ES2632436T3

ES2632436T3 - Aislamiento, identificación y caracterización de cepas con actividad probiótica a partir de heces de lactantes alimentados exclusivamente con leche materna

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Publication number: ES2632436T3
Application number: ES14190638.8T
Authority: ES
Inventors: José María VIEITES FERNÁNDEZ; Sergio MUÑOZ QUEZADA; Inmaculada Llamas Company; José MALDONADO LOZANO; Fernando Romero Braquehais; Antonio Francisco SUÁREZ GARCÍA; Ángel GIL HERNÁNDEZ; Carolina GÓMEZ LLORENTE; Miriam BERMÚDEZ BRITO
Original assignee: Hero AG
Current assignee: Hero AG
Priority date: 2009-03-10
Filing date: 2010-03-09
Publication date: 2017-09-13
Anticipated expiration: 2030-03-09
Also published as: US8637297B2; CN102421889B; EP2407532A2; DK2407532T3; PL2407532T3; CN104232544B; RU2551315C2; RU2011138363A; US20120076829A1; EP2407532A4; EP2848681A1; CN104232545A; DK2848682T3; US20130280789A1; PL2848681T4; EP2848681B1; CN104232545B; ES2532095T3; ES2636944T3; CN102421889A

Abstract

Una cepa de microorganismo probiotico aislada de heces de ninos alimentados exclusivamente con leche materna caracterizada porque consiste en Lactobacillus paracasei HERO 7 con numero de referencia CNCM 1-4034, depositada el 2 de julio de 2008 en el CNCM National Collection of Microorganism Culture, Pasteur Institute 25, Rue du Docteur Roux, F-75724 Paris.

Description

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Con estos resultados, se seleccionó de este segundo grupo una bacteria con los mejores valores en las pruebas de resistencia (Ejemplos 7 y 9) y se denominó inicialmente como Lactobacillus paracasei HERO 7 (posteriormente numerada por el Instituto Pasteur [CNCM National Collection of Microorganism Culture PASTEUR INSTITUTE 25, Rue du Docteur Roux F75724 París] como Lactobacillus paracasei CNCM 14034, donde se la depositó el 2 de julio

5 de 2008).

Posteriormente, se realizó lo mismo con el grupo de las bifidobacterias, habiéndose encontrado un único grupo que tenía una homología del 100 % de un fragmento de 1136 pb del gen ADNr 16s con:

10 Clon de bacteria no cultivadas ARNr 235 Bifidobacterium breve, cepa: ATCC 15700

Con estos resultados, se seleccionó una bacteria del grupo de bifidobacterias con los mejores resultados de resistencia (139,6 % a pH 2,5) (Ejemplos 7 y 9) y se denominó inicialmente Bifidobacterium breve HERO 15B

15 (posteriormente renombrada por el Instituto Pasteur [CNCM National Collection of Microorganism Culture PASTEUR INSTITUTE 25, Rue du Docteur Roux F75724 París] como Bifidobacterium breve CNCM 14035, donde se depositó el 2 de julio de 2008). Por la tanto, estas bacterias clasificadas como: Lactobacillus rhamnosus HERO 22A

20 Lactobacillus paracasei HERO 7 Bifidobacterium breve HERO 15B. se enviaron al Instituto Pasteur para su depósito, donde se reconocieron como únicas, y se les asignó la siguiente denominación final:

Denominación inicial: Denominación final:

Lactobacillus paracasei HERO 7 CNCM I4034

Bifidobacterium breve HERO 15B CNCM I4035

Lactobacillus rhamnosus HERO 22A CNCM I4036 25 Resultados de resistencia a pH, sales biliares y adhesión celular

Como se ha indicado anteriormente, para que las cepas probióticas ejerzan un efecto beneficioso en el intestino, para alcanzar el colon deben sobrevivir al paso a través del estómago, resistiendo su acidez (pH 2,53,5) (Holzapfel 30 et al. 1998) y, por otro lado, deben ser resistentes a las sales biliares presentes en el intestino delgado (Otles et al. 2003).

En el presente estudio, se incubaron las bacterias a pH 3,0 durante 3 horas, aunque se ha descrito que 90 minutos debieran ser suficientes para reproducir el tiempo que transcurre entre la entrada y la salida del estómago (Jin et al. 35 1998). En este caso, las cepas aisladas y los controles presentaron una viabilidad cercana al 100 %, (Ejemplo 12/ Figuras 1 y 4) pero la exposición a pH 2,5 mostró ser muy selectiva, debido a que ningún control presentó viabilidad y solo lo hizo la cepa Lactobacillus rhamnosus 22A (CNCM 14036). En otras palabras, la cepa Lactobacillus rhamnosus 22A es considerablemente más resistente al ácido que las bacterias de control, por lo tanto, su paso por el tracto gastrointestinal y la posterior colonización están facilitados. Por otra parte, la cepa L. rhamnosus 7A dela

40 invención presenta una mayor viabilidad a pH 3,0 que las cepas utilizadas como control (Ejemplo 12, Figuras 1, 4), lo que significa un mayor paso al intestino delgado.

La viabilidad de cultivos probióticos a pH 3,0 durante 2 horas y en medios que contengan 5001000 mg (0,050,1 %) de ácidos biliares por litro, se consideran pruebas convencionales de tolerancia al ácido y a las sales biliares

45 (Snelling 2005), aunque concentraciones de sales biliares al 0,3 % sería adecuada para seleccionar probióticos. Las pruebas de sales biliares realizadas a distintas concentraciones (0,3 % y 0,7 %), presentaron valores superiores al 100 % en todos los casos para las bacterias objeto de la invención y superiores que las bacterias comerciales utilizadas como controles (Ejemplo 12, Figuras 2 y 5). En conclusión las cepas de lactobacilos de la invención son más resistentes al pH y a las sales biliares que otras bacterias utilizadas hoy día como probióticos.

50 Se ha descrito que los lactobacilos en general presentan una mayor resistencia a las condiciones gastrointestinales, en especial con respecto a la acidez y a las sales biliares (Ross et al. 2005). Los resultados encontrados concuerdan con esta descripción, dado que los valores de resistencia a las condiciones gastrointestinales son ligeramente mayores en lactobacilos que en bifidobacterias.

55 Como también se ha mencionado anteriormente, otro aspecto muy importante para la entrada de los probióticos en la microbiota intestinal es la capacidad de adhesión en las células epiteliales intestinales, dado que evitan que las cepas probióticas se eliminen debido a los movimientos peristálticos y a otras bacterias que forman la microbiota intestinal. Adicionalmente, la adhesión es la primera etapa en la colonización y es probablemente un prerrequisito

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para la exclusión competitiva de enteropatógenos (Forestier et al. 2001; Lee et al. 2003) y para la inmunomodulación del hospedador (Ouwehand et al.1999; Plant y Conway 2002).

En la presente invención, las propiedades de adhesión de las distintas cepas se estudiaron utilizando células HT29

5 como un modelo in vitro de epitelio intestinal (Ejemplo 12, Figuras 3 y 6). El patrón de adhesión mostró ser específico para cada cepa, dado que presentaron valores muy distintos a pesar de ser de la misma especie. Esto se puede comprender comparando la capacidad de adhesión de distintos probióticos descritos, por ejemplo, el Lactobacillus casei (Fyos®) presenta una adhesión del 14,4 %, mientras que Lactobacillus casei (Lactophilus®) presenta una adhesión del 2,6 % (Morata De Ambrosini et al., 1999). Como se indica anteriormente, la adherencia

10 de las cepas de lactobacilos de la presente invención es muy superior (el 7,5 % para L. rhamnosus CNCM 14036 y el 15,5 % para L. paracasei CNCM 14034) a la de otras bacterias, tales como Lactobacillus rhamnosus GG, que es del orden del 5 % en células HT29 (Dunne et al., 2001) (Tabla 3). Asimismo, la bifidobacteria B. breve CNCM I4035, también se adhiere a dichas células con un valor mucho mayor que el 16,7 % (Figura 5), en comparación con el 9 % de las bacterias utilizadas como controles.

15 Estos datos confirman los resultados de la presente invención, que muestran la variabilidad existente en las distintas cepas probióticas. En este caso concreto, los controles de los lactobacilos presentan una adhesión (4 %) que corresponde a la mitad de la de los controles de las bifidobacterias (8 %), sin embargo, las cepas aisladas en la presente invención presentan una adhesión mayor que sus controles, debido a que cuando se alinearon los ARNr

20 16s de los distintos grupos se seleccionaron las que tenían los mejores valores de adhesión epitelial.

Por lo tanto, en el caso de los lactobacilos se seleccionaron las cepas que presentaban una adhesión en el orden del 7,48 y 11,55 %, con respecto al 4,80 y 4,09 % de sus controles (Figura 3), y en el caso de las bifidobacterias se seleccionaron las que presentaban una adhesión del 16,7 %, con respecto al 8,8 y 9,1 % de sus controles (Figura 6).

25 En otras palabras, las bacterias que constituyen los distintos objetos de la presente invención tienen una mayor capacidad de colonización y permanencia en el intestino y, por lo tanto, conducen a un mejor efecto probiótico.

Resultados de la caracterización de las bacterias aisladas

30 Estudio del ARN 16s

Han aparecido distintas técnicas moleculares para la identificación, composición y enumeración de la comunidad bacteriana completa del intestino, la mayoría se basan en el estudio del gen del ARN ribosómico (ARNr) 16S, debido a que durante la última década, el gen del ARNr 16s ha revolucionado la manera en que los taxonomistas clasifican 35 e identifican las bacterias. El gen del ARNr 16s comprende regiones que varían desde altamente variables a altamente conservadas, y la diferencia de las secuencias se utilizan para determinar las relaciones filogenéticas y distinguir bacterias desde especies hasta cepas. Existen disponibles base de datos con más de 200.000 genes del ARNr 16s, tales como, por ejemplo, NCBI/BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi), base de datos ribosómica del projectRPD (http://rpd.cme.msu.edu/htlm) y EMBL (http://www.emblheidelberg.de/), estas bases de datos 40 comparan las secuencias del gen del ARNr 16s existentes, con las nuevas secuencias obtenidas. Como se muestra en el Ejemplo 2, las cepas aisladas en la presente invención presentaron una alta homología con Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus paracasei y Bifidobacterium breve, lo que concuerda con documentos anteriores que afirman que en un niño alimentado con leche materna hay altos niveles de bifidobacterias en las heces, entre el 4060 % del total de la microbiota, en donde Bifidobacterium breve se encuentra en porcentaje considerable (Harmsen

45 et al. 2000). Además, existe un alto porcentaje de lactobacilos, principalmente L. casei, L. paracasei, L. acidophilus, entre otros (Heiling et al. 2002, Satokari et al. 2002).

El porcentaje de homología del gen del ARNr 16s de las cepas aisladas fue muy alto (99100 %) de acuerdo con la base de datos NCBI/BLAST (Ejemplo 2). Los fragmentos del gen del ARNr 16s son aproximadamente de 1,4 kb, y 50 los fragmentos secundarios varían entre 1474 pb para Lactobacillus rhamnosus 22A HERO (CNCM 14036), 1274 pb para (CNCM 14034)7 HERO y 1118 pb para Bifidobacterium breve 15B HERO (CNCM I4035). Precisamente, esta última presenta una homología del 100 % con Bifidobacterium breve ATCC 15700 y un clon no cultivable de Bifidobacterium, por lo tanto, sería de interés ampliar el fragmento secuenciado del gen del ARNr 16s, pero en este caso no se pudo obtener un fragmento más grande debido a que los oligonucleótidos 27F (SEQ. ID.

55 NO 1) y 1492R (SEQ. ID. NO 2), que amplifican un fragmento de aproximadamente 1400 pb, no fueron capaces de amplificar el gen del ARN de 16s de la cepa Bifidobacterium breve 15B HERO (CNCM I4035). Por lo tanto, se utilizaron otros oligonucleótidos universales que amplifican fragmentos más pequeños, tales como 39F (SEQ. ID. NO 3) y 1391R (SEQ. ID. NO 4).

60 Los fragmentos secuenciados del gen del ARNr 16s de las cepas de lactobacilos aislados muestran una homología del 99 % con un grupo de Lactobacillus rhamnosus y la otra cepa presenta una homología del 100 % con una gran diversidad de Lactobacillus paracasei, y con un pequeño número de Lactobacillus casei. Se alinearon los fragmentos de ARNr 16s de los controles, de las cepas Lactobacillus rhamnosus 22A HERO (CNCM I4036) y de Lactobacillus paracasei 7 HERO (CNCM 14034), y de un fragmento de L. paracasei que tenía una alta homología con la cepa

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prevención de algunas enfermedades tales como los trastornos gastrointestinales y el cáncer (Julia et al. 2006).

La presente invención no solo demuestra la capacidad de las cepas seleccionadas para inhibir el crecimiento de bacterias patógenas y de virus entéricos intestinales, sino que también demuestra características superiores que 5 definen las propiedades probióticas de los microorganismos, tales como la resistencia al pH, las sales biliares y la adherencia al intestino, en comparación con las bacterias probióticas de control conocidas en el estado de la técnica.

Los resultados han mostrado en todos los casos que las propiedades probióticas de las bacterias de la invención son mejores que dichas bacterias control. Se sabe así que la actividad de las bacterias utilizadas como controles

10 está enfocada en los siguientes campos:

L. casei inmunitas de Danone

Los efectos beneficiosos asociados con las composiciones probióticas que contienen L. casei inmunitas (Actimel®)

15 tienen la mejor respuesta inmunitaria frente a distintos agentes infecciosos, aumentando el nivel de citocinas activadoras del sistema inmunitario, mejorando la respuesta proliferativa de los linfocitos T y modulando la expresión de los linfocitos NK. Se ha observado que beber Actimel® mejora el pronóstico de las diarreas infantiles asociadas con infecciones, reduciendo la gravedad y duración de las mismas.

20 A su vez, las composiciones que contienen L. casei inmunitas tienen efectos antinflamatorios positivos sobre la mucosa del colon humano debido a que aumentan la respuesta inmunitaria del hospedador, lo cual es beneficioso para individuos con enfermedades inflamatorias intestinales y para la prevención del cáncer de colon.

A la vista de lo anterior y de los distintos experimentos comparativos realizados, los que han mostrado las mejores

25 propiedades probióticas de Lactobacillus paracasei HERO 7 (CNCM 14034) con respecto a L. casei inmunitas, Lactobacillus paracasei HERO 7 (CNCM 14034) tiene una excelente aplicación, entre otros, en la prevención de distintas patologías tales como la malabsorción de lactosa, reducción de los niveles plasmáticos de colesterol, distintos tipos de diarreas, enfermedades inflamatorias intestinales, cáncer, etc., en la mejora de la respuesta inmunitaria con respecto a distintos agentes infecciosos, en la mejora de las diarreas infantiles, como un

30 antinflamatorio de la mucosa del colon humano (y, por consiguiente, en la prevención del cáncer de colon).

LGG

Lactobacillus GG se adhiere a las células intestinales, estimulando la respuesta inmunitaria y previniendo la diarrea

35 patógena. Distintos estudios han demostrado que el consumo de composiciones que contienen LGG, tales como Bioactif de Kaiku®, inhibe la colonización competitiva del intestino por microorganismos patógenos. A su vez, estos microorganismos producen compuestos antimicrobianos que inhiben el crecimiento de cepas patógenas, con la posterior inhibición del crecimiento de cepas patógenas. Por lo tanto, el consumo de composiciones con LGG mantiene o restaura el equilibrio de la microflora intestinal, optimizando los procesos de absorción de la función de la

40 mucosa intestinal.

A la vista de lo anterior y de los distintos experimentos comparativos realizados que han mostrado las mejores propiedades probióticas de Lactobacillus rhamnosus HERO 22A (CNCM 14036) con respecto a Lactobacillus GG, Lactobacillus rhamnosus HERO 22A (CNCM 14036) tiene una excelente aplicación, entre otros, la estimulación de

45 la respuesta inmunitaria y la prevención de la diarrea patógena, y en el mantenimiento o restablecimiento del equilibrio de la microflora intestinal.

Bifidobacterium longum y Bifidobacterium bifidum

50 Sabe a partir del estado de la técnica que Bifidobacterium longum es resistentes a los antibióticos, por lo tanto su consumo en periodos en los que los individuos están en tratamiento con antibióticos previene la diarrea que se produce ocasionalmente en los pacientes. Otras aplicaciones de estos microorganismos están dirigidas a reducir el colesterol, aliviar los síntomas de la intolerancia a la lactosa, estimular el sistema inmunitario y prevenir el cáncer.

55 El consumo de composiciones con B. bifidum alivia los síntomas asociados con la diarrea. A su vez, son microorganismos que aumentan la respuesta inmunológica del individuo incrementando la actividad fagocítica en la sangre periférica.

A la vista de lo anterior y de los distintos experimentos comparativos realizados que han mostrado las mejores

60 propiedades probióticas de Bifidobacterium breve HERO 15B (CNCM 14035) con respecto a Bifidobacterium longum y B. bifidum, Bifidobacterium breve HERO 15B (CNCM 14035) tiene una aplicación excelente, entre otros, en la estimulación de la respuesta inmunitaria y la prevención de la diarrea provocada por antibióticos, en la reducción del colesterol, la mejora de los síntomas de la intolerancia a la lactosa, en la prevención del cáncer, etc.

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En el caso de las bacterias, estas se almacenaron en una solución de MRS a la que se añadió glicerol al 20 % (p/v) mediante congelamiento a 80 ºC. Los virus se almacenaron congelados en medio MEM a 190 ºC.

5 Obtención de los sobrenadantes sin células para el estudio

Para obtener sobrenadante concentrado para los distintos ensayos, las cepas se cultivaron en medio de cultivo durante 17 horas y 24 horas, en medio MRS (CNCM I4034 y CNCM I4036) o MRS al que se añadió cisteína al 0,05 % (CNCM I4035), a 37 ºC. El sobrenadante de cada una de las cepas se recogió mediante centrifugación y se

10 liofilizó. El concentrado obtenido se disolvió hasta obtener una solución concentrada 10x, el pH se neutralizó hasta un valor de 6,0 y se esterilizó mediante filtración a través de 0,22 µm. Se almacenaron congeladas a 20 ºC alícuotas del sobrenadante neutralizado y esterilizado hasta su uso.

Ensayos de actividad en medio líquido con respecto a los patógenos digestivos bacterianos

15 Para llevar a cabo los ensayos de inhibición en medio líquido se utilizó una modificación del protocolo de Spinler et al. (2008). Brevemente, se añadieron a placas de multipocillos, por separado, 250 µl de volumen de los sobrenadantes obtenidos en porcentajes crecientes (0,2 % al 4 %) (v/v) al medio de cultivo inoculado al 5 % con el cultivo de una noche de cada uno de los patógenos. Las curvas de crecimiento se obtuvieron de una manera

20 controlada mediante la medición de la DO a 595 nm, utilizando el lector de placas Multiskan 5 Ascent. A partir de los resultados obtenidos en los distintos duplicados se evaluó la inhibición ejercida de forma cuantitativa, en la forma de porcentaje de inhibición del crecimiento con respecto al control sin la adición del sobrenadante de la cepa inhibidora.

Ensayos de actividad en medio líquido con respecto a los patógenos digestivos virales

25 Los ensayos de reducción de la infección viral por el sobrenadante de las cepas del estudio se llevaron a cabo de acuerdo con el protocolo publicado por Botic et al. (2007), con modificaciones para la adaptación del mismo al trabajo a realizarse en este proyecto. En este caso, para realizar estos ensayos, se utilizó la línea de células intestinales humanas HT29.

30 Resultados de los ensayos de actividad en medio líquido con respecto a los patógenos digestivos bacterianos: Listeria monocytogenes, Shigella sonnei y Helicobacter pylori

Para evaluar el efecto de los sobrenadantes de cultivo de las cepas L. paracasei, L. rhamnosus y B. breve, se 35 utilizaron respectivamente sobrenadantes de cultivo neutralizados y concentrados 10x de las 17 y 24 h.

Los resultados variaron en enormemente dependiendo tanto de la cepa probiótica como de la patógena. En el caso de L. monocytogenes, la adición del sobrenadante obtenido tras el cultivo durante 17 horas de L. paracasei tuvo un efecto inhibidor (Figura 10A). En el caso de L. rhamnosus, los mejores resultados se obtuvieron a partir de la adición 40 del sobrenadante de 24 horas de cultivo. En el caso de B. breve destacó la inhibición de L. monocytogenes CECT 4031 T (Figura 10B). Los resultados obtenidos para S. sonnei fueron similares a los de L. monocytogenes, dado que para L. paracasei los mejores resultados se obtuvieron a partir de la adición del sobrenadante obtenido tras el crecimiento durante 17 h y en L. rhamnosus los mejores resultados se obtuvieron a partir de la adición del sobrenadante de 24 horas de cultivo (Figura 10C). En el caso de H. pylori, se obtuvo una reducción significativa del

45 crecimiento del patógeno con los sobrenadantes de 17 h y 24 h de L. paracasei y B. breve, observándose la mayor inhibición en los sobrenadantes que procedían del cultivo de 24 h. Los porcentajes de inhibición obtenidos se describen en la siguiente tabla (Tabla 4).

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