ES2635515T3

ES2635515T3 - Micropartícula y composición farmacéutica de la misma

Info

Publication number: ES2635515T3
Application number: ES09713553.7T
Authority: ES
Inventors: Yoshinori Kakizawa; Reiji Nishio; Junji Michizoe; Masakazu Koiwa; Nobuo Ida; Taisuke Hirano; Yoichiro Koshi
Original assignee: Toray Industries Inc
Current assignee: Toray Industries Inc
Priority date: 2008-02-22
Filing date: 2009-02-20
Publication date: 2017-10-04
Anticipated expiration: 2029-02-20
Also published as: CA2715665C; BRPI0905790A2; HUE035331T2; CN101932311B; RU2010138925A; EP2251006B1; CN101932311A; CA2715665A1; AU2009216216A1; AU2009216216B2; PT2251006T; KR101542433B1; DK2251006T3; EP2251006A4; PL2251006T3; JPWO2009104706A1; EP2251006A1; KR20100120119A; RU2490009C2; JP5712485B2

Abstract

Micropartícula, que comprende un aglomerado de partículas que contienen sustancia activa hidrófila, partícula que comprende un polímero anfífilo compuesto por un segmento hidrófobo de poli(hidroxiácido) y un segmento hidrófilo de polisacárido o polietilenglicol, y una sustancia activa hidrófila, y en la que el número de aglomeración de dichas partículas está en el intervalo de10 a la séptima potencia de 10.

Description

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DESCRIPCION

Microparticula y composicion farmaceutica de la misma SECTOR TECNICO

La presente invencion se refiere a una microparticula que comprende un aglomerado de particulas que contienen sustancias activas hidrofilas, y una composicion farmaceutica de la misma. Particularmente, la presente invencion se refiere a una microparticula y una composicion farmaceutica de la misma como un llamado sistema de administracion de farmacos. Mas particularmente, por ejemplo, la presente invencion se refiere a una microparticula que contiene eficazmente una proteina, una farmaco peptidico, un farmaco de acido nucleico, y similares de propiedad hidrofila y gran peso molecular, y una composicion farmaceutica de la misma.

ANTECEDENTES TECNICOS

Se desarrollan preparaciones particuladas que tienen farmacos encerrados en particulas finas llamadas nanoparticula, microparticula, nanoesfera, microesfera o microcapsula, y se intenta utilizarlas como agentes de liberacion sostenida para farmacos.

Las preparaciones particuladas que utilizan compuestos polimericos como base incluyen particulas finas compuestas por acido polilactico o poli(acido lactico-acido glicolico) biodegradable. En estas preparaciones particuladas, es dificil encapsular un farmaco proteico o peptidico de propiedad hidrofila y gran peso molecular mientras que mantiene la bioactividad. Ademas, cuando se administra en el cuerpo humano, se sabe que el farmaco es liberado de forma masiva en un corto periodo, y este fenomeno se denomina una descarga inicial.

Como particulas finas compuestas por un polimero de union covalente de sacarido y poli(hidroxiacido), la bibliografia de patentes 1 da a conocer una microcapsula para portar una sustancia farmacologicamente activa compuesta por un producto de reaccion de poliol y acido polilactico. En esta tecnica, no se utilizan polisacaridos, y no se menciona nada acerca de la inclusion de un peptido o proteina. La microcapsula fabricada mediante un procedimiento de secado por pulverizacion libero el farmaco encapsulado en un 62% en 24 horas. Esta velocidad de liberacion es demasiado rapida, y la microcapsula puede aplicarse dificilmente como un agente de liberacion sostenida para un farmaco.

La bibliografia de patentes 2 y la bibliografia no de patentes 1 dan a conocer una nanoparticula o una nanoparticula compuesta por un material que tiene un polimero biodegradable injertado en polisacaridos, pero estas bibliografias no mencionan nada acerca de una microparticula compuesta por nanoparticulas. La bibliografia de patentes 2 da a conocer, por ejemplo, un procedimiento de emulsion doble ya mencionado en otras bibliografias, como un procedimiento de fabricacion de una microparticula para encapsular una sustancia activa hidrofila, pero no hay ninguna descripcion especifica, y no se constata la inclusion de un farmaco en una particula, o la liberacion de un farmaco a partir de una particula. El documento no de patente 1 da a conocer una microparticula que encapsula una albumina fabricada mediante el procedimiento de emulsion doble, pero la eficiencia de encapsulacion para la cantidad incluida de la albumina es el 53% o menos, y la baja eficiencia de encapsulacion de la sustancia activa hidrofila presenta un problema en el coste de fabricacion.

La bibliografia de patentes 3 da a conocer una particula fina que contiene un polimero anfifilo compuesto por polisacaridos y un poliester alifatico, mas especificamente una particula fina compuesta por un nucleo interno de polisacaridos, una capa externa hidrofoba de poliester alifatico, y un modificador de superficie unido a la capa externa hidrofoba. Esta particula fina no tiene una estructura de aglomeracion de particulas finas, y no se muestran ejemplos especificos sobre particulas de diametro de particula de unidades micrometricas. La eficiencia de encapsulacion de la sustancia hidrofila es del 50% o menos, y esta baja eficiencia de encapsulacion es un problema similar al caso anterior.

La bibliografia de patentes 4 da a conocer una nanoparticula de diametro de particula promedio de menos de 300 nm, compuesta por un polimero de dextrano de origen natural, pero no se muestran ejemplos especificos. Esta no es una estructura de aglomeracion de particulas finas, y el diametro de particula promedio es de cientos de nanometros, y es probable que el farmaco se difunda desde el sitio de administracion, y no es preferente como agente de liberacion sostenida.

Como el polimero para formar particulas, la bibliografia de patentes 5 y la bibliografia de patentes 6 dan a conocer y sugieren la utilizacion de un polimero de bloques anfifilo que tiene una parte hidrofila tal como polietilenglicol, y una parte hidrofoba tal como poli(acido lactico-acido glicolico). Las particulas micelares que utilizan dicho polimero de bloques anfifilo son habitualmente hidrofobas en el interior, e hidrofilas en la capa externa, y son adecuadas para la contencion de farmacos de bajo peso molecular hidrofobos, pero no son adecuadas para la contencion de sustancias activas hidrofilas, tales como una proteina o un peptido.

La bibliografia de patentes 7 y la bibliografia no de patentes 2 dan a conocer intentos de contener una proteina en

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una particula utilizando un polimero de bloques anfifilo, pero la cantidad del farmaco que estara contenido es pequena, o la descarga inicial es grande, y hasta la fecha la tecnologia de fabricacion de particulas que tienen propiedades adecuadas como inyeccion de liberacion sostenida de un farmaco hidrofilo aun no esta establecida.

Bibliografia de patentes 1: Publicacion de solicitud de patente japonesa No. 8-19226

Bibliografia de patentes 2: Traduccion al japones de la publicacion de solicitud internacional PCT No. 2004-521152 Bibliografia de patentes 3: WO2006/095668

Bibliografia de patentes 4: Traduccion al japones de la publicacion de solicitud internacional PCT No. 10-511957

Bibliografia de patentes 5: Traduccion al japones de la publicacion de solicitud internacional PCT No. 2004-513154

Bibliografia de patentes 6: Traduccion al japones de la publicacion de solicitud internacional PCT No. 2004-514734

Bibliografia de patentes 7: Traduccion al japones de la publicacion de solicitud internacional PCT No. 2000-501084

Bibliografia no de patentes 1: Yuichi Oya y otros 3, "Encapsulation and/or Release Behavior of Bovine Serum Albumin within and from Polylactide-Grafted Dextran Microspheres" (Macromolecular Bioscience, 2004, vol. 4, pags. 458-463).

Bibliografia no de patentes 2: Anshu Yang y otros 5, "Tumor necrosis factor alpha blocking peptide loaded PEG- PLGA nanopeptides: Preparation and in vitro evaluation" (International Journal of Pharmaceutics, 2007, vol. 331, pags. 123-132).

DIVULGACION DE LA INVENCION PROBLEMAS A RESOLVER POR LA INVENCION

Tal como se ha mencionado anteriormente, se han desarrollado microparticulas utilizando un polimero, y es, por lo tanto, un objetivo primario de la presente invencion presentar una microparticula capaz de encapsular una sustancia activa hidrofila de forma eficiente y, mas particularmente, una microparticula capaz de liberar el farmaco encapsulado a una velocidad apropiada, sin causar descarga inicial significativa.

MEDIOS PARA RESOLVER LOS PROBLEMAS

Los inventores de la presente invencion acumularon intensamente estudios para resolver los problemas, y han completado finalmente la presente invencion.

Es decir, la presente invencion se refiere a una microparticula, segun la reivindicacion 1, que comprende un aglomerado de particulas que contienen sustancia activa hidrofila, particula que comprende un polimero anfifilo compuesto por un segmento hidrofobo de poli(hidroxiacido) y un segmento hidrofilo de polisacaridos o polietilenglicol, y una sustancia activa hidrofila, y en la que el numero de aglomeracion de dichas particulas esta en un intervalo de 10 a la septima potencia de 10. Mas particularmente, la presente invencion se refiere a una microparticula que comprende aglomerado de particulas que contienen sustancia activa hidrofila, particula que tiene un segmento hidrofilo de un polimero anfifilo en el interior y tiene una capa externa del segmento hidrofobo del polimero anfifilo, y un procedimiento de fabricacion de la misma, y una composicion farmaceutica de la misma.

EFECTOS DE INVENCION

La microparticula de la presente invencion es capaz de encapsular una sustancia activa hidrofila de forma eficiente, y de liberar la sustancia activa hidrofila a una velocidad apropiada en el cuerpo humano, y es, por lo tanto, utilizable como nueva preparacion de sistema de administracion de farmacos (DDS).

BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS

[La figura 1] muestra la liberacion de farmaco a partir de microparticulas que encapsulan hormona del crecimiento humana.

[La figura 2] muestra la liberacion de farmaco a partir de microparticulas de dextrano-PLGA que encapsulan insulina humana.

[La figura 3] muestra una imagen de SEM de microparticulas de dextrano-PLGA.

[La figura 4] muestra una imagen de SEM de una microparticula de polietilenglicol-poli(epsilon-caprolactona).

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[La figura 5] muestra los cambios en la evolucion temporal de la concentracion de farmaco en sangre en ratones a los que se administraron particulas que encapsulan hormona del crecimiento humana por via subcutanea.

[La figura 6] muestra cambios en la evolucion temporal de la concentracion de farmaco en sangre en ratones a los que se administraron microparticulas que encapsulan hormona del crecimiento humana por via subcutanea.

[La figura 7] muestra los cambios de peso corporal en ratones a los que se administraron microparticulas que encapsulan hormona del crecimiento humana por via subcutanea.

[La figura 8] muestra cambios en la evolucion temporal de la concentracion de IGF-1 en sangre en ratones a los que se administraron microparticulas que encapsulan hormona del crecimiento humana por via subcutanea.

[La figura 9] muestra la liberacion de farmaco en una solucion tampon de microparticulas que encapsulan exendina- 4.

[La figura 10] muestra cambios en la evolucion temporal de la concentracion de farmaco en sangre en ratones a los que se administraron microparticulas que encapsulan exendina-4 por via subcutanea.

[La figura 11] muestra la liberacion de farmaco a partir de microparticulas de particulas asociadas que encapsulan hormona del crecimiento humana.

[La figura 12] muestra la relacion entre el diametro de particula y la cantidad de carbonato de dimetilo anadida en el momento de la preparacion de una emulsion de tipo S/Ac/Ag.

[La figura 13] muestra resultados de la eficiencia de captura y tasa de contencion de microparticulas que encapsulan FD40.

[La figura 14] muestra una imagen de SEM de polvo de microparticulas preparado a partir de polimero de PEG- PLGA (5 k-10 k).

[La figura 15] muestra una imagen de SEM de polvo de microparticulas preparado a partir de polimero de PEG- PLGA (5 k-61 k).

[La figura 16] muestra el comportamiento de liberacion de FD40 a partir de microparticulas que encapsulan FD40.

[La figura 17] muestra el comportamiento de liberacion de farmaco a partir de microparticulas que encapsulan insulina humana.

[La figura 18] muestra cambios en la evolucion temporal de la concentracion de farmaco en sangre en ratones a los que se administraron microparticulas que encapsulan hormona del crecimiento humana por via subcutanea.

[La figura 19] muestra cambios en la evolucion temporal de la concentracion de farmaco en sangre en ratones a los que se administraron microparticulas que encapsulan hormona del crecimiento humana por via subcutanea.

[La figura 20] muestra cambios en la evolucion temporal de la concentracion de IGF-1 en sangre en ratones a los que se administraron microparticulas que encapsulan hormona del crecimiento humana por via subcutanea.

[La figura 21] muestra cambios en la evolucion temporal de la farmacocinetica sanguinea en ratones a los que se administraron microparticulas que encapsulan exendina-4 por via subcutanea.

[La figura 22] muestra la relacion entre el diametro de particula y la cantidad de carbonato de dimetilo anadida en el momento de la preparacion de emulsion de tipo S/Ac/Ag.

MEJOR MODO PARA LLEVAR A CABO LA INVENCION

La presente invencion, se caracteriza por la formacion de una microparticula mediante la aglomeracion de particulas que contienen sustancia activa hidrofila, particula que comprende un polimero anfifilo y una sustancia activa hidrofila. En el presente documento, la aglomeracion es la union de dos o mas particulas por medio de una fuerza inter-particulas u otra sustancia, y la formacion de un conjunto. La fuerza inter-particulas no esta particularmente especificada, pero ejemplos utilizables incluyen interaccion hidrofoba, puente de hidrogeno y fuerza de van der Waals. La aglomeracion no esta limitada a un estado de contacto mutuo de particulas, sino que sustancias que tienen una afinidad por particulas pueden estar presentes entre particulas, o particulas pueden distribuirse en una matriz. Como las sustancias que tienen afinidad por particulas o la matriz, es preferente un polimero. En la presente invencion, por aglomeracion de las particulas que contienen sustancia activa hidrofila, en comparacion con una unica particula, se consigue el efecto de que la eficiencia de encapsulacion de la sustancia activa hidrofila es mayor.

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El diametro de particula de las particulas que contienen sustancia activa hidrofila a asociar es variable.

Las microparticulas son particulas que tienen el diametro de particula que varia entre submicrometros y submilimetros. En la presente invencion, el diametro de particula promedio de las microparticulas no esta particularmente limitado, pero en el caso de la administracion de las microparticulas mediante inyeccion al cuerpo humano, cuanto mayor es el diametro de particula promedio, mayor es la aguja de la jeringa, y la carga del paciente se incrementa y, por lo tanto, desde el punto de vista de rebajar la carga del paciente, es preferente estar en un intervalo de 1 p.m a 50 pmi. El diametro de particula promedio de las microparticulas puede determinarse mediante analisis de imagenes utilizando un microscopio electronico de barrido.

El numero de aglomeraciones de particulas que contienen sustancia activa hidrofila para componer una microparticula esta en un intervalo de 10 hasta la septima potencia de 10, preferentemente, en un intervalo de la quinta potencia de 10 hasta la septima potencia de 10. El numero de aglomeraciones se calcula a partir del diametro de particula promedio de particulas que contienen sustancia activa hidrofila y el diametro de particula promedio de microparticulas.

En la presente invencion, el polimero anfifilo esta compuesto por un segmento hidrofobo de poli(hidroxiacido) y un segmento hidrofilo de polisacaridos o polietilenglicol. En el presente documento, la propiedad anfifila es un estado que tiene propiedades tanto hidrofilas como hidrofobas, y en cuanto a la propiedad hidrofila, cuando la solubilidad en agua es mayor en cierto segmento que en otros segmentos, se dice que dicho segmento es hidrofilo. Es preferente que un segmento hidrofilo sea soluble en agua, pero si es apenas soluble, es hidrofilo si su solubilidad en agua es mayor que otros segmentos. Se dice que cierto segmento es hidrofobo si la solubilidad en agua es menor que otras partes. Es preferente que un segmento hidrofobo sea insoluble en agua, pero si es soluble, puede ser hidrofobo si la solubilidad en agua es menor que otros segmentos.

Ejemplos especificos de poli(hidroxiacido) del polimero anfifilo incluyen acido poliglicolico, acido polilactico, poli(acido 2-hidroxibutirico), poli(acido 2-hidroxivalerico), poli(acido 2-hidroxicaproico), poli(acido 2-hidroxicaprico), poli(acido malico), y derivados y copolimeros de estos compuestos de alto peso molecular. Sin embargo, dado que se desea que las microparticulas de la presente invencion no tengan efectos significativos en el momento de la administracion en el cuerpo humano, tambien es preferente que el poli(hidroxiacido) del polimero anfifilo sea un polimero de alto peso molecular biocompatible. El polimero de alto peso molecular biocompatible es una sustancia que no tiene efectos significativos sobre el cuerpo humano cuando se administra, y mas especificamente, es preferente que la DL50 sea de 2.000 mg/kg o mas mediante administracion oral del polimero de alto peso molecular en rata.

Como poli(hidroxiacido) del polimero de alto peso molecular biocompatible, es preferente un copolimero de acido polilactico, y acido poliglicolico, o poli(acido lactico-acido glicolico). Cuando el poli(hidroxiacido) es un poli(acido lactico-acido glicolico), la relacion de composicion del poli(acido lactico-acido glicolico) (acido lactico/acido glicolico) (% molar/molar) no esta particularmente limitada siempre que se alcancen los objetivos de la presente invencion, pero la relacion es, preferentemente, de 10/0 a 30/70, o mas preferentemente, de 60/40 a 40/60.

Cuando el segmento hidrofilo del polimero anfifilo son polisacaridos, ejemplos de los polisacaridos pueden incluir celulosa, quitina, quitosano, goma gellan, acido alginico, acido hialuronico, pululano o dextrano, y el mas preferente es dextrano.

El polimero anfifilo esta compuesto, preferentemente, por polimerizacion por injerto de una o mas cadenas de injerto de poli(hidroxiacido) en una cadena principal de polisacarido. En el presente documento el peso molecular promedio de la cadena principal de polisacarido es, preferentemente, de 1.000 a 100.000, o mas preferentemente, de 2.000 a 50.000, y el peso molecular promedio del poli(hidroxiacido) es, preferentemente, de 500 a 100.000, o mas preferentemente, de 1.000 a 10.000. El valor de peso molecular promedio del poli(hidroxiacido) respecto al peso molecular promedio de polisacaridos es, preferentemente, de 0,01 veces a 100 veces, mas preferentemente, de 0,02 veces a 10 veces, o de la forma mas preferente de 0,02 veces a 1 vez.

El numero de cadenas de injerto de poli(hidroxiacido) unidas con la cadena principal de polisacaridos es, preferentemente, de 2 a 50. El numero de cadenas de injerto puede determinarse a partir del peso molecular promedio de polimero anfifilo de tipo injerto, la cadena principal de polisacaridos, y la cadena de injerto de poli(hidroxiacido).

Cuando el segmento hidrofilo del polimero anfifilo es polietilenglicol, es preferente que el polimero anfifilo sea un polimero de bloques de polietilenglicol y poli(hidroxiacido). En la presente invencion, el termino "bloque" se refiere a un segmento de parte de una molecula de polimero, que consiste, como minimo, en cinco o mas unidades de monomero, y que es diferente en estructura o configuracion quimica entre un segmento de parte y otro segmento de parte adyacente, y un polimero formado por dos o mas bloques acoplados linealmente se denomina un polimero de bloques. Cada bloque que forma un polimero de bloques puede comprender dos o mas unidades de monomero, es decir, se puede formar un polimero aleatorio, alterno, o de gradiente. Cuando el segmento hidrofilo del polimero anfifilo es polietilenglicol, es preferente que el polimero anfifilo sea un polimero de bloques que acopla cada uno de

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polietilenglicol y polihidroxiacido.

Cuando el segmento hidrofilo del polimero anfifilo es polietilenglicol, ejemplos especificos del polietilenglicol a utilizar incluyen polietilenglicol de cadena lineal o ramificado o sus derivados, y un ejemplo preferente de derivado de polietilenglicol es eter monoalquilico de polietilenglicol. El grupo alquilo del eter monoalquilico de polietilenglicol es un grupo alquilo de cadena lineal o ramificado que tiene de 1 a 10 atomos de carbono, y un grupo alquilo ramificado que tiene de 1 a 4 atomos de carbono es mas preferente, y grupos metilo, etilo, propilo e isopropilo se desean particularmente.

El peso molecular promedio del polietilenglicol no esta particularmente limitado, sino que es, preferentemente, de 2.000 a 15.000, mas preferentemente, de 2.000 a 12.000, aun mas preferentemente, de 4.000 a 12.000, y, de forma particularmente preferente, de 5.000 a 12.000.

Cuando el segmento hidrofilo del polimero anfifilo es polietilenglicol, el peso molecular promedio del poli(hidroxiacido) no esta particularmente limitado, sino que es, preferentemente, de 5.000 a 200.000, mas preferentemente, de 15.000 a 150.000, o aun mas preferentemente, de 20.000 a 100.000. El valor de peso molecular promedio de poli(hidroxiacido) respecto al peso molecular promedio de polietilenglicol es, preferentemente, 1,0 vez o mas, mas preferentemente, 2 veces o mas, de la forma mas preferente 4 veces o mas y, de forma particularmente preferente, de 4 veces o mas a 25 veces o menos.

En esta descripcion, el peso molecular promedio se refiere al peso molecular promedio en numero a menos que se especifique lo contrario, y el peso molecular promedio en numero es un peso molecular promedio calculado mediante un procedimiento que no considera la ponderacion de magnitud de una molecula, y el peso molecular promedio de polimero anfifilo, polisacaridos y polietilenglicol puede obtenerse como el peso molecular convertido en poliestireno o pululano medido mediante cromatografia de permeacion en gel (GPC). El peso molecular promedio de poli(hidroxiacido) puede determinarse a partir de la relacion de valor integral maximo de residuo terminal y el valor integral maximo de otros que el residuo terminal, segun lo medido mediante medicion por resonancia magnetica nuclear (1H-RMN).

El polimero anfifilo compuesto por polisacaridos y poli(hidroxiacido) utilizado en la presente invencion puede sintetizarse en cualquiera de los procedimientos conocidos, y siempre que pueda formarse una emulsion de fase inversa, el procedimiento de sintesis no esta especificado, y puede fabricarse, por ejemplo, en cualquiera de los siguientes procedimientos (1), (2), y (3).

(1) En presencia de un catalizador de estano, se anade un monomero de activacion de hidroxiacido a polisacaridos para llevar a cabo una reaccion de polimerizacion, y se anade ademas poli(hidroxiacido), y se fabrica un polimero anfifilo de tipo injerto [Macromolecules, 31, 1032-1039 (1998)].

(2) El grupo hidroxilo de polisacaridos parcialmente no protegidos de los cuales la mayoria del grupo hidroxi esta protegido por un sustituyente es activado por una base, se anade un monomero de activacion de hidroxiacido para formar una o mas cadenas de injerto compuestas por poli(hidroxiacido), y finalmente el grupo protector se retira, y se fabrica un polimero anfifilo de tipo injerto [Polymer, 44, 3927-3933, (2003)].

(3) En polisacaridos, se anade un copolimero de poli(hidroxiacido) para ejecutar una reaccion de condensacion utilizando un agente deshidratante y/o un agente de activacion funcional, y se fabrica un polimero anfifilo de tipo injerto [Macromolecules, 33, 3680-3685 (2000)].

El polimero anfifilo compuesto por polietilenglicol y poli(hidroxiacido) utilizado en la presente invencion puede sintetizarse en cualquiera de los procedimientos conocidos, y siempre que pueda formarse una emulsion de fase inversa, el procedimiento de sintesis no se especifica, y por ejemplo, en presencia de un catalizador de estano, se anade un monomero de activacion de hidroxiacido a polietilenglicol para llevar a cabo una reaccion de polimerizacion para formar poli(hidroxiacido), y se fabrica un polimero de bloques anfifilo [Journal of Controlled Release, 71,203-211 (2001)].

La estructura de la particula que contiene sustancia activa hidrofila que comprende el polimero anfifilo y la sustancia bioactiva hidrofila no esta particularmente limitada, pero siempre que la particula que contiene sustancia activa hidrofila tenga un segmento hidrofilo de un polimero anfifilo en el interior, y tenga una capa externa de un segmento hidrofobo de un polimero anfifilo, es preferente dado que la sustancia activa hidrofila contenida puede mantenerse de forma mas estable.

Cuando la particula que contiene sustancia activa hidrofila es una particula que tiene un segmento hidrofilo de un polimero anfifilo en el interior, y que tiene una capa externa de un segmento hidrofobo de un polimero anfifilo, es una de las realizaciones preferentes si un modificador de superficie se une a la capa externa de poli(hidroxiacido). En el presente documento, la union puede ser union no covalente o union covalente. La union no covalente es, preferentemente, interaccion hidrofoba, pero puede incluir interaccion electrostatica, puente de hidrogeno o fuerza de van der Waals, o una combinacion de las mismas. En la union no covalente, la capa externa hidrofoba de

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particulas finas que comprenden el polimero anfifilo, y la parte hidrofoba de un modificador de superficie descrito a continuacion pueden unirse, preferentemente, entre si mediante interaccion hidrofoba. En este caso, es particularmente preferente que el dispersante de particulas sea agua, solucion tampon, solucion salina fisiologica, solucion acuosa de modificador de superficie, o dispersante de particulas finas de disolvente hidrofilo.

El modificador de superficie es, preferentemente, un compuesto capaz de estabilizar la interfase de agua-aceite de la emulsion de tipo S/Ac/Ag, o la interfase de emulsion aceite-aceite de emulsion de tipo S/Ac1/Ac2, y mas preferentemente, un compuesto que tiene propiedades para potenciar la estabilidad coloidal de microparticulas. El modificador de superficie puede ser un tipo o una mezcla de varios tipos. En el presente documento, la propiedad de mejorar la estabilidad coloidal significa prevenir o retardar la agregacion de microparticulas en el disolvente.

En la presente invencion, es preferente que el modificador de superficie sea un compuesto anfifilo o un polimero hidrofilo.

El polimero hidrofilo del modificador de superficie de la presente invencion es, preferentemente, cualquiera seleccionado entre el grupo que comprende polietilenglicol, polivinilpirrolidona, alcohol polivinilico, polietilenimina, acido poliacrilico, acido polimetacrilico, poli-1,3-dioxolano, polimero de 2-metacriloil oxietil fosforil colina, poli-1,3,6- trioxano, poliaminoacido, un peptido, una proteina, sacaridos, y analogos de los mismos.

Los analogos del polimero hidrofilo pueden incluir un surfactante que tiene un polimero hidrofilo parcialmente modificado mediante un grupo hidrofobo, tal como un alquilo de cadena larga, pero no estan particularmente limitados al mismo.

Como analogo de polietilenglicol de un modificador de superficie de la presente invencion, es preferente utilizar Pluronic (marca registrada) disponible en el mercado de BASF o sus equivalentes.

Como poliaminoacido de un modificador de superficie de la presente invencion, puede utilizarse, preferentemente, acido poliaspartico, acido poliglutamico, o sus analogos. Un analogo que introduce un grupo alquilo de cadena larga en parte de acido poliaspartico o acido poliglutamico es particularmente preferente.

Como peptido de un modificador de superficie de la presente invencion, puede utilizarse un peptido basico.

Como proteina de un modificador de superficie de la presente invencion, es preferente gelatina, caseina, o albumina para mejorar el rendimiento de dispersion de las particulas. Como proteina, un anticuerpo es uno de los ejemplos preferentes.

Como sacaridos de un modificador de superficie de la presente invencion, son preferentes monosacaridos, oligosacaridos y polisacaridos. Como polisacaridos, son preferentes celulosa, quitina, quitosano, goma gellan, acido alginico, acido hialuronico, pululano y dextrano. Particularmente, es preferente colesteril pululano en vista de una mejor dispersabilidad de particulas. Son preferentes los analogos de uno cualquiera seleccionado entre el grupo que comprende celulosa, quitina, quitosano, goma gellan, acido alginico, acido hialuronico, pululano y dextrano

Como modificador de superficie, estos ejemplos de peptido, proteina y sacaridos son particularmente preferentes para ser analogos que modifican parcialmente el grupo hidrofobo de un alquilo de cadena larga, o analogos que modifican el polimero hidrofilo o el compuesto anfifilo.

En el modificador de superficie de la presente invencion, el compuesto anfifilo incluye un lipido como uno de los ejemplos preferentes.

En el modificador de superficie de la presente invencion, el compuesto anfifilo incluye un surfactante como uno de los ejemplos preferentes. Los ejemplos preferentes del surfactante incluyen: agentes activos no ionicos, tales como copolimero de polioxietileno-polipropilenglicol, ester de acido graso de sacarosa, ester de acido graso de polietilenglicol, monoester de acido graso de polioxietileno sorbitan, diester de acido graso de polioxietileno sorbitan, monoester de acido graso de polioxietileno glicerina, diester de acido graso de polioxietileno glicerina, acido graso de poliglicerina, aceite de ricino de polioxietileno, aceite de ricino endurecido con polioxietileno; sulfatos de alquilo tales como lauril sulfato sodico, lauril sulfato de amonio, estearil sulfato sodico; o lecitina.

En la presente invencion, la sustancia activa hidrofila se indica como ejemplo mediante un compuesto de bajo peso molecular, proteina, peptido, ADN, ARN, o acido nucleico modificante. Incluso un farmaco hidrofobo puede estar contenido en la microparticula de la presente invencion si se hace hidrofila utilizando un agente solubilizante. El agente solubilizante en el presente documento, preferentemente, incluye ciclodextrina y sus analogos.

La proteina o el peptido utilizado en la presente invencion como sustancia activa hidrofila no esta particularmente limitada, pero es preferente una proteina bioactiva o un peptido bioactivo. La proteina bioactiva o el peptido bioactivo incluyen hormona peptidica, citocina, proteina enzimatica, o anticuerpo. Y ejemplos especificos incluyen: peptido antagonista del receptor GLP-1 tal como la exendina-4, hormona paratiroidea (PTH), calcitonina, insulina, factor de

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crecimiento similar a insulina, angiotensina, glucagon, GLP-1; bombesina, motilina, gastrina, hormona del crecimiento, prolactina (hormona luteotropica), gonadotropina (hormona gonadotropica), hormona tirotropica, hormona adrenocorticotropica (ACTH), derivado de ACTH (ebiratida), hormona estimulante de los melanocitos, hormona estimulante del foliculo (FSH), sermorelina, vasopresina, oxitocina, protirelina, hormona luteinizante (LH), corticotropina, secretina, somatropina, tirotropina (hormona estimulante del tiroides), stomatostatina, hormona liberadora de gonadotropina (GnRH), G-cSf, eritropoyetina (EPO), trombopoyetina (TPO), potenciador de megacariocitos, HGF, EGF, VEGF, interferon a, interferon p, interferon y, interleucinas, FGF (factor de crecimiento de fibroblastos), BMP (proteinas de la medula osea), factor timico humoral (THF), factor timico serico (FTS), superoxido dismutasa (SOD) , uroquinasa, lisozima, activador del plasminogeno tisular, asparaquinasa, calicreina, grelina, adiponectina, leptina, peptido diuretico de sodio auricular, factor diuretico de sodio auricular, peptido diuretico de sodio cerebral (BNP), conantocina G, dinorfina, endorfina, kiotorfina, encefalina, neurotensina, angiostina, bradiquinina, sustancia P, kalidina, hemoglobina, proteina C, factor Vila, glucocerebrosidasa, estreptoquinasa, estafiloquinasa, timosina, pancreozimina, colecistoquinina, lactogeno de placenta humana, factor de necrosis tumoral (TNF), polimixina B, colistina, gramicidina, bacitracina, timopoyetina, bombecina, ceruleina, timoestimulina, secretina, resistina, hepcidina, neuropeptido Y, neuropeptido S, colecistoquinina-pancreozimina (CCK-PZ), factor nutriente derivado del cerebro (BDNF), vacuna, y similares. Estas proteinas bioactivas o peptidos bioactivos pueden ser proteinas o peptidos naturales, o derivados modificados en parte de su secuencia, o compuestos modificados por polietilenglicol o cadena de azucar.

Cuando la sustancia activa hidrofila es ADN, ARN, o acido nucleico modificante, puede ser cualquiera de surfactante cationico, lipido cationico, polimero cationico, u otros compuestos complejados con los analogos de los mismos.

En la presente invencion, los sacaridos utilizados como sustancia activa hidrofila incluyen acido hialuronico, heparina, sulfato de dextrano, dextrano o dextrano marcado con FITC (por ejemplo, FD40, etc.).

La presente invencion tambien se refiere a un procedimiento para fabricar la microparticula, segun la reivindicacion 11, formada por aglomeracion de las particulas que contienen sustancia activa hidrofila, comprendiendo el procedimiento:

(a) una etapa de formar una emulsion de fase inversa mezclando un disolvente acuoso que contiene la sustancia activa hidrofila y un disolvente organico inmiscible en agua que disuelve el polimero anfifilo,

(b) una etapa de obtener un contenido solido que contiene la sustancia activa hidrofila retirando el disolvente de la emulsion de fase inversa, y

(c) una etapa de introducir el contenido solido o un liquido de dispersion que contiene el contenido solido en una fase liquida que contiene el modificador de superficie.

En el procedimiento para fabricar la microparticula formada por aglomeracion de las particulas que contienen sustancia activa hidrofila de la presente invencion, la emulsion de fase inversa se forma anadiendo un disolvente acuoso que contiene la sustancia activa hidrofila a un disolvente organico inmiscible en agua que disuelve un polimero anfifilo y mezclandolos. Si fuera necesario, es posible utilizar, por ejemplo, un dispositivo de agitacion tal como un agitador magnetico, un dispositivo de agitacion con turbina, un homogeneizador o un dispositivo emulsionante de membrana dotado de una pelicula porosa. El disolvente organico inmiscible en agua en la presente invencion es un disolvente organico cuya solubilidad en agua es 30 g (disolvente organico inmiscible en agua)/100 ml (agua) o menos, y otros disolventes organicos cuya solubilidad en agua es mayor que el valor especificado se caracterizan como disolventes organicos miscibles en agua.

Como la solucion acuosa en la etapa (a), se utiliza agua o solucion acuosa que contiene una sustancia soluble en agua. La sustancia soluble en agua puede ser cualquiera de sales inorganicas, sacaridos, sales organicas, aminoacidos, y similares.

La propiedad del disolvente organico inmiscible en agua en la etapa (a) no esta particularmente limitada, sino que es, preferentemente, un disolvente capaz de disolver poli(hidroxiacido) como segmento hidrofobo del polimero anfifilo, y de apenas disolver o no disolver el segmento hidrofilo. Es preferente que el disolvente organico inmiscible en agua se disipe y se retire mediante liofilizacion o similar, y es preferente que sea 0,1 g (disolvente organico inmiscible en agua)/100 ml (agua) o menos. Los ejemplos especificos del disolvente organico inmiscible en agua incluyen acetato de etilo, acetato de isopropilo, acetato de butilo, carbonato de dimetilo, carbonato de dietilo, cloruro de metileno y cloroformo. La relacion del disolvente organico inmiscible en agua respecto al disolvente acuoso es, preferentemente, de 1.000:1 a 1:1, mas preferentemente, de 100:3 a 3:1. La concentracion del polimero anfifilo en el disolvente organico inmiscible en agua varia con el tipo del disolvente organico inmiscible en agua o el polimero anfifilo, pero es, preferentemente, del 0,01 al 90% (p/p), mas preferentemente, del 0,1 al 50% (p/p), o aun mas preferentemente, del 1 al 20% (p/p).

En la etapa (a), en el proceso de formacion de una emulsion de fase inversa mediante el disolvente acuoso que contiene la sustancia activa hidrofila y el disolvente organico inmiscible en agua que disuelve el polimero anfifilo, dependiendo del proposito farmacologico, puede formarse una emulsion de fase inversa utilizando un disolvente organico inmiscible en agua disolviendo dos o mas tipos de polimero anfifilo.

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En la etapa (a), en el proceso de formacion de una emulsion de fase inversa mediante el disolvente acuoso que contiene la sustancia activa hidrofila y el disolvente organico inmiscible en agua que disuelve el polimero anfifilo, con el fin de ayudar a la formacion de la emulsion de fase inversa y de formar una emulsion de fase inversa uniforme y fina, se puede anadir un agente auxiliar. Dicho agente auxiliar puede ser, preferentemente, un compuesto seleccionado entre el grupo que comprende alcohol alquilico que tiene de 3 a 6 atomos de carbono, alquilamina que tiene de 3 a 6 atomos de carbono, y acido alquilcarboxilico que tiene de 3 a 6 atomos de carbono. La estructura de cadena alquilo de estos agentes auxiliares no esta especificada particularmente, y puede ser aplicable una estructura de cadena lineal o bien una estructura ramificada, o puede ser utilizable un alquilo saturado o un alquilo no saturado. En la presente invencion, en particular, terc-butanol, iso-butanol, y pentanol son preferentes como agente auxiliar.

El diametro de particula promedio de la emulsion de fase inversa en la etapa (a) es variable con el diametro de particula de la microparticula deseada de la presente invencion, y no esta particularmente limitado, pero para fabricar una microparticula para una preparacion farmaceutica que es una de las aplicaciones de la microparticula de la presente invencion, el limite superior del diametro de particula promedio es, preferentemente, 50 p.m, mas preferentemente, 5 pm, aun mas preferentemente, 500 nm, de forma particularmente preferente 150 nm, y de la forma mas preferente 100 nm. El limite inferior del diametro de particula promedio de la emulsion de fase inversa es, preferentemente, 10 nm, o mas preferentemente, 50 nm.

A continuacion, en el procedimiento de fabricacion de una microparticula, es importante incluir la etapa (b) de obtencion de un contenido solido que contiene la sustancia activa hidrofila retirando el disolvente de la emulsion de fase inversa obtenida en la etapa (a).

En la etapa (b), el procedimiento de retirada del disolvente de la emulsion de fase inversa no esta particularmente limitado, sino que puede incluir, por ejemplo, calentamiento, secado al vacio, dialisis, liofilizacion, operacion de centrifugado, filtracion, re-sedimentacion, y una combinacion de los mismos.

Entre estos procedimientos de retirada del disolvente de la emulsion de fase inversa, la liofilizacion es particularmente preferente, dado que es pequeno en cambios estructurales debido a la union de particulas en la emulsion de fase inversa, y es capaz de evitar degeneracion debida a alta temperatura de la sustancia activa hidrofila. El estado y el aparato de liofilizacion incluyen un proceso de congelacion y un proceso de secado a presion reducida, y es particularmente preferente que el proceso consista en una etapa de congelacion preliminar como un procedimiento ordinario de liofilizacion, una etapa de secado primaria a presion reducida y baja temperatura, y una etapa de secado secundaria a presion reducida. Por ejemplo, enfriando y congelando por debajo del punto de fusion de la solucion acuosa y el disolvente organico inmiscible en agua, para componer una emulsion de fase inversa y, a continuacion, secando a presion reducida, se obtiene una sustancia activa hidrofila liofilizada que contiene contenido solido. La temperatura de congelacion preliminar puede determinarse apropiadamente mediante experimentos considerando la composicion del disolvente y, en general, es preferente que sea de -20°C o menos. El grado de presion reducida en el proceso de secado puede determinarse apropiadamente mediante experimentos considerando la composicion disolvente y, en general, es preferente que sea de 3.000 Pa o menos o, mas preferentemente, 500 Pa o menos, para la reduccion del tiempo de secado. Para la liofilizacion, es preferente utilizar un aparato de liofilizacion para laboratorio que tenga una trampa de frio y sea conectable a una bomba de vacio, o un aparato de liofilizacion al vacio de tipo gradilla utilizado en la fabricacion de preparaciones farmaceuticas, y despues de la congelacion preliminar utilizando nitrogeno liquido o refrigerante, el secado a presion reducida se ejecuta a temperatura refrigerada o temperatura ambiente utilizando una bomba de vacio u otro dispositivo de reduccion de la presion.

El contenido solido que contiene la sustancia activa hidrofila obtenida en la etapa (b) se obtiene como un agregado de particulas que contienen sustancia activa hidrofila que comprende el polimero anfifilo, agregado que se adapta a la estructura de la emulsion de fase inversa. En el presente documento, el agregado es una masa irregular que reune particulas finas mediante fuerza inter-particulas, y se distingue claramente en forma de la microparticula de la presente invencion. El diametro de particula promedio de la sustancia activa hidrofila que contiene particulas finas para formar este agregado es variable con el diametro de particula de la microparticula deseada de la presente invencion, y no esta particularmente limitado, pero para fabricar una microparticula para una preparacion farmaceutica que es una de las aplicaciones de la microparticula de la presente invencion, el limite superior del diametro de particula promedio es, preferentemente, 50 pm, mas preferentemente, 5 pm, de la forma mas preferente 500 nm, especialmente 150 nm, particularmente 100 nm. El limite inferior del diametro de particula promedio de la sustancia activa hidrofila que contiene particulas finas es, preferentemente, 10 nm, o mas preferentemente, 50 nm.

En el procedimiento para fabricar la microparticula de la presente invencion, es importante incluir la etapa (c) de introducir un liquido de dispersion que contiene el contenido solido en una fase liquida que contiene el modificador de superficie.

En la etapa (c), el procedimiento de introduccion del liquido de dispersion que contiene el contenido solido en una fase liquida que contiene el modificador de superficie incluye, por ejemplo, un procedimiento de adicion del

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contenido solido a una fase liquida que contiene el modificador de superficie, y un procedimiento de dispersion del contenido solido una vez en un medio de dispersion, y adicion del liquido de dispersion obtenido (suspension de solido en aceite (S/Ac)) en una fase liquida que contiene el modificador de superficie.

Para dispersar el contenido solido que contiene la sustancia activa hidrofila una vez en un medio de dispersion, el medio de dispersion no esta particularmente limitado, sino que es, preferentemente, un disolvente capaz de disolver poli(hidroxiacido), pero no de disolver sustancialmente el segmento hidrofilo que compone el polimero anfifilo, con el proposito de sostener la estructura de particula que contiene sustancia activa hidrofila compuesta por el polimero anfifilo que tiene la estructura de la emulsion de fase inversa para componer el contenido solido que contiene la sustancia activa hidrofila. El disolvente capaz de disolver poli(hidroxiacido), pero no de disolver sustancialmente el segmento hidrofilo es un disolvente cuya solubilidad del segmento hidrofilo en el disolvente es 50 mg/ml o menos, preferentemente, 10 mg/ml o menos.

El medio de dispersion puede ser disolvente organico inmiscible en agua o disolvente organico miscible en agua siempre que tenga las caracteristicas mencionadas anteriormente, y el disolvente organico inmiscible en agua es mas preferente. Los ejemplos especificos del disolvente organico inmiscible en agua capaz de disolver poli(hidroxiacido) de polimero anfifilo, pero no de disolver sustancialmente en el segmento hidrofilo incluyen acetato de etilo, acetato de isopropilo, acetato de butilo, carbonato de dimetilo, carbonato de dietilo, cloruro de metileno, cloroformo, dioxano, tolueno y xileno.

El medio de dispersion para dispersar el contenido solido que contiene la sustancia activa hidrofila puede contener diversos aditivos solubles en el medio de dispersion, con el proposito de controlar la velocidad de liberacion de la sustancia activa hidrofila debido a descomposicion o disgregacion de las particulas que contienen sustancia activa hidrofila, por ejemplo, un compuesto acido, un compuesto basico, un polimero anfifilo, o un polimero biodegradable.

La fase liquida en la etapa (c) es, preferentemente, capaz de disolver el modificador de superficie, y tiene un punto de ebullicion mas alto que el medio de dispersion del contenido solido que contiene la sustancia activa hidrofila, y puede incluir cualquiera del disolvente acuoso, disolvente organico inmiscible en agua, y disolvente organico miscible en agua. En el presente documento, el disolvente acuoso es agua, o solucion acuosa que contiene un componente soluble en agua, y el componente soluble en agua incluye, por ejemplo, sales inorganicas, sacaridos, sales organicas, y aminoacidos; el disolvente organico inmiscible en agua incluye, por ejemplo, aceite de silicona, aceite de sesamo, aceite de soja, aceite de maiz, aceite de semilla de algodon, aceite de coco, aceite de linaza, aceite mineral, aceite de ricino, aceite de ricino endurecido, parafina liquida, n-hexano, n-heptano, glicerol, y aceite oleico; y el disolvente organico miscible en agua incluye, por ejemplo, glicerina, acetona, etanol, acido acetico, dipropilenglicol, trietanol amina y trietilenglicol. En la presente invencion, la fase liquida en la etapa (c) es, preferentemente, un disolvente acuoso o un disolvente organico miscible en agua. Cuando la fase liquida es un disolvente acuoso, y el medio de dispersion es un disolvente organico inmiscible en agua, la suspension obtenida en la etapa (c) es una llamada emulsion de tipo solido-en-aceite-agua (S/Ac/Ag), y cuando la fase liquida es disolvente organico inmiscible en agua o disolvente organico miscible en agua, y no es miscible en el medio de dispersion, es una emulsion de tipo solido-en-aceite-en-aceite (S/Ac1/Ac2).

La relacion en volumen de la fase liquida respecto al medio de dispersion para dispersar el contenido solido que contiene la sustancia activa hidrofila es, generalmente, de 1.000:1 a 1: 1.000, o, preferentemente, de 100:1 a 1: 100.

La concentracion del modificador de superficie en la fase liquida de la presente invencion es variable con el tipo del modificador de superficie, y es, preferentemente, del 0,01 al 90% (p/v), mas preferentemente, del 0,1 al 50% (p/v), o aun mas preferentemente, del 5 al 10% (p/v).

El modificador de superficie puede unirse a una capa externa de poli(hidroxiacido) del polimero anfifilo de la microparticula de la presente invencion, y la cantidad de union en este caso es, preferentemente, del 0,0001% al 1% del peso de la microparticula.

En la fase liquida en la etapa (c), ademas del modificador de superficie, pueden anadirse diversos aditivos dependiendo del proposito farmacologico, tal como agente tamponante, antioxidante, sal, polimero, o azucar.

En la etapa (c), tambien es preferente anadir sales inorganicas en la fase liquida. Es preferente que las sales inorganicas sean sal de metal alcalino o sal de metal alcalinoterreo, y cloruro sodico es particularmente preferente. La concentracion de sales inorganicas en la fase liquida es, preferentemente, de 0 a 1 M, mas preferentemente, de 10 mM a 1 M, o aun mas preferentemente, de 10 mM a 100 mM.

En la etapa (c), con el fin de producir una microparticula de un tamano de particula mas pequeno, la emulsion de tipo solido en aceite en agua (S/Ac/Ag) o la emulsion de tipo solido en aceite en aceite (S/Ac1/Ac2) formada puede procesarse mediante una operacion de emulsion. El procedimiento de emulsion no esta particularmente limitado siempre que pueda fabricarse una emulsion estable. Por ejemplo, el procedimiento incluye un procedimiento de agitacion, o un procedimiento utilizando un homogeneizador de alta presion, o un homomezclador de alta velocidad.

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En la etapa (c), cuando el liquido de dispersion obtenido dispersando el contenido solido que contiene la sustancia activa hidrofila una vez en que el medio de dispersion se anade en la fase liquida que contiene el modificador de superficie, retirando el medio de dispersion, se obtiene una dispersion deseada de la microparticula formada por aglomeracion de las particulas que contienen sustancia activa hidrofila. El procedimiento de retirada del medio de dispersion no esta particularmente limitado, sino que puede incluir procedimientos de secado en liquido, dialisis, liofilizacion, operacion de centrifugado, filtracion, y re-sedimentacion, y secado en liquido o liofilizacion pueden ser particularmente preferentes. En la etapa (c), cuando se utiliza un disolvente acuoso como fase liquida, se obtiene un dispersante acuoso de la microparticula en este proceso.

Retirando la fase liquida del dispersante de microparticula obtenido en este proceso, puede obtenerse la microparticula de la presente invencion. El procedimiento de retirada de la fase liquida no esta particularmente limitado, sino que puede incluir, preferentemente, procedimientos de eliminacion por destilacion mediante evaporacion, dialisis, liofilizacion, operacion de centrifugado y filtracion.

Los campos de aplicacion de la microparticula obtenida en la presente invencion son amplios, y versatiles, y se utiliza particularmente como una preparacion farmaceutica. Cuando la microparticula de la presente invencion se utiliza como la preparacion farmaceutica, aparte de microparticulas, pueden estar contenidos diversos aditivos farmacologicos utiles, y los aditivos utilizables incluyen agente tamponante, antioxidante, sal, polimero, o azucar.

Cuando la microparticula de la presente invencion se utiliza como una preparacion farmaceutica, el procedimiento de administracion incluye, por ejemplo, administracion oral y administracion parenteral, y la administracion parenteral es preferente. La administracion parenteral incluye administracion hipodermica, administracion intramuscular, administracion enterica, administracion pulmonar, administracion local (nariz, piel, ojo), y administracion en cavidades corporales, y las inyecciones hipodermicas e intramusculares son preferentes en particular. La dosis y el numero de veces de administracion de la preparacion farmaceutica de la presente invencion en el cuerpo del paciente pueden seleccionarse apropiadamente dependiendo de la sustancia activa hidrofila, la via de administracion, la edad y el peso corporal del paciente, o la gravedad del sintoma, pero habitualmente una dosis de 0,1 |xg a 100 mg, preferentemente, de 1 |xg a 10 mg se administra por dia por persona adulta.

EJEMPLOS

A continuacion se muestran ejemplos, pero la presente invencion no esta limitada a los ejemplos descritos en el presente documento.

Ejemplo 1

Sintesis de dextrano-acido polilactico (PLA)

1.1 Sintesis de TMS-dextrano (compuesto 1)

Se anadio dextrano (NACALAI TESQUE, INC. NAKARAI producto conforme al grado especial estandar, peso molecular promedio en numero: 13.000, 5,0 g) a formamida (100 ml), y se calento a 80°C. En esta solucion, se anadio 1,1,1,3,3,3-hexametildisilazano (100 ml) por goteo durante 20 minutos. Despues del goteo, la solucion se agito durante 2 horas a 80°C. Despues de la finalizacion de la reaccion, la solucion de reaccion se devolvio a temperatura ambiente, y la solucion se separo en dos capas mediante un embudo de dispensado. La capa superior se concentro a presion reducida, y se anadio metanol (300 ml), y el contenido solido obtenido se filtro y se seco, y se obtuvo TMS-dextrano (11,4 g) como contenido solido de color blanco.

1.2 Sintesis de TMS-dextrano-PLA (compuesto 2)

El compuesto 1 (0,5 g) y terc-butoxi potasio (35 mg) se secaron durante 1 hora a presion reducida, y se anadio tetrahidrofurano (20 ml), y la mezcla se agito durante 1 hora a temperatura ambiente. En esta solucion, se anadio gota a gota una solucion en tetrahidrofurano (20 ml) de (L)-lactida (4,49 g), y la mezcla se agito durante 5 minutos. Despues de la finalizacion de la reaccion, el disolvente se concentro a presion reducida, y se purifico mediante reprecipitacion mediante un sistema de cloroformo-metanol, y se obtuvo TMS-dextrano-PLA (1,9 g) como contenido solido de color blanco.

1.3 Sintesis de dextrano-PLA (compuesto 3)

En una solucion en cloroformo (24 ml) del compuesto 2 (1,9 g), se anadieron metanol (10,8 ml) y acido clorhidrico 12 N (1,2 ml), y se agitaron durante 30 minutos a temperatura ambiente. El disolvente se elimino por destilacion a presion reducida, y el residuo se disolvio en cloroformo (10 ml), y se anadio gota a gota a eter dietilico enfriado a 0°C, y el producto se deposito. La materia de deposito se elimino por filtracion, y se concentro a presion reducida, y se obtuvo dextrano-PLA (1,6 g). El peso molecular promedio en peso de este polimero fue 48.720, y el peso molecular promedio en numero fue 43.530. (Medicion por GPC: columna Toso TSK-gel a-5000 x 2, disolvente del sistema dMf, detector del IR, producto estandar, pululano). El peso molecular promedio de la cadena de injerto de

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este polimero determinado mediante medicion de 1H-RMN fue 2.300. El numero de cadenas de injerto fue de 10 a 12.

Ejemplo 2 Sintesis de dextrano-poli(acido lactico-acido glicolico) (PLGA)

2.1 Sintesis de TMS-dextrano-PLGA (compuesto 4, compuesto 5, compuesto 6)

El compuesto 1 (0,5 g) y terc-butoxi potasio (35 mg) se secaron durante 1 hora a presion reducida, y se anadio tetrahidrofurano (10 ml), y la mezcla se agito durante 1 hora a temperatura ambiente. En esta solucion, se anadio gota a gota solucion en tetrahidrofurano (15 ml) de (DL)-lactida (1,12 g) y glicolido (0,9 g), y la mezcla se agito durante 5 minutos. Despues de la finalizacion de la reaccion, el disolvente se concentro a presion reducida, y se purifico mediante reprecipitacion mediante un sistema de cloroformo-metanol, y se obtuvo TMS-dextrano-PLGA (1,96 g) como contenido solido de color blanco (compuesto 4). De la misma manera, mediante la cantidad de carga de (DL)-lactida (0,784 g) y glicolido (0,63 g), se sintetizo el compuesto 5, y mediante la cantidad de carga de (DL)- lactida (1,12 g) y glicolido (0,9 g), se sintetizo el compuesto 6.

2.2 Sintesis de dextrano-PLGA (compuesto 7, compuesto 8, compuesto 9)

En una solucion en cloroformo (14 ml) del compuesto 4 (1,96 g), se anadieron metanol (6,3 ml) y acido clorhidrico 12 N (0,7 ml), y se agitaron durante 30 minutos a temperatura ambiente. El disolvente se elimino por destilacion a presion reducida, y el residuo se disolvio en cloroformo (10 ml), y se anadio gota a gota a eter dietilico enfriado a 0°C, y el producto se deposito. La materia de deposito se elimino por filtracion, y se concentro a presion reducida, y se obtuvo dextrano-PLGA (1,25 g) (compuesto 7). A partir de los compuestos 5 y 6, se obtuvieron productos de dextrano-PLGA de la misma manera, excepto que se utilizo acido trifluoroacetico (compuesto 8, compuesto 9). El peso molecular promedio en peso y el peso molecular promedio en numero del polimero de los compuestos 7 a 9 se determinaron mediante medicion por GPC (columna Toso TSK-gel a-5000 x 2, disolvente del sistema DMF, detector del IR, producto estandar, pululano). El peso molecular promedio de la cadena de injerto y el numero de cadenas de injerto se determinaron mediante medicion de 1H-RMN.

En cuanto al compuesto 7, el peso molecular promedio en peso fue 43.820, el peso molecular promedio en numero fue 33.422, el peso molecular de la cadena de injerto fue 1.900, y el numero de cadenas de injerto fue de 7 a 10.

En cuanto al compuesto 8, el peso molecular promedio en peso fue 94.088, el peso molecular promedio en numero fue 81.250, el peso molecular de la cadena de injerto fue 3.250, y el numero de cadenas de injerto fue 21.

En cuanto al compuesto 9, el peso molecular promedio en peso fue 137.695, el peso molecular promedio en numero fue 109.630, el peso molecular de la cadena de injerto fue 6.442, y el numero de cadenas de injerto fue 15.

Ejemplo 3. Procedimiento de preparacion de microparticulas que encapsulan hormona del crecimiento humana (hGH)

Se disolvieron 5 mg de dextrano-acido polilactico (PLA) del ejemplo 1 (el peso molecular promedio de dextrano es 13.000, el peso molecular promedio de PLA es 2.300, el numero de cadenas de injerto de PLA es de 10 a 12, compuesto 3) o dextrano-poli(acido lactico-acido glicolico) (PLGA) del ejemplo 2 (peso molecular promedio de dextrano: 13.000, el peso molecular promedio de PLGA es 19,000, numero de cadenas de injerto de PLGA de 7 a 10, compuesto 7) en 100 |j.l de carbonato de dimetilo para preparar una solucion de polimero de 50 mg/ml. En esta solucion de polimero, se anadieron 20 |j.l de terc-butanol, y se anadieron gota a gota 20 |j.l de solucion acuosa de 2 mg/ml de hGH, y se agito en vortice para preparar una emulsion de fase inversa. Esta emulsion de fase inversa se congelo de forma preliminar, y se liofilizo utilizando un aparato de liofilizacion (EYELA, FREEZE DRYER FD-1000), a temperatura de enfriamiento de la trampa de -45°C, y grado de vacio de 20 Pa, durante 24 horas. El contenido solido obtenido se disperso en 200 |j.l de carbonato de dimetilo para preparar una suspension S/Ac. Esta suspension S/Ac se anadio gota a gota en 2 ml de solucion acuosa que contenia Pluronic F-68 al 10% (una marca registrada de BASF), y se agito y se emulsiono en un mezclador en vortice para preparar una emulsion de tipo S/Ac/Ag. A partir de esta emulsion de tipo S/Ac/Ag, el disolvente organico inmiscible en agua se retiro mediante secado en liquido, y se obtuvo un liquido de dispersion de microparticulas. El liquido de dispersion de microparticulas se congelo de forma preliminar mediante nitrogeno liquido, y se liofilizo utilizando un aparato de liofilizacion (EYELA, FREEZE DRYER FD-1000), a temperatura de enfriamiento de la trampa de -45°C, y grado de vacio de 20 Pa, durante 24 horas, y se obtuvo polvo de microparticulas que encapsulan hGH. Las microparticulas obtenidas se observaron mediante un microscopio electronico de barrido (SEM: HITACHI, S-4800), y se calculo el diametro de particula promedio, y el diametro de particula promedio de las microparticulas fue 4,0 ixm.

Ejemplo 4. Medicion de la eficiencia de encapsulacion de farmacos de microparticulas que encapsulan hormona del crecimiento humana (hGH)

Se pesaron 20 mg de microparticulas que encapsulan hormona del crecimiento humana preparadas en el

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procedimiento del ejemplo 3 utilizando polimero de dextrano-PLA (compuesto 3) o dextrano-PLGA (compuesto 7) utilizando un tubo Eppendorf de 1,5 ml, y se disolvieron en 1 ml de solucion tampon A (PBS que contenia albumina de suero bovino al 0,1%, Pluronic F-68 al 0,1% (una marca registrada de BASF), y azida sodica al 0,02%), y se centrifugaron durante 10 minutos a 18.000 x g, y se separaron en particulas (precipitacion) y un sobrenadante. El sobrenadante se recogio en otro tubo, y las particulas se suspendieron de nuevo en 1 ml de solucion tampon, y la operacion de centrifugado y la separacion en particulas y un sobrenadante se llevaron a cabo de nuevo en las mismas condiciones. Esta operacion de limpieza se repitio una vez mas (un total de tres veces de operacion de centrifugado), y la concentracion de hormona del crecimiento humana de cada sobrenadante recogido mediante las operaciones de centrifugado se midio utilizando un kit de ELISA (fabricado por R&D Systems). A partir de la cantidad cargada de hGH en el momento de la preparacion de particulas (peso de particula 20 mg), la cantidad total de hGH de tres sobrenadantes mediante operaciones de centrifugado se sustrajo, y la eficiencia de encapsulacion se calculo segun la formula a continuacion.

Eficiencia de encapsulacion (%) =

(cantidad de hGH cargada (ng) - cantidad total de hGH en el sobrenadante (ng)) cantidad de hGH cargada (ng)

x100

En microparticulas de dextrano-PLA o microparticulas de dextrano-PLGA, la eficiencia de encapsulacion de la hGH fue del 92,6% en microparticulas de dextrano-PLA, y del 85,7% en microparticulas de dextrano-PLGA, y se demostro que el farmaco proteico puede encapsularse a una elevada frecuencia en ambas particulas.

Ejemplo 5. Analisis de velocidad de liberacion de farmaco in vitro a partir de microparticulas que encapsulan hormona del crecimiento humana (hGH)

Las microparticulas centrifugadas tres veces en el ejemplo 4 se suspendieron y se dispersaron en 1,2 ml de solucion tampon A. A partir de esta solucion, una parte (40 p.l) se transfirio a otro tubo, y se centrifugo durante 10 minutos a 18.000 x g para precipitar las particulas, y 30 p.l de sobrenadante se recogieron en un tubo diferente (muestra a 0 horas). La suspension de particulas restantes se coloco en un tubo Eppendorf de 1,5 ml, y se inclino a uno y otro lado y se mezclo lentamente en una incubadora a 37°C, utilizando un rotador a una velocidad de 6 rpm. A partir de esta solucion, una pequena parte (40 p.l) se disperso a intervalos de tiempo especificos, y el sobrenadante se separo de forma similar mediante operacion de centrifugado. En la muestra de sobrenadante recogida en cada tiempo, la concentracion de hGH se midio utilizando el kit de ELISA, y la cantidad de liberacion (%) se calculo en la formula a continuacion.

Cantidad de liberacion (%) =

(concentracion de hGH en el sobrenadante (ng/ml) x 1,2 (ml)) x^

cantidad de hGH encapsulada (ng) en 20 mg de particulas

La figura 1 muestra cambios en la evolucion temporal de la liberacion de farmaco a partir de microparticulas fabricadas utilizando polimero de dextrano-PLA o dextrano-PLGA. En ambas particulas, apenas se observo descarga inicial, y el farmaco fue liberado linealmente en proporcion al lapso de tiempo, y se observo un perfil favorable. El tiempo requerido para la liberacion del 50% del farmaco fue de aproximadamente 1 mes en la microparticula de dextrano-PLA, y de aproximadamente 1 semana en la microparticula de dextrano-PLGA, y se sugirio que la velocidad de liberacion puede controlarse seleccionando el tipo de poli(hidroxiacido).

Ejemplo 6. Procedimiento de preparacion de microparticulas que encapsulan insulina humana

Se disolvieron 5 mg de dextrano-PLA (el peso molecular promedio de dextrano es 13.000, el peso molecular promedio de PLA es 2.300, el numero de cadenas de injerto de PLA es de 10 a 12, compuesto 3) o dextrano-PLGA (el peso molecular promedio de dextrano es 13.000, el peso molecular promedio de pLgA es 19.000, numero de cadenas de injerto de PLGA de 7 a 10, compuesto 7) en 100 p.l de carbonato de dimetilo para preparar una solucion de polimero de 50 mg/ml. En esta solucion de polimero, se anadieron 20 p.l de terc-butanol, y se anadieron gota a gota 20 p.l de solucion acuosa de 2 mg/ml de insulina humana, y se agito en vortice para preparar una emulsion de fase inversa. Esta emulsion de fase inversa se congelo de forma preliminar mediante nitrogeno liquido, y se liofilizo utilizando un aparato de liofilizacion (EYELA, FREEZE DRYER FD-1000), a temperatura de enfriamiento de la trampa de -45°C, y grado de vacio de 20 Pa, durante 24 horas. El contenido solido obtenido se disperso en 200 p.l de carbonato de dimetilo para preparar una suspension S/Ac. Esta suspension S/Ac se anadio gota a gota en 2 ml de solucion acuosa que contenia Pluronic F-68 al 10% (una marca registrada de BASF), y se agito y se emulsiono en un mezclador en vortice para preparar una emulsion de tipo S/Ac/Ag. A partir de esta emulsion de tipo S/Ac/Ag, el disolvente organico inmiscible en agua se retiro mediante secado en liquido, y se obtuvo un liquido de dispersion de microparticulas. El liquido de dispersion de microparticulas se congelo de forma preliminar mediante nitrogeno liquido, y se liofilizo utilizando un aparato de liofilizacion (EYELA, FREEZE DRYER FD-1000), a temperatura de enfriamiento de la trampa de -45°C, y grado de vacio de 20 Pa, durante 24 horas, y se obtuvo polvo de microparticulas que encapsulan insulina humana. Las microparticulas obtenidas se observaron mediante un microscopio electronico de barrido (SEM: HITACHI, S-4800), y se calculo el diametro de particula promedio, y el diametro de particula promedio fue de 6,4 pmi en las microparticulas obtenidas a partir del compuesto 3, y 5,3 pmi en las microparticulas obtenidas a partir del compuesto 7.

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Ejemplo 7. Medicion de eficiencia de encapsulacion de farmacos de microparticulas que encapsulan insulina humana

Se pesaron 20 mg de microparticulas que encapsulan insulina humana preparadas en el procedimiento del ejemplo 6 utilizando polimero de dextrano-PLGA (compuesto 7) utilizando un tubo Eppendorf de 1,5 ml, y se disolvieron en 1 ml de solucion tampon A (PBS que contenia albumina de suero bovino al 0,1%, Pluronic F-68 al 0,1% (una marca registrada de BASF), y azida sodica al 0,02%), y se centrifugaron durante 10 minutos a 18.800 x g, y se separaron en particulas (precipitacion) y un sobrenadante. El sobrenadante se recogio en otro tubo, y las particulas se suspendieron de nuevo in 1 ml de solucion tampon, y la operacion de centrifugado y la separacion en particulas y un sobrenadante se llevaron a cabo de nuevo en las mismas condiciones. Esta operacion de limpieza se repitio una vez mas (un total de tres veces de operacion de centrifugado), y la concentracion de insulina humana de cada sobrenadante recogido mediante las operaciones de centrifugado se midio mediante el procedimiento de ELISA en sandwich. A partir de la cantidad cargada de insulina humana en el momento de la preparacion de particulas (por peso de particulas de 20 mg), la cantidad total de insulina humana de tres sobrenadantes mediante operaciones de centrifugado se sustrajo, y la eficiencia de encapsulacion se calculo segun la formula a continuacion.

Eficiencia de encapsulacion (%) =

(cantidad de insulina cargada (ng) - cantidad total de insulina en el sobrenadante (ng)) cantidad de insulina cargada (ng)

x100

En microparticulas de dextrano-PLA o microparticulas de dextrano-PLGA, la eficiencia de encapsulacion de insulina humana fue del 75,7%, y se demostro que el farmaco puede encapsularse a una elevada eficiencia.

Ejemplo 8. Analisis de velocidad de liberacion de farmaco in vitro a partir de microparticulas que encapsulan insulina humana

Las microparticulas centrifugadas tres veces en el ejemplo 7 se suspendieron y se dispersaron en 1,2 ml de solucion tampon A. A partir de esta solucion, una parte (40 pl) se transfirio a otro tubo, y se centrifugo durante 10 minutos a 18.800 x g para precipitar las particulas, y 30 pl de sobrenadante se recogieron en un tubo diferente (muestra a 0 horas). La suspension de particulas restantes se coloco en un tubo Eppendorf de 1,5 ml, y se inclino a uno y otro lado y se mezclo lentamente en una incubadora a 37°C, utilizando un rotador a una velocidad de 6 rpm. A partir de esta solucion, una pequena parte (40 pl) se disperso a intervalos de tiempo especificos, y el sobrenadante se separo de forma similar mediante operacion de centrifugado. En la muestra de sobrenadante recogida en cada tiempo, la concentracion de insulina humana se midio mediante el procedimiento de ELISA en sandwich, y la cantidad de liberacion (%) se calculo en la formula a continuacion.

Cantidad de liberacion (%) =

(concentracion de insulina humana en el sobrenadante (ng/ml) x 1,2 (ml)) x^

cantidad de insulina humana encapsulada (ng) en 20 mg de particulas

La figura 2 muestra cambios en la evolucion temporal de la liberacion de insulina humana. Apenas se observo descarga inicial, y el farmaco fue liberado linealmente en proporcion al lapso de tiempo, y se observo un perfil favorable. El tiempo requerido para la liberacion del 50% del farmaco fue de aproximadamente 6 dias.

Ejemplo 9. Cambios en la evolucion temporal de la morfologia de la microparticula

Se pesaron 5 mg de microparticulas que encapsulan hGH preparadas en el ejemplo 3 en un tubo Eppendorf, y se dispersaron en 1 ml de Milli-Q, y se separaron de forma centrifuga durante 30 minutos a 13.000 rpm, y se privaron del sobrenadante, y se dispersaron de nuevo en 1 ml de Milli-Q, y se separaron de forma centrifuga, y las microparticulas se limpiaron. En la solucion de suspension de microparticulas incubada durante un tiempo especificado, se anadio 1 ml de Milli-Q, y la solucion se separo de forma centrifuga durante 30 minutos a 13.000 rpm, se privo del sobrenadante, y se disperso de nuevo en 1 ml de Milli-Q, y se separo de forma centrifuga, y las microparticulas se limpiaron. Las microparticulas obtenidas despues de la limpieza se dispersaron en 100 pl de Milli- Q, y 3 pl del liquido de dispersion de microparticulas se anadieron gota a gota sobre un sustrato de silicio, y se dejaron reposar a temperatura ambiente durante 10 minutos, y se secaron durante 3 horas en un desecador. A continuacion, utilizando un dispositivo de pulverizacion de iones (HITACHI, E-1030), se deposito platino sobre la superficie de muestra (tiempo de deposito 15 segundos), y la forma y el estado superficial de la microparticula se observaron mediante un microscopio electronico de barrido (SEM: HITACHI, S-4800), a un voltaje de aceleracion de 1 kV y una corriente de sonda elevada.

Tal como se muestra en la figura 3, justo despues de la fabricacion, la superficie era lisa y esferica, y las particulas estaban obviamente deformadas despues de la incubacion durante 13 dias a 37°C, se formaron muchos poros, y se demostro que las particulas se descompusieron gradualmente junto con el progreso de liberacion del farmaco.

Ejemplo comparativo 1

Se disolvieron 5 mg de polietilenglicol-poli(epsilon-caprolactona) (el peso molecular promedio de polietilenglicol es

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5.000, el peso molecular promedio de poli(epsilon-caprolactona) es 37.000) se disolvieron en 100 pl de carbonato de dimetilo para preparar una solucion de polimero de 50 mg/ml. En esta solucion de polimero, se anadieron 20 pl de terc-butanol, y se anadieron gota a gota 20 pl de solucion acuosa de 2 mg/ml de hGH, y se agito en vortice para preparar una emulsion de fase inversa. Esta emulsion de fase inversa se congelo de forma preliminar mediante nitrogeno liquido, y se liofilizo utilizando un aparato de liofilizacion (EYELA, FREEZE DRYER FD-1000), a temperatura de enfriamiento de la trampa de -45°C, y grado de vacio de 20 Pa, durante 24 horas. El contenido solido obtenido se disperso en 200 pl de carbonato de dimetilo para preparar una suspension S/Ac. Esta suspension S/Ac se anadio gota a gota en 2 ml de solucion acuosa que contenia Pluronic F-68 al 10% (una marca registrada de BASF), y se agito y se emulsiono en un mezclador en vortice para preparar una emulsion de tipo S/Ac/Ag. A partir de esta emulsion de tipo S/Ac/Ag, el disolvente organico inmiscible en agua se retiro mediante secado en liquido, y se obtuvo un liquido de dispersion de microparticulas. El liquido de dispersion de microparticulas se congelo de forma preliminar mediante nitrogeno liquido, y se liofilizo utilizando un aparato de liofilizacion (EYELA, FREEZE DRYER FD-1000), a temperatura de enfriamiento de la trampa de -45°C, y grado de vacio de 20 Pa, durante 24 horas, y se obtuvo polvo de microparticulas que encapsulan hGH. Las microparticulas obtenidas se observaron mediante un microscopio electronico de barrido (SEM: HITACHI, S-4800), y se calculo el diametro de particula promedio, y el diametro de particula promedio de las microparticulas fue 8,0 pm.

Se pesaron 5 mg del polvo de microparticulas preparadas que encapsulan hGH se pesaron utilizando un tubo Eppendorf, y se dispersaron en 1 ml de Milli-Q, y se centrifugaron durante 30 minutos a 13.000, se privaron del sobrenadante, y se dispersaron de nuevo en 1 ml de Milli-Q, y se separaron de forma centrifuga de forma similar, y las microparticulas se limpiaron. Las microparticulas obtenidas despues de la limpieza se dispersaron en 100 pl de Milli-Q, y se anadieron gota a gota 5 pl del liquido de dispersion de microparticulas sobre un sustrato de silicio, y se dejaron reposar a temperatura ambiente durante 10 minutos, y se secaron durante 3 horas en un desecador. A continuacion, utilizando un dispositivo de pulverizacion de iones (HITACHI, E-1030), se deposito platino sobre la superficie de muestra (tiempo de deposito 15 segundos), y la forma y el estado superficial de la microparticula se observaron mediante un microscopio electronico de barrido (SEM: HITACHI, S-4800), a un voltaje de aceleracion de 1 kV y una corriente de sonda elevada.

Tal como se muestra en la figura 4, a diferencia de la microparticula de dextrano-PLGA en el ejemplo 9, despues de la incubacion durante 21 dias a 37°C, las particulas apenas habian cambiado morfologicamente, y se produjo un problema en el rendimiento de liberacion de la sustancia activa hidrofila.

Ejemplo 10. Administracion hipodermica de microparticulas que encapsulan hormona del crecimiento humana (hGH) en raton

Se disolvieron 25 mg de dextrano-acido polilactico (PLA) (el peso molecular promedio de dextrano es 13.000, el peso molecular promedio de PLA es 2.300, el numero de cadenas de injerto de PLA es de 10 a 12, compuesto 3) o dextrano-poli(acido lactico-acido glicolico) (PLGA) (el peso molecular promedio de dextrano es 13.000, peso molecular promedio de PLGA 19.000, el numero de cadenas de injerto de PLGA es de 7 a 10, compuesto 7) en 500 pl de carbonato de dimetilo para preparar una solucion de polimero de 50 mg/ml. En esta solucion de polimero, se anadieron 100 pl de terc-butanol, y se anadieron gota a gota 250 pl de solucion acuosa de 10 mg/ml de hGH, y se agito en vortice para preparar una emulsion de fase inversa. Esta emulsion de fase inversa se congelo de forma preliminar, y se liofilizo utilizando un aparato de liofilizacion (EYELA, FREEZE DRYER FD-1000), a temperatura de enfriamiento de la trampa de -45°C, y grado de vacio de 20 Pa, durante 24 horas. El contenido solido obtenido se disperso en 1 ml de carbonato de dimetilo para preparar una suspension S/Ac. Esta suspension S/Ac se anadio gota a gota en 10 ml de solucion acuosa que contenia Pluronic F-68 al 10% (una marca registrada de BASF), y se agito y se emulsiono en un mezclador en vortice para preparar una emulsion de tipo S/Ac/Ag. A partir de esta emulsion de tipo S/Ac/Ag, el disolvente organico inmiscible en agua se retiro mediante secado en liquido, y se obtuvo un liquido de dispersion de microparticulas. El liquido de dispersion de microparticulas se congelo de forma preliminar mediante nitrogeno liquido, y se liofilizo utilizando un aparato de liofilizacion (EYELA, FREEZE DRYER fD-1000), a temperatura de enfriamiento de la trampa de -45°C, y grado de vacio de 20 Pa, durante 24 horas, y se obtuvo polvo de microparticulas que encapsulan hGH. Las microparticulas obtenidas se observaron mediante un microscopio electronico de barrido (SEM: HITACHI, S-4800), y se calculo el diametro de particula promedio, y el diametro de particula promedio fue de 4,9 pm en las microparticulas obtenidas a partir del compuesto 3, y 4,2 pm en las microparticulas obtenidas a partir del compuesto 7.

Se suspendieron 300 mg de las microparticulas preparadas y se dispersaron en 3 ml de solucion fisiologica tamponada con fosfato (PBS), y se centrifugaron durante 5 minutos a 80 x g para precipitar microparticulas, y el sobrenadante se transfirio a otro tubo. El sobrenadante se centrifugo de nuevo durante 5 minutos a 80 x g para precipitar las particulas restantes, y el sobrenadante se retiro. Mediante redispersion en 1 ml de PBS despues de la primera vez de precipitacion por centrifugado y una segunda vez de precipitacion por centrifugado, la misma operacion de limpieza por centrifugado se repitio tres veces, y la hormona del crecimiento no encapsulada en las microparticulas se retiro. Finalmente, la precipitacion se disperso de nuevo en 200 pl de PBS, y se obtuvo una solucion de administracion. La cantidad de hormona del crecimiento encapsulada en microparticula de dextrano-PLA y microcapsula de dextrano-PLGA se midio mediante un kit de ELISA y se determino la concentracion en la solucion

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de limpieza, y se sustrajo de la cantidad cargada, y se determino la cantidad encapsulada en 300 mg de particulas administradas por raton, y la microparticula de dextrano-PLA fue de 590 pg, y las microparticulas de dextrano-PLGA fueron de 536 pg.

Esta solucion se inyecto por via hipodermica en dos posiciones en el lomo de ratones Balb/C macho de 10 semanas de vida, y se tomaron muestras de la sangre a intervalos de tiempo especificos a partir de la vena caudal. En la sangre muestreada, se anadio heparina de concentracion final de 3,3 Ul/ml, y se recogio el plasma mediante separacion por centrifugado durante 5 minutos a 5.000 rpm, y la concentracion de hormona del crecimiento en plasma se midio utilizando un kit de ELISA.

A modo de comparacion, una solucion de proteinas de hormona del crecimiento humana no granulada (700 pg/0,2 ml) se administro por via hipodermica en raton, y se tomaron muestras de la sangre de forma similar.

Con el fin de suprimir la produccion de anticuerpos mediante administracion de hormona del crecimiento humana, que es una proteina distinta para raton, tres dias antes de la administracion de la particula, un inmunosupresor, hidrato de Tacrolimus (Astellas) se administro por via hipodermica a una dosis de 26 pg/raton, y seguidamente 13 pg/raton se administraron por via hipodermica en el momento de la administracion del farmaco, y 3 dias y 7dias mas tarde.

La figura 5 muestra cambios en la evolucion temporal de la concentracion de hormona del crecimiento humana en plasma. En el raton al que se le administro farmaco no granulado, el nivel en sangre 1 hora despues de la administracion era muy alto, mas de 5.000 ng/ml, y a continuacion, cayo subitamente, hasta un nivel de un dia antes de la administracion. Por otro lado, en el raton al que se le administro el farmaco de microparticula preparado utilizando polimero de dextrano-PLA, un aumento transitorio del nivel en sangre justo despues de la administracion se suprimio a 200 ng/ml o menos, y durante siete dias consecutivos, el nivel en sangre se mantuvo a niveles elevados. En microparticulas de dextrano-PLA, no se observo en absoluto aumento transitorio de la concentracion despues de la administracion, y una concentracion en sangre casi especifica se mantuvo durante siete dias, y se observo un excelente rendimiento de liberacion sostenida.

Ejemplo 11. Administracion hipodermica de microparticulas que encapsulan hormona del crecimiento humana (hGH) en raton (evaluacion de la actividad farmacologica)

Se disolvieron 2 mg de dextrano-poli(acido lactico-acido glicolico) (PLGA) (el peso molecular promedio de dextrano es 13.000, el peso molecular promedio de PLGA es 1.900, el numero de cadenas de injerto de PLGA es de 7 a 10, compuesto 7) en 500 pl de carbonato de dimetilo para preparar una solucion de polimero de 50 mg/ml. En esta solucion de polimero, se anadieron 100 pl de terc-butanol, y se anadieron gota a gota 250 pl de solucion acuosa de 10 mg/ml de hGH, y se agito en vortice para preparar una emulsion de fase inversa. Esta emulsion de fase inversa se congelo de forma preliminar mediante nitrogeno liquido, y se liofilizo utilizando un aparato de liofilizacion (EYELA, FREEZE DRYER FD-1000), a temperatura de enfriamiento de la trampa de -45°C, y grado de vacio de 20 Pa, durante 24 horas. El contenido solido obtenido se disperso en 1 ml de carbonato de dimetilo para preparar una suspension S/Ac. Esta suspension S/Ac se anadio gota a gota en 10 ml de solucion acuosa que contenia Pluronic F- 68 al 10% (una marca registrada de BASF), y se agito y se emulsiono en un mezclador en vortice para preparar una emulsion de tipo S/Ac/Ag. A partir de esta emulsion de tipo S/Ac/Ag, el disolvente organico inmiscible en agua se retiro mediante secado en liquido, y se obtuvo un liquido de dispersion de microparticulas. El liquido de dispersion de microparticulas se congelo de forma preliminar mediante nitrogeno liquido, y se liofilizo utilizando un aparato de liofilizacion (EYELA, FREEZE DRYER FD-1000), a temperatura de enfriamiento de la trampa de -45°C, y grado de vacio de 20 Pa, durante 24 horas, y se obtuvo polvo de microparticulas que encapsulan hGH. Las microparticulas obtenidas se observaron mediante un microscopio electronico de barrido (SEM: HITACHI, S-4800), y se calculo el diametro de particula promedio, y el diametro de particula promedio de las microparticulas obtenidas fue de 4,1 pm.

300 mg de las microparticulas preparadas se suspendieron y se dispersaron en 3 ml de solucion fisiologica tamponada con fosfato (PBS), y las particulas se precipitaron mediante separacion por centrifugado durante 5 minutos a 80 x g, y un sobrenadante se transfirio a otro tubo. El sobrenadante se separo de forma centrifuga de nuevo durante 5 minutos a 80 x g, y las particulas restantes se precipitaron, y el sobrenadante se retiro. La primera precipitacion por centrifugado y la segunda precipitacion por centrifugado se combinaron, y se dispersaron de nuevo en 1 ml de PBS, y, de forma similar, se llevo a cabo una tercera operacion de centrifugado, y la hormona del crecimiento no encapsulada en las particulas se retiro. Finalmente, la precipitacion se disperso de nuevo en 200 pl de PBS para preparar una solucion de administracion.

Esta solucion se inyecto por via hipodermica en el lomo de ratones a los que se les habia extraido la glandula pituitaria de 8 semanas (de Japan SLC), y se tomaron muestras de la sangre a intervalos especificos a partir de la vena caudal. En la sangre muestreada, se anadio heparina de concentracion final de 3,3 Ul/ml, y se centrifugo durante 5 minutos a 5.000 rpm, y el plasma se recogio, y la concentracion de hormona del crecimiento en plasma y la concentracion de IGF-1 de raton se midieron mediante procedimiento de ELISA.

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Con el fin de suprimir la produccion de anticuerpos mediante administracion de hormona del crecimiento humana, que es una proteina extrana para el raton, tres dias antes de la administracion de la particula, un inmunosupresor, hidrato de Tacrolimus (Astellas) se administro por via hipodermica a 26 pg/raton, y seguidamente 13 pg/raton se administraron por via hipodermica en el momento de la administracion del farmaco, y 3 dias y 7 dias mas tarde.

La figura 6 muestra cambios en la evolucion temporal de la concentracion de hormona del crecimiento humana en plasma. En el raton al que se le administro farmaco no granulado, el nivel en sangre 1 hora despues de la administracion era muy alto, y a continuacion, cayo subitamente, hasta un nivel de dos dias antes de la administracion. Por otro lado, en la microparticula de dextrano-PLGA, un aumento de la concentracion transitorio justo despues de la administracion se suprimio a la baja, y durante diez dias consecutivos despues de la administracion, la concentracion en plasma se mantuvo en niveles altos. En este momento, los cambios de peso corporal del raton se muestran en la figura 7. En el raton al que se le administro la hormona del crecimiento en solitario, el peso corporal aumentado se suprimio a aproximadamente el 5%, pero en el raton al que se le administraron las microparticulas de dextrano-PLGA, el peso corporal se incremento en aproximadamente un 20%.

La figura 8 muestra la concentracion de IGF-1 en plasma. La concentracion de IGF-1 en plasma se correlaciona con la concentracion de hormona del crecimiento humana en sangre, y en el raton al que se le administraron las microparticulas de dextrano-PLGA, se mantuvieron niveles altos durante diez dias despues de la administracion.

Ejemplo 12. Analisis de la velocidad de liberacion de farmaco en solucion tampon a partir de microparticulas que encapsulan exendina-4 (agonista del receptor GLP-1)

Se disolvieron 25 mg de dextrano-poli(acido lactico-acido glicolico) (PLGA) (el peso molecular promedio de dextrano es 13.000, el peso molecular promedio de PLGA es 3.250 (compuesto 8) o 6.442 (compuesto 9), el numero de cadenas de injerto de PLGA es 21 (compuesto 8) o 15 (compuesto 9) en 500 pl de carbonato de dimetilo para preparar una solucion de polimero de 50 mg/ml. En esta solucion de polimero, se anadieron 100 pl de terc-butanol, y se anadieron gota a gota 250 pl de 10 mg/ml de exendina-4 (sintetizada por encargo con Sigma Genosys), y se agito en vortice para preparar una emulsion de fase inversa. Esta emulsion de fase inversa se congelo de forma preliminar mediante nitrogeno liquido, y se liofilizo utilizando un aparato de liofilizacion (EYELA, FREEZE DRYER FD-1000), a temperatura de enfriamiento de la trampa de -45°C, y grado de vacio de 20 Pa, durante 24 horas. El contenido solido obtenido se disperso en 1 ml de carbonato de dimetilo para preparar una suspension S/Ac. Esta suspension S/Ac se anadio gota a gota en 10 ml de solucion acuosa que contenia Pluronic F-68 al 10% (una marca registrada de BASF), y se agito y se emulsiono en un mezclador en vortice para preparar una emulsion de tipo S/Ac/Ag. A partir de esta emulsion de tipo S/Ac/Ag, el disolvente organico inmiscible en agua se retiro mediante secado en liquido, y se obtuvo un liquido de dispersion de microparticulas. El liquido de dispersion de microparticulas se congelo de forma preliminar mediante nitrogeno liquido, y se liofilizo utilizando un aparato de liofilizacion (EYELA, FREEZE DRYER FD-1000), a temperatura de enfriamiento de la trampa de -45°C, y grado de vacio de 20 Pa, durante 24 horas, y se obtuvo polvo de microparticulas que encapsulan exendina-4. Las microparticulas obtenidas se observaron mediante un microscopio electronico de barrido (SEM: HITACHI, S-4800), y se calculo el diametro de particula promedio, y el diametro de particula promedio fue 4,3 pm en el compuesto 8, y 4,5 pm en el compuesto 9.

Estas microparticulas se limpiaron tres veces segun el procedimiento en el ejemplo 4, y se suspendieron y se dispersaron en 1,2 ml de solucion tampon A. A partir de esta solucion, una parte (40 pl) se transfirio a otro tubo, y se centrifugo durante 10 minutos a 18.000 x g para precipitar las particulas, y 30 pl de sobrenadante se recogieron en un tubo diferente (muestra a 0 horas). La suspension de particulas restantes se coloco en un tubo Eppendorf de 1,5 ml, y se inclino a uno y otro lado y se mezclo lentamente en una incubadora a 37°C, utilizando un rotador a una velocidad de 6 rpm. A partir de esta solucion, una pequena parte (40 pl) se disperso a intervalos de tiempo especificos, y el sobrenadante se separo de forma similar mediante operacion de centrifugado. En la muestra de sobrenadante recogida en cada tiempo, la concentracion de exendina-4 se midio mediante el procedimiento de ELISA, y la cantidad de liberacion (%) se calculo en la formula a continuacion.

Cantidad de liberacion (%) =

(concentracion de exendina-4 en el sobrenadante (ng/ml) x 1,2 (ml)) cantidad de exendina-4 encapsulada (ng) en 20 mg de particulas

La figura 9 muestra cambios en la evolucion temporal de la liberacion de farmaco a partir de microparticulas fabricadas utilizando cada polimero de dextrano-PLGA. En ambas microparticulas, apenas se observo descarga inicial, y el farmaco fue liberado linealmente en proporcion al lapso de tiempo, y se observo un perfil favorable.

Ejemplo 13. Administracion hipodermica de microparticulas que encapsulan exendina-4 (agonista del receptor GLP- 1) en raton

Se suspendieron 300 mg de microparticulas en el ejemplo 12 y se dispersaron en 3 ml de solucion fisiologica

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tamponada con fosfato (PBS), y las microparticulas se precipitaron mediante operacion de centrifugado durante 5 minutos a 80 x g, y un sobrenadante se transfirio a otro tubo. El sobrenadante se separo de forma centrifuga de nuevo durante 5 minutos a 80 x g, y las particulas restantes se precipitaron, y el sobrenadante se retiro. La primera precipitacion por centrifugado y la segunda precipitacion por centrifugado se combinaron, y se dispersaron de nuevo en 1 ml de PBS, y, de forma similar, se llevo a cabo una tercera operacion de centrifugado, y la exendina-4 no encapsulada en las particulas se retiro. Finalmente, la precipitacion se disperso de nuevo en 200 p.l de PBS para preparar una solucion de administracion.

Esta solucion se inyecto por via hipodermica en el lomo de ratones SCID de 8 semanas de vida (CB 17/lcr- Prkdcscid/CrlCrlk) (de Crea Japan Inc.), y se tomaron muestras de la sangre a intervalos especificos a partir de la vena caudal. En la sangre muestreada, se anadio heparina de concentracion final de 3,3 Ul/ml, y se centrifugo durante 5 minutos a 5.000 rpm, y el plasma se recogio, y la concentracion de exendina-4 en plasma se midio mediante procedimiento de ELISA. A modo de comparacion, una solucion de exendina-4 no graduada (700 |xg/0,2 ml) se administro por via hipodermica en raton, y se tomaron muestras de la sangre de forma similar.

La figura 10 muestra cambios en la evolucion temporal de la concentracion de exendina-4 en plasma. En el raton al que se le administro farmaco no granulado, el nivel en sangre 1 hora despues de la administracion era muy alto y, a continuacion, cayo subitamente, hasta un nivel de antes de la administracion. Por otro lado, en la microparticula de dextrano-PLGA, un aumento de la concentracion transitorio despues de la administracion se suprimio a la baja, y durante cinco semanas consecutivas despues de la administracion, la concentracion en plasma se mantuvo en niveles altos.

Ejemplo 14. Sintesis de dextrano-poli(acido lactico-acido glicolico) (PLGA)

14.1 Sintesis de TMS-dextrano-PLGA (compuesto 10, compuesto 11, compuesto 12, compuesto 13)

El compuesto 1 (0,5 g) y terc-butoxi potasio (35 mg) se secaron durante 1 hora a presion reducida, y se anadio tetrahidrofurano (10 ml), y la mezcla se agito durante 1 hora a temperatura ambiente. En esta solucion, se anadio gota a gota una solucion en tetrahidrofurano (15 ml) de (DL)-lactida (0,558 g) y glicolido (0,45 g), y la mezcla se agito durante 5 minutos. Despues de la finalizacion de la reaccion, el disolvente se concentro a presion reducida, y se purifico mediante reprecipitacion mediante un sistema de cloroformo-metanol, y se obtuvo TMS-dextrano-PLGA (1,96 g) como contenido solido de color blanco (compuesto 10).

En un procedimiento similar, mediante la cantidad de carga de (DL)-lactida (0,67 g) y glicolido (0,54 g), se sintetizo el compuesto 11.

En un procedimiento similar, mediante la cantidad de carga de (DL)-lactida (0,781 g) y glicolido (0,629 g), se sintetizo el compuesto 12.

En un procedimiento similar, mediante la cantidad de carga de (DL)-lactida (1,123 g) y glicolido (0,9 g), se sintetizo el compuesto 13.

14.2 Sintesis de dextrano-PLGA (compuesto 14, compuesto 15, compuesto 16, compuesto 17)

En solucion en cloroformo (10 ml) del compuesto 10, se anadio acido trifluoroacetico (1 ml), y se agito durante 30 minutos a temperatura ambiente. El disolvente se elimino por destilacion a presion reducida, y el residuo se disolvio en cloroformo (10 ml), y se anadio gota a gota a eter dietilico enfriado a 0°C, y el producto se deposito. La materia de deposito se elimino por filtracion, y se concentro a presion reducida, y se obtuvo dextrano-PLGA (0,44 g) (compuesto 14).

A partir de los compuestos 11, 12, y 13, se obtuvieron productos de dextrano-PLGA mediante un procedimiento similar (compuesto 5, compuesto 16, compuesto 17). El peso molecular promedio en peso y el peso molecular promedio en numero del polimero de los compuestos 14 a 17 se determinaron mediante medicion por GPC (columna Toso TSK-gel a-5000 x 2, disolvente del sistema DMF, detector del IR, producto estandar, pululano). El peso molecular promedio de la cadena de injerto y el numero de cadenas de injerto se determinaron mediante medicion de 1H-RmN.

En cuanto al compuesto 14, el peso molecular promedio en peso fue 99.462, el peso molecular promedio en numero fue 85.101, el peso molecular promedio en numero de la cadena de injerto fue 2.167, y el numero de cadenas de injerto fue 33.

En cuanto al compuesto 15, el peso molecular promedio en peso fue 107.779, el peso molecular promedio en numero fue 92.134, el peso molecular promedio en numero de la cadena de injerto fue 3.127, y el numero de cadenas de injerto fue 25.

En cuanto al compuesto 16, el peso molecular promedio en peso fue 121.281, el peso molecular promedio en

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numero fue 101.873, el peso molecular promedio en numero cadenas de injerto fue 30.

En cuanto al compuesto 17, el peso molecular promedio en numero fue 122.151, el peso molecular promedio en numero cadenas de injerto fue 22.

Ejemplo 15. Procedimiento de preparacion de microparticulas que encapsulan hormona del crecimiento humana (hGH)

Se disolvieron 5 mg de cada dextrano-poli(acido lactico-acido glicolico) (polimero de dextrano-PLGA, compuestos 14 a 17) del ejemplo 14 en 100 pl de carbonato de dimetilo para preparar una solucion de polimero de 50 mg/ml. En esta solucion de polimero, se anadieron 20 pl de terc-butanol, y se anadieron gota a gota 50 pl de solucion acuosa de 1 mg/ml de hGH, y se agito en vortice para preparar una emulsion de fase inversa. Esta emulsion de fase inversa se congelo de forma preliminar mediante nitrogeno liquido, y se liofilizo utilizando un aparato de liofilizacion (EYELA, FREEZE DRYER FD-1000), a temperatura de enfriamiento de la trampa de -45°C, y grado de vacio de 20 Pa, durante 24 horas. El contenido solido obtenido se disperso en 200 pl de carbonato de dimetilo para preparar una suspension S/Ac. Esta suspension S/Ac se anadio gota a gota en 2 ml de solucion acuosa que contenia Pluronic F- 68 al 10% (una marca registrada de BASF), y se agito y se emulsiono en un mezclador en vortice para preparar una emulsion de tipo S/Ac/Ag. A partir de esta emulsion de tipo S/Ac/Ag, el disolvente organico inmiscible en agua se retiro mediante secado en liquido, y se obtuvo un liquido de dispersion de microparticulas. El liquido de dispersion de microparticulas se congelo de forma preliminar mediante nitrogeno liquido, y se liofilizo utilizando un aparato de liofilizacion (EYELA, FREEZE DRYER FD-1000), a temperatura de enfriamiento de la trampa de -45°C, y grado de vacio de 20 Pa, durante 24 horas, y se obtuvo polvo de microparticulas que encapsulan hGH. Las microparticulas obtenidas se observaron mediante un microscopio electronico de barrido (SEM: HITACHI, S-4800), y se calculo el diametro de particula promedio, y el diametro de particula promedio de las microparticulas estaba dentro de un intervalo de 1,0 a 10 pm.

Ejemplo 16. Medicion de eficiencia de encapsulacion de farmacos de microparticulas que encapsulan hormona del crecimiento humana (hGH)

Se pesaron 20 mg de microparticulas que encapsulan hormona del crecimiento humana preparada en el procedimiento del ejemplo 15 utilizando cada polimero de dextrano-PLGA (compuestos 14 a 17) utilizando un tubo Eppendorf de 1,5 ml, y se disolvieron en 1 ml de solucion tampon A (PBS que contenia albumina de suero bovino al 0,1%, Pluronic F-68 al 0,1% (una marca registrada de BASF), y azida sodica al 0,02%), y se centrifugaron durante 10 minutos a 18.000 x g, y se separaron en particulas (precipitacion) y un sobrenadante. El sobrenadante se recogio en otro tubo, y las particulas se suspendieron de nuevo en 1 ml de solucion tampon, y la operacion de centrifugado y la separacion en particulas y un sobrenadante se llevaron a cabo de nuevo en las mismas condiciones. Esta operacion de limpieza se repitio una vez mas (un total de tres veces de operacion de centrifugado), y la concentracion de hormona del crecimiento humana de cada sobrenadante recogido mediante las operaciones de centrifugado se midio utilizando un kit de ELISA (fabricado por R&D Systems). A partir de la cantidad cargada de hGH en el momento de la preparacion de particulas (peso de particula 20 mg), se sustrajo la cantidad total de hGH de tres sobrenadantes mediante operaciones de centrifugado, y la eficiencia de encapsulacion se calculo segun la formula a continuacion.

de la cadena de injerto fue 3.000, y el numero de

peso fue 144.838, el peso molecular promedio en de la cadena de injerto fue 4.864, y el numero de

Eficiencia de encapsulacion (%) =

x 100

En microparticulas de dextrano-PLGA, la eficiencia de encapsulacion de hGH fue del 87,5% en microparticulas del compuesto 14, el 94,2% en microparticulas del compuesto 15, el 95,7% en microparticulas del compuesto 16, y el 97,5% en microparticulas del compuesto 17, y se demostro que el farmaco proteico puede encapsularse a una elevada frecuencia en todas las microparticulas.

Ejemplo comparativo 2

Fabricacion de particulas que encapsulan hormona del crecimiento y medicion de eficiencia de encapsulacion de farmacos

Se disolvieron 10 mg de dextrano-poli(acido lactico-acido glicolico)(PLGA) (compuesto 14 o compuesto 17) en 2 ml de acetato de etilo para preparar una solucion de polimero. En esta solucion de polimero, se anadieron gota a gota 100 pl de solucion acuosa de 0,5 mg/ml de hGH, y se agito. Despues de la operacion de agitacion, la solucion se anadio a 20 ml de dioxano. El disolvente se evaporo, y la solucion se concentro a aproximadamente 2 ml, y el liquido de dispersion de particulas se anadio a agua que contenia 500 mg de Pluronic F-68 (una marca registrada de BASF). La muestra se liofilizo, y se anadio 1 ml de agua a 50 mg de la muestra, y las particulas se dispersaron de nuevo, y se obtuvieron particulas que contenian sustancia activa hidrofila no asociadas. El diametro de particula promedio de las particulas se midio mediante un procedimiento de dispersion de luz dinamica utilizando un aparato

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ELS-Z (fabricado por Otsuka Denshi), y la eficiencia de encapsulacion de farmacos se determino igual que en el ejemplo 16.

Como resultado, en las particulas del compuesto 14, el diametro de particula promedio fue 190,5 nm, y la eficiencia de encapsulacion fue el 73%, y en las particulas del compuesto 17, el diametro de particula promedio fue 197,5 nm, y la eficiencia de encapsulacion fue el 70%, y la eficiencia de encapsulacion fue menor que en las microparticulas del ejemplo 16.

Ejemplo 17. Analisis de la velocidad de liberacion de farmaco in vitro a partir de microparticulas que encapsulan hormona del crecimiento humana (hGH)

Las particulas limpiadas tres veces en el ejemplo 16 se suspendieron y se dispersaron en 1,2 ml de solucion tampon A. A partir de esta solucion, una parte (40 pl) se transfirio a otro tubo, y se centrifugo durante 10 minutos a 18.000 x g para precipitar las particulas, y 30 pl de sobrenadante se recogieron en un tubo diferente (muestra a 0 horas). La suspension de particulas restantes se coloco en un tubo Eppendorf de 1,5 ml, y se inclino a uno y otro lado y se mezclo lentamente en una incubadora a 37°C, utilizando un rotador a una velocidad de 6 rpm. A partir de esta solucion, una pequena parte (40 pl) se disperso a intervalos de tiempo especificos, y el sobrenadante se separo de forma similar mediante operacion de centrifugado. En la muestra de sobrenadante recogida en cada tiempo, la concentracion de hGH se midio mediante el kit de ELISA, y la cantidad de liberacion (%) se calculo en la formula a continuacion.

Cantidad de liberacion (%) =

(concentracion de hGH en el sobrenadante (ng/ml) x 1,2 (ml)) x^

cantidad de hGH encapsulada (ng) en 20 mg de particulas

La figura 11 muestra cambios en la evolucion temporal de la liberacion de farmaco a partir de microparticulas fabricadas en el ejemplo 15. En estas microparticulas, apenas se observo descarga inicial, y el farmaco fue liberado linealmente en proporcion al lapso de tiempo, y se observo un perfil favorable. El tiempo requerido para la liberacion del 50% del farmaco fue de aproximadamente 6 dias en microparticulas del compuesto 14, aproximadamente 9 dias en microparticulas del compuesto 15, aproximadamente 16 dias en microparticulas del compuesto 16, y aproximadamente 1 mes en microparticulas del compuesto 17, y se sugirio que la velocidad de liberacion podria controlarse cambiando la cantidad cargada de lactida y glicolido en el momento de la sintesis de TMS-dextrano- PLGA.

Ejemplo 18. Procedimiento de preparacion de microparticulas que encapsulan dextrano marcado con fluoresceina (FD40) con diametro de particula diferente

5 mg de dextrano-poli(acido lactico-acido glicolico) (PLGA) (compuesto 7) del ejemplo 2 se disolvieron en 100 pl de carbonato de dimetilo para preparar una solucion de polimero de 50 mg/ml. En esta solucion de polimero, se anadieron 20 pl de terc-butanol, y se anadieron gota a gota 20 pl de solucion acuosa de 1 mg/ml de FD40, y se agito en vortice para preparar una emulsion de fase inversa. Esta emulsion de fase inversa se congelo de forma preliminar mediante nitrogeno liquido, y se liofilizo utilizando un aparato de liofilizacion (EYELA, FREEZE DRYER fD-1000), a temperatura de enfriamiento de la trampa de -45°C, y grado de vacio de 20 Pa, durante 24 horas. El contenido solido obtenido se disperso en 50 pl, 100 pl, 200 pl, 350 pl, 500 pl, 1 ml, 2 ml y 6 ml de carbonato de dimetilo para preparar una suspension S/Ac. Esta suspension S/Ac se anadio gota a gota en 2 ml de solucion acuosa que contenia Pluronic F-68 al 10% (una marca registrada de BASF), y se agito y se emulsiono en un mezclador en vortice para preparar una emulsion de tipo S/Ac/Ag. A partir de esta emulsion de tipo S/Ac/Ag, el disolvente organico inmiscible en agua se retiro mediante secado en liquido, y se obtuvo un liquido de dispersion de microparticulas. El liquido de dispersion de microparticulas se congelo de forma preliminar mediante nitrogeno liquido, y se liofilizo utilizando un aparato de liofilizacion (EYELA, FREEZE DRYER fD-1 000), a temperatura de enfriamiento de la trampa de -45°C, y grado de vacio de 20 Pa, durante 24 horas, y se obtuvo polvo de microparticulas que encapsulan FD40. Las microparticulas obtenidas se observaron mediante un microscopio electronico de barrido (SEM: HITACHI, S-4800), y se calculo el diametro de particula promedio.

La figura 12 muestra la correlacion entre el diametro de particula promedio y la cantidad de carbonato de dimetilo anadida en el momento de la preparacion de la emulsion de tipo S/Ac/Ag. En un intervalo de 50 pl a 500 pl, junto con el aumento de la cantidad de carbonato de dimetilo, se observo declive del diametro de particula promedio. De 500 pl a 6 ml, casi no se observo ninguna diferencia en el diametro de particula promedio.

Ejemplo 19. Sintesis de polimero de PEG-PLGA (serie PEG2k)

Se mezclaron eter monometilico de polietilenglicol (fabricado por NOF Corp., SUNBRIGHT MEH-20H, peso molecular promedio en numero: 1.862, Mw/Mn = 1,03), (DL)-lactida, y glicolido en la composicion especificada mostrada en la tabla 1, y se calentaron a 140°C. Despues de agitar durante 20 minutos, se anadio octilato de estano (II) (el 0,05% en peso respecto a eter monometilico de polietilenglicol), y se agito durante 3 horas a 180°C. La solucion de reaccion se devolvio a temperatura ambiente, y se disolvio en cloroformo (a una concentracion de

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aproximadamente 100 mg/ml), y se precipito de nuevo y se refino en eter dietilico enfriado a 0°C, y el contenido solido obtenido se filtro, se descomprimio y se seco, y se obtuvo polimero de PEG-PLGA como contenido solido de color blanco o marron palido. El peso molecular promedio en numero de este polimero se determino mediante 1H- RMN (tabla 1).

[Tabla 1]

Tabla 1. Cantidad cargada de materia prima y resultados de la reaccion de la sintesis de polimero de PEG-PLGA (serie PEG2k)_________________________________________________________________________________

Cantidad cargada (g): Rendimiento (g) Peso molecular (1H-RMN) Composicion de polimero (peso molecular de PEG)-(peso molecular de PLGA)

PEG: (DL)- lactida Glicolido

0,8: 1,44 1,16 4,74 13500 2k-11,5k

0,4: 1,44 1,16 2,65 23560 2k-21,5k

0,2: 1,44 1,16 2,52 52700 2k-50,7k

Ejemplo 20. Sintesis de polimero de PEG-PLGA (serie PEG5k)

Se mezclaron eter monometilico de polietilenglicol (fabricado por NOF Corp., SUNBRIGHT MEH-20H, peso molecular promedio en numero: 5.128, Mw/Mn = 1,02), (DL)-lactida, y glicolido en la composicion especificada mostrada en la tabla 2, y se calentaron a 140°C. Despues de agitar durante 20 minutos, se anadio octilato de estano (II) (el 0,05% en peso respecto a eter monometilico de polietilenglicol), y se agito durante 3 horas a 180°C. La solucion de reaccion se devolvio a temperatura ambiente, y se disolvio en cloroformo (a una concentracion de aproximadamente 100 mg/ml), y se precipito de nuevo y se refino en eter dietilico enfriado a 0°C, y el contenido solido obtenido se filtro, se descomprimio y se seco, y se obtuvo polimero de PEG-PLGA como contenido solido de color blanco o marron palido. El peso molecular promedio en numero de este polimero se determino mediante 1H- RMN (tabla 2).

[Tabla 2]

Tabla 2. Cantidad cargada de materia prima y resultados de la reaccion de sintesis de polimero de PEG-PLGA (serie PEG5k)_______________________________________________________________________________________

PEG: (DL)- lactida Glicolido

0,5: 0,72 0,58 1,31 15.600 5k-10k

0,5: 1,44 1,16 2,51 28.400 5k-23k

0,33: 1,44 1,16 2,1 37.500 5k-32,5k

0,6: 2,88 2,32 5,5 44.400 5k-39,4k

0,27: 1,44 1,16 2,62 52.000 5k-47k

0,2: 1,44 1,16 2,52 66.000 5k-61k

0,3: 2,16 1,74 4,07 69.935 5k-65k

0,8: 2,16 1,74 3,79 59.555 5k-55k

0,1: 1,15 0,93 - 109.381 5k-105k

Ejemplo 21. Sintesis de polimero de PEG-PLGA (serie PEG10k)

Se mezclaron eter monometilico de polietilenglicol (fabricado por NOF Corp., SUNBRIGHT MEH-10H, peso molecular promedio en numero: 9.975, Mw/Mn = 1,02), (DL)-lactida, y glicolido en la composicion especificada mostrada en la tabla 3, y se calentaron a 140°C. Despues de agitar durante 20 minutos, se anadio octilato de estano (II) (el 0,05% en peso respecto a eter monometilico de polietilenglicol), y se agito durante 3 horas a 180°C. La solucion de reaccion se devolvio a temperatura ambiente, y se disolvio en cloroformo (a una concentracion de aproximadamente 100 mg/ml), y se precipito de nuevo y se refino en eter dietilico enfriado a 0°C, y el contenido solido obtenido se filtro, se descomprimio y se seco, y se obtuvo polimero de PEG-PLGA como contenido solido de color blanco o marron palido. El peso molecular promedio en numero de este polimero se determino mediante 1H- RMN (tabla 3).

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[Tabla 3]

Tabla 3. Cantidad cargada de materia prima y resultados de la reaccion de sintesis de polimero de PEG-PLGA (serie PEG10k)______________________________________________________________________________________

PEG: (DL)- lactida Glicolido

0,5: 1,44 1,16 2,3 49000 10k-39k

0,25: 1,44 1,16 2,48 105000 10k-95k

Ejemplo 22. Procedimiento de preparacion de microparticulas que encapsulan FD40

Se disolvieron 5 mg del polimero de PEG-PLGA preparado en los ejemplos 19 a 21 en 100 pl de carbonato de dimetilo para preparar una solucion de polimero de 50 mg/ml. En esta solucion de polimero, se anadieron 20 pl de terc-butanol, se anadio una cantidad especifica de solucion acuosa de 10 mg/ml de FD40 tal como se muestra en la tabla 4, y se agito para preparar una emulsion de fase inversa. Esta emulsion de fase inversa se congelo de forma preliminar mediante nitrogeno liquido, y se liofilizo utilizando un aparato de liofilizacion (EYELA, FREEZE DRYER FD-1000), a temperatura de enfriamiento de la trampa de -45°C, y grado de vacio de 20 Pa, durante 24 horas. El contenido solido obtenido se disperso en 200 pl de carbonato de dimetilo para preparar una suspension S/Ac. Esta suspension S/Ac se anadio gota a gota en 2 ml de solucion acuosa que contenia Pluronic F-68 al 10% (una marca registrada de BASF), y se agito y se emulsiono en un mezclador en vortice para preparar una emulsion de tipo S/Ac/Ag. A partir de esta emulsion de tipo S/Ac/Ag, el disolvente organico inmiscible en agua se retiro mediante secado en liquido, y se obtuvo un liquido de dispersion de microparticulas. El liquido de dispersion de microparticulas se congelo de forma preliminar mediante nitrogeno liquido, y se liofilizo utilizando un aparato de liofilizacion (EYELA, FREEZE DRYER FD-1000), a temperatura de enfriamiento de la trampa de -45°C, y grado de vacio de 20 Pa, durante 24 horas, y se obtuvo polvo de microparticulas que encapsulan FD40, y una parte del mismo se observo mediante un microscopio electronico de barrido (SEM: HITACHI, S-4800), y se calculo el diametro de particula promedio (tabla 4). Imagenes de SEM del polvo preparado a partir del polimero de PEG-PLGA de 5k a 10k se muestran en la figura 14, e imagenes de SEM del polvo preparado a partir del polimero de PEG-PLGA de 5k a 61k se muestran en la figura 15.

[Tabla 4]

Tabla 4. Cantidad de solucion acuosa de FD40 a anadir a cada polimero, y diametro de particula promedio de las microparticulas obtenidas.

Composicion de PEG-PLGA: Cantidad de solucion acuosa de FD40 (pl) Diametro de particula promedio (pm)

2k-11,5k: 13 -

2k-21,5k: 12 -

2k-50,7k: 12 -

5k-10k: 20 -

5k-23k: 20 4,6

5k-32,5k: 20 4,3

5k-39,4k: 20 -

5k-47k: 20 4,2

5k-61k: 20 3,9

5k-65k: 20 3,2

10k-39k: 18 4,8

10k-95k: 15 4,5

Ejemplo 23. Medicion de la eficiencia de encapsulacion de microparticulas que encapsulan FD40

Se peso una microparticula (5 mg) que encapsula FD40 preparada en el procedimiento del ejemplo 22 utilizando el polimero de PEG-PLGA utilizando un tubo Eppendorf de 1,5 ml, y se disperso en Milli-Q (1 ml), y se centrifugo durante 30 minutos, y se separo en un sobrenadante que contenia FD40 no encapsulado y particulas que

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encapsulan FD40, y se recogio. Las particulas que encapsulan FD40 recogidas se disolvieron en N,N- dimetilformamida (250 p.l), y las particulas se disgregaron. El sobrenadante que contenia FD40 no encapsulado y solucion de N,N-dimetilformamida (50 p.l) que contenia FD40 encapsulado se anadieron a Milli-Q (3 ml) individualmente, y se agitaron bien, y FD40 se determino cuantitativamente utilizando un espectrofotometro fluorescente (HORlBA, Fluoro MAX-3, longitud de onda de excitacion 495 nm, longitud de onda fluorescente 520 nm), y se calculo la eficiencia de encapsulacion en el volumen de recogida completo.

La figura 13 muestra la eficiencia de encapsulacion de FD40 en microparticulas preparadas a partir de polimero de PEG-PLGA. En todas las series de 2k, 5k, 10k de peso molecular de PEG, cuando el peso molecular de PLG era alto, la eficiencia de encapsulacion tendia a ser alta. En particular, en la serie PEG5k, a 5k-65k, la eficiencia de encapsulacion era muy alta, siendo de aproximadamente el 90%. La eficiencia de encapsulacion era de aproximadamente el 55% en 10k-95k (PLGA/PEG = 9,5) casi a una misma relacion de peso molecular que 5k-47k *OKGA/PEG = 9,4) de eficiencia de encapsulacion alta (aproximadamente el 80%), la eficiencia de encapsulacion era de aproximadamente el 55%.

Ejemplo comparativo 3. Fabricacion de particulas que encapsulan FD40

Se disolvieron 10 mg de polimero de PEG-PLGA (5k-61k) en 2 ml de acetato de etilo para preparar una solucion de polimero. En esta solucion de polimero, se anadieron gota a gota 100 p.l de solucion de 2 mg/ml de hormona del crecimiento, y se agito. Despues de la operacion de agitacion, la solucion se anadio a 20 ml de dioxano. El disolvente se evaporo, y se concentro a aproximadamente 2 ml, y el liquido de dispersion de particulas se anadio a agua que contenia 500 mg de Pluronic F-68 (una marca registrada de BASF). La muestra se liofilizo, y se anadio 1 ml de agua a 50 mg de la muestra, y las particulas se dispersaron de nuevo, y se obtuvieron particulas que contenian sustancia activa hidrofila no asociadas. El diametro de particula promedio de las particulas se midio mediante un procedimiento de dispersion de luz dinamica utilizando un aparato ELS-Z (fabricado por Otsuka Denshi), y la eficiencia de encapsulacion de farmacos se determino igual que en el ejemplo 23.

Como resultado, la eficiencia de encapsulacion de FD40 fue del 48%, el diametro de particula promedio fue 203,8 nm, y la eficiencia de encapsulacion fue menor que en las microparticulas del ejemplo 23.

Ejemplo 24. Analisis de la velocidad de liberacion de FD40 in vitro a partir de microparticulas que encapsulan FD40

Con el fin de evaluar la relacion entre el comportamiento de liberacion sostenida y la longitud de la cadena de PLGA para componer el polimero de la particulas de PEG-PLGA, el comportamiento de liberacion se evaluo en particulas de 5k-23k, 5k-32,5k, 5k-47k, y 5k-61k, de las microparticulas que encapsulan el FD40 preparadas en el ejemplo 22.

Las microparticulas se almacenaron, justo despues de la preparacion, en estado liofilizado a -30°C, y se devolvieron a temperatura normal antes de la utilizacion. Se pesaron exactamente 20 mg de polvo de particulas, y se colocaron en un tubo de 1,5 ml (tubo Eppendorf), y se anadio 1 ml de tampon de ensayo (azida sodica al 0,02%, Pluronic F-68 al 0,1% (una marca registrada de BASF), y albumina de suero bovino al 0,1% anadidos a solucion en PBS), y se agitaron firmemente mediante un mezclador tactil y se suspendieron. A continuacion, utilizando una maquina centrifuga de alta velocidad de Hitachi (CF16RX), la solucion se centrifugo durante 10 minutos a 18.900 x g, y se retiraron 950 p.l de fraccion sobrenadante que contenia FD40 no encapsulado, y se anadieron de nuevo 950 p.l de tampon de ensayo, y las particulas se suspendieron y centrifugaron, y la operacion de limpieza de particulas se repitio un total de tres veces.

En las particulas limpiadas tres veces, se anadieron 950 p.l de tampon de ensayo una vez mas, y las particulas se suspendieron, y 100 p.l de cada una se dispensaron en un tubo de 1,5 ml. En cada tubo, se anadieron 900 p.l de tampon de ensayo para obtener una solucion total de 1 ml, que se incubo en una incubadora a 37°C mientras se hacia rotar a 10 rpm por medio de un rotador. Cada tubo incubado se centrifugo secuencialmente durante 10 minutos a 18.900 x g, y se dispensaron 950 p.l de sobrenadante, y se almacenaron a 4°C hasta el momento de la medicion de la intensidad fluorescente.

La intensidad fluorescente de la solucion muestreada se midio utilizando una cubeta desechable de 3 ml (KARTELL) y HORIBA Fluoro MAX-3, a una longitud de onda de excitacion de 494 nm y una longitud de onda fluorescente de 512 nm, y la relacion de liberacion sostenida se determino a partir de la relacion de la cantidad de FD40 utilizada en la preparacion de las particulas.

La figura 16 muestra la cantidad de liberacion de FD40 a partir de las diversas microparticulas determinadas por la evaluacion de liberacion. El eje de abscisas indica el tiempo de incubacion, y el eje de ordenadas representa la relacion de liberacion respecto a la cantidad cargada. En particulas 5k-23k cortas en la cadena de PLGA, aproximadamente el 40% de la cantidad cargada se libero en el plazo de 1 dia en el periodo de incubacion inicial, y en un mes, casi toda la cantidad fue liberada excepto la parte de descarga inicial. Por el contrario, a medida que la longitud de la cadena de PLGA se vuelve mas grande, la cantidad de liberacion inicial disminuia, y en microparticulas de 5k-61k, la cantidad de liberacion en un primer dia del periodo inicial era del 10% o menos.

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Ejemplo 25. Medicion de eficiencia de encapsulacion de farmacos de microparticulas que encapsulan insulina humana

Utilizando el polimero de PEG-PLGA (5k-61k) preparado en el ejemplo 20, se prepararon microparticulas que encapsulan insulina humana en el mismo procedimiento que en el ejemplo 22. Las microparticulas obtenidas (20 mg) se pesaron utilizando un tubo Eppendorf de 1,5 ml, y se disolvieron en 1 ml de solucion tampon A (PBS que contenia albumina de suero bovino al 0,1%, Pluronic F-68 al 0,1% (una marca registrada de BASF), y azida sodica al 0,02%), y se centrifugaron durante 10 minutos a 18.800 x g, y se separaron en particulas (precipitacion) y un sobrenadante. El sobrenadante se recogio en otro tubo, y las particulas se suspendieron de nuevo en 1 ml de solucion tampon A, y la operacion de centrifugado y la separacion en particulas y un sobrenadante se llevaron a cabo de nuevo en las mismas condiciones. Esta operacion de limpieza se repitio una vez mas (un total de tres veces de operacion de centrifugado), y la concentracion de insulina humana de cada sobrenadante recogido mediante las operaciones de centrifugado se midio mediante el procedimiento de ELISA en sandwich.

El procedimiento de ELISA en sandwich se llevo a cabo en el siguiente procedimiento. Se inmovilizo anticuerpo monoclonal anti-insulina humana (fabricado por Fitzgerald, N.° de clon E6E5) sobre una placa de ELISA (Maxisorp de Nunc Corp.) a una concentracion de 5 pg/ml, y 50 pl de solucion tampon de ELISA (solucion tampon clorato Tris 0,1 M que contenia BSA al 0,25% y Tween 20 al 0,05%, pH 8,0) y se anadieron 50 pl de muestra de medicion o muestra estandar diluida en solucion de dilucion de ELISA (PBS que contenia BSA al 0,25% y Tween 20 al 0,05%), y la solucion se hizo reaccionar a temperatura ambiente agitando durante 1 hora. La placa se limpio tres veces en una solucion de limpieza (PBS que contenia Tween 20 al 0,05%), y el reactivo que no reacciono se retiro, y se anadieron 0,5 pg/ml de anticuerpo monoclonal antihumano marcado con biotina (fabricado por Fitzgerald, N.° de clon D4B8), y conjugado de estreptavidina-HRP (fabricado por Zymed), y las soluciones se hicieron reaccionar a temperatura ambiente agitando durante 1 hora y 15 minutos. Despues de cada reaccion, la placa se limpio tres veces en una solucion de limpieza (PBS que contenia Tween 20 al 0,05%), y el reactivo que no reacciono se retiro. Finalmente, se anadio el sustrato de HRP, y la actividad de enzima HRP del conjugado combinado se determino mediante colorimetria, y tomando como base la curva de trabajo preparada a partir de del desarrollo del color de insulina estandar, se determino la concentracion de insulina en la muestra.

A partir de la cantidad cargada de insulina humana en el momento de la preparacion de particulas (por peso de particulas de 20 mg), se sustrajo la cantidad total de insulina humana de tres sobrenadantes mediante operaciones de centrifugado, y la eficiencia de encapsulacion se calculo segun la formula a continuacion.

Eficiencia de encapsulacion (%) =

(cantidad de insulina cargada (ng) - cantidad total de insulina en los sobrenadantes (ng)) cantidad de insulina cargada (ng)

x100

El diametro de particula promedio de las microparticulas obtenidas fue 4,7 pm. La eficiencia de encapsulacion de insulina humana en microparticulas fue 86,75, y se demostro que el farmaco proteico podria estar contenido a una eficiencia alta.

Ejemplo 26. Analisis de velocidad de liberacion de farmaco in vitro a partir de microparticulas que encapsulan insulina humana

Las microparticulas centrifugadas tres veces en el ejemplo 25 se suspendieron y se dispersaron en 1,0 ml de solucion tampon A. A partir de esta solucion, se dispensaron 0,1 ml de cada una en diez tubos Eppendorf (1,5 ml de capacidad), y se anadieron 0,9 ml de solucion tampon A en cada tubo, y se diluyeron 10 veces. Justo despues de la dilucion, un tubo se centrifugo durante 10 minutos a 18.800 x g para precipitar las particulas, y un sobrenadante se recogio en un tubo diferente (muestra a 0 horas). Los nueve tubos restantes se inclinaron a uno y otro lado y se mezclaron lentamente en una incubadora a 37°C, utilizando un rotador a una velocidad de 6 rpm. A intervalos de tiempo especificos, cada tubo se centrifugo de forma similar, y el sobrenadante se separo. En la muestra de sobrenadante recogida en cada tiempo, la concentracion de insulina se midio mediante el procedimiento de ELISA en sandwich, y la cantidad de liberacion de insulina (%) se calculo en la formula a continuacion.

Cantidad de liberacion (%) =

(concentracion de insulina en el sobrenadante (ng/ml) x 1 (ml)) cantidad de insulina encapsulada (ng) en 20 mg de particulas

La figura 17 muestra cambios en la evolucion temporal de la liberacion de insulina. Junto con el lapso de tiempo, el farmaco fue liberado gradualmente, y la velocidad de liberacion aumento despues de 30 dias, y la mayoria del farmaco se libero en aproximadamente 60 dias.

Ejemplo 27. Administracion hipodermica de microparticulas que encapsulan hormona del crecimiento humana (hGH) en raton

Se disolvieron 25 mg de polimero de PEG-PLGA en 500 pl de carbonato de dimetilo para preparar una solucion de polimero de 50 mg/ml. En esta solucion de polimero, se anadieron 100 pl de terc-butanol, y se dejaron caer gota a

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gota 250 pl de solucion acuosa de 10 mg/ml de hGH, y se agito en vortice para preparar una emulsion de fase inversa. Esta emulsion de fase inversa se congelo de forma preliminar mediante nitrogeno liquido, y se liofilizo utilizando un aparato de liofilizacion (EYELA, FREEZE DRYER FD-1000), a temperatura de enfriamiento de la trampa de -45°C, y grado de vacio de 20 Pa, durante 24 horas. El contenido solido obtenido se disperso en 1 ml de carbonato de dimetilo para preparar una suspension S/Ac. Esta suspension S/Ac se anadio gota a gota en 10 ml de solucion acuosa que contenia Pluronic F-68 al 10% (una marca registrada de BASF), y se agito y se emulsiono en un mezclador en vortice para preparar una emulsion de tipo S/Ac/Ag. A partir de esta emulsion de tipo S/Ac/Ag, el disolvente organico inmiscible en agua se retiro mediante secado en liquido, y se obtuvo un liquido de dispersion de microparticulas. El liquido de dispersion de microparticulas se congelo de forma preliminar mediante nitrogeno liquido, y se liofilizo utilizando un aparato de liofilizacion (EYELA, FREEZE DRYER FD-1000), a temperatura de enfriamiento de la trampa de -45°C, y grado de vacio de 20 Pa, durante 24 horas, y se obtuvo polvo de microparticulas que encapsulan hGH. El diametro de particula promedio de las microparticulas obtenidas fue 6,0 pm.

Se suspendieron 300 mg de las microparticulas preparadas y se dispersaron en 3 ml de solucion fisiologica tamponada con fosfato (PBS), y se centrifugaron durante 5 minutos a 80 x g para precipitar microparticulas, y un sobrenadante se transfirio a otro tubo. El sobrenadante se centrifugo de nuevo durante 5 minutos a 80 x g para precipitar las particulas restantes, y el sobrenadante se retiro. La primera precipitacion por centrifugado y la segunda precipitacion por centrifugado se combinaron, y se dispersaron de nuevo en 1 ml de PBS, y la misma operacion de limpieza por centrifugado se repitio tres veces en total, y se retiro la hormona del crecimiento no encapsulada en las microparticulas. Finalmente, la precipitacion se disperso de nuevo en 200 pl de PBS, y se obtuvo una solucion de administracion. La cantidad de hormona del crecimiento encapsulada en particulas de PEG-PLGA se midio mediante un kit de ELISA, y se sustrajo de la cantidad cargada, y se determino la cantidad encapsulada en 300 mg de particulas administradas por raton, y se obtuvieron 700 pg de microparticulas de PEG-PLGA.

La figura 18 muestra cambios en la evolucion temporal de la concentracion de hormona del crecimiento humana en plasma. En el raton al que se le administro farmaco no granulado, el nivel en sangre 1 hora despues de la administracion era muy alto, mas de 5.000 ng/ml, y a continuacion, cayo subitamente, hasta un nivel de un dia antes de la administracion. Por otro lado, en el raton al que se le administro el farmaco de microparticula preparado utilizando polimero de PEG-PLGA, un aumento transitorio del nivel en sangre justo despues de la administracion se suprimio a 100 ng/ml o menos, y durante siete dias consecutivos, el nivel en sangre se mantuvo a niveles elevados.

Ejemplo 28. Fabricacion de microparticulas anadiendo sal a la fase liquida en la etapa (c)

En 100 pl de solucion de 50 mg/ml de polimero de PEG-PLGA (5k-61k)/carbonato de dimetilo, se anadieron 20 pl de terc-butanol, y se anadieron 20 pl de solucion acuosa de 10 mg/ml de FD40, y la mezcla se agito para preparar una solucion de micela inversa (emulsion Ag/Ac). La solucion obtenida se congelo de forma preliminar mediante nitrogeno liquido, y se liofilizo durante una noche utilizando un aparato de liofilizacion, y se obtuvo un contenido solido que contenia FD40. En el contenido solido obtenido que contenia FD40, se anadieron 200 pl de carbonato de dimetilo, y se agito en vortice durante 10 segundos para preparar una suspension S/Ac, y se anadio gota a gota en 2 ml de solucion acuosa que contenia Pluronic F-68 al 10% (una marca registrada de BASF) junto con cloruro sodico a una concentracion especificada (0 M, 10 mM, 50 mM, 1 M), y se agito y se emulsiono en vortice durante 30 segundos para preparar una solucion de emulsion de tipo S/Ac/Ag. A partir de la solucion de emulsion de tipo S/Ac/Ag obtenida, el disolvente organico inmiscible en agua se retiro utilizando un evaporador (se evacuo a 30 hPa, y se evacuo y se retiro por destilacion durante 5 minutos) para preparar una materia dispersada en agua de microparticulas que contienen FD40. La solucion acuosa dispersa de microparticulas que contienen FD40 se congelo de forma preliminar mediante nitrogeno liquido, y se liofilizo durante una noche utilizando un aparato de liofilizacion, y se obtuvo polvo de microparticulas que contenian FD40. Las microparticulas obtenidas se observaron mediante un microscopio electronico de barrido (SEM: HITACHI, S-4800), y se calculo el diametro de particula promedio, y en todas las condiciones de concentracion de cloruro sodico, el diametro de particula promedio de microparticulas fue 6,5 pm.

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Se presaron 20 mg del polvo de microparticulas que contenian FD40 obtenido, y se dispersaron en 1 ml de solucion tampon de PBS (que contenia Pluronic F-68 al 0,1% (una marca registrada de BASF), BSA al 0,1%, y azida sodica al 0,01%), y se centrifugaron (14.000 rpm, 10 minutos). Despues de la recogida del sobrenadante, las microparticulas se suspendieron de nuevo en 1 ml de solucion tampon de PBS, y se centrifugaron, y las microparticulas se limpiaron adicionalmente dos veces mas. Las microparticulas limpiadas se suspendieron de nuevo en 1 ml de solucion tampon de PBS, se dispensaron a 900 pl cada una en tubos Eppendorf de 1,5 ml, y se anadieron 900 pl de solucion tampon de PBS, y la solucion se incubo a 37°C, y se recogieron muestras despues de 24 horas. Las muestras recogidas se centrifugaron durante 10 minutos a 14.000 rpm, y el FD40 contenido en el sobrenadante se midio utilizando un espectrofotometro fluorescente (HORIBA, Fluoro MAX-3, longitud de onda de excitacion 495 nm, longitud de onda fluorescente 520 nm), y se calculo la cantidad de liberacion. La cantidad de FD40 en el sobrenadante recogido en el momento de la limpieza se midio de forma similar, y la eficiencia de encapsulacion se calculo a partir de la cantidad cargada.

La eficiencia de encapsulacion fue del 73%, 97%, 84%, y 82% a concentraciones de cloruro sodico de 0 M, 10 mM, 50 mM y 1 M. La cantidad de liberacion en 1 dia fue del 14%, 7%, 15% y 11% a concentraciones de cloruro sodico de 0 M, 10 mM, 50 mM y 1 M, y a la concentracion de cloruro sodico de 10 mM, la eficiencia de encapsulacion era la mas alta, y la cantidad de liberacion en 1 dia (descarga inicial) era menor.

Ejemplo 29. Administracion hipodermica de microparticulas que encapsulan hormona del crecimiento humana (hGH) en raton (evaluacion de la actividad farmacologica)

Se disolvieron 25 mg de cada polimero de PEG-PLGA (5k-55k) y polimero de PEG-PLGA (5k-105k) del ejemplo 20 en 500 pl de carbonato de dimetilo para preparar una solucion de polimero de 50 mg/ml. En esta solucion de polimero, se anadieron 100 pl de terc-butanol, y se anadieron gota a gota 250 pl de solucion acuosa de 10 mg/ml de hGH, y se agito en vortice para preparar una emulsion de fase inversa. Esta emulsion de fase inversa se congelo de forma preliminar mediante nitrogeno liquido, y se liofilizo utilizando un aparato de liofilizacion (EYELA, FREEZE DRYER FD-1000), a temperatura de enfriamiento de la trampa de -45°C, y grado de vacio de 20 Pa, durante 24 horas. El contenido solido obtenido se disperso en 1 ml de carbonato de dimetilo para preparar una suspension S/Ac. Esta suspension S/Ac se anadio gota a gota en 10 ml de solucion acuosa que contenia Pluronic F-68 al 10% (una marca registrada de BASF), y se agito y se emulsiono en un mezclador en vortice para preparar una emulsion de tipo S/Ac/Ag. A partir de esta emulsion de tipo S/Ac/Ag, el disolvente organico inmiscible en agua se retiro mediante secado en liquido, y se obtuvo un liquido de dispersion de microparticulas. El liquido de dispersion de microparticulas se congelo de forma preliminar mediante nitrogeno liquido, y se liofilizo utilizando un aparato de liofilizacion (EYELA, FREEZE DRYER FD-1000), a temperatura de enfriamiento de la trampa de -45°C, y grado de vacio de 20 Pa, durante 24 horas, y se obtuvo polvo de microparticulas que encapsulan hGH. Las microparticulas obtenidas se observaron mediante un microscopio electronico de barrido (SEM: HITACHI, S-4800), y se calculo el diametro de particula promedio, y el diametro de particula promedio de las microparticulas obtenidas fue 4,2 pm en las microparticulas de polimero de PEG-PLGA (5k-55k) (microparticulas 5k-55k), y 7,5 pm en las microparticulas de polimero de PEG-PLGA (5k-105k) (microparticulas 5k-105k).

Se suspendieron 300 mg de cada una de las microparticulas preparadas anteriormente y se dispersaron en 3 ml de solucion fisiologica tamponada con fosfato (PBS), y las particulas se precipitaron mediante separacion por centrifugado durante 5 minutos a 80 x g, y un sobrenadante se transfirio a otro tubo. El sobrenadante se separo de forma centrifuga de nuevo durante 5 minutos a 80 x g, y las particulas restantes se precipitaron, y el sobrenadante se retiro. La primera precipitacion por centrifugado y la segunda precipitacion por centrifugado se combinaron, y se dispersaron de nuevo en 1 ml de PBS y, de forma similar, se llevo a cabo una tercera operacion de centrifugado, y la hormona del crecimiento no encapsulada en las particulas se retiro. Finalmente, la precipitacion se disperso de nuevo en 200 pl de PBS para preparar una solucion de administracion.

Esta solucion se inyecto por via hipodermica en el lomo de ratones ICR con la glandula pituitaria extraida de 8 semanas de edad (de Japan SLC), y se tomaron muestras de la sangre a intervalos especificos a partir de la vena caudal. En la sangre muestreada, se anadio heparina de concentracion final de 3,3 UI/ml, y se centrifugo durante 5 minutos a 5.000 rpm, y el plasma se recogio, y la concentracion de hormona del crecimiento en plasma y la concentracion de iGf-1 de raton se midieron mediante procedimiento de ELISA.

Con el fin de suprimir la produccion de anticuerpos mediante la administracion de hormona del crecimiento humana, que es una proteina extrana para el raton, tres dias antes de la administracion de la particula, un inmunosupresor, hidrato de Tacrolimus (Astellas) se administro por via hipodermica a 26 pg/raton, y seguidamente 13 pg/raton se administraron por via hipodermica en el momento de la administracion del farmaco, y dos veces una semana mas tarde.

La figura 19 muestra cambios en la evolucion temporal de la concentracion de hormona del crecimiento humana en

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plasma. En el raton al que se le administro farmaco no granulado, el nivel en sangre 1 hora despues de la administracion era muy alto y, a continuacion, cayo subitamente, hasta un nivel de un dia antes de la administracion. Por otro lado, en el raton al que se le administro el farmaco de microparticula fabricado utilizando polimero de PEG- PLGA, un aumento de la concentracion transitorio justo despues de la administracion se suprimio a la baja, aproximadamente 1/100 del nivel en el raton al que se le administro farmaco no granulado, y durante mas de nueve dias consecutivos despues de la administracion, el nivel en sangre se mantuvo a niveles elevados.

La figura 20 muestra la concentracion de IGF-1 en plasma durante este periodo de tiempo. La concentracion de IGF- 1 en plasma era elevada despues de la administracion tanto en microparticulas 5k-55k como microparticulas 5k- 105k, y se mantuvieron niveles altos durante 7 dias en microparticulas 5k-55k, y mas de 14 dias en microparticulas 5k-105k.

Ejemplo 30. Administracion hipodermica de microparticulas que encapsulan exendina-4 (agonista del receptor GLP- 1) en raton

Se disolvieron 25 mg de polimero de PEG-PLGA (5k-61k) en el ejemplo 20 en 500 pl de carbonato de dimetilo para preparar una solucion de polimero de 50 mg/ml. En esta solucion de polimero, se anadieron 100 pl de terc-butanol, y se anadieron gota a gota 250 pl de 10 mg/ml exendina-4 (sintetizada por encargo con Sigma Genosys), y se agito en vortice para preparar una emulsion de fase inversa. Esta emulsion de fase inversa se congelo de forma preliminar mediante nitrogeno liquido, y se liofilizo utilizando un aparato de liofilizacion (EYELA, FREEZE DRYER FD-1000), a temperatura de enfriamiento de la trampa de -45°C, y grado de vacio de 20 Pa, durante 24 horas. El contenido solido obtenido se disperso en 1 ml de carbonato de dimetilo para preparar una suspension S/Ac. Esta suspension S/Ac se anadio gota a gota en 10 ml de solucion acuosa que contenia Pluronic F-68 al 10% (una marca registrada de BASF), y se agito y se emulsiono en un mezclador en vortice para preparar una emulsion de tipo S/Ac/Ag. A partir de esta emulsion de tipo S/Ac/Ag, el disolvente organico inmiscible en agua se retiro mediante secado en liquido, y se obtuvo un liquido de dispersion de microparticulas. El liquido de dispersion de microparticulas se congelo de forma preliminar mediante nitrogeno liquido, y se liofilizo utilizando un aparato de liofilizacion (EYELA, FREEZE DRYER FD-1000), a temperatura de enfriamiento de la trampa de -45°C, y grado de vacio de 20 Pa, durante 24 horas, y se obtuvo polvo de microparticulas que encapsulan exendina-4. Las microparticulas obtenidas se observaron mediante un microscopio electronico de barrido (SEM: HITACHI, S-4800), y se calculo el diametro de particula promedio, y el diametro de particula promedio de las microparticulas fue 6,0 pm.

Se suspendieron 300 mg de las microparticulas preparadas y se dispersaron en 3 ml de solucion fisiologica tamponada con fosfato (PBS), y las particulas se precipitaron mediante separacion por centrifugado durante 5 minutos a 80 x g, y un sobrenadante se transfirio a otro tubo. El sobrenadante se separo de forma centrifuga de nuevo durante 5 minutos a 80 x g, y las particulas restantes se precipitaron, y el sobrenadante se retiro. La primera precipitacion por centrifugado y la segunda precipitacion por centrifugado se combinaron, y se dispersaron de nuevo en 1 ml de PBS, y, de forma similar, se llevo a cabo una tercera operacion de centrifugado, y la exendina-4 no encapsulada en las particulas se retiro. Finalmente, la precipitacion se disperso de nuevo en 200 pl de PBS para preparar una solucion de administracion.

Esta solucion se inyecto por via hipodermica en dos posiciones en el lomo de ratones Balb/C macho de 10 semanas de vida (de Japan SLC), y se tomaron muestras de la sangre a intervalos de tiempo especificos a partir de la vena caudal. En la sangre muestreada, se anadio heparina de concentracion final de 3,3 UI/ml, y se recogio el plasma mediante separacion por centrifugado durante 5 minutos a 5.000 rpm, y la concentracion de hormona del crecimiento en plasma se midio mediante el procedimiento de ELISA.

A modo de comparacion, una solucion de exendina-4 no graduada (700 pg/0,2 ml) se administro por via hipodermica en raton, y se tomaron muestras de la sangre de forma similar.

Con el fin de suprimir la produccion de anticuerpos mediante administracion de exendina-4, que es una proteina distinta para raton, tres dias antes de la administracion de la particula, un inmunosupresor, hidrato de Tacrolimus (Astellas), se administro por via hipodermica a una dosis de 26 pg/raton, y seguidamente se administraron 13 pg/raton por via hipodermica en el momento de la administracion del farmaco, y dos veces una semana mas tarde.

La figura 21 muestra cambios en la evolucion temporal de la concentracion de exendina-4 en plasma. En el raton al que se le administro farmaco no granulado, el nivel en sangre 1 hora despues de la administracion era muy alto y, a continuacion, cayo subitamente, hasta un nivel de un dia antes de la administracion. Por otro lado, en el raton al que se le administro el farmaco de microparticula preparada utilizando polimero de PEG-PLGA, un aumento transitorio del nivel en sangre justo despues de la administracion se suprimio a aproximadamente menos de 1/100, y el nivel en sangre se mantuvo a niveles elevados durante un mes.

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Ejemplo 31. Preparacion de microparticulas que encapsulan dextrano marcado con fluoresceina (FD40) con diametro de particula diferente

Se disolvieron 5 mg de polimero de PEG-PLGA (5k-55k) en el ejemplo 20 en 100 pl de carbonato de dimetilo para preparar una solucion de polimero de 50 mg/ml. En esta solucion de polimero, se anadieron 20 pl de terc-butanol, y se anadieron gota a gota 20 pl de solucion acuosa de 1 mg/ml de FD40, y se agito en vortice para preparar una emulsion de fase inversa. Esta emulsion de fase inversa se congelo de forma preliminar mediante nitrogeno liquido, y se liofilizo utilizando un aparato de liofilizacion (EYELA, FREEZE DRYER FD-1000), a temperatura de enfriamiento de la trampa de -45°C, y grado de vacio de 20 Pa, durante 24 horas. El contenido solido obtenido se disperso en 50 pl, 200 pl y 500 pl de carbonato de dimetilo para preparar una suspension S/Ac. Esta suspension S/Ac se anadio gota a gota en 2 ml de solucion acuosa que contenia Pluronic F-68 al 10% (una marca registrada de BASF), y se agito y se emulsiono en un mezclador en vortice para preparar una emulsion de tipo S/Ac/Ag. A partir de esta emulsion de tipo S/Ac/Ag, el disolvente organico inmiscible en agua se retiro mediante secado en liquido, y se obtuvo un liquido de dispersion de microparticulas. El liquido de dispersion de microparticulas se congelo de forma preliminar mediante nitrogeno liquido, y se liofilizo utilizando un aparato de liofilizacion (EYELA, FREEZE DRYER FD-1000), a temperatura de enfriamiento de la trampa de -45°C, y grado de vacio de 20 Pa, durante 24 horas, y se obtuvo polvo de microparticulas que encapsulan FD40. Las microparticulas obtenidas se observaron mediante un microscopio electronico de barrido (SEM: HITACHI, S-4800), y se calculo el diametro de particula promedio.

La figura 22 muestra la correlacion entre el diametro de particula promedio y la cantidad de carbonato de dimetilo anadida en el momento de la preparacion de emulsion de tipo S/Ac/Ag. En un intervalo de 50 pl a 500 pl, junto con el aumento de cantidad de carbonato de dimetilo, se observo declive del diametro de particula promedio.

APLICABILIDAD INDUSTRIAL

Una microparticula de la presente invencion libera una sustancia activa hidrofila a una velocidad apropiada en el cuerpo humano, y es util como preparacion farmaceutica de sistema de administracion de farmacos (DDS).

Claims

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

REIVINDICACIONES

1. Microparticula, que comprende un aglomerado de particulas que contienen sustancia activa hidrofila, particula que comprende un polimero anfifilo compuesto por un segmento hidrofobo de poli(hidroxiacido) y un segmento hidrofilo de polisacarido o polietilenglicol, y una sustancia activa hidrofila, y en la que el numero de aglomeracion de dichas particulas esta en el intervalo de 10 a la septima potencia de 10.
2. Microparticula, segun la reivindicacion 1, en la que la particula que contiene sustancia activa hidrofila tiene un segmento hidrofilo de polimero anfifilo en el interior, y tiene una capa externa de un segmento hidrofobo de polimero anfifilo.
3. Microparticula, segun la reivindicacion 1 o 2, en la que el polimero anfifilo es un polimero anfifilo de tipo injerto compuesto por una cadena principal de polisacarido y una o varias cadenas de injerto de poli(hidroxiacido).
4. Microparticula, segun la reivindicacion 3, en la que la cadena principal de polisacarido es dextrano.
5. Microparticula, segun la reivindicacion 1 o 2, en la que el polimero anfifilo es un polimero de bloques compuesto por polietilenglicol y poli(hidroxiacido).
6. Microparticula, segun la reivindicacion 5, en la que el peso molecular promedio del polietilenglicol es de 2.000 a 15.000.
7. Microparticula, segun la reivindicacion 5 o 6, en la que la relacion del peso molecular promedio de poli(hidroxiacido) respecto al peso molecular promedio de polietilenglicol es de 4 o mas.
8. Microparticula, segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en la que el poli(hidroxiacido) es poli(acido lactico- acido glicolico).
9. Microparticula, segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en la que el diametro de particula promedio es de 1 a 50 pmi.
10. Microparticula, segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en la que la sustancia activa hidrofila es un peptido o una proteina.
11. Procedimiento para fabricar una microparticula, que comprende:

(a) una etapa de formar una emulsion de fase inversa mezclando un disolvente acuoso que contiene la sustancia activa hidrofila y un disolvente organico inmiscible en agua que disuelve un polimero anfifilo,

(b) una etapa de obtener un contenido solido que contiene una sustancia activa hidrofila retirando el disolvente de la emulsion de fase inversa, y

(c) una etapa de introducir un liquido de dispersion que contiene el contenido solido en una fase liquida que contiene un modificador de superficie.
12. Procedimiento, segun la reivindicacion 11, en el que el disolvente se retira de la emulsion de fase inversa mediante un procedimiento de liofilizacion.
13. Procedimiento, segun la reivindicacion 11 o 12, en el que el medio de dispersion del liquido de dispersion que contiene el contenido solido es un disolvente capaz de disolver poli(hidroxiacido) y que es 10 mg/ml o menos en la solubilidad de un segmento hidrofilo para componer un polimero anfifilo.
14. Procedimiento, segun cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13, en el que la fase liquida es un disolvente acuoso o bien un disolvente organico miscible en agua.
15. Preparacion farmaceutica que comprende la microparticula, segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10.