ES2635713T3

ES2635713T3 - Compuestos de heteroarilo y usos de los mismos

Info

Publication number: ES2635713T3
Application number: ES11838628.3T
Authority: ES
Inventors: Kwangho Lee; Deqiang Niu; Russell C. Petter; Juswinder Singh
Original assignee: Celgene CAR LLC
Current assignee: Celgene CAR LLC
Priority date: 2010-11-01
Filing date: 2011-10-31
Publication date: 2017-10-04
Anticipated expiration: 2031-10-31
Also published as: US9765038B2; EP2635285A1; US20160130236A1; EP2635285B1; US20120149722A1; WO2012061303A1; US9238629B2; JP5956999B2; US20180072687A1; EP2635285A4; US10081606B2; JP2013544807A

Abstract

Compuesto de fórmula I:**Fórmula** o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en la que: W es -O- o -NH-; R1 es -OR; cada R es independientemente alquilo C1-4 o fluoroalquilo C1-4; cada uno de R2 y R3 es independientemente hidrógeno, -OH u -OR; y R4 es -CF3, Cl o Br.

Description

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anteriormente, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

Tal como se usa en el presente documento, el término “sal farmacéuticamente aceptable” se refiere a aquellas sales que son, dentro del alcance del criterio médico razonable, adecuadas para su uso en contacto con los tejidos de seres humanos y animales inferiores sin excesiva toxicidad, irritación, respuesta alérgica y similares, y son acordes a una razón riesgo beneficio razonable. Se conocen bien en la técnica sales farmacéuticamente aceptables. Por ejemplo, S. M. Berge et al., describen sales farmacéuticamente aceptables en detalle en J. Pharmaceutical Sciences, 1977, 66, 1-19, incorporado como referencia en el presente documento. Las sales farmacéuticamente aceptables de los compuestos de esta invención incluyen las derivadas de bases y ácidos inorgánicos y orgánicos adecuados. Ejemplos de sales de adición de ácido no tóxicas, farmacéuticamente aceptables son sales de un grupo amino formadas con ácidos inorgánicos tales como ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido fosfórico, ácido sulfúrico y ácido perclórico o con ácidos orgánicos tales como ácido acético, ácido oxálico, ácido maleico, ácido tartárico, ácido cítrico, ácido succínico o ácido malónico o usando otros métodos usados en la técnica tales como intercambio iónico. Otras sales farmacéuticamente aceptables incluyen sales de adipato, alginato, ascorbato, aspartato, bencenosulfonato, benzoato, bisulfato, borato, butirato, canforato, canforsulfonato, citrato, ciclopentanopropionato, digluconato, dodecilsulfato, etanosulfonato, formiato, fumarato, glucoheptonato, glicerofosfato, gluconato, hemisulfato, heptanoato, hexanoato, yodhidrato, 2-hidroxi-etanosulfonato, lactobionato, lactato, laurato, laurilsulfato, malato, maleato, malonato, metanosulfonato, 2-naftalenosulfonato, nicotinato, nitrato, oleato, oxalato, palmitato, pamoato, pectinato, persulfato, 3-fenilpropionato, fosfato, pivalato, propionato, estearato, succinato, sulfato, tartrato, tiocianato, p-toluenosulfonato, undecanoato, valerato, y similares.

Las sales derivadas de bases apropiadas incluyen sales de metal alcalino, metal alcalinotérreo, amonio y N+(alquilo C1-4)4. Las sales de metal alcalino o metal alcalinotérreo representativas incluyen sodio, litio, potasio, calcio, magnesio, y similares. Otras sales farmacéuticamente aceptables incluyen, cuando sea apropiado, cationes no tóxicos de amonio, amonio cuaternario y amina formados usando contraiones tales como haluro, hidróxido, carboxilato, sulfato, fosfato, nitrato, alquil inferior-sulfonato y arilsulfonato.

2. Descripción de realizaciones a modo de ejemplo

Tal como se describe en detalle en el presente documento, a continuación, los compuestos proporcionados son inhibidores selectivos de al menos una mutación de EGFR. Se ha hallado sorprendentemente que los compuestos proporcionados son inhibidores selectivos de al menos una mutación de EGFR en comparación con EGFR silvestre (“WT”). En determinadas realizaciones, la al menos una mutación de EGFR es T790M. En determinadas realizaciones, la al menos una mutación de EGFR es una mutación de deleción. En algunas realizaciones, la al menos una mutación de EGFR es una mutación activante. En determinadas realizaciones, un compuesto proporcionado inhibe selectivamente al menos una mutación de deleción/resistente y al menos una mutación activante en comparación con EGFR WT. En algunas realizaciones, un compuesto proporcionado inhibe selectivamente al menos una mutación de deleción y/o al menos una puntual, y no afecta en cuanto a la inhibición de EGFR WT.

Puede seleccionarse una mutación de EGFR de T790M (resistente u oncogénica), L858R (activante), delE746-A750 (activante), G719S (activante), o una combinación de las mismas.

Tal como se usa en el presente documento, el término “inhibe selectivamente”, tal como se usa en comparación con la inhibición de EGFR WT, significa que un compuesto proporcionado inhibe al menos una mutación de EGFR (es decir, al menos una mutación de deleción, al menos una mutación activante, o una combinación de al menos una mutación de deleción y al menos una mutación activante) en al menos un ensayo descrito en el presente documento (por ejemplo, bioquímico o celular). En algunas realizaciones, el término “inhibe selectivamente”, tal como se usa en comparación con la inhibición de EGFR WT significa que un compuesto proporcionado es al menos 50 veces más potente, al menos 45 veces, al menos 40, al menos 35, al menos 30, al menos 25 o al menos 20 veces más potente como inhibidor de al menos una mutación de EGFR, tal como se define y describe en el presente documento, en comparación con EGFR WT.

Tal como se usa en el presente documento, el término “que inhibe poco a EGFR WT” significa que un inhibidor selectivo de al menos una mutación de EGFR, tal como se define y describe anteriormente y en el presente documento, inhibe EGFR en el límite superior de detección de al menos un ensayo tal como se describe en el presente documento (por ejemplo, bioquímico o celular tal como se describe en detalle en los ejemplos 24-26). En algunas realizaciones, el término “que inhibe poco a EGFR WT” significa que un compuesto proporcionado inhibe EGFR WT con un CI50 de al menos 10 M, al menos 9 M, al menos 8 M, al menos 7 M, al menos 6 M, al menos 5 M, al menos 3 M, al menos 2 M o al menos 1 M.

En determinadas realizaciones, un compuesto proporcionado inhibe selectivamente (a) al menos una mutación activante; y (b) T790M; y (c) inhibe poco a WT. En algunas realizaciones, la al menos una mutación activante es una mutación de deleción. En algunas realizaciones, la al menos una mutación activante es una mutación puntual. En algunas realizaciones, una mutación activante es L858R. En algunas realizaciones, una mutación activante es G719S. En algunas realizaciones, una mutación activante es delE746-A750.

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algunas realizaciones, la al menos una mutación activante es una mutación de deleción. En algunas realizaciones, la al menos una mutación activante es una mutación puntual. En algunas realizaciones, una mutación activante es delE746-A750. En algunas realizaciones, una mutación activante es L858R. En algunas realizaciones, una mutación activante es G719S.

Por consiguiente, otra realización de la presente invención se refiere a tratar o paliar la gravedad de una o más enfermedades en las que se sabe que al menos un mutante de EGFR desempeña un papel. Específicamente, la presente invención se refiere a un método de tratar o paliar la gravedad de una enfermedad o un estado seleccionado de un trastorno proliferativo, en el que dicho método comprende administrar a un paciente que lo necesita un compuesto o una composición según la presente invención.

En algunas realizaciones, la presente invención proporciona un método para tratar o paliar la gravedad de uno o más trastornos seleccionados de un cáncer. En algunas realizaciones, el cáncer se asocia con un tumor sólido. En determinadas realizaciones, el cáncer es cáncer de mama, glioblastoma, cáncer de pulmón, cáncer de cabeza y cuello, cáncer colorrectal, cáncer de vejiga o cáncer de pulmón de células no pequeñas. En algunas realizaciones, la presente invención proporciona un método para tratar o paliar la gravedad de uno o más trastornos seleccionados de carcinoma de células escamosas, carcinoma de glándula salival, carcinoma de ovarios o cáncer de páncreas.

En determinadas realizaciones, la presente invención proporciona un método para tratar o paliar la gravedad de neurofibromatosis tipo I (NF1), neurofibromatosis tipo II (NF2) neoplasias de células de Schwann (por ejemplo MPNST) o schwannomas.

Los compuestos y las composiciones, según el método de la presente invención, pueden administrarse usando cualquier cantidad y cualquier vía de administración eficaz para tratar o paliar la gravedad de un cáncer. La cantidad exacta requerida variará de un sujeto a otro, dependiendo de la especie, la edad y el estado general del sujeto, la intensidad de la infección, el agente particular, su modo de administración, y similares. Los compuestos de la invención se formulan preferiblemente en forma unitaria de dosificación para facilidad de administración y uniformidad de dosificación. La expresión “forma unitaria de dosificación” tal como se usa en el presente documento se refiere a una unidad físicamente diferenciada de agente apropiada para el paciente que va a tratarse. Sin embargo, se entenderá que el uso diario total de los compuestos y las composiciones de la presente invención lo decidirá el médico encargado dentro del alcance del criterio médico razonable. El nivel de dosis eficaz específico para cualquier paciente u organismo particular dependerá de una variedad de factores incluyendo el trastorno que esté tratándose y la gravedad del trastorno; la actividad del compuesto específico empleado; la composición específica empleada; la edad, el peso corporal, la salud general, el sexo y la dieta del paciente; el momento de administración, la vía de administración y la tasa de excreción del compuesto específico empleado; la duración del tratamiento; fármacos usados en combinación o de manera coincidente con el compuesto específico empleado, y factores similares bien conocidos en las técnicas médicas. El término “paciente”, tal como se usa en el presente documento, significa un animal, preferiblemente un mamífero, y lo más preferiblemente un ser humano.

Las composiciones farmacéuticamente aceptables de esta invención pueden administrarse a seres humanos y otros animales por vía oral, por vía rectal, por vía parenteral, por vía intracisternal, por vía intravaginal, por vía intraperitoneal, de forma tópica (como mediante polvos, pomadas o gotas), por vía bucal, como pulverización oral o nasal, o similares, dependiendo de la intensidad de la infección que esté tratándose. En determinadas realizaciones, los compuestos de la invención pueden administrarse por vía oral o por vía parenteral a niveles de dosificación de aproximadamente 0,01 mg/kg a aproximadamente 50 mg/kg o desde aproximadamente 1 mg/kg hasta aproximadamente 25 mg/kg, de peso corporal del sujeto al día, una o más veces a día, para obtener el efecto terapéutico deseado.

Las formas de dosificación líquidas para administración oral incluyen, pero no se limitan a, emulsiones, microemulsiones, disoluciones, suspensiones, jarabes y elixires farmacéuticamente aceptables. Además de los compuestos activos, las formas de dosificación líquidas pueden contener diluyentes inertes usados habitualmente en la técnica tales como, por ejemplo, agua u otros disolventes, agentes solubilizantes y emulsionantes tales como alcohol etílico, alcohol isopropílico, carbonato de etilo, acetato de etilo, alcohol bencílico, benzoato de bencilo, propilenglicol, 1,3-butilenglicol, dimetilformamida, aceites (en particular, aceites de semilla de algodón, cacahuete, maíz, germen, oliva, ricino y sésamo), glicerol, alcohol tetrahidrofurfurílico, polietilenglicoles y ésteres de sorbitano de ácidos grasos, y mezclas de los mismos. Además de diluyentes inertes, las composiciones orales también pueden incluir adyuvantes tales como agentes humectantes, agentes emulsionantes y de suspensión, agentes edulcorantes, saborizantes y perfumantes.

Pueden formularse preparaciones inyectables, por ejemplo, suspensiones inyectables estériles acuosas u oleaginosas según la técnica conocida usando agentes de dispersión o humectantes y agentes de suspensión adecuados. La preparación inyectable estéril también puede ser una disolución, suspensión o emulsión inyectable estéril en un diluyente o disolvente no tóxico aceptable por vía parenteral, por ejemplo, como una disolución en 1,3butanodiol. Entre los vehículos y disolventes aceptables que pueden emplearse se encuentran el agua, solución de Ringer, disolución isotónica de cloruro de sodio y según la U.S.P. Además, se emplean de manera convencional aceites fijos estériles como disolvente o medio de suspensión. Para este fin, puede emplearse cualquier aceite fijo insípido incluyendo mono o diglicéridos sintéticos. Además, se usan ácidos grasos tales como ácido oleico en la

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preparación de productos inyectables.

Pueden esterilizarse las formulaciones inyectables, por ejemplo, mediante filtración a través de un filtro de retención de bacterias, esterilización terminal (con calor) o esterilización mediante radiación ionizante o mediante la incorporación de agentes de esterilización en forma de composiciones sólidas estériles que pueden disolverse o dispersarse en agua estéril u otro medio inyectable estéril antes de su uso.

Para prolongar el efecto de un compuesto de la presente invención, a menudo es deseable ralentizar la absorción del compuesto a partir de una inyección subcutánea o intramuscular. Esto puede lograrse mediante el uso de una suspensión líquida de material cristalino o amorfo con escasa solubilidad en agua. La tasa de absorción del compuesto depende entonces de su velocidad de disolución que puede depender, a su vez, del tamaño de cristal y forma cristalina. Alternativamente, se logra la absorción retardada de una forma de compuesto administrada por vía parenteral disolviendo o suspendiendo el compuesto en un vehículo de aceite. Se producen formas de depósito inyectables formando matrices microencapsuladas del compuesto en polímeros biodegradables tales como polilactida-poliglicolida. Dependiendo de la razón de compuesto con respecto a polímero y la naturaleza del polímero particular empleado, puede controlarse la tasa de liberación de compuesto. Los ejemplos de otros polímeros biodegradables incluyen poli(ortoésteres) y poli(anhídridos). También se preparan formulaciones de depósito inyectables atrapando el compuesto en liposomas o microemulsiones que son compatibles con los tejidos corporales.

Las composiciones para administración rectal o vaginal son preferiblemente supositorios que pueden prepararse mezclando los compuestos de esta invención con excipientes o portadores no irritantes adecuados tales como manteca de cacao, polietilenglicol o una cera para supositorios que son sólidos a la temperatura ambiental pero líquidos a la temperatura corporal y, por tanto, se funden en el recto o la cavidad vaginal y liberan el compuesto activo.

Las formas de dosificación sólidas para administración oral incluyen cápsulas, comprimidos, pastillas, polvos y gránulos. En tales formas de dosificación sólidas, el compuesto activo se mezcla con al menos un excipiente o portador inerte, farmacéuticamente aceptable tal como citrato de sodio o fosfato de dicalcio y/o a) cargas o expansores tales como almidones, lactosa, sacarosa, glucosa, manitol y ácido silícico, b) aglutinantes tales como, por ejemplo, carboximetilcelulosa, alginatos, gelatina, polivinilpirrolidinona, sacarosa y goma arábiga, c) humectantes tales como glicerol, d) agentes disgregantes tales como agar, carbonato de calcio, almidón de patata o tapioca, ácido algínico, determinados silicatos y carbonato de sodio, e) agentes retardantes de la disolución tales como parafina, f) aceleradores de la absorción tales como compuestos de amonio cuaternario, g) agentes humectantes tales como, por ejemplo, alcohol cetílico y monoestearato de glicerol, h) absorbentes tales como caolín y arcilla de bentonita, y i) lubricantes tales como talco, estearato de calcio, estearato de magnesio, polietilenglicoles sólidos, laurilsulfato de sodio, y mezclas de los mismos. En el caso de cápsulas, comprimidos y pastillas, la forma de dosificación también puede comprender agentes tamponantes.

También pueden emplearse composiciones sólidas de un tipo similar como cargas en cápsulas de gelatina blanda y dura usando excipientes tales como lactosa o azúcar de la leche así como polietilenglicoles de alto peso molecular y similares. Las formas de dosificación sólidas de comprimidos, grageas, cápsulas, pastillas y gránulos pueden prepararse con recubrimientos y cubiertas tales como recubrimientos entéricos y otros recubrimientos bien conocidos en la técnica de la formulación farmacéutica. Pueden contener opcionalmente agentes opacificantes y también puede presentar una composición que libera el/los principio(s) activo(s) únicamente, o preferentemente, en una determinada parte del tracto intestinal, opcionalmente, de manera retardada. Los ejemplos de composiciones de inclusión que pueden usarse incluyen ceras y sustancias poliméricas. También pueden emplearse composiciones sólidas de un tipo similar como cargas en cápsulas de gelatina blanda y dura usando excipientes tales como lactosa

o azúcar de la leche así como polietilenglicoles de alto peso molecular y similares. En algunas realizaciones, una composición sólida es una cápsula de gelatina dura llena de líquido o una dispersión sólida.

Los compuestos activos también pueden estar en forma microencapsulada con uno o más excipientes tal como se indicó anteriormente. Las formas de dosificación sólidas de comprimidos, grageas, cápsulas, pastillas y gránulos pueden prepararse con recubrimientos y cubiertas tales como recubrimientos entéricos, recubrimientos de control de la liberación y otros recubrimientos bien conocidos en la técnica de la formulación farmacéutica. En tales formas de dosificación sólidas, el compuesto activo puede mezclarse con al menos un diluyente inerte tal como sacarosa, lactosa o almidón. Tales formas de dosificación también pueden comprender, como es práctica habitual, sustancias adicionales distintas de diluyentes inertes, por ejemplo, lubricantes para la preparación de comprimidos y otros adyuvantes para la preparación de comprimidos tales como estearato de magnesio y celulosa microcristalina. En el caso de cápsulas, comprimidos y pastillas, las formas de dosificación también pueden comprender agentes tamponantes. Pueden contener opcionalmente agentes opacificantes y también pueden presentar una composición que libera el/los principio(s) activo(s) únicamente, o preferentemente, en una determinada parte del tracto intestinal, opcionalmente, de manera retardada. Los ejemplos de composiciones de inclusión que pueden usarse incluyen ceras y sustancias poliméricas.

Las formas de dosificación para administración tópica o transdérmica de un compuesto de esta invención incluyen pomadas, pastas, cremas, lociones, geles, polvos, disoluciones, pulverizaciones, inhalantes o parches. Se mezcla el

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componente activo en condiciones estériles con un portador farmacéuticamente aceptable y cualquier conservante o tampón necesario según pueda requerirse. También se contempla que una formulación oftálmica, gotas óticas y colirios están dentro del alcance de esta invención. Adicionalmente, la presente invención contempla el uso de parches transdérmicos, que tienen la ventaja añadida de proporcionar la administración controlada de un compuesto al organismo. Tales formas de dosificación pueden producirse disolviendo o dispensando el compuesto en el medio apropiado. También pueden usarse potenciadores de la absorción para aumentar el flujo del compuesto a través de la piel. Puede controlarse la tasa o bien proporcionando una membrana de control de la tasa o bien dispersando el compuesto en un gel o una matriz de polímero.

Según otra realización, la invención se refiere a un método de inhibición de la actividad de al menos un mutante de EGFR (por ejemplo, una mutación de deleción, una mutación activante, una mutación resistente, o una combinación de las mismas) en una muestra biológica que comprende la etapa de poner en contacto dicha muestra biológica con un compuesto de esta invención, o una composición que comprende dicho compuesto. En determinadas realizaciones, la invención se refiere a un método de inhibición irreversible de la actividad de al menos un mutante de EGFR (por ejemplo, una mutación de deleción, una mutación activante, o una combinación de las mismas) en una muestra biológica que comprende la etapa de poner en contacto dicha muestra biológica con un compuesto de esta invención, o una composición que comprende dicho compuesto.

En determinadas realizaciones, un compuesto proporcionado inhibe selectivamente en una muestra biológica (a) al menos una mutación activante, (b) T790M, y (c) inhibe poco a WT. En algunas realizaciones, la al menos una mutación activante es una mutación de deleción. En algunas realizaciones, la al menos una mutación activante es una mutación puntual. En algunas realizaciones, una mutación activante es delE746-A750. En algunas realizaciones, una mutación activante es L858R. En algunas realizaciones, una mutación activante es G719S.

El término “muestra biológica”, tal como se usa en el presente documento, incluye, sin limitación, cultivos celulares o extractos de los mismos; material de biopsia obtenido de un mamífero o extractos del mismo; y sangre, saliva, orina, heces, semen, lágrimas, u otros líquidos corporales o extractos de los mismos.

La inhibición de la actividad de al menos un mutante de EGFR (por ejemplo, una mutación de deleción, una mutación activante, una mutación resistente, o una combinación de las mismas) en una muestra biológica es útil para una variedad de fines que conoce un experto en la técnica. Los ejemplos de tales fines incluyen, pero no se limitan a, transfusión sanguínea, trasplante de órganos, almacenamiento de muestras biológicas y ensayos biológicos.

Otra realización de la presente invención se refiere a un método de inhibición de la actividad de al menos un mutante de EGFR (por ejemplo, una mutación de deleción, una mutación activante, una mutación resistente, o una combinación de las mismas) en un paciente que comprende la etapa de administrar a dicho paciente un compuesto de la presente invención, o una composición que comprende dicho compuesto. En determinadas realizaciones, la presente invención proporciona un método para inhibir (a) al menos una mutación activante, (b) T790M en un paciente, y (c) inhibe poco a WT, en el que dicho método comprende administrar al paciente un compuesto proporcionado, o una composición del mismo. En algunas realizaciones, la al menos una mutación activante es una mutación de deleción. En algunas realizaciones, la presente invención proporciona un método para inhibir al menos un mutante de EGFR en un paciente, en el que la al menos una mutación activante es una mutación puntual. En algunas realizaciones, la presente invención proporciona un método para inhibir al menos un mutante de EGFR en un paciente, en el que una mutación activante es delE746-A750. En algunas realizaciones, la presente invención proporciona un método para inhibir al menos un mutante de EGFR en un paciente, en el que una mutación activante es L858R. En algunas realizaciones, la presente invención proporciona un método para inhibir al menos un mutante de EGFR en un paciente, en el que una mutación activante es G719S.

Según otra realización, la invención se refiere a un método de inhibición de la actividad de al menos un mutante de EGFR (por ejemplo, una mutación de deleción, una mutación activante, una mutación resistente, o una combinación de las mismas) en un paciente que comprende la etapa de administrar a dicho paciente un compuesto de la presente invención, o una composición que comprende dicho compuesto. Según determinadas realizaciones, la invención se refiere a un método de inhibición irreversible de la actividad de al menos un mutante de EGFR (por ejemplo, una mutación de deleción, una mutación activante, una mutación resistente, o una combinación de las mismas) en un paciente que comprende la etapa de administrar a dicho paciente un compuesto de la presente invención, o una composición que comprende dicho compuesto. En determinadas realizaciones, la presente invención proporciona un método para inhibir de manera irreversible (a) al menos una mutación activante y (b) T790M en un paciente, y (c) inhibe poco a WT, en el que dicho método comprende administrar al paciente un compuesto proporcionado, o una composición del mismo. En algunas realizaciones, la al menos una mutación activante es una mutación de deleción. En algunas realizaciones, la al menos una mutación activante es una mutación puntual. En algunas realizaciones, la presente invención proporciona un método para inhibir de manera irreversible al menos un mutante de EGFR en un paciente, en el que una mutación activante es delE746-A750. En algunas realizaciones, la presente invención proporciona un método para inhibir de manera irreversible al menos un mutante de EGFR en un paciente, en el que una mutación activante es L858R. En algunas realizaciones, la presente invención proporciona un método para inhibir de manera irreversible al menos un mutante de EGFR en un paciente, en el que una mutación activante es G719S.

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simultáneamente, de manera secuencial o dentro de un periodo de tiempo entre sí normalmente en el plazo de cinco horas entre sí.

Tal como se usa en el presente documento, el término “combinación”, “combinado”, y términos relacionados se refieren a la administración simultánea o secuencial de agentes terapéuticos según esta invención. Por ejemplo, un compuesto de la presente invención puede administrarse con otro agente terapéutico simultáneamente o de manera secuencial en formas de dosificación unitarias independientes o juntos en una única forma de dosificación unitaria. Por consiguiente, la presente invención proporciona una única forma de dosificación unitaria que comprende un compuesto proporcionado, un agente terapéutico adicional, y un portador, adyuvante o vehículo farmacéuticamente aceptable.

La cantidad de ambos, un compuesto de la invención y agente terapéutico adicional (en aquellas composiciones que comprenden un agente terapéutico adicional tal como se describió anteriormente) que puede combinarse con los materiales portadores para producir una única forma de dosificación variará dependiendo del huésped tratado y el modo de administración particular. Preferiblemente, las composiciones de esta invención deben formularse de modo que pueda administrarse una dosificación de entre 0,01 -100 mg/kg de peso corporal/día de un compuesto de la invención.

En aquellas composiciones que comprenden un agente terapéutico adicional, ese agente terapéutico adicional y el compuesto de esta invención pueden actuar de manera sinérgica. Por tanto, la cantidad del agente terapéutico adicional en tales composiciones será menor de la requerida en una monoterapia que utiliza solo ese agente terapéutico. En tales composiciones puede administrarse una dosificación de entre 0,01 -1.000 g/kg de peso corporal/día del agente terapéutico adicional.

La cantidad de agente terapéutico adicional presente en las composiciones de esta invención no será mayor que la cantidad que se administraría normalmente en una composición que comprende ese agente terapéutico como único principio activo. Preferiblemente, la cantidad de agente terapéutico adicional en las composiciones dadas a conocer actualmente oscilará entre aproximadamente el 50% y el 100% de la cantidad normalmente presente en una composición que comprende ese agente como único agente terapéuticamente activo.

Los compuestos de esta invención, o composiciones farmacéuticas de los mismos, también pueden incorporarse en composiciones para recubrir un dispositivo médico implantable, tal como prótesis, válvulas artificiales, injertos vasculares, endoprótesis y catéteres. Se han usado endoprótesis vasculares, por ejemplo, para superar una reestenosis (nuevo estrechamiento de la pared del vaso después de una lesión). Sin embargo, los pacientes que usan endoprótesis u otros dispositivos implantables corren el riesgo de presentar la formación de coágulos o activación plaquetaria. Estos efectos no deseados pueden prevenirse o mitigarse mediante el recubrimiento previo del dispositivo con una composición farmacéuticamente aceptable que comprende un inhibidor de cinasa. Los dispositivos implantables recubiertos con un compuesto de esta invención son otra realización de la presente invención.

Ejemplos

Tal como se representa en los ejemplos a continuación, en determinadas realizaciones a modo de ejemplo, se preparan compuestos según los siguientes procedimientos generales. Se apreciará que, aunque los métodos generales representan la síntesis de determinados compuestos de la presente invención, pueden aplicarse los siguientes métodos generales, y otros métodos que conoce un experto habitual en la técnica, a todos los compuestos y subclases y especies de cada uno de estos compuestos, tal como se describe en el presente documento.

Los números de compuesto utilizados en los ejemplos a continuación corresponden a los números de compuesto expuestos en la tabla 1, anteriormente.

Los compuestos proporcionados se preparan según métodos que conoce un experto habitual en la técnica e incluyen métodos descritos en detalle en el documento US 20100029610, publicado el 4 de febrero de 2010, cuya totalidad se incorpora al presente documento como referencia.

EJEMPLO 1

Compuesto 1-11, N-(3-(5-(trifluorometil)-2-(2,3,4-trimetoxifenilamino)pirimidin-4-ilamino)fenil)acrilamida)

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Para obtener el ejemplo 1, se agitó una mezcla del producto intermedio 1 (16 mg) y 2,3,4-trimetoxianilina (20 ul) en dioxano (1,0 ml) con ácido trifluoroacético en cantidades catalíticas durante la noche a 50ºC. Se concentró el producto en bruto a presión reducida y se purificó usando HPLC (modificador de TFA) para dar el compuesto del título (17 mg) como sal de TFA. 1H-RMN (DMSO-d6, 400 MHz)  10,2 (S, 1 H), 8,94 (a, 1 H), 8,52 (a, 1 H), 8,34 (S, 1 H), 7,78 (S, 1 H), 7,49 (d, J = 7,8 Hz, 1 H), 7,29 (m, 2 H), 7,14 (a, 1 H), 6,43 (dd, J = 10,1, 16,8 Hz, 1 H) 6,24 (dd, J = 1,8, 16,8 Hz, 1 H), 5,75 (dd, J = 1,8, 10,1 Hz, 1 H), 3,74 (S, 3 H), 3,71 (S, 3 H), 3,70 (S, 3 H); masa calculada para C23H22F3N5O4: 489,2, hallada: 490,0 (M+H+).

EJEMPLO 2

Compuesto I-12, N-(3-(5-cloro-2-(2-metoxifenilamino)pirimidin-4-iloxi)fenil)acrilamida)

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10 Se preparó el compuesto I-12 mediante una ruta similar tal como se describe en el ejemplo 1 usando N-Boc-3aminofenol y 2,4,5-tricloropirimidina en la etapa 1 y 2-metoxianilina en la etapa 4. Masa calculada para C20H17ClN4O3: 396,1, hallada: 397,0 (M+H+). EJEMPLO 3 15 Compuesto I-10, N-(3-(5-(trifluorometil)-2-(2,3,4-trimetoxifenilamino)pirimidin-4-iloxi)fenil)acrilamida)

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Se preparó el compuesto I-10 mediante una ruta similar tal como se describe en el ejemplo 1 usando N-Boc-3aminofenol y 2,4-dicloro-5-trifluorometilpirimidina en la etapa 1 y 2,3,4-trimetoxianilina en la etapa 4. 1H-RMN (DMSO-d6, 400 MHz)  10,32 (S, 1 H), 9,08 (S, 1 H), 8,58 (S, 1 H), 7,65 (S, 1 H), 7,52 (d, J = 8,4 Hz, 1 H), 7,4 (t, J =

20 8,0 Hz, 1 H), 7,03 (m, 1 H), 6,97 (d, J = 7,6 Hz, 1 H), 6,43 (dd, J = 10,0, 16,8 Hz, 1 H), 6,27 (dd, J = 2,0, 16,8 Hz, 1 H), 5,78 (dd, J = 2,0, 10,0 Hz, 1 H), 3,74 (S, 3 H), 3,71 (S, 3 H), 3,70 (S, 3 H); masa calculada para C23H21F3N4O5: 490,1, hallada: 491,5 (M+H+).

EJEMPLO 4

Compuesto I-9, N-(3-(2-(2,4-dimetoxifenilamino)-5-(trifluorometil)pirimidin-4-iloxi)fenil)acrilamida)

imagen14

Se preparó el compuesto I-9 mediante una ruta similar tal como se describe en el ejemplo 1 usando N-Boc-3aminofenol y 2,4-dicloro-5-trifluorometilpirimidina en la etapa 1 y 2,4-dimetoxianilina en la etapa 4. 1H-RMN (DMSOd6, 400 MHz)  10,3 (S, 1 H), 8,92 (S, 1 H), 8,55 (a, 1 H), 7,64 (S, 1 H), 7,54 (d, J = 7,2 Hz, 1 H), 7,41 (a, 1 H), 7,20 (d, J = 8,4 Hz, 1 H), 6,96 (a, 1 H), 6,54 (a, 1 H), 6,43 (dd, J = 10,0, 17,2 Hz, 1 H), 6,27 (dd, J = 2,0, 17,2 Hz, 1 H), 5,79 (dd, J = 2,0, 10,0 Hz, 1 H), 3,71 (S, 6 H); masa calculada para C22H19F3N4O4: 460,1, hallada: 461,4 (M+H+).

EJEMPLO 5

Compuesto I-8, N-(3-(5-bromo-2-(2,3,4-trimetoxifenilamino)pirimidin-4-iloxi)fenil)acrilamida)

imagen15

10 Se preparó el compuesto I-8 mediante una ruta similar tal como se describe en el ejemplo 1 usando N-Boc-3aminofenol y 2,4-dicloro-5-bromopirimidina en la etapa 1 y 2,3,4-trimetoxianilina en la etapa 4. 1H-RMN (DMSO-d6, 400 MHz)  10,34 (S, 1 H), 8,45 (S, 1 H), 8,42 (S, 1 H), 7,63 (S, 1 H), 7,55 (d, J = 8,0 Hz, 1 H), 7,42 (t, J = 8,0 Hz, 1 H), 7,09 (d, J = 9,2 Hz, 1 H), 6,98 (dd, J = 1,2, 7,6 Hz, 1 H), 6,40-6,47 (m, 2 H), 6,26 (dd, J = 2,0, 17,2 Hz, 1 H), 5,78 (dd, J = 2,0, 10,0 Hz, 1 H), 3,72 (S, 3 H), 3,71 (s, 3 H), 3,70 (S, 3 H); masa calculada para C22H21BrN4O5: 500,1,

15 hallada: 501,2 (M+H+).

EJEMPLO 6

Compuesto I-13, N-(3-(5-bromo-2-(2,4-dimetoxifenilamino)pirimidin-4-iloxi)fenil)acrilamida)

imagen16

Se preparó el compuesto I-13 mediante una ruta similar tal como se describe en el ejemplo 1 usando N-Boc-320 aminofenol y 2,4-dicloro-5-bromopirimidina en la etapa 1 y 2,4-dimetoxianilina en la etapa 4. Masa calculada para C21H19BrN4O4: 470,1, hallada: 471,2 (M+H+).

EJEMPLO 7 Compuesto I-5, N-(3-(5-bromo-2-(2,3,4-trimetoxifenilamino)pirimidin-4-ilamino)fenil)acrilamida)

imagen17

Se preparó el compuesto I-5 mediante una ruta similar tal como se describe en el ejemplo 1 usando N-Boc-1,3

5 diaminobenceno y 2,4-dicloro-5-bromopirimidina en la etapa 1 y 2,3,4-trimetoxianilina en la etapa 4. 1H-RMN (DMSO-d6, 400 MHz)  10,15 (S, 1 H), 8,63 (S, 1 H), 8,17 (S, 1 H), 7,94 (S, 1 H), 7,89 (S, 1 H), 7,52 (d, J = 9,2 Hz, 1 H), 7,43 (m, 1 H), 7,24 (m, 2 H), 6,51 (m, 1 H), 6,44 (dd, J = 10,0, 17,2 Hz, 1 H), 6,26 (dd, J = 2,0, 17,2 Hz, 1 H), 5,76 (dd, J = 2,0, 10,0 Hz, 1 H), 3,77 (S, 3 H), 3,73 (S, 3 H), 3,72 (S, 3 H); masa calculada para C22H22BrN5O4: 499,1, hallada: 500,1 (M+H+).

10 EJEMPLO 8

Compuesto I-14, N-(3-(5-bromo-2-(2,3-dimetoxifenilamino)pirimidin-4-ilamino)fenil)acrilamida)

imagen18

Se preparó el compuesto I-14 mediante una ruta similar tal como se describe en el ejemplo 1 usando N-Boc-1,3diaminobenceno y 2,4-dicloro-5-bromopirimidina en la etapa 1 y 2,3-dimetoxianilina en la etapa 4. Masa calculada 15 para C21H20BrN5O3: 469,1, hallada: 470,3 (M+H+).

EJEMPLO 9

Compuesto I-15, N N-(3-(5-cloro-2-(2,4-dimetoxifenilamino)pirimidin-4-iloxi)fenil)acrilamida)

imagen19

Se preparó el compuesto I-15 mediante una ruta similar tal como se describe en el ejemplo 1 usando N-Boc-320 aminofenol y 2,4,5-tricloropirimidina en la etapa 1 y 2,4-dimetoxianilina en la etapa 4. Masa calculada para

imagen20

imagen21

EJEMPLO 15 Compuesto I-1, N-(3-(2-(2-metoxifenilamino)-5-(trifluorometil)pirimidin-4-ilamino)fenil)acrilamida)

imagen22

Se preparó el compuesto I-1 mediante ruta similar tal como se describe en el ejemplo 1 usando N-Boc-1,3

5 diaminobenceno y 2,4-dicloro-5-trifluorometilpirimidina en la etapa 1 y 2-metoxianilina en la etapa 4. 1H-RMN (DMSO-d6, 400 MHz)  10,2 (S, 1 H), 9,1 (S, 1 H), 8,41 (S, 1 H), 8,38 (S, 1 H), 7,8 (S, 1 H), 7,7 (d, J = 7,8 Hz, 1 H), 7,5 (d, J = 8,2 Hz, 1 H), 7,3 (t, J = 8,2 Hz, 1 H), 7,1 (d, J = 8,2 Hz, 1 H), 6,97 (S, 2 H), 6,62 (a, 1 H), 6,41 (dd, J = 10,1, 17,0 Hz, 1 H), 6,24 (d, J = 17,0 Hz, 1 H), 5,74 (d, J = 10,1 Hz, 1 H), 3,79 (S, 3 H); masa calculada para C21H18F3N5O2: 429,1, hallada: 430,0 (M+H+).

10 EJEMPLO 16

Compuesto I-18, N-(3-(5-cloro-2-(2-metoxifenilamino)pirimidin-4-ilamino)fenil)acrilamida)

imagen23

Se preparó el compuesto I-18 mediante ruta similar tal como se describe en el ejemplo 1 usando N-Boc-1,3diaminobenceno y 2,4,5-tricloropirimidina en la etapa 1 y 2-metoxianilina en la etapa 4. Masa calculada para 15 C20H18ClN5O2: 395,1, hallada: 396,1 (M+H+).

EJEMPLO 17

Compuesto I-19, N-(3-(5-fluoro-2-(2-metoxifenilamino)pirimidin-4-iloxi)fenil)acrilamida)

imagen24

Se preparó el compuesto I-19 mediante ruta similar tal como se describe en el ejemplo 1 usando N-Boc-320 aminofenol y 2,4-dicloro-5-fluoropirimidina en la etapa 1 y 2-metoxianilina en la etapa 4. Masa calculada para

C20H17FN4O3: 380,1, hallada: 381,4 (M+H+). EJEMPLO 18 Compuesto I-6, N-(3-(5-bromo-2-(2,3-dimetoxifenilamino)pirimidin-4-iloxi)fenil)acrilamida)

imagen25

5 Se preparó el compuesto I-6 mediante ruta similar tal como se describe en el ejemplo 1 usando N-Boc-3-aminofenol y 2,4-dicloro-5-bromopirimidina en la etapa 1 y 2,3-dimetoxianilina en la etapa 4. 1H-RMN (DMSO-d6, 400 MHz)  10,35 (S, 1 H), 8,53 (S, 1 H), 8,35 (S, 1 H), 7,69 (S, 1 H), 7,55 (m, 1 H), 7,46 (m, 1 H). 7,11 (dd, J = 6,4 Hz, 1 H), 6,96 (d, J = 7,2 Hz, 1 H), 6,64 (m, 2 H), 6,43 (dd, J = 10,0, 17,0 Hz, 1 H), 6,26 (dd, J = 2,0, 17,0 Hz, 1 H), 5,77 (dd, J = 2,0, 10,0 Hz, 1 H), 3,71 (S, 3 H), 3,65 (S, 3 H); masa calculada para C21H19BrN4O4: 470,1, hallada: 471,3 (M+H+).

10 EJEMPLO 19

Compuesto I-20, N-(3-(5-bromo-2-(2,4-dimetoxifenilamino)pirimidin-4-ilamino)fenil)acrilamida)

imagen26

Se preparó el compuesto I-20 mediante ruta similar tal como se describe en el ejemplo 1 usando N-Boc-1,3diaminobenceno y 2,4-dicloropirimidina en la etapa 1 y 2,4-dimetoxianilina en la etapa 4. Masa calculada para 15 C21H20BrN5O3: 469,1, hallada: 469,9 (M+H+).

EJEMPLO 20

Compuesto I-21, N-(3-(5-cloro-2-(2,4-dimetoxifenilamino)pirimidin-4-ilamino)fenil)acrilamida)

imagen27

Se preparó el compuesto I-21 mediante ruta similar tal como se describe en el ejemplo 1 usando N-Boc-1,3

diaminobenceno y 2,4,5-tricloropirimidina en la etapa 1 y 2,4-dimetoxianilina en la etapa 4. Masa calculada para C21H20ClN5O3: 425,1, hallada: 426,3 (M+H+). EJEMPLO 21 Compuesto I-22, N-(3-(5-bromo-2-(2-metoxifenilamino)pirimidin-4-ilamino)fenil)acrilamida)

imagen28

5 Se preparó el compuesto I-22 mediante ruta similar tal como se describe en el ejemplo 1 usando N-Boc-1,3diaminobenceno y 2,4-dicloro-5-bromopirimidina en la etapa 1 y 2-metoxianilina en la etapa 4. Masa calculada para C20H18BrN5O2: 439,1, hallada: 440,1 (M+H+). EJEMPLO 22 10 Compuesto I-23, N-(3-(2-(2,3-dimetoxifenilamino)-5-(trifluorometil)pirimidin-4-iloxi)fenil)acrilamida)

imagen29

Se preparó el compuesto I-23 mediante ruta similar tal como se describe en el ejemplo 1 usando N-Boc-3aminofenol y 2,4-dicloro-5-trifluorometilpirimidina en la etapa 1 y 2,3-dimetoxianilina en la etapa 4. Masa calculada para C22H19F3N4O4: 460,1, hallada: 461,1 (M+H+).

15 EJEMPLO 23

Compuesto I-17, N-(3-(5-cloro-2-(2,3-dimetoxifenilamino)pirimidin-4-iloxi)fenil)acrilamida

imagen30

Se preparó el compuesto I-17 mediante ruta similar tal como se describe en el ejemplo 1 usando N-Boc-3aminofenol y 2,4,5-tricloropirimidina en la etapa 1 y 2,3-dimetoxianilina en la etapa 4. Masa calculada para 20 C21H19ClN4O4: 426,9, hallada: 427,3 (M+H+).

5

10

15

20

25

30

Ejemplos biológicos

Se describen a continuación ensayos usados para medir la actividad biológica de los compuestos proporcionados como inhibidores selectivos de EGFR mutante en comparación con EGFR WT (y otras proteína cinasas).

EJEMPLO 24

Protocolo de ensayo Omnia para la evaluación de potencia frente a EGFR (WT) y enzimas activas de EGFR (T790M/L858R)

A continuación se describe el protocolo de ensayo bioquímico usando EGFR-WT y EGFR-T790M/L858R.

La mecánica de la plataforma de ensayo se describe de la mejor manera por el proveedor (Invitrogen, Carlsbad, CA) en su sitio web en la siguiente URL: www.invitrogen.com/content.cfm?pageid=11338 o www.invitrogen.com/site/us/en/home/Products-and-Services/Applications/Drug-Discovery/Target-and-LeadIdentification-and-Validation/KinaseBiology/KB-Misc/Biochemical-Assays/Omnia-Kinase-Assays.html.

En resumen, se prepararon disoluciones madre 10X de EGFR-WT (PV3872) de Invitrogen y EGFR-T790M/L858R (40350) de BPS Bioscience, San Diego, CA, ATP 1,13X (AS001A) y sustratos peptídicos conjugados de Tyr-Sox apropiados (KCZ1001) en tampón de reacción de cinasa 1X que consistía en Tris 20 mM, pH 7,5, MgCl2 5 mM, EGTA 1 mM, -glicerofosfato 5 mM, glicerol al 5% (disolución madre 10X, KB002A) y DTT 0,2 mM (DS001A). Se preincubaron 5 l de cada enzima en una placa de microtitulación de superficie sin unión, blanca de 384 pocillos de Corning (#3574) (Corning, NY) durante 30 min a 25ºC con un volumen de 0,5 l de DMSO al 50% y compuestos diluidos en serie preparados en DMSO al 50%. Se iniciaron las reacciones de cinasa con la adición de 45 l de la mezcla de sustratos peptídicos de ATP/Tyr-Sox y se monitorizaron cada 71 segundos durante 60 minutos a ex360/em485 en un lector de placas Synergy4 de BioTek (Winooski, VT). A la conclusión de cada ensayo, se examinaron curvas de progreso para cada pocillo para determinar la cinética de reacción lineal y la estadística de ajuste (R2, intervalo de confianza del 95%, suma absoluta de cuadrados). Se determinó la velocidad inicial (de 0 minutos a ∼30 minutos) de cada reacción a partir de la pendiente de una representación gráfica de las unidades relativas de fluorescencia frente al tiempo (minutos) y luego se representó gráficamente frente a la concentración de inhibidor para estimar la CI50 a partir de un modelo de pendiente variable de log[inhibidor] frente a la respuesta, en GraphPad Prism del software GraphPad (San Diego, CA).

[EGFR-WT] = 5 nM, [ATP] = 15 uM, [Y12-Sox] = 5 uM (ATP KMap ∼12 uM); y [EGFR-T790M/L858R] = 2,5 nM, [ATP] = 20 uM, [Y12-Sox] = 5 uM (ATP KMap ∼20 uM).

La tabla 3 muestra la actividad de compuestos seleccionados de esta invención en el ensayo de inhibición de EGFR descrito anteriormente. La tabla 3 muestra datos de EGFR mutante en comparación con EGFR WT y proporciona la razón de selectividad de WT con respecto a mutante para cada compuesto de prueba. Los números de compuesto corresponden a los números de compuesto en la tabla 1.

Tabla 3. Datos de inhibición bioquímica de EGFR (mutante y silvestre)

N.º de compuesto: EGFR WT CI50 (nM) EGFR (T790M/L858R) CI50 (nM) Razón WT/mutante

I-1: 100-300 1-10 >50

I-2: 100-300 1-10 >50

I-3: 10-30 <1 >40

I-4: 30-100 1-10 >30

I-5: 30-100 <1 >45

I-6: 300-1000 10-30 >45

I-7: 10-30 1-10 >25

I-8: 30-100 <1 >50

I-9: 100-300 1-10 >50

I-10: 30-100 <1 >50

I-11: 10-30 <1 >25

I-12: 300-1000 <1 >50

I-13: 30-100 1-10 >25

I-14: 300-1000 1-10 >50

I-15: 100-300 1-10 >50

I-16: 100-300 1-10 >50

I-17: 300-1000 10-100 >35

I-18: 300-1000 10-30 >30

I-19: 100-300 10-30 >10

I-20: 30-100 1-10 >45

5

10

15

20

25

30

35

I-21: 100-300 1-10 >50

I-22: 100-300 1-10 >50

I-23: >1000 10-30 >50

EJEMPLO 25

Cultivo celular y anticuerpos

Se obtuvieron células de carcinoma epidermoide humano A431, adenocarcinoma de NSCLC humano H1975 y de NSCLC humano HCC827 del Centro Americano de Cultivos Tipo (Manassas, VA). Se hicieron crecer las células A431 en DMEM (Invitrogen, Carlsbad, CA) complementado con FBS al 10% (HyClone, South Logan, UT) y penicilina-estreptomicina al 1% (P/S, Lonza, Walquersville, MD). Se hicieron crecer las células H1975 y HCC827 en RPMI 1640 completo (Invitrogen) complementado con FBS al 10% y P/S al 1%. Se mantuvieron todas las células y se propagaron como cultivos en monocapa a 37ºC en un incubador con el 5% de CO2 humidificado.

Se obtuvieron todos los anticuerpos primarios de Cell Signaling (Danvers, MA) y se usaron a 1:1000. Se usaron los anticuerpos secundarios a 1:10.000. Se obtuvo el anticuerpo IRDye 800CW de IgG de cabra anti-ratón de LiCor Biosciences (Lincoln, NE) y se obtuvo Alexa Fluor 680 de IgG de cabra anti-conejo de Invitrogen.

Inmunotransferencia

Se hicieron crecer las células en placas de 12 pocillos (Corning, Coring, NY) hasta el 90% de confluencia y luego se incubaron en medios con bajo contenido de suero (FBS al 0,1%) durante 16-18 h. Luego se trataron las células con compuesto de prueba 5, 1,25, 0,31, 0,078, 0,020 o 0,005 M en medios con bajo contenido de suero (FBS al 0,1%) durante 1 h. Entonces se estimularon las células A431 con EGF 50 ng/ml (Peprotech, Rocky Hill, NJ) durante 15 min. Después del tratamiento, se lavaron las monocapas celulares con PBS frío (Invitrogen) y se lisaron inmediatamente mediante rascado en 60 ul de tampón de extracción celular frío (Invitrogen) complementado con inhibidores de proteasas completos (Roche, Indianápolis, IN) e inhibidores de fosfatasas PhosphoSTOP (Roche).

Se determinaron las concentraciones proteicas del lisado mediante ensayo de BCA (Pierce, Rockford, IL) y se separaron 50 ug de cada lisado mediante SDS-PAGE en gradiente al 4-12% (Invitrogen), se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa (Biorad, Hercules, CA) y se examinaron con sonda con anticuerpos específicos. Se cuantificaron las señales de fosfo-proteína usando la obtención de imágenes por infrarrojos Odyssey (Li-Cor Biosciences).

Para evaluar la señalización de fosfo-EGFR, se examinaron con sonda transferencias con anticuerpos anti-fosfo-EGFR de conejo (Y1068) y anti-EGFR total de ratón. Se normalizó la señal de fosfo-EGFR con respecto a la expresión de EGFR total para cada muestra. Para evaluar la señalización de fosfo-proteína ribosómica S6, se examinaron con sonda transferencias con anticuerpo anti-fosfo-proteína ribosómica S6 de ratón y anti-proteína ribosómica S6 total de conejo. Se normalizaron las transferencias tal como se indicó anteriormente. Se indican los resultados como % del control de DMSO. Se ajustaron los datos normalizados usando un programa de análisis de curva sigmoidea (Graph Pad Prism versión 5) con pendiente de Hill variable para determinar los valores de CE50.

Los resultados de este experimento se representan en la figura 1 y la figura 2 y la tabla 4, en las que se muestra que los compuestos de prueba I-3 e I-7 son selectivos de mutante inhibiendo solo pEGFR y su diana posterior, la proteína ribosómica S6 en células H1975, mientras que no afecta en absoluto a WT-EGFR en células A431.

La tabla 4 muestra datos de EGFR mutante en células H1975 (doble mutación L858R/T790M) y HCC827 (delE746-A750 mutación) en comparación con EGFR WT (A431 células). Los números de compuesto citados en la tabla 4 corresponden a los números de compuesto en la tabla 1.

Tabla 4. Señalización de EGFR (mutante y silvestre) (1 h)

N.º de compuesto: EGFR WT CE50 (nM) H1975 CE50 (nM) Razón WT/mutante HCC827 CE50 (nM) Razón WT/mutante

I-1: >1000 10-100 >50 10-100 >50

I-2: >1000 10-100 >50 <10 >50

I-3: >1000 10-100 >50 10-100 >50

I-4: >1000 100-500 >20 - -

I-5: >1000 10-100 >50 - -

I-6: - 10-100 - - -

I-7: >1000 10-100 >50 - -

I-8: >1000 100-500 >5 500-1000 >1

I-9: >1000 10-100 >50 - -

I-10: >1000 10-100 >50 - -

I-11: >1000 10-100 >50 100-500 >5

I-13: >1000 100-500 >20 - -

I-14: - - - - -

I-15: >1000 100-500 >10 - -

I-16: >1000 100-500 >35 <10 >50

I-17: 17 - - - 500-1000

I-20: - 100-500 - - -

I-21: >1000 500-1000 >5 - -

I-22: >1000 100-500 >10 >1000 >1

I-23: >1000 >1000 >1 - -

EJEMPLO 26

Proliferación celular

Se sembraron en placa células en medios de crecimiento complementados con FBS al 5% y P/S al 1% a una densidad de 3.000 células por pocillo en placas de cultivo tisular de 96 pocillos (Corning). Se permitió que

5 sedimentasen las células durante 4 h y luego se trataron con compuesto de prueba 5, 1,25, 0,31, 0,078, 0,020 ó 0,005 M durante 72 h. Se determinó la viabilidad celular mediante CellTiter Glo (Promega, Madison, WI) y se convirtieron los resultados a números de células usando una curva patrón. Se determinaron valores de inhibición del crecimiento (GI50) mediante Graph Pad Prism.

El resultado de este experimento se representa en la tabla 5, en la que se muestra la inhibición selectiva de mutante

10 en células H1975 (doble mutación L858R/T790M) y HCC827 (mutación de deleción delE746-A750) pero no en células A431 con WT-EGFR.

Tabla 5. Proliferación celular de EGFR (mutante y silvestre)

N.º de compuesto: EGFR WT GI50 (nM) H1975 GI50 (nM) Razón WT/mutante HCC827 GI50 (nM) Razón WT/mutante

I-1: >1000 100-500 >10 10-100 >20

I-2: >1000 >1000 >1 100-500 >15

I-3: >1000 100-500 >5 10-100 >50

I-4: >1000 100-500 >20 100-500 >20

I-5: >1000 >1000 >1 100-500 >20

I-6: >1000 500-1000 >1 500-1000 >1

I-7: >1000 100-500 >10 100-500 >15

I-8: 8 >1000 >1000 >1 100-500

I-9: >1000 100-500 >10 100-500 >25

I-10: >1000 100-500 >10 100-500 >10

I-11: >1000 100-500 >10 10-100 >40

I-12: >1000 >1000 >1 500-1000 >5

I-13: >1000 500-1000 >1 100-500 >20

I-15: >1000 >1000 >1 100-500 >25

I-16: >1000 100-500 >35 <10 >50

I-18: >1000 >1000 >1 500-1000 >5

I-19: >1000 >1000 >1 100-500 >10

I-20: >1000 >1000 >1 100-500 >10

I-21: >1000 >1000 >1 500-1000 >5

I-22: >1000 500-1000 >1 500-1000 >5

I-23: >1000 >1000 >1 >1000 >1

EJEMPLO 27

Experimento de lavado en células H1975 que contienen deleción de EGFR/mutación T790M

15 Se sembraron en placa células en medios de crecimiento complementados con 10% FBS y P/S al 1% a una densidad de 2,0 x 10 5 células por pocillo en placas de cultivo tisular de 12 pocillos. Se permitió que sedimentasen las células durante 4 h y luego se mantuvieron en medios con bajo contenido de suero (FBS al 0,1%) durante la noche.

A la mañana siguiente, se retiraron los medios y se trataron las células con compuesto de prueba 500 nM en medios

20 con bajo contenido de suero durante 1 h. Se lavaron las células para que careciesen de compuesto 2X con PBS (Invitrogen). Se lisó inmediatamente un conjunto de células tal como se indicó anteriormente en el punto de tiempo de 0 h. Se incubaron las células restantes con medio de crecimiento RPMI-1640 completo (FBS al 10%) durante 1, 3, 6 y 24 h. Durante la primera hora, se lavaron las células 2 veces con PBS cada 30 min. Se recogieron los controles de DMSO (al 0,5%) en los puntos de tiempo de 0, 3, 6 y 24 h.

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Claims

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