JPWO2009104706A1 - マイクロ粒子およびその医薬品組成物 - Google Patents

Abstract

ポリ（ヒドロキシ酸）の疎水性セグメントと多糖またはポリエチレングリコールの親水性セグメントからなる両親媒性ポリマーおよび親水性活性物質を含有してなる親水性活性物質含有粒子が会合してなるマイクロ粒子は、親水性活性物質を効率よく封入し、生体内において適切な速度で親水性活性物質を放出できるため、ＤＤＳ製剤として有用である。

Description

本発明は、親水性活性物質を含有する粒子が会合してなるマイクロ粒子およびその医薬品組成物に関する。詳しくは、本発明は、いわゆるドラッグデリバリーシステム(Drug Delivery System)としてのマイクロ粒子およびその医薬品組成物に関する。更に詳しくは、本発明は、例えば、親水性かつ分子量の大きいタンパク質・ペプチド医薬、核酸医薬などを効果的に内包するマイクロ粒子およびその医薬品組成物に関する。

ナノパーティクル、マイクロパーティクル、ナノスフィア、マイクロスフィアあるいはマイクロカプセルなどと呼ばれる微粒子に薬剤を封入した微粒子製剤が開発され、薬物の徐放剤として用いることが検討されている。

ポリマー化合物を基材とする微粒子製剤としては、生分解性であるポリ乳酸またはポリ（乳酸−グリコール酸）を用いた微粒子が挙げられる。これらの微粒子製剤においては、親水性かつ分子量の大きいタンパク質・ペプチド医薬を、生理活性を保った状態で封入することは難しい。加えて、生体投与時に、初期バーストと呼ばれる薬物が短時間で大量に放出される現象が起こることが知られている。

糖類とポリ（ヒドロキシ酸）を共有結合させたポリマーからなる微粒子として、特許文献１では、ポリオールとポリ乳酸の反応物からなる、薬理学的活性剤を担時するためのマイクロカプセルが開示されている。この技術では多糖は使用されておらず、ペプチド・タンパク質の封入についても開示がない。噴霧乾燥法によって製造したマイクロカプセルは封入した薬物を２４時間に６２％放出している。この放出速度は、あまりにも速くマイクロカプセルの薬物徐放剤としての用途を妨げるものである。

特許文献２、非特許文献１では多糖に生分解性ポリマーをグラフトした材料からなるナノ粒子またはマイクロ粒子が開示されているが、これらの文献ではナノ粒子が会合して形成されたマイクロ粒子については言及されていない。特許文献２には、親水性の活性成分を被包するためのマイクロ粒子の製造法として、文献に既に記載された方法、例えば、「ダブルエマルジョン」法が挙げられているが、具体的な記述は無く、粒子への薬物の封入や粒子からの薬物の放出が実現していない。非特許文献１では、「ダブルエマルジョン」法により製造されたアルブミンを封入したマイクロ粒子が開示されているが、アルブミンの仕込み量に対する封入率は５３％以下であり、親水性活性物質の低い封入率は、製造にコストが掛かる問題がある。

特許文献３では多糖と脂肪族ポリエステルから成る両親媒性ポリマーを含んで成る微粒子であって、多糖から成る内核、脂肪族ポリエステルから成る疎水性外層、疎水性外層に結合した表面改質剤から成る微粒子が開示されている。当該粒子は、微粒子が会合した構造を有しておらず、粒径がマイクロメートルサイズの粒子については、具体的な例示は無い。また、親水性活性物質の封入率は５０％以下であり、上記と同様低い封入率が問題となる。

特許文献４ではデキストランの天然誘導化ポリマーからなる、平均粒径３００ｎｍ未満のナノ微粒子が開示されているが、具体的な例示はない。また、微粒子が会合した構造を有しておらず、平均粒径が数百ナノメートルであることは、投与部位からの拡散を招き徐放剤として好ましくない。

また、粒子を形成するポリマーとして、特許文献５、特許文献６では、ポリエチレングリコールなどの親水性部分とポリ（乳酸−グリコール酸）などの疎水性部分をもつ両親媒性ブロックポリマーを用いる検討がおこなわれ、開示されている。このような両親媒性ブロックポリマーを用いたミセル粒子は、通常内部が疎水性、外層部が親水性の構造を有するため、疎水性低分子薬物の内包には適しているが、タンパク、ペプチドなどの親水性活性物質の内包は困難である。

また、特許文献７、非特許文献２では両親媒性ブロックポリマーを用いた粒子にタンパクを内包する試みについても開示されているが、内包可能な薬物量が少ない、あるいは初期バースト大きいといった欠点があり、親水性薬物の徐放注射剤として適した性質をもつ粒子の作製技術はいまだ確立されていない。
特公平８−１９２２６号公報 特表２００４−５２１１５２号公報 ＷＯ２００６／０９５６６８ 特表平１０−５１１９５７号公報 特表２００４−５１３１５４号公報 特表２００４−５１４７３４号公報 特表２０００−５０１０８４号公報 大矢裕一、他3名、「ポリ乳酸をグラフト化したデキストランマイクロスフィアへのウシ血清アルブミンの封入及び／もしくは放出挙動（Encapsulation and/or Release Behavior of Bovine Serum Albumin within and from Polylactide-Grafted Dextran Microspheres）」、マクロモレキュラー・バイオサイエンス(Macromolecular Bioscience)、2004年、第４巻、p.458-463 アンシュ・ヤン（Anshu Yang）、他５名、「ＴＮＦ−αを遮断するペプチドを内封したＰＥＧ−ＰＬＧＡ粒子の調製と生体内挙動（Tumor necrosis factor alpha blocking peptide loaded PEG-PLGA nanoparticles: Preparation and in vitro evaluation）」、インターナショナル・ジャーナル・オブ・ファーマシューティクス(International Journal of Pharmaceutics)、2007年、第331巻、p.123-132

上記のように、ポリマーを使用したマイクロ粒子開発が行われているが、親水性活性物質を効率よく封入可能なマイクロ粒子であって、顕著な初期バーストを示さず、且つ適度な速度で封入された薬物を放出可能なマイクロ粒子を提供することを課題とする。

本発明者らは、上記の課題を解決するために鋭意研究を行った結果、本発明を完成するに至った。

すなわち本発明は、ポリ（ヒドロキシ酸）の疎水性セグメントと多糖またはポリエチレングリコールの親水性セグメントからなる両親媒性ポリマーおよび親水性活性物質を含有してなる親水性活性物質含有粒子が会合してなるマイクロ粒子、詳しくは、内部に両親媒性ポリマーの親水性セグメントを有し、両親媒性ポリマーの疎水性セグメントの外層を有する親水性活性物質含有粒子が会合してなるマイクロ粒子、その製造方法およびその医薬品組成物についてである。

本発明のマイクロ粒子は親水性活性物質を効率よく封入し、生体内において適切な速度で親水性活性物質を放出しうるので、新規なＤＤＳ製剤として利用することができる。

ヒト成長ホルモン内包マイクロ粒子からの薬物放出。 ヒトインスリン内包デキストラン−ＰＬＧＡマイクロ粒子からの薬物放出。 デキストラン−ＰＬＧＡマイクロ粒子のＳＥＭ像。 ポリエチレングリコール−ポリ（イプシロン−カプロラクトン）マイクロ粒子のＳＥＭ像。 ヒト成長ホルモン内包粒子を皮下投与したマウスの血中薬物濃度の経時変化。 ヒト成長ホルモン内包マイクロ粒子を皮下投与したマウスの血中薬物濃度の経時変化。 ヒト成長ホルモン内包マイクロ粒子を皮下投与したマウスの体重変化。 ヒト成長ホルモン内包マイクロ粒子を皮下投与したマウスの血中ＩＧＦ−１濃度の経時変化。 エキセンジン４内包マイクロ粒子の緩衝液中での薬物放出。 エキセンジン４内包マイクロ粒子を皮下投与したマウスの血中薬物濃度の経時変化。 ヒト成長ホルモン内包会合粒子からの薬物放出。 Ｓ／Ｏ／Ｗ型エマルジョン作成時に添加した炭酸ジメチル量と粒径の関係。 ＦＤ４０内包マイクロ粒子の内包率の結果。 ＰＥＧ−ＰＬＧＡポリマー（５ｋ−１０ｋ）から調製したマイクロ粒子粉末のＳＥＭ像。 ＰＥＧ−ＰＬＧＡポリマー（５ｋ−６１ｋ）から調製したマイクロ粒子粉末のＳＥＭ像。 ＦＤ４０内包マイクロ粒子からのＦＤ４０放出挙動。 ヒトインスリン内包マイクロ粒子からの薬物放出挙動。 ヒト成長ホルモン内包マイクロ粒子を皮下投与したマウスの血中薬物濃度の経時変化。 ヒト成長ホルモン内包マイクロ粒子を皮下投与したマウスの血中薬物濃度の経時変化。 ヒト成長ホルモン内包マイクロ粒子を皮下投与したマウスの血中ＩＧＦ−１濃度の経時変化。 エキセンジン４内包マイクロ粒子を皮下投与したマウスの血中薬物動態の経時変化。 Ｓ／Ｏ／Ｗ型エマルジョン作成時に添加した炭酸ジメチル量と粒径の関係。

本発明においては、両親媒性ポリマーおよび親水性活性物質を含有してなる親水性活性物質含有粒子が会合してマイクロ粒子を形成することを特徴としている。ここで言う会合とは、２以上の粒子が粒子間力もしくは他物質を介して結合し，集合体を形成することである。粒子間力は特に限定されないが、疎水性相互作用、水素結合、ファン・デル・ワールス力が挙げられる。会合は、粒子同士が接している状態に限定されず、粒子間に粒子と親和性を有する物質が存在していても良く、マトリックスに粒子が分散していても良い。粒子に親和性を有する物質、マトリックスとしてはポリマーが好ましい。本発明においては、該親水性活性物質含有粒子が会合することで、単独の粒子であるよりも親水性活性物質の内包率に優れるという効果がもたらされる。なお、会合する該親水性活性物質含有粒子の粒径は異なっていても良い。

マイクロ粒子とは、サブミクロンからサブミリメータの粒径を有する粒子のことである。本発明のマイクロ粒子の平均粒径は特に制限はないが、例えば注射により該マイクロ粒子を生体投与する場合、平均粒径が大きくなるほど注射針を患者にとって負担の大きい太いものを使用する必要があるため、患者負担の軽減の観点からも１μｍから５０μｍであることが好ましい。マイクロ粒子の平均粒径は走査型電子顕微鏡による画像解析法により求めることができる。

マイクロ粒子を構成する親水性活性物質含有粒子の会合数は、１０から１０の７乗の範囲であることが好ましく、より好ましくは１０の５乗から１０の７乗の範囲である。会合数は、親水性活性物質含有粒子の平均粒径とマイクロ粒子の平均粒径から計算できる。

本発明においては、両親媒性ポリマーがポリ（ヒドロキシ酸）の疎水性セグメントと多糖またはポリエチレングリコールの親水性セグメントからなることを特徴としている。ここで言う両親媒性とは、親水性と疎水性の両方の性質を有しているということで、親水性とは、任意の部位の水への溶解度が、他のセグメントより高いとき、該部位を親水性であると言う。親水性セグメントは、水に可溶であることが望ましいが、難溶であっても他の部位と比較して、水への溶解度が高ければ良い。また、疎水性とは、任意の部位の水への溶解度が、他の部位より低いとき、該セグメントを疎水性であるという。疎水性セグメントは、水に不溶であることが望ましいが、可溶であっても他の部位と比較して、水への溶解度が低ければ良い。

両親媒性ポリマーのポリ（ヒドロキシ酸）鎖としては、具体的には、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、ポリ（２−ヒドロキシ酪酸）、ポリ（２−ヒドロキシ吉草酸）、ポリ（２−ヒドロキシカプロン酸）、ポリ（２−ヒドロキシカプリン酸）、ポリ（リンゴ酸）またはこれらの高分子化合物の誘導体ならびに共重合体が挙げられるが、本発明のマイクロ粒子は生体投与時に著しく有害な影響を与えるものでないことが好ましいため、両親媒性ポリマーのポリ（ヒドロキシ酸）についても生体適合性高分子であることが好ましい。なお、ここで言う生体適合性高分子とは、生体に投与した際に著しく有害な影響を及ぼさないものを言い、より具体的には、ラットに該高分子を経口投与する場合のＬＤ５０が２，０００ｍｇ／ｋｇ以上のものを言う。

生体適合性高分子であるポリ（ヒドロキシ酸）としては、ポリ乳酸、ポリグリコール酸またはポリ（乳酸−グリコール酸）の共重合体が好ましい。ポリ（ヒドロキシ酸）がポリ（乳酸−グリコール酸）である場合、ポリ（乳酸−グリコール酸）の組成比（乳酸／グリコール酸）（モル／モル％）は、本発明の目的が達成される限り特に限定されないが、１００／０〜３０／７０のものが好ましく、６０／４０〜４０／６０のものが特に好ましい。

両親媒性ポリマーの親水性セグメントが多糖である場合、多糖としては、セルロース、キチン、キトサン、ジェランガム、アルギン酸、ヒアルロン酸、プルランもしくはデキストランが挙げられるが、デキストランであることが好ましい。

該両親媒性ポリマーは多糖主鎖にポリ（ヒドロキシ酸）のグラフト鎖がグラフト重合していることが好ましい。ここで、多糖主鎖の平均分子量は、１，０００から１００，０００であることが好ましく、２，０００から５０，０００であることがより好ましく、ポリ（ヒドロキシ酸）の平均分子量は、５００から１００，０００であることが好ましく、１，０００から１０，０００がより好ましい。また、多糖の平均分子量に対するポリ（ヒドロキシ酸）の平均分子量の値としては、好ましくは、０．０１倍から１００倍であり、より好ましくは、０．０２倍から１０倍であり、更に好ましくは、０．０２倍から１倍である。

多糖主鎖に結合しているポリ（ヒドロキシ酸）グラフト鎖の数は、好ましくは、２から５０である。グラフト鎖数は、グラフト型両親媒性ポリマー、多糖主鎖、ポリ（ヒドロキシ酸）グラフト鎖平均分子量から求めることができる。

両親媒性ポリマーの親水性セグメントがポリエチレングリコールである場合、該両親媒性ポリマーは、ポリエチレングリコールとポリ（ヒドロキシ酸）のブロックポリマーであることが好ましい。本発明において、用語「ブロック」とは、ポリマー分子の一部分で，少なくとも５個以上のモノマー単位からなり，その部分に隣接する他の部分と化学構造上あるいは立体配置上異なるものを言い、少なくとも２以上のブロックが線状に連結してできたポリマーをブロックポリマーと言う。ブロックポリマーを構成する各ブロック自体が、２種類以上のモノマー単位からなる、ランダム、交互、グラジエントポリマーであっても良い。なお、両親媒性ポリマーの親水性セグメントがポリエチレングリコールである場合該両親媒性ポリマーは、ポリエチレングリコールとポリヒドロキシ酸がそれぞれ１つずつ連結したブロックポリマーであることが好ましい。

両親媒性ポリマーの親水性セグメントがポリエチレングリコールである場合、使用されるポリエチレングリコールとしては直鎖もしくは分岐のポリエチレングリコールまたはその誘導体が挙げられ、好ましくは直鎖のポリエチレングリコール誘導体である。ポリエチレングリコール誘導体の好ましい例としてはポリエチレングリコールモノアルキルエーテルが挙げられる。ポリエチレングリコールモノアルキルエーテルのアルキル基としては炭素数１〜１０の直鎖状もしくは分岐状アルキル基が挙げられ、炭素数１〜４の直鎖状もしくは分岐状アルキル基が好ましく、メチル、エチル、プロピル、iso−プロピル基がより好ましい。

ポリエチレングリコールの平均分子量には特に制限はないが、２，０００〜１５，０００であることが好ましく、２，０００〜１２，０００であることがより好ましく、４，０００〜１２，０００であることが更に好ましく、５，０００〜１２，０００であることが特に好ましい。

両親媒性ポリマーの親水性セグメントがポリエチレングリコールである場合のポリ（ヒドロキシ酸）の平均分子量は特に限定されないが、５，０００〜２００，０００であることが好ましく、１５，０００〜１５０，０００がより好ましく、２０，０００〜１００，０００が更に好ましい。また、ポリエチレングリコールの平均分子量に対するポリ（ヒドロキシ酸）の平均分子量の値としては、好ましくは、１倍以上であり、より好ましくは２倍以上であり、更に好ましくは４倍以上であり、特に好ましくは４倍以上２５倍以下である。

なお本明細書での平均分子量は、特に断りがない限り数平均分子量を言い、数平均分子量とは、分子の大きさの重み付けを考慮しない方法で算出した平均分子量であり、両親媒性ポリマー、多糖およびポリエチレングリコールの平均分子量はゲルパーミションクロマトグラフィー（ＧＰＣ）で測定したポリスチレンやプルラン換算の分子量として求めることができる。また、ポリ（ヒドロキシ酸）の平均分子量は、核磁気共鳴（^１Ｈ−ＮＭＲ）測定により、末端残基のピーク積分値と末端残基以外のピーク積分値の比から求めることができる。

本発明で使用される多糖およびポリ（ヒドロキシ酸）からなる両親媒性ポリマーは、既知の方法で合成すれば良く、逆相エマルジョンを形成することができれば、合成法により限定されないが、例えば以下の（１）、（２）または（３）のようにして製造することができる。
（１）すず触媒存在下、多糖にヒドロキシ酸活性化モノマーを加えて重合反応を行い、ポリ（ヒドロキシ酸）を導入することでグラフト型両親媒性ポリマーを製造する方法［Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，３１，１０３２−１０３９（１９９８年）］。
（２）水酸基の大部分が置換基で保護された多糖の一部未保護の水酸基を塩基で活性化後、ヒドロキシ酸活性化モノマーを加えてポリ（ヒドロキシ酸）からなるグラフト鎖を導入し、最後に保護基を取り除くことにより、グラフト型両親媒性ポリマーを製造する方法［Ｐｏｌｙｍｅｒ，４４，３９２７−３９３３，（２００３年）］。
（３）多糖に対して、ポリ（ヒドロキシ酸）の共重合体を脱水剤および／または官能基の活性化剤を用いて縮合反応させることにより、グラフト型両親媒性ポリマーを製造する方法［Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，３３，３６８０−３６８５（２０００年）］。

本発明で使用されるポリエチレングリコールおよびポリ（ヒドロキシ酸）からなる両親媒性ポリマーは、既知の方法で合成すれば良く、逆相エマルジョンを形成することができれば、合成法により限定されないが、例えば、すず触媒存在下、ポリエチレングリコールにヒドロキシ酸活性化モノマーを加えて重合反応を行い、ポリ（ヒドロキシ酸）を導入することで両親媒性ブロックポリマーを製造する方法［Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ，７１，２０３−２１１（２００１年）］により製造することができる。

前述の両親媒性ポリマーと親水性生理活性物質を含有してなる親水性活性物質含有粒子の構造は特に限定されないが、内部に両親媒性ポリマーの親水性セグメントを有し、両親媒性ポリマーの疎水性セグメントの外層を有する親水性活性物質含有粒子である場合、内包される親水性活性物質がより安定に保持されうるため、好ましい。

親水性活性物質含有粒子が、内部に両親媒性ポリマーの親水性セグメントを有し、両親媒性ポリマーの疎水性セグメントの外層を有する粒子である場合、ポリ（ヒドロキシ酸）外層に表面改質剤が結合しているものについても好ましい態様のひとつである。ここでいう結合とは非共有結合であっても共有結合であっても良い。非共有結合は、好ましくは疎水的な相互作用であるが、静電相互作用、水素結合、フアン・デル・ワールスカでも良く、それらが複合した結合でも良い。非共有結合においては、両親媒性ポリマーを含む微粒子の疎水性外層と後述の表面改質剤の疎水部分とが、疎水的な相互作用により結合していることが好ましい。この場合、微粒子の分散媒が水、緩衝液、生理食塩水、表面改質剤水溶液または親水性溶媒である微粒子分散体であることがとくに好ましい。

表面改質剤は、Ｓ／Ｏ／Ｗ型エマルジョンの水−油界面あるいはＳ／Ｏ１／Ｏ２型エマルジョンの油−油エマルジョン界面を安定化するものであることが好ましく、また好ましくは、マイクロ粒子のコロイド安定性を向上させる性質を有する化合物である。表面改質剤は、１種でも複数の混合物でも良い。ここでコロイド安定性を向上させるとは、マイクロ粒子の溶媒中における凝集を防ぐことまたは遅延させることを言う。

本発明では、表面改質剤は、両親媒性化合物または親水性ポリマーであることが好ましい。

本発明での表面改質剤の親水性ポリマーとしては、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリエチレンイミン、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリ−１，３−ジオキソラン、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンポリマー、ポリ−１，３，６−トリオキサン、ポリアミノ酸、ペプチド、タンパク質、糖類もしくはいずれかの類縁体であることが好ましい。

該親水性ポリマーの類縁体としては、親水性ポリマーを長鎖アルキルなどの疎水基を部分的に修飾するなどした界面活性剤が挙げられるが、これらに限定されるものではない。

本発明での表面改質剤のポリエチレングリコール類縁体としては、ＢＡＳＦから市販されるＰｌｕｒｏｎｉｃ（ＢＡＳＦの登録商標）もしくはその同等品が好ましい。

本発明での表面改質剤のポリアミノ酸としては、ポリアスパラギン酸もしくはポリグルタミン酸またはこれらの類縁体が好ましい。ポリアスパラギン酸もしくはポリグルタミン酸の一部に長鎖アルキル基を導入した類縁体はとくに好ましい。

本発明での表面改質剤のペプチドとしては、塩基性ペプチドが挙げられる。

本発明での表面改質剤のタンパク質としては、ゼラチン、カゼインまたはアルブミンが粒子の分散性向上のために好ましい。タンパク質としては、抗体も好ましい１例として挙げられる。

本発明での表面改質剤の糖類としては、単糖類、オリゴ糖類、多糖類が好ましい。多糖類としては、セルロース、キチン、キトサン、ジェランガム、アルギン酸、ヒアルロン酸、プルランもしくはデキストランが好ましく、特にコレステロール化プルランは、粒子の分散性向上のために好ましく、セルロース、キチン、キトサン、ジェランガム、アルギン酸、ヒアルロン酸、プルランもしくはデキストランのいずれかの類縁体が好ましい。

表面改質剤としてのこれらのペプチド、タンパク質、糖類は、長鎖アルキルなどの疎水基を部分的に修飾するなどした類縁体や前述の親水性ポリマーや両親媒性化合物を修飾した類縁体が特に好ましい。

本発明での表面改質剤では、両親媒性化合物は、脂質であることも好ましい例の１つである。

本発明での表面改質剤では、両親媒性化合物は、界面活性剤であることも好ましい例の１つである。界面活性剤としては、ポリオキシエチレンポリプロピレングリコール共重合体、ショ糖脂肪酸エステル、ポリエチレングリコール脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタンモノ脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタンジ脂肪酸エステル、ポリオキシエチレングリセリンモノ脂肪酸エステル、ポリオキシエチレングリセリンジ脂肪酸エステル、ポリグリセリン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンヒマシ油、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油等の非イオン性活性剤や、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸アンモニウム、ステアリル硫酸ナトリウムなどのアルキル硫酸塩またはレシチンが好ましい。

本発明において親水性活性物質とは、低分子化合物、タンパク質、ペプチド、ＤＮＡ、ＲＮＡまたは修飾核酸が例示される。また、疎水性薬物の場合であっても、可溶化剤などで親水性とすることで本発明のマイクロ粒子に含有させても良い。ここでいう可溶化剤としては、シクロデキストリンやその類縁体が好ましい。

本発明において親水性活性物質として使用されるタンパク質またはペプチドとしては特に限定されないが、生理活性タンパク質または生理活性ペプチドが好ましい。生理活性タンパク質または生理活性ペプチドとしては、ペプチドホルモン、サイトカイン、酵素タンパク、抗体などが挙げられ、具体例として、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、カルシトニン、インスリン、インスリン様成長因子、アンギオテンシン、グルカゴン、ＧＬＰ−１やエキセンジン４に代表されるＧＬＰ−１受容体アゴニストペプチド、ボンベシン、モチリン、ガストリン、成長ホルモン、プロラクチン（黄体刺激ホルモン）、ゴナドトロピン（性腺刺激ホルモン）、サイロトロピックホルモン、副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）、ＡＣＴＨ誘導体（エビラタイド等）、メラニン細胞刺激ホルモン、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、セルモレリン、バソプレシン、オキシトシン、プロチレリン、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、コルチコトロピン、セクレチン、ソマトロピン、チロトロピン（甲状腺刺激ホルモン）、ソマトスタチン、性腺刺激ホルモン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）、Ｇ−ＣＳＦ、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、メガカリオサイトポテンシエーター、ＨＧＦ、ＥＧＦ、ＶＥＧＦ、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンγ、インターロイキン類、ＦＧＦ（線維芽細胞増殖因子）類、ＢＭＰ（骨形成蛋白）類、胸腺液性因子（ＴＨＦ）、血中胸腺因子（ＦＴＳ）、スーパーオキサイドジスムターゼ（ＳＯＤ）、ウロキナーゼ、リゾチーム、組織プラスミノーゲン活性化因子、アスパラギナーゼ、カリクレイン、グレリン、アディポネクチン、レプチン、心房性ナトリウム利尿ペプチド、心房性ナトリウム利尿因子、脳性ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）、コナントキンＧ、ダイノルフィン、エンドルフィン、キョウトルフィン、エンケファリン、ニューロテンシン、アンジオスタチン、ブラジキニン、サブスタンスＰ、カリジン、ヘモグロビン、プロテインＣ、ＶＩＩａ因子、グルコセレブロシダーゼ、ストレプトキナーゼ、スタフィロキナーゼ、サイモシン（チモシン）、パンクレオザイミン、コレシストキニン、ヒト胎盤ラクトーゲン、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、ポリミキシンＢ、コリスチン、グラミシジン、バシトラシン、サイモポエチン、ボムベシン、セルレイン、サイモスチムリン、セレクチン、レジスチン、ヘプシジン、ニューロペプチドＹ、ニューロペプチドＳ、コレシストキニン−パンクレオザイミン（ＣＣＫ−ＰＺ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ワクチン等を挙げることができる。これら生理活性タンパク質または生理活性ペプチドは、天然のタンパクまたはペプチドであっても、その配列の一部を改変した誘導体であっても、ポリエチレングリコールや糖鎖などで修飾したものであっても構わない。

親水性活性物質がＤＮＡ、ＲＮＡまたは修飾核酸である場合、カチオン性界面活性剤、カチオン性脂質、カチオン性ポリマーおよびそれらの類縁体と複合化したものであってもよい。

本発明において親水性活性物質として使用される糖類としては、ヒアルロン酸、ヘパリン、デキストラン硫酸、デキストランまたはＦＩＴＣ標識デキストラン（例えば、ＦＤ４０）等が挙げられる。

また本発明は、前記親水性活性物質含有粒子が会合してなるマイクロ粒子の製造方法であって、
（ａ）親水性活性物質を含む水系溶媒と両親媒性ポリマーを溶解した水非混和性有機溶媒を混合することにより、逆相エマルジョンを形成する工程、
（ｂ）逆相エマルジョンから溶媒を除去して親水性活性成分含有固形分を得る工程、
（ｃ）親水性活性成分含有固形分または親水性活性成分含有固形分分散液を、表面改質剤を含む液相に導入する工程、
を含むマイクロ粒子の製造方法に関する。

本発明の親水性活性物質含有粒子が会合してなるマイクロ粒子の製造方法では、逆相エマルジョンは、親水性活性物質を含む水系溶媒を、両親媒性ポリマーを溶解した水非混和性有機溶媒に添加し、混和することで形成される。必要であれば、例えば、マグネティックスターラーなどの撹拌装置、タービン型攪拌機、ホモジナイザー、多孔質膜を装備した膜乳化装置などを使用しても良い。なお、本発明における水非混和性有機溶媒とは、水への溶解度が３０ｇ（水非混和性有機溶媒）／１００ｍｌ（水）以下の有機溶媒のことであり、左記の水への溶解度を上回る有機溶媒については水混和性有機溶媒に位置づけられる。

工程（ａ）における水系溶媒には、水あるいは水溶性成分を含有する水溶液を使用する。該水溶性成分として、例えば、無機塩類、糖類、有機塩類、アミノ酸などが挙げられる。

工程（ａ）における水非混和性有機溶媒の性質としては特に限定されないが、該両親媒性ポリマーの疎水性セグメントであるポリ（ヒドロキシ酸）が可溶で且つ、親水性セグメントが難溶または不溶であることが好ましい。また、該非水混和性有機溶媒は、凍結乾燥等により揮散除去できることが好ましく、０．１ｇ（水非混和性有機溶媒）／１００ｍｌ（水）以下であることがより好ましい。該水非混和性有機溶媒の具体例としては、酢酸エチル、酢酸イソプロピル、酢酸ブチル、炭酸ジメチル、炭酸ジエチル、塩化メチレン、クロロフォルムが挙げられる。なお、該水非混和性有機溶媒に対する水系溶媒の比は、好ましくは１，０００：１〜１：１、より好ましくは１００：１〜３：１である。該水非混和性有機溶媒中の両親媒性ポリマーの濃度は、水非混和性有機溶媒、両親媒性ポリマーの種類によって異なるが、０．０１〜９０％（ｗ／ｗ）、より好ましくは０．１〜５０％（ｗ／ｗ）、更に好ましくは、１〜２０％（ｗ／ｗ）である。

工程（ａ）における、親水性活性物質を含む水系溶媒、両親媒性ポリマーを溶解した水非混和性有機溶媒により、逆相エマルジョンを形成する工程において、製剤学的目的に応じて、２種以上の両親媒性ポリマーを溶解した水非混和性有機溶媒により、逆相エマルジョンを形成しても良い。

工程（ａ）における、親水性活性物質を含む水系溶媒、両親媒性ポリマーを溶解した水非混和性有機溶媒により、逆相エマルジョンを形成する工程において、逆相エマルジョンの形成を補助し、均一かつ微小な逆相エマルジョンを形成する目的のために、共剤を添加することができる。共剤としては、炭素数３から６のアルキルアルコール、炭素数３から６のアルキルアミン、炭素数３から６のアルキルカルボン酸から選ばれる化合物が望ましい。これら共剤のアルキル鎖の構造は、特に限定されず、直鎖構造でも分岐構造でも良く、飽和アルキルでも、不飽和アルキルでも良い。本発明において、共剤としては、tert-ブタノール、iso-プロパノール、ペンタノールがとくに好ましい。

工程（ａ）における逆相エマルジョンの平均粒径は、所望する本発明のマイクロ粒子の粒径によりとくに限定されないが、本発明のマイクロ粒子の用途の１つである医薬品用のマイクロ粒子を製造するには、平均粒径の上限は５０μｍであることが好ましく、より好ましくは５μｍ、さらに好ましくは５００ｎｍ、さらに好ましくは１５０ｎｍ、最も好ましくは１００ｎｍである。逆相エマルジョンの平均粒径の下限は、好ましくは、１０ｎｍであり、より好ましくは５０ｎｍである。

次に、マイクロ粒子の製造方法では、工程（ａ）で得られた逆相エマルジョンから溶媒を除去して親水性活性成分含有固形分を得る工程（ｂ）を含むことが重要である。

工程（ｂ）において、逆相エマルジョンから溶媒を除去する方法は、特に限定されるものではないが、例えば、加熱、減圧乾燥、透析、凍結乾燥、遠心操作、濾過、再沈殿および、それらの組み合わせが挙げられる。

前記逆相エマルジョンから溶媒を除去する方法の中でも、凍結乾燥は、逆相エマルジョン中の粒子の合一などによる構造変化が少なく、また、親水性活性物質の高温による変性を回避しうるので、とくに好ましい。凍結乾燥の条件、装置としては、凍結過程と減圧下での乾燥工程を含むものであり、凍結乾燥の常法である予備凍結、減圧・低温下での一次乾燥、減圧下での二次乾燥を経る工程がとくに好ましい。例えば逆相エマルジョンを構成する、水系溶媒と水非混和性有機溶媒の融点以下に冷却・凍結し、次いで減圧乾燥することにより、凍結乾燥した親水性活性物質含有固形分が得られる。予備凍結の温度としては、溶媒組成から適宜実験的に決定すれば良いが、−２０℃以下が好ましい。また、乾燥過程における減圧度も、溶媒組成から適宜実験的に決定すれば良いが、３，０００Ｐａ以下が好ましく、より好ましくは、５００Ｐａ以下が乾燥時間の短縮のためにより好ましい。凍結乾燥には、コールドトラップを備え真空ポンプと接続可能なラボ用凍結乾燥機や医薬品の製造などに用いられる棚式真空凍結乾燥機を使用することが好ましく、液体窒素、冷媒などによる予備凍結の後、冷却下または室温で真空ポンプなどの減圧装置で減圧乾燥を行えば良い。

工程（ｂ）において得られる親水性活性成分含有固形分は、逆相エマルジョンの構造を反映した両親媒性ポリマーを含有してなる親水性活性物質含有粒子の凝集体として得られる。なお、ここで言う凝集体とは、微粒子が粒子間力によって集合した不定形な塊であり、本発明のマイクロ粒子とは形状において明確に区別される。該凝集体を構成する親水性活性物質含有微粒子の平均粒径は、所望する本発明のマイクロ粒子の粒径によりとくに限定されないが、本発明のマイクロ粒子の用途の１つである医薬品用のマイクロ粒子を製造するには、平均粒径の上限は５０μｍであることが好ましく、より好ましくは５μｍ、さらに好ましくは５００ｎｍ、さらに好ましくは１５０ｎｍ、最も好ましくは１００ｎｍである。親水性活性物質含有微粒子の平均粒径の下限は、好ましくは、１０ｎｍであり、より好ましくは５０ｎｍである。

本発明のマイクロ粒子の製造方法では、親水性活性成分含有固形分または親水性活性成分含有固形分分散液を、表面改質剤を含む液相に導入する工程（ｃ）、を含むことが重要である。

工程（ｃ）において、親水性活性成分含有固形分または親水性活性成分含有固形分分散液を表面改質剤を含む液相に導入する方法は、例えば、親水性活性成分含有固形分を、表面改質剤を含む液相に添加する方法や、親水性活性成分含有固形分を一旦分散媒に分散させて、得られた分散液（ソリッド・イン・オイル（Ｓ／Ｏ）サスペンション）を、表面改質剤を含む液相に添加する方法が挙げられる。

親水性活性成分含有固形分を一旦分散媒に分散させる場合、分散媒としてはとくに限定されるものではないが、親水性活性成分含有固形分を構成する逆相エマルジョンの構造を反映した両親媒性ポリマーからなる親水性活性物質含有粒子構造を保持する目的で、ポリ（ヒドロキシ酸）が可溶で且つ、両親媒性ポリマーを構成する親水性セグメントを実質的に溶解しない溶媒であることがより好ましい。なお、ポリ（ヒドロキシ酸）が可溶で且つ、親水性セグメントを実質的に溶解しない溶媒とは、溶媒中での親水性セグメントの溶解度が５０ｍｇ／ｍｌ以下、好ましくは１０ｍｇ／ｍＬ以下の溶媒である。

また、分散媒は前記特徴を有していれば水非混和性有機溶媒または水混和性有機溶媒であってもよいが、水非混和性有機溶媒であることが好ましい。なお、両親媒性ポリマーのポリ（ヒドロキシ酸）が可溶で且つ、親水性セグメントを実質的に溶解しない水非混和性有機溶媒の具体例としては、酢酸エチル、酢酸イソプロピル、酢酸ブチル、炭酸ジメチル、炭酸ジエチル、塩化メチレン、クロロフォルム、ジオキサン、トルエン、キシレンなどが挙げられる。

親水性活性物質含有固形分を分散させる分散媒には、親水性活性物質含有粒子の分解もしくは崩壊による親水性活性物質の放出速度の制御を目的に、分散媒に可溶な各種添加剤、例えば酸性化合物、塩基性化合物、両親媒性ポリマーまたは生分解性ポリマーなどを含有しても良い。

工程（ｃ）における液相は、前述の表面改質剤を可溶で且つ、親水性活性成分含有固形分分散媒よりも高い沸点を有することが好ましく、水系溶媒、水非混和性有機溶媒、水混和性有機溶媒のいずれであっても良い。ここでいう水系溶媒としては、水あるいは水溶性成分を含有する水溶液が好ましく、該水溶性成分として、例えば、無機塩類、糖類、有機塩類、アミノ酸などが挙げられ、水非混和性有機溶媒としては、例えば、シリコン油、ゴマ油、大豆油、コーン油、綿実油、ココナッツ油、アマニ油、鉱物油、ヒマシ油、硬化ヒマシ油、流動パラフィン、ｎ−ヘキサン、ｎ−ヘプタン、グリセロール、オレイン酸などが挙げられ、水混和性有機溶媒としては、例えば、グリセリン、アセトン、エタノール、酢酸、ジプロピレングリコール、トリエタノールアミン、トリエチレングリコールなどが挙げられる。本発明においては、工程（ｃ）における液相は水系溶媒または水混和性有機溶媒であることが好ましい。液相が水系溶媒で、かつ、分散媒が水非混和性有機溶媒の場合には、工程（ｃ）で得られる懸濁液は、いわゆるソリッド・イン・オイル・イン・ウォーター（Ｓ／Ｏ／Ｗ）型エマルジョンとなり、液相が水非混和性有機溶媒または水混和性有機溶媒でかつ分散媒と混和しない場合には、ソリッド・イン・オイル・イン・オイル（Ｓ／Ｏ１／Ｏ２）型エマルジョンとなる。

親水性活性物質含有固形分を分散させる分散媒に対する液相の容積比は、一般的には１，０００：１〜１：１，０００、より好ましくは１００：１〜１：１００である。

本発明の液相中における表面改質剤濃度は、表面改質剤の種類によって異なるが、好ましくは、０．０１〜９０％（ｗ／ｖ）であり、より好ましくは０．１〜５０％（ｗ／ｖ）、さらに好ましくは、５〜１０％（ｗ／ｖ）である。

表面改質剤は本発明のマイクロ粒子の両親媒性ポリマーのポリ（ヒドロキシ酸）外層に結合してもよいが、その場合の結合量は、好ましくは、マイクロ粒子重量に対して０．０００１％から１％である。

工程（ｃ）おける液相には、表面改質剤に加え、製剤学的な目的に応じて、各種添加物、例えば、緩衝剤、抗酸化剤、塩、ポリマーまたは糖などを含有しても良い。

工程（ｃ）おいては、液相に無機塩類を添加することも好ましい。無機塩類は、アルカリ金属塩またはアルカリ土類金属塩であることが好ましく、塩化ナトリウムがより好ましい。液相中の無機塩類の濃度は、好ましくは０〜１Ｍであり、より好ましくは１０ｍＭ〜１Ｍであり、さらに好ましくは１０ｍＭ〜１００ｍＭである。

工程（ｃ）において、より微細なマイクロ粒子を製造する目的で、形成されるソリッド・イン・オイル・イン・ウォーター（Ｓ／Ｏ／Ｗ）型エマルジョンまたはソリッド・イン・オイル・イン・オイル（Ｓ／Ｏ１／Ｏ２）型エマルジョンの乳化操作を行っても良い。乳化方法は、安定なエマルジョンを調製できるものであれば特に限定されるものではない。例えば、撹拌による方法、高圧ホモジナイザー、高速ホモミキサーなどを用いる方法などが挙げられる。

工程（ｃ）で、親水性活性成分含有固形分を一旦分散媒に分散させて、得られた分散液を、表面改質剤を含む液相に添加した場合には、分散媒を除去することで、所望の親水性活性物質含有微粒子が会合してなるマイクロ粒子の懸濁液が得られる。分散媒を除去する方法は、特に限定されるものではないが、例えば、液中乾燥、透析、凍結乾燥、遠心操作、濾過、再沈殿が挙げられ、液中乾燥、凍結乾燥が特に好ましい。工程（ｃ）において、液相として水系溶媒を用いた場合には、本工程により、マイクロ粒子の水系分散体が得られる。

前述の通り得られたマイクロ粒子分散体から液相を除去することにより、本発明のマイクロ粒子を得ることができる。液相を除去する方法としては、特に限定されるものではないが、蒸発による留去、透析、凍結乾燥、遠心操作、濾過が好ましい。

本発明により得られるマイクロ粒子の応用分野は広く、多岐の利用が可能であるが、医薬品組成物として好ましく利用される。本発明のマイクロ粒子を医薬品組成物として用いるには、マイクロ粒子の他に製剤学的に有用な各種添加剤を含有していても良く、添加できる添加物は、好ましくは、緩衝剤、抗酸化剤、塩、ポリマーまたは糖である。

本発明のマイクロ粒子を医薬品組成物として利用する場合の投与方法として、例えば、経口投与または非経口投与が挙げられるが、好ましくは非経口投与である。非経口投与としては、皮下投与、筋肉内投与、経腸投与、経肺投与、局所投与（鼻、皮膚、眼）および腹腔内投与等に利用できるが、特に好ましい投与方法として皮下あるいは筋肉内への注射が挙げられる。また、本発明の医薬組成物を生体に投与する際の投与量や投与回数は、親水性活性物質、投与形態、患者の年齢、体重、症状の重篤度によって適宜選択されうるが、通常成人１日あたり０．１μｇ〜１００ｍｇ、好ましくは１μｇ〜１０ｍｇの範囲で投与される。

以下に実施例を示すが、本発明はこれらの実施例により限定されるものでない。

実施例１ デキストラン−ポリ乳酸（ＰＬＡ）の合成
１−１．ＴＭＳ−デキストラン（化合物（１））の合成
デキストラン（ナカライテスク株式会社、ナカライ規格特級適合品、数平均分子量１３０００、５．０ｇ）をホルムアミド（１００ｍｌ）に加え、８０℃に加熱した。この溶液に１，１，１，３，３，３−ヘキサメチルジシラザン（１００ｍｌ）を２０分掛けて滴下した。滴下終了後、８０℃で２時間攪拌した。反応終了後、反応溶液を室温に戻し、分液漏斗で２層を分離した。上の層を減圧下濃縮した後、メタノール（３００ｍｌ）を加え、得られた固体をろ過、乾燥し、ＴＭＳ−デキストラン（１１．４ｇ）を白色固体として得た。

１−２．ＴＭＳ−デキストラン−ＰＬＡ（化合物（２））の合成
化合物（１）（０．５ｇ）とｔｅｒｔ−ブトキシカリウム（３５ｍｇ）を減圧下１時間乾燥後、テトラヒドロフラン（２０ｍｌ）を加え、１時間室温で攪拌した。この溶液に（Ｌ）−ラクチド（４．４９ｇ）のテトラヒドロフラン（２０ｍｌ）溶液を滴下し、５分間攪拌した。反応終了後、溶媒を減圧下濃縮し、クロロフォルム−メタノール系で再沈殿精製を行うことによってＴＭＳ−デキストラン−ＰＬＡ（１．９ｇ）を白色固体として得た。

１−３．デキストラン−ＰＬＡ（化合物（３））の合成
化合物（２）（１．９ｇ）のクロロフォルム（２４ｍｌ）溶液に、メタノール（１０．８ｍｌ）と１２Ｎ塩酸（１．２ｍｌ）を加え、 室温で３０分間攪拌した。溶媒を減圧下留去後、残渣をクロロフォルム（１０ｍｌ）に溶解し、０℃に冷却したジエチルエーテルに滴下することで生成物を析出させた。析出物をろ別後、減圧下濃縮しデキストラン−ＰＬＡ（１．６ｇ）を得た。本ポリマーの重量平均分子量は４８７２０、数平均分子量は４３５３０であった。（ＧＰＣによる測定: カラム 東ソ− ＴＳＫ−ｇｅｌ α−５０００×２、ＤＭＦ系溶媒、検出器 ＲＩ、標準品 プルラン）。本ポリマーの^１Ｈ−ＮＭＲ測定により決定されたグラフト鎖の平均分子量は２３００であった。グラフト鎖数は１０〜１２であった。

実施例２ デキストラン−ポリ（乳酸−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）の合成
２−１．ＴＭＳ−デキストラン−ＰＬＧＡ（化合物（４）、化合物（５）、化合物（６））の合成
化合物（１）（０．５ｇ）とｔｅｒｔ−ブトキシカリウム（３５ｍｇ）を減圧下１時間乾燥後、テトラヒドロフラン（１０ｍｌ）を加え、１時間室温で攪拌した。この溶液に（ＤＬ）−ラクチド（１．１２ｇ）とグリコリド（０．９ｇ）のテトラヒドロフラン（１５ｍｌ）溶液を滴下し、５分間攪拌した。反応終了後、溶媒を減圧下濃縮し、クロロフォルム−メタノール系で再沈殿精製を行うことによってＴＭＳ−デキストラン−ＰＬＧＡ（１．９６ｇ）を白色固体として得た（化合物（４））。同様な方法で、（ＤＬ）−ラクチド（０．７８４ｇ）とグリコリド（０．６３ｇ）の仕込量で化合物（５）を、同仕込量（ＤＬ）−ラクチド（１．１２ｇ）とグリコリド（０．９ｇ）で化合物（６）を合成した。

２−２．デキストラン−ＰＬＧＡ（化合物（７）、化合物（８）、化合物（９））の合成
化合物（４）（１．９６ｇ）のクロロフォルム（１４ｍｌ）溶液に、メタノール（６．３ｍｌ）と１２Ｎ塩酸（０．７ｍｌ）を加え、 室温で３０分間攪拌した。溶媒を減圧下留去後、残渣をクロロフォルム（１０ｍｌ）に溶解し、０℃に冷却したジエチルエーテルに滴下することで生成物を析出させた。析出物をろ別後、減圧下濃縮しデキストラン−ＰＬＧＡ（１．２５ｇ）を得た（化合物（７））。化合物（５）、（６）からもトリフルオロ酢酸を使用した以外は類似の方法でデキストラン−ＰＬＧＡを得た（化合物（８）、化合物（９））。化合物（７）〜（９）のポリマーの重量平均分子量、数平均分子量はＧＰＣ測定（カラム 東ソ− ＴＳＫ−ｇｅｌ α−５０００×２、ＤＭＦ系溶媒、検出器 ＲＩ、標準品 プルラン）によって決定した。グラフト鎖の平均分子量、グラフト鎖数は^１Ｈ−ＮＭＲ測定により決定した。

化合物（７）については、重量平均分子量４３，８２０、数平均分子量３３，４２２、グラフト鎖分子量１，９００、グラフト鎖数７〜１０であった。

化合物（８）については、重量平均分子量９４，０８８、数平均分子量８１，２５０、グラフト鎖分子量３，２５０、グラフト鎖数２１であった。

化合物（９）については重量平均分子量１３７，６９５、数平均分子量１０９，６３０、グラフト鎖分子量６，４４２、グラフト鎖数１５であった。

実施例３ ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）内包マイクロ粒子の調製法
実施例１のデキストラン−ポリ乳酸（ＰＬＡ）（デキストラン平均分子量１３，０００、ＰＬＡ平均分子量２，３００、ＰＬＡグラフト鎖数１０〜１２、化合物（３））または実施例２のデキストラン-ポリ（乳酸−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）（デキストラン平均分子量１３，０００、ＰＬＧＡ平均分子量１，９００、ＰＬＧＡグラフト鎖数７〜１０、化合物（７））５ｍｇを炭酸ジメチル１００μｌに溶解し、５０ｍｇ／ｍｌのポリマー溶液を調製した。該ポリマー溶液にtert−ブタノール２０μｌを添加後、２ｍｇ／ｍｌのｈＧＨ水溶液２０μｌを滴下し、ボルテックスで撹拌して逆相エマルジョンを製造した。該逆相エマルジョンを液体窒素で予備凍結した後、凍結乾燥機（ＥＹＥＬＡ、ＦＲＥＥＺＥ ＤＲＹＥＲ ＦＤ−１０００）を用いて、トラップ冷却温度−４５℃、真空度２０Ｐａにて２４時間凍結乾燥した。得られた固形分を炭酸ジメチル２００μｌに分散させ、Ｓ／Ｏサスペンションを調製した。該Ｓ／Ｏサスペンションを１０％ Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−６８（ＢＡＳＦの登録商標）含有水溶液２ｍｌに滴下し、ボルテックスミキサーで撹拌・乳化させてＳ／Ｏ／Ｗ型エマルジョンを調製した。該Ｓ／Ｏ／Ｗ型エマルジョンから液中乾燥により水非混和性有機溶媒を除去して、マイクロ粒子分散液とした。該マイクロ粒子分散液を液体窒素で予備凍結した後、凍結乾燥機（ＥＹＥＬＡ、ＦＲＥＥＺＥ ＤＲＹＥＲ ＦＤ−１０００）を用いて、トラップ冷却温度−４５℃、真空度２０Ｐａにて２４時間凍結乾燥することで、ｈＧＨ内包マイクロ粒子粉末を得た。得られたマイクロ粒子を走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ：ＨＩＴＡＣＨＩ、Ｓ−４８００）により観察することで平均粒子径を算出したところ、マイクロ粒子の平均粒径は４．０μｍであった。

実施例４ ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）内包マイクロ粒子の薬物内包率の測定
デキストラン−ＰＬＡ（化合物（３））またはデキストラン−ＰＬＧＡ（化合物（７））ポリマーを用いて実施例３の方法で作成したヒト成長ホルモン内包マイクロ粒子２０ｍｇを１．５ｍｌエッペンドルフチューブに秤量し、１ｍｌの緩衝液Ａ（０．１％ウシ血清アルブミン、０．１％ Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−６８（ＢＡＳＦの登録商標）および０．０２％アジ化ナトリウムを含むＰＢＳ）に溶解して１８，０００×ｇ、１０分間の遠心により粒子（沈殿）と上清を分離した。上清を別のチューブに回収した後、粒子を１ｍｌの緩衝液に再けん濁し、上記条件での遠心による粒子と上清の分離を再度行った。この洗浄操作をもう一度繰り返し（計３回遠心）、各遠心で回収した上清中のヒト成長ホルモン濃度をＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄシステムズ社製）で測定した。粒子作製時の仕込みのｈＧＨ量（粒子重量２０ｍｇあたり）から３回の遠心上清中のｈＧＨ量合計を差し引くことで、以下の式により内包率を計算した。

内包率（％）＝ 仕込みｈＧＨ量（ｎｇ）−上清中ｈＧＨ量合計（ｎｇ）×１００
仕込みｈＧＨ量（ｎｇ）。

デキストラン−ＰＬＡマイクロ粒子またはデキストラン−ＰＬＧＡマイクロ粒子におけるｈＧＨの内包率は、デキストラン−ＰＬＡマイクロ粒子において９２．６％、デキストラン−ＰＬＧＡマイクロ粒子において８５．７％であり、いずれの粒子も高い効率でタンパク薬物を内包可能であることが示された。

実施例５ ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）内包マイクロ粒子からのｉｎ ｖｉｔｒｏ薬物放出速度の解析
実施例４で３回洗浄を行ったマイクロ粒子を１．２ｍｌの緩衝液Ａにけん濁分散させた。この溶液から一部（４０μ１）を別のチューブに移し、１８，０００×ｇ１０分間の遠心により粒子を沈殿させ、上清３０μｌを別のチューブに回収した（０時間サンプル）。残りの粒子けん濁液は、１．５ｍｌエッペンドルフチューブ中で、３７℃インキュベーター内でローテーターを用いて６ｒｐｍの速度でゆっくりと転倒混和させた。この溶液から経時的に少量（４０μｌ）を分取して、上記と同様に遠心による上清分離を行った。各時点で回収した上清サンプル中のｈＧＨ濃度をＥＬＩＳＡキットで測定し、放出量（％）を以下の式により計算した。

放出量（％）＝上清中ｈＧＨ濃度（ｎｇ／ｍｌ）×１．２（ｍｌ）×１００
２０ｍｇ粒子中の内包ｈＧＨ量（ｎｇ）。

デキストラン−ＰＬＡまたはデキストラン−ＰＬＧＡポリマーを用いて作製したマイクロ粒子からの薬物放出のタイムコースを図１に示す。いずれの粒子も初期バーストがほとんどなく、時間経過に比例して薬物が直線的に放出される良好なプロファイルを示した。５０％の薬物が放出されるのに要する時間は、デキストラン−ＰＬＡマイクロ粒子で約１ヶ月、デキストラン−ＰＬＧＡマイクロ粒子では約１週間であり、ポリ（ヒドロキシ酸）の種類を選択することで放出速度を調節可能であることが示された。

実施例６ ヒトインスリン内包マイクロ粒子の調製法
デキストラン-ＰＬＡ（デキストラン平均分子量１３，０００、ＰＬＡ平均分子量２，３００、ＰＬＡグラフト鎖数１０〜１２、化合物（３））もしくはデキストラン-ＰＬＧＡ（デキストラン平均分子量１３，０００、ＰＬＧＡ平均分子量１，９００、ＰＬＧＡグラフト鎖数７〜１０、化合物（７））５ｍｇを炭酸ジメチル１００μｌに溶解し、５０ｍｇ／ｍｌのポリマー溶液を調製した。該ポリマー溶液にtert−ブタノール２０μｌを添加後、２ｍｇ／ｍｌのヒトインスリン水溶液２０μｌを滴下し、ボルテックスで撹拌して逆相エマルジョンを製造した。該逆相エマルジョンを液体窒素で予備凍結した後、凍結乾燥機（ＥＹＥＬＡ、ＦＲＥＥＺＥ ＤＲＹＥＲ ＦＤ−１０００）を用いて、トラップ冷却温度−４５℃、真空度２０Ｐａにて２４時間凍結乾燥した。得られた固形分を炭酸ジメチル２００μｌに分散させ、Ｓ／Ｏサスペンションを調製した。該Ｓ／Ｏサスペンションを１０％ Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−６８（ＢＡＳＦの登録商標）含有水溶液２ｍｌに滴下し、ボルテックスミキサーで撹拌・乳化させてＳ／Ｏ／Ｗ型エマルジョンを調製した。該Ｓ／Ｏ／Ｗ型エマルジョンから液中乾燥により水非混和性有機溶媒を除去して、マイクロ粒子分散液とした。該マイクロ粒子分散液を液体窒素で予備凍結した後、凍結乾燥機（ＥＹＥＬＡ、ＦＲＥＥＺＥ ＤＲＹＥＲ ＦＤ−１０００）を用いて、トラップ冷却温度−４５℃、真空度２０Ｐａにて２４時間凍結乾燥することで、ヒトインスリン内包粒子粉末を得た。マイクロ粒子を走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ：ＨＩＴＡＣＨＩ、Ｓ−４８００）により観察することで平均粒子径を算出したところ、化合物（３）から得られたマイクロ粒子の平均粒径は６．４μｍ、化合物（７）から得られたマイクロ粒子の平均粒径は５．３μｍであった。

実施例７ ヒトインスリン内包マイクロ粒子の薬物内包率の測定
デキストラン−ＰＬＧＡ（化合物（７））ポリマーを用いて実施例６の方法で作成したヒトインスリン内包マイクロ粒子２０ｍｇを１．５ｍｌエッペンドルフチューブに秤量し、１ｍｌの緩衝液Ａ（０．１％ウシ血清アルブミン、０．１％ Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−６８（ＢＡＳＦの登録商標）および０．０２％アジ化ナトリウムを含むＰＢＳ）に溶解して１８，８００×ｇ、１０分間の遠心により粒子（沈殿）と上清を分離した。上清を別のチューブに回収した後、粒子を１ｍｌの緩衝液にけん濁し、上記条件での遠心による粒子と上清の分離を再度行った。この洗浄操作をもう一度繰り返し（計３回遠心）、各遠心で回収した上清中のヒトインスリン濃度をサンドイッチＥＬＩＳＡ法で測定した。粒子作製時の仕込みのヒトインスリン量（粒子重量２０ｍｇあたり）から３回の遠心上清中のヒトインスリン量合計を差し引くことで、以下の式により内包率を計算した。

内包率(%)＝仕込みインスリン量（ｎｇ）−上清中インスリン量合計（ｎｇ）×１００
仕込みインスリン量(ｎｇ)。

デキストラン−ＰＬＧＡマイクロ粒子へのヒトインスリンの内包率は７５．７％であり、高い効率で内包可能であることが示された。

実施例８ ヒトインスリン内包マイクロ粒子からのｉｎ ｖｉｔｒｏ薬物放出速度の解析
実施例７で３回洗浄を行った粒子を１．２ｍｌの緩衝液Ａにけん濁分散させた。この溶液から一部（４０μ１）を別のチューブに移し、１８，８００×ｇ１０分間の遠心により粒子を沈殿させ、上清３０μｌを別のチューブに回収した（０時間サンプル）。回収後のサンプルは測定まで凍結保存した。残りの粒子けん濁液は、１．５ｍｌエッペンドルフチューブ中で、３７℃インキュベーター内でローテーターを用いて６ｒｐｍの速度でゆっくりと転倒混和させた。この溶液から経時的に少量（４０μｌ）を分取して、上記と同様に遠心による上清分離を行った。各時点で回収した上清サンプル中のヒトインスリン濃度をサンドイッチＥＬＩＳＡ法で測定し、放出量（％）を以下の式により計算した。

放出量(％)＝上清中ヒトインスリン濃度（ｎｇ／ｍｌ）×１．２（ｍｌ）×１００
２０ｍｇ粒子中の内包ヒトインスリン量（ｎｇ）。

ヒトインスリン放出のタイムコースを図２に示す。初期バーストがほとんどなく、時間経過に比例して薬物が直線的に放出される良好なプロファイルを示した。５０％の薬物が放出されるのに要する時間は、約６日であった。

実施例９ マイクロ粒子形態の経時的変化
実施例３で調製したｈＧＨ内包マイクロ粒子粉末５ｍｇをエッペンドルフチューブに秤量し、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ １ｍｌに分散後、１３，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離し、上清を除去後に再度Ｍｉｌｌｉ−Ｑ １ｍｌに分散させ、遠心分離することでマイクロ粒子の洗浄を行った。また、所定時間インキュベートしたマイクロ粒子懸濁溶液には、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ １ｍｌを加えて１３，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離し、上清除去後に再度Ｍｉｌｌｉ−Ｑ １ｍｌに分散させ、同様に遠心分離することでマイクロ粒子の洗浄を行った。得られた洗浄後のマイクロ粒子をＭｉｌｌｉ−Ｑ １００μｌに分散させ、マイクロ粒子分散溶液をシリコン基板上に５μｌ滴下し、約１０分間室温放置したのちに、デシケーター内で３時間乾燥させた。その後、イオンスパッタ（ＨＩＴＡＣＨＩ、Ｅ−１０３０）を用いて試料表面への白金蒸着（蒸着時間１５秒）を行い、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ：ＨＩＴＡＣＨＩ、Ｓ−４８００）により加速電圧を1kV、プローブ電流をhighに設定して、マイクロ粒子形状、表面状態観察を行った。

図３に見られる通り、作製直後は球形で表面がなめらかであった粒子が、３７℃、１３日間インキュベーション後には形状が顕著にくずれ、多くの孔があいた像となり、薬物の放出に対応して粒子の分解が進んでいることが示された。

比較例１
ポリエチレングリコール−ポリ（イプシロン−カプロラクトン）（ポリエチレングリコールの平均分子量５，０００、ポリ（イプシロン−カプロラクトン）の平均分子量３７，０００）５ｍｇを炭酸ジメチル１００μｌに溶解し、５０ｍｇ／ｍｌのポリマー溶液を調製した。該ポリマー溶液にtert−ブタノール２０μｌを添加後、2ｍｇ／ｍｌのｈＧＨ水溶液２０μｌを滴下し、ボルテックスで撹拌して逆相エマルジョンを製造した。該逆相エマルジョンを液体窒素で予備凍結した後、凍結乾燥機（ＥＹＥＬＡ、ＦＲＥＥＺＥ ＤＲＹＥＲ ＦＤ−１０００）を用いて、トラップ冷却温度−４５℃、真空度２０Ｐａにて２４時間凍結乾燥した。得られた固形分を炭酸ジメチル２００μｌに分散させ、Ｓ／Ｏサスペンションを調製した。該Ｓ／Ｏサスペンションを１０％ Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−６８（ＢＡＳＦの登録商標）含有水溶液２ｍｌに滴下し、ボルテックスミキサーで撹拌・乳化させてＳ／Ｏ／Ｗ型エマルジョンを調製した。該Ｓ／Ｏ／Ｗ型エマルジョンから液中乾燥により水非混和性有機溶媒を除去して、マイクロ粒子分散液とした。該マイクロ粒子分散液を液体窒素で予備凍結した後、凍結乾燥機（ＥＹＥＬＡ、ＦＲＥＥＺＥ ＤＲＹＥＲ ＦＤ−１０００）を用いて、トラップ冷却温度−４５℃、真空度２０Ｐａにて２４時間凍結乾燥することで、ｈＧＨ内包粒子粉末を得た。マイクロ粒子を走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ：ＨＩＴＡＣＨＩ、Ｓ−４８００）により観察することで平均粒子径を算出したところ、得られたマイクロ粒子の平均粒径は８．０μｍであった。

調製したｈＧＨ内包マイクロ粒子粉末５ｍｇをエッペンドルフチューブに秤量し、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ １ｍｌに分散後、１３，０００ ｒｐｍで３０分間遠心分離し、上清を除去後に再度Ｍｉｌｌｉ−Ｑ １ｍｌに分散させ、遠心分離することでマイクロ粒子の洗浄を行った。また、所定時間インキュベートしたマイクロ粒子懸濁溶液には、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ １ｍｌを加えて１３，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離し、上清除去後に再度Ｍｉｌｌｉ−Ｑ １ｍｌに分散させ、同様に遠心分離することでマイクロ粒子の洗浄を行った。得られた洗浄後のマイクロ粒子をＭｉｌｌｉ−Ｑ １００μｌに分散させ、マイクロ粒子分散溶液をシリコン基板上に５μｌ滴下し、約１０分間室温放置したのちに、デシケーター内で３時間乾燥させた。その後、イオンスパッタ（ＨＩＴＡＣＨＩ、Ｅ−１０３０）を用いて試料表面への白金蒸着（蒸着時間１５秒）を行い、ＳＥＭ（ＨＩＴＡＣＨＩ、Ｓ−４８００）により加速電圧を1kV、プローブ電流をhighに設定して、マイクロ粒子形状、表面状態観察を行った。

図４に見られる通り実施例９のデキストラン−ＰＬＧＡマイクロ粒子の場合とは異なり、３７℃、２１日インキュベーション後でも粒子の形態はほとんど変化せず、親水性活性物質の放出性に問題が見られた。

実施例１０ ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）内包マイクロ粒子のマウス皮下投与
デキストラン−ポリ乳酸（ＰＬＡ）（デキストラン平均分子量１３，０００、ＰＬＡ平均分子量２，３００、ＰＬＡグラフト鎖数１０〜１２、化合物（３））またはデキストラン−ポリ（乳酸−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）（デキストラン平均分子量１３０００、ＰＬＧＡ平均分子量１，９００、ＰＬＧＡグラフト鎖数７〜１０、化合物（７））２５ｍｇを炭酸ジメチル５００μｌに溶解し、５０ｍｇ／ｍｌのポリマー溶液を調製した。該ポリマー溶液にtert−ブタノール１００μｌを添加後、１０ｍｇ／ｍｌのｈＧＨ水溶液２５０μｌを滴下し、ボルテックスで撹拌して逆相エマルジョンを製造した。該逆相エマルジョンを液体窒素で予備凍結した後、凍結乾燥機（ＥＹＥＬＡ、ＦＲＥＥＺＥ ＤＲＹＥＲ ＦＤ−１０００）を用いて、トラップ冷却温度−４５℃、真空度２０Ｐａにて２４時間凍結乾燥した。得られた固形分を炭酸ジメチル１ｍｌに分散させ、Ｓ／Ｏサスペンションを調製した。該Ｓ／Ｏサスペンションを１０％ Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−６８（ＢＡＳＦの登録商標）含有水溶液１０ｍｌに滴下し、ボルテックスミキサーで撹拌・乳化させてＳ／Ｏ／Ｗ型エマルジョンを調製した。該Ｓ／Ｏ／Ｗ型エマルジョンから液中乾燥により水非混和性有機溶媒を除去して、マイクロ粒子分散液とした。該マイクロ粒子分散液を液体窒素で予備凍結した後、凍結乾燥機（ＥＹＥＬＡ、ＦＲＥＥＺＥ ＤＲＹＥＲ ＦＤ−１０００）を用いて、トラップ冷却温度−４５℃、真空度２０Ｐａにて２４時間凍結乾燥することで、ｈＧＨ内包マイクロ粒子粉末を得た。マイクロ粒子を走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ：ＨＩＴＡＣＨＩ、Ｓ−４８００）により観察することで平均粒子径を算出したところ、得られたマイクロ粒子の平均粒径は、化合物（３）のマイクロ粒子が４．９μｍ、化合物（７）のマイクロ粒子が４．２μｍであった。

上記で作成したマイクロ粒子３００ｍｇを３ｍｌのリン酸生理緩衝液（ＰＢＳ）にけん濁分散させ、８０×ｇ、５分間の遠心によりマイクロ粒子を沈殿させ、上清を別チューブに移した。上清は再度８０×ｇ、５分間の遠心を行って残存している粒子を沈殿させ、上清は除去した。１回目の遠心沈殿と２回目の遠心沈殿をあわせて１ｍｌのＰＢＳに再分散し、同様の遠心洗浄操作を３回繰り返すことにより、マイクロ粒子に内包されていない成長ホルモンを除去した。最後に沈殿を２００μｌのＰＢＳに再分散して、投与溶液とした。なお、デキストラン−ＰＬＡマイクロ粒子およびデキストラン−ＰＬＧＡマイクロ粒子それぞれに内包された成長ホルモン量は、洗浄液中の濃度をＥＬＩＳＡキットで測定し、仕込量から差し引くことにより計算した結果、マウス１匹あたりに投与した３００ｍｇの粒子に内包されていた量として、デキストラン−ＰＬＡマイクロ粒子は５９０μｇ、デキストラン−ＰＬＧＡマイクロ粒子は５３６μｇであった。

本溶液を、１０週齢の雄Ｂａｌｂ／Ｃマウスの背部皮下２カ所に注射投与し、尾静脈から経時的に採血をおこなった。採取した血液は、終濃度３．３ＩＵ／ｍｌのヘパリンを添加して５，０００ｒｐｍ５分間遠心して血漿を回収し、ＥＬＩＳＡキットを用いて血漿中成長ホルモン濃度を測定した。

比較として、粒子化していないヒト成長ホルモンタンパク溶液（７００μｇ／０．２ｍｌ）を皮下投与したマウスについても同様に採血を行った。

なお、マウスにとって異種タンパク質であるヒト成長ホルモン投与による抗体産生を抑制するために、粒子投与の３日前に免疫抑制剤タクロリムス水和物（アステラス社）２６μｇ／マウスを皮下投与し、その後、薬物投与時、３日後、７日後にも１３μｇ／マウスを皮下投与した。

血漿中ヒト成長ホルモン濃度の経時変化を図５に示す。マイクロ粒子化していない薬物を投与したマウスでは、投与１時間後に血中濃度は５，０００ｎｇ／ｍｌ以上の非常に高い値を示し、その後急速に低下して１日後には投与前のレベルまで低下した。一方、デキストラン−ＰＬＡポリマーを用いて作製したマイクロ粒子化薬物を投与したマウスでは、投与直後の一過性の血中濃度の上昇は２００ｎｇ／ｍｌ以下に抑えられ、７日後まで血中濃度が持続的に高い値を示した。また、デキストラン−ＰＬＧＡマイクロ粒子については、投与後の一過性の濃度上昇が全くなく、かつ７日後までほぼ一定の血中濃度を維持するという非常に良好な徐放性能が示された。

実施例１１ ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）内包マイクロ粒子のマウス皮下投与（薬理活性評価）
実施例２のデキストラン-ポリ（乳酸−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）（デキストラン平均分子量１３，０００、ＰＬＧＡ平均分子量１，９００、ＰＬＧＡグラフト鎖数７〜１０、化合物（７））２５ｍｇを炭酸ジメチル５００μｌに溶解し、５０ｍｇ／ｍｌのポリマー溶液を調製した。該ポリマー溶液にtert−ブタノール１００μｌを添加後、１０ｍｇ／ｍｌのｈＧＨ水溶液２５０μｌを滴下し、ボルテックスで撹拌して逆相エマルジョンを製造した。該逆相エマルジョンを液体窒素で予備凍結した後、凍結乾燥機（ＥＹＥＬＡ、ＦＲＥＥＺＥ ＤＲＹＥＲ ＦＤ−１０００）を用いて、トラップ冷却温度−４５℃、真空度２０Ｐａにて２４時間凍結乾燥した。得られた固形分を炭酸ジメチル１ｍｌに分散させ、Ｓ／Ｏサスペンションを調製した。該Ｓ／Ｏサスペンションを１０％ Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−６８（ＢＡＳＦの登録商標）含有水溶液１０ｍｌに滴下し、ボルテックスミキサーで撹拌・乳化させてＳ／Ｏ／Ｗ型エマルジョンを調製した。該Ｓ／Ｏ／Ｗ型エマルジョンから液中乾燥により水非混和性有機溶媒を除去して、マイクロ粒子分散液とした。該マイクロ粒子分散液を液体窒素で予備凍結した後、凍結乾燥機（ＥＹＥＬＡ、ＦＲＥＥＺＥ ＤＲＹＥＲ ＦＤ−１０００）を用いて、トラップ冷却温度−４５℃、真空度２０Ｐａにて２４時間凍結乾燥することで、ｈＧＨ内包マイクロ粒子粉末を得た。マイクロ粒子を走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ：ＨＩＴＡＣＨＩ、Ｓ−４８００）により観察することで平均粒子径を算出したところ、得られたマイクロ粒子の平均粒径は４．１μｍであった。

上記で作成したマイクロ粒子３００ｍｇを３ｍｌのリン酸生理緩衝液（ＰＢＳ）にけん濁分散させ、８０×ｇ、５分間の遠心により粒子を沈殿させ、上清を別チューブに移した。上清は再度８０×ｇ、５分間の遠心を行って残存している粒子を沈殿させ、上清は除去した。１回目の遠心沈殿と２回目の遠心沈殿をあわせて１ｍｌのＰＢＳに再分散し、同様の遠心洗浄操作を３回繰り返すことにより、粒子に内包されていない成長ホルモンを除去した。最後に沈殿を２００μｌのＰＢＳに再分散して、投与溶液とした。

本溶液を、８週齢の脳下垂体摘出ＩＣＲマウス（日本ＳＬＣ社）の背部皮下に注射投与し、尾静脈から経時的に採血をおこなった。採取した血液は、終濃度３．３ＩＵ／ｍｌのヘパリンを添加して５,０００ｒｐｍ５分間遠心して血漿を回収し、ＥＬＩＳＡ法を用いて血漿中成長ホルモン濃度及び、マウスＩＧＦ−１濃度を測定した。

比較として、粒子化していないヒト成長ホルモンタンパク溶液（７００μｇ／０．２ｍｌ）を皮下投与したマウスについても同様に採血を行った。

なお、マウスにとって異種タンパク質であるヒト成長ホルモン投与による抗体産生を抑制するために、粒子投与の３日前に免疫抑制剤タクロリムス水和物（アステラス社）２６μｇ／マウスを皮下投与し、その後、薬物投与時、３日後、７日後にも１３μｇ／マウスを皮下投与した。

血漿中ヒト成長ホルモン濃度の経時変化を図６に示す。マイクロ粒子化していない薬物を投与したマウスでは、投与１時間後に血中濃度は非常に高い値を示し、その後急速に低下して２日後には投与前のレベルまで低下した。一方、デキストラン−ＰＬＧＡマイクロ粒子については、投与後の一過性の濃度上昇が低く抑えられ、かつ投与１０日後まで血漿中の濃度が高い値で維持された。また、この時のマウスの体重変化推移を図７に示す。成長ホルモン単独を投与したマウスでは体重増加は５％程度に抑えられたが、デキストラン−ＰＬＧＡマイクロ粒子を投与したマウスでは２０％程度の体重増加が確認された。

血漿中のＩＧＦ−１濃度を図８に示す。血漿中のＩＧＦ−１濃度は血中のヒト成長ホルモン濃度と相関し、デキストラン−ＰＬＧＡマイクロ粒子を投与したマウスでは投与後１０日目まで高い値を維持していることが確認された。

実施例１２ エキセンジン４（ＧＬＰ−１受容体アゴニスト）内包マイクロ粒子からの緩衝液中薬物放出速度の解析
デキストラン−ポリ（乳酸−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）（デキストラン平均分子量１３，０００、ＰＬＧＡ平均分子量３,２５０（化合物（８））または６，４４２（化合物（９））、ＰＬＧＡグラフト鎖数２１（化合物（８））または１５（化合物（９）））２５ｍｇを炭酸ジメチル５００μｌに溶解し、５０ｍｇ／ｍｌのポリマー溶液を調製した。該ポリマー溶液にtert−ブタノール１００μｌを添加後、１０ｍｇ／ｍｌのエキセンジン４（シグマジェノシス社委託合成）水溶液２５０μｌを滴下し、ボルテックスで撹拌して逆相エマルジョンを製造した。該逆相エマルジョンを液体窒素で予備凍結した後、凍結乾燥機（ＥＹＥＬＡ、ＦＲＥＥＺＥ ＤＲＹＥＲ ＦＤ−１０００）を用いて、トラップ冷却温度−４５℃、真空度２０Ｐａにて２４時間凍結乾燥した。得られた固形分を炭酸ジメチル１ｍｌに分散させ、Ｓ／Ｏサスペンションを調製した。該Ｓ／Ｏサスペンションを１０％ Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−６８（ＢＡＳＦの登録商標）含有水溶液１０ｍｌに滴下し、ボルテックスミキサーで撹拌・乳化させてＳ／Ｏ／Ｗ型エマルジョンを調製した。該Ｓ／Ｏ／Ｗ型エマルジョンから液中乾燥により水非混和性有機溶媒を除去して、マイクロ粒子分散液とした。該マイクロ粒子分散液を液体窒素で予備凍結した後、凍結乾燥機（ＥＹＥＬＡ、ＦＲＥＥＺＥ ＤＲＹＥＲ ＦＤ−１０００）を用いて、トラップ冷却温度−４５℃、真空度２０Ｐａにて２４時間凍結乾燥することで、エキセンジン４内包マイクロ粒子粉末を得た。マイクロ粒子を走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ：ＨＩＴＡＣＨＩ、Ｓ−４８００）により観察することで平均粒子径を算出したところ、得られたマイクロ粒子の平均粒径は化合物（８）のマイクロ粒子が４．３μｍ、化合物（９）のマイクロ粒子が４．５μｍであった。

これらのマイクロ粒子を実施例４の方法に従い３回洗浄した後、１．２ｍｌの緩衝液Ａにけん濁分散させた。この溶液から一部（４０μｌ）を別のチューブに移し、１８０００×ｇ１０分間の遠心によりマイクロ粒子を沈殿させ、上清３０μｌを別のチューブに回収した（０時間サンプル）。残りのマイクロ粒子けん濁液は、１．５ｍｌエッペンドルフチューブ中で、３７℃インキュベーター内でローテーターを用いて６ｒｐｍの速度でゆっくりと転倒混和させた。この溶液から経時的に少量（４０μｌ）を分取して、上記と同様に遠心による上清分離を行った。各時点で回収した上清サンプル中のエキセンジン４濃度をＥＬＩＳＡ法で測定し、放出量（％）を以下の式により計算した。

放出量（％）＝上清中エキセンジン４濃度（ｎｇ／ｍｌ）×１．２（ｍｌ）×１００
２０ｍｇ粒子中の内包エキセンジン４量（ｎｇ）。

各デキストラン−ＰＬＧＡポリマーを用いて作製したマイクロ粒子からの薬物放出のタイムコースを図９に示す。いずれのマイクロ粒子も初期バーストがほとんどなく、時間経過に比例して薬物が直線的に放出される良好なプロファイルを示した。

実施例１３ エキセンジン４（ＧＬＰ−１受容体アゴニスト）内包マイクロ粒子のマウス皮下投与
実施例１２のマイクロ粒子３００ｍｇを３ｍｌのリン酸生理緩衝液（ＰＢＳ）にけん濁分散させ、８０×ｇ、５分間の遠心によりマイクロ粒子を沈殿させ、上清を別チューブに移した。上清は再度８０×ｇ、５分間の遠心を行って残存しているマイクロ粒子を沈殿させ、上清は除去した。１回目の遠心沈殿と２回目の遠心沈殿をあわせて１ｍｌのＰＢＳに再分散し、同様の遠心洗浄操作を３回繰り返すことにより、マイクロ粒子に内包されていないエキセンジン４を除去した。最後に沈殿を２００μｌのＰＢＳに再分散して、投与溶液とした。

本溶液を、８週齢のＳＣＩＤマウス（ＣＢ１７／ｌｃｒ―Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ／ＣｒｌＣｒｌｋ）（日本クレア社）の背部皮下に注射投与し、尾静脈から経時的に採血をおこなった。採取した血液は、終濃度３．３ＩＵ／ｍｌのヘパリンを添加して５０００ｒｐｍ５分間遠心して血漿を回収し、ＥＬＩＳＡ法を用いて血漿中エキセンジン４濃度を測定した。比較として、マイクロ粒子化していないエキセンジン４溶液（７００μｇ／０．２ｍｌ）を皮下投与したマウスについても同様に採血を行った。

血漿中エキセンジン４濃度の経時変化を図１０に示す。マイクロ粒子化していない薬物を投与したマウスでは、投与１時間後に血中濃度は非常に高い値を示し、その後急速に低下して投与前のレベルまで低下した。一方、デキストラン−ＰＬＧＡマイクロ粒子については、投与後の一過性の濃度上昇が低く抑えられ、かつ５週間まで高い血漿中濃度を維持した。

実施例１４ デキストラン−ポリ（乳酸−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）の合成
１４−１．ＴＭＳ−デキストラン−ＰＬＧＡ（化合物（１０）、化合物（１１）、化合物（１２）、化合物（１３））の合成
化合物（１）（０．５ｇ）とｔｅｒｔ−ブトキシカリウム（３５ｍｇ）を減圧下１時間乾燥後、テトラヒドロフラン（１０ｍｌ）を加え、１時間室温で攪拌した。この溶液に（ＤＬ）−ラクチド（０．５５８ｇ）とグリコリド（０．４５ｇ）のテトラヒドロフラン（１５ｍｌ）溶液を滴下し、５分間攪拌した。反応終了後、溶媒を減圧下濃縮し、クロロフォルム−メタノール系で再沈殿精製を行うことによってＴＭＳ−デキストラン−ＰＬＧＡ（１．９６ｇ）を白色固体として得た（化合物（１０））。

同様な方法で、（ＤＬ）−ラクチド（０．６７ｇ）とグリコリド（０．５４ｇ）の仕込量で化合物（１１）を合成した。

同様な方法で、（ＤＬ）−ラクチド（０．７８１ｇ）とグリコリド（０．６２９ｇ）の仕込量で化合物（１２）を合成した。

同様な方法で、（ＤＬ）−ラクチド（１．１２３ｇ）とグリコリド（０．９ｇ）の仕込量で化合物（１３）を合成した。

１４−２．デキストラン−ＰＬＧＡ（化合物（１４）、化合物（１５）、化合物（１６）、化合物（１７））の合成
化合物（１０）のクロロフォルム溶液（１０ｍＬ）に、トリフルオロ酢酸（１ｍＬ）を加え、 室温で３０分間攪拌した。溶媒を減圧下留去後、残渣をクロロフォルム（１０ｍｌ）に溶解し、０℃に冷却したジエチルエーテルに滴下することで生成物を析出させた。析出物をろ別後、減圧下濃縮しデキストラン−ＰＬＧＡ（０．４４ｇ）を得た（化合物（１４））。

化合物（１１）、（１２）、（１３）からも類似の方法でデキストラン−ＰＬＧＡを得た（化合物（１５）、化合物（１６）化合物（１７））。化合物（１４）〜（１７）のポリマーの重量平均分子量、数平均分子量はＧＰＣ測定（カラム 東ソ− ＴＳＫ−ｇｅｌ α−５０００×２、ＤＭＦ系溶媒、検出器 ＲＩ、標準品 プルラン）によって決定した。グラフト鎖の平均分子量、グラフト鎖数は^１Ｈ−ＮＭＲ測定により決定した。

化合物（１４）については、重量平均分子量９９，４６２、数平均分子量８５，１０１、グラフト鎖数平均分子量２，１６７、グラフト鎖数３３であった。

化合物（１５）については、重量平均分子量１０７，７７９、数平均分子量９２，１３４、グラフト鎖数平均分子量３，１２７、グラフト鎖数２５であった。

化合物（１６）については重量平均分子量１２１，２８１、数平均分子量１０１，８７３、グラフト鎖数平均分子量３，０００、グラフト鎖数３０であった。

化合物（１７）については重量平均分子量１４４，８３８、数平均分子量１２２，１５１、グラフト鎖数平均分子量４，８６４、グラフト鎖数２２であった。

実施例１５ ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）内包マイクロ粒子の調製法
実施例１４の各デキストラン−ポリ（乳酸−グリコール酸）（デキストラン−ＰＬＧＡポリマー、化合物（１４）〜（１７））５ｍｇを炭酸ジメチル１００μｌに溶解し、５０ｍｇ／ｍｌのポリマー溶液を調製した。該ポリマー溶液にtert−ブタノール２０μｌを添加後、１ｍｇ／ｍｌのｈＧＨ水溶液５０μｌを滴下し、ボルテックスで撹拌して逆相エマルジョンを製造した。該逆相エマルジョンを液体窒素で予備凍結した後、凍結乾燥機（ＥＹＥＬＡ、ＦＲＥＥＺＥ ＤＲＹＥＲ ＦＤ−１０００）を用いて、トラップ冷却温度−４５℃、真空度２０Ｐａにて２４時間凍結乾燥した。得られた固形分を炭酸ジメチル２００μｌに分散させ、Ｓ／Ｏサスペンションを調製した。該Ｓ／Ｏサスペンションを１０％ Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−６８（ＢＡＳＦの登録商標）含有水溶液２ｍｌに滴下し、ボルテックスミキサーで撹拌・乳化させてＳ／Ｏ／Ｗ型エマルジョンを調製した。該Ｓ／Ｏ／Ｗ型エマルジョンから液中乾燥により水非混和性有機溶媒を除去して、マイクロ粒子分散液とした。該マイクロ粒子分散液を液体窒素で予備凍結した後、凍結乾燥機（ＥＹＥＬＡ、ＦＲＥＥＺＥ ＤＲＹＥＲ ＦＤ−１０００）を用いて、トラップ冷却温度−４５℃、真空度２０Ｐａにて２４時間凍結乾燥することで、ｈＧＨ内包マイクロ粒子粉末を得た。得られたマイクロ粒子を走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ：ＨＩＴＡＣＨＩ、Ｓ−４８００）により観察したところ、粒径は１．０〜１０μｍの範囲内であった。

実施例１６ ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）内包マイクロ粒子の薬物内包率の測定
各デキストラン−ＰＬＧＡポリマー（化合物（１４）〜（１７））を用いて実施例１５の方法で作成した成長ホルモン内包マイクロ粒子２０ｍｇを１．５ｍｌエッペンドルフチューブに秤量し、１ｍｌの緩衝液Ａ（０．１％ウシ血清アルブミン、０．１％ Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−６８（ＢＡＳＦの登録商標）および０．０２％アジ化ナトリウムを含むＰＢＳ）に溶解して１８，０００×ｇ、１０分間の遠心により粒子（沈殿）と上清を分離した。上清を別のチューブに回収した後、粒子を１ｍｌの緩衝液に再けん濁し、上記条件での遠心による粒子と上清の分離を再度行った。この洗浄操作をもう一度繰り返し（計３回遠心）、各遠心で回収した上清中のヒト成長ホルモン濃度をＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄシステムズ社製）で測定した。粒子作製時の仕込みのｈＧＨ量（粒子重量２０ｍｇあたり）から３回の遠心上清中のｈＧＨ量合計を差し引くことで、以下の式により内包率を計算した。

内包率（％）＝ 仕込みｈＧＨ量（ｎｇ）−上清中ｈＧＨ量合計（ｎｇ）×１００
仕込みｈＧＨ量（ｎｇ）。

デキストラン−ＰＬＧＡマイクロ粒子それぞれにおけるｈＧＨの内包率は、化合物（１４）のマイクロ粒子で８７．５％、化合物（１５）のマイクロ粒子で９４．２％、化合物（１６）のマイクロ粒子で９５．７％、化合物（１７）のマイクロ粒子で９７．５％であり、いずれのマイクロ粒子も高い効率でタンパク薬物を内包可能であることが示された。

比較例２ 成長ホルモン内包粒子の調製および薬物内包率の測定
デキストラン−ポリ（乳酸−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）（化合物（１４）又は、化合物（１７））１０ｍｇを酢酸エチル２ｍＬに溶解し、ポリマー溶液を調製した。該ポリマー溶液に、０．５ｍｇ／ｍＬの成長ホルモン溶液１００μＬを滴下し攪拌した。攪拌後、２０ｍＬのジオキサンに添加した。溶媒を蒸発させ約２ｍＬまで濃縮した後、該粒子分散液を５００ｍｇのＰｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−６８（ＢＡＳＦの登録商標）を含有した水に添加した。試料を凍結乾燥した後、５０ｍｇの試料に１ｍＬの水を添加し粒子を再分散させて、会合していない親水性活性物質含有粒子を得た。該粒子の平均粒径は、装置ＥＬＳ−Ｚ（大塚電子））を使用し、動的光散乱法で測定し、薬剤の内包率は、実施例１６と同様に求めた。

その結果、化合物（１４）の粒子については平均粒径１９０．５ｎｍ、内包率は７３％、化合物（１７）の粒子については平均粒径１９７．０ｎｍ、内包率は７０％であり、実施例１６のマイクロ粒子と比較して内包率は劣っていた。

実施例１７ ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）内包マイクロ粒子からのｉｎ ｖｉｔｒｏ薬物放出速度の解析
実施例１６で３回洗浄を行った粒子を１．２ｍｌの緩衝液Ａにけん濁分散させた。この溶液から一部（４０μ１）を別のチューブに移し、１８０００×ｇ１０分間の遠心により粒子を沈殿させ、上清３０μｌを別のチューブに回収した（０時間サンプル）。残りの粒子けん濁液は、１．５ｍｌエッペンドルフチューブ中で、３７℃インキュベーター内でローテーターを用いて６ｒｐｍの速度でゆっくりと転倒混和させた。この溶液から経時的に少量（４０μｌ）を分取して、上記と同様に遠心による上清分離を行った。各時点で回収した上清サンプル中のｈＧＨ濃度をＥＬＩＳＡキットで測定し、放出量（％）を以下の式により計算した。

放出量（％）＝上清中ｈＧＨ濃度（ｎｇ／ｍｌ）×１．２（ｍｌ）×１００
２０ｍｇ粒子中の内包ｈＧＨ量（ｎｇ）。

実施例１５で作製したマイクロ粒子からの薬物放出のタイムコースを図１１に示す。いずれの粒子も初期バーストがほとんどなく、時間経過に比例して薬物が直線的に放出される良好なプロファイルを示した。５０％の薬物が放出されるのに要する時間は、化合物（１４）のマイクロ粒子で約６日、化合物（１５）のマイクロ粒子で約９日、化合物（１６）のマイクロ粒子で約１６日、化合物（１７）のマイクロ粒子で約１ヶ月であり、ＴＭＳ−デキストラン−ＰＬＧＡ合成時のラクチドおよびグリコリド仕込量を変えることで薬物の放出速度を調節可能であることが示された。

実施例１８ 粒子径の異なるフルオレセイン標識デキストラン(ＦＤ４０)内包マイクロ粒子の調製
実施例２のデキストラン-ポリ（乳酸−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）（化合物（７））５ｍｇを炭酸ジメチル１００μｌに溶解し、５０ｍｇ／ｍｌのポリマー溶液を調製した。該ポリマー溶液にtert−ブタノール２０μｌを添加後、１ｍｇ／ｍｌのＦＤ４０水溶液２０μｌを滴下し、ボルテックスで撹拌して逆相エマルジョンを製造した。該逆相エマルジョンを液体窒素で予備凍結した後、凍結乾燥機（ＥＹＥＬＡ、ＦＲＥＥＺＥ ＤＲＹＥＲ ＦＤ−１０００）を用いて、トラップ冷却温度−４５℃、真空度２０Ｐａにて２４時間凍結乾燥した。得られた固形分を炭酸ジメチル５０μｌ，１００μｌ，２００μｌ，３５０μｌ，５００μｌ，１ｍｌ，２ｍｌ，６ｍｌに分散させ、Ｓ／Ｏサスペンションを調製した。該Ｓ／Ｏサスペンションを１０％ Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−６８（ＢＡＳＦの登録商標）含有水溶液２ｍｌに滴下し、ボルテックスミキサーで撹拌・乳化させてＳ／Ｏ／Ｗ型エマルジョンを調製した。該Ｓ／Ｏ／Ｗ型エマルジョンから液中乾燥により水非混和性有機溶媒を除去して、マイクロ粒子分散液とした。該マイクロ粒子分散液を液体窒素で予備凍結した後、凍結乾燥機（ＥＹＥＬＡ、ＦＲＥＥＺＥ ＤＲＹＥＲ ＦＤ−１０００）を用いて、トラップ冷却温度−４５℃、真空度２０Ｐａにて２４時間凍結乾燥することで、ｈＧＨ内包マイクロ粒子粉末を得た。得られたマイクロ粒子を走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ：ＨＩＴＡＣＨＩ、Ｓ−４８００）により観察することで、平均粒子径を算出した。

平均粒子径とＳ／Ｏ／Ｗ型エマルジョン作成時に添加した炭酸ジメチル量の相関を図１２に示す。５０μｌから５００μｌの間では、炭酸ジメチル量の増加に伴い平均粒子径の低下が観測された。５００μｌから６ｍｌの間では平均粒子径の差はほとんど観測されなかった。

実施例１９ ＰＥＧ−ＰＬＧＡポリマーの合成（ＰＥＧ２ｋシリーズ）
ポリエチレングリコールモノメチルエーテル（日本油脂製、ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ ＭＥＨ−２０Ｈ、数平均分子量１，８６２、Ｍｗ／Ｍｎ＝１．０３）、（ＤＬ）−ラクチドとグリコリドを下記表１の仕込量で混合し、１４０℃に加熱した。２０分攪拌後、オクチル酸すず（II）（ポリエチレングリコールモノメチルエーテルに対して０．０５重量％）を加え、１８０℃で３時間攪拌した。反応液を室温に戻した後、クロロフォルム（約１００ｍｇ／ｍｌ濃度になるよう）に溶解し、０℃に冷却したジエチルエーテルで再沈殿精製し、得られた固体を濾別、減圧乾燥することでＰＥＧ−ＰＬＧＡポリマーを白色、または薄茶色の固体として得た。本ポリマーの数平均分子量は^１Ｈ−ＮＭＲから求めた（表１）。

実施例２０ ＰＥＧ−ＰＬＧＡポリマーの合成（ＰＥＧ５ｋシリーズ）
ポリエチレングリコールモノメチルエーテル（日本油脂製、ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ ＭＥＨ−２０Ｈ、数平均分子量５，１２８、Ｍｗ／Ｍｎ＝１．０２）、（ＤＬ）−ラクチドとグリコリドを下記表２の仕込量で混合し、１４０℃に加熱した。２０分攪拌後、オクチル酸すず（II）（ポリエチレングリコールモノメチルエーテルに対して０．０５重量％）を加え、１８０℃で３時間攪拌した。反応液を室温に戻した後、クロロフォルム（約１００ｍｇ／ｍｌ濃度になるよう）に溶解し、０℃に冷却したジエチルエーテルで再沈殿精製し、得られた固体を濾別、減圧乾燥することでＰＥＧ−ＰＬＧＡポリマーを白色、または薄茶色の固体として得た。本ポリマーの数平均分子量は^１Ｈ−ＮＭＲから求めた（表２）。

実施例２１ ＰＥＧ−ＰＬＧＡポリマーの合成（ＰＥＧ１０ｋシリーズ）
ポリエチレングリコールモノメチルエーテル（日本油脂製、ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ ＭＥＨ−１０Ｔ、数平均分子量９，９７５、Ｍｗ／Ｍｎ＝１．０２）、（ＤＬ）−ラクチドとグリコリドを下表３の割合で混合し、１４０℃に加熱した。２０分攪拌後、オクチル酸すず（II）（ポリエチレングリコールモノメチルエーテルに対して０．０５重量％）を加え、１８０℃で３時間攪拌した。反応液を室温に戻した後、クロロフォルム（約１００ｍｇ／ｍｌ濃度になるよう）に溶解し、０℃に冷却したジエチルエーテルで再沈殿精製し、得られた固体を濾別、減圧乾燥することでＰＥＧ−ＰＬＧＡポリマーを白色、または薄茶色の固体として得た。本ポリマーの数平均分子量は^１Ｈ−ＮＭＲから求めた（表３）。

実施例２２ ＦＤ４０内包マイクロ粒子の調製法
実施例１９〜２１で作製したＰＥＧ−ＰＬＧＡポリマー５ｍｇを炭酸ジメチル１００μｌに溶解し、５０ｍｇ／ｍｌのポリマー溶液を調製した。該ポリマー溶液にｔｅｒｔ−ブタノールを２０μｌ添加後、下表４に示す所定量の１０ｍｇ／ｍｌ ＦＤ４０水溶液を加え、攪拌することで逆相エマルション溶液を製造した。該逆相エマルジョン溶液を、液体窒素で予備凍結した後、凍結乾燥機（ＥＹＥＬＡ、ＦＲＥＥＺＥ ＤＲＹＥＲ ＦＤ−１０００）を用いて、トラップ冷却温度−４５℃、真空度２０Ｐａにて２４時間凍結乾燥した。得られた固形分を炭酸ジメチル２００μｌに分散させ、Ｓ／Ｏサスペンションを調製した。該Ｓ／Ｏサスペンションを１０％ Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−６８（ＢＡＳＦの登録商標）含有水溶液２ｍｌに滴下し、ボルテックスミキサーで撹拌・乳化させてＳ／Ｏ／Ｗ型エマルジョンを調製した。該Ｓ／Ｏ／Ｗ型エマルジョンから液中乾燥により水非混和性有機溶媒を除去して、マイクロ粒子分散液とした。該マイクロ粒子分散液を液体窒素で予備凍結した後、凍結乾燥機（ＥＹＥＬＡ、ＦＲＥＥＺＥ ＤＲＹＥＲ ＦＤ−１０００）を用いて、トラップ冷却温度−４５℃、真空度２０Ｐａにて２４時間凍結乾燥することで、ＦＤ４０内包マイクロ粒子粉末を得て、それらの一部については走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ：ＨＩＴＡＣＨＩ、Ｓ−４８００）により観察し、平均粒子径を算出した（表４）。５ｋ−１０ｋのＰＥＧ−ＰＬＧＡポリマーから調製した粉末のＳＥＭ像を図１４に、５ｋ−６１ｋのＰＥＧ−ＰＬＧＡポリマーから調製した粉末のＳＥＭ像を図１５に示す。

実施例２３ ＦＤ４０内包マイクロ粒子の内包率の測定
ＰＥＧ−ＰＬＧＡポリマーを用いて実施例２２の方法で作成したＦＤ４０内包マイクロ粒子（５ｍｇ）を１．５ｍｌエッペンドルフチューブに秤量し、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ（１ｍｌ）に分散後、３０分間の遠心分離により、未内包ＦＤ４０を含む上清とＦＤ４０内包粒子を分離、回収した。回収したＦＤ４０内包マイクロ粒子はＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（２５０μｌ）に溶解させることで粒子を崩壊させた。未内包ＦＤ４０を含む上清と、内包ＦＤ４０を含むＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド溶液（５０μｌ）をそれぞれＭｉｌｌｉ−Ｑ（３ｍｌ）に添加し、よく攪拌後、蛍光分光光度計（ＨＯＲＩＢＡ、Ｆｌｕｏｒｏ ＭＡＸ−３、励起波長４９５ｎｍ、蛍光波長５２０ｎｍ）を用いてＦＤ４０の定量を行い、全回収量に対する内包率を算出した。

ＰＥＧ−ＰＬＧＡポリマーから作製したマイクロ粒子におけるＦＤ４０の内包率を図１３に示す。ＰＥＧの分子量が２ｋ、５ｋ、１０ｋすべてのシリーズにおいて、ＰＬＧＡの分子量が高いときに封入率が高くなる傾向が確認された。特にＰＥＧ５ｋシリーズの場合では、５ｋ−６５ｋにおいて約９０％という高封入率であった。高封入率（約８０％）であった５ｋ−４７ｋ（ＰＬＧＡ／ＰＥＧ＝９．４）と同程度の分子量比である１０ｋ−９５ｋ（ＰＬＧＡ／ＰＥＧ＝９．５）では、封入率が約５５％であった。

比較例３ ＦＤ４０内包粒子の調製
ＰＥＧ−ＰＬＧＡポリマー（５ｋ−６１ｋ）１０ｍｇを酢酸エチル２ｍＬに溶解し、ポリマー溶液を調製した。該ポリマー溶液に、２ｍｇ／ｍＬの成長ホルモン溶液１００μＬを滴下し攪拌した。攪拌後、２０ｍＬのジオキサンに添加した。溶媒を蒸発させ約２ｍＬまで濃縮した後、該粒子分散液を５００ｍｇのＰｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−６８（ＢＡＳＦの登録商標）を含有した水に添加した。試料を凍結乾燥した後、５０ｍｇの試料に１ｍＬの水を添加し粒子を再分散させて、会合していない親水性活性物質含有粒子を得た。該粒子の平均粒径は、装置ＥＬＳ−Ｚ（大塚電子））を使用し、動的光散乱法で測定し、薬剤の内包率は、実施例２３と同様に求めた。

その結果、ＦＤ４０の内包率は４８％、平均粒径は２０３．８ｎｍであり、実施例２３のマイクロ粒子と比較して内包率は劣っていた。

実施例２４ ＦＤ４０内包マイクロ粒子からのｉｎ ｖｉｔｒｏＦＤ４０放出速度の解析
ＰＥＧ−ＰＬＧＡポリマー粒子を構成するＰＬＧＡ鎖の長さと徐放挙動との関係を評価するため、実施例２２で作成したＦＤ４０内包マイクロ粒子のうち、５ｋ−２３ｋ、５ｋ−３２．５ｋ、５ｋ−４７ｋ、５ｋ−６１ｋの粒子の放出挙動を評価した。

マイクロ粒子は調製後、凍結乾燥状態にて−３０℃にて保存し、使用前に常温に戻し使用した。粒子粉末２０ｍｇを計りとり１．５ｍｌチューブ（エッペンドルフ）に入れたのち、アッセイバッファー（０．０２％アジ化ナトリウム、０．１％ Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−６８（ＢＡＳＦの登録商標）、０．１％牛血清アルブミン添加ＰＢＳ溶液）１ｍｌを添加し、タッチミキサーで激しく攪拌して懸濁した。その後、日立高速遠心機（ＣＦ１６ＲＸ）を用いて１８，９００×ｇで１０分間遠心し内包されなかったＦＤ４０が含まれる上清画分９５０μｌを取り除いた、その後、アッセイバッファー９５０μｌを再度加え、懸濁後遠心を行う粒子洗浄を繰り返し、合計３回の洗浄を行った。

３回の洗浄を行った粒子は再度アッセイバッファーを９５０μｌ加え粒子を懸濁させた後、１００μｌずつ１．５ｍｌチューブに分注した。それぞれのチューブにアッセイバッファー９００μｌを加え合計１ｍｌとして、３７℃インキュベーター内にてローテーターを用い１０ｒｐｍで回転しながらインキュベートした。インキュベートしたそれぞれのチューブは経時的に１８９００×ｇ、１０分間遠心し、上清９５０μｌを分取し蛍光強度の測定まで４℃にて保存した。

サンプリングした溶液の蛍光強度の測定は３ｍｌディスポーザルキュベット（ＫＡＲＴＥＬＬ）とＨＯＲＩＢＡ Ｆｌｕｏｒｏ ＭＡＸ−３を用いて励起波長４９４ｎｍ、蛍光波長５１２ｎｍで測定し、粒子作成時に使用したＦＤ４０量との比より徐放比率を決定した。

放出評価により決定した各種マイクロ粒子からのＦＤ４０放出量を図１６に示す。横軸はインキュベーション時間、縦軸は仕込量に対する放出比率を示す。ＰＬＧＡ鎖の短い５ｋ−２３ｋの粒子ではインキュベーション初期の１日以内に仕込み量の４０％程度が放出し、その後、１ヶ月で初期バースト分を除くほぼ全量が放出した。これに対し、ＰＬＧＡ鎖の長さが長くなるにつれて、初期の放出量が低下し、５ｋ―６１ｋのマイクロ粒子では初期の１日間の放出量は１０％以下であった。

実施例２５ ヒトインスリン内包マイクロ粒子の薬物内包率の測定
実施例２０で作製したＰＥＧ−ＰＬＧＡポリマー（５ｋ−６１ｋ）を用いて、実施例２２と同様の方法でヒトインスリン内包マイクロ粒子を作製した。得られたマイクロ粒子（２０ｍｇ）を１．５ｍｌエッペンドルフチューブに秤量し、１ｍｌの緩衝液Ａ（０．１％ウシ血清アルブミン、０．１％ Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−６８（ＢＡＳＦの登録商標）および０．０２％アジ化ナトリウムを含むＰＢＳ）に溶解して１８，８００×ｇ、１０分間の遠心により粒子（沈殿）と上清を分離した。上清を別のチューブに回収した後、粒子を１ｍｌの緩衝液Ａに再懸濁し、上記条件での遠心による粒子と上清の分離を再度行った。この洗浄操作をもう一度繰り返し（計３回遠心）、各遠心で回収した上清中のインスリン濃度をサンドイッチＥＬＩＳＡ法にて測定した。

サンドイッチＥＬＩＳＡ法は、以下の方法で行った。抗ヒトインスリンモノクローナル抗体（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ社製ｃｌｏｎｅ Ｎｏ．Ｅ６Ｅ５）を５μｇ／ｍｌの濃度で固相化したＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ社Ｍａｘｉｓｏｒｐ)に、ＥＬＩＳＡ緩衝液（０．２５％ＢＳＡおよび０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む０．１Ｍ Ｔｒｉｓ塩酸緩衝液ｐＨ８．０）５０ｕＬおよびＥＬＩＳＡ希釈液（０．２５％ＢＳＡおよび０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ）で希釈した測定サンプルまたは標準インスリン溶液５０ｕＬを加えて室温で１時間振とう反応させた。プレートを洗浄液（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ）で３回洗浄して未反応の試薬を除去した後、ビオチン標識した抗ヒトインスリンモノクローナル抗体（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ社製ｃｌｏｎｅ Ｎｏ．Ｄ４Ｂ８）０．５μｇ／ｍｌ、およびストレプトアビジン−ＨＲＰコンジュゲート(Ｚｙｍｅｄ社製)を室温で１時間および１５分間順次振とう反応させた。各反応後にはプレートを洗浄液（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ）で３回洗浄して未反応の試薬を除去した。最後にＨＲＰの基質を加えて結合したコンジュゲートのＨＲＰ酵素活性を比色定量し、標準インスリンの発色から作成した検量線を元に、サンプル中のインスリン濃度を読みとった。

粒子作製時の仕込みのインスリン量（粒子重量２０ｍｇあたり）から３回の遠心上清中のインスリン量合計を差し引くことで、以下の式により内包率を計算した。

内包率（％）＝仕込みインスリン量(ｎｇ)−上清中インスリン合計(ｎｇ)×１００
仕込みインスリン量(ｎｇ)。

得られたマイクロ粒子の平均粒径は、４．７μｍであった。また、マイクロ粒子中のヒトインスリンの内包率は、８６．７％であり、高い効率でタンパク薬物を内包可能であることが示された。

実施例２６ ヒトインスリン内包マイクロ粒子からのｉｎ ｖｉｔｒｏ薬物放出速度の解析
実施例２５で３回洗浄を行ったマイクロ粒子を１．０ｍｌの緩衝液Ａにけん濁分散させた。この溶液を０．１ｍｌずつ１０本のエッペンドルフチューブ（１．５ｍｌ容量）に分注し、それぞれに緩衝液Ａ０．９ｍｌを加えて１０倍に希釈した。希釈直後に、１本のチューブを１８８００×ｇ１０分間で遠心して粒子を沈殿させ、上清を別のチューブに回収した（０時間サンプル）。残りの９本のチューブは、３７℃インキュベーター内でローテーターを用いて６ｒｐｍの速度でゆっくりと転倒混和させた。経時的に１本ずつのチューブを用いて、上記と同様に遠心による上清分離を行った。各時点で回収した上清サンプル中のインスリン濃度をサンドイッチＥＬＩＳＡで測定し、インスリン放出量（％）を以下の式により計算した。

インスリン放出量（％）＝上清中インスリン濃度(ng/ml)×１（ml）×１０×１００
２０ｍｇ粒子中の内包インスリン量（ng）。

インスリン放出のタイムコースを図１７に示す。時間経過とともに薬物が徐々に放出され、３０日以降に放出の速度が上昇して約６０日で大部分の薬物が放出された。

実施例２７ ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）内包マイクロ粒子のマウス皮下投与
ＰＥＧ−ＰＬＧＡポリマー（５ｋ−６１ｋ）２５ｍｇを炭酸ジメチル５００μｌに溶解し、５０ｍｇ／ｍｌのポリマー溶液を調製した。該ポリマー溶液にtert−ブタノール１００μｌを添加後、１０ｍｇ／ｍｌのｈＧＨ水溶液２５０μｌを滴下し、ボルテックスで撹拌して逆相エマルジョンを製造した。該逆相エマルジョンを液体窒素で予備凍結した後、凍結乾燥機（ＥＹＥＬＡ、ＦＲＥＥＺＥ ＤＲＹＥＲ ＦＤ−１０００）を用いて、トラップ冷却温度−４５℃、真空度２０Ｐａにて２４時間凍結乾燥した。得られた固形分を炭酸ジメチル１ｍｌに分散させ、Ｓ／Ｏサスペンションを調製した。該Ｓ／Ｏサスペンションを１０％ Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−６８（ＢＡＳＦの登録商標）含有水溶液１０ｍｌに滴下し、ボルテックスミキサーで撹拌・乳化させてＳ／Ｏ／Ｗ型エマルジョンを調製した。該Ｓ／Ｏ／Ｗ型エマルジョンから液中乾燥により水非混和性有機溶媒を除去して、マイクロ粒子分散液とした。該マイクロ粒子分散液を液体窒素で予備凍結した後、凍結乾燥機（ＥＹＥＬＡ、ＦＲＥＥＺＥ ＤＲＹＥＲ ＦＤ−１０００）を用いて、トラップ冷却温度−４５℃、真空度２０Ｐａにて２４時間凍結乾燥することで、ｈＧＨ内包マイクロ粒子粉末を得た。得られたマイクロ粒子の平均粒径は、６．０μｍであった。

上記で作成したマイクロ粒子３００ｍｇを３ｍｌのリン酸生理緩衝液（ＰＢＳ）にけん濁分散させ、８０×ｇ、５分間の遠心により粒子を沈殿させ、上清を別チューブに移した。上清は再度８０×ｇ、５分間の遠心を行って残存している粒子を沈殿させ、上清は除去した。１回目の遠心沈殿と２回目の遠心沈殿をあわせて１ｍｌのＰＢＳに再分散し、同様の遠心洗浄操作を３回繰り返すことにより、粒子に内包されていない成長ホルモンを除去した。最後に沈殿を２００μｌのＰＢＳに再分散して、投与溶液とした。なお、ＰＥＧ−ＰＬＧＡ粒子に内包された成長ホルモン量は、洗浄液中の濃度をＥＬＩＳＡキットで測定し、仕込量から差し引くことにより計算した結果、マウス１匹あたりに投与した３００ｍｇの粒子に内包されていた量として、ＰＥＧ−ＰＬＧＡマイクロ粒子は７００μｇであった。

本溶液を、１０週令の雄Ｂａｌｂ／Ｃマウスの背部皮下２カ所に注射投与し、尾静脈から経時的に採血をおこなった。採取した血液は、終濃度３．３ＩＵ／ｍｌのヘパリンを添加して５，０００ｒｐｍで５分間遠心して血漿を回収し、ＥＬＩＳＡキットを用いて血漿中成長ホルモン濃度を測定した。

比較として、粒子化していないヒト成長ホルモンタンパク溶液（７００μｇ／０．２ｍｌ）を皮下投与したマウスについても同様に採血を行った。

なお、マウスにとって異種タンパク質であるヒト成長ホルモン投与による抗体産生を抑制するために、粒子投与の３日前に免疫抑制剤タクロリムス水和物（アステラス社）２６μｇ／マウスを皮下投与し、その後、薬物投与時、３日後、７日後にも１３μｇ／マウスを皮下投与した。

血漿中ヒト成長ホルモン濃度の経時変化を図１８に示す。マイクロ粒子化していない薬物を投与したマウスでは、投与１時間後に血中濃度は５,０００ｎｇ／ｍｌ以上の非常に高い値を示し、その後急速に低下して１日後には投与前のレベルまで低下した。一方、ＰＥＧ−ＰＬＧＡポリマーを用いて作製したマイクロ粒子化薬物を投与したマウスでは、投与直後の一過性の血中濃度の上昇は１００ｎｇ／ｍｌ以下に抑えられ、７日後まで血中濃度が持続的に高い値を示した。

実施例２８ 工程（ｃ）おいて液相に塩を添加したマイクロ粒子製造
５０ｍｇ／ｍｌのＰＥＧ−ＰＬＧＡポリマー（５ｋ−６１ｋ）／炭酸ジメチル溶液１００μｌにtert−ブタノールを２０μｌ添加し、１０ｍｇ／ｍｌのＦＤ４０水溶液を２０μｌ加え、撹拌することで逆ミセル（Ｗ／Ｏエマルション）溶液を調製した。得られた溶液を、液体窒素で予備凍結した後、凍結乾燥機で一晩凍結乾燥することでＦＤ４０含有固形分（Solid）とした。得られたＦＤ４０含有固形分に炭酸ジメチル２００μｌを加えてボルテックスで１０秒間撹拌することでＳ／Ｏサスペンションとし、所定濃度の塩化ナトリウム（０Ｍ、１０ｍＭ、５０ｍＭ、１Ｍ）を含む１０％ Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−６８（ＢＡＳＦの登録商標）含有水溶液２ｍｌに滴下して、３０秒間ボルテックスで撹拌して乳化させることでＳ／Ｏ／Ｗ型エマルション溶液を調製した。得られたＳ／Ｏ／Ｗ型エマルション溶液から、エバポレーターを用いて水非混和性有機溶媒を除去（３０ｈＰａまで減圧後、５分間減圧留去）することで、ＦＤ４０封入マイクロ粒子の水分散体とした。ＦＤ４０封入マイクロ粒子分散水溶液を液体窒素で予備凍結した後、凍結乾燥機で一晩凍結乾燥することで、粉末状のＦＤ４０封入マイクロ粒子を調製した。得られたマイクロ粒子を走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ：ＨＩＴＡＣＨＩ、Ｓ−４８００）により観察することで平均粒子径を算出したところ、いずれの塩化ナトリウム濃度条件下においてもマイクロ粒子の平均粒径は６．５μｍであった。

得られた粉末状ＦＤ４０封入マイクロ粒子を２０ｍｇ秤量し、ＰＢＳ緩衝液１ｍｌ（０．１％ Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−６８（ＢＡＳＦの登録商標）、０．１％ ＢＳＡ、０．０２％アジ化ナトリウムを含む）に分散後、遠心分離（１４，０００ｒｐｍ、１０分間）した。上清回収後、ＰＢＳ緩衝液１ｍｌにマイクロ粒子を再懸濁、遠心分離することでマイクロ粒子の洗浄をさらに２回行った。洗浄したマイクロ粒子をＰＢＳ緩衝液１ｍｌに再度懸濁させ、１．５ｍｌエッペンドルフチューブに１００μｌずつ分注し、ＰＢＳ緩衝液９００μｌを加え、３７℃でインキュベーションし、１日後にサンプル回収した。回収したサンプルは、１４，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離を行い、蛍光分光光度計（ＨＯＲＩＢＡ、Ｆｌｕｏｒｏ ＭＡＸ−３、励起波長４９５ｎｍ、蛍光波長５２０ｎｍ）を用いて上清中に含まれるＦＤ４０を蛍光測定し、放出量を算出した。また、洗浄時に回収した上清中のＦＤ４０量も同様に蛍光測定を行い、仕込量値から封入率を算出した。

封入率は、塩化ナトリウム濃度０Ｍ、１０ｍＭ、５０ｍＭ、１Ｍそれぞれの条件において、７３％、９７％、８４％、８２％であった。また、１日後の放出量は、塩化ナトリウム濃度０Ｍ、１０ｍＭ、５０ｍＭ、１Ｍそれぞれの条件において、１４％、７％、１５％、１１％であり、塩化ナトリウム１０ｍＭ添加の時に、最も内包率が高く、１日後の放出量（初期バースト）が少ない結果であった。

実施例２９ ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）内包マイクロ粒子のマウス皮下投与（薬理活性評価）
実施例２０のＰＥＧ−ＰＬＧＡポリマー（５ｋ−５５ｋ）およびＰＥＧ−ＰＬＧＡポリマー（５ｋ−１０５ｋ）それぞれ２５ｍｇを、炭酸ジメチル５００μｌに溶解し、５０ｍｇ／ｍｌのポリマー溶液を調製した。該ポリマー溶液にtert−ブタノール１００μｌを添加後、１０ｍｇ／ｍｌのｈＧＨ水溶液２５０μｌを滴下し、ボルテックスで撹拌して逆相エマルジョンを製造した。該逆相エマルジョンを液体窒素で予備凍結した後、凍結乾燥機（ＥＹＥＬＡ、ＦＲＥＥＺＥ ＤＲＹＥＲ ＦＤ−１０００）を用いて、トラップ冷却温度−４５℃、真空度２０Ｐａにて２４時間凍結乾燥した。得られた固形分を炭酸ジメチル１ｍｌに分散させ、Ｓ／Ｏサスペンションを調製した。該Ｓ／Ｏサスペンションを１０％ Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−６８（ＢＡＳＦの登録商標）含有水溶液１０ｍｌに滴下し、ボルテックスミキサーで撹拌・乳化させてＳ／Ｏ／Ｗ型エマルジョンを調製した。該Ｓ／Ｏ／Ｗ型エマルジョンから液中乾燥により水非混和性有機溶媒を除去して、マイクロ粒子分散液とした。該マイクロ粒子分散液を液体窒素で予備凍結した後、凍結乾燥機（ＥＹＥＬＡ、ＦＲＥＥＺＥ ＤＲＹＥＲ ＦＤ−１０００）を用いて、トラップ冷却温度−４５℃、真空度２０Ｐａにて２４時間凍結乾燥することで、ｈＧＨ内包マイクロ粒子粉末を得た。得られたマイクロ粒子を走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ：ＨＩＴＡＣＨＩ、Ｓ−４８００）により観察することで平均粒子径を算出したところ、マイクロ粒子の平均粒径は、ＰＥＧ−ＰＬＧＡポリマー（５ｋ−５５ｋ）のマイクロ粒子（５ｋ−５５ｋマイクロ粒子）は４．２μｍ、ＰＥＧ−ＰＬＧＡポリマー（５ｋ−１０５ｋ）のマイクロ粒子（５ｋ−１０５ｋマイクロ粒子）は７．５μｍであった。

上記で作成したマイクロ粒子３００ｍｇをそれぞれ３ｍｌのリン酸生理緩衝液（ＰＢＳ）にけん濁分散させ、８０×ｇ、５分間の遠心により粒子を沈殿させ、上清を別チューブに移した。上清は再度８０×ｇ、５分間の遠心を行って残存している粒子を沈殿させ、上清は除去した。１回目の遠心沈殿と２回目の遠心沈殿をあわせて１ｍｌのＰＢＳに再分散し、同様の遠心洗浄操作を３回繰り返すことにより、粒子に内包されていない成長ホルモンを除去した。最後に沈殿を２００μｌのＰＢＳに再分散して、投与溶液とした。

本溶液を、８週齢の脳下垂体摘出処置ＩＣＲマウス（日本ＳＬＣ）の背部皮下に注射投与し、尾静脈から経時的に採血をおこなった。採取した血液は、終濃度３．３ＩＵ／ｍｌのヘパリンを添加して５，０００ｒｐｍ５分間遠心して血漿を回収し、ＥＬＩＳＡ法を用いて血漿中成長ホルモン濃度および、血漿中ＩＧＦ−１濃度を測定した。

比較として、粒子化していないヒト成長ホルモンタンパク溶液（７００μｇ／０．２ｍｌ）を皮下投与したマウスについても同様に採血を行った。

なお、マウスにとって異種タンパク質であるヒト成長ホルモン投与による抗体産生を抑制するために、粒子投与の３日前に免疫抑制剤タクロリムス水和物（アステラス社）２６μｇ／マウスを皮下投与し、その後、薬物投与時以降、週に２回の間隔で１３μｇ／マウスを皮下投与した。

血漿中ヒト成長ホルモン濃度の経時変化を図１９に示す。マイクロ粒子化していない薬物を投与したマウスでは、投与１時間後に非常に高い値を示し、その後急速に低下して１日後には投与前のレベルまで低下した。一方、ＰＥＧ−ＰＬＧＡポリマーを用いて作製したマイクロ粒子化薬物を投与したマウスでは、投与直後の一過性の血中濃度の上昇はマイクロ粒子化していない薬物を投与したマウスのおよそ１００分の１以下に抑えられ、投与９日以上、血中濃度が持続的に高い値を示した。

この時の血漿中のＩＧＦ−１濃度を図２０に示す。血漿中のＩＧＦ−１濃度は５ｋ−５５ｋマイクロ粒子、および５ｋ−１０５ｋマイクロ粒子とも投与後上昇し、５ｋ−５５ｋマイクロ粒子では７日目まで、５ｋ−１０５ｋマイクロ粒子では１４日以上、高い値に維持された。

実施例３０ エキセンジン４（ＧＬＰ−１受容体アゴニスト）内包マイクロ粒子のマウス皮下投与
実施例２０のＰＥＧ−ＰＬＧＡポリマー（５ｋ−６１ｋ）２５ｍｇを炭酸ジメチル５００μｌに溶解し、５０ｍｇ／ｍｌのポリマー溶液を調製した。該ポリマー溶液にtert−ブタノール１００μｌを添加後、１０ｍｇ／ｍｌのエキセンジン４（シグマジェノシス社委託合成）水溶液２５０μｌを滴下し、ボルテックスで撹拌して逆相エマルジョンを製造した。該逆相エマルジョンを液体窒素で予備凍結した後、凍結乾燥機（ＥＹＥＬＡ、ＦＲＥＥＺＥ ＤＲＹＥＲ ＦＤ−１０００）を用いて、トラップ冷却温度−４５℃、真空度２０Ｐａにて２４時間凍結乾燥した。得られた固形分を炭酸ジメチル１ｍｌに分散させ、Ｓ／Ｏサスペンションを調製した。該Ｓ／Ｏサスペンションを１０％ Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−６８（ＢＡＳＦの登録商標）含有水溶液１０ｍｌに滴下し、ボルテックスミキサーで撹拌・乳化させてＳ／Ｏ／Ｗ型エマルジョンを調製した。該Ｓ／Ｏ／Ｗ型エマルジョンから液中乾燥により水非混和性有機溶媒を除去して、マイクロ粒子分散液とした。該マイクロ粒子分散液を液体窒素で予備凍結した後、凍結乾燥機（ＥＹＥＬＡ、ＦＲＥＥＺＥ ＤＲＹＥＲ ＦＤ−１０００）を用いて、トラップ冷却温度−４５℃、真空度２０Ｐａにて２４時間凍結乾燥することで、エキセンジン４内包マイクロ粒子粉末を得た。得られたマイクロ粒子を走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ：ＨＩＴＡＣＨＩ、Ｓ−４８００）により観察することで平均粒子径を算出したところ、マイクロ粒子の平均粒径は、６．０μｍであった。

上記で作成したマイクロ粒子３００ｍｇを３ｍｌのリン酸生理緩衝液（ＰＢＳ）にけん濁分散させ、８０×ｇ、５分間の遠心により粒子を沈殿させ、上清を別チューブに移した。上清は再度８０×ｇ、５分間の遠心を行って残存している粒子を沈殿させ、上清は除去した。１回目の遠心沈殿と２回目の遠心沈殿をあわせて１ｍｌのＰＢＳに再分散し、同様の遠心洗浄操作を３回繰り返すことにより、粒子に内包されていないエキセンジン４を除去した。最後に沈殿を２００μｌのＰＢＳに再分散して、投与溶液とした。

本溶液を、１０週令の雄Ｂａｌｂ／Ｃマウス（日本ＳＬＣ社）の背部皮下２カ所に注射投与し、尾静脈から経時的に採血をおこなった。採取した血液は、終濃度３．３ＩＵ／ｍｌのヘパリンを添加して５，０００ｒｐｍで５分間遠心して血漿を回収し、ＥＬＩＳＡ法を用いて血漿中エキセンジン４濃度を測定した。

比較として、粒子化していないエキセンジン４溶液（７００μｇ／０．２ｍｌ）を皮下投与したマウスについても同様に採血を行った。

なお、マウスにとって異種タンパク質であるエキセンジン４投与による抗体産生を抑制するために、粒子投与の３日前に免疫抑制剤タクロリムス水和物（アステラス社）２６μｇ／マウスを皮下投与し、その後、薬物投与時以降、週に２回の間隔で１３μｇ／マウスを皮下投与した。

血漿中エキセンジン４濃度の経時変化を図２１に示す。マイクロ粒子化していない薬物を投与したマウスでは、投与１時間後に血中濃度は非常に高い値を示し、その後急速に低下して１日後には投与前のレベルまで低下した。一方、ＰＥＧ−ＰＬＧＡポリマーを用いて作製したマイクロ粒子化薬物を投与したマウスでは、投与直後の一過性の血中濃度の上昇はおよそ１００分の１以下に抑えられ、１ヶ月後まで血中濃度が持続的に高い値を示した。

実施例３１ 粒子径の異なるフルオレセイン標識デキストラン(FD４０)内包マイクロ粒子の調製
実施例２０のＰＥＧ−ＰＬＧＡポリマー（５ｋ−５５ｋ） ５ｍｇを炭酸ジメチル１００μｌに溶解し、５０ｍｇ／ｍｌのポリマー溶液を調製した。該ポリマー溶液にtert−ブタノール２０μｌを添加後、１ｍｇ／ｍｌのFD４０水溶液２０μｌを滴下し、ボルテックスで撹拌して逆相エマルジョンを製造した。該逆相エマルジョンを液体窒素で予備凍結した後、凍結乾燥機（ＥＹＥＬＡ、ＦＲＥＥＺＥ ＤＲＹＥＲ ＦＤ−１０００）を用いて、トラップ冷却温度−４５℃、真空度２０Ｐａにて２４時間凍結乾燥した。得られた固形分を炭酸ジメチル５０μｌ，２００μｌ，５００μｌに分散させ、Ｓ／Ｏサスペンションを調製した。該Ｓ／Ｏサスペンションを１０％ Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−６８（ＢＡＳＦの登録商標）含有水溶液２ｍｌに滴下し、ボルテックスミキサーで撹拌・乳化させてＳ／Ｏ／Ｗ型エマルジョンを調製した。該Ｓ／Ｏ／Ｗ型エマルジョンから液中乾燥により水非混和性有機溶媒を除去して、マイクロ粒子分散液とした。該マイクロ粒子分散液を液体窒素で予備凍結した後、凍結乾燥機（ＥＹＥＬＡ、ＦＲＥＥＺＥ ＤＲＹＥＲ ＦＤ−１０００）を用いて、トラップ冷却温度−４５℃、真空度２０Ｐａにて２４時間凍結乾燥することで、ＦＤ４０内包マイクロ粒子粉末を得た。得られたマイクロ粒子を走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ：ＨＩＴＡＣＨＩ、Ｓ−４８００）により観察することで、平均粒子径を算出した。

平均粒子径とＳ／Ｏ／Ｗ型エマルジョン作成時に添加した炭酸ジメチル量の相関を図２２に示す。５０μｌから５００μｌの間で、炭酸ジメチル量の増加に伴い平均粒子径の低下が観測された。

本発明のマイクロ粒子は、生体内において適切な速度で親水性活性物質を放出しうるので、ＤＤＳ製剤として利用することができる。

Claims (15)

1. ポリ（ヒドロキシ酸）の疎水性セグメントと多糖またはポリエチレングリコールの親水性セグメントからなる両親媒性ポリマーおよび親水性活性物質を含有してなる親水性活性物質含有粒子が会合してなる、マイクロ粒子。
2. 親水性活性物質含有粒子が、内部に両親媒性ポリマーの親水性セグメントを有し、両親媒性ポリマーの疎水性セグメントの外層を有することを特徴とする、請求項１に記載のマイクロ粒子。
3. 両親媒性ポリマーが、多糖主鎖およびポリ（ヒドロキシ酸）グラフト鎖からなるグラフト型両親媒性ポリマーであることを特徴とする、請求項１または２に記載のマイクロ粒子。
4. 多糖主鎖がデキストランであることを特徴とする、請求項３に記載のマイクロ粒子。
5. 両親媒性ポリマーが、ポリエチレングリコールおよびポリ（ヒドロキシ酸）からなるブロックポリマーであることを特徴とする、請求項１または２のマイクロ粒子。
6. ポリエチレングリコールの平均分子量が２，０００〜１５，０００であることを特徴とする、請求項５に記載のマイクロ粒子。
7. ポリエチレングリコールの平均分子量に対するポリ（ヒドロキシ酸）の平均分子量の比が４以上であることを特徴とする、請求項５または６に記載のマイクロ粒子。
8. ポリ（ヒドロキシ酸）がポリ（乳酸−グリコール酸）であることを特徴とする、請求項１〜７のいずれかに記載のマイクロ粒子。
9. 平均粒径が１〜５０μｍであることを特徴とする、請求項１〜８のいずれかに記載のマイクロ粒子。
10. 親水性活性物質がペプチドまたはタンパク質であることを特徴とする、請求項１〜９のいずれかに記載のマイクロ粒子。
11. （ａ）親水性活性物質を含む水系溶媒と両親媒性ポリマーを溶解した水非混和性有機溶媒を混合することにより、逆相エマルジョンを形成する工程、（ｂ）逆相エマルジョンから溶媒を除去して親水性活性成分含有固形分を得る工程、および（ｃ）親水性活性成分含有固形分または親水性活性成分含有固形分分散液を、表面改質剤を含む液相に導入する工程、
    を含むことを特徴とする、マイクロ粒子の製造方法。
12. 逆相エマルジョンから溶媒を除去する方法が凍結乾燥法であることを特徴とする、請求項１１記載のマイクロ粒子の製造方法。
13. 親水性活性成分含有固形分分散液の分散媒が、ポリ（ヒドロキシ酸）が可溶で且つ、両親媒性ポリマーを構成する親水性セグメントの溶解度が１０ｍｇ／ｍＬ以下の溶媒であることを特徴とする、請求項１１または１２に記載のマイクロ粒子の製造方法。
14. 液相が水系溶媒または水混和性有機溶媒であることを特徴とする、請求項１１〜１３のいずれかに記載のマイクロ粒子の製造方法。
15. 請求項１〜１０のいずれかに記載のマイクロ粒子を含んでなる、医薬品組成物。

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