CN102311438A - 喹唑啉化合物 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一类喹唑啉化合物。具体地，本发明提供了一类具有抑制EGFR过度表达和/或活性过高的喹唑啉化合物。本发明还提供了含有所述喹唑啉化合物的药物组合物及其在治疗癌症方面的应用。

Description

喹唑啉化合物

技术领域

本发明涉及药物领域，更具体地，本发明涉及一类具有抑制EGFR过度表达和/或活性过高的喹唑啉化合物及其应用。背景技术

表皮生长因子(Epidermal Growth Factor，EGF)与表皮生长因子受体(Epidermal Growth Factor Receptor，EGFR)结合可以激活酪氨酸激酶的活性，并因此激活导致细胞增殖的反应。EGFR的过度表达和活性增强可以最终导致不可控的细胞分裂，这也是肿瘤发生的前兆。因此，能够抑制EGFR过度表达和活性过高的化合物可用来作为治疗肿瘤的候选化合物。发明内容

本发明提供了选自下列化合物的至少一种化合物和/或其至少一种药学上可接受的盐，(3aR，6aR)-N-(4-(1-(3-氟苄基)-1H-吲唑-5-氨基)-7-甲氧基喹唑啉-6-取代)-1-甲基六氢吡咯[3，4-b]并吡咯-5(1H)-甲酰胺；(3aS，6aS)-N-(4-(1-(3-氟苄基)-1H-吲唑-5-氨基)-7-甲氧基喹唑啉-6-取代)-1-甲基六氢吡咯[3，4-b]并吡咯-5(1H)-甲酰胺；(3aR，6aR)-N-(4-(3-乙炔苯氨基)-7-甲氧基喹唑啉-6-取代)-1-甲基六氢吡咯[3，4-b]并吡咯-5(1H)-甲酰胺；(3aS，6aS)-N-(4-(3-氯-4-(3-氟苄氧基)苯氨基)-7-甲氧基喹唑啉-6-取代)-1-甲基六氢吡咯[3，4-b]并吡咯-5(1H)-甲酰胺；(3aR，6aR)-N-(4-(3-氯-4-(3-氟苄氧基)苯氨基)-7-甲氧基喹唑啉-6-取代)-1-甲基六氢吡咯[3，4-b]并吡咯-5(1H)-甲酰胺；(3aS，6aS)-N-(4-(3-氯-4-(3-氟苄氧基)苯氨基)喹唑啉-6-取代)-1-甲基六氢吡咯[3，4-b]并吡咯-5(1H)-甲酰胺；和(3aR，6aR)-N-(4-(3-氯-4-(3-氟苄氧基)苯氨基)喹唑啉-6-取代)-1-甲基六氢吡咯[3，4-b]并吡咯-5(1H)-甲酰胺。

本发明还提供了一种药物组合物，包括至少一种药学上可接受的载体和至少一种所述化合物和/或至少一种药学上可接受的盐。

本发明还提供了一种用于治疗对于抑制EGFR过度表达和/或活性过高有效的肿瘤的药物(组合物)，包括有效量的所述的至少一种化合物和/或至少一种药学上可接受的盐。

本发明进一步提供了一种用于抑制EGFR过度表达和/或活性过高的药物(组合物)，包括有效量的所述的至少一种化合物和/或至少一种药学上可接受的盐。

本发明进一步提供了上述化合物和/或其药学上可接受的盐的用途，它们被用于制备治疗癌症的药物。

在另一优选例中，所述的癌症是与EGFR的过度表达和/或活性过高有关的癌症。更佳地，所述的癌症选自下组：肺癌、头颈癌、结肠癌、咽癌、表皮鳞癌和胰腺癌。

本发明进一步提供了上述化合物和/或其药学上可接受的盐的用途，它们被用于制备抑制EGFR的过度表达和/或活性过高的抑制剂。具体实施方式

本发明的说明书中用到的下列词汇、短语和符号，除非在它们所应用的上下文中显示有不同的含义，其含义通常是如下所阐述的。下面的缩写和术语含有如下指定的含义。

所述化合物，包括但不限于，它们的光学异构体、外消旋体，及其他混合物。在这些情况下，单一对映体或非对映体，例如具有光学活性的结构，可通过不对称合成或由外消旋混合物或非对映体混合物拆分得到。对于消旋混合物或非对映体混合物的拆分，可以用传统的方法分离，例如使用拆分试剂结晶；也可以用色谱法分离，例如手性高效液相色谱(HPLC)柱。

本文所述化合物存在各种互变异构体，术语“化合物”包括该化合物的所有互变异构形式。这里化合物也包括其不同的晶体形式，包含多晶和包合物。同样，术语“盐”也包括了该化合物的所有异构体、消旋体、其他混合物、Z-和E-型、互变异构体和晶体形式。

术语“药学上可接受的盐”包括但不限于与无机酸形成的盐，如盐酸盐、磷酸盐、二磷酸盐、氢溴酸盐、硫酸盐、亚磺酸盐、硝酸盐、及其类似盐；也包括与有机酸形成的盐，如苹果酸盐、马来酸盐、富马酸盐、酒石酸盐、琥珀酸盐、柠檬酸盐、醋酸盐、乳酸盐、磺酸盐、对甲苯磺酸盐、2-羟乙基磺酸盐、苯甲酸盐、水杨酸盐、硬脂酸盐和链烷酸盐如醋酸盐，HOOC-(CH2)n-COOH其中n是0-4的盐，及其类似盐。类似地，药学上可接受的阳离子包括但不限于钠、钾、钙、铝、锂和铵。

此外，如果所述的化合物是一种与酸形成的盐，其游离碱可以通过碱化该盐溶液获得。相反地，如果化合物是游离碱，则其盐特别是药学上可接受的盐可以通过由碱制酸的常规程序制得，即将游离碱溶于合适的有机溶剂后用酸处理。本领域一般技术人员可识别各种可能用来制备无毒的药学上可接受的盐的合成方法。

“溶剂化物”如“水合物”，是由溶剂和化合物互相作用形成。术语“化合物”，应该包括了化合物的溶剂化物(包括化合物的水合物)。同样，“盐”也包括了盐的溶剂化物(如盐的水合物)。合适的溶剂化物是药学上可接受的，例如水合物，它包括了单水合物和半水合物。

“螯合物”，是由化合物与金属离子在两个(或更多的)点配位而成。术语“化合物”应该包括化合物的螯合物。同样，“盐”也包括盐的螯合物。

“非共价复合物”是由一个化合物和另一分子通过非共价键相互作用形成的。例如，复合物可以通过范德华力、氢键和静电相互作用(也称为离子键)形成。这些非共价复合物也包含在术语“化合物”的概念中。

术语“活性成分”表示一种具有生物活性的化学物质。在一些方案中，“活性成分”是一种具有医药效用的化学物质。

“处理”、“治疗”或“减缓”指的是给予一患有一种疾病、具有一种疾病的症状、或有易患一种疾病体质的个体所述的至少一种化合物和/或至少一种药学上可接受的盐，用以治愈、治疗、缓和、抒解、改变、医治、改善、改良或是影响该疾病、该疾病的症状、或易患该疾病的体质。该疾病可以是，比如癌症。

术语“抑制”指的是一种生物活动或生物过程的基础活性的降低。“抑制EGFR的过度表达和/或活性过高”指的是相对于在没有所述至少一种化合物和/或至少一种药学上可接受的盐时EGFR的活性，由所述至少一种化合物和/或至少一种药学上可接受的盐的存在直接或间接的作用导致EGFR的表达和/或活性降低。活性的降低可以是所述的至少一种化合物和/或至少一种药学上可接受的盐与EGFR直接的相互作用引起的，或者是由于所述至少一种化合物和/或至少一种药学上可接受的盐与其他一种或多种因子的相互作用进而最终影响了EGFR的活性引起的。例如，所述的至少一种化合物和/或至少一种药学上可接受的盐的存在，可通过直接与EGFR结合而降低其活性，可通过直接或间接地影响其它因素来降低EGFR活性，或通过直接或间接得降低细胞或器官中EGFR的数量，来降低EGFR的活性。

术语”有效量”指的是，所述至少一种化合物和/或至少一种药学上可接受的盐对于能有效“治疗”个体的一种疾病或不适的用量。如果是癌症时，有效量可引起前面定义“处理”、“治疗”和“减缓”中所述个体任何一种可见的或可检测的变化。例如，有效量能减少癌症或肿瘤细胞的数目；缩小肿瘤的大小；抑制或阻止肿瘤细胞向周边器官的侵入，例如，肿瘤蔓延入软组织或骨骼中；抑制或阻止肿瘤的转移；抑制或阻止肿瘤的生长；一定程度上减轻一种或多种与癌症相关的症状；减少发病率和死亡率；提高生活质量；或者是上述效果的结合。有效量可以是通过抑制EGFR活性来减少疾病症状的用量。对于癌症治疗，体内实验的效果可以通过评估如存活期、疾病进展时间(Time to DiseaseProgression，TTP)、反应率(Response Rates，RR)、持续反应期和/或生活质量来测量。专业人员已经意识到，有效量可以随着给药的途径、赋形剂的剂量、以及与其他药物的合用而变化。

术语“有效量”还可指得是所述至少一种化合物和/或其至少一种药学上可接受的盐对抑制EGFR的过度表达和/或活性过高有效的剂量。

本发明的一种或几种优选方式将在下面列出。

本发明提供了选自下列化合物中的至少一种化合物，和/或其至少一种药学上可接受的盐，(3aR，6aR)-N-(4-(1-(3-氟苄基)-1H-吲唑-5-氨基)-7-甲氧基喹唑啉-6-取代)-1-甲基六氢吡咯[3，4-b]并吡咯-5(1H)-甲酰胺；(3aS，6aS)-N-(4-(1-(3-氟苄基)-1H-吲唑-5-氨基)-7-甲氧基喹唑啉-6-取代)-1-甲基六氢吡咯[3，4-b]并吡咯-5(1H)-甲酰胺；(3aR，6aR)-N-(4-(3-乙炔苯氨基)-7-甲氧基喹唑啉-6-取代)-1-甲基六氢吡咯[3，4-b]并吡咯-5(1H)-甲酰胺；(3aS，6aS)-N-(4-(3-氯-4-(3-氟苄氧基)苯氨基)-7-甲氧基喹唑啉-6-取代)-1-甲基六氢吡咯[3，4-b]并吡咯-5(1H)-甲酰胺；(3aR，6aR)-N-(4-(3-氯-4-(3-氟苄氧基)苯氨基)-7-甲氧基喹唑啉-6-取代)-1-甲基六氢吡咯[3，4-b]并吡咯-5(1H)-甲酰胺；(3aS，6aS)-N-(4-(3-氯-4-(3-氟苄氧基)苯氨基)喹唑啉-6-取代)-1-甲基六氢吡咯[3，4-b]并吡咯-5(1H)-甲酰胺；和(3aR，6aR)-N-(4-(3-氯-4-(3-氟苄氧基)苯氨基)喹唑啉-6-取代)-1-甲基六氢吡咯[3，4-b]并吡咯-5(1H)-甲酰胺。

本发明所述的喹唑啉化合物和/或其药学可接受的盐都可以用商业上可获得的原料、通过已知的方法合成得到。具体的合成步骤可在本申请的实施例部分详细说明。

对目标喹唑啉化合物的制备有帮助的合成化学改造技术是众所周知的，如R.Larock，Comprehensive Organic Transforma tions，VCH Publishers(1989)；T.W.Greene和P.G.M.Wuts，Protective Groups in OrganicSynthesis，3^rd Ed.，John Wiley and Sons(1999)；L.Fieser和M.Fieser，Fieser and Fieser’s Reagen ts for Organic Synthesis，John Wiley and Sons(1994)；和L.Paquette编，Encyclopedia of Reagents for Organic Synthesis，John Wiley and Sons(1995)及其后续的版本中都有公开。

所述的至少一种化合物和/或至少一种药学上可接受的盐可以通过柱层析、高效液相色谱、结晶或其他适当的方法进行纯化。

所述的至少一种喹唑啉化合物和/或至少一种药学上可接受的盐，可以与EGFR作用和/或抑制EGFR的活性。

本发明还提供了一种组合物，包括至少一种药学上可接受的载体以及所述的至少一种化合物和/或至少一种药学上可接受的盐。

包括所述的至少一种化合物和/或至少一种药学上可接受的盐的组合物，可以口服、非肠道式、吸入剂喷雾、或是植入式贮器等方式给药。这里用到的术语“非肠道式”，指的是包括皮下、皮内、静脉、肌肉、关节内、动脉内、滑膜内、胸骨内、脊椎内、患处内、以及颅内注射或输注技术。

口服用的组合物可以是任何一种可接受的口服剂型，包括但不限于：片剂、胶囊、乳剂、以及水相悬浮剂、分散剂以及溶液。常用的片剂载体包括乳糖和玉米淀粉。片剂中也常加入如硬脂酸镁之类的润滑剂。以胶囊形式口服时，有效的稀释剂可包括乳糖以及干燥的玉米淀粉。当口服水相悬浮液或乳剂提供口服时，可用乳化剂或悬浮剂使活性成分悬浮或溶解于一油相中。若有需要，还可添加一定的甜味、香料、或色素。

无菌可注射组合物(如水状或油状悬浮液)可按照任何一种已知技术，使用适合的分散剂或润湿剂(如：Tween80)以及悬浮剂来完成制备。无菌可注射组合物也可制备成无菌的可注射溶液或悬浮液，溶于一无毒性的可用于非肠道式的稀释剂或溶剂中，例如，1，3-丁二醇溶液。在可接受的载体与溶剂中，可使用的是甘露糖醇、水、林格尔氏液、以及生理盐水。此外，无菌的低沸点油，如合成的单-或双-酸甘油酯，通常为溶剂或悬浮介质。脂肪酸，例如油酸以及其甘油脂衍生物，以及天然的药学可接受的油脂，例如橄榄油或蓖麻油，尤其是聚乙氧基化的形态，常用于制备可注射溶液。这些油溶液或悬浮液亦可含有一长链的醇类稀释剂、分散剂、或羧甲基纤维素、或其类似的分散剂。

一吸入剂组合物可依相关已知的药物配方技术而制得，且可制备于生理盐水中，再添加苯甲醇或其他合适的防腐剂、增加生物利用度之吸收促进剂、氟碳、以及/或本技术领域中其他已知之增溶剂或分散剂。

用于皮肤的组合物可配方为油脂、霜剂、乳液、软膏、以及类似的产品。用于组合物的合适载体可包括：植物或矿物油、白矿脂(一种白色软石蜡)、支链脂肪或油脂、动物脂肪、以及高分子量的醇类(大于12个碳)。较佳的载体可以为活性成分能溶解于其中者。此外，在添加增加颜色或香味成分之外，亦可依需要加入乳化剂、增溶剂、稀释剂、以及抗氧化剂。而外皮渗透促进剂也可添加于这些典型配方中。这类促进剂的例子可见于美国专利3,989,816和4,444,762。

霜剂配方可将矿物油、自体乳化之蜂蜡、以及水混合后之混合物，其中混合之活性成分系溶解于一小量的油脂中，例如杏仁油，再掺杂于其中。此类乳液的一范例是包括约40重量份的水、约20重量份的蜂蜡、约40重量份的矿物油、以及约1重量份的杏仁油。软膏可混合一活性成分溶于一植物油中(例如杏仁油)、以及温的软石蜡，并让混合物冷却而制备。这类软膏的一范例，是包括约30％重量百分比的杏仁油和约70％重量百分比的白软石蜡。

“药学上可接受的载体”，指的是能与组合物中的活性成分相容，甚至在一些优选方式中能稳定活性成分，而且不能对于欲治疗的个体有危害。例如，环糊精(能与所述至少一种化合物和/或至少一种药学上可接受的盐形成特定的、溶解性更强的复合物)之类的增溶剂，可作为医药用的载体来传送活性化合物。其他载体的例子包括胶态二氧化硅、硬脂酸镁、纤维素、十二烷基硫酸钠、以及色素如D&C黄色10号(D&C Yellow#10)。

合适的体外实验可用于早期评价所述至少一种化合物和/或至少一种药学上可接受的盐抑制EGFR活性的效果，其治疗癌症的效果可进一步通过体内实验检验。例如，所述化合物和/或药学上可接受的盐可给予有癌症的动物(如小鼠模型)，然后检测其治疗效果。根据上述结果，还可以决定其对动物(如，人)适合的剂量和给药方式。

本发明还提供了一种用于治疗对抑制EGFR的过度表达和/或活性过高有效的肿瘤的药物，所述的药物包括所述的有效量的至少一种化合物和/或至少一种药学上可接受的盐。

所述的至少一种化合物和/或至少一种药学上可接受的盐可用来达到一种有益的治疗或预防效果，例如，在患有癌症的个体中。这里所用的术语“癌症”指的是细胞紊乱，其特征为不可控或不可调的细胞增殖、细胞分化的减少、不恰当的侵入周围组织的能力、和/或在异常部位建立新的生长的能力。术语“癌症”，包括但不限于实体肿瘤和血液肿瘤。术语“癌症”包含皮肤、组织、器官、骨骼、软骨、血液和血管的疾病。术语“癌症”进一步包含原发癌症和转移性癌。

实体肿瘤的非限定性例子包括胰腺癌、膀胱癌、结肠直肠癌、乳腺癌(包括转移性乳腺癌)、前列腺癌(包括雄激素依赖的和非雄激素依赖的前列腺癌)、肾癌(包括转移性的肾细胞癌)、肝细胞癌、肺癌(包括非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)、细支气管肺泡癌(bronchioloalveolarcarcinoma(BAC))和肺腺癌)、卵巢癌(包括进展性表皮癌或进展性原发性腹膜癌)、宫颈癌、胃癌、食管癌、头颈癌(包括头颈部鳞状细胞癌)、皮肤癌(包括恶性黑色素瘤)、神经内分泌系统癌症(包括转移性神经内分泌瘤)、脑瘤(包括例如神经胶质瘤、间变性少突胶质细胞瘤、成人多形性胶质母细胞瘤)、骨癌、软组织肉瘤、和甲状腺癌。

血液肿瘤的非限定性例子包括急性髓细胞性白血病(acute myeloidleukemia(AML))、慢性髓细胞性白血病(chronic myelogenous leukemia(CML))(包括加速期的慢性髓细胞性白血病和急变期的慢性髓细胞性白血病(CML-BP))、急性淋巴细胞性白血病(acute lymphoblastic leukemia(ALL))、慢性淋巴细胞性白血病(chronic lymphocytic leukemia(CLL))、何杰金氏病(Hodgkin’s disease(HD))、非何杰金氏淋巴瘤(non-Hodgkin’s lymphoma(NHL))(包括滤泡性淋巴瘤和套细胞淋巴瘤)、B细胞淋巴瘤(B-cell lymphoma)、T细胞淋巴瘤(T-cell lymphoma)、多发性骨髓瘤(multiple myeloma(MM))、瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白症(Waldenstrom’s macroglobulinemia)、骨髓增生异常综合症(myelodysplastic syndromes(MDS))(包括难治性贫血(refractoryanemia(RA))、RAR型贫血(refractory anemia with ringed siderblasts(RARS))、过量芽细胞顽固性贫血(refractory anemia with excess blasts(RAEB))，和过量芽细胞顽固性贫血合并急性转化(RAEB intransformation(RAEB-T))、以及骨髓增生综合症。

在一些实施方案中，能够治疗的癌症的例子，包括但不限于，肺癌、头颈癌、结肠直肠癌、胰腺癌、结肠癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、胃癌、肾癌、肝癌、脑癌、骨癌和白血病。在一些实施方案中，能够治疗的癌症的例子，选自肺癌、头颈癌、结肠癌、咽癌、表皮鳞癌和胰腺癌。

在一些实施方案中，所述的至少一种化合物和/至少一种药学上可接受的盐，可与其他不同于所述的至少一种化合物和/至少一种药学上可接受的盐的治疗制剂联合用药。在一些实施方案中，其他的治疗制剂一种抗癌制剂。在一些实施方案中，其他制剂是一种具有被治疗的疾病或症状的病人通常服用的制剂。所述的至少一种化合物和/或至少一种药学上可接受的盐，可与其他的治疗制剂以单一制剂的形式服用，或以分开的制剂形式服用。当以分开的制剂形式服用时，其他的治疗制剂可以在所述至少一种化合物和/或至少一种药学上可接受的盐服用之前、同时或之后服用。

在一些实施方案中，所述的至少一种化合物和/至少一种药学上可接受的盐，可与其他抗癌症制剂联合用药。这里所用的术语“抗癌症制剂”指得是任何一种用于癌症患者治疗肿瘤的制剂。抗癌症制剂的非限定性例子包括：放疗制剂、免疫疗法制剂、DNA损伤的化疗制剂和干扰细胞复制的化疗制剂。

DNA损伤的化疗制剂的非限定性例子包括，局部异构酶I的抑制剂(如，依立替康(irinotecan)、托泊替康(topotecan)和喜树碱(camptothecin)以及他们的类似物、代谢物，以及阿霉素(doxorubicin))；局部异构酶Ⅱ抑制剂(如，依托泊苷(etoposide)、替尼泊苷(teniposide)、和道诺霉素(daunorubicin))；烷化剂(如，左旋溶肉瘤素(melphalan)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、白消安(busulfan)、三胺硫磷(thiotepa)、异环磷酰胺(ifosfamide)、亚硝基脲氮芥(carmustine)、环己亚硝脲(lomustine)、甲基环己亚硝脲(semustine)、链脲霉素(streptozocin)、氨烯咪胺(decarbazine)、甲氨蝶呤(methotrexate)、丝裂霉素C(mitomycin C)和环磷酰胺(cyclophosphamide))；DNA插入剂(如，顺铂(cisplatin)、奥沙利铂(oxaliplatin)和卡波铂(carboplatin))；DNA插入剂和自由基产生剂如博来霉素(bleomycin)；以及核苷模仿剂(如5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)、卡培他滨(capecitibine)、2，2-二氟脱氧胞嘧啶核苷(gemcitabine)、氟达拉滨(fludarabine)、阿糖胞苷(cytarabine)、，巯基嘌呤(mercaptopurine)、硫鸟嘌呤(thioguanine)、喷司他丁(pentostatin)和羟基脲(hydroxyurea))。

干扰细胞复制的化疗制剂包括：紫杉醇(paclitaxel)、紫杉萜(docetaxel)，及有关的类似物；长春新碱(vincristine)、长春灭瘟碱(vinblastin)，及有关的类似物；镇静剂(thalidomide)及有关的类似物(如：CC-5013和CC-4047)；蛋白酪氨酸激酶抑制剂(如，甲磺酸伊马替尼(imatinibmesylate)和吉非替尼(gefitinib))；蛋白酶体抑制剂(如，硼替佐米(bortezomib))；NF-κB抑制剂，包括lκB激酶抑制剂；与肿瘤中过度表达的蛋白结合，从而下调细胞复制的抗体，(如曲妥单抗(trastuzumab)、利妥昔单抗(rituximab)、西妥昔单抗(cetuximab)和贝伐单抗(bevacizuma))；以及其他的蛋白或酶抑制剂，已知这些蛋白或酶在肿瘤中会被调高、过度表达或激活，对这些蛋白或酶的抑制能够抑制细胞复制。

本发明还提供了一种用于抑制EGFR过度表达和/或活性过高的药物，包含有效量所述的至少一种化合物和/或至少一种药学上可接受的盐。具体实施方式

下述实施例应确定为纯粹地作为示例，而不应当是以任何方式对本发明的限制。

以下例子中使用到的缩写列表：AcOH    (acetic acid)乙酸CMC-Na  (carboxymethyl cellulose sodium)羧甲基纤维素钠DELFIA  (Dissociation-Enhanced Lanthanide Fluorescent Immunoassay)解离增强的镧系荧光免疫分析DMEM    (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium)DMEM培养基DMF     (N，N-Dimethylformamide)N，N-二甲基甲酰胺DMSO    (Dimethyl sulfoxide)二甲基亚砜DTT     (Dithiothreitol)二硫苏糖醇EDTA    (ethylenediaminetetraacetic acid)乙二胺四乙酸钠EtOAc   (ethyl acetate)乙酸乙酯FBS     (fetal bovine serum)胎牛血清h       (hour)小时mL      (milliliter(s))毫升min     (minute(s))分钟PBS     (phosphate buffered saline)磷酸缓冲液PE      (petroleum ether)石油醚PMSF    (phenylmethanesulfonylfluoride)苯甲基磺酰氯Py      (pyridine)嘧啶THF     (tetrahydrofuran)四氢呋喃Tris-Cl (hydroxymethylaminomethane hydrochloride)三羟甲基氨基甲烷盐酸盐

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。实施例1：(3aR，6aR)-N-(4-(1-(3-氟苄基)-1H-吲唑-5-氨基)-7-甲氧基喹唑啉-6-取代)-1-甲基六氢吡咯[3，4-b]并吡咯-5(1H)-甲酰胺

化合物1是通过如下反应路线合成的。

5-硝基-1氢-吲唑(1-a，5g，30.65mmol)，3-氟代苄溴(3.76mL，30.65mmol)和粉末状碳酸钾(4.66g，30.65mmol)溶于3mL二甲基甲酰胺中，于80℃搅拌3小时，再倒入100mL水中，抽滤出析出物并用硅胶柱分离纯化，洗脱剂为石油醚∶乙酸乙酯＝3∶1，得到1-b(5.3g，19.7mmol)。

将1-b(5.3g，19.7mmol)溶于20mL甲醇，在氮气保护下加入雷尼镍(0.53g，湿重)。反应液脱气后于氢气氛下还原，在室温下反应过夜。反应液过滤，滤液减压浓缩得到化合物1-c(4.65g，5.28mmol)。

2-氨基-4-氟苯甲酸(1-d，7.75g，50mmol)及乙酸甲脒(15.6g，150mmol)悬浮于乙醇中，搅拌回流过夜，再自然冷却至室温。抽滤出析出物并真空干燥，得化合物1-e(8.0g，48mmol)。

7-氟喹唑啉(1-e，8.0g，48mmol)溶于24mL浓硫酸中，冰浴使之降至0℃。于搅拌下慢慢滴入24mL硝酸，控制反应液温度不高于0℃。滴完后慢慢升温至100℃，并在此温度下回流三天。反应液自然冷却至室温，慢慢倒入冰水中，过滤收集析出物，再用醋酸重结晶，得到化合物1-f(3.25g，15.53mmol)。

氮气保护下，将金属钠(0.71g，31mmol)小心加入到100mL无水甲醇中并搅拌10分钟，得到甲醇钠的甲醇溶液。再将7-氟-6-硝基喹唑啉(1-f，3.25g，15.53mmol)加入上述溶液中，加热回流3小时。反应液自然冷却至室温后用稀盐酸(2N)酸化至pH＝3～4。减压除去大部分溶剂，于水中搅拌悬浮的剩余物，抽滤，真空干燥即得化合物1-g(3.17g，14.4mmol)。

DMF(1-g，1.23g，5.56mmol)溶于8mL氯化亚砜中，小心加入0.5mL二甲基甲酰胺，将反应液加热回流4小时。减压蒸干溶剂得化合物1-h(1.2g，5.0mmol).

4-氯-7-甲氧基-6-硝基喹唑啉(1-h，1.2g，5.02mmol)和1-(3-氟苄基)-5-氨基-1氢-吲唑(1-c，1.2g，4.98mmol)加入到40mL二氧六环中，加热回流3小时，反应液自然冷却至室温，抽滤分离出析出物，再用硅胶柱分离纯化得到黄色固体1-i(1.7g，3.88mmol)。

化合物1-i(1.5g，3.7mmol)溶于20mL甲醇中，氮气保护下加入雷尼镍(0.13g，湿重)。反应液脱气后于氢气氛下室温还原4小时。小心滤掉催化剂，滤液减压浓缩得到黄色固体1-j(1.36g，3.29mmol)。

化合物1-j(1.36g，3.29mmol)、吡啶(0.78g，9.86mmol)溶于3mL二甲基甲酰胺中，滴入氯甲酸苯酯(1.53g，9.86mmol)并于室温下搅拌1小时，过滤即得1-k(1.40g，2.63mmol)。

在3mL二甲基甲酰胺中加入化合物1-k(1.1g，2.2mmol)，吡啶(0.2g，2.6mmol)和(3aR，6aR)-1-甲基八氢吡咯[3，4-b]并吡咯-5(1H)(0.33g，2.6mmol)，于80℃搅拌1小时，再倒入冰水中，乙酸乙酯(3×40mL)萃取。乙酸乙酯萃取液用食盐水洗，再用无水硫酸钠干燥，滤掉干燥剂，减压蒸干得到粗产品。粗产品用硅胶柱分离纯化，洗脱剂为乙酸乙酯∶甲醇＝2∶1，得到化合物1(0.79g，1.4mmol)。MS(m/e)：566.7(M+1)⁺。实施例2：(3aS，6aS)-N-N-(4-(1-(3-氟苄基)-1H-吲唑-5-氨基)-7-甲氧基喹唑啉-6-取代)-1-甲基六氢吡咯[3，4-b]并吡咯-5(1H)-甲酰胺

化合物2是以(3aS，6aS)-1-甲基八氢吡咯[3，4-b]并吡咯-5(1H)为原料，根据实施例1相似的反应步骤制备得到。MS(m/e)：565.7(M+1)⁺。实施例3：(3aR，6aR)-N-(4-(3-乙炔苯氨基)-7-甲氧基喹唑啉-6-取代)-1-甲基六氢吡咯[3，4-b]并吡咯-5(1H)-甲酰胺

化合物3-a(40g，0.138mol，参照WO2010002845所述方法制备)、吡啶(40mL，0.495mol)和无水二甲基甲酰胺(22mL)溶于无水四氢呋喃(500mL)中，于-10℃滴加氯甲酸苯酯3-b(22mL，0.175mol)。滴加完毕，于室温继续搅拌反应12小时。抽滤出析出物，再将析出物搅拌悬浮于稀碳酸氢钠水溶液(500mL)中。再次抽滤，滤饼先后用水和乙酸乙酯洗涤，真空干燥后得化合物3-c(46g)。在30mL二氧六环(dioxane)中加入化合物3-c(1g，2.44mmol)和3-d(369mg，2.92mmol)并于70℃搅拌回流5小时，冷却至室温后抽滤出析出物，滤饼用少量乙酸乙酯洗涤、真空干燥即得化合物3(0.8g)。MS(m/e)：443.4(M+1)+。实施例4：(3aS，6aS)-N-(4-(3-氯-4-(3-氟苄氧基)苯氨基)-7-甲氧基喹唑啉-6-取代)-1-甲基六氢吡咯[3，4-b]并吡咯-5(1H)-甲酰胺

化合物4是根据实施例2的步骤制备得到的。MS(m/e)：576.9(M+1)⁺实施例5：(3aR，6aR)-N-(4-(3-氯-4-(3-氟苄氧基)苯氨基)-7-甲氧基喹唑啉-6-取代)-1-甲基六氢吡咯[3，4-b]并吡咯-5(1H)-甲酰胺

化合物5是根据实施例1的步骤制备得到的。MS(m/e)：576.7(M+1)⁺实施例6：(3aS，6aS)-N-(4-(3-氯-4-(3-氟苄氧基)苯氨基)喹唑啉-6-取代)-1-甲基六氢吡咯[3，4-b]并吡咯-5(1H)-甲酰胺

化合物6是根据实施例2的步骤制备得到的。MS(m/e)：546.8(M+1)⁺实施例7：(3aR，6aR)-N-(4-(3-氯-4-(3-氟苄氧基)苯氨基)喹唑啉-6-取代)-1-甲基六氢吡咯[3，4-b]并吡咯-5(1H)-甲酰胺

化合物7是根据实施例1的步骤制备得到的。MS(m/e)：546.8(M+1)⁺实施例8：抑制EGFR活性的测定1.试剂和溶液

细胞裂解液：50mM Tris-Cl/pH8.0，0.5M NaCl和0.2mM EDTA，0.1％Triton X-100，1μg/ml抑肽酶(Aprotinin)，0.75μg/ml亮抑肽酶(Leupeptin)，1μg/ml胃酶抑素(Pepstatin)，1mM DTT，500μM钒酸钠(Sodium Vanadate)，1mM PMSF。使用前加入蛋白酶抑制剂，置于冰上。●样品稀释液：20mM Tris-Cl/pH7.3，150mM NaCl，0.1％BSA，0.05％Tween-20。●1xPBS缓冲液：NaCl 0.137M，KCl 0.0027M，Na₂PO₄-12H₂O 0.01M，KH₂PO₄0.0015M，pH7.4。●洗涤缓冲液：含有0.05％Tween-20的PBS缓冲液。●封闭液：含有1％BSA的PBS缓冲液。2.细胞处理和裂解液制备

将A431细胞(可购自中科院上海生化细胞所细胞库)以2.5×10⁴/孔的密度种到96孔板中，于5％CO₂，37℃的细胞培养箱中过夜培养。●真空吸掉培养基，用200μL无血清DMEM培养基清洗细胞后加入90μL/孔无血清DMEM培养基，于5％CO₂，37℃的细胞培养箱中饥饿过夜。●将待测化合物以无血清DMEM培养基稀释至10，3.3，1.1，0.37，0.12，0.04，0.013，0.004μM，将10μL稀释后的化合物加入到90μL细胞培养体系中，DMSO终浓度为0.5％，于5％CO₂，37℃的细胞培养箱中培养1小时。以不加入待测化合物的10μL无血清DMEM培养基加入到90μL细胞培养体系中，DMSO终浓度为0.5％，其它处理或培养条件相同的处理组作为对照孔。●向药物处理孔和对照孔分别加入10μL 200ng/ml EGF(Biosource，PHG0064)，混合，培养45分钟。●吸掉培养基后加入100μL细胞裂解液，放于-80℃冰箱中过夜。3.DELFIA检测步骤

在DELFIA Yellow Plate(Perkin Elmer，AAAND-0001)中加入100μL/孔用PBS稀释至0.5μg/ml的抗-EGFR抗体(R&D，AF231)，25℃摇床包被过夜。●用200μL DELFIA洗涤缓冲液洗3次。●加入200μL封闭液，25℃摇床孵育1小时。●用200μL DELFIA洗涤缓冲液洗3次。●加入80μL样品稀释液和20μL细胞裂解液，25℃摇床孵育1小时。●加入100μL用DELFIA分析缓冲液(Perkin Elmer，1244-106)稀释至0.5μg/ml的Eu-PT66抗体(Perkin Elmer，AD0040)，25℃摇床孵育1小时。●用200μL DELFIA洗涤缓冲液洗3次。●加入100μL DELFIA enhancement(Perkin Elmer，4001-0010)，25℃摇床孵育30分钟。●在Victor³ Wallec 1420(Perkin Elmer)检测荧光信号(340nm激发光/620nm发射光)。4.数据分析

其中：●药物处理孔读值：表示受EGF和待测药物双重作用的细胞的荧光信号。●背景读值：表示未受任何刺激的细胞的荧光信号。●对照孔读值：表示只受EGF刺激的细胞的荧光信号。5.IC50计算：用XL-Fit 2.0软件获得。

结果显示，7个化合物均对EGFR的活性有抑制作用。与美国专利申请No.12/164,610中公开的一些化合物相比，所述的至少一些化合物和/或药学上可接受的盐在细胞水平的检测中对EGFR有更强的抑制作用。实施例9：人癌裸小鼠皮下移植瘤模型中的抗肿瘤作用研究1.材料与方法：

人肿瘤细胞株：Fadu(人头颈部肿瘤，咽癌细胞，ATCC#：HTB-43)，HCC827(人非小细胞肺癌，ATCC#：CRL-2868)，A431(人表皮鳞癌细胞，ATCC#：CRL-2592)细胞株均购自ATCC。FaDu细胞培养在含10％胎牛血清的EMEM培养基，A431和HCC827细胞培养在DMEM培养液中，37℃和5％CO₂培养箱中培养。

实验动物：实验动物Balb/c裸小鼠，6～8周龄，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司。饲养于屏障系统动物房，温度20～25℃，湿度40％～70％，每日光照/黑暗各12小时。动物分笼饲养，每笼4只，自由摄食饮水，饲料Co₆₀辐照灭菌，水为高压灭菌。

受试化合物混悬分散在灭菌的0.5％CMC-Na中，配制浓度为0.05～1mg/mL，然后4℃储存。

皮下肿瘤模型构建及抗肿瘤效果研究：将80％融合生长的肿瘤细胞用0.05％胰酶-EDTA消化约10分钟，1000rpm转速离心，收集细胞计数并用无血清培养基重悬细胞，调整肿瘤细胞悬液至适宜浓度。裸鼠适应检疫后用于肿瘤细胞接种。Fadu、A431和HCC827细胞分别接种于裸小鼠右侧腋下(FaDu或A431细胞，3×10⁶细胞/只动物，0.1mL/只；HCC827细胞，5×10⁶细胞/只动物，0.2mL/只)。

接种约2-3周，当肿瘤体积均值达到100-300mm³时动物进行随机数字分组，组别为溶媒对照组和受试化合物组(见表1.和表2.)。实验动物分组后，次日予以灌胃给药，共给药21天，给药体积为10ml/kg。每周测量肿瘤体积2-3次，肿瘤体积计算公式：肿瘤体积(mm³)＝短径²×长径/2；肿瘤生长抑制率(TGI％)计算公式：TGI(％)＝100-(T-T₀)/(C-C₀)×100。T₀代表受试化合物组首次测量时的肿瘤体积；T代表受试化合物组后续某次测量的肿瘤体积；C₀代表溶媒对照组首次测量时的肿瘤体积；C，代表溶媒对照组后续某次测量的肿瘤体积。实验过程中，对动物的体重和行为活动也进行相应的观察。表1在Fadu，A431裸小鼠皮下移植瘤的分组和给药方案

表2在HCC827裸小鼠皮下移植瘤的分组和给药方案

2.统计学分析：

肿瘤大小的数据以均值±标准差(Mean±SD)表示。采用单因素多水平方差分析，各用药组与模型组的比较采用Student’s t检验或秩和检验，计算p值，p＜0.05为两组间有显著性的统计学差异。3.结果：

在以上三个模型的实验中，某化合物能剂量依赖性地显著抑制肿瘤生长。另外，所有受试化合物组受试动物在实验过程中均未见体重降低现象。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (9)

1.选自下列化合物的至少一种化合物和/或其至少一种药学上可接受的盐，

(3aR，6aR)-N-(4-(1-(3-氟苄基)-1H-吲唑-5-氨基)-7-甲氧基喹唑啉-6-取代)-1-甲基六氢吡咯[3，4-b]并吡咯-5(1H)-甲酰胺；

(3aS，6aS)-N-(4-(1-(3-氟苄基)-1H-吲唑-5-氨基)-7-甲氧基喹唑啉-6-取代)-1-甲基六氢吡咯[3，4-b]并吡咯-5(1H)-甲酰胺；

(3aR，6aR)-N-(4-(3-乙炔苯氨基)-7-甲氧基喹唑啉-6-取代)-1-甲基六氢吡咯[3，4-b]并吡咯-5(1H)-甲酰胺；

(3aS，6aS)-N-(4-(3-氯-4-(3-氟苄氧基)苯氨基)-7-甲氧基喹唑啉-6-取代)-1-甲基六氢吡咯[3，4-b]并吡咯-5(1H)-甲酰胺；

(3aR，6aR)-N-(4-(3-氯-4-(3-氟苄氧基)苯氨基)-7-甲氧基喹唑啉-6-取代)-1-甲基六氢吡咯[3，4-b]并吡咯-5(1H)-甲酰胺；

(3aS，6aS)-N-(4-(3-氯-4-(3-氟苄氧基)苯氨基)喹唑啉-6-取代)-1-甲基六氢吡咯[3，4-b]并吡咯-5(1H)-甲酰胺；和

(3aR，6aR)-N-(4-(3-氯-4-(3-氟苄氧基)苯氨基)喹唑啉-6-取代)-1-甲基六氢吡咯[3，4-b]并吡咯-5(1H)-甲酰胺。

2.一种药物组合物，其特征在于，它包含至少一种药学上可接受的载体以及选自下列化合物的至少一种化合物和/或至少一种药学上可接受的盐，

(3aR，6aR)-N-(4-(1-(3-氟苄基)-1H-吲唑-5-氨基)-7-甲氧基喹唑啉-6-取代)-1-甲基六氢吡咯[3，4-b]并吡咯-5(1H)-甲酰胺；

(3aS，6aS)-N-(4-(1-(3-氟苄基)-1H-吲唑-5-氨基)-7-甲氧基喹唑啉-6-取代)-1-甲基六氢吡咯[3，4-b]并吡咯-5(1H)-甲酰胺；

(3aR，6aR)-N-(4-(3-乙炔苯氨基)-7-甲氧基喹唑啉-6-取代)-1-甲基六氢吡咯[3，4-b]并吡咯-5(1H)-甲酰胺；

(3aS，6aS)-N-(4-(3-氯-4-(3-氟苄氧基)苯氨基)-7-甲氧基喹唑啉-6-取代)-1-甲基六氢吡咯[3，4-b]并吡咯-5(1H)-甲酰胺；

(3aR，6aR)-N-(4-(3-氯-4-(3-氟苄氧基)苯氨基)-7-甲氧基喹唑啉-6-取代)-1-甲基六氢吡咯[3，4-b]并吡咯-5(1H)-甲酰胺；

(3aS，6aS)-N-(4-(3-氯-4-(3-氟苄氧基)苯氨基)喹唑啉-6-取代)-1-甲基六氢吡咯[3，4-b]并吡咯-5(1H)-甲酰胺；和

(3aR，6aR)-N-(4-(3-氯-4-(3-氟苄氧基)苯氨基)喹唑啉-6-取代)-1-甲基六氢吡咯[3，4-b]并吡咯-5(1H)-甲酰胺。

3.一种用于治疗对抑制EGFR的过度表达和/或活性过高有效的癌症的药物，其特征在于，包括有效量的选自下列化合物的至少一种化合物和/或其至少一种药学上可接受的盐，

(3aR，6aR)-N-(4-(1-(3-氟苄基)-1H-吲唑-5-氨基)-7-甲氧基喹唑啉-6-取代)-1-甲基六氢吡咯[3，4-b]并吡咯-5(1H)-甲酰胺；

(3aS，6aS)-N-(4-(1-(3-氟苄基)-1H-吲唑-5-氨基)-7-甲氧基喹唑啉-6-取代)-1-甲基六氢吡咯[3，4-b]并吡咯-5(1H)-甲酰胺；

(3aR，6aR)-N-(4-(3-乙炔苯氨基)-7-甲氧基喹唑啉-6-取代)-1-甲基六氢吡咯[3，4-b]并吡咯-5(1H)-甲酰胺；

(3aS，6aS)-N-(4-(3-氯-4-(3-氟苄氧基)苯氨基)-7-甲氧基喹唑啉-6-取代)-1-甲基六氢吡咯[3，4-b]并吡咯-5(1H)-甲酰胺；

(3aR，6aR)-N-(4-(3-氯-4-(3-氟苄氧基)苯氨基)-7-甲氧基喹唑啉-6-取代)-1-甲基六氢吡咯[3，4-b]并吡咯-5(1H)-甲酰胺；

(3aS，6aS)-N-(4-(3-氯-4-(3-氟苄氧基)苯氨基)喹唑啉-6-取代)-1-甲基六氢吡咯[3，4-b]并吡咯-5(1H)-甲酰胺；和

(3aR，6aR)-N-(4-(3-氯-4-(3-氟苄氧基)苯氨基)喹唑啉-6-取代)-1-甲基六氢吡咯[3，4-b]并吡咯-5(1H)-甲酰胺。

4.如权利要求3所述的药物，其特征在于，所述的肿瘤选自肺癌、头颈癌、结肠癌、咽癌、表皮鳞癌和胰腺癌。

5.如权利要求3所述的药物，其特征在于，进一步包括有效量的一种抗癌制剂，其中所述的抗癌制剂不同于权利要求1所述的至少一种化合物和/或其至少一种药学上可接受的盐。

6.一种用于抑制EGFR过度表达和/或活性过高的药物，其特征在于，包含有效量的权利要求1所述的至少一种化合物和/或其至少一种药学上可接受的盐。

7.一种权利要求1所述的化合物和/或其药学上可接受的盐的用途，其特征在于，用于制备治疗癌症的药物。

8.如权利要求7所述的用途，其特征在于，所述的癌症是与EGFR的过度表达和/或活性过高有关的癌症。

9.如权利要求7所述的用途，其特征在于，所述的癌症选自下组：肺癌、头颈癌、结肠癌、咽癌、表皮鳞癌和胰腺癌。