beta), amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP) y tecnología de amplificación por círculo rodante (RCAT) u otras tecnologías de amplificación enzimática in vitro. El paso de amplificación se lleva a cabo usando cebadores correspondientes a las secuencias de las regiones adaptadoras. El ADN bicatenario resultante se puede purificar usando una columna de purificación, bolas electromagnéticas a las que se une el cebador o por electroforesis mediante un gel de agarosa.
El ADN bicatenario resultante se puede insertar en un vector de elección usando métodos conocidos en la técnica. En un aspecto preferido, los cebadores usados durante el paso de amplificación por PCR contienen en sus regiones 5’ sitios diana para endonucleasas de restricción que generan extremos compatibles con los presentes en el vector de elección. Los sitios diana de endonucleasas permiten la generación de extremos cohesivos que se pueden usar para clonar los polinucleótidos en vectores apropiados.
La etapa de secuenciación se puede llevar a cabo usando cualquier medio conocido de secuenciación tal como secuenciación química (Maxam-Gilbert), secuenciación dideoxi de Sanger, pirosecuenciación, secuenciación con detección de fluorescencia y secuenciación de ADN por espectrometría de masas.
B. Polipéptidos inmunogénicos, polinucleótidos, vectores y células huésped
El método de selección inmunogénica rápida (RIS) según la presente divulgación permite la identificación de polipéptidos que son variantes del polipéptido presentado en la superficie de un virus y que son candidatos para generar anticuerpos neutralizantes y por tanto, para su uso como composiciones inmunogénicas o vacunas. De esta manera, en otro aspecto, la divulgación se refiere a polipéptidos identificados por el método de la invención.
El término “polipéptido”, que se usa en el presente documento de forma intercambiable con proteína, se refiere a una cadena de aminoácidos de cualquier longitud en donde los diferentes aminoácidos están unidos entre sí por medio de enlaces peptídicos o puentes disulfuro.
En el caso particular en donde el virus seleccionado según el método de la divulgación sea un retrovirus, el polipéptido es una variante de una proteína de la envuelta. En un aspecto preferido, el retrovirus es VIH y el polipéptido según la presente divulgación es una variante de gp120.
El polipéptido identificado según el método RIS de la divulgación, preferiblemente comprende al menos una mutación en una región seleccionada del grupo que consiste en la región constante C1, la región variable V1, la región variable V2, la región constante C2, la región constante C5 y el ectodominio de gp41.
En un aspecto más preferido, la mutación en la región constante C1 es una mutación en la posición 88. En un aspecto más preferido, el residuo mutado en la posición 88 es un Asp. En un aspecto aún más preferido, la mutación en la región constante C1 es una mutación N88D.
En un aspecto más preferido, la mutación en la región variable V1 es una mutación en una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste en las posiciones 131, 132 y 138. En un aspecto más preferido, los residuos mutados en las posiciones 131, 132 y 138 en la región V1 son Y, N y/o G, respectivamente. En un aspecto aún más preferido, la mutación en la región V1 es C131Y, T132N y/o D138G.
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aproximadamente 40, aproximadamente 50, aproximadamente 60, aproximadamente 70, aproximadamente 80, aproximadamente 90 o aproximadamente 100. De esta manera, se pueden usar fragmentos (por ejemplo, epítopos u otros fragmentos antigénicos) de un polipéptido gp120, tal como cualquiera de los polipéptidos gp120 descritos en el presente documento o un fragmento de los mismos como inmunógenos.
El término “composición inmunogénica” se refiere a una composición que provoca una respuesta inmunitaria que produce anticuerpos o respuestas inmunitarias celulares contra un inmunógeno específico. Se pueden preparar composiciones inyectables, por ejemplo, como soluciones, suspensiones y emulsiones líquidas. El término “composición inmunogénica” se refiere a una composición que puede ser reconocida por un sistema inmunitario huésped. Por ejemplo, una composición antigénica contiene epítopos que pueden reconocer componentes humorales (por ejemplo, anticuerpo) y/o celulares (por ejemplo, linfocitos T) de un sistema inmunitario huésped.
El término “vacuna” se refiere a una composición inmunogénica para administración in vivo a un huésped, que puede ser un primate, particularmente un huésped humano, para conferir protección contra enfermedad, particularmente una enfermedad vírica.
Las composiciones inmunogénicas según la divulgación son útiles para el tratamiento o prevención de enfermedades causadas por una infección de VIH. En un aspecto adicional, la divulgación se refiere a un péptido, un ácido nucleico, un vector, una composición inmunogénica o una vacuna según la divulgación para uso en la prevención de una enfermedad resultante de una infección por VIH-1. De forma alternativa, la invención se refiere al uso de un péptido, un ácido nucleico, un vector, una composición inmunogénica o una vacuna según la divulgación para la fabricación de un medicamento para la prevención de una enfermedad resultante de infección por VIH-1. De forma alternativa, la divulgación se refiere a un método para la prevención en un sujeto de una enfermedad resultante de infección por VIH-1 que comprende la administración a dicho sujeto de un péptido, un ácido nucleico, un vector, una composición inmunogénica o una vacuna según la divulgación.
El término “tratamiento”, como se usa en el presente documento comprende cualquier tipo de terapia, cuyo fin es terminar, prevenir, mejorar y/o reducir la susceptibilidad a un estado clínico descrita en el presente documento. En una forma de realización preferida, el término tratamiento se refiere a tratamiento profiláctico (es decir, una terapia para reducir la susceptibilidad a un estado clínico, un trastorno o afección como se define en el presente documento).
De esta manera, “tratamiento”, “tratar” y similares, como se usan en el presente documento, se refieren a obtener un efecto farmacológico y/o fisiológico deseado, que cubre cualquier tratamiento de un afección patológica o trastorno en un mamífero incluyendo un ser humano. El efecto puede ser profiláctico en términos de prevenir completa o parcialmente un trastorno o síntoma del mismo y/o puede ser terapéutico en términos de una cura parcial o completa para un trastorno y/o efecto adverso atribuible al trastorno. Esto es, “tratamiento” incluye (1) prevenir que el trastorno se produzca o reaparezca en un sujeto, (2) inhibir el trastorno, tal como parar su desarrollo, (3) parar o terminar el trastorno o al menos los síntomas asociados con el mismo, de modo que el huésped no padezca más el trastorno o sus síntomas, tal como producir regresión del trastorno o sus síntomas, por ejemplo, restaurar o reparar una función perdida, que falta o defectuosa, o estimular un proceso ineficaz, o (4) mitigar, aliviar o mejorar el trastorno, o síntomas asociados con el mismo, donde se usa mejora en un sentido amplio para referirse a al menos una reducción en la magnitud de un parámetro, tal como inflamación, dolor y/o deficiencia inmunitaria.
Los términos “prevenir” y “prevención”, como se usan en el presente documento, se refieren a un descenso en la aparición de células patológicas en un animal. La prevención puede ser completa (por ejemplo, la ausencia total de células patológicas en un sujeto). La prevención también puede ser parcial, de modo que por ejemplo la aparición de células patológicas en un sujeto es menor que la que se habría producido sin la presente divulgación. Prevención también se refiere a susceptibilidad reducida a una afección clínica.
Las composiciones inmunogénicas según la divulgación pueden comprender además un soporte farmacéuticamente aceptable.
Un “soporte farmacéuticamente aceptable”, “diluyente farmacéuticamente aceptable” o “excipiente farmacéuticamente aceptable” o “vehículo farmacéuticamente aceptable”, usados de forma intercambiable en el presente documento, se refiere a un relleno, diluyente, material encapsulante o formulación auxiliar de cualquier tipo convencional sólido, semisólido o líquido no tóxico. Un soporte farmacéuticamente aceptable es esencialmente no tóxico para los receptores a las dosis y concentraciones empleadas y es compatible con otros ingredientes de la formulación. Por ejemplo, el soporte para una formulación que contiene polipéptidos normalmente no incluiría agentes oxidantes y otros compuestos que se sabe que son dañinos para los polipéptidos. Los soportes adecuados incluyen, pero no están limitados a, agua, dextrosa, glicerol, solución salina, etanol y combinaciones de los mismos. El soporte puede contener agentes adicionales tales como agentes humectantes o emulsionantes, agentes reguladores del pH o adyuvantes que aumentan la eficacia de la formulación. Los adyuvantes de podrían seleccionar por ejemplo, de grupo que consiste en: AlK(SO4)2, AlNa(SO4)2, AlNH4 (SO4), sílice, alúmina, Al(OH)3, Ca3(PO4)2, caolín, carbono, hidróxido de aluminio, muramil dipéptidos, N-acetil-muramil-L-treonil-D-isoglutamina (thr-DMP), Nacetil-nornuramil-L-alanil-D-isoglutamina (CGP 11687, también denominado nor-MDP), N-acetilmuramil-L-alanil-D
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isoglutaminil-L-alanina-2-(1’2’-dipalmitoil-sn-glicero-3-hidroxfosforiloxi)-etilamina (CGP 19835A, también denominada MTP-PE), RIBI (MPL+TDM+CWS) en una emulsión al 2 por ciento de escualeno/Tween-80®, lipopolisacáridos y sus varios derivados, incluyendo lípido A, adyuvante completo de Freund (FCA), adyuvantes incompletos de Freund, adyuvante 65 de Merck, polinucleótidos (por ejemplo, ácidos poli IC y poli AU), cera D de Mycobacterium, tuberculosis, sustancias encontradas en Corynebacterium parvum, Bordetella pertussis, y miembros del género Brucella, Titermax, ISCOMS, Quil A, ALUN, derivados de lípido A, derivados de la toxina del cólera, derivados de HSP, derivados de LPS, matrices peptídicas sintéticas o GMDP, interleuquina 1, interleuquina 2, Montanide ISA-51 y QS-21, oligonucleótido CpG, poli I:C y GM-CSF. Véase Hunter R, US 5.554.372, y Jager E, Knuth A, WO1997028816.
Se puede unir de forma covalente un polipéptido gp120 variante según la divulgación a un soporte, que es una macromolécula inmunogénica a la que se puede unir una molécula antigénica. Cuando está unido a un soporte, el polipéptido unido se hace más inmunogénico. Los soportes se eligen para aumentar la inmunogenicidad de la molécula unida y/o inducir títulos mayores de anticuerpos contra el soporte que son diagnóstica, analítica y/o terapéuticamente beneficiosos. La unión covalente de una molécula a un soporte puede conferir inmunogenicidad aumentada y dependencia de células T. Véase, Pozsgay V, et al., PNAS 1999; 96:5194-5197, Lee S, et al., J. Immunol. 1976; 116:1711-1718 y Dintzis R, et al., PNAS 1976; 73:3671-3675. Soportes útiles incluyen soportes poliméricos, que pueden ser naturales (por ejemplo, polisacáridos, polipéptidos o proteínas de bacterias o virus), materiales semisintéticos o sintéticos que contienen uno o más grupos funcionales a los que se pueden unir un grupo reactivo. También se pueden usar como soportes productos bacterianos y proteínas víricas (por ejemplo, antígeno de superficie y antígeno central del virus de la hepatitis B), así como proteínas de organismos superiores tal como hemocianina de lapa californiana, hemocianina de cangrejo bayoneta, edestina, seroalbúminas de mamífero e inmunoglobulinas de mamífero. Productos bacterianos adicionales para uso como soportes incluyen proteínas de la pared bacteriana y otros productos (por ejemplo, paredes celulares y lipopolisacárido (LPS) de estreptococos y estafilococos).
La presente divulgación se refiere además a prevenir o reducir síntomas asociados con infección por VIH. Estos incluyen síntomas asociados con la fase sintomática menor de la infección por VIH, incluyendo, por ejemplo, zóster, erupción cutánea e infección de las uñas, llagas bucales, infección recurrente de nariz y garganta, y pérdida de peso. Además, síntomas adicionales asociados con la fase sintomática principal de la infección por VIH incluyen, por ejemplo, candidiasis bucal o vaginal (Candida), diarrea persistente, pérdida de peso, tos persistente, tuberculosis reactivada e infecciones recurrentes por herpes, tal como herpes labial (herpes simple). Los síntomas de SIDA en estado más avanzado que se pueden tratar según la presente divulgación, incluyen, por ejemplo, diarrea, nausea y vómitos, candidiasis y llagas bucales, infecciones vaginales persistentes, recurrentes y cáncer cervical, linfadenopatía generalizada persistente (PGL), infecciones cutáneas graves, verrugas y tiña, infecciones respiratorias, neumonía, en especial neumonía por Pneumocystis carinii (PCP), herpes zóster (o culebrilla), problemas del sistema nervioso, tales como dolores, entumecimiento u “hormigueo” en las manos y los pies, anormalidades neurológicas, sarcoma de Kaposi, linfoma, tuberculosis y otras infecciones oportunistas.
Los efectos beneficiosos de los péptidos, ácidos nucleicos y vectores de la divulgación incluyen, por ejemplo, prevenir o retrasar la infección inicial de un individuo expuesto a VIH; reducir la carga vírica en un individuo infectado con VIH; prolongar la fase asintomática de infección por VIH; mantener cargas víricas bajas a través de terapia antiretroviral (TAR); aumentar los niveles de células T CD4 o reducir el descenso en células T CD4, tanto específicas como no específicas para VIH-1, en pacientes sin tratamiento previo con fármacos y en pacientes tratados con ART, aumentar en conjunto la salud o calidad de vida de un individuo con SIDA; y prolongar la esperanza de vida de un individuo con SIDA. Un médico puede comparar el efecto de inmunización con el estado del paciente antes del tratamiento, o con el estado esperado de un paciente sin tratar, para determinar si el tratamiento es eficaz en inhibir el SIDA.
La composición inmunogénica se puede administrar por cualquier medio que conozca el experto en la materia, tal como mediante inyección intramuscular, subcutánea o intravenosa, y administración oral, nasal o anal. Véase, Banga A, “Parenteral Controlled Delivery of Therapeutic Peptides and Proteins”, en Therapeutic Peptides and Proteins (Technomic Publishing Co., Inc., Lancaster, PA, EE UU, 1995). Para prolongar el tiempo durante el que está disponible el péptido o proteína para estimular una respuesta, se puede suministrar el péptido o proteína como un implante, una inyección oleaginosa o como un sistema particulado. El sistema particulado puede ser una micropartícula, una microcápsula, una microesfera, una nanocápsula, o partícula similar. Véase Banga, 1995, anteriormente. Se ha mostrado que un soporte particulado basado en un polímero sintético actúa como adyuvante para aumentar la respuesta inmunitaria, además de proporcionar una liberación controlada. También se pueden usar sales de aluminio como adyuvantes para producir una respuesta inmunitaria.
Se pueden formular composiciones inmunogénicas en formas farmacéuticas unitarias, adecuadas para la administración individual de dosis precisas. En dosis pulsadas, se proporciona una administración embolada de una composición inmunogénica que incluye un inmunógeno divulgado, seguido por un periodo de tiempo en donde no se administra inmunógeno divulgado al sujeto, seguido por una segunda administración embolada. Se puede administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición inmunogénica en una dosis única, o en dosis múltiples, por ejemplo, a diario, durante un ciclo de tratamiento. En ejemplos específicos, no limitantes, se
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Las técnicas de inmunoensayos heterogéneos implican típicamente el uso de un material de fase sólida al que se une el producto de reacción, pero se puede adaptar para implicar la unión de antígenos y anticuerpos no inmovilizados (es decir, un inmunoensayo en fase solución). El producto de reacción se separa del exceso de muestra, reactivos del ensayo y otras sustancias eliminando la fase sólida de la mezcla de reacción (por ejemplo, mediante lavados). Un tipo de inmunoensayo en fase sólida que se puede usar según la presente divulgación es un inmunoensayo sándwich. En el ensayo sándwich, cuanto más analito hay presente en la muestra, mayor es la cantidad de marcador presente en la fase sólida. Este tipo de formato de ensayo en general es preferido, especialmente para la visualización de bajas concentraciones de analito, porque la aparición de marcador en la fase sólida se detecta más fácilmente.
Según un aspecto preferido de la presente divulgación, un péptido de la presente divulgación que es específicamente reactivo con un anticuerpo anti-VIH se une a un soporte sólido (es decir, inmovilizar) e incuba en contacto con la muestra biológica en la que se prueba la presencia de un anticuerpo anti-VIH. Se puede añadir un agente bloqueante para reducir la unión no específica.
Como se apreciará, el péptido se puede incubar con la muestra biológica en un estado no unido y unirse posteriormente al soporte sólido (es decir, inmovilizar). Los soportes se tratan luego preferiblemente de forma extensa (por ejemplo, lavando) para eliminar sustancialmente los anticuerpos no contra VIH que pueden estar presentes pero que han fracasado en unirse al péptido unido. Como resultado de tal tratamiento, se forma un complejo inmunitario entre el péptido y el anticuerpo anti-VIH.
Después se añade preferiblemente un segundo anticuerpo detectablemente marcado (capaz de unirse al anticuerpo inicial (por ejemplo, un anticuerpo anti-IgG humano)) y el soporte se incuba en condiciones suficientes para permitir que el segundo anticuerpo se una a cualquier anticuerpo anti-VIH que pueda estar presente. El soporte se trata luego preferiblemente de forma extensa (por ejemplo, lavando) para eliminar sustancialmente cualquier segundo anticuerpo no unido. Si está presente un anticuerpo anti-VIH en la muestra de prueba, los dos anticuerpos formarán un complejo inmune con el péptido inmovilizado (es decir, un sándwich segundo anticuerpo/anticuerpo antiVIH/péptido inmovilizado). En tal ensayo, la detección del segundo anticuerpo unido al soporte es indicativa de anticuerpo anti-VIH en la muestra que se prueba. Véase Schuurs A, et al., US 3.791.932 y US 4.016.043 y Pankratz T, et al., US 5.876.935. El segundo anticuerpo puede ser una inmunoglobulina natural aislada de una especie no humana (por ejemplo, anticuerpo murino anti-IgG humana, anticuerpo de cabra anti-IgG humana, anticuerpo de cabra anti-IgM humana) o se puede producir de forma recombinante o sintética. Puede ser una inmunoglobulina o un fragmento de inmunoglobulina (por ejemplo, FAb, F[Ab]2). Según se desee, se pueden emplear otras moléculas de unión (capaces de unirse a anticuerpos anti-VIH) junto con o en lugar de tales segundos anticuerpos. Por ejemplo, los anticuerpos anti-VIH se pueden biotinilar y el segundo anticuerpo se puede cambiar por avidina o estreptavidina marcada.
Para eliminar la etapa de separación unido-libre y reducir el tiempo y equipo necesarios para un ensayo de unión química, se puede emplear de forma alternativa un formato de ensayo homogéneo. En tales ensayos, un componente del par de unión puede estar aún inmovilizado; sin embargo, la presencia del segundo componente del par de unión se detecta sin una separación unido-libre. Ejemplos de métodos ópticos homogéneos son el método EMIT (Syva, Sunnyvale, CA, EE UU), que opera mediante detección de extinción de fluorescencia; el método de aglutinación de partículas de látex por nefelometría laser de Behringwerke (Marburgo, DE), que opera detectando cambios en la dispersión de la luz; el método de aglutinación de partículas de látex LPIA (Mitsubishi Chemical Industries, Tokio, JP); el método de despolarización de fluorescencia TDX (Abbott Laboratories, Abbott Park, IL, EE UU); y el método de transferencia de energía de fluorescencia (Cis Bio International, Paris, FR). Se puede adaptar cualquiera de tales ensayos para su uso según los objetivos de la presente divulgación.
El ensayo de unión de la presente divulgación se puede configurar como un ensayo competitivo. En un ensayo competitivo, cuanto más anticuerpo anti-VIH esté presente en la muestra de prueba, menor cantidad de marcador estará presente en la fase sólida.
De una manera similar al ensayo sándwich, el ensayo competitivo se puede realizar suministrando una cantidad definida de un anticuerpo anti-VIH marcado y determinar si el líquido que se prueba contiene anticuerpo anti-VIH que competiría con el anticuerpo marcado para unirse al soporte. En tal ensayo competitivo, la cantidad de anticuerpo marcado capturado es inversamente proporcional a la cantidad de analito presente en la muestra de prueba. Se han descrito varios ensayos de este tipo en la técnica. Véase Smith D, et al., US 4.401.764, Clagett J, et al., US 4.746.631, Li C, et al., US 4.661.444, Chieregatt E, et al., GB 2084317, Mochida E, et al., US 4.185.084, Sadeh D, et al., US 4.243.749, Lucas F, et al., US 5.698.411, Landrum, anteriormente, Leuvering J, US 4.313.734, Gribnau T, et al., US 4.373.932, y Baugher B, et al., US 5.501.985. El uso de enzimas (en especial fosfatasa alcalina, betagalactosidasa, peroxidasa de rábano o ureasa) como marcador detectable (es decir, un inmunoensayo enzimático o EIA) es preferido.
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Los productos de PCR se clonaron en los vectores pNL4.3 y pCDNA3.1 usando el kit Rapid DNA Ligation (Roche Applied Science, Indianápolis, IN) según las especificaciones del fabricante. Los vectores recombinantes de pNL4.3 y pcDNA3.1 se introdujeron en las células competentes MAX Efficiency® Stb12™ y células competentes MAX Efficiency® DH5α™ (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE UU), respectivamente, y se amplificaron durante la noche (ON) a 30ºC con agitación en un volumen de 3 ml. Se realizaron varias transformaciones simultáneamente para evitar la pérdida de variabilidad y se mezclaron en el aumento a escala de la amplificación (250 ml, 30ºC, ON con agitación). Después de la incubación, se plaquearon 20 µl y el ADN del plásmido se purificó usando un sistema PureYield™ Plasmid Maxiprep (Promega, Madison, WI, EE UU). Ambos productos se digirieron además con XbaI y NotI para verificar la presencia del gen env. Si eran positivos, los clones se secuenciaron y/o usaron para transfección. Los virus se produjeron por cotransfección transitoria de células 293T usando las construcciones de pNL4.3. Se recogieron los sobrenadantes del cultivo celular que contenían los viriones 2 días después de la transfección y los viriones se concentraron usando una unidad de filtro centrífugo Amicon® Ultra. Los viriones se resuspendieron en solución salina tamponada con fosfato (PBS).
4. Ensayo de captura de viriones
Se recubrieron pocillos de microtitulación durante la noche a 4ºC con anti-Fc policlonal (5 µg/ml en 100 µl de PBS). Los pocillos se bloquearon con seroalbúmina bovina (BSA) al 3% en PBS durante 1 hora a 37ºC. Se añadieron 100 µl de virus (1000 ng/ml) originarios de la librería a los pocillos de mcirotitulación. Se añadieron 5 µl de los Acm de captura (100 ng/ml) a los pocillos correspondientes y la placa se incubó a 37ºC con agitación (450 rpm). Después de una incubación de 2 horas, los pocillos se lavaron seis veces con PBS y se cuantificaron equivalentes de virus por enzimoinmunoanálisis de adsorción (ELISA) de p24 o se extrajo el ARN con el kit High Pure Viral RNA (Roche Applied Science, Indianápolis, IN, EE UU) según las instrucciones del fabricante.
5. Amplificación de ARN de env de VIH-1 por RT-PCR anidada
Se amplificó el ARN de env del aislado de VIH-1 mediante transcripción inversa reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR) usando un kit de RT-PCR (The GeneAmp® Gold RNA PCR Reagent Kit; Applied Biosystems, Carlsbad, CA, EE UU) y un sistema de PCR Expand High Fidelity (Roche Applied Science, Indianápolis, IN). Se usó un volumen de molde de ARN de 8 µl para reacción de RT-PCR y el ARN se sometió a transcripción inversa con el cebador 102 (inverso) a 50ºC durante 20 minutos. La región env se amplificó con los cebadores 101 (directo) y 104 (inverso) de un volumen de 5 µl de ADNc seguido por una PCR anidada con los cebadores 179 (directo) y 180 (inverso) usando un volumen de 2 µl de molde. Véase la tabla 1. Las condiciones de ambas amplificaciones por PCR de env fueron: i) 1 ciclo de 94ºC durante 2 minutos, ii) 35 ciclos de 94ºC durante 2 minutos, 55ºC durante 1 minuto y 72ºC durante 3 minutos, iii) 1 ciclo de 72ºC durante 7 minutos y iv) parada a 4ºC. El amplicón resultante (2583 pb) se sometió a electroforesis con un marcador de peso molecular de 1 Kb en un gel de agarosa al 1,0% teñido con tinción de gel SYBR® Safe DNA.
6. Clonación y secuenciación del gen env
Los productos de PCR del paso anterior se clonaron en los vectores pNL4.3 y pcDNA3.1 como se ha descrito anteriormente. Se transformaron células competentes Stbl2 y DH5α con estos plásmidos como se ha ilustrado previamente. El ADN del plásmido se purificó usando un kit QIAprep Spin Miniprep (Qiagen, Valencia, CA, EE UU) y se digirió además con XbaI y NotI para verificar la presencia del gen env. Los clones positivos para env se secuenciaron usando BigDye® Terminator v3.1 y los cebadores 183 (directo), 185 (directo), 186 (directo), 190 (inverso), 192 (inverso) y 193 (inverso). Véase la tabla 1.
7. Análisis de secuencia
El alineamiento de las secuencias de nucleótidos se realizó usando las aplicaciones del programa CLUSTAL W (EMBL-EBI, http://www.ebi.ac.uk/FTP/, Febrero 2011) y programa Contig Assembly (CAP) integradas en BioEdit versión 7.0.9.0 y después se editaron a mano. Véase Thompson J, et al., Nucl. Acids Res. 1994; 22(22):673-4680 y Huang X, Genomics 1992; 14(1):18-25.

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