CN103910735B - 吡唑并嘧啶酮化合物以及衍生物、及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提出了吡唑并嘧啶酮化合物以及衍生物(式I所示化合物)、及其制备方法和应用，该化合物为式I所示化合物或式I所示化合物的药学上可接受的盐、结晶水合物或溶剂合物。利用该化合物作为AKT/PI3K抑制剂，能够用于药物靶向治疗癌症的相关疾病。在式I所示化合物中，R1、R2、R3、R4如说明书所定义。
Description
技术领域
本发明涉及医药领域，具体的，本发明涉及吡唑并嘧啶酮化合物以及衍生物、及其制备方法和应用，更具体的，涉及式I所示化合物或式I所示化合物的药学上可接受的盐、结晶水合物或溶剂合物、及其制备方法和在制备治疗癌症的药物中的用途，以及药物组合物。
背景技术
世卫组织最新数据预测，到2020年前，全球癌症发病率将增加50％，即每年将新增1500万癌症患者。不仅如此，癌症的死亡人数也在全球迅猛上升，2007年全球共有760万人死于癌症，2030年这个数字可能会增至1320万。根据中国卫生部肿瘤防治办公室提供的相关数据，恶性肿瘤(癌症)已成为我国第二大致死疾病(城镇居民第一大致死疾病)。数据称，我国男、女性恶性肿瘤新发病率分别为130.3～305.4/10万人和39.5～248.7/10万人，发病率逐年上升。据预测，到2020年，中国将有550万新发癌症病例，其中死亡人数将达到400万。目前全国约有425.6万左右的恶性肿瘤现有患者。另外，国内环境污染和食品安全也直接导致恶性肿瘤病例剧增。
恶性肿瘤的治疗是医学界长期以来一直致力于攻克的难题。常规的癌症药物治疗是化疗。化疗药物也被称作细胞毒性药物，它们进入癌症患者体内发挥作用时不分良莠，在攻击癌症细胞的同时，也会大量杀死机体的正常细胞，化疗药物的副作用虽然显而易见。近年来，有多种分子靶向抗癌药物在经过了大量的实验室研究、动物实验和临床实验后，已陆续得以批准使用。各种靶向抗癌药物各有优势，给癌症的治疗带来希望，但在实际应用中，科学家也发现它们各有缺陷。例如，抗体药物治疗实体瘤仍存在着一些难题，由于药物难以进入实体肿瘤内部，因此治疗大体积的实体肿瘤疗效不佳。另外，多数靶向药物单独应用效果不佳，需要与传统化疗药物联合使用，还有，已投放市场的靶向药物价格都十分昂贵，这是普通患者难以负担得起的。
在中国医院用药市场，临床用抗肿瘤药物和免疫调节剂的销售规模近几年来一直稳步增长。2008-2012年销售规模继续稳定增长，2012年销售总额达到了178.87亿元，相比2011年增长了19％。同时，由于目前已上市的抗肿瘤药物均存在一定程度的缺点，而疗效好、安全性高且价格经济的分子靶向治疗药物非常少。
PI3K-AKT-mTOR信息传导途径对细胞生长，分裂，生存，繁殖等至关重要。其活跃失控则导致细胞无规则繁殖而引发或增进癌变，例如血癌、大肠癌、乳腺癌、肝癌、肾癌等，因此是小分子抑制剂的较好作用靶位，可为癌症的靶向治疗提供机会。
磷脂酰肌醇3激酶(PI3K，Phosphoinositide-3kinase)是脂激酶家族成员，可通过磷脂酰肌醇的3位磷酸化产生磷脂酰肌醇三磷酸脂(PIP3)来调节细胞的代谢和生长，参与细胞增殖、分化、凋亡和葡萄糖转运等多种细胞功能的调节。PI3K可分为3类，其结构与功能各异。其中研究最广泛的为I类PI3K，此类PI3K为异源二聚体，由一个调节亚基和一个催化亚基组成。调节亚基含有SH2和SH3结构域，与含有相应结合位点的靶蛋白相作用。该亚基通常称为p85，参考于第一个被发现的亚型(isotype)。催化亚基有4种，即p110α，β，δ，γ，而δ仅限于白细胞，其余则广泛分布于各种细胞中。由调节亚基p85和催化亚基p110构成。PI3K活性的增加常与多种癌症相关。
AKT，亦称为蛋白激酶B(PKB)，是PI3K下游主要的效应物，其通过下游多种途径对靶蛋白进行磷酸化而发挥抗凋亡作用。AKT可分为3种亚型(AKT1、AKT2、AKT3或PKBα、PKBβ、PKBγ)，3种亚型的功能各异，但也有重叠。PI3K激活的结果是在质膜上产生第二信使PIP3，PIP3与细胞内含有Pleckstrin Homology(PH)结构域的信号蛋白AKT和PDK1(phosphoinositide dependent kinase-1)结合，使Akt从细胞质转移到细胞膜上.并在3一磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1(PDK1，phosphoinositide dependent kinase-1)的辅助下，通过使Akt蛋白上的苏氨酸磷酸化位点(Thr308)和丝氨酸磷酸化位点(Ser473)磷酸化而使其激活。激活后的Akt通过直接和间接两种途径激活其底物雷帕霉素靶体蛋白(mTOR)：直接磷酸化mTOR，或者通过失活结节性硬化复合物2(TSC2)从而维持Rheb的GTP结合态，然后增强mTOR的激活。肿瘤抑制基因PTEN(phosphatase and tensin homology deleted onchromosome10，第10号染色体磷酸酶和张力蛋白同源丢失性基因)编码的产物可以使PIP3在D3位去磷酸化生成PIP2，从而实现P13K/Akt信号通路的负性调节，抑制细胞增殖和促进细胞凋亡。
目前仍未有AKT/PI3K抑制剂成功上市，因此开发出更安全、高效的AKT/PI3K抑制剂的靶向抗肿瘤新药具有巨大的社会价值和经济效益，也是目前国内外各大药企的研究热点。
发明内容
本发明旨在至少在一定程度上解决上述技术问题之一或至少提供一种有用的商业选择。为此，本发明提出了一种能够有效用于作治疗或预防各种癌症或肿瘤疾病的靶向治疗药物。
本发明的一个目的在于提出一种化合物。根据本发明的实施例，所述化合物为通式I所示(通式I所示化合物，也称为式I所示化合物)吡唑并嘧啶酮化合物以及衍生物、或式I所示化合物药学上可接受的盐、结晶水合物或溶剂合物。
其中，R1、R2、R3和R4如本文中定义。
本发明的另一个目的是提供前面所述化合物的制备方法。
本发明的另一个目的是提供包括本发明的化合物的药物组合物，其中所述组合物进一步包含一种或多种可药用赋形剂和治疗有效量的至少一种本发明的化合物、或其药学上可接受的盐、或其结晶水合物、或其溶剂合物。
本发明的另一个目的是提供本发明的化合物在制备药物中的用途。根据本发明的实施例，所述药物作为AKT/PI3K抑制剂，用于制备治疗癌症的靶向药物。
本发明式I所示化合物的这些和其它目的、特点和优点在随后本专利公开的详细说明中披露。下面详细描述本发明：
在本发明的第一方面，本发明提供一种化合物。根据本发明的实施例，该化合物为式I所示化合物或式I所示化合物的药学上可接受的盐、结晶水合物或溶剂合物：
其中，
R1为选自CH3、C2H5、H、F、Cl、Br、CF3、CN、NO2、NH2、CH2COOH、OCH3、OC2H5、OH、NHSO2CH3、CH2CONH2和COCH3的任意一种；R2为选自取代或未取代的苯环，取代或未取代的含有0～4个杂原子的C2-C12的环状基团；R3为选自H、CH3、F、Cl、Br、CF3、CN、NO2、NH2、CH2COOH、OCH3、OC2H5、OH、NHSO2CH3、CH2CONH2、COCH3、苯基、苄基和巯基的任意一种；R4为选自取代或未取代的苯环，其中，苯环上的取代基为选自H、F、Cl、Br、CH3、C2H5、CF3、CN、NO2、NH2、CH2COOH、OCH3、OC2H5、OH、NHSO2CH3、CH2CONH2和COCH3的任意一种。
根据本发明的实施例，所述杂原子独立地为选自O、S和N的任意一种。根据本发明的实施例，所述环状基团为单环或稠环。根据本发明的实施例，所述环状基团中的环由3-12个环原子构成，并且所述3～12个环原子中的杂原子为选自N、O、及S(O)n的任意一种，其中n为0、1或2，其余环原子为C。根据本发明的实施例，所述环也可具有一个或多个双键。
根据本发明的实施例，R2选自下列之一：
进一步的，
在本发明的实施例中，R1为选自CH3、C2H5、CF3、CN、NO2、OCH3和COCH3的任意一种。
在本发明的实施例中，R2为选自取代或未取代的苯环，以及取代或未取代的含有0～4个杂原子的C2-C12的环状基团的任意一种。根据本发明的实施例，所述杂原子独立地为选自O、S和N的至少一种；所述环状基团为单环，所述环状基团中的环由3-12个环原子构成，并且所述环原子中的杂原子为选自N、O、及S(O)n的任意一种，其中n为0、1或2，其余环原子为C。根据本发明的实施例，所述环也可具有一个或多个双键。
根据本发明的实施例，R2选自下列之一：
在本发明的实施例中，R3为选自H、CH3、Cl、CF3、CH2COOH、OCH3、OC2H5、CH2CONH2、COCH3和苯基的任意一种。
在本发明的实施例中，R4为选自取代或未取代的苯环，其中，苯环上的取代基为选自H、F、Cl、CH3、CF3、OCH3和OH的至少一种。
根据本发明的实施例，R4为选自下列的任意一种：
更进一步的，
在本发明的实施例中，R1为CH3或CN。
在本发明的实施例中，R2为选自下列的任意一种：
在本发明的实施例中，R3为选自H、CH3、Cl、OCH3、CH2CONH2、COCH3和苯基的任意一种。
在本发明的实施例中，R4为选自下列的任意一种：
在本发明的实施例中，所述通式I所示化合物为：吡唑并嘧啶酮化合物以及衍生物、或药学上可接受的盐、结晶水合物或溶剂合物。
由此，根据本发明的实施例，优选地，本发明前面所述的化合物选自下列化合物的一种或其药学上可接受的盐、结晶水合物或溶剂合物：
本发明的发明人通过实验研究，惊奇地发现，上述化合物可作为AKT/PI3K抑制剂，可用作治疗或预防各种癌症或肿瘤疾病的靶向治疗药物。
在本发明中所使用的术语，“药学上可接受的盐”为通式I化合物与无机酸或有机酸反应形成的常规的无毒盐。例如，所述常规的无毒盐可通过通式I化合物与无机酸或有机酸反应制得，所述无机酸包括盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、胺基磺酸和磷酸等，以及所述有机酸包括柠檬酸、酒石酸、乳酸、丙酮酸、乙酸、苯磺酸、对甲苯磺酸、甲磺酸、萘磺酸、乙磺酸、萘二磺酸、马来酸、苹果酸、丙二酸、富马酸、琥珀酸、丙酸、草酸、三氟乙酸、硬酯酸、扑酸、羟基马来酸、苯乙酸、苯甲酸、水杨酸、谷氨酸、抗坏血酸、对胺基苯磺酸、2-乙酰氧基苯甲酸和羟乙磺酸等；或者通式I化合物与丙酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、富马酸、马来酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、天冬氨酸或谷氨酸形成酯后再与无机碱形成的钠盐、钾盐、钙盐、铝盐或铵盐；或者通式I化合物与有机碱形成的甲胺盐、乙胺盐或乙醇胺盐；或者通式I化合物与赖氨酸、精氨酸、鸟氨酸形成酯后再与盐酸、氢溴酸、氢氟酸、硫酸、硝酸、磷酸形成的对应的无机酸盐或与甲酸、乙酸、苦味酸、甲磺酸和乙磺酸形成的对应的有机酸盐。
在本发明的第二方面，本发明提出了一种制备前面所述的化合物(即式I所示化合物或式I所示化合物药学上可接受的盐、结晶水合物或溶剂合物)的方法。根据本发明的实施例，该方法包括以下步骤：
(1)使式1a所示化合物与式2a所示化合物进行接触，以便获得式3a所示化合物；
(2)使所述式3a所示化合物与铁(Fe)粉进行接触，以便获得式4a所示化合物；
(3)使所述式4a所示化合物与式5a所示化合物进行接触，以便获得式I所示化合物；
其中，R1、R2、R3以及R4为如前面中所定义的。
发明人发现，利用本发明的该方法能够快速有效地制备式I所示化合物或式I所示化合物药学上可接受的盐、结晶水合物或溶剂合物，且合成路线短、环境友好、目标产物的收率和纯度较高，原料易得、操作及后处理简单、适合工业化生产。
在本发明的一个实施例中，前面所述化合物的合成路线为：
下面对在本发明的实施例中所采用的制备前面所述化合物的一般方法进行描述：
(1)式3a所示化合物的制备
使式1a所示化合物与硝基丙二醛钠(式2a所示化合物)进行接触，以便获得式3a所示化合物。
具体地，在三口瓶中依次加入乙醇、硝基丙二醛钠(式2a所示化合物)、式1a所示化合物，将所得溶液搅拌回流8～24小时，经薄层色谱(TLC)点板测试反应完全(展开剂为CH2Cl2/MeOH＝10∶1(V/V))。反应毕，将混合物在真空下浓缩，得式3a所示化合物的粗品，为棕黄色油状液，将其用乙醇溶解，再用乙酸乙酯搅拌重结晶(控制温度在10～25℃，搅拌2小时)，固体经过滤干燥，即式3a所示化合物。
(2)式4a所示化合物的制备
使所述式3a所示化合物与铁(Fe)进行接触，以便获得式4a所示化合物。
具体地，在甲醇溶液中加入式3a所示化合物，然后加入铁、氯化铵的水溶液，将所得混合物搅拌加热至50℃～80℃，反应0.5～3小时。经薄层色谱(TLC)点板测试反应完全(展开剂为CH2Cl2/MeOH＝10∶1(V/V))。反应毕，将混合物过滤，滤液真空浓缩，即得式4a所示化合物。
(3)式I所示化合物的制备
使所述式4a所示化合物与式5a所示化合物进行接触，以便获得式I所示化合物。
具体地，在三口瓶中加入式4a所示化合物、二氯甲烷、式5a所示化合物，随后加入吡啶，将所得混合物在20℃～30℃下搅拌反应2～5小时。经薄层色谱(TLC)点板测试反应完全(展开剂为CH2Cl2/MeOH＝10∶1(V/V))。反应毕，将混合物浓缩，经硅胶柱层析纯化，得式I所示化合物，为白色固体。
在本发明的实施例中，所述通式I所示化合物为：吡唑并嘧啶酮化合物以及衍生物、或药学上可接受的盐、结晶水合物或溶剂合物。
根据本发明的实施例，优选式I所示化合物为式1所示化合物，式1所示化合物的合成路线为：
根据本发明的实施例，优选式I所示化合物为式17所示化合物，式17所示化合物的合成路线为：
根据本发明的实施例，优选式I所示化合物为式25所示化合物，式25所示化合物的合成路线为：
根据本发明的实施例，优选式I所示化合物为式39所示化合物，式39所示化合物的合成路线为：
根据本发明的实施例，优选式I所示化合物为式57所示化合物，式57所示化合物的合成路线为：
在本发明的第三方面，本发明提出了一种药物组合物，其包含前面所述的化合物。根据本发明的实施例，所述药物组合物可以进一步包括药学上可接受的赋形剂。该药用组合物还可以进一步包含气味剂、香味剂等常规添加剂。该药物制剂可用作肿瘤(或癌症)的靶向治疗药物，用于抗肿瘤靶向治疗药物的生产。
本发明所提供的药物组合物优选含有重量比为0.1％～90％的前面所述的化合物作为活性成份，优选的是，前面所述的化合物作为活性成分占药物组合物总重量的5％～80％，其余部分为药学可接受的载体和/或常规添加剂。
本发明所提供的化合物和药物组合物可以是多种形式，如片剂、胶囊、颗粒剂、分散片、粉剂、糖浆、溶液状、悬浮液、气雾剂，但不仅限于上述剂型。本发明还可以制成注射液、注射用粉针，适用于注射给药。这些注射液包括静脉注射液、肌肉注射液，但不仅限于上述剂型。
本发明的药物组合物的各种剂型可按照药学领域的常规制备方法制备。其制剂配方的单位计量中包含0.05mg～600mg的式I所示化合物，优选地，制剂配方的单位计量中包含1mg～400mg的式I所示化合物。本发明的化合物和药物组合物可对哺乳动物临床使用，包括人和动物，可以通过口、鼻、皮肤、肺或者胃肠道等的途径给药。不管采用何种服用方法，个人的最佳剂量应依据具体的治疗方案而定。通常情况下是从小剂量开始，逐渐增加剂量一直到找到最适合的剂量。最优选的给药途径为口服，最优选的剂型为胶囊。
在本发明的第四方面，本发明提出了前面所述的化合物在制备药物中的用途，所述药物作为AKT/PI3K抑制剂，能够用于治疗癌症。
根据本发明的实施例，所述癌症为选自晚期实体瘤、肺癌、肝癌、骨癌、胰腺癌、头和颈部癌、表皮或眼内黑色素瘤、子宫癌、卵巢癌、结直肠癌、肛区癌、胃癌、乳腺癌、输卵管癌、子宫内膜癌、宫颈癌、阴道癌、外阴癌、何杰金氏病、食道癌、小肠癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、前列腺癌、慢性或急性白血病、淋巴细胞性淋巴瘤、膀胱癌、肾细胞癌、肾盂癌、原发性中枢神经系统淋巴瘤、脊柱肿瘤、神经母细胞瘤、脑干胶质瘤和垂体腺瘤的至少一种。根据本发明的实施例，所述癌症疾病为选自肺癌、肝癌、急性髓细胞性白血病、慢性粒细胞白血病、前列腺癌和结肠癌的至少一种。
利用本发明所述化合物对处于对数生长期的肿瘤细胞：人结肠癌细胞株(LoVo)、人肝癌细胞株(HepG2)、人神经母细胞瘤细胞株(SH-SY5Y)、人乳腺癌细胞株(MCF-7)、人肺癌细胞株(A549)、人前列腺癌细胞株(DU145)、人单核细胞白血病细胞株(Thp-1)，均具有良好的抑制作用。可将本发明所述化合物用于制备治疗人乳腺癌、人肺癌、人肝癌、人结肠癌、以及前列腺癌、白血病的药物。
通过对本发明的化合物进行小鼠的急性毒性实验，数据表明本发明所示化合物的体内毒性较低。
对本发明化合物进行生物学PI3Kα、β、δ和γ试验，测试结果表明：本发明所述式1-式63所示的，共63个化合物，在PI3Kδ试验中发现pIC50至少为7或更大。发现至少式1、17、25、39和57的化合物的PI3Kδ的选择性为PI3Kα、β和/或γ的至少十倍。
对本发明化合物的PI3K的荧光偏振分析，通过测定本发明化合物的IC50值来鉴别PI3K的抑制剂，实验可以看出，该本发明所述化合物作为PI3K抑制剂，对乳腺、肺、肝、结肠的肿瘤细胞均具有很好的抑制作用，是良好的PI3K抑制剂，具有良好的靶向治疗作用。这也说明本发明的化合物在治疗肿瘤方面具有极其显著的疗效，在获得显著药效的同时具有毒副作用低的优势，获得了预料不到的技术效果。本发明所述化合物可用于制备成治疗癌症相关疾病的药物，例如乳腺癌、肺癌、肝癌、结肠癌。
药理实验表明，本发明所述化合物对多种肿瘤细胞的增殖具有抑制作用。不仅如此，该类化合物还具有毒性较小，对肿瘤细胞具有选择性的优势，是一种具有PI3K/AKT双重抑制功能的靶向抗肿瘤药物。同时，该类化合物易于合成，总产率较高。种种优势显示此类化合物具有成为肿瘤治疗药物的巨大潜力。本发明所述的吡唑并嘧啶酮化合物以及衍生物(式I所示化合物)，具有很好的抗癌应用前景，作为良好的新一代抗癌药物，可用于治疗癌症相关疾病，用于癌症治疗药物的生产，因而具良好的商业价值。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
具体实施方式
在以下的实施例中将进一步举例说明本发明。这些实施例仅用于说明本发明，但不以任何方式限制本发明。
本发明的实施例提供了式I所示化合物、或药学上可接受的盐、结晶水合物、或溶剂合物，式I所示化合物或式I所示化合物的药学上可接受的盐、结晶水合物、或溶剂合物的制备方法、药物组合物、以及式I所示化合物或式I所示化合物的药学上可接受的盐、结晶水合物、或溶剂合物在制备药物中的用途，本发明说明书中所用原料及试剂如无特殊说明，均为商业购买。
实施例1：式3a-1所示化合物的制备
在三口瓶中依次加入乙醇(1000mL)、式2a所示化合物(27.8克，0.2摩尔)、式1a-1所示化合物(21.1克，0.1摩尔)，将所得溶液搅拌回流12小时，经薄层色谱(TLC)点板测试反应完全(展开剂为CH2Cl2/MeOH＝10∶1(V/V))。反应毕，将混合物在真空下浓缩，得式3a所示化合物的粗品，为棕黄色油状液，将其用乙醇(100mL)溶解，再用乙酸乙酯(300mL)搅拌2小时，控制温度在10～15℃重结晶，过滤，固体经干燥，即得式3a-1所示化合物(12.4克，收率42.4％)。
实施例2：式3a-1所示化合物的制备
在三口瓶中依次加入乙醇(1000mL)、式2a所示化合物(16.7克，0.12摩尔)、式1a-1所示化合物(21.1克，0.1摩尔)，将所得溶液搅拌回流8小时，经薄层色谱(TLC)点板测试反应完全(展开剂为CH2Cl2/MeOH＝10∶1(V/V))。反应毕，将混合物在真空下浓缩，得式3a所示化合物的粗品，为棕黄色油状液，将其用乙醇(100mL)溶解，再用乙酸乙酯(300mL)搅拌2小时，控制温度在20～25℃重结晶，过滤，固体经干燥，即得式3a-1所示化合物(7.83克，收率26.8％)。
实施例3：式3a-1所示化合物的制备
在三口瓶中依次加入乙醇(1000mL)、式2a所示化合物(34.8克，0.25摩尔)、式1a-1所示化合物(21.1克，0.1摩尔)，将所得溶液搅拌回流24小时，经薄层色谱(TLC)点板测试反应完全(展开剂为CH2Cl2/MeOH＝10∶1(V/V))。反应毕，将混合物在真空下浓缩，得式3a所示化合物的粗品，为棕黄色油状液，将其用乙醇(100mL)溶解，再用乙酸乙酯(300mL)搅拌2小时，控制温度在15～20℃重结晶，过滤，固体经干燥，即得式3a-1所示化合物(9.94克，收率34.0％)。
实施例4：式3a-2所示化合物的制备
在三口瓶中依次加入乙醇(1000mL)、式2a所示化合物(27.8克，0.2摩尔)、式1a-2所示化合物(21.4克，0.1摩尔)，将所得溶液搅拌回流12小时，经薄层色谱(TLC)点板测试反应完全(展开剂为CH2Cl2/MeOH＝10∶1(V/V))。反应毕，将混合物在真空下浓缩，得式3a所示化合物的粗品，为棕黄色油状液，将其用乙醇(100mL)溶解，再用乙酸乙酯(300mL)搅拌2小时，控制温度在10～15℃重结晶，过滤，固体经干燥，即得式3a-2所示化合物(11.3克，收率38.3％)。
实施例5：式3a-2所示化合物的制备
在三口瓶中依次加入乙醇(1000mL)、式2a所示化合物(16.7克，0.12摩尔)、式1a-2所示化合物(21.4克，0.1摩尔)，将所得溶液搅拌回流8小时，经薄层色谱(TLC)点板测试反应完全(展开剂为CH2Cl2/MeOH＝10∶1(V/V))。反应毕，将混合物在真空下浓缩，得式3a所示化合物的粗品，为棕黄色油状液，将其用乙醇(100mL)溶解，再用乙酸乙酯(300mL)搅拌2小时，控制温度在20～25℃重结晶，过滤，固体经干燥，即得式3a-2所示化合物(7.12克，收率24.1％)。
实施例6：式3a-2所示化合物的制备
在三口瓶中依次加入乙醇(1000mL)、式2a所示化合物(34.8克，0.25摩尔)、式1a-2所示化合物(21.4克，0.1摩尔)，将所得溶液搅拌回流24小时，经薄层色谱(TLC)点板测试反应完全(展开剂为CH2Cl2/MeOH＝10∶1(V/V))。反应毕，将混合物在真空下浓缩，得式3a所示化合物的粗品，为棕黄色油状液，将其用乙醇(100mL)溶解，再用乙酸乙酯(300mL)搅拌2小时，控制温度在15～20℃重结晶，过滤，固体经干燥，即得式3a-2所示化合物(10.8克，收率36.6％)。
实施例7：式3a-3所示化合物的制备
在三口瓶中依次加入乙醇(1000mL)、式2a所示化合物(27.8克，0.2摩尔)、式1a-3所示化合物(27.3克，0.1摩尔)，将所得溶液搅拌回流12小时，经薄层色谱(TLC)点板测试反应完全(展开剂为CH2Cl2/MeOH＝10∶1(V/V))。反应毕，将混合物在真空下浓缩，得式3a所示化合物的粗品，为棕黄色油状液，将其用乙醇(100mL)溶解，再用乙酸乙酯(300mL)搅拌2小时，控制温度在10～15℃重结晶，过滤，固体经干燥，即得式3a-3所示化合物(17.3克，收率48.9％)。
实施例8：式3a-3所示化合物的制备
在三口瓶中依次加入乙醇(1000mL)、式2a所示化合物(16.7克，0.12摩尔)、式1a-3所示化合物(27.3克，0.1摩尔)，将所得溶液搅拌回流8小时，经薄层色谱(TLC)点板测试反应完全(展开剂为CH2Cl2/MeOH＝10∶1(V/V))。反应毕，将混合物在真空下浓缩，得式3a所示化合物的粗品，为棕黄色油状液，将其用乙醇(100mL)溶解，再用乙酸乙酯(300mL)搅拌2小时，控制温度在20～25℃重结晶，过滤，固体经干燥，即得式3a-3所示化合物(10.8克，收率30.5％)。
实施例9：式3a-3所示化合物的制备
在三口瓶中依次加入乙醇(1000mL)、式2a所示化合物(34.8克，0.25摩尔)、式1a-3所示化合物(27.3克，0.1摩尔)，将所得溶液搅拌回流24小时，经薄层色谱(TLC)点板测试反应完全(展开剂为CH2Cl2/MeOH＝10∶1(V/V))。反应毕，将混合物在真空下浓缩，得式3a所示化合物的粗品，为棕黄色油状液，将其用乙醇(100mL)溶解，再用乙酸乙酯(300mL)搅拌2小时，控制温度在15～20℃重结晶，过滤，固体经干燥，即得式3a-3所示化合物(13.4克，收率37.8％)。
实施例10：式3a-4所示化合物的制备
在三口瓶中依次加入乙醇(1000mL)、式2a所示化合物(27.8克，0.2摩尔)、式1a-4所示化合物(22.2克，0.1摩尔)，将所得溶液搅拌回流12小时，经薄层色谱(TLC)点板测试反应完全(展开剂为CH2Cl2/MeOH＝10∶1(V/V))。反应毕，将混合物在真空下浓缩，得式3a所示化合物的粗品，为棕黄色油状液，将其用乙醇(100mL)溶解，再用乙酸乙酯(300mL)搅拌2小时，控制温度在10～15℃重结晶，过滤，固体经干燥，即得式3a-4所示化合物(9.89克，收率32.6％)。
实施例11：式3a-4所示化合物的制备
在三口瓶中依次加入乙醇(1000mL)、式2a所示化合物(16.7克，0.12摩尔)、式1a-4所示化合物(22.2克，0.1摩尔)，将所得溶液搅拌回流8小时，经薄层色谱(TLC)点板测试反应完全(展开剂为CH2Cl2/MeOH＝10∶1(V/V))。反应毕，将混合物在真空下浓缩，得式3a所示化合物的粗品，为棕黄色油状液，将其用乙醇(100mL)溶解，再用乙酸乙酯(300mL)搅拌2小时，控制温度在20～25℃重结晶，过滤，固体经干燥，即得式3a-4所示化合物(6.43克，收率21.2％)。
实施例12：式3a-4所示化合物的制备
在三口瓶中依次加入乙醇(1000mL)、式2a所示化合物(34.8克，0.25摩尔)、式1a-4所示化合物(22.2克，0.1摩尔)，将所得溶液搅拌回流24小时，经薄层色谱(TLC)点板测试反应完全(展开剂为CH2Cl2/MeOH＝10∶1(V/V))。反应毕，将混合物在真空下浓缩，得式3a所示化合物的粗品，为棕黄色油状液，将其用乙醇(100mL)溶解，再用乙酸乙酯(300mL)搅拌2小时，控制温度在15～20℃重结晶，过滤，固体经干燥，即得式3a-4所示化合物(7.82克，收率25.8％)。
实施例13：式3a-5所示化合物的制备
在三口瓶中依次加入乙醇(1000mL)、式2a所示化合物(27.8克，0.2摩尔)、式1a-5所示化合物(19.8克，0.1摩尔)，将所得溶液搅拌回流12小时，经薄层色谱(TLC)点板测试反应完全(展开剂为CH2Cl2/MeOH＝10∶1(V/V))。反应毕，将混合物在真空下浓缩，得式3a所示化合物的粗品，为棕黄色油状液，将其用乙醇(100mL)溶解，再用乙酸乙酯(300mL)搅拌2小时，控制温度在10～15℃重结晶，过滤，固体经干燥，即得式3a-5所示化合物(10.8克，收率38.7％)。
实施例14：式3a-5所示化合物的制备
在三口瓶中依次加入乙醇(1000mL)、式2a所示化合物(16.7克，0.12摩尔)、式1a-5所示化合物(19.8克，0.1摩尔)，将所得溶液搅拌回流8小时，经薄层色谱(TLC)点板测试反应完全(展开剂为CH2Cl2/MeOH＝10∶1(V/V))。反应毕，将混合物在真空下浓缩，得式3a所示化合物的粗品，为棕黄色油状液，将其用乙醇(100mL)溶解，再用乙酸乙酯(300mL)搅拌2小时，控制温度在20～25℃重结晶，过滤，固体经干燥，即得式3a-5所示化合物(8.94克，收率32.0％)。
实施例15：式3a-5所示化合物的制备
在三口瓶中依次加入乙醇(1000mL)、式2a所示化合物(34.8克，0.25摩尔)、式1a-5所示化合物(19.8克，0.1摩尔)，将所得溶液搅拌回流24小时，经薄层色谱(TLC)点板测试反应完全(展开剂为CH2Cl2/MeOH＝10∶1(V/V))。反应毕，将混合物在真空下浓缩，得式3a所示化合物的粗品，为棕黄色油状液，将其用乙醇(100mL)溶解，再用乙酸乙酯(300mL)搅拌2小时，控制温度在15～20℃重结晶，过滤，固体经干燥，即得式3a-5所示化合物(9.24克，收率33.1％)。
实施例16：式4a-1所示化合物的制备
在三口瓶中加入甲醇(1000mL)、式3a-1所示化合物(2.92克，0.01摩尔)，然后加入铁(28克，0.5摩尔)、氯化铵(32克，0.6摩尔)的水溶液，将所得混合物搅拌加热至70℃，反应1.5小时。经薄层色谱(TLC)点板测试反应完全(展开剂为CH2Cl2/MeOH＝10∶l(V/V))。反应毕，将混合物过滤，滤液真空浓缩，即得式4a-1所示化合物(1.97克，收率75.2％)。
实施例17：式4a-1所示化合物的制备
在三口瓶中加入甲醇(1000mL)、式3a-1所示化合物(2.92克，0.01摩尔)，然后加入铁(5.6克，0.1摩尔)、氯化铵(6.4克，0.12摩尔)的水溶液，将所得混合物搅拌加热至80℃，反应0.5小时。经薄层色谱(TLC)点板测试反应完全(展开剂为CH2Cl2/MeOH＝10∶1(V/V))。反应毕，将混合物过滤，滤液真空浓缩，即得式4a-1所示化合物(1.59克，收率60.6％)。
实施例18：式4a-1所示化合物的制备
在三口瓶中加入甲醇(1000mL)、式3a-1所示化合物(2.92克，0.01摩尔)，然后加入铁(14克，0.25摩尔)、氯化铵(16克，0.3摩尔)的水溶液，将所得混合物搅拌加热至50℃，反应3小时。经薄层色谱(TLC)点板测试反应完全(展开剂为CH2Cl2/MeOH＝10∶1(V/V))。反应毕，将混合物过滤，滤液真空浓缩，即得式4a-1所示化合物(1.85克，收率70.5％)。
实施例19：式4a-2所示化合物的制备
在三口瓶中加入甲醇(1000mL)、式3a-2所示化合物(2.95克，0.01摩尔)，然后加入铁(28克，0.5摩尔)、氯化铵(32克，0.6摩尔)的水溶液，将所得混合物搅拌加热至70℃，反应1.5小时。经薄层色谱(TLC)点板测试反应完全(展开剂为CH2Cl2/MeOH＝10∶1(V/V))。反应毕，将混合物过滤，滤液真空浓缩，即得式4a-2所示化合物(1.76克，收率66.3％)。
实施例20：式4a-2所示化合物的制备
在三口瓶中加入甲醇(1000mL)、式3a-2所示化合物(2.95克，0.01摩尔)，然后加入铁(5.6克，0.1摩尔)、氯化铵(6.4克，0.12摩尔)的水溶液，将所得混合物搅拌加热至80℃，反应1小时。经薄层色谱(TLC)点板测试反应完全(展开剂为CH2Cl2/MeOH＝10∶1(V/V))。反应毕，将混合物过滤，滤液真空浓缩，即得式4a-2所示化合物(1.34克，收率50.5％)。
实施例21：式4a-2所示化合物的制备
在三口瓶中加入甲醇(1000mL)、式3a-2所示化合物(2.95克，0.01摩尔)，然后加入铁(14克，0.25摩尔)、氯化铵(16克，0.3摩尔)的水溶液，将所得混合物搅拌加热至50℃，反应3小时。经薄层色谱(TLC)点板测试反应完全(展开剂为CH2Cl2/MeOH＝10∶1(V/V))。反应毕，将混合物过滤，滤液真空浓缩，即得式4a-2所示化合物(1.59克，收率59.9％)。
实施例22：式4a-3所示化合物的制备
在三口瓶中加入甲醇(1000mL)、式3a-3所示化合物(3.54克，0.01摩尔)，然后加入铁(28克，0.5摩尔)、氯化铵(32克，0.6摩尔)的水溶液，将所得混合物搅拌加热至70℃，反应1.5小时。经薄层色谱(TLC)点板测试反应完全(展开剂为CH2Cl2/MeOH＝10∶1(V/V))。反应毕，将混合物过滤，滤液真空浓缩，即得式4a-3所示化合物(2.50克，收率77.1％)。
实施例23：式4a-3所示化合物的制备
在三口瓶中加入甲醇(1000mL)、式3a-3所示化合物(3.54克，0.01摩尔)，然后加入铁(5.6克，0.1摩尔)、氯化铵(6.4克，0.12摩尔)的水溶液，将所得混合物搅拌加热至80℃，反应1小时。经薄层色谱(TLC)点板测试反应完全(展开剂为CH2Cl2/MeOH＝10∶1(V/V))。反应毕，将混合物过滤，滤液真空浓缩，即得式4a-3所示化合物(2.35克，收率72.6％)。
实施例24：式4a-3所示化合物的制备
在三口瓶中加入甲醇(1000mL)、式3a-3所示化合物(3.54克，0.01摩尔)，然后加入铁(14克，0.25摩尔)、氯化铵(16克，0.3摩尔)的水溶液，将所得混合物搅拌加热至50℃，反应3小时。经薄层色谱(TLC)点板测试反应完全(展开剂为CH2Cl2/MeOH＝10∶1(V/V))。反应毕，将混合物过滤，滤液真空浓缩，即得式4a-3所示化合物(2.29克，收率70.7％)。
实施例25：式4a-4所示化合物的制备
在三口瓶中加入甲醇(1000mL)、式3a-4所示化合物(3.03克，0.01摩尔)，然后加入铁(28克，0.5摩尔)、氯化铵(32克，0.6摩尔)的水溶液，将所得混合物搅拌加热至70℃，反应1.5小时。经薄层色谱(TLC)点板测试反应完全(展开剂为CH2Cl2/MeOH＝10∶1(V/V))。反应毕，将混合物过滤，滤液真空浓缩，即得式4a-4所示化合物(1.70克，收率62.5％)。
实施例26：式4a-4所示化合物的制备
在三口瓶中加入甲醇(1000mL)、式3a-4所示化合物(2.92克，0.01摩尔)，然后加入铁(5.6克，0.1摩尔)、氯化铵(6.4克，0.12摩尔)的水溶液，将所得混合物搅拌加热至80℃，反应1小时。经薄层色谱(TLC)点板测试反应完全(展开剂为CH2Cl2/MeOH＝10∶1(V/V))。反应毕，将混合物过滤，滤液真空浓缩，即得式4a-4所示化合物(1.48克，收率54.1％)。
实施例27：式4a-4所示化合物的制备
在三口瓶中加入甲醇(1000mL)、式3a-4所示化合物(2.92克，0.01摩尔)，然后加入铁(14克，0.25摩尔)、氯化铵(16克，0.3摩尔)的水溶液，将所得混合物搅拌加热至50℃，反应3小时。经薄层色谱(TLC)点板测试反应完全(展开剂为CH2Cl2/MeOH＝10∶1(V/V))。反应毕，将混合物过滤，滤液真空浓缩，即得式4a-4所示化合物(1.68克，收率61.5％)。
实施例28：式4a-5所示化合物的制备
在三口瓶中加入甲醇(1000mL)、式3a-5所示化合物(2.79克，0.01摩尔)，然后加入铁(28克，0.5摩尔)、氯化铵(32克，0.6摩尔)的水溶液，将所得混合物搅拌加热至70℃，反应1.5小时。经薄层色谱(TLC)点板测试反应完全(展开剂为CH2Cl2/MeOH＝10∶1(V/V))。反应毕，将混合物过滤，滤液真空浓缩，即得式4a-5所示化合物(1.94克，收率77.8％)。
实施例29：式4a-5所示化合物的制备
在三口瓶中加入甲醇(1000mL)、式3a-5所示化合物(2.79克，0.01摩尔)，然后加入铁(5.6克，0.1摩尔)、氯化铵(6.4克，0.12摩尔)的水溶液，将所得混合物搅拌加热至80℃，反应1小时。经薄层色谱(TLC)点板测试反应完全(展开剂为CH2Cl2/MeOH＝10∶1(V/V))。反应毕，将混合物过滤，滤液真空浓缩，即得式4a-5所示化合物(1.69克，收率67.8％)。
实施例30：式4a-5所示化合物的制备
在三口瓶中加入甲醇(1000mL)、式3a-5所示化合物(2.79克，0.01摩尔)，然后加入铁(14克，0.25摩尔)、氯化铵(16克，0.3摩尔)的水溶液，将所得混合物搅拌加热至50℃，反应3小时。经薄层色谱(TLC)点板测试反应完全(展开剂为CH2Cl2/MeOH＝10∶1(V/V))。反应毕，将混合物过滤，滤液真空浓缩，即得式4a-5所示化合物(1.77克，收率71.0％)。
实施例31：式1所示化合物的制备
在三口瓶中加入式4a-1所示化合物(26.2克，0.1摩尔)、二氯甲烷(500毫升)、式5a-1所示化合物(32.8克，0.112摩尔)，随后加入吡啶(11.9克，0.15摩尔)，将所得混合物在25℃下搅拌反应4小时。经薄层色谱(TLC)点板测试反应完全(展开剂为CH2Cl2/MeOH＝10∶1(V/V))。反应毕，将混合物真空减压浓缩，得式1所示化合物粗品，将粗品用甲醇(80mL)溶解，再加入乙酸乙酯(240mL)在室温下搅拌析晶，过滤，固体经干燥，即得式1所示化合物(40.5克，收率78.1％)，纯度99.6％(高效液相)。
实施例32：式1所示化合物的制备
在三口瓶中加入式4a-1所示化合物(26.2克，0.1摩尔)、二氯甲烷(500毫升)、式5a-1所示化合物(29.3克，0.1摩尔)，随后加入吡啶(11.9克，0.15摩尔)，将所得混合物在20℃下搅拌反应5小时。经薄层色谱(TLC)点板测试反应完全(展开剂为CH2Cl2/MeOH＝10∶1(V/V))。反应毕，将混合物真空减压浓缩，得式1所示化合物粗品，将粗品用甲醇(80mL)溶解，再加入乙酸乙酯(240mL)在室温下搅拌析晶，过滤，固体经干燥，即得式1所示化合物(36.5克，收率70.4％)，纯度99.2％(高效液相)。
实施例33：式1所示化合物的制备
在三口瓶中加入式4a-1所示化合物(26.2克，0.1摩尔)、二氯甲烷(500毫升)、式5a-1所示化合物(43.8克，0.15摩尔)，随后加入吡啶(11.9克，0.15摩尔)，将所得混合物在30℃下搅拌反应2小时。经薄层色谱(TLC)点板测试反应完全(展开剂为CH2Cl2/MeOH＝10∶1(V/V))。反应毕，将混合物真空减压浓缩，得式1所示化合物粗品，将粗品用甲醇(80mL)溶解，再加入乙酸乙酯(240mL)在室温下搅拌析晶，过滤，固体经干燥，即得式1所示化合物(38.6克，收率74.4％)，纯度99.0％(高效液相)。
实施例34：式17所示化合物的制备
在三口瓶中加入式4a-2所示化合物(26.5克，0.1摩尔)、二氯甲烷(500毫升)、式5a-2所示化合物(27.4克，0.112摩尔)，随后加入吡啶(11.9克，0.15摩尔)，将所得混合物在25℃下搅拌反应4小时。经薄层色谱(TLC)点板测试反应完全(展开剂为CH2Cl2/MeOH＝10∶1(V/V))。反应毕，将混合物真空减压浓缩，得式17所示化合物粗品，将粗品用甲醇(80mL)溶解，再加入乙酸乙酯(240mL)在室温下搅拌析晶，过滤，固体经干燥，即得式17所示化合物(34.8克，收率73.5％)，纯度99.3％(高效液相)。
实施例35：式17所示化合物的制备
在三口瓶中加入式4a-2所示化合物(26.5克，0.1摩尔)、二氯甲烷(500毫升)、式5a-2所示化合物(24.5克，0.1摩尔)，随后加入吡啶(11.9克，0.15摩尔)，将所得混合物在20℃下搅拌反应5小时。经薄层色谱(TLC)点板测试反应完全(展开剂为CH2Cl2/MeOH＝10∶1(V/V))。反应毕，将混合物真空减压浓缩，得式17所示化合物粗品，将粗品用甲醇(80mL)溶解，再加入乙酸乙酯(240mL)在室温下搅拌析晶，过滤，固体经干燥，即得式17所示化合物(25.8克，收率54.5％)，纯度99.1％(高效液相)。
实施例36：式17所示化合物的制备
在三口瓶中加入式4a-2所示化合物(26.5克，0.1摩尔)、二氯甲烷(500毫升)、式5a-2所示化合物(36.7克，0.15摩尔)，随后加入吡啶(11.9克，0.15摩尔)，将所得混合物在30℃下搅拌反应2小时。经薄层色谱(TLC)点板测试反应完全(展开剂为CH2Cl2/MeOH＝10∶1(V/V))。反应毕，将混合物真空减压浓缩，得式17所示化合物粗品，将粗品用甲醇(80mL)溶解，再加入乙酸乙酯(240mL)在室温下搅拌析晶，过滤，固体经干燥，即得式17所示化合物(31.6克，收率66.8％)，纯度99.0％(高效液相)。
实施例37：式25所示化合物的制备
在三口瓶中加入式4a-3所示化合物(32.4克，0.1摩尔)、二氯甲烷(500毫升)、式5a-3所示化合物(32.4克，0.112摩尔)，随后加入吡啶(11.9克，0.15摩尔)，将所得混合物在25℃下搅拌反应4小时。经薄层色谱(TLC)点板测试反应完全(展开剂为CH2Cl2/MeOH＝10∶1(V/V))。反应毕，将混合物真空减压浓缩，得式25所示化合物粗品，将粗品用甲醇(80mL)溶解，再加入乙酸乙酯(240mL)在室温下搅拌析晶，过滤，固体经干燥，即得式25所示化合物(42.0克，收率72.7％)，纯度99.4％(高效液相)。
实施例38：式25所示化合物的制备
在三口瓶中加入式4a-3所示化合物(32.4克，0.1摩尔)、二氯甲烷(500毫升)、式5a-3所示化合物(29.0克，0.1摩尔)，随后加入吡啶(11.9克，0.15摩尔)，将所得混合物在20℃下搅拌反应5小时。经薄层色谱(TLC)点板测试反应完全(展开剂为CH2Cl2/MeOH＝10∶1(V/V))。反应毕，将混合物真空减压浓缩，得式25所示化合物粗品，将粗品用甲醇(80mL)溶解，再加入乙酸乙酯(240mL)在室温下搅拌析晶，过滤，固体经干燥，即得式25所示化合物(38.1克，收率66.0％)，纯度99.0％(高效液相)。
实施例39：式25所示化合物的制备
在三口瓶中加入式4a-3所示化合物(32.4克，0.1摩尔)、二氯甲烷(500毫升)、式5a-3所示化合物(43.4克，0.15摩尔)，随后加入吡啶(11.9克，0.15摩尔)，将所得混合物在30℃下搅拌反应2小时。经薄层色谱(TLC)点板测试反应完全(展开剂为CH2Cl2/MeOH＝10∶1(V/V))。反应毕，将混合物真空减压浓缩，得式25所示化合物粗品，将粗品用甲醇(80mL)溶解，再加入乙酸乙酯(240mL)在室温下搅拌析晶，过滤，固体经干燥，即得式25所示化合物(40.0克，收率69.2％)，纯度99.4％(高效液相)。
实施例40：式39所示化合物的制备
在三口瓶中加入式4a-4所示化合物(27.3克，0.1摩尔)、二氯甲烷(500毫升)、式5a-4所示化合物(30.4克，0.112摩尔)，随后加入吡啶(11.9克，0.15摩尔)，将所得混合物在25℃下搅拌反应4小时。经薄层色谱(TLC)点板测试反应完全(展开剂为CH2Cl2/MeOH＝10∶1(V/V))。反应毕，将混合物真空减压浓缩，得式39所示化合物粗品，将粗品用甲醇(80mL)溶解，再加入乙酸乙酯(240mL)在室温下搅拌析晶，过滤，固体经干燥，即得式39所示化合物(39.3克，收率77.3％)，纯度99.7％(高效液相)。
实施例41：式39所示化合物的制备
在三口瓶中加入式4a-4所示化合物(27.3克，0.1摩尔)、二氯甲烷(500毫升)、式5a-4所示化合物(27.2克，0.1摩尔)，随后加入吡啶(11.9克，0.15摩尔)，将所得混合物在20℃下搅拌反应5小时。经薄层色谱(TLC)点板测试反应完全(展开剂为CH2Cl2/MeOH＝10∶1(V/V))。反应毕，将混合物真空减压浓缩，得式39所示化合物粗品，将粗品用甲醇(80mL)溶解，再加入乙酸乙酯(240mL)在室温下搅拌析晶，过滤，固体经干燥，即得式39所示化合物(29.4克，收率57.9％)，纯度99.3％(高效液相)。
实施例42：式39所示化合物的制备
在三口瓶中加入式4a-4所示化合物(27.3克，0.1摩尔)、二氯甲烷(500毫升)、式5a-4所示化合物(40.7克，0.15摩尔)，随后加入吡啶(11.9克，0.15摩尔)，将所得混合物在30℃下搅拌反应2小时。经薄层色谱(TLC)点板测试反应完全(展开剂为CH2Cl2/MeOH＝10∶1(V/V))。反应毕，将混合物真空减压浓缩，得式39所示化合物粗品，将粗品用甲醇(80mL)溶解，再加入乙酸乙酯(240mL)在室温下搅拌析晶，过滤，固体经干燥，即得式39所示化合物(36.4克，收率71.6％)，纯度98.9％(高效液相)。
实施例43：式57所示化合物的制备
在三口瓶中加入式4a-5所示化合物(24.9克，0.1摩尔)、二氯甲烷(500毫升)、式5a-1所示化合物(32.8克，0.112摩尔)，随后加入吡啶(11.9克，0.15摩尔)，将所得混合物在25℃下搅拌反应4小时。经薄层色谱(TLC)点板测试反应完全(展开剂为CH2Cl2/MeOH＝10∶1(V/V))。反应毕，将混合物真空减压浓缩，得式57所示化合物粗品，将粗品用甲醇(80mL)溶解，再加入乙酸乙酯(240mL)在室温下搅拌析晶，过滤，固体经干燥，即得式57所示化合物(34.6克，收率68.4％)，纯度99.4％(高效液相)。
实施例44：式57所示化合物的制备
在三口瓶中加入式4a-5所示化合物(24.9克，0.1摩尔)、二氯甲烷(500毫升)、式5a-1所示化合物(29.3克，0.1摩尔)，随后加入吡啶(11.9克，0.15摩尔)，将所得混合物在20℃下搅拌反应5小时。经薄层色谱(TLC)点板测试反应完全(展开剂为CH2Cl2/MeOH＝10∶1(V/V))。反应毕，将混合物真空减压浓缩，得式57所示化合物粗品，将粗品用甲醇(80mL)溶解，再加入乙酸乙酯(240mL)在室温下搅拌析晶，过滤，固体经干燥，即得式57所示化合物(28.2克，收率55.8％)，纯度99.1％(高效液相)。
实施例45：式57所示化合物的制备
在三口瓶中加入式4a-5所示化合物(24.9克，0.1摩尔)、二氯甲烷(500毫升)、式5a-1所示化合物(43.8克，0.15摩尔)，随后加入吡啶(11.9克，0.15摩尔)，将所得混合物在30℃下搅拌反应2小时。经薄层色谱(TLC)点板测试反应完全(展开剂为CH2Cl2/MeOH＝10∶1(V/V))。反应毕，将混合物真空减压浓缩，得式57所示化合物粗品，将粗品用甲醇(80mL)溶解，再加入乙酸乙酯(240mL)在室温下搅拌析晶，过滤，固体经干燥，即得式57所示化合物(32.4克，收率64.1％)，纯度99.2％(高效液相)。
实施例46：式1所示化合物的胶囊剂
1)处方：
2)制备工艺：将原料和各辅料分别过100目筛备用。将聚乙二醇6000式1所示化合物混合均匀，再将混合物倒入装有乳糖和羧甲基淀粉钠的容器中搅拌均匀，并将5％聚维酮K30的水溶液加入适量到容器中制成软材，14目筛制粒；50℃-60℃干燥至水分2.0-4.5％，14目筛整粒，加入硬脂酸镁混合均匀，送检测含量；根据检测结果确定胶囊填装范围，进行胶囊填装，检测合格后，包装，即得。
实施例47：式17所示化合物的片剂
1)处方：
2)制备工艺：
将式17所示化合物、可压性淀粉、β-无水乳糖、微晶纤维素和无水胶体二氧化硅混合均匀，再过12目尼龙筛整粒，颗粒经含量测定合格后，将颗粒粉末用12mm冲直接压片，即得。
实施例48：式25所示化合物的胶囊剂
1)处方：
2)制备工艺：将原料和各辅料分别过100目筛备用。将聚乙二醇6000与式25所示化合物混合均匀，再将混合物倒入装有乳糖、羧甲基淀粉钠的容器中搅拌均匀，并将5％羟丙甲纤维素水溶液的水溶液加入适量到容器中制成软材，14目筛制粒；50℃-60℃干燥至水分2.0-4.5％，14目筛整粒，加入硬脂酸镁混合均匀，送检测含量；根据检测结果确定胶囊填装范围，进行胶囊填装，检测合格后，包装，即得。
实施例49：式39所示化合物的颗粒剂
1)处方：
2)制备工艺：将原料和各辅料分别过100目筛备用。将聚维酮K30溶于适量乙醇中制成溶液，备用。将式39所示化合物、微晶纤维素、磷酸二氢钠、乳糖，交联聚维酮混合均匀，聚维酮k30乙醇溶液制软材，20目筛制粒，65℃干燥，18目筛整粒，再外加微粉硅胶2.0g总混，灌装成颗粒剂。
实施例50：式57所示化合物的注射剂
1)处方：
2)制备工艺：
(1)配料：按处方量称取苯甲酸钠、枸橼酸、酒石酸、EDTA-NaCa溶于适量注射用水中；加入式57所示化合物后加热、搅拌使溶解，再加苯甲醇、1，2-丙二醇、氯化钠、沙氏磷酸盐缓冲液及注射用水(30℃)至全量，搅拌使溶解，加针用活性炭(0.1％)，搅拌15分钟。砂芯抽滤系统除去活性炭，取粗滤液，测定溶液的PH值及式57所示化合物的含量，合格后通过孔径为0.22μm的微孔滤膜精滤后，灌封1ml至20ml的安瓿中，同时充入氮气。
(2)消毒：将灌封好的安瓿置消毒柜内，121℃，12～15min饱和流通蒸汽灭菌消毒，并用有色水检查漏封安瓿。
(3)灯检、包装、全检合格后即得成品。
实施例51：式1所示化合物的注射用粉针
1)处方：
2)制备工艺：
(1)配料：称取对羟基苯甲酸钠、维生素C、EDTA-2Na、海藻酸丙二醇酯溶于适量注射用水中，加入式1所示化合物后加热、搅拌使溶解，加硼酸、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠及注射用水。
(2)灭菌、灌封：再加入针用活性炭(0.1％)，加热60～80℃保温15分钟，过滤脱炭，通过0.22μm微孔滤膜精滤，滤液分装入西林瓶中留住出气口。
(3)冷冻干燥：将装入西林瓶中的滤液，先在-45℃进行预冻2～4小时，然后再-45℃～15℃下减压干燥24～48小时，最后再30-40℃高温干燥6-8小时。
(4)扎盖、包装、全检合格后即得冻干无菌粉针成品。
实施例52：式17所示化合物的注射用粉针
1)处方：
2)制备工艺：将海藻酸丙二醇酯溶于适量水中，使成胶体状，备用。将微粉化的式17所示化合物混悬在海藻酸丙二醇酯中，通过均质机研磨，制成粒度为10μm，然后将混合物用软胶囊填充剂灌装，使式17所示化合物加入软明胶胶囊中。
实施例53：本发明所述化合物对7种肿瘤细胞的抑制
抑制细胞增殖测定方法采用常用的MTT法，该测定方法可用于测定不同的本发明目标化合物对7种癌细胞增殖的抑制能力，利用本领域熟知的方法，可以对任意癌细胞使用相似的测定方法。将处于对数生长期的肿瘤细胞：人结肠癌细胞株(LoVo)、人肝癌细胞株(HepG2)、人神经母细胞瘤细胞株(SH-SY5Y)、人乳腺癌细胞株(MCF-7)、人肺癌细胞株(A549)、人前列腺癌细胞株(DU145)、人单核细胞白血病细胞株(Thp-1)(以下简称：结肠癌(LoVo)、肝癌(HepG2)、神经母细胞瘤(SH-SY5Y)、乳腺癌(MCF-7)、肺癌(A549)、前列腺癌(DU145)、白血病(Thp-1))用0.25％胰酶消化，然后用培养液(DMEM+10％FBS或者PRMI1640+10％FBS)将细胞稀释悬浮成单细胞悬液，调整细胞密度为2.0×104个/mL，每孔加入100μL接种于96孔板中，在37℃、饱和湿度、5％二氧化碳的培养箱中培养24h后，按实验设计分别加入0.1μM、1μM、5μM、10μM、20μM、30μM、50μM、100μM的式1、式17、式25、式39、式57所示化合物，每个浓度平行5个复孔，并分别设置实验组和对照组，继续孵育72h后，向每孔中加入10μL的MTT溶液(5mg/mL)，然后37℃下孵育4h，再向每孔中加入100μL细胞裂解液(10％SDS+0.1％NH4Cl)，避光孵育过夜。次日用酶标仪测定各孔在570nm处的吸光度(OD)值，参考波长650nm。根据吸光度值计算细胞生长抑制率：抑制率(100％)＝[1-(实验组OD均值-空白组OD均值)/(对照组OD均值-空白组OD均值)]×100％。以药物浓度为横坐标，细胞抑制率为纵坐标，绘制细胞生长抑制曲线。上述实验重复3次。用IBM SPSSTM Statistics20统计软件中的Probit模块，概率单位回归法，计算IC50值。
下表1显示了本发明式1、式17、式25、式39、式57所示化合物对7种肿瘤细胞的IC50：
表1
由表1可以看出，该本发明所述化合物对以上7种肿瘤细胞具有很好的抑制作用。其中，式1所示化合物对结肠癌(LoVo)、肝癌(HepG2)、肺癌(A549)、白血病(Thp-1)的抑制效果较好；式17所示化合物对结肠癌(LoVo)、肝癌(HepG2)、乳腺癌(MCF-7)、肺癌(A549)、白血病(Thp-1)的抑制效果较好；式25所示化合物对肝癌(HepG2)、白血病(Thp-1)的抑制效果较好；式39所示化合物对结肠癌(LoVo)、乳腺癌(MCF-7)、肺癌(A549)、白血病(Thp-1)的抑制效果较好；式57所示化合物对结肠癌(LoVo)、肝癌(HepG2)和肺癌(A549)、白血病(Thp-1)的抑制效果较好。可将本发明所述化合物用于制备治疗人乳腺癌、人肺癌、人肝癌、人结肠癌、以及前列腺癌、白血病的药物。
实施例54：本发明式1所示化合物的急性毒性实验
试验对象为昆明小白鼠(18-22g，雌雄各半)，试验前禁食12h，不禁水。将本发明式1所示化合物配制成不同浓度的注射液于紫外灯下照射15min待用。取小白鼠10只，以2只为一组(雌性各半)，分5组，选择剂量间距较大的一系列剂量，分别给各组老鼠注射不同浓度的本发明式1所示化合物的注射液，获得0％和100％致死量范围。正式实验选取各剂量组动物数为10只(雌雄各半)，体重和性别分层随机分配，完成动物分组和剂量计算后尾静脉注射给药。给药时先从中剂量组开始，以便能从最初的几组动物接受药物后的反应来判断两组的剂量是否合适，否则可随时进行调整，尽可能使动物的死亡率在50％上下，死亡率为0％或100％时，不能用于计算。给药后观察小白鼠活动改变情况和死亡数，连续观察3天。用加权机率单位(Bliss法)计算小白鼠的半致死量(LD50)及其95％可信限，结果见下表2。
表2：
| 化合物 | LD50(mg/kg) | 95％可信限 |
| 式1所示化合物 | 110.4 | 104.0-118.5 |
通过与卡氮芥(45.2mg/kg)、美法仑(32mg/kg)和喜树碱(57.3mg/kg)的体内毒性比较，上表数据表明式1所示化合物的体内毒性较低。
实施例55：本发明化合物的生物学PI3Kα、β、δ和γ试验
试验原则
试验读出器在信号发生中利用特异性和高亲合力结合PIP3至独立的普列克底物蛋白同源结构(PH)域。简要地，通过从能量转移复合物置换生物素化的PIP3，探测PIP3产物，所述复合物由铕(Eu)-标记的抗-GST单克隆抗体、GST-标签的PH域、生物素-PIP3和链霉亲和素-APC组成。激发Eu导致能量转移至APC并于665nm发射敏化荧光。通过PI3K激酶活性形成的PIP3竞争PH域上的结合位点，导致能量转移损失和信号衰减。
试验方法
用0.1μl的100％DMSO将固体化合物平铺在384-孔、V型底、低体积Greiner板的所有孔中(除了第6和18列外)。化合物经连续稀释(以100％DMSO，4倍)，从板的第1列至第12列和从第13列至第24列，留下第6和18列仅含DMSO，以使每个测试化合物得到11个浓度。
采用自Millipore的特异性PI3K激酶试剂盒实施该试验。
试验试剂盒组成如下：
4x PI3K反应缓冲液(含200mM Hepes pH7、600mM NaCl、40mM MgC12、＜1％胆酸盐(w/v)、＜1％Chaps(w/v)、0.05％叠氮化钠(w/v))、PIP2(1mM)、3x生物素PIP3(50μM)、检测Mix C(含267mM KF)、检测Mix A(含60μg/ml链霉亲和素-APC)、检测Mix B(含36μg/ml铕-抗-GST(抗-GST-K)和90μg/mlGST-GRP1-PH-域和1mM DTT)、停止液(含150mM EDTA)。
仅手工添加3μl的反应缓冲液(含1mM DTT)至第18列用于100％抑制对照(无活性)。
手工添加3μl的2X酶溶液至所有孔，除了第18列外。用化合物预先孵育15分钟。
手工添加3μl的2X底物溶液至所有孔。(第6列代表0％抑制对照)
放置板1小时(盖住避光)(在γ的情况下仅需要孵育50min)
手工添加3μl停止液/检测液至所有孔
放置板1小时(盖住避光)
在BMG Rubystar上读取该试验数值并利用比率数据计算11点曲线。
NB底物溶液(浓度)不同于各同工型(参见下面)
α
2x底物溶液，含500μM ATP、16μM PIP2和0.030μM3X生物素-PIP3。
β
2x底物溶液，含800μM ATP、16μM PIP2和0.030μM3X生物素-PIP3。
δ
2X底物溶液，含160μM ATP、10μM PIP2和0.030μM3X生物素-PIP3。
γ
2X底物溶液，含30μM ATP、16μM PIP2和0.030μM3X生物素-PIP3。
分析方法
通过在活性碱中的XC504-参数逻辑曲线拟合运算法则处理数据。
使高和低对照％(分别为0％和100％抑制)之间的抑制正态化
初级模数拟合：斜率、Min和Max渐近线变量
次级模数拟合：(1)Fix Min渐近线，(2)Fix Max渐近线，(3)Fix Min和Max渐近线
曲线拟合QC：pXC5095％CL率＞10
-20＜Min渐近线＜20
80＜Max渐近线＜120
在以上的PI3Kα、β、δ和/或γ试验或类似的试验中测试本发明所述式1-式63所示的，共63个化合物，并在PI3Kδ试验中发现pIC50至少为7或更大。
发现至少式1、17、25、39和57的化合物的PI3Kδ的选择性为PI3Kα、β和/或γ的至少十倍。
实施例56：关于本发明化合物的PI3K的荧光偏振分析
由于本分析通过测量抑制来鉴别PI3K的抑制剂，故其用于测定本发明化合物的IC50值。
材料：反应缓冲液：20mM HEPES(pH7.5)、2mM MgCl2、0.05％CHAPS；和0.01％BME(新鲜添加)；终止/检测缓冲液：100mM HEPES(pH7.5)、4mM EDTA、0.05％CHAPS；水中的20mMATP；水中的1mM PIP2；于10％甘油中的1.75mg/mL或1.4mg/mLGST-GRP；红色检测剂(塔姆拉(TAMRA))20μM；板：纽克公司384孔黑色聚丙烯荧光板。
方法：通过每孔放入5μL稀释过的酶，随后添加5μL稀释过的化合物(或9.5μL酶，随后0.5μL于DMSO中的化合物)并混合，来执行分析。接着，添加10μL底物以起始反应。将样本培养30-60分钟，随后通过添加20μL终止/检测剂混合物来终止反应。
用反应缓冲液稀释PI3K(例如，将5μL或7.5μL PI3K添加到620μL反应缓冲液中)，并且每孔使用5μL稀释过的酶。各孔中添加5μL反应缓冲液或在缓冲液中稀释过的药物(例如，4μL/100，故反应物中最终DMSO为1％)。反复移液来混合样本。或者，可将酶稀释到1215μL。在此情况下，每孔添加9.8μL，并将0.2μL化合物添加到DMSO中。
为制备1mL底物溶液，将955μL反应缓冲液、40μL PIP2与25μL ATP混合。将10μL底物添加到各孔中以起始反应。这产生每一反应20μM PIP2和25μM ATP。
通过将4μL红色检测剂和1.6μL或2.0μL GST-GRP与1mL终止缓冲液混合，来制备终止/检测剂混合物，这产生10nM探针和70nM GST-GRP。将20μL终止/检测剂混合物添加到各孔中，以终止反应。在将红色探针溶液保持黑暗30-90分钟后，读取板。
在0点时，在即将添加底物前将终止/检测剂混合物添加到酶中。为另外进行对照，将终止/检测剂混合物添加到缓冲液(无酶)和底物中或仅缓冲液(无底物)中。
汇集的PI3K制剂的蛋白质浓度为0.25mg/mL。推荐反应物具有0.06μL/20μL(0.015μg/20μL)或0.01125μg/15μL或0.75μg/mL的蛋白质浓度。
在具有针对塔姆拉的滤光器的机器上读取板。单位为mP，并且无酶对照组读取到约190-220mP个单位。具有完全活性的酶在30分钟后使荧光偏振降低到70-100mP。活性化合物使mP值几乎升高到对照值或120-150mP个单位。
活体外细胞培养物生长分析法：
所用人肿瘤细胞系包括：乳腺细胞系MCF7；肺细胞系A549；肝细胞系HepG2和结肠细胞系HCT116。将细胞涂于96孔培养板中。涂板后1天，将抑制剂添加到细胞中。药物处理后3天，通过染料MTS由活细胞进行的代谢转化(种公认的细胞增殖分析)测定活细胞密度。使用购自普洛麦格公司(Promega Corp.)(威斯康星州麦迪逊(Madison，WI))的分析试剂盒，遵循与试剂盒一起提供的方案，执行所述分析。通过在490nm下测量吸光度，于96孔读板器中读取MTS分析结果。各处理的作用是相对于在同一培养板中生长的媒剂处理的细胞计算为对照组生长百分比。赋予50％生长抑制的药物浓度定为IC50(μg/ml)。表3为所述生物分析的结果。
表3
由表3可以看出，该本发明所述化合物作为AKT/PI3K抑制剂，对乳腺、肺、肝、结肠的肿瘤细胞均具有很好的抑制作用，是良好的AKT/PI3K抑制剂，本发明所述化合物可用于制备成治疗癌症相关疾病的靶向治疗药物，例如用于治疗乳腺癌、肺癌、肝癌、结肠癌。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
Claims (11)
1.一种化合物，其特征在于，所述化合物为式I所示化合物或式I所示化合物的药学上可接受的盐，
其中，
R1为选自CH3、C2H5、CN的任意一种；
R2为下列之一：
R3为选自H、CH3、F、Cl、Br、OCH3、OC2H5、CH2CONH2、COCH3、苯基的任意一种；
R4为下列之一：
2.根据权利要求1所述的化合物，其特征在于，
R1为CH3或CN；
R2选自下列之一：
R3为选自H、CH3、Cl、OCH3、CH2CONH2、COCH3和苯基的任意一种；
R4选自下列之一：
3.根据权利要求1所述的化合物，其特征在于，所述化合物为选自下列的一种或其药学上可接受的盐：
4.一种制备权利要求1-3中任一项所述化合物的方法，其特征在于，包括：
(1)使式1a所示化合物与式2a所示化合物进行接触，以便获得式3a所示化合物；
(2)使所述式3a所示化合物与铁粉进行接触，以便获得式4a所示化合物；
(3)使所述式4a所示化合物与式5a所示化合物进行接触，以便获得式I所示化合物；
其中，R1、R2、R3以及R4如权利要求1-3中任一项所定义的。
5.一种药物组合物，其特征在于，包括：
权利要求1-3中任一项所述的化合物。
6.根据权利要求5所述的药物组合物，其特征在于，进一步包括：药学上可以接受的赋形剂。
7.根据权利要求5或6所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物呈片剂、胶囊、颗粒剂、分散片、粉剂、糖浆、溶液状、悬浮液、气雾剂、注射液、注射用粉针的药物制剂形式。
8.权利要求1-3中任一项所述的化合物在制备药物中的用途，所述药物为靶向抗肿瘤的AKT/PI3K抑制剂。
9.根据权利要求8所述的用途，其特征在于，所述药物用于治疗癌症。
10.根据权利要求9所述的用途，其特征在于，所述癌症为选自晚期实体瘤、肺癌、肝癌、骨癌、胰腺癌、头和颈部癌、表皮或眼内黑色素瘤、子宫癌、卵巢癌、结直肠癌、肛区癌、胃癌、乳腺癌、输卵管癌、子宫内膜癌、宫颈癌、阴道癌、外阴癌、何杰金氏病、食道癌、小肠癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、前列腺癌、慢性或急性白血病、淋巴细胞性淋巴瘤、膀胱癌、肾细胞癌、肾盂癌、原发性中枢神经系统淋巴瘤、脊柱肿瘤、神经母细胞瘤、脑干胶质瘤和垂体腺瘤的至少一种。
11.根据权利要求9所述的用途，其特征在于，所述癌症为选自肺癌、肝癌、急性髓细胞性白血病、慢性粒细胞白血病、前列腺癌和结肠癌的至少一种。
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