TWI705136B - 新穎乳酸菌及其應用 - Google Patents

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Abstract

本發明提供經分離且經純化之乳酸菌，其為副乾酪乳桿菌(Lactobacillus paracasei ) PS23 (PS23)，及其在以下方面中之應用：延遲衰老過程；增進免疫調節活性；減少、預防或治療過敏；減少、預防或治療發炎；預防或治療慢性病症；及/或預防及/或治療情緒障礙或神經病狀。

Description

新穎乳酸菌及其應用
本發明係關於新穎益生菌及其應用。特定而言，本發明係關於新穎乳酸菌及相關組合物及使用方法。
世界衛生組織(World Health Organization，WHO)將益生菌定義為「活的微生物體，其在以足夠的量投與時，賦予宿主健康益處」。已知諸如乳酸菌等益生菌具有腸功能調控活性、免疫刺激活性及抗癌活性。
各種乳酸菌菌株(LAB)用於製造發酵食品，包括牛乳、麵包、蔬菜及其他可食用之植物材料。LAB係一組通常用於產生發酵食品之革蘭氏陽性(Gram-positive)菌。已廣泛研究LAB在飲食及臨床應用中之益處。LAB已用作用於保存食物之發酵劑，其利用低pH及在其發酵活性期間產生之發酵產物之作用來抑制腐敗細菌之生長。為此，LAB已用於製備多種不同食品，例如乳酪、酸乳及其他來自牛乳之發酵乳產品。由於已發現LAB在攝取後對人類及動物展現出有價值之性質，因此其已引起極大關注。特定而言，已發現乳桿菌屬(Lactobacillus)或雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)之特定菌株能夠定殖腸黏膜且有助於維持人類及動物之健康。抗發炎活性及免疫調節活性為LAB之眾所周知之特性。US 7875421係關於約氏乳桿菌(Lactobacillus johnsonii)菌株之DNA序列之用途，特定而言用於闡明微生物與其定殖宿主之相互作用及此外用於闡明此菌株展現出之益生菌性質基礎之其基因體序列。WO 2018/129722提供經分離之乳酸菌(LAB)(即發酵乳桿菌PS150(Lactobacillus fermentum PS150))，其用於改善情緒障礙或神經病狀及治療或預防神經退化性疾病。
然而，業內需要開發有益於健康之新穎益生菌。
本揭示內容提供經分離且經純化之乳酸菌，其為副乾酪乳桿菌PS23(Lactobacillus paracasei PS23、PS23)，其已根據布達佩斯條約(Budapest Treaty)保存於德國微生物菌種保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen)且登錄號為DSMZ 32322。
本揭示內容亦提供組合物，其包含本發明之PS23細胞及視情況可食用之載劑或醫藥上可接受之載劑。在一個實施例中，PS23細胞可以全細菌之形式使用，該等細菌係活細胞或死細胞。在一個實施例中，組合物係呈適於經口投與之形式。在另一實施例中，組合物係呈固體、半固體、液體、粉末顆粒之形式。
本揭示內容亦提供技術方案1之乳酸菌之用途，其用於製造用於個體之以下目的之製劑：(i)延遲衰老過程(抗衰老)；(ii)增進免疫調節活性；(iii)減少、預防或治療過敏；(iv)減少、預防或治療發炎；(v)預防或治療與腸道發炎有關之慢性病症；及/或(vi)預防及/或治療情緒障礙或神經病狀或治療或預防與神經元之細胞凋亡或神經退化有關之疾病。在一個實施例中，抗衰老為預防或延遲免疫衰老、預防或延遲肌少症或增 進腸道障壁或腸道免疫。在一個實施例中，PS23可預防或治療與免疫系統中之年齡相關性劣化(即，免疫衰老)及發炎衰老(immunosenescence)有關之慢性病症。在一個實施例中，PS23可預防或延遲肌少症。
在一個實施例中，與神經元之細胞凋亡或神經退化有關之疾病係選自由以下組成之群：中風、阿茲海默氏病(Alzheimer's disease)、亨廷頓氏病(Huntington's disease)、帕金森氏病(Parkinson's disease)、皮克氏病(Pick's disease)、庫賈氏病(Creutzfeldt-Jakob's disease)、帕金森-ALS-失智症候群、威爾森氏病(Wilson's disease)、多發性硬化、進行性核上性麻痺、神經病性疼痛有關之雙極性障礙、皮質基底核退化症、精神分裂症、注意力缺失過動病症(ADHD)、失智症、肌肉萎縮性脊髓側索硬化症、視網膜疾病、癲癇、中風、暫時性腦缺血發作、心肌缺血、肌肉缺血、由與長時間暫停至腦部之血流有關之手術技術引起之缺血、頭部損傷、脊髓損傷、缺氧及抑鬱症。
在一個實施例中，PS23可預防或治療壓力有關病症。在一個實施例中，PS23可改善睡眠品質及效率。
在一個實施例中，與腸道發炎有關之慢性病症係發炎性腸病或發炎性腸症候群。
圖1顯示副乾酪乳桿菌副乾酪亞種PS23(Lactobacillus paracasei subsp.Paracasei PS23)及其他乾酪乳桿菌(Lactobacillus casei)及副乾酪乳桿菌模式菌株之基因體指紋分析圖譜。M，標記物(250-10,000 bp)；泳道1，副乾酪乳桿菌堅韌亞種ATCC 25599(Lactobacillus paracasei subsp.tolerans ATCC 25599)；泳道2，副乾酪乳桿菌副乾酪亞 種ATCC 25302(Lactobacillus paracasei subsp.paracasei ATCC 25302)；泳道3，乾酪乳桿菌乾酪亞種ATCC 393(Lactobacillus casei subsp.casei ATCC 393)；泳道4，副乾酪乳桿菌副乾酪亞種PS23。
圖2顯示熱殺死或活體PS23降低糞便之潛血評分。
圖3A及3B顯示PS23降低DSS誘導之結腸縮短。A，DSS治療組中之平均長度顯著短於對照組。B，PS23挽救DSS誘導之結腸中之組織損害。
圖4顯示PS23降低結腸促發炎性細胞介素含量及MPO活性。
圖5A至5E顯示PS23能夠逆轉由生命早期壓力誘導之異常表型。A及B，MS小鼠在開放空間中心區域中所花費之時間及進入中心區域之次數減少。C，MS小鼠在EPM開放臂中所花費之時間百分比減少。D，站立頻率降低，此指示MS小鼠之探索性活動減少。E，MS不僅產生具有焦慮樣行為之小鼠，且亦產生具有抑鬱症樣行為之小鼠。
圖6顯示PS23使MS誘導之發炎正常化。
圖7顯示PS23使MS誘導之HPA軸功能障礙正常化。
圖8顯示PS23增加海馬體中之GR及BDNF蛋白質表現。
圖9顯示母嬰分離小鼠之海馬體中多巴胺之轉換率。數據呈現為平均值±SD。相對於CON組，*** p<0.001；相對於MS組，### p<0.001。
圖10顯示藉由莫氏水迷宮(Morris water maze)測試對SAMP8小鼠之學習及記憶力之行為評價。數據呈現為平均值+/- SD。相對於未衰老組，#p<0.05；相對於衰老組，*p<0.05。
圖11顯示藉由開放空間測試評價SAMP8小鼠之運動活動。數據呈現為平均值+/- SD。相對於未衰老組，#p<0.05；相對於衰老組，*p<0.05。
圖12A及12B顯示SAMP8小鼠腦組織中之血清素(A)及多巴胺(B)含量。數據呈現為平均值±SD。相對於未衰老組，# p<0.05；相對於衰老組，* p<0.05。
圖13顯示SAMP8小鼠中之血清BDNF含量。數據呈現為平均值+/- SD。相對於未衰老組，#p<0.05；相對於衰老組，*p<0.05。
圖14(A)及14(B)顯示SAMP8小鼠前額葉皮質及海馬體中之SOD含量(A)及麩胱甘肽過氧化酶(GPx)含量(B)。數據呈現為平均值±SD。相對於未衰老組，# p<0.05；相對於衰老組，* p<0.05。
圖15(A)至15(C)顯示對SAMP8小鼠衰老程度之評估。評估類別包括行為(A)、皮膚及毛髮(B)以及眼睛及脊柱(C)。數據呈現為平均值+/- SD。分級評分系統遵循Takeda等人1981(Mech Ageing Dev.1981,17(2)：183-94)。
圖16顯示SAMP8小鼠之吞噬作用活性。數據呈現為平均值+/- SD。相對於未衰老組，#p<0.05；相對於衰老組，*p<0.05。
圖17(A)至17(C)顯示SAMP8小鼠中之血清IL-10(A)、TNF-α(B)及MCP-1(C)之含量。數據呈現為平均值+/- SD。相對於未衰老組，#p<0.05；相對於衰老組，*p<0.05。
圖18顯示SAMP8小鼠脾細胞中總T細胞及CD4+細胞之百分比。數據呈現為平均值+/- SD。相對於未衰老組，#p<0.05；相對於衰老組，*p<0.05。
圖19顯示由經ConA刺激之SAMP8脾細胞所產生之IFN-γ及IL-5含量。數據呈現為平均值+/- SD。相對於未衰老組，#p<0.05；相對於衰老組，*p<0.05。
圖20顯示PS23對SAMP8小鼠中SOD及GPx之血清含量之效應。數據呈現為平均值+/- SD。相對於未衰老組，#p<0.05；相對於衰老組，*p<0.05。
圖21(A)及21(B)顯示SAMP8小鼠之身體組成(A)及前肢握力(B)。數據呈現為平均值+/- SD。相對於未衰老組，#p<0.05；相對於衰老組，*p<0.05。
圖22顯示SAMP8小鼠比目魚肌之耗氧速率。數據呈現為平均值+/- SD。相對於未衰老組，#p<0.05；相對於衰老組，*p<0.05。
圖23顯示SAMP8小鼠脛骨前肌中之肌肉粒線體合成有關之基因表現。數據呈現為平均值+/- SD。相對於未衰老組，#p<0.05；相對於衰老組，*p<0.05。
圖24顯示SAMP8小鼠脛骨前肌中之發炎性細胞介素IL-6之基因表現。數據呈現為平均值+/- SD。相對於未衰老組，#p<0.05；相對於衰老組，*p<0.05。
圖25(A)及25(B)顯示SAMP8小鼠之腸道通透性(A)及腸道長度(B)。數據呈現為平均值+/- SD。相對於未衰老組，#p<0.05；相對於衰老組，*p<0.05。
圖26(A)及26(B)顯示SAMP8小鼠腸液中MCP-1(A)及IgA(B)之含量。數據呈現為平均值+/- SD。相對於未衰老組，#p<0.05；相對於衰老組，*p<0.05。
圖27(A)至27(D)顯示藉由開放空間測試評價重複CORT注射小鼠之總路程(A)、中心時間(B)、中心進入次數(C)及中心路程(D)。數據呈現為平均值±SD。相對於CON組，# p<0.05，## p<0.01；相對於CORT組，* p<0.05，** p<0.01。
圖28(A)及28(B)顯示重複CORT注射小鼠之藉由強迫游泳測試評價之不動時間(A)及蔗糖偏嗜度(B)。數據呈現為平均值±SD。相對於CON組，# p<0.05；相對於CORT組，* p<0.05，** p<0.01。
圖29(A)至29(C)顯示重複CORT注射小鼠海馬體中之鹽皮質激素受體(A)、糖皮質激素受體(B)及BDNF(C)之相對表現程度。數據呈現為平均值±SD。相對於CON組，## p<0.01，### p<0.001；相對於CORT組，* p<0.05，*** p<0.001。
圖30顯示重複CORT注射小鼠糞便中之雙歧桿菌屬(Bifidobacterium spp.)、乳桿菌屬(Lactobacillus spp.)及球形梭菌(Clostridium coccoides)群之相對豐度。數據呈現為平均值±SD。相對於CON組，## p<0.01，### p<0.001；相對於CORT組，* p<0.05，** p<0.01，*** p<0.001。
圖31顯示重複CORT注射小鼠腦組織中之血清素含量。數據呈現為平均值±SD。相對於CON組，# p<0.05，## p<0.05；相對於CORT組，* p<0.05，** p<0.01。
圖32(A)及32(B)顯示經口投與PS23一週增進PSQI評分(A)及睡眠效率(B)。數據呈現為平均值±SD。* p<0.05。
除非另有明確說明，否則與連詞「及」連接之物項組不應 解讀為需要彼等物項中之每一者及每個均存在於分組中，而是應解讀為「及/或」。類似地，除非另有明確說明，否則與連詞「或」連接之物項組不應解讀為需要在該組中相互排除，而是應解讀為「及/或」。此外，儘管可以單數形式描述或主張本發明之物項、元件或組件，但預計複數在其範圍內，除非限於明確說明單數。
除非另有明確說明，否則如本文所使用，術語「一(a、an)」及「該」應理解為意指單數及複數二者。因此，「一(a、an)」及「該」(及若適當，其文法變化形式)係指一或多個。
術語「益生菌」在現有技術中視為在以足夠量投與時賦予宿主健康益處之微生物。益生菌微生物必須滿足與毒性之缺乏、存活率、黏附及有益效應有關之若干要求。該等益生菌特徵係菌株依賴性的，即使在同一物種之細菌內亦係如此。
如本文所使用，術語「醫藥上可接受」係指在合理醫學判斷範圍內適於與個體(人類或非人類動物)之組織接觸使用而無過度毒性、刺激性、過敏反應或其他問題或併發症且與合理益處/風險比相稱之化合物、材料、組合物及/或劑型。在與調配物之其他成分相容之意義上，每一載劑、賦形劑等亦必須係「可接受的」。適宜載劑、賦形劑等可參見標準醫藥文獻。
術語「可食用之載劑」係指適於與個體之組織接觸使用之化合物、材料、組合物及/或劑型。在與調配物之其他成分相容之意義上，每一載劑亦必須係「可接受的」。
如本文所使用之術語「有效量」係在合理醫學判斷範圍內高至足夠以正向方式顯著改變欲治療病狀且低到足夠避免嚴重副作用(以 合理之效益/風險比)之組合物中每一菌株之菌落形成單位(cfu)之量。
如本文所使用，術語「病症」可與「疾病」或「病狀」交換使用。
如本文所使用，術語「情緒障礙」係一類描述情緒嚴重變化之疾患。情緒障礙下之疾患包括：重度抑鬱症、雙極性障礙(躁狂-欣快、活動過多、過度膨脹之自我、不切實際的樂觀)、持續性抑鬱症(長久性輕度抑鬱症)、循環性情感疾患(雙極性障礙之輕度形式)及SAD(季節性情感障礙)。
如本文所使用，術語「神經病狀」係一類描述神經損害及疾病對腦功能就行為、記憶力或認知而言之影響之疾患。神經病狀下之疾患包括(但不限於)壓力(例如慢性輕度壓力)、認知減退、認知損害(包括輕度認知損害(MCI))、記憶差錯、一般回憶問題、認知障礙或諸如阿茲海默氏病、亨廷頓氏病、帕金森氏病、失智症、肌肉萎縮性脊髓側索硬化症、中風及精神分裂症等神經退化性疾病。
術語「治療」應理解為意指減輕或減少特定疾病或病狀之至少一種徵象、症狀、適應症或效應。如本文所使用，「預防」應理解為限制、降低疾病或病狀之發作速率或程度或抑制其至少一種徵象或症狀之發展。
如本文所使用，術語「個體」係可自投與如本文所揭示之化合物或組合物受益之任何動物。在一些實施例中，個體係哺乳動物，例如人類、靈長類動物、狗、貓、馬、牛、豬、齧齒類動物(例如大鼠或小鼠)。通常，哺乳動物係人類。
在一個實施例中，本發明提供經分離且經純化之乳酸菌， 其為副乾酪乳桿菌PS23(PS23)，其已根據布達佩斯條約保存於德國微生物菌種保藏中心且登錄號為DSMZ 32322。
在一個實施例中，經分離且經純化之副乾酪乳桿菌群係自健康人類面部分離。
在一個實施例中，16S rRNA基因序列及pheS基因序列顯示PS23與副乾酪乳桿菌副乾酪亞種具有高度相似性。
在另一態樣中，本發明提供組合物，其包含本發明之PS23細胞及視情況可食用之載劑或醫藥上可接受之載劑。在本發明之組合物中，該等PS23細胞可以全細菌(其可為活的或死的)形式使用。較佳地，細菌細胞係作為活的活細胞存在。
本發明之組合物可呈適於投與、特定而言經口投與之任一形式。此包括(例如)固體、半固體、液體、顆粒及粉末。
本發明之組合物之實例係營養組合物，包括食物產品且特定而言乳產品。
該組合物可為(例如)膠囊、錠劑、飲料、粉末或乳產品。視情況，可存在益生菌(例如乳酸菌)之其他菌株。較佳地，本發明之營養組合物係嬰幼兒食品、嬰兒配方乳或較大嬰兒配方。較佳地，本發明組合物係類藥劑營養品或醫藥產品、營養補充劑或醫療食品。
本發明之營養組合物亦包括食品補充劑及功能性食品。「食品補充劑」表示自通常用於食品中之化合物製得，但呈錠劑、粉末、膠囊、飲劑之形式或呈通常與滋養品無關之任何其他形式且其對人的健康具有有益效應之產品。「功能性食品」係亦對人的健康具有有益效應之滋養品。特定而言，食品補充劑及功能性食品可對疾病具有生理學效應(保 護性或治癒性)。
若本發明之組合物係飲食補充劑，則其可原樣投與、可與適宜可飲用液體(例如水、酸乳、牛乳或果汁)混合或可與固體或液體食品混合。在此背景中，飲食補充劑可呈錠劑、丸劑、膠囊、菱形錠劑、顆粒、粉末、懸浮液、小藥囊、軟錠劑、甜食、棒狀物、糖漿形式及相應投與形式，通常呈單位劑量形式。較佳地，包含本發明之組合物之飲食補充劑係以錠劑、菱形錠劑、膠囊或粉末形式投與，以製備飲食補充劑之習用製程製造。
本文所闡述之組合物可係醫藥上可接受之組合物，其可包括一或多種醫藥上可接受之載劑、賦形劑、黏合劑、稀釋劑或諸如此類。本發明組合物可經調配用於各種投與途徑，例如藉由經口投與。其亦可與遞送媒劑組合提供，例如在一些囊封技術中。
對於經口投與而言，粉末、懸浮液、顆粒、錠劑、丸劑、膠囊、膠囊錠及囊片可接受作為固體劑型。該等劑型可藉由(例如)將本文所揭示之一或多種化合物與至少一種添加劑(例如澱粉或其他添加劑)混合來製備。適宜添加劑為蔗糖、乳糖、纖維素糖、甘露醇、麥芽糖醇、聚葡萄糖、澱粉、瓊脂、海藻酸鹽、幾丁質、幾丁聚醣、果膠、黃著膠、阿拉伯膠、明膠、膠原、酪蛋白、白蛋白、合成或半合成聚合物或甘油酯。視情況，經口劑型可含有有助於投與之其他成分，例如無活性稀釋劑、或潤滑劑(例如硬脂酸鎂)、或防腐劑(例如對羥苯甲酸酯或山梨酸)、或抗氧化劑(例如抗壞血酸、生育酚或半胱胺酸)、崩解劑、黏合劑、增稠劑、緩衝劑、甜味劑、矯味劑或芳香劑。錠劑及丸劑可進一步經業內已知之適宜包衣材料來處理。
用於經口投與之液體劑型可呈醫藥上可接受之乳液、糖漿、酏劑、懸浮液及溶液之形式，其可含有無活性稀釋劑(例如水)。可使用諸如(但不限於)油、水、醇及該等物質之組合等無菌液體將醫藥調配物及組合物製備為液體懸浮液或溶液。可添加醫藥上適宜之表面活性劑、懸浮劑、乳化劑用於經口或非經腸投與。
在另一態樣中，本發明提供用於個體之以下方法：(i)延遲衰老過程(抗衰老)；(ii)增進免疫調節活性；(iii)減少、預防或治療過敏；(iv)減少、預防或治療發炎；(v)預防或治療與腸道發炎有關之慢性病症；及/或(vi)預防及/或治療情緒障礙或神經病狀或治療或預防與神經元之細胞凋亡或神經退化有關之疾病，其包含向該個體投與有效量之本發明之PS23細胞或含有其之組合物。在一個實施例中，有效量範圍為約1×107至約1×1013個細胞/天之熱殺死PS23細胞或約1×107至約1×1013CFU/天之活體PS23細胞。在一些實施例中，有效量範圍為約1×107至約1×1012個細胞/天、約1×107至約1×1011個細胞/天、約1×107至約1×1010個細胞/天、約1×108至約1×1013個細胞/天、約1×108至約1×1012個細胞/天或約1×108至約1×1011個細胞/天之熱殺死PS23細胞或1×107至約1×1012CFU/天、約1×107至約1×1011CFU/天、約1×107至約1×1010CFU/天、約1×108至約1×1013CFU/天或約1×108至約1×1012CFU/天或約1×108至約1×1011CFU/天之活體PS23細胞。在另一實施例中，有效量為約1×1010個細胞/天之熱殺死PS23細胞或1×1010CFU/天之活體PS23細胞。
在一個實施例中，抗衰老包括(但不限於)預防或延遲免疫衰老、預防或延遲肌少症及增進腸道障壁或腸道免疫。
PS23可增進吞噬作用活性、改善全身發炎、增加總T細胞 及CD4+細胞群體且平衡脾細胞之Th1/Th2反應。因此，PS23可預防或治療與免疫系統中之年齡相關性劣化(即，免疫衰老)及發炎衰老有關之慢性病症，例如心血管疾病、癌症及2型糖尿病。
PS23亦可預防或延遲肌少症。肌少症係年齡有關之肌肉質量損失及肌肉力量下降，其與身體殘疾、生活品質差及脆弱性強烈相關。
在一個實施例中，與神經元之細胞凋亡或神經退化有關之疾病可選自由以下組成之群：中風、阿茲海默氏病、亨廷頓氏病、帕金森氏病、皮克氏病、庫賈氏病、帕金森-ALS-失智症候群、威爾森氏病、多發性硬化、進行性核上性麻痺、神經病性疼痛有關之雙極性障礙、皮質基底核退化症、精神分裂症、注意力缺失過動病症(ADHD)、失智症、肌肉萎縮性脊髓側索硬化症、視網膜疾病、癲癇、中風、暫時性腦缺血發作、心肌缺血、肌肉缺血、由與長時間暫停至腦部之血流有關之手術技術引起之缺血、頭部損傷、脊髓損傷、缺氧及抑鬱症。
PS23可增加學習能力、記憶力及運動活動。因此，PS28可預防且延遲神經退化。該等效應可藉由降低腦中之氧化壓力且藉由增強BDNF表現來達成。因此，PS23可預防或治療中樞神經系統(CNS)中之衰老及氧化壓力有關之病症，例如慢性腦發炎、腦血管意外、衰老及神經退化性疾病。
在一些實施例中，PS23可預防且治療壓力有關病症。PS23挽救焦慮樣行為、探索性活動、抑鬱症樣行為、正規化HPA軸功能障礙、增加海馬體中之GR及BDNF蛋白質表現且保護神經元免受壓力且增加海馬體中之多巴胺轉換率。
在一些實施例中，PS23預防且治療壓力有關病症。PS23 可減少CORT誘導之抑鬱症樣行為、增加海馬體中之糖皮質激素受體(GR)、鹽皮質激素受體(MR)及BDNF蛋白質表現、保護神經元免受壓力且增加腦中之血清素含量。
在一些實施例中，PS23改善睡眠品質及效率。
在一個實施例中，PS23可增進腸道通透性、減少腸道發炎或增進黏膜免疫性。在一個實施例中，與腸道發炎有關之慢性病症包括(但不限於)發炎性腸病及發炎性腸症候群。
藉由下文所呈現之實例更詳細地闡述本發明，實例之前為附圖之簡要說明。然而，不言而喻，該等實例係以說明本發明標的物之方式給出，且不以任何方式構成對其之限制。
實例 材料及方法
1.1.PS23之製備
PS23(DSM 32322)係自健康人類糞便分離。藉由對其16S rDNA序列進行系譜分類將其鑑別為新穎菌株。將經分離之PS23接種於Man Rogosa Sharpe培養液(MRS；BD Difco,Becton-Dickinson,Sparks,MD MD,USA)中，在37℃下培養18h，且然後藉由在6000×g下離心10min收穫。將糰粒重新懸浮於MRS加上12.5%甘油中至每毫升5×109個群落形成單位之最終濃度。然後將重新懸浮之溶液等分於冷凍管中且在-20℃下儲存直至使用。當使用時，使等分試樣預熱至37℃持續1h且重新懸浮於鹽水中，之後投與小鼠。
1.2.動物及圈養
本研究中所使用之所有小鼠均係購自國家實驗室動物中心 (National Laboratory Animal Center，NLAC；Taipei,Taiwan)且安置在國立陽明大學(National Yang-Ming University)之動物中心。使房間保持在22±2℃、50%-60%濕度下，且處於12h光/暗循環下。除非另有說明，否則隨時自由地為小鼠提供水及飼料(實驗室飲食可高壓滅菌之齧齒類動物飲食5010；PMI Nutrition International,Brentwood,MO,USA)。所有動物實驗程序均由國立陽明大學實驗動物照護及使用委員會審查並批准。使小鼠適應一週，之後開始實驗。
1.3.實驗設計及樣品收集
對於DSS誘導之UC小鼠模型，將雌性BALB/c小鼠(6至8週齡)隨機分配至健康(CON)、UC對照(DSS)、DSS+熱殺死PS23(熱殺死)及DSS+活體PS23(活體)組中。自第1天至第7天，向CON及DSS組二者經口投與鹽水；而向熱殺死組及活體組分別經口投與熱殺死(1×109個細胞/小鼠/天)或活體PS23(1×109CFU/小鼠/天)。在第8天，將所有DSS組之飲用水換成5%之DSS水(g/mL)。在第14天，收集小鼠之糞便以用於量測糞便潛血含量。在收集糞便之後，使用CO2窒息將小鼠處死。小心地切除結腸，以量測自盲腸至肛門之長度。然後在量測之後立即切下一小部分末端結腸且固定於10%磷酸鹽緩衝之福馬林(formalin)中用於組織學用途。將結腸之剩餘部分儲存在-80℃下直至進行結腸蛋白質提取。
對於MS小鼠模型，使用定時懷孕之雌性C57BL/6J小鼠。為評估PS23之影響精神效應，吾人向MS實驗組投與PS23。自PD29藉由胃管灌食給予MS組經鹽水重新懸浮之熱殺死(1×109個細胞/小鼠/天)或活體PS23(1×109CFU/小鼠/天)達4週，而在同一時期期間給予MS及未經處理之對照組鹽水。在PS23治療期結束時，使小鼠經歷一連串行為測試。 按照以下順序自最小壓力至最大壓力依次給予測試：開放空間測試(OFT)；高架十字迷宮(EPM)；及強迫游泳測試(FST)。所有測試均係在光照階段期間進行。
1.4結腸組織均質上清液之製備
使結腸組織於RIPA溶解緩衝液(50mM Tris-HCl,pH 7.5、150mM NaCl、0.5%去氧膽酸鈉、1% NP-40及0.1% SDS)中在蛋白酶抑制劑(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)存在下均質化。於冰上使結腸蛋白質勻漿培育15min，且然後在4℃下在12,000g下離心10min。收集上清液且儲存在-80℃下直至進行分析。使用Bradford分析測定蛋白質含量。
1.5細胞介素產生之測定
藉由市售套組(IFN-γ及IL-10使用Biolegand ELISA套組；IL-8、TNF-α、IL-1β及IL-6使用eBioscience ELISA套組)量測血清或結腸組織均質上清液中之細胞介素含量。
1.6髓過氧化酶活性分析
藉由市售套組(Cayman MPO過氧化分析套組)量測結腸組織均質上清液髓過氧化酶(MPO)活性值。
1.7開放空間測試
藉由OFT檢查小鼠之運動活動。在此測試中，將小鼠置於開放空間活動室中10min(Tru Scan活動系統；Coulbourn Instruments,Whitehall,PA,USA)。方形活動室(25.4×25.4×38cm)係由Plexiglas牆壁製成，每一側上具有兩個光束感測條。每次測試之後，利用70%乙醇清潔盒子。自動記錄活動且利用Tru Scan 2.2軟體(Coulbourn Instruments) 進行量化。藉由Tru Scan活動系統量測行進之總路程、移動時間及中心路程及時間。中心區界定為量測12.5×12.5cm之中心中之區域。
1.8高架十字迷宮測試
高架十字迷宮係由兩個閉合臂及兩個開放臂(高度，45cm；全臂長度，66cm；臂寬度，10cm；閉合臂之牆壁高度，30cm)構成。使用此測試來評價小鼠之焦慮樣行為。將小鼠置於中心臂交叉區(10×10cm)中且容許在迷宮中自由探索10min。在每次測試之後，利用70%乙醇清潔迷宮。藉由安裝在迷宮中心天花板上之攝像機記錄小鼠活動。稍後藉由EthoVision視訊跟蹤軟體(Noldus Information Technology,Wageningen,the Netherlands)分析所記錄之活動。量化總行進路程及在開放臂及閉合臂中停留之持續時間。
1.9強迫游泳測試
使用FST來評價小鼠之抑鬱症樣行為。簡言之，在第一天將小鼠置於含有15cm水(23℃-25℃)之透明丙烯酸圓筒(高度，30cm；內部直徑，10cm)中使其游泳6min。游泳之後，利用薄型紙使小鼠乾燥且使其返回至飼養籠。第二天，給予小鼠5min之第二游泳時段。藉由攝像機記錄游泳時段且藉由EthoVision視訊跟蹤軟體分析行為。量化第二時段期間之不動時間。
1.10血清皮質酮
首先將血清稀釋，且然後使用市售CORT EIA套組(Cayman Chemical,Michigan,MI,USA)分析皮質酮濃度。遵循製造商之說明書，使用套組中所提供之標準品對皮質酮濃度進行內插。
1.11統計分析
所有數據均表示為平均值±SEM或平均值±SD。在適當時利用龐費洛尼事後測試(Bonferroni’s post-test)或雙尾t測試藉由單向或雙向方差分析(ANOVA)分析各組之間的差異。
實例1 副乾酪乳桿菌PS23之基因分型
下表列示與PS23之16S rRNA序列及pheS DNA序列相比，其16S rRNA及pheS DNA序列顯示最高相似性值之彼等生物體。
Figure 108100458-A0305-02-0019-3
16S rRNA基因及pheS基因之比較指示PS23屬副乾酪乳桿菌副乾酪亞種。
藉由ERIC-PCR及(GTG)5-PCR分析之基因體指紋分析顯示PS23係副乾酪乳桿菌之新穎菌株(參見圖1)。
使用API 50 CHL套組(bioMerieux,France)研究PS23之糖利用。發酵測試指示PS23具有與副乾酪乳桿菌副乾酪亞種相似之生物化學性質。
Figure 108100458-A0305-02-0020-4
+，陽性；-，陰性；±，較弱。
實例2 PS23降低腸道出血
由於每天5% DSS持續7天可引起嚴重組織損害且導致腸道出血，因此在DSS處理組中之糞便中可能存在血液。為量測腸道發炎之嚴重程度，吾人自每一小鼠收集糞便以在第13天進行潛血分析。顏色較深之樣品評分較高。如圖2中所示，DSS組中之糞便潛血評分顯著高於對照組(p<0.0001)，此指示DSS挑戰後腸道出血增加。此由糞便及其肛門具有血液之觀察結果支持，指示所有經DSS處理之小鼠均患有輕度至重度之腸道發炎。長期投與熱殺死或活體PS23能夠降低出血，此乃因發現糞便潛血評分較低(圖2)。特定而言，活體PS23較其熱殺死形式更有效地降低出血，此乃因評分顯著低於DSS組(圖2；p<0.05)。
實例3 PS23降低DSS誘導之結腸縮短
DSS鼠類模型之特徵在於結腸長度縮短。吾人發現，DSS治療組中之平均長度顯著短於對照組(圖3A；p<0.0001)。然而，PS23組中之長度較長，尤其在活體組中，其顯著長於DSS組(圖3A；p<0.01)。另外，吾人發現，活體PS23組中之小鼠結腸中存在更多的固結糞便，此指示投與降低腹瀉。此外，組織學顯示PS23挽救結腸中DSS誘導之組織損害(圖3B)，如根據對腸細胞損失、隱窩發炎、嗜中性球、固有層、上皮增生及單核細胞之觀察結果所評估。
實例4 PS23降低結腸促發炎性細胞介素含量及MPO活性
在DSS-結腸炎模型中已報導DSS誘導之腸道發炎及結腸組織中TNF-α、IL-6及MPO活性之增加。吾人在DSS處理小鼠之結腸組織發現TNF-α、IL-6及MPO活性增加之類似結果(圖4)。另一方面，投與熱殺死及活體PS23二者均降低結腸組織中之所有細胞介素含量及MPO活性， 而兩組中TNF-α、IL-6及MPO活性之降低在統計學上達到與DSS組之顯著差異(圖4；p<0.05)。
實例5 PS23挽救MS誘導之焦慮樣行為及探索性活動
吾人向C57BL/6J小鼠施加MS且使用曠場測試(OFT)、高架十字迷宮(EPM)及強迫游泳測試(FST)來評價MS小鼠之行為。如圖5中所示，在開放空間中心區域中停留之時間及進入次數減少(圖5A及5B)，且在EPM開放臂中停留之時間百分比降低(圖5C)，此指示MS導致小鼠更加焦慮。另外，吾人亦發現站立頻率降低(圖5D)，此指示MS小鼠具有減少之探索性活動。此外，吾人發現MS不僅產生具有焦慮樣行為之小鼠，且亦產生具有抑鬱症樣行為之小鼠，如在FST中，不動時間增加(圖5E)。有趣的是，投與熱殺死及活體PS23二者持續4週挽救該等降低(圖5A-5E)，此指示PS23能夠逆轉由生命早期壓力誘導之異常表型。
實例6 PS23正規化MS誘導之發炎
吾人發現，MS將小鼠之免疫性轉向發炎增加，此乃因在MS組中血清TNF-α及IL-6較高，而抗發炎性細胞介素IL-10則低於對照(圖6)。另一方面，吾人發現長期投與PS23降低發炎(由血清TNF-α及IL-6減少所示)且增加IL-10含量(圖6)。由於過度活化之免疫反應增加發生身體及心理功能障礙之風險，因此吾人在MS小鼠中之發現可與先前DSS實驗中所示之PS23抗發炎效應相呼應且可部分地係PS23如何改善MS小鼠之焦慮樣及抑鬱症樣行為之基礎。
實例7 PS23正規化MS誘導之HPA軸功能障礙
與顯示MS破壞HPA軸之大多數先前研究一致，吾人發現在與非MS對照小鼠相比時，在基礎狀態及受壓狀態二者下CORT含量不 同，且HPA軸活性在基礎狀態下過度活化(圖7；p<0.01)。儘管如此，吾人發現，FST後30min出現減弱之CORT含量，且受壓對基礎CORT含量之比率顯著低於對照(圖7；p<0.0001)，此表明HPA軸受MS損害且在刺激時不能維持足夠之CORT含量。相比之下，MS組之熱殺死及活體PS23二者中之CORT含量挽救至接近對照含量(圖7)，此指示PS23能夠正規化失調之HPA軸。
實例8 PS23增加海馬體中之GR及BDNF蛋白質表現
GR係負責HPA軸中之反饋抑制之主要受體。為更詳細地研究MS及PS23對HPA軸之效應，吾人檢查海馬體GR蛋白含量。吾人發現MS小鼠中之GR表現降低(圖8)，此指示MS損害HPA軸之反饋迴路，此可係MS組中血清CORT含量升高之原因。另外，吾人發現，此區中BDNF蛋白含量降低(圖8)。海馬體中BDNF含量之改變與抑鬱症相關。有可能在生命早期期間，MS程序損害小鼠中之海馬體發育並導致BDNF含量不足，此二者均削弱壓力反應。相反，由於與MS組相比，GR及BDNF蛋白含量顯著增加(圖8；p<0.05)，因此長期投與熱殺死及活體PS23二者能夠逆轉該等含量之降低，且保護海馬體神經元免受壓力。
經口投與活體或熱殺死PS23增加海馬體中之多巴胺轉換率(圖9)。
實例9 衰老加速傾向小鼠8(SAMP8)小鼠模型中之抗衰老研究
實驗設計示於以下方案中。
Figure 108100458-A0305-02-0024-5
PS23預防且延遲神經退化。經口投與PS23增加衰老SAMP8小鼠之學習及記憶能力(圖10)。
經口投與PS23增加衰老SAMP8小鼠之運動活動(圖11)。
經口投與PS23增加衰老SAMP8小鼠之神經傳遞質(例如血清素及多巴胺)含量(圖12(A)及12(B))。
經口投與PS23增加衰老SAMP8小鼠之血清BDNF含量(圖13)。
經口投與PS23增加衰老SAMP8小鼠前額葉皮質及海馬體中之抗氧化酶(例如超氧化物歧化酶(SOD)及麩胱甘肽過氧化酶(GPx))之含量(圖14(A)及14(B))。
經口投與PS23延遲且預防衰老SAMP8小鼠之衰老有關之生理變化(圖15(A)至15(C))。
經口投與PS23增進衰老SAMP8小鼠之受衰老損害之吞噬作用活性(圖16)。
經口投與PS23藉由增加抗發炎性細胞介素IL-10、減少促發炎細胞介素TNF-α且減少發炎性趨化介素MCP-1來改善衰老SAMP8小鼠之全身發炎(圖17(A)至17(C))。
經口投與PS23增加衰老SAMP8小鼠脾細胞中之總T細胞及CD4+細胞群體(圖18)。
經口投與PS23增加由CoA刺激之衰老SAMP8小鼠脾細胞之IFN-γ產生且減少IL-5(圖19)。
經口投與PS23增加衰老SAMP8小鼠血清中之抗氧化酶(例如超氧化物歧化酶(SOD)及麩胱甘肽過氧化酶(GPx))之含量(圖20)。
經口投與PS23增加衰老SAMP8小鼠之肌肉質量及握力(圖21(A)及21(B))。
經口投與PS23增加衰老SAMP8小鼠比目魚肌之耗氧速率(圖22)。
經口投與PS23增加衰老SAMP8小鼠之肌肉粒線體合成有關之基因表現(圖23)。
經口投與PS23減少衰老SAMP8小鼠脛骨前肌中之發炎性細胞介素IL-6基因表現(圖24)。
經口投與PS23改善衰老SAMP8小鼠之腸道通透性且修復受衰老過程損害之腸道長度(圖25(A)及25(B))。
經口投與PS23減少衰老SAMP8小鼠腸液中之發炎性趨化介素MCP-1且增加分泌性IgA(圖26(A)及26(B))。
實例10 PS23預防且治療壓力有關病症
PS23預防且治療壓力有關病症。下文顯示藉由重複皮質酮注射誘導之抑鬱症模型之實驗設計。
雄性C57BL/6N小鼠，6至8週齡，n=10
Figure 108100458-A0305-02-0026-6
OFT：曠場測試 TST：尾懸吊測試 BS：采血樣FST：強迫游泳測試 SPT：蔗糖偏嗜度測試
經口投與活體或熱殺死PS23挽救CORT誘導之焦慮樣行為及探索性活動(圖27(A)至27(D))。
經口投與活體或熱殺死PS23挽救CORT誘導之抑鬱症樣行為(圖28(A)及28(B))。
經口投與活體或熱殺死PS23增加海馬體中之糖皮質激素受體(GR)、鹽皮質激素受體(MR)及BDNF蛋白質表現，且保護神經元免受壓力(圖29(A)至29(C))。
經口投與活體或熱殺死PS23增加CORT誘導之抑鬱症小鼠中「好」細菌(如乳桿菌屬及雙歧桿菌屬)之相對豐度，且減少「壞」細菌(如梭菌屬(Clostridium))之相對豐度。該等結果顯示經口投與PS23可調節腸道微生物區(圖30)。
經口投與PS23增加CORT誘導之抑鬱症小鼠腦中之血清素含量(圖31)。
PS23改善睡眠品質及效率。每天向六名健康人經口投與PS23(3×1010CFU/天)達一週。在第0天及第7天藉由匹茲堡睡眠品質指數(Pittsburgh Sleep Quality Index，PSQI)評價睡眠品質及效率。結果顯示經口投與PS23改善睡眠品質及睡眠效率(圖32(A)及32(B))。
生物材料寄存
國內寄存資訊[請依寄存機構、日期、號碼順序註記]
1.食品工業發展研究所；105年11月24日；BCRC 910755
國外寄存資訊[請依寄存國家、機構、日期、號碼順序註記]
1.德國；Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH(DSMZ)；2016年6月6日；DSM 32322

Claims (16)

  1. 一種經分離且經純化之乳酸菌，其為副乾酪乳桿菌(Lactobacillus paracasei)PS23，其於食品工業發展研究所之寄存編號為BCRC 910755。
  2. 一種組合物，其包含食品工業發展研究所寄存編號為BCRC 910755之細胞及可食用之載劑或醫藥上可接受之載劑。
  3. 如請求項2之組合物，其中該等食品工業發展研究所寄存編號為BCRC 910755之細胞可以全細菌之形式使用，該等細菌係活細胞或死細胞。
  4. 如請求項2之組合物，其係呈適於經口投與之形式。
  5. 如請求項4之組合物，其係呈固體、半固體、液體、粉末顆粒之形式。
  6. 一種如請求項1之乳酸菌之用途，其用於製造用於個體之以下目的之製劑：(i)預防或延遲免疫衰老、預防或延遲肌少症或增進腸道障壁或腸道免疫、預防或治療與免疫系統中之年齡相關性劣化及發炎衰老有關之慢性病症；(ii)增進免疫調節活性；(iii)減少、預防或治療過敏；(iv)減少、預防或治療發炎；(v)預防或治療與腸道發炎有關之慢性病症；(vi)預防或治 療壓力有關病症，其中該壓力有關病症係慢性腦發炎、腦血管意外、衰老及神經退化性疾病、焦慮樣行為、探索性活動、抑鬱症樣行為或正規化HPA軸功能障礙；及/或(vii)預防及/或治療情緒障礙或神經病狀或治療或預防與神經元之細胞凋亡或神經退化有關之疾病。
  7. 如請求項6之用途，其中該乳酸菌係預防或延遲免疫衰老、預防或延遲肌少症或增進腸道障壁或腸道免疫。
  8. 如請求項6之用途，其中該乳酸菌可預防或治療與免疫系統中之年齡相關性劣化及發炎衰老有關之慢性病症。
  9. 如請求項6之用途，其中該乳酸菌可預防或延遲肌少症。
  10. 如請求項6之用途，其中與神經元之細胞凋亡或神經退化有關之該疾病係選自由以下組成之群：中風、阿茲海默氏病(Alzheimer's disease)、亨廷頓氏病(Huntington's disease)、帕金森氏病(Parkinson's disease)、皮克氏病(Pick's disease)、庫賈氏病(Creutzfeldt-Jakob's disease)、帕金森-ALS-失智症候群、威爾森氏病(Wilson's disease)、多發性硬化、進行性核上性麻痺、神經病性疼痛有關之雙極性障礙、皮質基底核退化症、精神分裂症、注意力缺失過動病症(ADHD)、失智症、肌肉萎縮性脊髓側索硬化症、視網膜疾病、癲癇、中風、暫時性腦缺血發作、心肌缺血、肌肉缺血、由與長時間暫停至腦部之血流有關之手術技術引起之缺血、頭部損傷、脊髓損傷、缺氧及抑鬱症。
  11. 如請求項6之用途，其中該乳酸菌可增加學習能力、記憶力及運動活動。
  12. 如請求項6之用途，其中該乳酸菌可預防或治療慢性腦發炎、腦血管意外、衰老及神經退化性疾病、焦慮樣行為、探索性活動、抑鬱症樣行為或正規化HPA軸功能障礙。
  13. 如請求項12之用途，其中該乳酸菌可預防或治療慢性腦發炎、腦血管意外、衰老或神經退化性疾病。
  14. 如請求項6之用途，其中該乳酸菌可改善睡眠品質及效率。
  15. 如請求項6之用途，其中與腸道發炎有關之該慢性病症係發炎性腸病或發炎性腸症候群。
  16. 如請求項6之用途，其中以約1×107至約1×1013個細胞/天之熱殺死PS23細胞或約1×107至約1×1013CFU/天之該乳酸菌之活細胞範圍內之量投與如請求項1之乳酸菌。
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