ES2782507T3 - Nanopartículas poliméricas y un proceso para su preparación - Google Patents

Abstract

Una nanopartícula polimérica biodegradable formada por el copolímero tetrabloque de PLA-PEG-PPG-PEG o el copolímero pentabloque de PLA-PEG-PPG-PEG-PLA.

Description

DESCRIPCIÓN

Nanopartículas poliméricas y un proceso para su preparación

Campo de la invención

La presente invención se refiere al campo de la nanotecnología, en particular, a la producción de nanopartículas poliméricas biodegradables. La presente invención también se refiere a un procedimiento para producir nanopartículas poliméricas biodegradables capaces de transportar agentes terapéuticos y/o agentes de direccionamiento. Estas nanopartículas poliméricas biodegradables tienen un inmenso potencial en el campo de la terapéutica, el diagnóstico y el teranóstico.

Antecedentes de la invención

La terapia dirigida molecularmente ha surgido como un enfoque prometedor para superar la falta de especificidad de los agentes quimioterapéuticos convencionales en el tratamiento del cáncer. Los fármacos peptídicos sintéticos en la terapia contra el cáncer muestran una alta especificidad, estabilidad y facilidad de síntesis en comparación con las proteínas convencionales. Sin embargo, el suministro de estos péptidos anticancerígenos al sitio objetivo plantea grandes problemas debido a factores tales como la degradación enzimática, inmunogenicidad y una vida útil corta en la sangre. El suministro dirigida de medicamentos contra el cáncer sería más efectiva si el sistema de administración pudiera alcanzar los tejidos tumorales deseados a través de la penetración de barreras en el cuerpo con una pérdida mínima de su volumen o actividad en la circulación sanguínea y matará selectivamente las células tumorales. Esto mejoraría la supervivencia del paciente y la calidad de vida al aumentar la concentración intracelular de fármacos y reducir las toxicidades limitantes de la dosis simultáneamente. Una de las estrategias para el suministro de fármacos peptídicos consiste en conjugar péptidos con péptidos penetrantes de células (CPP) para el suministro directa del fármaco dentro del citosol. Sin embargo, la conjugación con CPP aumenta el costo y disminuye la eficacia y la estabilidad de los fármacos peptídicos, y en algunos casos puede aumentar la toxicidad. Algunos agentes terapéuticos peptídicos como NuBCP-9 y Bax-BH3 muestran una unión selectiva a las células cancerosas e inician la apoptosis. Desafortunadamente, las formulaciones de fármacos libres de agentes terapéuticos peptídicos requieren el uso de grandes cantidades y la administración frecuente del péptido, aumentando así el coste y las molestias de la terapia.

Existe una necesidad apremiante de un sistema de suministro que pueda suministrar efectivamente agentes terapéuticos, incluidos péptidos terapéuticos, en el citosol de las células cancerosas. El documento WO 2012/024530 describe conjugados terapéuticos y partículas que comprenden a) una pluralidad de polímeros hidrófobos; b) una pluralidad de polímeros hidrófilos-hidrófobos; y c) una pluralidad de péptidos o proteínas terapéuticos unidos al polímero hidrófobo o al polímero hidrófilo-hidrófobo. El documento WO 03/086369 describe nanoesferas poliméricas biodegradables para suministrar compuestos terapéuticos que comprenden (i) un copolímero multibloque de poliésterpolietileno; (ii) opcionalmente un poliéster enredado con el copolímero multibloque para dar rigidez a las nanoesferas. El documento Wo 2006/014626 describe constructos en partículas para la liberación de agentes activos estabilizados por copolímeros anfifílicos para proporcionar una liberación sostenida del ingrediente activo. Otros documentos que divulgan partículas poliméricas biodegradables incluyen los siguientes artículos: Yoo Hyuk Sang, et al., "Biodegradable polymeric micelles composed of doxorubicin conjugated PLGA-PEG block copolymer", Journal of Controlled Release.

2001. Vol. 70, no. 1-2, páginas 63-70; Hyuk Sang Yoo, et al., "Biodegradable Nanoparticles Containing Doxorubicin-PLGA Conjugate for Sustained Release", Pharmaceutical Research. 1999. Vol. 16, no. 7, páginas 1114-1118. Kim S Y et al., "Poly(ethylene oxide)-poly(propylene oxide)-poly(ethyleneoxide)/poly(e-caprolactone) (PCL) Amphiphilic Block Copolymeric Nanospheres II, Thermo-responsive Drug Release Behaviours. Journal of Controlled Release 31/12/2000 Col 65, páginas 345-358.

Sumario

En este documento se proporciona una nanopartícula de copolímero de bloque biodegradable, una nanopartícula de copolímero de bloque biodegradable para tratar enfermedades y una composición farmacéutica que comprende una nanopartícula de copolímero de bloque biodegradable como se define en las reivindicaciones adjuntas. Las partículas de copolímero pueden usarse como un vehículo para diversas entidades, incluidos agentes terapéuticos y de direccionamiento, y en procedimientos para el tratamiento de enfermedades. Estas nanopartículas poliméricas son no tóxicas y biodegradables, tienen un tamaño ajustable y pueden aumentar la semivida del fármaco encapsulado in vivo.

La nanopartícula polimérica biodegradable está formada por el copolímero de bloque de poli(ácido láctico)-poli(etilenglicol)-poli(propilenglicol)-poli(etilenglicol) (PLA-PEG-PPG-PEG) o del copolímero de bloque de PLA-PEG-PPG-PEG-PLA.

En algunas realizaciones, el componente de poli(ácido láctico) (PLA) de la nanopartícula polimérica biodegradable tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 4.000 g/mol a 90.000 g/mol. En algunas realizaciones, el componente de poli(etilenglicol)-poli(propilenglicol)-poli(etilenglicol) (PEG-PPG-PEG) de la nanopartícula polimérica biodegradable tiene un peso molecular promedio en el intervalo de aproximadamente 4.000 g/mol a 15.000 g/mol.

En algunas realizaciones, el PLA se modifica químicamente con un copolímero de bloque hidrófilo-hidrófobo usando un enlace covalente.

En algunas realizaciones, el tamaño de la nanopartícula polimérica biodegradable está en el intervalo de 30-120 nm.

Las siguientes abreviaturas pueden emplearse en el presente documento: poli(metacrilato de metilo)-poli(ácido metilacrílico) (PMMA-PMAA), ácido poli(estireno-poliacrílico) (PS-PAA), poli(ácido acrílico)-poli(vinilpiridina ) (PAA-PVP), poli(ácido acrílico)-poli(metacrilato de N,N-dimetilaminoetilo) (PAA-PDMAEMA), poli(etilenglicol)-poli(butilenglicol) (PEG-PBG) y poli(etilenglicol)-poli(propilenglicol)-poli(etilenglicol) (PEG-PPG-p Eg ).

En algunas realizaciones, la nanopartícula polimérica biodegradable está sustancialmente libre de emulsionante, o comprende además emulsionante externo de aproximadamente 0,5 % a 5 % en peso.

En una realización, el peso molecular promedio del bloque de poli(ácido láctico) está en el intervalo de aproximadamente 4.000 g/mol a 90.000 g/mol, el peso molecular promedio del bloque PEG-PPG-PEG está en el intervalo de aproximadamente 4.000 g/mol a 15.000 g/mol, y el emulsionante externo es de aproximadamente 0,5 % a 5 % en peso.

En otra realización, el peso molecular promedio del bloque de poli(ácido láctico) es menor o igual a aproximadamente 16.000 g/mol, el peso molecular promedio del bloque PEG-PPG-PEG está en el intervalo de aproximadamente 4.000 g/mol a 15.000 g/mol, y la composición está sustancialmente libre de emulsionante.

En algunas realizaciones, la nanopartícula polimérica biodegradable comprende además un agente terapéutico. El agente terapéutico puede encapsularse, conjugarse en la superficie o adsorberse en la nanopartícula polimérica biodegradable. El agente terapéutico puede seleccionarse de un grupo que comprende pequeñas moléculas orgánicas, ácidos nucleicos, polinucleótidos, oligonucleótidos, nucleósidos, ADN, ARN, aminoácidos, péptidos, proteínas, antibióticos, moléculas de bajo peso molecular, quimioterapéuticos, fármacos, iones metálicos, colorantes, radioisótopos, agentes de contraste y agentes de formación de imágenes.

En una realización adicional, el agente terapéutico es un péptido anticancerígeno. En una realización, el péptido anticancerígeno es FSRSLHSLL o cualquier polipéptido que incorpora sustancialmente el FSRSLHSLL, en el que el FSRSLHSLL está en la configuración D o L. En otra realización, el péptido anticancerígeno se modifica químicamente con un polímero hidrófobo. En una realización, el péptido anticancerígeno es FSRSLHSLL modificado químicamente con poli(ácido láctico).

En otras realizaciones, el péptido anticancerígeno comprende una secuencia o una secuencia modificada del dominio MUC1-CD tal como CQCRRKN o AQARRKN.

En otras realizaciones, el péptido anticancerígeno que comprende una secuencia o una secuencia modificada del MUC1-CD puede estar unido a un dominio de transducción de proteínas tal como poliarginina. En algunas realizaciones, la poliarginina está compuesta de nueve residuos de arginina.

En otras realizaciones, los agentes terapéuticos son quimioterapéuticos que incluyen, pero no se limitan a, paclitaxel, doxorrubicina, pimozida, perimetamina, indenoisoquinolinas o nor-indenoisoquinolinas.

En otra realización, el agente terapéutico es insulina.

En algunas realizaciones, la nanopartícula polimérica biodegradable comprende además una fracción de direccionamiento seleccionada del grupo que consiste en vitaminas, fármacos de molécula pequeña, ligandos, aminas, fragmentos de péptidos, anticuerpos y aptámeros. En una realización específica, la fracción de direccionamiento es ácido fólico.

Las nanopartículas poliméricas biodegradables de acuerdo con esta invención pueden producirse mediante un proceso que comprende:

a. disolver ácido poliláctico (PLA) y un copolímero de bloque hidrófilo-hidrófobo en un disolvente orgánico para obtener una solución;

b. añadir un agente de acoplamiento de carbodiimida y una base a la solución para obtener una mezcla de reacción; c. agitar la mezcla de reacción para obtener un copolímero de bloque de PLA modificado químicamente con el copolímero de bloque hidrófilo-hidrófobo;

d. disolver el copolímero de bloque de la etapa (c) en un disolvente orgánico y homogeneizar para obtener una mezcla homogeneizada;

e. añadir la mezcla homogeneizada a una fase acuosa para obtener una emulsión; y

f. agitar la emulsión para obtener nanopartículas poliméricas biodegradables.

En una realización, el proceso opcionalmente comprende las etapas de lavar las nanopartículas poliméricas biodegradables con agua y secar las nanopartículas poliméricas biodegradables.

En una realización adicional, el proceso da como resultado nanopartículas poliméricas biodegradables que tienen un tamaño en el intervalo de 30-120 nm.

En otra realización, el proceso opcionalmente comprende agregar emulsionante en la etapa (a).

Las nanopartículas poliméricas biodegradables que comprenden además un agente terapéutico de acuerdo con esta invención pueden producirse mediante un proceso que comprende:

a. homogeneizar un agente terapéutico con las nanopartículas poliméricas biodegradables descritas anteriormente en un disolvente orgánico para obtener una emulsión primaria;

b. emulsionar adicionalmente la emulsión primaria de la etapa (a) en una fase acuosa para obtener una emulsión secundaria; y

c. agitar la segunda emulsión para obtener las nanopartículas poliméricas que además comprenden un agente terapéutico.

En una realización, el proceso comprende opcionalmente las etapas de lavar las nanopartículas poliméricas biodegradables que comprenden el agente terapéutico con agua y secar las nanopartículas poliméricas biodegradables.

En algunas realizaciones, el proceso comprende la incorporación de un agente terapéutico seleccionado de un grupo que consiste en pequeñas moléculas orgánicas, ácidos nucleicos, polinucleótidos, oligonucleótidos, nucleósidos, ADN, ARN, aminoácidos, péptidos, proteínas, antibióticos, moléculas de bajo peso molecular, quimioterapéuticos, fármacos, iones metálicos, colorantes, radioisótopos, agentes de contraste y agentes de formación de imágenes. En una realización adicional, el agente terapéutico es un péptido anticancerígeno, en el que el péptido anticancerígeno es FSRSLHSLL o cualquier polipéptido que incorpore sustancialmente el FSRSLHSLL, y en el que el FSRSLHSLL está en la configuración D o L. En una realización específica, el péptido anticancerígeno se modifica químicamente con un polímero hidrófobo. Una realización es el péptido anticancerígeno FSRSLHSLL modificado químicamente con poli(ácido láctico).

En otras realizaciones, el péptido anticancerígeno es una secuencia o una secuencia modificada del dominio MUC1-CD tal como CQCRRKN o AQARRKN.

En otras realizaciones, el péptido anticancerígeno que comprende una secuencia o una secuencia modificada del MUC1-CD puede estar unido a un dominio de transducción de proteínas tal como poliarginina. En algunas realizaciones, la poliarginina está compuesta de nueve residuos de arginina.

En otras realizaciones, los agentes terapéuticos son quimioterapéuticos que incluyen, pero no se limitan a, paclitaxel, doxorrubicina, pimozida, perimetamina, indenoisoquinolinas o nor-indenoisoquinolinas.

Una nanopartícula de polímero que comprende un copolímero de tetrabloque PLA-PEG-PPG-PEG, en el que las nanopartículas poliméricas biodegradables comprenden además un agente terapéutico libre o modificado, de acuerdo con la invención puede producirse mediante un proceso que comprende:

a. homogeneizar el agente terapéutico con las nanopartículas poliméricas biodegradables de copolímero de tetrabloque PLA-PEG-PPG-PEG en un disolvente orgánico para obtener una emulsión primaria;

b. emulsionar adicionalmente la emulsión primaria de la etapa (a) en una fase acuosa para obtener una emulsión secundaria; y

c. agitar la emulsión secundaria para obtener las nanopartículas poliméricas biodegradables de PLA-PEG-PPG-PEG que comprenden el agente terapéutico libre o modificado. En una realización, el peso molecular de PLA está en el intervalo de aproximadamente 3.000 g/mol a 10.000 g/mol. En otra realización, el peso molecular de PLA está en el intervalo de aproximadamente 4.000 g/mol a 90.000 g/mol.

En algunas realizaciones, el peso molecular del copolímero de bloque hidrófilo-hidrófobo PEG-PPG-PEG está en el intervalo de aproximadamente 4.000 g/mol a 15.000 g/mol.

En una realización adicional, el agente terapéutico está unido covalentemente a un polímero hidrófobo. En una realización, el agente terapéutico está unido covalentemente a poli(ácido láctico).

Otro aspecto de la invención que se proporciona en el presente documento son las nanopartículas poliméricas biodegradables del copolímero de bloques PLA-PEG-PPG-PEG obtenido por los procesos descritos en la presente solicitud.

Otro aspecto es un procedimiento para tratar la enfermedad que comprende administrar nanopartículas poliméricas biodegradables de PLA-PEG-PPG-PEG que además comprende al menos un agente terapéutico, a un sujeto que lo necesite.

En algunas realizaciones, la enfermedad es cáncer y el agente terapéutico es un péptido anticancerígeno o un quimioterapéutico. En algunas realizaciones, el cáncer es cáncer de mama, y el péptido anticancerígeno es una secuencia o secuencia modificada del dominio MUC1-CD tal como CQCRRKN o Aq Ar RKN.

En otras realizaciones, el péptido anticancerígeno que comprende una secuencia o una secuencia modificada del MUC1-CD se puede unir a un dominio de transducción de proteínas tal como poliarginina. En algunas realizaciones, la poliarginina está compuesta de nueve residuos de arginina.

En una realización particular, la enfermedad es diabetes y el agente terapéutico es insulina.

Un aspecto adicional de la presente invención es una composición farmacéutica que comprende una nanopartícula polimérica biodegradable de la presente invención, y al menos un vehículo farmacéuticamente aceptable.

En una realización, la composición farmacéutica es adecuada para suministro en un sujeto mediante inyección intravenosa, inyección intramuscular o vías orales.

Un aspecto adicional es un copolímero de bloques que consiste esencialmente en un segmento de poli(ácido láctico) (PLA) y un segmento de poli(etilenglicol)-poli(propilenglicol)-poli(etilenglicol) (PEG-PPG- PEG).

Otro aspecto es un conjugado que comprende un agente terapéutico unido covalentemente a un polímero hidrófobo. En algunas realizaciones, el agente terapéutico está unido covalentemente a poli(ácido láctico). En algunas realizaciones, el agente terapéutico se selecciona del grupo que consiste en un péptido, proteína y polipéptido.

Otro aspecto proporcionado en el presente documento es el proceso para preparar un conjugado que comprende un agente terapéutico unido covalentemente a poli(ácido láctico), en el que el proceso comprende la reacción del agente terapéutico y poli(ácido láctico) en presencia de un agente de acoplamiento de carbodiimida y un derivado hidroxilado.

Un aspecto adicional es un procedimiento para tratar una enfermedad que comprende administrar nanopartículas poliméricas biodegradables de PLA-PEG-PPG-PEG que además comprende al menos un agente terapéutico unido covalentemente a poli(ácido láctico), a un sujeto que lo necesite.

Breve descripción de las figuras

Las siguientes figuras forman parte de la presente memoria descriptiva y se incluyen para ilustrar adicionalmente aspectos de la presente invención. La invención puede entenderse mejor por referencia a las figuras en combinación con la descripción detallada de las realizaciones específicas presentadas en el presente documento.

La Figura 1 proporciona el diagrama esquemático de las nanopartículas poliméricas del copolímero de bloques PLA-PEG-PPG-PEG.

La Figura 2 proporciona espectros de FTIR de nanopartículas de PLA, PEG-PPG-PEG y PLA-PEG-PPG-PEG. La Figura 3A muestra los espectros de Resonancia Magnética Nuclear (RMN) de nanopartículas de PLA-PEG-PPG-PEG sintetizadas a partir de un copolímero de bloque de PEG-PPG-PEG de 1.100 g/mol.

La Figura 3B muestra los espectros de Resonancia Magnética Nuclear (RMN) de nanopartículas de PLA-PEG-PPG-PEG sintetizadas a partir de un copolímero de bloque de PEG-PPG-PEG de 4.400 g/mol.

La Figura 3C muestra los espectros de Resonancia Magnética Nuclear (RMN) de nanopartículas de PLA-PEG-PPG-PEG sintetizadas a partir de un copolímero de bloque de PEG-PPG-PEG de 8.400 g/mol.

Las Figuras 4A y B muestran imágenes de Micrografía Electrónica de Transmisión (TEM) de nanopartículas poliméricas de PLA-PEG-PPG-PEG.

Las Figuras 5A, B y C muestran la internalización celular de nanopartículas de PLA-PEG-PPG-PEG que encapsulan el colorante fluorescente, Rodamina B en células MCF-7.

La Figura 6A muestra la liberación in vitro de L-PLBCL2P9 encapsulado a lo largo del tiempo de las nanopartículas de PLA-PEG-PPG-PEG sintetizadas usando diferentes copolímeros a 25 °C.

La Figura 6B muestra la eficacia de las nanopartículas de PLA-PEG-PPG-PEG sintetizadas usando diferentes copolímeros de bloque cargados con el fármaco L-PLBCL2P9 para su liberación y proliferación celular en la línea celular MCF-7.

La Figura 7A muestra la eficacia del péptido anticancerígeno, nanopartículas de PLA-PEG-PPG-PEG cargadas con L-PLBCL2P9 en la línea celular primaria HUVEC.

La Figura 7B muestra la eficacia del suministro de las nanopartículas de PLA-PEG-PPG-PEG cargadas con péptido anticancerígeno L-PLBCL2P9, en comparación con el suministro de fármacos usando el péptido de penetración celular (CPP) en la proliferación de células MCF-7.

La Figura 8A muestra hemoglobina en ratones BALB/c tratados con nanopartículas puras de PLA-PEG-PPG-PEG a una dosis de 150 mg/kg de peso corporal.

La Figura 8B muestra el recuento de neutrófilos y linfocitos en ratones BALB/c tratados con nanopartículas puras de PLA-PEG-PPG-PEG a una dosis de 150 mg/kg de peso corporal.

La Figura 8C muestra el volumen celular empaquetado, MCV (Volumen Corpuscular Medio), MCH (Hemoglobina Corpuscular Media) y MCHC (Concentración de hemoglobina corpuscular media), en ratones BALB/c tratados con nanopartículas puras de PLA-PEG-PPG-PEG a una dosis de 150 mg/kg de peso corporal.

La Figura 9A muestra los niveles de aspartato transaminasa y alanina transaminasa en ratones BALB/c tratados con nanopartículas puras de PLA-PEG-PPG-PEG a una dosis de 150 mg/kg de peso corporal.

La Figura 9B muestra los niveles de fosfatasa alcalina en ratones BALB/c tratados con nanopartículas puras de PLA-PEG-PPG-PEG a una dosis de 150 mg/kg de peso corporal.

La Figura 9C muestra los niveles de urea y nitrógeno ureico en sangre (BUN) en ratones BALB/c tratados con nanopartículas puras de PLA-PEG-PPG-PEG a una dosis de 150 mg/kg de peso corporal.

La Figura 10 muestra la histopatología del cerebro, corazón, hígado, bazo, riñón y pulmón de ratones BALB/c inyectados con nanopartículas puras de PLA-PEG-PPG-PEG.

Las Figuras 11A y B muestran la regresión tumoral en ratones con Tumor de Ascitis de Ehrlich (EAT) tratados con nanopartículas de PLA-PEG-PPG-PEG con L-PLBCL2P9 encapsulado (8.800 g/mol).

La Figura 12A muestra ratones con Tumor de Ascitis de Ehrlich (EAT) en el día 1.

La Figura 12B muestra la supresión del crecimiento tumoral en ratones EAT tratados con nanopartículas de PLA-PEG-PPG-PEG con PL-BCl2p 9 encapsulado (8.800 g/mol) en el día 21.

La Figura 12C muestra ratones de control no tratados en el día 21.

La Figura 13 muestra la eficacia de las nanopartículas de PLA-PEG-PPG-PEG cargadas con insulina para controlar los niveles de glucosa en sangre en conejos diabéticos.

La Figura 14 muestra los datos de liberación de un péptido con dominio citoplasmático MUC1 unido a una secuencia de poliarginina (RRRRRRRRRCQCRRKN) de nanopartículas de PLA-pEG-PPG-PEG.

Descripción detallada de la invención

Las nanopartículas se pueden producir como nanocápsulas o nanoesferas. La carga de proteínas en la nanopartícula puede llevarse a cabo mediante el proceso de adsorción o el proceso de encapsulación (Spada et al., 2011; Protein delivery of polymeric nanoparticles; World Academy of Science, Engineering and Technology: 76). Las nanopartículas, mediante el uso de estrategias de focalización tanto pasivas como activas, pueden mejorar la concentración intracelular de fármacos en las células cancerosas al tiempo que evitan la toxicidad en las células normales. Cuando las nanopartículas se unen a receptores específicos y entran a la célula, generalmente están envueltas por endosomas a través de endocitosis mediada por receptores, evitando así el reconocimiento de la glucoproteína P, uno de los principales mecanismos de resistencia a los medicamentos (Cho et al., 2008, Therapeutic Nanoparticles for Drug Delivery in Cancer, Clin. Cancer Res., 2008, 14: 1310-1316). Las nanopartículas se eliminan del cuerpo mediante opsonización y fagocitosis (Sosnik et al., 2008; Polymeric Nanocarriers: New Endeavors for the Optimization of the Technological Aspects of Drugs; Recent Patents on Biomedical Engineering, 1: 43-59). Los sistemas basados en nanoportadores se pueden usar para el suministro efectivo de medicamentos con las ventajas de una penetración intracelular mejorada, suministro localizado, protección de medicamentos contra la degradación prematura, perfil farmacocinético controlado y de distribución del fármaco en el tejido, menor requerimiento de dosis y rentabilidad (Farokhzad OC, Cheng J, Teply BA, Sherifi I, Jon S, Kantoff PW; Targeted nanoparticle-aptamer bioconjugates for cancer Chemotherapy in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2006,103 (16): 6315-20; Fonseca C, Simoes S, Gaspar RE, Paclitaxel-loaded p LGa nanoparticles: preparation, physicochemical characterization and in vitro anti-tumoral activity. J. Controlled Release 2002; 83 (2): 273-86; Hood et al., Nanomedicine, 2011, 6(7): 1257-1272).

La absorción de nanopartículas es indirectamente proporcional a sus pequeñas dimensiones. Debido a su pequeño tamaño, se ha descubierto que las nanopartículas poliméricas evaden el reconocimiento y la absorción por el sistema retículo-endotelial (RES) y, por lo tanto, pueden circular en la sangre durante un período prolongado (Borchard et al., 1996, Pharm. Res. 7: 1055-1058). Las nanopartículas también pueden extravasarse en el sitio patológico como la vasculatura permeable de un tumor sólido, proporcionando un mecanismo de direccionamiento pasivo. Debido a la mayor área de superficie que conduce a tasas de solubilización más rápidas, las estructuras de tamaño nanométrico generalmente muestran mayores concentraciones plasmáticas y valores de área bajo la curva (AUC). Un tamaño de partícula más pequeño ayuda a evadir el mecanismo de defensa del huésped y aumenta el tiempo de circulación en sangre. El tamaño de las nanopartículas afecta la liberación del fármaco. Las partículas más grandes tienen una difusión más lenta de los fármacos en el sistema. Las partículas más pequeñas ofrecen un área de superficie más grande pero conducen a una liberación rápida del fármaco. Las partículas más pequeñas tienden a agregarse durante el almacenamiento y el transporte de dispersiones de nanopartículas. Por lo tanto, se desea un compromiso entre un tamaño pequeño y la máxima estabilidad de las nanopartículas. El tamaño de las nanopartículas utilizadas en un sistema de administración de fármacos debe ser lo suficientemente grande como para evitar su fuga rápida en los capilares sanguíneos, pero lo suficientemente pequeño como para escapar de la captura de macrófagos fijos alojados en el sistema reticuloendotelial, tal como el hígado y el bazo.

Además de su tamaño, las características superficiales de las nanopartículas también son un factor importante para determinar la vida útil y el destino durante la circulación. Las nanopartículas deberían idealmente tener una superficie hidrofílica para escapar de la captura de macrófagos. Las nanopartículas formadas a partir de copolímeros de bloque con dominios hidrófilos e hidrófobos cumplen estos criterios. La degradación controlada del polímero también permite mayores niveles de suministro del agente a un estado de enfermedad. La degradación del polímero también puede verse afectada por el tamaño de partícula. Las tasas de degradación aumentan con el aumento del tamaño de partícula in vitro (Biopolymeric Nanoparticles; Sundar et al., 2010, Science and Technology of Advanced Materials; doi: 10.1088/1468-6996/11/1/014104).

El poli(ácido láctico) (PLA) ha sido aprobado por la FDA de Estados Unidos, para aplicaciones en ingeniería de tejidos, materiales médicos y portadores de fármacos y se conocen en la técnica sistemas de suministro de fármacos basados en poli(ácido láctico)-poli(etilenglicol) PLA-PEG. El documento US2006/0165987A1 describe una nanoesfera polimérica biodegradable clandestina que comprende copolímeros de multibloque de poli(éster)-poli(etileno) y componentes opcionales para impartir rigidez a las nanoesferas e incorporar compuestos farmacéuticos. El documento US2008/0081075A1 divulga una nueva estructura de micelas mixtas con un núcleo interno funcional y cubiertas externas hidrófilas, autoensambladas a partir de una macromolécula de injerto y uno o más copolímeros de bloque. El documento US2010/0004398A1 describe una nanopartícula polimérica de configuración de cubierta/núcleo con una región de interfase y un proceso para producir la misma.

Sin embargo, estas nanopartículas poliméricas requieren esencialmente el uso de aproximadamente 1% a 2% de emulsionante para la estabilidad de las nanopartículas. Los emulsionantes estabilizan las partículas dispersas en un medio. PVA, PEG, Tween 80 y Tween 20 son algunos de los emulsionantes comunes. Sin embargo, el uso de emulsionantes es un motivo de preocupación para las aplicaciones in vivo, ya que la lixiviación de los emulsionantes puede ser tóxica para el sujeto (Safety Assessment on polyethylene glycols (PEGS) and their derivatives as used in cosmetic products, Toxicology, octubre 15 de 2005; 214 (1-2): 1-38). El uso de emulsionante también aumenta la masa de la nanopartícula, reduciendo así la carga del fármaco, lo que lleva a mayores requisitos de dosificación. Otras desventajas que aún prevalecen en los sistemas de transporte de fármacos en nanopartículas son la escasa biodisponibilidad oral, la inestabilidad en circulación, la distribución inadecuada en el tejido y la toxicidad. Existe una gran necesidad de un sistema de suministro que pueda suministrar efectivamente agentes terapéuticos que incluyan péptidos terapéuticos en el citosol de las células cancerosas sin las desventajas presentadas anteriormente.

En el presente documento se proporcionan sistemas de suministro terapéutico eficaces que comprenden nanopartículas poliméricas, no tóxicas, biodegradables, con un tamaño ajustable y que aumentan la semivida del fármaco in vivo. Los expertos en la materia sabrán que la invención descrita en el presente documento está sujeta a variaciones y modificaciones distintas de las descritas específicamente. Debe entenderse que la invención descrita en el presente documento incluye todas esas variaciones y modificaciones. La invención también incluye todos las etapas, características, composiciones y compuestos mencionados o indicados en esta memoria descriptiva, individual o colectivamente, y cualquiera y todas las combinaciones de cualesquiera dos o más de dichas etapas o características.

Definiciones

Por conveniencia, antes de una descripción adicional de la presente invención, en el presente documento se recopilan ciertos términos empleados en la memoria descriptiva, ejemplos y reivindicaciones adjuntas. Estas definiciones deben leerse a la luz del resto de la divulgación y ser entendidas por un experto en la materia. A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos que se usan en el presente documento tienen el mismo significado que comúnmente entiende una persona de habilidad ordinaria en la técnica. Los términos utilizados a lo largo de esta memoria descriptiva se definen como sigue, a menos que se limite de otra manera en casos específicos.

Los artículos "un", "uno, una" y "el, la" se usan para referirse a uno o más de uno (es decir, a al menos uno) del objeto gramatical del artículo.

Los términos "comprenden", "que comprende", "que incluye", "que contiene", "caracterizado por" y equivalentes gramaticales de los mismos se usan en el sentido inclusivo y abierto, lo que significa que pueden incluirse elementos adicionales. No pretende ser interpretado como "consiste solo en".

Como se usa en el presente documento, "que consiste en" y su equivalente gramatical excluye cualquier elemento, etapa o ingrediente no especificado en la reivindicación.

Como se usa en el presente documento, el término "alrededor de" o "aproximadamente" generalmente significa dentro del 20 %, más preferiblemente dentro del 10 %, y lo más preferiblemente aún dentro del 5 % de un valor o intervalo dado.

El término "biodegradable", como se usa en el presente documento, se refiere tanto a rompimiento como a degradación enzimática y no enzimática de la estructura polimérica.

Como se usa en el presente documento, el término "nanopartícula" se refiere a partículas en el intervalo de 10 nm a 1000 nm de diámetro, en el que el diámetro se refiere al diámetro de una esfera perfecta que tiene el mismo volumen que la partícula. El término "nanopartícula" se usa indistintamente como "nanopartícula" o "nanopartículas". En algunos casos, el diámetro de la partícula está en el intervalo de aproximadamente 1-1000 nm, 10-500 nm o 30-120 nm.

En algunos casos, puede estar presente una población de partículas. Como se usa en este documento, el diámetro de las nanopartículas es un promedio de una distribución en una población particular.

Como se usa en el presente documento, el término "polímero" tiene su significado ordinario como se usa en la técnica, es decir, una estructura molecular que comprende una o más unidades repetidas (monómeros), conectadas por enlaces covalentes. Las unidades repetidas pueden ser todas idénticas, o en algunos casos, puede haber más de un tipo de unidad repetida presente dentro del polímero.

El término "ácido nucleico" se refiere a polinucleótidos tales como ácido desoxirribonucleico (ADN), ácido ribonucleico (ARN), sus variantes y derivados de los mismos.

Como se usa en el presente documento, el término "agente terapéutico" y "fármaco" se usan indistintamente y también pretenden abarcar no solo compuestos o especies que son inherentemente farmacéutica o biológicamente activas, sino también materiales que incluyen uno o más de estos compuestos activos o especies, así como conjugaciones, modificaciones y fragmentos farmacológicamente activos, y derivados de anticuerpos de los mismos.

Una "fracción de direccionamiento" o "agente de direccionamiento" es una molécula que se unirá selectivamente a la superficie de células seleccionadas. Por ejemplo, la fracción de direccionamiento puede ser un ligando que se une al receptor de la superficie celular que se encuentra en un tipo particular de célula o que se expresa con mayor frecuencia en las células objetivo que en otras células.

El agente de direccionamiento, o agente terapéutico puede ser un péptido o proteína. "Proteínas" y "péptidos" son términos bien conocidos en la técnica, y tal como se usan en el presente documento, estos términos tienen su significado ordinario en la técnica. En general, los péptidos son secuencias de aminoácidos de menos de aproximadamente 100 aminoácidos de longitud, pero pueden incluir hasta 300 aminoácidos. Las proteínas generalmente se consideran moléculas de al menos 100 aminoácidos. Los aminoácidos pueden estar en configuración D o L. Una proteína puede ser, por ejemplo, un fármaco proteico, un anticuerpo, un anticuerpo recombinante, una proteína recombinante, una enzima o similares. En algunos casos, uno o más de los aminoácidos del péptido o proteína se pueden modificar, por ejemplo, mediante la adición de una entidad química como un grupo carbohidrato, un grupo fosfato, un grupo farnesilo, un grupo isofarnesilo, un grupo ácido graso, un conector para la conjugación, funcionalización u otra modificación, tal como ciclación, ciclación secundaria y cualquiera de las numerosas modificaciones destinadas a conferir propiedades más ventajosas a péptidos y proteínas. En otros casos, uno o más de los aminoácidos del péptido o proteína se pueden modificar mediante sustitución con uno o más aminoácidos que no se producen de forma natural. Los péptidos o proteínas pueden seleccionarse de una biblioteca combinatoria tal como una biblioteca de fagos, una biblioteca de levaduras o una biblioteca combinatoria in vitro.

Como se usa en el presente documento, el término "anticuerpo" se refiere a cualquier molécula que incorpora una secuencia de aminoácidos o molécula con similitud estructural secundaria o terciaria que confiere afinidad de unión a un antígeno dado que es similar o mayor a la afinidad de unión mostrada por una región variable de inmunoglobulina que contiene moléculas de cualquier especie. El término anticuerpo incluye, sin limitación, anticuerpos nativos que consisten en dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras; moléculas de unión derivadas de fragmentos de una cadena ligera, una cadena pesada o ambos, fragmentos de dominio variable, anticuerpos de cadena pesada o cadena ligera solamente, o cualquier combinación modificada de estos dominios, ya sea monoespecífica o biespecífica, y si se conjuga o no a una segunda fracción diagnóstica o terapéutica tal como un agente de formación de imágenes o una molécula quimioterapéutica. El término incluye, sin limitación, fracciones de unión derivadas de la región variable de inmunoglobulina derivados de una especie de murino, rata, conejo, cabra, llama, camello, humano o cualquier otro vertebrado. El término se refiere a cualquier fracción de unión a la región variable de inmunoglobulina independientemente del procedimiento de descubrimiento (derivado de hibridoma, humanizado, derivado de fagos, derivado de levadura, derivado de presentación combinatoria o cualquier procedimiento de derivación similar conocido en la técnica), o procedimiento de producción (bacteriano, de levadura, cultivo de células de mamífero, o animal transgénico, o cualquier procedimiento de producción similar conocido en la técnica).

La presente invención proporciona una nanopartícula polimérica biodegradable, segura no tóxica y elaborada de un copolímero de bloque y un proceso para su preparación. Las nanopartículas poliméricas biodegradables de la presente invención están formadas por un copolímero de bloque que consiste esencialmente en poli(ácido láctico) (PLA) modificado químicamente con un copolímero de bloque hidrófilo-hidrófobo, en el que dicho copolímero de bloque hidrófilo-hidrófobo se selecciona de poli(metacrilato de metilo)-poli(ácido metilacrílico) (PMMA-PMAA), poli(estireno)-poli(ácido acrílico) (PS-PAA), poli(ácido acrílico)-poli(vinilpiridina) (PAA-PVP), poli(ácido acrílico)-poli(metacrilato de N,N-dimetilaminoetilo) (pAa -PDMAEMA), poli(etilenglicol)-poli(butilenglicol) (PEG-PBG) y poli(etilenglicol)-poli(propilenglicol)-poli(etilenglicol) (PEG-PPG-PEG).

La presente invención proporciona un proceso para preparar la nanopartícula polimérica biodegradable de la presente invención. La nanopartícula resultante no solo es no tóxica, segura y biodegradable, sino que es estable in vivo, tiene una alta estabilidad de almacenamiento y puede usarse de manera segura en un sistema de transporte de nanoportadores o medicamentos en el campo de la medicina. De hecho, las nanopartículas de la presente invención aumentan la semivida del fármaco o agente terapéutico suministrable in vivo. La presente invención también proporciona un proceso para la carga eficiente de fármacos en una nanopartícula polimérica biodegradable para formar un sistema de transporte de fármacos eficaz y dirigido que evita la degradación prematura de los agentes activos y tiene un gran potencial para su uso en la terapia contra el cáncer.

También se proporciona una composición que comprende la nanopartícula polimérica biodegradable para uso en medicina y en otros campos que emplean un sistema portador o un recipiente o depósito de nanopartículas. Las nanopartículas de la presente invención pueden usarse ampliamente en composiciones para pronóstico, terapéuticas, diagnósticas o teranósticas. Adecuadamente, las nanopartículas de la presente invención se usan para el suministro de fármacos y agentes, así como para el diagnóstico de enfermedades y la obtención de imágenes médicas en humanos y animales. Por lo tanto, la presente invención proporciona un procedimiento para el tratamiento de enfermedades usando las nanopartículas que además comprende un agente terapéutico como se describe en el presente documento. Las nanopartículas de la presente invención también pueden usarse en otras aplicaciones tales como reacciones químicas o biológicas en la que se requiere un recipiente o depósito, tal como biosensores, como agentes para enzimas inmovilizadas y similares.

Se obtuvieron resultados inesperados y sorprendentes cuando los presentes inventores intentaron producir nanopartículas poliméricas biodegradables sin el uso de ningún emulsionante o estabilizador. Las nanopartículas poliméricas biodegradables así obtenidas por el proceso son seguras, estables y no tóxicas. En una realización, el copolímero de bloque de PEG-PPG-PEG se une covalentemente a la matriz de ácido poliláctico (PLA), dando como resultado que el copolímero de bloque se convierta en una parte de la matriz, es decir, el sistema de suministro de nanopartículas. Por el contrario, en la técnica anterior, el emulsionante (por ejemplo, PEG-PPG-PEG) no forma parte de la matriz de nanopartículas y, por lo tanto, se lixivia (Figura 1). A diferencia de las nanopartículas de la técnica anterior, no hay lixiviación del emulsionante al medio de las nanopartículas proporcionadas en el presente documento.

Las nanopartículas obtenidas por el presente proceso no son tóxicas y son seguras debido a la ausencia de emulsionantes añadidos, que pueden lixiviarse in vivo. La ausencia o cantidad reducida de emulsionante también conduce a nanopartículas con una mayor proporción de fármaco con respecto al polímero. Estas nanopartículas tienen una mayor estabilidad y una mayor vida útil en almacenamiento en comparación con las nanopartículas poliméricas presentes en la técnica. Las nanopartículas poliméricas de la presente invención están preparadas para ser biodegradables de modo que los productos de degradación puedan excretarse fácilmente del cuerpo. La degradación también proporciona un procedimiento por el cual los contenidos encapsulados en la nanopartícula pueden liberarse en un sitio dentro del cuerpo.

El poli(ácido láctico) (PLA) es un polímero hidrófobo, y es el polímero preferido para la síntesis de las nanopartículas poliméricas de la presente invención. Sin embargo, también se pueden usar poli(ácido glicólico) (PGA) y copolímero de bloque de ácido poliláctico-ácido co-glicólico (PLGA). El polímero hidrófobo también puede derivarse biológicamente o ser un biopolímero.

El peso molecular del PLA usado está generalmente en el intervalo de aproximadamente 4.000 g/mol a 90.000 g/mol. El peso molecular promedio de PLA también puede ser de aproximadamente 60.000 g/mol.

Los copolímeros de bloque como poli(etilenglicol)-poli(propilenglicol)-poli(etilenglicol) (PEG-PPG-PEG), poli(metacrilato de metilo)-poli(ácido metilacrílico) (PMMA-PMAA), poli(estireno)-poli(ácido acrílico) (PS-PAA), poli(ácido acrílico)-poli(vinilpiridina) (PAA-PVP), poli(ácido acrílico)-poli(metacrilato de N,N-dimetilaminoetilo) (PAA-PDMAEMA), poli(etilenglicol)-poli(butilenglicol) (PEG-PBG) y PG-p R (poliglicerol (PG) y sus copolímeros con poliéster (PR) que incluyen ácido adípico, ácido pimélico y ácido sebácico) son copolímeros hidrofílicos o hidrofílicoshidrofóbicos que se pueden usar en la presente invención e incluyen copolímeros de bloque de tipo ABA tales como PEG-PPG-PEG, copolímeros de bloque BAB tales como PPG-PEG-PPG, copolímeros multibloque alternantes de tipo (AB)n y copolímeros multibloque aleatorios. Los copolímeros de bloque pueden tener dos, tres o más números de bloques distintos. El PEG es un componente preferido ya que imparte hidrofilia, antifagocitosis contra macrófagos y resistencia al reconocimiento inmunológico.

En algunas realizaciones, el peso molecular promedio (Mn) del copolímero de bloque hidrófilo-hidrófobo está generalmente en el intervalo de 1.000 a 20.000 g/mol. En una realización adicional, el peso molecular promedio (Mn) del copolímero de bloque hidrófilo-hidrófobo es de aproximadamente 4.000 g/mol a 15.000 g/mol. En algunos casos, el peso molecular promedio (Mn) del copolímero de bloque hidrófilo-hidrófobo es 4.400 g/mol, 8.400 g/mol, o 14.600 g/mol.

Un copolímero de bloques de la presente invención puede consistir esencialmente en un segmento de poli(ácido láctico) (PLA) y un segmento de poli(etilenglicol)-poli(propilenglicol)-poli(etilenglicol) (PEG-PPG -PEG).

Una nanopartícula polimérica biodegradable específica de la presente invención está formada por el copolímero de bloque de poli(ácido láctico)-poli(etilenglicol)-poli(propilenglicol)-poli(etilenglicol) (PLA-PEG-PPG-PEG).

Otra nanopartícula polimérica biodegradable específica de la presente invención está formada por el copolímero de bloque de poli(ácido láctico)-poli(etilenglicol)-poli(propilenglicol)-poli(etilenglicol)-poli(ácido láctico) (PLA-PEG-PPG-PEG-PLA).

Los polímeros biodegradables de la presente invención pueden formarse modificando químicamente PLA con un copolímero de bloque hidrófilo-hidrófobo usando un enlace covalente.

Las nanopartículas poliméricas biodegradables de la presente invención tienen un tamaño en el intervalo de aproximadamente 30-120 nm.

En una realización, el polímero biodegradable de la presente invención está sustancialmente libre de emulsionante, o puede comprender un emulsionante externo en una cantidad de aproximadamente 0,5 % a 5 % en peso.

En una realización, la nanopartícula polimérica biodegradable de la presente invención es PLA-PEG-PPG-PEG, y el peso molecular promedio del bloque de poli(ácido láctico) es de aproximadamente 60.000 g/mol, el peso promedio del bloque de PEG-PPG-PEG es de aproximadamente 8.400 o aproximadamente 14.600 g/mol, y el emulsionante externo es de aproximadamente 0,5 % a 5 % en peso.

En otra realización, la nanopartícula polimérica biodegradable de la presente invención es PLA-PEG-PPG-PEG, y el peso molecular promedio del bloque de poli(ácido láctico) es menor o igual a aproximadamente 16.000 g/mol, el peso promedio del bloque de PEG-PPG-PEG es de aproximadamente 8.400 g/mol o de aproximadamente 14.600 g/mol, y en el que la composición está sustancialmente libre de emulsionante.

En la presente invención, los disolventes orgánicos útiles en la preparación de las nanopartículas preparadas en el presente documento son adecuadamente acetonitrilo (C2H3N), dimetilformamida (DMF; C3H7NO), acetona ((CH3)2 CO) y diclorometano (CH2Ch).

El proceso para preparar nanopartículas poliméricas biodegradables de la presente invención comprende disolver poli(ácido láctico) (PLA) y un copolímero de bloque hidrófilo-hidrófobo en un disolvente orgánico para obtener una solución; añadir un agente de acoplamiento de carbodiimida y una base a la solución para obtener una mezcla de reacción; agitar la mezcla de reacción para obtener un copolímero de bloque de PLA modificado químicamente con el copolímero de bloque hidrófilo-hidrófobo; disolver el copolímero de bloque de la etapa anterior en disolvente orgánico y homogeneizar para obtener una mezcla homogeneizada; añadiendo la mezcla homogeneizada a una fase acuosa para obtener una emulsión; y agitar la emulsión para obtener las nanopartículas poliméricas.

Los agentes de acoplamiento de carbodiimida son bien conocidos en la técnica. Los agentes de acoplamiento de carbodiimida adecuados incluyen, pero no se limitan a, N,N-diciclohexilcarbodiimida (DCC), N-(3-dietilaminopropil)-N-etilcarbodiimida (EDC) y N,N-diisopropilcarbodiimida.

La reacción de acoplamiento se lleva a cabo habitualmente en presencia de catalizadores y/o bases auxiliares tales como trialquilaminas, piridina o 4-dimetilamino piridina (DMAP).

La reacción de acoplamiento también puede llevarse a cabo en combinación con un derivado hidroxilado, tal como N-hidroxisuccinimida (NHS). Otros derivados hidroxilados incluyen, pero no se limitan a, 1-hidroxibenzotriazol (HOBt), 1-hidroxi-7-azabenzotriazol (HOAt), 6-cloro-1-hidroxibenzotriazol (Cl-HOBt).

El proceso descrito anteriormente puede comprender opcionalmente las etapas adicionales de lavar las nanopartículas poliméricas biodegradables con agua y secar las nanopartículas poliméricas biodegradables poliméricas. El proceso también puede comprender opcionalmente una primera etapa de adición de emulsionante. Las nanopartículas resultantes de este proceso pueden tener un tamaño en el intervalo de 30-120 nm.

En un proceso específico, el PLA y el copolímero, PEG-PPG-PEG, se disuelven en un disolvente orgánico para obtener una solución polimérica. A esta solución, se agrega N,N-diciclohexilcarbodiimida (DCC) seguido de 4-dimetilaminopiridina (DMAP) de -4 °C a 0 °C. Se deja agitar la solución de 250 a 300 rpm a una temperatura baja que varía de -4 °C a 0 °C durante 20 a 28 horas. Las nanopartículas de PLA-PEG-PPG-PEG tienen PLA unido covalentemente a PEG-PPG-PEG para formar una matriz de PLA-PEG-PPG-PEG. Las nanopartículas son precipitadas por un disolvente orgánico tal como éter dietílico, metanol o etanol y se separan de la solución por procedimientos convencionales en la técnica que incluyen filtración, ultracentrifugación o ultrafiltración. Las nanopartículas se almacenan a una temperatura que oscila entre 2 °C y 8 °C.

El proceso de la presente invención proporciona la ventaja adicional de no requerir etapas adicionales de congelación o el uso de proteínas señuelo ya que no se usan ninguno, o una cantidad mínima, de emulsionantes en el proceso. La presente invención se lleva a cabo fácilmente en condiciones de temperatura ambiente de 25 °C-30 °C y no requiere un cizallamiento excesivo para obtener el tamaño de partícula pequeño deseado.

Se proporciona un espectro de FTIR de un ejemplo de nanopartículas de la presente invención en la Figura 2. Los espectros de RMN de las nanopartículas se proporcionan en las Figuras 3A, 3B y 3C. La nanopartícula tiene una configuración sustancialmente esférica como se muestra en las imágenes de TEM de las Figuras 4A y 4B, sin embargo, las nanopartículas pueden adoptar una configuración no esférica al hincharse o encogerse. La nanopartícula es de naturaleza anfifílica. El potencial zeta y el PDI (Índice de Polidispersidad) de las nanopartículas se proporcionan en la Tabla 2. La estabilidad de almacenamiento de las nanopartículas de la presente invención es mejor en comparación con los sistemas basados en emulsionantes convencionales ya que no hay adición de ningún emulsionante libre al proceso y el copolímero de bloques que comprende la fracción PEG está unido covalentemente en la matriz global de PLA-PEG-PPG-PEG. La vida útil en almacenamiento de la nanopartícula varía de 6 a 18 meses.

Las nanopartículas de la presente invención tienen dimensiones que varían de 30-120 nm de acuerdo con la medición usando un Microscopio Electrónico de Transmisión (Figura 4). En realizaciones adecuadas, el diámetro de las nanopartículas de la presente invención será menor que 200 nm de diámetro, y más adecuadamente menor que aproximadamente 100 nm de diámetro. En ciertas de tales realizaciones, las nanopartículas de la presente invención estarán en el intervalo de aproximadamente 10 a 200 nm, en el intervalo de aproximadamente 20 a 150 nm, o en el intervalo de aproximadamente 30 a 120 nm de diámetro.

Las nanopartículas de la presente invención son capaces de suministrar agentes o entidades activas a sitios específicos (Figura 5). El tamaño de partícula y las propiedades de liberación de la nanopartícula de PLA-PEG-PPG-PEG de la presente invención pueden controlarse variando el peso molecular del PLA o de PEG-PPG-PEG en la matriz polimérica. La liberación del agente o entidad activa puede controlarse de 12 horas a 60 días, lo cual es una mejora con respecto a los sistemas de PLA-PEG convencionales disponibles en la técnica (Figuras 6A). La capacidad de carga del fármaco de la nanopartícula también se puede controlar variando el peso molecular promedio del copolímero de bloque en la matriz polimérica de las nanopartículas. Hay un aumento en la capacidad de carga de fármacos de la nanopartícula con un aumento en la longitud del bloque del copolímero de bloque de PEG-PPG-PEG (Tabla 3).

Como las nanopartículas poliméricas formadas por el copolímero de bloque de PLA-PEG-PPG-PEG son de naturaleza anfifílica, pueden cargarse tanto fármacos hidrófobos como hidrófilos en las nanopartículas. Las nanopartículas de la presente invención poseen una alta capacidad de carga de fármacos debido a la ausencia o al uso mínimo de emulsionantes, lo que da como resultado una reducción de la carga de dosis y la frecuencia de la terapia. La relación de agente activo o entidad con respecto a la nanopartícula es mayor en las nanopartículas de la presente invención en comparación con los sistemas convencionales que emplean emulsionantes, ya que el peso del emulsionante puede sumar hasta el 50% del peso total de la formulación (International Journal of Pharmaceutics, 15 de junio 2011, Volumen 411, publicaciones 1-2, páginas 178-187; International Journal of Pharmaceutics, 2010, 387: 253-262). Las nanopartículas ayudan a lograr el suministro de fármacos en dosis únicas y bajas junto con una toxicidad reducida. El porcentaje en peso del agente activo con respecto al sistema nanoportador de PLA-PEG-PPG-PEG varía de 2-20 % con respecto a la nanopartícula. La mayor carga de fármaco en la nanopartícula reduce el requerimiento de dosis del fármaco ya que la dosis efectiva puede administrarse a un nivel de dosificación reducido. La carga interna mejorada en las nanopartículas poliméricas con una actividad prolongada de las entidades cargadas sin obstaculizar la capacidad de carga total de la nanopartícula conduce a un suministro efectivo de compuestos terapéuticos de gran potencial. La Figura 7B muestra la eficacia del péptido anticancerígeno, L-NuBCP-9, también denominado en el presente documento "L-PLBCL2P9", (configuración L de la secuencia de aminoácidos FSRSLHSLL) cargado en una formulación de nanopartículas en comparación con la formulación del fármaco peptídico libre y la formulación convencional de fármaco conjugado con péptido de penetración celular en líneas celulares primarias HUVEC.

Las nanopartículas de PLA-PEG-PPG-PEG de la presente invención no son tóxicas de acuerdo con lo confirmado por estudios de línea celular in vitro y estudios de modelo de ratón in vivo. Los parámetros hematológicos evaluados en ratones tratados con nanopartículas de PLA-PEG-PPG-PEG a una dosis de 150 mg/kg de peso corporal no mostraron cambios significativos en los niveles de recuento en sangre completa, recuento de glóbulos rojos, recuento de glóbulos blancos, niveles de neutrófilos y linfocitos con el grupo de control (Figura 8). Los parámetros bioquímicos evaluados para las funciones hepáticas y renales no mostraron cambios significativos en los niveles totales de proteína, albúmina y globulina entre los grupos de control y los tratados con nanopartículas. Los niveles de las enzimas hepáticas, alanina transaminasa (ALT), aspartato transaminasa (AST) y fosfatasa alcalina (ALP) no aumentaron significativamente en el grupo tratado con nanopartículas de PLA-PEG-PPG-PEG en comparación con el grupo de control, como se observa en las Figuras 9A y 9B. No hay cambios significativos en los niveles de urea y nitrógeno ureico en sangre (BUN) en ratones tratados con nanopartículas de PLA-PEG-PPG-PEG en comparación con el control (Figura 9C). La Figura 10 muestra la histopatología de los órganos, cerebro, corazón, hígado, bazo, riñón y pulmón de ratones inyectados con nanopartículas de PLA-PEG-PPG-PEG.

Las nanopartículas de la presente invención pueden encapsular y/o adsorber una o más entidades. La entidad también se puede conjugar directamente con el copolímero de bloque de la nanopartícula biodegradable. Las entidades de la presente invención incluyen, pero sin limitarse a, moléculas orgánicas pequeñas, ácidos nucleicos, polinucleótidos, oligonucleótidos, nucleósidos, ADN, ARN, ARNpi, aminoácidos, péptidos, proteínas, aminas, anticuerpos y variantes de los mismos, antibióticos, moléculas de bajo peso molecular, quimioterapéuticos, fármacos o agentes terapéuticos, iones metálicos, colorantes, radioisótopos, agentes de contraste y/o agentes de formación de imágenes.

Las moléculas adecuadas que pueden encapsularse son agentes terapéuticos. En los agentes terapéuticos se incluyen proteínas o péptidos o fragmentos de los mismos, insulina, etc., fármacos hidrófobos como doxorrubina, paclitaxel, gemcitabina, docetaxel, etc., antibióticos como anfotericina B, isoniazida (INH), etc., y ácidos nucleicos. Los agentes terapéuticos también incluyen quimioterapéuticas tales como paclitaxel, doxorrubicina pimozida, perimetamina, indenoisoquinolinas o nor-indenoisoquinolinas.

El agente terapéutico puede comprender aminoácidos naturales y no naturales (sintéticos). Ejemplos no limitativos incluyen compuestos bicíclicos y peptidomiméticos tales como peptidomiméticos cíclicos.

Se sabe que la forma L o la configuración L de los péptidos terapéuticos son económicamente más baratos de fabricar pero tienen una desventaja en las aplicaciones de fármacos ya que se sabe que se degradan muy rápidamente en el sistema in vivo en comparación con sus formas D. Sin embargo, la encapsulación de tales L-péptidos por las nanopartículas de la presente invención no da como resultado la degradación en la circulación debido a la encapsulación en el núcleo de las nanopartículas como lo confirman los estudios in vivo (Figuras 11,12 y 13).

El suministro dirigido de las nanopartículas cargadas con fármacos contra el cáncer se puede lograr en comparación con las formulaciones de fármacos libres prevalentes en la técnica. Las nanopartículas de la presente invención también pueden estar conjugadas, bioconjugadas o adsorbidas en la superficie con una o más entidades que incluyen fracciones dirigidas en la superficie de las nanopartículas. Las fracciones de direccionamiento hacen que las nanopartículas se localicen en un tumor o en un sitio de enfermedad y liberen un agente terapéutico. La fracción de direccionamiento puede unirse o asociarse con moléculas enlazadoras. Las moléculas de direccionamiento incluyen, pero no de limitan a, moléculas de anticuerpo, ligandos de receptores de crecimiento, vitaminas, péptidos, haptenos, aptámeros y otras moléculas de direccionamiento conocidas por los expertos en la materia. Las moléculas de fármacos y las moléculas de formación de imágenes también se pueden unir a las fracciones de direccionamiento en la superficie de las nanopartículas directamente o mediante moléculas enlazadoras.

Ejemplos específicos y no limitantes de fracciones de direccionamiento incluyen vitaminas, ligandos, aminas, fragmentos de péptidos, anticuerpos, aptámeros, una transferrina, un anticuerpo o fragmento del mismo, antígeno sialil Lewis X, ácido hialurónico, derivados de manosa, derivados de glucosa, lectinas específicas de células, galaptina, galectina, lactosilceramida, un derivado de esteroides, una secuencia RGD, EGF, péptido de unión a EGF, péptido de unión al receptor de uroquinasa, un péptido derivado de trombospondina, un derivado de albúmina y/o una molécula derivada de la química combinatoria.

Además, las nanopartículas de la presente invención pueden funcionalizarse en la superficie y/o conjugarse con otras moléculas de interés. Las moléculas pequeñas de bajo peso molecular como el ácido fólico, el antígeno específico de la membrana de la próstata (PSMA), los anticuerpos, los aptámeros, las moléculas que se unen a receptores o antígenos en la superficie celular, etc., pueden unirse covalentemente al copolímero de bloque de PEG-PPG-PEG o al componente p Eg de la matriz polimérica. En una realización adecuada de la presente invención, la matriz comprende de polímero y una entidad. En algunos casos, la entidad o la fracción de direccionamiento puede asociarse covalentemente con la superficie de la matriz polimérica. Los agentes terapéuticos pueden estar asociados con la superficie de la matriz polimérica o encapsulados en toda la matriz polimérica de las nanopartículas. La captación celular de la nanopartícula conjugada es mayor en comparación con las nanopartículas puras.

La nanopartícula de la presente invención puede comprender uno o más agentes unidos a la superficie de la nanopartícula a través de procedimientos bien conocidos en la técnica y también encapsular uno o más agentes para funcionar como una nanopartícula multifuncional. Las nanopartículas de la presente invención pueden funcionar como nanopartículas multifuncionales que pueden combinar el direccionamiento al tumor, terapia tumoral y formación de imágenes tumorales en un sistema todo en uno, proporcionando un enfoque multimodal útil en la batalla contra el cáncer. La nanopartícula multifuncional puede tener uno o más agentes activos con mecanismos de acción similares o diferentes, sitios de acción similares o diferentes; o funciones similares y diferentes.

La encapsulación de la entidad en la nanopartícula de PLA-PEG-PPG-PEG se prepara por el procedimiento de precipitación en emulsión. La nanopartícula polimérica PLA-PEG-PPG-PEG preparada utilizando el proceso de la presente invención se disuelve en un disolvente orgánico que comprende un disolvente orgánico. La entidad se agrega a la solución polimérica en el intervalo de peso de 10-20% en peso del polímero. La solución polimérica se agrega luego gota a gota a la fase acuosa y se agita a temperatura ambiente durante 10-12 horas para permitir la evaporación del solvente y la estabilización de las nanopartículas. Las nanopartículas cargadas con la entidad se recogen por centrifugación, se secan y se almacenan a 2 °C - 8 °C hasta su uso posterior. Se pueden agregar otros aditivos tales como azúcares, aminoácidos, metilcelulosa, etc., a la fase acuosa en el proceso para la preparación de las nanopartículas poliméricas cargadas con la entidad.

La capacidad de carga de la entidad de las nanopartículas de la presente invención es alta, alcanzando casi el 70-90 % como se muestra en la Tabla 3. El sistema de nanoportador basado en PLA-PEG-PPG-PEG de la presente invención evita la degradación prematura y suministro efectivo y dirigido de péptido anticancerígeno a las células cancerosas. Las nanopartículas de PLA-PEG-PPG-PEG biodegradables foliares de superficie que encapsulan péptidos terapéuticos tales como NuBCP-9, Bax BH3, etc., en el núcleo pueden suministrarse eficazmente en el citosol de las células cancerosas sin el uso de péptidos penetrantes de células. Los estudios in vitro con líneas celulares MCF-7 desafiadas con nanopartículas cargadas con L-PLBCL2P9 mostraron la destrucción completa de las células en 48-72 horas de acuerdo con lo evaluado por el ensayo XTT (Figura 7B) y estudios in vivo (Figuras 11 y 12). La Figura 7B también muestra la eficacia de las nanopartículas para liberación sostenida y suministro eficiente del fármaco en comparación con las formulaciones de fármacos libres en las líneas celulares MCF-7.

En realizaciones adecuadas, se consigue una mayor carga de la entidad en las nanopartículas de PLA-PEG-PPG-PEG uniendo el agente activo con PLA de bajo peso molecular. La entidad está unida covalentemente con PLA de bajo peso molecular mediante una reacción con un reactivo de acoplamiento de carbodiimida en combinación con un derivado hidroxilado. Como ejemplo, el agente de acoplamiento de carbodiimida es etil-dimetil aminopropil carbodiimida y el derivado hidroxilado es la química de N-hidroxi-succinimida (EDC/NHS). El peso molecular de p La está en el intervalo de aproximadamente 3.000-10.000 g/mol. Se consigue una mayor carga de fármacos tanto hidrófobos como hidrófilos en las nanopartículas de PLA-PEG-PPG-PEG (Ejemplo 5, Tablas 4 y 5). Las nanopartículas con fármacos encapsulados en PLA se suministraron al citosol sin la ayuda de péptidos penetrantes de células (CPP).

Los procesos específicos para la formación de nanopartículas y los usos en la composición farmacéutica se proporcionan en este documento con fines de referencia. Estos procesos y usos pueden llevarse a cabo a través de una variedad de procedimientos aparentes para los expertos en la materia.

Otra realización de la presente invención proporciona un proceso para la preparación de nanopartículas poliméricas biodegradables del copolímero de bloque de pLA-PEG-PPG-PEG, en el que dicho proceso comprende (a) disolver un copolímero de PEG-PPG-PEG y poli(ácido láctico) (PLA) en un disolvente orgánico para obtener una solución, (b) añadir N,N-diciclohexilcarbodiimida (DCC) y 4-(dimetilamino)piridina (DMAP) a la solución a una temperatura en el intervalo de -4 °C a 0 °C para obtener una mezcla de reacción, (c) agitar la mezcla de reacción de 250 a 400 rpm a una temperatura que varía de -4 °Ca 0 °C durante 20 a 28 horas para obtener el copolímero de bloque de PLA-PEG-PPG-PEG, (d) disolver el copolímero de bloque de PLA-PEG-PPG-PEG en un disolvente orgánico y homogeneizar de 250 a 400 rpm para obtener una mezcla homogeneizada, (e) agregar la mezcla homogeneizada a una fase acuosa para obtener una emulsión, y (f) agitar la emulsión de 25 °C a 30 °C de 250 a 400 rpm durante 10 a 12 horas para obtener las nanopartículas del copolímero de bloque de PLA-PEG-PPG-PEG.

En otra realización de la presente invención, se proporciona un proceso para la preparación de nanopartículas poliméricas biodegradables de copolímero de bloque de PLA-PEG-PPG-PEG, en el que dicho proceso comprende (a) disolver un copolímero de PEG-PPG-PEG y un poli(ácido láctico) (PLA) en un disolvente orgánico para obtener una solución, (b) añadir N,N-diciclohexilcarbodiimida (DCC) y 4-(dimetilamino)piridina (DMAP) a la solución a una temperatura en el intervalo de -4 °C a 0 °C para obtener una mezcla de reacción, (c) agitar la mezcla de reacción de 250 a 400 rpm a una temperatura que varía de -4 °C a 0 °C durante 20 a 28 horas para obtener el copolímero de bloque de PLA-PEG-PPG-PEG, (d) disolver el copolímero de bloque de PLA-PEG-PPG-PEG en un disolvente orgánico y homogeneizar de 250 a 400 rpm para obtener una mezcla homogeneizada, (e) añadir la mezcla homogeneizada a una fase acuosa para obtener una emulsión, y (f) agitar la emulsión de 25 °C a 30 °C de 250 a 400 rpm durante 10 a 12 horas para obtener las nanopartículas del copolímero de bloque de PLA-PEG-PPG-PEG, en el que dicho proceso comprende opcionalmente las etapas de lavar las nanopartículas del copolímero de bloque de PLA-PEG-PpG-PEG con agua y secar las nanopartículas mediante un procedimiento convencional.

En otra realización de la presente invención, se proporciona un proceso para la preparación de nanopartículas poliméricas biodegradables de copolímero de bloque de PLA-PEG-PPG-PEG, en el que dicho proceso comprende (a) disolver un copolímero de PEG-PPG-PEG y poli-ácido láctico (PLA) en un disolvente orgánico para obtener una solución, (b) añadir N,N-diciclohexilcarbodiimida (DCC) y 4-(dimetilamino)piridina (DMAP) a la solución a una temperatura en el intervalo de -4 °C a 0 °C para obtener una mezcla de reacción, (c) agitar la mezcla de reacción d 250 a 400 rpm a una temperatura que varía de -4 °C a 0 °C durante 20 a 28 horas para obtener el copolímero de bloque de PLA-PEG-PPG-PEG, (d) disolver el copolímero de bloque de PLA-PEG-PPG-PEG en un disolvente orgánico y homogeneizar de 250 a 400 rpm para obtener una mezcla homogeneizada, (e) añadir la mezcla homogeneizada a una fase acuosa para obtener una emulsión, y (f) agitar la emulsión de 25 °C a 30 °C de 250 a 400 rpm durante 10 a 12 horas para obtener las nanopartículas del copolímero de bloque de PLA-PEG-PPG-PEG, en el que el tamaño de la nanopartícula está en el intervalo de 30-120 nm.

En otra realización más de la presente invención, se proporciona un proceso para la preparación de nanopartículas poliméricas biodegradables del copolímero de bloque de PLA-PEG-PPG-PEG, en el que dicho proceso comprende (a) disolver un copolímero de PEG-PPG-PEG y poli(ácido láctico) (PLA) en un disolvente orgánico para obtener una solución, (b) añadir N,N-diciclohexilcarbodiimida (DCC) y 4-(dimetilamino)piridina (DMAP) a la solución a una temperatura en el intervalo de -4 °C a 0 °C para obtener una mezcla de reacción, (c) agitar la mezcla de reacción de 250 a 400 rpm a una temperatura que varía de -4 °C a 0 °C durante 20 a 28 horas para obtener el copolímero de bloque de PLA-PEG-PPG- PEG, (d) disolver el copolímero de bloque de PLA-PEG-PPG-PEG en un disolvente orgánico y homogeneizar de 250 a 400 rpm para obtener una mezcla homogeneizada, (e) añadir la mezcla homogeneizada a una fase acuosa para obtener una emulsión, y (f) agitar la emulsión de 25 °C a 30 °C de 250 a 400 rpm durante 10 a 12 horas para obtener las nanopartículas del copolímero de bloque de PLA-PEG-PPG-PEG, en el que el peso molecular del copolímero de PEG-PPG-PEG está en el intervalo de 1.000 g/mol a 10.000 g/mol.

En una realización adicional de la presente invención, se proporciona un proceso para la preparación de nanopartículas poliméricas biodegradables del copolímero de bloque de PLA-PEG-PPG-PEG, en el que dicho proceso comprende (a) disolver un copolímero de PEG-PPG-PEG y poli(ácido láctico) (PLA) en un disolvente orgánico para obtener una solución, (b) añadir N,N-diciclohexilcarbodiimida (DCC) y 4-(dimetilamino)piridina (DMAP) a la solución a una temperatura en el intervalo de -4 °C a 0 °C para obtener una mezcla de reacción, (c) agitar la mezcla de reacción de 250 a 400 rpm a una temperatura que varía de -4 °C a 0 °C durante 20 a 28 horas para obtener el copolímero de bloque de PLA-PEG-PPG-PEG, (d) disolver el copolímero de bloque de PLA-PEG-PPG-PEG en un disolvente orgánico y homogeneizar de 250 a 400 rpm para obtener una mezcla homogeneizada, (e) añadir la mezcla homogeneizada a una fase acuosa para obtener una emulsión, y (f) agitar la emulsión de 25 °C a 30 °C de 250 a 400 rpm durante 10 a 12 horas para obtener las nanopartículas del copolímero de bloque de PLA-PEG-P PG-PEG, en el que el peso molecular de PLA está en el intervalo de 10.000 g/mol a 60.000 g/mol.

En una realización adicional de la presente invención, se proporciona un proceso para la preparación de nanopartículas poliméricas biodegradables de copolímero de bloque de PLA-PEG-PPG-PEG, en el que dicho proceso comprende (a) disolver un copolímero de PEG-PPG-PEG y poli(ácido láctico) (PLA) en un disolvente orgánico para obtener una solución, (b) añadir N,N-diciclohexilcarbodiimida (DCC) y 4-(dimetilamino)piridina (DMAP) a la solución a una temperatura en el intervalo de - 4 °Ca 0 °C para obtener una mezcla de reacción, (c) agitar la mezcla de reacción de 250 a 400 rpm a una temperatura que varía de -4 °C a 0 °C durante 20 a 28 horas para obtener el copolímero de bloque de PLA-PEG-PPG-p Eg (d) disolver el copolímero de bloque de PLA-PEG-PPG-PEG en un disolvente orgánico y homogeneizar de 250 a 400 rpm para obtener una mezcla homogeneizada (e) añadir la mezcla homogeneizada a una fase acuosa para obtener una emulsión, y (f) agitar la emulsión de 25 °C a 30 °C de 250 a 400 rpm durante 10 a 12 horas para obtener las nanopartículas del copolímero de bloque de PLA-PEG-PPG-PEG, en el que la solución de la etapa (a) opcionalmente comprende aditivos tales como un emulsionante.

Otra realización de la presente invención proporciona nanopartículas poliméricas biodegradables de copolímero de bloque de PLA-PEG-PPG-PEG obtenidas por el proceso para la preparación de nanopartículas poliméricas biodegradables de copolímero de bloque de PLA-PEG-PPG-PEG, en el que dicho proceso comprende (a) disolver un copolímero de PEG-PPG-PEG y poli(ácido láctico) (PLA) en un disolvente orgánico para obtener una solución, (b) añadir N,N-diciclohexilcarbodiimida (DCC) y 4-(dimetilamino)piridina (DMAP) a la solución a una temperatura en el intervalo de -4 °C a 0 °C para obtener una mezcla de reacción (c) agitar la mezcla de reacción de 250 a 400 rpm a una temperatura que varía de -4 °C a 0 °C durante 20 a 28 horas para obtener el copolímero de bloque de PLA-PEG-PPG-PEG (d) disolver el copolímero de bloque de PLA-PEG-PPG-PEG en un disolvente orgánico y homogeneizando de 250 a 400 rpm para obtener una mezcla homogeneizada, (e) añadiendo el mezcla homogeneizada a una fase acuosa para obtener una emulsión, y (f) agitar la emulsión de 25 °C a 30 °C de 250 a 400 rpm durante 10 a 12 horas para obtener las nanopartículas del copolímero de bloque de PLA-PEG-PPG-PEG.

Otra realización de la presente invención proporciona una composición que comprende la nanopartícula polimérica biodegradable del copolímero de bloque de PLA-PEG-PPG-PEG obtenida por el proceso para la preparación de nanopartículas poliméricas biodegradables del copolímero de bloque de PLA-PEG-PPG-PEG, en el que dicho el proceso comprende (a) disolver un copolímero de PEG-PPG-PEG y poli(ácido láctico) (PLA) en un disolvente orgánico para obtener una solución, (b) añadir N,N-diciclohexilcarbodiimida (DCC) y 4-(dimetilamino)piridina (DMAP) a la solución a una temperatura en el intervalo de -4 °C a 0 °C para obtener una mezcla de reacción, (c) agitar la mezcla de reacción de 250 a 400 rpm a una temperatura que varía de -4 °C a 0 °C durante 20 a 28 horas para obtener el copolímero de bloque de PLA-PEG-PPG-PEG, (d) disolver el copolímero de bloque de PLA-PEG-PPG-PEG en un disolvente orgánico y homogeneizar de 250 a 400 rpm para obtener una mezcla homogeneizada, (e) añadiendo la mezcla homogeneizada a una fase acuosa para obtener una emulsión, y (f) agitando la emulsión de 25 °C a 30 °C de 250 a 400 rpm durante 10 a 12 horas para obtener las nanopartículas de copolímero de bloque de PLA-PEG-PPG-PEG.

Una realización particular de la presente invención proporciona un proceso para preparar nanopartículas poliméricas biodegradables de copolímero de bloque de PLA-PeG-PPG-PEG que comprende al menos una entidad, en la que dicho proceso comprende (a) homogeneizar la entidad con las nanopartículas poliméricas del copolímero de bloque de PLA-PEG-PPG-PEG disuelto en un disolvente orgánico de 250 a 400 rpm para obtener una emulsión primaria, (b) emulsionar la emulsión primaria en una fase acuosa de 250 a 400 rpm para obtener una emulsión secundaria, y (c) agitar la emulsión secundaria de 25 °C a 30 °C de 250 a 400 rpm durante 10 a 12 horas para obtener la nanopartícula de PLA-PEG-PPG-PEG que comprende la entidad.

En otra realización de la presente invención, se proporciona un proceso para preparar nanopartículas poliméricas biodegradables de copolímero de bloque de PLA-PEG-PPG-PEG que comprende al menos una entidad, en la que dicho proceso comprende (a) homogeneizar la entidad con las nanopartículas poliméricas de copolímero de bloque de PLA-PEG-PPG-PEG disuelto en un disolvente orgánico de 250 a 400 rpm para obtener una emulsión primaria, (b) emulsionar la emulsión primaria en una fase acuosa de 250 a 400 rpm para obtener una emulsión secundaria, y (c) agitar la emulsión secundaria de 25 °C a 30 °C de 250 a 400 rpm durante 10 a 12 horas para obtener la nanopartícula de PLA-PEG-PPG-PEG que comprende la entidad, en la que dicho proceso opcionalmente comprende las etapas de lavar las nanopartículas del copolímero de bloque de PLA-PEG-PPG-PEG que comprende la entidad con agua y secar las nanopartículas por un procedimiento convencional.

En otra realización de la presente invención, se proporciona un proceso para preparar nanopartículas poliméricas biodegradables de copolímero de bloque de PLA-PEG-PPG-PEG que comprende al menos una entidad, en la que dicho proceso comprende (a) homogeneizar la entidad con las nanopartículas poliméricas de copolímero de bloque de PLA-PEG-PPG-PEG disuelto en un disolvente orgánico de 250 a 400 rpm para obtener una emulsión primaria, (b) emulsionar la emulsión primaria en una fase acuosa de 250 a 400 rpm para obtener una emulsión secundaria, y (c) agitar la emulsión secundaria de 25 °C a 30 °C de 250 a 400 rpm durante 10 a 12 horas para obtener la nanopartícula de PLA-PEG-PPG-PEG que comprende la entidad, en la que la entidad se selecciona de un grupo que consiste en pequeñas moléculas orgánicas, ácidos nucleicos, polinucleótidos, oligonucleótidos, nucleósidos, ADN, ARN, aminoácidos, péptidos, proteínas, antibióticos, moléculas de bajo peso molecular, moléculas farmacológicamente activas, fármacos, iones metálicos, colorantes, radioisótopos, agentes de contraste, agentes de formación de imágenes y fracciones de direccionamiento.

En otra realización de la presente invención, se proporciona un proceso para preparar nanopartículas poliméricas biodegradables de copolímero de bloque de PLA-PEG-PPG-PEG que comprende al menos una entidad, en la que dicho proceso comprende (a) homogeneizar la entidad con las nanopartículas poliméricas de copolímero de bloque de PLA-PEG-PPG-PEG disuelto en un disolvente orgánico de 250 a 400 rpm para obtener una emulsión primaria, (b) emulsionar la emulsión primaria en una fase acuosa de 250 a 400 rpm para obtener una emulsión secundaria, y (c) agitar la emulsión secundaria de 25 °C a 30 °C de 250 a 400 rpm durante 10 a 12 horas para obtener la nanopartícula de PLA-PEG-PPG-PEG que comprende la entidad, en la que la entidad es una fracción de direccionamiento seleccionado del grupo consiste en vitaminas, ligandos, aminas, fragmentos de péptidos, anticuerpos y aptámeros.

En otra realización de la presente invención, se proporciona un proceso para preparar nanopartículas poliméricas biodegradables de copolímero de bloque de PLA-PEG-PPG-PEG que comprende al menos una entidad, en la que dicho proceso comprende (a) homogeneizar la entidad con las nanopartículas poliméricas del copolímero de bloque de PLA-PEG-PPG-PEG disuelto en un disolvente orgánico de 250 a 400 rpm para obtener una emulsión primaria, (b) emulsionar la emulsión primaria en una fase acuosa de 250 a 400 rpm para obtener una emulsión secundaria, y (c) agitar la emulsión secundaria de 25 °C a 30 °C de 250 a 400 rpm durante 10 a 12 horas para obtener la nanopartícula de PLA-PEG-PPG-PEG que comprende la entidad, en la que la entidad se enlaza a PLA.

En otra realización de la presente invención, se proporciona un proceso para preparar nanopartículas poliméricas biodegradables de copolímero de bloque de PLA-PEG-PPG-PEG que comprende al menos una entidad, en la que dicho proceso comprende (a) homogeneizar la entidad con las nanopartículas poliméricas de copolímero de bloque de PLA-PEG-PPG-PEG disuelto en un disolvente orgánico de 250 a 400 rpm para obtener una emulsión primaria, (b) emulsionar la emulsión primaria en una fase acuosa de 250 a 400 rpm para obtener una emulsión secundaria, y (c) agitar la emulsión secundaria de 25 °C a 30 °C de 250 a 400 rpm durante 10 a 12 horas para obtener la nanopartícula de PLA-PEG-PPG-PEG que comprende la entidad, en la que la entidad se enlaza a PLA de peso molecular en el intervalo de 3.000 g/mol a 10.000 g/mol.

Otra realización de la presente invención proporciona una nanopartícula polimérica biodegradable de PLA-PEG-PPG-PEG que comprende al menos una entidad obtenida por el proceso que comprende (a) homogeneizar la entidad con las nanopartículas poliméricas del copolímero de bloque de PLA-PEG-PPG-PEG disuelto en un disolvente orgánico de 250 a 400 rpm para obtener una emulsión primaria, (b) emulsionar la emulsión primaria en una fase acuosa de 250 a 400 rpm para obtener una emulsión secundaria, y (c) agitar la emulsión secundaria de 25 °C a 30 °C de 250 a 400 rpm durante 10 a 12 horas para obtener la nanopartícula de PLA-PEG-PPG-PEG que comprende la entidad.

Otra realización de la presente invención proporciona una composición que comprende la nanopartícula polimérica biodegradable de PLA-PEG-PPG-PEG que comprende al menos una entidad obtenida por el proceso que comprende (a) homogeneizar la entidad con las nanopartículas poliméricas de copolímero de bloque de PLA-PEG- PPG-PEG disuelto en un disolvente orgánico de 250 a 400 rpm para obtener una emulsión primaria, (b) emulsionar la emulsión primaria en una fase acuosa de 250 a 400 rpm para obtener una emulsión secundaria, y (c) agitar la emulsión secundaria de 25 °C a 30 °C de 250 a 400 rpm durante 10 a 12 horas para obtener la nanopartícula de PLA-PEG-PPG-PEG que comprende la entidad.

En otra realización de la presente invención, se proporciona una composición que comprende la nanopartícula polimérica biodegradable de PLA-PEG-PPG-PEG que comprende al menos una entidad obtenida mediante el proceso que comprende (a) homogeneizar la entidad con las nanopartículas poliméricas de copolímero de bloque de PLA-PEG-PPG-PEG disuelto en un disolvente orgánico de 250 a 400 rpm para obtener una emulsión primaria, (b) emulsionar la emulsión primaria en una fase acuosa de 250 a 400 rpm para obtener una emulsión secundaria, y (c) agitar la emulsión secundaria de 25 °C a 30 °C de 250 a 400 rpm durante 10 a 12 horas para obtener la nanopartícula de PLA-PEG-PPG-PEG que comprende la entidad, en la que la composición opcionalmente comprende al menos un excipiente farmacéutico seleccionado del grupo que consiste en conservantes, antioxidantes, agente espesante, agente quelante, agente isotónico, agente saborizante, agente edulcorante, colorante, solubilizante, tintes, sabores, aglutinante, emoliente, rellenos, lubricantes y conservantes.

Otro aspecto más de la presente invención proporciona un procedimiento para tratar una enfermedad que comprende administrar nanopartículas poliméricas biodegradables de PLA-PEG-PPG-PEG que además comprende al menos un agente terapéutico, a un sujeto que lo necesite.

En otro aspecto, la presente invención proporciona el uso de la nanopartícula polimérica biodegradable compuesta de copolímero de bloque de PLA-PEG-PpG-PEG que comprende al menos una entidad para la fabricación de un medicamento.

También se proporcionan en el presente documento composiciones o formulaciones farmacéuticas, que comprenden las nanopartículas proporcionadas en el presente documento y un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable.

Las formulaciones farmacéuticas adecuadas pueden contener, por ejemplo, de aproximadamente 0,1 % a aproximadamente 99,9 %, preferiblemente de aproximadamente 1 % a aproximadamente 60 %, del ingrediente o ingredientes activos. Las formulaciones farmacéuticas para administración enteral o parenteral son, por ejemplo, aquellas en formas de dosificación unitarias, tales como comprimidos recubiertos de azúcar, comprimidos, cápsulas o supositorios, o ampollas. Si no se indica lo contrario, estos se preparan de una manera ya conocida, por ejemplo, por medio de procesos convencionales de mezcla, granulación, recubrimiento de azúcar, disolución o liofilización. Se apreciará que el contenido unitario de un compañero de combinación contenida en una dosis individual de cada forma de dosificación no necesita constituir en sí mismo una cantidad efectiva ya que la cantidad efectiva necesaria puede alcanzarse mediante la administración de una pluralidad de unidades de dosificación.

Las composiciones farmacéuticas pueden contener, como ingrediente activo, una o más de las nanopartículas de la invención en combinación con uno o más vehículos (excipientes) farmacéuticamente aceptables. Al preparar las composiciones de la invención, el ingrediente activo se mezcla típicamente con un excipiente, se diluye con un excipiente o se incluye dentro de dicho vehículo en forma de, por ejemplo, una cápsula, bolsita, papel u otro recipiente. Cuando el excipiente sirve como diluyente, puede ser un material sólido, semisólido o líquido, que actúa como vehículo, portador o medio para el ingrediente activo. Por lo tanto, las composiciones pueden estar en forma de comprimidos, píldoras, polvos, pastillas, sobre, cápsulas lisas, elixires, suspensiones, emulsiones, soluciones, jarabes, aerosoles (como un medio sólido o líquido), ungüentos que contienen, por ejemplo, hasta 10 % en peso del compuesto activo, cápsulas de gelatina blandas y duras, supositorios, soluciones inyectables estériles y polvos envasados estériles.

Algunos ejemplos de excipientes adecuados incluyen lactosa (por ejemplo, lactosa monohidratada), dextrosa, sacarosa, sorbitol, manitol, almidones (por ejemplo, almidón glicolato de sodio), goma arábiga, fosfato cálcico, alginatos, tragacanto, gelatina, silicato de calcio, dióxido de silicio coloidal, celulosa microcristalina, polivinilpirrolidona (por ejemplo, povidona), celulosa, agua, jarabe, metilcelulosa e hidroxipropilcelulosa. Las formulaciones pueden incluir adicionalmente: agentes lubricantes tales como talco, estearato de magnesio y aceite mineral; agentes humectantes; agentes emulsionantes y de suspensión; agentes conservantes tales como metil y propilhidroxibenzoatos; agentes edulcorantes; y agentes saborizantes.

Las formas líquidas en las que los compuestos y composiciones de la presente invención pueden incorporarse para administración oral o mediante inyección incluyen soluciones acuosas, jarabes con sabor adecuado, suspensiones acuosas o oleosas y emulsiones saborizadas con aceites comestibles tales como aceite de semilla de algodón, aceite de sésamo, aceite de coco o aceite de maní, así como elixires y vehículos farmacéuticos similares.

La invención se ilustra mediante los siguientes ejemplos no limitantes.

Ejemplos

La divulgación se ilustrará ahora con ejemplos de trabajo, y que tiene la intención de ilustrar el funcionamiento de la divulgación y no pretende restringir de ninguna manera el alcance de la presente divulgación. A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos utilizados en este documento tienen el mismo significado que entiende comúnmente un experto en la materia a la que pertenece esta divulgación. Aunque pueden utilizarse procedimientos y materiales similares o equivalentes a los descritos en este documento en la práctica de los procedimientos y composiciones descritos, se describen ejemplos de procedimientos, dispositivos y materiales en el presente documento.

Ejemplo 1

Preparación de nanopartículas poliméricas de copolímero de bloque de PLA-PEG-PPG-PEG

Se obtuvieron poli(ácido láctico) (Peso molecular -45,000-60,000 g/mol), PEG-PPG-PEG (Tabla 1) y reactivos de cultivo de tejidos a través de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). Todos los reactivos fueron de grado analítico o superior y se usaron como se recibieron, a menos que se indique lo contrario. Las líneas celulares se obtuvieron de NCCS Pune, India. El péptido Nur-9 se sintetizó a medida con un 95% de pureza.

Preparación del copolímero de bloque de PLA-PEG-PPG-PEG

Se disolvieron 5 g de poli(ácido láctico) (PLA) con un peso molecular promedio de 60.000 g/mol en 100 ml de CH2CI2 (diclorometano) en un matraz de fondo redondo de 250 ml. A esta solución, se añadieron 0,7 g de polímero PEG-PPG-PEG (intervalo de peso molecular de 1100-8400 Mn). La solución se agitó durante 10-12 horas a 0 °C. A esta mezcla de reacción, se le añadieron 5 ml de solución de N,N-diciclohexilcarbodimida (DCC) al 1% seguido de una adición lenta de 5 ml de 4-dimetilaminopiridina (DMAP) al 0,1% de -4 °C a 0 °C/temperaturas bajo cero. La mezcla de reacción se agitó durante las siguientes 24 horas seguido de precipitación del copolímero de bloque de PLA-PEG-PPG-PEG con éter dietílico y filtración usando papel de filtro Whatman No.1. Los precipitados de copolímero de bloque de PLA-PEG-PPG-PEG así obtenidos se secan a bajo vacío y se almacenan a una temperatura de 2 °C a 8 °C hasta su uso posterior.

Preparación de nanopartículas de PLA-PEG-PPG-PEG

Las nanopartículas de PLA-PEG-PPG-PEG se prepararon mediante un procedimiento de precipitación en emulsión. Se disolvieron por separado 100 mg del copolímero de PLA-PEG-PPG-PEG obtenido mediante el proceso mencionado anteriormente en un disolvente orgánico, por ejemplo, acetonitrilo, dimetilformamida (DMF) o diclorometano para obtener una solución polimérica.

Las nanopartículas se prepararon añadiendo esta solución polimérica gota a gota a la fase acuosa de 20 ml de agua destilada. La solución se agitó magnéticamente a temperatura ambiente durante 10 a 12 horas para permitir la evaporación del disolvente residual y la estabilización de las nanopartículas. Las nanopartículas se recogieron luego por centrifugación a 25.000 rpm durante 10 minutos y se lavaron tres veces con agua destilada. Las nanopartículas se liofilizaron más y se almacenaron a una temperatura de 2 °C a 8 °C hasta su uso posterior.

Caracterización de nanopartículas poliméricas de copolímero de bloque de PLA-PEG-PPG-PEG

La forma de las nanopartículas obtenidas por el proceso mencionado anteriormente es esencialmente esférica como se observa en la imagen de Microscopía Electrónica de Transmisión que se muestra en las Figuras 4A-B. Las imágenes TEM permitieron la determinación del intervalo de tamaño de partícula, que es de aproximadamente 30 a 120 nm. El radio hidrodinámico de la nanopartícula se midió utilizando un instrumento de dispersión dinámica de luz (DLS) y está en el intervalo de 110-120 nm (Tabla 2).

Las características de las nanopartículas de PLA-PEG-PPG-PEG sintetizadas usando un intervalo de pesos moleculares del copolímero de bloque, PEG-PPG-PEG, se muestran en la Tabla 2. Los espectros FTIR del PLA, PLA-PEG, el copolímero de bloque de PEG-PPG-PEG y las nanopartículas poliméricas de PLA-PEG-PPG-PEG se presentan en la Figura 2A. El FTIR demostró ser insensible a las diferencias entre estas especies. Por lo tanto, se realizó una caracterización adicional usando RMN.

Los espectros de RMN de las nanopartículas de PLA-PEG-PPG-PEG obtenidas usando diferentes pesos moleculares del copolímero de bloque, PEG-PPG-PEG, se muestran en las Figuras 3A-C. En las figuras, el protón con un desplazamiento químico de aproximadamente 5,1 representa el protón del éster de PLA y el protón con un desplazamiento químico de alrededor de 3,5 representa el protón del éter de PEG-PPG-PEG. La presencia de ambos protones en los espectros confirma la conjugación de PLA con PEG-PPG-PEG.

Ejemplo 2

Preparación de una nanopartícula con entidad encapsulada

Preparación de una nanopartícula polimérica con fármaco encapsulado

Las nanopartículas de la presente invención son de naturaleza anfifílica y pueden cargarse tanto con fármacos hidrófobos tales como doxorrubicina como con fármacos hidrófilos tales como los péptidos anticancerígenos de nueve mer (L-NuBCP-9 o L-PLBCL2P9, configuración L de FSRSLHSLL), dominios BH3 de 16 mer, etc.

Se disuelven 100 g de la nanopartícula de PLA-PEG-PPG-PEG preparada usando el proceso del Ejemplo 1 en 5 ml de un disolvente orgánico como acetonitrilo (CH3CN), dimetilformamida (DMF; C3H7NO), acetona o diclorometano (CH2Cl2).

Se disuelven 1-5 mg de la entidad farmacológica, L-PLBCL2P9 (configuración L de FSRSLHSLL), en una solución acuosa y se agrega a la solución polimérica anterior. La entidad generalmente se toma en el intervalo de peso de aproximadamente 10-20% en peso del polímero. Esta solución se sonica brevemente durante 10-15 segundos a 250­ 400 rpm para producir una emulsión primaria fina.

La emulsión primaria fina se agrega gota a gota usando una jeringa/micropipeta a la fase acuosa de 20 ml de agua destilada y se agita magnéticamente de 250 a 400 rpm de 25 °C a 30 °C durante 10 a 12 h para permitir la evaporación del disolvente y la estabilización de las nanopartículas. La fase acuosa comprende además un aditivo de azúcar. La suspensión de nanopartículas resultante se dejó en agitación durante la noche, en una condición descubierta abierta, para evaporar el disolvente orgánico residual. Las nanopartículas poliméricas encapsuladas L-PLBCL2P9 se recogen por centrifugación a 10.000 g durante 10 min o por ultrafiltración a 3000 g durante 15 min. (Amicon Ultra, membrana Ultracel con 100.000 NMWL, Millipore, EE. UU.). Las nanopartículas se resuspenden en agua destilada, se lavan tres veces y se liofilizan. Se almacenan a una temperatura de 2 °C a 8 °C hasta su uso posterior. Las nanopartículas poliméricas son altamente estables sin carácter sigiloso.

Comparación de la eficacia de carga de la nanopartícula polimérica preparada usando diferentes pesos del copolímero

Se prepararon nanopartículas poliméricas de PLA-PEG-PPG-PEG usando diferentes pesos moleculares del polímero PEG-PPG-PEG usando el proceso como se mencionó anteriormente. Las nanopartículas poliméricas de p LA-PEG-PPG-PEG cargadas con pireno se prepararon usando el copolímero de PLA-PEG-PPG-PEG sintetizado usando pesos moleculares variables del polímero PEG-PPG-PEG. Se tomó pireno en el intervalo del 2-20% en peso del copolímero de bloque de PLA-PEG-PpG-PEG y se prepararon nanopartículas cargadas con colorante fluorescente. La capacidad de carga de la entidad de las nanopartículas variaba dependiendo del peso molecular del polímero PEG-PPG-PEG utilizado para la síntesis de las nanopartículas. La Tabla 3 proporciona el porcentaje de la molécula de formación de imágenes encapsulada por las nanopartículas poliméricas producidas usando diferentes pesos moleculares del copolímero de bloque.

Internalización celular del colorante fluorescente, Rodamina

Se prepararon nanopartículas poliméricas de PLA-PEG-PPG-PEG cargadas con rodamina usando el proceso mencionado anteriormente. Se tomó rodamina en el intervalo de 2-20% en peso del copolímero de bloque de PLA-PEG-PPG-PEG y se prepararon nanopartículas cargadas con colorante fluorescente.

Se sembraron inicialmente 1 * 105 células MCF-7 y se cultivaron hasta un 60% de confluencia en matraces cubreobjetos. Luego, las células se lavaron dos veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS) y se cultivaron en 10 ml de medio DMEM que contenía suero bovino fetal al 10% (FBS) y penicilina/estreptomicina al 1% durante 24 h. El medio de crecimiento se aspiró y las células se lavaron dos veces con PBS. Las nanopartículas cargadas con rodamina se añadieron a las células unidas a cubreobjetos y se incubaron a 37 °C durante 12 h. Después de la incubación, las células se lavaron y se retiraron los cubreobjetos. A continuación se lavó con solución de PBS y finalmente se fijó con paraformaldehído al 4% durante 20 minutos a temperatura ambiente. Después de eliminar el agente de fijación, las células se lavaron y se tiñeron con DAPI (células de núcleos teínas con colorante fluorescente) durante 5 minutos y luego se enjuagaron en agua corriente durante 1 minuto. Los cubreobjetos se analizaron luego utilizando un microscopio fluorescente confocal (Microscopio Olympus, FluoView FV1000, Japón). La internalización celular de las nanopartículas en las células MCF-7 se confirmó usando nanopartículas cargadas con colorante fluorescente (Rodamina B) junto con el Microscopio de Barrido Láser Confocal (CLSM) (Figura 5).

Ejemplo 3

Preparación de nanopartículas poliméricas encapsuladas con fármaco con una fracción de direccionamiento

Se pueden usar diversas moléculas pequeñas tales como aminas o aminoácidos que proporcionan una función -COOH o -NH2, respectivamente, para la conjugación de biomoléculas como fracciones de direccionamiento sobre las nanopartículas poliméricas de la presente invención.

Preparación de PLA-PEG-PPG-PEG-Lisina

El copolímero de PLA-PEG-PPG-PEG se conjugó con un aminoácido, lisina, para tener el grupo -NH2. Se disolvieron 5 g de PLA-PEG-PPG-PEG y 0,05 g de lisina en 100 ml de acetonitrilo/diclorometano (1:1) en un matraz RB de 250 ml y se dejó agitar a -4-0 °C. A esta solución, se le agregó solución de N,N-Diciclohexilcarbodimida (DCC) al 1% seguido de una adición lenta de 4-Dimetilaminopiridina (DMAP) al 0,1% a 0 °C. La mezcla de reacción se agitó durante 24 horas, después de lo cual se precipitó PLA-PEG-PPG-PEG-Lisina con éter dietílico y se filtró a través de papel de filtro Whatman N° 1. Los precipitados se secaron a bajo vacío y se mantuvieron a 2-8 °C hasta su uso.

Preparación de nanopartículas a partir de PLA-PEG-PPG-PEG-Lisina

Para la preparación de nanopartículas, se disolvió el copolímero de PLA-PEG-PPG-PEG-Lisina (100 mg) en acetonitrilo (o dimetilformamida (DMF) o diclorometano). Luego se añadió el fármaco (aproximadamente 10-20% en peso del polímero) a la solución con una breve sonicación de 15 s para producir una emulsión primaria. La emulsión primaria resultante se añadió gota a gota a la fase acuosa de agua destilada (20 ml) y se agitó magnéticamente a temperatura ambiente durante 10-12 horas para permitir la evaporación del disolvente y la estabilización de las nanopartículas. Las nanopartículas formadas se recogieron por centrifugación a 25.000 rpm durante 10 minutos y se lavaron tres veces con agua destilada y se liofilizaron, seguido de almacenamiento a 2-8 °C para su uso posterior.

Bio-conjugación de nanopartículas con ácido fótico (FA)

Se disolvieron 20 mg de nanopartículas de PLA-PEG-PPG-PEG liofilizadas en agua MilliQ y se trataron con N-(3-dietilaminopropil)-N-etilcarbodiimida (EDC) (50 pl, 400 mM) y N-hidroxisuccinimida (NHS) (50 pl, 100 mM) y la mezcla se agitó suavemente durante 20 min. Después de que se añadió esta solución de ácido fólico de 10 mM y la solución se agitó suavemente durante 30 minutos seguido de filtración usando un filtro Amicon para eliminar el FA sin reaccionar que queda en el filtrado. Las nanopartículas conjugadas con ácido fólico se liofilizaron seguido de almacenamiento a -20 °C.

Ejemplo 4

Evaluación del potencial de suministro de la nanopartícula polimérica de PLA-PEG-PPG-PEG

Liberación in vitro del fármaco encapsulado por la nanopartícula polimérica de PLA-PEG-PPG-PEG

Una mezcla que contenía 10 ml de solución salina tamponada con fosfato y 10 mg de nanopartículas de PLA-PEG-PPG-PEG que encapsulaban L-PLBCL2P9 (fármaco) conjugado con rodamina B se agitó a 200 rpm a 37 °C. Se recogieron muestras sobrenadantes de la mezcla por centrifugación a 25.000 rpm a diferentes intervalos de tiempo durante un período de 6 días. Las nanopartículas se resuspendieron en tampón nuevo después de cada centrifugación. Se sometieron 2 ml del sobrenadante a estimación de proteínas usando el kit BCA (Pierce, EE. UU.) para evaluar la cantidad de liberación de fármaco espectrofotométricamente a 562 nm. La liberación del fármaco se calculó mediante una curva de calibración estándar. Se observó que la liberación del fármaco por las nanopartículas poliméricas de PLA-PEG-PPG-PEG se puede controlar mejor que las nanopartículas convencionales de PLA (Figura 6A).

El ensayo XTT (sal interna de 2,3-bis(2-metoxi-4-nitro-5-sulfofenil)-5-[(fenilamino)-carbonil1-2H-tetrazolio sódico)

La viabilidad celular usando ensayos XTT (sal interna de 2,3-bis(2-metoxi-4-nitro-5-sulfofenil)-5-[(fenilamino)-carbonil]-2H-tetrazolio sódico) se llevó a cabo en líneas celulares HUVEC primarias y líneas celulares MCF-7 (Figuras 6B, 7A y 7B).

Se sembraron un total de 1 x 104 células MCF-7 en cada pocillo de una placa de 96 pocillos y se cultivaron durante 24 h. Después de 24 horas, las células en cada placa se trataron con nanopartículas poliméricas de la presente invención que contenían péptido L-PLBCL2P9 5 pM o nanopartículas de control sin ningún péptido. Las células también se trataron por separado con la misma concentración de péptido L-PLBCL2P9 sin ningún péptido de penetración celular (CPP). Las células se incubaron con las nanopartículas durante diferentes intervalos de tiempo de 16 h, 24 h, 48 h, 72 h y 96 h. Después de la incubación, el medio que contenía nanopartículas de PLA-PEG-PPG-PEG cargadas con péptido anticancerígeno L-PLBCL2P9 se intercambió con medio fresco, y se añadieron 10 pl del reactivo del kit de mezcla XTT reconstituido a cada pocillo. Después de cultivar durante 4 h, se midió la absorbancia de la muestra utilizando un lector de placas de microtitulación (Bio-Rad, CA, EE. UU.) a 450 nm. La proliferación de células se determinó como el porcentaje de células viables del control no tratadas y se analizó por triplicado. La Figura 6B muestra el efecto de la nanopartícula de PLA-PEG-PPG-PEG cargada con L-PLBCL2P9 sobre la viabilidad celular de la línea celular MCF-7 en relación con el tiempo. La Figura 7A muestra el efecto de la nanopartícula de PLA-PEG-PPG-PEG cargada con el fármaco L-PLBCL2P9 sobre la viabilidad celular de la línea celular HUVEC primaria en relación con el tiempo.

Ejemplo 5

Modificación de fármacos peptídicos para lograr una mayor carga terapéutica en nanopartículas

Se logró una mayor carga de agentes terapéuticos tanto hidrófobos como hidrófilos modificando covalentemente la fracción del fármaco con PLA de bajo peso molecular. El fármaco peptídico se modifica usando PLA de bajo peso molecular usando química de etil-dimetil aminopropil carbodiimida y N-hidroxi-succinimida (EDC/NHS). El peso molecular promedio del PLA utilizado para la unión de la entidad generalmente está en el intervalo de aproximadamente 3.000-10.000 g/mol.

Se disolvió 1 g de PLA con un peso molecular de 5.000 g/mol en 10 ml de acetonitrilo. A esta solución, se añadieron 500 pl de N-(3-dietilaminopropil)-N-etilcarbodiimida (EDC; 400 mM) en diclorometano y 500 pl de N-hidroxisuccinimida (NHS; 100 mM) en diclorometano. La mezcla se agitó suavemente durante 2 horas seguido de precipitación de PLA con éter dietílico. Este PLA se denominó PLA "activado". Se disolvió 1 mmol de PLA activado en acetonitrilo y a esta solución, se le añadió 1 mmol del fármaco peptídico L-PLBCL2P9, y la mezcla de reacción se agitó suavemente nuevamente durante 30 minutos. Esta mezcla se precipitó luego con éter dietílico y se secó a bajo vacío seguido de almacenamiento a -20 °C hasta su uso posterior.

La capacidad de carga del fármaco de la nanopartícula polimérica aumentó con un aumento en el peso del copolímero de bloque utilizado para la preparación de la nanopartícula. La capacidad de carga del fármaco de la nanopartícula también aumenta significativamente por la conjugación del PLA de bajo peso molecular con el agente terapéutico (es decir, L-PLBCL2P9) antes de la carga del fármaco en las nanopartículas poliméricas, como se muestra en las Tablas 4 y 5. El aumento en la capacidad de carga de fármacos de las nanopartículas de la presente invención es de 5% a 10%.

Ejemplo 6

Estudios in vivo para evaluar la seguridad y toxicidad de las nanopartículas

Se realizaron estudios en ratones BALB/c para evaluar la toxicidad y la seguridad de las nanopartículas poliméricas de PLA-PEG-PPG-PEG preparadas usando el proceso como se presenta en el Ejemplo 1.

Parámetros de hematología

Las nanopartículas de PLA-PEG-PPG-PEG se inyectaron por vía intravenosa en el grupo de animales a una dosis única de 150 mg/kg de peso corporal y los parámetros hematológicos se evaluaron en los grupos de control y tratados con nanopartículas a intervalos de 7 días durante un período de 21 días. El grupo de control no recibió nanopartículas. No hubo cambios significativos en el Recuento Sanguíneo Completo (CBC), el recuento de Glóbulos Rojos (RBC), el recuento de Glóbulos Blancos (WBC), Neutrófilos, linfocitos, volumen de células empaquetadas, MCV (Volumen Corpuscular Medio), MCH (Hemoglobina Corpuscular Media) y MCHC (Concentración de Hemoglobina Corpuscular Media) entre el control y los grupos tratados con nanopartículas como se observa en la Figura 8.

Análisis bioquímicos de sangre para las funciones hepática y renal

Las nanopartículas de PLA-PEG-PPG-PEG se inyectaron por vía intravenosa en el grupo de animales a una dosis única de 150 mg/kg de peso corporal y los parámetros hematológicos se evaluaron en los grupos de control y tratados con nanopartículas a intervalos de 7 días durante un período de 21 días.

No hubo cambios significativos en los niveles totales de proteína, albúmina y globulina entre el control y los grupos tratados. Los niveles de las enzimas hepáticas, alanina transaminasa (ALT), aspartato transaminasa (AST) y fosfatasa alcalina (ALP) no aumentaron significativamente en el grupo tratado con nanopartículas de PLA-PEG-PPG-PEG como se observa en la Figura 9. El nitrógeno de urea y de urea en sangre (BUN) es un buen indicador de la función renal. No hubo cambios significativos en los niveles de urea y BUN de los ratones tratados en comparación con el control como se observa en la Figura 9.

Histopatología de los órganos de ratones tratados con nanopartículas de PLA-PEG-PPG-PEG

Los ratones BALB/c se trataron con nanopartículas de PLA-PEG-PPG-PEG a una dosis única de 150 mg/kg de peso corporal. Después de 21 días, se sacrificaron los animales y se realizó una histología de los tejidos del órgano para evaluar cualquier daño tisular, inflamación o lesiones debidas a la toxicidad causada por las nanopartículas de PLA-PEG-PPG-PEG o sus productos de degradación. No se observaron anormalidades ni lesiones histopatológicas evidentes en el cerebro, corazón, hígado, bazo, pulmón y riñón del animal tratado con nanopartículas, como se muestra en la Figura 10.

Ejemplo 7

Eficacia de las nanopartículas de PLA-PEG-PPG-PEG como sistemas de nanoportadores in vivo

Se utilizaron ratones transgénicos modelo Tumoral de Ascitis de Ehrlich (EAT) del tipo de la cepa BALB/c para evaluar la eficacia de las nanopartículas como sistemas de nanoportadores. Se tomaron animales para el estudio con un peso corporal de 20 g (Figura 12a).

El fármaco peptídico anticancerígeno, L-PLBCL2P9, se cargó en las nanopartículas poliméricas de PLA-PEG-PPG-PEG. Los ratones recibieron una formulación intraperitoneal de las nanopartículas poliméricas preparadas en el Ejemplo 2 que comprende el péptido anticancerígeno, L-PLBCL2P9, a una dosis de 200-1000 |jg de péptido encapsulado en PLA-PEG-PPG-PEg . El peso total del péptido anticancerígeno administrado a los animales fue de 300 jg a 600 jg/ratón. La frecuencia de dosificación de la formulación fue quincenal durante un período de 21 días y los animales se mantuvieron en observación durante un período de 60 días.

Se observó supresión del crecimiento tumoral en los ratones después de la administración de las nanopartículas cargadas con L-PLBCL2P9 durante un período de 60 días (Figura 11). Se descubrió que los ratones tratados con las nanopartículas cargadas con L-PLBCL2P9 estaban completamente curados de tumores (Figura 12b) en comparación con el grupo de control (Figura 12c). El grupo de control recibió nanopartículas simples sin ningún agente terapéutico.

Evaluación de nanopartículas de PLA-PEG-PPG-PEG cargadas con insulina como depósito parenteral en conejos diabéticos

Encapsulación de insulina en nanopartículas de PLA-PEG-PPG-PEG

Las nanopartículas de PLA-PEG-PPG-PEG con insulina encapsulada se prepararon por el procedimiento de evaporación doble del disolvente de la emulsión. Para la preparación de nanopartículas, se disolvió 1 g de copolímero de PLA-PEG-PPG-PEG en acetonitrilo. Se añadió insulina (500 UI) a la solución con una breve sonicación de 15 s para producir una emulsión primaria. La emulsión primaria resultante se añadió gota a gota a una fase acuosa de 30 ml y se agitó magnéticamente a temperatura ambiente durante 6-8 horas para permitir la evaporación del disolvente y la estabilización de las nanopartículas. Las nanopartículas se recogieron por centrifugación a 21.000 rpm durante l0 minutos y se lavaron tres veces con agua destilada. Las nanopartículas de PLA-PEG-PPG-PEG cargadas con insulina se liofilizaron y se almacenaron a 4 °C hasta su uso posterior.

Estudios in vivo

A los conejos diabéticos se les administró una dosis única de 50 Ul/kg de peso corporal de nanopartículas de PLA-PEG-PPG-PEG cargadas con insulina, por vía subcutánea, y se monitorizaron durante 10 días.

En animales que recibieron una dosis de insulina de 50 Ul/kg de peso corporal, el nivel de glucosa en sangre se mantuvo entre 120-150 mg/dl hasta 8 días después de lo cual se observó un aumento gradual en el nivel de glucosa en sangre. Las nanopartículas poliméricas cargadas con fármaco forman un depósito en el sitio de inyección y liberan la insulina atrapada de manera sostenida debido a la lenta degradación y difusión. El nivel de glucosa no volvió a los niveles diabéticos originales (500 mg/dl) incluso después de 8 días, lo que indica la capacidad de las nanopartículas poliméricas para retener y liberar insulina bioactiva de manera sostenida durante un período de tiempo de más una semana (Figura 13).

Evaluación de nanopartículas de PLA-PEG-PPG-PEG cargadas con MUC1:

Liberación in vitro de MUC1 encapsulado por la nanopartícula polimérica de PLA-PEG-PPG-PEG

Una mezcla que contenía 10 ml de solución salina tamponada de fosfato y 10 mg de nanopartículas de PLA-PEG-PPG-PEG que encapsula rodamina B conjugada con un péptido del dominio citoplasmático MUC1 unido al dominio de transducción de proteína de poliarginina (Ac-RRRRRRRRRCQCRRKN-NH2) se agitó a 200 rpm a 37 °C. Se recogieron muestras sobrenadantes de la mezcla por centrifugación a 25.000 rpm a diferentes intervalos de tiempo durante un período de 6 días. Las nanopartículas se resuspendieron en tampón nuevo después de cada centrifugación. Se sometieron 2 ml del sobrenadante a estimación de proteínas usando el kit BCA (Pierce, EE. UU.) para evaluar la cantidad de liberación de fármaco espectrofotométricamente a 562 nm. La liberación del fármaco se calculó mediante una curva de calibración estándar. Se observó que la liberación del fármaco por las nanopartículas poliméricas de PLA-PEG-PPG-PEG se puede controlar hasta 60 días (Figura 14).

El ensayo XTT (sal interna de 2.3.-bis(2-metoxi-4-nitro-5-sulfofenil)-5-í(fenilamino)-carbonill-2H-tetrazolio sódico)

La viabilidad celular usando XTT (sal interna de 2,3,-bis(2-metoxi-4-nitro-5-sulfofenil)-5-[(fenilamino)-carbonil]-2H-tetrazolio sódico) se llevó a cabo en líneas celulares HUVEC primarias y líneas celulares MCF-7 (Tabla 6).

Se sembraron un total de 1 x 104 células MCF-7 en cada pocillo de una placa de 96 pocillos y se cultivaron durante 24 h. Después de 24 horas, las células en cada placa se trataron con nanopartículas poliméricas de la presente invención que contenían 20 o 30 pM de péptido de dominio citoplasmático MUC1 unido a una secuencia de poliarginina (RRRRRRRRRCQCRRKN) o nanopartículas de control sin ningún péptido. Las células se incubaron con las nanopartículas durante diferentes intervalos de tiempo que van desde 16 h, 24 h, 48 h, 72 h y 96 h. Después de la incubación, el medio que contenía nanopartículas de PLA-PEG-PPG-PEG cargadas con péptido de dominio citoplasmático MUC1 se intercambió con medio nuevo, y se añadieron 10 pl del reactivo del kit de mezcla XTT reconstituido a cada pocillo. Después de cultivar durante 4 h, se midió la absorbancia de la muestra utilizando un lector de placa de microtitulación (Bio-Rad, CA, EE. UU.) a 450 nm. La proliferación de células se determinó como el porcentaje de células viables del control no tratado y se analizó por triplicado. La Tabla 6 muestra el efecto de la nanopartícula de PLA-PEG-PPG-PEG cargada con péptido de dominio citoplasmático MUC1 sobre la viabilidad celular de la línea celular de carcinoma de mama dependiente de hormonas, MCF-7.

Los expertos en la materia reconocerán, o podrán determinar utilizando no más que la experimentación de rutina, muchos equivalentes a las realizaciones específicas de la invención descritas en el presente documento. Se pretende que tales equivalentes estén abarcados por las siguientes reivindicaciones.

Lista de tablas

La Tabla 1 proporciona los detalles del copolímero de bloque de PEG-PPG-PEG utilizado para la preparación del copolímero de PLA-PEG-PPG-PEG

Claims (15)

REIVINDICACIONES

1. Una nanopartícula polimérica biodegradable formada por el copolímero tetrabloque de PLA-PEG-PPG-PEG o el copolímero pentabloque de PLA-PEG-PPG-PEG-PLA.

2. La nanopartícula polimérica biodegradable de la reivindicación 1 que comprende además un agente terapéutico.

3. La nanopartícula polimérica biodegradable de la reivindicación 2, en la que el agente terapéutico es seleccionada de un grupo que comprende pequeñas moléculas orgánicas, ácidos nucleicos, polinucleótidos, oligonucleótidos, nucleósidos, ADN, a Rn , aminoácidos, péptidos, proteínas, antibióticos, moléculas de bajo peso molecular, quimioterapéuticos, fármacos, iones metálicos, colorantes, radioisótopos, agentes de contraste y agentes de formación de imágenes.

4. La nanopartícula polimérica biodegradable de la reivindicación 3, en la que el péptido es un péptido anticancerígeno o insulina, y en el que el péptido anticancerígeno está opcionalmente modificado químicamente con un polímero hidrófobo.

5. La nanopartícula polimérica biodegradable de las reivindicaciones 1, que comprende además una fracción de direccionamiento seleccionada del grupo que consiste en vitaminas, fármacos de molécula pequeña, ligandos, aminas, fragmentos de péptidos, anticuerpos y aptámeros.

6. Nanopartículas poliméricas biodegradables de PLA-PEG-PPG-PEG que comprenden al menos un agente terapéutico para su uso en un procedimiento para tratar una enfermedad que comprende administrar nanopartículas poliméricas biodegradables de PLA-PEG-PPG-PEG que además comprenden al menos un agente terapéutico, opcionalmente covalentemente unido a poli(ácido láctico), a un sujeto que lo necesite.

7. Nanopartículas poliméricas biodegradables de la reivindicación 6 para su uso en el tratamiento de una enfermedad en la que:

i) la enfermedad es cáncer, y en la que el agente terapéutico es un péptido anticancerígeno, ADN, oligonucleótido, ARNip y/o un quimioterapéutico; o

ii) la enfermedad es diabetes, y en la que el agente terapéutico es insulina.

8. Una composición farmacéutica que comprende una nanopartícula polimérica biodegradable de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, y al menos un vehículo farmacéuticamente aceptable.

9. La nanopartícula polimérica biodegradable de la reivindicación 1, en la que el poli(ácido láctico) (PLA) tiene un peso molecular promedio en el intervalo de aproximadamente 4.000-90.000 g/mol y/o en la que el polietilenglicolpolipropilenglicol-polietilenglicol (PEG-PPG-PEG) tiene un peso molecular promedio en el intervalo de aproximadamente 4.000 g/mol a 15.000 g/mol.

10. La nanopartícula polimérica biodegradable de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que el diámetro de la nanopartícula polimérica biodegradable está en el intervalo de aproximadamente 10 a 200 nm, en el intervalo de aproximadamente 20 a 150 nm, o en el intervalo de aproximadamente 30 a 120 nm.

11. La nanopartícula polimérica biodegradable de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que la nanopartícula polimérica biodegradable está sustancialmente libre de emulsionante o comprende un emulsionante externo de aproximadamente 0,5% a 5% en peso.

12. La nanopartícula polimérica biodegradable de la reivindicación 4, en la que el péptido anticancerígeno es FSRSLHSLL o cualquier polipéptido que incorpore sustancialmente el FSRSLHSLL, y en el que el FSRSLHSLL está en la configuración D o L.

13. La nanopartícula polimérica biodegradable de la reivindicación 4, en la que el péptido anticancerígeno es seleccionado del grupo que consiste en

a) CQCRRKN, una secuencia del dominio MUC1-CD;

b) AQARRKN, una secuencia modificada del dominio MUC1-CD;

c) RRRRRRRRRCQCRRKN, una secuencia del dominio MUC1-CD unido covalentemente a poliarginina; y d) RRRRRRRRRAQARRKN, una secuencia modificada del dominio MUC1-CD unido covalentemente a poliarginina.

14. Una nanopartícula polimérica biodegradable formada del copolímero tetrabloque de PLA-PEG-PPG-PEG o del copolímero pentabloque de PLA-PEG-PPG-PEG-PLA para su uso en el tratamiento del cáncer, en la que la nanopartícula comprende además un péptido anticancerígeno.

15. Una nanopartícula polimérica biodegradable formada del copolímero tetrabloque de PLA-PEG-PPG-PEG o del copolímero pentabloque de PLA-PEG-PPG-PEG-PLA para su uso en el tratamiento de cáncer, en la que la nanopartícula comprende además un agente quimioterapéutico seleccionado del grupo que consiste en paclitaxel, doxorrubicina, docetaxel y gemcitabina.