CN109134628A - 一种乳酸菌素plnE及其制备方法 - Google Patents

一种乳酸菌素plnE及其制备方法 Download PDF

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肖丽萍
王丽娜
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傅心锋
周通
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Fujian Aonong Biological Technology Group Co Ltd
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Abstract

本发明涉及一种乳酸菌素plnE及其制备方法，该乳酸菌素plnE的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。与现有技术相比，本发明利用基因工程技术体外重组表达乳酸菌素plnE，具有分子量小、人工合成方便且活性高等特点，对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、巴氏杆菌等细菌具有很强的杀菌作用，在断奶仔猪饲料中应用可以促进断奶仔猪的肠道健康和提高免疫功能。

Description

一种乳酸菌素plnE及其制备方法
技术领域
本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种乳酸菌素plnE及其制备方法。
背景技术
随着抗生素的大量使用甚至滥用，它也随之产生了很多的不良影响，如引起动物菌群失衡、产生耐药性、危害人类健康等。因此，研究可以改善畜禽健康、提高生长性能且安全无毒的能替代抗生素的添加剂具有重要的意义。乳酸菌素指的是部分乳酸菌在其代谢过程中，可以通过核糖体合成而产生的能够抑菌的蛋白。乳酸菌素具有无毒、无副作用、无残留，耐低温贮藏，热稳定性等优点，可以选择性的杀死一些致病菌，并可以保护和促进机体益生菌的生长，从而调节机体的免疫功能，在动物生产上可以作为饲料添加剂被应用。过去大多都是采用硫酸铵沉淀、乙酸乙酯等方法提纯乳酸菌素，然而得到的乳酸菌素的产量有限且活性不高。
专利CN106191044A公开了一种提高乳酸菌素plnK产量的基因工程方法，专利CN107043769A公开了一种提高乳酸菌素plnJ的产量的基因工程，这两篇专利制备得到了乳酸菌素plnK和plnJ，但在应用中发现，这两种乳酸菌素虽然也有抑菌效果，但抑菌所需的量较大，即抑菌所需的成本较高。
发明内容
本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种产量高、活性好的乳酸菌素plnE及其制备方法。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：一种乳酸菌素plnE，该乳酸菌素plnE的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述乳酸菌素plnE的分子量为6.2KDa。该乳酸菌素plnE的等电点为11.7。
一种如上所述乳酸菌素plnE的制备方法，包括以下步骤：
(1)合成plnE上游引物F和plnE下游引物R，其中，plnE上游引物F为5’-CGCGGATCCATGCTACAGTTTGAGAAGTT-3’，plnE下游引物R为5’-CGGAATTCTTAACGAATACTTTTCAAAA-3’；
(2)以plnE上游引物F和plnE下游引物R为扩增引物，以乳酸菌DNA为模板，进行PCR扩增，PCR扩增产物用琼脂糖凝胶电泳鉴定；
(3)琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物后，切线目的条带进行纯化；将纯化后的plnE产物进行酶切、重组，并转化至BL21感受态细胞，即得所述乳酸菌素plnE。用基因工程技术体外重组表达乳酸菌素plnE，具有分子量小，人工合成方便且活性高等特点。
所述的plnE上游引物F和plnE下游引物R由上海生工生物工程股份有限公司合成。
所述的酶切将纯化后的plnE产物与质粒pET-32(+)进行双酶切，得到酶切的PCR目的片段和载体片段。
所述的重组是将酶切得到的PCR目的片段和载体片段进行连接反应。
上述乳酸菌素plnE用于杀菌、促进肠道健康以及提高断奶仔猪的免疫力。乳酸菌素plnE不仅具有广谱的抗菌活性，还有一个很重要的功能，就是起到调节黏膜免疫功能的作用，可以提高细胞因子如：MDA5、IFN-α、IFN-β的表达量，这些细胞因子能够杀死肠道中的病微生物，起到调节黏膜免疫功能的作用，从而提高断奶仔猪的免疫力。
所述的菌包括大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌或巴氏杆菌中的一种或多种。该乳酸菌素plnE具有广谱的抗菌活性，且当同为0.1mg/mL浓度时，plnE的抑菌效果比同类物质更强。
与现有技术相比，本发明的有益效果体现在：利用基因工程技术体外重组表达乳酸菌素plnE，具有分子量小，人工合成方便且活性高等特点，对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、巴氏杆菌等细菌具有很强的杀菌作用，在断奶仔猪饲料中应用可以促进断奶仔猪的肠道健康和提高免疫功能。
具体实施方式
下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例：
(1)参考Gene Bank乳酸菌(Gene Bank：X94434)的plnE基因的核苷酸序列，采用Primer Premier6设计一对特异性引物，plnE上游引物F：5’-CGCGGATCCATGCTACAGTTTGAGAAGTT-3’，plnE下游引物R：5’-CGGAATTCTTAACGAATACTTTTCAAAA-3’，将设计好的引物序列送往上海生工生物工程股份有限公司合成。
(2)以plnE基因的上游引物F和下游引物R作为扩增引物，乳酸菌DNA为模板，对plnE基因进行PCR扩增，PCR扩增产物用琼脂糖凝胶电泳鉴定。
(3)琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物后，切线目的条带进行纯化；将纯化后的plnE产物与质粒pET-32(+)进行双酶切；取酶切的PCR目的片段和载体片段进行连接反应；将连接后的重组质粒，转化至BL21感受态细胞，获得能够在体外诱导表达的重组蛋白。将其蛋白命名为乳酸菌素plnE，最后用酶标仪测定乳酸菌素plnE的浓度(浓度为0.48mg/mL)。
一、乳酸菌素plnE的抑菌实验
(1)试验设计
1、指示菌的复苏：大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、巴氏杆菌按1:100的比例加入到高压好的LB Broth中。其中，巴氏杆菌培养基需加入5％的血清。
2、加热LB Broth Agar培养基，然后倒入约20mL的固体培养基至无菌的平板中，待平板凝固后，加入200uL的指示菌液。
3、待指示菌液吹干，将无菌的牛津杯放入含有指示菌的平板，在牛津杯中各加入10uL的样品。试验设计见表1，分为3个处理组，每组3个重复。最后将固体平板放入37℃恒温培养箱，培养至24h，游标卡尺用于测量抑菌圈的大小，并做好记录。
表1试验设计
组别 乳酸菌素类型 浓度(mg/mL)
空白对照组 —— 0
对比组 plnJ 0.1
试验组 plnE 0.1
(2)试验结果
乳酸菌素plnE对大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、巴氏杆菌的抑菌效果由抑菌圈的直径大小(mm)表述，如表2所示，乳酸菌素plnE浓度为0.1mg/mL对大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、巴氏杆菌都有显著的抑菌效果，而且，在0.1mg/mL浓度下，plnE的抑菌效果优于现有同类产品，说明本发明具有很强的杀菌作用。
表2抑菌效果
二、动物试验设计
(1)试验设计
选取200头24日龄断奶仔猪，然后随机分成4个处理组，每个处理组设置5个重复，每个重复10头，基础日粮配方见表3、表4。A组为空白对照组，不添加乳酸菌素plnE，B组添加1.2ug/mL的乳酸菌素plnE，C组添加2.4ug/mL乳酸菌素plnE，D组添加4.8ug/mL的乳酸菌素plnE。试验期为45d，每天观察仔猪的精神、食欲、腹泻、发病、体重等变化，并做好记录。试验结束后称重，计算料重比，测定乳酸菌素plnE对动物生产性能的影响(见表5)。采集各组猪的空肠和十二指肠，先测量空肠绒毛高度(VH)、隐窝深度(CD)，各指标取平均值，试验结果见表6；再采用ELISA法测定各处理组猪的十二指肠SIgA含量，运用荧光定量PCR法检测各处理组猪的十二指肠黏膜免疫细胞因子(MDA5、IFN-α、IFN-β基因)的表达量，试验结果见表7。
表3基础日粮配方
表4预混料主要组分
组分 含量
铁(mg/kg) 120
铜(mg/kg) 200
锌(mg/kg) 120
锰(mg/kg) 50
硒(mg/kg) 0.2
碘(mg/kg) 0.4
维生素A(IU) 12000
维生素D3(IU) 2000
维生素E(IU) 40
维生素K3(mg/kg) 3.2
维生素B1(mg/kg) 3.0
维生素B2(mg/kg) 6.0
维生素B6(mg/kg) 3.5
维生素B12(mg/kg) 0.04
烟酸(mg/kg) 40
泛酸(mg/kg) 25
叶酸(mg/kg) 3.2
生物素(mg/kg) 0.3
(2)试验结果
表5生产性能
结果表明，不同浓度的乳酸菌素plnE对断奶仔猪的生长发育有影响，添加乳酸菌素plnE后，发病率、死亡率、腹泻率比A组(空白对照)低，且以C组(添加2.4ug/mL)效果最好，说明本发明能显著提高动物机体的生产性能。
表6各组断奶仔猪空肠组织形态测定结果
项目 A组 B组 C组 D组
绒毛高度(μm) 359.1<sup>a</sup> 387.6<sup>a</sup> 446.8<sup>b</sup> 412.33<sup>b</sup>
隐窝深度(μm) 261.5<sup>a</sup> 268.9<sup>a</sup> 250.3<sup>b</sup> 260.5<sup>a</sup>
绒毛高度/隐窝深度 1.37<sup>a</sup> 1.44<sup>a</sup> 1.79<sup>b</sup> 1.58<sup>a</sup>
结果表明，与A组(空白对照)相比，断奶仔猪的绒毛高度有不同程度的提高，其中C的效果最佳；隐窝深度有不同程度的下降，其中C组最低，绒毛高度/隐窝深度的比值以C组最好，说明本发明能显著促进动物机体的肠道健康。
表7乳酸菌素plnE对断奶仔猪十二指肠黏膜SIgA含量及细胞因子表达量的影响
项目 A组 B组 C组 D组
SIgA含量(ug/mL) 80.47<sup>a</sup> 110.56<sup>b</sup> 122.49<sup>b</sup> 118.36<sup>b</sup>
MDA5相对表达量 1<sup>A</sup> 7<sup>A</sup> 12<sup>B</sup> 10<sup>B</sup>
IFN-α相对表达量 1<sup>A</sup> 2<sup>A</sup> 10<sup>B</sup> 8<sup>B</sup>
IFN-β相对表达量 1<sup>A</sup> 5<sup>A</sup> 9<sup>B</sup> 7<sup>A</sup>
结果表明，C组十二指肠黏膜SIgA含量显著高于A组(P&lt;0.05)，且免疫细胞因子MDA5、IFN-α、IFN-β基因的表达量极显著高于A组(P&lt;0.01)，说明本发明能显著增强动物机体的免疫功能。
序列表
&lt;110&gt; 福建傲农生物科技集团股份有限公司
漳州傲农牧业科技有限公司
广州傲农生物科技有限公司
&lt;120&gt; 一种乳酸菌素plnE及其制备方法
&lt;160&gt; 3
&lt;170&gt; SIPOSequenceListing 1.0
&lt;210&gt; 1
&lt;211&gt; 56
&lt;212&gt; PRT
&lt;213&gt; 人工序列(Artificial Sequence)
&lt;400&gt; 1
Met Leu Gln Phe Glu Lys Leu Gln Tyr Ser Arg Leu Pro Gln Lys Lys
1 5 10 15
Leu Ala Lys Ile Ser Gly Gly Phe Asn Arg Gly Gly Tyr Asn Phe Gly
20 25 30
Lys Ser Val Arg His Val Val Asp Ala Ile Gly Ser Val Ala Gly Ile
35 40 45
Arg Gly Ile Leu Lys Ser Ile Arg
50 55
&lt;210&gt; 2
&lt;211&gt; 29
&lt;212&gt; DNA
&lt;213&gt; 人工序列(Artificial Sequence)
&lt;400&gt; 2
cgcggatcca tgctacagtt tgagaagtt 29
&lt;210&gt; 3
&lt;211&gt; 28
&lt;212&gt; DNA
&lt;213&gt; 人工序列(Artificial Sequence)
&lt;400&gt; 3
cggaattctt aacgaatact tttcaaaa 28

Claims (5)

1.一种乳酸菌素plnE，其特征在于，该乳酸菌素plnE的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述乳酸菌素plnE的分子量为6.2KDa。
2.根据权利要求1所述的一种乳酸菌素plnE，其特征在于，所述的乳酸菌素plnE等电点为11.7。
3.一种如权利要求1或2所述乳酸菌素plnE的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)合成plnE上游引物F和plnE下游引物R，其中，plnE上游引物F为5’-CGCGGATCCATGCTACAGTTTGAGAAGTT-3’，plnE下游引物R为5’-CGGAATTCTTAACGAATACTTTTCAAAA-3’；
(2)以plnE上游引物F和plnE下游引物R为扩增引物，以乳酸菌DNA为模板，进行PCR扩增，PCR扩增产物用琼脂糖凝胶电泳鉴定；
(3)琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物后，切割目的条带进行纯化；将纯化后的plnE产物进行酶切、重组，并转化至BL21感受态细胞，即得所述乳酸菌素plnE。
4.根据权利要求3所述的一种乳酸菌素plnE的制备方法，其特征在于，所述的酶切将纯化后的plnE产物与质粒pET-32(+)进行双酶切，得到酶切的PCR目的片段和载体片段。
5.根据权利要求3所述的一种乳酸菌素plnE的制备方法，其特征在于，所述的重组是将酶切得到的PCR目的片段和载体片段进行连接反应。
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