CN103459410A - HIV gp-120变体的快速选择方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于快速免疫原选择(rapid immunogen selection，RIS)的方法，其基于使包含所展示的表面多肽之随机化HIV gp120变体的重组病毒文库与所述中和抗体的结合。本发明还涉及根据本发明RIS方法分离之HIV gp120免疫原在用于治疗由病毒造成之疾病的药物中和在用于鉴定患者中中和抗体的诊断中的用途。

Description

HIV gp-120变体的快速选择方法
技术领域
本发明涉及可引发高中和抗体(neutralizing antibody，nAb)活性的免疫原的快速选择方法。本发明公开并举例说明了nAb活性增强的这些免疫原的几个实例。特别地，本发明公开了针对HIV-1Env表位的抗体亲和力增强的免疫原。
背景技术
据估计，自1982年以来全世界已有多于6千万人感染了人免疫缺陷病毒。在相同时间范围中这些感染个体中有近一半死于所产生的获得性免疫缺陷综合征(Acquired Immunodeficiency Sydrome，AIDS)。虽然最近病毒传播似乎已到达稳定阶段，但是据报道在2009年仍有250万例HIV新感染。HIV仍然是主要的公共健康问题。参见UNAIDS，2010Report onthe global AIDS epidemic。
HIV-1是迄今为止描述的遗传多样性最大的病毒病原体之一。HIV-1系统树有三个主要分支，M(主要)、N(新型)和O(离群)组。M组病毒是最广泛的，占全球感染的多于99％。主要基于短的env(包膜)基因序列，该组目前被分为九种不同的遗传亚型或分支(clade)(A至K)。参见McCutchan F，AIDS2000；14(S3)：S31-S44和Robertson D等，Science2000；288：55-56。
Env是变异性最大的HIV-1基因，在分支之间有多至35％的序列多样性，分支内有多至20％的序列多样性，并且在单个感染者中有多至10％的序列多样性。参见Kuiken C等，AIDS1996；10：31-37和Shankarappa R等，J.Virol.1999；73：10489-10502。分支B在欧洲、美国和澳大利亚占主导地位。参见Kuiken C等，AIDS1996；Am.J.Epidemiol.2000；152：814-822。分支C常见于非洲南部、中国和印度并且目前在全世界感染了比任何其他分支都更多的人。参见McCutchan，2000(见上文)。在非洲中部和东部以分支A和D为主。
然而，由于常见的共流行病毒(co-circulating viruse)之间的混合导致了分支间(interclade)的重组体，所以许多病毒难以归类至分支。参见Heyndrickx L等，J.Virol.200；74：363-370和McCutchan F等，Virology1999；254：226-234。一些重组形式事实上产生了重要的流行品系，称为流行重组形式(circulating recombinant form，CRF)。这些CRF中最常见的两种是在泰国发现的CRF01(AE)(其最初被归类为分支E，但是后来发现仅env是分支E而基因组的其他部分是分支A)，和非洲西部常见的AG重组形式CRF02。参见Robertson，2000(见上文)。在全球，分支A至D以及CRF01AE和CRF02AG重组体占全球感染的多于90％。
针对病毒包膜蛋白(Env)的中和抗体(nAb)是通过阻断易感细胞感染的针对HIV-1暴露的第一道获得性免疫防线。参见Kwong P等，Nature1998；393：648-659；Moore J等，J.Virol.1994；68：469-484；MooreP等，J.Virol.1996；70：1863-1872和Parren P等，AIDS1999；13：S137-S162。疫苗针对多种病毒的效力归因于其引发nAb的能力。参见Burton D，Nat.Rev.Immunol.2002；2：706-713和Zinkerangel R等，Adv.lmmunol.2001；79：1-53。然而，尽管付出了巨大的努力，但是关于开发有效HIV-1免疫原进展有限。参见Burton，2002(见上文)；McMichael A，Hanke T，Nat.Med.2003；9：874-880和Moore，1996(见上文)。这些免疫原的设计需要鉴定能够引起更好的nAb应答的表位。遗憾的是，到目前，开发引发广泛nAb应答的免疫原的所有尝试都失败了。
因此，本领域需要能够引起更好的nAb应答的新HIV-1免疫原。
发明内容
本发明涉及用于快速选择免疫原(rapid selection of immunogen，RIS)的方法，所述免疫原在用作B细胞免疫原时可引发高nAb活性。所述方法包括：i)使野生型目的表位的核苷酸编码序列随机突变以产生所述表位之变体的文库，ii)用已知对野生型表位具有亲和力的抗体或其部分测试文库，以及iii)选择抗体亲和力增加的表位变体。优选地，所述表位是HIV表位。更优选地，所述表位是Env表位。
在第二实施方案中，本发明涉及通过RIS方法得到的核苷酸序列和肽，例如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：3的核苷酸序列。
在第三实施方案中，本发明涉及通过RIS方法得到的核苷酸序列和肽用于预防和治疗完全或部分由野生型目的表位之作用引起的疾病的用途。优选地，所述疾病是AIDS或由HIV感染造成的疾病。
在第四实施方案中，本发明涉及RIS方法的诊断用途。
附图说明
图1.使用本发明RIS方法鉴定的突变体的序列。最上方的序列对应于AC10gp160多肽的121至160位氨基酸。所分离克隆中氨基酸与AC10gp160中氨基酸相同的对应区域的序列以点示出，或者在其中突变体序列与野生型序列不同的那些位置处用对应氨基酸示出。
图2.4E10抗体与LR1-C1特异性突变体之间所建议的相互作用。示出了整个env基因中的11个氨基酸替换，包括3个潜在N连接糖基化位点的缺失。C131Y突变尤其相关，原因是该替换消除了C131与C157之间的天然二硫键，破坏了V1／V2环的构造。
图3.使用根据本发明之RIS方法鉴定的LR1-C1病毒体示出对于广泛中和抗体(broadly neutralizing antibody)4E10增加的亲和力。图示出通过将增加量的AC10野生型分离株和LR1-C1分离株添加到包被有4E10抗体或未经处理的板中所确定的病毒体与包被有4E10抗体的板结合的滴定。图表明与野生型变体相比，4E10抗体与LR1-C1的亲和力增加为4倍。
图4.使用根据本发明之RIS方法用4E10抗体鉴定的LR1-C1病毒体没有示出对于其他广泛中和抗体增加的亲和力。图示出通过将增加量的AC10野生型分离株、LR1-C1分离株或在env基因中携带缺失的病毒体添加到包被有2F5(图A)、2G12(图B)或b12(图C)抗体或未经处理的板中所确定的病毒体与包被有所述抗体之板结合的滴定。
图5.SEQ ID NO：31与AC10野生型HXB2序列的比对。SEQ IDNO：31对于PG16抗体具有亲和力。修饰序列示出两种突变：i)潜在糖基化位点中的N203S和ii)gp41免疫显性区中的G604E。
发明详述
A.快速免疫原选择(RIS)方法
本发明涉及一种用于优化作为免疫原的HIV-1包膜蛋白(Env)的新方法。该方法将表位依赖于其在病毒体上暴露而引发抗体的能力考虑在内。所述方法基于从具有随机突变包膜蛋白之病毒体的文库中选择对广泛nAb亲和力增加的变体。
根据本发明，使用来自HIV毒株AC10的全长env基因通过基于PCR的方法产生随机突变包膜的文库。克隆到pNL4-3环境中并通过瞬时转染至293T细胞中得到病毒体。通过改进的溶液中病毒体捕获测定(in-solution virion capture assay)进行与广泛nAb4E10亲和力增加的病毒的选择。从捕获的病毒群体中提取RNA并进行逆转录PCR以得到来自对应病毒的env基因用于进一步的测序并克隆回pNL4-3环境中。在一轮选择之后，分离了与4E10抗体亲和力增加为4倍的包膜。参见实施例。
因此，在第一方面中，本发明涉及一种用于鉴定能够引发针对多肽之中和抗体的免疫原的方法，其包括：
(i)使对所述多肽特异的中和抗体与重组病毒文库相接触，每一种所述重组病毒包含编码所述多肽之变体的随机化基因并表达所述多肽；
(ii)基于与中和抗体结合的能力，将重组病毒文库中与中和抗体结合的那些成员与不发生此结合的成员分离；以及
(iii)确定在步骤(ii)中选择的重组病毒文库成员中发现的变体多肽的序列。
本文使用的术语“免疫原”旨在指能够在个体中引起获得性免疫应答的物质，其中所述获得性免疫应答能够引起这样的免疫应答，其显著地作用于与免疫原共享免疫学特性的病原体。
本发明使用的术语“引发”在涉及免疫应答时，指特异性控制或影响免疫应答的活性，并且包括激活免疫应答、上调免疫应答、增强免疫应答和／或改变免疫应答(例如，通过引发某一类型的免疫应答，进而使对象中免疫应答的普遍类型(prevalent type)由有害或无效的改变成有利或保护性的)。
术语“中和抗体”是与病原体结合并干扰所述病原体感染细胞和／或引起对象疾病的能力的抗体或其抗原结合片段。通常，用于本发明方法的中和抗体与病原体的表面结合，并且相对于不存在所述抗体或存在阴性对照时的病原体感染，使病原体感染被抑制或减少至少99％、至少95％、至少90％、至少85％、至少80％、至少75％、至少70％、至少60％、至少50％、至少45％、至少40％、至少35％、至少30％、至少25％、至少20％或至少10％。然后可使用本文提供方法中的任一种来测试nAb以确定它们是否具有中和活性或BNAb活性。如果中和抗体或BNAb在非人动物中产生，则CDR可由非人框架转移至人框架以产生适于施用于人的抗体。本领域中已描述了用于确定抗体是否是nAb的方法。参见Li M等，J.Virol.2005；79：10108-10125；Wei X等，Nature2003；422：307-312和Montefiori D，Curr.Protoc.Immunol.2005；Jan，第12章：第12.11单元。这些方法基于，在使用病毒对编码报道基因的接受细胞系进行单轮病毒感染之后确定报道基因表达的减少。
本文使用的术语“病毒”指可仅在生物体活细胞内复制的小感染源(infectious agent)。可用于本发明方法的病毒家族的非限制性实例包括腺病毒科(adenoviridae)、非洲猪瘟样病毒(African swine fever-likeviruse)、沙粒病毒科(arenaviridae)、动脉炎病毒(arterivirus)、星状病毒科(astroviridae)、杆状病毒科(baculoviridae)、双RNA病毒科(birnaviridae)、布尼亚病毒科(bunyaviridae)、杯状病毒科(caliciviridae)、圆环病毒科(circoviridae)、冠状病毒科(coronaviridae)、δ病毒(deltavirus)、丝状病毒科(filoviridae)、黄病毒科(flaviviridae)、嗜肝DNA病毒科(hepadnaviridae)、肝炎病毒科(hepeviridae)、疱疹病毒科(herpesviridae)、正粘病毒科(orthomyxoviridae)、副粘病毒科(paramyxoviridae)、小RNA病毒科(picomaviridae)、痘病毒科(poxyviridae)、呼肠孤病毒科(reoviridae)、逆转录病毒科(retroviridae)和弹状病毒科(rhabdoviridae)。
A.1接触步骤
在第一步中，本发明的方法包括使对在所述病毒表面上展示的多肽特异的中和抗体与重组病毒文库相接触，每一种所述重组病毒包含编码在病毒表面上展示的所述多肽之变体的随机化基因。
本文使用的术语“文库”指包含编码不同重组多肽的多核苷酸的多核苷酸多样集合或混合体。本发明方法中待使用文库的大小和复杂性可以不同。例如，本发明的方法可用于筛选具有多至500000种不同成员的文库，或具有1×106、1×108种或更多种成员的文库。典型的病毒文库具有1×108至1×1013种成员，并且这样的文库可使用本发明的方法来筛选。实际上，虽然优选这样的文库，但是本方法也可显然地用于筛选小得多的文库(例如，具有1000至50,000、50至1000、或100至500、或10至100、或5至100种成员的文库)。变体文库的多样性可通过在DNA三联体(triplet)水平上诱变编码变体的基因使得单个密码子产生差异(例如，通过在PCR反应中使用部分随机化序列的引物)来产生。
当本文提及分子的文库时，该术语可用于指核酸或蛋白质水平(即，在所编码蛋白质表达发生之前或之后)下的这种文库。然而，显然地，为了进行结合伴侣(binding partner)相互作用的选择，这样的表达文库必须以蛋白质水平存在。因此，为了使接触步骤(a)成功发生，文库必须以蛋白质水平存在(但是最初它们可以以核酸水平存在)。
在一个优选实施方案中，步骤(i)中所用中和抗体所针对的多肽在病毒中表达。在一个优选实施方案中，多肽“在病毒表面上”展示。本文使用的该术语指在不需要破坏病毒结构的情况下可接近试剂(例如抗体)的任何多肽。应理解，在表面上展示的多肽对于无包膜病毒而言可以是衣壳多肽，或对于包膜病毒而言可以是包膜多肽。在一个优选实施方案中，在病毒表面上展示的多肽是包膜多肽。
可对任何病毒包膜蛋白进行改造以得到重组病毒的文库，每一种所述重组病毒包含编码所述多肽之变体的随机化基因。示例性的抗原包括选自以下的那些：流感病毒血凝素，人呼吸道合胞病毒G糖蛋白，登革病毒的核心蛋白、基质蛋白或其他蛋白质，麻疹病毒血凝素，单纯疱疹病毒2型糖蛋白gB，脊髓灰质炎病毒I VP1，HIV-1或HIV-II的包膜或衣壳糖蛋白，乙型肝炎表面抗原，白喉毒素，链球菌24M表位，淋球菌菌毛蛋白，假狂犬病病毒g50(gpD)，假狂犬病病毒II(gpB)，假狂犬病病毒gIII(gpC)，假狂犬病病毒糖蛋白H，假狂犬病病毒糖蛋白E，传染性胃肠炎糖蛋白195，传染性胃肠炎基质蛋白，猪轮状病毒糖蛋白38，猪细小病毒衣壳蛋白，Serpulinahydodysenteriae保护性抗原，牛病毒性痢疾糖蛋白55，新城病毒血凝素-神经氨酸酶，猪流感血凝素，猪流感神经氨酸酶，口蹄疫病毒，猪霍乱病毒(hog colera virus)，猪流感病毒，非洲猪瘟病毒，支原体liyopneutiioniae，牛传染性鼻气管炎病毒，牛传染性鼻气管炎病毒糖蛋白E、糖蛋白G，传染性喉气管炎病毒，传染性喉气管炎病毒糖蛋白G或糖蛋白I，La Crosse病毒的糖蛋白，新生牛腹泻病毒，委内瑞拉马脑炎病毒，punta toro病毒，鼠白血病病毒，小鼠乳房肿瘤病毒，乙型肝炎病毒核心蛋白和乙型肝炎病毒表面抗原或其片段或衍生物，马流感病毒或马疱疹病毒的抗原(包括马流感病毒类型A／阿拉斯加91神经氨酸酶、马流感病毒类型A／迈阿密63神经氨酸酶、马流感病毒类型A／肯塔基81神经氨酸酶、马疱疹病毒类型1糖蛋白B和马疱疹病毒类型1糖蛋白D)，牛呼吸道合胞病毒或牛副流感病毒的抗原(牛呼吸道合胞病毒附着蛋白(BRSV G)、牛呼吸道合胞病毒融合蛋白(BRSV F)、牛呼吸道合胞病毒核衣壳蛋白(BRSVN)、牛副流感病毒3型融合蛋白、牛副流感病毒3型血凝素神经氨酸酶)，牛病毒性腹泻病毒糖蛋白48和糖蛋白53。
优选地，重组病毒的文库是逆转录病毒的文库。术语“逆转录病毒”意指通过酶逆转录酶由其RNA基因组产生DNA从而在宿主细胞中复制并且属于家族逆转录病毒科(retroviridae)的任何RNA病毒。
术语“逆转录病毒”以其常规意义用于本文并且一般包括其中遗传物质是单链RNA并且采用逆转录酶在宿主中将病毒RNA转录为DNA的一类病毒。本文所指的逆转录病毒可特别地属于病毒家族逆转录病毒科，更特别地属于亚科肿瘤病毒亚科(oncovirinae)、慢病毒亚科(lentivirinae)或泡沫病毒亚科(spumavirinae)。本文所指的逆转录病毒可以是致病的。Env序列可来源于任何已知的逆转录病毒，包括但不限于HIV、MuLV、SMRV、SFV、HPV、MMTV、SRV、HTLV-I、HTLV-II、BLV、BIV、SIV、维斯纳病毒(visna virus)、EIAV、FIV和EIAV；以及来源于逆转录病毒亚科的任何一种(例如，肿瘤病毒亚科、慢病毒亚科或泡沫病毒亚科)。许多逆转录病毒克隆(包括HIV-1克隆)是良好表征并且可获得的。
本文特别指的是感染动物的逆转录病毒，更优选温血动物的逆转录病毒，甚至更优选脊椎动物的逆转录病毒，更优选哺乳动物的逆转录病毒，又更优选灵长类动物的逆转录病毒，并且最优选人的逆转录病毒。本文特别优选的是包括但不限于HIV-1、HIV-2、HTLV-I和HTLV-2的人逆转录病毒。已良好确立的HIV(和其他逆转录病毒)序列信息库包括GenBank、EMBL、DDBJ和NCBI。经良好表征的HIV-1克隆包括HXCB2、HIV-1-MN和HIV-1-MN-ST.1。参见Hall L等，J.Virol.1992；66(9)：5553-5560。
在一个优选实施方案中，重组病毒的文库是由至少一种表面多肽随机化所产生的HIV病毒的文库。本文中使用首字母缩略词“HIV”来一般性地指人免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus)，包括人免疫缺陷病毒1(HIV-1)和人免疫缺陷病毒2(HIV-2)的所有分支和/或毒株并且与用于HIV的较老术语(例如HTL VIII和LAV)同义。
在一个更优选的实施方案中，HIV文库中的不同成员在env基因中随机化。本文使用的术语env基因指病毒基因组中编码HIV包膜蛋白的多核苷酸。本文使用的术语“Env多肽”或“包膜多肽”指来源于HIV包膜蛋白的分子。HIV的包膜蛋白是约160kd的糖蛋白(gp160)。在病毒感染宿主细胞期间，gp160被宿主细胞蛋白酶切割形成gp120和膜内在蛋白质(integral membrane protein)gp41。
“gp120多肽”是来源于Env多肽之gp120区的分子。成熟的gp120野生型多肽在其一级序列中具有约500个氨基酸。gp120被重度N糖基化，产生了120kD的表观分子量。gp120的的氨基酸序列为约511个氨基酸。gp120包含穿插在五个可变结构域(V1至V5)中的五个相对保守的结构域(C1至C5)。可变结构域包含大量的氨基酸替换、插入和缺失。“gp120多肽”包括单一亚基和多聚体两种。gp41部分锚定在病毒体的膜双层中(并且跨越膜双层)，而gp120区段凸出到周围环境中。gp120的受体结合结构域定位在蛋白质的N端一半上。这之后是脯氨酸富集区(PRR)，认为其作为与结合融合机制之受体通讯的枢纽(hinge)或触发物起作用。gp120的C端是高度保守的并且与gp41相互作用。野生型gp160多肽的示例性序列是可获得的。参见GenBank登录号AAB05604和AAD12142。
env基因的随机化可在完整env基因序列上进行，或优选地在env基因中对应于gp120编码区域的部分上进行，原因是gp120是与靶细胞上的受体相互作用并且构成与中和抗体结合的最佳候选物的分子。而且，env基因中编码gp120的区域的随机化可在整个序列上进行或针对gp120多肽的一个或更多个结构域。因此，根据本发明的RIS方法考虑了使用在gp120的任意保守环(C1至C5)、gp120任意可变环(V1至V5)或者优选的保守区与可变环之组合中进行随机化产生的HIV文库。在一个优选实施方案中，随机化在整个env基因上进行。在另一个实施方案中，随机化在env基因的对应于gp120的区域中进行。在另一个实施方案中，随机化在env基因的对应于gp120V1和/或V2区的区域中进行。
可使用任意诱变技术将突变引入到核酸分子中。参见Sambrook J等，“Molecular Cloning.A Laboratory Manual”(Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，US，1989)；Bishop T等，“Nucleic Acid and Protein Sequence.A Practical Approach”(IRL Press，Oxford，England，1987)；Reznikoff W编，“Maximizing Gene Expression”(Butterworths Publishers，Stoneham，MA，US，1987)；Davis L等，“BasicMethods in Molecular Biology”(Elsevier Science Publishing Co.，NewYork，NY，US，1986)；Schleef M编，“Plasmid for Therapy andVaccination”(Wiley-VCH Verlag GmbH，Weinheim，Germany2001)；Adereth Y等，Biotechniques2005，38：864-868；Allan J等，Biotechniques1995；18：746-750；Bubeck A等，J.Virol.2004，78：8026-8035；Doran B，美国专利公开20070111201；Locher C等，DNA Cell Biol.2005；24：256-263；Vasl J等，Biotechniques2004；37：726-730；Weiss G等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA2000；97：8950-8954和Delcourt M，US6,924,112。诱变策略包括随机诱变、丙氨酸扫描诱变(Ala-scan mutagenesis)、位点特异性诱变和嵌合重组。诱变试剂盒和服务是广泛市售的。
术语“中和抗体”包括BNAb的亚类。本文使用的“广泛中和抗体”或“BNAb”应理解为通过任何方法得到的这样的抗体，当其以有效剂量递送时可用作治疗剂用于针对多于7种HIV毒株(优选多于8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多种HIV毒株)预防或治疗HIV感染或AIDS。用于根据本发明之RIS方法的合适中和抗体包括但不限于，针对近膜端外部区(membrane-proximal external region，MPER)的抗体、针对CD4结合位点的抗体和针对高甘露糖聚糖的抗体。在一些优选实施方案中，用于根据本发明方法之RIS方法的中和抗体包括选自以下的抗体中的一种或更多种：
a)识别gp41胞外结构域中邻近病毒膜的区段的4E10抗体。参见Cardoso R，等，Immunity2005；22：163-173，PHSL登录号90.091703，NIH ARRRP目录号10091和Katinger H等，US5,753,503；
b)识别gp41胞外结构域中邻近病毒膜的区段的2F5抗体。参见OfekG，等，J.Virol.2004；78：10724-10737，PHSL登录号90.091704，NIHARRRP目录号1475和Katinger(见上文)；
c)EP0822941中描述的与HIV-1的两种不同抗原决定簇结合的抗体，其中所述抗原决定簇是gp160的片段，以及对应于处理的HIV-1分离株BH10中gp120的79至184位和326至400位氨基酸。参见PHSL登录号95032240和95032241；
d)识别gp120外部表面上的碳水化合物的2G12(mAb2G12)。参见Trkola A等，J.Virol.1996；70：1100-1108，EACC登录号93091517和NIH ARRRP目录号1476；
e)识别CD4结合位点的b12抗体。参见Burton D等，Science1994；266：1024-1027，NIH ARRRP目录号2640和Burton D等，EP0675904；以及
f)中和抗体PG9、PG16、PG20、PGG14和PGC14。参见Chan-HuiP等，WO2010107939。
本领域中已描述了用于确定抗体是否是nAb的方法。这些方法中有一些是基于，确定使用编码报道基因的接受细胞系进行单轮病毒感染后抗体对报道基因表达之作用的减少。参见Li，2005，Wei，2003，Montefiori，2005(见上文)和Alvin C，WO2009117661。
根据本发明使用的抗体的中和能力可通过IC50(即，引起靶细胞感染降低50％的抗体浓度)进行表征。优选地，根据本发明使用的中和抗体的IC50为2μg／mL或更低(小于0.15μg／mL、小于0.125μg／mL、小于0.10μg／mL、小于0.075μg／mL、小于0.05μg／mL、小于0.025μg／mL、小于0.02μg／mL、小于0.015μg／mL、小于0.0125μg／mL、小于0.01μg／mL、小于0.0075μg／mL、小于0.005μg／mL或小于0.004μg／mL(抗体浓度为10-8或更低、优选10-9M或更低、优选10-10M或更低，即10-11M、10-12M、10-13M或更低)。这意味着在体外中和HIV临床分离株的50％仅需要非常低的抗体浓度。可以使用本领域所述的标准中和测定来测量效力。
在足以使得重组病毒文库中能够与中和抗体特异性结合的那些成员确实与所述抗体结合的条件下进行接触步骤。
本文使用的术语“特异性结合”(或其衍生词)指结合对(例如，两种蛋白质或化合物)之间的相互作用。在一些实施方案中，相互作用的亲和常数为至多10-6摩尔／升、至多10-7摩尔／升或至多10-8摩尔／升。一般来说，短语“特异性结合”指一种化合物与另一种化合物的特异性结合，其中通过任何标准测定(例如，免疫测定)所测量的结合水平在统计上显著高于测定的背景对照。
接触步骤期间的条件可以由本领域技术人员以常规方式进行确定。示例性的“接触”条件可包括孵育15分钟至4小时(例如，在4℃、37℃或室温下孵育1小时)。然而，这些可以根据例如相互作用的结合伴侣的性质而视情况改变。样品可任选地并优选地经历温和摇动、混合或旋转。此外，可添加其他适当的试剂，例如降低非特异性结合的封闭剂。例如，可使用1％至4％的BSA或其他合适的封闭剂(例如，乳)。然而，应理解，接触条件可以不同并且可以由本领域技术人员根据筛选方法的目的来调整。例如，如果孵育温度是例如室温或37℃，则这可增加鉴定在这些条件下稳定的结合剂(binder)(例如，在在37℃孵育的情况下，在人体条件下稳定的结合剂)的可能性。如果结合伴侣之一或两者是一些治疗应用中待使用的候选物(例如，抗体)，则这样的特性可能是极其有利的。这样的调整在技术人员的技术范围内。
在一个优选实施方案中，可使用本领域技术人员已知的多种技术(在专利和科学文献中有充分描述)将用于接触步骤的中和抗体固定在固体支持物上。固体支持物可以是本领域技术人员已知的抗体可与其连接的任何材料。例如，固体支持物可以是微滴定板中的测试孔或硝酸纤维素滤膜或其他合适的膜。或者，支持物可以是珠或盘，例如玻璃、纤维玻璃、乳胶或塑性材料(例如聚苯乙烯或聚氯乙烯)。支持物也可以是磁性颗粒或光纤传感器。参见Jorgenson R等，US5,359,681。
可使用本领域技术人员已知的多种技术(在专利和科学文献中有充分描述)将抗体固定在固体支持物上。在本发明的上下文中，固定包括非共价缔合(例如，吸附)和共价结合(其可以是抗原与支持物上的官能团之间的直接连接或可以是借助交联剂的连接)两种。优选通过吸附至微滴定板的孔或膜进行固定。在这样的情况下，吸附可通过在合适缓冲液中使抗体与固体支持物接触合适时间来实现。接触时间随温度而改变，但是通常在约1小时与1天之间。在一个实施方案中，使塑料微滴定板(例如聚苯乙烯或聚氯乙烯)的孔与量为约10ng至约1μg并且优选约100至200ng的抗体接触足以固定足够量的多肽。
抗体与固体支持物的共价结合还可通过首先使支持物与双功能试剂反应来实现，所述双功能试剂会与支持物和抗体上的官能团(例如羟基或氨基)二者反应。例如，可使用公知技术，使用苯醌或通过使支持物上的醛基与结合伴侣上的胺和活性氢缩合使抗体与具有适当聚合物涂层的支持物共价结合。
或者，代替将中和抗体共价或非共价地固定在支持物上，本发明考虑了这样的可行性，通过与第一抗体(对之前已固定在支持物上的Fc或抗Fc抗体片段特异)结合来固定抗体。除了帮助捕获抗体之外，第一抗体使中和抗体定向以增加对于与病毒文库成员结合具有活性的固定化抗体的百分比。例如，固定可这样来进行，即首先使已固定在固体支持物(通常为微滴定板的孔)上的抗体与文库接触，使得允许文库中对中和抗体样品显示出亲和力的那些病毒与固定化抗体结合。然后将未结合的样品从固定化抗体-病毒复合物中移除。更特别地，一旦如上所述使抗体固定在支持物上，通常封闭支持物上剩余的蛋白质结合位点。
A.2分离步骤
在第二步中，本发明的RIS方法包括基于与中和抗体结合的能力，将重组病毒文库中与中和抗体结合的成员与不发生此结合的成员相分离。
所述分离步骤可涉及物理分离(例如，在珠上或FACS)或将固相从反应混合物中移除，或者可涉及这样的步骤，其中使固相经历一次或更多次洗涤步骤以移除反应混合物的其他组分。在其中进行物理分离或移除固相的实施方案中，优选使固相也经历一次或更多次洗涤步骤。
洗涤步骤可根据固相和与其结合的相互作用结合伴侣的性质以任何适当方式来进行。洗涤颗粒固相的适当方法对于本领域技术人员是公知的。例如，如果固相是颗粒，则可通过在颗粒形成沉淀的条件下离心颗粒并且移除上清液来进行洗涤步骤。然后，可将颗粒重悬于适当的水性介质(例如，接触步骤中采用的相同介质)中。洗涤(或实际上，接触步骤)的强度(stringency)可通过添加本领域技术人员公知的适当试剂(例如，吐温)进行调整，以例如降低背景或非特异性性结合。这样的沉淀和重悬步骤构成一次洗涤。可进行任何适当次数的洗涤。然而，如果固相是磁性的，则洗涤步骤可常规地通过以下过程来进行：施加磁场于其中已进行接触步骤的容器，移除上清液并将固相重悬于适当的水性介质中。这样的磁性分离和重悬步骤构成一次洗涤步骤，并且可进行任何适当次数的洗涤。如果固体支持物是非颗粒的(例如，是平表面，例如板、盘或滤膜)，则洗涤这些固相的适当方法同样对于本领域技术人员是公知的。
与上述的任选洗涤步骤相同，应注意，在RIS方法的任何其他适当阶段也可进行一次或更多次的洗涤步骤。例如，也可在已进行任何固定步骤之后进行一次或更多次的洗涤固相的步骤，例如以移除未与固相结合的中和抗体。实际上，优选这样的洗涤步骤。另外，可在所述方法过程的其他适当时间对固相进行一次或更多次洗涤步骤，以移除例如未结合的实体。本领域技术人员可容易地确定所需的洗涤次数。
一旦移除反应混合物中与中和抗体弱结合的非特异性结合的组分，最后通过洗脱重组病毒文库中已与中和抗体特异性结合的那些成员来进行分离步骤。根据固定类型，所述洗脱步骤可通过任何合适方法进行，例如，通过采用破坏非共价键的碱，去污剂或类似试剂，然后中和，以使得相互作用的伴侣重新折叠并与彼此结合。一般来说，在生物素标签的情况下，将包含这种标签的文库构建体改造成包含用于切割的一些类型的位点，像蛋白酶位点、限制酶位点或可用二硫苏醇糖(DTT)打开的可切割S-S接头部分。也可使用TEA。切割位点(例如上述的那些)可与任何类型的标签一起使用以使得能够洗脱或有助于洗脱。
由洗脱步骤引起的病毒从中和抗体中的释放通常可通过测量上清液中一种或更多种病毒多肽的存在来进行。在一个优选实施方案中，测定的多肽是病毒衣壳多肽。当特别地使用HIV文库时，可适用于一些本文所示实施方案的HIV蛋白质的非限制性实例包括HIV gag蛋白p53、p24、p17、p7、p6、p2或p1；HIV env糖蛋白gp120、gp41或gp160；HIV酶包括整合酶(p31)、逆转录酶(p51或p66)、RNA酶H(p15)、蛋白酶(p10)、HIV nef蛋白(p25／p27)、HIV vif蛋白p23、HIV rev蛋白p19、HIV vpr蛋白(p12／p10)、HIV vpU蛋白(p16)或HIV tat蛋白(p16／p14)。在一个优选实施方案中，用于确定所选择的病毒是否已从中和抗体中有效洗脱所测定的HIV多肽是p24。
本文使用的术语“HIV p24”指HIV gag区域的基因产物，其特征在于表观相对分子量为约24,000道尔顿。术语“HIV p24”还指具有p24免疫学活性的p24的修饰形式和片段。
可通过酶免疫测定来测量p24，而结合p24的检测需要用酸进行预处理以解离复合物。虽然制造商之间使用的方法不同，但是HIV p24抗原测试采用进行了改造以检测抗原而非抗体的ELISA技术。在一种代表性测定(例如“抗体夹心”式)中，使针对HIV p24的特异性单克隆抗体与固相(微滴定板孔或聚苯乙烯珠)结合以在添加时起“捕获”样品中病毒抗原的作用。添加去污剂(例如，Triton X100)以破坏病毒体，如果基质中存在抗原，则抗原与固相上的单克隆抗体结合。
A.3检测步骤
在第三步中，根据本发明的RIS方法包括确定在步骤(ii)中所选择的那些文库成员中病毒表面上展示的所述变体多肽的序列。
一旦根据本发明方法选择或分离了病毒文库中的一组或更多组相互作用成员，使这些成员经历进一步的分析。所述进一步的分析或使用一般需要使候选结合伴侣与中和抗体分开、移除、分离或洗脱并且进行进一步的表达或产生。因此，本发明的方法还包括这样的步骤，其中使病毒文库中能够与中和抗体特异性相互作用的所述成员分开、移除、洗脱或优选分离，或者在彼此分离的情况下被表达或产生。所述进一步分析一般涉及通过以下来分离单个相互作用文库成员：通过从结合病毒分离RNA，使病毒RNA逆转录为cDNA并将所述cDNA克隆到合适的表达载体中。
一旦编码结合伴侣的DNA被克隆到合适的表达载体中，可对编码结合伴侣的DNA进行测序，或可以以可溶形式表达蛋白质并使其经历适当的结合研究以进一步在蛋白质水平表征候选物。适当的结合研究取决于结合伴侣的性质，并且包括但不限于ELISA、过滤筛选测定、FACS或免疫荧光测定、BiaCore亲和力测量或定量结合常数的其他方法、染色组织切片或细胞以及其他免疫组织化学方法。这样的方法在文献中已良好记载并且他们的一种或更多种可用于分析所选择的包膜蛋白变体。
如上所提到的，用于分析单个相互作用结合伴侣的适当方法是本领域已知的。一种优选方法是，对文库中与中和抗体特异性结合的病毒的遗传物质进行测序。
通常，在具有RNA作为遗传物质的逆转录病毒的情况下，检测步骤包括分离RNA，使RNA逆转录以得到单链cDNA，处理单链DNA以得到双链DNA，将双链cDNA克隆到所选择的载体中并对cDNA进行测序。
逆转录使用本领域技术人员已知的方法进行，并且可等温地，以及在RNA依赖性DNA聚合酶存在下通过使用热稳定的RNA聚合酶进行，所述RNA依赖性DNA聚合酶包括但不限于，AMV、克隆的AMV、MMLV、SuperscriptII、ReverTraAce、Tth逆转录酶、乙型肝炎逆转录酶、花椰菜花叶病毒逆转录酶、细菌逆转录酶和Thermoscript。本发明采用的酶包括RNA酶H活性被降低、大大被降低或完全消除的那些酶。“RNA酶H活性大大降低”的酶意指具有小于约20％，优选小于约15％、10％或5％，并且最优选小于约2％的相应野生型或RNA酶H+酶的RNA酶H活性的酶，例如野生型莫罗尼鼠白血病病毒(M-MLV)、禽成髓细胞增多症病毒(AMV)或劳斯氏肉瘤病毒(RSV)逆转录酶。任何酶的RNA酶H活性可通过多种已知测定来确定。参见Kotewicz M等，Nucl.Acids Res.1988；16：265-277，Gerard G等，Focus1992；14(5)：91-93和Kotewicz M等，US5,244,797。用于本发明的一些特别优选的多肽包括但不限于，M-MLV逆转录酶、RSV逆转录酶、AMV逆转录酶、RAV(劳氏相关病毒)逆转录酶、MAV(成髓细胞增多症相关病毒)逆转录酶和HIV逆转录酶。参见Kotewicz M等，US5,244,797和Gerard G等，WO1998047912。然而，本领域普通技术人员应理解，能够由核糖核酸分子产生DNA分子(即，具有逆转录酶活性)的任何酶可等价地用于本发明的组合物、方法和试剂盒。
可使用本领域已知的任何方法处理单链cDNA以得到双链DNA。优选地，使用体外扩增技术进行单链dDNA向双链DNA的转化，例如聚合酶链反应(PCR)、连接酶链反应(LCR)、基于核酸序列的扩增(NASBA)、链置换扩增(SDA)、转录介导的扩增(TMA)、支链DNA技术(BranchedDNA technology,bDNA)、接头辅助的DNA扩增(linker-aided DNAamplification，LADA)、Qβ复制酶扩增(Q-beta)、环介导的等温扩增(LAMP)和滚动环扩增技术(Rolling Circle Amplification Technology，RCAT)或其他体外酶扩增技术。使用对应于适配体(adapter)区域之序列的引物进行扩增步骤。所得双链DNA可使用柱纯化、与引物结合的电磁珠、或通过琼脂糖凝胶电泳进行纯化。
然后可使用本领域已知方法将所得双链DNA插入到选定载体中。在一个优选实施方案中，在PCR扩增步骤期间使用的引物在其5’区中包含用于限制性内切酶的靶位点，其产生与选定载体中存在的那些相容的末端。内切酶靶位点允许产生可用于在适当载体中克隆多核苷酸的粘性末端。
可使用任何已知的测序手段进行测序步骤，例如化学测序(Maxam-Gilbert)、Sanger双脱氧测序、焦磷酸测序(pyrosequencing)、荧光检测测序和质谱DNA测序。
B.免疫原性多肽、多核苷酸、载体和宿主细胞
根据本发明的快速免疫原选择(RIS)方法允许鉴定这样的多肽，其是在病毒表面上展示的多肽的变体并且是用于产生中和抗体(并因此将其用作免疫原性组合物或疫苗)的候选物。因此，在另一方面中，本发明涉及通过本发明方法鉴定的多肽。
在本文中可与蛋白质互换使用的术语“多肽”指任何长度的氨基酸链，其中不同的氨基酸通过肽键或双硫桥彼此连接。
在根据本发明方法选择的病毒是逆转录病毒的具体情况下，多肽是包膜蛋白的变体。在一个优选实施方案中，逆转录病毒是HIV并且根据本发明的多肽是gp120变体。
根据本发明RIS方法鉴定的多肽优选在选自以下的区域中包含至少一个突变：C1恒定区、V1可变区、V2可变区、C2恒定区、C5恒定区和gp41胞外结构域。
在一个更优选的实施方案中，C1恒定区中的突变是第88位上的突变。在一个更优选的实施方案中，第88位上的突变残基是Asp。在一个更更优选的实施方案中，C1恒定区中的突变是N88D突变。
在一个更优选的实施方案中，V1可变区中的突变是在选自第131位、132位和138位的一个或更多个位置处的突变。在一个更优选的实施方案中，V1区中第131位、132位和138位上的突变残基分别是Y、N和/或G。在一个更更优选的实施方案中，V1区中的突变是C131Y、T132N和／或D138G。
在一个更优选的实施方案中，V2可变区中的突变是在选自第160位和187位的一个或更多个位置处的突变。在一个更优选的实施方案中，V2区中的突变残基是第160位上的Y和／或第187位上的Asp。在一个更更优选的实施方案中，V2区中的突变是N160Y和/或N191D。
在一个更优选的实施方案中，C2恒定区中的突变是第219位上的突变。在一个更优选的实施方案中，C2区中第219位上的突变残基是Val。在一个更更优选的实施方案中，C2区中的突变是I219V。
在一个更优选的实施方案中，C5恒定区中的突变是在选自第479位和507位的一个或更多个位置处的突变。在一个更优选的实施方案中，C5区中第479位和507位上的突变残基分别是Ile和Trp。在一个更优选的实施方案中，C5区中的突变是M475I和/或R507W。
在一个更优选的实施方案中，根据本发明突变的gp120变体或其片段携带C131Y、T132N、D138G和N160Y突变。
在一个更优选的实施方案中，根据本发明突变的gp120变体或其片段携带N88D、C131Y、T132N、D138G、N160Y、N191D、A226V、M479I、R507W和Y647N突变。
在另一个实施方案中，根据本发明的gp120变体或其片段携带N203S和G604E突变。
在一个更优选的实施方案中，gp41胞外结构域中的突变是T643N。
上述位置的编号指由SEQ ID NO：2所示HIV AC10HXb2分离株的env基因(SEQ ID NO：1)编码的gp160前蛋白的序列，其由SEQ ID NO：1所述env基因编码。参见Li，2005(见上文)和NCBI登录号AY835446。
在一个优选实施方案中，根据本发明的免疫原性多肽包含由SEQ IDNO：3的多核苷酸编码的LR1-C1分离株(SEQ ID NO：4)之enV多肽或其片段。LR1-C1分离株包含对应于SEQ ID NO：2编号的N88D、C131Y、T132N、D138G、T132N、N160Y、N191D、A226V、M479I、R507W和Y647N突变。
在一个优选实施方案中，根据本发明的免疫原性多肽包含用PG16抗体分离的克隆10的env多肽(SEQ ID NO：31)或其片段。经修饰序列显示出N203S和G604E突变。
在一个优选实施方案中，根据本发明的免疫原性gp120变体或其片段包含选自以下的序列：SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ IDNO：28、SEQ ID NO：29和SEQ ID NO：31。
虽然显示出针对在本说明书中已确定的中和抗体亲和力增加的gp120突变体来源于AC10HIV分离株(NCBI登录号AY835446和SEQID NO：1所示env基因)，但是应理解，根据本发明的免疫原性多肽可通过替换其他HIV分离株env基因的相应位置而来源于所述其他HIV分离株。其他HIV分离株中的相应位置可使用任何合适的序列比对算法无需进一步步骤而直接测定。
用于比较的序列比对方法在本领域是公知的。可例如通过Smith-Waterman局部同源性算法、通过Needleman-Wunsch同源性比对算法、通过Pearson-Lipman相似性搜索法、通过这些算法的电脑化执行或通过手动比对和目测观察来进行用于比较的序列最佳比对。参见SmithT，Waterman M，Adv.Appl.Math.1981；2：482-489；Needleman S，Wunsch C，J.Mol.Biol.1970；48：443-453；PearsonW，Lipman D，Proc.Natl.Acad.Sci.USA1988；85：2444-2448；the GAP，BE STFIT，FASTA andTFASTA programs，Wisconsin Genetics Software Package，GeneticsComputer Group，Madison，WI，US；Ausubel F等编，“Short Protocols inMolecular Biology”，第4版(John Wiley and Sons，Inc.，New York，NY，US)。
“片段”是编码本发明HIV-1包膜多肽的多核苷酸的独特部分，其长度短于来源序列(parent sequence)。类似地，术语“片段”指，包含多至减去一个氨基酸残基的所定义肽序列全长的本发明HIV-1包膜多肽，以及其编码核苷酸序列。例如，片段可包含5至2500个连续核苷酸或氨基酸残基。用作探针、引物、抗原、治疗分子或用于其他目的的片段的长度可以是至少5、10、15、16、20、25、30、40、50、60、75、100、150、250、500个或至少700个连续核苷酸或氨基酸残基。片段可优选地选自分子的某些区域。例如，多肽片段可包含选自多肽前250个或500个氨基酸(或前25％或50％)(如所定义的某定义序列所示的)的某一长度的连续氨基酸。清楚的是，这些长度是示例性的，并且本发明实施方案可包括本说明书(包括序列表、表格和附图)所支持的任意长度。
本公开内容涉及核酸构建体，其包含编码HIV-1抗原性gp120多肽的多核苷酸序列。这些多核苷酸包括编码目的多肽的DNA、cDNA和RNA序列。
本发明使用的术语“多核苷酸”指通过可变数目的单体形成的多聚体，其中所述单体是核苷酸，包括核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸两种。所述多核苷酸包含通过甲基化修饰的单体以及未修饰形式。术语“多核苷酸”和“核酸”在本发明中可互换使用并且包括mRNA、cDNA和重组多核苷酸。本发明所使用的多核苷酸不限于与在天然状态下所呈现的相同的多核苷酸，而包括包含非天然核苷酸类似物和核苷酸间键的多核苷酸。
用于将本发明核酸进行操纵并插入载体中的方法在本领域是公知的。参见Sambrook，1989(见上文)和Ausubel F等编，“Short Protocols inMolecular Biology”，第4版(John Wiley and Sons，Inc.，New York，NY，US，2002)。
通常，编码本发明gp120多肽的核酸构建体是质粒。然而，可使用其他载体(例如，病毒载体、噬菌体、粘粒)来复制核酸。在本发明的上下文中，核酸构建体通常是表达载体，其包含有助于所插入的基因序列有效转录的启动子序列。表达载体通常包含复制起点、启动子以及允许对转化细胞进行表型选择的特异性核酸序列。
更一般地，可使编码本发明gp120多肽的多核苷酸序列与能够在引入到宿主细胞后驱动核酸表达的任何启动子和／或增强子可操作性连接。启动子是引导核酸转录的一列核酸控制序列。启动子包括(可)接近转录起始位点的必需核酸序列，例如在II型聚合酶启动子的情况下(TATA元件)。启动子还可包含可位于距转录起始位点多至几千个碱基对的远端增强子或抑制元件。包括组成型和诱导型启动子两种。参见Bitter G等，Meth.Enzymol.1987；153：516-544。
为了产生这样的核酸构建体，将编码gp120多肽的多核苷酸序列插入到合适的表达载体(例如质粒表达载体)中。用于生产编码gp120多肽的多核苷酸序列和用于在体外操纵它们的方法对于本领域技术人员是公知的。参见Sambrook，1989和Ausubel，2002(见上文)。
可将编码免疫原性gp120多肽的多核苷酸序列插入到表达载体中，所述表达载体包括但不限于质粒、病毒或可被操纵以允许插入或整合序列并且可在原核生物或真核生物中表达的其他运载体中。宿主可包括微生物、酵母、昆虫和哺乳动物生物体。在原核生物中表达具有真核生物或病毒序列的DNA序列的方法在本领域是公知的。能够在宿主中表达并复制的生物功能性病毒和质粒DNA载体在本领域是已知的。
用重组DNA转化宿主细胞可通过本领域普通技术人员公知的常规技术来进行。在宿主是原核生物(例如大肠杆菌)的情况下，可使用本领域公知的步骤由在对数生长期后收获并随后经CaCl2法处理的细胞制备能够进行DNA摄取的感受态细胞。或者，可使用MgCl2或RbCl。转化也可在形成宿主细胞的原生质体(如果期望的话)后或通过电穿孔进行。
当宿主细胞是真核生物时，可使用这样的DNA转染方法，例如磷酸钙共沉淀、常规机械方法(例如微注射)、电穿孔、插入包埋在脂质体中的质粒、或病毒载体。也可用编码免疫原性gp120多肽的多核苷酸序列和编码可选择表型的第二外源DNA分子(例如单纯性疱疹胸苷激酶基因)共转化真核细胞。另一种方法是使用真核生物病毒载体(例如猴病毒40(SV40)或牛乳头瘤病毒)来瞬时感染或转化真核细胞并表达蛋白质。参见Gluzman Y编，“Eukaryotic Viral Vectors”(Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，US，1982)。
C.抗体
根据本发明的gp120变体或其片段也可用于产生抗体，当对象的生物流体中存在病毒或其颗粒时所述抗体产生能够识别并中和HIV。因此，在另一方面中，本发明涉及与根据本发明的免疫原性多肽特异性结合的抗体。
如本发明中所使用的，术语“抗体”指这样的单体蛋白或多聚体蛋白质，其包含具有与确定抗原相结合的能力并且包含免疫球蛋白分子轻链或重链可变区之全部或部分的至少一种多肽。本发明的抗体包括但不限于，单克隆抗体、单特异性抗体、多克隆抗体、多特异性抗体、双抗体(diabody)、三抗体(triabody)、四抗体(tetrabody)、人抗体、人源化抗体、骆驼化抗体(camelized antibodies)、嵌合抗体、单链抗体、单域抗体(single domain antibody)、Fab片段、F(ab)’片段、F(ab)’2片段、Fv片段(即，抗体的最小功能模块)、单链Fv(scFv)、二硫化物稳定化Fv(dsFv)、Fd、VH、VL、Vα、Vβ和抗独特型(抗Id)抗体(例如，针对本发明抗体的抗Id抗体)、内抗体(intrabody)和任意上述抗体的表位结合片段。在一些实施方案中，抗体是单克隆抗体。在另一些实施方案中，抗体是Fv片段，包括VH和VL区。
可利用本发明的肽通过常规手段产生这些抗体。参见Kieber-Emmons T等，WO1991004273。例如，可通过以下方法产生多克隆抗体：用以上鉴定的肽之一或两种或多价构建体常规地刺激所选择动物的免疫系统，允许免疫系统产生针对其的天然抗体，并从动物血液或其他生物流体中收集这些抗体。通过使用如上所述的多价构建体作为抗原可得到高效价的多克隆抗体。所得抗体能够结合与感染对象的生物流体中存在的形式相同的选定HTV抗原。
另外，本发明的肽还可用于产生这样的抗体，其可用作模板以产生抗独特型抗体，所述抗独特型抗体具有肽序列所含中和表位结构的内影像(internal image)。然后这些抗体(多克隆或单克隆抗体)可用于疫苗制剂或主动免疫疗法。因此，本发明还包括携带有肽的内影像的单克隆或多克隆抗体，以及用于产生这些抗体的方法。参见Kieber-Emmons(见上文)。
在期望得到单克隆抗体(MAb)并将其用于本发明的组合物和方法的情况下，可使用公知的常规技术通过使用可用的肿瘤细胞系产生表达期望MAb的杂种瘤细胞系。参见
Figure BDA0000391052630000201
G，Milstein C，Nature1975；256(5517)：495-497。
重组抗体可使用用于其生产的已知技术来产生。参见Huse W等，Science1989；246：1275-1281。期望的高效价抗体也可通过对针对这些抗原开发的单克隆或多克隆抗体采用已知的重组技术来产生。参见Amit R等，Science1986；233：747-753；Queen C等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA1988；86：10029-10033；Riechmann L等，Nature1988；332：323-327和Barbas C等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA1992；89：4457-4461以及Winter P，GB2188638。
D.能够产生中和抗体的免疫原性组合物
本文公开的gp120变体多肽和编码变体gp120多肽的核酸分子可用作免疫原或用于产生免疫原以引发针对gp120或gp120表达病毒的免疫应答(免疫原性组合物)，从而预防、降低或控制例如HIV-1感染或其相关症状。在施用治疗有效量的所公开的治疗组合物后，可监测对象的HIV-1感染、与HIV-1感染相关的症状，或两者。因此，在另一方面中，本发明涉及这样的免疫原性组合物，其包含根据本发明的HIV-1gp120变体多肽或其免疫原性片段、编码所述多肽的多核苷酸或包含所述多核苷酸的表达载体。
适用于免疫原性组合物的gp120的合适免疫原性片段包括大小相对小的肽，例如，大小为约5至100个氨基酸，例如约5、约6、约7、约8、约9、约10、约15、约20、约25、约30、约40、约50、约60、约70、约80、约90或约100个氨基酸。因此，gp120多肽的片段(例如，表位或其他抗原性片段)例如本文所述的任意gp120多肽或其片段可用作免疫原。
术语“免疫原性组合物”指引发免疫应答从而产生针对特定免疫原的抗体或细胞介导免疫应答的组合物。可将可注射组合物制备成例如液体溶液、悬液和乳液。术语“抗原性组合物”指可被宿主免疫系统识别的组合物。例如，抗原性组合物包含可被宿主免疫系统的体液(例如，抗体)和／或细胞(例如，T淋巴细胞)组分识别的表位。
术语“疫苗”指用于体内施用于宿主(可以是灵长类动物，特别是人宿主)以赋予针对疾病(特别是病毒疾病)的保护的免疫原性组合物。
根据本发明的免疫原性组合物可用于治疗或预防由HIV感染造成的疾病。在又一方面中，本发明涉及用于治疗或预防由HIV-1感染造成的疾病的根据本发明的肽、核酸、载体、免疫原性组合物或疫苗。或者，本发明涉及根据本发明的肽、核酸、载体、免疫原性组合物或疫苗在制备用于治疗或预防由HIV-1感染造成之疾病的药物中的用途。或者，本发明涉及用于治疗或预防对象中由HIV-1感染造成的疾病的方法，其包括向所述对象施用根据本发明的肽、核酸、载体、或免疫原性组合物或疫苗。
本文中任何地方使用的术语“治疗”包括任何类型的疗法，其目的是终止、预防、改善和／或降低对本文所述临床病症的易感性。在一个优选实施方案中，术语治疗涉及预防性治疗(即，降低本文所定义的临床病症、疾病或病症的异感性的治疗)。
本文使用的术语“治疗”指得到期望的药理学作用和／或生理学作用，包括哺乳动物(包括人)中病理病症或疾病的任何治疗。所述作用可以是预防性的(在完全或部分预防疾病或其症状方面)和／或可以是治疗性的(在部分或完全治愈疾病和／或可归因于疾病的不利影响方面)。即，“治疗”包括(1)预防疾病在对象中发生或复发；(2)抑制疾病，例如阻止其发展；(3)停止或终止疾病或至少一种与其相关的症状，使得宿主不再患疾病或其症状，例如造成疾病或其症状退化，例如通过恢复或修复丧失的、缺少的或缺陷的功能，或刺激低效的过程；或者(4)减轻、减缓或改善疾病或与其相关的症状，其中使用改善在广义上指参数(例如炎症、疼痛和／或免疫缺陷)幅度至少减少。
本文使用的术语“预防”指使动物中病理性细胞的发生降低。预防可以是完全的(例如，对象中完全不存在病理性细胞)。预防也可以是部分的，例如使得对象中病理性细胞的发生少于不使用本发明时发生的情况。预防还指降低对临床病症的易感性。
根据本发明的免疫原性组合物还可包含可药用载体。
本文中可互换使用的“可药用载体”、“可药用稀释剂”或“可药用赋形剂”或“可药用载剂”指任何常规类型的无毒固体、半固体或液体填充物、稀释剂、封装材料或制剂辅料。可药用载体在所采用的剂量和浓度下对受体基本上是无毒性的，并且与制剂的其他成分相容。例如，用于包含多肽之制剂的载体通常不包含氧化剂和已知对多肽有害的其他化合物。合适的载体包括但不限于，水、右旋糖(dextrose)、甘油、盐水、乙醇及其组合。载体可包含另外的试剂，例如润湿剂或乳化剂、pH缓冲剂、或增强制剂效力的佐剂。佐剂可例如选自：AlK(SO4)2，AlNa(SO4)2，AlNH4(SO4)，氧化硅，明矾，Al(OH)3，Ca3(PO4)2，高岭土，碳，氢氧化铝，胞壁酰二肽，N-乙酰-胞壁酰-L-苏氨酰-D-异谷氨酰胺(thr-DMP)，N-乙酰-正胞壁酰(nornuramyl)-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺(CGP11687，也称为nor-MDP)，N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-谷氨酰胺酰-L-丙氨酸-2-(1′2′-二棕榈酰-sn-甘油-3-羟基磷酰氧基)-乙胺(CGP19835A，也称为MTP-PE)，2％鲨烯／吐温
Figure BDA0000391052630000221
乳液中的RIBI(MPL+TDM+CWS)，脂多糖及其多种衍生物(包括脂质A)，弗氏完全佐剂(FCA)，弗氏不完全佐剂，Merck佐剂65，多核苷酸(例如，聚IC和聚AU酸)，来自结核分支杆菌(mycobacterium，tuberculosis)的蜡质D、短棒状杆菌(Corynebacteriumparvum)、百日咳杆菌(Bordetella pertussis)以及布鲁氏菌属(Brucella)成员中发现的物质，Titermax，ISCOMS，Quil A，ALUN，脂质A衍生物，霍乱毒素衍生物，HSP衍生物，LPS衍生物，合成肽基质或GMDP，白介素1，白介素2，Montanide ISA-51和QS-21，CpG寡核苷酸，聚I：C和GM-CSF。参见Hunter R，US5,554,372和Jager E，Knuth A，WO1997028816。
根据本发明的变体gp120多肽可与载体共价连接，其是抗原性分子可与之结合的免疫原性大分子。当与载体结合时，结合多肽的免疫原性变得更大。选择载体以增加结合分子的免疫原性和／或引发针对载体的抗体的更高效价，这在诊断、分析和／或治疗上是有益的。分子与载体的共价连接可赋予增强的免疫原性和T细胞依赖性。参见Pozsgay V等，PNAS1999；96：5194-5197，Lee S等，J.Immunol.1976；116：1711-1718和Dintzis R等，PNAS1976；73：3671-3675。可用的载体包括聚合性载体，其可以是包含反应部分可与其结合的一个或更多个官能团的天然物质(例如，来自细菌或病毒的多糖、多肽或蛋白质)、半合成物质或合成物质。细菌产物和病毒蛋白质(例如，乙型肝炎表面抗原和核心抗原)也可用作载体，以及来自较高等生物体的蛋白质(例如钥孔戚血蓝蛋白、鲎血蓝蛋白、麻仁球蛋白、哺乳动物血清白蛋白和哺乳动物免疫球蛋白)也是如此。用作载体的另一些细菌产物包括细菌壁蛋白质和其他产物(例如，链球菌或链球菌细胞壁和脂多糖(LPS))。
本发明还涉及预防或减少与HIV感染相关的症状。这些包括与HIV感染轻微症状阶段相关的症状，包括例如带状疹、皮疹和指甲感染、口疮、复发性鼻喉感染和体重减轻。此外，与HIV感染主要症状阶段相关的另一些症状包括例如口腔和阴道鹅口疮(念珠菌属)、持续性腹泻、体重减轻、持续性咳嗽、再活化肺结核和复发性疱疹感染(例如感冒疮(单纯性疱疹))。可根据本发明进行治疗的充分发展型(full-blown)AIDS的症状包括例如，腹泻、恶心和呕吐、鹅口疮和口腔溃疡、持续性复发性阴道感染和子宫癌、持续性全身性淋巴结病(PGL)、重度皮肤感染、疣和癣、呼吸道感染、肺炎(尤其是卡氏肺孢子虫肺炎(Pneumocystis cariniipneumonia，PCP)、带状疱疹(或带状疹)、神经系统问题(例如，疼痛、麻痹或手脚“发麻(pins and needles)”、神经学异常)、卡波济氏肉瘤、淋巴瘤、肺结核和其他机会性感染。
本发明的肽、核酸和载体的有益作用包括例如，预防或延迟暴露于HIV的个体的初次感染；降低感染HIV的个体的病毒负荷(virul burden)；延长HIV感染的无症状期；在病毒水平已通过抗逆转录病毒疗法(ART)降低的HIV感染患者中维持低的病毒载量(viral load)；在未用药患者和经ART治疗的患者中增加HIV-1特异性和非特异性CD4T细胞的水平或使CD4T细胞的降低减小，增加患AIDS个体的整体健康或生活质量；以及延长患AIDS个体的预期寿命。临床医生可将免疫作用与治疗之前患者的情况，或与未治疗患者的预期情况进行比较，以确定治疗在抑制AIDS方面是否有效。
免疫原性组合物可通过本领域技术人员已知的任何手段来施用，例如通过肌内、皮下或静脉内注射，以及口服、经鼻或肛门施用。参见BangaA，“Parenteral Controlled Delivery of Therapeutic Peptides andProteins，”in Therapeutic Peptides and Proteins(Technomic PublishingCo.，Inc.，Lancaster，PA，US，1995)。为了延长肽或蛋白质可用于刺激应答的时间，肽或蛋白质可作为植入物、油状注射剂或作为颗粒系统提供。颗粒系统可以是微粒、微胶囊、微球、纳米胶囊或类似的颗粒。参见Banga，1995(见上文)。已证明基于合成聚合物的颗粒载体用于充当佐剂，除提供控制释放之外还增强免疫应答。铝盐也可用作佐剂来产生免疫应答。
免疫原性组合物可配制成适用于精确剂量的个体化施用的单位剂型。在脉冲剂量(pulse dose)中，提供了包含所公开免疫原的免疫原性组合物的团注施用(bolus administration)，然后经过不向对象施用所公开免疫原的一段时间段，然后进行第二次团注施用。在治疗过程中，可以以单次剂量或多剂量(例如，每天)施用治疗有效量的免疫原性组合物。在具体的非限制性实例中，在一天中，在一周中，或在一个月中施用脉冲剂量的包含所公开免疫原的免疫原性组合物。
每当期望作用(例如降低的HIV-1感染的体征、症状或实验结果)时，可施用免疫原性组合物。一般来说，剂量足以治疗或改善疾病的症状或体征，并且对对象不产生不可接受的毒性。可采用全身施用或局部施用。
对治疗用途有效的量可取决于疾病的严重性和患者年龄、体重、一般状况以及其他临床因素。因此，适当治疗方案的最终确定由主治临床医生做出。通常，体外使用的剂量可在对于原位施用药物组合物可用的量方面提供有用的指导，并且可使用动物模型来确定治疗具体疾病的有效剂量。参见Gilman R等编，Goodman and Gilman′s：The Pharmacological Basisof Therapeutics，第8版(Pergamon Press，New York，NY，US，1990)和Gennaro A编，Remington′s Pharmaceutical Sciences，第18版(MackPublishing Co.，Easton，PA，US，1990)。通常，gp120多肽的剂量范围为约0.1μg／kg体重至约100mg／kg体重。另一些合适的范围包括约1μg／kg体重至10mg／kg体重的剂量。在一个实例中，剂量是约1.0μg至约50mg肽／对象，例如1μg至1mg肽／对象，例如1mg肽／对象。给药安排可根据临床因素(例如对象对肽的敏感性及其疾病的发展速度)在每天到稀少到一年一次变化。因此，对象可接受第一剂量所公开的治疗分子，然后在稍晚时候，例如至少一天后，例如至少一周后，接受第二剂量(或甚至更多剂量)。
本文所公开的药物组合物可以以剂量单元制备并施用。固体剂量单元包括片剂、胶囊、透皮递送系统和栓剂。既可通过以单个剂量单元或几次较小剂量单元的形式单次施用，也可通过在特定间隔细分剂量的多次施用来进行治疗量的施用。合适的单次或分次剂量包括但不限于约0.01、0.1、0.5、1、3、5、10、15、30或50μg蛋白质／kg／天。
使用编码本文所述抗原性gp120多肽的核酸构建体(例如组合使用)作为用于治疗性例如预防性方案(例如疫苗)的药物组合物(药物)，并施用于对象(例如，灵长类对象，例如人对象)以引发针对一种或更多种HIV分支或毒株的免疫应答。例如，本文所述组合物可施用于感染HIV之前的人(或非人)对象以抑制病毒感染或病毒复制。因此，上述药物组合物可施用于对象以引发针对HIV的保护性免疫应答。为了引发免疫应答，将治疗有效(例如，免疫有效)量的核酸构建体施用于对象，例如人(非人)对象。
通过核酸构建体进行免疫在本领域是公知的并且例如以下进行教导。参见Robinson H等，US5,643,578(其描述了通过引入编码期望抗原的DNA以引发细胞介导应答或体液应答来使脊椎动物免疫的方法)；WeinerD等，US5,593,972和Weiner D等，US5,817,637(其描述了使编码抗原的核酸分子与使得能够表达的调节序列有效连接)；以及Urban R等，US5,880,103(其描述了将编码免疫原性肽或其他抗原的核酸递送至生物体的几种方法)。所述方法包括核酸(或其自身的合成肽)的脂质体递送、和免疫刺激构建体、或在混合胆固醇与
Figure BDA0000391052630000251
(皂素)时自发形成的大小为30至40nm的带负电荷的笼状结构。
为了施用gp120核酸分子，可例如通过由施用使得其变为细胞内的适当核酸表达载体表达，例如通过使用逆转录病毒载体，通过直接注射，通过使用微粒轰击(例如，基因枪；Biolistic，Dupont Corp，Delware，DE，US)，用脂质、细胞表面受体或转染剂包被，或通过与已知进入细胞核的同源样肽(homeobox-like peptide)结合施用，将核酸递送到细胞内。参见Morgan J等.，US4,980,286和Joliot A等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA1991；88：1864-1868。本发明包括所有形式的核酸递送，包括合成的寡聚物(oligo)、裸(naked)DNA、整合或不整合到基因组中的质粒和病毒。
在使用核酸来免疫的另一种途径中，也可由减毒病毒宿主或载体或细菌载体表达免疫原性gp120多肽。重组疫苗病毒、腺相关病毒(AAV)、疱疹病毒、逆转录病毒或其他病毒载体可用于表达肽或蛋白质，从而引发CTL应答。例如，可用于TB免疫方案的疫苗载体和方法为本发明的肽提供了另一些可能的载剂。参见Paoletti E等，US4,722,848和Stover C等，Nature1991；351：456-460。
在一个实例中，使用病毒载体。这些载体包括但不限于，腺病毒、疱疹病毒、牛痘或RNA病毒(例如逆转录病毒)。在一个实例中，逆转录病毒载体是鼠或禽逆转录病毒的衍生物。其中可插入单个外源基因的逆转录病毒载体的实例包括但不限于，莫罗尼鼠白血病病毒(MoMuLV)、哈维鼠肉瘤病毒(HaMuSV)、鼠乳腺肿瘤病毒(MuMTV)和劳斯氏肉瘤病毒(RSV)。当对象是人时，可利用例如长臂猿白血病病毒(GaLV)的载体。多种另外的逆转录病毒载体可整合多个基因。所有的这些载体可转移或整合可选择标志物的基因，使得可识别并产生转导细胞。通过将编码gp120多肽的核酸序列与例如编码用于特定靶细胞上之受体的配体的另一种基因一起插入到病毒载体中，载体就成为靶特异性的。逆转录病毒载体可通过连接例如糖、糖脂或蛋白质而制成靶特异性的。优选的靶向通过使用抗体靶向逆转录病毒载体来完成。本领域技术人员知晓或在没有过度实验的情况下可容易地确定可插入到逆转录病毒基因组中或与病毒包膜连接以允许靶特异性递送包含编码gp120多肽之多核苷酸的逆转录病毒载体的特异性多核苷酸序列。
对于核酸构建体合适的制剂包括可包含抗氧化剂、缓冲剂和抑菌剂的水性和非水性溶液、等渗无菌溶液；以及可包含悬浮剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂和防腐剂的水性和非水性无菌悬液。制剂可存在于单位剂量或多剂量密封容器(例如，安瓿和小瓶)中，并且可在冷冻干燥(冻干)条件下储存，其在使用之前仅需要即时添加无菌液体载体(例如水)。可由无菌粉末、颗粒剂和片剂制备即时溶液和悬液。优选地，载体是缓冲盐水溶液。更优选地，在施用前配制用于本发明方法的组合物以保护核酸构建体免受损害。例如，可配制组合物以减少用于制备、储存或施用表达载体的装置(玻璃器皿、注射器或针)上腺病毒载体的损失。可配制组合物以降低组分的光敏感性和／或温度敏感性。为了这个目的，组合物优选包含可药用液态载体(例如上述的那些)和稳定剂，所述稳定剂选自聚山梨酯80、L-精氨酸、聚乙烯吡咯烷酮、海藻糖及其组合。
在治疗应用中，在暴露于HIV之前或之后或者HIV感染之前或之后向对象施用治疗有效量的组合物。当在暴露之前施用时，治疗应用可称为预防性施用(例如，以疫苗的形式)。组合物的单次或多次施用根据对象所需和耐受的剂量和频率来施用。在一个实施方案中，剂量为以团注施用一次，但是在另一个实施方案中可周期性施用直至实现治疗结果(例如，保护性免疫应答)。一般来说，剂量足以治疗或改善疾病的症状或体征，并且不产生对象不可接受的毒性。可使用全身或局部施用。
在核酸疫苗的环境下，可与编码gp120多肽之核酸构建体一起施用与参与先天免疫的受体结合并对其进行刺激的天然或合成免疫刺激性组合物。例如，刺激某些Toll样受体(例如，TLR7、TLR8和TLR9)的药剂可与编码gp120多肽之核酸构建体组合施用。在一些实施方案中，核酸构建体与免疫刺激性CpG寡核苷酸组合施用。
编码gp120多肽的核酸构建体可作为裸DNA质粒引入体内。DNA载体可通过本领域已知方法引入到期望宿主细胞中，所述方法包括但不限于转染、电穿孔(例如，经皮电穿孔)、微注射、转导、细胞融合、DEAE右旋糖酐、磷酸钙沉淀、使用基因枪或使用DNA载体转运体。参见Wu C等，J.Biol.Chem.1992；267：963-967，Wu C和Wu G，Biol.Chem.1988；263：14621-14624和Williams R等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA1991；88：2726-2730。用于配制裸DNA并将其施用于哺乳动物肌肉组织的方法也是已知的。参见Felgner P等，US5,580,859和US5,589,466。另一些分子也可用于帮助在体内转染核酸，例如阳离子寡肽、来源于DNA结合蛋白的肽或阳离子聚合物。参见Bazile D等，WO1995021931和Byk G等，WO1996025508。
可用于将编码gp120免疫原的核酸构建体引入宿主细胞中的另一种公知方法是粒子轰击(即基因枪转化(biolistic transformation))。基因枪转化通常以几种方式之一来完成。一种常见方法包括向细胞推动惰性或生物活性颗粒。参见Sanford等，US4,945,050，US5,036,006和US5,100,792。
或者，载体可通过脂质体转染(lipofection)引入体内。使用阳离子脂质可促进带负电核酸的包封，并且也可可促进与带负电细胞膜的融合。参见Felgner P，Ringold G，Science1989；337：387-388。已描述了对于转移核酸特别有用的脂质化合物和组合物。参见Felgner P等，US5,459,127，Behr J等，WO1995018863和Byk G，WO1996017823。
如免疫原性多肽一样，核酸组合物可以以单剂量施用，或者可以以时间间隔开的多次剂量施用，以引发针对HIV的免疫应答。例如，可在几周、几个月或甚至几年的时间中向对象施用两剂量、三剂量、或四剂量、或五剂量、或六剂量或更多剂量，以优化免疫应答。
将本文所公开的免疫原性组合物与其他药剂(例如，蛋白质、抗体和其他抗HIV剂)一起施用可以是有利的。这种抗HIV治疗剂的实例包括核苷逆转录酶抑制剂，例如阿巴卡韦、AZT、地达诺新、恩曲他滨、拉米夫定、司他夫定、替诺福韦、扎西他滨、齐多夫定等；非核苷逆转录酶抑制剂，例如地拉韦啶、依法韦仑、奈韦拉平；蛋白酶抑制剂，例如安普那韦、阿扎那韦、茚地那韦、洛匹那韦、奈非那韦、osamprenavir、利托那韦、沙奎那韦、替拉那韦等；以及融合蛋白抑制剂，例如恩夫韦地等。在某些实施方案中，免疫原性组合物与其他抗HIV治疗剂同时施用。在某些实施方案中，免疫原性组合物与其他抗HIV治疗剂顺序施用，例如在施用另一药剂之前或之后。本领域技术人员知道，顺序施用可意指之后立即施用或在适当时间段(例如晚数小时、天、周、月或甚至年)后施用。
E.用于检测生物样品中抗HIV抗体的方法和用于检测中和抗体应答的方法
本发明所述的免疫原适合于在来自患者的样品中鉴定对所述免疫原特异的抗体。因为根据本发明的免疫原特异性结合中和抗体，所以免疫原可用于检测已形成中和抗体的那些患者。因此，抗体可基于患者是否表现出中和抗体来帮助鉴定个体化治疗。因此，在另一方面中，本发明涉及一种用于检测样品中对病毒特异的中和抗体的方法，其包括：
(i)使所述样品与根据本发明的多肽相接触，以及
(ii)检测所述多肽之间免疫复合物的形成。
术语和表达“中和抗体”、“病毒”、“多肽”在以上已进行了详细描述。
在一个优选实施方案中，病毒是HIV并且多肽是如以上定义的gp120变体多肽或其免疫原性片段。在一个更优选的实施方案中，样品来自HIV-1感染患者或来自AIDS疫苗受体。
根据本发明的方法可使用任意多种的测定形式。这些形式可以是多相或均相的，顺序的或同时的，竞争性的或非竞争性的。参见Peterson M等，US5,563,036；Cheng A等，US5,627,080；Lee J等，US5,633,141；Peterson M等，US5,679,525；Draetta G等，US5,691,147；Lucas F等，US5,698,411；Yan C等，US5,747,352；Davidson R，US5,811,526；Oh C等，US5,851,778和Landrum E等，US5,976,822。这样的测定可设计成定量的，以测量抗HIV抗体的浓度或量；或者它们可设计成定性的，以测量抗HIV抗体是否存在。科学文献中可得到根据本发明原则可适于使用的免疫测定的另外描述。参见Gnann J等，Methods Enzymol.1989；178：693-714；Dopel S等，Eur.J.Clin.Chem.Clin.Biochem.1991；29：331-337；ManochaM等，Immunol.Lett.2003；85(3)：275-278)；Brattegaard K等，AIDS1995；9(6)：656-657；Beristain C等，J.Clin.Lab.Anal.1995；9：347-350；ModrowS等，J.Acquir.Immune Defic.Syndr.1989；2：141-148；Gueye-Ndiaye A等，AIDS1993；7：475-481；Sabatier J等，AIDS1989；3：215-220；Sommerfelt M等，Expert Opin.Biol.Ther.2004；4：349-361；Alcaro M等，Curr.Protein Pept.Sci.2003；4：285-290；Smith R等，Arch.Pathol.Lab.Med.1990；114：254-258；Petrov R等，Biomed.Sci.1990；1：239-244；Zolla-Pazner S，Nat.Rev.Immunol.2004；4：199-210；Baillou A等，J.Clin.Microbiol.1991；29：1387-1391和McGaughey G等，Curr.HIV Res.2004；2：193-204。
多相(Heterogeneous)免疫测定技术通常包括使用反应产物与之结合的固相材料，但是也可调整成包括非固定抗原与抗体的结合(即，溶液相免疫测定)。通过将固相从反应混合物中移除(例如，通过洗涤)使反应产物与过量的样品、测定试剂和其他物质分离。可根据本发明使用的固相免疫测定的一种类型是夹心免疫测定(sandwich immunoassay)。在夹心测定中，样品中存在的分析物越多，固相上存在的标记量就越多。一般优选该类型的测定形式，尤其是对于低分析物浓度的观察，原因是固相上标记的出现更容易被检测到。
根据本发明的一个优选实施方案，与抗HIV抗体特异性反应的本发明之肽结合(即固定)至固相支持物，并且在与被测试抗HIV抗体是否存在的生物样品的接触下进行孵育。可添加封闭剂以减少非特异性结合。
如所理解的，肽可与生物样品以未结合状态孵育，然后结合(即固定)至固体支持物。然后，优选对支持物进行彻底处理(例如，通过洗涤)以基本上移除可存在但未与结合肽结合的非HIV抗体。这种处理的结果是，在肽与抗HIV抗体之间形成免疫复合物。
然后，优选地添加可检测标记的第二抗体(能够与初始抗体(例如，抗人IgG抗体)结合)，并且在足以允许第二抗体与可存在的任何抗HIV抗体结合的条件下孵育支持物。然后优选对支持物进行彻底处理(例如，通过洗涤)以基本上移除任何未结合的第二抗体。如果测试样品中存在抗HIV抗体，则两种抗体与固定化肽会形成免疫复合物(即，第二抗体／抗HIV抗体／固定化肽三明治夹心)。在这样的测定中，检测与支持物结合的第二抗体是被测试样品中抗HIV抗体的指示。参见Schuurs A等，US3,791,932和US4,016,043；以及Pankratz T等，US5,876,935。第二抗体可以是分离自非人物种的天然免疫球蛋白(例如，抗人IgG鼠抗体、抗人IgG山羊抗体、抗人IgM山羊抗体)，或者其可通过重组或合成产生。第二抗体可以是完整的免疫球蛋白或免疫球蛋白片段(例如，FAb、F[Ab]2)。如期望，可采用其他结合分子(能够与抗HIV抗体结合)与这种第二抗体配合或代替这种第二抗体。例如，抗HIV抗体可被生物素化并且第二抗体可被替代为标记的亲和素或链霉亲和素。
为了省略未结合分离步骤并减少化学结合测定所需的时间和设备，可替代性地采用均相测定形式。在这样的测定中，结合对中的一种组分仍可被固定；但是，在不进行未结合分离的情况下检测结合对中第二组分的存在。均相光学方法的实例包括EMIT方法(Syva，Sunnyvale，CA，US)，其通过检测荧光淬灭来运行；Behringwerke的激光浊度测定乳胶颗粒凝集法(laser nephelometry latex particle agglutination method，Marburg，DE)，其通过检测光散射的改变来运行；LPIA乳胶颗粒凝集法(MitsubishiChemical Industries，Tokyo，JP)；TDX荧光去极化法(AbbottLaboratories，Abbott Park，IL，US)以及荧光能量转移法(Cis BioInternational，Paris，FR)。任意这样的测定可适用于根据本发明的目的。
本发明的结合测定可配置成竞争性测定。在竞争性测定中，测试样品中存在的抗HIV抗体越多，固相上存在的标记的量就越低。
通过与夹心测定类似的方式，竞争性测定可通过以下方法进行：提供限定量的经标记抗HIV抗体，并确定被测试流体中是否包含与经标记抗体竞争与支持物结合的抗HIV抗体。在这样的竞争性测定中，捕获的经标记抗体的量与测试样品中存在的分析物的量成反比。本领域中已描述了这种类型的几种测定。参见Smith D等，US4,401,764；Clagett J等，US4,746,631；Li C等，US4,661,444；Chieregatt E等，GB2084317；MochidaE等，US4,185,084；Sadeh D等，US4,243,749；Lucas F等，US5,698,411；Landrum(见上文)，Leuvering J，US4,313,734；Gribnau T等，US4,373,932和Baugher B等，US5,501,985。优选使用酶(例如，碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、辣根过氧化物酶或脲酶)作为可检测标记(即，酶免疫测定或EIA)。
可通过使用响应于酶标记催化的显色底物(包括放出或吸收荧光、UV、可见光的那些底物)来检测酶标记的存在。更优选地，可采用化学标记(例如，胶体金、乳胶珠标记)。
可使用多重检测器、多通道滤波器、光栅或光谱特性不同的萤石来完成标记的检测。参见Ward D等，US5,759,781。特别优选的是采用过氧化物酶作为酶标记，特别是与显色底物3，3′，5，5′-四甲基联苯胺(TMB)、OPD或ABTS配合使用。在用过氧化物酶作为酶标记抗体的情况下，可使用高碘酸盐法或报道的其中伴侣与异双功能试剂连接的方法。参见Nakane P等，J.Histochem.Cytochem.1974；22：1084-1090。在本发明的免疫测定中可采用多种的任意固相支持物。对于固相支持物合适的材料是合成物，例如聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚酰胺或其他合成聚合物；天然聚合物，例如纤维素；以及衍生化天然聚合物，例如醋酸纤维素或消极纤维素；以及玻璃，尤其是玻璃纤维。支持物可采用球、棒、管和微测定或微滴定板的形式。片状结构例如纸条、小板和膜同样是合适的。载体的表面对于水性溶液是可渗透的和不可渗透的。
虽然上述描述涉及测定是作为流体的生物样品(例如，血清、血液、尿、唾液、胰液、脑脊液、精液)中抗HIV抗体的存在，但是应理解，任何流体生物样品(例如，组织或活检提取物、排泄物提取物、痰)可同样地用于本发明的测定。更优选地，被测定的生物样品是血清或血浆。
因为根据本发明的免疫原能够引起广泛中和抗体的产生，所以这些免疫原也可用于检测响应于患者中病原体的中和抗体。因此，在另一方面中，本发明涉及一种用于检测针对对象中病毒感染的中和抗体应答的方法，其包括使用根据本发明的用于检测中和抗体的方法在所述对象中检测中和抗体的存在，其中相对于对照对象，所述对象中中和抗体的存在指示所述对象中响应于所述病毒感染的中和抗体。
在一个优选实施方案中，病毒是HIV并且其中所述多肽是根据本发明的gp120变体多肽或其片段。在一个更优选的实施方案中，样品来自HIV-1感染患者或者来自AIDS疫苗受体。
一般方法
1.试剂
使用以下试剂：
(a)质粒。pNL4.3质粒得自于National Institutes of Health AIDSResearch and Reference Reagent Program(NIH ARRRP，NIH，Bethesda，MD，US)。pcDNA3.1质粒得自于Invitrogen(Carslbad，CA，US)。
(b)HIV-1分离株。使用B分支HIV-1原代分离株AC-10(NeutNetconsortium，Milan，IT)。
(c)细胞系。TZM-bl细胞(CD4+CXCR4+CCR5+)得自于NIH库(NIH，Bethesda，Maryland，US)。在包含10％胎牛血清、20mML-谷氨酰胺、100U盘尼西林／ml和100μg链霉素／ml的杜氏改良Eagle培养基(DMEM)中维持293T和TZM-bl细胞。
(d)抗体。使用具有广泛中和活性的抗EnV-HIV-1单克隆抗体(MAb)(括号中给出表位特异性)(NIH ARRRP,NIH，Bethesda，MD，US；Polymun AG，Vienna，AT)。这些包括：4E10(近膜端外部区；MPER)、2F5(MPER)、b12(CD4结合位点)、2G12(gp120高甘露糖糖原)和PG16(gp120病毒刺突)。
2.体外随机诱变
使用Genemorph II随机诱变试剂盒(Stratagene，La Jolla，CA，US)将突变引入HIV AC-10env中。通过将随机突变包膜转移到pNL4-3和pcDNA3.1质粒中来产生嵌合HIV病毒体的文库。转移通过引入保留病毒序列的限制性位点并用酶XbaI和NotI(New England Biolabs，Ipswich，MA，US)消化来介导。
3.克隆和文库产生
使用快速DNA连接试剂盒(Roche Applied Science，Indianapolis，IN)根据制造商说明书将PCR产物克隆到载体pNL4.3和pcDNA3.1中。将pNL4.3和pcDNA3.1的重组载体分别引入到
Figure BDA0000391052630000321
Stbl2TM感受态细胞和DH5αTM感受态细胞((Invitrogen，Carslbad，CA，US)中，并在30℃下搅拌扩增过夜(ON)，体积为3mL。同时进行几个转化以避免丢失可变性，并在扩大规模的扩增中将其混合在一起(250mL，30℃，搅拌过夜)。孵育后，铺板20μL并使用PureYieldTM PlasmidMaxiprep System(Promega，Madison，WI，US)纯化质粒DNA。两种产物均用XbaI和NotI进一步消化以证明env基因的存在。如果是阳性的，则对克隆进行测序和/或用于转染。通过使用pNL4.3构建体瞬时共转染293T细胞产生病毒。在转染后两天收集包含病毒体的细胞培养物上清液并使用
Figure BDA0000391052630000331
Ultra离心过滤器单元浓缩病毒体。将病毒体重悬于磷酸盐缓冲盐水(PBS)中。
4.病毒捕获测定
在4℃下用多克隆抗Fc(100μlPBS中5μg／mL)包被微滴定孔过夜。在37℃用PBS中的3％牛血清白蛋白(BSA)将孔封闭1小时。向微滴定孔中添加100μl来源于文库的病毒(1000ng／mL)。向对应孔中添加5μl捕获的MAb(100ng／mL)并将板在37℃搅拌(450rpm)孵育。孵育2小时后，用PBS将孔洗涤六次，并且通过p24酶联免疫吸附测定(ELISA)定量病毒等同物，或者用High Pure Viral RNA Kit(Roche Applied Science，Indianapolis，IN，US)根据制造商说明书提取RNA。
5.巢式PCR HIV-1env RNA扩增
使用RT-PCR试剂盒(The
Figure BDA0000391052630000332
Gold RNA PCR Reagent Kit；Applied Biosystems，Carlsbad，CA，US)和Expand High Fidelity PCRSystem(Roche Applied Science，Indianapolis，IN)通过逆转录酶聚合酶链反应(RT-PCR)扩增分离的HIV-1env RNA。对于RT-PCR反应使用8μL的RNA模板体积，并且在50℃下用引物102(反向)使RNA逆转录20分钟。用引物101(正向)和104(反向)由5μL体积的cDNA扩增env区域，然后使用2μL体积的模板用引物179(正向)和180(反向)进行巢式PCR。参见表1。两种env PCR扩增的条件是：i)94℃下2分钟，1个循环；ii)94℃下2分钟，55℃下1分钟和75℃下3分钟，35个循环；iii)72℃下7分钟，1个循环以及iv)4℃下终止。所得扩增子(2583bp)与1Kb分子量标志物一起在用
Figure BDA0000391052630000333
Safe DNA凝胶染色剂进行染色的1.0％琼脂糖凝胶中进行电泳。
6.env基因的克隆和测序
如上所述将先前步骤的PCR产物克隆到pNL4.3和pcDNA3.1载体中。如先前所述用这些质粒转化Stbl2和DH5α感受态细胞。质粒DNA使用QIAprep Spin Miniprep Kit(Qiagen，Valencia，CA，US)进行纯化并用XbaI and NotI进一步消化以证明env基因的存在。使用
Figure BDA0000391052630000341
Terminator v3.1以及引物183(正向)、185(正向)、186(正向)、190(反向)、192(反向)和193(反向)对env阳性克隆进行测序。参见表1。
7.序列分析
通过使用CLUSTAL W程序(EMBL-EBI，http：／／www.ebi.ac.uk／FTP／，2011年2月)和合并到BioEdit7.0.9.0版本中的Contig Assembly Program(CAP)应用程序进行核苷酸序列的比对，然后进行手动编辑。参见Thompson J等，Nucl.Acids Res.1994；22(22)：673-4680和Huang X，Genomics1992；14(1)：18-25。
表1：引物序列和基因定位。基因定位基于HIV-1HXB2基因组(GenBank登录号K03455)。1Wei X等，Antimicrob.Agents Chemother.2002；46(6)：1896-1905。
8.重组病毒的产生
将表达具有特定相关突变(潜在糖基化位点缺失和V1／V2环的构造改变)的包膜糖蛋白4E10的克隆在30℃搅拌扩增过夜，体积为250mL。质粒DNA使用PureYieldTMPlasmid Maxiprep System(Promega，Madison，WI，US)进行纯化并用于瞬时共转染293T细胞。转染后两天收获包含假病毒的上清液。通过ELISA定量p24水平。
9.结合测定
用之前所述的捕获测定来确定MAb(4E10、2F5、2G12、b12和PG16)与完整病毒体的结合。首先，将病毒与BMAb在溶液中孵育以有助于病毒-BMAb结合。然后，通过之前固定在板中的抗FC抗体捕获病毒-BMAb复合物。用PBS中的1％Triton-X裂解固定的病毒-BMAb。通过如上所述的ELISA来定量病毒裂解物中的p24。ΔEnv pNL4.3构建体用作阴性对照。通过与野生型AC-10病毒比较来确定结合亲和力的增加。
上文中所述的所有公开均通过引用整体并入本文。
虽然为了清楚和理解的目的对上述本发明进行了一些详细的描述，但是本领域技术人员通过阅读本公开内容可理解，可对形式和细节作出多种改变而不偏离本发明和所附权利要求的真实范围。
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Figure IDA0000391052690000041
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Figure IDA0000391052690000081
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Figure IDA0000391052690000211

Claims (27)

1.能够引发抗病毒的中和抗体的多肽，其包含HIV-1gp120的变体或其免疫原性片段，其中相对于SEQ ID NO：2的编号，所述多肽包含C131Y、T132N、D138G和N160Y突变或者所述多肽包含N203S和G604E突变。
2.能够引发抗病毒的中和抗体的多肽，其中所述多肽包含变体HIV-1gp120或其免疫原性片段，其中所述变体gp120或其免疫原性片段选自这样的多肽，其相对于SEQ ID NO：2的编号至少包含选自第88、131、132、138、160、191、203、226、479、507、604和647位的位置上的突变。
3.根据权利要求2所述的多肽，其中所述突变选自N88D、C131Y、T132N、D138G、N160Y、N191D、N203S、A226V、M479I、R507W、G604E和Y647N。
4.根据权利要求3所述的多肽或免疫原性片段，其中所述多肽或其免疫原性片段包含选自以下的序列：SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：17、SEQID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ IDNO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29和SEQ ID NO：31。
5.抗体，其特异性结合根据权利要求1至4中任一项所述的多肽。
6.多核苷酸，其编码根据权利要求1至4中任一项所述的多肽。
7.根据权利要求6所述的多核苷酸，其具有SEQ ID NO：3的序列。
8.表达载体，其包含根据权利要求7所述的多核苷酸。
9.宿主细胞，其包含根据权利要求1至4中任一项所述的多肽、根据权利要求5所述的多核苷酸或根据权利要求6所述的表达载体。
10.免疫原性组合物或疫苗，其包含根据权利要求1至4中任一项所述的多肽、根据权利要求5所述的多核苷酸或根据权利要求6所述的表达载体。
11.根据权利要求1至4中任一项所述的多肽、根据权利要求6所述的多核苷酸、根据权利要求7所述的表达载体或者根据权利要求10所述的免疫原性组合物或疫苗，其用于医学。
12.根据权利要求1至4中任一项所述的多肽、根据权利要求6所述的多核苷酸、根据权利要求7所述的表达载体或者根据权利要求10所述的免疫原性组合物或疫苗，其用于治疗或预防由HIV感染引起的疾病。
13.用于检测样品中对给定病原体特异的中和抗体的方法，其包括：
(i)使所述样品与根据权利要求1至4所述的多肽相接触，以及
(ii)检测所述多肽与所述中和抗体之间免疫复合物的形成。
14.用于检测对象中抗病毒感染的中和抗体应答的方法，其包括使用根据权利要求13所述的方法检测所述对象中中和抗体的存在，其中相对于对照对象，所述对象中中和抗体的存在指示所述对象中对病毒感染的中和抗体应答。
15.根据权利要求13或14所述的方法，其中所述病毒是HIV，并且其中所述多肽是根据权利要求1至4中任一项所述的gp120变体多肽或其片段。
16.权利要求15所限定的方法，其中所述样品来自HIV-1感染患者，或者其中所述样品来自AIDS疫苗接受者。
17.用于鉴定能够引发针对多肽之中和抗体的免疫原的方法，其包括：
(i)使对所述多肽特异的中和抗体与重组病毒的文库相接触，每一种所述重组病毒包含编码所述多肽之变体的随机化基因并表达所述多肽；
(ii)基于它们与所述中和抗体结合的能力，将所述重组病毒的文库中结合所述中和抗体的那些成员与不发生此结合的成员相分离；以及
(iii)确定在步骤(ii)中选定的所述重组病毒文库的成员中发现的所述变体多肽的序列。
18.权利要求17所限定的方法，其中所述中和抗体是固定化的。
19.根据权利要求17或18所述的方法，其中步骤(ii)中选定的那些文库成员中病毒表面上展示的所述变体多肽的序列测定如下所述进行：通过对来自所述文库中与所述中和抗体结合的成员的遗传物质进行测序。
20.权利要求17至19中任一项所限定的方法，其中那些文库成员的分离如下所述来确定：通过对来自结合成员之群体的病毒的至少一种多肽进行定量。
21.权利要求20所限定的方法，其中所述病毒多肽是所述病毒衣壳的多肽。
22.权利要求17至21中任一项所限定的方法，其中步骤(ii)中选定的那些文库成员中病毒表面上展示的所述变体多肽的序列测定如下所述进行：通过对来自所述文库中与所述中和抗体结合的成员的遗传物质进行测序。
23.根据权利要求17至22中任一项所述的方法，其中所述病毒是逆转录病毒。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述随机化基因是env基因。
25.根据权利要求23或24所述的方法，其中所述逆转录病毒是HIV。
26.权利要求25所限定的方法，其中在步骤(ii)中确定的所述病毒衣壳的多肽是p24。
27.根据权利要求25或26中任一项所述的方法，其中所述中和抗体选自4E10mAb、2F5mAb、b12mAb、2G12mAb和PG16mAb。
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