TWI466888B - 喹唑啉化合物 - Google Patents

Description

喹唑啉化合物

本發明涉及藥物領域，具體涉及某些喹唑啉化合物、含有所述化合物的組成物及其用途。這些喹唑啉化合物能有效地抑制表皮生長因子受體(EGFR)的過量表現及/或過度活性(overactivity)。

表皮生長因子(EGF)與表皮生長因子受體(EGFR)結合能啟動酪氨酸激酶活性，並因此可引發導致細胞增殖的反應。EGFR的過量表現及/或過度活性可導致失控的細胞分裂，所述失控的細胞分裂可以是癌症的誘因。因此，能抑制EGFR的過量表現及/或過度活性的化合物是具治療癌症潛力之候選物。

本發明提供了至少一種選自以下的化合物：(3aR,6aR)-N-(4-(1-(3-氟苄基)-1H-吲唑-5-基胺基)-7-甲氧基喹唑啉-6-基)-1-甲基六氫吡咯並[3,4-b]吡咯-5(1H)-甲醯胺；(3aS,6aS)-N-(4-(1-(3-氟苄基)-1H-吲唑-5-基胺基)-7-甲氧基喹唑啉-6-基)-1-甲基六氫吡咯並[3,4-b]吡咯-5(1H)-甲醯胺；(3aR,6aR)-N-(4-(3-乙炔基苯基胺基)-7-甲氧基喹唑啉-6-基)-1-甲基-六氫吡咯並[3,4-b]吡咯-5(1H)-甲醯胺；(3aS,6aS)-N-(4-(3-氯-4-(3-氟苄基氧基)苯基胺基)-7-甲氧基喹唑啉-6-基)-1-甲基六氫吡咯並[3,4-b]吡咯-5(1H)-甲醯胺；(3aR,6aR)-N-(4-(3-氯-4-(3-氟苄基氧基)苯基胺基)-7-甲氧基喹唑啉-6-基)-1-甲基六氫吡咯並[3,4-b]吡咯-5(1H)-甲醯胺；(3aS,6aS)-N-(4-(3-氯-4-(3-氟苄基氧基)苯基胺基)喹唑啉-6-基)-1-甲基六氫吡咯並[3,4-b]吡咯-5(1H)-甲醯胺；和(3aR,6aR)-N-(4-(3-氯-4-(3-氟苄基氧基)苯基胺基)喹唑啉-6-基)-1-甲基六氫吡咯並[3,4-b]吡咯-5(1H)-甲醯胺，及/或至少一種其藥學上可接受的鹽。

本發明還提供了一種醫藥組成物，其包含至少一種藥學上可接受的載劑和本文所述的至少一種化合物及/或至少一種其藥學上可接受的鹽。

本發明還提供了一種治療對抑制表皮生長因子受體的過量表現及/或過度活性有反應的癌症的方法，其包括向需要其的個體投予有效量的本文所述的至少一種化合物及/或至少一種其藥學上可接受的鹽。

本發明還提供了本發明之化合物及/或至少一種其藥學上可接受的鹽在製備用於治療癌症的藥物中的用途。在較佳的具體實施例中，所述癌症係選自肺癌、頭頸癌、結腸直腸癌、咽癌、表皮樣癌和胰腺癌。

本發明進一步提供了一種抑制表皮生長因子受體的過量表現及/或過度活性的方法，其包括使表皮生長因子受體與有效量的至少一種化合物及/或至少一種其藥學上可接受的鹽接觸。

除非它們所應用的上下文顯示有不同含義，否則本說明書中所用的下列辭彙、短語和符號通用地用於表示下面給出的含義。在全文中下列縮寫和術語具有所給出的含義：

本文所述的化合物包括但不限於它們的光學異構物、外消旋物以及它們的其他混合物。在這些情況下，單個對映異構物或非對映異構物，即光學活性形式，可通過不對稱合成或者通過拆分外消旋物或非對映異構物混合物來得到。外消旋物或非對映異構物混合物的拆分可通過例如常規方法來實現，所述常規方法例如在拆分試劑存在下結晶或者使用例如手性高壓液相層析(HPLC)管柱的層析法。

在本文所述的化合物以多種互變異構形式存在的情況下，術語"化合物"包括該化合物的所有互變異構形式。所述化合物也包括晶形，包括多晶型物和包合物。同樣，術語"鹽"也包括該化合物的鹽的所有異構物、外消旋物、其他混合物、Z-和E-形式、互變異構形式和晶形。

"藥學上可接受的鹽"包括但不限於與無機酸形成的鹽，如鹽酸鹽、磷酸鹽、二磷酸鹽、氫溴酸鹽、硫酸鹽、亞磺酸鹽、硝酸鹽及類似的鹽；以及與有機酸形成的鹽，如蘋果酸鹽、馬來酸鹽、富馬酸鹽、酒石酸鹽、琥珀酸鹽、檸檬酸鹽、乙酸鹽、乳酸鹽、甲磺酸鹽、對甲苯磺酸鹽、2-羥乙基磺酸鹽、苯甲酸鹽、水楊酸鹽、硬脂酸鹽和鏈烷酸鹽(alkanoate)如乙酸鹽、其中n是0-4的HOOC-(CH₂ )_n -COOH的鹽及類似的鹽。類似地，藥學上可接受的陽離子包括但不限於鈉、鉀、鈣、鋁、鋰和銨。

此外，如果本文所述的化合物是以酸加成鹽的形式獲得的，則可通過鹼化該酸加成鹽的溶液獲得游離鹼。相反，如果產物是游離鹼，則可按照由鹼化合物製備酸加成鹽的常規操作通過將游離鹼溶於合適的有機溶劑並用酸處理該溶液來製備加成鹽，特別是藥學上可接受的加成鹽。本領域技術人員知曉可用來製備無毒的藥學上可接受的加成鹽的各種合成方法。

"溶劑合物(solvate)"如"水合物"是通過溶劑與化合物的互相作用形成的。術語"化合物"包括化合物的溶劑合物，包括水合物。同樣，"鹽"也包括鹽的溶劑合物，如水合物。合適的溶劑合物是藥學上可接受的溶劑合物，例如水合物，包括單水合物和半水合物。

"螯合物"是通過化合物與金屬離子在兩個(或更多個)點配位而形成的。術語"化合物"包括化合物的螯合物。同樣，"鹽"也包括鹽的螯合物。

"非共價複合物"是通過化合物與另一種分子的相互作用形成的，其中在化合物與該分子之間不形成共價鍵。例如，複合可通過凡得瓦相互作用、氫鍵和靜電相互作用(也稱為離子鍵)發生。所述非共價複合物也包括在術語"化合物"中。

術語"活性劑"表示具有生物學活性的化學物質。在一些具體實施例中，"活性劑"是具有醫藥效用的化學物質。

"處理"、"治療"或"減輕"是指以治癒、痊癒、減輕、緩解、改變、矯正、改善、改進或影響疾病或障礙、疾病或障礙的症狀或者罹患疾病或障礙的素質為目的向患有所述疾病或障礙、或者具有所述疾病或障礙的症狀、或者具有罹患所述疾病或障礙的素質的個體投予本文所述的至少一種化合物及/或至少一種藥學上可接受的鹽。所述疾病或障礙可以是例如癌症。

術語"抑制"表示生物學活動或生物學過程的基線活性的降低。"抑制表皮生長因子受體的過量表現和/或過度活性"是指相對於不存在所述至少一種化合物及/或至少一種其藥學上可接受的鹽時EGFR的活性，作為對存在本文所述的至少一種化合物及/或至少一種藥學上可接受的鹽的直接或間接回應EGFR的表現和/或活性的降低。活性的降低可以是由本文所述的至少一種化合物及/或至少一種藥學上可接受的鹽與EGFR的直接相互作用引起的，或者是由本文所述的至少一種化合物及/或至少一種藥學上可接受的鹽與一種或多種進而影響EGFR活性的其他因子的相互作用引起的。例如，本文所述的至少一種化合物及/或至少一種藥學上可接受的鹽的存在可通過直接與EGFR結合、通過(直接或間接)導致另一種因子降低EGFR活性或通過(直接或間接)降低細胞或有機體中存在的EGFR量來降低EGFR活性。

術語"有效量"是指有效"治療"個體的疾病或障礙的本文所述的至少一種化合物及/或至少一種藥學上可接受的鹽的量。在癌症的情況下，有效量可導致如上文在"處理"、"治療"和"減輕"的定義中所述的個體的任何可見的或可檢測的變化。例如，有效量能減少癌症或腫瘤細胞的數目；減小腫瘤的大小；抑制或阻止腫瘤細胞向周邊器官浸潤，包括例如腫瘤向軟組織和骨骼的蔓延；抑制和阻止腫瘤轉移；抑制和阻止腫瘤生長；在一定程度上緩解一種或多種與癌症相關的症狀；降低發病率和死亡率；提高生活品質；或者上述效果的組合。有效量可以是足以減輕對抑制表皮生長因子受體的過量表現及/或過度活性有響應的疾病症狀的量。對於癌症治療，在體內的功效能例如通過評估存活期、疾病進展的時間(TTP)、回應率(RR)、回應持續時間及/或生活品質來測量。正如本技術領域具通常技術者所公認的那樣，有效量可以隨著投予途徑、賦形劑的使用以及與其他藥物的合用而變化。

術語"有效量"還可以指有效抑制表皮生長因子受體的過量表現及/或過度活性的本文所述的至少一種化合物及/或至少一種藥學上可接受的鹽的量。

本發明的一種或多種具體實施例的詳細情況如下文所示。

本發明提供了至少一種選自以下的化合物：(3aR,6aR)-N-(4-(1-(3-氟苄基)-1H-吲唑-5-基胺基)-7-甲氧基喹唑啉-6-基)-1-甲基六氫吡咯並[3,4-b]吡咯-5(1H)-甲醯胺；(3aS,6aS)-N-(4-(1-(3-氟苄基)-1H-吲唑-5-基胺基)-7-甲氧基喹唑啉-6-基)-1-甲基六氫吡咯並[3,4-b]吡咯-5(1H)-甲醯胺；(3aR,6aR)-N-(4-(3-乙炔基苯基胺基)-7-甲氧基喹唑啉-6-基)-1-甲基-六氫吡咯並[3,4-b]吡咯-5(1H)-甲醯胺；(3aS,6aS)-N-(4-(3-氯-4-(3-氟苄基氧基)苯基胺基)-7-甲氧基喹唑啉-6-基)-1-甲基六氫吡咯並[3,4-b]吡咯-5(1H)-甲醯胺；(3aR,6aR)-N-(4-(3-氯-4-(3-氟苄基氧基)苯基胺基)-7-甲氧基喹唑啉-6-基)-1-甲基六氫吡咯並[3,4-b]吡咯-5(1H)-甲醯胺；(3aS,6aS)-N-(4-(3-氯-4-(3-氟苄基氧基)苯基胺基)喹唑啉-6-基)-1-甲基六氫吡咯並[3,4-b]吡咯-5(1H)-甲醯胺；和(3aR,6aR)-N-(4-(3-氯-4-(3-氟苄基氧基)苯基胺基)喹唑啉-6-基)-1-甲基六氫吡咯並[3,4-b]吡咯-5(1H)-甲醯胺，及/或至少一種其藥學上可接受的鹽。

本文所述的喹唑啉化合物及/或其藥學可接受的鹽可通過本領域公知的方法由可市售獲得的原料合成。具體的方法在本申請的實施例部分有舉例說明。

可用於合成所需的喹唑啉化合物的合成化學轉化例如在R. Larock,Comprehensive Organic Transformations ,VCH Publishers(1989)；T.W. Greene和P.G.M. Wuts,Protective Groups in Organic Synthesis ,第3版,John Wiley and Sons(1999)；L. Fieser和M. Fieser,Fieser and Fieser’s Reagents for Organic Synthesis ,John Wiley and Sons(1994)；以及L. Paquette編輯,Encyclopedia of Reagents for Organic Synthesis ,John Wiley and Sons(1995)及其後續的版本中也有記載。

本文所述的至少一種化合物及/或至少一種藥學上可接受的鹽可通過管柱層析、高效液相層析、結晶法或其他合適的方法純化。

本文所述的至少一種喹唑啉化合物及/或至少一種藥學上可接受的鹽能與EGFR激酶相互作用及/或抑制EGFR的活性。

本發明還提供了一種組成物，其包含至少一種藥學上可接受的載劑以及本文所述的至少一種化合物及/或至少一種藥學上可接受的鹽。

包含本文所述的至少一種化合物及/或至少一種藥學上可接受的鹽的組成物能以各種已知的方式例如口服、胃腸外、通過吸入噴霧或經由植入的儲存器進行投予。本文所用的術語"胃腸外"包括皮下、皮內、靜脈內、肌內、關節內、動脈內、滑膜內、胸骨內、鞘內、損害內和顱內注射或輸注技術。

口服組成物可以是任何一種口服可接受的劑型，包括但不限於片劑、膠囊、乳劑以及水性懸浮劑、分散物和溶液。常用的片劑載劑包括乳糖和玉米澱粉。片劑中也常加入潤滑劑如硬脂酸鎂。對於以膠囊形式進行的口服投予，有用的稀釋劑包括乳糖和乾燥的玉米澱粉。當水性懸浮劑或乳劑口服投予時，可將活性成分懸浮或溶解於混合有乳化劑或助懸劑的油相中。如果需要，還可加入某些甜味劑、矯味劑或著色劑。

無菌可注射組成物(如水性或油性懸浮劑)可按照本領域已知的技術使用合適的分散劑或潤濕劑(如吐溫80(Tween 80))和助懸劑來配製。無菌可注射製劑也可以是在無毒的胃腸外可接受的稀釋劑或溶劑中的無菌的可注射溶液或懸浮液，例如在1,3-丁二醇中的溶液。可以利用的藥學上可接受的介質和溶劑尤其是甘露醇、水、林格氏液和等張的氯化鈉溶液。此外，無菌的固定油通常被用作溶劑或懸浮媒介物(例如合成的單酸甘油酯或甘油二酯)。脂肪酸例如油酸及其甘油脂衍生物可用於製備注射劑，因為它們是天然的藥學上可接受的油，例如橄欖油或蓖麻油，例如它們的聚氧乙基化形式。這些油溶液或懸浮液還可含有長鏈醇稀釋劑或分散劑、或者羧甲基纖維素或類似的分散劑。

吸入組成物可按照藥物製劑領域中習知的技術製備，且可製備成在鹽水中的溶液，使用苯甲醇或其他合適的防腐劑、增加生物利用度的吸收促進劑、碳氟化合物、及/或本領域已知的其他增溶劑或分散劑。

局部用組成物可配製成油、乳膏劑、洗劑、軟膏劑等形式。用於所述組成物的合適載劑包括植物油或礦物油、白礦脂(白軟石蠟)、支鏈脂肪或油、動物脂肪和高分子量的醇(大於12個碳)。在一些具體實施例中，藥學上可接受的載劑是活性成分可溶解於其中的藥學上可接受的載劑。如果需要，還可以包含乳化劑、穩定劑、保濕劑和抗氧化劑以及產生顏色或香味的物質。此外，在這些局部用製劑中還可以使用經皮滲透促進劑。所述促進劑的例子可見於美國專利3,989,816和4,444,762。

可以由礦物油、自乳化蜂蠟和水的混合物配製乳膏劑，在所述混合物中混合有溶解在少量油如杏仁油中的活性成分。所述乳膏劑的例子是包括約40份水、約20份蜂蠟、約40份礦物油和約1份杏仁油的乳膏劑。軟膏劑可如下配製：將活性成分在植物油如杏仁油中的溶液與溫熱的軟石蠟混合，並使該混合物冷卻。所述軟膏劑的例子是包括約30%重量的杏仁油和約70%重量的白軟石蠟的軟膏劑。

"藥學上可接受的載劑"是指與組成物中的活性成分相容(在一些具體實施例中能穩定活性成分)並且對治療的個體無害的載體。例如，增溶劑如環糊精(其與本文所述的至少一種化合物及/或至少一種藥學上可接受的鹽形成特定的、溶解性更大的複合物)可作為藥物賦形劑來遞送活性成分。其他載劑的例子包括膠態二氧化矽、硬脂酸鎂、纖維素、十二烷基硫酸鈉和D&C Yellow #10。親水性賦形劑例如合成的和天然的聚合物(例如白蛋白及其衍生物)也是藥學上可接受的載劑的例子。

合適的體外測定法可用于初步評估本文所述的至少一種化合物及/或至少一種藥學上可接受的鹽抑制EGFR活性的功效。通過體內測定法可進一步考察本文所述的至少一種化合物及/或至少一種藥學上可接受的鹽治療癌症的功效。例如，可將本文所述的化合物及/或其藥學上可接受的鹽投予至患有癌症的動物(如小鼠模型)並且檢測其治療效果。根據結果，還可以確定對動物如人而言適宜的劑量範圍和投予途徑。

本發明還提供了一種治療對抑制表皮生長因子受體的過量表現及/或過度活性有反應的癌症的方法，其包括向需要其的個體投予有效量的本文所述的至少一種化合物及/或至少一種藥學上可接受的鹽。

本文所述的至少一種化合物及/或至少一種藥學上可接受的鹽能用於實現有益的治療或預防效果，例如在患有癌症的個體中實現有益的治療或預防效果。本文所用的術語"癌症"是指以失控的或失調的細胞增殖、減少的細胞分化、不適宜的侵入周圍組織的能力及/或在異位建立新生長的能力為特徵的細胞障礙。術語"癌症"包括但不限於實體瘤和血液腫瘤(bloodborne tumor)。術語"癌症"包括皮膚、組織、器官、骨骼、軟骨、血液和血管的疾病。術語"癌症"還包括原發性癌症和轉移性癌症。

實體瘤的非限制性例子包括胰腺癌；膀胱癌；結腸直腸癌；乳腺癌，包括轉移性乳腺癌；前列腺癌，包括雄激素依賴性前列腺癌和雄激素非依賴性前列腺癌；腎癌，包括例如轉移性腎細胞癌；肝細胞癌；肺癌，包括例如非小細胞肺癌(NSCLC)、細支氣管肺泡癌(BAC)和肺腺癌；卵巢癌，包括例如進行性上皮癌或原發性腹膜癌(primary peritoneal cancer)；子宮頸癌；胃癌；食道癌；頭頸癌，包括例如頭頸鱗狀細胞癌；皮膚癌，包括例如惡性黑素瘤；神經內分泌癌，包括轉移性神經內分泌腫瘤；腦腫瘤，包括例如神經膠質瘤、退行性寡樹突膠質細胞瘤(anaplastic oligodendroglioma)、成人多形性神經膠質母細胞瘤和成人退行性星狀細胞瘤；骨癌；軟組織肉瘤；和甲狀腺癌。

血液腫瘤的非限制性例子包括急性骨髓性白血病(acute myeloid leukemia,AML)；慢性骨髓性白血病(chronic myelogenous leukemia,CML)，包括加速期CML和CML急變期(CML-BP)；急性淋巴性白血病(acute lymphoblastic leukemia,ALL)；慢性淋巴性白血病(chronic lymphocytic leukemia,CLL)；霍奇金病(HD)；非霍奇金淋巴瘤(NHL)，包括濾泡型淋巴瘤和套細胞淋巴瘤；B細胞淋巴瘤；T細胞淋巴瘤；多發性骨髓瘤(MM)；瓦爾登斯特倫巨球蛋白血症(Waldenstrom’s macroglobulinemia)；骨髓增生異常綜合症(MDS)，包括難治性貧血(RA)、環形鐵粒幼紅細胞性難治性貧血(refractory anemia with ringed siderblasts,RARS)、原始細胞過多性難治性貧血(refractory anemia with excess blasts,RAEB)和轉化中的原始細胞過多性難治性貧血(RAEB in transformation,RAEB-T)；以及骨髓增生綜合症(myeloproliferative syndrome)。

在一些具體實施例中，所治療的癌症的例子包括但不限於肺癌、頭頸癌、結腸直腸癌、胰腺癌、結腸癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、胃癌、腎癌、肝癌、腦癌、骨癌和白血病。在一些具體實施例中，所治療的癌症的例子選自肺癌、頭頸癌、結腸直腸癌、咽癌、表皮樣癌和胰腺癌。

在一些具體實施例中，本文所述的至少一種化合物及/或至少一種藥學上可接受的鹽與有效量的其他治療劑聯合投予，所述其他治療劑不同于本文所述的至少一種化合物及/或至少一種藥學上可接受的鹽。在一些具體實施例中，所述其他治療劑是抗癌劑。在一些具體實施例中，所述其他治療劑是通常投予至患有被治療的疾病或病症的患者的治療劑。本文所述的至少一種化合物及/或至少一種藥學上可接受的鹽可與所述其他治療劑以單一劑型一起投予或者以分開的劑型一起投予。當以分開的劑型投予時，其他治療劑可以在本文所述的至少一種化合物及/或至少一種藥學上可接受的鹽投予之前、同時或之後投予。

在一些具體實施例中，本文所述的至少一種化合物及/或至少一種藥學上可接受的鹽與抗癌劑聯合投予。本文所用的術語"抗癌劑"是指以治療癌症為目的投予於患有癌症的個體的任何物質。抗癌劑的非限制性例子包括：放射治療；免疫治療；損傷DNA的化學治療劑；和破壞細胞複製的化學治療劑。

損傷DNA的化學治療劑的非限制性例子包括拓撲異構酶Ⅰ抑制劑(如，伊立替康、拓撲替康、喜樹鹼及其類似物或代謝物、和多柔比星)；拓撲異構酶Ⅱ抑制劑(如，依託泊苷、替尼泊苷和柔紅黴素)；烷化劑(如，苯丙氨酸氮芥、苯丁酸氮芥、白消安、噻替呱、異環磷醯胺、卡莫司汀、洛莫司汀、司莫司汀、鏈脲黴素、氨烯咪胺(decarbazine)、甲氨蝶呤、絲裂黴素C和環磷醯胺)；DNA插入劑(如，順鉑、奧沙利鉑和卡鉑)；DNA插入劑和自由基產生劑如博來黴素；以及核苷擬似物(如，5-氟尿嘧啶、卡培他濱(capecitibine)、吉西他濱、氟達拉濱、阿糖胞苷、巰基嘌呤、硫鳥嘌呤、噴司他丁和羥基脲)。

破壞細胞複製的化學治療劑包括：紫杉醇、多西他賽和有關類似物；長春新鹼、長春鹼及有關類似物；沙立度胺及有關類似物(如，CC-5013和CC-4047)；蛋白酪胺酸激酶抑制劑(如，甲磺酸伊馬替尼和吉非替尼)；蛋白酶體抑制劑(如，硼替佐米)；NF-κB抑制劑，包括ⅠκB激酶的抑制劑；與癌症中過量表現的蛋白質結合並從而下調細胞複製的抗體(如，曲妥珠單抗、利妥昔單抗、西妥昔單抗和貝伐珠單抗)；以及已知在癌症中被上調、過量表現或啟動的蛋白質或酶的其他抑制劑，所述蛋白質或酶的抑制下調細胞複製。

本發明還提供了一種抑制表皮生長因子受體的過量表現及/或過度活性的方法，其包括使表皮生長因子受體與有效量的本文所述的至少一種化合物及/或至少一種藥學上可接受的鹽接觸。

實施例

下列實施例用於對本發明進行舉例說明，但不限制本發明的範圍。

在下列實施例中，使用了下面的縮寫：

AcOH　乙酸

CMC-Na　羧甲基纖維素鈉

DELFIA　解離增強鑭系元素螢光免疫分析(Dissociation-Enhanced Lanthanide Fluorescent Immunoassay)

DMEM　DME培養基(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium)

DMF　N,N-二甲基甲醯胺

DMSO　二甲基亞碸

DTT　二硫蘇糖醇

EDTA　乙二胺四乙酸

EtOAc　乙酸乙酯

FBS　胎牛血清

h　小時

mL　毫升

min　分鐘

PBS　磷酸鹽緩衝鹽水

PE　石油醚

PMSF　苯甲磺醯氟

Py　吡啶

THF　四氫呋喃

Tris-Cl　三羥甲基胺基甲烷鹽酸鹽

實施例1： (3aR,6aR)-N-(4-(1-(3-氟苄基)-1H-吲唑-5-基胺基)-7-甲氧基喹唑啉-6-基)-1-甲基六氫吡咯並[3,4-b]吡咯-5(1H)-甲醯胺

按照下面的流程製備了化合物1 。

將5-硝基-1H-吲唑(1-a ,5g,30.65mmol)、1-(溴甲基)-3-氟苯(3.76mL,30.65mmol)和碳酸鉀粉末(4.66g,30.65 mmol)在DMF(3mL)中的混合物於80℃攪拌3h，然後將其倒入水(100 mL)中。通過過濾獲得沉澱物，將其用矽膠層析(PE/EtOAc=3:1)純化，得到1-b (5.3g,19.7mmol)。

在N₂ 下，向1-b (5.3g,19.7mmol)在甲醇(20 mL)中的溶液中加入阮內鎳(0.53g,濕重)，將混合物脫氣並且在氫氣氛下於室溫攪拌過夜。小心濾出催化劑，將濾液真空濃縮，得到1-c (4.65g,19.3mmol)。

將2-胺基-4-氟苯甲酸(1-d ,7.75g,50mmol)和乙酸甲脒(15.6g,150mmol)在乙醇中的混合物於回流溫度攪拌過夜，然後冷卻至環境溫度。濾出沉澱物並真空乾燥，得到1-e (8.0g,48mmol)。

將7-氟喹唑啉-4(3H)-酮(1-e ,8.0g,48mmol)溶於濃H₂ SO₄ (24mL)中，將溶液在冰浴中冷卻至0℃。然後向上述溶液中滴加HNO₃ (24 mL)以將反應溫度保持在0℃以下。然後將混合物緩慢加熱至100℃並攪拌3天。將所得的混合物冷卻至環境溫度，倒入冰水中。通過過濾收集沉澱物，然後用AcOH重結晶，得到1-f (3.25g,15.53mmol)。

在N₂ 下，將金屬鈉(0.71g,31mmol)小心加入到甲醇(無水,100mL)中並攪拌10分鐘以製備新鮮的甲醇鈉溶液。然後向上述溶液中加入7-氟-6-硝基喹唑啉-4(3H)-酮(1-f ,3.25g,15.53mmol)，將混合物加熱至回流達3h。將所得的混合物冷卻至環境溫度，用HCl(2N)酸化至pH=3至4。在減壓下除去揮發物。將殘餘物懸浮在水中，通過過濾收集固體，真空乾燥，得到1-g (3.17g,14.4mmol)。

將DMF(0.5mL)加入到7-甲氧基-6-硝基喹唑啉-4(3H)-酮(1-g ,1.23g,5.56mmol)在SOCl₂ (8mL)中的溶液中，將混合物加熱至回流達4h。在減壓下除去揮發物，得到1-h (1.2g,5.0mmol)。

將4-氯-7-甲氧基-6-硝基喹唑啉(1-h ,1.2g,5.02mmol)和1-(3-氟苄基)-1H-吲唑-5-胺(1-c ,1.2g,4.98mmol)在二烷(40mL)中的混合物加熱至回流達3h。然後將其冷卻至環境溫度。通過過濾得到沉澱物，用矽膠層析純化，得到1-i (1.7g,3.88mmol)，為黃色固體。

在N₂ 下，向1-i (1.5g,3.7mmol)在甲醇(20mL)中的溶液中加入阮內鎳(0.13g,濕重)。將懸浮液脫氣，用H₂ 淨化三次，然後在氫氣氛下於室溫攪拌4h。小心濾掉催化劑。將濾液真空濃縮，得到1-j (1.36g,3.29mmol)，為黃色固體。

向1-j (1.36g,3.29mmol)和吡啶(0.78g,9.86mmol)在DMF(3mL)中的溶液中加入氯甲酸苯酯(1.53g,9.86mmol)。將混合物於室溫攪拌1h。通過過濾得到沉澱物，乾燥，得到1-k (1.40g,2.63mmol)。

將1-k (1.1g,2.2mmol)、吡啶(0.2g,2.6mmol)和(3aR,6aR)-1-甲基八氫吡咯並[3,4-b]吡咯(0.33g,2.6mmol)在DMF(3mL)中的溶液於80℃攪拌1h，然後倒入冰水中，用EtOAc(3×40mL)萃取。將合併的萃取液用鹽水洗滌，用N₂ SO₄ (無水)乾燥、過濾並濃縮。將殘餘物用矽膠層析(EtOAc/甲醇=2:1)純化，得到化合物1 (0.79g,1.4mmol)。MS(m /e ): 567.1(M+1)⁺ 。

實施例2 ：(3aS,6aS)-N-(4-(1-(3-氟苄基)-1H-吲唑-5-基胺基)-7-甲氧基喹唑啉-6-基)-1-甲基六氫吡咯並[3,4-b]吡咯-5(1H)-甲醯胺

按照實施例1的操作在類似的條件下使用(3aS,6aS)-1-甲基八氫吡咯並[3,4-b]吡咯製備了化合物2 。MS(m /e ): 566.8(M+1)⁺ 。

實施例3 ：(3aR,6aR)-N-(4-(3-乙炔基苯基胺基)-7-甲氧基喹唑啉-6-基)-1-甲基-六氫吡咯並[3,4-b]吡咯-5(1H)-甲醯胺

于-10℃，向化合物3-a (40g,0.138mol,按照WO2010002845中所公開的操作製備)、吡啶(40mL,0.495mol)和DMF(無水,22mL)在無水THF(500mL)中的溶液中滴加氯甲酸苯酯3-b (22mL,0.175mol)。將混合物於室溫攪拌12 h。濾出沉澱物，然後將其懸浮在飽和NaHCO₃ 溶液(500mL)中。將固體濾出，用H₂ O和EtOAc洗滌，真空乾燥，得到化合物3-c (46g)。將化合物3-c (1g,2.44mmol)和化合物3-d (369mg,2.92mmol)在二烷(30mL)中的混合物於70℃攪拌5小時，然後冷卻至環境溫度。將沉澱物濾出，用EtOAc洗滌，真空乾燥，得到化合物3 (0.8g)。MS(m/e): 443.4(M+1)⁺ 。

實施例4 ：(3aS,6aS)-N-(4-(3-氯-4-(3-氟苄基氧基)苯基胺基)-7-甲氧基喹唑啉-6-基)-1-甲基六氫吡咯並[3,4-b]吡咯-5(1H)-甲醯胺

按照實施例2的操作製備了化合物4 。

MS(m /e ): 576.9(M+1)⁺

實施例5 ：(3aR,6aR)-N-(4-(3-氯-4-(3-氟苄基氧基)苯基胺基)-7-甲氧基喹唑啉-6-基)-1-甲基六氫吡咯並[3,4-b]吡咯-5(1H)-甲醯胺

按照實施例1的操作製備了化合物5 。

MS(m /e ): 576.7(M+1)⁺

實施例6 ：(3aS,6aS)-N-(4-(3-氯-4-(3-氟苄基氧基)苯基胺基)喹唑啉-6-基)-1-甲基六氫吡咯並[3,4-b]吡咯-5(1H)-甲醯胺

按照實施例2的操作製備了化合物6 。

MS(m /e ): 546.8(M+1)⁺

實施例7 ：(3aR,6aR)-N-(4-(3-氯-4-(3-氟苄基氧基)苯基胺基)喹唑啉-6-基)-1-甲基六氫吡咯並[3,4-b]吡咯-5(1H)-甲醯胺

按照實施例1的操作製備了化合物7 。

MS(m /e ): 546.8(M+1)⁺

藥理學試驗 抑制EGFR活化的試驗

細胞接種及饑餓：將稀釋在含有10% FBS的DMEM中的A431(人表皮樣癌)細胞以1.3×10⁴ 個細胞/孔接種在96孔盤中並培養過夜。然後將細胞培養物的培養基替換為90μL/孔無血清DMEM培養基。將板培養過夜以進行饑餓。

化合物稀釋及處理：將供試化合物以3倍系列稀釋在含有5% DMSO的無FBS的培養基中。向細胞中加入10μL/孔的稀釋的化合物，向對照孔中加入10μL/孔不含供試化合物的5% DMSO。對於每個試驗點而言進行二重複的研究。然後，將盤在5% CO₂ 培養箱中於37℃培養60分鐘。加入10μL/孔200 ng/mL EGF(Biosource，PHG0064)，將盤在5% CO₂ 培養箱中於37℃培養45分鐘。

裂解物的製備：除去培養基，向每個孔中加入100μL/孔50 mM Tris-Cl,pH 8.0細胞裂解緩衝液(含有0.5M NaCl,0.2 mM EDTA,0.1% Triton X-100,1μg/mL抑肽酶(aprotinin),0.75μg/mL亮抑蛋白酶肽,1μg/mL胃蛋白酶抑制劑,1 mM DTT,500μM釩酸鈉和1 mM PMSF)以裂解細胞。在使用前即刻加入蛋白酶抑制劑。將細胞裂解物於-80℃冷凍過夜。

板被覆及封閉：向96-孔DELFIA盤(Perkin Elmer,AAAND-0001)中加入100μL/孔用PBS稀釋的0.5μg/mL抗-EGFR抗體(Perkin Elmer,AF231)，在溫和振搖下於25℃培養過夜。棄去溶液。將盤用200μL/孔DELFIA洗滌緩衝液(含有0.05%吐溫-20的PBS緩衝液)洗滌3次。向每個孔中加入200μL/孔封閉緩衝液(含有0.137M NaCl,0.0027M KCl,0.01M Na₂ PO₄ ．12H₂ O,0.0015M KH₂ PO₄ ,pH7.4的PBS緩衝液,和1% BSA)，將盤在溫和振搖下於25℃培養2 h。

結合：棄去封閉緩衝液，將盤用200μL/孔DELFIA洗滌緩衝液洗滌3次。然後向每個孔中加入80μL/孔樣品稀釋液(20 mM Tris-Cl/pH7.3,150 mM NaCl,0.1% BSA和0.05%吐溫-20)和20μL/孔細胞裂解物。將盤在溫和振搖下於25℃再培養1h。

檢測：將盤再次用200μL/孔DELFIA洗滌緩衝液洗滌3次。加入100μL/孔用DELFIA測定緩衝液(Perkin Elmer,1244-106)稀釋的0.5μg/mL Eu-PT66抗體(Perkin Elmer,AD0040)，將盤在溫和振搖下於25℃培養1h。用200μL/孔DELFIA洗滌緩衝液洗滌3次後，加入100μL/孔DELFIA促進緩衝液(enhancement buffer)(Perkin Elmer,4001-0010)。將盤在溫和振搖下於25℃培養30 min。

讀數：在Victor³ (PerkinElmer)上於340 nm的激發波長和620 nm的發射波長測量螢光信號。

如下計算抑制率：

其中：

[螢光讀數]_處理的 是EGF刺激後用供試化合物處理的孔的讀數。

[螢光讀數]_未處理的 是既不用化合物處理、也不進行EGF刺激的孔的讀數，其用作細胞背景信號。

[螢光讀數]_EGF 是進行EGF刺激、但不用化合物處理的孔的讀數，其用作最大信號。

使用XL-Fit 2.0軟體計算IC₅₀ 。

化合物1 -化合物7 的IC₅₀ 值分別為0.185、0.439、0.006、0.016、0.044、0.210和0.241 μM。

在人異種移植模型中進行的體內抗腫瘤試驗

1.　材料與方法：

人腫瘤細胞株：Fadu(人頭頸、咽癌,HTB-43)、HCC827(人非小細胞肺癌,NSCLC;CRL-2868)、A431(人表皮樣癌,CRL-2592)細胞株均購自ATCC；使Fadu、HCC827和A431細胞分別在EMEM、RPMI 1640和DMEM培養基+10% FBS中生長。將這些細胞在加濕培養箱中於37℃、在5% CO₂ 下培養。

動物：無胸腺小鼠(6至8周齡)購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司。將動物在標準條件(12:12 h光照/黑暗，相對濕度40%-50%,20-25℃)下飼養於SPF環境中，每籠4只動物，動物自由攝取Co⁶⁰ 照射的無菌食物和無菌水。

活性劑：將供試化合物以不同濃度(0.05至1.0 mg/mL)配製在無菌的0.5% CMC-Na中，然後於4℃儲存。

腫瘤細胞的皮下植入及抗腫瘤功效研究：將腫瘤細胞於37℃在5% CO₂ 培養箱中培養至它們達到約80%匯合。用0.05%胰蛋白酶-EDTA使細胞脫附，於800 rpm離心，將細胞懸浮在無血清的培養基中。調整濃度以進行裸鼠植入。使裸鼠隔離數天，然後進行植入，將在0.1 mL培養基中的3×10⁶ 個FaDu或A431細胞或者在0.2 mL培養基中的5×10⁶ 個HCC827細胞皮下注射於裸鼠的右側脅腹。

接種後1-3周，當平均腫瘤體積達到100-300 mm³ 時，將動物進行隨機化並分為介質組和化合物處理組。每天一次以不同劑量水準給小鼠口服介質、即0.5% CMC-Na或供試化合物。給藥體積為10 mL/kg體重(給藥方案如表1和表2中所示)。通過用測徑器測量長和寬每週測量腫瘤體積2-3次，用下式計算腫瘤體積：腫瘤體積(TV,mm³ )=寬² ×長/2。在實驗期間對動物的體重和行為進行了觀察。如下計算腫瘤生長抑制：TGI(%)=100-(T-T₀ )/(C-C₀ )×100%，其中T表示實驗期間在具體的一天處理組的平均腫瘤體積，T₀ 表示同一處理組在處理的第一天的平均腫瘤體積，C表示實驗期間在該具體的一天對照組的平均腫瘤體積，C₀ 表示同一對照組在處理的第一天的平均腫瘤體積。

2.　統計學分析：

腫瘤體積資料被表示為平均值±SD。採用單因素方差分析(one-way ANOVA)進行了多重比較，採用t-檢驗(Student’s t test)與介質對照進行了比較。P <0.05時認為差異在統計學上是顯著性的。

3.　結果：

在所述三個腫瘤模型中，供試化合物以劑量依賴性方式表現出了顯著的腫瘤生長抑制作用。另外，用供試化合物處理的小鼠在實驗期間均未表現出顯著的體重降低。

用實施例3中的代表性供試化合物產生的TGI(%)如下表所示。

hERG測定法 1.　細胞培養

使用用hERG cDNA穩定轉染並且表達hERG通道的CHO細胞株進行了研究。將細胞在含有以下物質的培養基中進行培養：

‧DME培養基(DMEM/F12)

‧10%(v/v)熱滅活胎牛血清(FBS)

‧1%(v/v)青黴素/鏈黴素

‧500μg/ml試劑(G418)

試驗前，採用Accumax(Innovative Cell Technologies)收穫細胞。

2.　溶液

使用下列溶液進行了電生理記錄：

3.　記錄系統

使用EPC10 USB(HEKA)進行了全細胞記錄。將細胞於-80 mV的保持電位進行電壓鉗制。通過於+20 mV去極化2秒啟動hERG電流，然後使電流回到-50 mV達2秒以除去失活並觀察去啟動尾電流。於-50 mV的第一個步驟被用作基線以測量尾電流峰幅度。

4.　化合物的處置與稀釋

在玻璃小瓶中將化合物製備成10 mM DMSO儲備液。將儲備液於室溫劇烈混合10分鐘。為了進行測試，使用溶液在玻璃小瓶中稀釋化合物；在使用前不超過30分鐘製備稀釋液。在最後稀釋時存在等量的DMSO(0.1%)。

5.　電生理學操作

在完成全細胞模式後，對細胞監測90秒以評估穩定性，並且用外液洗滌66秒。然後，在整個操作中每20秒對細胞應用上文所述的電壓方案。僅允許記錄參數高於閾值的穩定細胞進入加藥操作。

對細胞應用含有0.1% DMSO(介質)的外液以建立基線。使電流穩定3分鐘後，應用化合物。分4個步驟加入化合物溶液，將細胞保持在供試溶液中，直至化合物的作用達到穩態或者化合物的作用達最大值6 min。隨後，加入陽性對照(100 nM西沙必利(Cisapride))。用外液進行洗脫，直至電流恢復至穩態。

6.　資料分析

採用Pulsefit and Origin 7(Originlab Corporation)對資料進行了分析。

7.　結果

使用手動全細胞膜片鉗測定法，化合物3 以9.3±1.2μM(五個濃度，5×2)的IC₅₀ 抑制hERG尾電流。

Claims (7)

1. 一種化合物(3aR,6aR)-N-(4-(3-乙炔基苯基胺基)-7-甲氧基喹唑啉-6-基)-1-甲基-六氫吡咯並[3,4-b]吡咯-5(1H)-甲醯胺，及/或其藥學上可接受的鹽。
2. 一種藥物組成物，其包括至少一種藥學上可接受的載劑以及化合物(3aR,6aR)-N-(4-(3-乙炔基苯基胺基)-7-甲氧基喹唑啉-6-基)-1-甲基-六氫吡咯並[3,4-b]吡咯-5(1H)-甲醯胺及/或其藥學上可接受的鹽。
3. 一種使用化合物(3aR,6aR)-N-(4-(3-乙炔基苯基胺基)-7-甲氧基喹唑啉-6-基)-1-甲基-六氫吡咯並[3,4-b]吡咯-5(1H)-甲醯胺，及/或其藥學上可接受的鹽在製備治療對抑制表皮生長因子受體的過量表現及/或過度活性有反應的癌症之藥物組成物的用途。
4. 如申請專利範圍第3項所述的用途，其中所述癌症選自肺癌；頭頸癌；結腸直腸癌；咽癌；表皮樣癌和胰腺癌。
5. 如申請專利範圍第4項所述的用途，其中所述肺癌為非小細胞肺癌。
6. 如申請專利範圍第3項所述的用途，其進一步包括向所述個體投予有效量的抗癌劑，其中所述抗癌劑不同於申請專利範圍第1項中所述的化合物及/或其藥學上可接受的鹽。
7. 一種使用如申請專利範圍第1項中所述的化合物及/或其藥學上可接受的鹽在製備抑制表皮生長因子受體的過量表現及/或過度活性之藥物組成物的用途。