ES2645433T3 - Haptenos de quetiapina para su uso en inmunoensayos - Google Patents

Haptenos de quetiapina para su uso en inmunoensayos Download PDF

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Thomas R. DECORY
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Abstract

Un compuesto de Fórmula 1:**Fórmula** en el que: en el que R1 es H,**Fórmula** CH2NH2, o CH2NHC(O)(CH2)mCO2H; R2 es H,**Fórmula** CH2NH2, o CH2NHC(O)(CH2)mCO2H; siempre que o R1 o R2 sean H, y siempre que además ambos de R1 y R2 y no sean H simultáneamente; R3 es H; m es 1, 2, 3, 4, ó 5; n es 1, 2, 3, 4, ó 5.

Description

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Haptenos de quetiapina para su uso en inmunoensayos Descripcion
CAMPO DE LA INVENCION
La invencion se refiere al campo de los inmunoensayos para determinar la presencia de quetiapina en fluidos biologicos humanos.
ANTECEDENTES DE LA INVENCION
Davis, P. C., et. al., Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 2010, vol. 51, N°. 5 paginas 11131119 se refiere al desarrollo y validacion de un metodo LC-MS/MS para la determinacion de quetiapina y cuatro metabolitos relacionados en el plasma humano.
La esquizofrenia es un trastorno psiquiatrico cronico y debilitante que afecta aproximadamente al 0,45-1% de la poblacion mundial (van Os, J.; Kapur, S. "Schizophrenia" Lancet 2009, 374, 635-645). Los objetivos principales del tratamiento son lograr la remision sostenida de los smtomas psicoticos, reducir el riesgo y consecuencias de recafda, y mejorar el funcionamiento del paciente y calidad de vida en general. Aunque muchos pacientes con esquizofrenia son capaces de alcanzar estabilidad de los smtomas con las medicaciones anti-psicoticas disponibles, el mal cumplimiento con la medicacion es una razon comun para la recafda con medicaciones orales administradas diariamente. Varios estudios Abdel-Baki, A.; Ouellet-Plamondon, C.; Malla, A. "Pharmacotherapy Challenges in Patients with First-Episode Psychosis" Journal of Affective Disorders 2012, 138, S3-S14) que investigan los resultados del no-cumplimiento han demostrado que los pacientes con esquizofrenia que no toman su medicacion como se ha prescrito tienen tasas mas altas de recafda, ingreso hospitalario y suicido asf como mortalidad aumentada. Se estima que del 40 al 75% de los pacientes con esquizofrenia tienen dificultad en cumplir un regimen de tratamiento oral (Lieberman, J. A.; Stroup, T. S.; McEvoy, J. P.; Swartz, M. S.; Rosenheck, R. A.; Perkins, D. O.; Keefe, R. S. E.; Davis, S. M.; Davis, C. E.; Lebowitz, B. D.; Severe, J.; Hsiao, J. K. "Effectiveness of Antipyschotic Drugs in Patients with Chronic Schizophrenia" New England Journal of Medicine 2005, 353(12), 1209-1223). La monitorizacion de farmacos terapeutica (TDM) es la cuantificacion de concentraciones de suero o plasma de farmacos, incluyendo farmacos anti-psicoticos, para la monitorizacion y optimizacion del tratamiento. Dicha monitorizacion permite, por ejemplo, la identificacion de pacientes que no cumplen con su regimen de medicacion, que no estan alcanzando dosis terapeuticas, que no responden a dosis terapeuticas, que tienen tolerabilidad suboptima, que tienen interacciones farmaco-farmaco farmacocineticas, o que tienen metabolismo anormal que dan lugar en concentraciones de plasma inadecuadas. Existe una variabilidad individual considerable en la capacidad del paciente, absorber, distribuir, metabolizar y excretar farmacos anti-psicoticos. Tales diferencias pueden estar provocadas por enfermedad concurrente, edad, medicacion concomitante o peculiaridades geneticas. Formulaciones de farmacos diferentes tambien pueden influir en el metabolismo del farmaco anti-psicotico. La TDM permite la optimizacion de la dosis para pacientes individuales, mejorando los resultados terapeuticos y funcionales. La TDM permite ademas a un medico que prescribe asegurar el cumplimiento con las dosificaciones prescritas y la consecucion de concentraciones de suero efectivas.
Hasta la fecha, los metodos para determinar los niveles de concentraciones de suero o plasma de los farmacos anti-psicoticos implican el uso de cromatograffa lfquida (LC) con deteccion por UV o espectrometffa de masas, y radioinmunoensayos (ver, por ejemplo, Woestenborghs et al., 1990 "On the selectivity of some recently developed RIA's" in Methodological Surveys in Biochemistry and Analysis 20:241-246. Analysis of Drugs and Metabolites, Including Anti-infective Agents; Heykants et al., 1994 "The Pharmacokinetics of Risperidone in Humans: A Summary", J Clin Psychiatry 55/5, suppl:13-17; Huang et al., 1993 "Pharmacokinetics of the novel anti-psychotic agent risperidone and the prolactin response in healthy subjects", Clin Pharmacol Ther 54:257-268). Los radioinmunoensayos detectan una o ambas de risperidona y paliperidona. Salamone et al. en la Patente US N° 8.088.594 divulgan un inmunoensayo competitivo para risperidona usando anticuerpos que detectan tanto la risperidona como la paliperidona pero no metabolitos garmacologicamente inactivos. Los anticuerpos usados en el inmunoensayo competitivo estan desarrollados contra un inmunogeno particular. ID Labs Inc. (London, Ontario, Canada) comercializa ELISA para olanzapina, otro farmaco anti-psicotico, que tambien utiliza un formato competitivo. Las instrucciones para el uso indican que el ensayo esta disenado para propositos de seleccion y pretendido para uso forense o de investigacion, y no esta pretendido espedficamente para uso terapeutico. Las instrucciones recomiendan que todas las muestras positivas deben confirmarse con cromatograffa de gas/espectrometffa de masas (GC-MS), e indican que el anticuerpo usado detecta olanzapina y clozapina (ver ID Labs Inc., "Instructions For Use Data Sheet IDEL-F083", Fecha de Revision, 8 de agosto, 2011). Algunos de estos metodos, concretamente HPLC y GC/MS, pueden ser caros y laboriosos, y se realizan solo generalmente en laboratorios grandes o especializados que tienen el equipo apropiado.
Existe una necesidad de otros metodos para determinar los niveles de farmacos anti-psicoticos, particularmente metodos que pueden realizarse en la oficina de un medico que prescribe (donde el tratamiento para un paciente individual puede ajustarse en consecuencia de una manera mucho mas oportuna) y en otros entornos
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medicos que carecen de equipo de LC o GC/MS o requieren resultados de las pruebas rapidos. La quetiapina es:
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SUMARIO DE LA INVENCION
La presente invencion proporciona compuestos y conjugados que permiten tal metodo mejorado para determinar los niveles del farmaco anti-psicotico quetiapina.
La invencion comprende compuestos de Formula I
en el que:
R1 es H
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CH2NH2, o CH2NHC(O)(CH2)mCO2H; R2 es H,
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CH2NH2, o CH2NHC(O)(CH2)mCO2H;
R3 es H, siempre que dos de R1, R2, R3 sean H, y siempre que ademas R1, R2 y R3 no sean todos H
simultaneamente; m es 1, 2, 3, 4, 0 5; n es 1,2, 3, 4, 0 5.
La invencion comprende conjugados de compuestos de la invencion con portadores inmunogenicos como protemas, y productos producidos por el proceso de poner en contacto los compuestos de la invencion con portadores inmunogenicos.
BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS
Las Figs. 1 y 2muestran resultados de ELISA Competitivo generados por varios hibridomas;
La Fig. 3 muestra el formato de inmunoensayo competitivo usado en un dispositivo de ensayo de flujo lateral; y
La Fig. 4 muestra una cuerva de respuesta de dosis tfpica generada con sub-clones de quetiapina 89-3, 8913, y 89-5.
DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION
La presente invencion proporciona compuestos y conjugados que permiten la determinacion de niveles de farmacos anti-psicoticos. Tales metodos permitiran a los clmicos evaluar objetivamente en una cita como de probable es que el empeoramiento de los smtomas de un paciente puedan deberse a la falta de cumplimiento. Alternativamente, si se cumple, un clinico puede considerar una eleccion de tratamiento distinta. La monitorizacion de farmacos terapeutica, que se habilita por tales metodos, es clave para identificar las opciones de tratamiento mas efectivas. Ademas, los clmicos creen que tal TDM les ayudara a pasar a una relacion muy diferente con sus pacientes, es decir, ir de una discusion hipotetica del no cumplimiento del tratamiento hacia una mas colaborativa involucrando a los pacientes para que participen activamente en la optimizacion de sus regfmenes de tratamiento.
El desarrollo del metodo requiere primero la smtesis de varios inmunogenos, que comprende un hapteno sintetico ligado a una protema. Un hapteno es una molecula pequena que puede inducir una respuesta inmune cuando esta unido a un portador grande como una protema. Son sustancias libres de protemas, de mayormente bajo peso molecular, que no son capaces de estimular la formacion de anticuerpos por sf solos, pero que reaccionan con anticuerpos. Un conjugado hapteno-protema es capaz de estimular la produccion de anticuerpos. La generacion de anticuerpos espedficos contra moleculas pequenas es util para el desarrollo de inmunoensayos (Pharm Res. 1992, 9(11):1375-9, Annali Dell'Istituto Superiore di Sanita. 1991, 27(1):167-74, Annali Dell'Istituto Superiore di Sanita. 1991, 27(1):149-54, Immunology Letters.1991,28(1):79-83).
La invencion comprende compuestos de Formula I
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en la que:
R1 es H,
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CH2NH2, o CH2NHC(O)(CH2)mCO2H; R2 es H,
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CH2NH2, o CH2NHC(O)(CH2)mCO2H;
R3 es H, siempre que dos de R1, R2, R3 sean H, y siempre que ademas R1, R2 y R3 no sean todos H simultaneamente; m es 1, 2, 3, 4, 0 5; n es 1,2, 3, 4, 0 5.
La invencion comprende compuestos de Formula I en la que:
R1 es H,
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CH2NH2, o CH2NHC(O)(CH2)mCO2H; R2 es H,
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CH2NH2, o CH2NHC(O)(CH2)mCO2H;
R3 es H, siempre que o R1 o R2 sean H, y siempre que ademas ambos de R1 y R2 no sean H simultaneamente; m es 1, 2, 3, 4, 0 5; n es 1,2, 3, 4, 0 5.
Tambien se describen en la presente compuestos de Formula I: en la que:
R1 es H, o CH2NH-(Y)p-G;
R2 es H, o CH2NH-(Y)p-G; siempre que o R1 o R2 sean H, y siempre que ademas tanto R1 como R2 no sean H simultaneamente;
R3 es H;
en la que:
Y es grupo espaciador organico;
G es un grupo de ligamiento funcional capaz de enlazar con un portador; p es 1.
La invencion comprende compuestos de Formula I en la que R1 es H,
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CH2NH2, o CH2NHC(O)(CH2)mCO2H; R2 es H,
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CH2NH2, o CH2NHC(O)(CH2)mCO2H; siempre que o R1 o R2 sean H, y siempre que ademas ambos de R1 y R2 no sean H simultaneamente;
R3 es H,
m es 1, 2, 3, 4, 0 5; n es 1,2, 3, 4, 0 5.
En otra realizacion de la invencion:
R1 es H,
o CH2NH2; R2 es H,
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o CH2NH2; siempre que o R1 o R2 sean H, y siempre que ademas ambos de R1 y R2 no sean H
simultaneamente;
R3 es H,
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m es 1, 2, 3, 4, o 5; n es 1,2, 3, 4, o 5.
Otra realizacion de la invencion es un compuesto de Formula I que es:
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La invencion proporciona ademas conjugados de los compuestos anteriores con un portador inmunogenico. Otra realizacion de la invencion es por lo tanto un conjugado de un compuesto de Formula I en el que:
R1 es H,
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CH2NH2, o CH2NHC(O)(CH2)mCO2H; R2 es H,
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CH2NH2, o CH2NHC(O)(CH2)mCO2H;
R3 es H, siempre que dos de R1, R2, R3 sean H, y siempre que ademas R1, R2 y R3 no sean todos H
simultaneamente; m es 1, 2, 3, 4, 0 5;
n es 1, 2, 3, 4, 0 5; y un portador inmunogenico.
Otra realizacion de la invencion es un conjugado de un compuesto de Formula I en el que: R1 es H,
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CH2NH2, o CH2NHC(O)(CH2)mCO2H; R2 es H,
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CH2NH2, o CH2NHC(O)(CH2)mCO2H;
R3 es H, siempre que o R1 o R2 sean H, y siempre que ademas ambos de R1 y R2 no sean H simultaneamente; m es 1, 2, 3, 4, 0 5;
n es 1, 2, 3, 4, 0 5; con un portador inmunogenico.
Tambien se describe en la presente un conjugado de un compuesto de Formula I en el que:
R1 es H, o CH2NH-(Y)p-G;
R2 es H, o CH2NH-(Y)p-G; siempre que o R1 o R2 sean H, y siempre que ademas tanto R1 como R2 no sean H simultaneamente;
R3 es H;
en el que:
Y es grupo espaciador organico;
G es un grupo de ligamiento funcional capaz de enlazar con un portador; p es 1; y un portador inmunogenico.
Otra realizacion de esta invencion es un conjugado de un compuesto de Formula I en el que R1 es H,
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CH2NH2, o CH2NHC(O)(CH2)mCO2H; R2 es H,
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CH2NH2, o CH2NHC(O)(CH2)mCO2H; siempre que o R1 o R2 sean H, y siempre que ademas ambos de R1 y R2 no sean H simultaneamente;
R3 es H,
m es 1, 2, 3, 4, 0 5;
n es 1, 2, 3, 4, 0 5; y un portador inmunogenico.
Otra realizacion de la invencion es un conjugado de un compuesto de Formula I en el que:
R1 es H,
o CH2NH2; R2 es H,
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o CH2NH2; siempre que o R1 o R2 sean H, y siempre que ademas ambos de R1 y R2 no sean H
simultaneamente;
R3 es H,
m es 1, 2, 3, 4, 0 5;
n es 1, 2, 3, 4, 0 5; y un portador inmunogenico.
Otra realizacion de la invencion es un conjugado del compuesto
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y un portador inmunogenico.
Una realizacion preferida de la invencion es cualquiera de los conjugados anteriores en los que el portador inmunogenico es una protema.
Una realizacion preferida de la invencion es cualquiera de los conjugados anteriores, en los que dicha protema es hemocianina de lapa de ojo de cerradura, ovoalbumina o tiroglobulina bovina.
Otra realizacion preferida de la invencion es un conjugado de un portador inmunogenico y un compuesto seleccionado del grupo consistente de:
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y
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Otra realizacion de la invencion es un conjugado de un compuesto seleccionado del grupo consistente de:
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y
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y una protema.
Una realizacion mas preferida de la invencion es un conjugado de una protema y un compuesto seleccionado del grupo consistente de:
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y
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en el que dicha protema es hemocianina de lapa de ojo de cerradura, ovoalbumina o tiroglobulina bovina.
La invencion tambien proporciona productos formados del proceso de poner en contacto los compuestos anteriores con un portador inmunogenico.
Otra realizacion de la invencion es por lo tanto un producto hecho por el proceso de poner en contacto un
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compuesto de Formula I
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en el que
R1 es H,
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CH2NH2, o CH2NHC(O)(CH2)mCO2H; R2 es H,
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CH2NH2, o CH2NHC(O)(CH2)mCO2H;
R3 es H, siempre que dos de R1, R2, R3 sean H, y siempre que ademas R1, R2 y R3 no sean todos H simultaneamente; m es 1, 2, 3, 4, o 5;
n es 1, 2, 3, 4, o 5; con un portador inmunogenico.
Otra realizacion de la invencion es un producto hecho por el proceso de poner en contacto un compuesto de Formula I en el que:
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R1 es H,
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CH2NH2, o CH2NHC(O)(CH2)mCO2H; R2 es H,
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CH2NH2, o CH2NHC(O)(CH2)mCO2H;
R3 es H, siempre que o R1 o R2 sean H, y siempre que ademas ambos de R1 y R2 no sean H simultaneamente; m es 1, 2, 3, 4, 0 5;
n es 1, 2, 3, 4, 0 5; con un portador inmunogenico.
Tambien se describe en la presente un producto hecho por el proceso de poner en contacto un compuesto de Formula I en el que:
R1 es H, o CH2NH-(Y)p-G;
R2 es H, o CH2NH-(Y)p-G; siempre que o R1 o R2 sean H, y siempre que ademas tanto R1 como R2 no sean H simultaneamente;
R3 es H; en el que:
Y es grupo espaciador organico;
G es un grupo de ligamiento funcional capaz de enlazar con un portador; p es 1; con un portador inmunogenico.
Otra realizacion de la invencion es un producto hecho por el proceso de poner en contacto un compuesto de F0rmula I
en el que R1 es H,
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CH2NH2, o CH2NHC(O)(CH2)mCO2H; R2 es H,
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CH2NH2, o CH2NHC(O)(CH2)mCO2H; siempre que o R1 o R2 sean H, y siempre que ademas ambos de R1 y R2 no sean H simultaneamente;
R3 es H,
m es 1, 2, 3, 4, 0 5;
n es 1, 2, 3, 4, 0 5; con un portador inmunogenico.
Otra realizacion de la invencion es un producto hecho por el proceso de poner en contacto un compuesto de Formula I en el que:
R1 es H,
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o CH2NH2; R2 es H,
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o CH2NH2; siempre que o R1 o R2 sean H, y siempre que ademas ambos de R1 y R2 no sean H
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simultaneamente;
R3 es H,
m es 1, 2, 3, 4, o 5;
n es 1,2, 3, 4, o 5; con un portador inmunogenico.
Una realizacion preferida de la invencion es un producto hecho por el proceso de poner en contacto cualquiera de los compuestos anteriores con un portador inmunogenico en el que el portador inmunogenico es una protema.
Una realizacion mas preferida de la invencion es un producto hecho por el proceso de poner en contacto cualquiera de los compuestos anteriores con un portador inmunogenico en el que el portador inmunogenico es una protema y en el que dicha protema es hemocianina de lapa de ojo de cerradura, ovoalbumina o tiroglobulina bovina.
Otra realizacion de la invencion es un producto hecho por el proceso de poner en contacto un compuesto
que es
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o
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con un portador inmunogenico.
Otra realizacion de la invencion es un producto hecho por el proceso de poner en contacto un compuesto
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con una protema.
Otra realizacion de la invencion es un producto hecho por el proceso de poner en contacto un compuesto
que es
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o
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con una protema, en el que dicha protema es hemocianina de lapa de ojo de cerradura, o tiroglobulina bovina. ABREVIATURAS
En la presente y a lo largo de la solicitud, se pueden usar las siguientes abreviaturas.
AMAS
ester de N-(a-maleimidoacetoxi) succinimida
BINAP
2,2'-bis(difenilfosfino)-1,1'-binaftilo
Boc o BOC
terc-butoxicarbonilo
BTG
tiroglobulina bovina
Bu3N
tributilamina
DCC
diciclohexilcarbodiimida
DCM
diclorometano
DIEA
diisopropiletilamina
DMF
N,N-dimetilformamida
EDCI o EDC
clorhidrato de 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida
EDTA
acido etilenediaminetetraacetico
HOBT o HOBt
hidrato de 1-hidroxibenzotriazol
KLH
hemocianina de lapa de ojo de cerradura
Pd2(dba)3
tris(dibencilideneacetona)dipaladio(0)
SATA
N-succinimidil S-acetiltioacetato
TEA o Et3N
trietilamina
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TF
tetrahidrofurano
TFA
acido trifluoroacetico
r.t.
temperatura ambiente
DEAD
dietilazodicarboxilato
DIC
diisopropilcarbodiimida
NHS
N-hidroxisuccinimida
TFP
Tetrafluorofenilo
PNP
p-nitrofenilo
TBTU
O-(Benzotriazol-1-il)-N,N,N',N'- tetrametiluronio tetrafluoroborato
DEPBT
3-(dietoxifosforiloxi)-1,2,3-benzotrazin-4(3H)-ona
BOP-Cl
cloruro Bis(2-oxo-3-oxazolidinil)fosfonico
DTT
ditioeritritol
DEFINICIONES
El termino "conjugados" se refiere a cualquier sustancia formada de la union de partes separadas. Conjugados representativos de acuerdo con la presente invencion incluyen aquellos formados por la union de una molecula pequena, como los compuestos de Formula I, y una molecula grande, como un portador o un polfmero de poliamina, particularmente una protema. En el conjugado la molecula pequena puede unirse en uno o mas sitios activos en la molecula grande.
El termino "hapteno" se refiere a un antigeno parcial o incompleto. Un hapteno es una sustancia libre de protemas, que no es capaz de estimular la formacion de anticuerpos, pero que reacciona con anticuerpos. Los anticuerpos se forman acoplando un hapteno con un portador inmunogenico de alto peso molecular, y despues inyectando este producto acoplado, es decir, un inmunogeno en un sujeto humano o animal.
El termino "inmunogeno" se refiere a una sustancia capaz de inducir, producir, o generar una respuesta inmune en un organismo.
Un "portador inmunogenico", como se usa en la presente, es una sustancia inmunogenica, comunmente una protema, que puede unirse en una o mas posiciones con haptenos, permitiendo de este modo la produccion de anticuerpos que pueden enlazar espedficamente con estos haptenos. Ejemplos de sustancias portadoras inmunogenicas incluyen, pero no estan limitadas a, protemas, glicoprotemas, complejos poliamino-polisacaridos, partmulas, y acidos nucleicos que son reconocidos como extranos y por lo tanto inducen una respuesta inmunologica del huesped. Los poliamino-polisacaridos pueden prepararse a partir de polisacaridos usando cualquiera de los medios convencionales conocidos para esta preparacion.
Pueden emplearse varios tipos de protemas como portadores inmunogenicos, incluyendo sin limitacion, albuminas, protemas sericas, lipoprotemas, etc. Las protemas ilustrativas incluyen albumina de suero bovino, hemocianina de lapa de ojo de cerradura, ovoalbumina de huevo, tiroglobulina bovina, albumina de suero humano de la fraccion V, albumina de conejo, globulina de semilla de calabaza, toxoide de difteria, toxoide de tetanos, toxina botulmica, protemas succiniladas , y poli(aminoacidos) sinteticos tales como polilisina.
Los portadores inmunogenicos tambien pueden incluir poli amino-polisacaridos, que son un polfmero de alto peso molecular compuesto por condensaciones repetidas de monosacaridos. Ejemplos de polisacaridos son almidones, glucogeno, celulosa, gomas de carbohidratos como goma arabiga, agar, y demas. El polisacarido tambien contiene residuos de poli(amino acidos) y/o residuos de lfpidos.
El portador inmunogenico tambien puede ser un poli(acido nucleico) ya sea solo o conjugado con uno de los poli(amino acidos) o polisacaridos anteriormente mencionados.
El portador inmunogenico tambien puede incluir partmulas solidas. Las partmulas son generalmente de al menos aproximadamente 0,02 micras (pm) y de no mas de aproximadamente 100 pm, y habitualmente de aproximadamente 0,05 pm a 10 pm de diametro. La partmula puede ser organica o inorganica, hinchable o no hinchable, porosa o no porosa, optimamente de una densidad proxima al agua, generalmente de alrededor de 0,7 a 1,5 g/ml., y compuesta de material que puede ser trasparente, parcialmente trasparente u opaco. Las partmulas pueden ser materiales biologicos como celulas y microorganismos, incluyendo ejemplos no limitativos como eritrocitos, leucocitos, linfocitos, hibridomas, Streptococcus, Staphylococcus aureus, E. coli y virus. Las partfculas tambien pueden estar compuestas de polfmeros organicos e inorganicos, liposomas, latex, vesfculas fosfolfpidas, o lipoprotemas.
El termino "derivado" se refiere a un compuesto qmmico o molecula hecha a partir de un compuesto padre por una o mas reacciones qmmicas.
El termino "analogo" de un compuesto qmmico se refiere a un compuesto qmmico que contiene una cadena
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de atomos de carbono y los mismos grupos funcionales particulares que un compuesto de referencia, pero la cadena de carbonos del analogo es mas larga o mas corta que la del compuesto de referencia.
Un "marcador", "moleculas detectoras", o "indicador" es cualquier molecula que produce, o puede ser inducida para producir, una senal detectable. El marcador conjugado con un analito, inmunogeno, anticuerpo, o con otra molecula como un receptor o molecula que puede enlazar con un receptor como un ligando, particularmente un hapteno o anticuerpo. Ejemplos no limitativos de marcadores incluyen isotopos radioactivos (por ejemplo 1251), enzimas (por ejemplo, p-galactosidasa, peroxidasa), fragmentos de enzimas, sustratos de enzimas, inhibidores de enzimas, coenzimas, catalizadores, fluoroforos (por ejemplo, rodamina, isotiocianato de fluorescema o FITC, o Dylight 649), colorantes, quimioluminiscentes y luminiscentes (por ejemplo, dioxetanos, luciferina) o sensibilizantes.
Como se usa en la presente, un "espaciador" se refiere a una porcion de una estructura qmmica que conecta dos o mas subestructuras como haptenos, portadores, inmunogenos, marcadores o colaboradores de enlace a traves de un grupo de ligamiento funcional. Estos grupos espaciadores estan compuestos de atomos tfpicamente presentes y ensamblados de maneras encontradas tfpicamente en compuestos organicos y asf pueden ser referidos como "grupos espaciadores organicos". Los bloques de construccion qmmica usados para ensamblar los espaciadores se describiran en lo sucesivo en esta solicitud. Entre los espaciadores preferidos estan las cadenas de carbono lineales o ramificadas, saturadas o no saturadas. Estas cadenas de carbono pueden incluir tambien uno o mas heteroatomos dentro de la cadena, uno o mas heteroatomos reemplazando uno o mas hidrogenos de cualquier atomo de carbono en la cadena, o en el extremo de las cadenas. Por "heteroatomos" se entiende atomos distintos del carbono que se eligen del grupo consistente de oxfgeno, nitrogeno, fosforo y azufre, en donde los atomos de nitrogeno, fosforo y azufre pueden existir en un estado de oxidacion y pueden tener carbono u otros heteroatomos unidos a ellos. El espaciador puede incluir tambien grupos dclicos o aromaticos como parte de la cadena o como una sustitucion en uno de los atomos en la cadena.
El numero de atomos en el grupo espaciador se determina contando los atomos distintos de hidrogeno. El numero de atomos en una cadena dentro de un grupo espaciador se determina contando el numero de atomos distintos de hidrogeno a lo largo de la ruta mas corta entre las subestructuras que se estan conectando. Las longitudes de cadena preferida son entre 1 y 20 atomos.
Un "grupo de ligamiento funcional" se refiere a un grupo reactivo que esta presente en un hapteno y puede usarse para proporcionar un sitio reactivo disponible a traves del cual la parte de hapteno puede acoplarse con otra fraccion a traves de la formacion de un enlace qrnmico covalente para producir un conjugado de un hapteno con otra fraccion (como un marcador o portador). El hapteno puede ligarse de este modo con una fraccion como biotina para formar un companero de enlace competitivo para el hapteno.
Los grupo espaciadores pueden usarse para ligar el hapteno con el portador. Los espaciadores de longitudes diferentes permiten que uno se una al hapteno con diferentes distancias del portador para la presentacion al sistema inmune del animal o humano que se esta humanizando para la optimizacion del proceso de formacion de anticuerpos. La union en diferentes posiciones en la molecula de hapteno permite la oportunidad de presentar sitios espedficos en el hapteno al sistema inmune para influir en el reconocimiento de anticuerpos. El espaciador puede contener grupos solubilizantes hidrofilos para hacer el derivado de hapteno mas soluble en medio acuoso. Ejemplos de grupos solubilizantes hidrofilos incluyen pero no estan limitados a grupos polioxialquiloxilo, por ejemplo, cadenas de polietilenglicol; hidroxilo; carboxilato y grupos sulfonato.
El termino "grupo nucleofilo" o "nucleofilo" se refiere a una especie que dona un par de electrones para formar un enlace qrnmico en una reaccion. El termino "grupo electrofilo" o "electrofilo" se refiere a una especie que acepta un par de electrones de un nucleofilo para formar un enlace qrnmico en una reaccion.
El termino "sustituido" se refiere a la sustitucion de un atomo o grupo de atomos en lugar de un atomo de hidrogeno en un atomo de carbono en cualquier posicion en la molecula padre. Ejemplos no limitativos de sustituyentes incluyen atomos de grupos halogeno, amino, hidroxi, carboxi, alquilo, arilo, heteroalquilo, heteroarilo, ciano, alcoxi, nitro, aldehfdo y cetona.
El termino "alquilo" se refiere a tanto radicales de cadena lineal como ramificada de hasta 12 atomos de carbono, a menos que se indique lo contrario, y se pretende espedficamente que incluya radicales que tiene cualquier grado o nivel de saturacion. Alquilo incluye, pero no esta limitado a metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo, isobutilo, sec-butilo, terc-butilo, pentilo, isopentilo, hexilo, isohexilo, heptilo, octilo, 2,2,4-trimetilpentilo, nonilo, decilo, undecilo y dodecilo.
El termino "cicloalquilo" se refiere a un radical de anillo de hidrocarburo saturado o parcialmente insaturado monodclico o bidclico compuesto de 3 a 10 atomos de carbono. Los sustituyentes de alquilo pueden estar opcionalmente presentes en el anillo. Ejemplos incluyen ciclopropilo, 1,1 -dimetil ciclobutilo, 1,2,3-trimetilciclopentilo, ciclohexilo y ciclohexenilo.
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El termino "heteroatomo" se refiere a un atomo de nitrogeno, un atomo de oxfgeno, un atomo de fosforo o un atomo de azufre en el que los atomos de nitrogeno, fosforo y azufre pueden existir en cualquier estado de oxidacion permitido.
El termino "heteroalquilo" se refiere a un grupo alquilo que incluye uno o mas heteroatomos dentro de la cadena, uno o mas heteroatomos que reemplazan uno o mas hidrogenos de cualquier atomo de carbono en la cadena, o en el extremo de las cadenas.
El termino "heterociclilo" se refiere a un anillo no aromatico (es decir saturado o parcialmente insaturado) compuesto de 3 a 7 atomos de carbono y al menos un heteroatomo seleccionado de N, O, o S. Los sustituyentes de alquilo pueden estar opcionalmente presentes en el anillo. Ejemplos incluyen tetrahidrofurilo, dihidropiranilo, piperidilo, 2,5-dimetipiperidilo, morfolinilo, piperazinilo, tiomorfolinilo, pirrolidinilo, pirrolinilo, pirazolidinilo, pirazolinilo, imidazolidinilo e imidazolinilo.
El termino "hidroxialquilo" se refiere a al menos un grupo hidroxilo enlazado con cualquier atomo de carbono a lo largo de una cadena de alquilo.
El termino "aminoalquilo" se refiere a al menos un grupo amino primario o secundario enlazado con cualquier atomo de carbono a lo largo de una cadena de alquilo.
El termino "alcoxialquilo" se refiere a al menos un grupo alcoxi enlazado a cualquier atomo de carbono a lo largo de una cadena de alquilo.
El termino "polialcoxialquilo" se refiere a compuestos alcoxi de cadena larga e incluye polietilenglicoles de tamanos discretos o monodispersos.
El termino "tioalquilo" se refiere a al menos un grupo de azufre enlazado con cualquier atomo de carbono a lo largo de una cadena de alquilo. El grupo de azufre puede estar en cualquier estado de oxidacion e incluye sulfoxidos, sulfonas y sulfatos.
El termino "carboxialquilo" se refiere a al menos un grupo carboxilato enlazado con cualquier atomo de carbono a lo largo de una cadena de alquilo. el termino "grupo carboxilato" incluye acidos carboxflicos y esteres de alquilo, cicloalquilo, arilo o aralquilo carboxilato.
El termino "alquilcarbonilo" se refiere a un grupo que tiene un grupo carbonilo enlazado a cualquier atomo de carbono a lo largo de una cadena de alquilo. El termino "heteroarilo" se refiere a radicales de anillo aromatico de 5- a 7- miembros mono- o de 8- a 10- miembros bidclico, cualquier anillo de los cuales consiste de uno a cuatro heteroatomos seleccionados de N, O o S donde los atomos de nitrogeno o azufre pueden existir en cualquier estado de oxidacion permitido. Ejemplos incluyen bencimidazolilo, benzotiazolilo, benzotienilo, benzoxazolilo, furilo, imidazolilo, isotiazolilo, isoxazolilo, oxazolilo, pirazinilo, pirazolilo, piridilo, pirimidinilo, pirrolilo, quinolinilo, tiazolilo y tienilo.
El termino "heteroaralquilo" se refiere a un grupo alquilo Ci-6 que tiene un sustituyente de heteroarilo. Ejemplos incluyen furiletilo y 2-quinolinolpropilo.
El termino "alcoxi" se refiere a radicales de cadena lineal o ramificada de hasta 12 atomos de carbono, a menos que se indique lo contrario, enlazados a un atomo de oxfgeno. ejemplos incluyen metoxi, metoxi, propoxi, isopropoxi y butoxi.
El termino "arilo" se refiere a radicales de anillo aromatico monodclico o bidclico que contienen de 6 a 12 carbonos en el anillo. Los sustituyentes de alquilo pueden estar opcionalmente presentes en el anillo. Ejemplos incluyen fenilo, bifenilo y naftaleno.
El termino "aralquilo" se refiere a un grupo alquilo Ci-6 que contiene un sustituyente de arilo. Ejemplos incluyen bencilo, feniletilo o 2-naftilmetilo.
El termino "heteroaralquilo" se refiere a un grupo alquilo Ci-6 que contiene un sustituyente de heteroarilo. Ejemplos incluyen furilmetilo y piridilpropilo.
El termino "ariloxi" se refiere a un atomo de oxfgeno enlazado a un sustituyente de arilo. Ejemplos incluyen fenoxi y benciloxi.
El termino "arilalcoxi" se refiere a un grupo alcoxi enlazado con un sustituyente de arilo. Ejemplos incluyen eter de fenilmetilo.
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El termino "acilo" se refiere al grupo -C(O)Ra, donde Ra es alquilo, arilo, aralquilo, heteroarilo y heteroaralquilo. Un "agente acilante" anade el grupo -C(O)Ra a una molecula.
El termino "sulfonilo" se refiere al grupo -S(O)2Ra, donde Ra es hidrogeno, alquilo, cicloalquilo, haloalquilo, arilo, aralquilo, heteroarilo y heteroaralquilo. Un "agente sulfonilante" anade el grupo -S(O)2Ra a una molecula.
Los espaciadores que llevan grupos de ligamiento funcional reactivos para la union de haptenos con moleculas portadoras pueden prepararse por una amplia variedad de metodos. El espaciador puede formarse usando una molecula que es funcionalizada o activada diferencialmente con grupos en cualquier extremo para permitir la reaccion secuencial selectiva con el hapteno y el portador, pero puede usarse la misma fraccion reactiva en ambos extremos. Los grupos seleccionados para la reaccion con el hapteno y el grupo de ligamiento funcional a ser unido con el portador se determinan por el tipo de funcionalidad en el hapteno y el portador con el que se va a unir el hapteno. Los espaciadores y metodos de union de haptenos y portadores incluyen pero no estan limitados a los descritos por Brinkley, M., A., Bioconjugate Chem. 1992, 3:2-13, Hermanson, Greg T., Bioconjugate Techniques,. Academic Press, London, Amsterdam, Burlington, MA, USA, 2008 y Thermo Scientific Pierce Crosslinking Technical Handbook; disponible para descarga o solicitud de copia impresa de Thermo Scientific 3747 N Meridian Rd, Rockford, IL USA 61l0l, ph 800-874-3723 o en:
http://www.piercenet.com/ y referencias en los mismos. Muchas moleculas diferencialmente activadas para la formacion de grupos espaciadores estan comercialmente disponibles de vendedores, por ejemplo Thermo Scientific.
Para haptenos que llevan un grupo amino, los modos de union del espaciador al hapteno incluyen reaccion de la amino en el hapteno con un bloque de construccion del espaciador que lleva un haluro de acilo o ester activo. "Esteres activos" se definen como esteres que se han sometido a reaccion con grupo nucleofilo, por ejemplo un grupo amino, bajo condiciones suaves para formar un ligamiento estable. Un ligamiento estable se define como uno que permanece intacto bajo condiciones de uso adicional, por ejemplo pasos sinteticos posteriores, uso como un inmunogeno, o en ensayo bioqmmico. Un ejemplo preferido de un ligamiento estable es un enlace amida. Los esteres activos y metodos de formacion se describen por Benoiton, N.L., in Houben-Weyl, Methods of Organic Chemistry, Thieme Stuttgart, New York, vol E22 seccion 3.2:443 y Benoiton, N.L., Chemistry of Peptide Synthesis, Taylor and Francis, NY, 2006. Los esteres activos preferidos incluyen ester de p-nitrofenilo (PNP), ester de N- hidroxisuccinimida (NHS) y ester de tetrafluorofenilo (TFP). Los haluros de acilo pueden prepararse por muchos metodos conocidos por el experto en la tecnica por ejemplo, reaccion del acido carboxflico con cloruro de tionilo o cloruro de oxalilo, ver: Fieser, L.F. y Fieser, M. Reagents for Organic Synthesis, John Wiley and Sons, NY, 1967 y referencias en el mismo. Estos pueden convertirse a otros esteres activos como esteres de p-nitrofenilo (PNP) que tambien puede usarse en espaciadores bi-funcionales activos como se describe por Wu et.al, Organic Letters, 2004 ,6 (24):4407. Los esteres de N-hidroxisuccinimida (NHS) pueden prepararse por la reaccion de carbonato de N.N- disuccinimidilo (CAS 74124-79-1) con el acido carboxflico de un compuesto en presencia de una base organica como trietilamina o diisopropiletilamina en solvente aprotico bajo condiciones anhidras como se describe en el Ejemplo 35 de la WO2012012595 o usando N-hidroxisuccinimida y diciclohexilcarbodiimida (DCC) u otro agente deshidratante, bajo condiciones anhidras. Los esteres de tetrafluorofenilo (TFP) pueden prepararse por la reaccion de acidos carboxflicos con 2,3,5,6-tetrafluorofeniltrifluoroacetato en presencia de una base organica como trietilamina o diisopropiletilamina en un solvente aprotico bajo condiciones anhidras como se informa por Wilbur, et.al, Bioconjugate Chem., 2004,15(1):203.
Un experto en la tecnica reconocera que los espaciadores mostrados en la Tabla 1, entre otros, pueden obtenerse usando metodos conocidos y unirse a haptenos que llevan amino utilizando optimizacion rutinaria de condiciones de reaccion, Estos espaciadores permiten la union del hapteno a un grupo tiol en un portador.
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Tabla 1
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Los valores razonables para m y n estan entre 1 y
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Tambien puede usarse como un modo de union el acoplamiento directo de la amina en el hapteno y una funcionalidad del acido carboxHico en el bloque de construccion del espaciador en presencia de un agente de acoplamiento. Los reactivos preferidos son los usados tfpicamente en la smtesis de peptidos. Los reactivos de acoplamiento de peptidos incluyen pero no estan limitados a O-(Benzotriazol-1-il)-N,N,N',N'-tetrametiluronio tetrafluoroborato (TbTU, CAS #125700-67-6), ver: Pruhs, S., Org. Process. Res. Dev. 2006, 10:441; N- Hidroxibenzotriazol (HOBT, CAS #2592-95-2) con un agente deshidratante de cabodiimida, por ejemplo N-N- diciclohexilcarbodiimida (DCC), diisopropilcarbodiimida (DIC), o clorhidrato de 1-etil-3 (3-dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC), ver: Konig W., Geiger, R. Chem. Ber., 1970, 103 (3):788; 3-(dietoxifosforiloxi)-1,2,3-benzotrazin- 4(3H)-ona (DEPBT, CAS#165534-43-0), ver: Liu, H. et.al., Chinese Chemical Letters, 2002, 13(7):601; cloruro bis (2- oxo-3-oxazolidinil)fosfonico; (BOP-Cl, CaS# 68641-49-6), ver: Diago-Meseguer, J et.al. Synthesis, 1980, 7:547-51 y otros descritos con detalle por Benoiton en Chemistry of Peptide Synthesis, CRC Press, Boca Raton, FL, 2005, Capftulo 2, y el boletm tecnico proporcionado por Advanced Automated Peptide Protein Technologies (aapptec), 6309 Shepardsville Rd., Louisville KY 40228, ph 888 692 9111;
www.aapptec.com, y las referencias citadas en el
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mismo. Estos metodos crean un ligamiento de amida estable uniendo el hapteno con el espaciador. Ejemplos de espaciadores que pueden obtenerse usando metodos conocidos y unidos a haptenos que llevan amino utilizando optimizacion rutinaria de condiciones de reaccion empleando los metodos descritos y citados anteriormente se muestran, pero no estan limitados a, los mostrados en la Tabla 2. Estos espaciadores permiten la union del hapteno a un grupo tiol en un portador.
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Los espaciadores tambien pueden construirse de una manera escalonada por la union secuencial de los grupos qmmicos apropiados al hapteno incluyendo el paso de formar el grupo de ligamiento funcional que es capaz de enlazar con el portador. Ver los ejemplos ilustrativos bajo los Esquemas de Reaccion Generales.
Adicionalmente, cuando el hapteno tiene un grupo nucleofilo, por ejemplo un grupo tiol, un grupo amino o un grupo hidroxilo que se volvera el punto de union del espaciador, el espaciador puede construirse tambien por alquilacion del grupo tiol, amina o hidroxilo. Puede usarse cualquier grupo alquilo que este apropiadamente sustituido con una fraccion capaz de someterse a una reaccion de sustitucion, por ejemplo, un haluro de alquilo, o ester de acido sulfonico como el p-Toluenosulfonato, para unir el espaciador. Son conocidos por los expertos en la tecnica muchos ejemplos de reacciones de alquilacion y se pueden encontrar ejemplos espedficos en la bibliograffa qrnmica general y optimizarse a traves de la experimentacion rutinaria. Un debate de reacciones de alquilacion con muchas referencias puede encontrarse en el Capftulo 10 de la March's Advanced Organic Chemistry, Smith, M.B., and March, J., John Wiley & sons, Inc. NY, 2001. Pueden emplearse tambien otros ligamientos como la reaccion de la fraccion nucleofila, por ejemplo una amina, en el hapteno con un isocianato para formar una urea o reaccion con un isotiocianato para formar un ligamiento de tiourea, ver: Li, Z., et.al., Phosphorus, Sulfur and Silicon and the Related Elements, 2003, 178(2):293-297. Los espaciadores pueden unirse a haptenos que llevan grupos hidroxilo a traves de la reaccion con grupos isocianato para formar ligamientos de carbamato o uretano. El espaciador puede activarse diferencialmente con el grupo funcional de isocianato en un extremo y un grupo de ligamiento funcional capaz de reaccionar con el portador, ver: Annunziato, M.E., Patel, U.S., Ranade, M. y Palumbo, P.S., Bioconjugate Chem., 1993, 4:212-218.
Para haptenos que llevan un grupo de acido carboxflico, los modos de union de una parte del espaciador con el hapteno incluyen la activacion del grupo de acido carboxflico como un haluro de acilo o ester activo, ejemplos de los cuales se muestran en la Tabla 3, la preparacion de los cuales se ha descrito anteriormente, seguido por la reaccion con un grupo amino (-NH2-), hidrazino (-NH-NH2-), hidrazido (-C(O)-NH-NH2-) o hidroxilo (-OH) en la parte del espaciador para formar un ligamiento de amida, hidrazida, diacilhidrazina o ester, o el acoplamiento directo del grupo de acido carboxflico con un grupo amino en la parte del espaciador o directamente en el portador con un reactivo de acoplamiento de peptidos y/o agente deshidratante de carbodimida, descritos anteriormente, ejemplos de los cuales se muestran en las Tablas 4 y 5. Los procedimientos encontrados en las referencias citadas anteriormente para la formacion de esteres activados y el uso de agentes de acoplamiento de peptidos pueden emplearse para la union de haptenos que llevan acido carboxflico con bloques de construccion de espaciadores y portadores de protemas con grupos amino disponibles utilizando optimizacion rutinaria de las condiciones de reaccion.
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Tabla 4
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HOBT
DEPT
BOP-Cl
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Tabla 5
^ —NCN-^ ^ Cl"
diisopropilcarbodiimida (DIC)
Diciclohexilcarbodiimida(DCC) 1-metil-3(3-dimetilaminopropil) carbodiimida.HCl (EDC)
Otros grupos electrofilos pueden estar presentes en el hapteno para unir el espaciador, por ejemplo, un haluro de sulfonilo
o grupo de fosforo electrofilo, por ejemplo:
O
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■S“CI
II
o
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Ver: Malachowski, William P., Coward, James K., Journal of Organic Chemistry, 1994, 59 (25):7616 o:
, O
i-P-ORc
ORc
Rc es alquilo, cicloalquilo, arilo, arilo sustituido, aralquilo.
Ver: Aliouane, L., et.al, Tetrahedron Letters, 2011,52(28):8681.
Los haptenos que llevan grupos aldehido o cetona pueden unirse a espaciadores usando metodos que incluyen pero no estan limitados a reaccion con un grupo hidrazida H2N-NH-C(O)- en el espaciador para formar una acilhidrazona, ver: Chamow, S.M., Kogan, T.P., Peers, D.H., Hastings, R.C., Byrn, R.A. y Askenaszi, A., J. Biol. Chem., 1992, 267(22): 15916. Ejemplos de grupos espaciadores hidrazida bifuncionales que permiten la union a un grupo tiol en el portador se muestran en la Tabla 6.
Tabla 6
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Los haptenos pueden contener tambien grupos tiol que pueden reaccionarse con el portador siempre que el portador se haya modificado para proporcionar un grupo que pueda reaccionar con el tiol. Los grupos portadores pueden modificarse por metodos que incluyen pero no estan limitados a la union de un grupo que contiene un grupo funcional de maleimida por la reaccion de un grupo amino en el portador con N-succinimidil maleimidoacetato, (AMAS, CAS# 55750-61-3), Succinimidil yodoacetato (CAS # 151199-81-4), o cualquiera de los grupos espaciadores bifuncionales mostrados en la Tabla 1 para introducir un grupo que pueda someterse a reaccion resultando en la union del hapteno con el portador.
El grupo de ligamiento funcional capaz de formar un enlace con el portador puede ser cualquier grupo capaz de formar un ligamiento estable y puede ser reactivo a una variedad de grupos diferentes en el portador. El grupo de ligamiento funcional puede reaccionar preferiblemente con un grupo amino, un grupo de acido carboxflico o un grupo tiol en el portador, o derivado de los mismos. Ejemplos no limitativos del grupo de ligamiento funcional son un grupo de acido carboxflico, haluro de acrilo, ester activo (como se ha definido anteriormente), isocianato, isotiocianato, haluro de alquilo, grupo amino, grupo tiol, grupo maleimida, grupo acrilato (H2C=CHC(O)-) o grupo vinil sulfona H2C=CH-SO2-) Ver: Park, J.W., et.al., Bioconjugate Chem., 2012, 23(3): 35o. El grupo de ligamiento funcional puede estar presente como parte de un bloque de construccion del espaciador diferencialmente activado que puede reaccionarse por pasos con el hapteno y el derivado de hapteno resultante puede reaccionarse despues con el portador. Alternativamente, el hapteno puede derivatizarse con un espaciador que lleve un grupo precursor que puede transformarse en el grupo de ligamiento funcional por una reaccion posterior. Cuando el grupo de ligamiento funcional en el espaciador es un grupo amina o de acido carboxflico, la reaccion de acoplamiento con el grupo de acido carboxflico o amina en el portador puede llevarse a cabo directamente a traves del uso de reactivos de acoplamiento de peptido de acuerdo con los procedimientos en las referencias citadas anteriormente para estos reactivos.
Pueden usarse grupos disulfuro particulares, por ejemplo, piridildisulfuros, como el grupo de ligamiento funcional en el espaciador que puede someterse a intercambio con un grupo tiol en el portador para formar un ligamiento de disulfuro mixto, ver: Ghetie, V.,v et al., Bioconjugate Chem., 1990, 1:24-31. Estos espaciadores pueden unirse por reaccion del hapteno que lleva amina con un ester activo que se une a un espaciador que lleva el grupo piridildisulfuro, ejemplos de los cuales incluyen pero no estan limitados a los mostrados en la Tabla 7.
Tabla 7
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Mas a menudo el portador es una protema y los grupos £-amino de los residuos de lisina pueden usarse para la union, ya sea directamente por reaccion con un grupo de ligamiento funcional amino-reactivo o tras derivatizacion con un grupo que contiene tiol, incluyendo N-Succinimidil S-Acetiltioacetato, (SATA, CAS 76931-93-6), o un analogo del mismo, seguido por la escision del grupo acetato con hidroxilamina para exponer el grupo tiol para la reaccion con el grupo de ligamiento funcional en el hapteno. Los grupos tiol tambien pueden introducirse en el portador por la reduccion de los enlaces de disulfuro dentro de los portadores de protemas con reactivos reductores suaves incluyendo pero no limitado a 2-mercaptoetilamina, ver: Bilah, M., et.al., Bioelectrochemistry, 2010, 80(1):49, reactivos de fosfina, ver: Kirley, T.L., Analytical Biochemistry, 1989, 180(2):231 o ditioeritritol (DTT, CAS 3483-12-3) Cleland, W., Biochemistry, 1964, 3:480-482.
ESQUEMAS DE REACCION GENERALES
Los compuestos representativos de la presente invencion pueden sintetizarse de acuerdo con los metodos sinteticos generales descritos a continuacion. Los compuestos de Formula (I) pueden prepararse por metodos conocidos por los expertos en la tecnica. Los siguientes esquemas de reaccion se pretende que representen ejemplos de la invencion y no se pretende de ninguna manera que limiten la invencion.
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Pueden prepararse derivados de quetiapina por una variedad de metodos. El grupo hidroxilo primario en la quetiapina, el compuesto de partida (R1 y R2 = H) mostrado en el Esquema 1, puede acilarse usando, por ejemplo anhndrido succmico y el metodo descrito por Fiedler, H., et.al., Langmuir, 1994, 10:3959. El acido resultante puede funcionalizarse adicionalmente como se describe en otro lugar en esta divulgacion o unirse directamente a un portador usando cualquier numero de los metodos anteriormente mencionados incluyendo los mostrados en los ejemplos posteriores.
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El grupo hidroxilo primario de quetiapina tambien puede alquilarse para formar un eter de acuerdo con el procedimiento de la US20100069356, como se muestra en el esquema 2, usando un haluro de alquilo o un ester de sulfonato, como 4-bromometilpentanoato en presencia de hidrogenosulfato de tetrabutilamonio e hidroxido de sodio acuoso para proporcionar un acido que puede usarse como se describe anteriormente.
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Los compuestos de Formula I en los que R2 es CH2NHC(O)(CH2)mCO2H pueden hacerse de acuerdo con el Esquema 3. La reaccion de 2-(2-(2-(aminometil)-4-(dibenzo[b,f][1,4]tiazepin-11-il)piperazin-1-il)etoxi)etanol, preparado como se describe en el Ejemplo 1, procede con un compuesto anhndrido dclico, como anhndrido succmico o anhfdrido glutarico, en un solvente como piridina, a temperaturas que vanan de temperatura ambiente a 60° C, durante aproximadamente 48 horas. Los expertos en la tecnica reconoceran que se puede usar la misma qrnmica para crear compuestos de Formula I en los que R1 es CH2NHC(O)(CH2)mCO2H.
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pueden hacerse de acuerdo con el Esquema 4. Los compuestos de Formula I, en los que R2 es CH2NHC(O)(CH2)mCO2H, preparados de acuerdo como se describe en el esquema 1, se tratan con N-t- butoxicarbonilpiperazina, dietilcianofosfonato, y una base, como diidopropiletilamina. La reaccion se lleva a cabo en un solvente, como diclorometano, durante aproximadamente 2 horas a temperatura ambiente. La desproteccion del grupo piperazinilo se logra con anhfdrido trifluoroacetico como se describe en el Esquema 4, seguido por la reaccion con un anhndrido apropiado, como anhfdrido succmico o anhndrido maleico, en presencia de una base adecuada como diisopropiletilamina. Los expertos en la tecnica reconoceran que puede usarse la misma qrnmica para crear compuestos de Formula I en los que R1 es
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Los compuestos de Formula I en los que R1 es
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pueden hacerse de acuerdo con el Esquema 5. La maleimida puede introducirse por cualquier metodo conocido en la tecnica. Los grupos funcionales de maleimida como 2,5-dioxopirrolidin-1-ilo 2- (2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1 -il) acetato en los que m es 1, pueden usarse en un solvente como DMF o CH2Cl2, y una base, como tributilamina o trietilamina. Alternativamente, el grupo piperazinilo desprotegido descrito en el Esquema 4 puede elaborarse con una funcionalidad de maleimida, como se describe en el Esquema 5 para dar compuestos de Formula I en los que R1 es
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Los expertos en la tecnica reconoceran que puede usarse la misma quimica para crear compuestos de Formula I en los que R2 es
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pueden conjugarse con protemas de acuerdo al metodo mostrado en el Esquema 6. La activacion de los residuos de lisina de protemas por la acilacion del epsilon-nitrogeno con N-succinimidil S-acetiltioacetato (SATA), seguido poa la hidrolisis posterior del grupo S-acetilo con hidroxilamina produce un grupo sulfidrilo nucleofilo. La conjugacion de la protema activada por sulfidrilo con el hapteno derivatizado de maleimida (preparado como se describe en el esquema general 3) procede a traves de una reaccion de activacion de Michael. Las protemas adecuadas son conocidas por los expertos en la tecnica e incluyen hemocianina de lapa de ojo de cerradura, tiroglobulina bovina y ovoalbumina. Puede usarse la misma metodologfa para conjugar protemas con haptenos funcionalizados con maleimida en los que R1 o R2 es
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Los haptenos funcionalizados con acido carboxflico, en los que R1 o R2 es CH2NHC(O)(CH2)mCO2H, pueden conjugarse con protemas de acuerdo con el metodo mostrado en el Esquema 7. La reaccion con N- hidroxisuccinimida y un agente de acoplamiento adecuado, como diciclohexilcarbodiimida, y una base, como tributil amina, en un solvente como DMF, a una temperatura de aproximadamente 20° C, durante aproximadamente 18 horas activa el acido carbox^lico con el grupo saliente hidroxipirrolidina-2,5-diona. El conector activado y el hapteno pueden entonces conjugarse con una protema en un solvente, como un tampon de fosfato de pH 7.5, a aproximadamente 20° C, durante aproximadamente 2,5 horas. Las protemas adecuadas con conocidas por los expertos en la tecnica e incluyen hemocianina de lapa de ojo de cerradura, tiroglobulina bovina y ovoalbumina. Puede usarse la misma metodologfa para conjugar protemas con haptenos funcionalizados con acido carboxflico en los que R1 o R2 es
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Los conjugados anteriores son utiles para la produccion de anticuerpos que enlazan con el farmaco anti- psicotico para el que se han generado (quetiapina). Estos anticuerpos pueden usarse en ensayos para detectar la presencia y/o cantidad del farmaco anti-psicotico en las muestras del paciente. Dicha deteccion permite la monitorizacion de farmacos terapeutica habilitando todos los beneficios de la misma. La deteccion de niveles de farmacos anti-psicoticos puede ser util para muchos propositos, incluyendo: deteccion en combinacion con la deteccion de otros farmacos anti-psicoticos, incluyendo los seleccionados del grupo consistente de risperidona, paliperidona, aripiprazol, olanzapina y metabolitos de los mismos, dicha deteccion permitiendo la medicion simultanea de estos farmacos anti-psicoticos; la determinacion de la adherencia o cumplimiento del paciente con la terapia prescrita; uso como una herramienta de decision para determinar si un paciente debena pasarse de un regimen anti-psicotico oral a un regimen anti-psicotico inyectable de larga duracion; uso como una herramienta de decision para determinar si el nivel de dosis o intervalo de dosificacion de los anti-psicoticos orales o inyectables debena aumentarse o disminuirse para asegurar la consecucion o el mantenimiento de los niveles de farmacos eficaces o seguros; uso como una ayuda en el inicio de la terapia de farmacos anti-psicoticos proporcionando evidencias de la consecucion de los niveles mmimos de pK; uso para determinar la bioequivalencia del farmaco anti- psicotico en formulaciones multiples o de multiples fuentes; uso para evaluar el impacto de polifarmada y interacciones farmaco-farmaco potenciales; y uso como una indicacion de que el paciente debena excluirse o incluirse en una prueba clmica y como una ayuda en la posterior monitorizacion de la adherencia a los requisitos de medicacion de la prueba clmica.
Habiendo proporcionado los conjugados de la presente invencion, que comprenden los compuestos de la presente y un portador inmunogenico, pueden generarse los anticuerpos, por ejemplo anticuerpos policlonales, monoclonales, quimericos y humanizados, que enlazan con el farmaco anti-psicotico. Tales anticuerpos que se contemplan particularmente incluyen anticuerpos monoclonales y policlonales asf como fragmentos de los mismos, por ejemplo, protemas recombinantes, que contienen el dominio de enlace con el antfgeno y/o una o mas regiones determinantes de la complementariedad de estos anticuerpos. Preferiblemente, el anticuerpo enlazara con el
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farmaco y cualquier metabolito farmacologicamente activo deseado. Alterando la localizacion de la union de un portador inmunogenico en un conjugado de farmacos, puede disenarse en los anticuerpos la selectividad y reactividad cruzada con metabolites y/o farmacos relacionados. Para la quetiapina, la reactividad cruzada con los metabolites de quetiapina como N-desalquilquetiapina (norquetiapina), sulfoxido de quetiapina, O- desalquilquetiapina o 7-hidroxi quetiapina puede ser deseable o no. Pueden generarse anticuerpos que detectan multiples de estos farmacos y/o metabolitos, o se pueden generar anticuerpos que detectan cada uno separadamente (definiendo por lo tanto las propiedades de "enlace espedfico" del anticuerpo. Un anticuerpo enlaza espedficamente con uno o mas compuestos cuando su enlace con el uno o mas compuestos es equimolar o sustancialmente equimolar.
Los metodos para producir dichos anticuerpos comprenden inocular un huesped con el conjugado (el compuesto y el portador inmunogenico siendo un inmunogeno) incorporando caractensticas de la presente invencion. Los huespedes adecuados incluyen, pero no estan limitados a, ratones, ratas, hamsteres, cobayas, conejos, pollos, burros, caballos, monos, chimpances, orangutanes, gorilas, humanos, y cualquier especie capaz de montar una respuesta inmune madura. Los procedimientos de inmunizacion estan bien establecidos en la tecnica y se exponen en numerosos tratados y publicaciones incluyendo "The Immunoassay Handbook",2a Edicion, editada por David Wild (Nature Publishing Group, 2000) y las referencias citadas en el mismo.
Preferiblemente, una caractenstica que incorpora inmunogenos de la presente invencion se administra a un sujeto huesped, por ejemplo un animal o humano, en combinacion con un adyuvante. Los adyuvantes adecuados incluyen, pero no estan limitados a, adyuvante de Freund, hidroxido de aluminio en polvo (alumbre), hidroxido de aluminio junto con Bordetella pertussis, y monofosforil lfpido A-sintetico trehalosa dicorinomicolato (MPL-TDM).
Los anticuerpos policlonales pueden promoverse en un huesped mairnfero por una o mas inyecciones de un inmunogeno que puede administrarse opcionalmente junto con un adyuvante. Tfpicamente, un inmunogeno o una combinacion de un inmunogeno y un adyuvante se inyecta en un huesped mamffero por una o multiples inyecciones subcutaneas o intraperitoneales. Preferiblemente, el programa de inmunizacion se lleva a cabo durante al menos una semana, y mas preferiblemente, durante dos o mas semanas. Los anticuerpos policlonales producidos de esta manera pueden aislarse y purificarse utilizando metodos bien conocidos en la tecnica.
Los anticuerpos monoclonales pueden producirse por los metodos de hibridomas bien establecidos de Kohler y Milstein, por ejemplo, Nature 256:495-497 (1975).Los metodos de hibridomas implican tfpicamente inmunizar un huesped o linfocitos de un huesped, recolectar el anticuerpo monoclonal que secreta o tiene el potencial de secretar linfocitos, fusionar los linfocitos con celulas inmortalizadas, y seleccionar las celulas que secretan el anticuerpo monoclonal deseado.
Puede inmunizarse un huesped para obtener linfocitos que producen o son capaces de producir anticuerpos espedficos para un inmunogeno. Alternativamente, los linfocitos pueden inmunizarse in vitro. Si se desean celulas humanas, pueden usarse linfocitos de sangre periferica, aunque se prefieren celulas del bazo o linfocitos de otras fuentes mamfferas.
Los linfocitos pueden fusionarse con una lmea celular inmortalizada para formar celulas de hibridomas, un proceso que puede facilitarse por el uso de un agente de fusion, por ejemplo polietilenglicol. A modo de ilustracion, pueden usarse celulas de mieloma de roedor mutante, bovinas, o humanas inmortalizadas por transformacion. Se prefieren las poblaciones sustancialmente puras de celulas de hibridomas, en oposicion con las celulas inmortalizadas no fusionadas. Asf, tras la fusion, las celulas pueden cultivarse en un medio adecuado que inhibe el crecimiento o supervivencia de celulas inmortalizadas, no fusionadas, por ejemplo, usando celulas de mieloma mutantes que carecen de enzima hipoxantina guanina fosforribosil transferasa (HGPRT). En tal situacion, pueden anadirse hipoxantina, aminopterina y timidina al medio (medio HAT) para evitar el crecimiento de celulas deficientes de HGPRT a la vez que se permite que crezcan los hibridomas.
Preferiblemente, las celulas inmortalizadas fusionadas eficientemente, pueden aislarse de poblaciones mixtas por seleccion en un medio como HAT, y soportar la expresion estable y de alto nivel del anticuerpo tras la fusion. Las lmeas celulares inmortalizadas preferidas incluyen lmeas celulares de mieloma disponibles del American Type Culture Collection, Manassas, VA.
Como las celulas de hibridomas tfpicamente secretan anticuerpo extracelularmente, el medio de cultivo puede ensayarse para la presencia de anticuerpos monoclonales espedficos para el farmaco anti-psicotico. Puede usarse la inmunoprecipitacion de ensayos de enlace in vitro, por ejemplo, radioinmunoensayo (RIA) o ensayo por inmunoabsorcion ligado a enzimas (ELISA), para medir la especificidad de enlace de los anticuerpos monoclonales.
Las celulas de hibridomas que secretan anticuerpos monoclonales pueden aislarse como clones individuales limitando los procedimientos de dilucion y sub-cultivando. Los medios de cultivo adecuados incluyen, pero no estan limitados a, Medio de Eagle modificado de Dulbecco, RPMI-1640, y medio libre de polipeptido, reducido de polipeptidos o libre de suero, por ejemplo Ultra DOMA PF o HL-1, disponibles de Biowhittaker,
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Walkersville, MD. Alternativamente, las celulas de hibridomas pueden cultivarse in vivo como ascitis.
Los anticuerpos monoclonales pueden aislarse y/o purificarse a partir de un medio de cultivo o fluido de ascitis por procedimientos de purificacion de inmunoglobulina (Ig) convencionales incluyendo, pero no limitados a, polipeptido A-SEFAROSA, cromatograffa de hidroxilapatita, electroforesis en gel, dialisis, precipitacion con sulfato de amonio y cromatograffa por afinidad.
Los anticuerpos monoclonales tambien pueden producirse por metodos recombinantes como los descritos en la Patente U.S. N° 4.166.452. Los anticuerpos monoclonales que codifican ADN pueden aislarse y secuenciarse usando procedimientos convencionales, por ejemplo usando sondas de oligonucleotidos que enlazan espedficamente con genes de la cadena de anticuerpos pesada y ligera murinos, preferiblemente con sonda de aDn aislado de lmeas celulares de hibridomas de anticuerpos monoclonales que secretan anticuerpos espedficos para farmacos anti-psicoticos.
INMUNOENSAYOS
Los anticuerpos asf producidos pueden usarse en inmunoensayos para reconocer/enlazar con el farmaco anti-psicotico, detectando de este modo la presencia y/o cantidad del farmaco en una muestra del paciente. Preferiblemente, el formato del ensayo es un formato de inmunoensayo competitivo. Tal formato de ensayo asf como otros ensayos se describen, entre otros sitios, en Hampton et al. (Serological Methods, A Laboratory Manual, APS Press, St. Paul, MN 1990) y Maddox et al. (J. Exp. Med. 158:12111, 1983).
Tambien puede proporcionar un kit de reactivos que comprende un anticuerpo tal como se ha descrito anteriormente. Un kit de reactivos representativo puede comprender un anticuerpo que enlaza con el farmaco anti- psicotico, quetiapina, un complejo que comprende un analogo de un farmaco anti-psicotico o un derivado de los mismos acoplado con una fraccion marcadora, y puede tambien comprender opcionalmente uno o mas calibradores que comprenden una cantidad conocida de un farmaco anti-psicotico o un estandar relacionado.
Como se ha indicado anteriormente, los kits de reactivos pueden comprender calibradores y/o materiales de control que comprenden una cantidad conocida del analito a medir. La concentracion del analito puede calcularse comparando los resultados obtenido para una muestra con los resultados obtenidos para un estandar. Puede construirse una curva de calibracion y usarse para relacionar los conjuntos de resultados y para determinar la concentracion de un analito en una muestra.
Cualquier muestra que se sospeche que contenga un analito, por ejemplo, un farmaco anti-psicotico, pueden analizarse de acuerdo con los metodos de las realizaciones actualmente preferidas. La muestra puede pre- tratarse si se desea y puede prepararse en cualquier medio conveniente que no interfiera con el ensayo. Preferiblemente, la muestra comprende un medio acuoso como un fluido corporal de un huesped, lo mas preferido plasma o suero.
Solitudes en tramite tituladas "Haptens of Aripiprazole" (Expediente del Agente N°. PRD3265USPSP, primer inventor nombrado: Remmerie), "Haptens of Olanzapine" (Expediente del Agente N°. PRD3266USPSP, primer
inventor nombrado: Remmerie), "Haptens of Paliperidone" (Expediente del Agente N°. PRD3267USPSP, primer
inventor nombrado: Remmerie), "Haptens of Quetiapine" (Expediente del Agente N°. PRD3268USPSP, primer
inventor nombrado: Remmerie), "Haptens of Risperidone and Paliperidone" (Expediente del Agente N°. PRD3269USPSP, primer inventor nombrado: Remmerie), "Antibodies to Aripiprazole Haptens and Use Thereof" (Expediente del Agente N°. CDS5128USPSP, primer inventor nombrado: Hryhorenko), "Antibodies to Olanzapine Haptens and Use Thereof' (Expediente del Agente N°. CDS5132USPSP, primer inventor nombrado: Hryhorenko), "Antibodies to Paliperidone Haptens and Use Thereof' (Expediente del Agente N°. CDS5126USPSP, primer inventor nombrado: Hryhorenko), "Antibodies to Quetiapine Haptens and Use Thereof' (Expediente del Agente N°. CDS5134USPSP, primer inventor nombrado: Hryhorenko), "Antibodies to Risperidone Haptens and Use Thereof' (Expediente del Agente N°. CDS5130USPSP, primer inventor nombrado: Hryhorenko), "Antibodies to Aripiprazole and Use Thereof" (Expediente del Agente N°. CDS5129USPSP, primer inventor nombrado: Hryhorenko), "Antibodies to Olanzapine and Use Thereof" (Expediente del Agente N°. CDS5133USPSP, primer inventor nombrado: Hryhorenko), "Antibodies to Paliperidone and Use Thereof" (Expediente del Agente N°. CDS5127USPSP, primer inventor nombrado: Hryhorenko), "Antibodies to Quetiapine and Use Thereof" (Expediente del Agente N°. CDS5135USPSP, primer inventor nombrado: Hryhorenko), "Antibodies to Risperidone and Use Thereof" (Expediente del Agente N°. CDS5131USPSP, primer inventor nombrado: Hryhorenko).
EJEMPLOS
Los compuestos representativos de la presente invencion pueden sintetizarse de acuerdo con los metodos sinteticos generales descritos a continuacion. Los compuestos de Formula (I) pueden prepararse por metodos conocidos por los expertos en la tecnica. Los siguientes ejemplos se pretende que representen ejemplos de la invencion y no se pretende que limiten la invencion de ninguna manera.
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Ejemplo 1
2-(2-(2-(aminometil)-4-(dibenzo[b,f][1,4]tiazepin-11-il)piperazin-1-il)etoxi)etanol Paso A
Piperazina-2-carbonitrilo
H
rN
V
N H
Se trato gota a gota una solucion agitada de tetrahidrofurano (300 ml) y etilendiamina (108,2 g) a 30° C con 2-cloroacrilonitrilo (105,0 g) durante un periodo de 2 horas y se agito durante 6 horas adicionales a 30° C. La mezcla de la reaccion se enfrio a 20° C y se formo el precipitado. La reaccion se filtro, y el filtrado se ajusto a PH 4 anadiendo acido clorhffdrico al 35%. El precipitado resultante se recogio por filtracion. Los precipitados combinados se disolvieron en solucion de acido clorhffdrico al 20% y despues se vertieron en solucion de tHf para precipitar el compuesto del tftulo, que se seco bajo presion reducida y se uso en la siguiente reaccion sin purificacion adicional. 1H NMR: (D2O, 400 MHz): 8 (ppm) 5.00-4.97 (m, 1H), 3.79 (d, J=4.8 Hz, 2H), 3.62-3.44 (m, 4H).
Paso B
terc-Butil 3-cianopiperazina-1-carboxilato
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A una solucion de compuesto piperazina-2-carbonitrilo, preparada como se ha descrito en el paso anterior, (90,6 g, 0,492 mol) se le anadio trietilamina (206 ml, 1,476 mol) y Boc2O (117 g, 0,542 mol). La mezcla de la reaccion se agito a temperatura ambiente durante la noche, y despues se concentro. El residuo se purifico por cromatograffa en gel de sflice para proporcionar el compuesto del fftulo.
1H NMR: (CDCla, 400 MHz): 8 (ppm) 4.06-3.91 (m, 3H), 3.28-2.83 (m, 4H), 1.47 (s, 9H).
Paso C
terc-Butil 3-ciano-4-(2-(2-hidroxietoxi)etil)piperazina-1-carboxilato
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Se trato una solucion de terc-butil 3-cianopiperazina-1-carboxilato, preparada como se describe en el paso anterior (10 g, 0,047 mol) y 2-(2-hidroxietoxi)acetaldel'ffdo (14, 8 g) (ver: Bodin, A.,Contact Dermatitis, 2001,44:207) en diclorometano con acido formico (12,7 g) y la mezcla de la reaccion se agito a temperatura ambiente durante la noche. Se anadio cianoborohidruro de sodio (7,2 g, 0,118 mol) en porciones. La mezcla de la reaccion se agito a temperatura ambiente durante 3 horas seguido por la adicion de agua y extraccion con diclorometano. La capa organica se lavo con salmuera, se seco sobre sulfato de sodio, se filtro, y se concentro. El producto bruto se purifico por cromatograffa en columna para proporcionar el producto.
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1H NMR: (CDCI3, 400 MHz): 5 (ppm) 4.15 (s, 1H), 3.69-3.63 (m, 4H), 3.58 (d, J=4.4 Hz, 2H), 3.47-3.44 (m, 4H), 2.61 (d, J=5.2 Hz, 2H), 2.51-2.48 (m, 4H), 1.43 (s, 9H).
Paso D
terc-Butil 3-(aminometil)-4-(2-(2-hidroxietoxi)etil)piperazina-1-carboxilato
O |
h^'Y1 N
A una solucion de terc-butil 3-ciano-4-(2-(2-hidroxietoxi)etil)piperazina-1-carboxilato, preparada como se describe en el paso anterior (9,9 g, 33,1 mmol) en metanol (20 ml) se le anadio Ni Raney (15 g). La solucion de la reaccion se agito a temperatura ambiente durante la noche bajo atmosfera de hidrogeno (50 psi). La mezcla se filtro y concentro para proporcionar el producto, que se uso en el paso siguiente sin purificacion adicional.
ESI-MS (M+1): 304 calculado para C14H29N3O4 303.
Paso E
terc-Butil 4-(2-(2-hidroxietoxi)etil)-3-((2,2,2-trifluoroacetamido)metil)piperazina-1-carboxilato
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A una solucion de terc-butil 3-(aminometil)-4-(2-(2-hidroxietoxi)etil)piperazina-1-carboxilato, preparada como se describe en el paso anterior (8,8 g) en diclorometano (100 ml) se le anadio trietilamina (8,8 g, 87,0 mmol) y anhfdrido trifluoroacetico (6,1 g, 29,0 mmol). La mezcla de la reaccion se agito a temperatura ambiente durante 12 h, se diluyo con diclorometano y se lavo con agua. La capa organica se lavo con salmuera, se seco sobre sulfato de sodio, se filtro, y se concentro para dar el producto bruto que se purifico por cromatograffa en columna para proporcionar el compuesto del tttulo.
ESI-MS (M+1): 400 calculado para C16H28F3N3O5 399.
Paso F
2,2,2-Trifluoro-N-((1-(2-(2-hidroxietoxi)etil)piperazin-2-il)metil)acetamida
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Una solucion de terc-butil 4-(2-(2-hidroxietoxi)etil)-3-((2,2,2-trifluoroacetamido)metil)piperazina-1- carboxilato, preparada como se describe en el paso anterior (8,6 , bruto) en cloruro de hidrogeno metanolico (20 ml) se agito a temperatura ambiente durante 1 hora, seguido por concentracion para proporcionar el compuesto del tttulo que se uso sin purificacion adicional. ESI-MS (M+1): 300 calculado para C11H20F3N3O3 299.
Paso G
Acido 2-((2-Nitrofenil)tio)benzoico
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A una solucion de acido 2-mercapto-benzoico (30 g, 0,195 mol) en isopropanol (500 ml) a temperature ambiente se le anadieron 1-fluoro-2-nitro-benceno (30,2 g, 0,214 mol), agua (100 ml) e hidroxido de potasio (31,1 g, 0,555 mol). La mezcla de la reaccion se agito a temperature ambiente durante la noche, se extinguio con agua y se diluyo con acetato de etilo. La fase acuosa se extrajo con acetato de etilo (3x400 ml) y los extractos organicos combinados se lavaron con cloruro sodico acuoso saturado (500 ml), se secaron sobre sulfato de magnesio, se filtraron y se concentraron. El residuo bruto se purifico por cromatograffa flash en columna en gel de sflice para dar el compuesto del tftulo. ESI-MS (M+1): 276 calculado para C13H9NO4S 275. 1H NMR: (CDCls, 400 MHz): 8 (ppm) 8.128.07 (m, 2H), 7.54-7.43 (m, 2H), 7.42-7.39 (m, 2H), 7.35-7.31 (m, 1H), 7.12-7.09 (m, 1H).
Paso H
Acido 2-((2-aminofenil)tio)benzoico
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A una solucion de acido 2-((2-nitrofenil)tio)benzoico, preparado como se describe en el paso anterior (43,3 g, 0,157 mol) en acetato de etilo (500 ml) se le anadio Pd/C (8 g). La solucion de la reaccion se agito a temperatura ambiente durante la noche bajo atmosfera gaseosa de hidrogeno. La mezcla se filtro y concentro para proporcionar el compuesto del tftulo. ESI-MS (M+1): 246 calculado para C13H11NO2S 245. 1H NMR: (CDCla, 400 MHz): 8 (ppm) 8.20-8.17 (m, 1H), 7.51-7.48 (m, 1H), 7.36-7.30 (m, 2H), 7.21-7.17 (m, 1H), 6.88-6.80 (m, 3H).
Paso I
Dibenzo[b,f][1,4]tiazepin-11(10H)-ona
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A una solucion de acido 2-((2-aminofenil)tio)benzoico, preparado como se describe en el paso anterior, (30 g, 0,122 mol) en diclorometano (300 ml) se le anadio EDCl (35,2 g, 0,183 mol), trietilamina (51 ml, 0,366 mol) y HOBT (24,7 g, 0,183 mol). La mezcla de la reaccion se agito a temperatura ambiente durante 12 horas, se lavo con 1M de HCl acuoso, bicarbonato sodico acuoso saturado, cloruro sodico acuoso saturado, y se seco sobre MgSO4. La solucion se filtro, se concentro y se purifico por cromatograffa en columna para proporcionar el compuesto del tftulo. ESI-MS (M+1): 228 calculado para C13H9NOS 227. 1H NMR: (CDCla, 400 MHz): 8 (ppm) 7.70-7.67 (m, 1H), 7.58-7.52 (m, 2H), 7.50-7.42 (m, 2H), 7.39-7.35 (m, 1H), 7.24-7.22 (m, 1H), 7.17-7.13 (m, 1H).
Paso J
11-Clorodibenzo[b,f][1,4]tiazepina
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Se calento a reflujo una solucion de dibenzo[b,f][1,4]tiazepin-11(10H)-ona, preparada como se describe en el paso anterior (14,6 g, 64 mmol) en oxicloruro de fosforo (20 ml) durante 2 horas. La mezcla se concentro para proporcionar el producto bruto que se uso directamente sin purificacion adicional. ESI-MS (M+1): 246 calculado para C13H8ClNS 245.
Paso K
N-((4-(Dibenzo[b,f][1,4]tiazepin-11-il)-1-(2-(2-hidroxietoxi)etil)piperazin-2-il)metil)-2,2,2-trifluoroacetamida
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A una solucion de 11-clorodibenzo[b,f][1,4]tiazepina, preparada como se describe en el paso anterior, (2 g, bruto) en dioxano (20 ml) se anadio Pd2(dba)3 (327 mg, 0,357 mmol), BINAP (225 mg, 0,357 mmol), trietilamina (6 ml, 42,9 mmol) y 2,2,2-trifluoro-N-((1-(2-(2-hidroxietoxi)etil)piperazin-2-il)metil)acetamida, preparada como se describe en el Paso F, (2,4 g, bruto). La mezcla resultante se calento a reflujo durante la noche bajo atmosfera de nitrogeno, se filtro a traves de CELITE™, y se concentro. El residuo se purifico por cromatograffa en gel de silice para proporcionar el compuesto del tftulo. ESI-MS (M+1): 509 calculado para C24H27F3N4O3S 508.
Paso L
2-(2-(2-(Aminometil)-4-(dibenzo[b,f][1,4]tiazepin-11-il)piperazin-1-il)etoxi)etanol
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Una mezcla de N-((4-(dibenzo[b,f][1,4]tiazepin-11 -il)-1-(2-(2-hidroxietoxi)etil)piperazin-2-M)metil)-2,2,2- trifluoroacetamida, preparada como se describe en el paso anterior (2,0 g), y carbonato potasico acuoso (5%) (15 ml) en metanol (20 ml) se agito a temperatura ambiente durante 18 horas y se extrajo con acetato de etilo. Las capas organicas se lavaron con cloruro sodico acuoso saturado, se secaron sobre sulfato de sodio, se filtraron, se evaporaron para dar el producto bruto que se purifico por cromatograffa en columna, y seguido por prep-HPLC para proporcionar el compuesto del tftulo como un solido amarillo. ESI-MS (M+1): 413 calculado para C23H28N4O2S 412. 1H NMR: (CDCl3, 400 MHz): 8 (ppm) 7.52-7.50 (m, 1H), 7.41-7.31 (m, 4H), 7.17-7.12 (m, 1H), 7.02-7.00 (m, 1H), 6.89-6.84 (m, 1H), 3.66-3.59 (m, 5H), 3.54-3.51 (m, 2H), 3.49-3.38 (m, 1H), 3.19-3.12 (m, 1H), 3.03-2.88 (m, 2H), 2.79-2.53 (m, 5H).
Ejemplo 2
N-((4-(Dibenzo[b,f][1,4]tiazepm-11-il)-1-(2-(2-hidroxietoxi)etil)piperazin-2-il)metil)-2-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-
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A una solucion de 2-(2-(2-(aminometil)-4-(dibenzo[b,f][1,4]tiazepin-11-il)piperazin-1-il)etoxi)etanol, preparada como se describe en el Ejemplo 1, (7,8 mg, 19,0 jmoles) en 410 |jl de DMF y 8,9 |jl de tributilamina se le anadieron 480 jl de una solucion DMF de ester de N-(a-maleimidoacetoxi) succinimida (AMAS, 10 mg/ml, 4,8 mg, 19,0 jmoles). Se permitio que la solucion resultante se agitase durante 60 minutos a 20° C, despues se uso como tal en la reaccion de conjugacion con protema activada por tiol.
Ejemplo 3
2-{2-[4-(3-Aminometil-dibenzo[b,f][1,4]tiazepin-11-il)-piperazin-1-il]-etoxi}-etanol
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Paso A
Acido 11-Oxo-10,11-dihidrodibenzo[b,f][1,4]tiazepina-3-carboxflico
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Se calento una mezcla de 2-amino-bencenotiol (1,34 ml, 12,5 mmol), acido 2-bromo-tereftalico (1,54 g, 6,3 mmol), oxido cuproso (0,50 g, 3,5 mmol), quinolina (6,3 ml), y piridina (0,63 ml) en un bano de aceite a 180° C bajo nitrogeno durante 20 horas, despues se enfrio a temperatura ambiente. Se anadio lentamente acido clorhndrico concentrado (20 ml) mientras se enfriaba en agua fria, con agitacion. Se filtro el precipitado resultante, se lavo con agua, y se seco para dar el compuesto del tftulo bruto (2 g). LC-MS: m/z 270 (M-1).
Paso B
Cloruro de 11-Cloro-dibenzo[b,f][1,4]tiazepina-3-carbonilo
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A una suspension de acido 11-Oxo-10,11-dihidrodibenzo[b,f][1,4]tiazepina-3-carboxflico, preparada como se describe en el paso anterior (0,41 g), en tolueno (6,5 ml) se le anadio DMF (0,125 ml) y cloruro de tionilo (6,5 ml). La mezcla se calento en un bano de aceite a 80° C bajo nitrogeno durante la noche. La solucion resultante se concentro hasta la sequedad. El producto bruto se uso para el paso siguiente.
Paso C
Amida de acido 11-cloro-dibenzo[b,f][1,4]tiazepina-3-carboxflico
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Se trato una solucion de cloruro de 11-cloro-dibenzo[b,f][1,4]tiazepina-3-carbonilo, preparada como se describe en el paso anterior, (ca 1,5 mmol) en diclorometano (10 ml) con una solucion de 1,4-dioxano de amoniaco (0,5 M, 9 ml) bajo un bano de hielo. La suspension resultante se agito a temperatura ambiente durante 1 hora, y la reaccion se extinguio con agua (10 ml). El precipitado resultante se filtro, se lavo con agua y diclorometano, y se seco. La capa organica del filtrado se lavo con solucion de bicarbonato sodico acuoso saturado y se concentro a un producto blanquecino adicional, que se uso en el paso siguiente sin purificacion adicional. LC-MS: m/z 289 (M+1). 1H NMR (DMSOd6, 400 MHz): 8 (ppm) 8.19 (br, 1H), 8.00-7.96 (m, 2H), 7.90 (d, 1H), 7.64 (br, 1H), 7.56 (m, 1H), 7.47 (m, 1H), 7.31 (m, 2H).
Paso D
Amida de acido 11-{4-[2-(2-Hidroxi-etoxi)-etil]-piperazin-1-il}-dibenzo[b,f][1,4]tiazepina-3-carboxflico
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A una solucion de amida de acido 11-cloro-dibenzo[b,f][1,4]tiazepina-3-carboxflico, preparada como se describe en el paso anterior, (0,40 g) en DMF (1,5 ml) y tolueno (1,5 ml) se le anadio 2-(2-piperazin-1-il-etoxi)-etanol (0,50 g, 2,9 mmol). La solucion se calento en un bano de aceite a 110° C bajo nitrogeno durante 5 horas, se concentro, y se purifico (gel de silice, 2-5% metanol-diclorometano que contema eluyente de amoniaco) para dar el compuesto del tftulo como un solido blanquecino. LC-MS: m/z 427 (M+1).
Paso E
2-{2-[4-(3-Aminometil-dibenzo[b,f][1,4]tiazepin-11-il)-piperazin-1-il]-etoxi}-etanol
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A una solucion de 2-{2-[4-(3-Aminometil-dibenzo[b,f][1,4]tiazepin-11-il)-piperazin-1-il]-etoxi}-etanol, preparada como se describe en el paso anterior, (0,24 g, 0,56 mmol) en THF (15 ml) se le anadio 1M de solucion de THF hforida de litio aluminio (6 ml, 6mmol). La suspension blanca se calento en una bano de aceite a 70° C bajo nitrogeno durante 2 horas. La suspension de la reaccion se extinguio con la adicion lenta de solucion de sulfato de sodio acuoso saturado bajo un bano de hielo. La fase de la solucion se separo, y se extrajo el solido con THF (5x10 ml). Las fases organicas combinadas se concentraron y purificaron (gel de silice, 2-5% metanol diclorometano que contema eluyente de amoniaco ) para dar el compuesto del tftulo como un solido blanquecino. LC-MS: m/z 413 (M+1). 1H NMR (CDCl3, 400 MHz) 8 (ppm) 7.47 (s, 1H), 7.38 (m, 1H), 7.26 (m, 2H, superpuesto con solvente), 7.17 (m, 1H), 7.06 (m, 1H), 6.88 (m, 1H), 3.85 (s, 2H), 3.76-3.46 (m, 11H, conteniendo protones intercambiables), 2.662.57 (m, 8H).
Ejemplo 4
2-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)-N-((11-(4-(2-(2-hidroxietoxi)ethil)piperazin-1-il)dibenzo[b,f][1,4]tiazepin-3-
il)metil)acetamida
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A una solucion de 2-{2-[4-(3-aminometil-dibenzo[b,f][1,4]tiazepin-11-il)-piperazin-1-il]-etoxi}-etanol, preparada como se describe en el Ejemplo 3, (5,6 mg, 13,6 pmoles) en 295 pl de DMF y 6,4 pl de tributilamina se le anadieron 340 pl de una solucion de dMf de de ester de N-(a-maleimidoacetoxi)succinimida (AMAS, 10 mg/ml, 3,4 mg, 13,6 pmoles). Se permitio que la solucion resultante se agitase durante 60 minutos a 20° C, despues se uso como tal en la reaccion de conjugacion con protema activada por tiol
Ejemplo 5
N-((4-(dibenzo[b,f][1,4]tiazepin-11-il)-1-(2-(2-hidroxietoxi)ethil)piperazin-2-il)metil)-2-(2,5-dioxo-2,5-dihidro- 1H-pirrol-1-il)acetamida-tiroglobulina bovina-conjugado
Paso A
Reaccion de Tiroglobulina Bovina (BTG) con SATA:
A 3,0 ml de una solucion de tiroglobulina bovina (BTG, 20,0 mg, 0,03 pmoles) en 100 mM de tampon de fosfato pH 7.5 se anadieron 276,0 pl de una solucion de DMF de N-succinimidil-S-acetiltioacetato (SATA, 25 mg/ml, 6,9 mg, 30,0 pmoles). La solucion resultante se incubo a 20° C durante 1 hora en un mezclador de rodillos. La reaccion se purifico en una columna Sephadex G-25 usando 100 mM de tampon de fosfato, 5 mM de EDTA, y pH
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6.0. A 6,0 ml de BTG-SATA (18,0 mg, 0,027 jmoles) se le anadieron 600 |jl de 2,5 M de hidroxilamina, 50 mM de EDTA, pH 7.0 La solucion resultante se incubo a 20° C durante 1 hora en un mezclador de rodillos.
Paso B
A una alfcuota de solucion de BTG-SH, preparada como se describe en el paso anterior, (6,6 ml, 0,027 jmoles) se le anadio una alfcuota de la solucion preparada en el Ejemplo 2 (898,9 jl, 19,0 jmoles). La mezcla turbia resultante se incubo durante 3 horas a 20° C en un mezclador de rodillos. La reaccion se filtro a traves de un filtro de jeringa de 0,45 jm, despues se purifico en una columna Sephadex G-25 usando 100 mM de tampon de fosfato, 0,14 M de cloruro sodico, a pH 7.4.
Ejemplo 6
2-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)-N-((11-(4-(2-(2-hidroxietoxi)etil)piperazin-1-il)dibenzo[b,f][1,4]tiazepin-3- il)metil)acetamida-tiroglubulina bovina-conjugado
A una alfcuota de solucion de BTG-SH, preparada como se describe en el Ejemplo 5 Paso A, (3,4 ml, 0,014 jmoles) se le anadieron 641,4 jl de 2-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)-N-((11-(4-(2-(2- hidroxietoxi)ethil)piperazin-1-il)dibenzo[b,f][1,4]tiazepin-3-il)metil)acetamida, preparada como se describe en el ejemplo 4, (13,6 jmoles). La mezcla turbia resultante se incubo durante 3 horas a 20° C en un mezclador de rodillos. La reaccion se purifico en una columna Sephadex G-25 usando 100 mM de tampon de fosfato, 0,14M de cloruro sodico, a pH 7.4.
Ejemplo 7
N-((4-(dibenzo[b,f][1,4]tiazepin-11-il)-1-(2-(2-hidroxietoxi)etil)piperazin-2-il)metil)-2-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1- il)acetamida-hemocianina de lapa de ojo de cerradura-conjugado
Paso A
Reaccion de hemocianina de lapa de ojo de cerradura (KLH) con SATA
A una solucion de 3,18 ml de hemocianina de lapa de ojo de cerradura (KLH, 15,6 mg, 0,156 jmoles) en 100 mM de tampon de fosfato, 0,46M de cloruro sodico, a pH 7,4 se le anadieron 72,1 jl de una solucion de DMF de N-succinimidil-S-acetiltioacetato (SATA, 25 mg/ml,1,8 mg, 7,80 jmoles). La solucion resultante se incubo a 20° C durante 1 hora en un mezclador de rodillos. La reaccion se purifico en una columna Sephadex G-25 usando 100 mM de tampon de fosfato, 0,46 M de cloruro sodico, 5 mM de EDTA, a pH 6.0. A 6,27 ml de la solucion de KLH-SATA resultante (13,3 mg, 0,133 jmoles) se le anadieron 627 jl de 2,5M de hidroxilamina, 50 mM de EDTA, a pH 7.0. La solucion resultante se incubo a 20° C durante 1 hora en un mezclador de rodillos. La reaccion se uso como tal en la reaccion de conjugacion con hapteno activado por maleimida.
Paso B
A un alfcuota de solucion de KLH-SH, preparada como se describe en el paso anterior (6,9 ml, 0,133 jmoles) se le anadio una alfcuota de la solucion preparada en el Ejemplo 2, (624,3 jl, 13,3 jmoles). La mezcla turbia resultante se incubo durante 3 horas a 20° C en un mezclador de rodillos. La reaccion se filtro a traves de un filtro de jeringa de 0,45 jm despues se purifico en una columna Sephadex G-25 usando 100 mM de tampon de fosfato, 0,46M de cloruro sodico, a pH 7.4.
Ejemplo 8
2-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)-N-((11-(4-(2-(2-hidroxietoxi)ethil)piperazin-1-il)dibenzo[b,f][1,4]thiazepin-3- il)metil)acetamida-hemocianina de lapa de ojo de cerradura-conjugado
A una alfcuota de solucion de KLH-SH, preparada como se describe en el Ejemplo 7 Paso A (3,2 ml, 0,061 jmoles) se le anadio una alfcuota de la solucion preparada en el Ejemplo 4 (283,0 jl, 6,10 jmoles). La mezcla turbia resultante se incubo durante 3 horas a 20° C en un mezclador de rodillos. La reaccion se purifico en una columna Sephadex G-25 usando 100 mM de tampon de fosfato, 0,46M de cloruro sodico, a pH 7.4.
Ejemplo 9
Inmunoensayo Competitivo para Quetiapina
Siguiendo una serie de inmunizaciones con inmunogenos de quetiapina, se probaron sangrados de cola de raton para reactividad usando un ELISA. Tambien se probaron sobrenadantes de hibridomas, y los datos del ELISA
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
se muestran en las Tablas 1 y 2 siguiente muestran reactividad de varios hibridomas (el companero de fusion eran celulas NSO).
Tabla 1
Dilucion
g 10 11 12
400
79 89 90 95 Compuesto N°9
400
1200
1200
3600
3600
10800
10800
BlSJb
1.5858 1.3168 1.4302 0 0533 Compuesto N°9
1.5111 1.0627 1.2186 0.0427
0.5578 0.4213 0.598 0.0219
0.554 0.4447 0.5353 0.0233
0.1932 0.1582 0.1868 0.0154
0.171 0.2111 0.1838 0.0132
0.0736 0.0722 0.0733 0.0107
0.0884 0.0774 0.086 0.0107
Tabla 2
dilucion
402 1A4 4G12 IF6
400
0.5467 u.2002 0.0144 0 1303
1200
0.1793 O.0619 0.01035 0.03905
3600
0.06655 0.026 0.00325 0.0192
10300
0.02755 0.0132 0.00765 0.01035
400
3.7296 0.24275 0.22535 0.00615
1200
2.4516 0.0763 0.00685
3600
1.1575 0.02875 0.00615
10300
0.4622 O.0147 0.0145 0.00645
dilucion
5E9 2F2 3E2
El sobrenadante se probo entonces por ELISA competitivo para determinar si las senales eran espedficas para quetiapina. Las Figs. 1 y 2 muestran los resultados de hibridomas representativos. Los datos muestran reactividad espedfica para quetiapina.
La Fig. 3 muestro el formato de inmunoensayo competitivo usado en un dispositivo de ensayo de flujo lateral en el que el anticuerpo de captura, un clon de quetiapina, se deposito en un chip junto con un conjugado de deteccion que consistfa de quetiapina conjugada con un fluorofeno. En este formato competitivo como muestra la Fig. 3, un nivel bajo de analito (quetiapina) da lugar a una senal alta, mientras que un nivel alto de analito (quetiapina) da lugar a una senal baja. La cantidad de quetiapina en la muestra puede calcularse de la perdida de fluorescencia comparada con una muestra de control sin farmaco presente. Una curva de respuesta a dosis tfpica generada con los sub-clones de quetiapina 89-3, 89-13 y 89-5 se muestra en la Fig. 4.

Claims (15)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    45
    50
    55
    60
    65
    Reivindicaciones
    1. Un compuesto de Formula 1:
    en el que:
    en el que R1 es H,
    imagen1
    imagen2
    imagen3
    CH2NH2, o CH2NHC(O)(CH2)mCO2H; R2 es H,
    imagen4
    CH2NH2, o CH2NHC(O)(CH2)mCO2H; siempre que o R1 o R2 sean H, y siempre que ademas ambos de R1 y R2 y no sean H simultaneamente;
    R3 es H;
    m es 1, 2, 3, 4, o 5; n es 1,2, 3, 4, o 5.
    5
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    55
    60
    65
  2. 2. El compuesto de la Reivindicacion 1 en el que:
    R1 es H,
    o CH2NH2; R2 es H,
    imagen5
    imagen6
    o CH2NH2; siempre que o R1 o R2 sean H, y siempre que ademas ambos de R1 y R2 no sean H simultaneamente;
    R3 es H;
    m es 1, 2, 3, 4, o 5; n es 1,2, 3, 4, o 5.
  3. 3. El compuesto de la Reivindicacion 1, seleccionado del grupo que consiste de:
    imagen7
    imagen8
    5
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    50
    55
    60
    65
    y
    imagen9
  4. 4. Un conjugado de un compuesto de la Reivindicacion 1 y un portador inmunogenico.
  5. 5. El conjugado de la Reivindicacion 4, donde dicho portador inmunogenico es una protema.
  6. 6. El conjugado de la Reivindicacion 5, donde dicha protema es hemocianina de lapa de ojo de cerradura, ovoalbumina o tiroglobulina bovina.
  7. 7. Un conjugado del compuesto de la Reivindicacion 2 y un portador inmunogenico.
  8. 8. El conjugado de la Reivindicacion 7 donde dicho portador inmunogenico es una protema.
  9. 9. El conjugado de cualquiera de las Reivindicaciones 4-6 en el que el compuesto es
    imagen10
    imagen11
    imagen12
    5
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    50
    55
    60
    65
    o
    imagen13
  10. 10. El conjugado de la Reivindicacion 5 en el que el compuesto es:
    imagen14
    o
    imagen15
  11. 11. El conjugado de la Reivindicacion 10 en el que dicha protema es hemocianina de lapa de ojo de cerradura, ovoalbumina o tiroglobulina bovina.
  12. 12. El conjugado de la Reivindicacion 4 o la Reivindicacion 7 hecha por el proceso de poner en contacto un compuesto de la Reivindicacion 1 o la Reivindicacion 2 con un portador inmunogenico.
  13. 13. El conjugado de la Reivindicacion 12 hecho por el proceso de poner en contacto un compuesto que es
    imagen16
    5
    10
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    30
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    40
    45
    50
    55
    60
    65
    o
    imagen17
    con un portador inmunogenico.
  14. 14. El conjugado de la Reivindicacion 13 en el que el portador inmunogenico es una protema.
  15. 15. El conjugado de la Reivindicacion 14 en el que la protema es hemocianina de lapa de ojo de cerradura, ovoalbumina o tiroglobulina bovina.
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