ES2822907T3 - Haptenos de quetiapina para su uso en inmunoensayos - Google Patents

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Yong Gong
Rhys Salter
Eric Hryhorenko
Thomas R Decory
Bart M Remmerie
Banumathi Sankaran
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Abstract

Un compuesto de Fórmula 1: **(Ver fórmula)** en el que: R1 es H, **(Ver fórmula)** o CH2NHC(O)(CH2)mCO2H; R2 es H, **(Ver fórmula)** o CH2NHC(O)(CH2)mCO2H; R3 es H; siempre que o R1 o R2 sean H, y siempre que además ambos de R1 y R2 y no sean H simultáneamente; m es 1, 2, 3, 4, o 5; y n es 1, 2, 3, 4, ó 5.

Description

DESCRIPCIÓN
Haptenos de quetiapina para su uso en inmunoensayos
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La invención se refiere al campo de los inmunoensayos para determinar la presencia de quetiapina en fluidos biológicos humanos.
ANTECEDENTES DE LA INVENCION
La esquizofrenia es un trastorno psiquiátrico crónico y debilitante que afecta aproximadamente al 0,45-1% de la población mundial (van Os, J.; Kapur, S. "Schizophrenia" Lancet 2009, 374, 635-645). Los objetivos principales del tratamiento son lograr la remisión sostenida de los síntomas psicóticos, reducir el riesgo y consecuencias de recaída, y mejorar el funcionamiento del paciente y calidad de vida en general. Aunque muchos pacientes con esquizofrenia son capaces de alcanzar estabilidad de los síntomas con las medicaciones anti-psicóticas disponibles, el mal cumplimiento con la medicación es una razón común para la recaída con medicaciones orales administradas diariamente. Varios estudios Abdel-Baki, A.; Ouellet-Plamondon, C.; Malla, A. "Pharmacotherapy Challenges in Patients with First-Episode Psychosis" Journal of Affective Disorders 2012, 138, S3-S14) que investigan los resultados del no-cumplimiento han demostrado que los pacientes con esquizofrenia que no toman su medicación como se ha prescrito tienen tasas más altas de recaída, ingreso hospitalario y suicido así como mortalidad aumentada. Se estima que del 40 al 75% de los pacientes con esquizofrenia tienen dificultad en cumplir un régimen de tratamiento oral (Lieberman, J. A.; Stroup, T. S.; McEvoy, J. P.; Swartz, M. S.; Rosenheck, R. A.; Perkins, D. O.; Keefe, R. S. E.; Davis, S. M.; Davis, C. E.; Lebowitz, B. D.; Severe, J.; Hsiao, J. K. "Effectiveness of Antipyschotic Drugs in Patients with Chronic Schizophrenia" New England Journal of Medicine 2005, 353(12), 1209-1223). La monitorización de fármacos terapéutica (TDM) es la cuantificación de concentraciones de suero o plasma de fármacos, incluyendo fármacos anti-psicóticos, para la monitorización y optimización del tratamiento. Dicha monitorización permite, por ejemplo, la identificación de pacientes que no cumplen con su régimen de medicación, que no están alcanzando dosis terapéuticas, que no responden a dosis terapéuticas, que tienen tolerabilidad subóptima, que tienen interacciones fármaco-fármaco farmacocinéticas, o que tienen metabolismo anormal que dan lugar en concentraciones de plasma inadecuadas. Existe una variabilidad individual considerable en la capacidad del paciente, absorber, distribuir, metabolizar y excretar fármacos anti-psicóticos. Tales diferencias pueden estar provocadas por enfermedad concurrente, edad, medicación concomitante o peculiaridades genéticas. Formulaciones de fármacos diferentes también pueden influir en el metabolismo del fármaco anti-psicótico. La TDM permite la optimización de la dosis para pacientes individuales, mejorando los resultados terapéuticos y funcionales. La TDM permite además a un médico que prescribe asegurar el cumplimiento con las dosificaciones prescritas y la consecución de concentraciones de suero efectivas.
Hasta la fecha, los métodos para determinar los niveles de concentraciones de suero o plasma de los fármacos anti-psicóticos implican el uso de cromatografía líquida (LC) con detección por UV o espectrometría de masas, y radioinmunoensayos (ver, por ejemplo, Woestenborghs et al., 1990 "On the selectivity of some recently developed RIA’s" in Methodological Surveys in Biochemistry and Analysis 20:241-246. Analysis of Drugs and Metabolites, Including Anti-infective Agents; Heykants et al., 1994 "The Pharmacokinetics of Risperidone in Humans: A Summary", J Clin Psychiatry 55/5, suppl:13-17; Huang et al., 1993 "Pharmacokinetics of the novel anti-psychotic agent risperidone and the prolactin response in healthy subjects", Clin Pharmacol Ther 54:257-268). Los radioinmunoensayos detectan una o ambas de risperidona y paliperidona. Salamone et al. en la Patente US N° 8.088.594 divulgan un inmunoensayo competitivo para risperidona usando anticuerpos que detectan tanto la risperidona como la paliperidona pero no metabolitos garmacológicamente inactivos. Los anticuerpos usados en el inmunoensayo competitivo están desarrollados contra un inmunógeno particular. ID Labs Inc. (London, Ontario, Canadá) comercializa ELISA para olanzapina, otro fármaco anti-psicótico, que también utiliza un formato competitivo. Las instrucciones para el uso indican que el ensayo está diseñado para propósitos de selección y pretendido para uso forense o de investigación, y no está pretendido específicamente para uso terapéutico. Las instrucciones recomiendan que todas las muestras positivas deben confirmarse con cromatografía de gas/espectrometría de masas (GC-MS), e indican que el anticuerpo usado detecta olanzapina y clozapina (ver ID Labs Inc., "Instructions For Use Data Sheet IDEL-F083", Fecha de Revisión, 8 de agosto, 2011). Algunos de estos métodos, concretamente HPLC y GC/MS, pueden ser caros y laboriosos, y se realizan sólo generalmente en laboratorios grandes o especializados que tienen el equipo apropiado.
Davis, P.C. et. al. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 2010, vol. 51, N° 5 páginas 1113­ 1119 se refiere al desarrollo y validación de un método de LC-MS/MS para la determinación de quetiapina y cuatro metabolitos relacionados en plasma humano.
Existe una necesidad de otros métodos para determinar los niveles de fármacos anti-psicóticos, particularmente métodos que pueden realizarse en la oficina de un médico que prescribe (donde el tratamiento para un paciente individual puede ajustarse en consecuencia de una manera mucho más oportuna) y en otros entornos médicos que carecen de equipo de LC o GC/MS o requieren resultados de las pruebas rápidos.
La quetiapina es:
Figure imgf000003_0001
SUMARIO DE LA INVENCION
La presente invención proporciona compuestos y conjugados que permiten tal método mejorado para determinar los niveles del fármaco anti-psicótico quetiapina.
La invención comprende compuestos de Fórmula I
Figure imgf000003_0002
en los que:
R1 es H,
Figure imgf000003_0003
o CH2NHC(O)(CH2)mCO2H;
R2 es H,
Figure imgf000004_0001
o CH2NHC(O)(CH2)mCO2H;
R3 es H, siempre que dos de R1, R2, R3 sean H, y siempre que además R1, R2 y R3 no sean todos H simultáneamente;
m es 1,2, 3, 4, ó 5;
n es 1, 2, 3, 4, ó 5.
La invención comprende conjugados de compuestos de la invención con portadores inmunogénicos como proteínas, y productos producidos por el proceso de poner en contacto los compuestos de la invención con portadores inmunogénicos.
BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS
Las Figs. 1 y 2muestran resultados de ELISA Competitivo generados por varios hibridomas;
La Fig. 3 muestra el formato de inmunoensayo competitivo usado en un dispositivo de ensayo de flujo lateral; y
La Fig. 4 muestra una cuerva de respuesta de dosis típica generada con sub-clones de quetiapina 89-3, 89­ 13, y 89-5.
DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION
La presente invención proporciona compuestos y conjugados que permiten la determinación de niveles de fármacos anti-psicóticos. Tales métodos permitirán a los clínicos evaluar objetivamente en una cita como de probable es que el empeoramiento de los síntomas de un paciente pueda deberse a la falta de cumplimiento. Alternativamente, si se cumple, un clínico puede considerar una elección de tratamiento distinta. La monitorización de fármacos terapéutica, que se habilita por tales métodos, es clave para identificar las opciones de tratamiento más efectivas. Además, los clínicos creen que tal TDM les ayudará a pasar a una relación muy diferente con sus pacientes, es decir, ir de una discusión hipotética del no cumplimiento del tratamiento hacia una más colaborativa involucrando a los pacientes para que participen activamente en la optimización de sus regímenes de tratamiento.
El desarrollo del método requiere primero la síntesis de varios inmunógenos, que comprende un hapteno sintético ligado a una proteína. Un hapteno es una molécula pequeña que puede inducir una respuesta inmune cuando está unido a un portador grande como una proteína. Son sustancias libres de proteínas, de mayormente bajo peso molecular, que no son capaces de estimular la formación de anticuerpos por sí solos, pero que reaccionan con anticuerpos. Un conjugado hapteno-proteína es capaz de estimular la producción de anticuerpos. La generación de anticuerpos específicos contra moléculas pequeñas es útil para el desarrollo de inmunoensayos (Pharm Res. 1992, 9(11):1375-9, Annali Dell’Istituto Superiore di Sanita. 1991, 27(1):167-74, Annali Dell’Istituto Superiore di Sanita.
1991,27(1):149-54, Immunology Letters.1991,28(1):79-83).
La invención comprende compuestos de Fórmula I
Figure imgf000005_0001
en los que:
R1 es H,
Figure imgf000005_0002
o CH2NHC(O)(CH2)mCO2H;
R3 es H, siempre que dos de R1, R2, R3 sean H, y siempre que además R1, R2 y R3 no sean todos H simultáneamente;
m es 1, 2, 3, 4, ó 5;
n es 1, 2, 3, 4, ó 5.
La invención comprende compuestos de Fórmula I
en los que:
R1 es H,
Figure imgf000006_0001
o CH2NHC(O)(CH2)mCO2H;
R2 es H,
Figure imgf000006_0002
o CH2NHC(O)(CH2)mCO2H;
R3 es H, siempre que o R1 o R2 sean H, y siempre que además ambos de R1 y R2 no sean H simultáneamente;
m es 1,2, 3, 4, ó 5;
n es 1, 2, 3, 4, ó 5.
También se describen en la presente compuestos de Fórmula I:
en la que:
R1 es H, o CH2 NH-(Y)p-G;
R2 es H, o CH2NH-(Y)p-G; siempre que o R1 o R2 sean H, y siempre que además tanto R1 como R2 no sean H simultáneamente;
R3 es H;
en la que:
Y es grupo espaciador orgánico;
G es un grupo de ligamiento funcional capaz de enlazar con un portador;
p es 1.
La invención comprende compuestos de Fórmula I
en la que R1 es H,
Figure imgf000007_0001
H simultáneamente;
R3 es H,
m es 1, 2, 3, 4, ó 5;
n es 1, 2, 3, 4, ó 5.
En otra realización de la invención:
R1 es H, o
Figure imgf000007_0002
R2 es H, o
Figure imgf000007_0003
; siempre que o R1 o R2 sean H, y siempre que además ambos de R1 y R2 no sean H simultáneamente;
R3 es H,
m es 1, 2, 3, 4, ó 5;
n es 1,2, 3, 4, ó 5.
Otra realización de la invención es un compuesto de Fórmula I que es:
Figure imgf000008_0001
La invención proporciona además conjugados de los compuestos anteriores con un portador inmunogénico. Otra realización de la invención es por lo tanto un conjugado de un compuesto de Fórmula I en el que: R1 es H,
Figure imgf000008_0002
, o CH2NHC(O)(CH2)mCO2H;
R2 es H,
Figure imgf000009_0001
o CH2NHC(O)(CH2)mCO2H;
R3 es H, siempre que dos de R1, R2, R3 sean H, y siempre que además R1, R2 y R3 no sean todos H simultáneamente;
m es 1,2, 3, 4, ó 5;
n es 1,2, 3, 4, ó 5; y un portador inmunogénico.
Otra realización de la invención es un conjugado de un compuesto de Fórmula I en el que:
R1 es H,
Figure imgf000009_0002
o CH2NHC(O)(CH2)mCO2H;
R2 es H,
Figure imgf000009_0003
, o CH2NHC(O)(CH2)mCO2H;
R3 es H, siempre que o R1 o R2 sean H, y siempre que además ambos de R1 y R2 no sean H simultáneamente;
m es 1, 2, 3, 4, ó 5;
n es 1,2, 3, 4, ó 5; con un portador inmunogénico.
También se describe en la presente un conjugado de un compuesto de Fórmula I en el que:
R1 es H, o CH2NH-(Y)p-G;
R2 es H, o CH2NH-(Y)p-G; siempre que o R1 o R2 sean H, y siempre que además tanto R1 como R2 no sean H simultáneamente;
R3 es H;
en el que:
Y es grupo espaciador orgánico;
G es un grupo de ligamiento funcional capaz de enlazar con un portador;
p es 1; y un portador inmunogénico.
Otra realización de esta invención es un conjugado de un compuesto de Fórmula I
en el que R1 es H,
Figure imgf000010_0001
, o CH2NHC(O)(CH2)mCO2H;
R2 es H,
Figure imgf000010_0002
, o CH2NHC(O)(CH2)mCO2H; siempre que o R1 o R2 sean H, y siempre que además ambos de R1 y R2 no sean H simultáneamente;
R3 es H,
m es 1, 2, 3, 4, ó 5;
n es 1,2, 3, 4, ó 5; y un portador inmunogénico.
Otra realización de la invención es un conjugado de un compuesto de Fórmula I en el que:
R1 es H, o
Figure imgf000011_0001
R2 es H, o
Figure imgf000011_0002
; siempre que o R1 o R2 sean H, y siempre que además ambos de R1 y R2 no sean H simultáneamente; R3 es H,
m es 1, 2, 3, 4, ó 5;
n es 1,2, 3, 4, ó 5; y un portador inmunogénico.
Otra realización de la invención es un conjugado del compuesto
Figure imgf000011_0003
y un portador inmunogénico.
Una realización preferida de la invención es cualquiera de los conjugados anteriores en los que el portador inmunogénico es una proteína.
Una realización preferida de la invención es cualquiera de los conjugados anteriores, en los que dicha proteína es hemocianina de lapa de ojo de cerradura, ovoalbúmina o tiroglobulina bovina.
Otra realización preferida de la invención es un conjugado de un portador inmunogénico y un compuesto seleccionado del grupo consistente de:
Figure imgf000012_0001
Otra realización de la invención es un conjugado de un compuesto seleccionado del grupo consistente de:
Figure imgf000012_0002
y una proteína.
Una realización más preferida de la invención es un conjugado de una proteína y un compuesto seleccionado del grupo consistente de:
Figure imgf000013_0002
en el que dicha proteína es hemocianina de lapa de ojo de cerradura, ovoalbúmina o tiroglobulina bovina.
La invención también proporciona productos formados del proceso de poner en contacto los compuestos anteriores con un portador inmunogénico.
Otra realización de la invención es por lo tanto un producto hecho por el proceso de poner en contacto un compuesto de Fórmula I
Figure imgf000013_0001
en el que
R1 es H,
Figure imgf000014_0001
, o CH2NHC(O)(CH2)mCO2H;
R3 es H, siempre que dos de R1, R2, R3 sean H, y siempre que además R1, R2 y R3 no sean todos H simultáneamente;
m es 1,2, 3, 4, ó 5;
n es 1,2, 3, 4, ó 5; con un portador inmunogénico.
Otra realización de la invención es un producto hecho por el proceso de poner en contacto un compuesto de Fórmula I en el que:
R1 es H,
Figure imgf000014_0002
, o CH2NHC(O)(CH2)mCO2H;
R2 es H,
Figure imgf000015_0001
, o CH2NHC(O)(CH2)mCO2H;
R3 es H, siempre que o R1 o R2 sean H, y siempre que además ambos de R1 y R2 no sean H simultáneamente;
m es 1,2, 3, 4, ó 5;
n es 1,2, 3, 4, ó 5; con un portador inmunogénico.
También se describe en la presente un producto hecho por el proceso de poner en contacto un compuesto de Fórmula I en el que:
R1 es H, o CH2NH-(Y)p-G;
R2 es H, o CH2NH-(Y)p-G; siempre que o R1 o R2 sean H, y siempre que además tanto R1 como R2 no sean H simultáneamente;
R3 es H;
en el que:
Y es grupo espaciador orgánico;
G es un grupo de ligamiento funcional capaz de enlazar con un portador;
p es 1; con un portador inmunogénico.
Otra realización de la invención es un producto hecho por el proceso de poner en contacto un compuesto de Fórmula I
en el que R1 es H,
Figure imgf000015_0002
, o CH2NHC(O)(CH2)mCO2H;
R2 es H,
Figure imgf000016_0001
, o CH2NHC(O)(CH2)mCO2H; siempre que o R1 o R2 sean H, y siempre que además ambos de R1 y R2 no sean H simultáneamente;
R3 es H,
m es 1, 2, 3, 4, ó 5;
n es 1,2, 3, 4, ó 5; con un portador inmunogénico.
Otra realización de la invención es un producto hecho por el proceso de poner en contacto un compuesto de Fórmula I en el que:
R1 es H, o
Figure imgf000016_0002
R2 es H, o
Figure imgf000016_0003
; siempre que o R1 o R2 sean H, y siempre que además ambos de R1 y R2 no sean H simultáneamente; R3 es H,
m es 1, 2, 3, 4, ó 5;
n es 1,2, 3, 4, ó 5; con un portador inmunogénico.
Una realización preferida de la invención es un producto hecho por el proceso de poner en contacto cualquiera de los compuestos anteriores con un portador inmunogénico en el que el portador inmunogénico es una proteína.
Una realización más preferida de la invención es un producto hecho por el proceso de poner en contacto cualquiera de los compuestos anteriores con un portador inmunogénico en el que el portador inmunogénico es una proteína y en el que dicha proteína es hemocianina de lapa de ojo de cerradura, ovoalbúmina o tiroglobulina bovina.
Otra realización de la invención es un producto hecho por el proceso de poner en contacto un compuesto que es
Figure imgf000017_0001
con un portador inmunogénico.
Otra realización de la invención es un producto hecho por el proceso de poner en contacto un compuesto que es
Figure imgf000017_0002
con una proteína.
Otra realización de la invención es un producto hecho por el proceso de poner en contacto un compuesto que es
Figure imgf000018_0001
con una proteína, en el que dicha proteína es hemocianina de lapa de ojo de cerradura, o tiroglobulina bovina. ABREVIATURAS
En la presente y a lo largo de la solicitud, se pueden usar las siguientes abreviaturas.
AMAS éster de N-(a-maleimidoacetoxi) succinimida
BINAP 2,2’-bis(difenilfosfino)-1,1 ’-binaftilo
Boc o BOC terc-butoxicarbonilo
BTG tiroglobulina bovina
Bu3 N tributilamina
DCC diciclohexilcarbodiimida
DCM diclorometano
DIEA diisopropiletilamina
DMF N,N-dimetilformamida
EDCI o EDC clorhidrato de 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida
EDTA ácido etilenediaminetetraacético
HOBT o HOBt hidrato de 1-hidroxibenzotriazol
KLH hemocianina de lapa de ojo de cerradura
Pd2(dba)3 tris(dibencilideneacetona)dipaladio(0)
SATA N-succinimidil S-acetiltioacetato
TEA o Et3N trietilamina
TF tetrahidrofurano
TFA ácido trifluoroacético
r.t. temperatura ambiente
DEAD dietilazodicarboxilato
DIC diisopropilcarbodiimida
NHS N-hidroxisuccinimida
TFP Tetrafluorofenilo
PNP p-nitrofenilo
TBTU O-(Benzotriazol-1 -il)-N,N,N’,N’- tetrametiluronio tetrafluoroborato
DEPBT 3-(dietoxifosforiloxi)-1,2,3-benzotrazin-4(3H)-ona
BOP-Cl cloruro Bis(2-oxo-3-oxazolidinil)fosfónico
DTT ditioeritritol
DEFINICIONES
El término "conjugados" se refiere a cualquier sustancia formada de la unión de partes separadas. Conjugados representativos de acuerdo con la presente invención incluyen aquellos formados por la unión de una molécula pequeña, como los compuestos de Fórmula I, y una molécula grande, como un portador o un polímero de poliamina, particularmente una proteína. En el conjugado la molécula pequeña puede unirse en uno o más sitios activos en la molécula grande.
El término "hapteno" se refiere a un antígeno parcial o incompleto. Un hapteno es una sustancia libre de proteínas, que no es capaz de estimular la formación de anticuerpos, pero que reacciona con anticuerpos. Los anticuerpos se forman acoplando un hapteno con un portador inmunogénico de alto peso molecular, y después inyectando este producto acoplado, es decir, un inmunógeno en un sujeto humano o animal.
El término "inmunógeno" se refiere a una sustancia capaz de inducir, producir, o generar una respuesta inmune en un organismo.
Un "portador inmunogénico", como se usa en la presente, es una sustancia inmunogénica, comúnmente una proteína, que puede unirse en una o más posiciones con haptenos, permitiendo de este modo la producción de anticuerpos que pueden enlazar específicamente con estos haptenos. Ejemplos de sustancias portadoras inmunogénicas incluyen, pero no están limitadas a, proteínas, glicoproteínas, complejos poliamino-polisacáridos, partículas, y ácidos nucleicos que son reconocidos como extraños y por lo tanto inducen una respuesta inmunológica del huésped. Los poliamino-polisacáridos pueden prepararse a partir de polisacáridos usando cualquiera de los medios convencionales conocidos para esta preparación.
Pueden emplearse varios tipos de proteínas como portadores inmunogénicos, incluyendo sin limitación, albúminas, proteínas séricas, lipoproteínas, etc. Las proteínas ilustrativas incluyen albúmina de suero bovino, hemocianina de lapa de ojo de cerradura, ovoalbúmina de huevo, tiroglobulina bovina, albúmina de suero humano de la fracción V, albúmina de conejo, globulina de semilla de calabaza, toxoide de difteria, toxoide de tétanos, toxina botulínica, proteínas succiniladas, y poli(aminoácidos) sintéticos tales como polilisina.
Los portadores inmunogénicos también pueden incluir poli amino-polisacáridos, que son un polímero de alto peso molecular compuesto por condensaciones repetidas de monosacáridos. Ejemplos de polisacáridos son almidones, glucógeno, celulosa, gomas de carbohidratos como goma arábiga, agar, y demás. El polisacárido también contiene residuos de poli(amino ácidos) y/o residuos de lípidos.
El portador inmunogénico también puede ser un poli(ácido nucleico) ya sea solo o conjugado con uno de los poli(amino ácidos) o polisacáridos anteriormente mencionados.
El portador inmunogénico también puede incluir partículas sólidas. Las partículas son generalmente de al menos aproximadamente 0,02 micras (gm) y de no más de aproximadamente 100 gm, y habitualmente de aproximadamente 0,05 gm a 10 gm de diámetro. La partícula puede ser orgánica o inorgánica, hinchable o no hinchable, porosa o no porosa, óptimamente de una densidad próxima al agua, generalmente de alrededor de 0,7 a 1,5 g/ml., y compuesta de material que puede ser trasparente, parcialmente trasparente u opaco. Las partículas pueden ser materiales biológicos como células y microorganismos, incluyendo ejemplos no limitativos como eritrocitos, leucocitos, linfocitos, hibridomas, Streptococcus, Staphylococcus aureus, E. coli y virus. Las partículas también pueden estar compuestas de polímeros orgánicos e inorgánicos, liposomas, látex, vesículas fosfolípidas, o lipoproteínas.
El término "derivado" se refiere a un compuesto químico o molécula hecha a partir de un compuesto padre por una o más reacciones químicas.
El término "análogo" de un compuesto químico se refiere a un compuesto químico que contiene una cadena de átomos de carbono y los mismos grupos funcionales particulares que un compuesto de referencia, pero la cadena de carbonos del análogo es más larga o más corta que la del compuesto de referencia.
Un "marcador", "moléculas detectoras", o "indicador" es cualquier molécula que produce, o puede ser inducida para producir, una señal detectable. El marcador conjugado con un analito, inmunógeno, anticuerpo, o con otra molécula como un receptor o molécula que puede enlazar con un receptor como un ligando, particularmente un hapteno o anticuerpo. Ejemplos no limitativos de marcadores incluyen isótopos radioactivos (por ejemplo 1251), enzimas (por ejemplo, p-galactosidasa, peroxidasa), fragmentos de enzimas, sustratos de enzimas, inhibidores de enzimas, coenzimas, catalizadores, fluoróforos (por ejemplo, rodamina, isotiocianato de fluoresceína o FITC, o Dylight 649), colorantes, quimioluminiscentes y luminiscentes (por ejemplo, dioxetanos, luciferina) o sensibilizantes.
Como se usa en la presente, un "espaciador" se refiere a una porción de una estructura química que conecta dos o más subestructuras como haptenos, portadores, inmunógenos, marcadores o colaboradores de enlace a través de un grupo de ligamiento funcional. Estos grupos espaciadores están compuestos de átomos típicamente presentes y ensamblados de maneras encontradas típicamente en compuestos orgánicos y así pueden ser referidos como "grupos espaciadores orgánicos". Los bloques de construcción química usados para ensamblar los espaciadores se describirán en lo sucesivo en esta solicitud. Entre los espaciadores preferidos están las cadenas de carbono lineales o ramificadas, saturadas o no saturadas. Estas cadenas de carbono pueden incluir también uno o más heteroátomos dentro de la cadena, uno o más heteroátomos reemplazando uno o más hidrógenos de cualquier átomo de carbono en la cadena, o en el extremo de las cadenas. Por "heteroátomos" se entiende átomos distintos del carbono que se eligen del grupo consistente de oxígeno, nitrógeno, fósforo y azufre, en donde los átomos de nitrógeno, fósforo y azufre pueden existir en un estado de oxidación y pueden tener carbono u otros heteroátomos unidos a ellos. El espaciador puede incluir también grupos cíclicos o aromáticos como parte de la cadena o como una sustitución en uno de los átomos en la cadena.
El número de átomos en el grupo espaciador se determina contando los átomos distintos de hidrógeno. El número de átomos en una cadena dentro de un grupo espaciador se determina contando el número de átomos distintos de hidrógeno a lo largo de la ruta más corta entre las subestructuras que se están conectando. Las longitudes de cadena preferida son entre 1 y 20 átomos.
Un "grupo de ligamiento funcional" se refiere a un grupo reactivo que está presente en un hapteno y puede usarse para proporcionar un sitio reactivo disponible a través del cual la parte de hapteno puede acoplarse con otra fracción a través de la formación de un enlace químico covalente para producir un conjugado de un hapteno con otra fracción (como un marcador o portador). El hapteno puede ligarse de este modo con una fracción como biotina para formar un compañero de enlace competitivo para el hapteno.
Los grupos espaciadores pueden usarse para ligar el hapteno con el portador. Los espaciadores de longitudes diferentes permiten que uno se una al hapteno con diferentes distancias del portador para la presentación al sistema inmune del animal o humano que se está humanizando para la optimización del proceso de formación de anticuerpos. La unión en diferentes posiciones en la molécula de hapteno permite la oportunidad de presentar sitios específicos en el hapteno al sistema inmune para influir en el reconocimiento de anticuerpos. El espaciador puede contener grupos solubilizantes hidrófilos para hacer el derivado de hapteno más soluble en medio acuoso. Ejemplos de grupos solubilizantes hidrófilos incluyen pero no están limitados a grupos polioxialquiloxilo, por ejemplo, cadenas de polietilenglicol; hidroxilo; carboxilato y grupos sulfonato.
El término "grupo nucleófilo" o "nucleófilo" se refiere a una especie que dona un par de electrones para formar un enlace químico en una reacción. El término "grupo electrófilo" o "electrófilo" se refiere a una especie que acepta un par de electrones de un nucleófilo para formar un enlace químico en una reacción.
El término "sustituido" se refiere a la sustitución de un átomo o grupo de átomos en lugar de un átomo de hidrógeno en un átomo de carbono en cualquier posición en la molécula padre. Ejemplos no limitativos de sustituyentes incluyen átomos de grupos halógeno, amino, hidroxi, carboxi, alquilo, arilo, heteroalquilo, heteroarilo, ciano, alcoxi, nitro, aldehído y cetona.
El término "alquilo" se refiere a tanto radicales de cadena lineal como ramificada de hasta 12 átomos de carbono, a menos que se indique lo contrario, y se pretende específicamente que incluya radicales que tiene cualquier grado o nivel de saturación. Alquilo incluye, pero no está limitado a metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo, isobutilo, sec-butilo, terc-butilo, pentilo, isopentilo, hexilo, isohexilo, heptilo, octilo, 2,2,4-trimetilpentilo, nonilo, decilo, undecilo y dodecilo.
El término "cicloalquilo" se refiere a un radical de anillo de hidrocarburo saturado o parcialmente insaturado monocíclico o bicíclico compuesto de 3 a 10 átomos de carbono. Los sustituyentes de alquilo pueden estar opcionalmente presentes en el anillo. Ejemplos incluyen ciclopropilo, 1, 1 -dimetil ciclobutilo, 1,2,3-trimetilciclopentilo, ciclohexilo y ciclohexenilo.
El término "heteroátomo" se refiere a un átomo de nitrógeno, un átomo de oxígeno, un átomo de fósforo o un átomo de azufre en el que los átomos de nitrógeno, fósforo y azufre pueden existir en cualquier estado de oxidación permitido.
El término "heteroalquilo" se refiere a un grupo alquilo que incluye uno o más heteroátomos dentro de la cadena, uno o más heteroátomos que reemplazan uno o más hidrógenos de cualquier átomo de carbono en la cadena, o en el extremo de las cadenas.
El término "heterociclilo" se refiere a un anillo no aromático (es decir saturado o parcialmente insaturado) compuesto de 3 a 7 átomos de carbono y al menos un heteroátomo seleccionado de N, O, o S. Los sustituyentes de alquilo pueden estar opcionalmente presentes en el anillo. Ejemplos incluyen tetrahidrofurilo, dihidropiranilo, piperidilo, 2,5-dimetipiperidilo, morfolinilo, piperazinilo, tiomorfolinilo, pirrolidinilo, pirrolinilo, pirazolidinilo, pirazolinilo, imidazolidinilo e imidazolinilo.
El término "hidroxialquilo" se refiere a al menos un grupo hidroxilo enlazado con cualquier átomo de carbono a lo largo de una cadena de alquilo.
El término "aminoalquilo" se refiere a al menos un grupo amino primario o secundario enlazado con cualquier átomo de carbono a lo largo de una cadena de alquilo.
El término "alcoxialquilo" se refiere a al menos un grupo alcoxi enlazado a cualquier átomo de carbono a lo largo de una cadena de alquilo.
El término "polialcoxialquilo" se refiere a compuestos alcoxi de cadena larga e incluye polietilenglicoles de tamaños discretos o monodispersos.
El término "tioalquilo" se refiere a al menos un grupo de azufre enlazado con cualquier átomo de carbono a lo largo de una cadena de alquilo. El grupo de azufre puede estar en cualquier estado de oxidación e incluye sulfóxidos, sulfonas y sulfatos.
El término "carboxialquilo" se refiere a al menos un grupo carboxilato enlazado con cualquier átomo de carbono a lo largo de una cadena de alquilo. el término "grupo carboxilato" incluye ácidos carboxílicos y ésteres de alquilo, cicloalquilo, arilo o aralquilo carboxilato.
El término "alquilcarbonilo" se refiere a un grupo que tiene un grupo carbonilo enlazado a cualquier átomo de carbono a lo largo de una cadena de alquilo. El término "heteroarilo" se refiere a radicales de anillo aromático de 5- a 7- miembros mono- o de 8- a 10- miembros bicíclico, cualquier anillo de los cuales consiste de uno a cuatro heteroátomos seleccionados de N, O o S donde los átomos de nitrógeno o azufre pueden existir en cualquier estado de oxidación permitido. Ejemplos incluyen bencimidazolilo, benzotiazolilo, benzotienilo, benzoxazolilo, furilo, imidazolilo, isotiazolilo, isoxazolilo, oxazolilo, pirazinilo, pirazolilo, piridilo, pirimidinilo, pirrolilo, quinolinilo, tiazolilo y tienilo.
El término "heteroaralquilo" se refiere a un grupo alquilo C1-6 que tiene un sustituyente de heteroarilo. Ejemplos incluyen furiletilo y 2-quinolinolpropilo.
El término "alcoxi" se refiere a radicales de cadena lineal o ramificada de hasta 12 átomos de carbono, a menos que se indique lo contrario, enlazados a un átomo de oxígeno. ejemplos incluyen metoxi, metoxi, propoxi, isopropoxi y butoxi.
El término "arilo" se refiere a radicales de anillo aromático monocíclico o bicíclico que contienen de 6 a 12 carbonos en el anillo. Los sustituyentes de alquilo pueden estar opcionalmente presentes en el anillo. Ejemplos incluyen fenilo, bifenilo y naftaleno.
El término "aralquilo" se refiere a un grupo alquilo C1-6 que contiene un sustituyente de arilo. Ejemplos incluyen bencilo, feniletilo o 2-naftilmetilo.
El término "heteroaralquilo" se refiere a un grupo alquilo C1-6 que contiene un sustituyente de heteroarilo. Ejemplos incluyen furilmetilo y piridilpropilo.
El término "ariloxi" se refiere a un átomo de oxígeno enlazado a un sustituyente de arilo . Ejemplos incluyen fenoxi y benciloxi.
El término "arilalcoxi" se refiere a un grupo alcoxi enlazado con un sustituyente de arilo . Ejemplos incluyen éter de fenilmetilo.
El término "acilo" se refiere al grupo -C(O)Ra , donde Ra es alquilo, arilo, aralquilo, heteroarilo y heteroaralquilo. Un "agente acilante" añade el grupo -C(O)Ra a una molécula.
El término "sulfonilo" se refiere al grupo -S(O)2 Ra , donde Ra es hidrógeno, alquilo, cicloalquilo, haloalquilo, arilo, aralquilo, heteroarilo y heteroaralquilo. Un "agente sulfonilante" añade el grupo -S(O)2 Ra a una molécula.
Los espaciadores que llevan grupos de ligamiento funcional reactivos para la unión de haptenos con moléculas portadoras pueden prepararse por una amplia variedad de métodos. El espaciador puede formarse usando una molécula que es funcionalizada o activada diferencialmente con grupos en cualquier extremo para permitir la reacción secuencial selectiva con el hapteno y el portador, pero puede usarse la misma fracción reactiva en ambos extremos. Los grupos seleccionados para la reacción con el hapteno y el grupo de ligamiento funcional a ser unido con el portador se determinan por el tipo de funcionalidad en el hapteno y el portador con el que se va a unir el hapteno. Los espaciadores y métodos de unión de haptenos y portadores incluyen pero no están limitados a los descritos por Brinkley, M., A., Bioconjugate Chem. 1992, 3:2-13, Hermanson, Greg T., Bioconjugate Techniques,. Academic Press, London, Amsterdam, Burlington, MA, USA, 2008 y Thermo Scientific Pierce Crosslinking Technical Handbook; disponible para descarga o solicitud de copia impresa de Thermo Scientific 3747 N Meridian Rd, Rockford, IL USA 61101, ph 800-874-3723 o en: http://www.piercenet.com/ y referencias en los mismos. Muchas moléculas diferencialmente activadas para la formación de grupos espaciadores están comercialmente disponibles de vendedores, por ejemplo Thermo Scientific.
Para haptenos que llevan un grupo amino, los modos de unión del espaciador al hapteno incluyen reacción de la amino en el hapteno con un bloque de construcción del espaciador que lleva un haluro de acilo o éster activo. "Ésteres activos" se definen como ésteres que se han sometido a reacción con grupo nucleófilo, por ejemplo un grupo amino, bajo condiciones suaves para formar un ligamiento estable. Un ligamiento estable se define como uno que permanece intacto bajo condiciones de uso adicional, por ejemplo pasos sintéticos posteriores, uso como un inmunógeno, o en ensayo bioquímico. Un ejemplo preferido de un ligamiento estable es un enlace amida. Los ésteres activos y métodos de formación se describen por Benoiton, N.L., in Houben-Weyl, Methods of Organic Chemistry, Thieme Stuttgart, New York, vol E22 sección 3.2:443 y Benoiton, N.L., Chemistry of Peptide Synthesis, Taylor and Francis, NY, 2006. Los ésteres activos preferidos incluyen éster de p-nitrofenilo (PNP), éster de N-hidroxisuccinimida (NHS) y éster de tetrafluorofenilo (TFP). Los haluros de acilo pueden prepararse por muchos métodos conocidos por el experto en la técnica por ejemplo, reacción del ácido carboxílico con cloruro de tionilo o cloruro de oxalilo, ver: Fieser, L.F. y Fieser, M. Reagents for Organic Synthesis, John Wiley and Sons, NY, 1967 y referencias en el mismo. Estos pueden convertirse a otros ésteres activos como ésteres de p-nitrofenilo (PNP) que también puede usarse en espaciadores bi-funcionales activos como se describe por Wu et.al, Organic Letters, 2004 ,6 (24):4407. Los ésteres de N-hidroxisuccinimida (NHS) pueden prepararse por la reacción de carbonato de N.N-disuccinimidilo (CAS 74124-79-1) con el ácido carboxílico de un compuesto en presencia de una base orgánica como trietilamina o diisopropiletilamina en solvente aprótico bajo condiciones anhidras como se describe en el Ejemplo 35 de la WO2012012595 o usando N-hidroxisuccinimida y diciclohexilcarbodiimida (DCC) u otro agente deshidratante, bajo condiciones anhidras. Los ésteres de tetrafluorofenilo (TFP) pueden prepararse por la reacción de ácidos carboxílicos con 2,3,5,6-tetrafluorofeniltrifluoroacetato en presencia de una base orgánica como trietilamina o diisopropiletilamina en un solvente aprótico bajo condiciones anhidras como se informa por Wilbur, et.al, Bioconjugate Chem., 2004,15(1):203.
Un experto en la técnica reconocerá que los espaciadores mostrados en la Tabla 1, entre otros, pueden obtenerse usando métodos conocidos y unirse a haptenos que llevan amino utilizando optimización rutinaria de condiciones de reacción, Estos espaciadores permiten la unión del hapteno a un grupo tiol en un portador.
Figure imgf000023_0001
También puede usarse como un modo de unión el acoplamiento directo de la amina en el hapteno y una funcionalidad del ácido carboxílico en el bloque de construcción del espaciador en presencia de un agente de acoplamiento. Los reactivos preferidos son los usados típicamente en la síntesis de péptidos. Los reactivos de acoplamiento de péptidos incluyen pero no están limitados a O-(Benzotriazol-1-il)-N,N,N’,N’-tetrametiluronio tetrafluoroborato (TBTU, CAS #125700-67-6), ver: Pruhs, S., Org. Process. Res. Dev. 2006, 10:441; N-Hidroxibenzotriazol (HOBT, CAS #2592-95-2) con un agente deshidratante de cabodiimida, por ejemplo N-N-diciclohexilcarbodiimida (DCC), diisopropilcarbodiimida (DIC), o clorhidrato de 1 -etil-3 (3-dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC), ver: Konig W., Geiger, R. Chem. Ber., 1970, 103 (3):788; 3-(dietoxifosforiloxi)-1,2,3-benzotrazin-4(3H)-ona (dEpBT, CAS#165534-43-0), ver: Liu, H. et.al., Chinese Chemical Letters, 2002, 13(7):601; cloruro bis (2-oxo-3-oxazolidinil)fosfónico; (BOP-Cl, Cas# 68641-49-6), ver: Diago-Meseguer, J et.al. Synthesis, 1980, 7:547-51 y otros descritos con detalle por Benoiton en Chemistry of Peptide Synthesis, CRC Press, Boca Raton, FL, 2005, Capítulo 2, y el boletín técnico proporcionado por Advanced Automated Peptide Protein Technologies (aapptec), 6309 Shepardsville Rd., Louisville KY 40228, ph 888 692 9111; www.aapptec.com. y las referencias citadas en el mismo. Estos métodos crean un ligamiento de amida estable uniendo el hapteno con el espaciador. Ejemplos de espaciadores que pueden obtenerse usando métodos conocidos y unidos a haptenos que llevan amino utilizando optimización rutinaria de condiciones de reacción empleando los métodos descritos y citados anteriormente se muestran, pero no están limitados a, los mostrados en la Tabla 2. Estos espaciadores permiten la unión del hapteno a un grupo tiol en un portador.
Tabla 2
Figure imgf000024_0002
Los espaciadores también pueden construirse de una manera escalonada por la unión secuencial de los grupos químicos apropiados al hapteno incluyendo el paso de formar el grupo de ligamiento funcional que es capaz de enlazar con el portador. Ver los ejemplos ilustrativos bajo los Esquemas de Reacción Generales.
Adicionalmente, cuando el hapteno tiene un grupo nucleófilo, por ejemplo un grupo tiol, un grupo amino o un grupo hidroxilo que se volverá el punto de unión del espaciador, el espaciador puede construirse también por alquilación del grupo tiol, amina o hidroxilo. Puede usarse cualquier grupo alquilo que esté apropiadamente sustituido con una fracción capaz de someterse a una reacción de sustitución, por ejemplo, un haluro de alquilo, o éster de ácido sulfónico como el p-Toluenosulfonato, para unir el espaciador. Son conocidos por los expertos en la técnica muchos ejemplos de reacciones de alquilación y se pueden encontrar ejemplos específicos en la bibliografía química general y optimizarse a través de la experimentación rutinaria. Un debate de reacciones de alquilación con muchas referencias puede encontrarse en el Capítulo 10 de la March’s Advanced Organic Chemistry, Smith, M.B., and March, J., John Wiley & sons, Inc. NY, 2001. Pueden emplearse también otros ligamientos como la reacción de la fracción nucleófila, por ejemplo una amina, en el hapteno con un isocianato para formar una urea o reacción con un isotiocianato para formar un ligamiento de tiourea, ver: Li, Z., et.al., Phosphorus, Sulfur and Silicon and the Related Elements, 2003, 178(2):293-297. Los espaciadores pueden unirse a haptenos que llevan grupos hidroxilo a través de la reacción con grupos isocianato para formar ligamientos de carbamato o uretano. El espaciador puede activarse diferencialmente con el grupo funcional de isocianato en un extremo y un grupo de ligamiento funcional capaz de reaccionar con el portador, ver: Annunziato, M.E., Patel, U.S., Ranade, M. y Palumbo, P.S., Bioconjugate Chem., 1993, 4:212-218.
Para haptenos que llevan un grupo de ácido carboxílico, los modos de unión de una parte del espaciador con el hapteno incluyen la activación del grupo de ácido carboxílico como un haluro de acilo o éster activo, ejemplos de los cuales se muestran en la Tabla 3, la preparación de los cuales se ha descrito anteriormente, seguido por la reacción con un grupo amino (-NH2-), hidrazino (-NH-NH2-), hidrazido (-C(O)-NH-NH2-) o hidroxilo (-OH) en la parte del espaciador para formar un ligamiento de amida, hidrazida, diacilhidrazina o éster, o el acoplamiento directo del grupo de ácido carboxílico con un grupo amino en la parte del espaciador o directamente en el portador con un reactivo de acoplamiento de péptidos y/o agente deshidratante de carbodimida, descritos anteriormente, ejemplos de los cuales se muestran en las Tablas 4 y 5. Los procedimientos encontrados en las referencias citadas anteriormente para la formación de ésteres activados y el uso de agentes de acoplamiento de péptidos pueden emplearse para la unión de haptenos que llevan ácido carboxílico con bloques de construcción de espaciadores y portadores de proteínas con grupos amino disponibles utilizando optimización rutinaria de las condiciones de reacción.
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Tabla 4
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Tabla 5
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Otros grupos electrófilos pueden estar presentes en el hapteno para unir el espaciador, por ejemplo, un haluro de sulfonilo
O
i ií i~s II~c\
o
o grupo de fósforo electrófilo, por ejemplo:
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Ver: Malachowski, William P., Coward, James K., Journal of Organic Chemistry, 1994, 59 (25):7616
o:
. O
i~ -p -ORc
ÓRC
Rc es alquilo, cicloalquilo, arilo, arilo sustituido, aralquilo.
Ver: Aliouane, L., et.al, Tetrahedron Letters, 2011,52(28) :8681.
Los haptenos que llevan grupos aldehído o cetona pueden unirse a espaciadores usando métodos que incluyen pero no están limitados a reacción con un grupo hidrazida H2N-NH-C(O)- en el espaciador para formar una acilhidrazona, ver: Chamow, S.M., Kogan, T.P., Peers, D.H., Hastings, R.C., Byrn, R.A. y Askenaszi, A., J. Biol. Chem., 1992, 267(22): 15916. Ejemplos de grupos espaciadores hidrazida bifuncionales que permiten la unión a un grupo tiol en el portador se muestran en la Tabla 6.
Tabla 6
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Los haptenos pueden contener también grupos tiol que pueden reaccionarse con el portador siempre que el portador se haya modificado para proporcionar un grupo que pueda reaccionar con el tiol. Los grupos portadores pueden modificarse por métodos que incluyen pero no están limitados a la unión de un grupo que contiene un grupo funcional de maleimida por la reacción de un grupo amino en el portador con N-succinimidil maleimidoacetato, (AMAS, CAS# 55750-61 -3), Succinimidil yodoacetato (CAS # 151199-81 -4), o cualquiera de los grupos espaciadores bifuncionales mostrados en la Tabla 1 para introducir un grupo que pueda someterse a reacción resultando en la unión del hapteno con el portador.
El grupo de ligamiento funcional capaz de formar un enlace con el portador puede ser cualquier grupo capaz de formar un ligamiento estable y puede ser reactivo a una variedad de grupos diferentes en el portador. El grupo de ligamiento funcional puede reaccionar preferiblemente con un grupo amino, un grupo de ácido carboxílico o un grupo tiol en el portador, o derivado de los mismos. Ejemplos no limitativos del grupo de ligamiento funcional son un grupo de ácido carboxílico, haluro de acrilo, éster activo (como se ha definido anteriormente), isocianato, isotiocianato, haluro de alquilo, grupo amino, grupo tiol, grupo maleimida, grupo acrilato (H2C=CHC(O)-) o grupo vinil sulfona H2C=CH-SO2-) Ver: Park, J.W., et.al., Bioconjugate Chem., 2012, 23(3): 350. El grupo de ligamiento funcional puede estar presente como parte de un bloque de construcción del espaciador diferencialmente activado que puede reaccionarse por pasos con el hapteno y el derivado de hapteno resultante puede reaccionarse después con el portador. Alternativamente, el hapteno puede derivatizarse con un espaciador que lleve un grupo precursor que puede transformarse en el grupo de ligamiento funcional por una reacción posterior. Cuando el grupo de ligamiento funcional en el espaciador es un grupo amina o de ácido carboxílico, la reacción de acoplamiento con el grupo de ácido carboxílico o amina en el portador puede llevarse a cabo directamente a través del uso de reactivos de acoplamiento de péptido de acuerdo con los procedimientos en las referencias citadas anteriormente para estos reactivos.
Pueden usarse grupos disulfuro particulares, por ejemplo, piridildisulfuros, como el grupo de ligamiento funcional en el espaciador que puede someterse a intercambio con un grupo tiol en el portador para formar un ligamiento de disulfuro mixto, ver: Ghetie, V.,v et al., Bioconjugate Chem., 1990, 1:24-31. Estos espaciadores pueden unirse por reacción del hapteno que lleva amina con un éster activo que se une a un espaciador que lleva el grupo piridildisulfuro, ejemplos de los cuales incluyen pero no están limitados a los mostrados en la Tabla 7.
Tabla 7
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Más a menudo el portador es una proteína y los grupos £-amino de los residuos de lisina pueden usarse para la unión, ya sea directamente por reacción con un grupo de ligamiento funcional amino-reactivo o tras derivatización con un grupo que contiene tiol, incluyendo N-Succinimidil S-Acetiltioacetato, (SATA, CAS 76931-93-6), o un análogo del mismo, seguido por la escisión del grupo acetato con hidroxilamina para exponer el grupo tiol para la reacción con el grupo de ligamiento funcional en el hapteno. Los grupos tiol también pueden introducirse en el portador por la reducción de los enlaces de disulfuro dentro de los portadores de proteínas con reactivos reductores suaves incluyendo pero no limitado a 2-mercaptoetilamina, ver: Bilah, M., et.al., Bioelectrochemistry, 2010, 80(1):49, reactivos de fosfina, ver: Kirley, T.L., Analytical Biochemistry, 1989, 180(2):231 o ditioeritritol (DTT, CAS 3483-12-3) Cleland, W., Biochemistry, 1964, 3:480-482.
ESQUEMAS DE REACCION GENERALES
Los compuestos representativos de la presente invención pueden sintetizarse de acuerdo con los métodos sintéticos generales descritos a continuación. Los compuestos de Fórmula (I) pueden prepararse por métodos conocidos por los expertos en la técnica. Los siguientes esquemas de reacción se pretende que representen ejemplos de la invención y no se pretende de ninguna manera que limiten la invención.
Pueden prepararse derivados de quetiapina por una variedad de métodos. El grupo hidroxilo primario en la quetiapina, el compuesto de partida (R1 y R2 = H) mostrado en el Esquema 1, puede acilarse usando, por ejemplo anhídrido succínico y el método descrito por Fiedler, H., et.al., Langmuir, 1994, 10:3959. El ácido resultante puede funcionalizarse adicionalmente como se describe en otro lugar en esta divulgación o unirse directamente a un portador usando cualquier número de los métodos anteriormente mencionados incluyendo los mostrados en los ejemplos posteriores.
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El grupo hidroxilo primario de quetiapina también puede alquilarse para formar un éter de acuerdo con el procedimiento de la US20100069356, como se muestra en el esquema 2, usando un haluro de alquilo o un éster de sulfonato, como 4-bromometilpentanoato en presencia de hidrógenosulfato de tetrabutilamonio e hidróxido de sodio acuoso para proporcionar un ácido que puede usarse como se describe anteriormente.
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Los compuestos de Fórmula I en los que R2 es CH2NHC(O)(CH2)mCO2H pueden hacerse de acuerdo con el Esquema 3. La reacción de 2-(2-(2-(aminometil)-4-(dibenzo[b,f][1,4]tiazepin-11-il)piperazin-1-il)etoxi)etanol, preparado como se describe en el Ejemplo 1, procede con un compuesto anhídrido cíclico, como anhídrido succínico o anhídrido glutárico, en un solvente como piridina, a temperaturas que varían de temperatura ambiente a 60° C, durante aproximadamente 48 horas. Los expertos en la técnica reconocerán que se puede usar la misma química para crear compuestos de Fórmula I en los que R1 es CH2NHC(O)(CH2)mCO2H.
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pueden hacerse de acuerdo con el Esquema 4. Los compuestos de Fórmula I, en los que R2 es CH2NHC(O)(CH2)mCO2H, preparados de acuerdo como se describe en el esquema 1, se tratan con N-t-butoxicarbonilpiperazina, dietilcianofosfonato, y una base, como diidopropiletilamina. La reacción se lleva a cabo en un solvente, como diclorometano, durante aproximadamente 2 horas a temperatura ambiente. La desprotección del grupo piperazinilo se logra con anhídrido trifluoroacético como se describe en el Esquema 4, seguido por la reacción con un anhídrido apropiado, como anhídrido succínico o anhídrido maleico, en presencia de una base adecuada como diisopropiletilamina. Los expertos en la técnica reconocerán que puede usarse la misma química para crear compuestos de Fórmula I en los que R1 es
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Los compuestos de Fórmula I en los que R1 es
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pueden hacerse de acuerdo con el Esquema 5. La maleimida puede introducirse por cualquier método conocido en la técnica. Los grupos funcionales de maleimida como 2,5-dioxopirrolidin-1-ilo 2- (2,5-dioxo-2,5-dihidro-1 H-pirrol-1 -il) acetato en los que m es 1, pueden usarse en un solvente como DMF o CH2CL, y una base, como tributilamina o trietilamina. Alternativamente, el grupo piperazinilo desprotegido descrito en el Esquema 4 puede elaborarse con una funcionalidad de maleimida, como se describe en el Esquema 5 para dar compuestos de Fórmula I en los que R1 es
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Los expertos en la técnica reconocerán que puede usarse la misma química para crear compuestos de Fórmula I en los que R2 es
Esquema 6
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Los haptenos funcionalizados con maleimida en los que R1 o R2 es
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pueden conjugarse con proteínas de acuerdo al método mostrado en el Esquema 6. La activación de los residuos de lisina de proteínas por la acilación del épsilon-nitrógeno con N-succinimidil S-acetiltioacetato (SATA), seguido poa la hidrólisis posterior del grupo S-acetilo con hidroxilamina produce un grupo sulfidrilo nucleófilo. La conjugación de la proteína activada por sulfidrilo con el hapteno derivatizado de maleimida (preparado como se describe en el esquema general 3) procede a través de una reacción de activación de Michael. Las proteínas adecuadas son conocidas por los expertos en la técnica e incluyen hemocianina de lapa de ojo de cerradura, tiroglobulina bovina y ovoalbúmina. Puede usarse la misma metodología para conjugar proteínas con haptenos funcionalizados con maleimida en los que R1 o R2 es
Esquema 7:
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Los haptenos funcionalizados con ácido carboxílico, en los que R1 o R2 es CH2NHC(O)(CH2)mCO2H, pueden conjugarse con proteínas de acuerdo con el método mostrado en el Esquema 7. La reacción con N-hidroxisuccinimida y un agente de acoplamiento adecuado, como diciclohexilcarbodiimida, y una base, como tributil amina, en un solvente como DMF, a una temperatura de aproximadamente 20° C, durante aproximadamente 18 horas activa el ácido carboxílico con el grupo saliente hidroxipirrolidina-2,5-diona. El conector activado y el hapteno pueden entonces conjugarse con una proteína en un solvente, como un tampón de fosfato de pH 7.5, a aproximadamente 20° C, durante aproximadamente 2,5 horas. Las proteínas adecuadas con conocidas por los expertos en la técnica e incluyen hemocianina de lapa de ojo de cerradura, tiroglobulina bovina y ovoalbúmina. Puede usarse la misma metodología para conjugar proteínas con haptenos funcionalizados con ácido carboxílico en los que R1 o R2 es
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PRODUCCION DE ANTICUERPOS
Los conjugados anteriores son útiles para la producción de anticuerpos que enlazan con el fármaco antipsicótico para el que se han generado (quetiapina). Estos anticuerpos pueden usarse en ensayos para detectar la presencia y/o cantidad del fármaco anti-psicótico en las muestras del paciente. Dicha detección permite la monitorización de fármacos terapéutica habilitando todos los beneficios de la misma. La detección de niveles de fármacos anti-psicóticos puede ser útil para muchos propósitos, incluyendo: detección en combinación con la detección de otros fármacos anti-psicóticos, incluyendo los seleccionados del grupo consistente de risperidona, paliperidona, aripiprazol, olanzapina y metabolitos de los mismos, dicha detección permitiendo la medición simultánea de estos fármacos anti-psicóticos; la determinación de la adherencia o cumplimiento del paciente con la terapia prescrita; uso como una herramienta de decisión para determinar si un paciente debería pasarse de un régimen anti-psicótico oral a un régimen anti-psicótico inyectable de larga duración; uso como una herramienta de decisión para determinar si el nivel de dosis o intervalo de dosificación de los anti-psicóticos orales o inyectables debería aumentarse o disminuirse para asegurar la consecución o el mantenimiento de los niveles de fármacos eficaces o seguros; uso como una ayuda en el inicio de la terapia de fármacos anti-psicóticos proporcionando evidencias de la consecución de los niveles mínimos de pK; uso para determinar la bioequivalencia del fármaco antipsicótico en formulaciones múltiples o de múltiples fuentes; uso para evaluar el impacto de polifarmacía y interacciones fármaco-fármaco potenciales; y uso como una indicación de que el paciente debería excluirse o incluirse en una prueba clínica y como una ayuda en la posterior monitorización de la adherencia a los requisitos de medicación de la prueba clínica.
Habiendo proporcionado los conjugados de la presente invención, que comprenden los compuestos de la presente y un portador inmunogénico, pueden generarse los anticuerpos, por ejemplo anticuerpos policlonales, monoclonales, quiméricos y humanizados, que enlazan con el fármaco anti-psicótico. Tales anticuerpos que se contemplan particularmente incluyen anticuerpos monoclonales y policlonales así como fragmentos de los mismos, por ejemplo, proteínas recombinantes, que contienen el dominio de enlace con el antígeno y/o una o más regiones determinantes de la complementariedad de estos anticuerpos. Preferiblemente, el anticuerpo enlazará con el fármaco y cualquier metabolito farmacológicamente activo deseado. Alterando la localización de la unión de un portador inmunogénico en un conjugado de fármacos, puede diseñarse en los anticuerpos la selectividad y reactividad cruzada con metabolitos y/o fármacos relacionados. Para la quetiapina, la reactividad cruzada con los metabolitos de quetiapina como N-desalquilquetiapina (norquetiapina), sulfóxido de quetiapina, O-desalquilquetiapina o 7-hidroxi quetiapina puede ser deseable o no. Pueden generarse anticuerpos que detectan múltiples de estos fármacos y/o metabolitos, o se pueden generar anticuerpos que detectan cada uno separadamente (definiendo por lo tanto las propiedades de "enlace específico" del anticuerpo. Un anticuerpo enlaza específicamente con uno o más compuestos cuando su enlace con el uno o más compuestos es equimolar o sustancialmente equimolar.
Los métodos para producir dichos anticuerpos comprenden inocular un huésped con el conjugado (el compuesto y el portador inmunogénico siendo un inmunógeno) incorporando características de la presente invención. Los huéspedes adecuados incluyen, pero no están limitados a, ratones, ratas, hámsteres, cobayas, conejos, pollos, burros, caballos, monos, chimpancés, orangutanes, gorilas, humanos, y cualquier especie capaz de montar una respuesta inmune madura. Los procedimientos de inmunización están bien establecidos en la técnica y se exponen en numerosos tratados y publicaciones incluyendo "The Immunoassay Handbook",2a Edición, editada por David Wild (Nature Publishing Group, 2000) y las referencias citadas en el mismo.
Preferiblemente, una característica que incorpora inmunógenos de la presente invención se administra a un sujeto huésped, por ejemplo un animal o humano, en combinación con un adyuvante. Los adyuvantes adecuados incluyen, pero no están limitados a, adyuvante de Freund, hidróxido de aluminio en polvo (alumbre), hidróxido de aluminio junto con Bórdetela pertussis, y monofosforil lípido A-sintético trehalosa dicorinomicolato (MPL-TDM).
Los anticuerpos policlonales pueden promoverse en un huésped mamífero por una o más inyecciones de un inmunógeno que puede administrarse opcionalmente junto con un adyuvante. Típicamente, un inmunógeno o una combinación de un inmunógeno y un adyuvante se inyecta en un huésped mamífero por una o múltiples inyecciones subcutáneas o intraperitoneales. Preferiblemente, el programa de inmunización se lleva a cabo durante al menos una semana, y más preferiblemente, durante dos o más semanas. Los anticuerpos policlonales producidos de esta manera pueden aislarse y purificarse utilizando métodos bien conocidos en la técnica.
Los anticuerpos monoclonales pueden producirse por los métodos de hibridomas bien establecidos de Kohler y Milstein, por ejemplo, Nature 256:495-497 (1975). Los métodos de hibridomas implican típicamente inmunizar un huésped o linfocitos de un huésped, recolectar el anticuerpo monoclonal que secreta o tiene el potencial de secretar linfocitos, fusionar los linfocitos con células inmortalizadas, y seleccionar las células que secretan el anticuerpo monoclonal deseado.
Puede inmunizarse un huésped para obtener linfocitos que producen o son capaces de producir anticuerpos específicos para un inmunógeno. Alternativamente, los linfocitos pueden inmunizarse in vitro. Si se desean células humanas, pueden usarse linfocitos de sangre periférica, aunque se prefieren células del bazo o linfocitos de otras fuentes mamíferas.
Los linfocitos pueden fusionarse con una línea celular inmortalizada para formar células de hibridomas, un proceso que puede facilitarse por el uso de un agente de fusión, por ejemplo polietilenglicol. A modo de ilustración, pueden usarse células de mieloma de roedor mutante, bovinas, o humanas inmortalizadas por transformación. Se prefieren las poblaciones sustancialmente puras de células de hibridomas, en oposición con las células inmortalizadas no fusionadas. Así, tras la fusión, las células pueden cultivarse en un medio adecuado que inhibe el crecimiento o supervivencia de células inmortalizadas, no fusionadas, por ejemplo, usando células de mieloma mutantes que carecen de enzima hipoxantina guanina fosforribosil transferasa (HGPRT). En tal situación, pueden añadirse hipoxantina, aminopterina y timidina al medio (medio HAT) para evitar el crecimiento de células deficientes de HGPRT a la vez que se permite que crezcan los hibridomas.
Preferiblemente, las células inmortalizadas fusionadas eficientemente, pueden aislarse de poblaciones mixtas por selección en un medio como HAT, y soportar la expresión estable y de alto nivel del anticuerpo tras la fusión. Las líneas celulares inmortalizadas preferidas incluyen líneas celulares de mieloma disponibles del American Type Culture Collection, Manassas, VA.
Como las células de hibridomas típicamente secretan anticuerpo extracelularmente, el medio de cultivo puede ensayarse para la presencia de anticuerpos monoclonales específicos para el fármaco anti-psicótico. Puede usarse la inmunoprecipitación de ensayos de enlace in vitro, por ejemplo, radioinmunoensayo (RIA) o ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA), para medir la especificidad de enlace de los anticuerpos monoclonales.
Las células de hibridomas que secretan anticuerpos monoclonales pueden aislarse como clones individuales limitando los procedimientos de dilución y sub-cultivando. Los medios de cultivo adecuados incluyen, pero no están limitados a, Medio de Eagle modificado de Dulbecco, RPMI-1640, y medio libre de polipéptido, reducido de polipéptidos o libre de suero, por ejemplo Ultra DOMA PF o HL-1, disponibles de Biowhittaker, Walkersville, MD. Alternativamente, las células de hibridomas pueden cultivarse in vivo como ascitis.
Los anticuerpos monoclonales pueden aislarse y/o purificarse a partir de un medio de cultivo o fluido de ascitis por procedimientos de purificación de inmunoglobulina (Ig) convencionales incluyendo, pero no limitados a, polipéptido A-SEFAROSA, cromatografía de hidroxilapatita, electroforesis en gel, diálisis, precipitación con sulfato de amonio y cromatografía por afinidad.
Los anticuerpos monoclonales también pueden producirse por métodos recombinantes como los descritos en la Patente U.S. N° 4.166.452. Los anticuerpos monoclonales que codifican ADN pueden aislarse y secuenciarse usando procedimientos convencionales, por ejemplo usando sondas de oligonucleótidos que enlazan específicamente con genes de la cadena de anticuerpos pesada y ligera murinos, preferiblemente con sonda de ADN aislado de líneas celulares de hibridomas de anticuerpos monoclonales que secretan anticuerpos específicos para fármacos anti-psicóticos.
INMUNOENSAYOS
Los anticuerpos así producidos pueden usarse en inmunoensayos para reconocer/enlazar con el fármaco anti-psicótico, detectando de este modo la presencia y/o cantidad del fármaco en una muestra del paciente. Preferiblemente, el formato del ensayo es un formato de inmunoensayo competitivo. Tal formato de ensayo así como otros ensayos se describen, entre otros sitios, en Hampton et al. (Serological Methods, A Laboratory Manual, APS Press, St. Paul, MN 1990) y Maddox et al. (J. Exp. Med. 158:12111, 1983).
También puede proporcionar un kit de reactivos que comprende un anticuerpo tal como se ha descrito anteriormente. Un kit de reactivos representativo puede comprender un anticuerpo que enlaza con el fármaco antipsicótico, quetiapina, un complejo que comprende un análogo de un fármaco anti-psicótico o un derivado de los mismos acoplado con una fracción marcadora, y puede también comprender opcionalmente uno o más calibradores que comprenden una cantidad conocida de un fármaco anti-psicótico o un estándar relacionado.
Como se ha indicado anteriormente, los kits de reactivos pueden comprender calibradores y/o materiales de control que comprenden una cantidad conocida del analito a medir. La concentración del analito puede calcularse comparando los resultados obtenido para una muestra con los resultados obtenidos para un estándar. Puede construirse una curva de calibración y usarse para relacionar los conjuntos de resultados y para determinar la concentración de un analito en una muestra.
Cualquier muestra que se sospeche que contenga un analito, por ejemplo, un fármaco anti-psicótico, pueden analizarse de acuerdo con los métodos de las realizaciones actualmente preferidas. La muestra puede pre­ tratarse si se desea y puede prepararse en cualquier medio conveniente que no interfiera con el ensayo. Preferiblemente, la muestra comprende un medio acuoso como un fluido corporal de un huésped, lo más preferido plasma o suero.
Solitudes en trámite tituladas "Haptens of Aripiprazole" (Expediente del Agente N°. PRD3265USPSP, primer inventor nombrado: Remmerie), "Haptens of Olanzapine" (Expediente del Agente N°. PRD3266USPSP, primer inventor nombrado: Remmerie), "Haptens of Paliperidone" (Expediente del Agente N°. PRD3267USPSP, primer inventor nombrado: Remmerie), "Haptens of Quetiapine" (Expediente del Agente N°. PRD3268USPSP, primer inventor nombrado: Remmerie), "Haptens of Risperidone and Paliperidone" (Expediente del Agente N°. PRD3269USPSP, primer inventor nombrado: Remmerie), "Antibodies to Aripiprazole Haptens and Use Thereof" (Expediente del Agente N°. CDS5128USPSP, primer inventor nombrado: Hryhorenko), "Antibodies to Olanzapine Haptens and Use Thereof" (Expediente del Agente N°. CDS5132USPSP, primer inventor nombrado: Hryhorenko), "Antibodies to Paliperidone Haptens and Use Thereof" (Expediente del Agente N°. CDS5126USPSP, primer inventor nombrado: Hryhorenko), "Antibodies to Quetiapine Haptens and Use Thereof" (Expediente del Agente N°. CDS5134USPSP, primer inventor nombrado: Hryhorenko), "Antibodies to Risperidone Haptens and Use Thereof" (Expediente del Agente N°. CDS5130USPSP, primer inventor nombrado: Hryhorenko), "Antibodies to Aripiprazole and Use Thereof" (Expediente del Agente N°. CDS5129USPSP, primer inventor nombrado: Hryhorenko), "Antibodies to Olanzapine and Use Thereof" (Expediente del Agente N°. CDS5133USPSP, primer inventor nombrado: Hryhorenko), "Antibodies to Paliperidone and Use Thereof" (Expediente del Agente N°. CDS5127USPSP, primer inventor nombrado: Hryhorenko), "Antibodies to Quetiapine and Use Thereof" (Expediente del Agente N°. CDS5135USPSP, primer inventor nombrado: Hryhorenko), "Antibodies to Risperidone and Use Thereof" (Expediente del Agente N°. c DS5131USPSP, primer inventor nombrado: Hryhorenko).
EJEMPLOS
Los compuestos representativos de la presente invención pueden sintetizarse de acuerdo con los métodos sintéticos generales descritos a continuación. Los compuestos de Fórmula (I) pueden prepararse por métodos conocidos por los expertos en la técnica. Los siguientes ejemplos se pretende que representen ejemplos de la invención y no se pretende que limiten la invención de ninguna manera.
Ejemplo 1
2-(2-(2-(aminometil)-4-(dibenzo[b,f][1,4]tiazepin-11 -il)piperazin-1 -il)etoxi)etanol
Paso A
Piperazina-2-carbonitrilo
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Se trató gota a gota una solución agitada de tetrahidrofurano (300 ml) y etilendiamina (108,2 g) a 30° C con 2-cloroacrilonitrilo (105,0 g) durante un periodo de 2 horas y se agitó durante 6 horas adicionales a 30° C. La mezcla de la reacción se enfrió a 20° C y se formó el precipitado. La reacción se filtró, y el filtrado se ajusto a PH 4 añadiendo ácido clorhídrico al 35%. El precipitado resultante se recogió por filtración. Los precipitados combinados se disolvieron en solución de ácido clorhídrico al 20% y después se vertieron en solución de THF para precipitar el compuesto del título, que se secó bajo presión reducida y se usó en la siguiente reacción sin purificación adicional.
1H NMR: (D2O, 400 MHz): 5 (ppm) 5.00-4.97 (m, 1H), 3.79 (d, J=4.8 Hz, 2H), 3.62-3.44 (m, 4H).
Paso B
terc-Butil 3-cianopiperazina-1 -carboxilato
Figure imgf000034_0002
A una solución de compuesto piperazina-2-carbonitrilo, preparada como se ha descrito en el paso anterior, (90,6 g, 0,492 mol) se le añadió trietilamina (206 ml, 1,476 mol) y Boc2O (117 g, 0,542 mol). La mezcla de la reacción se agitó a temperatura ambiente durante la noche, y después se concentró. El residuo se purificó por cromatografía en gel de sílice para proporcionar el compuesto del título.
1H NMR: (CDCla, 400 MHz): 5 (ppm) 4.06-3.91 (m, 3H), 3.28-2.83 (m, 4H), 1.47 (s, 9H).
Paso C
terc-Butil 3-ciano-4-(2-(2-hidroxietoxi)etil)piperazina-1-carboxilato
Figure imgf000034_0003
Se trató una solución de terc-butil 3-cianopiperazina-1-carboxilato, preparada como se describe en el paso anterior (10 g, 0,047 mol) y 2-(2-hidroxietoxi)acetaldehído (14, 8 g) (ver: Bodin, A.,Contact Dermatitis, 2001,44:207) en diclorometano con ácido fórmico (12,7 g) y la mezcla de la reacción se agitó a temperatura ambiente durante la noche. Se añadió cianoborohidruro de sodio (7,2 g, 0,118 mol) en porciones. La mezcla de la reacción se agitó a temperatura ambiente durante 3 horas seguido por la adición de agua y extracción con diclorometano. La capa orgánica se lavó con salmuera, se seco sobre sulfato de sodio, se filtró, y se concentró. El producto bruto se purificó por cromatografía en columna para proporcionar el producto.
1H NMR: (CDCI3, 400 MHz): 5 (ppm) 4.15 (s, 1H), 3.69-3.63 (m, 4H), 3.58 (d, J=4.4 Hz, 2H), 3.47-3.44 (m, 4H), 2.61 (d, J=5.2 Hz, 2H), 2.51-2.48 (m, 4H), 1.43 (s, 9H).
Paso D
terc-Butil 3-(aminometil)-4-(2-(2-hidroxietoxi)etil)piperazina-1-carboxilato
Figure imgf000035_0001
A una solución de terc-butil 3-ciano-4-(2-(2-hidroxietoxi)etil)piperazina-1-carboxilato, preparada como se describe en el paso anterior (9,9 g, 33,1 mmol) en metanol (20 ml) se le añadió Ni Raney (15 g). La solución de la reacción se agitó a temperatura ambiente durante la noche bajo atmósfera de hidrógeno (50 psi). La mezcla se filtró y concentró para proporcionar el producto, que se usó en el paso siguiente sin purificación adicional.
ESI-MS (M+1): 304 calculado para C14H29N3O4303.
Paso E
terc-Butil 4-(2-(2-hidroxietoxi)etil)-3-((2,2,2-trifluoroacetamido)metil)piperazina-1-carboxilato
Figure imgf000035_0002
A una solución de terc-butil 3-(aminometil)-4-(2-(2-hidroxietoxi)etil)piperazina-1-carboxilato, preparada como se describe en el paso anterior (8,8 g) en diclorometano (100 ml) se le añadió trietilamina (8,8 g, 87,0 mmol) y anhídrido trifluoroacético (6,1 g, 29,0 mmol). La mezcla de la reacción se agitó a temperatura ambiente durante 12 h, se diluyó con diclorometano y se lavó con agua. La capa orgánica se lavó con salmuera, se secó sobre sulfato de sodio, se filtró, y se concentró para dar el producto bruto que se purificó por cromatografía en columna para proporcionar el compuesto del título.
ESI-MS (M+1): 400 calculado para C16H28F3N3O5399.
Paso F
2,2,2-Trifluoro-N-((1-(2-(2-hidroxietoxi)etil)piperazin-2-il)metil)acetamida
Figure imgf000035_0003
Una solución de terc-butil 4-(2-(2-hidroxietoxi)etil)-3-((2,2,2-trifluoroacetamido)metil)piperazina-1-carboxilato, preparada como se describe en el paso anterior (8,6 , bruto) en cloruro de hidrógeno metanólico (20 ml) se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora, seguido por concentración para proporcionar el compuesto del título que se usó sin purificación adicional. ESI-MS (M+1): 300 calculado para C11H20F3N3O3299.
Paso G
Acido 2-((2-Nitrofenil)tio)benzoico
Figure imgf000036_0001
A una solución de ácido 2-mercapto-benzoico (30 g, 0,195 mol) en isopropanol (500 ml) a temperatura ambiente se le añadieron 1-fluoro-2-nitro-benceno (30,2 g, 0,214 mol), agua (100 ml) e hidróxido de potasio (31,1 g, 0,555 mol). La mezcla de la reacción se agitó a temperatura ambiente durante la noche, se extinguió con agua y se diluyó con acetato de etilo. La fase acuosa se extrajo con acetato de etilo (3x400 ml) y los extractos orgánicos combinados se lavaron con cloruro sódico acuoso saturado (500 ml), se secaron sobre sulfato de magnesio, se filtraron y se concentraron. El residuo bruto se purificó por cromatografía flash en columna en gel de sílice para dar el compuesto del título. ESI-MS (M+1): 276 calculado para C13H9NO4S 275. 1H NMR: (CDCl3, 400 MHz): 5 (ppm) 8.12­ 8.07 (m, 2H), 7.54-7.43 (m, 2H), 7.42-7.39 (m, 2H), 7.35-7.31 (m, 1H), 7.12-7.09 (m, 1H).
Paso H
Acido 2-((2-aminofenil)tio)benzoico
Figure imgf000036_0002
A una solución de ácido 2-((2-nitrofenil)tio)benzoico, preparado como se describe en el paso anterior (43,3 g, 0,157 mol) en acetato de etilo (500 ml) se le añadió Pd/C (8 g). La solución de la reacción se agitó a temperatura ambiente durante la noche bajo atmósfera gaseosa de hidrógeno. La mezcla se filtró y concentró para proporcionar el compuesto del título. ESI-MS (M+1): 246 calculado para C13H11NO2S 245. 1H Nm R: (CDCl3, 400 MHz): 5 (ppm) 8.20-8.17 (m, 1H), 7.51-7.48 (m, 1H), 7.36-7.30 (m, 2H), 7.21-7.17 (m, 1H), 6.88-6.80 (m, 3H).
Paso I
Dibenzo[b,f][1,4]tiazepin-11 (10H)-ona
Figure imgf000036_0003
A una solución de ácido 2-((2-aminofenil)tio)benzoico, preparado como se describe en el paso anterior, (30 g, 0,122 mol) en diclorometano (300 ml) se le añadió EDCl (35,2 g, 0,183 mol), trietilamina (51 ml, 0,366 mol) y HOBT (24,7 g, 0,183 mol). La mezcla de la reacción se agitó a temperatura ambiente durante 12 horas, se lavó con 1M de HCl acuoso, bicarbonato sódico acuoso saturado, cloruro sódico acuoso saturado, y se secó sobre MgSO4. La solución se filtró, se concentró y se purificó por cromatografía en columna para proporcionar el compuesto del título. ESI-MS (M+1): 228 calculado para C13H9NOS 227. 1H NMR: (CDCla, 400 MHz): 5 (ppm) 7.70-7.67 (m, 1H), 7.58-7.52 (m, 2H), 7.50-7.42 (m, 2H), 7.39-7.35 (m, 1H), 7.24-7.22 (m, 1H), 7.17-7.13 (m, 1H).
Paso J
11 -Clorodibenzo[b,f][1,4]tiazepina
Se calentó a reflujo una solución de dibenzo[b,f][1,4]tiazepin-11 (10H)-ona, preparada como se describe en el paso anterior (14,6 g, 64 mmol) en oxicloruro de fósforo (20 ml) durante 2 horas. La mezcla se concentró para proporcionar el producto bruto que se usó directamente sin purificación adicional. ESI-MS (M+1): 246 calculado para C13H8ClNS 245.
Paso K
N-((4-(Dibenzo[b,f][1,4]tiazepin-11 -il)-1 -(2-(2-hidroxietoxi)etil)piperazin-2-il)metil)-2,2,2-trifluoroacetamida
Figure imgf000037_0001
A una solución de 11-clorodibenzo[b,f][1,4]tiazepina, preparada como se describe en el paso anterior, (2 g, bruto) en dioxano (20 ml) se añadió Pd2(dba)3 (327 mg, 0,357 mmol), BINAP (225 mg, 0,357 mmol), trietilamina (6 ml, 42,9 mmol) y 2,2,2-trifluoro-N-((1-(2-(2-hidroxietoxi)etil)piperazin-2-il)metil)acetamida, preparada como se describe en el Paso F, (2,4 g, bruto). La mezcla resultante se calentó a reflujo durante la noche bajo atmósfera de nitrógeno, se filtró a través de CELITE™, y se concentró. El residuo se purificó por cromatografía en gel de sílice para proporcionar el compuesto del título. ESI-MS (M+1): 509 calculado para C24H27F3N4O3S 508.
Paso L
2-(2-(2-(Aminometil)-4-(dibenzo[b,f][1,4]tiazepin-11 -il)piperazin-1 -il)etoxi)etanol
Figure imgf000037_0002
Una mezcla de N-((4-(dibenzo[b,f][1,4]tiazepin-11 -il)-1 -(2-(2-hidroxietoxi)etil)piperazin-2-il)metil)-2,2,2-trifluoroacetamida, preparada como se describe en el paso anterior (2,0 g), y carbonato potásico acuoso (5%) (15 ml) en metanol (20 ml) se agitó a temperatura ambiente durante 18 horas y se extrajo con acetato de etilo. Las capas orgánicas se lavaron con cloruro sódico acuoso saturado, se secaron sobre sulfato de sodio, se filtraron, se evaporaron para dar el producto bruto que se purificó por cromatografía en columna, y seguido por prep-HPLC para proporcionar el compuesto del título como un sólido amarillo. ESI-MS (M+1): 413 calculado para C23H28N4O2S 412.
1H NMR: (CDCl3, 400 MHz): 5 (ppm) 7.52-7.50 (m, 1H), 7.41-7.31 (m, 4H), 7.17-7.12 (m, 1H), 7.02-7.00 (m, 1H), 6.89-6.84 (m, 1H), 3.66-3.59 (m, 5H), 3.54-3.51 (m, 2H), 3.49-3.38 (m, 1H), 3.19-3.12 (m, 1H), 3.03-2.88 (m, 2H), 2.79-2.53 (m, 5H).
Ejemplo 2
N-((4-(Dibenzo[b,f][1,4]tiazepm-11 -il)-1 -(2-(2-hidroxietoxi)etil)piperazin-2-il)metil)-2-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1 H-pirrol-1 -il)acetamida
Figure imgf000038_0001
A una solución de 2-(2-(2-(aminometil)-4-(dibenzo[b,f][1,4]tiazepin-11-il)piperazin-1-il)etoxi)etanol, preparada como se describe en el Ejemplo 1, (7,8 mg, 19,0 pmoles) en 410 pl de DMF y 8,9 pl de tributilamina se le añadieron 480 pl de una solución DMF de éster de N-(a-maleimidoacetoxi) succinimida (AMAS, 10 mg/ml, 4,8 mg, 19,0 pmoles). Se permitió que la solución resultante se agitase durante 60 minutos a 20° C, después se usó como tal en la reacción de conjugación con proteína activada por tiol.
Ejemplo 3
2-{2-[4-(3-Aminometil-dibenzo[b,f][1,4]tiazepin-11 -il)-piperazin-1 -il]-etoxi}-etanol
Figure imgf000038_0002
Paso A
Acido 11 -Oxo-10,11 -dihidrodibenzo[b,f][1,4]tiazepina-3-carboxílico
Figure imgf000038_0003
Se calentó una mezcla de 2-amino-bencenotiol (1,34 ml, 12,5 mmol), ácido 2-bromo-tereftálico (1,54 g, 6,3 mmol), óxido cuproso (0,50 g, 3,5 mmol), quinolina (6,3 ml), y piridina (0,63 ml) en un baño de aceite a 180° C bajo nitrógeno durante 20 horas, después se enfrió a temperatura ambiente. Se añadió lentamente ácido clorhídrico concentrado (20 ml) mientras se enfriaba en agua fría, con agitación. Se filtró el precipitado resultante, se lavó con agua, y se secó para dar el compuesto del título bruto (2 g). LC-MS: m/z 270 (M-1).
Paso B
Cloruro de 11 -Cloro-dibenzo[b,f][1,4]tiazepina-3-carbonilo
Figure imgf000039_0001
A una suspensión de ácido 11-Oxo-10,11-dihidrodibenzo[b,f][1,4]tiazepina-3-carboxílico, preparada como se describe en el paso anterior (0,41 g), en tolueno (6,5 ml) se le añadió dMf (0,125 ml) y cloruro de tionilo (6,5 ml). La mezcla se calentó en un baño de aceite a 80° C bajo nitrógeno durante la noche. La solución resultante se concentró hasta la sequedad. El producto bruto se usó para el paso siguiente.
Paso C
Amida de ácido 11 -cloro-dibenzo[b,f][1,4]tiazepina-3-carboxílico
Figure imgf000039_0002
Se trató una solución de cloruro de 11-cloro-dibenzo[b,f][1,4]tiazepina-3-carbonilo, preparada como se describe en el paso anterior, (ca 1,5 mmol) en diclorometano (10 ml) con una solución de 1,4-dioxano de amoniaco (0,5 M, 9 ml) bajo un baño de hielo. La suspensión resultante se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora, y la reacción se extinguió con agua (10 ml). El precipitado resultante se filtró, se lavó con agua y diclorometano, y se secó. La capa orgánica del filtrado se lavó con solución de bicarbonato sódico acuoso saturado y se concentró a un producto blanquecino adicional, que se usó en el paso siguiente sin purificación adicional. LC-MS: m/z 289 (M+1). 1H NMR (DMSOd6, 400 MHz): 5 (ppm) 8.19 (br, 1H), 8.00-7.96 (m, 2H), 7.90 (d, 1H), 7.64 (br, 1H), 7.56 (m, 1H), 7.47 (m, 1H), 7.31 (m, 2H).
Paso D
Amida de ácido 11 -{4-[2-(2-Hidroxi-etoxi)-etil]-piperazin-1 -il}-dibenzo[b,f][1,4]tiazepina-3-carboxílico
Figure imgf000039_0003
A una solución de amida de ácido 11-cloro-dibenzo[b,f][1,4]tiazepina-3-carboxílico, preparada como se describe en el paso anterior, (0,40 g) en DMF (1,5 ml) y tolueno (1,5 ml) se le añadió 2-(2-piperazin-1-il-etoxi)-etanol (0,50 g, 2,9 mmol). La solución se calentó en un baño de aceite a 110° C bajo nitrógeno durante 5 horas, se concentró, y se purificó (gel de sílice, 2-5% metanol-diclorometano que contenía eluyente de amoniaco) para dar el compuesto del título como un sólido blanquecino. LC-MS: m/z 427 (M+1).
Paso E
2-{2-[4-(3-Aminometil-dibenzo[b,f][1,4]tiazepin-11 -il)-piperazin-1 -il]-etoxi}-etanol
Figure imgf000040_0001
A una solución de 2-{2-[4-(3-Aminometil-dibenzo[b,f][1,4]tiazepin-11-il)-piperazin-1-il]-etoxi}-etanol, preparada como se describe en el paso anterior, (0,24 g, 0,56 mmol) en t Hf (15 ml) se le añadió 1M de solución de THF híbrida de litio aluminio (6 ml, 6mmol). La suspensión blanca se calentó en una baño de aceite a 70° C bajo nitrógeno durante 2 horas. La suspensión de la reacción se extinguió con la adición lenta de solución de sulfato de sodio acuoso saturado bajo un baño de hielo. La fase de la solución se separó, y se extrajo el sólido con THF (5x10 ml). Las fases orgánicas combinadas se concentraron y purificaron (gel de sílice, 2-5% metanol diclorometano que contenía eluyente de amoniaco ) para dar el compuesto del título como un sólido blanquecino. LC-MS: m/z 413 (M+1). 1H nMr (CDCl3, 400 MHz) 5 (ppm) 7.47 (s, 1H), 7.38 (m, 1H), 7.26 (m, 2H, superpuesto con solvente), 7.17 (m, 1H), 7.06 (m, 1H), 6.88 (m, 1H), 3.85 (s, 2H), 3.76-3.46 (m, 11H, conteniendo protones intercambiables), 2.66­ 2.57 (m, 8H).
Ejemplo 4
2-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1 H-pirrol-1 -il)-N-((11 -(4-(2-(2-hidroxietoxi)ethil)piperazin-1 -il)dibenzo[b,f][1,4]tiazepin-3-il)metil)acetamida
Figure imgf000040_0002
A una solución de 2-{2-[4-(3-aminometil-dibenzo[b,f][1,4]tiazepin-11-il)-piperazin-1-il]-etoxi}-etanol, preparada como se describe en el Ejemplo 3, (5,6 mg, 13,6 pmoles) en 295 pl de DMF y 6,4 pl de tributilamina se le añadieron 340 pl de una solución de DMF de de éster de N-(a-maleimidoacetoxi)succinimida (AMAS, 10 mg/ml, 3,4 mg, 13,6 pmoles). Se permitió que la solución resultante se agitase durante 60 minutos a 20° C, después se uso como tal en la reacción de conjugación con proteína activada por tiol
Ejemplo 5
N-((4-(dibenzo[b,f][1,4]tiazepin-11 -il)-1 -(2-(2-hidroxietoxi)ethil)piperazin-2-il)metil)-2-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1 H-pirrol-1 -il)acetamida-tiroglobulina bovina-conjugado
Paso A
Reacción de Tiroglobulina Bovina (BTG) con SATA:
A 3,0 ml de una solución de tiroglobulina bovina (BTG, 20,0 mg, 0,03 pmoles) en 100 mM de tampón de fosfato pH 7.5 se añadieron 276,0 pl de una solución de DMF de N-succinimidil-S-acetiltioacetato (SATA, 25 mg/ml, 6,9 mg, 30,0 pmoles). La solución resultante se incubó a 20° C durante 1 hora en un mezclador de rodillos. La reacción se purificó en una columna Sephadex G-25 usando 100 mM de tampón de fosfato, 5 mM de EDTA, y pH 6.0. A 6,0 ml de BTG-SATA (18,0 mg, 0,027 gmoles) se le añadieron 600 gl de 2,5 M de hidroxilamina, 50 mM de EDTA, pH 7.0 La solución resultante se incubó a 20° C durante 1 hora en un mezclador de rodillos.
Paso B
A una alícuota de solución de BTG-SH, preparada como se describe en el paso anterior, (6,6 ml, 0,027 gmoles) se le añadió una alícuota de la solución preparada en el Ejemplo 2 (898,9 gl, 19,0 gmoles). La mezcla turbia resultante se incubó durante 3 horas a 20° C en un mezclador de rodillos. La reacción se filtró a través de un filtro de jeringa de 0,45 gm, después se purifico en una columna Sephadex G-25 usando 100 mM de tampón de fosfato, 0,14 M de cloruro sódico, a pH 7.4.
Ejemplo 6
2-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1 H-pirrol-1 -il)-N-((11 -(4-(2-(2-hidroxietoxi)etil)piperazin-1 -il)dibenzo[b,f][1,4]tiazepin-3-il)metil)acetamida-tiroglubulina bovina-conjugado
A una alícuota de solución de BTG-SH, preparada como se describe en el Ejemplo 5 Paso A, (3,4 ml, 0,014 gmoles) se le añadieron 641,4 gl de 2-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1 H-pirrol-1 -il)-N-((11 -(4-(2-(2-hidroxietoxi)ethil)piperazin-1-il)dibenzo[b,f][1,4]tiazepin-3-il)metil)acetamida, preparada como se describe en el ejemplo 4, (13,6 gmoles). La mezcla turbia resultante se incubó durante 3 horas a 20° C en un mezclador de rodillos. La reacción se purificó en una columna Sephadex G-25 usando 100 mM de tampón de fosfato, 0,14M de cloruro sódico, a pH 7.4.
Ejemplo 7
N-((4-(dibenzo[b,f][1,4]tiazepin-11 -il)-1 -(2-(2-hidroxietoxi)etil)piperazin-2-il)metil)-2-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1 H-pirrol-1 -il)acetamida-hemocianina de lapa de ojo de cerradura-conjugado
Paso A
Reacción de hemocianina de lapa de ojo de cerradura (KLH) con SATA
A una solución de 3,18 ml de hemocianina de lapa de ojo de cerradura (KLH, 15,6 mg, 0,156 gmoles) en 100 mM de tampón de fosfato, 0,46M de cloruro sódico, a pH 7,4 se le añadieron 72,1 gl de una solución de DMF de N-succinimidil-S-acetiltioacetato (SATA, 25 mg/ml,1,8 mg, 7,80 gmoles). La solución resultante se incubó a 20° C durante 1 hora en un mezclador de rodillos. La reacción se purificó en una columna Sephadex G-25 usando 100 mM de tampón de fosfato, 0,46 M de cloruro sódico, 5 mM de EDTA, a pH 6.0. A 6,27 ml de la solución de KLH-SATA resultante (13,3 mg, 0,133 gmoles) se le añadieron 627 gl de 2,5M de hidroxilamina, 50 mM de EDTA, a pH 7.0. La solución resultante se incubó a 20° C durante 1 hora en un mezclador de rodillos. La reacción se usó como tal en la reacción de conjugación con hapteno activado por maleimida.
Paso B
A un alícuota de solución de KLH-SH, preparada como se describe en el paso anterior (6,9 ml, 0,133 gmoles) se le añadió una alícuota de la solución preparada en el Ejemplo 2, (624,3 gl, 13,3 gmoles). La mezcla turbia resultante se incubó durante 3 horas a 20° C en un mezclador de rodillos. La reacción se filtró a través de un filtro de jeringa de 0,45 gm después se purificó en una columna Sephadex G-25 usando 100 mM de tampón de fosfato, 0,46M de cloruro sódico, a pH 7.4.
Ejemplo 8
2-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1 H-pirrol-1 -il)-N-((11 -(4-(2-(2-hidroxietoxi)ethil)piperazin-1 -il)dibenzo[b,f][1,4]thiazepin-3-il)metil)acetamida-hemocianina de lapa de ojo de cerradura-conjugado
A una alícuota de solución de KLH-SH, preparada como se describe en el Ejemplo 7 Paso A (3,2 ml, 0,061 gmoles) se le añadió una alícuota de la solución preparada en el Ejemplo 4 (283,0 gl, 6,10 gmoles). La mezcla turbia resultante se incubó durante 3 horas a 20° C en un mezclador de rodillos. La reacción se purificó en una columna Sephadex G-25 usando 100 mM de tampón de fosfato, 0,46M de cloruro sódico, a pH 7.4.
Ejemplo 9
Inmunoensayo Competitivo para Quetiapina
Siguiendo una serie de inmunizaciones con inmunógenos de quetiapina, se probaron sangrados de cola de ratón para reactividad usando un ELISA. También se probaron sobrenadantes de hibridomas, y los datos del ELISA se muestran en las Tablas 1 y 2 siguiente muestran reactividad de varios hibridomas (el compañero de fusión eran células NSO).
Tabla 1
Figure imgf000042_0001
Tabla 2
Figure imgf000042_0002
El sobrenadante se probó entonces por ELISA competitivo para determinar si las señales eran específicas para quetiapina. Las Figs. 1 y 2 muestran los resultados de hibridomas representativos. Los datos muestran reactividad específica para quetiapina.
La Fig. 3 muestro el formato de inmunoensayo competitivo usado en un dispositivo de ensayo de flujo lateral en el que el anticuerpo de captura, un clon de quetiapina, se depositó en un chip junto con un conjugado de detección que consistía de quetiapina conjugada con un fluorofeno. En este formato competitivo como muestra la Fig. 3, un nivel bajo de analito (quetiapina) da lugar a una señal alta, mientras que un nivel alto de analito (quetiapina) da lugar a una señal baja. La cantidad de quetiapina en la muestra puede calcularse de la pérdida de fluorescencia comparada con una muestra de control sin fármaco presente. Una curva de respuesta a dosis típica generada con los sub-clones de quetiapina 89-3, 89-13 y 89-5 se muestra en la Fig. 4.

Claims (14)

REIVINDICACIONES
1. Un compuesto de Fórmula 1:
Figure imgf000043_0001
en el que:
R1 es H,
Figure imgf000043_0002
o CH2NHC(O)(CH2)mCO2H;
R2 es H,
Figure imgf000043_0003
o CH2NHC(O)(CH2)mCO2H;
R3 es H; siempre que o R1 o R2 sean H, y siempre que además ambos de R1 y R2 y no sean H simultáneamente;
m es 1,2, 3, 4, o 5; y
n es 1,2, 3, 4, ó 5.
2. El compuesto de la Reivindicación 1 seleccionado del grupo que consiste de:
Figure imgf000045_0002
en el que:
m es 1,2, 3, 4, o 5; y
n es 1,2, 3, 4, o 5.
3. El compuesto de la reivindicación 2 que es
Figure imgf000045_0001
en el que:
m es 1, 2, 3, 4, o 5; y
n es 1, 2, 3, 4, o 5.
4. El compuesto de la reivindicación 2 que es
Figure imgf000046_0001
en el que:
m es 1,2, 3, 4, o 5; y
n es 1,2, 3, 4, o 5.
5. El compuesto de la reivindicación 2 que es
Figure imgf000046_0002
en el que:
m es 1, 2, 3, 4, o 5; y
n es 1, 2, 3, 4, o 5.
6. El compuesto de la reivindicación 2 que es
Figure imgf000046_0003
en el que:
m es 1, 2, 3, 4, o 5; y
n es 1, 2, 3, 4, o 5.
7. El compuesto de la reivindicación 2 que es
Figure imgf000047_0001
en el que:
m es 1,2, 3, 4, o 5; y
n es 1,2, 3, 4, o 5.
8. El compuesto de la reivindicación 2 que es
Figure imgf000047_0002
en el que:
m es 1, 2, 3, 4, o 5; y
n es 1, 2, 3, 4, o 5.
9. El compuesto de la reivindicación 1 que es
Figure imgf000047_0003
en el que m es 1, 2, 3, 4, o 5.
10. El compuesto de la reivindicación 1 que es
Figure imgf000048_0001
en el que m es 1, 2, 3, 4, o 5.
11. Un conjugado de un compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 1-10 y un portador inmunogénico.
12. El conjugado de la reivindicación 11, elaborado mediante el proceso de poner en contacto un compuesto de la reivindicación 1 con un portador inmunogénico.
13. El conjugado de la reivindicación 11 o la reivindicación 12, en el que el portador inmunogénico es una proteína.
14. El conjugado de la reivindicación 13, en el que la proteína es hemocianina de lapa californiana, ovoalbúmina o tiroglobulina bovina.
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