ES2634492T3 - Compuestos de quinazolinona - Google Patents

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Jack Gordon Parsons
Michael McNAUGHTON
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Abstract

Un compuesto de fórmula general I **Fórmula** el O el en la que R1 y R2 junto con el átomo de N al que están unidos, forman un heterociclilo de 5 o 6 miembros opcionalmente sustituido que puede contener al menos un heteroátomo adicional seleccionado entre N y O; Y R3 se selecciona entre alquilo e 1-6 opcionalmente sustituido y cicloalquilo e 3-6 opcionalmente sustituido, en la que los sustituyentes opcionales se seleccionan entre alquilo e 1-4, arilo opcionalmente sustituido, halo, cicloalquilo e 3-6 opcionalmente sustituido y heterociclilo de 5 o 6 miembros opcionalmente sustituido que contiene al menos un heteroátomo seleccionado entre N y O, o sales farmacéuticamente aceptables del mismo.

Description

Compuestos de quinazolinona. 5 CAMPO
La presente invencion se refiere a compuestos de quinazolinona, procesos para su preparacion y dichos compuestos para su uso como agentes farmaceuticos para el tratamiento de la enfermedad de Parkinson (EP).
10 ANTECEDENTES
La EP es una enfermedad progresiva que se caracteriza sintomaticamente por lentitud del movimiento (bradicinesia), rigidez y/o temblor e inestabilidad postural. Los pacientes con EP tienen una deficiencia de la dopamina neurotransmisora, debido a una degeneracion cronica y progresiva de la sustancia negra en el cerebro.
15
La causa de la EP es desconocida, sin embargo, la deficiencia de dopamina ha conducido al uso extendido de agentes de reemplazo de la dopamina como tratamientos sintomaticos para la enfermedad. El farmaco mas comunmente prescrito para este tratamiento es L-3,4-dihidroxifenilalanina (L-dopa) y agonistas de la dopamina.
20 Estos tratamientos sintomaticos tienen exito en el aumento de la calidad de vida de los pacientes que padecen EP. Sin embargo, dichos tratamientos de reemplazo de la dopamina tienen limitaciones significativas, particularmente en un tratamiento a largo plazo. Estas limitaciones incluyen fluctuaciones en la eficacia del tratamiento, lo que conduce al fenomeno "on-off (fase normal-periodo de bloqueo)" y la aparicion de efectos secundarios que se manifiestan como movimientos involuntarios anormales.
25
En lugar de L-dopa, los medicamentos mas comunes para aliviar estos sfntomas motores son agonistas de la dopamina, tales como asrotigotina, pramipexol, bromocriptina, ropinirol, cabergolina, pergolida, apomorfina y lisurida, agentes anticolinergicos, antagonistas de d-aspartato de N-metilo (NMDA), beta-bloqueantes, asf como el inhibidor de la Monoamina oxidasa B (MAO-B) selegelina y el inhibidor de la Catecol-O-metil transferasa (COMT) entacapona. 30
La mayor parte de estos medicamentos intervienen en la cascada de senales dopaminergicas y/o colinergicas e incluyen sintomaticamente en las alteraciones motoras.
Aunque los tratamientos sintomaticos anteriores pueden mejorar la vida de un paciente con EP, restaurando a 35 menudo casi normalmente la funcion durante algun periodo de tiempo, cada uno tienen efectos secundarios y ningun tratamiento proporciona una cura para la enfermedad. Con el tiempo, segun avanza la enfermedad, la dosificacion del farmaco puede ajustarse para cumplir mejor las necesidades sintomaticas de un paciente.
RESUMEN
40
La presente invencion proporciona compuestos de quinazolina que son neurologicamente activos y pueden usarse en el tratamiento de la EP.
La Publicacion de Patente Internacional n.° WO2005/095360 describe compuestos heterocfclicos que tienen dos 45 anillos de 6 miembros condensados con atomos de nitrogeno en las posiciones 1 y 3, un grupo carboxi en la posicion 4 y un grupo hidroxi en la posicion 8, siendo ambos anillos aromaticos. Estos compuestos son utiles como agentes farmaceuticos, en particular para el tratamiento de afecciones neurologicas, mas especfficamente afecciones neurodegenerativas, tales como enfermedad de Alzheimer (EA).
50 Ahora se han desarrollado compuestos heterocfclicos que tienen dos anillos de 6 miembros condensados con atomos de nitrogeno en las posiciones 1 y 3, un grupo carboxi en la posicion 4, un grupo hidroxi en la posicion 8 y sustituyentes en las posiciones 2 y 3.
Estos compuestos estan dentro del alcance generico de la Publicacion de Patente Internacional n.° 2005/095360, 55 pero no se desvelan especfficamente en la misma.
Sin desear quedar ligando a teorfa alguna, se cree que la naturaleza de los sustituyentes en las posiciones 2 y 3 puede ser importante, haciendoles utiles en el tratamiento de la EP. Particularmente, los sustituyentes en estas posiciones se establecen para proporcionar una gestion superior del hierro ionico biologicamente disponible (Fe),
que se ha identificado en altas concentraciones dentro de la region del cerebro humano asociada a (EP) - la sustancia negra (SN). En respuesta a un activador no identificado en la EP, los niveles de Fe en las neuronas de la SN se elevan significativamente. Este aumento del Fe se cree que esta asociado a la generation de especies reactivas de oxfgeno (ROS) daninas y puede ser un factor que contribuye a la perdida de las celulas productoras de 5 dopamina de la SN, que es la caracterfstica neuropatologica clave de la EP. Los inventores han identificado que los compuestos de la presente invention son capaces especfficamente de asociarse principalmente al Fe, actuando para impedir su captation excesiva por las celulas neuronales y reduciendo su concentration intracelular.
La action de los compuestos de la presente invencion difiere del tratamiento de otras enfermedades neurologicas, 10 tales como EA. Los compuestos empleados para la EA estan disenados para asociarse principalmente a los metales ionicos cobre (Cu) y cinc (Zn). Estos metales particulares han demostrado estar unidos estrechamente dentro de depositos de placa de la protefna beta amiloide (Abeta), una caracterfstica distintiva de la patologfa de la EA. El secuestro y la elimination de Cu y Zn se considera que reduce su disponibilidad para la interaction con Abeta, inhibiendo la toxicidad de esa protefna y la tendencia a formar palcas. Los compuestos para el tratamiento de la EA 15 han demostrado adicionalmente que muestran la funcion de transportar Cu y/o Zn en las celulas neuronales. En EA, se ha demostrado que dichos metales transportados influyen en (disminuyen) el procedimiento de la molecula precursora APP, que se escinde para producir Abeta, como se observa en las placas de Alzheimer, y para promover la expresion de enzimas que degradan Abeta. Como alternativa, los compuestos de la presente invencion se han seleccionado para no facilitar preferiblemente la captacion de metal celular.
20
En un aspecto, se proporciona un compuesto de general formula I
imagen1
en la que
R y R junto con el atomo de N al que estan unidos, forman un heterociclilo de 5 o 6 miembros opcionalmente 25 sustituido que puede contener al menos un heteroatomo adicional seleccionado entre N y O; y
R3 se selecciona entre alquilo Ci-6 opcionalmente sustituido y cicloalquilo C3-6 opcionalmente sustituido, en la que los sustituyentes opcionales se seleccionan entre alquilo C1-4, arilo opcionalmente sustituido, halo, cicloalquilo C3-6 opcionalmente sustituido y heterociclilo de 5 o 6 miembros opcionalmente sustituido que contiene al menos un heteroatomo seleccionado entre N y O,
30 o sales farmaceuticamente aceptables del mismo.
La invencion tambien proporciona un proceso para la preparation del compuesto de formula I que se ha definido anteriormente que comprende las etapas de:
35
(a) delation de un compuesto de formula III en presencia de una fuente de un grupo saliente
en la que
R3 es como se ha definido anteriormente; y R8 es H o un grupo protector
para preparar un compuesto de formula IV
imagen2
imagen3
en la que
R3 y R8 son como se han definido anteriormente; y LG es un grupo saliente; y 5
(b) aminacion del compuesto de formula IV con una fuente de NR1R2 en la que R1 y R2 son como se han definido anteriormente y desproteccion cuando R8 es un grupo protector.
Como alternativa, la invencion proporciona un proceso para la preparacion del compuesto de formula I que se ha 10 definido anteriormente, que comprende las etapas de:
(i) delation de un compuesto de formula V en presencia de una fuente de NR3
imagen4
en la que
15 R3 es como se ha definido anteriormente; y LG es un grupo saliente
para preparar un compuesto de formula VI
en la que
20 R3 y LG son como se han definido anteriormente; y
1 2 1 2
(ii) aminacion del compuesto de formula VI con una fuente de NR R en la que R y R son como se han definido anteriormente.
25 La invencion tambien proporciona el compuesto de formula I que se ha definido anteriormente para su uso como un agente farmaceutico para el tratamiento de la enfermedad de Parkinson.
El compuesto de formula I se administra ventajosamente en forma de una composition farmaceutica junto con un vehfculo farmaceuticamente aceptable.
En un segundo aspecto, se proporciona una composition farmaceutica que comprende el compuesto de formula I que se ha definido anteriormente y un vehiculo farmaceuticamente aceptable.
5 DESCRIPCIQN DETALLADA
La presente invention se refiere a compuestos neurologicamente activos que son utiles para el tratamiento de la enfermedad de Parkinson.
imagen5
sustituido que puede contener al menos un heteroatomo adicional seleccionado entre N y O; y 15 R3 se selecciona entre alquilo C1-6 opcionalmente sustituido y cicloalquilo C3-6 opcionalmente sustituido,
en la que los sustituyentes opcionales se seleccionan entre alquilo C1-4, arilo opcionalmente sustituido, halo, cicloalquilo C3-6 opcionalmente sustituido y heterociclilo de 5 o 6 miembros opcionalmente sustituido que contiene al menos un heteroatomo seleccionado entre N y O, o sales farmaceuticamente aceptables del mismo.
20 Preferiblemente, R3 se selecciona entre metilo sustituido con cicloalquilo C3-6 o metilo sustituido con heterociclilo de 5 o 6 miembros opcionalmente sustituido que contiene al menos un heteroatomo seleccionado entre N y O; alquilo C2-6 sustituido y cicloalquilo C3-6 opcionalmente sustituido.
25
En una realization, los compuestos de formula I tienen la formula la
imagen6
en la que
R a y R a junto con el atomo de N al que estan unidos, forman un heterociclilo de 5 o 6 miembros opcionalmente sustituido que puede contener al menos un heteroatomo adicional seleccionado entre N y O; y R3a es alquilo C1-4
30 o sales farmaceuticamente aceptables del mismo.
1 2
Preferiblemente, R a y R a junto con el atomo de N al que estan unidos, forman un heterociclilo de 5 o 6 miembros saturado opcionalmente sustituido que puede contener al menos un heteroatomo adicional seleccionado entre N y O.
Los ejemplos representativos de compuestos de formula la son como se indican a continuation:
imagen7
o sales farmaceuticamente aceptables de los mismos.
5 En otra realization, los compuestos de formula I tienen la formula lb
imagen8
en la que
R1 y R2 son como se han definido anteriormente; y R3b es cicloalquilo C3-6 opcionalmente sustituido 10 o sales farmaceuticamente aceptables de los mismos.
imagen9
sustituido que puede contener al menos un heteroatomo adicional seleccionado entre N y O; y
R3c se selecciona entre cicloalquilo C3-6 opcionalmente sustituido, arilo opcionalmente sustituido y heterociclilo de 5 o
6 miembros opcionalmente sustituido que contiene al menos un heteroatomo seleccionado entre N y O
o sales farmaceuticamente aceptables de los mismos.
Los ejemplos representativos de compuestos de formula Ic son como se indican a continuacion:
imagen10
o sales farmaceuticamente aceptables de los mismos.
El termino "alquilo C1-6" se refiere a grupos hidrocarburo de cadena lineal o cadena ramificada que tienen de 1 a 6 atomos de carbono. Los ejemplos incluyen etilo, propilo, isopropilo, butilo, isobutilo, sec-butilo, terc-butilo, pentilo, neopentilo y hexilo.
10 El termino "cicloalquilo C3-6" se refiere a grupos hidrocarburo cfclicos no aromaticos que tienen de 3 a 6 atomos de carbono. Los ejemplos incluyen ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo y ciclohexilo.
5
El termino "arilo" se refiere a residuos individuales, polinucleares, conjugados o condensados de hidrocarburos aromaticos. Los ejemplos incluyen fenilo, bifenilo, terfenilo, cuaterfenilo, naftilo, tetrahidronaftilo, antracenilo, 15 dihidroantracenilo, benzantracenilo, dibenxantracenilo y fenantrenilo. Se prefieren arilos de 6 miembros, tal como fenilo.
La expresion "heterociclilo de 5 o 6 miembros" se refiere a grupos hidrocarburo monocfclicos saturados o insaturados que contienen al menos un atomo heteroatomo seleccionado del grupo que consiste en N y O.
20
Los heterociclilos adecuados incluyen grupos heterocfclicos que contienen N, tales como, grupos heteromonocfclicos de 5 o 6 miembros insaturados que contienen de 1 a 4 atomos de nitrogeno, por ejemplo, pirrolilo, pirrolinilo, imidazolilo, pirazolilo, piridilo, pirimidinilo, pirazinilo, piridazinilo, triazolilo o tetrazolilo; grupos heteromonocfclicos saturados de 5 o 6 miembros que contienen de 1 a 3 atomos de nitrogeno, tales como, 25 pirrolidinilo, imidazolidinilo, piperidinilo o piperazinilo;
un grupo heteromonocfclico insaturado de 5 a 6 miembros que contiene un atomo de oxfgeno, tal como piranilo o furilo;
un grupo heteromonocfclico insaturado de 5 o 6 miembros que contiene de 1 a 2 atomos de oxfgeno y de 1 a 3 atomos de nitrogeno, tales como, oxazolilo, isoxazolilo o oxadiazolilo; y 30 un grupo heteromonocfclico saturado de 5 o 6 miembros que contiene de 1 a 2 atomos de oxfgeno y de 1 a 3 atomos de nitrogeno, tal como, morfolinilo.
Los heterociclilos preferidos incluyen piperidinilo, piperazinilo, morfolinilo, piridinilo, pirazolilo, imidazolilo y tetrazolilo. 35 El termino "halo" se refiere a fluor, cloro, bromo y yodo, preferiblemente fluor.
La expresion "opcionalmente sustituido" se refiere a un grupo que puede o no estar adicionalmente sustituido con uno o mas grupos seleccionados entre alquilo C1-6, Si(alquilo 61.0)3, cicloalquilo C3-6, alquenilo C2-6, alquinilo C2-6, arilo, heterociclilo, halo, haloalquilo C1-0, halocicloalquilo C3-0, haloalquenilo C2-0, haloalquinilo C2-0, haloarilo, haloheterociclilo, hidroxi, alcoxi C1-0, alqueniloxi C2-0, alquiniloxi C2-0, ariloxi, heterocicliloxi, carboxi, haloalcoxi C1-0, 5 halOalqueniloxi C2-0, halOalquiniloxi C2-0, haloariloxi, nitro, nitroalquilo C1-0, nitroalquenilo C2-0, nitroarilo, nitroheterociclilo, azido, amino, alquilamino C1-0, alquenilamino C2-0, alquinilamino C2-0, arilamino, heterociclamino acilo, alquilacilo C1-0, alquenilacilo C2-0, alquinilacilo C2-0, arilacilo, heterociclilacilo, acilamino, aciloxi, aldehfdo, alquilsulfonilo C1-0, arilsulfonilo, alquilsulfonilamino C1-0, arilsulfonilamino, alquilsulfoniloxi C1-0, arilsulfoniloxi, alquilsulfenilo C1-0, alquilsulfenilo C2-0, arilsulfenilo, carboalcoxi, carboariloxi, mercapto, alquiltio C1-0, ariltio, aciltio, 10 ciano, grupos que contienen fosforo y similares. Los sustituyentes opcionales preferidos se seleccionan entre alquilo C1-4, arilo opcionalmente sustituido, halo, cicloalquilo C3-0 opcionalmente sustituido y heterociclilo de 5 o 0 miembros opcionalmente sustituido que contiene al menos un heteroatomo seleccionado entre N y O.
Los compuestos de la invencion tambien pueden prepararse como sales que son farmaceuticamente aceptables, 15 pero se apreciara que las sales no farmaceuticamente aceptables tambien entran dentro del alcance de la presente invencion, ya que estas son utiles como intermedios en la preparacion de sales farmaceuticamente aceptables. Los ejemplos de sales farmaceuticamente aceptables incluyen sales de cationes farmaceuticamente aceptables, tales como sodio, potasio, litio, calcio, magnesio, amonio y alquilamonio; sales de adicion de acidos de acidos inorganicos farmaceuticamente aceptables, tales como acido clorhfdrico, ortofosforico, sulfurico, fosforico, nftrico, carbonico, 20 borico, sulfamico y bromhfdrico; o sales de acidos organicos farmaceuticamente aceptables, tales como acido acetico, propionico, butfrico, tartarico, maleico, hidroximaleico, fumarico, cftrico, lactico, mucico, gluconico, benzoico, succfnico, oxalico, fenilacetico, metanosulfonico, trihalometanosulfonico, toluenosulfonico, bencenosulfonico, isetionico, salicflico, sulfanflico, aspartico, glutamico, edetico, estearico, palmftico, oleico, laurico, pantotenico, tannico, ascorbico, valerico y orotico. Las sales de grupos amina tambien pueden comprender sales de amonio 25 cuaternario, en las que el atomo de nitrogeno amino lleva un grupo organico adecuado tal como un resto alquilo, alquenilo, alquinilo o aralquilo. Las sales preferidas son sales de adicion de acidos de acidos inorganicos farmaceuticamente aceptables, tales como sales de adicion de acido clorhfdrico o bromhfdrico.
Las sales pueden formarse mediante medios convencionales, tales como haciendo reaccionar la forma de base libre 30 del compuesto con uno o mas equivalentes del acido apropiado en un disolvente o medio en el que la sal es insoluble, o en un disolvente tal como agua que se retira al vacfo o por liofilizacion o mediante intercambio de los aniones de una sal existentes por otro anion en una resina de intercambio ionico adecuada.
Ha de apreciarse que una referencia a una sal farmaceuticamente aceptable incluye las formas de adicion de 35 disolvente o formas cristalinas de las mismas, particularmente solvatos o polimorfos. Los solvatos contienen cantidades estequiometricas o no estequiometricas de un disolvente, y pueden formarse durante el proceso de cristalizacion con disolventes farmaceuticamente aceptables tales como agua, alcoholes, tales como metanol, etanol o alcohol isopropflico, DMSO, acetonitrilo, dimetil formamida (DMF) y similares, formando parte el solvato de la estructura cristalina mediante union no covalente o ocupando un orificio en la estructura cristalina. Los hidratos se 40 forman cuando el disolvente es agua, o los alcoholatos se forman cuando el disolvente es alcohol. Los solvatos de los compuestos de la presente invencion pueden prepararse o formarse convenientemente durante los procesos descritos en el presente documento. Ademas, los compuestos de la presente invencion pueden existir en formas no solvatadas, asf como solvatadas. En general, las formas solvatadas se consideran equivalentes a las formas no solvatadas para los fines de los compuestos y metodos proporcionados en el presente documento.
45
Ademas, los compuestos de la presente invencion pueden existir en formas no solvatadas, asf como en formas solvatadas con disolventes farmaceuticamente aceptables tales como agua, etanol, y similares. Las formas solvatadas de los compuestos de la presente invencion tambien se considera que seran desveladas en el presente documento.
50
Cuando un compuesto posee un centro quiral, el compuesto puede usarse como un enantiomero o diastereomero purificado, o como una mezcla de cualquier relacion de estereoisomeros. Sin embargo, se prefiere que la mezcla comprenda al menos un 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 97,5 % o un 99 % del isomero preferido.
55 Tambien se describen profarmacos de los compuestos de formula I.
El termino "profarmaco" se usa en el presente documento en su sentido mas amplio para incluir los compuestos que se convierten in vivo en el compuesto de formula I. El uso de la estrategia del profarmaco optimiza la administracion del farmaco con respecto a su sitio de accion, por ejemplo, el cerebro. En una realizacion, los compuestos de
formula I que tienen grupos libres de amino, amido, hidroxi o acido carboxflico pueden convertirse en profarmacos. Los profarmacos incluyen compuestos en los que los carbonatos, carbamatos, amidas y esteres alquflicos que se unen covalentemente a los sustituyentes anteriores de los compuestos de la presente invencion a traves de la cadena lateral del profarmaco de carbonil carbono. Los profarmacos tambien incluyen derivados de fosfato de los 5 compuestos (tal como acidos, sales de acidos, o esteres) unidos a traves de un enlace de fosforo-oxfgeno a un hidroxilo libre de compuestos de formula I. Los profarmacos tambien pueden incluir N-oxidos, y S-oxidos de los atomos de nitrogeno apropiados en la formula I.
En otra realizacion, los profarmacos incluyen la presencia de un resto alquilo C-i-a o arilester que esta disenado para 10 resistir la hidrolisis hasta que el profarmaco ha cruzado la BHE, donde las esterasas en la superficie interna de la BHE actuan para hidrolizar el ester y liberar el C8 hidroxilo del compuesto de formula I.
Procesos para elaborar los compuestos
15 Los compuestos de formula general I se preparan generalmente ciclando el compuesto de formula III. La ciclacion puede realizarse usando cualquier tecnica conocida adecuada, por ejemplo, ciclacion deshidratante que implica cloruro de cloroacetilo.
Los productos formados a partir de cualquier etapa de reaccion pueden derivarse adicionalmente usando tecnicas 20 conocidas por los expertos en la tecnica. Como alternativa, la derivacion del intermedio mono-halo puede experimentarse antes de la reaccion del segundo sustituyente halo. Los expertos en la tecnica apreciaran que el orden de las reacciones descritas para las sfntesis anteriores pueden cambiarse en ciertas circunstancias, y que ciertas funcionalidades pueden necesitar derivarse (es decir, protegerse) en ciertos casos para que las reacciones que se han descrito anteriormente procedan con un rendimiento y eficacia razonables. Los tipos de funcionalidades 25 de proteccion se conocen bien por lo expertos en la tecnica y se describen, por ejemplo, en Greene (Greene, T., Wuts, P. (1999) Protective Groups in Organic Synthesis. Wiley-Interscience; 3a edicion).
Los ejemplos de grupos protectores que pueden usarse para proteger un grupo hidroxi incluyen, pero sin limitacion, grupos sililo (por ejemplo, trimetilsililo, f-butildimetilsililo, t-butildifenilsililo), grupos bencilo (por ejemplo, haluros de 30 bencilo, metoxibencilo, nitrobencilo, bencilo tales como bromuro de bencilo o cloruro de bencilo), grupos alquilo (por ejemplo, metilo, etilo, n e /-propilo, y n, sec y f-butilo) y grupos acilo (por ejemplo, acetilo, tales como cloruro de acetilo o anhfdrido de acetilo y benzoflo).
El grupo saliente puede ser cualquier tipo conocido adecuado, tal como los desvelados en J. March, "Advanced 35 Organic Chemistry: Reactions, Mechanisms and Structure" 4a Edicion, pags. 352-357, John Wiley & Sons, Nueva York, 1992. Preferiblemente, el grupo saliente es halogeno, mas preferiblemente cloro.
Composiciones farmaceuticas
40 La presente invencion proporciona composiciones farmaceuticas que comprenden al menos uno de los compuestos de la formula I y un vehfculo farmaceuticamente aceptable. El vehfculo debe ser "farmaceuticamente aceptable" significa que es compatible con los otros ingredientes de la composicion y no es perjudicial para un sujeto. Las composiciones de la presente invencion pueden contener otros agentes terapeuticos, como se describe a continuacion, y pueden formularse, por ejemplo, empleando vehfculos o diluyentes solidos o lfquidos 45 convencionales, asf como aditivos farmaceuticos de un tipo apropiado para el modo de administracion deseado (por ejemplo, excipientes, aglutinantes, conservantes, estabilizantes, saporfferos, etc.) de acuerdo con tecnicas tales como las conocidas en la tecnica de la formulacion farmaceutica (vease, por ejemplo, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21a Ed., 2005, Lippincott Williams & Wilkins).
50 Los compuestos de la invencion pueden administrarse por cualquier medio adecuado, tal como, por via oral, tal como en forma de comprimidos, capsulas, granulos o polvos; por via sublingual; por via bucal; por via parenteral, tal como por via subcutanea, intravenosa, intramuscular, intra(trans)dermica, o inyeccion intracisternal o tecnicas de infusion (por ejemplo, como soluciones o suspensiones acuosas o no acuosas esteriles inyectables); por via nasal, tal como por nebulizacion por inhalacion o insuflacion; por via topica, tal como en forma de una crema o pomada, por 55 via ocular en forma de una solucion o suspension; por via vaginal en forma de ovulos vaginales, tampones o cremas; o por via rectal, tal como en forma de supositorios; en formulaciones de dosificacion unitarias que contienen vehfculos no toxicos, farmaceuticamente aceptables o diluyentes. Los compuestos pueden, por ejemplo, administrarse en una forma adecuada para su liberacion inmediata o liberacion prolongada. La liberacion inmediata o la liberacion prolongada pueden conseguirse por el uso de composiciones farmaceuticas adecuadas que
comprenden los presentes compuestos, o, particularmente en el caso de la liberacion prolongada, por el uso de dispositivos tales como implantes subcutaneos o bombas osmoticas.
Las composiciones farmaceuticas para la administracion de los compuestos de la invencion pueden presentarse 5 convenientemente en forma de dosificacion unitaria y pueden prepararse por cualquiera de los metodos bien conocidos en la tecnica de farmacia. Estos metodos generalmente incluyen la etapa de poner el compuesto de formula I en asociacion con el vehfculo que constituye uno o mas ingredientes accesorios. En general, las composiciones farmaceuticas se preparan poniendo uniforme e fntimamente el compuesto de formula I en asociacion con un vehfculo lfquido o un vehfculo solido finamente dividido o ambos, y despues, si es necesario, 10 dando forma al producto en la formulacion deseada. En la composicion farmaceutica el compuesto objeto activo se incluye en una cantidad suficiente para producir el efecto deseado en el proceso o condicion de las enfermedades. Como se usa en el presente documento, el termino "composicion" pretende incluir un producto que comprende los ingredientes especificados en las cantidades especificadas, asf como cualquier producto que sea resultado, directa o indirectamente, de la combinacion de los ingredientes especificados en las cantidades especificadas.
15
Las composiciones farmaceuticas que contienen el compuesto de formula I pueden estar en una forma adecuada para su uso oral, por ejemplo, en forma de comprimidos, grageas, pastillas, suspensiones acuosas u oleosas, polvos o granulos dispersables, emulsiones, capsulas duras o blandas, o jarabes o elixires. Las composiciones destinadas al uso oral pueden prepararse de acuerdo con cualquier metodo conocido en la tecnica para la fabricacion de 20 composiciones farmaceuticas y tales composiciones pueden contener uno o mas agentes, tales como agentes edulcorantes, agentes saporfferos, agentes colorantes y agentes conservantes, por ejemplo, para proporcionar preparaciones farmaceuticamente estables y agradables al paladar. Los comprimidos contienen el compuesto de formula I en mezcla con excipientes farmaceuticamente aceptables no toxicos que son adecuados para la fabricacion de comprimidos. Estos excipientes pueden ser, por ejemplo, diluyentes inertes, tales como carbonato de 25 calcio, carbonato sodico, lactosa, fosfato de calcio o fosfato sodico; agentes de granulacion y disgregantes, por ejemplo, almidon de mafz, o acido algfnico; agentes aglutinantes, por ejemplo, almidon, gelatina o goma arabiga, y agentes lubricantes, por ejemplo, estearato de magnesio, acido estearico o talco. Los comprimidos pueden estar sin recubrir o pueden estar recubiertos mediante tecnicas conocidas para retrasar la desintegracion y absorcion en el tracto gastrointestinal y proporcionar asf una accion sostenida durante un perfodo mas largo. Por ejemplo, puede 30 emplearse un material de retardo temporal tal como monoestearato de glicerilo o diestearato de glicerilo. Tambien se pueden recubrir para formar comprimidos terapeuticos osmoticos para una liberacion de control
Las formulaciones para su uso oral tambien pueden presentarse como capsulas duras de gelatina, en las que el compuesto de formula I se mezcla con un diluyente solido inerte, por ejemplo, carbonato de calcio, fosfato de calcio 35 o caolfn, o como capsulas de gelatina blanda, en las que el compuesto de formula I se mezcla con agua o un medio oleoso, por ejemplo aceite de cacahuete, parafina lfquida, o aceite de oliva.
Las suspensiones acuosas contienen los materiales activos en mezcla con excipientes adecuados para la fabricacion de suspensiones acuosas. Tales excipientes son agentes de suspension, por ejemplo 40 carboximetilcelulosa sodica, metilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, alginato sodico, polivinilpirrolidona, goma de tragacanto y goma arabiga; los agentes dispersantes o humectantes pueden ser un fosfatido de origen natural, por ejemplo lecitina, o productos de condensacion de un oxido de alquileno con acidos grasos, por ejemplo estearato de polioxietileno, o productos de condensacion de oxido de etileno con alcoholes alifaticos de cadena larga, por ejemplo heptadecaetilenoxicetanol, o productos de condensacion de oxido de etileno con esteres parciales derivados de 45 acidos grasos y un hexitol tal como monooleato de polioxietileno sorbitol, o productos de condensacion de oxido de etileno con esteres parciales derivados de acidos grasos y anhfdridos de hexitol, por ejemplo monooleato de polietileno sorbitan. Las suspensiones acuosas tambien pueden contener uno o mas conservantes, por ejemplo etilo, o n-propilo, p-hidroxibenzoato, uno o mas agentes colorantes, uno o mas agentes soporfferos, y uno o mas agentes edulcorantes, tales como sacarosa o sacarina.
50
Las suspensiones oleosas pueden formularse suspendiendo el compuesto de formula I en un aceite vegetal, por ejemplo aceite de cacahuete, aceite de oliva, aceite de sesamo o aceite de coco, o en un aceite mineral, tal como parafina lfquida. Las suspensiones oleosas pueden contener un agente espesante, por ejemplo, cera de abejas, parafina dura o alcohol cetflico. Pueden anadirse agentes edulcorantes, tales como los expuestos anteriormente, y 55 agentes saporfferos para proporcionar una preparacion oral de sabor agradable. Estas composiciones se pueden conservar mediante la adicion de un antioxidante tal como acido ascorbico.
Los polvos dispersables y granulos adecuados para la preparacion de una suspension acuosa mediante la adicion de agua proporcionan el compuesto de formula I en mezcla con un agente dispersante o humectante, un agente de
suspension y uno o mas conservantes. Los agentes dispersantes o humectantes y agentes de suspension se ilustran por los ya mencionados anteriormente. Tambien pueden estar presentes excipientes adicionales, por ejemplo, agentes edulcorantes, saporfferos y colorantes.
5 Las composiciones farmaceuticas de la invencion tambien pueden estar en forma de emulsiones de aceite en agua. La fase oleosa puede ser un aceite vegetal, por ejemplo aceite de oliva o aceite de cacahuete, o un aceite mineral, por ejemplo, parafina lfquida o mezclas de estos. Los agentes emulsionantes adecuados pueden ser gomas ocurrir naturalmente, por ejemplo goma arabiga o goma de tragacanto, fosfatidos de origen natural, por ejemplo soja, lecitina y esteres o esteres parciales derivados de acidos grasos y anhfdridos de hexitol, por ejemplo monooleato de 10 sorbitan, y productos de condensacion de dichos esteres parciales con oxido de etileno, por ejemplo monooleato de polioxietilensorbitan. Las emulsiones tambien pueden contener agentes edulcorantes y saporfferos.
Los jarabes y elixires se pueden formular con agentes edulcorantes, por ejemplo glicerol, propilenglicol, sorbitol o sacarosa. Dichas formulaciones tambien pueden contener un demulcente, un conservante y agentes saporfferos y 15 colorantes.
Las composiciones farmaceuticas pueden estar en la forma de una suspension acuosa u oleaginosa inyectable esteril. Esta suspension se puede formular de acuerdo con la tecnica conocida usando los agentes dispersantes o humectantes y agentes de suspension adecuados que se han mencionado anteriormente de suspension. La 20 preparacion inyectable esteril puede ser tambien una solucion o suspension inyectable esteril en un diluyente parenteralmente aceptable no toxico o disolvente, por ejemplo, como una solucion en 1,3 diol-butano. Entre los vehfculos y disolventes aceptables que pueden emplearse se encuentran agua, solucion de Ringer y solucion isotonica de cloruro sodico. Ademas, se emplean convencionalmente aceites fijos esteriles como un disolvente o medio de suspension. Para este fin puede emplearse cualquier aceite fijo blando incluyendo mono o digliceridos 25 sinteticos. Ademas, los acidos grasos, tales como acido oleico, encuentran uso en la preparacion de formulaciones inyectables.
Para la administracion al tracto respiratorio, incluyendo la administracion intranasal, el compuesto activo se puede administrar por cualquiera de los metodos y formulaciones que se emplean en la tecnica para administracion al 30 tracto respiratorio.
Por lo tanto, en general, el compuesto activo se puede administrar en forma de una solucion o una suspension o como un polvo seco.
35 Las soluciones y suspensiones seran generalmente acuosas, por ejemplo preparadas a partir de agua sola (por ejemplo agua esteril o libre de pirogenos) o agua y un co-disolvente fisiologicamente aceptable (por ejemplo etanol, propilenglicol o polietilenglicoles, tales como PEG 400).
Dichas soluciones o suspensiones pueden contener adicionalmente otros excipientes, por ejemplo, conservantes 40 (tales como cloruro de benzalconio), agentes/tensioactivos solubilizantes tales como polisorbatos (por ejemplo, Tween 80, Span 80, cloruro de benzalconio), agentes tamponantes, agentes de ajuste de la isotonicidad (por ejemplo, cloruro sodico), potenciadores de la absorcion y potenciadores de viscosidad. Las suspensiones pueden contener ademas agentes de suspension (por ejemplo, celulosa microcristalina y carboximetilcelulosa sodica).
45 Las soluciones o suspensiones se aplican directamente a la cavidad nasal por medios convencionales, por ejemplo con un cuentagotas, pipeta o pulverizador. Las formulaciones pueden proporcionarse en una forma unica o multidosis. En el ultimo caso, se proporciona deseablemente un medio de medicion de dosis. En el caso de un gotero o pipeta, esto se puede conseguir por la administracion al sujeto de un volumen predeterminado apropiado de la solucion o suspension. En el caso de un pulverizador, esto se puede conseguir, por ejemplo, por medio de una 50 bomba de pulverizacion de atomizacion dosificadora.
La administracion al tracto respiratorio tambien puede conseguirse por medio de una formulacion en aerosol en la que el compuesto se proporciona en un envase presurizado con un propulsor adecuado, tal como un clorofluorocarbono (CFC), por ejemplo diclorodifluorometano, triclorofluorometano o diclorotetrafluoroetano, dioxido 55 de carbono u otro gas adecuado. El aerosol tambien puede contener convenientemente un tensioactivo tal como lecitina. La dosis de compuesto activo puede controlares mediante la provision de una valvula dosificadora.
Como alternativa, el compuesto activo puede proporcionarse en forma de un polvo seco, por ejemplo, una mezcla en polvo del compuesto en una base en polvo adecuada, tal como lactosa, almidon, derivados de almidon, tales como
hidroxipropilmetil celulosa y polivinilpirrolidona (PVP). Convenientemente, el vehfculo en polvo formara un gel en la cavidad nasal. La composicion en polvo puede presentarse en forma de dosis unitaria, por ejemplo en capsulas o cartuchos de, por ejemplo, gelatina, o envases blister a partir de los cuales el polvo se puede administrar por medio de un inhalador.
5
En formulaciones destinadas a la administracion al tracto respiratorio, incluyendo formulaciones intranasales, el compuesto activo generalmente tendra un tamano de partfcula pequeno, por ejemplo del orden de 5 micrometros o menos. Tal tamano de partfcula puede obtenerse por medios conocidos en la tecnica, por ejemplo por micronizacion.
10 Cuando se desee, se pueden emplear formulaciones adaptadas para dar una liberacion sostenida del compuesto activo.
El compuesto activo se puede administrar por inhalacion oral como un polvo de flujo libre a traves de un "Diskhaler" (marca registrada de Glaxo Group Ltd) o un inhalador de aerosol de dosis regulada.
15
Los compuestos de la presente invencion tambien se pueden administrar en forma de supositorios para la administracion rectal del farmaco. Estas composiciones se pueden preparar mezclando el farmaco con un excipiente no irritante adecuado que es solido a temperaturas ordinarias pero lfquido a la temperatura rectal y, por lo tanto, se fundira en el recto para liberar el farmaco. Tales materiales son manteca de cacao y polietilenglicoles.
20
Las composiciones adecuadas para administracion vaginal pueden presentarse como ovulos vaginales, tampones, cremas, geles, pastas, espumas o pulverizadores que contienen ademas del principio activo, tales vehfculos que se conocen en la tecnica como apropiados.
25 Para su uso topico, se emplean cremas, pomadas, jaleas, soluciones o suspensiones, etc., que contienen los compuestos de la presente invencion. (Para los fines de esta solicitud, la aplicacion topica incluira enjuagues bucales y gargarismos).
Para aplicacion en el ojo, el compuesto activo puede estar en la forma de una solucion o suspension en un vehfculo 30 acuoso o no acuoso esteril adecuado. Tambien pueden incluirse aditivos, por ejemplo, tampones, conservantes incluyendo agentes bactericidas y fungicidas, tales como acetato o nitrato de fenil mercurico, cloruro de benzalconio, o clorohexidina y agentes espesantes, tales como hipromelosa.
Los compuestos de la presente invencion tambien se pueden administrar en forma de liposomas. Como se conoce 35 en la tecnica, los liposomas se obtienen generalmente de fosfolfpidos u otras sustancias lipfdicas. Los liposomas estan formados por cristales lfquidos hidratados mono o multilamelares que se dispersan en un medio acuoso. Puede usarse cualquier lfpido no toxico, fisiologicamente aceptable y metabolizable capaz de formar liposomas. Las presentes composiciones en forma de liposomas pueden contener, ademas de un compuesto de la presente invencion, estabilizantes, conservantes, excipientes y similares. Los lfpidos preferidos son los fosfolfpidos y 40 fosfatidilcolinas, tanto naturales como sinteticos. Se conocen en la tecnica metodos para formar liposomas.
La eficacia de esta clase de compuestos puede ser aplicable a endoprotesis de elucion de farmacos. Las aplicaciones potenciales de las endoprotesis de elucion de farmacos con estos compuestos incluyen la estenosis de la arteria pulmonar, estenosis de la vena pulmonar, asf como estenosis de la arteria coronaria. Las endoprotesis de 45 elucion de farmacos tambien se pueden usar en los injertos de vena safena o injertos o conductos arteriales. Las endoprotesis de elucion de farmacos tambien se pueden usar en los injertos de vena safena o injertos o conductos arteriales. Las endoprotesis de elucion de farmacos que liberan esta clase de compuestos tambien pueden ser aplicables para el tratamiento de estenosis de la aorta o las arterias perifericas, tal como la arteria ilfaca, la arteria femoral o la arteria poplftea. El compuesto puede estar unido a la endoprotesis de elucion de farmaco por cualquiera 50 de diversos metodos conocidos en el campo. Los ejemplos de tales metodos incluyen polfmeros, fosforil colina y ceramica. El compuesto tambien se puede impregnar en una endoprotesis bioabsorbible.
Los compuestos activos tambien pueden presentarse para su uso en forma de composiciones veterinarias, que se pueden preparar, por ejemplo, por metodos que son convencionales en la tecnica. Los ejemplos de tales 55 composiciones veterinarias incluyen aquellas adaptadas para:
(a) administracion oral, aplicacion externa, por ejemplo, sistemas de pulverizacion (por ejemplo, soluciones o suspensiones acuosas o no acuosas); comprimidos o bolos; polvos, granulos o perlas para mezcla con piensos; pastas para aplicacion a la lengua;
(b) administracion parenteral, por ejemplo, por inyeccion subcutanea, intramuscular o intravenosa, por ejemplo, como una solucion o suspension esteril; o (cuando sea apropiado) por inyeccion intramamaria, donde se introduce una suspension o disolucion en la ubre a traves del pezon;
(c) aplicaciones topicas, por ejemplo, como una crema, pomada o pulverizacion aplicada a la piel; o
5 (d) por via rectal o intravaginal, por ejemplo, como un ovulo vaginal, crema o espuma.
La composicion farmaceutica y el metodo de la presente invencion pueden comprender ademas otros compuestos terapeuticamente activos como se aprecia en el presente documento que se aplican normalmente en el tratamiento de afecciones neurologicas. La seleccion de los agentes apropiados para su uso en terapia de combinacion puede 10 hacerse por un experto en la tecnica, de acuerdo con los principios farmaceuticos convencionales. La combinacion de agentes terapeuticos puede actuar sinergicamente para efectuar el tratamiento o prevencion de los diversos trastornos que se han descrito anteriormente. Usando este enfoque, se puede lograr eficacia terapeutica con dosificaciones mas bajas de cada agente, reduciendo de esta manera el potencial de efectos secundarios adversos.
15 Los ejemplos de otros agentes terapeuticos incluyen agentes de reemplazo de la dopamina y agonistas de la dopamina tales asrotigotina, pramipexol, bromocriptina, ropinirol, cabergolina, pergolida, apomorfina y lisurida, agentes anticolinergicos, antagonistas de NMDA, beta-bloqueantes, asf como el inhibidor de MAO-B selegilina y el inhibidor de COMT entacapona.
20 Cuando se emplean otros agentes terapeuticos en combinacion con los compuestos de la presente invencion se pueden usar, por ejemplo, en cantidades como se indica en la Physician Desk Reference (PDR) o como se determina de otra manera por un experto en la tecnica.
Usos
25
Los compuestos de formula I se pueden usar en el tratamiento de la enfermedad de Parkinson.
Generalmente, el termino "tratamiento" se refiere a que afecta a un sujeto, tejido o celula para obtener un efecto farmacologico y/o fisiologico deseado e incluyen: (a) prevenir que se produzca la enfermedad en un sujeto que 30 puede estar predispuesto a la enfermedad, pero aun no se ha diagnosticado que la tiene; (B) inhibir la enfermedad, es decir, detener su desarrollo; o (c) aliviar o mejorar los efectos de la enfermedad, es decir, causar la regresion de los efectos de la enfermedad.
El termino "sujeto" se refiere a cualquier animal que tiene una enfermedad que requiere tratamiento con el 35 compuesto de formula I.
Ademas de los primates, como los seres humanos, pueden tratarse una diversidad de mamfferos diferentes usando los compuestos, composiciones y metodos de la presente invencion. Por ejemplo, pueden tratarse mamfferos incluyendo, pero sin limitacion, vacas, ovejas, cabras, caballos, perros, gatos, cobayas, ratas u otros animales 40 bovinos, ovinos, equinos, caninos, felinos, roedores o murinos. Sin embargo, la invencion tambien se puede poner en practica en otras especies, tales como especies aviares (por ejemplo, pollos).
El termino "administracion" debe entenderse que significa proporcionar un compuesto de la invencion a un sujeto que necesita tratamiento.
45
Dosificaciones
La expresion "cantidad terapeuticamente eficaz" se refiere a la cantidad del compuesto de formula I que provocara la respuesta biologica o medica de un tejido, sistema, animal o ser humano que se busca por el investigador, 50 veterinario, doctor en medicina u otro medico.
En el tratamiento o prevencion de afecciones que requieren la inhibicion de la cinasa, un nivel de dosificacion apropiado sera generalmente de aproximadamente 0,01 a 500 mg por kg de peso corporal del paciente por dfa que se puede administrar en dosis unicas o multiples. Preferiblemente, el nivel de dosificacion sera de aproximadamente 55 0,1 a aproximadamente 250 mg/kg por dfa; mas preferiblemente de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 100 mg/kg por dfa. Un nivel de dosificacion adecuado puede ser de aproximadamente 0,01 a 250 mg/kg por dfa, aproximadamente de 0,05 a 100 mg/kg por dfa, o aproximadamente 0,1 a 50 mg/kg por dfa. Dentro de este intervalo, la dosificacion puede ser de 0,05 a 0,5, 0,5 a 5 o de 5 a 50 mg/kg por dfa. Para la administracion oral, las composiciones se proporcionan preferiblemente en forma de comprimidos que contienen de 1,0 a 1000 miligramos
del principio activo, particularmente 1,0, 5,0, 10,0, 15,0, 20,0, 25,0, 50,0, 75,0, 100,0, 150,0, 200,0, 250,0, 300,0, 400,0, 500,0, 600,0, 750,0, 800,0, 900,0 y 1000,0 miligramos del principio activo. La dosificacion puede seleccionarse, por ejemplo, a cualquier dosis dentro de cualquiera de estos intervalos, para la eficacia terapeutica y/o ajuste sintomatico de la dosificacion al paciente a tratar. Los compuestos se administraran preferiblemente en un 5 regimen de 1 a 4 veces por dfa, preferiblemente una o dos veces por dfa.
Se entendera que el nivel de dosis especffico y la frecuencia de dosificacion para cualquier paciente particular puede variarse y dependera de una diversidad de factores, incluyendo la actividad del compuesto especffico empleado, la estabilidad metabolica y la duracion de la accion de ese compuesto, la edad, peso corporal, salud general, sexo, 10 dieta, modo y tiempo de administracion, velocidad de excrecion, combinacion de farmacos, la gravedad de la afeccion particular, y el huesped sometido a terapia.
Ejemplos
15 La invencion se describira ahora en detalle a modo de referencia unicamente con respecto a los siguientes ejemplos no limitantes.
Para fines de claridad, a los compuestos de esta invencion se les hace referencia mediante numeros, por ejemplo 14 y 2-3. Las estructuras de los compuestos de ejemplo a las que se hace referencia se dan en las Tablas 1-7.
20
En los Ejemplos 1 a 7, se cita la siguiente referencia:
White y col., J Neuroscience, (1998) 18, 6207-6217.
25 Ejemplo 1 Esquema 1
Una gama de 8-hidroxi-3H-quinazolin-4-onas 2,3-disustituidas 4-9 pueden prepararse mediante la ruta sintetica 30 representada en el Esquema 1. El acido 2,4-diclorobenzoico disponible en el mercado 1-1 se nitra para dar acido 2,4-dicloro-5-nitrobenzoico 1-2. El compuesto nitro 1-2 se reduce con cloruro de estano (II) para proporcionar la anilina 1-3 que, a su vez, se convierte en la acetamida 1-4. Una segunda nitracion proporciona el intermedio 1-5, la hidrolisis de la base posterior proporciona el fenol 1-6. La amida 2-10 se produce en presencia de una amina y un agente de activacion, EDC. La reaccion destaca en que el fenol no requiere proteccion. La amida 2-10 se deja 35 reaccionar con polvo de Fe en acido acetico glacial para dar la amina 2-11. La reaccion con cloruro de cloroacetilo seguido de reaccion de condensacion con PCl3 proporciona el compuesto de clorometilo 4-15. Finalmente, la aminacion con una amina secundaria y la formacion de HCl proporciona los compuestos diana deseados 4-9.
imagen11
Acido 2,4-dicloro-5-nitrobenzoico (1-2)
Se anadio en una portion acido 2,4-diclorobenzoico 1-1 (1,0 g, 5,34 mmol) a una solution agitada de acido nftrico 5 concentrado (0,26 ml, 5,75 mmol) en acido sulfurico concentrado (7 ml). Despues de 3 horas a temperatura ambiente, la solution se vertio sobre hielo. El solido de color blanco resultante se aislo por filtration y se lavo con H2O (x 3). Despues, el solido de color blanco se agito con Na2CO3 al 1 % (ac.) (20 ml) durante 1 h a temperatura ambiente. El material insoluble restante se retiro por filtration y el filtrado transparente resultante se concentro para dar un solido de color amarillo palido. La recristalizacion en H2O proporciono la sal sodica en forma de cristales de 10 color amarillo palido. (Nota: el otro producto secundario, 2,4-dicloro-3-nitrobenzoato sodico, permanecio en solucion). Los cristales de color amarillo de 2,4-dicloro-5-nitrobenzoato sodico se disolvieron en una cantidad minima de H2O y se acidifico mediante la adicion lenta de HCl concentrado hasta que se formo un precipitado de color blanco. Despues del aislamiento por filtration y el lavado con H2O se obtuvo acido 2,4-dicloro-5-nitrobenzoico 1-2 en forma de un solido de color blanco (0,91 g, 72 %). 1H RMN (400 MHz, CDCh) 5 7,73 (s, 1H), 8,60 (s, 1H).
15
Acido 2,4-dicloro-5-aminobenzoico (1-3)
Se anadio cloruro de estano (II) hidrato (50 g, 0,29 mol) a una solucion de acido 2,4-dicloro-5-nitrobenzoico 1-2 (10,0 g, 0,045 mol) en EtOH (200 ml). La mezcla se agito durante 70 °C durante 30 min, se enfrio y se vertio sobre 20 hielo. El pH de la mezcla se ajusto a 8 usando NaHCO3 acuoso saturado. La suspension se dejo en agitation a temperatura ambiente durante 5 h y se acidifico de nuevo a pH 5 con AcOH glacial. La suspension de color blanco resultante se lavo continuamente con EtOAc, los extractos se combinaron, se lavaron con salmuera, se secaron sobre Na2SO4, se filtraron y se concentraron para proporcionar la amina deseada 1-3 en forma de un solido de color blanquecino (8,8 g, 96 %). 1H RMN (400 MHz, CD3OD) 5 7,27 (s, 1H), 7,30 (s, 1H).
25
Acido 5-acetamido-2,4-diclorobenzoico (1-4)
Se anadio anhfdrido acetico (27 ml) a acido 2,4-dicloro-5-aminobenzoico 1-3 (8,0 g, 0,041 mol) en AcOH glacial (150 ml). La solucion se agito a temperatura ambiente durante 30 min y se concentro para producir la acetamida 30 deseada 1-4 en forma de un solido de color blanco (9,6 g, 96 %). 1H RMN (400 MHz, CD3OD) 5 2,19 (s, 3H), 7,62 (s, 1H), 8,32 (s, 1H).
Acido 3-acetamido-4,6-dicloro-2-nitrobenzoico (1-5)
Se anadio en porciones acido 5-acetamido-2,4-diclorobenzoico 1-4 (40,0 g, 0,161 mol) a una mezcla enfriada de H2SO4 concentrado (400 ml) y acido mtrico concentrado (400 ml) a 5 °C. Despues de agitar durante 2 h, se anadio 5 H2SO4 concentrado (100 ml)/acido mtrico concentrado (100 ml). Despues de 90 min mas, se anadio H2SO4 concentrado (400 ml)/acido mtrico concentrado (200 ml) y la agitacion continuo durante 2 h mas. La mezcla de reaccion se vertio cuidadosamente sobre hielo, dando como resultado la formacion de un precipitado de color amarillo. El producto se recogio por filtracion y despues se extrajo en EtOAc. Las capas organicas combinadas se lavaron con H2O y salmuera, se secaron sobre Na2SO4, se filtraron y se concentraron para proporcionar el 10 compuesto nitro 1-5 en forma de un solido de color amarillo/naranja (38,1 g, rendimiento del 81 %). 1H RMN (400 MHz, d6-DMSO) 6 1,99 (s, 3H), 8,21 (s, 1H), 10,27 (s, 1H).
Acido 4,6-dicloro-3-hidroxi-2-nitrobenzoico (1-6)
15 Se anadio una solucion de KOH (73,4 g,) en H2O (330 ml) a acido 3-acetamido-4,6-dicloro-2-nitrobenzoico 1-5 (38,1 g, 0,130 mol). La solucion de color pardo resultante se calento a reflujo durante 18 h (temp. bano 130 °C). La reaccion se enfrio y se extrajo con eter. Despues, la capa acuosa se acidifico a pH 2 con HCl concentrado y se extrajo en EtOAc (x 4). Las capas organicas combinadas se lavaron con salmuera (x 3), se secaron sobre Na2SO4, se filtraron y se concentraron para proporcionar acido 4,6-dicloro-3-hidroxi-2-nitrobenzoico 1-6 en forma de un solido 20 de color pardo (31,0 g, 95 %). 1H RMN (400 MHz, d6-DMSO) 6 7,88 (s, 1H).
4.6- Dicloro-N-ciclopropilmetil-3-hidroxi-2-nitrobenzamida (2-10, R = ciclopropilmetilo))
El acido 4,6-dicloro-3-hidroxi-2-nitrobenzoico 1-6 (5,03 g, 19,9 mmol) se disolvio en CH2Cl2 anhidro (60 ml) y THF 25 anhidro (30 ml) y despues se trato con EDC (4,61 g, 24,0 mmol), (aminometil)ciclopropano (2,35 ml, 27,1 mmol) y DIEA (4,18 ml, 24,0 mmol). La reaccion se agito durante una noche a temperatura ambiente y despues se diluyo con CH2Cl2 y HCl 0,5 M (ac.). El producto se extrajo en CH2Ch (x 4). La capa organica se lavo con NaHCO3 ac. sat. y salmuera, se seco sobre Na2SO4, se filtro y se concentro para proporcionar la amida 2-10 en forma de una espuma de color pardo (3,40 g, rendimiento en bruto del 56 %). 1H RMN (400 MHz, d6-DMSO) 6 0,17 (m, 2H).0,32 (m, 2H),
30 0,93 (m, 1 H), 3,0 (t, J = 8 Hz, 2H), 7,16 (s, 1 H), 8,38 (t a, J = 8,0 Hz, 1 H).
2-Amino-4,6-dicloro-N-ciclopropilmetil-3-hidroxi-benzamida (2-11, R = ciclopropilmetilo)
La amida 2-10 (10,1 g, 33,1 mmol) se disolvio en AcOH glacial (180 ml), despues se trato con polvo de Fe (11,2 g, 35 0,2 mol) y se calento a 80 °C en una atmosfera de nitrogeno durante 1,5 h. La suspension de color beige se trato con NaHCO3 ac. sat. hasta que se hizo transparente, y despues se filtro a traves de celite lavando con EtOH. El filtrado se concentro y despues se extrajo en EtOAc (x 4). La capa organica se lavo con salmuera, se seco sobre Na2SO4, se filtro, se concentro y se trituro con eter/petroleo (1:10). La amina 2-11 se recogio por filtracion en forma de un solido de color pardo oscuro (6,8 g, 75 %). 1H RMN (400 MHz, d6-DMSO) 6 0,21 (m, 2H), 0,39 (m, 2H), 1,18(m, 1 H),
40 3,10 (t, J = 8,0 Hz, 2H), 4,93 (s a, 2H), 6,84 (s, 1 H), 8,42 (t a, J = 8,0 Hz, 1H).
5.7- Dicloro-2-clorometil-3-ciclopropilmetil-8-hidroxi-3H-quinazolin-4-ona (4-15, R = ciclopropilmetilo)
La amina 2-11 (6,8 g, 24,7 mmol) en CH2Ch anhidro (85 ml) se trato con cloruro de cloroacetilo (4,5 ml, 56,5 mmol) a 45 0 °C en una atmosfera de N2. La reaccion se calento a temperatura ambiente durante 30 min y despues se diluyo con eter (30 ml)/petroleo (100 ml). El precipitado de color pardo resultante se recogio por filtracion, lavado con petroleo y se seco para proporcionar el intermedio clorometilacetamida en forma de un polvo de color pardo (6,4 g, 74 %). 1H RMN (400 MHz, d6-DMSO) 6 0,18 (m, 2H), 0,38 (m, 2H), 1,26 (m, 1 H), 3,04 (t, J = 8,0 Hz, 2H), 4,19 (s, 2H), 7,52 (s, 1 H), 8,18 (s, 1 H), 9,67 (s, 1 H), 10,07 (s a, 1 H). A una suspension de la clorometilacetamida (2,59 g, 50 7,37 mmol) en tolueno (73 ml) se le anadio PCl3 (1,93 ml, 22,1 mmol). La reaccion se calento a reflujo vigoro en una atmosfera de Ar durante 2,5 h. Se enfrio y se concentro al vado. Se anadio H2O (10 ml), despues NaHCO3 ac. sat. (2 ml) hasta un pH de 5-6. Se anadio EtOAc y se sonico bien, transfiriendo la mezcla a un embudo de separacion. Se extrajo en EtOAc (x 4), se seco sobre Na2SO4, se filtro, se concentro y se purifico por FC eluyendo con EtOAc al 20 %/petroleo para proporcionar el compuesto clorometilo deseado 4-15 en forma de un solido de color naranja claro 55 (771 mg, 31 %). 1H RMN (400 MHz, d6-DMSO) 60,41 (m, 4H), 1,22 (m, 1H), 3,97 (d, J = 4,4 Hz, 2H), 4,81 (s, 2H), 7,57 (s, 1H), 10,39 (s, 1H).
F4267
Se disolvio el derivado clorometilo 4-15 (917 mg, 2,75 mmol) en CH2Cl2 anhidro (25 ml) enfriado a 0 °C y despues se trato con dimetilamina (7,5 ml, 15,0 mmol, solucion 2,0 M en MeOH). La reaction se dejo calentar a temperatura ambiente durante una noche, despues se concentro y se extrajo en CH2Cl2 lavando con NaHCO3 ac. sat. La capa acuosa se extrajo adicionalmente con CH2Cl2 (x 3). Las capas organicas combinadas se secaron sobre Na2SO4, se 5 filtraron y se concentraron. El aceite resultante se recogio en MeOH (50 ml) y se trato con HCl conc. (1,5 ml). Despues de concentrar la solucion, el solido de color amarillo resultante se bombeo seco y despues se trituro con MeOH (3 ml)/eter (70 ml) para precipitar F4267 (820 mg, 79 %) en forma de un solido de color amarillo palido que se recogio por filtration (Vease la Tabla 1 para el Analisis).
10 Tabla 1: Compuestos y Compuestos Comparativos (*) preparados de acuerdo con el Ejemplo 1 (Esquema 1)
Compuesto
Estructura PM 1H RMN Espec. Masas
F4267*
Cl o OH NMe2 Precursor: 342,2 sal HCl: 378,7 1H RMN (400 MHz, d6-DMSO) 5 0,48 (m, 4H), 1,19 (t, J = 4,80 Hz, 1H), 2,94 (s, 3H), 2,95 (s,3 H), 3,85 (d, J = 6,8 Hz, 2H), 4,86 (d, J = 4,80 Hz, 2H), 7,63 (s, 1 H), 8,68 (s a,1H) m/z 342,1, 344,1 [M+H]+
F4268*
Cl O °nrX HC, OH NMe2 Precursor: 316,2 sal HCl: 352,6 1H RMN (400 MHz, d6-DMSO) 5 1,24 (t, J = 7,2 Hz, 3H), 2,96 (s, 3H), 2,97 (s, 3H), 3,91 (c, J = 7,2 Hz, 2H), 4,79 (d, J = 5,2 Hz, 2H), 7,64 (s, 1 H), 10,21 (s, 1 H), 10,51 (s, 1 H). m/z 316,1, 318,0 [M+H]+
F4383
Cl O OH N ^l\T k Precursor: 411.3 sal bis HCl: 484.3 1H RMN (400 MHz, D2O) 5 0,20 (d, J = 4,0 Hz, 2H), 0,39(d, J = 4,8 Hz, 2H),0,96 (m, 1H), 1,17 (t, J = 7,Hz, 3H), 3,03(c, J = 7,0, 4,0 Hz, 2H), 3,30(m a, 8H), 3,78(d, J = 4,0 Hz, 2H), 4,06(s, 2H), 7,04(s, 1 H). m/z 411,2, 413,2 [M+H]+
F4384
Cl o OH N Sx Precursor: 384,3 sal HCl: 420,7 1H RMN (400 MHz, d6-DMSO) 5 0,48 (m, 4H), 1,21(m, 1 H), 3,59(d, J = 4,8 Hz, 2H),3,90 (d, J = 4,0 Hz, 2H), 3,97(d, J = 4,8 Hz, 2H), 4,15(t, J = 4,8 Hz, 2H), 4,85 (s, 2H), 7,62 (s, 1 H), 10,58 (s, 1 H), 10,87 (s a, 1H). m/z 411,2, 413,2 [M+H]+
F4385*
Cl 0 .AX’ OH Precursor: 370,3 sal HCl: 406,7 1H RMN (400 MHz, d6-DMSO) 5 0,43(m, 2H), 1,17(t, J = 7,6 Hz, 2H),1,20(m, 1H),1,29(t, J = 7,2 Hz, 3H), 2,86(m, 2H), 3,15 (parcialmente oscurecido), 3,92(d, J = 7,2 Hz, 2H), 4,76 (d, J = 4,8 Hz, 2H), 7,65(s,1H),10,10(s, 1H),10,81(s, 1H). m/z 370,1, 372,2 [M+H]+
F4386*
Cl 0 cXX" OH Precursor: 344,2 sal HCl: 380,7 1H RMN (400 MHz, d6-DMSO) 5 1,25, (t, J = 7,2 Hz), 1,30 (t, J = 7,2 Hz, 3H), 4,71(d, J = 4,0 Hz, 2H), 3,38(parcialmente oscurecido), 3,96(c, J = 7,2, 4,0 Hz, 2H), 7,65 (s, 1 H), 9,66 (s, 1H), 10,63(s, 1H). m/z 344,0, 346,1[M+H]+
F4387*
Cl O C|AfAN^ OH \7 Precursor: 366,2 sal HCl: 402,7 1H RMN (400 MHz, d6-DMSO) 5 0,46(d, J = 4,4 Hz, 2H), 0,52(d, J = 7,2 Hz, 2H), 1,18(m, 1 H), 3,03(s a, 3H), 3,90(m, 2H), 3,98(s, 1 H), 4,32(s, 2H), 4,84(s, 2H), 7,66(s, 1 H), 10,51 (s, 1 H), 10,68(s, 1 H). m/z 366,1, 368,1 [M+H]+
F4391
Cl 0 “ 0 Precursor: 382,3 sal HCl: 418,7 1H RMN (400 MHz, d6-DMSO) 5 0,53 (m,4H), 1,19 (m,1 H), 1,43(m, 1 H), 1,72(m, 1H), 1,81 (m, 2H), 2,06(m, 2H), 3,18(m, 2H), 3,67(m, 2H), 3,92(d, J = 7,0 Hz), 4,80(s, 2H), 7,61 (s, 1 H), 10,18(s a, 1 H), 10,65(s, 1 H). m/z 382,4, 384,4
F4392*
OH Precursor: 340,2 sal HCl: 376,7 1H RMN (400 MHz, d6-DMSO) 5 1,24 (t, J = 7,2 Hz, 3H), 3,03 (s, 3H),3,96 (m, 3H), 4,30 (s, 2H), 4,80(s, 2H), 7,65(s, 1 H), 10,50(s, 1 H), 10,65(s a, 1H). m/z 340,1, 342,1[M+H]+
F4480*
Cl o OH _^N $ F Precursor: 436,31 sal HCl: 472,8 1H RMN (400 MHz, d6-DMSO) 5 0,37(d, J = 4,4 Hz, 2H), 0,46(d, J = 7,6 Hz, 2H), 1,07 (m, 1 H), 2,96 (d, J = 4,4 Hz, 3H), 3,79 (m, 2H), 4,48(t ap., J = 4,4 Hz, 2H), 4,73(s, 2H), 7,20 (t ap., J = 8,4 Hz, 2H), 7,60 (s, 1 H), 7,64 (t ap., J = 7,2 Hz, 2H), 10,23 (s a, 1H), 10,51 (s, 1 H). m/z 436,4, 438,4 [M+H]+
F4499
Cl 0 “ 0 Precursor: 368,3 sal HCl: 404,7 1H RMN (400 MHz, d6-DMSO) 5 0,45(d, J = 3,6 Hz, 2H), 0,48(d, J = 7,2 Hz, 2H), 1,21 (m, 1 H), 2,05 (m a, 4H), 3,26 (m, 2H), 3,74 (m, 2H), 3,86 (d, J = 8,0 Hz, 2H), 4,90 (d, J = 4,2 Hz, 2H), 7,65 (s, 1 H), 10,51 (s, 1 H), 10,58 (s a, 1 H). m/z 368,4, 370,4 [M+H]+
F4535*
Cl 0 OH Precursor: 398,33 sal HBr: 434,79 1H RMN (400 MHz, d6-DMSO) 5 0,410,48 (m, 4H), 1,19 (m, 1H), 1,73 (m, 4H), 3,19 (m, 4H), 3,86 (d, J = 7,2 Hz, 2H), 4,74 (s, 2H), 7,60 (s, 1 H), 10,18 (s a, 1 H), 10,77 (s, 1H) m/z 400,2 [M+Hf, 402,2
F4536*
Cl O OH Precursor 410,34 sal HCl: 446,80 1H RMN (d6-DMSO, 400 MHz) 0,50 (m, 4H), 1,08 (t, J = 6,8 Hz, 2H), 1,21 (m, 5H), 1,58 (m, 2H), 1,79 (m, 2H), 2,17 (m, 2H), 2,93 (s, 3H), 3,92 (s, 2H), 4,48 (m, 1 H), 4,87 (d, J = 16,8 Hz, 1H), 7,66 (s, 1H), 9,82 m a, 1H), 10,78 (d, J = 11,6 Hz, 1 H). ES+ve 410,5, 412,4 [M+H]+
F4581*
Cl 0 OH Precursor: 356,25 sal HBr: 392,71 1H RMN (500 MHz, d6-DMSO) 5 0,460,53 (m, 4H), 1,23 (m, 1 H), 1,37 (t, J = 7.0 Hz, 3H), 2,95 (d, 4J = 5,0 Hz, 3H), 3,33 (m, 1 H), 3,41 (m, 1 H), 3,91 (d, J = 7.0 Hz, 2H), 4,74 (dd, 2J = 17,0, 4J = 6.0 Hz, 1 H), 4,88 (dd, 2J = 17,0, 4J = 4,0 Hz, 1 H), 7,65 (s, 1 H), 10,39 (s a, 1 H), 10,70 (s, 1H). m/z 356,3, 358,3 [M+H]+
F4H*
Cl 0 OH ^NH Precursor: 328,19
F4I*
Cl 0 OH ^NH Precursor: 342,22
F4J*
Cl 0 .w OH ^^NH Precursor: 356,25
Ejemplo 2
Esquema 2
5
Una gama de 8-hidroxi-3H-quinazolin-4-onas 2,3-disustituidas novedosas 4-9 puede prepararse mediante la ruta sintetica representada en el Esquema 2. El acido nitro 1-6 preparado de acuerdo con el Esquema 1 mostrado en el Ejemplo 1 se metila selectivamente en el grupo carboxi usando yodometano en DMF para proporcionar ester metflico 1-7. La conversion en el eter metflico 2-2 se consigue calentando 1-7 en acetona y yodometano. La 10 hidrolisis de 2-2 por calentamiento en NaOH y metanol proporciona el acido 2-1. La formation de cloruro de acido seguida de reaction con una amina proporciona el intermedio 4-5 con rendimientos de buenos a excelentes. La reduction con polvo de Fe en acido acetico glacial da la amina 4-6 que, a su vez, se cicla para dar 4-7 en AcOH a reflujo y cloruro de cloroacetilo. La aminacion de 4-7 seguido de la desproteccion con BBr3 en CH2Cl2 o HBr a reflujo proporciona el compuesto diana 4-9.
imagen12
Acido 4,6-dicloro-3-metoxi-2-nitrobenzoico (1-7)
5 A una solution del acido 1-6 (0,88 g, 3,5 mmol) en DMF (8 ml) se le anadio K2CO3 (1,44 g, 10 mmol) seguido de yodometano (0,43 ml, 6,95 mmol). La reaction se calento a 60 °C durante 17 h y despues se retiro dMf a presion reducida para dar una goma de color naranja. Se anadio H2O (20 ml) y la solution se acidified a pH 1 con una solution al 10 % de HCl. Despues, la solution acuosa se extrajo con EtOAc (30 ml) y se lavo con H2O y salmuera. Despues del secado sobre Na2SO4 la reaction se filtro y se concentro para proporcionar 1-7 en forma de una goma 10 de color naranja (0,82 g, rendimiento del 88 %). 1H RMN (400 MHz, CDCls) 5 3,94 (s, 3H), 7,69 (s, 1 H), 10,85 (s a, 1 H).
4,6-Dicloro-3-metoxi-2-nitrobenzoato de metilo (2-2)
15 Al fenol 1-7 (10,4 g, 39,1 mmol) en acetona de calidad HPLC (150 ml) se le anadieron K2CO3 (15 g, 108,5 mmol) y yodometano (5 ml, 80,3 mmol). La reaction se calento a 60 °C durante 22 h. El matraz se enfrio y despues se anadio H2O (40 ml), y la mezcla se agito durante 30 min. Los volatiles se retiraron al vacfo y el residuo se recogio en CH2Cl2 y H2O. Despues de la extraction en CH2Cl2 (x 3), las capas organicas combinadas se lavaron con H2O, se secaron sobre Na2SO4, se filtraron y se concentraron para dar el ester metflico 2-2 en forma de un aceite de color naranja 20 (9,92 g, rendimiento del 91 %). 1H RMN (400 MHz, d6-DMSO) 5 .95 (s, 3H), 8,22 (s, 1 H).
Acido 4,6-dicloro-3-metoxi-2-nitrobenzoico (2-1)
Al ester metflico 2-2 (9,90 g, 35,3 mmol) en MeOH (150 ml) se le anadio NaOH 2 N (150 ml) y la reaction se calento 25 a reflujo durante 2,5 h. El metanol se retiro al vacfo y la mezcla se extrajo con EtOAc. La capa acuosa se acidifico a pH 2 con una solution concentrada de HCl y despues se extrajo en EtOAc (x 3). Las capas organicas combinadas se lavaron con salmuera, se secaron sobre Na2sO4, se filtraron y se concentraron para proporcionar el acido 2-1 en forma de un solido de color naranja (8,84 g, rendimiento del 94 %). 1H RMN (400 MHz, d6-DMSO) 5 3,83 (s, 3H), 3,95 (s, 3H), 8,23 (s, 1 H).
Preparation de F4095
4.6- Dicloro-3-metoxi-N-propil-2-nitrobenzamida (4-5)
El bcido 2-2 (1,41 g, 5,3 mmol) se calentd a reflujo en cloruro de tionilo (20 ml) durante 2 h. Despues de un periodo de refrigeracion, los volbtiles se retiraron al vacio y el residuo se destild azeotrbpicamente con tolueno. Despues, el 5 cloruro de acido resultante se seco a aito vacio, despues se dlsolvio en CH2CI2 anhidro (50 ml), se enfrio a 0 °C y despuds se trato con propilamina (2,45 ml, 29,9 mmol). La reaccion se calento a temperatura ambiente durante 2 h. El disolvente se retiro al vacio y ei residuo se recogib en EtOAc y salmuera. La capa acuosa se extrajo tres veces en EtOAc y las capas organicas combinadas se lavaron con H2O, se secaron sobre Na2S04, se filtraron y se concentraron para proporcionar la amida en la que R es propilo 4-5 en forma de un solido de color naranja ciaro. 10 (1,5 g, rendimiento del 92 %). 1H RMN (400 MHz, d6-DMSO) 5 0,91 (t, J = 7,0 Hz, 3H), 1,40 (c, J = 7,0 Hz, 2H), 3,07 (c, J = 7,0 Hz, 2H), 3,84 (s, 3H), 8,13 (s, 1H), 8,84 (s a, 1 H).
4.6- Dicloro-3-metoxi N-propil-2-nitrobenzamida (4-6)
15 El compuesto nitro 4-5 en el que R es propilo (1,50 g, 4,88 mmol) en AcOH glacial (50 ml) se calentd a 80 °C con polvo de Fe (1,21 g, 21,7 mmol) durante 1 h. La reaccion se filtro a traves de celite, se lavo con EtOAc (x 3) y se concentro. El residuo se diluyd con EtOAc y NaHC03 ac. sat. y la capa acuosa se extrajo con EtOAc (x 3), Las capas organicas combinadas se lavaron con H20, se secaron sobre NaaSOn, se filtraron y se concentraron para proporcionar la amina 4-6 en forma de un aceite de color pardo ciaro (1,21 g, rendimiento del 89%). 'H RMN 20 (400 MHz, d6-DMSO) 5 0,94 (t, J = 7,2 Hz, 3H), 1,49 (c, J = 7,2 Hz, 2H), 3,18 (c, J = 7,2 Hz, 2H), 3,82 (s, 3H), 5,22 (s a, 2H), 6,77 (s, 1 H), 8,42 (t, J = 7,2 Hz, 1H).
5.7- Dicloro-2-(clorometil)-8-metoxi-3-propilquinazolin-4(3H)-ona (4-7)
25 La amina 4-6 en la que R es propilo (1,18 g, 4,26 mmol) en AcOH glacial (40 ml) se trato con cloruro de cloroacetilo (0,85 ml, 10,6 mmol) con o sin la adicidn de acido sulfurico concentrado (0,6 equiv.) y la reaccion se calentd a reflujo en una atmosfera de N2 durante 4 h. Se anadio mas cantidad de cloruro de cloroacetilo (0,85 ml) y la reaccion se calentd hasta que no se observo mas cantidad de material de partida por TLC. La reaccion se enfrid y despues el pH se ajustd a 5 usando NaOH 2 N. La reaccion se extrajo en CH2CI2 (x 3), Las capas organicas combinadas se 30 secaron sobre Na2S04, se filtraron, se concentraron y se purificaron por cromatografia ultrarrapida eluyendo con EtOAc al 10 % y despues al 15 %/eter de petroleo 40 °C-60 °C para proporcionar el compuesto clorometilo 4-7 en el que R es propilo en forma de un aceite (501 mg, rendimiento del 35 %). 1H RMN (400 MHz, d6-DMSO) 5 0,95 (t, J = 7,4 Hz, 3H), 1,64 (c, J = 7,4 Hz, 2H), 3,97 (t, J = 7,4 Hz, 2H), 3,99 (s, 3H), 4,91 (s, 2H), 7,77 (s, 1 H).
35 5,7-Dicloro-2-((metilamino)metil)-8-metoxi-3-propilquinazolin-4(3H)-ona (4-8)
El compuesto clorometilo 4-7 en el que R es propilo (280 mg, 0,834 mmol) en CH2CI2 anhidro (8 ml) se enfrid a 0 °C y la solucidn de metilamina en etanol (2,0 ml, 33 % en peso) se anadio gota a gota a la solucion. La reaccion se dejo calentar a temperatura ambiente durante una noche y despues los volatiles se eliminaron al vacio. El residuo se 40 recogid en CH2CI2 y NaHCCH ac. sat. y despuds se extrajo con CH2CI2 (x 2). Las capas orgbnicas combinadas se lavaron con H2O, se secaron sobre Na2SO.11, se filtraron y se concentraron para proporcionar la amina 4-8 en la que R es propilo yR'y R" son hidrogeno (220 mg, rendimiento del 80 %) en forma de un aceite. 1H RMN (400 MHz, d6- DMSO) d 0,95 (t, J = 7,2 Hz, 3H), 1,62 (c, J = 7,2 Hz, 3H), 2,36 (s, 3H), 3,80 (s, 2H), 3,98 (triplete ocultado, J = 7,2 Hz, 2H), 3,99 (s, 3H), 7,63 (s, 1 H).
45
5.7- Dicloro-8-hidroxi-2-((metilamino)metil)-3-propilquinazolin-4(3H)-ona (F4095)
Se enfrid dter metilico 4-8 (220 mg, 0,67 mmol) en CH2CI2 (8 ml) a 0 °C y despues a la reaccion se le anadio gota a gota BBr3 (158 pi, 1,64 mmol). Despues del caientamiento a temperatura ambiente durante una noche, la reaccidn 50 se interrumpid cuidadosamente con MeOH a 0 °C. La solucidn se concentro y despues se anadid de nuevo metanol. Este procedimiento se repitid varias veces. La RMN del material en bruto revelo material de partida (aprox. 15 %) junto con el producto deseado. El material en bruto se disolvid de nuevo en CH2CI2 anhidro (8 ml) y se trato gota a gota con BBr3 (200 ml,). La reaccidn se calentd a temperatura ambiente durante una noche y despuds el procedimiento de tratamiento anterior se empleo para dar el producto en bruto. La trituracion con MeOH (1 ml)/eter 55 (20 ml) y la filtracidn proporciono ei compuesto diana deseado 1095 (158 mg, rendimiento del 57%). 1H RMN (400 MHz, d6-DMSO) 5 0,95 (t, J = 7,2 Hz, 3H), 1,58 (c, J = 7,2 Hz, 2H), 2,74 (s, 3H), 3,90 (t, J = 7,2 Hz, 2H), 4,51 (s, 2H), 7,59 (s, 1H), 8,88 (s, 2H), 10,19 (s, 1 H). MS mlz 316,2, 318,2 [M+H]".
Tabla 2: Compuestos y Compuestos Comparativos (*) preparados de acuerdo con el Ejemplo 2 (Esquema 2)
Compuesto
Estructura PM ’H rmn Espec. de masas
F4161*
Cl 0 fVr 1 OH NHMe Precursor: 288,13 Sal HBr: (400 MHZ, d6-DMSO) 5 2,44 (s, 3H), 3,37 (s, 3H), 4,51 (t, J = 4,8 Hz, 2H), 7,60 (s, 1 H), 8,99 (sa, 2H), 10,19 (s, 1 H) mlz 288,1, 290,1 [M+Hf
F4473*
Cl O OH ^ Precursor: 330,21 Sal HOP: 366,67 1H RMN (400 MHz, d6-DMSO) 51,23 (m, 6H), 3,22 (s, 4H), 3,40 (s, 3H), 4,63 (s, 2H), 7,61 (s, 1H), 9,89 (s a, 1H), 10,65 (s, 1H) mlz 330,1, 332,1 [M+Hf
F4475
OH ^N^ Precursor: 342,23 Sal HBr: 423,13 1H RMN (400 MHz, d6-DMSO) 51,40-1,90 (m, 6H), 3,18 (m, 2H), 3,40 (s, 3H), 3,57 (m, 2H), 4,70 (s, 2H), 7,61 (s, 1 H), 9,09 (s a, 1 H), 10,19 (s, 1 H) mlz 342,1, 344,1 [M+Hf
F4477*
Cl 0 (W C|^An^ OH Precursor: 316,19 Sal HBr: 397,1 1H RMN (400 MHz, d6-DMSO) 5 0,97 (t, J = 7,9 Hz, 3H), 1,65 (m, 2H), 3,00 (m, 2H), 3,40 (s, 3H), 4,49 (s, 2H), 7,62 (s, 1 H), 9,86 (s a, 1 H). 10,24 (s, 1 H) mlz 316,0, 318,0 [M+Hf
F4483
“ 0 Precursor: 356,25 Sal HBr: 437,16 ’H RMN (400 MHz, d6-DMSO) 5 1,20(t, J = 7,6 Hz, 3H)1,40-1,90 (m, 6H), 3,17 (m, 2H), 3,56 (m, 2H), 3,88 (c, J = 7,6 Hz, 2H), 4,71 (s, 2H), 7,62 (s, 1 H), 9,05 (s a, 1 H), 10,23 (s, 1 H) mlz 356,3, 358,1 [M+Hf
F4486*
JA~ OH HN^_ Precursor: 302,16 Sal HBr: 383.07 1H RMN (400 MHz, d6-DMSO) 51,24 (t, J = 6,8 Hz, 3H), 2,76 (s, 3H), 3,94 (c, J = 6,8 Hz, 2H), 4,58 (s, 2H), 8,98 (s a, 2H), 10,25 (s, 1H). mlz 302,2, 304,2 [M+H]*
F4487*
OH P F Precursor: 410,28 Sal HBr: 491,18 1H RMN (400 MHz, d6-DMSO) 5 1,20(t, J = 7,8 Hz, 3H), 2,93 (s, 3H), 3,88 (m, 2H), 4,55 (m, 2H), 4,76 (s, 2H), 7,23 (d, J = 7,5 Hz, 2H), 7,60 (d, J = 7,5 Hz, 2H), 7,65 (s, 1 H), 8,79 (s a, 1 H), 10,21 (s, 1 H) mlz 410,1, 412,2 [M+H]+
F4492
,,46r OH Precursor: 370,27 Sal HBr: 451,19 1 H RMN (400 MHz, d6-DMSO) 6 0,97 (t, J = 7,0 Hz, 3H), 1,43 (m,1H), 1,61 (m, 2H), 1,75 (m, 1 H), 1,86 (m, 4H), 3,22 (m, 2H), 3,59 (m, 2H), 3,85 (m, 2H), 4,78 (d, J = 4,0 Hz, 2H), 7,63 (s, 1 H), 9,18 (s a, 1 H),10,25 (s, 1H). mlz 370,1, 372,1 [M+H]+
F4495*
OH HN^ Precursor: 316,19 Sal HBr: 397,10 1H RMN (400 MHz, d6-DMSO) 5 1,20 (t, J = 7,9 Hz, 3H), 1,31 (t, J = 7,9 Hz, 3H), 3,15 (m, 2H), 3,93 (m, 2H), 4,49 (s, 2H), 7,62 (s, 1 H), 8,79 (s, 2H), 10,30 (s, 1 H) mlz 316,2, 318,2 [M+H]+
F4496*
J&- OH HN^ Precursor: 302,16 Sal HBr: 383,07 1H RMN (400 MHz, d6-DMSO) 5 1,31 (t, J = 6,8 Hz, 3H), 3,14 (m, 2H), 3,44 (s, 3H), 4,54 (s, 2H), 7,65 (S, 1 H), 8,95 (s, 2H), 10,30 (s, 1H). mlz 302,2, 304,2 [M+H]+
F4473*
Cl 0 XfK' c,Af^sN^ OH Precursor: 330,22 Sal HBr: 411,12 1H RMN (400 MHz, d6-DMSO) 51,23 (m, 6H), 3,31 (m, 4H), 3,39 (s, 3H), 4,62 (s, 2H), 7,64 (s, 1H), 9,83 (s a, 1H), 10,65 (s, 1H), mlz 330,1 [M+Hf, 332,1
F4551*
Cl O " A. Precursor: 358,26 Sal HBr: 439,17 1H RMN (400 MHz, d6-DMSO) 5 0,89 (m, 6H), 1,72 (m, 4H), 3,25 (m, 4H), 3,42 (s, 3H), 4,77 (s, 2H), 7,64 (s, 1 H), 9,11 (s a, 1 H), 10,40 (s, 1H). mlz 358,1 [M+H]+, 360,1
F4549'
OH HN^ Precursor: 330,21 Sal HBr: 411,12 1H RMN (400 MHz, d6-DMSO) 50,95 (t, J = 7,6 Hz, 3H), 1,23 (t, J = 6,8 Hz, 3H), 1,74 (m, 2H), 3,06 (m, 2H), 3,96 (m, 2H), 4,56 (s, 2H), 7,65 (s. 1 H), 8,94 (s a, 1 H), 10,31 (s, 1H). mlz 330,2 [M+Hf, 332,2
F4550*
.jJ&T "VX Precursor: 372,30 Sal HBr: 453,20 1H RMN (400 MHz, d6-DMSO) 5 0,88 (t, J = 7,2 Hz, 6H), 1,25 (m, 3H), 1,72 (m, 4H), 3,28 (m, 4H), 3,95 (d, J = 7,2 Hz, 2H), 4,78 (s, 2H), 7,67 (s, 1H), 9,16 (s a, 1 H), 10,39 (s, 1H). mlz 372,1 [M+H]\ 374,1
F4530*
jfar OH ^ Precursor: 330,21 Sal HBr: 411,12 1H RMN (400 MHz, d6-DMSO) 5 0,95 (t, J = 6,8 Hz, 3H), 1,63 (m, 2H), 3,00 (3, 6H), 3,80 (m, 2H), 4,76 (s, 2H), 7,66 (s, 1 H), 9,44 (s a, 1 H), 10,23 (s, 1H). mlz 328,3 [M+H]\ 330,3
F4540*
OH Precursor: 330,21 Sal HBr: 411,12 'H RMN (400 MHz, d6-DMSO) 5 0,94 (t, J = 6,8 Hz, 3H), 1,14 (t, J = 6,9 Hz, 3H), 1,49 (m, 2H), 3,17 (c, J = 6,8 Hz, 2H), 3,30 (m, 2H), 4,52 (s, 2H), 7,10 (s, 1 H), 8,05 (s a, 1H), 8,18 (s, 1H). mlz 330,3 [M+H]\ 332,3
F4541*
j&r r"i Precursor: 357,26 Sal HBr: 439,17 1H RMN (400 MHz, d6-DMSO) 5 0,95 (m, 3H), 1,28 (m, 6H), 1,64 (m, 2H), 3,33 (m, 4H), 3,86 (m, 2H), 4,71 (m, 2H), 7,67 (s, 1 H), 9,14 (s a, 1 H), 10,41 (s, 1 H). mlz 358,3 [M+Hf, 360,3
F4542*
jj&r OH HN^ Precursor: 344,23 Sal HBr: 425,14 1H RMN (400 MHz, d6-DMSO) 5 0,94 (m, 6H), 1,65 (m, 2H), 1,74 (m, 2H), 3,07 (m, 3H), 3,83 (m, 2H), 3,86 (m, 2H), 4,54 (s, 2H), 7,66 (s, 1 H), 9,00 (s, 2H), 10,33 (s, 1H). mlz 344,3 [M+H]+, 346,3
F4543*
0H C'v, Precursor: 386,32 Sal HBr: 467,23 1H RMN (400 MHz, d6-DMSO) 5 0,89 (t, J = 7,2 Hz, 3H), 0,94 (t, J = 7,2 Hz, 3H), 1,64 (c, J = 7,6 Hz, 2H), 1,71 (c, J = 7,6 Hz, 2H),3,27 (m, 5H), 3,84 (t, J = 7,2 Hz, 2H), 4,76 (s, 1 H), 4,78 (s, 1 H), 7,66 (s, 1 H), 9,14 (s, 2H), 10,39 (s, 1H). mlz 386,1 [M+Hf, 388,1
F4544*
Cl 0 OH HN^ Precursor: 330,22 Sal HBr: 411,12 1H RMN (400 MHz, d6-DMSO) 5 0,91 (s, 6H), 2,07 (m, 1 H), 2,75 (s, 3H), 3,79 (d, J = 6,0 Hz, 2H), 4,52 (s, 2H), 7,66 (s, 1 H), 8,93 (S, 2H), 10,30 (s, 1H). mlz 330,3 [M+Hf, 332,3
F4545*
OH HN^ Precursor: 344,24 Sal HBr: 425,15 1H RMN (400 MHz, d6-DMSO) 5 0,91 (s, 6H), 1,30 (t, J = 7,2 Hz, 3H), 2,07 (m, 1 H), 3,18 (m, 2H), 3,81 (d, J = 7,6 Hz, 2H), 4,51 (s, 2H), 7,66 (s, 1H), 8,90 (s, 2H), 10,35 (s, 1H). mlz 344,3 (M+Hf, 346,3
F4546*
Precursor: 372,29 Sal HBr: 453,20 1H RMN (400 MHz, d6-DMSO) 5 0,91 (m, 6H), 1,28 (t, J = 6,8 Hz, 6H), 2,08 (m, 1 H), 3,92 (m, 4H), 3,81 (d. J = 7,6 Hz, 2H), 4,70 (s, 1 H), 4,71 CJ = 0.4 Hz, 1H), 7,66 (s, 1 H), 9,11 (s, 2H), 10,40 (s, 1H). mlz 372,3 [M+Hf, 374,3
F4547*
..TV OH HN^ Precursor: 358,27 Sal HBr: 439,18 1H RMN (400 MHz, d6-DMSO) 5 0.90 (m, 6H), 1,28 (t, J = 7,2, 3H), 1,74 (m, 2H), 2,06 (m, 1 H), 3,06 (m, 2H), 3,81 (d. J = 8,0 Hz, 2H), 4,52 (s, 1 H), 7,66 (s, 1H), 9,14 (s, 2H), 10,35 (s, 1H). mlz 358,3 [M+Hf, 360,3
F4548*
C! 0 CiXpCN^ oh a Precursor: 400,35 Sal HBr: 481,25 1H RMN (400 MHz, d6-DMSO) 6 0,87-0,92 (m, 12H), 1,71 (m, 4H), 2,07 (m, 1H), 3 28 (m, 4H), 3,80 (d, J = 7,6 Hz, 2H), 4,75 (4J = 4,4 Hz, 1H), 7,66 (s, 1 H), 9,19 (s, 2H), 10,40 (s, 1H). mlz 400,4 [M+Hf, 402,4
F4553*
Cl 0 | C|-^f^N^S OH HN^ Precursor: 344,24 Sal HBr: 425,15 1H RMN (400 MHz, d6-DMSO) 5 0,95 (m, 3H), 1,58 (s, 3H), 1,59 (s, 3H), 1,65 (m, 2H), 3,11 (m, 2H), 4,43 (m, 1 H), 4,71 (s, 2H), 7,62 (s, 1 H), 8,99 (sa, 1 H), 10,45 (s, 1H). mlz 344,1 [M+H]*, 346,1
F4554*
Cl O , aaA ci^Y^n^ OH HN^ Precursor: 330,21 Sal HBr: 411,12 1H RMN (400 MHz, d6-DMSO) 6 1,25 (m, 3H), 1,55 (s, 3H), 1,57 (s, 3H), 3,17 (m, 2H), 3,11 (m, 2H), 4,42 (m, 1 H), 4,73 (s, 2H), 7,82 (s, 1 H), 8,78 (s a, 1 H), 10,30 (s, 1 H). mlz 330,3 [M+H]\ 332,3
F4555*
Cl 0 I 0H C\ Precursor: 386,32 Sal HBr: 467,23 1H RMN (400 MHz, d6-DMSO) 5 0,93 (m, 6H), 1,57 (s, 3H), 1,58 (s, 3H), 1,74 (m, 4H), 3,17 (m, 4H), 3,11 (m, 2H), 4,35 (m, 1 H), 4,76 (s, 2H), 7,67 (s, 1 H), 8,90 (s a, 1 H), 10,33 (s, 1 H). mlz 386,1 [M+Hf, 388,1
F4552*
Cl 0 „VV c,A^n^ OH ^N'V^V| Precursor: 344,24 Sal HBr: 425,15 1H RMN (400 MHz, d6-DMSO) 6 0,92 (t, J = 6,8 Hz, 3H), 1,32 (m, 2H), 1,74 (m, 2H), 2,98 (s, 3H), 3,31 (m, 2H), 3,39 (s, 3H), 4,68 (dd, 2J = 12,0, AJ = 5,6 Hz, 1 H), 4,82 (d, 2J = 14,4 Hz, 1 H), 7,66 (s, 1 H), 9,26 (s a, 1 H), 10,27 (S, 1 H). mlz 344,1 [M+H]*, 346,1
F4582*
Cl O AA- C|Af^N^ OH Precursor: 316,18 Sal HBr: 397,10 1H RMN (400 MHz, d6-DMSO) 5 1,33 (t, J = 7,2 Hz, 3H), 2,96 (d, AJ = 4,4 Hz, 3H), 3,39 (m, 2H), 3,41 (s, 3H), 4,68 (dd, 2J = 16,8, AJ = 5,6 Hz, 1 H), 4,82 (d, 2J = 17,6 Hz, 1 H), 7,66 (s, 1 H), 9,25 (s a, 1 H), 10,27 (s, 1H) mlz 316,2, 318,2 [M+H]*
F4A*
Cl 0 I ■rVY ClY^N^ OH ^NH Precursor: 316,18
imagen13
*Mismo mdtodo que para los demas compuestos. El compuesto final se neutralizo con NaHCOa ac. sat. y se convirtio en la sal HCI.
5 Ejemplo 3 Esquema 3
Tambien pueden sintetizarse 8-hidroxi-3H-quinazo!in-4-onas 2,3-disustituidas 4-9 mediante la ruta representada en 10 el Esquema 3. For lo tanto. el ester metilico 2-2 (preparado de acuerdo con el Esquema 2 mostrado en el Ejemplo 2) se reduce con polvo de hierro en dcido acdtico para dar la anilina 2-3. La hidrdlisis para dar el acido 2-4 y despuds la formacion de amida a travds del cloruro de acido proporciona 4-6. La ciclacidn deshidratante se consigue por la action del cloruro de cloroacetilo a reflujo en acido acdtico para proporcionar el intermedio clorometilo 4-7. La aminacidn seguida de desproteccidn con BBr3 o acido bromhidrico en ebullition genera la quinazolinona 2,315 disustituida deseada 4-9.
imagen14
imagen15
2-Amino-4,6-dicloro-3-metoxibenzoato de metilo (2-3)
20 Se ahadid polvo de hierro (18,2 g, 330 mmol) a una solution de ester metilico 2-2 (13,3 g, 480 mmol) en acido acdtico glacial (120 ml). La mezcla se agitd a 55 °C durante 1,5 h y despuds se filtro caliente a travds de celite, lavando con acetato de etilo. El filtrado se concentro y despuds se ahadieron acetato de etilo y NaC03 ac. sat. La capa orgdnica se aislo, se lavo con H2O, se seed sobre K2CO3 y se concentro para dar 2-3 en forma de un solido de color blanquecino (11,6 g, rendimiento del 97 %). 1H RMN (CDCI3, 400 MHz) 5 3,79 (s, 3H), 3,89 (s, 3H), 6,71 (s, 1
H).
Acido 2-amino-4,6-dicloro-3-metoxibenzoico (2-4)
5 A una soluci6n agitada de anilina 2-3 (11,5 g, 460 mmol) en metanol (250 ml) y H2O (70 ml) se le anadio NaOH 2 N (25 ml). La mezcla de reaccion se calento a reflujo durante 1 h, se afladio mas cantidad de NaOH 2 N (25 ml) y la mezcla se calento a reflujo durante 1 h mas. La soiuciOn se enfriO y el metanol se retiro al vacfo. La mezcla se disolviO en H2O y se extrajo con acetato de etilo. La capa acuosa se acidified a pH 2 con HCI cone, y despues se extrajo en acetato de etilo (x 3). Los extractos combinados se lavaron con salmuera, se secaron sobre Na2S04, se 10 fiitraron y se concentraron para proporcionar el acido 2-4 en forma de un solido de color beige (10,4 g, rendimiento del 95 %). 1H RMN (MeOD, 400 MHz) 5 3,80 (s, 3H), 6,70 (s, 1 H).
Preparacidn de F4269 (Ejemplo Comparative)
15 2-Amino-4, 6-dicloro-3-metoxi-N-metilbenzamida
A una mezcla del dcido (3,13 g, 13,3 mmol) en tolueno (22 ml) enfriado a 0 °C se le anadio cloruro de tionilo (3,9 ml, 53,0 mmol). La mezcla se calento a reflujo durante 2 h y la solucion resultante se concentro a sequedad. El cloruro de acido se disolvio en CH2CI2 anhidro (22 ml) y se enfrid a 0 °C. Se afiadid metilamina (15 ml, solucion 8,0 M en 20 etanol absoluto, 120 mmol) y la reaccidn se dejd calentar a temperatura ambiente durante una noche. La mezcla se concentrd y se purified por cromatografia ultrarrapida eluyendo con acetato de etilo al 30 %-60 %/eter de petroleo 40-60 °C para proporcionar el producto en forma de un aceite de color pardo (2,43 g, rendimiento del 74 %). H RMN (d6-DMSO, 400 MHz) 5 2,72 (t, J = 4,0 Hz, 3H), 3,68 (s, 3H), 5,33 (s, 2H), 6,72 (s, 1 H), 8,37 (d, J = 4,0 Hz, 1 H).
25 5,7-dicloro-2-(clorometil)-8-metoxi-3-metilquinazolin-4(3H)-ona
A una solucion de la amida (2,43 g, 9,76 mmol) en acido acetico (39 ml) se le anadid cloruro de cloroacetilo (4,86 ml, 61 mmol) y la reaccidn se calentd a reflujo durante 6 h y despues se enfrid a temperatura ambiente. La reaccidn se concentrd y despues se purified por cromatografia ultrarrapida eluyendo con acetato de etilo al 15 %-40 %/eter de 30 petrdieo a 40-60 °C para proporcionar el cloruro en forma de un solido (878 mg, rendimiento del 57 %). 1H RMN (d6- DMSO, 400 MHz) 5 3,54 (s, 3H), 4,00 (s, 3H), 4,91 (s, 2H), 7,74 (s, 1 H).
5.7- Dicloro-2-((dimetilamino)metil)-8-metoxi-3metilquinazolin-4(3H)-ona
35 A una solucion del compuesto clorometilo (500 mg, 1,63 mmol) a 0 °C se le anadid dimetilamina (12 ml, 2,0 M, 24 mmol). La reaccidn se calentd a temperatura ambiente y se agito durante 3 dias y se concentrd. El producto en bruto se purified por cromatografia ultrarrapida eluyendo con acetato de etilo al 70 %-80 %-100 %/eter de petrdieo a 40-60 °C para proporcionar la amina en forma de un solido de color amarillo (391 mg, rendimiento del 76%). 1H RMN (d6-DMSO, 400 MHz) 5 2,26 (s, 6H), 3,56 (s, 2H), 3,58 (s, 3H), 3,97 (s, 3H), 7,68 (s, 1 H)
40
5.7- Dicloro-2-(dimetilamino)metil-8-hidroxi-3-metilquinazolin-4(3H)-ona (PB1269)
A una mezcla del derivado metoxi (391 mg, 1,24 mmol) en CH2CI2 anhidro (6 ml) a 0 °C se le anadid BBr3 (234 ml, 2,48 mmol). La mezcla se agito a temperatura ambiente durante 36 h despues de lo cual se enfrid a 0 °C y la 45 reaccidn se interrumpid cuidadosamente con metanol. La solucion se concentrd y despues se anadid de nuevo metanol. Este procedimiento se repitid varias veces. Al producto en bruto se le afiadiO dter y unas gotas de metanol para precipitar F4269 en forma de un solido de color crema que se recogid por filtracion y se seed (340 mg, rendimiento del 72 %). 5 1H RMN (400 MHz, d6-DMSO) 5 2,95 (s, 3H), 2 96 (s, 3H), 3,33 (s, 3H), 4,67(d, J = 5,2 Hz, 2H), 7,62 (s, 1 H), 9,37 (s a, 1 H), 10,2 (s, 1 H). m/z 315,1,316,2 [M+HJ+
50
Ejemplo 4 Ejemplo comparative
Esquema 4
55 Tambidn pueden prepararse 8-hidroxi-3H-quinazolin-4-onas 2,3-disustituidas 4-9 mediante la ruta representada en el Esquema 4. El acido nitro 1-6 (preparado de acuerdo con el Esquema 1 mostrado en el Ejemplo 1) se redujo para dar la anilina 1-8 con polvo de hierro y acido acetico. La acilacidn de 1-8 con cloruro de cloroacetilo proporciona la amida 1-9. La formacion de amida de un paso seguido de ciclacidn desbidratante para dar el cloruro 1-10 se consigue por la accion de PCh y una amina en tolueno a reflujo. Despues de la purificacion, la aminacion del
compuesto clorometito 1-10 proporciona el compuesto diana F4271.
imagen16
imagen17
5 Acido 2-amino-4,6-dicloro-3-hidroxibenzoico (1-8)
Una mezcla de 4,6-dicloro-3-hidroxi-2-nitrobenzoico 1-6 (700 mg, 2,78 mmol), polvo de Fe (400 mg, 7,16 mmol) y 3cido acetico glacial (13 ml) se calentP a 80 °C durante 50 min, se enfriP y los sPlidos se retiraron por filtracion, El filtrado se concentro para dar un solido de color pardo. La purificaciPn por cromatografia ultrarrppida eluyendo con 10 AcOH al 1 %/EtOAc a AcOH al 3 %/EtOAc proporciono acido 2-amino-4,6~dic!oro-3-hidroxibenzoico (1-8) en forma de un solido de color pardo claro (582 mg, 94 %). 1H RMN (d6-DMSO, 400 MHz) 6 6,68 (s, 1H).
Acido 4,6-dicloro-2-(2-cloroacetamido)-3-hidroxibenzoico (1-9)
15 A una mezcla del acido (1,0 g, 4,50 mmol) en CH2CI2 anhidro (22 ml) se le anadio cloruro de cioroacetilo (1,4 ml, 18 mmol) a 0°C. La reacciPn se calentP a temperatura ambiente durante 1 h y despuPs se concentro para proporcionar un aceite de color naranja. 1H RMN (d6-DMSO, 400 MHz) 5 4,18 (s, 2H), 7,56 (s, 1H), 9,83 (s, 1 H), 10,22 (s, 1 H).
20 5,7-Dicloro-2-(clorometil)-8-hidroxi-3-isobutilquinazolin-4(3H)-ona
A una mezcla del acido (500 mg, 1,68 mmol) en tolueno anhidro (8 ml) se le anadio PCI3 (293 pi, 3,36 mmol) y despuPs isobutilamina (250 pi, 2,52 mmol). La reaccion se calentP a reflujo durante 2,5 h, despuPs se enfriP a temperatura ambiente y se concentro. Se anadiP H2O seguido de NaHCOs ac. sat. hasta que el pH fue de 7. La 25 mezcla se extrajo en EtOAc (x 3) y las capas organicas combinadas se lavaron con salmuera, se secaron sobre Na2S04, se filtraron, se concentraron y se purificaron por cromatografia ultrarrppida eluyendo con EtOAc al 20 %/Pter de petrPleo a 40-60 °C para proporcionar el derivado clorometilo (71 mg, rendimiento del 13 %). 1H RMN (d6-DMSO, 400 MHz) 5 0,90 (d, J = 6,8 Hz, 1H), 2,17 (m, 1H), 3,93 (d, J = 7,6 Hz, 2H), 4,83 (S, 2H), 7,63 (s, 1H), 10,47 (s, 1H).
30
5,7-Dicloro-2-((dimetilamino)metil)-8-hidroxi-3-isobutilquinazolin-4(3H)-ona (F4271)
A una solucion del compuesto clorometilo (50 mg, 0,149 mmol) en CH2CI2 anhidro (2 ml) a 0 °C se le anadiP dimetilamina (3 ml, solucion 2,0 M en MeOH, 6 mmol). La reaccion se calento a temperatura ambiente durante una 35 noche y despuPs se concentro a sequedad. El residuo se recogiP en MeOH (2 ml) y HCI cone. (0,5 ml) y despues los volatiles se retiraron al vacio. La trituracion con MeOH (algunas gotas) y eter proporciono la amida deseada (PB1271) en forma de un sPlido de color blanquecino (19 mg, 33 %). YH RMN (400 MHz, d6-DMSO) S 0,48 (m, 4H), 1,19 (t, J = 4,80 Hz, 1 H), 2,94 (s, 3H), 2,95 (s,3 H), 3,85 (d, J = 6,8 Hz, 2H), 4,86 (d, J = 4,80 Hz, 2H), 7,63 (s, 1 H), 8,68 (s a, 1 H), 10,64 (s, 1 H), 10,65 (s a, 1 H). MS mlz 344,3, 346,3 [M+Hf.
40
Ejemplo 5 - EvaluaciPn de los compuestos de FPrmula I
Los siguientes Ensayos se usaron en la evaluaciPn de los compuestos de fprmula I para determinar la idoneidad para su uso en los mPtodos de la invencipn.
Ensayo 1. Ensayo de inhibicion de H202.
Este ensayo de fluorescencia evalua la capacidad de un compuesto de ensayo para inhibir la generacion de perbxido de hidrbgeno (H202) por hierro en presencia de un sustrato reductor, tal como acido ascbrbico. En el 5 ensayo, el hierro en forma de FeCh o cobre, se deja reaccionar con acido ascbrbico por incubacion durante 1 h a 37 °C en presencia del compuesto fluorescente DCF y peroxidasa de rabano picante. Ei H202 generado por el sistema se evalua midiendo el perfil de fluorescencia especifico a las longitudes de onda de excitacibn y emisibn de 485 y 530 nm respectivamente, en presencia de concentraciones en aumento del compuesto de ensayo. Los compuestos de ensayo se clasifican de acuerdo con su capacidad para inhibir el H202 generado por el sistema, 10 donde valores inferiores reflejan mayor capacidad para inhibir la produccibn de H202.
Ensayo 2 (a). Ensayos de neurotoxicidad de las celulas neuronal primaries
Se prepararon cultivos corticales como se ha descrito previamente (White y col., 1998). Se extrajeron cortex 15 embrionarios del dia 14 de ratbn BL6Jx129sv, se diseccionaron sin meninges y se disociaron en tripsina al 0,025 % (peso/vol). Las celulas disociadas se distribuyeron en placas de cultivo de 48 pocillos a una densidad de 2 x 106 cbluias/ml en MEM con FCS al 25 % (vol/vol) y HS al 5 % (vol/vol) y se incubaron a 37 °C durante 2 h. Despubs, el medio se reemplazb con medio Neurobasal (Invitrogen Life Technologies) y complementos B27 (Invitrogen Life Technologies). Los cultivos se mantuvieron a 37 °C en C02 al 5 %. Antes de la experimentacibn, el medio de cultivo 20 se reemplazb con medio neurobasal y B27 sin antioxidantes (Invitrogen Life Technologies).
Las celulas neuronales corticales se cultivaron durante cinco dias segun el Ensayo 2 en medio NB y complemento B27.
25 El dia seis, se anadieron los compuestos de ensayo a los cultivos de cblulas neuronales en medio NB y complemento B27 sin antioxidantes.
Los compuestos de ensayo se disolvieron en DMSO al 100 % hasta una concentracibn de 2,5 mM (10 mM si se pesb un exceso del compuesto por vial - despubs diluido a 2,5 mM). La solucion madre 2,5 mM se diluyb en serie 1 30 en 10 para dar soluciones de trabajo de 250 250 uM, 25 uM, 2,5 uM. Los compuestos de ensayo no se anadieron directamente a las celulas, en su lugar, se anadieron a una "Placa de farmaco" de 48 pocillos como se indica a continuacibn:
Preparacion de "Placa de farmaco":
35
A una placa de 48 pocillos aftadir:
Pocillo 1: 576 ul de NB + B27 (sin antioxidante)* + 24 ul de compuesto de ensayo 2,5 uM Pocillo 2: 576 ul de NB + B27 (sin antioxidante) + 24 ul de compuesto de ensayo 25 uM
Pocillo 3: 576 ul de NB + B27 (sin antioxidante) + 24 ul de compuesto de ensayo 250 uM
40 Pocillo 4: 576 ul de NB + B27 (sin antioxidante) + 24 ul de compuesto de ensayo 2,5 uM
Pocillo 5: 576 ul de NB + B27 (sin antioxidante) + 24 ul de compuesto de ensayo 25 uM
Pocillo 6: 576 ul de NB + B27 (sin antioxidante) + 24 ul de compuesto de ensayo 250 uM
Pocillo 7: 576 ul de NB + B27 (sin antioxidante) + 24 ul de diluyente del compuesto de ensayo**
Pocillo 8: 600 ul de NB + B27 (sin antioxidante)
45
La Placa de Farmaco se incubo a 37 °C durante 15 min. Se afiadieron 200 ul de cada pocillo por triplicado a la placa de celulas correspondiente. La placa de cblulas se incubb a 37 °C, durante 4 dias, (se ensayaron 2 compuestos en cada placa de celulas).
50 * Medio NB y B27 (sin antioxidantes),
** Diluyente PBT DMSO al 10 % en NB + B27 (sin antioxidantes)
A la finalizacion del ensayo, se afiadib un volumen 1/10 de MTS por pocillo de placa (es decir, 25 ul/250 ul). Las placas se incubaron a 37 °C durante 2 h, y despues la absorbancia se leyb a 560 nm.
55
Ensayo 3. Ensayo de captacibn de metal
Las cblulas de neuroblastoma humano M17 se ponen en placas de 6 pocillos y se dejan durante una noche. Se anaden suficientes celulas para dar aproximadamente un 70 % de confluencia el dia siguiente del experimento. Se
anaden los compuestos de ensayo al medio y se mezdan con cantidades equimolares de solucion de CuCI2. A = Cu 10 pM + MPAC 10 pM; B = Cu 10 pM + MPAC 10 pM.
Las celulas se incuban en 1 ml de mezcla medio/MPAC/Cu durante 5 horas a 37 °C. Al final de la incubacion, el 5 medio se retira con un aspirador de vacio y se afiade 1 ml de PBS para desalojar las celulas. Las cdlulas se ponen entonces en tubos Eppendorf y se sedimentan El PBS se retira y los sedimentos celulares restantes se congelan a - 20 °C.
Los sedimentos celulares se preparan como se indica a continuation:
10
Se reciben los sedimentos celulares de niveles similares en tubos de microcentrlfuga de 1,5 ml. Se anaden 50 pi de acido nitrico concentrado (Aristar, BDH) a cada sedimento celular y se deja que lo digiera durante una noche. Se calientan las muestras durante 20 min a 90 °C para completar la digestion. El volumen de cada muestra se redujo a ~45 ul despues de la digestion. Se afiade 1 ml del diluyente de acido nitrico al 1 % a cada muestra (denominado 15 como las muestras de "solucion de preparation").
Las mediciones se fabricaron usando un instrumento Varian UltraMass ICPMS en condiciones operativas adecuadas para el analisis multi-elemento de rutina.
20 E! instrumento se calibro usando Blank, 10, 50 y 100 ppb de una solucion estandar de ICPMS multi-elemento certificada (ICP-MS- CAI2-1, Accustandard) para Fe, Cu y Zn en acido nitrico al 1 %. Se uso una solucion estandar interna certificada que contenia itrio 100 ppb (Y 89) como un control interno (ICP-MS- IS-MIX1-1, Accustandard).
Ensayo 4. Propiedades fisicoquimicas
25
Calculos de area de superficie polar (PSA)
Los valores del area de superficie polar se calcularon usando el programa basado en web disponible a traves de "Molinspiration", un paquete para el calculo de propiedades moleculares.
30
Mediciones turbidimdtricas de solubilidad
La estimacidn de la solubilidad se midio tanto a pH 2,0 como pH 6,5. Esto esta dentro del intervalo de pH que puede anticiparse a lo largo del tracto gastrointestinal proximal en los seres humanos.
35
Los compuestos se disuelven en DMSO a concentraciones apropiadas y despues se anaden en HCI 0,01 M (aprox. pH = 2,0) o tampbn fosfato isotdnico a pH 6,5, siendo la concentration de DMSO final del 1 %. Despues, las muestras se analizaron a travds de nefelometria para determinar un intervalo de solubilidad. [segun D. Bevan y R. S. Lloyd, Anal. Chem. 2000, 72, 1781-1787].
40
Valores de cLog P
Los valores de Log P teoricos se determinan usando el software ACD Log P. Los valores citados se han calculado a partir de una base de datos no preparada y se refieren a las especies no ionizadas.
45
Ensayo 5. Perfil farmacocinetico
El perfil farmacocinetico de los compuestos de ensayo se determina por el siguiente ensayo:
50 - Infusion intravenosa del compuesto de ensayo; se administran 2 mg/kg en un vehiculo adecuado a 2 ratas
y la sangre arterial se muestrea hasta 24 horas.
- Administration oral del compuesto de ensayo; se administran 30 mg/kg en un vehiculo adecuado a travds de sonda nasogdstrica a 2 ratas y la sangre arterial se muestrea hasta 24 horas.
- Las concentraciones plasmaticas del compuesto de ensayo se determinan mediante un metodo analitico
55 adecuado.
Calculos:
C^-tofa/ *
Dosisw
AUCiv
BA(%)
AUCpral * DosiSiy AUCtv * Dosisora,
CLtotai = depuracion plasmatica total despues de administracibn IV 5 Vd, = volumen de distribution durante la fase de eliminacibn despues de la administracion IV BA = biodisponibilidad oral
AUCiv = area bajo la curva de concentracibn plasmbtica frente al perfil temporal desde el momento cero hasta el infinito despubs de la administracion IV
AUCoral = area bajo la curva de concentracibn plasmatica frente al perfil temporal desde el momento cero hasta el 10 infinito despubs de la administracibn oral
p = constante de velocidad de eliminacion terminal despues de la administracibn IV
Ensayo 6. Penetration de la barrera hematoencefalica
15 Cada compuesto ensayado demuestra una permeabilidad a travbs de una BHE sana.
Se administrb una inyeccibn en bolo de cada uno de los compuestos de ensayo (50 pi de una solucibn acuosa de 3 mg/ml que contenia propilenglicol al 40 % y etanol al 10 %) por inyeccibn en la vena de la cola a ratones macho no consanguineos Swiss (5-7 semanas de edad). Como alternativa, el compuesto de ensayo se administrb por via oral 20 a los ratones de acuerdo con procedimientos estandar conocidos por el experto en la tecnica
5 y 60 min posteriores a la dosis (n = 3 ratones en cada punto temporal), la sangre se recogio por puncion cardiaca y todo el cerebro se extrajo haciendo una incision a travbs de la parte posterior del crbneo. Los ratones se anestesiaron aproximadamente 3-4 min antes de la recogida de la sangre y el cerebro con una inyeccibn 25 intraperitoneal de ketamina y xilazina (133 mg/kg y 10 mg/kg, respectivamente).
Todo el cerebro se puso en viales de pollpropileno pesados previamente y se almacenb a -20 °C hasta el analisis. El dia del anblisis, todo el cerebro se homogeneizb en 3 partes de agua (sobre hielo para reducir el potencial de la degradacibn del cerebro ex vivo) y una allcuota del homogenado cerebral y el plasma se analizb para determinar la 30 concentracibn de compuesto por LCMS. Los estandares se prepararon afiadiendo homogenado de cerebro en bianco y tanto las muestras como los estbndares se procesaron afiadiendo acetonitrilo al homogenado tisular, centrifugando e inyectando una alicuota del sobrenadante sobre en el analisis por LCMS.
Para asegurar una recuperacion completa del compuesto del cerebro, el homogenado de cerebro se enriquecio con 35 el compuesto (en acetonitrilo al 50 %:agua al 50 %) con respecto a una concentracibn nominal de 500 ng/ml. Despues, la concentracibn del compuesto en el sobrenadante se determino por LCMS y se comparb con la concentracibn de sobrenadante cuando el compuesto se anadio tras la precipitacion con acetonitrilo.
Cblculos
40
ccerebro = chomogenado cerebral - cvasculatura cerebral cvasculatura cerebral = cplasma * Vp
45
C.P
c cerebro c plasma
Pap (cm/s)
c cerebro j*0 plasma dl A
ccerebro = concentracibn del compuesto en el parbnquima cerebral (ng/g) chomogenado cerebral = concentracibn del compuesto en el homogenado cerebral (ng/g) cvasculatura cerebral = concentracibn del compuesto en la vasculatura cerebral (ng/g)
Cplasma = concentracibn del compuesto en plasma (ng/ml)
Vp = volumen plasmatico cerebral (26 pl/g para ratones macho no consanguineos Swiss)
C:P = relacibn cerebro-plasma
Pap = coeficiente de permabilidad aparente del compuesto que permea la barrara hematoencefblica
Jc plasmadt = concentracibn del compuesto en plasma desde el momento cero hasta 5 min posteriores a la dosis o
(equivalente a la concentration plasmbtica 5 min posteriores a la dosis, asumiendo que no hay retrodifusibn del cerebro al plasma dentro de este periodo de tiempo)
A = brea superficial de capilares que forman la barrera hematoencefalica (240 cm2/g de peso cerebral por raton)
5 Ensayo 7
Metabolismo in vitro en microsomas de higado humano
Metodos de incubacibn: La solubilidad de los compuestos de ensayo y su recuperation a partir de los medios de 10 incubacibn se confirmaron antes del ensayo metabblico. La estabilidad metabblica se realizo incubando los compuestos de prueba individualmente (1 pM) a 37 °C con microsomas hepbticos humanos. La reaccibn metabolica se inicib mediante la adicion de un sistema de regeneracion de NADPH (es decir NADPH es el cofactor requerido para el metabolismo mediado por CYP450) y se interrumpio en diversos momentos durante el periodo de incubacibn mediante la adicion de acetonitrilo. Tambien se incluyeron muestras adicionales con co-factores duales, es decir 15 NADPH y UDPGA (el co-factor para la glucuronidacion), en la incubacibn para la evaluacibn cualitativa del potencial para la formation de glucuronido. La pbrdida relativa de precursor y la formacibn de productos metabblicos se controlb por LC/MS usando un espectrometro de masas Waters/Micromass LCT,
Cblculosi La concentracion del compuesto de ensayo frente a los datos de tiempo se ajusto a una funcion de 20 decaimiento exponencial para determinar la constante de velocidad de primer orden para la deplecibn del sustrato. En los casos en los que fue evidente una desviacibn clara de la cinbtica de primer orden, unicamente se utilizo la porcibn lineal inicial del perfil para determinar la constante de velocidad de degradacion (k). Despubs, cada constante de velocidad de deplecibn de sustrato se uso para calcular: [1] la semivida de degradacion, [2] un valor de depuracibn intrinseco in vitro (CLinun vitro); [3] un valor de depuracibn intrinseco in vivo predicho (CLir,t); y [4] una 25 relacibn de extraccibn hepatica in vivo predicha (Eh).
[1] t1/2~
ln(2)
k
[2] CL,
■int, in vitro '
contenido de proteins microsdmica (0,4 mg de proteina/ml) masa hepatica (g) 45 mg de proteina microsdmica
mt mt, m vitro peso corporal t (kg) g de masa hepdtica
30 [4] Eh =
CL;n,
Q + CL/m
* Se asumieron los siguientes parametros de escala para estimar los parametros de la estabilidad metabblica:
Especie
Masa hepatica (q hlqado/kq masa corporal) Caudal (Q) (ml/min/kg)
Ser humano
25,7 20,7
Se asumieron 45 mg de proteina microsomica/g de masa hepatica
35 Predicciones de depuracibn hepatica in vivo v relaciones de extraccibn hepatica: Las relaciones de extraccibn hepbtica predichas de microsomas (Eh) obtenidas en base a la velocidad relativa de degradacibn del compuesto de ensayo in vitro, condujeron a compuestos de ensayos clasificados como compuestos de extraccibn baja (< 0,3), intermedia (0,3 - 0,7), alta (0,7 - 0,95) o muy alta (> 0,95). Los supuestos que se extraen de esta clasificacibn se indican a continuation 40
NOTA:
El uso de microsomas hepbticos en la prediccibn de la depuracibn hepatica in vivo y la relacibn de extraccibn se basa en varios supuestos (Obach, 1999; Drug Metab. Dispos. 27: 1350-1359):
45
1) La depuracibn metabblica hepatica (microsomica) el mecanismo de depuracibn principal para los compuestos in vivo\
2) El mecanismo oxidativo dependiente de NADPH predomina sobre otras rutas metabolicas (es decir, metabolismo de conjugacibn directa, reduccion, hidrblisis, etc,); y,
50 3) Las tasas de la actividad metabblica y enzimbtica in vitro son verdaderamente un reflejo de las que
existen in vivo,
Los calcuios de la depuracion intrinseca se basan en el "metodo T1/2 in vitro" (Obach, 1999), que tiene dos supuestos inherentes adicionaies:
1) La concentracibn de sustrato empleada esta muy por debajo de la Km evidente para la renovacion del sustrato; y,
2) No hay ninguna inhibicibn de producto significativa, ni hay ninguna inactivation de enzima basada en algun mecanismo.
10
Los datos deben considerarse dentro de estos terminos de referenda.
Inhibicion de la isoforma CYP450 15 Ensayo basado en fluorescencia
Los microsomas que contienen enzimas CYP450 humanas recombinantes individuales (Supersomes™) se incubaron en presencia de una concentracibn ftja de un sustrato de sonda que forma un metabolito fiuorescente en el metabolismo mediado por CYP450. Se anadieron concentradones variables del compuesto de ensayo (es decir, 20 inhibidor potendal; 40 - 0,06 pM) a estas incubaciones, y la CI50 del compuesto de ensayo se evaluo de acuerdo con ei porcentaje de reduccibn en cuanto a la formacion del metabolito fiuorescente como se determinb a traves del analisis de la repuesta de fluorescencia global a una longitud de onda dada para cada isoforma.
Se incluyb un inhibidor conocido de cada isoforma CYP450 en cada ensayo como un control positivo, y su CI50 se 25 comparb con los valores de la bibliografia para determinacion la aceptacion del ensayo.
La fluorescencia inherente del compuesto de ensayo se examinb en las condiciones de ensayo especificas para cada isoforma antes y despues del ensayo fluorombtrico para identificar cualquier interferencia especifica de compuesto debido al precursor o los productos metabolicos. Si la fluorescencia de fondo en estas muestras aumentb 30 debido a la interferencia especifica de compuesto, entonces las muestras de inhibicibn de CYP450 se cuantificaron usando un ensayo por LC/MS. Los inhibidores de control positivo se analizaron mediante ambos metodos (fluorescencia y deteccion por LC/MS) para confirmar que el mbtodo de cuantificacion no altero el valor de CI50.
Inhibicibn de la isoforma CYP450 usando un enfoque de sustrato especifico
35
El presente estudio es una seleccibn de "Nivel 2" para evaluar la inhibicibn enzimbtica potencial a una concentracion de compuesto de ensayo de 20 pM usando un procedimiento de sustrato especifico en microsomas de higado humano,
40 El estudio de inhibicibn de enzima especifico de sustrato se basa en la formacion de un metabolito que esta mediada por una isoforma CYP450 especifica usando microsomas de higado humano. En el estudio actual, se controlares las siguientes reacciones para evaluar las interacciones con las isoformas CYP450 especificas. Se incluyb un inhibidor conocido de cada isoforma en cada ensayo como control positivo. Los siguientes valores de CI50 se han indicado en la bibliografia usando condiciones de ensayo equivalentes para cada isoforma CYP450:_______________________
isoforma CYP450
Ruta metabolica Inhibidor de control positivo Valor de CI50 en la biblioqrafia
CYP1A2
Fenacetin-O-deetilasa Furafilina 1,76a
CYP2C9
diclofenaco-4-hidroxilacibn Sulfafenazol 0,27a
CYP2C19
(S)-mefenitofna-4'hidroxilacibn Ticlopidina 2,7°
CYP2D6
dextrometorfan-O- desmetilacibn Quinidina 0,058a
CYP2E1
Clorzoxazon-6-hidroxilacibn Tranilcipromina 8,94a
CYP3A4*
midazolam-1 '-hidroxilacibn Ketoconazol 0,019a
testosterona-6|)-hidroxilacibn
0,026a
* Se recomienda usar dos sustratos no relacionados estructuralmente para CYP3A4; Bjornsson y col. (2003) Drug Metab. Dispos. 31: 815-832 "VValsky y Obach (2004) Drug. Metab Dispos. 32: 647-660 ^urpeinen y col, (2004) Drug. Metab. Dispos. 32: 626-631
Una concentracidn individual (20 |jM) del compuesto de ensayo se incubo a 37 °C de forma concomitante con un sustrato especifico para una isoforma CYP individual as s Km (es decir, fenacetina 50 pM, diclofenaco 6 pM, (S)- mefenitofna 50 pM, dextrometorfan 3 pM, clorzoxazona 20 pM, midazolam 2,5 pM y testosterona 50 pM) en 5 microsomas de higado humano a una concentracion de proteinas de 0,4 mg/ml (CYP1A2, CYP2C9, CYP2E1, CYP3A4 y CYP2D6) o 1,0 mg/ml (CYP2C19). La reaccidn se inicib mediante la adicidn de un sistema de regeneracion de NADPH y se interrumpid mediante la adicidn de acetonitrilo antes de determinar la concentracidn (y la tasa de formacion aparente) del metabolito especifico por LC/MS.
10 El efecto inhibitorio de CYP450 (es decir, % de inhibicion) del compuesto de ensayo a una concentracion de 20 pM se evalud de acuerdo con el porcentaje de reduccion en la tasa de formacidn aparente del metabolito especifico, apreciando que la formacion de metabolito maxima se produce en ausencia del inhibidor. Ha de apreciarse que los valores de CI50 para los controles positivos frente a cada isoforma CYP450 se estimaron en base al % de inhibicidn de la actividad de CYP450 a dos con centra ciones que agruparon el valor de CI50 esperado,
15
La CI50 se considero como la concentracidn a la que habla una reduccidn del 50 % en la cantidad de metabolito formado, con respecto a la maxima cantidad de formacion.
Tabla 3: Datos biologicos para los compuestos y compuestos comparativos (*)
Perfil de eficacia in vitro Propiedades fisicoquimicas
H2O2 CI50 (pM)a % de Fe-DA cf. Fe 0,4 pM/DA 50 pM Citotox. (% de viabilidad a 1 y 10 uM)b Transporte de metal PM de partida/PSA ClogP
F4271*
OH NMe2 0,17 57% M17 104,4,61,5 102,3, 52,5 TransDorte de metal 27,8 % 344,34 HCI 380,70 3,17
F4383
9 .2HCI 1,51 81 % M17: 118,5, 103,4 102,3, 92,7 TransDorte de metal 8 % 411,33 484,25 (2,sal HCI) 3,57
F4384
" 0 HCI 2,15 59% M17; 116.3, 86,5 106.4, 73,0 TransDorte de metal 17% 384,27 420,73 (sal HCI) 2,84
F4385*
crN^'N^v*'| OH HCI 0,91 86% M17; 99,2,97,7 105,0, 97,7 TransDorte de metal 9% 370,28 406,74 (sal HCI) 3,63
F4386*
Cl o °H N .HCI I I 0,33 77% M17: 101,8 105,2 99,8 91,9 101,4 111,7 107,9 106,8 TransDorte de metal 13% 344,24 380,70 (sal HCI) 3,18
F4387*
Cl 0 XXXy on 0,46 77% M17: 104,0 19,8 92.7 20,7 95,9 35,5 100.7.41.7 Transoorte de metal 111 % 366,24 402,7 (sal HCI) 3,17
F4391
0H 0 0,59 97 % (2 (jM Fe) M17: 87,4, 57,5 95,9, 70,5 96,0 66,5 Transoorte de metal 34% 382,28 418,74 (sal HCI) 3,88
F4392*
Cl 0 J$c OH 0,57 72% Transoorte de metal 161 % 340,20 376,66 (sal HCI) 2,73
F4473*
Cl o fV“' OH ^ 0,6 62 % 97.0 91,6 99.0 106,1 Transoorte de metal 9% 330,22 Sal HBr 411,12 2,77
F4475
Cl o N^ OH jL 0,5 80% TransDorte de metal 8 % 342,23 Sal HBr: 423,13 2,906
F4477*
0H hn\^y 0,22 65 % TransDorte de metal 16% 316,19 Sal HBr: 397,1 2,305
F4480*
Cl o /VVy cr n Ih F 0,47 46% 91,6, 30,3 106,7, 33,3 TransDorte de metal 138 % 436,31 HCI: 472,77 4,60
F4483
j#K OH 0,33 62% 93,4, 99,7 105,5, 72,3 TransDorte de metal 22 % 356,25 sal HBr: 437,16 3,44
F4486*
^6; OH 1,93 56 % 97,9, 52,2 101,4,43,3 TransDorte de metal 14% 302,16 Sal HBr; 383,07 1,776
F4487*
4ctcr 0,76 53% TransDorte de metal 133% 410,2786 Sal HBr: 491,18
F4492
OH 1,14 55 % TransDorte de metal 18 % 370,27 Sal HBr: 451,19 3,96
F4495*
OH N'V*'j 0,77 45% 89,3,47,9 112,8,57,1 TransDorte de metal 8 % 316,189 Sal HBr: 397,095 2,31
F4496*
J&x;. OH 0,83 45% 102,7,59,4 114,6, 101,2 TransDorte de metal 7% 302,162 Sal HBr: 383,069 1,77
F4499
Cl o /YX> ci-^y^N 1 HC! 0„ £ 1,89 55% 99,1,68,6 76,5, 78,1 Transcorte de metal 15% 368,26 sal HCI: 404,72 3,32
F4530*
Cl 0 iVy^ HBr OH 0,29 57% 105,0, 57,6, 96,2,41,4, Transporte de metal 24% 409,00 sal HBr: 411,12 2,77
F4535*
OH 0,88 62 % 87.0. 63.6, 103.0, 59,8, TransDorte de metal 25% 410,34 sal HCI: 446,80 4,80
F4536*
J5&C?7 OH 1,0 81 % 92,7,64,9, 105,1, 91,9, 109,8,40,9 Transoorte de metal 24 % 410,34 sal HCI: 446,80 4,72
F4540*
Cl 0 a"V^N*S H& OH >10 122 % 100.4, 83,4, 111.5, 96,5 TransDorte de metal 14% 330,21 sal HBr: 411,12 4,72
F4541*
Cl 0 iiV"^ HBr OH 0,74 107 % 97.3, 76,6, 96.4, 90,8. TransDorte de metal 13% 357,26 sal HBr: 439,17 3,83
F4542*
ci-^V^ H& OH 0,36 47% 105.8, 36,6, 102.9, 73,4, 94,3,48,7, TransDorte de metal 30% 344,23 sal HBr: 425,14 3,36
F4543*
Cl 0 rVN^ HBr on 0,50 71 % 92,0, 52,6, 107,4, 61,5, TransDorte de metal 62 % 386,32 sal HBr: 467,23 4,89
F4544*
jfcV OH HN^ .HBr 0,83 164% 84,0,29,7, 86,9,26,7, TransDorte de metal 19% 330,22 sal HBr: 411,12 2,70
F4545*
OH HN^ HBr 0,43 148 % 86,4, 36,2, 85,0, 28,0, TransDorte de metal 40% 344,24 sal HBr: 425,15 3,23
F4546*
Cl 0 jYrr 0H n HBr 0,46 66% 95,6,63,7, 92,2, 86,5, 103,3, 100,3, TransDorte de metal 21 % 372,29 sal HBr: 453,20 4,23
F4547*
OH HN^ .H8r 0,50 34% 75,0, 25,2, 83,9, 26,0, TransDorte de metal 54 % 358,27 sal HBr: 439,18 3,76
F4548*
OH/^N^ .HBr 0,38 40 % 96,5, 55,9, 96,0, 46,0, TransDorte de metal 38 % 400,35 sal HBr: 481,25 5,29
F4549*
Cl 0 (fV^N^ OH HN^ .HBr 0,30 40% 98,5,44,6, 99,7, 52,1, TransDorte de metal 22 % 330,21 sal HBr: 411,12 2,83
F4550*
Cl o (iT<'N^v HBr 0,75 128 % 88.7.71.7, 94.7, 83,5 Transoorte de metal 35% 372,30 sal HBr: 453,20 4,36
F4551*
Jk~ OH 0,45 56 % 89,7, 50,7, 96,9, 62,5, Transoorte de metal 30% 358,26 sal HBr: 439,17 3,83
F4552*
OH 0,63 59% 97,8.58,7, 99,0, 62,8, Transoorte de metal 94% 344,24 sal HBr: 425,15 3,30
F4553*
C|A^NA| OH HN^ 344,24 sal HBr: 425,15 3,14
F4554*
Cl 0 | CI^N^ OH HN^ 330,21 sal HBr: 411,12 2,61
F4555*
Cl 0 | C|A^N^ OH 386,32 sal HBr: 467,23
F4581*
Cl 0 OH 0,50 356,25 sal HBr: 392,71 3,22
F4582*
Cl 0 AA' OH 0,55 316,19 sal HBr: 397,10 2,24
a- Concentracion en pM de compuesto de ensayo requerido para inhibir el 50 % de la produccidn de Abeta H2O2. b-% de inhibition de la toxicidad de Abeta (promedio)
Compuesto
Biodisponibilidad Capacidad de convertirse en farmaco Toxicidad a 30 mg/kgh
Union de protefnas plasmaticas (%>*
Concentracion de plasma de rat6n (ng/ml)b Relacion cerebro-plasma (IV) (B:P)C Estudios PK en la ratad Metabolismo (Eh predichof Estudio de isoformas CYP450 (Clso)' Solubilidad en equilibrio (pH 2-7 )s
F4161*
Humano 95,7 Hasta 510,4 NA ti/2 = 6,7 h Cmax = 6,7 pM Tmax = 15 min % de dosis en orina = 0,1 AUCo-2<h 846,6 (jM/min l24 = 0.045-0.15 pM Microsomas Humano< 0,2 Hepatocitos Humano = 0,20 Perro = 0,56 Rata = 0,29 Andlisis por LCMS: CYP1A2 ICso: 25.7 uM CYP2C91 ICso: >40 uM CYP2C19 ICso: >40 uM CYP2D6 ICso: 40 uM (enfoque especifico de sustrato) CYP3A4 IC50: 13.8 uM 196 pg/ml-746 pg/ml - dependiente del PH No tdxico
F4267*
Humano 99,5 Hasta 1166,6 3,46 en 5 min 2,02 en 60 min Redclaje enterohepatico tic = 4,9h (unicamente dosificacion oral- 30 mg/Kg) l» = 0,25-0,5 uM Microsomas: Humano< 0,31 Hepatocitos Humano = 0,44 Perro = 0,39 Rata = 0,45 Especifico de sustrato: CYP1A2ICso: 15,3 uM CYP2C9 IC50: >30 uM CYP2C19 ICso: >30 uM CYP2D6 ICso: 7,4 uM CYP3A4 ICso: >30 uM 393-1705 pg/ml - dependiente del pH No tdxico
Compuesto
Biodisponibilidad Capacidad de convertirse en farmaco Toxicidad a 30 mg/kgh
Union de proteinas plasmaticas (%)a
Concentracion de plasma de ratdn (ng/ml)b Relacton cerebro-plasma (IV) (B:P)C Estudios PK en la ratad Metabolismo (Eh predicho)8 Estudio de isoformas CYP450 (Clso)r Solubilidad en equilibrio (pH 2-7)3
F4268*
Raton 79, 7- 82,2 Rata 94,5-94,8 Humano 97,1 Hasta 975,9 2,96 en 5 min 2,63 en 60 min Reciclaje enterohepStico ti/2= 4,3h (oral- 30 mg/Kg) Cmax= 10 uM Tmax= 20 min Exposictdn ret: 51,9 % 0,1 % de dosis en orina l24 = 0,02-0,05 uM Microsomas: Humano< 0,2 Hepatocitos Humano = 0,28 Perro = 0,49 Rata = 0,30 Especlfico de sustrato: CYP1A2 IC50: -20 uM CYP2C9 IC50: >20,0 uM CYP2C19 ICM: >20,0 uM CYP2D6 I Cm: >20 uM CYP2E1 ICso: >20 uM CYP3A4- Midazolam ICm- -20 uM CYP3A4- Testosterona ICm: >20 uM 3814-10184 pg/ml - no dependiente del PH No toxico
F4269*
Raton 34,2-41,8 Rata 88,4-92,6 Humano 94,1- 94,6 Hasta 492,1 2,96 en 5 min 2,12 en 60 min Reciclaje enterohepatico ti/j=5,6 h h (oral- 20 mg/Kg) Cmax=3,3 uM Tmax=22,5 min AUC0. 24h(min*umoi/l) = 330,29 0,1 % de dosis en orina ba = 0,01-0,03 uM Microsomas Humano< 0,2 Hepatocitos Humana = 0,38 Perro = 0,54 Rata = 0,35 Especlfico de sustrato: CYP1A2 24,1 uM CYP2C9 >30 uM CYP2C19 >30 uM CYP2D6 >30 uM CYP3A4- Midazolam>30 uM CYP3A4- Testosterona >30 uM 166-2670 pg/ml - dependiente de! pH No toxico
Complies to
Biodisponibilidad Capacidad de convertirse en farmaco Toxictdad a 30 mg/kg”
Union de proteinas plasmaticas (%)a
Concentration de plasma deraton (ng/ml)6 Rel acion cerebro-plasma (IV) (B:P)C Estudios PK en la ratad Metabolismo (Eh predicho)* Estudio de isoformas CYP450 (C!so)f Solubilidad en equilibrio (pH 2-7)°
F4385*
Human 98,7- 99,2 Hasta 9074 Dosificacion Oral: 0,31 en 30 min, 0,42 en 240 min Recidaje enterohepatico tii2 = 14,7 h (oral- 20 mg/Kg) Cmax=7,3 uM Tmax = 30 min AUCo.241, (min*umol/l) = 3124,7 0,05 % de dosis en orina l24 = 0,5-1,5u Microsomas: Humano< 0,2 Hepatocitos Human = 0,55 Perro = 0,37 Rata = 0,35 Especifico de sustrato: CYP1A2 13,4 uM CYP2C9 >30 uM CYP2C19 >30 UM CYP2D6 5,1 uM CYP3A4- Midazolam 21,5 uM CYP3A4- Testosterona >30 uM 683-1662 pg/ml- dependiente del pH No toxico
F4386*
NA Hasta 3294,1 NA NA NA NA NA No toxico
F4387*
NA Hasta 942,7 0,65 en 5 min 0,29 en 60 min NA Microsomas Humano = 0,75 NA NA No tdxico
F4391
NA Hasta 17255,9 NA NA NA NA NA No tdxico
F4473*
NA Hasta 1356,2 NA NA NA NA NA No toxico
F4483
NA Hasta 1585,2 NA NA NA NA NA No tdxico
F4486*
NA Hasta 1115 Dosificacion oral: 0,23 en 30 min, 0,22 en 240 min NA NA NA NA No tdxico
Compuesto
Biodisponibilidad Capacidad de convertirse en farmaco Toxicidad a 30 mg/kg"
Union de proteinas plasmdticas l%)3
Concentraci6n de plasma de ratbn (ng/ml)b Relacion cerebro-plasma (IV) (B:P)C Estudios PK en la rata11 Metabolismo (Eh predicho)6 Estudio de isoformas CYP450 (CIjo)’ Solubitidad en equilibrio (pH 2-7)a
F4495*
Humano 97,7- 97,6 Hasta 8935 DosificaciOn oral: 0,65 en 30 min, 0,64 en 240 min Reciolaje enterohepatico tio — 4,1h (oral- 20 mg/Kg) Cmax=56,7 uM Tmax=30 min AUCo. 24h(min*umol/l) = 5218,4 0,18 % de dosis en orina 124 = 0,05-0,3 uM Microsomas: Humano< 0,2 Hepatocitos Humano = 0,22 Perro = 0,56 Rata = 0,35 Especifico de sustrato: CYP1A2 13,7 uM CYP2C9 >30 uM CYP2C19 >30 uM CYP2D6 9,5 uM CYP3A4- Midazolam >30 uM CYP3A4- Testosterona >30 uM 2227-4727 pg/ml- no dependiente del pH No tdxico
F4496*
Humano 91,8- 93,1 Hasta 3330,8 Dosificacion oral 1,42 en 30 min, 1,97 en 240 min Reciclaje enterohepatico ti/2 = 6,1h (oral- 20 mg/Kg) Cmax=7,61 uM Tmax=45 min AUCo. 24h(min umol/l) = 1069,3 0,19 % de dosis en orina l24 = 0,02-0,1 uM Microsomas: Humano< 0,2 Hepatocitos Humano = 0,43 Perro = 0,66 Rata = 0,35 Especifico de sustrato: CYP1A2 22uM CYP2C9 >30 uM CYP2C19 >30 uM CYP2D6 >30 uM CYP3A4- Midazolam:4,4 uM CYP3A4- Testosterona 8.6 uM 224-1504 pg/ml- no dependiente del pH No tbxico
Preparation de la toxina 6-OHDA (1.65 ma/ml. Sioma Cat. n ° H-4381):
5 La toxina 6-OHDA se disuelve en una solution de bcido ascbrbico (0,2 mg/ml en dh20), se almacena en oscuridad sobre hielo. Para aumentar la veiocidad de la anestesia y reducir el estres en el raton, se inyecta por via subcutanea una premedicacibn con atropina (0,5 mg/kg) y xilazina (10 mg/kg) a traves de una aguja de calibre 27).
Preparar la aauia de lesion para invectar 6-OHDA:
10
Se absorbe PBS en la linea (asegurarse de que no hay burbujas de aire) con hasta 200 ml en una jeringa Hamilton. La jeringa se pone en la bomba de jeringas Kd Scientific y se sujeta. La bomba se enciente y la jeringa se carga en la bomba. El volumen de la bomba se ajusta a 2 ml y la veiocidad se ajusta a 0,5 ml/min. La aguja de lesibn se situa de manera que el biselado (ojo) de la aguja estb a un bngulo de 45° de la linea central y se aprieta para asegurar la 15 aguja. La bomba se enciente y se comprueba si sale fluido.
Anestesia
Se transporta un 3-4 % de isoflurano por el oxigeno para inducir la anestesia y un 1-2 % para mantener la anestesia. 20 El animal se pone en una cbmara de induction pequefia y se somete unos pocos minutos al 4 % de isoflurano en oxigeno a un caudal de aprox. 1 l/min. Despuds, el ratbn se pone en el marco estereotbxico. El tubo anestbsico se desconecta de la caja de induccion y el isoflurano se reduce a una concentration al 2 % y el caudal de oxigeno a aprox. 300-400 cm/min. El tubo se conecta a la pieza de nariz fijada en el marco estereotaxico de manera que el gas de la anestesia pueda administrase continuamente durante la cirugia. Se atornilla una barra de oreja LHS en aprox. 25 3 mm. Se atornilla una barra de oreja RHS hasta que se pueda mover hacia ningun lado la cabeza (aproximadamente 5 mm). Los incisivos frontales se colocan sobre el protector bucal y se pone una proteccidn de nariz (3 mm por debajo de 0). El protector bucal se atornilla en su lugar y se asegura que la parte superior de la cabeza del ratbn estb nivelada (comprobar de nuevo una vez expuesto el crbneo del animal).
30 Usando un bisturl (tamaho 4, hoja 22), el cuero cabelludo se corta por el centra de la cabeza del ratbn para exponer el craneo. Tipicamente 10-15 mm. La superficie del craneo se seca con una bola de algodon. El taladro se mide con una regia 3 mm posterior al bregma y entre 1 y 1,5 mm lateralmente desde la linea central. El craneo se perfora en esta posicibn hasta que la superficie del cerebro se expone.
35 Carga de toxina
6-OHDA se aspira hasta llenar aproximadamente 15 cm de la linea y la jeringa. Se asegura que el fluido saiga de la aguja. El bisel de la aguja estb alineado sobre la linea central donde cruza el bregma, visto por el microscopio de diseccibn de Motik. Se asegura que la aguja estb a unos pocos mm por encima del crbneo antes de posicionarla. El 40 marco se mueve 2,9 mm en una direccibn posterior y 1,1 mm (11 muescas pequenas) lateralmente a la derecha (para inyecciones RHS) a partir de las coordenadas iniciales en el bregma. La aguja se desplaza hacia abajo hasta que la punta de la aguja sblo toca la superficie del cerebro
La aguja se baja a la profundidad requerida de 4,6 mm y se deja reposar el cerebro durante 2 min. Se inyectan 2 ml 45 de la toxina en la SNpc RHS, tardando 4 min. Se dejan 2 min para asegurar que la toxina se dispersa. Se retira la aguja y se aplica antiseptico a la herida, con sutura o pegamento para cerrar.
El raton se envuelve en un pedazo de tela y se coloca en una caja de recuperacibn caliente (en una almohadilla de calor) con botellas de agua (tubos de 50 ml) calentados a 50 °C. Se anade el jarabe Panadoi® a la botella de agua 50 del raton.
Mbtodo de rotacion
La rotacibn se registra por el sistema Rotacount basado en ordenador - (Columbus Instruments, Columbus, OH, 55 Estados Unidos). El sistema se compone de 8 tazones con los sensores conectados a un ordenador que mide las vueltas en aumento (90 grados y vueitas completas de 360 grados) en sentido horario o antihorario. Los sensores se colocan por encima del centra de cada recipiente aproximadamente 30 cm por encima de cada uno. Se fijan unos tubos y una pipeta de plastico vacia fina de manera que el sensor se extiende ahora hasta unos pocos cm de la base del tazbn.
Los ratones se colocan individualmente en los ocho tazones. Los ratones se sujetan a las pipetas a travds de una abrazadera de cable y cinta. Una abrazadera de cable (al menos 15 cm de longitud) se enrolla alrededor del cuerpo del ratdn (parte superior del pecho, detras de las patas delanteras) y se aprieta para asegurar una sujecion segura 5 pero no demasiado apretada asegurdndose de que el extremo este en posicion vertical, Una vez atados los ratones, son devueltos a sus tazones durante dos minutos. Una vez que los ratones estdn seguros, los extremos sueltos de la abrazadera de cable pueden ser adheridos con cinta adhesiva a la parte inferior de la pipeta. Esto ahora significa que cualquier movimiento del raton se registrar^ en el sensor. Una vez que todos los ratones estan sujetos, entonces es posible iniciar el software. Los datos se registran en intervalos de 5 minutos. Los ratones se dejan solos 10 en la sala de comportamiento durante 30 minutos para que se aclimaten a su entorno. Esto tambidn proporciona datos de referencia para cada animal.
Para preparar las jeringuillas de anfetamina, se pesa la anfetamina (Sigma) utilizando SOP G8. Tipicamente, son suficientes 5 mg en 4 ml de soiucidn salina para 12-15 ratones en un dia La anfetamina se inyecta ip a una dosis de 15 5 mg/kg. Para ayudar a la absorcion de la anfetamina, se afiaden 300 ml mas de soiucidn salina en cada jeringa.
Una vez transcurridos los 30 minutos, se inyecta en ratones. Una vez que los ratones han sido inyectados, sus movimientos son controlados durante dos minutos a medida que la anfetamina hace efecto, Los ratones se dejan durante 60 minutos mientras el ordenador registra las rotaciones. El experimento se puede detener en cualquier 20 momento despuds de 60 minutos. Las rotaciones se registran como sentido horario CW o en sentido antihorario CCW.
Criterios de inclusion/exclusidn Dia 3:
25 El animal se incluye si el total de rotaciones en los 60 minutos posteriores a la anfetamina es mayor de 200 y menos de 450.
El animal se excluye si se registran menos de 200 rotaciones en los 60 minutos y ya no se incluye en el ensayo. Los animates que no alcanzan los criterios de seleccidn son sacrificados.
30
Tabla 5: Datos de lesion de 6-OHDA
Tratamiento - control o compuesto o compuesto comparativo
Conducta (Rotacion) % SSV (vueltas totales/h * DE) % de recuentos celulares SN de SSV (SSV = 0 %) (celulas ± DE) Ratones en ensayo (n= ) /ratones en exp.
Ratones sin lesiones
ND 284,73 % (6184* 197,07) 6
Control SSV
0% (259,05 ± 120,21) 0% (1920,56*641,47) 10/26
F4076
16,54% (216,22 ±86,46) 129,77 % (4412,80*502,55) 9/10
F4267 (30 mg kg)
36,33 % (164,93 ± 110,90) 110,44 % (4041,70*799,55) 9/15
F4267 (15 mg kg
-23,39 % (319,67± 171,05) 77,86 % (3415,96*498,05) 8/10
F4267
7,01 % 55,79 % 7/9
(5 mg kg)
(240,89 ± 171,99) (2992,00 * 883,84)
F4268
56,04 % (114,56*71,86) 93,96 % (3725,04 * 842,65) 9/12
F4269
48,85 % (132,50 ± 81,93) 68,91 % (3243,93 * 724,98) 8/12
F4385
49,98 % (129,57* 16,26) 56,81 % (3011,56*502,27) 9/17
F4387
24,51 % (195,57* 114,48) 46,90 % (2821,24*940,22) 7/12
F4495
18,06% (212,29 ± 101,41) 57,22 % (3019,56 ±318,79) 8/27
F4496
36,62 % (164,20 ± 100,40) 95,68 % (3758,11 ± 510,98) 10/27
L-DOPA
52,26 % (123,67 ±80,90) 1,73 % (1953,78 ±280,21) 6/9
Selegilina
71,13% (74,80 ± 57,95) 0,43 % (1928,89 ± 301,77) 6/9
Ejemplo 7 - Tecnica in vivo para enfermedad de Parkinson: MPTP
MPTP (1-meti! 4-fenilo 1,2,3,6-tetrahidropiridina) es un producto quimico que esta relacionado con !os fbrmacos 5 analgesicos opioides. MPTP causa efectos secundarios de Parkinson. Esto ocurre cuando MPTP es metabolizado en MPP+, que mata las neuronas en una parte del cerebro llamada sustancia negra. MPP+ interfiere con el metabolismo de las mitocondrias, lo que conduce a la muerte celular y provoca la acumulacibn de radicales libres, molbculas toxicas que contribuyen mas a la destruccibn celular. MPTP tiene capacidades para realizar la muerte neuronal en cblulas dopaminbrgicas. Tales efectos conducen al agotamiento de las neuronas dopaminergicas, lo 10 que tiene graves implicaciones en el control cortical de los movimientos complejos.
Diseno experimental general:
Experimento 1a - Determinar aue MPTP provoca una muerte celular continuada 15
Ratones de control (no tg) y transgenicos reciben cinco inyecciones por via intraperitoneal de MPTP-HCI (aguja de calibre 23, 20 mg/kg de base libre; Sigma, St, Louis, MO, Estados Unidos) disuelto en una solucion salina estbril al 0,9 % e un intervalo de 2 h en 1 dia. Los animales de control recibieron cinco inyecciones por via intraperitoneal de solucibn salina al 0,9 %. Esto da como resultado una lesibn - 60 % de la SN. Se usan 20 C57BL6, 10 controles y 10 20 hA53T tg para establecer la dosis precisa de toxina en 2 semanas. Los animales se dejan recuperarse durante 1 semana, 2 semanas, 1 mes, 12 meses y 18 meses. Los animales se sacrificaron y los cerebros se extrajeron para realizar un anblisis histologico (estereologico) y bioqufmico,
Experimento 2 - Determinacidn de su el f&rmaco de ensavo reduce la muerte celular inducida oor MPTP.
25
Los animales se tratan como se ha descrito anteriormente. Se tratan con el fbrmaco de ensayo 2 dias despubs de la inyeccibn de MPTP hasta la muerte. El fbrmaco de ensayo se administra por sonda nasogbstrica a una dosis diaria de 30 mg/kg. El tiempo hasta la muerte de los animales depende del anblisis del Experimento 1, normalmente un mes o menos.
30
Administracion del fbrmaco
Los fbrmacos se adminisiran por sonda nasogbstrica, a una dosis diaria de 30 mg/kg.
35 Monitorizacion conductual:
Los ratones se evaluan antes de sacrificarlos para el anblisis histologico.
Rotarod
40
La coordinacion motora y la fuerza se evaluan utilizando el rotarod. El rotarod se compone de una varilla giratoria de plastico de 3,6 cm de dibmetro axial dividida por discos metblicos en cinco secciones para permitir la prueba de miiltiples ratones simultaneamente. Los ratones son entrenados en dos sesiones donde la velocidad de rotacibn se aumenta de 0-30 rpm durante 5 min y una sesibn de entrenamiento donde la rotacibn es una constante de 16 rpm 45 durante 5 min. En los dos dias de entrenamiento, los animales se evaluan formalmente en el rotarod girando a 16 rpm durante un maximo de 3 min: el tiempo hasta caer en esta prueba individual es el punto de datos registrados.
Ensavo con barra
50 La barra es una varilla de madera de 700 mm de largo, 5 mm de dibmetro. La varilla se apoya en su base y se
mantiene vertical. La distancia total a pie para los ratones es de 550 mm. El tiempo que tarda el raton en descender la barra se mide con un tiempo m&ximo de 120 s. Si se cae un raton, el tiempo se anota como 120 s.
Tabla 6: Datos de MPTP para los compuestos y compuestos comparativos (*)
Tratamiento
Conducta en ensayo con barra, campo abierto % de recuentos celulares de SN de SSV (c6lulas +/- DE) Ratones en ensayo (n-)
Control SSV F4267* (30 mg/kg)
NA No lesionados 285,74 % (6184,72 ± 197,07 SSV 0% (2164,43 ±320,79) F4267 53,94 % (3331,96 ±262,97) 30
SSV CQ
NA 7 dlas tratamiento SSV 35,2 % (2180 +/-236) CQ 44 % (2725 +1-257) 30
SSV, F4268*, L-DOPA (20 mg/kg) Selegilina
No puede analizarse la conducta en el ensayo con barra No lesionados 352,74 % (6184,72 ± 197,07) SSV 0% (1753 +/- 323) F4268 74,83 % (3065± 387) L-DOPA 10,39% (1935 ±296) 50
SSV,F4268* (30 mg/kg), L-DOPA (20 mg/kg) Selegilina (1 mg/kg)
Prueba con barra: No lesionados 26,95 % (2,13 ± 1,15) SSV 0% (2,92 ±1,88) F468 -25,38 % (3,66 ± 1,87) L-DOPA -205,29 % (8,91 ± 5,25) Seleailina - 198,93% (8,73 ±7,95) F4268/L-DOPA -4,21 % (2,77± 1,10) No lesionados 320,59 % (6184,72 ± 197,07) SSV 0% (1929,14 ±355,82) F4268 64,00 % (3163,87 ±611,27) L-DOPA 4,50 % (2015,91± 729,87) Seleailina 39,2 % (2754,62 ±461,23) F4268/L-DOPA 55,21 % (2721,94 ±419,73) 60
Control SSV F4486* (30 mg/kg) F4495* (30 mg/kg), F4496* (30 mg/kg)
No lesionados 26,95 % (2,13 ± 1,15) SSV 0 % (2,92 ±1,88) F4486 38,46% (1,81 ±0,80) F4495 18,32% (2,26 ±0,82) F4496 38,61 % (1,79 ±1,13) No lesionados 289,87 % (6184,72± 197,07) SSV 0% (2133,59 ± 162,57) F4486 24,11 % (2647,97 ±814,44) F4495 50,33 % (3207,49 ±678,16) F4496 69,62 % (3619,04 ±613,47) 50
Control SSV F4095* (30 mg/kg) F4161* (30 mg/kg), F4391 (30 mg/kg)
No lesionados 26,95 % (2,13 ±1,15) SSV 0% (2,92 ±1,88) F4095 24,25 % (2,21 ±0,89) F4161 2,55 % (2,85 ±1,63) F4391 9,96 % (2,63 ±1,10) No lesionados 284,73 % (6184,72± 197,07) SSV 0% (2172,12 ±420,33) F4095 12,15% (2436,00 ± 603,06) F4161 28,05 % (2781,33 ±382,88) F4391 25,18 % (2719,11 ±255,12) 50
Control SSV F4267*
NA No lesionados 220,39 % (6184,72± 197,07) SSV 0% (2806,26 ± 329,26) F4267 ,43,S,„ 70
Control SSV F4269* (30 mg/kg)
NA No lesionados 220,39 % (6184,72± 197,07) SSV 0% (2806,26 ± 329,26) F4269 26,76 % (3557,33 ±556,55) 70
Control SSV F4385*
NA No lesionados 220,39 % (6184,72± 197,07) SSV 0% (2806,26 ± 329,26) F4385 31,49 % (3690,00 ±919,10) 70
Control SSV F4268*
NA No lesionados 220,39 % (6184,72± 197,07) SSV 0% (2806,26 ± 329,26) F4268 40,35 % (3797,33 ±562,78) 70
Control SSV F4495* (30 mg/kg)
NA No lesionados 220,39 % (6184,72± 197,07) SSV 0% (2806,26 ± 329,26) F4495 45,45 % (4081,78 1538,77) 70
Control SSV F4496* (30 mg/kg)
NA No lesionados 220,39 % (6184,721 197,07) SSV 0 % (2806,26 1329,26) F4496 33,80 % (3754,67 ±619,05) 70
En las siguientes reivindicaciones y en la description anterior de la invention, excepto cuando el contexto exija expresamente otra cosa debido un lenguaje expreso o una implicacibn necesaria, la palabra "comprender" o variaciones tales como "comprende" o "que comprende" en un sentido inclusivo, es decir para especificar la 5 presencia de las caracteristicas indicadas pero no para impedir la presencia o adicion de otras caracteristicas en diversas realizaciones de la invencibn.

Claims (7)

1. Un compuesto de formula general I
imagen1
5 en la que
R1 y R2 junto con el atomo de N al que est£n unidos, forman un heterociclilo de 5 o 6 miembros opcionalmente sustltuido que puede contener al menos un heteroatomo adicional seleccionado entre N y 0; y R3 se selecciona entre alquilo Cm opcionalmente sustituido y cicloalquilo C3-6 opcionalmente sustituido, en la que los sustituyentes opcionales se seleccionan entre alquilo C1.4, arilo opcionalmente sustituido, halo, 10 cicloalquilo Cm opcionalmente sustituido y heterociclilo de 5 0 6 miembros opcionalmente sustituido que contiene al menos un heteroatomo seleccionado entre N y O,
0 sales farmac6uticamente aceptables del mismo.
2, Un compuesto de acuerdo con la reivindicacidn 1, en el que R3 se selecciona entre metilo sustituido 15 con cicloalquilo Cm 0 metilo sustituido con heterociclilo de 5 0 6 miembros opcionalmente sustituido que contiene al
menos un heteroatomo seleccionado entre N y O; alquilo C2-6 sustituido y cicloalquilo C3-6 opcionalmente sustituido
3. Un compuesto de acuerdo con la reivindicacidn 1 que es un compuesto de fdrmula la
imagen2
20 en la que
R’a y R2a junto con el atomo de N a! que estan unidos, forman un heterociclilo de 5 0 6 miembros opcionalmente sustituido que puede contener al menos un heterodtomo adicional seleccionado entre N y O; y R3a es alquilo Cm
0 sales farmaceuticamente aceptables del mismo.
25
4. Un compuesto de acuerdo con la reivindicacidn 1 que se selecciona entre los siguientes:
imagen3
F4383
F4384
imagen4
imagen5
Cl O
F4475
imagen6
imagen7
imagen8
F4492
o sales farmaceuticamente aceptables de los mismos.
5
5. Una composicibn farmaceutica que comprende un compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 y un vehiculo farmaceuticamente aceptable.
6. Un compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 o una composicion de 10 acuerdo con la reivindicacion 5, para su uso en el tratamiento de la enfermedad de Parkinson.
7. Un proceso para la preparation del compuesto de formula I o la de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que comprende las etapas de:
15
(a) ciclacion de un compuesto de formula ill en presencia de una fuente de un grupo saliente
imagen9
en la que
R3 es como se ha definido en la reivindicacibn 1; y R8 es H o un grupo protector 20 para preparar un compuesto de formula IV
en la que
R3 y R® son como se han definido anteriormente; y LG es un grupo saliente; y
(b) aminacion del compuesto de fbrmula IV con una fuente de NR1R2 en la que R1 y R2 son como se han definido en la reivindicacibn 1 y desproteccibn cuando R8 es un grupo protector.
8. Un proceso para la preparacibn del compuesto de fbrmula I de acuerdo con una cualquiera de las
10 reivindicaciones 1 a 4 que comprende las etapas de:
(i) ciclacion de un compuesto de fbrmula V en presencia de una fuente de NR
Cl
imagen10
en la que
15 R3 es como se ha definido en la reivindicacibn 1; y LG es un grupo saliente para preparar un compuesto de fbrmula VI
en la que
20 R3 y LG son como se han definido anteriormente; y
imagen11
(ii) aminacibn del compuesto de fbrmula VI con una fuente de NR’r2 en la que R1 y R2 son como se han definido en la reivindicacibn 1.
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