CN104232545A

CN104232545A - 来自完全以母乳喂养的婴儿粪便的具有益生活性的菌株的分离、鉴定和表征

Info

Publication number: CN104232545A
Application number: CN201410478147.1A
Authority: CN
Inventors: 何塞·玛丽亚·维埃特斯·费尔南德; 塞尔吉奥·穆诺兹·奎扎达; 尹玛库拉达·拉玛斯·科姆帕尼; 何塞·马尔多纳多·洛扎诺; 费尔南多·罗梅罗·布拉奎哈伊; 安东尼奥·弗朗西斯科·苏阿雷兹·加西亚; 安琪儿·吉尔·赫尔南德兹; 卡罗莱纳·戈麦斯·略伦特; 米里亚姆·贝穆德斯·布里托
Original assignee: Hero AG
Current assignee: Biopolis SL
Priority date: 2009-03-10
Filing date: 2010-03-09
Publication date: 2014-12-24
Anticipated expiration: 2030-03-09
Also published as: ES2632436T3; EP2407532A4; PL2848682T3; DK2848682T3; CN104232544B; ES2636944T3; US20120076829A1; EP2848681A1; US8637297B2; WO2010103140A3; ES2532095T3; DK2407532T3; WO2010103132A1; RU2011138363A; US20130280789A1; DK2848681T3; RU2551315C2; CN102421889A; EP2848682A1; EP2407532A2

Abstract

本发明涉及分离自完全以母乳喂养的儿童的粪便的益生微生物。所述微生物由于其对摄取它们的人的健康具有有益作用的益生性质而用于食品或制药工业，特别是用于幼儿配方奶。所述微生物包括鼠李糖乳杆菌HERO 22A(CNCM I-4036)、副干酪乳杆菌HERO 7(CNCM I-4034)和短双歧杆菌HERO15B(CNCM I-4035)。

Description

来自完全以母乳喂养的婴儿粪便的具有益生活性的菌株的分离、鉴定和表征

本申请是申请号为201080020442.2(国际申请号PCT/ES2010/000097)、申请日为2010年3月09日、发明名称为“来自完全以母乳喂养的婴儿粪便的具有益生活性的菌株的分离、鉴定和表征”的中国发明专利申请的分案申请，原申请为要求申请日为2009年3月10日、申请号为PCT/ES09/000130的西班牙申请的优先权的中国发明专利申请。

技术领域

本研究的一般目的是分离益生微生物以后续用于食品和制药工业，特别是将其用于幼儿配方奶中。所述微生物对pH、胆汁盐具有高度抗性并具有高度肠细胞粘附，因此它们特别适用于前述工业中。

背景技术

近几十年来，营养学已经得到了极大的发展，并且所述发展已改变了营养学的概念。以前认为膳食具有提供维持健康状况所必需的营养物的作用，而现在，这一概念已经发展为以下看法：膳食可以含有除了提供营养之外的促进健康的食品。这是食品工业开始开发大量促进健康的产品的原因。在这个领域，功能性食品的方面已有了极大的发展，其中人群对益生菌的食用每天都在增加。实际的挑战是扩大对这些食品的了解，在这些食品中含有益生菌的那些食品得到特别的关注。

存在非常古老的记录涉及来自食用具有高细菌含量的食品的有益效果，例如在旧约中，其中提及亚伯拉罕将其长寿的原因归结于食用奶，或者在公元前76年，罗马历史学家Plinius推荐使用发酵奶来治疗肠胃炎(Senmier和De Vrese，2001年)。

在上个世纪最初，俄国微生物学家Elie Metchnikoff(1845年-1916年)建议食用发酵奶调节肠微生物群，从而对人体健康产生积极作用(Metchnikoff，1908年)。他关注于下述事实：保加利亚百岁老人的人数令人难以置信，尽管这是最为贫穷的欧洲国家之一。他观察到保加利亚人大量食用酸奶。Metchnikoff成功地分离了产生酸奶的细菌，并将其用于他的研究中。这是益生研究的开始。Metchnikoff成为下述概念的坚定支持者：膳食可以保护人体免受病原侵入，并因此改善和延长生命的质量。他还是开发胶囊形式的乳酸菌制剂用于口服的第一人，该制剂称为乳杆菌素。

同时，法国微生物学家Tissier观察到，母乳喂养的新生儿的粪便微生物群比接受人造奶的儿童的粪便微生物群具有更多的双歧杆菌属的细菌，并且认识到这种微生物的有益作用。

之后在1940年，双歧奶显示在第一次世界大战期间减轻儿童的营养不良。1950年，Degusta厂制备了Biogur和Bio-garde。1989年，在瑞士，发酵奶的食用和产量提高。1993年，两位研究者Modler和Vila-García开发了第一种低酸度生物酸奶。

1965年，Lilly和Stillwell首次将术语“益生菌”用于命名胃发酵的产物。但是益生菌的更为有效和广泛使用的定义是在很长时间以后由Fuller说明的(Fuller，1992年；Fuller，1989年)。益生菌定义为：“经加入到食品中的活微生物的补充对接受者的健康起有益效果，因为它们调节他/她肠道微生物平衡的改善”。对于成年人，这包括来自发酵奶和用这些细菌冻干的制剂二者。

1998年，位于布鲁塞尔的国际生命科学会(International Life ScienceInstitute，ILSI)将益生菌定义为活微生物，当其以足够量摄入时，对健康具有有益效果，该效果大于常规营养效果。它们有益地影响生物体的一个或多个功能。它们提供更好的健康状况，和/或降低疾病风险。它们可以对一般人群或其特殊群体具有功能。

目前存在益生微生物的定义的标准：

1.它们是人来源的。

2.它们具有非病原的性质。

3.它们对技术方法的破坏具有抗性。

4.它们对胃酸和胆汁的破坏具有抗性。

5.它们粘附于肠上皮。

6.它们能够在胃肠道定殖。

7.它们产生抗微生物物质。

8.它们调节免疫响应。

9.它们影响人代谢活性(胆固醇吸收、维生素产生等)

益生细菌可以影响所有的肠细胞和这些细胞的作用机制，包括对微生物群的作用(Backhed和Ley，2005年)、免疫功能的调节(Picard等人，2004年；Kalliomaki，2004年)和上皮屏障功能的提高(Madsen等人，2001年；Isolauri&Salminen，2005年)。

在具有益生活性的细菌中，来自双歧杆菌属的那些细菌在肠中最为丰富，为成人结肠细菌的25％，母乳喂养的新生儿中的95％。目前有很多食品(酸奶和奶)补充了这种类型的细菌。根据抑制其它厌氧细菌(例如梭菌属、类杆菌属、双歧杆菌属、假单胞菌、葡萄菌属、链球菌属和肠杆菌科)的附着的“体外”研究，同样具有益生活性的其它菌株为来自乳杆菌属的那些细菌(Silva等人，1987年)。

在一些病理学中采用益生菌作为医学手段已得到了广泛认可，并且其效果的证据确凿，主要是对于以下的临床研究和元分析(meta-analysis)的结果：乳糖吸收不良(Adolfsson等人，2004年；Piaia等人，2003年)、胃肠道感染(Brownlee等人，2003年)和与使用抗生素有关的腹泻(D'Souza等人，2002年)。此外，已显示使用益生细菌双歧杆菌、乳杆菌和/或二者的混合物对一些消化性疾病具有有益效果。在文献中存在很多有益效果方面的证据。

对肠道微生物群的成分之间的关系以及与宿主的相互作用的理解是非常复杂的。基因组有助于分析对肠道条件响应的经分离的细菌，从而部分揭示了菌株的代谢能力，但是，其中可以表达这些能力的条件以及得以分离形成肠道微生物群的绝大多数菌株的条件在很大程度上仍然是未知的，只能通过部分或全部鉴定它们的基因组的分子工具来进行鉴定。由于此原因，益生菌和功能食品领域的发展为全面的发展。

因此，考虑到益生菌株之间存在不同作用并且属于相同种的菌株种类可能具有不同生理特性，而不同生理特性又使它们具有抗其它细菌的不同或改善的益生性质，因此鉴于它们的健康和工业益处，对新益生菌株的作用的鉴定和表征是非常重要的。

本研究的一般目的是分离益生微生物以后续用于食品和制药工业，特别是将其用于幼儿配方奶中，所述益生微生物具有改善的益生性质、对酸性pH的抗性、对胆汁盐的抗性和肠细胞粘附。

本发明提供和表征了分离自完全以母乳喂养的儿童的粪便的益生微生物。

随着本发明的目标菌株通过胃和肠道，其对pH和胆汁盐的更大抗性使得所述益生微生物具有更大的存活能力，并因此提高它们的定殖作用，也因此提高它们抗其它潜在病原细菌的拮抗作用。另一方面，构成本发明目标的益生菌株对人体肠道细胞的更大粘附性可以实现对所有免疫系统调节的更大作用。

发明内容

本发明提供了分离自完全以母乳喂养的儿童的粪便的益生微生物。由于所述微生物的益生性质，而所述益生性质对摄入它们的那些人健康具有有益作用，所述微生物用于食品或制药工业中，特别是用于幼儿配方奶中。

为分离所述益生微生物，本发明提出了下述具体目标：a)分离获自完全以母乳喂养的儿童的粪便的乳酸细菌菌株；b)评估对pH和胆汁盐的抗性；和c)评估对肠上皮细胞的粘附性。

通常在婴儿的粪便中寻找益生细菌。此外，存在某些惯例，推荐益生菌必须是人来源的，据信其原因在于它们能更好地植入人体肠道中。然而，很多分离的菌株并不满足益生条件，因为它们很少或根本不对消化液具有抗性，并且它们中的一些并不粘附于肠上皮。在本发明中，选择完全以母乳喂养的婴儿，以确保分离的细菌不是商业细菌。此外，已显示以母乳喂养的婴儿的肠道微生物群非常富含双歧杆菌和乳杆菌。

涉及益生菌，必须通过下述表征有效的益生菌：

1.其对宿主具有有益作用的能力，例如对疾病的抗性。

2.其不造成病原性或毒性。

3.其经通过胃肠道的存活能力。例如对胃酸和胆汁酸的抗性。

4.其保持粘附于肠壁细胞的能力。

5.其短且稳定的生成时间和其在储存条件下长时间保持存活的能力。

6.其是人来源的。

7.其产生抗病原的抗微生物物质、抗肿瘤性质。

8.其影响代谢活性的能力。

与益生摄入有关的健康益处包括：

1.减轻源自乳糖吸收不良的症状。

2.提高对肠道感染性疾病的天然抗性。

3.降低血清胆固醇浓度。

4.改善消化。

5.刺激胃肠免疫力。

6.发展对食物抗原的免疫耐受和降低过敏风险。

因此，本发明涉及分离自婴儿粪便的新的益生微生物。具体而言，本发明涉及鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)HERO 22A(CNCM 1-4036)、副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)HERO 7(CNCM 1-4034)和短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)HERO 15B(CNCM I-4035)微生物。所述微生物具有抗相同种的微生物的改善的益生性质。

制剂涉及一种或数种成分的组合物或组，即存在于复杂物质(食品或剂型等)中的成分的类别和数量以及它们存在的比例。

“载体”理解为允许本发明的菌株生长、运输和/或施用的任何类型的物质。取决于所述菌株意指的目的和/或用途，“载体”可具有不同的性质。本发明涉及药学上可接受的“载体”例如通常与胶囊、片剂或粉末相关的那些载体，以及由成分或食品形成的“载体”。

意指用于特殊膳食的食品为这样的食品：即，由于它们的特定组成或制备它们的特定方法，所述食品与基本食品具有明显区别，其适用于所指出的营养目标且销售时指明它们实现所述目标。(1989年5月3日的欧盟指令89/398/EEC，其涉及近似于成员国对要用于特殊膳食的食品的法律(6月30日的DO series L no.186))。

特殊膳食理解为必须满足下述人群的特定营养需要的那种：

i)具有吸收过程或代谢障碍的确定人群，或

ii)处于特定生理状况且因此从受控地摄入确定食物中获得特殊益处的确定人群；或

iii)健康的婴儿或幼儿。

食品补充剂涉及这样的食品：其目的是补充正常膳食，且由以单独或组合方式具有营养或生理作用的浓缩的营养源或营养物或其它物质组成，以剂量形式销售，所述剂量形式即胶囊、丸剂、片剂、锭剂和其它类似形式、粉末囊剂(powder sachet)、液体安瓿、具有点滴器的瓶和必须以小的整体量摄取的液体和粉末的其它类似形式；(欧洲议会和理事会2002年6月10日的指令2002/46/EC，其涉及近似于成员国在食品补充物质方面的法律)。

益生菌涉及对宿主的健康具有有益作用的那些微生物细胞制剂或微生物细胞或微生物细胞的组分。

益生元理解为“来自有益于和刺激肠道细菌生长从而改善宿主肠道平衡的膳食的不可消化的成分”。使用的益生元包括：菊粉、寡果糖、低聚半乳糖、来自胶质和其他橡胶以及黏液的水解的寡糖、和抗性淀粉和麦芽糊精以及核苷酸。

本发明的目的涉及分离自完全以母乳喂养的儿童的粪便的益生微生物菌株，其特征在于，包括鼠李糖乳杆菌HERO 22A(CNCM 1-4036)或副干酪乳杆菌HERO 7(CNCM 1-4034)或短双歧杆菌HERO 15B(CNCMI-4035)。

在一个具体实施方式中，所述菌株为鼠李糖乳杆菌HERO 22A(CNCMI-4036)。

在另一个具体实施方式中，所述菌株为副干酪乳杆菌HERO 7(CNCM1-4034)。

在另一个具体实施方式中，所述菌株为短双歧杆菌HERO 15B(CNCMI-4035)。

在一个实施方式中，上述菌株以纯的生物培养物的形式提供。在另一个实施方式中，所述菌株为分离的。

在一个实施方式中，上述微生物菌株以活细胞的形式提供；在另一个实施方式中，所述菌株以非活细胞的形式提供。

本发明的另一个目的涉及包含上述微生物菌株的制剂。在一个具体实施方式中，所述制剂包含另一种益生物；在另一个实施方式中，其额外地包含益生元物质。

在另一个具体实施方式中，所述制剂包含适于摄入的载体。所述载体为药学上可接受的，例如通常与胶囊、片剂或粉末相关的那些载体。

在另一个具体实施方式中，所述载体是食品。所述食品选自奶和奶衍生的产品，特别是发酵奶和乳酪；谷类食物和衍生物，包括面包团；汤和其他脱水形式的的类似产品；经发酵的肉制品；水果衍生物、果汁和软饮料；用于特殊营养用途的食品。

本发明的另一个目的涉及益生微生物的菌株或上述用于膳食的制剂。在一个实施方式中，所述膳食涉及幼儿和/或成人和/或特殊膳食。

在另一个实施方式中，上述益生微生物的菌株或制剂用于制备幼儿配方奶。在一个具体实施方式中，所述配方由即食型幼儿奶和/或幼儿谷类食物和/或幼儿食品组成。

在另一个实施方式中，上述益生微生物的菌株或制剂用于制备食品补充剂。

在另一个实施方式中，上述益生微生物的菌株或制剂用于制备口服和/或肠营养的特殊配方。

在另一个实施方式中，上述益生微生物的菌株或制剂用于制药用途的制剂/可应用为医药制品/用于制备药品。

在另一个实施方式中，上述益生微生物的菌株或制剂可应用于刺激免疫系统和/或预防/治疗哮喘和/或预防/治疗胃肠道障碍，和/或消除/调节主要消化性病原，和/或预防/治疗肥胖及其并存疾病(包括代谢综合征和糖尿病)和/或衰老相关疾病。

所述胃肠道障碍包括肠道运输变化，例如便秘和矿物质生物利用度变化、感染和吸收不良综合征。

所述吸收不良综合征包括影响肠道解剖结构的障碍(例如短肠综合征)和影响肠道生理的障碍(例如胰腺囊性纤维化)、糖(尤其是乳糖)吸收不良、脂质吸收改变、食物过敏、和炎性肠病(例如克罗恩病和溃疡性结肠炎)。

附图说明

图1通过表格示出了与两种商业化菌株相比，pH对本发明的目标鼠李糖乳杆菌CNCM I-4036和副干酪乳杆菌CNCM I-4034菌株存活的影响。具体而言，所述表格示出了来自下述菌株的pH抗性研究的菌落形成单元存活性的值(％)：分离的鼠李糖乳杆菌22A(CNCM I-4036)、副干酪乳杆菌7(CNCM I-4034)菌株和它们的各商业对照。通过比较在测试的不同pH下存在于对照中的细菌数量和存在的细菌数量，以存活％示出所述值。结果表示为％列中的百分比单位。可以观察到在pH 3，菌株7和22A的抗性和测试的商业菌株类似或稍高于测试的商业菌株。然而在pH 2，相比在此pH下不存活的其余菌株，菌株22A具有非常高的存活性。

图2通过表格示出了与两种商业化菌株相比，胆汁盐(Oxgall)对本发明的目标鼠李糖乳杆菌CNCM I-4036和副干酪乳杆菌CNCM I-4034菌株存活的影响。因此，所述表格示出了来自下述菌株的胆汁盐抗性研究的存活性的值(％)：分离的菌株鼠李糖乳杆菌22A(CNCM 1-4036)、副干酪乳杆菌7(CNCM 1-4034)和它们的各商业对照。比较在测试的不同胆汁盐浓度下存在于对照中的细菌数量与存在的细菌数量，以存活％示出所述值。结果表示为％列中的百分比单位。从所述结果可知，在0.3％和0.7％胆汁盐的浓度下，菌株7和22A的存活百分比都远高于测试的商业菌株，是后者的两倍。两个菌株都具有高于100％的存活率，说明它们甚至可以在这些盐的存在下繁殖。结合它们对pH的高度抗性，表明了所述菌株的高定殖潜力。

图3通过表格示出了与两种商业化菌株相比，本发明的目标鼠李糖乳杆菌CNCM I-4036和副干酪乳杆菌CNCM I-4034菌株对人肠HT-29细胞的粘附。通过来自下述菌株的肠上皮细胞粘附研究的存活性的值示出了所述能力：分离的鼠李糖乳杆菌22A(CNCM 1-4036)、副干酪乳杆菌7(CNCM1-4034)菌株和它们的各商业对照。比较存在于对照中的细菌数量，以粘附细菌％示出所述值。两种细菌具有的对人肠HT-29细胞的粘附百分比都远高于测试的商业菌株，这表明了它们在调节肠细胞活性(包括免疫调节)中的潜在作用。

图4通过表格示出了与两种商业化菌株相比，pH对本发明的目标菌株短双歧杆菌CNCM 1-4035存活的影响。通过来自所述菌株相比其各商业对照的pH抗性研究的存活性的值示出了所述影响。通过比较在测试的不同pH下存在于对照中的细菌数量和存在的细菌数量，以存活％示出所述值。结果表示为％列中的百分比单位。可以观察到在pH 3，菌株15B的抗性显著高于测试的其它两种双歧杆菌的抗性，其存活性为大于100％，这表明所述细菌甚至可以在该pH下繁殖。

图5通过表格示出了与两种商业化菌株相比，胆汁盐(Oxgall)对本发明的目标菌株短双歧杆菌CNCM I-4035存活的影响。以下述菌株的胆汁盐抗性研究的方式示出该影响：分离的菌株短双歧杆菌15B(CNCM I-4035)和其各商业对照。通过比较在测试的不同胆汁盐浓度下存在于对照中的细菌数量与存在的细菌数量，以存活％示出所述值。结果表示为％列中的百分比单位。在低浓度胆汁盐存在下的存活的值类似于另外两种双歧杆菌的那些值。然而，在更高的浓度下，菌株15B显示出更高的存活。

图6通过表格示出了与两种商业化菌株相比，本发明的目标短双歧杆菌CNCM I-4035对人肠HT-29细胞的粘附。通过来自下述菌株的肠上皮细胞粘附研究的存活性的值示出所述能力：经分离的菌株短双歧杆菌15B(CNCMI-4035)和其各商业对照。比较存在于对照中的细菌数量，以粘附细菌％示出所述值。本发明的目标菌株对人肠HT-29细胞的粘附百分比远高于测试的商业菌株的粘附百分比，这表明了其在调节肠细胞活性(包括免疫调节)中的潜在作用。

图7示出了与两种商业化菌株(其对照)相比，本发明的目标菌株短双歧杆菌CNCM I-4035(短双歧杆菌15B)的酶活性(单位为：单位/ml培养基)。结果如实施例11中所述。获得的结果使得得到下述结论：CNCM I-4035的发酵活性和来自双歧杆菌属的种的发酵活性相符，从而允许将CNCMI-4035分类为所述属。

图8示出了与两种商业化菌株(其对照)相比，本发明的目标鼠李糖乳杆菌CNCM 1-4036(鼠李糖乳杆菌HERO 22A)和副干酪乳杆菌CNCM1-4034(副干酪乳杆菌HERO 7)的酶活性。结果如实施例11中所述。获得的结果使得得到下述结论：HERO 7和HERO 22A的发酵活性和来自副干酪乳杆菌属和鼠李糖乳杆菌属的种的发酵活性相符，从而允许将CNCM I-4036和CNCM I-4034分类为所述各属和种。

图9：图9A和9B示出了所选择的CNCM I-4034(副干酪乳杆菌HERO7)和CNCM I-4036(鼠李糖乳杆菌HERO 22A)及其对照的碳水化合物和其它底物(API 50CHL)的发酵活性结果。结果如实施例11中所述。获得的结果使得得到下述结论：HERO 7(CNCM I-4034)和HERO 22A(CNCMI-4036)的发酵活性和来自副干酪乳杆菌属和鼠李糖乳杆菌属的种的发酵活性相符，从而允许将CNCM I-4036和CNCM I-4034分类为所述属。

图10：图10A、10B和10C示出了本发明的益生细菌对单核细胞增生李斯特菌(L.monocytogenes)CECT 4031和宋内氏志贺氏菌(S.sonnei)CECT457施加影响的结果。(A)副干酪乳杆菌CNCM I-4034生长17个小时后获得的浓缩10倍的上清液对单核细胞增生李斯特菌CECT 4031施加的影响。(B)短双歧杆菌CNCM I-4035生长24小时后获得的浓缩10倍的上清液对单核细胞增生李斯特菌CECT 4031施加的影响。(C)鼠李糖乳杆菌CNCMI-4036生长24小时后获得的浓缩10倍的上清液对宋内氏志贺氏菌CECT 457施加的影响。

图11示出了培养时间17小时和24小时的1％和4％中和和未中和的副干酪乳杆菌CNCM I-4034上清液对细菌伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)CECT 725、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)CECT 443和鼠伤寒沙门氏菌CECT 4594的抑制作用。(A)培养时间17小时的未中和的副干酪乳杆菌CNCM I-4034对鼠伤寒沙门氏菌CECT 443的抑制作用。(B)培养时间24小时的未中和的副干酪乳杆菌CNCM I-4034对细菌鼠伤寒沙门氏菌CECT 4594的抑制作用。(C)培养时间24小时的未中和的副干酪乳杆菌CNCM 1-4034对细菌伤寒沙门氏菌CECT 725的抑制作用。(D)培养时间24小时的中和的副干酪乳杆菌CNCM I-4034对细菌伤寒沙门氏菌CECT 725的抑制作用。(E)培养时间17小时的未中和的副干酪乳杆菌CNCM I-4034对细菌伤寒沙门氏菌CECT 725的抑制作用。

图12示出了培养时间17小时和24小时的1％和4％中和和未中和的短双歧杆菌CNCM I-4035上清液对细菌伤寒沙门氏菌CECT 725的抑制作用。(A)培养时间17小时的1％和4％未中和的短双歧杆菌CNCM I-4035上清液对细菌伤寒沙门氏菌CECT 725的抑制作用。(B)培养时间17小时的1％和4％中和的短双歧杆菌CNCM I-4035上清液对细菌伤寒沙门氏菌CECT725的抑制作用。(C)培养时间24小时的1％和4％未中和的短双歧杆菌CNCM I-4035上清液对细菌伤寒沙门氏菌CECT 725的抑制作用。(D)培养时间24小时的1％和4％中和的短双歧杆菌CNCM I-4035上清液对细菌伤寒沙门氏菌CECT 725的抑制作用。

图13示出了培养时间17小时和24小时的1％和4％中和和未中和的鼠李糖乳杆菌CNCM I-4036上清液对细菌伤寒沙门氏菌CECT 725、鼠伤寒沙门氏菌CECT 4594、大肠杆菌ETEC CECT 501、大肠杆菌ETEC CECT 515、大肠杆菌ETEC CECT 729和大肠杆菌ETEC CECT 742的抑制作用。(A)培养时间17小时的1％和4％未中和的鼠李糖乳杆菌CNCM I-4036上清液对细菌伤寒沙门氏菌CECT 725的抑制作用。(B)培养时间24小时的1％和4％未中和的鼠李糖乳杆菌CNCM I-4036上清液对细菌伤寒沙门氏菌CECT 725的抑制作用。(C)培养时间24小时的1％和4％中和的鼠李糖乳杆菌CNCMI-4036上清液对细菌鼠伤寒沙门氏菌CECT 74594的抑制作用。(D)培养时间17小时的1％和4％未中和的鼠李糖乳杆菌CNCM I-4036上清液对细菌大肠杆菌ETEC CECT 501的抑制作用。(E)培养时间24小时的1％和4％未中和的鼠李糖乳杆菌CNCM I-4036上清液对细菌大肠杆菌ETEC CECT 501的抑制作用。(F)培养时间17小时的1％和4％未中和的鼠李糖乳杆菌CNCMI-4036上清液对细菌大肠杆菌ETEC CECT 515的抑制作用。(G)培养时间17小时的1％和4％未中和的鼠李糖乳杆菌CNCM 1-4036上清液对细菌大肠杆菌ETEC CECT 729的抑制作用。(H)培养时间24小时的1％和4％中和的鼠李糖乳杆菌CNCM I-4036上清液对细菌大肠杆菌ETEC CECT 742的抑制作用。

图14示出了本发明的菌株在(A)生长17小时后和(B)生长24小时后1倍浓缩的上清液获得的病毒Ito、Wa和VA70在HT-29细胞系中的感染中心的缩小。

具体实施方式

本发明提供益生微生物，其具有改善的对pH、胆汁盐的抗性和粘附的益生性质。具体而言，本发明分离和表征了分离自婴儿粪便的细菌鼠李糖乳杆菌HERO 22A(CNCM I-4036)、副干酪乳杆菌HERO 7(CNCM I-4034)和短双歧杆菌HERO 15B(CNCM I-4035)。

已知有大量和极多种微生物定殖于粘膜表面。成人中，存在的真核细胞要远多于原核细胞，事实上，估计90％的人体细胞为微生物细胞，而仅10％相当于原核细胞(Savage，1977年)。该微生物群体对人体生理的影响可能在肠道中更为明显，其原因在于下一事实：该器官含有这些生物体中的绝大多数。近侧小肠和中段小肠中的密度相对较低，但是在远端小肠中存在显著的提高，可以达到10⁸cfu/ml腔容量，并且在结肠中高达10¹¹-10¹²/g。

在生命的最初若干天中，在肠微生物群的组成中存在很大变化。出生时，肠为无菌的，并且在生命的最初若干小时中，细菌开始出现在粪便中。胃肠道首先被母体阴道和粪便细菌丛定殖。定殖在肠道中的微生物为具有该还原能力的那些微生物，包括例如肠细菌、链球菌和葡萄球菌的种类。氧被这些细菌消耗，逐渐改变了肠道环境，从而允许包括乳杆菌和双歧杆菌的厌氧细菌生长。这些定殖于新生儿的细菌主要来自母体和环境，分娩方式是肠道微生物群的主要决定因素之一(Bezirtzoglou，1997年)。

肠道生态系统由微生物群、肠上皮、粘膜免疫系统、和肠神经系统之间的相互作用形成(Gordon等人，1997年)。比较正常大鼠和具有无菌肠的大鼠，已经揭示了一系列的解剖、生化和生理差别。例如，微生物群的存在提高上皮交换，其还从胆酸上结合和移除羟基、代谢胆红素并将胆固醇还原为粪甾醇。

因此，肠和微生物群之间的关系非常密切，并且其可以看作是共生关系，这是因为，例如微生物群可以降解由于缺乏酶促机制而不能被肠降解的碳水化合物。随着产生短链脂肪酸，由该降解产生的产物主要用作肠上皮的营养物。此外，该微生物群的存在具有免疫调节作用，原因在于肠粘膜的主要生理特征为下述能力：针对可定殖于肠上皮的入侵病原开始能量响应、并同时对包含于食物中的细菌或针对定居微生物群具有零响应的能力。此响应缺乏是称为口服耐受的若干机制的活性过程。此过程是必需的，从而使得宿主不对任何微生物的存在出现炎性响应，并因此可以对不同微生物具有不同响应，从而辅助肠菌群的稳定。这是具有正常组成的微生物群可以辅助宿主的生理、免疫和代谢发展的原因。此生态系统保持平衡，并且任何破坏该平衡的原因可能引发病理(腹泻、炎性疾病)。

重要的是理解该生态系统、非病原菌株或“好菌株”的功能的重要性。在此理念上已开发了作为人体健康介质的益生菌的概念。在不同研究领域中，益生菌对不同情况中基因表达的调节的影响是最令人感兴趣的问题之一。

如前所述，本发明从完全以母乳喂养的儿童的粪便中分离了具有改善的益生性质的乳酸细菌和双歧杆菌。为此，评估了所分离细菌的pH抗性、胆汁盐抗性和肠上皮细胞粘附能力。本发明的基本结果指示，在这些婴儿的粪便中，存在对胃pH、胆汁盐具有高度抗性且具有肠上皮细胞粘附能力的细菌，所述细菌可以用作益生菌。

为了检测细菌的益生活性，首先必须将所述细菌进行一系列的体外试验，所述体外试验模拟所述细菌将在生物体内经受的条件，它们必须在所述条件下保持存活，并因此保留它们有益健康的性质。在本发明中，和本发明的细菌进行比较以显示其改善的益生性质而采用的对照细菌(实施例12)为：对于双歧杆菌，为HeroS.A.提供的两歧双歧杆菌(Bifidobacteriumbifidum)和长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)；对于乳杆菌，采用的是2种商业乳杆菌：干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)和鼠李糖乳杆菌GG(LGG)

考虑到构成本发明的细菌在刺激免疫系统和在其对主要消化性病原的作用方面的兴趣问题，出于下述原因选择了这些对照细菌:目前它们在世界范围内以发酵奶和其它剂量形式销售,并且对它们的益生作用方面、特别是预防儿童急性腹泻和调节动物和人的免疫系统方面存在若干公开报道。

因此，所述体外试验涉及：

对胃酸性的抗性：

在到达肠道之前，益生菌必须在它们通过胃的过程中存活(Henriksson等人，1999年)。胃中的胃酸分泌针对通过口服途径进入的绝大多数微生物负载形成第一防御机制。因此，细菌菌株在胃酸中存活是它们通过胃的能力的最准确的指示。科克大学益生菌研究组成功地分离和鉴定了显示出理想的益生特征的乳酸细菌(Dunne等人，1999年)。进行了初步实验以确定分离自人回肠的乳杆菌和双歧杆菌菌株所具有的初始抗性程度。通过胃管抽吸从健康个体获得人的胃液。由于胃中pH上下波动(可达1.5)，在使用之前进行测量。将该酸添加到RSM培养基(Rogosa Sharpe培养基)中。在RSM培养基(De Man等人，1960年)中并使用HCl将pH值改变为2.0至3.4，菌株的初始存活分别测量为乳杆菌108％和双歧杆菌106％。结果显示双歧杆菌对酸性非常敏感(Thornton，1996等)。因此，构成本发明的菌株的抗性值大于所述实验中研究的菌株的抗性值，即它们对酸性具有更大的抗性(图1和4)。

对胆酸盐的抗性

如上文所说明的，为表征益生潜力，必须还能够抗胆汁盐(Lee和Salminen，1995年)。在肝中由胆固醇合成胆酸，并且将胆酸以共轭化合物的形式从胆分泌到十二指肠(500-700mL/天)，这些酸几乎仅在微生物活性的作用下在结肠中经受更多的化学变化(去共轭、脱水、脱氢、以及去葡萄苷酸化)。共轭和去共轭的酸都具有体外抑制大肠杆菌、克雷伯氏菌属、以及肠球菌属菌株的生长的抗细菌活性(Lewis等人，1972年；Stewart等人，1986年)。去共轭形式抑制作用更高，革兰氏阳性菌比革兰氏阴性菌更敏感(Floch等人，1972年；Percy-Robb，1972年)。Dunne研究组(Dunne等人，1999年)在第一次试验中选择使用补充了牛、猪和人的胆酸的固体生长培养基，其中所述胆酸终浓度高达0.3％和7.5％，以评估菌株的胆汁盐抗性。在使乳杆菌和双歧杆菌生长之后，结果为它们表现出对牛胆酸的抗性，并且对于两个细菌组，猪胆酸的结果抑制作用更高(Thornton，1996年)。因此，涉及用于人类食用的可能益生菌的研究，最相关的结果是其在人胆酸中生长的能力。考虑到人胆酸并没有标准化，并且其胆酸含量在个体之间存在很大差别，将其胆酸含量标准化的牛胆酸(OXGALL)用作人胆酸的替代品是本领域现有技术中的普遍做法，这允许实施可重复的试验。这是在本发明中所遵循的方法，以研究构成本发明的细菌的胆汁盐抗性。获得的结果表明所述细菌对胆汁盐的抗性高于其商业对照(图2和5)。

益生菌株的肠上皮粘附

还必须在选择中评估粘附于肠上皮组织的菌株的粘附性以及定殖于胃肠道的能力。此作用的重要性在于下述事实：在选择后，一些益生菌不再能够定殖于它们的靶标宿主。事实上，在目前可得的益生菌中，看起来只有鼠李糖乳杆菌GG保持在胃肠道中较长的时间段(Berg等人，1998年；Goldin等人，1992年)。L rhamnosus GG粘附于属于人肠细胞系的Caco-2细胞、HT-29细胞和Caco-2细胞，这些细胞表现正常人结肠细胞的形态和生理特征，并用于检测调节肠病原粘附的机制(Bernet，1994年)。在近期研究中，它们已用于进行所述选择，并因此评估可能的乳酸细菌或双歧杆菌(基于所述菌的粘附能力)(Coconnier等人，1992年；Bernet等人，1993年；Greene&Klaenhammer，1994年；Crociani等人，1995年；Sarem等人，1996年；Tuomola&Salminen，1998年)。

从采用这些细胞系进行的研究可知，相比充分表征的鼠李糖乳杆菌GG菌株，本发明的乳杆菌菌株的粘附性(对Caco-2为约9％，对HT-29细胞为约5％；Tuomola等人，1998年；Dunne等人，2001年；Botes等人，2008年)非常高，其中鼠李糖乳杆菌CNCM I4036为7.5％，副干酪乳杆菌CNCMI-4034为15.5％(图3)。本领域的现有技术认为相比乳杆菌，双歧杆菌无论其种类，其粘附性都小(Dunne等人，2001年)。然而，HERO公司采用的两歧双歧杆菌和长双歧杆菌(本发明中视为对照)以接近9％的值粘附于HT-29细胞。同样，本发明的目标双歧杆菌以远更高的值16.7％粘附于所述细胞(图6)。

细菌的选择

因此，在本发明中，使用对于双歧杆菌和乳杆菌的特异培养基(实施例4)选择细菌。在分离的过程中，使用了对双歧杆菌描述为特异的3种新的培养基，它们是：BFM培养基(Nebra和Blanch，1999年)、改良哥伦比亚培养基和Beerens培养基(Beerens，1991年；实施例4.1、4.2和4.3)，从而在获得双歧杆菌菌落时获得了更好的结果。为了选择乳杆菌，使用的培养基为Rogosa琼脂培养基(实施例4.4)。

在本发明中，来自不同儿童的细菌菌落为4680个菌落，孵育该细菌菌落并进行选择测试。在对pH 3.0或胆汁盐抗性的第一个试验后，有758个菌落存活性为90％；对肠上皮细胞的粘附测试后，仅有90个菌落(实施例5、6和7)。

根据来源培养基，将这些菌落分成乳杆菌和双歧杆菌。通过扩增每个菌落的16S rRNA基因以进行后续测序及其在NCBI(BLAST)数据库中的同源性检索的方式，直接进行它们的分子鉴定(实施例10)。

最后，从Beerens培养基分离了29个细菌菌株，从Rogosa培养基分离了13个细菌菌株，并从改良哥伦比亚培养基分离了10个细菌菌株，所述菌株成功通过选择。鉴于所选的菌落的数量，如已经说明的，通过扩增每个菌落的16S rRNA基因以进行后续测序及在NCBI(BLAST)数据库中的同源性检索的方式，直接进行它们的分子鉴定。

对分类为乳杆菌的菌株进行测序，并且这些序列彼此进行比对，以了解菌株是否具有相同的16s rDNA基因，并且发现41株细菌可以被分成2个组：

对16s rDNA基因的1474bp片段具有99％同源性的组为：

鼠李糖乳杆菌菌株R-11

鼠李糖乳杆菌菌株La

鼠李糖乳杆菌，菌株：MNFLM01

鼠李糖乳杆菌菌株IDCC 3201

鼠李糖乳杆菌菌株：YIT 0105(＝ATCC 7469)

鼠李糖乳杆菌菌株Lcr3516S

根据这些结果，从该组中选择具有最佳抗性测试值的细菌(实施例7和9)，并称为鼠李糖乳杆菌HERO 22A，(该菌之后被巴斯德研究所[CNCMNational Collection of Microorganism Culture PASTEUR INSTITUTE 25,Ruédu Docteur Roux F-75724Paris]编号为鼠李糖乳杆菌CNCM 1-4036，其于2008年7月2日保藏于该处)。

对16s rDNA基因的1276bp片段具有100％同源性的另一组为：

副干酪乳杆菌，菌株：T11-9

副干酪乳杆菌，菌株：T7-10

干酪乳杆菌菌株KLDS 1.0720

干酪乳杆菌菌株L5

干酪乳杆菌，菌株：YIT 0209(＝NCDO 151)

干酪乳杆菌，菌株：YIT 0180(＝ATCC 334)

副干酪乳杆菌菌株IMPC 2.1

副干酪乳杆菌，菌株：NRIC 1944

副干酪乳杆菌，菌株：NRIC 1942

副干酪乳杆菌，菌株：NRIC 1938

副干酪乳杆菌，菌株：NRIC 1934

副干酪乳杆菌，菌株：NRIC 0638

干酪乳杆菌ATCC 334

副干酪乳杆菌菌株DJ1

干酪乳杆菌菌株Ru2-2i

副干酪乳杆菌分离株3C

副干酪乳杆菌分离株2C

副干酪乳杆菌

干酪乳杆菌菌株MCRF-284

乳杆菌L02

副干酪乳杆菌

副干酪乳杆菌，菌株SM20

干酪乳杆菌菌株BL23

副干酪乳杆菌副干酪亚种

干酪乳杆菌

副干酪乳杆菌Tolerans亚种

根据这些结果，从该第二组中选择具有最佳抗性测试值的细菌(实施例7和9)，并最初称为副干酪乳杆菌HERO 7，(该菌之后被巴斯德研究所[CNCM National Collection of Microorganism Culture PASTEUR INSTITUTE25,Rué du Docteur Roux F-75724Paris]编号为副干酪乳杆菌CNCM 1-4034，其于2008年7月2日保藏于该处)。

之后，对双歧杆菌的组进行相同处理，仅发现一组和下述菌株对16srDNA基因的1136bp片段具有100％同源性：

未培养的细菌克隆rRNA235

短双歧杆菌，菌株：ATCC 15700

根据这些结果，选择双歧杆菌组中具有最佳抗性结果(pH 2.5下139.6％)的细菌(实施例7和9)，并最初称为短双歧杆菌HERO 15B，(该菌之后被巴斯德研究所[CNCM National Collection of Microorganism Culture PASTEURINSTITUTE 25,Rué du Docteur Roux F-75724Paris]重新命名为短双歧杆菌CNCM I-4035，其于2008年7月2日保藏于该处)。

因此，这些菌株分类为：

鼠李糖乳杆菌HERO 22A

副干酪乳杆菌HERO 7

短双歧杆菌HERO 15B。

并且送至巴斯德研究所进行保存，在该处将这些菌株认可为独特的菌株并且给予下述最终命名：

对pH、胆汁盐的抗性和细胞粘附结果

如上文所指示，为了使益生菌株对肠道发挥有益作用，它们必须在通过胃时存活，从而抵抗其酸性(pH 2.5-3.5)(Holzapfel等人，1998年)，并且另一方面，它们必须对存在于小肠的胆汁盐具有抗性，以到达结肠(Otles等人，2003年)。

在本研究中，在pH 3.0下孵育细菌3小时，尽管已有描述90分钟即足以重现进入胃和离开胃之间的这段时间(Jin等人，1998年)。在此情况中，分离的菌株和对照表现出接近100％的活性(实施例12/图1和4)，但是暴露于pH 2.5表明，这是非常有选择性的，因为没有对照表现出活性，并且仅鼠李糖乳杆菌22A(CNCM I-4036)菌株具有活性。换而言之，本发明的菌株鼠李糖乳杆菌22A比对照细菌具有显著更高的抗酸性，因此，帮助其通过胃肠道以及之后的定殖。另一方面，在pH 3.0下，本发明的菌株鼠李糖乳杆菌7A比用作对照的菌株表现出更高的活性(实施例12，图1、4)，这表示更多地进入小肠。

pH 3.0下2小时和在每升含有500-1000mg(0.05-0.1％)胆酸的培养基中的益生培养物的活性，被认为是对酸和胆汁盐耐受的标准测试(Snelling，2005年)，尽管0.3％胆汁盐的浓度即适合用于选择益生菌。在本发明的目标细菌的所有情况中，不同浓度(0.3％和0.7％)下进行的胆汁盐测试提供了大于100％的值，并且大于用作对照的商业细菌(实施例12，图2和5)。综上所述，本发明的乳杆菌菌株相比目前用作益生菌的其它细菌而言，对pH和胆汁盐具有更大的抗性。

已经描述了通常乳杆菌对胃肠道条件具有更大的抗性，特别是就酸性和胆汁盐而言(Ross等人，2005年)。发现的结果和此描述是一致的，因为乳杆菌对胃肠道条件的抗性值要稍高于双歧杆菌。

如上文所述，益生菌进入肠道微生物群的另一个非常重要的方面是在肠上皮细胞上的粘附能力，原因在于，所述细胞防止益生菌株由于蠕动和形成肠道微生物群的其他细菌而被消除。此外，粘附是定殖的第一步，其可能是肠道病原的竞争性排除(Forestier等人，2001年；Lee等人，2003年)和宿主免疫调节(Ouwehand等人，1999年；Plant和Conway，2002年)的先决条件。

在本发明中，使用HT-29细胞作为肠上皮的体外模型研究了不同菌株的粘附性质(实施例12，图3和6)。粘附情况显示对每种菌株来说是特异的，因为它们即使来自相同的种也具有非常不同的值。通过比较所述的不同益生菌的粘附能力可以对此进行理解，例如干酪乳杆菌具有14.4％的粘附，而干酪乳杆菌具有2.6％的粘附(Morata De Ambrosini等人，1999年)。如所指示的，本发明的乳杆菌菌株的粘附要比例如鼠李糖乳杆菌GG(在HT-29细胞上约5％，Dunne等人，2001年)的其它菌株高得多(鼠李糖乳杆菌CNCM I4036为7.5％，副干酪乳杆菌CNCM I-4034为15.5％)(表3)。同样，作为本发明的目标之一的双歧杆菌短双歧杆菌CNCMI-4035也以远高于16.7％的值粘附于所述细胞(图5)，相比之下，用作对照的细菌为9％。

这些数据证实了本发明的结果，显示存在于不同益生菌株中的可变性。在此特异情况中，乳杆菌对照表现的粘附(4％)对应于双歧杆菌对照表现的粘附(8％)的一半，然而本发明中分离的菌株比它们的对照表现出更高的粘附，原因在于当比对了不同组的16s rRNA时，选择了具有上皮粘附最佳值的菌株。

因此，在乳杆菌的情况中，选择下述菌株：相比其对照的4.80和4.09％，所述菌株表现出约7.48和11.55％的粘附(图3)；而在双歧杆菌的情况中，选择下述菌株：相比其对照的8.8和9.1％，所述菌株表现出16.7％的粘附(图6)。换而言之，构成本发明的不同目的的细菌具有更高的定殖和保留于肠道中的能力，并且因此具有更高的益生作用。

分离细菌的表征结果

16s RNA研究

针对肠道整个细菌群体的鉴定、组成和计数已经出现不同的分子技术，其中多数基于16s核糖体RNA基因(rRNA)的研究，这是因为在过去十年中，16s rRNA基因已经变革了分类学者对细菌进行分类和鉴定的方式。16srRNA基因包括从高度可变至高度保守的区域，并且序列的差异用于确定系统发育关系以及在种和株之间区分细菌。存在的可用数据库具有超过200,000个16s rRNA基因，例如NCBI/BLAST(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)、核糖体数据库project-RPD(http://rpd.cme.msu.edu/htlm)和EMBL(http://www.embl-heidelberg.de/)，这些数据库比较现有16s rRNA基因序列和获得的新序列。如实施例2所示，本发明中分离的细菌与鼠李糖乳杆菌、副干酪乳杆菌和短双歧杆菌具有高度同源性，这和下述背景文献一致：在以母乳喂养的儿童中，在粪便中存在大量的双歧杆菌，约占总微生物群的40-60％，而其中发现短双歧杆菌为相当大的百分比(Harmsen等人，2000年)。此外还存在高百分比的乳杆菌，主要是干酪乳杆菌、副干酪乳杆菌、嗜酸乳杆菌等(Heiling等人，2002年；Satokari等人，2002年)。

根据NCBI/BLAST数据库，分离菌株的16s rRNA基因的同源性百分比非常高(99-100％)(实施例2)。16s rRNA基因片段为约1.4kb，并且第二片段范围为：对于鼠李糖乳杆菌22A HERO(CNCM I-4036)，为1474bp；对于(CNCM I-4034)7HERO，为1274bp；并且对于短双歧杆菌15B HERO(CNCM I-4035)为1118bp。精确来说，后者与短双歧杆菌ATCC 15700和双歧杆菌的不可培养克隆具有100％的同源性，因此扩增16s rRNA基因的经测序片段将是重要的，但是在此情况中可以获得更大的片段，因为寡核苷酸27F(SEQ.ID.NO 1)和1492R(SEQ.ID.NO 2)(扩增约1400bp的片段)无法扩增短双歧杆菌15B HERO菌株(CNCM I-4035)的16s rRNA基因。因此，采用其它扩增较小片段的通用寡核苷酸，例如39F(SEQ.ID.NO 3)和1391R(SEQ.ID.NO 4)。

分离的乳杆菌菌株的16s rRNA基因经测序的片段显示与鼠李糖乳杆菌组具有99％的同源性，而其它菌株与多个副干酪乳杆菌和少量干酪乳杆菌具有100％的同源性。将对照、鼠李糖乳杆菌HERO 22A(CNCM I-4036)和副干酪乳杆菌7HERO(CNCM I-4034)菌株的16s rRNA片段与副干酪乳杆菌(其与分离的菌株具有高度同源性)的片段进行了比对。由此可以看到，在对照菌株、鼠李糖乳杆菌HERO 22A(CNCM I-4036)和副干酪乳杆菌7HERO(CNCM I-4034)之间存在4个碱基的差异。在LGG和干酪乳杆菌对照之间也存在4个碱基的差异。鼠李糖乳杆菌22A HERO菌株(CNCM I-4036)和2个对照都具有1个碱基的差异，和LGG对照有1个碱基的差异，并且和干酪乳杆菌有3个碱基的差异。在此情况中，在比对的菌株之间存在较少差异，这表明在这些菌株中，16s rRNA基因相当保守。

为了扩大所研究的细菌菌株的基因组信息，扩增了16s和23s基因之间的基因间间隔，该间隔已知具有大的可变性(Barry等人1991年&Navarro等人，1992年)，其还用于区分原核生物的物种(Barry等人，1991年)。在分离的菌株中，基因间间隔片段的长度范围为：鼠李糖乳杆菌22A HERO(CNCM I-4036)579bp、副干酪乳杆菌7HERO(CNCM I-4034)512bp和短双歧杆菌15B HERO(CNCM I-4035)182bp。将16s-23s基因间片段与NCBI/BLAST数据库中的那些进行比较，结果显示鼠李糖乳杆菌22A HERO菌株(CNCM I-4036)与分离的鼠李糖乳杆菌TS1和鼠李糖乳杆菌PS1 16S具有100％的同源性。当比较所示的16s rRNA同源性结果时，结果则完全不同，因此可能菌株不在该数据库中，或者NCBI/BLAST数据库关于16s rRNA具有更多的信息，而关于16s-23s基因间间隔则不是这样。这些结果表明，本发明的目标分离菌株是独特的，这已通过巴斯德研究所特别将其命名为鼠李糖乳杆菌CNCM I-4036而得到证实。

在副干酪乳杆菌7HERO菌株(CNCM I-4034)的情况中，16s-23s基因间间隔的结果显示出干酪乳杆菌ATCC 334的100％的同源性。NCBI/BLAST数据库含有完整的基因组，并且其在显示16s rRNA的100％同源性的副干酪乳杆菌列表上，因此很可能分离的菌株是干酪乳杆菌ATCC 334；在对基因组的其它片段(例如23s或5s基因或其它)进行测序的任何情况中，可以同意或反对其完全对应于该菌株的这一看法。就此，在进行恰当的分析之后，巴斯德研究所认可该菌株是独特的。

对于双歧杆菌菌株的情况，该片段相当短，因此扩增了对照的基因间间隔，对于长双歧杆菌提供了165bp，对于两歧双歧杆菌提供了298bp，这证实了在该片段的大小方面存在很大的差异。将对照菌株、分离的菌株、短双歧杆菌15B HERO(CNCM I-4035)与和本发明的菌株具有99％同源性(NCBI/BLAST)的菌株进行了比对，观察到在对照和短双歧杆菌菌株之间具有大的差异；然而，在本发明的菌株和具有99％同源性的菌株(短双歧杆菌16S-23S内转录间隔区(ITS)，菌株Y8)之间仅存在1个碱基的差异。该菌株与具有16s rRNA的100％同源性的菌株完全不同，因此其可能是未进入该数据库的菌株。

所有这些结果都证实了本发明中分离的3个菌株是新的，因为它们尚未描述于本领域现有技术中。

表型鉴定

如实施例11所示，本发明采用碳水化合物发酵试剂盒(API 50CH)(图8)和酶活性试剂盒(API Zym)(图9)来分析所分离种的生化能力。它们构成了用于表型鉴定纯生物培养物的快速和理论上可重复的方法。这些测试已用于表征和鉴别奶(Medina等人，2001年)、酸奶和其它发酵奶制品(Andrighetto等人，1998年)、以及奶酪(Andrighetto等人，1998年；Bouton等人，1998年；和De Angelis等人，2001年)中的乳杆菌。然而，这些测试的可靠性已受到质疑，特别是对于API 50CH，因此其最初开发用于鉴别临床用途的乳杆菌菌株，并且制造商的数据库未针对一些乳杆菌种进行更新，因此具有鉴别的不确定结果(Andrighetto等人，1998年；和Collins等人，1993年)；然而，提供的信息仍对于在表型上表征分离的菌株是有价值的。

如图8所观察到的，分离的菌株以及对照表现出用作胰蛋白酶和α-糜蛋白酶的低蛋白水解活性，但是它们表现亮氨酸的不同活性；对于缬氨酸，在双歧杆菌中它们表现极低活性，而在乳杆菌中表现极高活性。

双歧杆菌对于α和β-半乳糖苷酶和α-糖苷酶也具有高活性。如Desjardins等人(1990年)所述，α-半乳糖苷酶和α-糖苷酶活性可以将双歧杆菌与其它乳酸细菌相区分。

观察到在双歧杆菌和分离的鼠李糖乳杆菌22A HERO菌株(CNCMI-4036)中，存在高α-半乳糖苷酶活性。换而言之，这是重要的活性，因为特定的糖(例如α-D-半乳糖基-寡糖)的水解使得双歧杆菌可以在肠道中选择性繁殖(Gopal等人，2001年；Gulewicz等人，2002年)，原因在于双歧杆菌可以利用半乳寡聚糖。评估双歧杆菌表型特征使得确认之前通过基因手段对它们的分类，并且确定它们的酶作用允许使用数种碳氢化合物底物，优选具有α键以产生乳酸的葡萄糖聚合物。

已经描述了其它来源和属的很少菌株包括乳杆菌具有β-葡糖苷酸酶能力(Gopa等人，2001年；Hopkins等人，1998年)。因此本发明的乳杆菌和双歧杆菌菌株以及它们的对照并不具有β-葡糖苷酸酶活性水平，认为这一点是有利的特征。缺乏β-葡糖苷酸酶活性是所有被认为是良好益生菌所必需具有的特征，因为这种酶由微生物来源的使原致癌物转化成致癌物的粪酶(硝基还原酶、偶氮还原酶)产生(Kurman，1988年)。Nanno等人(1986年)证实具有阳性β-葡糖苷酸酶细菌的提取物提高苯并芘的胆汁代谢物的突变活化，而具有阴性β-葡糖苷酸酶的提取物不具有此活性。简而言之，可以认为由于这些细菌对其它碳源例如甘露糖、海藻糖和葡糖苷酸具有低活性，它们优选乳糖和葡萄糖作为代谢碳源，尽管分离的鼠李糖乳杆菌22A HERO菌株(CNCM I-4036)具有α-海藻糖的酶活性，这对于发酵岩藻糖基-乳糖衍生物例如存在于母乳中的那些具有有利的作用，从而对双歧杆菌生长具有已知的有利效果。这一性质意味着本发明的益生菌在幼儿膳食中具有非常特殊的应用，但是它们也可以应用于成人膳食和特殊膳食中。

应该注意的另一方面是API 50CH的结果(图9B)，其中副干酪乳杆菌7HERO菌株(CNCM I-4034)发酵菊粉，这是其对照不具备的能力。发酵菊粉的能力并非是乳杆菌的普遍性质(Cebeci和Gurakan，2003年；Makras等人，2005年0)。这表明本发明的菌株具有发酵果寡糖(FOS)的能力，果寡糖广泛用作幼儿膳食中的益生元，从而促进乳杆菌和双歧杆菌主导的肠道微生物群的发展。本发明的细菌的这一特征强调了下述事实：本发明的益生菌在幼儿膳食中具有非常特殊的应用，但是它们也可以应用于成人膳食和特殊膳食中。已经证实了菊粉和FOS提高结肠中双歧杆菌的数量的能力(Roberfroid等人，1998年；Van Loo等人，1999年)。

益生活性

在满足上述涉及对pH的抗性、对胆汁盐的抗性、对肠上皮细胞的粘附和测序16S的要求之后，已获得了分离并确定的益生微生物。下一步骤包括表征其益生性质，具体而言，必需表征鼠李糖乳杆菌HERO 22A(CNCMI-4036)和/或副干酪乳杆菌HERO 7(CNCM 1-4034)和/或短双歧杆菌HERO15B(CNCM I-4035)的益生性质。

考虑到本发明的细菌满足涉及对pH、胆汁盐的抗性和粘附的要求，所述菌株可以应用于其中本领域现有技术已知使用益生菌的不同领域，例如应用于治疗和预防不同病理学例如乳糖消化不良、降低胆固醇血浆水平、不同类型的腹泻、炎性肠病、癌症、由病原细菌引起的障碍等。因此，所述益生菌将应用于不同领域，如对主要消化性病原的作用和刺激免疫系统等。

病源微生物

在对益生菌进行的不同类型的研究中，涉及胃肠系统的病源微生物的那些研究受到特别关注。在选择病原细菌时，必需要考虑它们彼此之间不同的致病性的机制。目标细菌是肠毒性大肠杆菌，因为其肠毒素的产生是人腹泻的重要原因。近期研究已经描述了某些乳酸细菌具有针对肠毒性大肠杆菌(Gopal等人，2001年；Todoriki等人，2001年；Chu等人，2005年；Tsai等人，2007年)和针对其它病原细菌例如鼠伤寒沙门氏菌和福氏志贺氏菌(Shigella flexneri)(Tien等人，2006年；Jankowska等人，2008年)的拮抗作用。

益生菌株另一个感兴趣的方面是可以产生称为细菌素的物质，该物质由一些细菌分泌，从而与在相同生态位生长的其它微生物竞争。这些物质可以抑制病原细菌在肠上皮细胞上的生长或粘附，其可以由一些乳酸细菌产生(Klaenhamer，1993年；Jack等人，1995年；Sablon等人，2000年)。

一个重要的方面是了解益生细菌或病原细菌与肠上皮细胞的相互作用，因为存在于人体微生物群中的所有细菌都直接与所述细胞相互作用。

已经描述了肠上皮细胞中病原细菌的存在刺激促炎性响应谱(Th1)、释放细胞因子例如TNF-α和IL-8、活化NF-κB(Tien等人，2006年；O'Hara等人，2006年)以及提高其表达。在多数情况中，该响应在益生细菌的存在下被部分降低，这指示了益生作用(Servin，2004年)。

因此，一些益生菌能够调节DC的性质，包括它们活化特异免疫响应的能力(Kelsall等人，2002年)。与肠道中的益生细菌接触后的刺激和耐受平衡对于维持其动态平衡和能够实施它们针对宿主消化系统中病原细菌的有益保护功能而言是重要的。

本发明的益生菌株显示对肠道病原微生物的生长具有抑制作用，所述病原微生物例如病原细菌，例如幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori)、单核细胞增生李斯特菌、宋内氏志贺氏菌、肠毒性大肠杆菌、肠沙门氏菌(Salmonella)、以及肠病毒例如轮状病毒。

乳糖吸收不良

哺乳动物出生时具有足够的乳糖酶活性，从而从母乳中利用乳糖。断奶后，该活性随着年龄而逐步降低，并且摄入含有乳糖的食物造成与乳糖耐受有关的指征和症状(异常胀气、腹部疼痛、腹泻等)。已知利用释放乳糖酶的益生菌有利于在肠管中消化乳糖，从而减轻乳糖不耐的症状。

胆固醇水平的下降

高水平的血脂，例如胆固醇和甘油三酯，由于其与心脏疾病有关而意味着人体健康的高风险。由于食用低脂肪含量或具有参与脂质代谢的微生物的食品对预防这些病症非常有益，因此已经表征了调节血清脂质的乳杆菌菌株。该益生作用与胆汁盐的水解密切相关。

因此已在动物(Akalin等人，1997；Fukushina和Nakano，1996年)和人类(Lin等人，1989年)中观察到施用益生菌可以降低血清胆固醇浓度。

腹泻

事实上，益生菌最为广泛记载的临床应用是治疗急性腹泻。临床试验已显示使用益生菌在用于预防和/治疗数种肠道障碍中的治疗剂中的功效，所述肠道障碍包括抗生素导致的腹泻(McFarland等人，1995年)、成人腹泻(等人，1990年)、儿童腹泻(Cetina-Sauri和Sierra，1994年)和游客腹泻(Kollaritsch等人，1993年)。

在这些情况中，用作生物治疗剂的益生菌影响大量酶和蛋白质的表达和活性，从而调节肠上皮并可以调节微生物群。

涉及抗生素有关的腹泻，当开具抗生素处方时采用益生菌可以降低腹泻的发作和/或缩短其持续时间。采用最广泛的微生物是：屎肠球菌(Enterococcus faecium)SF6(Wunderlich等人，1989年)、乳杆菌GG(Siitonen等人，1990年；Vanderhoof等人，1999年)、嗜酸乳杆菌、保加利亚乳杆菌(L.bulgaricus)、和布拉酵母菌(Saccharomyces Boulardii)。这些试剂促进降低肠道中微生物群的改变、粪便硬度改变和后者的频率。

由艰难梭状芽胞杆菌(Clostridium difficile，为机会性病原，其利用采用抗生素导致的肠道微生物群的改变)导致的腹泻具有广泛的临床症状，范围从温和的良性腹泻至发展出毒性巨结肠症的严重的结肠炎、腹内和全身并发症，可能导致患者死亡。腹泻通常发生于抗生素治疗开始后的数周。致病性顺序由抗生素(如果人暴露于摄取该药剂)诱导的肠道细菌微生物群的改变开始，这使得艰难梭状芽胞杆菌定殖。之后，该细菌释放导致组织损伤的毒素。艰难梭状芽胞杆菌的病原株产生称为A和B的毒素。布拉酵母菌通过释放切除这些毒素及其膜受体的54kDa蛋白酶而抑制毒素A和B(Castagliuolo等人，1999年)。

已显示口服鼠李糖乳杆菌GG和布拉酵母菌有效恢复患者的正常微生物群。

游客腹泻是由于细菌、病毒或寄生虫感染。存在导致游客腹泻的多种微生物，它们在国家之间可能不同。从频率上看，它们包括大肠杆菌、志贺氏菌属(Shigela)、沙门氏菌属(Salmonella)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、轮状病毒和蓝氏贾第鞭毛虫(Giardia lamblia)。游客腹泻影响半数进入高危地区的游客。在不同研究中用作益生菌的细菌为：乳杆菌、双歧杆菌、链球菌和肠球菌。乳杆菌GG是针对游客腹泻的最有效的益生菌。

炎性肠病

益生菌的主要用途之一涉及微生物群和免疫系统的失衡。据此方面，炎性肠病的研究是关于益生菌作为临床疗法的可能用途的最令人感兴趣的焦点。此领域内进行的研究已就临床使用益生菌和这些疾病中涉及的不同中间体的基因表达提供了重要信息。

炎性肠病(IBD)是来源未知的肠道慢性炎性障碍(溃疡性结肠炎、克罗恩病)，发病机理复杂，并涉及至少3个重要因素：基因易感性因素、肠道微生物丛和免疫介导受损。已经提出下述假说：IBD由于T细胞针对微生物群的异常响应而发生，还已推测病原生物体的存在可能导致这些疾病。

在具有IBD的患者的结肠活检样本中存在降低量的乳杆菌和双歧杆菌(Fabia等人，1993年；Favier等人，1997年)。IBD的常规治疗集中于抑制或调节宿主的免疫，并且在这些治疗中，使用益生菌是克罗恩病的有效治疗方法。这指示使用益生菌来调节微生物丛可能在治疗IBD中是重要的。

背景技术中的近期研究已经发现，具有克罗恩病的患者在疾病活性时间期间的粪便中具有降低量的β-半乳糖苷酶。这一降低与双歧杆菌的减少有关，所述双歧杆菌是β-半乳糖苷酶的来源(Favier等人，1997年)。

癌症

结肠直肠癌症是包括溃疡性结肠炎和克罗恩病的IBD的最严重的并发症之一(Eaden等人，2001年)。IBD可以产生致癌过程的最准确机制尚未得到明确的了解。推测其可能是慢性炎性过程的成因(Weitzman&Gordon，1990年)，其在一些实验模型中可以起到肿瘤促进剂的作用。

肠道微生物群和免疫系统在调节致癌作用中起重要作用。益生菌对这两者都可以具有作用，因此在此领域中已进行了对抗结肠癌的很大努力。已发现益生菌可以降低可以涉及于结肠致癌过程中的酶、诱变物、次级胆酸的浓度(Wollowski等人，2001年)。流行病学数据证实每日食用发酵制品具有抗结肠腺瘤或结肠癌的保护作用(Rafter和Glinghammar，1995年)。

作为益生菌和益生元的混合物的共生组合已用于研究癌症的预防。此组合提高短链脂肪酸的水平，短链脂肪酸是细菌发酵的主要产物，其主要作用为作为肠上皮的营养物来源。它们与分化诱导、增殖抑制和体外细胞凋亡的提高有关(Heerdt等人，1997年；Medina等人，1997年)，并且它们可以在预防一些疾病例如胃肠道障碍和癌症中起作用(Julia等人，2006年)。

本发明不仅证实了所选择的菌株抑制病原细菌和肠道病毒的生长的能力，而且比较本领域现有技术抑制的对照益生菌株，证实了定义微生物益生性质的卓越特征，例如对pH、胆汁盐的抗性和对肠的粘附。

结果已表明在所有情况中，本发明的细菌的益生性质要优于所述对照菌株。因此已知用作对照的细菌的活性集中于下述领域：

Danone的免疫干酪乳杆菌

与含有免疫干酪乳杆菌的益生组合物有关的有益作用对不同感染原具有最佳免疫响应，从而提高免疫系统活化细胞因子的水平、改善T细胞的增殖性响应和调节NK细胞的表达。已观察到饮用改善与感染有关的幼儿腹泻的预后，从而降低其严重性并缩短其持续时间。

因而含有免疫干酪乳杆菌的组合物对人结肠粘膜具有阳性的抗炎作用，因为它们提高宿主的免疫响应，这对具有炎性肠病的个体和对于预防结肠癌是有益的。

前述和进行的不同比较实验已显示副干酪乳杆菌HERO 7(CNCMI-4034)相比免疫干酪乳杆菌具有更好的益生性质，鉴于此，副干酪乳杆菌HERO 7(CNCM I-4034)作为人结肠粘膜的抗炎剂，在下述方面具有良好的应用：例如预防不同病理学，所述病理学例如乳糖吸收不良、胆固醇血浆水平降低、不同类型的腹泻、炎性肠病、癌症等；改善针对不同感染原的免疫响应；改善幼儿腹泻(以及相应地预防结肠癌)。

LGG

乳杆菌GG粘附于肠细胞，刺激免疫响应并预防病原性腹泻。不同研究已证实食用含有LGG的组合物，例如的Bioactif，抑制病源微生物在肠道的竞争性定殖。这些微生物又产生抑制病原菌株生长的抗微生物化合物，随后抑制病原菌株的生长。因此，食用具有LGG的组合物维持或恢复肠道微生物丛平衡，从而优化肠粘膜功能的吸收过程。

前述和进行的不同比较实验已证实鼠李糖乳杆菌HERO 22A(CNCMI-4036)相比乳杆菌GG具有更好的益生性质，鉴于此，鼠李糖乳杆菌HERO22A(CNCM I-4036)在下述方面具有良好的应用：例如刺激免疫响应和预防病原性腹泻以及维持或恢复肠道微生物丛平衡。

长双歧杆菌和两歧双歧杆菌

本领域现有技术已知长双歧杆菌对抗生素具有抗性，因此用抗生素进行治疗的个体定期食用长双歧杆菌会预防在患者中偶然导致的腹泻。这些微生物的其它应用目的在于降低胆固醇，减轻乳糖不耐的症状，刺激免疫系统和预防癌症。

食用具有两歧双歧杆菌的组合物缓解与腹泻有关的症状。因此，它们是通过提高外周血中噬菌细胞活性而提高个体免疫响应的微生物。

前述和进行的不同比较实验已证实短双歧杆菌HERO 15B(CNCMI-4035)相比长双歧杆菌和两歧双歧杆菌具有更好的益生性质，鉴于此，短双歧杆菌HERO 15B(CNCM I-4035)在下述方面具有良好的应用：例如刺激免疫响应和预防由抗生素引起的腹泻，降低胆固醇，改善乳糖不耐的症状，预防癌症等。

食品、饮料、药物等中的益生菌

将活微生物掺入食品中是一项长期的实践。酸奶和其它发酵奶是传统上包含有活微生物的食品。近年来功能性食品的开发已经带来了基于使用能够对生物体产生有益作用的微生物的新应用的发展。

在功能性食品领域中，幼儿膳食领域也不例外，并且近年来此类型的成分已经开始包含于不同类型的幼儿食品中。益生菌是主要发展方面之一，多数应用于配方奶的领域，主要为持续和生长配方。将益生菌掺入食品中的目的是它们植入宿主的结肠中，并且获得一系列的有益作用(降低病原菌丛、产生维生素和其它营养物质、降低培养介质的pH等)。

本发明的益生细菌已全部被认可为乳酸细菌群中的种，并且它们已经在世界范围内已知为零病原性。因此，可以接受它们以分离方式或者与其它乳酸细菌组合的方式用于发酵奶制品等，所述其它乳酸细菌例如嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、乳链球菌(Streptococcus lactis)等。类似地，它们在幼儿奶中的应用和任何其它乳酸细菌一样，不涉及任何潜在的食品安全问题。

将这些益生菌掺入食物和饮料中必需确保在产品最长保质期后通过使用合适的混合(或者适当时的发酵)方法在最终产品中有特定数量的活细菌。

本发明的益生菌可以应用于幼儿膳食以及成人膳食和特殊膳食中。所述益生菌可以单独以粉末形式或与其他本领域现有技术已知的赋形剂一起混合使用，所述赋形剂例如糖、蛋白质、奶粉等，或者作为优选发酵基于奶的制品中的活性成分。因此，所述益生菌可以以粉末或液体形式掺入到食品中，所述食品被一般人群使用，特别是奶或奶衍生的产品，尤其是发酵奶和奶酪；谷类食物和衍生物，包括面包团；脱水形式的汤和其它类似产品；发酵肉制品；水果衍生物、果汁和软饮料；用于特殊营养用途的食品，包括幼儿奶、幼儿谷类食物、即食型幼儿食品等。它们还可以见于食品补充剂和用于临床应用的口服和肠道营养的特殊配方。

如果其为粉末产品(幼儿奶、谷类食物等)，通过将它们干燥混合到最终产品中而将益生菌掺入。因此，本发明的益生菌可以掺入到用于以水或另一液体如奶复原的食品粉末中(幼儿奶粉、谷类食物等)。

在它们用于发酵奶或奶制品以及制备酸化奶的用途中，在以可控温度和时间而产生发酵的工艺的中间步骤向液体奶中加入益生菌，从而获得酸化奶。

本发明的益生菌还可以应用于食品补充剂和甚至在药品中，其可以以粉末制剂、片剂、糖涂覆的片剂等形式提供。这些产品具有治疗炎性肠病、胃溃疡、急性腹泻和胃肠道其它疾病的领域用途。

实施例

实施例1.扩增16S-23S基因间片段

扩增了所选菌株的基因间片段、进行测序并在NCBI(BLAST)数据库中进行了同源性检索，得到下述结果：

·鼠李糖乳杆菌22A(CNCM I-4036)和下述菌株具有579bp片段的100％同源性：

-鼠李糖乳杆菌分离株TS1

-鼠李糖乳杆菌分离株PS116S

·副干酪乳杆菌7(CNCM I-4034)和下述菌株具有512bp片段的100％同源性：

-干酪乳杆菌ATCC 334

·短双歧杆菌15B(CNCM I-4035)和下述菌株具有182bp片段16s-23s基因间间隔的99％同源性：

-短双歧杆菌(ITS)，菌株Y8

-长双歧杆菌(ITS)，菌株Y10

实施例2.比对经测序的区段

采用Clustalw程序在线工具(http://www.ebi.ac.uk/clustalw/)比对所选菌株和对照的经测序的区段。

菌株和对照的rDNA 16S基因序列的整体比对显示在对照与样品鼠李糖乳杆菌22A和副干酪乳杆菌7之间存在差异，而在样品7和副干酪乳杆菌的所选序列之间观察到完全的同源性。

涉及所选样品短双歧杆菌15B，观察到对照和样品短双歧杆菌15B序列之间有差异，在短双歧杆菌15B和短双歧杆菌的所选序列之间观察到100％同源性。

菌株15B和对照的基因间间隔16S-23S的序列的完全比对使得在对照和样品短双歧杆菌15B的序列之间观察到大的差异。

事实上，16S-23S基因间间隔的测序是独特的，并且不与针对双歧杆菌之前所述的任何情况相符，这指示本发明的菌株是独特的，巴斯德研究所通过给其同样独特的命名而认可了这一点。

实施例3获取和处理样品

样品的获取。

在本专利发明人儿科医生JM的诊所，在厌氧条件下获取2至4个月大的完全以母乳喂养的儿童的粪便。首先要求父母在早上将其儿童带到诊所，期望儿童在刺激后进行肠道运动，并在肠道运动后通过连接于无菌容器的盖的塑料匙将粪便收集于无菌容器中。一旦完成收集，将具有样品的容器放于厌氧罐(Oxoid,Hampshire,United Kingdom)中，所述厌氧罐连接有生成厌氧气氛的囊(Oxoid,Hampshire,UnitedKingdom)，并且将罐不透气地密封并在不超过2小时的时间内运到处理样品的实验室。

处理和接种样品

要进行分析的样品可以一经收集立刻处理，或者处理后在正确标记的Eppendorf管中冷却于-80℃。

因此，制备粪便在PBS(磷酸盐盐水缓冲液(PBS,Sigma-Aldrich,Madrid,Spain))中的10％悬浮液和L-半胱氨酸盐酸盐(Scharlau CEIME,Barcelona,Spain)(0.05％)。由此制剂制备10¹至10⁷的7个稀释液，最后将每个稀释液的50μl接种于2个所选的培养基中，并在37℃下在用于培养双歧杆菌的厌氧生活条件和用于培养乳杆菌的CO₂丰富培养基(CO₂Gen)中孵育72小时。

实施例4.制备培养基

然后指出用于双歧杆菌的3种特异培养基和专门用于乳杆菌的培养基：

1.Beerens培养基{Beerens，1990年)：此培养基用于确定双歧杆菌。

对于其制备，在1升Erlenmeyer烧瓶中，混合47g脑心浸液琼脂、5gD-(+)葡萄糖、0.5g柠檬酸铁III、0.5g L-半胱氨酸和1升蒸馏水。在加热搅拌板上恒速搅拌并加热该混合物若干分钟直到其沸腾，然后将其在室温下冷却。一旦达到55℃，向其中加入5ml丙酸和2.2ml 2Eq/L氢氧化钠，然后调整pH至5.0。

2.BFM培养基(Nebra&Blanch，1999年)：此培养基专门用于双歧杆菌。所述培养基以所指示的每升溶液的比例具有下述组分：

·2g肉浸膏

·7g酵母提取物

·2g淀粉

·0.5g L-半胱氨酸盐酸盐

·5g氯化钠

·5g蛋白胨

·2g胰蛋白胨

·5g半乳糖苷果糖

·1mg核黄素*

·1mg硫胺^*

·16mg亚甲基蓝

·2g氯化锂

·5ml丙酸

·15g琼脂

所对应的量用于制备500ml的此双歧杆菌选择性培养基。在加热搅拌板上恒速搅拌并加热该混合物若干分钟直到其沸腾，然后高压灭菌该溶液。最后，在浓缩溶液(原液1mg/ml)中制备维生素(^*)，然后将其过滤并在溶液达到约55℃时和丙酸一起添加到培养基中。

3.改良哥伦比亚培养基(pH 5.0)：此培养基专门用于双歧杆菌。所述培养基以所指示的每升溶液的比例具有下述组分：

·哥伦比亚琼脂培养基(Oxoid,Hampshire,United Kingdom)

·葡萄糖(5g/L)

·半胱氨酸(0.5g/L)

·琼脂(高达15g/L)

前述量用于制备1000ml的此双歧杆菌选择性培养基。在加热搅拌板上恒速搅拌并加热该混合物若干分钟直到其融化，然后将溶液高压灭菌。最后，在溶液达到约55℃时将丙酸添加到培养基中，并且用1N NaOH溶液调节pH至5.0。

4.Rogosa琼脂培养基：此培养基用于确定乳杆菌。对于其制备，下文是商业公司提供的说明。

根据商业公司提供的说明制备该培养基。

实施例5接种样品

一旦进行稀释后，通过接种环一式三份地接种它们中的每一个。然后将具有不同培养基的所有培养板在受控温度37℃的孵育器中进行孵育。

事先将具有双歧杆菌培养基的培养板放入厌氧生长罐中，其中加入了的囊(厌氧气氛生成系统)，并且在含有乳杆菌培养板的那些中加入了的囊(CO₂气氛生成气氛)，最后将它们在37℃下孵育72小时。

实施例6确定菌落形成单元的数量

孵育后，选择具有大于10个菌落形成单元生长的稀释液，通过电子菌落计数笔(菌落计数器型号608702,Bio Co,Kobe,Japan)计数每个培养基中的CFU。最后，通过下文的公式计算CFU的总数：

CFU＝菌落数量×稀释因数×稀释

进行培养后，将剩余的粪便样品储存于-80℃，直到进行分子生物学研究。

实施例7.测定对pH和胆汁盐的抗性

孵育72小时后，就用裸眼观察的形态学，从每个儿童的每个培养基中选择100个菌落。在液体Man Rogosa Sharpe(RSM)培养基和厌氧条件下孵育所述菌落(乳杆菌和双歧杆菌)48小时。随后，立刻用它们中的每一个制备甘油原液(RSM+甘油10％)。

同时，随着由不同菌落制备甘油原液，分析它们在pH 3.0和3％胆汁盐(Oxgall,Sigma-Aldrich,Spain)的浓度下的活性。为此目的，以下述方式进行所述操作：

1.以5000rpm离心菌落5分钟。

2.去除上清液并重悬于无菌PBS中。

3.在类似于上文的条件下再次离心。

4.重复步骤1至3三次。

5.最后重悬于1ml无菌PBS中。

6.将100ml的前述悬浮液接种于pH 7.0和pH 3.0以及溶于PBS的0.3％Oxgall的900ml PBS中。

7.在37℃下，在厌氧条件下孵育3小时。

8.对于其中进行孵育的每个条件，进行不同的稀释(10¹至10⁵)。

9.接种50μl的每个稀释液。

10.在37℃下，在厌氧生长条件下孵育72小时。

11.通过计数确定存在于对照和pH和Oxgall中的菌落数量。

12.通过下述等式确定每个菌落的存活性：

在pH 3.0和0.3％Oxgall下显示出大于90％的存活性的所有那些菌落都被认为是阳性的，保留所述菌落以进行其余测试。消除其它菌落。

实施例8.对照细菌

下述为和阳性对照使用的菌落：

Para双歧杆菌：Hero Spain S.A提供的两歧双歧杆菌和长双歧杆菌。

Para乳杆菌：采用了2种商业乳杆菌：干酪乳杆菌和鼠李糖乳杆菌GG(LGG)

用所选菌落完成初始筛选后，进行二次筛选。在此情况中，验证了在pH 2.5和2.0以及0.5％和0.7％Oxgall的存活性。进行的操作类似于第一次试验中采用的操作。确定存活性后，测定了存活性范围。在此二次筛选中，商业细菌对照提供的值小于零，因此具有大于4％的存活性百分比的细菌确定为选择阳性菌落的初始最佳范围。将菌落分成3组：

组1：存活性大于66％的菌落。

组2：存活性为33至66％的菌落。

组3：存活性大于4％的菌落。

图1和4示出了本发明的目标菌株对pH的抗性或存活结果。在菌株鼠李糖乳杆菌22A(CNCM I-4036)以及副干酪乳杆菌7(CNCM I-4034)的情况下，在图1中示出了结果，并且它们证实在pH 3.0下，菌株的抗性类似于或者稍高于测试的商业菌株。然而，在pH 2.0下，菌株22A相比其余在该pH不存活的菌株具有非常高的存活性。在菌株短双歧杆菌CNCM I-4035的情况中，图4示出了结果，其中可以观察到，在pH 3.0下菌株15B的抗性显著高于测试的另外两种双歧杆菌的抗性，其存活性高于100％，这指示细菌可以在该pH下繁殖。

图2和5示出胆酸盐对本发明的菌株的存活的影响结果。图2中，提供了涉及菌株CNCM I-4036和CNCM I-4034的结果。如所提及的，两个菌株都显示远高于所测试的商业菌株的存活百分率，存活百分比大于100％，这指示它们甚至可以在这些盐的存在下繁殖。图5中，提供了涉及菌株CNCMI-4035的结果。如此图中所示，如与本领域现有技术的对照双歧杆菌相比，该菌株显示了在更高浓度下的更好的存活。

实施例9.对肠上皮细胞粘附的测试

采用已通过对pH和胆汁盐抗性所选的菌落，进行了细胞粘附试验。所述试验采用肠上皮细胞HT29进行。首先，进行了通过不同染色测定细胞粘附的一系列尝试：革兰氏染色、亚甲基蓝染色、姬姆萨染色等。观察到，通过此手段非常难以测定对HT29细胞的粘附百分比。

提出了哪种方法为测定粘附百分比的最佳方法的问题，结论是最佳方法可能为将允许回收到所有粘附细菌的方法。因此，选择了胰蛋白酶化方法，最后以下述方式进行：

1.在37℃和5％CO₂下孵育HT29细胞，直至在24-孔板中汇合。

2.在厌氧条件下孵育要试验的不同菌落。

3.根据下述步骤使细菌与细胞接触：

a.以5000rpm离心细菌5分钟。

b.去除上清液，然后将细菌重悬于1ml无菌PBS中。

c.再重复步骤a和b两次。

d.在600nm下测定每种细菌的O.D.。

e.在前述制备的不含FBS(牛血清白蛋白)和抗生素(1至5x10⁶CFU/ml)的细胞培养基中稀释细菌培养物至O.D为0.8。

f.去除细胞的培养基。

g.用无菌PBS洗涤数次，从而去除FBS和抗生素残留物。

h.向每个孔中加入250ml的细菌悬浮液。一式三份进行实验。

i.在37℃和5％CO₂下孵育90分钟。

4.当细菌与细胞一起孵育后，进行下述操作：

a.通过用巴斯德吸管抽吸去除培养基。

b.用1X PBS(pH 7.0)洗涤4或5次。

c.加入100μl胰蛋白酶，并在37℃下孵育10-15分钟。

d.回收孔中的整个体积，并转入Eppendorf。

e.用150μl的PBS洗涤孔，并加入到同一Eppendorf中。

f.每个样品进行数次稀释(4或5次)。

g.接种每个稀释液的50μl。

h.在37℃和厌氧条件下孵育72小时，

i.进行菌落数量的计数。

5.测定粘附百分比。

图3显示本发明的目标菌株CNCM I-4036(菌株22A)和CNCM I-4034(菌株7)的粘附结果。两种菌株都具有远高于对照菌株显示的百分比的粘附百分比(在菌株22A的情况中，其为2倍)，这指示其在调节肠细胞活性包括免疫调节中的潜在作用。

图6显示了菌株CNCM 1-4035(菌株15B)的粘附结果，同样指示了远高于对照菌株的细胞粘附百分比。

实施例10.鉴定乳酸细菌

分离DNA、扩增16S rRNA片段并测序

根据粘附测试选择的菌落数，通过下述方式直接进行所述菌落的鉴定：扩增每个菌落的16S rRNA片段，测序并在美国国家生物技术信息中心(National Center of Biotechnology Information，NCBI)数据库中进行同源性检索。

首先，37℃下，在厌氧条件下在RSM培养基中孵育所选菌落48小时。然后用PBS洗涤。为此：

1.以5000rpm离心菌落5分钟。

2.去除上清液，将细菌沉淀重悬于1ml无菌PBS中。

3.重复步骤1和2三次。

4.最后，将沉淀重悬于1ml无菌PBS中。

然后提取细菌的基因组DNA，其中以下述方式进行：

1.以5000rpm离心前述悬浮液5分钟，并去除上清液。

2.将细菌沉淀重悬于567ml的Tris-EDTA(TE)缓冲液中。

3.加入30ml的10％十二烷基硫酸钠(SDS)和3ml蛋白酶K(20mg/ml)。

4.37℃下孵育混合物1小时。

5.加入100ml的5M NaCl和80ml的十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)/NaCl。

6.混合并在65℃下孵育10分钟。

7.加入相同体积(780ml)的氯仿/异戊醇(24:1)混合物。

8.混合并以10000rpm离心5分钟。

9.提取上层水相并转移至新的Eppendorf中。

10.加入相同体积的苯酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)混合物。

11.混合并以10000rpm离心5分钟。

12.提取上层水相并转移至新的Eppendorf中。

13.加入0.6体积的异丙醇。

14.4℃下以13000rpm离心13分钟。

15.去除上清液，并向沉淀的DNA中加入1ml的70％乙醇。

16.4℃下以13000rpm离心5分钟。

17.去除上清液，然后使剩余的DNA沉淀物在室温下干燥。

18.在20-50ml水中重悬。

19.通过分光光度计在260nm下测量浓度并获得260/280比以验证其纯度。

通过PCR扩增16s rDNA基因和16s-23s基因间间距。

·采用的寡核苷酸：

为扩增16s rDNA基因，采用下述组合的通用寡核苷酸：

27F 5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′(M＝A+C)(SEQ.ID.NO.1)

1492R 5′-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3′(Y＝C+T)(SEQ.ID.No.2)

在55℃的杂交温度，扩增时间90秒和35个循环，扩增了约1450bp的片段。

39F 5′-TGGCTCAGRWYGAACGCTRG-3′(R＝A+G,W＝A+T,Y＝C+T)(SEQ.ID.No.3)

1391R 5′-GACGGGCGGTGWGTRCA-3'(SEQ.ID.No.4)

在52℃的杂交温度，扩增时间90秒和35个循环，扩增了约1350bp的片段。

设计其它双歧杆菌特异寡核苷酸，为：

Bif 250bp F 5′-CTCGTAGGCGGTTCGTCG-3′(SEQ.ID.No.5)

Bif 250bp R 5--AACGGGCCCCACATCCAG-3′(SEQ.ID.No.6)

在65℃的杂交温度，扩增时间20秒和30个循环，扩增了约250bp的片段。

为了扩增乳杆菌细菌的16s-23s基因间间距，采用下述组合的寡核苷酸：

lactoF 5′-ACACCGCCCGTCACACCATG-3′(SEQ.ID.No.7)

lactoR 5-CCHSTTCGCTCGCCGCTACT-3′(H＝A+T,S＝G+C)(SEQ.ID.No.8)

乳杆菌特异寡核苷酸。在65℃的杂交温度，扩增时间30秒和30个循环，扩增了约600bp的片段。

ISBif F 5′-GGGATGCTGGTGTGGAAGAGA-3′(SEQ.ID.No.9)

ISBif R 5′-TGCTCGCGTCCACTATCCAGT-3′(SEQ.ID.NO.10)

双歧杆菌特异寡核苷酸。在60℃的杂交温度，扩增时间30秒和30个循环，扩增了约240bp的片段。

为了扩增16s rDNA基因和16s-23s基因间间距，将50-100ng of DNA上样用于PCR，所述PCR具有最终体积50μl，每个循环中采用变性温度94℃并变性30秒。根据上述每组寡核苷酸的条件进行编程。

在1.3％琼脂糖凝胶中验证扩增的结果，用溴乙锭对样品进行染色，在紫外投射仪中观察结果。

重复阴性的扩增，用GE healthcare试剂盒Ilustra^TM GFX^TM PCR DNA和凝胶条带纯化试剂盒，根据制造商的说明书扩增为阳性的那些。当纯化后，将样品重悬于25ml水中，并通过在新的1.3％琼脂糖凝胶中观察而确认纯化。

然后将样品拿到Parasitology and Biomedicine"Lopez-Neyra"研究所(CSIC)的DHA测序服务中心。

实施例11.通过发酵测试的鉴定

采用API ZYM和API 50CHL(bioMerieux's)系统。API ZYM系统为用于测定酶活性的半定量方法。该系统具有20个孔，其中19个含有用于检测19种酶的活性的脱水底物(图7和8)，获得比色结果，其指示酶活性的程度，并且测量为和对照相比的0-5个级别。还采用了API 50CH带和APICHL培养基(bioMerieux's)，其为用于获得49种碳水化合物的发酵谱的方法(图9和10)。获得比色结果，但是在这种情况中，它们仅相比对照分类为阳性(+)、阴性(-)、和中间程度(V)。在所有测试中都采用对照菌株。

实施例12.评估菌株副干酪乳杆菌CNCM I-4034、短双歧杆菌CNCM I-4035 和鼠李糖乳杆菌CNCM I-4036的抗微生物活性

研究菌株及培养和存储条件

在本发明中已分析了属于乳杆菌属和双歧杆菌属的总共3个菌株(表1)。

表1.研究中所用菌株和培养条件

对于这些菌株，已经评估了它们针对表2和3所示的细菌消化性病原体(幽门螺旋杆菌、单核细胞增生李斯特菌、宋内氏志贺氏菌、肠毒性大肠杆菌、肠病原大肠杆菌和肠道沙门氏菌)和病毒(病毒Ito、Wa和Va70)的抗微生物能力。

表2.采用的病原微生物菌株

表3.采用的病原微生物菌株

在细菌的情况中，其通过在-80℃下冷冻保存于添加20％(w/v)甘油的RSM溶液中。将病毒在-190℃下冷冻保存于MEM培养基中。

获得用于研究的无细胞的上清液

为了获得用于不同试验的浓缩上清液，37℃下，在液体培养基中培养菌株17h，在RSM培养基(CNCM I-4034和CNCM I-4036)或在添加0.05％半胱氨酸的RSM培养基(CNCM I-4035)中培养24小时。通过离心收集每种菌株的上清液，并冻干。溶解获得的浓缩物直到获得浓缩10倍的溶液，将pH调中性至6.0的值，然后通过0.22μm过滤而灭菌。将来自中性化且灭菌的上清液的等分试样冷冻保存于-20℃直到其使用。

在液体培养基中针对细菌消化性病原的活性试验

为在液体培养基中进行抑制试验，采用Spinler等人的程序(2008年)的修改方式。简而言之，在250μl体积的多孔板中，以渐增(0.2％至4％)百分比(v/v)向培养基中分别加入获得的上清液，所述培养基以5％接种了各病原的过夜生长物。以通过采用Multiskan 5Ascent读板器测定595nm下的OD进行监测的方式，获得生长曲线。从不同重复试验中获得的结果，针对不加入抑制菌株的上清液的对照，以生长抑制百分比的形式定量地评估实施的抑制作用。

在液体培养基中针对病毒消化性病原的活性试验

根据Botic等人(2007年)公布的程序，在本项目中为了适合进行的工作采用其修改方式，进行了研究菌株的上清液的病毒感染降低的试验。在此情况中，为进行这些试验，采用了HT-29人肠上皮细胞系。

在液体培养基中针对细菌消化性病原：单核细胞增生李斯特菌、宋内氏志贺氏菌和幽门螺旋杆菌的活性试验结果

为了评估菌株副干酪乳杆菌、鼠李糖乳杆菌和短双歧杆菌的生长上清液的作用，分别采用了17小时和24小时的中和的和浓缩10倍的生长上清液。

取决于益生菌和病原菌株，结果有很大变化。在单核细胞增生李斯特菌的情况中，加入副干酪乳杆菌生长17小时后获得的上清液具有抑制作用(图10A)。在鼠李糖乳杆菌的情况中，从加入24小时培养物的上清液获得了最佳结果。在短双歧杆菌的情况中，对单核细胞增生李斯特菌CECT 4031T的抑制作用(图10B)突出。针对宋内氏志贺氏菌获得的结果类似于单核细胞增生李斯特菌获得的结果，因为对于副干酪乳杆菌，最佳结果获得自加入生长17小时后获得的上清液；而对于鼠李糖乳杆菌，最佳结果获得自加入培养24小时的上清液(图10C)。在幽门螺旋杆菌的情况中，由副干酪乳杆菌和短双歧杆菌17小时和24小时的上清液，获得了病原生长的显著降低，最大的抑制为来自24小时培养的上清液。获得的抑制百分比描述于下表(表4)中。

表4：在添加的研究菌株的上清液培养基中，针对各病原获得的抑制百分比。

在液体培养基中针对细菌消化性病原：伤寒沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌和大肠杆菌的活性试验结果

对于细菌副干酪乳杆菌的上清液，观察到对测试沙门氏菌组的显著生长抑制(图11)。该作用主要由于未中和的上清液，这表明其由于来自发酵的酸的产生，从而限制了病原的生长。在伤寒沙门氏菌CECT 725的情况中，观察到1％和4％上清液的抑制作用，无论其是中和的还是未中和的，这表明该抑制是由于对病原产生该作用的某种类型的细菌素或其它性质未知的因素。

细菌短双歧杆菌的上清液对细菌伤寒沙门氏菌(CECT 725)施加了生长抑制作用。使用所有条件(17小时和24小时，中和和未和的；1％和4％)的上清液观察到这一作用，同样未明确任何类型的细菌素或不同性质的其它因素的产生(图12)。

对于细菌鼠李糖乳杆菌的上清液，主要在4％对所有的组(大肠杆菌ETEC、大肠杆菌EPEC和肠道沙门氏菌)观察到显著的生长抑制(图13)。主要采用未和的上清液观察到该作用，这再次表明其由于源自发酵的酸产物，从而限制了病原的生长。

尽管在大肠杆菌EPEC(CECT 742)和鼠伤寒沙门氏菌(CECT 4594)的情况下，采用中和的24小时的上清液观察到抑制，该作用可以如前述情况归因于来自益生细菌生长培养基的任何类型的因素或细菌素的存在(图13)。

在液体培养基中针对病毒消化性病原：人轮状病毒Ito、Wa和Va70的活性试验结果

已经优化了人轮状病毒Ito、Wa和Va70的感染程序、感染中心的检测和保护作用的定量。为了获得尽可能具有代表性的结果，已在HT-29人细胞系中进行了感染和保护试验。

当病毒在MA-104细胞中扩增时，将其在HT-29细胞系中进行滴定。获得的感染中心形成单位的效价为：病毒Ito为2.02x10⁶ffu/mL；病毒Wa为6.80x10⁴ffu/mL；病毒Va70为2.33x10⁵ffu/mL。由获得的滴定结果将病毒转换成适于感染的浓度。为确保试验的正确性，使用3个连续系列十倍稀释液进行感染试验，并一式三份进行感染试验。图14总结了以未经前述浓缩中和的上清液的上清液获得的感染中心的降低结果，所述上清液来自24小时培养物。这些结果表明本发明的菌株降低所有测试病毒(Wa、Ito和Va70)的感染中心。

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Claims

1.一种益生微生物菌株，其特征在于，所述菌株为短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)HERO 15B，其中，HERO 15B是指之后被巴斯德研究所编码为短双歧杆菌CNCM 1-4035，于2008年7月2日保藏于该处。

2.根据前述权利要求1所述的微生物菌株，其特征在于，所述菌株以纯生物培养物的形式提供。

3.根据权利要求1或2所述的益生微生物菌株，其特征在于，所述菌株以活细胞的形式提供。

4.根据权利要求1或2所述的益生微生物菌株，其特征在于，所述菌株以非活细胞的形式提供。

5.一种包含根据权利要求1-4中任一项所述的微生物菌株的制剂。

6.根据权利要求5所述的制剂，其特征在于，所述制剂还包含益生元物质。

7.根据权利要求5或6所述的制剂，其特征在于，所述制剂还包含适合于其摄取的载体。

8.根据权利要求7所述的制剂，其特征在于，所述载体是药学上可接受的载体。

9.根据权利要求7所述的制剂，其特征在于，所述载体是与胶囊、片剂或粉末相关的载体。

10.根据权利要求7所述的制剂，其特征在于，所述载体是由食品形成的。

11.根据权利要求10所述的制剂，其特征在于，所述食品选自：奶和奶衍生的产品；谷类食物和衍生物；汤；发酵的肉制品；果汁；即食型幼儿食品。

12.根据权利要求11所述的制剂，其特征在于，所述奶和奶衍生的产品是发酵奶和奶酪以及幼儿奶；所述谷类食物和衍生物是面包团和幼儿谷类制品。

13.根据权利要求1-4中任一项所述的益生微生物菌株或根据权利要求5-12中任一项所述的制剂在制备膳食中的用途。

14.根据权利要求13所述的菌株或制剂的用途，其特征在于，其用于幼儿和/或成人和/或特殊膳食，其中特殊膳食是指这样的食品，由于它们的特定组成或制备它们的特定方法，所述食品与基本食品具有明显区别，其适用于所指出的营养目标且销售时指明它们实现所述目标，1989年5月3日的欧盟指令89/398/EEC，其涉及近似于成员国对要用于特殊膳食的食品的法律，其由6月30日的DO seriesL no.186所限定，

其中，特殊膳食理解为必须满足下述人群的特定营养需要的那种：

i)具有吸收过程或代谢障碍的确定人群，或

iii)健康的婴儿或幼儿。

15.根据权利要求14所述的菌株或制剂的用途，其用于制备幼儿配方奶。

16.根据权利要求15所述的菌株或制剂的用途，其特征在于，所述配方奶为即食型幼儿奶。

17.根据权利要求1-12中任一项所述的菌株或制剂在制备食品补充剂中用途。

18.根据权利要求17所述的菌株或制剂的用途，其用于制备口服和/或肠道营养的配方中。

19.根据权利要求1-4中任一项所述的益生微生物菌株或根据权利要求5-12中任一项所述的制剂在制备药品中的用途。

20.根据权利要求1-4中任一项所述的益生微生物菌株或根据权利要求5-12中任一项所述的制剂在制备用于与下述方面相关的产品中的用途：刺激免疫系统和/或预防/治疗胃肠道障碍，和/或消除/调节消化道病原。

21.根据权利要求20所述用途，其特征在于，所述胃肠道障碍包括肠道传输变化、感染和吸收不良综合征。

22.根据权利要求21所述用途，其特征在于，所述肠道传输变化是便秘和矿物质的生物利用度变化。

23.根据权利要求21所述用途，其特征在于，所述感染包括胃感染和具有急性或慢性腹泻的胃肠道感染。