BR112014002911B1 - método para obtenção de uma fração de células e composição que compreende uma linhagem de l. bulgaricus - Google Patents
método para obtenção de uma fração de células e composição que compreende uma linhagem de l. bulgaricus Download PDFInfo
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Abstract
LINHAGEM DE L. BULGARICUS CAPAZ DE INIBIR A ADESÃO DE LINHAGENS DE H. PYLORI A CÉLULAS EPITELIAIS. A presente invenção refere-se a uma linhagem de Lactobacillus delbrueckii subsp. Bulgaricus, apropriada para uso no tratamento ou na prevenção de infecção com Helicobacter pylori.
Description
[001] A presente invenção refere-se ao campo de pró-bióticos. Particularmente, a invenção pertence a uma nova linhagem de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, útil para o tratamento ou a prevenção de infecção de Helicobacter pylori.
[002] De acordo com uma definição recentemente aprovada pela National Yogurt Association (NYA) ou o International Life Science Institute (ILSI) nos USA, pró-bióticos são micro-organismos vivos que com ingestão em uma quantidade suficiente exercem benefícios de saúde além de nutrição básica. Bactérias pró-bióticas foram descritas entre espécies pertencendo aos gêneros Lactobacillus, Bifidobacterium, Streptococcus e Lactococcus, comumente usados na indústria de laticínios. Pró-bióticos são pensados intervirem no nível da flora intestinal através de impedimento de desenvolvimento de microorganismos patogênicos e/ou através de ação mais direta sobre o sistema imune.
[003] Helicobacter pylori (H. pylori) é uma bactéria de forma espiral Gram-negativa que coloniza a camada de muco gástrico humano de mais que 50% da população mundial. Embora a maioria de indivíduos infectados com H. pylori seja assintomática embora seu epitélio gástrico mostre sinal de inflamação, 15% a 20% de indivíduos infectados com H. pylori desenvolvem doenças. Realmente, H. pylori é o principal agente causador de gastrite ativa crônica, doenças de úlcera péptica, atrofia, metaplasia, displasia, câncer gástrico e linfoma de tecido linfoide associado com mucosa gástrica (MALT) (ver para revisão Fox and Wang, 2007 e Polk e Peek, 2010).
[004] Durante infecção, H. pylori se liga especificamente a células epiteliais gástricas forrando o epitélio gástrico através de várias moléculas de adesão (adesinas) produzidas pelas bactérias tais como proteínas BabA e SabA. Adesão às células epiteliais gástricas protege as bactérias de fluxo líquido, movimento peristáltico e desprendimento da camada mucosa. Adesão de H. pylori à mucosa gástrica induz caminhos de transdução de sinal dentro de células epiteliais gástricas, conduzindo a danos de célula epitelial gástrica e atrofia via tensão oxidante, apoptose e/ou mecanismos de autofagia. Da mesma maneira, adesão de H. pylori a células epiteliais gástricas é uma etapa chave no estabelecimento de uma infecção da mucosa gástrica.
[005] O tratamento padrão em pacientes infectados com H. pylori são dois antibióticos associados a um inibidor de bomba de prótons (PPI), assim chamada terapia tripla. Entretanto, a taxa de erradicação de H. pylori seguindo terapia tripla está caindo devido à resistência a antibiótico, ou pobre aquiescência. Ainda, a despeito de vários experi-mentos clínicos, ainda não existe vacina efetiva disponível no mercado.
[006] Parece, a partir do citado anteriormente, que há uma ne cessidade de alternativas ou complementos para terapia tripla para o tratamento ou para a prevenção de infecção com H.pylori.
[007] Foi proposto, como uma alternativa, usar bactérias de ácido lático pró-bióticas (LAB) que produzem ácido lático, bacteriocinas e outras substâncias antimicrobianas. Boyanova et al. (2009) verificou várias linhagens de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus (L. bul- garicus) que inibem o crescimento de linhagens de H. pylori, incluindo linhagens resistentes a antibióticos, in vitro (usando um processo de difusão cavidade - agar), em uma maneira dependente de linhagem. Entretanto, as linhagens L. bulgaricus estudadas não são claramente identificadas e não são publicamente disponíveis. Simova et al. (2009) selecionou várias bactérias de ácido lático produzindo bacteriocina. Então, eles determinaram a atividade antimicrobiana das ditas linha- gens através de análise de atividade antimicrobiana de sobrenadante isento de células (CFS) destas linhagens através de dois processos in vitro: um processo de difusão cavidade - agar e o ensaio de diluição crítica de Barefoot and Klaenhammer. Eles verificaram que o CFS da linhagem de L. bulgaricus BB18 inibe o crescimento de um amplo es-pectro de micro-organismos patogênicos (bactérias ou leveduras), in-cluindo linhagens de H. pylori, devido sua atividade antimicrobiana.
[008] Os inventores isolaram uma nova linhagem de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus e verificaram, in vitro e in vivo, que esta linhagem inibe a adesão de linhagens de H. pylori a células epiteliais. Esta linhagem de L. bulgaricus (chamada DN_100_0602 ou CNCM I4428) por isso pode ser usada para o tratamento ou a prevenção de infecção com H. pylori, alvejando uma principal etapa no estabelecimento desta infecção, a saber, através de inibição de adesão de linhagens de H. pylori a células epiteliais.
[009] Da mesma maneira, um objeto da presente invenção é a linhagem de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus depositada, de acordo com o Tratado de Budapeste, em CNCM (Collection Nationale de Cultures de Micro-organismes, 25 rue du Docteur Roux, Paris) em 3 fevereiro de 2011, sob o número de acesso CNCM I-4428.
[0010] Esta linhagem CNCM I-4428 tem as seguintes característi cas: - morfologia: micro-organismo Gram-positivo, imóvel, forma de bastão, bacilos longos com granulações, - metabolismo: homofermentativo, catalase (-), - fermentação de açúcares (resultados obtidos com um teste API 50 CH em um meio MRS a 37oC por 48 horas): glicose, frutose, manose e lactose.
[0011] Ainda, esta linhagem é capaz de inibir a adesão de linha gens de H. pylori a células epiteliais in vitro e in vivo.
[0012] Como aqui usado, o termo "inibição de adesão de linhagens de H. pylori a células epiteliais" referesse a uma inibição significante (isto é, inibição total ou parcial) da adesão de linhagens de H. pylori a células epiteliais. A inibição da adesão de linhagens de H. pylori a células epiteliais pode ser medida in vitro, como mostrado no exemplo 1 abaixo.
[0013] A presente invenção também abrange linhagens mutantes ou geneticamente transformadas derivadas da linhagem parente CNCM I-4428, contanto que elas sejam capazes de inibir a adesão de linhagens de H. pylori a células epiteliais. Estas linhagens mutantes ou geneticamente transformadas podem ser linhagens em que um ou mais genes endógenos da linhagem parente sofreram mutação, por exemplo, para modificar algumas de suas propriedades metabólicas (por exemplo, sua habilidade para fermentar açúcares, sua resistência a acidez, sua sobrevivência para transporte no trato gastrointestinal, suas propriedades pós-acidulação ou sua produção de metabólito). Elas também podem ser linhagens resultantes da transformação genética da linhagem parente CNCM I-4428 através de um ou mais genes de interesse, por exemplo, de modo a conferir às ditas linhagens geneticamente transformadas características fisiológicas, ou para permitir que as mesmas expressem proteínas de interesse terapêutico ou para vacinas que sejam desejadas administrar através das ditas linhagens. Estas linhagens podem ser obtidas a partir da linhagem CNCM I-4428 por meio das técnicas convencionais para mutagênese randômica ou direcionada para sítio e transformação genética de Lactobacilli, tais como aqueles descritos por Gury et al. (2004) ou por Perea Vélez et al., 2007, ou por meio da técnica conhecida como "embaralhamento de genoma" (Patnaik et al., 2002 e Wang et al., 2007).
[0014] Um objeto da presente invenção é também um processo para obtenção de uma linhagem de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus capaz de inibir a adesão de linhagens de H. pylori a células epiteliais, compreendendo uma etapa de mutagênese ou transformação genética da linhagem CNCM I-4428.
[0015] Um objeto da presente invenção é também frações de célu las que podem ser obtidas a partir de uma linhagem de L. bulgaricus como definida acima, preferivelmente a linhagem CNCM I-4428, contando que elas sejam capazes de inibir a adesão de linhagens de H. pylori a células epiteliais. Elas são em particular preparações de DNA ou preparações de parede de bactérias obtidas de culturas da dita linhagem. Elas também podem ser sobrenadantes de cultura ou frações destes sobrenadantes. Por meio de exemplo, sobrenadante livre de células (CFS) da linhagem CNCM I-4428 pode ser obtido usando o processo para obtenção de um CFS de partir de uma outra linhagem de L. bulgaricus, mostrada em Simova et al., 2009.
[0016] Um objeto da presente invenção é também um processo para obtenção de uma fração de células que é capaz de inibir a adesão de linhagens de H. pylori a células epiteliais, compreendendo as etapas de: a) cultura de uma linhagem de L. bulgaricus como definida acima, preferivelmente a linhagem CNCM I-4428, e b) obtenção de fração de células a partir da cultura na etapa a).
[0017] Um objeto da presente invenção é também uma composi ção compreendendo uma linhagem de L. bulgaricus de acordo com a presente invenção, preferivelmente a linhagem CNCM I-4428, ou uma fração de células obtida a partir da dita linhagem de acordo com a pre-sente invenção.
[0018] Na composição da invenção, a dita linhagem pode ser usa da na forma de bactérias inteiras que podem estar vivas ou mortas. Alternativamente, a dita linhagem pode ser usada na forma de um li- sado de bactérias ou na forma de frações bacterianas; as frações bac- terianas apropriadas para este uso podem ser escolhidas, por exemplo, através de testes de suas propriedades sobre a adesão de linhagens de H. pylori a células epiteliais. Preferivelmente as células bacterianas estão presentes como células viáveis, vivas.
[0019] As composições da invenção podem estar em qualquer forma apropriada para administração, em particular administração oral. Isto inclui, por exemplo, sólidos, semissólidos, líquidos, e pulverizados. Composição líquida é genericamente preferida por facilidade de admi-nistração, por exemplo, como drinques.
[0020] A composição pode compreender pelo menos 105 cfu, pre ferivelmente pelo menos 106 cfu, por g de peso seco, de pelo menos uma linhagem de bactérias como mencionado acima.
[0021] A composição ainda pode compreender outras linhagens de bactérias que não as linhagens de acordo com a presente invenção, em particular linhagens pró-bióticas, tais como Lactobacillus, Bifido-bacterium, Streptococcus ou Lactococcus.
[0022] Quando as bactérias estão na forma de bactérias vivas, a composição tipicamente pode compreender 105 a 1013 unidades de formação de colônia (cfu), preferivelmente pelo menos 106 cfu, mais preferivelmente pelo menos 107 cfu, ainda mais preferivelmente pelo menos 108 cfu, e mais preferivelmente pelo menos 109 cfu por g de peso seco da composição. No caso de uma composição líquida, isto corresponde genericamente a 104 a 1012 unidades de formação de colônia (cfu), preferivelmente pelo menos 105 cfu, mais preferivelmente pelo menos 106 cfu, ainda mais preferivelmente pelo menos 107 cfu, e mais preferivelmente pelo menos 109 cfu/ mL.
[0023] A composição pode ser uma composição nutricional, inclu indo produtos alimentícios, suplementos alimentícios e alimento funci-onal. Um "suplemento de alimento" designa um produto fabricado a partir de compostos usualmente usados em alimentos, mas que está na forma de comprimidos, pulverizado, cápsulas, dose ou qualquer outra forma usualmente não associada com alimentos, e que tem efeitos benéficos para saúde de alguém. Um "alimento funcional" é um alimento que também tem efeitos benéficos para saúde de alguém. Em particular, suplementos alimentícios e alimento funcional podem ter um efeito fisiológico - protetor ou curativo - contra uma doença, por exemplo, contra uma doença crônica.
[0024] A composição nutricional de acordo com a invenção tam bém inclui um alimento de bebê, uma fórmula de leite infantil, ou uma fórmula de acompanhamento infantil. Preferivelmente a presente com-posição é um produto nutracêutico ou farmacêutico, um suplemento nutricional ou alimento médico.
[0025] A composição pode ser um produto laticínio, preferivelmen te um produto laticínio fermentado. O produto fermentado pode estar presente na forma de um líquido ou presente na forma de um pulverizado seco obtido por secagem de líquido fermentado. Exemplos de produtos laticínios incluem leite fermentado e/ou soro de leite coalhado fermentado em forma fixa, agitada ou bebível, queijo e iogurte.
[0026] O produto fermentado também pode ser um vegetal fer mentado, tal como soja fermentada, cereais e/ou frutas em formas fixas, agitadas ou bebíveis.
[0027] Em uma modalidade preferida, o produto fermentado é um produto fresco. Um produto fresco, que não sofreu severas etapas de tratamento térmico, tem a vantagem de que as linhagens de bactérias presentes estão na forma viva.
[0028] Um objeto da presente invenção é também uma linhagem de L. bulgaricus como definida acima, preferivelmente a linhagem CNCM I-4428, ou uma composição como definida acima para uso como um medicamento para tratamento ou prevenção de infecção com Helicobacter pylori.
[0029] Um objeto da presente invenção é também uma linhagem de L. bulgaricus como definida acima, preferivelmente a linhagem CNCM I-4428, ou uma composição como definida acima para uso como um medicamento, preferivelmente um medicamento para tratamento ou prevenção de infecção com H. pylori.
[0030] Um objeto da presente invenção é também uma linhagem de L. bulgaricus como definida acima, preferivelmente a linhagem CNCM I-4428, ou uma composição como definida acima para a fabricação de um medicamento, preferivelmente um medicamento para tratamento ou prevenção de infecção com H. pylori.
[0031] Um objeto da presente invenção é também um processo para tratamento ou prevenção de infecção com H. pylori em um sujeito em sua necessidade, o dito processo compreendendo administração ao dito sujeito de uma quantidade terapeuticamente efetiva de uma linhagem de L. bulgaricus como definida acima, preferivelmente a linhagem CNCM I-4428, ou uma composição como definida acima.
[0032] Determinação de uma quantidade terapeuticamente efetiva é bem conhecida por aqueles versados na técnica, especialmente em vista da exposição detalhada aqui provida.
[0033] Um objeto da presente invenção é também um processo para tratamento ou prevenção de infecção com H. pylori em um sujeito em sua necessidade, o dito processo compreendendo administração ao dito sujeito de uma quantidade terapeuticamente efetiva de uma linhagem de L. bulgaricus como definida acima, preferivelmente a linhagem CNCM I-4428, ou uma composição como definida acima.
[0034] Determinação de uma quantidade terapeuticamente efetiva é bem conhecida a partir daqueles versados na técnica, especialmente em vista da exposição detalhada aqui provida.
[0035] Um objeto da presente invenção é também um processo para a fabricação de um medicamento, preferivelmente um medicamento para tratamento ou prevenção de infecção com H. pylori, o dito processo compreendendo incorporação de uma linhagem de L. bulga- ricus como definida acima, em pelo menos um diluente, veículo ou ex- cipiente farmaceuticamente aceitável.
[0036] Como aqui usado, o tratamento ou prevenção abrange inter alia: infecção preventiva, estabilização de carga de H. pylori e/ou dimi-nuição de carga de H. pylori. O tratamento ou prevenção também abrange endereçamento de pelo menos um dos sintomas associados com H. pylori mencionados acima.
[0037] Métodos para diagnóstico de infecção com H. pylori são conhecidos na técnica. Por meio de exemplo, diagnóstico de infecção com H. pylori pode ser feito através de um teste de anticorpo de sangue, um teste de antígeno de fezes ou um teste de respiração de ureia carbono. Ele também pode ser feito através de biópsia sob endoscopia seguido por um teste de urease, um exame histológico ou uma cultura microbiana.
[0038] Os sintomas ou doenças associados com infecção de H. pylori são dor de estômago, azia, refluxo ácido, dor abdominal, regurgi-tação, vômito, eructação, flatulência, náusea, gastrite tal como gastrite ativa crônica, doenças de úlcera péptica, atrofia, metaplasia, displasia, câncer gástrico e linfoma de tecido linfoide associado com mucosa gástrica (MALT).
[0039] A presente invenção será mais claramente entendida a par tir da descrição que ainda se segue, a qual referesse a exemplos ilus-trando as propriedades anti-infecção da linhagem CNCM I-4428 assim como às figuras apostas.
[0040] A Figura 1 mostra evolução em peso (em gramas) de ca mundongos infectados por H. pylori SS1 recebendo um produto con-trolado, ou infectados por H. pylori SS1 e tratados com L. bulgaricus CNCM I-4428, ou infectados por H. pylori SS1 e tratados com L. bulga- ricus CNCM I-1632 (Lb 130), medida justo antes de tratamento (primeira barra), 3 semanas após o tratamento (segunda barra) e justo antes de sacrifício (terceira barra).
[0041] A Figura 2 mostra o escore de infecção obtido através de imuno-histoquímica usando anticorpos anti-H. pylori em camundongos (i) não infectados por H. pylori, (ii) infectados por H. pylori SS1 recebendo um produto controlado (leite não fermentado), (iii) infectados por H. pylori SS1 e tratados com L. bulgaricus CNCM I-1632 (Lb 130) e (iv) infectados por H. pylori SS1 e tratados com L. bulgaricus CNCM I4428. Definição de escores: 0: nenhuma glândula infectada, 1: raras glândulas infectadas, 2: 25% de glândulas infectadas, 3: de 25 a 50% de glândulas infectadas, 4: > 50% de glândulas infectadas.
[0042] A Figura 3 mostra a quantificação de DNA de H. pylori SS1obtido por PCR de tempo real em camundongos (i) não infectados por H. pylori, (ii) infectados por H. pylori SS1 mas, recebendo um produto controlado (leite não fermentado), (iii) infectados por H. pylori SS1
[0043] E tratados com L. bulgaricus CNCM I-4428 e (iv) infectador por H. pylori SS1 e tratados com L. bulgaricus CNCM I-1632 (Lb 130).
[0044] O método descrito por Oleastro et al. (2008) foi usado com modificações para avaliar o efeito de duas linhagens de Lactobacillus delbrueckiisubsp. Bulgaricus (CNCM I-4428 e CNCM I-1632 depositadas em CNCM em 25 de outubro de 1995) sobre as propriedades adesivas de H. pylori a células epiteliais.
[0045] Duas linhagens de H. pylori foram testadas: a linhagem J99 (BabA2; ATCC número: 700824) e a linhagem 09,193 (BabA1, isolada no Japão por Yoshio Yamaoka, da Oita University). Estas linhagens fo- ram testadas com uma MOI (multiplicidade de infecção) de 50. Células de H. pylori foram transferidas em tampão PBS após uma cultura de 24 horas em pylori agar (Biomérieux, France). A concentração de suspensões bacterianas das duas linhagens de H. pylori respectivamente foi normalizada em 2.108 cfu/mL (correspondendo a OD600 nm = 1).
[0046] Duas suspensões de Lactobacillus delbrueckii subsp. bul- garicus foram testadas com uma MOI de 50 (correspondendo a 25 mi- crolitros de suspensão normalizada de L. bulgaricus por cavidade).
[0047] 100 000 células AGS epiteliais (ATCC número: CRL-1739) foram inoculadas no dia anterior de experimento de infecção em 500 microlitros de meio DMEM F12 complementado com soro bovino fetal em 10%.
[0048] 1 mL de suspensão de H. pylori foi centrifugado 10 minutos em 10 000 g. O pélete foi ressuspenso em 1 mL de Diluente A (de PKH2 Green Fluorescent Cell Linker Kit, Sigma Aldrich, Saint-Louis) e 2,5 microlitros de PKH2 (Sigma Aldrich, Saint-Louis) foram adicionados. A suspensão foi incubada 2 minutos e 30 segundos em temperatura ambiente. A coloração foi interrompida pela adição de 2 mL de soro bovino fetal. Então 4 mL de meio DMEM/F12 foram adicionados antes de centrifugação da suspensão por 10 minutos em 10 000 g. O pélete foi novamente suspenso em 4 mL de meio de cultura e centrifugada 10 minutos em 10 000 g. Esta etapa de lavagem foi repetida duas vezes para remover excesso de fluorcromo.
[0049] Células AGS epiteliais foram dissociadas com tripsina se guindo condições padrões após três lavagens com PBS para descartar bactérias não aderentes. Emissão fluorescente foi analisada por cito- metria de fluxo. Fluorescência foi medida usando o citômetro de fluxo FACSCalibur (Becton Dickinson). Cada condição foi realizada em tri- plicatas.
[0050] Infecção com H. pylori foi realizada em duas condições - em condição de pré-infecção (pré): a suspensão de L. bulgaricus a ser testada foi adicionada às células AGS epiteliais 1h30 antes de infecção com H. pylori. Células foram analisadas por citome- tria de fluxo 1h30 após a infecção (tempo de incubação total de 3 horas); - em condição de coinfecção (co): a suspensão de L. bulga- ricus a ser testada e uma linhagem de H. pylori foram adicionadas às células AGS epiteliais ao mesmo tempo e as células foram analisadas por citometria de fluxo após um tempo de incubação de 1h 30.
[0051] O valor controle de intensidade de fluorescência é obtido com as células AGS epiteliais incubadas com linhagens de H. pylori por 1h 30.
[0052] Porcentagem de valores de adesão é dada em relação à adesão de H. pylori a células epiteliais AGS sem exposição a L. bulga- ricus, que foram fixados em 100%.
[0053] Resultados foram analisados a partir de valor médio obtido de triplicatas e eles foram feitos escores que eles foram significante- mente diferentes de acordo com o teste de Student (P < 0,05).
[0054] Os resultados são mostrados na Tabela 1 que se segue. Tabela 1: resultados obtidos com 2 linhagens de L. bulgaricus para seu efeito sobre adesão de H. pylori a células AGS epiteliais.
[0055] Definição de escores: -3: significante aumento em adesão, 0: nenhum efeito significante sobre adesão, 1: inibição significante de adesão a partir de 1 a 10%, 2: significante inibição de adesão a partir de 11 a 20%, 3: significante inibição de adesão a partir de 21 a 30%, 4: significante inibição de adesão superior a 30%.
[0056] Os resultados mostram que uma suspensão bacteriana da linhagem CNCM I-4428 inibe a adesão de duas linhagens de H. pylori (J99 e 09,193) a células AGS epiteliais em duas diferentes condições (pré- e coincubação), mas que uma suspensão bacteriana da linhagem CNCM I-1632 não tem esta propriedade.
[0057] H. pylori linhagem SS1 tendo uma habilidade de coloniza ção muito boa de mucosa gástrica de camundongos (Lee et al., 1997) foi usada. Identidade da linhagem foi verificada através de sequencia- mento de genes glm e hspA e vacA.
[0058] Produtos de leite fermentado por 2 linhagens diferentes de L. bulgaricus (CNCM I-4428 ou CNCM I-1632) foram preparados como se segue: Primeiro cultura em MRSn foi preparada a partir de linhagem congelada e incubada a 37oC por 17 horas. Uma segunda cultura foi preparada em leite desnatado enriquecido com extrato de levedura (2 g/L) através de inoculação a 1% a partir da primeira cultura e incubada a 37oC por 17 horas. Uma terceira cultura foi preparada em leite enriquecido com extrato de levedura (2 g/L) através de inoculação em 1% a partir da segunda cultura e incubação a 37oC até pH 4,7 ser atingido. O produto foi finalmente preparado por inoculação de leite enriquecido com extrato de levedura (2 g/L) em 1% com a terceira cultura até pH 4,7 ser atingido. Produtos foram estocados a -80oC. Contagem bacteriana foi realizada em MRSn após 48 horas de incubação. Contagem bacteriana foi 6.108 e 1,3.109 cfu/mL, respectivamente para linhagens CNCM I-4428 e CNCM I-1632.
[0059] 55 camundongos fêmeas BALB/cBy/J de 5 semanas de idade (Charles River, France) e testados como SPF (<<livres de pató- geno específico>>) foram divididos em grupos: 3 grupos de 15 camun-dongos foram infectados e 1 grupo de 10 camundongos foi usado como controle não infectado. Camundongos foram alimentados com alimento pobre em vitaminas para aperfeiçoar o desenvolvimento de lesão induzida por H. pylori.
[0060] Camundongos de 6 semanas de idade receberam uma di eta hídrica por 1 dia e então foram alimentados - forçados na manhã seguinte com 250 microlitros de uma suspensão enriquecida da linhagem de H. pylori SS1 (1 a 2 placas de Petri de H. pylori para 5 camundongos). Os camundongos foram colocados em uma gaiola com uma dieta normal. Então, os camundongos receberam novamente uma dieta hídrica na noite. Este protocolo foi repetido por 3 dias.
[0061] Oito semanas após sua infecção, camundongos foram tra tados por 6 semanas com produtos de leite contendo uma linhagem de L. bulgaricus. 120 g de produto de leite foram dados por gaiola por dia em garrafas de alimentação ao invés de água. As garrafas de alimentação foram trocadas cada dia. Para avaliar a quantidade de produtos ingeridos por animal, as garrafas de alimentação foram pesadas. Ainda, camundongos foram pesados justo antes de tratamento, 3 semanas após o tratamento e justo antes de sacrifício (resultados são mostrados na Figura 1).
[0062] Grupos controles de camundongos receberam leite enri- quecido com extrato de levedura (2 g/L) (isto é, sem qualquer linhagem de L. bulgaricus).
[0063] Camundongos foram sacrificados através de deslocamento cervical. Laparotomia foi realizada. Estômagos foram isolados e mucosa gástrica foi lavada em soro fisiológico.
[0064] Estômago foi cortado através de metade a partir de esôfago para o duodeno. Para a metade direita de estômago, cárdia foi eliminada, e então esta metade de estômago foi colocada em soro fisiológico para ser usada para o estudo molecular. A metade esquerda de estômago foi usada para histologia.
[0065] A metade esquerda de estômago foi fixada 1 noite em for mol 3,7% e lavada com etanol 70% e então embutida em parafina e seccionada em espessura de 3 micrômetros.
[0066] Imuno-histoquímica foi realizada com um anticorpo antíge- nos anti-H. pylori: anticorpo primário: anti-H. pylori (Dako, Ref. B0471); anticorpo secundário e DAB: Dako EnVision+ System - HRP (DAB) (Dako, Ref. K4011).
[0067] Estômagos direitos foram homogeneizados (rompidos) em 0,2 mL de soro fisiológico com um Potter - Elvehjem (o tubo foi pesado com e sem o tecido de estômago para conhecer o peso do tecido).
[0068] ADN total foi extraído do estômago triturado com o kit Arrow Stool DNA (NorDiag, Norvège) seguindo recomendações de fornecedor. Para cada estômago triturado DNA total foi novamente suspenso em 180 microlitros de tampão TRIS (10 mM).
[0069] Presença de DNA de H. pylori foi quantificada em extratos de DNA através de PCR de tempo real. Amplificação foi feita com ini-ciadores alvejando rRNA 23S, presente em duas cópias em H. pylori seguindo o processo descrito por Oleastro et al. (2003). Para 20 micro- litros de mistura (MgCl2 25 mM, iniciadores HPY-A e HPY-S 20 μM descritos por Ménard et al., 2002, sonda sensora que é marcada 5’ com LC-Red 640 e fosforilada 3’ e sonda âncora que é marcada 3’ com fluoresceína (ambas sondas descritas por Oleastro et al. 2003) 20 μM, tampão contendo a enzima (10X, kit FastStart DNA Master Hybridization probes, Roche Diagnostics), 5 μL de DNA em 200 ng/μL foram adicionados para serem amplificados em Light Cycler ROCHE, usando o seguinte programa: Desnaturação: 95°C 10 minutos Amplificação: 50 ciclos 20oC/s 95oC 0 s 60oC 20 s 72oC 12 s Fusão: 95oC 0 s 38oC 50 s 20oC/s 2.2 Resultados
[0070] Os escores de infecção obtidos através de imuno- histoquímica para L. bulgaricus linhagens CNCM I-4428 e CNCM I1632 (Lb 130) são mostrados na Figura 2. Estes resultados mostram que administração de produto de leite fermentado com a linhag m CNCM I-4428 para camundongos infectados por H. pylori diminui signi- ficantemente o escore de infecção mas que o tratamento com o produto leite fermentado com a linhagem CNCM I-1632 não diminui a carga de H. pylori. REFERÊNCIAS - Boyanova L et al., Lett Appl Microbiol. 2009;48:579-84. - Fox JG and Wang TC., J Clin Invest. 2007;117:60-9. - Gury J et al., Arch Microbiol. 2004;182:337-45. - Lee A et al., Gastroenterology. 1997;112:1386-97. - Ménard A et al., Antimicrob Agents Chemother. 2002;46:1156-7. - Oleastro M et al., J Clin Microbiol. 2003;41:397-402. - Oleastro M, et al., J Infect Dis. 2008;198:1379-87. - Patnaik R et al., Nat Biotechnol. 2002;20:707-12. - Perea Vélez M et al., Appl Environ Microbiol. 2007;73:3595-604. - Polk DB and Peek RM Jr., Nat Rev Cancer. 2010;10:403- 14. - Simova ED et al., J Appl Microbiol. 2009;106:692-701. - Wang Y et al., J Biotechnol. 2007;129:510-5.
Claims (8)
1. Método para obtenção de uma fração de células que é capaz de inibir a adesão de linhagens de H. pylori a células epiteliais, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: (a) cultivar de uma linhagem de L. Bulgaricus depositada sob o número de acesso \CNCM I-4428, e (b) obter a fração de células da cultura na etapa (a).
2. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende uma linhagem de L. Bulgaricus depositada sob o número de acesso CNCM I-4428, a referida composição sendo uma composição nutricional.
3. Composição de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que a referida composição é um produto alimentício, um suplemento alimentar ou um alimento funcional.
4. Composição de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que a referida composição é um alimento para bebês, uma fórmula de leite infantil ou uma fórmula de acompanhamento infantil.
5. Composição de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que a referida composição é um produto nutricêutico, um produto farmacêutico, um suplemento nutricional ou um alimento médico.
6. Composição de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que a referida composição é um produto laticínio, de preferência um produto laticínio fermentado.
7. Composição de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que a referida composição é um iogurte ou um queijo.
8. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 7, caracterizada pelo fato de que compreende pelo menos 106 cfu, por grama, da linhagem de L. Bulgaricus depositada sob o número de acesso CNCM I-4428.
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