ES2628350T3 - Compuestos antivíricos inhibidores de NS5A de HCV - Google Patents

Abstract

Un compuesto de fórmula:**Fórmula** o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

Description

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DESCRIPCION

Compuestos antivlricos inhibidores de NS5A de HCV Antecedentes

La hepatitis C esta reconocida como una enfermedad vlrica cronica del hlgado, que se caracteriza por enfermedad hepatica. Aunque los farmacos dirigidos al hlgado estan en amplio uso y han demostrado eficacia, la toxicidad y otros efectos secundarios han limitado su utilidad. Los inhibidores del virus de la hepatitis C (HCV) son utiles para limitar el establecimiento y la progresion de una infeccion por HCV, as! como en ensayos de diagnostico para el HCV.

Existe la necesidad de nuevos agentes terapeuticos contra el HCV. En particular, existe la necesidad de agentes terapeuticos contra el HCV que tengan amplia actividad contra los genotipos de HCV (por ejemplo, los genotipos 1a, 1b, 2a, 3a, 4a). Tambien existe una necesidad particular de agentes que sean menos susceptibles a resistencia vlrica. Se han descrito mutaciones de resistencia contra inhibidores para NS5A de HCV para los genotipos 1a y 1b en Antimicrobial Agents and Chemotherapy, septiembre de 2010, volumen 54, pag. 3641-3650.

Sumario

En una realizacion, la invencion proporciona un compuesto de formula:

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La presente divulgacion tambien proporciona una composicion farmaceutica que comprende un compuesto de la invencion o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo y al menos un vehlculo farmaceuticamente aceptable.

La presente divulgacion tambien proporciona una composicion farmaceutica para su uso en el tratamiento de la hepatitis C (HCV). En una realizacion, la composicion comprende al menos un agente terapeutico adicional para tratar el HCV. En una realizacion, el agente terapeutico se selecciona de ribavirina, un inhibidor de la proteasa NS3, un inhibidor nucleosldico o nucleotldico de la polimerasa NS5B de HCV, un inhibidor de la alfa-glucosidasa 1, un hepatoprotector, un inhibidor no nucleosldico de la polimerasa de HCV o combinaciones de los mismos. En una realizacion, la composicion comprende adicionalmente un inhibidor nucleosldico o nucleotldico de la polimerasa NS5B de HCV. En una realizacion, el inhibidor nucleosldico o nucleotldico de la polimerasa NS5B de HCV se selecciona de ribavirina, viramidina, levovirina, un L-nucleosido o isatoribina.

En una realizacion, se proporciona una composicion farmaceutica que comprende un compuesto como se describe en este documento y al menos un inhibidor nucleosldico o nucleotldico de la polimerasa NS5B de HCV y al menos un vehlculo farmaceuticamente aceptable. En una realizacion, la composicion comprende adicionalmente un interferon, un interferon pegilado, ribavirina o combinaciones de los mismos. En una realizacion, el inhibidor nucleosldico o nucleotldico de la polimerasa NS5B de HCV es sofosbuvir. En una realizacion, se proporciona una composicion farmaceutica que comprende un compuesto como se describe en este documento y al menos un inhibidor de la proteasa NS3 y al menos un vehlculo farmaceuticamente aceptable. En una realizacion, la composicion comprende adicionalmente sofosbuvir.

La presente divulgacion tambien proporciona una composicion farmaceutica que comprende adicionalmente un interferon o interferon pegilado.

La presente divulgacion tambien proporciona una composicion farmaceutica que comprende adicionalmente un analogo nucleosldico.

La presente divulgacion tambien proporciona una composicion farmaceutica en la que dicho analogo nucleosldico se selecciona de ribavirina, viramidina, levovirina, un L-nucleosido e isatoribina y dicho interferon es interferon-a o interferon-a pegilado.

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En otro aspecto, la divulgacion proporciona un compuesto de la invencion o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo, para su uso en el tratamiento profilactico o terapeutico de la hepatitis C o un trastorno asociado a la hepatitis C.

Descripcion detallada

Ahora se hara referencia en detalle a determinadas realizaciones de la divulgacion, cuyos ejemplos se ilustran en las estructuras y formulas adjuntas. Aunque la divulgacion se describira junto con las realizaciones enumeradas, se entendera que no esta previsto que la divulgacion se limite a esas realizaciones.

"Alquilo" es un hidrocarburo C1-C18 que contiene atomos de carbono normales, secundarios, terciarios o clclicos. Ejemplos son, metilo (Me, -CH3), etilo (Et, -CH2CH3), 1 -propilo (n-Pr, n-propilo, -CH2CH2CH3), 2-propilo (/-Pr, i- propilo, -CH(CH3)2), 1-butilo (n-Bu, n-butilo, -CH2CH2CH2CH3), 2-metil-1-propilo (i-Bu, i-butilo, -CH2CH(CH3)2), 2- butilo (s-Bu, s-butilo, -CH(CH3)CH2CH3), 2-metil-2-propilo (t-Bu, t-butilo, -C(CH3)3), 1 -pentilo (n-pentilo, - CH2CH2CH2CH2CH3), 2-pentilo (-CH(CH3)CH2CH2CH3), 3-pentilo (-CH(CH2CH3)2), 2-metil-2-butilo (-

C(CH3)2CH2CH3), 3-metil-2-butilo (-CH(CH3)CH(CH3)2), 3-metil-1-butilo (-CH2CH2CH(CH3)2), 2-metil-1-butilo (- CH2CH(CH3)CH2CH3), 1-hexilo (-CH2CH2CH2CH2CH2CH3), 2-hexilo (-CH(CH3)CH2CH2CH2CH3), 3-hexilo (- CH(CH2CH3)(CH2CH2CH3)), 2-metil-2-pentilo (-C(CHa)2CH2CH2CHa), 3-metil-2-pentilo (-CH(CH3)CH(CH3)CH2CH3), 4- metil-2-pentilo (-CH(CH3)CH2CH(CH3)2), 3-metil-3-pentilo (-C(CH3)(CH2CH3)2), 2-metil-3-pentilo (-

CH(CH2CH3)CH(CH3)2), 2,3-dimetil-2-butilo (-C(CH3)2CH(CH3)2), 3,3-dimetil-2-butilo (-CH(CH3)C(CH3)3 y

ciclopropilmetilo

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"Arilo" se refiere a un radical hidrocarburo aromatico monovalente de 6-20 atomos de carbono obtenido por la retirada de un atomo de hidrogeno de un solo atomo de carbono de un sistema de anillo aromatico precursor. Los grupos arilo tlpicos incluyen, pero sin limitacion, radicales obtenidos a partir de benceno, benceno sustituido, naftaleno, antraceno, bifenilo y similares.

El termino "amino," como se usa en el presente documento, se refiere a -NH2.

El termino "quiral" se refiere a moleculas que tienen la propiedad de no superposicion del companero de imagen especular, mientras que el termino "aquiral" se refiere a moleculas que pueden superponerse sobre sus companeros de imagen especular.

El termino "estereoisomeros" se refiere a compuestos que tienen una constitucion qulmica identica, pero se diferencian con respecto a la disposicion de los atomos o grupos en el espacio.

"Diastereomero" se refiere a un estereoisomero con dos o mas centros de quiralidad y cuyas moleculas no son imagenes especulares entre si. Los diastereomeros tienen propiedades flsicas diferentes, por ejemplo, puntos de fusion, puntos de ebullicion, propiedades espectrales y reactividades. Las mezclas de diastereoisomeros pueden separarse en procedimientos anallticos de alta resolucion, tal como, por ejemplo, electroforesis y cromatografla.

"Enantiomeros" se refiere a estereoisomeros de un compuesto que no son imagenes especulares superponibles entre si.

El termino "tratamiento" o "tratar", en la medida en que se relaciona con una enfermedad o afeccion incluye prevenir la aparicion de la enfermedad o afeccion, inhibir la enfermedad o afeccion, eliminar la enfermedad o afeccion y/o aliviar uno o mas slntomas de la enfermedad o afeccion.

Las definiciones estereoqulmicas y convenciones usadas en el presente documento siguen generalmente S. P. Parker, Ed., McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms (1984) McGraw-Hill Book Company, Nueva York; y Eliel, E. and Wilen, S., Stereochemistry of Organic Compounds (1994) John Wiley & Sons, Inc., Nueva York. Muchos de los compuestos organicos existen en formas opticamente activas, es dec/r, tienen la capacidad de rotar el plano de la luz polarizada. En la descripcion de un compuesto opticamente activo, los prefijos (D y L) o (R y S) se usan para indicar la configuracion absoluta de la molecula en torno a su centro o centros quirales. Los prefijos d y 1 o (+) y (-) se emplean para designar el sentido de rotacion del plano de luz polarizada por el compuesto, significando (-) o 1 que el compuesto es levogiro. Un compuesto con el prefijo (+) o d es dextrogiro. Para una estructura qulmica dada, estos estereoisomeros son identicos excepto porque son imagenes especulares entre si. Un estereoisomero especlfico tambien puede denominarse enantiomero y una mezcla de tales isomeros se denomina a menudo, mezcla enantiomerica. Una mezcla 50:50 de enantiomeros se denomina como una mezcla racemica o racemato, que puede aparecer cuando no ha habido estereoseleccion ni estereoespecificidad en un proceso o reaccion

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qulmica. Las expresiones "mezcla racemica" y "racemato" se refieren a una mezcla equimolar de dos especies enantiomericas, sin actividad optica. La divulgacion incluye todos los estereoisomeros de los compuestos descritos en el presente documento.

Profarmacos

El termino "profarmaco" como se usa en el presente documento se refiere a cualquier compuesto que cuando se administra a un sistema biologico genera un compuesto de la descripcion que inhibe la actividad del HCV ("el compuesto inhibidor activo"). El compuesto puede formarse a partir del profarmaco como un resultado de: (i) reaccion o reacciones qulmicas espontaneas, (ii) reaccion o reacciones qulmicas catalizadas con enzima, (iii) fotolisis, y/o (iv) reaccion o reacciones qulmicas metabolicas.

"Resto profarmaco" se refiere a un grupo funcional labil que se separa del compuesto inhibidor activo durante el metabolismo, sistematicamente, dentro de una celula, por hidrolisis, escision enzimatica o por algun otro proceso (Bundgaard, Hans, "Design and Application of Prodrugs" en A Textbook of Drug Design and Development (1991), P. Krogsgaard-Larsen and H. Bundgaard, Eds. Harwood Academic Publishers, pags. 113-191). Las enzimas que son capaces de un mecanismo de activacion enzimatica con los compuestos profarmacos de la divulgacion incluyen, pero sin limitacion, amidasas, esterasas, enzimas microbianas, fosfolipasas, colinasterasas y fosfasas. Los restos profarmaco pueden servir para aumentar la solubilidad, absorcion y lipofilicidad para optimizar la liberacion, biodisponibilidad y eficacia del farmaco. Un resto de profarmaco puede incluir un metabolito activo o el propio farmaco.

Los restos de profarmacos a modo de ejemplo incluyen los esteres de aciloximetilo hidrollticamente sensibles o labiles -CH2OC(=O)R99 y carbonatos de aciloximetilo -CH2OC(=O)OR99 en los que R99 es alquilo C1-C6, alquilo C1-C6 sustituido, arilo C6-C20 o arilo C6-C20 sustituido. El ester de aciloxialquilo se uso por primera vez como una estrategia de profarmaco para acidos carboxllicos y despues se aplico a fosfatos y fosfonatos por Farquhar et al. (1983) J. Pharm. Sci. 72: 324; tambien por las Patentes de Estados Unidos n.° 4816570, 4968788, 5663159 y 5792756. Posteriormente, el ester de aciloxialquilo se uso para suministrar acidos fosfonicos a traves de las membranas celulares y para aumentar la biodisponibilidad oral. Una variante proxima del ester aciloxialqullico, el ester de alcoxicarboniloxialquilo (carbonato), puede tambien aumentar la biodisponibilidad oral como un resto de profarmaco en los compuestos de las combinaciones de la divulgacion. Un ester de aciloximetilo a modo de ejemplo es pivaloiloximatoxi, (POM)-CH2OC(=O)C(CH3)3. Un resto de profarmaco de carbonato de aciloximetilo a modo de ejemplo es pivaloiloximetilcarbonato (pOc) -CH2OC(=O)OC(Ch3)3,

Grupos Protectores

En el contexto de la presente divulgacion, los grupos protectores incluyen restos profarmacos y grupos protectores qulmicos.

"Grupo protector" se refiere a un resto de un compuesto que enmascara o altera las propiedades de un grupo funcional o las propiedades del compuesto en su conjunto. Los grupos protectores qulmicos y las estrategias para la proteccion/desproteccion son bien conocidos en la tecnica. Vease, por ejemplo, Protective Groups in Organic Chemistry, Theodora W. Greene, John Wiley & Sons, Inc., Nueva York, 1991. Los grupos protectores se utilizan a menudo para enmascarar la reactividad de ciertos grupos funcionales, para ayudar en la eficacia de las reacciones qulmicas deseadas, por ejemplo, la fabricacion y la ruptura de enlaces qulmicos de una manera ordenada y planificada. La proteccion de grupos funcionales de un compuesto altera otras propiedades flsicas ademas de la reactividad del grupo funcional protegido, tal como, por ejemplo, la polaridad, lipofilicidad (hidrofobicidad) y otras propiedades que pueden medirse mediante herramientas anallticas comunes. Los productos intermedios protegidos qulmicamente pueden ser biologicamente activos o inactivos.

Los compuestos protegidos tambien pueden presentar alteraciones, y en algunos casos, propiedades optimizadas in vitro e in vivo, tal como, por ejemplo, paso a traves de las membranas celulares y resistencia a la degradacion o secuestro enzimatico. En este papel, los compuestos protegidos con efectos terapeuticos pretendidos pueden denominarse profarmacos. Otra funcion de un grupo protector es convertir el farmaco precursor en un profarmaco, por lo que el farmaco precursor se libera tras la conversion del profarmaco in vivo. Debido a que los profarmacos activos pueden absorberse mas eficazmente que el farmaco precursor, los profarmacos pueden poseer una mayor potencia in vivo que el farmaco precursor. Los grupos protectores se retiran, ya sea in vitro, en el caso de los intermedios qulmicos, o in vivo, en el caso de los profarmacos. Con los intermedios qulmicos, no es particularmente importante que los productos resultantes despues de la desproteccion, por ejemplo, alcoholes, sean fisiologicamente aceptables, aunque en general es mas deseable si los productos son farmacologicamente inocuos.

Los grupos protectores estan disponibles, son comunmente conocidos se usan opcionalmente para prevenir reacciones secundarias con el grupo protegido durante procedimientos sinteticos, es decir, rutas o metodos para preparar los compuestos de la divulgacion. En su mayor parte, la decision de que grupos proteger, cuando hacerlo y la naturaleza del grupo protector qulmico "PG" dependera de la qulmica de la reaccion a proteger contra (por ejemplo, condiciones acidas, basicas, oxidativas, reductoras u otras) y la direccion deseada de la slntesis. Los PG

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no necesitan ser, y generalmente no son, iguales si el compuesto esta sustituido con multiples PG. En general, se usara un PG para proteger grupos funcionales, tales como, por ejemplo, carboxilo, hidroxilo, tio o grupos amino y por tanto previene reacciones secundarias o por otra parte facilitan la eficacia sintetica. El orden de desproteccion para producir grupos desprotegidos libres depende de la direccion pretendida de la slntesis y las condiciones de reaccion que se produzcan y puede ocurrir en cualquier orden determinada por el experto.

Pueden protegerse varios grupos funcionales de los compuestos de la divulgacion. Por ejemplo, los grupos protectores para los grupos -OH (ya sean hidroxilo, acido carboxllico, acido fosfonico u otras funciones) incluyen "grupos formadores de eter o ester". Los grupos formadores de eter o ester son capaces de funcionar como grupos protectores qulmicos en los esquemas sinteticos expuestos en el presente documento. Sin embargo, algunos grupos protectores de hidroxilo y tio no son grupos formadores de eter ni de ester, como comprenderan los expertos en la materia, y se incluyen con amidas, se discuten mas adelante.

Un muy gran numero de grupos protectores de hidroxilo y grupos formadores de amida, y sus correspondientes reacciones de escision qulmica, se describe en Protective Groups in Organic Synthesis, Theodora W. Greene (John Wiley & Sons, Inc., Nueva York, 1991, ISBN 0-471-62301-6) ("Greene"). Vease tambien Kocienski, Philip J.; Protecting Groups (Georg Thieme Verlag Stuttgart, Nueva York, 1994). En particular Capltulo 1, Protecting Groups: An Overview, paginas 1-20, Capltulo 2, Hidroxil Protecting Groups, paginas 21-94, Capltulo 3, Diol Protecting Groups, paginas 95-117, Capltulo 4, Carboxil Protecting Groups, paginas 118-154, Capltulo 5, Carbonil Protecting Groups, paginas 155-184. Para grupos protectores para acido carboxllico, acido fosfonico, fosfonato, acido sulfonico y otros grupos protectores para acidos vease Greene como se expone mas adelante.

Estereoisom eros

Los compuestos de la divulgacion pueden tener centros quirales, por ejemplo, atomos de carbono o fosforo quirales. Los compuestos de la divulgacion incluyen, por lo tanto, todos los estereoisomeros, que incluyen enantiomeros, diastereomeros y atropisomeros. Ademas, los compuestos de la divulgacion incluyen isomeros opticos enriquecidos o resueltos en cualquiera o todos los atomos aquirales, asimetricos. En otras palabras, los centros quirales aparentes de las representaciones se proporcionan como las mezclas no racemicas o racemicas. Ambas mezclas racemicas y diastereomericas, as! como los isomeros opticos individuales aislados o sintetizados, sustancialmente libre de sus socios enantiomericos o diastereomericos, estan todos dentro del alcance de la divulgacion. Las mezclas racemicas se separan en sus isomeros individuales sustancialmente opticamente puros a traves de tecnicas bien conocidas, tales como, por ejemplo, la separacion de las sales diasteromericas formadas con aditivos opticamente activos, por ejemplo, acidos o bases, seguido de la conversion de nuevo a las sustancias opticamente activas. En la mayorla de los casos, el isomero optico deseado se sintetiza por medio de reacciones estereoespeclficas, comenzando con el estereoisomero apropiado del material de partida deseado o a traves de reacciones enantioselectivas.

Los compuestos de la divulgacion tambien pueden existir como isomeros tautomericos en determinados casos. Aunque solo puede representarse un tautomeoro, todas estas formas estan contempladas dentro del alcance de la divulgacion. Por ejemplo, pueden existir tautomeros de ene-amina para purina, pirimidina, imidazol, guanidina, amidina y sistemas de tetrazol, y todas sus posibles formas tautomericas estan dentro del alcance de la divulgacion.

Sales e Hidratos

Los ejemplos de sales fisiologica o farmaceuticamente aceptables de los compuestos de la divulgacion incluyen sales procedentes de una base apropiada, tal como, por ejemplo, un metal alcalino (por ejemplo, sodio), un metal alcalino terreo (por ejemplo, magnesio), amonio y NX4+ (en la que X es alquilo C1-C4). Las sales fisiologicamente aceptables de un atomo de hidrogeno o un grupo amino incluyen sales de acidos carboxllicos organicos, tales como, por ejemplo, acidos acetico, benzoico, lactico, fumarico, tartarico, maleico, malonico, malico, isetionico, lactobionoco y succlnico; acidos sulfonicos organicos, tal como, por ejemplo, acidos metanosulfonico, etanosulfonico, bencenosulfonico y p-toluenosulfonico; y acidos inorganicos, tal como, por ejemplo, acidos clorhldrico, sulfurico, fosforico y sulfamico. Las sales fisiologicamente aceptables de un compuesto de un grupo hidroxi incluyen el anion de dicho compuesto en combinacion con un cation adecuado tal como, por ejemplo, Na+ y NX4+ (en la que X se selecciona independientemente entre H o un grupo alquilo C1-C4).

Para uso terapeutico, las sales de ingredientes activos de los compuestos de la descripcion seran normalmente fisiologicamente aceptables, es decir seran sales obtenidas a partir de un acido o base fisiologicamente aceptable. Sin embargo, las sales de acidos o bases que no sean fisiologicamente aceptables tambien pueden encontrar uso, por ejemplo, en la preparacion o purificacion de un compuesto fisiologicamente aceptable. Todas las sales, se obtengan o no de un acido o base fisiologicamente aceptable, estan dentro del alcance de la presente divulgacion.

Las sales de metales se preparan normalmente haciendo reaccionar el hidroxido metalico con un compuesto de la presente divulgacion. Los ejemplos de sales metalicas que se preparan de este modo son sales que contienen Li+, Na+ y K+. Puede precipitarse una sal metalica menos soluble de la solucion de una sal mas soluble mediante la adicion del compuesto metalico adecuado.

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Ademas, pueden formarse sales a partir de la adicion de acido de determinados acidos organicos e inorganicos, por ejemplo, HCl, HBr, H2SO4, H3PO4 o acidos sulfonicos organicos, a centros basicos, normalmente aminas, o a grupos acidos. Finalmente, debe entenderse que las composiciones de la presente memoria comprenden compuestos de la divulgacion invencion en su forma no ionizada, as! como la forma zwitterionica, y combinaciones con cantidades estequiometricas de agua como en hidratos.

Tambien se incluyen dentro del ambito de esta divulgacion las sales de los compuestos parentales con uno o mas aminoacidos. Cualquiera de los aminoacidos naturales o no naturales son adecuados, especialmente los aminoacidos de origen natural hallados como componentes de las protelnas, aunque el aminoacido es normalmente uno que porte una cadena lateral con un grupo basico o acido, por ejemplo, lisina, arginina o acido glutamico, o un grupo neutral tal como, por ejemplo, glicina, serina, treonina, alanina, isoleucina o leucina.

Metodos de inhibicion de HCV

En este documento se describen metodos de inhibicion de la actividad de HCV, que comprenden la etapa de tratar una muestra sospechosa de contener HCV con un compuesto o composicion de la divulgacion.

La etapa de tratamiento comprende anadir el compuesto de la divulgacion a la muestra o comprende anadir un precursor de la composicion a la muestra. La etapa de adicion comprende cualquier metodo de administracion como se describe anteriormente.

Si se desea, la actividad del HCV despues de la aplicacion del compuesto puede observarse por cualquier metodo, incluyendo metodos directos e indirectos de deteccion de la actividad del HCV. Estan previstos todos los metodos cuantitativos, cualitativos y semicuantitativos de determinacion de la actividad del HCV. Normalmente, se aplica uno de los metodos de exploracion descritos anteriormente, sin embargo, cualquier otro metodo tal como, por ejemplo, la observacion de las propiedades fisiologicas de un organismo vivo, tambien es aplicable.

Muchos organismos contienen el HCV. Los compuestos de esta divulgacion son utiles en el tratamiento o profilaxis de afecciones asociadas con activacion del HCV en animales o en seres humanos.

Sin embargo, al explorar compuestos capaces de inhibir la actividad de HCV se debe tener en cuenta que los resultados de los ensayos enzimaticos puede que no siempre se correlacionen con los ensayos de cultivo celular. De este modo, un ensayo basado en celulas normalmente debe ser la herramienta principal de exploracion.

Formulaciones farmaceuticas

Los compuestos de esta divulgacion se formulan con portadores y excipientes convencionales, que se seleccionaran de acuerdo con la practica habitual. Los comprimidos contendran excipientes, emolientes, cargas, aglutinantes y similares. Las formulaciones acuosas se preparan en forma esteril, y cuando estan destinadas para su administracion por otra administracion que no sea la oral, generalmente seran isotonicas. Todas las formulaciones contendran opcionalmente excipientes, tales como, por ejemplo, las mostradas en el Handbook of Pharmaceutical Excipients (1986). Los excipientes incluyen acido ascorbico y otros antioxidantes, agentes quelantes, tales como, por ejemplo, EDTA, carbohidratos, tales como, por ejemplo, dextrina, hidroxialquilcelulosa, hidroxialquilmetilcelulosa, acido estearico y similares. El pH de las formulaciones oscila desde alrededor de 3 hasta alrededor de 11, pero habitualmente es de alrededor de 7 a 10. Normalmente, el compuesto se administrara en una dosis de 0,01 miligramos a 2 gramos. En una realization, la dosis sera de aproximadamente 10 miligramos a 450 miligramos. Se contempla que el compuesto puede administrarse una vez, dos veces o tres veces al dla.

En algunas realizaciones, el compuesto se administra durante aproximadamente 12 semanas o menos. En realizaciones adicionales, el compuesto se administra durante aproximadamente 12 semanas o menos, aproximadamente 8 semanas o menos, aproximadamente 8 semanas o menos, aproximadamente 6 semanas o menos, o aproximadamente 4 semanas o menos. El compuesto puede administrarse una vez al dla, dos veces al dla, una vez cada dos dlas, dos veces a la semana, tres veces a la semana, cuatro veces a la semana o cinco veces a la semana.

En realizaciones adicionales, se logra una respuesta virologica sostenida a aproximadamente 12 semanas, a aproximadamente 8 semanas, a aproximadamente 6 semanas, o a aproximadamente 4 semanas, o a aproximadamente 4 meses, o a aproximadamente 5 meses, o a aproximadamente 6 meses, o a aproximadamente 1 ano, o a aproximadamente 2 anos.

Aunque es posible que los principios activos se administren solos, puede ser preferible presentarlos como formulaciones farmaceuticas. Las formulaciones, para su uso tanto humano como veterinario, de la divulgacion comprenden al menos un principio activo, como se ha definido anteriormente, junto con uno o mas portadores aceptables y por lo tanto, opcionalmente otros ingredientes terapeuticos. El portador o portadores tiene/n que ser "aceptables" en el sentido de ser compatibles con los otros ingredientes de la formulation y fisiologicamente inocuos para el receptor de los mismos.

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Las formulaciones incluyen aquellas adecuadas para las rutas de administracion precedentes. Las formulaciones pueden presentarse convenientemente en forma de dosificacion unitaria y se pueden preparar por cualquiera de los metodos bien conocidos en la materia farmaceutica. Las tecnicas y formulaciones se encuentran en general en Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Co., Easton, PA). Tales metodos incluyen la etapa de asociar el principio activo con el portador que constituye uno o mas ingredientes auxiliares. Por lo general, las formulaciones se preparan asociando de forma uniforme y estrecha el principio activo con portadores llquidos o portadores solidos finamente divididos o ambos, y despues, en caso necesario, moldeando el producto.

Las formulaciones de la presente divulgacion, adecuadas para administracion oral, pueden presentarse como unidades discretas tales como, por ejemplo, capsulas, obleas o comprimidos, que contienen cada uno de ellos una cantidad predeterminada del principio activo; como polvo o granulos; como una solucion o suspension en un llquido acuoso o no acuoso; o como una emulsion llquida de aceite en agua o una emulsion llquida de agua en aceite. El principio activo tambien puede administrarse como un bolo, un electuario o una pasta.

Un comprimido se fabrica mediante compresion o moldeado, opcionalmente con uno o mas ingredientes accesorios. Los comprimidos prensados pueden prepararse prensando en una maquina adecuada el principio activo en una forma suelta, tal como, por ejemplo, polvo o granulos, mezclados de forma opcional con un aglutinante, lubricante, diluyente inerte, conservante, tensioactivo o dispersante. Los comprimidos moldeados pueden prepararse moldeando en una maquina adecuada una mezcla del principio activo en polvo humedecida con un diluyente llquido inerte. Los comprimidos pueden revestirse o marcarse y, de forma opcional, se formulan de forma que se proporcione una liberacion lenta o controlada del principio activo de estos.

Para la administracion al ojo u otros tejidos externos, por ejemplo, boca y piel, las formulaciones se aplican preferentemente como pomada o crema topica que contiene el o los principios activos en una cantidad de, por ejemplo, del 0,075 al 20 % p/p (que incluyen el o los principios activos) en un intervalo entre el 0,1 % y el 20 % en incrementos de 0,1 % p/p, tales como, por ejemplo, 0,6 % p/p, 0,7 % p/p, etc.), preferentemente del 0,2 al 15 % p/p y lo mas preferentemente del 0,5 al 10 % p/p. Cuando se formulan en una pomada, los principios activos pueden emplearse con una base de pomada paraflnica o miscible en agua. Como alternativa, los principios activos pueden formularse en una crema con una base de crema de aceite en agua.

Si se desea, la fase acuosa de la base de la crema puede incluir, por ejemplo, al menos un 30% p/p de un alcohol polihldrico, es decir un alcohol que tiene dos o mas grupos hidroxilo, tales como, por ejemplo, propilenglicol, butano 1,3-diol, manitol, sorbitol, glicerol y polietilenglicol (incluyendo PEG 400) y mezclas de los mismos. Las formulaciones topicas pueden incluir de manera deseable un compuesto que potencia la absorcion o la penetracion del principio activo a traves de la piel o de otras zonas afectadas. Los ejemplos de dichos potenciadores de la penetracion cutanea incluyen dimetilsulfoxido y analogos relacionados.

La fase oleosa de las emulsiones de la presente divulgacion puede estar constituida a partir de ingredientes conocidos de una manera conocida, Aunque la fase puede comprender simplemente un emulsionante (conocido tambien como emulgente), comprende de forma deseable una mezcla de al menos un emulsionante con una grasa o un aceite o con tanto una grasa como un aceite. Preferentemente, se incluye un emulsionante hidrofilo junto con un emulsionante lipofilo que actua como estabilizante. Tambien se prefiere incluir tanto un aceite como una grasa. Juntos, el emulsionante o emulsionantes con o sin el estabilizador o estabilizadores constituyen la denominada cera emulsionante y la cera junto con el aceite y la grasa forman la denominada base de unguento emulsionante que forma la fase oleosa dispersa de las formulaciones de crema.

Los emulgentes y estabilizantes de la emulsion para su uso en la formulacion de la divulgacion incluyen Tween® 60, Span® 80, alcohol de cetostearilo, alcohol bencllico, alcohol miristllico, monoestearato de glicerilo y laurilsulfato de sodio.

La eleccion de los aceites o grasas adecuados para la formulacion se basa en lograr las propiedades cosmeticas deseadas. La crema deberla ser preferentemente un producto no graso, que no manche y lavable, con la consistencia adecuada para evitar la filtracion desde tubos u otros contenedores. Pueden usarse esteres de alquilo de cadena lineal o ramificada, alquilesteres mono o dibasicos, tales como, por ejemplo, di-isoadipato, estearato de isocetilo, propilenglicol diester de acidos grasos de coco, miristato de isopropilo, oleato de decilo, palmitato de isopropilo, estearato de butilo, palmitato de 2-etilhexilo o una mezcla de esteres de cadena ramificada conocida como Crodamol CAP, siendo los tres ultimos los esteres preferidos. Estos pueden usarse solos o en combination dependiendo de las propiedades requeridas. Como alternativa, llpidos de alto punto de fusion, tales como, por ejemplo, parafina blanca blanda y/o parafina llquida u otros aceites minerales.

Las formulaciones farmaceuticas de acuerdo con la presente description comprenden uno o mas compuestos de la description junto con uno o mas portadores o excipientes farmaceuticamente aceptables y opcionalmente otros agentes terapeuticos. Las formulaciones farmaceuticas que contienen el principio activo pueden estar en cualquier forma adecuada para el metodo de administracion planeado. Cuando se usan para uso oral, por ejemplo, pueden prepararse comprimidos, trociscos, pastillas para chupar, suspensiones acuosas u oleosas, polvos o granulos dispersables, emulsiones, capsulas duras o blandas, jarabes o elixires. Las composiciones destinadas a uso oral

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pueden prepararse de acuerdo con cualquier metodo conocido en la tecnica para la fabricacion de composiciones farmaceuticas, y dichas composiciones pueden contener uno o mas agentes que incluyen agentes edulcorantes, agentes saborizantes, agentes colorantes y agentes conservantes, con el fin de proporcionar una preparation sabrosa. Son aceptables los comprimidos que contienen el principio activo mezclado con excipiente atoxico farmaceuticamente aceptable, que son adecuados para la fabricacion de comprimidos. Estos excipientes pueden ser, por ejemplo, diluyentes inertes, tal como, por ejemplo, carbonato calcico o sodico, lactosa, lactosa monohidrato, croscarmelosa sodica, povidona, fosfato calcico o sodico; agentes granulantes y disgregantes, tal como, por ejemplo, almidon de malz o acido alglnico; agentes aglutinantes, tal como, por ejemplo, celulosa, celulosa microcristalina, almidon, gelatina o goma arabiga; y agentes lubricantes, tal como, por ejemplo, estearato de magnesio, acido estearico o talco. Los comprimidos pueden estar sin recubrir o pueden estar recubiertos mediante tecnicas conocidas que incluyen la microencapsulacion para retrasar la desintegracion y la adsorcion en el tracto gastrointestinal y proporcionar de esta forma una action sostenida durante un periodo mas largo. Por ejemplo, puede emplearse un material con retraso de tiempo, tal como, por ejemplo, monoestearato de glicerilo o diestearato de glicerilo solo o con una cera.

Las formulaciones para uso oral tambien pueden presentarse como capsulas de gelatina dura, donde el principio activo se mezcla con un diluyente solido inerte, por ejemplo, fosfato calcico o caolina, o como capsulas de gelatina blanda, en las que el principio activo se mezcla con agua o un medio oleoso, tal como, por ejemplo, aceite de cacahuete, parafina llquida o aceite de oliva.

Las suspensiones acuosas de la divulgation contienen el material activo en premezcla con los excipientes adecuados para la fabricacion de suspensiones acuosas. Tales excipientes incluyen un agente de suspension, tal como, por ejemplo, carboximetilcelulosa sodica, metilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, alginato de sodio, polivinilpirrolidona, goma tragacanto y goma acacia, y agentes dispersantes o humectantes tales como, por ejemplo, un fosfatido natural (por ejemplo, lecitina), un producto de condensation de un oxido de alquileno con un acido graso (por ejemplo, estearato de polioxietileno), un producto de condensacion de oxido de etileno con un alcohol alifatico de cadena larga (por ejemplo, heptadecaetilenoxicetanol), un producto de condensacion de oxido de etileno con un ester parcial derivado de un acido graso y un hexitol anhidro (por ejemplo, monooleato de polioxietilensorbitano). La suspension acuosa tambien pueden contener uno o mas conservantes, tales como, por ejemplo, p-hidroxi-benzoato de etilo o n-propilo, uno o mas agentes colorantes, uno o mas agentes saborizantes y uno o mas agentes edulcorantes, tal como, por ejemplo, sacarosa o sacarina.

Las suspensiones oleosas pueden formularse suspendiendo al principio activo en un aceite vegetal, tal como, por ejemplo, aceite de cacahuete, aceite de oliva, aceite de sesamo o aceite de coco, o en un aceite mineral tal como, por ejemplo, parafina llquida. Las suspensiones orales pueden contener un agente espesante, tal como, por ejemplo, cera de abeja, parafina dura o alcohol cetllico. agentes edulcorantes, tal como, por ejemplo, los mostrados anteriormente y agentes saborizantes para proporcionar una preparacion oral mas sabrosa. Estas composiciones pueden conservarse mediante la adicion de un antioxidante tal como, por ejemplo, acido ascorbico.

Los polvos y granulos dispersables de la divulgacion, adecuados para la preparacion de una suspension acuosa mediante la adicion de agua proporcionan el principio activo mezclado con un agente dispersante o humectante, un agente de suspension y uno o mas conservantes. Los agentes dispersantes o humectantes adecuados y los agentes de suspension se ilustran mediante los desvelados anteriormente. Tambien pueden estar presentes excipientes adicionales, por ejemplo, agentes edulcorantes, saborizantes y colorantes.

Las composiciones farmaceuticas de la divulgacion tambien pueden estar en forma de emulsiones de aceite en agua. La fase oleosa puede ser un aceite vegetal, tal como, por ejemplo, aceite de oliva o aceite de cacahuete, un aceite mineral, tal como, por ejemplo, parafina llquida o una mezcla de estos. Los agentes emulsionantes adecuados incluyen gomas presentes de forma natural, tal como, por ejemplo, goma arabiga y goma de tragacanto, fosfatidas de origen natural, tal como, por ejemplo, lecitina de haba de soja, esteres o esteres parciales derivados de acidos grasos y anhldridos de hexitol, tal como, por ejemplo, monooleato de sorbitano y productos de condensacion de estos esteres parciales con oxido de etileno, tal como, por ejemplo, monooleato de polioxietilensorbitano. La emulsion tambien puede contener agentes edulcorantes y saborizantes. Los jarabes y elixires pueden formularse con agentes edulcorantes, tal como, por ejemplo, glicerol, sorbitol o sacarosa. Tales formulaciones tambien pueden contener un emoliente, un agente conservante, saborizante o colorante.

Las composiciones farmaceuticas de la divulgacion pueden estar en forma de una preparacion inyectable esteril, tal como, por ejemplo, una suspension acuosa u oleaginosa inyectable esteril. Esta suspension puede formularse de acuerdo con la tecnica conocida usando los agentes dispersantes o humectantes adecuados y los agentes de suspension que se han mencionado anteriormente. La preparacion inyectable esteril puede ser tambien una solution o suspension inyectable esteril en un diluyente o disolvente atoxico parenteralmente aceptable, tal como, por ejemplo, una solucion en 1,3-butanodiol o prepararse como polvo liofilizado. Entre los vehlculos y disolventes aceptables que pueden emplearse estan agua, solucion de Ringer y solucion de cloruro de sodio isotonica. Ademas, pueden emplearse de manera convencional aceites no volatiles esteriles como disolvente o medio de suspension. Para este fin, puede emplearse cualquier aceite suave no volatil, incluyendo mono o digliceridos sinteticos. Ademas, pueden usarse igualmente, por ejemplo, acidos grasos, tales como, acido oleico, en la preparacion de inyectables.

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La cantidad de principio activo que puede combinarse con el material de portador para producir una forma de dosificacion unitaria variara dependiendo del hospedador tratado y del modo de administracion particular. Por ejemplo, una formulacion de liberation temporal prevista para la administracion oral a seres humanos puede contener aproximadamente 1 a 1000 mg de material activo compuesto con una cantidad adecuada y conveniente de material de portador que puede variar desde aproximadamente 5 hasta aproximadamente 95 % de las composiciones totales (peso:peso). La composition farmaceutica puede prepararse para proporcionar cantidades facilmente medibles para su administracion. Por ejemplo, una solution acuosa prevista para la infusion intravenosa puede contener desde aproximadamente 3 a 500 pg del principio activo por mililitro de solucion a fin de que se pueda producir la infusion de un volumen adecuado a una velocidad de aproximadamente 30 ml/h.

Las formulaciones adecuadas para administracion sobre el ojo, incluyen gotas oculares, en las que el principio activo se disuelve o suspende en un portador adecuado, en especial un disolvente acuoso para el principio activo. El principio activo esta presente preferentemente en dichas formulaciones en una concentration de 0,5 a 20 % p/p, ventajosamente del 0,5 al 10 %, particularmente aproximadamente el 1,5 % p/p.

Las formulaciones adecuadas para administracion topica en la boca incluyen pastillas para chupar que comprenden al principio activo en una base aromatizada, normalmente sacarosa y acacia o tragacanto; pastillas que comprenden el principio activo en una base inerte, tal como, por ejemplo, gelatina y glicerina o sacarosa y goma arabiga; y colutorios que comprenden el principio activo en un portador llquido adecuado.

Las formulaciones para administracion rectal pueden presentarse como un supositorio con una base adecuada que comprende por ejemplo manteca de cacao o un salicilato.

Las formulaciones adecuadas para administracion intrapulmonar o nasal tienen un tamano de partlcula por ejemplo en el intervalo de 0,1 a 500 micrometres (incluyendo tamanos de partlcula en un intervalo entre 0,1 y 500 micrometres en incrementos de micrometres, tales como, por ejemplo, 0,5, 1,30 micrometres, 35 micrometres, etc.), que se administra por inhalation rapida a traves del conducto nasal o mediante inhalation a traves de la boca, de forma que alcance los sacos alveolares. Las formulaciones adecuadas incluyen soluciones acuosas u oleosas del principio activo. Las formulaciones adecuadas para la administracion de aerosol o de polvo seco pueden prepararse de acuerdo con metodos convencionales y pueden administrarse con otros agentes terapeuticos tales como, por ejemplo, Compuestos hasta ahora utilizados en el tratamiento o profilaxis de afecciones asociadas con la actividad de HCV.

Las formulaciones adecuadas para administracion vaginal se pueden presentar como pesarios, tampones, cremas, geles, pastas, espumas o formulaciones en pulverization que contienen, ademas del principio activo, los portadores que en la tecnica se sabe que son apropiados.

Las formulaciones adecuadas para administracion parenteral incluyen soluciones para inyeccion esteriles acuosas y no acusas que pueden contener antioxidantes, tampones, bacteriostaticos y solutos que hacen a la formulacion isotonica con la sangre del receptor previsto; y suspensiones esteriles acuosas y no acuosas que pueden incluir agentes suspensores y agentes espesantes.

Las formulaciones se presentan en envases de dosis individual o de multidosis, por ejemplo, ampollas selladas y viales, y pueden almacenarse en estado criodesecado (liofilizado) que requiere unicamente la adicion del portador llquido esteril, por ejemplo agua para inyeccion, inmediatamente antes de su uso. Las soluciones y suspensiones extemporaneas para inyeccion se preparan a partir de polvos esteriles, granulos y comprimidos del tipo descrito anteriormente. Las formulaciones en dosis individual preferidas son las que contienen una dosis diaria o una subdosis diaria, como se cita en el presente documento anteriormente, o una fraccion apropiada de las misma, del principio activo.

Debe entenderse que ademas de los ingredientes mencionados concretamente con anterioridad, las formulaciones de esta divulgation pueden incluir otros agentes que, en la tecnica, se relacionan convencionalmente con el tipo de formulacion en cuestion, por ejemplo, los adecuados para la administracion oral pueden incluir agentes saborizantes.

La divulgacion proporciona ademas composiciones veterinarias que comprenden al menos un principio activo como se ha definido anteriormente junto con un portador, debido a ello.

Los portadores veterinarios son materiales utiles para el fin de administrar la composicion y pueden ser materiales solidos, llquidos o gaseosos que, por otra parte, son inertes o aceptables en la tecnica veterinaria y son compatibles con el principio activo. Estas composiciones veterinarias pueden administrarse por via oral, parenteral o mediante cualquier otra via deseada.

Los compuestos de la divulgacion tambien pueden formularse para proporcionar una liberacion controlada del principio activo para permitir una dosificacion menos frecuente o para mejorar el perfil farmacocinetico o de toxicidad del principio activo. En consecuencia, la divulgacion tambien proporciona composiciones que comprenden uno o mas compuestos de la description formulada para liberacion sostenida o controlada.

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La dosis eficaz de un principio activo depende al menos de la naturaleza de la afeccion que se esta tratando, la toxicidad, de si los compuestos estan o no usandose de forma profilactica (dosis menores), el metodo de administracion y la formulacion farmaceutica, y sera determinado por el cllnico usando estudios convencionales de escalado de dosis.

Vfas de administracion

Se puede administrar uno o mas compuestos de la divulgacion (mencionados en este documento como ingredientes activos) por cualquier via apropiada para la afeccion a tratar. Las vlas adecuadas incluyen la oral, rectal, nasal, topica (incluyendo bucal y sublingual), vaginal y parenteral (incluyendo subcutanea, intramuscular, intravenosa, intradermica, intratecal y epidural) y similares. Se apreciara que la via de administracion preferida puede variar, por ejemplo, con la afeccion del destinatario. Una ventaja de los compuestos de esta divulgacion es que estan biodisponibles por via oral y se pueden dosificar por via oral.

Terapia de combinacion contra el HCV

En otra realizacion, los ejemplos no limitantes de combinaciones adecuadas incluyen combinaciones de uno o mas compuestos de la invention con uno o mas interferones, ribavirina o sus analogos, inhibidores de la proteasa NS3 de HCV, inhibidores de la alfa-glucosidasa 1, hepatoprotectores, inhibidores nucleosldicos o nucleotldicos de la polimerasa NS5B de HCV, inhibidores no nucleosldicos de la polimerasa NS5B de HCV, inhibidores de NS5A de HCV, agonistas de TLR-7, inhibidores de ciclofilina, inhibidores de IRES de HCV, potenciadores de la farmacocinetica y otros farmacos o agentes terapeuticos para tratar el HCV.

Mas especlficamente, se puede combinar uno o mas compuestos de la invencion con uno o mas compuestos seleccionados del grupo que consiste en

1) interferones, por ejemplo, rIFN-alfa 2b pegilado (PEG-Intron®), rIFN-alfa 2a pegilado (Pegasys®), rIFN-alfa 2b (Intron® A), rIFN-alfa 2a (Roferon®-A), interferon alfa (MOR-22, OPC-18, Alfaferone®, Alfanative®, Multiferon®, subalina), interferon alfacon-1 (Infergen®), interferon alfa-n1 (Wellferon), interferon alfa-n3 (Alferon®), interferon beta (Avonex®, DL-8234), interferon-omega (omega DUROS®, Biomed® 510), albinterferon alfa-2b (Albuferon®), IFN alfa-2b XL, BLX-883 (Locteron®), DA-3021, interferon alfa-2b glucosilado (AVI-005), PEG- Infergen, interferon lambda-1 PEGilado (iL-29 PEGilada) y Belerofon®;

2) ribavirina y sus analogos, por ejemplo, ribavirina (Rebetol®, Copegus®) y taribavirina (Viramidine®);

3) inhibidores de la proteasa NS3 de HCV, por ejemplo, boceprevir (SCH-503034, SCH-7), telaprevir (VX-950), TMC435350, BI-1335, BI-1230, MK-7009, VBY-376, VX-500, GS-9256, GS-9451, BMS-605339, PHX-1766, AS- 101, YH-5258, YH5530, YH5531, ABT-450, ACH-1625, ITMN-191, AT26893, MK5172, MK6325 y MK2748;

4) inhibidores de la alfa-glucosidasa 1, por ejemplo, celgosivir (MX-3253), Miglitol y UT-231B;

5) hepatoprotectores, por ejemplo, emericasan (IDN-6556), ME-3738, GS-9450 (LB-84451), silibilina y MitoQ;

6) inhibidores nucleosldicos o nucleotldicos de la polimerasa NS5B de HCV, por ejemplo, R1626, R7128 (R4048), IDX184, IDX-102, BCX-4678, valopicitabina (NM-283), MK-0608, sofosbuvir (GS-7977 (antiguamente PSI-7977)), VLX-135 (antiguamente ALS-2200) y INX-189 (ahora BMS986094);

7) inhibidores no nucleosldicos de la polimerasa NS5B de HCV, por ejemplo, PF-868554, VCH-759, VCH-916, JTK-652, MK-3281, GS-9190, VBY-708, VCH-222, A848837, ANA-598, GL60667, GL59728, A-63890, A-48773, A-48547, BC-2329, VCH-796 (nesbuvir), GSK625433, BILN-1941, XTL-2125, ABT-072, ABT-333, GS-9669, PSI- 7792 y GS-9190;

8) inhibidores de NS5A de HCV, por ejemplo, AZD-2836 (A-831), BMS-790052, ACH-3102, ACH-2928, MK8325, MK4882, MK8742, PSI-461, IDX719, GS-5885 y A-689;

9) agonistas de TLR-7, por ejemplo, imiquimod, 852A, GS-9524, ANA-773, ANA-975 (isatoribina), AZD-8848 (DSP-3025) y SM-360320;

10) inhibidores de ciclofilina, por ejemplo, DEBIO-025, SCY-635 y NIM811;

11) inhibidores de IRES de HCV, por ejemplo, MCI-067;

12) potenciadores de la farmacocinetica, por ejemplo, BAS-100, SPI-452, PF-4194477, TMC-41629, GS-9350 (cobicistat), GS-9585 y roxitromicina; y

13) otros farmacos para tratar el HCV, por ejemplo, timosina alfa 1 (Zadaxin), nitazoxanida (Alinea, NTZ), BIVN-

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401 (virostat), PYN-17 (altirex), KPE02003002, actilon (CPG-10101), GS-9525, KRN-7000, civacir, GI-5005, XTL- 6865, BIT225, PTX-111, ITX2865, TT-033i, ANA 971, NOV-205, tarvacina, EHC-18, VGX-410C, EMZ-702, AVI 4065, BMS-650032, BMS-791325, Bavituximab, MDX-1106 (ONO-4538), Oglufanida y VX-497 (merimepodib).

En otra realizacion mas, la presente solicitud describe composiciones farmaceuticas que comprenden un compuesto como se describe en este documento o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo, en combinacion con al menos un agente terapeutico adicional y un vehlculo o excipiente farmaceuticamente aceptable.

En otra realizacion, se proporciona una composicion farmaceutica que comprende un compuesto de la invencion y sofosbuvir y/o GS-5885 y opcionalmente un interferon o ribavirina.

En otra realizacion, se proporciona una composicion farmaceutica que comprende un compuesto de la invencion y un inhibidor nucleosldico o nucleotldico de la polimerasa NS5B de hCv y opcionalmente un interferon o ribavirina.

Se contempla que se administraran agentes terapeuticos adicionales de una manera que es conocida en la tecnica y que la dosificacion puede seleccionarse por los expertos en la materia. Por ejemplo, se pueden administrar agentes terapeuticos adicionales en una dosis de aproximadamente 0,01 miligramos a aproximadamente 2 gramos al dla.

Metabolitos de los compuestos

Los productos metabolicos in vivo de los compuestos pueden producirse, por ejemplo, por la oxidacion, reduccion, hidrolisis, amidacion, esterificacion y similares del compuesto administrado, principalmente debido a procesos enzimaticos. Dichos productos normalmente se identifican preparando un compuesto radiomarcado (por ejemplo, C14 o H3) de la divulgacion, administrandolo por via parenteral en una dosis detectable (por ejemplo, mayor de aproximadamente 0,5 mg/kg) a un animal tal como, por ejemplo, rata, raton, cobaya, mono o a un ser humano, dejando tiempo suficiente para que se produzca el metabolismo (normalmente de aproximadamente 30 segundos a 30 horas) y aislando sus productos de conversion de la orina, la sangre u otras muestras biologicas. Estos productos se alslan con facilidad ya que estan marcados (otros se alslan por el uso de anticuerpos capaces de unirse a epltopos, que sobreviven en el metabolito). Las estructuras del metabolito se determinan de forma convencional, por ejemplo, por analisis de EM o RMN. En general, el analisis de los metabolitos se realiza de la misma forma que en los estudios de metabolismo de farmacos convencionales bien conocidos para los expertos en la materia. Los productos de conversion, siempre que no se encuentren de otra forma in vivo, son utiles en ensayos de diagnostico para la dosificacion terapeutica de los compuestos de la divulgacion, incluso si no tienen actividad inhibidora de HCV por si mismos.

Se conocen metodos para determinar la estabilidad de los compuestos en secreciones gastrointestinales equivalentes.

Metodos a modo de ejemplo de preparacion de los compuestos

Las composiciones se preparan por cualquiera de las tecnicas aplicables de slntesis organica. Muchas de dichas tecnicas son bien conocidas en la tecnica. Sin embargo, muchas de las tecnicas conocidas estan detalladas en Compendium of Organic Synthetic Methods (John Wiley & Sons, Nueva York), Vol. 1, Ian T. Harrison y Shuyen Garrison, 1971; Vol. 2, Ian T. Harrison y Shuyen Harrison, 1974; Vol. 3, Louis S. Hegedus y Leroy Wade, 1977; Vol. 4, Leroy G. Wade, Jr., 1980; Vol. 5, Leroy G. Wade, Jr., 1984; y Vol. 6, Michael B. Smith; as! como March, J., Advanced Organic Chemistry, tercera edicion, (John Wiley & Sons, Nueva York, 1985), Comprehensive Organic Synthesis. Selectivity, Strategy & Efficiency in Modern Organic Chemistry. En 9 volumenes, Barry M. Trost, director de redaccion (Pergamon Press, Nueva York, impresion de 1993). Otros metodos adecuados para preparar los compuestos de la divulgacion se describen en la publicacion de solicitud de patente internacional numero WO 2006/020276.

Se proporcionan varios metodos a modo de ejemplo para la preparacion de las composiciones de la divulgacion en los esquemas y los ejemplos a continuacion. Estos metodos pretenden ilustrar la naturaleza de dichas preparaciones y no pretenden limitar el alcance de los metodos aplicables.

En general, las condiciones de reaccion, tales como, por ejemplo, la temperatura, el tiempo de reaccion, los disolventes, los procedimientos de pretratamiento y similares, seran los habituales en la tecnica para la reaccion particular a realizar. El material de referencia citado, junto con el material citado en el mismo, contiene descripciones detalladas de dichas condiciones. Normalmente las temperaturas seran de -100 °C a 200 °C, los disolventes seran aproticos o proticos y los tiempos de reaccion seran de 10 segundos a 10 dlas. El pretratamiento normalmente consiste en inactivar cualquier reactivo sin reaccionar seguido de reparto entre un sistema de capa acuosa/organica (extraccion) y separar la capa que contiene el producto.

Las reacciones de oxidacion y reduccion se llevan a cabo normalmente a temperaturas cercanas a la temperatura ambiente (aproximadamente 20 °C), aunque para reducciones de hidruros metalicos con frecuencia la temperatura se reduce a 0 °C a -100 °C, los disolventes son normalmente aproticos para las reducciones y pueden ser proticos o

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aproticos para las oxidaciones. Los tiempos de reaccion se ajustan para conseguir las conversiones deseadas.

Las reacciones de condensacion se llevan a cabo normalmente a temperaturas cercanas a la temperatura ambiente, aunque para no equilibrar, las condensaciones controladas cineticamente tambien son comunes temperaturas reducidas (0 °C a -100 °C). Los disolventes pueden ser proticos (comunes en reacciones de equilibrio) o aproticos (comunes en reacciones cineticamente controladas).

Las tecnicas sinteticas estandar tales como, por ejemplo, la retirada azeotropica de subproductos de reaccion y el uso de condiciones de reaccion anhidras (por ejemplo, entornos de gas inerte) son comunes en la tecnica y se aplicaran cuando sea aplicable.

Los terminos "tratado", "tratando", "tratamiento", y similares, cuando se usa en conexion con una operation sintetica qulmica, significa poner en contacto, mezclar, reaccionar, permitir reaccionar, poner en contacto, y otros terminos comunes en la tecnica para indicar que una o mas entidades qulmicas son tratadas de tal manera que se convierten a una o mas de otras entidades qulmicas. Esto significa que "tratar el compuesto uno con el compuesto dos" es sinonimo de "permitir que el compuesto uno reaccione con el compuesto dos", "poner en contacto el compuesto uno con el compuesto dos", "hacer reaccionar el compuesto uno con el compuesto dos", y otras expresiones comunes en la tecnica de slntesis organica para indicar razonablemente que el compuesto uno fue "tratado", "se hizo reaccionar", "se dejo reaccionar", etc., con el compuesto dos. Por ejemplo, el tratamiento indica la manera razonable y usual en la que se permite que los compuestos qulmicos organicos reaccionen. Las concentraciones normales (de 0,01 M a 10 M, normalmente 0,1 M a 1 M), las temperaturas (-100 °C a 250 °C, normalmente de -78 °C a 150 °C, mas normalmente de -78 °C a 100 °C, todavla mas normalmente de 0 °C a 100 °C), los recipientes de reaccion (normalmente vidrio, plastico, metal), disolventes, presiones, atmosferas (normalmente aire para reacciones de oxlgeno e insensibles al agua o nitrogeno o argon para oxlgeno o sensibles al agua), etc. a menos que se indique lo contrario. El conocimiento de reacciones similares conocidas en la tecnica de slntesis organica se usa para seleccionar las condiciones y el aparato para "tratar" en un proceso dado. En particular, un experto en la materia de slntesis organica selecciona las condiciones y el aparato razonablemente esperados para llevar a cabo con exito las reacciones qulmicas de los procedimientos descritos basandose en el conocimiento en la tecnica.

Las modificaciones de cada uno de los esquemas a modo de ejemplo y en los Ejemplos (en lo sucesivo "esquemas a modo de ejemplo") conducen a producir diversos analogos de los materiales a modo de ejemplo especlficos. Las citaciones citadas anteriormente que describen metodos adecuados de slntesis organica son aplicables a tales modificaciones.

En cada uno de los esquemas a modo de ejemplo puede ser ventajoso separar productos de reaccion unos de otros y/o de los materiales de partida. Los productos deseados de cada etapa o serie de etapas se separan y/o purifican (en lo sucesivo separan) al grado deseado de homogeneidad mediante las tecnicas comunes en la materia. Normalmente, tales separaciones implican extraction multifase, cristalizacion en un disolvente o mezcla de disolventes, destilacion, sublimation o cromatografla. La cromatografla puede implicar diversos metodos incluyendo, por ejemplo: fase inversa o fase normal; exclusion por tamano; intercambio ionico; aparatos y metodos de cromatografla llquida de alta, media y baja presion; analltica a pequena escala; lecho de movimiento simulado (SMB) y cromatografla preparativa de capa fina o espesa, as! como tecnicas de cromatografla de capa fina y ultrarrapida a pequena escala.

Otras clase de metodos de preparation implican el tratamiento de una mezcla con un reactivo seleccionado para unirse a, o producir de otro modo, un producto deseado separable, material de partida sin reaccionar, reaccion por producto o similares. Tales reactivos incluyen adsorbentes o absorbentes, tales como, por ejemplo, carbono activado, tamices moleculares, medios de intercambio ionico o similares. Como alternativa, los reactivos pueden ser acidos en el caso de un material basico, bases en el caso de un material acido, reactivos de union, tales como, por ejemplo, anticuerpos, protelnas de union, quelantes selectivos, tales como, por ejemplo, eteres de corona, reactivos de extraccion ionica llquido/llquido (LIX) o similares.

La selection de los metodos de separation adecuados depende de la naturaleza de los materiales implicados. Por ejemplo, punto de ebullition y peso molecular en destilacion y sublimacion, presencia o ausencia de grupos funcionales polares en cromatografla, estabilidad de materiales en medios acidos y basicos en extraccion multifase y similares. Un experto en la materia aplicara tecnicas con mas posibilidades de lograr la separacion deseada.

Un estereoisomero individual, por ejemplo, un enantiomero, sustancialmente libre de su estereoisomero puede obtenerse por resolution de la mezcla racemica usando un metodo, tal como, por ejemplo, formation de diastereomeros usando agentes de resolucion opticamente activos (Stereochemistry of Carbon Compounds, (1962) de E. L. Eliel, McGraw Hill; Lochmuller, C. H., (1975) J. Chromatogr., 113, 3) 283-302). Pueden separarse mezclas racemicas de compuestos quirales de la divulgation y aislarse por cualquier metodo adecuado, que incluye: (1) formacion de sales diastereomericas ionicas con compuestos quirales y separacion por cristalizacion fraccionada u otros metodos, (2) formacion de compuestos diastereomericos con reactivos de derivatizacion quiral, separacion de los diastereoisomeros y conversion a los estereoisomeros puros, y (3) separacion de los estereoisomeros sustancialmente puros o enriquecidos directamente en condiciones quirales.

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Bajo el metodo (1), pueden formarse sales diastereomericas por reaccion de bases quirales enantiomericamente puras, tales como, por ejemplo, brucina, quinina, efedrina, estricnina, a-metil-p-feniletilamina (anfetamina) y similares, con compuestos asimetricos que portan funcionalidad acida, tal como, por ejemplo, acido carboxllico y acido sulfonico. Puede inducirse la separacion de las sales diastereomericas por cristalizacion fraccionada o cromatografla ionica. Para la separacion de los isomeros opticos de compuestos amino, la adicion de acidos carboxllicos o sulfonicos quirales, tal como, por ejemplo, acido alcanforsulfonico, acido tartarico, acido mandelico o acido lactico puede resultar en la formacion de sales diastereomericas.

Como alternativa, por el metodo (2), el sustrato que debe resolverse se hace reaccionar con un enantiomero de un compuesto quiral para formar un par diastereomerico (Eliel, E. y Wilen, S. (1994) Stereochemistry of Organic Compounds, John Wiley & Sons, Inc., pag. 322). Pueden formarse compuestos diastereomericos haciendo reaccionar compuestos asimetricos con reactivos derivatizantes enantiomericamente puros, tal como, por ejemplo, derivados de metilo, seguido por la separacion de los diastereomeros y la hidrolisis para producir el sustrato enantiomericamente enriquecido libre. Un metodo para determinar la pureza optica implica hacer esteres quirales, tal como, por ejemplo, un ester mentllico, por ejemplo, (-) cloroformiato de mentilo en presencia de una base ester de Mosher, acetato de a-metoxi-a-(trifluorometil)fenilo (Jacob III. (1982) J. Org. Chem. 47:4165), de la mezcla racemica, y analizar el espectro de RMN para determinar la presencia de dos diastereomeros atropisomericos. Pueden separarse y aislarse diastereomeros estables de compuestos atropisomericos por cromatografla de fase normal y de fase inversa, siguiendo metodos para la separacion de naftil-isoquinolinas atropisomericas (Hoye, t., WO 96/15111). Por el metodo (3), una mezcla racemica de dos enantiomeros puede separarse por cromatografla usando una fase estacionaria quiral (Chiral Liquid Chromatography (1989) W. J. Lough, Ed. Chapman and Hall, Nueva York; Okamoto, (1990) J. of Chromatogr. 513:375-378). Pueden distinguirse enantiomeros enriquecidos o purificados por metodos usados para distinguir otras moleculas quirales con atomos de carbono asimetricos, tal como, por ejemplo, rotacion optica y dicrolsmo circular.

Esquemas y Ejemplos

Los aspectos generales de estos metodos a modo de ejemplo se describen a continuacion y en los Ejemplos. Cada uno de los productos de los siguientes procesos esta opcionalmente separado, aislado y/o purificado antes de su uso en procesos posteriores.

Se proporcionan en el presente documento varios metodos a modo de ejemplo para la preparacion de compuestos de la divulgacion, por ejemplo, en los Ejemplos a continuacion. Estos metodos pretenden ilustrar la naturaleza de tales preparaciones y no pretenden limitar el alcance de los metodos aplicables. Ciertos compuestos de la descripcion se pueden usar como intermedios para la preparacion de otros compuestos de la divulgacion. En los metodos a modo de ejemplo descritos en el presente documento, el fragmento E- V- tambien puede escribirse como R9-. PG representa un grupo protector comun para el grupo funcional dado al que esta unido. La instalacion y la retirada del grupo protector puede llevarse a cabo usando tecnicas estandar, tales como, por ejemplo, las descritas en Wuts, P. G. M., Greene, T. Protective Groups in Organic Synthesis, 4a ed.; John Wiley & Sons, Inc.: Hoboken, Nueva Jersey, 2007.

Esquema 1. Slntesis representativa de E-V-C(=0)-P-W-P-C(=0)-V-E

imagen3

El Esquema 1 muestra una slntesis general de una molecula E-V-C(=O)-P-W-P-C(=O)-V-E de la invencion en la que, para los propositos ilustrativos, E es metoxicarbonilamino. El tratamiento, ya sea el 1a o el 1c con uno o dos equivalentes respectivamente de cloroformiato de metilo en condiciones basicas (por ejemplo, hidroxido sodico) proporciona la molecula 1b o 1d.

imagen4

5 El Esquema 2 muestra una sintesis general de una molecula E-V-C(=O)-P-W-P-C(=O)-V-E de la invencion en la que, para los propositos ilustrativos, P es pirrolidina. El acoplamiento de la amina 2a con el acido 2b se lleva a cabo utilizando un reactivo de acoplamiento peptldico (por ejemplo HATU) para proporcionar 2c. Como alternativa, la amina 2d se acopla con dos equivalentes de 2b en condiciones similares para proporcionar 2e.

10

imagen5

5 El Esquema 6 muestra una sfntesis general de un intermedio R1-V-C(=O)-P-R2 en el que, para los propositos ilustrativos, P es pirrolidina, R1 es un grupo generico que se representa como E o un grupo protector de amino, y R2 es un grupo generico que se representa como -W-P-C(=O)-V-E, - W-P-C(=O)-V-NH-PG, -W-P-NH-PG o -W-NH-PG. El acoplamiento de la amina 6a (o 6d, 6h, 6k) con el acido 6b o 6e se consiguio usando un reactivo de acoplamiento de peptido (por ejemplo, HATU) para proporcionar 6c (o 6f, 6g, 6i, 6j, 6l, 6m) respectivamente.

10

5

imagen6

El Esquema 7 muestra una sfntesis general de un intermedio E-V-C(=O)-R1 en el que, para los propositos ilustrativos, E es metoxicarbonilamino y R1 es un grupo generico que se representa como -P-W-P-C(=O)-V-NH-PG, - P-W-P-PG, -P- W-PG, -P-PG o -O-PG. El tratamiento de 7a (o 7c, 7e, 7g, 7i) con cloroformiato de metilo en condiciones basicas (por ejemplo, hidroxido sodico) proporciona la molecula 7b (o 7d, 7f, 7h, 7j).

Esquema 9. Sfntesis representativa de R1-P-R2

imagen7

El Esquema 9 muestra una slntesis general de un intermedio R1-P-R2 en el que, para los propositos ilustrativos, R1 es -C(=O)-V-E o un grupo protector y R2 es benzamidazol sustituido. La formation del benzoimidazol se consigue por acoplamiento del acido 9b o 9e con una arilamina 9a, usando un reactivo de acoplamiento de peptido, tal como HATU, para proporcionar 9c o 9d. La ciclacion de la amida en presencia de un acido (tal como acido acetico) 5 proporciona la molecula que contiene bencimidazol 9d o 9g.

La formacion de bencimidazoles multiples se realiza de la misma manera, comenzando con una bis-diamina para proporcionar el correspondiente bis-benzamidazol.

10 Esquema 17 Slntesis representativa de R1-P-W-P-R2

imagen8

El Esquema 20 muestra una slntesis general de un intermedio R1-P-W-P-R2 de la invention, en el que, para los propositos ilustrativos, R1 y R2 son grupos protectores independientes y W es una unidad de dos anillos aromaticos

15 construida mediante una ciclacion mediada por un metal de transition. La alquilacion de fenol 20b con un bromuro de alquilo, tal como 20a, proporciona el eter 20c. La ciclacion de los anillos aromaticos en presencia de un catalizador de paladio proporciona el compuesto 20d. El tratamiento de 20d con CuBr2 proporciona la a-halocetona 20e, que proporciona 20f tras la adicion de un acido en condiciones basicas (por ejemplo, Et3N). La reaction de 20f con una amina o sal de amina (por ejemplo, acetato amonico) proporciona la molecula 20 g que contiene imidazol.

20 La oxidation de 20 g, 20i, o 201 puede realizarse por el calentamiento en presencia de MnO2 para proporcionar 20h, 20j, o 20m, respectivamente. La conversion de 20 g o 20h con un catalizador de paladio, tal como Pd2dba3 y X- Phos, y una fuente de boro, tal como bis(pinacolato)diboro proporciona el ester boronico 20i o 20j. El ester boronico

10

15

ester se acopla con un socio de acoplamiento apropiado (por ejemplo, 20k) usando un catalizador de paladio, tal como Pd(PPh3)4 o PdCl2(dppf), para proporcionar 20l o 20m. Para cada reaccion de acoplamiento cruzado mediada por metal de transicion, las funciones del nucleofilo y del electrofilo pueden invertirse para proporcionar el mismo producto de acoplamiento. Otros acoplamientos cruzados mediados por metales de transicion que permiten la construccion de W, pero emplean acoplamientos y reactivos alternativos, incluyen, pero no se limitan a, los acoplamientos Negishi, Kumada, Stille y Ullman. Para la preparacion de dos anillos aromaticos que contienen grupos W, este esquema general puede aplicarse mediante la eleccion apropiada de los reactivos de partida.

Esquema 18 Sfntesis representativa de R1-P-W-P-R2

imagen9

El Esquema 21 muestra una sfntesis general de un intermedio R1-P-W-P-R2 de la invencion, en el que, para los propositos ilustrativos, R1 y R2 son grupos protectores independientes y W es una unidad de dos anillos aromaticos construida mediante una ciclacion mediada por un metal de transicion. El tratamiento de 20d con un reactivo de vinilo activado (por ejemplo, trifluoroborato potasico) en presencia de un catalizador de paladio (por ejemplo, acetato de paladio y S-Phos) proporciona el compuesto vinflico 21a. La conversion a la a-halo cetona correspondiente puede realizarse por bromacion con N-bromosuccinimida, seguido de oxidacion con MnO2. El desplazamiento de la a-halo cetona se produce mediante la adicion de un acido en condiciones basicas (por ejemplo, Et3N). La bromacion de 21d prosigue tras el tratamiento con tribromuro de piridinio y se sigue la adicion de un segundo acido en condiciones basicas para proporcionar el diester 21e. La reaccion de 21e con una amina o sal de amina (por ejemplo, acetato amonico) proporciona la molecula 21 f que contiene imidazol. La oxidacion de 21f puede realizarse en presencia de MnO2 para proporcionar 21g.

imagen10

El Esquema 22 muestra una slntesis general de un intermedio E-V-C(=O)-P-W-P-R de la invencion en el que, para 5 los propositos ilustrativos, R es un grupo protector y W es una unidad de dos anillos aromaticos. El desplazamiento de la a-halo cetona 21b se produce mediante la adicion de un acido en condiciones basicas (por ejemplo, Et3N). La bromacion de 22b prosigue tras el tratamiento con tribromuro de piridinio y se sigue la adicion de un segundo acido en condiciones basicas para proporcionar el diester 22c. La reaccion de 22c con una amina o sal de amina (por ejemplo, acetato amonico) proporciona la molecula 22d que contiene imidazol. La oxidacion de 22d puede realizarse 10 en presencia de MnO2 para proporcionar 22e.

imagen11

5

10

El Esquema 23 muestra una sfntesis general de un intermedio E-V-C(=O)-P-W-P-R de la invencion en el que, para los propositos ilustrativos, R es un grupo protector y W es una unidad de dos anillos aromaticos. El desplazamiento de la a-halo cetona 21d se produce mediante la adicion de un acido en condiciones basicas (por ejemplo, Et3N). La reaccion de 23a con una amina o sal de amina (por ejemplo, acetato amonico) proporciona la molecula 23b que contiene imidazol. La oxidacion de 23b puede realizarse en presencia de MnO2 para proporcionar 23c.

Esquema 25. Sfntesis representativa de E-V-C(=0)-P-W-P-C(=0)-V-E

imagen12

El Esquema 25 muestra una sfntesis general de una molecula E-V-C(=O)-P-W-P-C(=O)-V-E de la invencion en la 15 que, para los propositos ilustrativos, E es etilcarbonilamino. El tratamiento, ya sea el 25a o el 25c con uno o dos equivalentes respectivamente de cloruro de propionilo en condiciones basicas (por ejemplo, hidroxido sodico) proporciona la molecula 25b o 25d.

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5 El Esquema 26 muestra una slntesis general de un E-V-C(=O)-P-R y de una molecula R1-P-R de la invencion, en la

que, para los propositos ilustrativos, R es un haloimidazol. El tratamiento del aldehldo 26a con glioxal, en presencia de hidroxido de amonio proporciona el imidazol 26b. El tratamiento con N-bromosuccinamida o yodo proporciona el correspondiente haloimidazol 26c y 26d respectivamente. La separation del compuesto bis-halogenado correspondiente se puede conseguir por cromatografla HPLC preparativa. La conversion del bis-haloimidazol en el

10 mono-haloimidazol tambien puede realizarse por calentamiento en presencia de sulfito sodico. Puede llevarse a

cabo una funcionalizacion adicional del grupo P tras elimination del grupo protector y acoplamiento con un acido apropiado (E-V-C(=O)-OH).

imagen14

El Esquema 27 muestra una slntesis general alternativa de un intermedio R1-P-W-P-R2 de la invencion, en el que, 5 para los propositos ilustrativos, R1 y R2 son grupos protectores independientes y W es una unidad de dos anillos aromaticos construida mediante una ciclacion mediada por un metal de transicion. La bromacion de 21b con un agente de bromacion (es decir, tribromuro de piridinio) proporciona el dibromuro 27a. El desplazamiento del bromuro primario procede entonces por la adicion de un acido en condiciones basicas (por ejemplo, K2CO3) para proporcionar 21d. La conversion a 21f o 21g puede realizarse siguiendo los metodos descritos en el Esquema 2l.

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imagen15

El Esquema 28 muestra una sintesis general alternativa de un intermedio E-V-C(=O)-P-W-P-R de la invencion en el 5 que, para los propositos ilustrativos, R es un grupo protector y W es una unidad de dos anillos aromaticos. La bromacion de 21b con un agente de bromacion (es decir, tribromuro de piridinio) proporciona el dibromuro 27a. El desplazamiento del bromuro primario procede entonces por la adicion de un acido en condiciones basicas (por ejemplo, K2CO3) para proporcionar 22d. La conversion a 22d o 22e puede realizarse siguiendo los metodos descritos en el Esquema 22.

10

Realizacion especifica

En una realizacion, se proporciona un compuesto de la formula:

15

o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo.

La divulgacion se ilustrara ahora por los siguientes Ejemplos no limitantes. Las abreviaturas siguientes se usan a 20 traves de toda la memoria descriptiva, que incluye los Ejemplos.

imagen16

(ac.)

Acuoso

(g)

Gas

(s)

Solido

°C

Grado Celsius

Ac

Acetato

ACN

Acetonitrilo

aprox.

Aproximado

Bis-pinB/(Bpin)2/(pinB)2

Bis(pinacolato)diboro

BOC/Boc

ferc-Butoxicarbonilo

calc.

Calculado

CC50

Concentracion de citotoxicidad al 50 %

COMU

hexafluorofosfato de 1-[(1-(ciano-2-etoxi-2- oxoetilidenoaminooxi)dimetilaminomorfolino)]uronio

d

Doblete

dba

dibenzalacetona

DCM

Diclorometano

dd

Doblete de dobletes

ddd

Doblete de doblete de dobletes

DIPEA/DIEA

N,N-Diisopropiletilamina

DMA

N,N-Dimetilacetamida

DMAP

4-Dimetilaminopiridina

DME

Dimetoxietano

DMEM

Medio esencial mlnimo de Eagle

DMF

Dimetilformamida

DMSO/dmso

Dimetilsulfoxido

dppf

1, 1 '-bis(difenilfosfanil)ferroceno

dt

Doblete de tripletes

CE50

Concentracion eficaz de mitad del maximo

IEN

lonizacion por electronebulizacion

Et

Etilo

ext.

Externo

FBS

Suero fetal bovino

g

Gramo

HATU

Hexafluorofosfato de 2-(1H-7-azabenzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametil uronio Metanamio

HPLC

Cromatografla llquida de alto rendimiento

hr/h

Hora

Hz

Hercio

J

Constante de acoplamiento

CLEM

Espectrometrla de masas cromatografla llquida

M

Molar

m

Multiplete

m/z

Masa para cargar

M+

Pico de masa

Me

Metilo

mg

Miligramo

MHz

Megahercio

min

Minuto

ml

Mililitro

mmol

Milimol

Moc

Metoxicarbonilo

EM

Espectrometrla de masas

MTBE

Metil ferc-butil eter

N

Normal

NADPH

Nicotinamida adenina dinucleotido fosfato

NBS

N-Bromosuccinimida

NMM

N-Metilmorfolina

RMN

Resonancia magnetica nuclear

o/n

Durante toda la noche

Papp

Permeabilidad aparente

PBS

Sistema tampon fosfato

Pd/C

Paladio sobre carbono

Ph

Fenilo

Phg/PhGly

Fenil glicina

Piv

Pivalato

Pro

Prolina

pyr

Piridina

c

Cuarteto

cd

Cuarteto de dobletes

cuant

Cuantitativo

quint

Quintete

ta/TA

Temperatura ambiente

s

Singlete

SPhos

2-Diciclohexilfosfino-2',6'-dimetoxibifenilo

t

Triplete

t-Bu

ferc-Butilo

TEMPO

(2,2,6,6-T etrametil-pi peridin-1-il)oxilo

Tf

Trifluorometanosulfonato

TFA

Acido trifluoroacetico

THF

Tetrahidrofurano

Thr

Threonina

TLC

Cromatografla en capa fina

tol.

Tolueno

UV

Ultravioleta

Val

Valina

p/v

Peso a volumen

p/p

Peso a peso

X-Phos/XPOS/Xphos

2-Diciclohexilfosfino-2',4',6'-triisopropilbifenil

5

Desplazamiento qulmico

^g

Microgramo

Ml

Microlitro

Ejemplos

Ejemplo AA (Referencia)

5

imagen17

imagen18

2-metoxietanol,

110°C

2-(9-cloro-1,4,5,11-

tetrahidroisocromeno^'.S'iejlnaftofl^-d]

9-bromo-3-cloro-10,11 -dihidro-5H-dibenzo[c,g] cromen-8(9H)-ona

Pdzdbaa, KOAc, XPOS, dioxano, 90 °C

2-(9-cIoro-1 11

2-il)pirrolidin-1 -ca rboxilato ferc-butilo

2-[9-(4!4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioxaborolan- 2-il)-1 ll-dihidroisocromenoH'.^ejlnaftoM ,2-d] imidazol-2-il]pirrolidin-1 -carboxilato de ferc-butilo

imidazol-S-ilJ-ll 1-dihidroisocromeno[4',3,:6,7]nafto[1,2-d] imidazol-2-il]pirrolidin-1-carboxilato de ferc-butilo

{[(metoxicarbonil)amino](fenil)acetil}pirrolidin-2-il)-1 A1- dihidroisocromeno^'^'iOJlnaftoIl ,2-d]imidazol-9-il]-1 H- imidazol-2-il}pirrolidin-1-il)-3-metil-1-oxobutan-2-il] carbamico

DIPEA, CH3CN. 50 C

Boc

2. NH4CI. Tolueno

imidazol-2-il)pirrolidin-i-carboxilato rerc-butilo

Mn02, CH2Ct2l ta

Boc

Jihidroisocromeno[4.3:6.7]nafto[1 2-d]imidazol-

Boc

Pd(PPh3)4, Pdci^dppf),

K2CO;!, DME/ DMF, 85 C

1. HCI, EtOH, 60 C

2- - N-(metoxicarbonilVam pirrolidin-2-il}-1 H-

COMU. DIPEA DMF TA

acido [1-(2-{5-[2-(1-

3,4-dihidronaftalen-1(2H)-ona: A una solucion en agitacion de 7-hidroxi-1-tetralona (13,9 g, 85,7 mmol) y 1-bromo- 2-(bromometil)-4-clorobenceno (25,6 g, 90,0 mmol) en dimetilformamida (850 ml), se le anadio carbonato potasico 5 (24 g, 172 mmol). La reaccion se agito en argon durante 18 horas, despues se diluyo con acetato de etilo (1 l). Los

extractos organicos se lavaron tres veces con agua y una vez con salmuera. Despues, la capa organica se seco con sulfato de magnesio, se filtro y se concentro. Al aceite resultante se le anadio metanol (500 ml) y la suspension se agito durante treinta minutos. Se aislo por filtracion 7-(2-bromo-5-clorobenciloxi)- (27,8 g, rendimiento del 89 %).

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3-cloro-10,11-dihidro-5H-dibenzo[c,g]cromen-8(9H)-ona: A un matraz de 1 l que contenla pivalato de paladio (II) (1,18 g, 3,8 mmol), tri(4-fluorofenil)fosfina (1,20 g, 3,8 mmol), acido pivalico (2,33 g, 22,8 mmol) y carbonato potasico (31,8 g, 228 mmol) se le anadio una solucion de 7-(2-bromo-5-clorobenciloxi)-3,4-dihidronaftalen-1(2H)-ona (27,8 g, 76,2 mmol) en dimetilacetamida (380 ml). El matraz se evacuo y se relleno con argon 5 veces y despues se agito en argon a 60 °C durante 24 horas. La reaccion se enfrio a temperatura ambiente y se diluyo con MTBE y agua. La mezcla bifasica resultante se agito durante 3 horas y se filtro a traves de Celite, aclarando con MTBE. La capa organica del filtrado se separo y despues se lavo dos veces con agua y una vez con salmuera. Despues, los organicos se secaron con sulfato de magnesio, se filtraron, se concentraron y se purificaron por cromatografla en columna ultrarrapida (Hexanos/DCM) para producir 3-cloro-10,11-dihidro-5H-dibenzo[c,g]cromen-8(9H)-ona (14,4 g, rendimiento del 67 %) en forma de un solido de color blanquecino.

9-bromo-3-cloro-10,11-dihidro-5H-dibenzo[c,g]cromen-8(9H)-ona: A una mezcla de 3-cloro-10,11-dihidro-5H- dibenzo[c,g]cromen-8(9H)-ona (14,8 g, 52 mmol) en cloroformo (50 ml) y acetato de etilo (50 ml) se le anadio bromuro de cobre (II) (24,3 g, 104 mmol). La reaccion se calento a 80 °C durante 2 horas y despues se enfrio a temperatura ambiente. La mezcla se diluyo con diclorometano y se lavo dos veces con una solucion 5:1 acuosa, saturada de cloruro de amonio e hidroxido de amonio acuoso (~38 %) y se lavo una vez con agua. La capa organica se seco con sulfato de magnesio, se filtro y se concentro para producir 9-bromo-3-cloro-10,11-dihidro-5H- dibenzo[c,g]cromen-8(9H)-ona (18,5 g, rendimiento > del 95 %) con pureza > del 95 %. Nota: Esta reaccion no siempre es tan limpia. A veces hay exceso de bromacion y a veces hay material de partida significativo. Estas impurezas pueden retirarse por cromatografla en columna ultrarrapida.

2- (9-cloro-1,4,5,11-tetrahidroisocromeno[4',3':6,7]nafto[1,2-d]imidazol-2-il)pirrolidin-1-carboxilato de terc-

butilo: A una solucion de acido (2S)-1-(ferc-butoxicarbonil)-pirrolidin-2-carboxllico (10,17 g, 47,25 mmol) y 9-bromo-

3- cloro-10,11-dihidro-6H-nafto[2,3-c]cromen-8(9H)-ona (5,7 mg, 15,7 mmol) en acetonitrilo (50 ml) se le anadio diisopropiletilamina (11,11 ml, 64 mmol). La reaccion se agito a 50 C durante 4 horas y despues se diluyo con acetato de etilo. Los extractos organicos se lavaron con agua y salmuera, se secaron (MgSO4) y se concentraron. El residuo en bruto resultante se purifico por cromatografla ultrarrapida para producir 2-(3-cloro-8-oxo-8,9,10,11- tetrahidro-5H-nafto[c,g]cromen-9-il) pirrolidin-1,2-dicarboxilato de (2S)-1-ferc-butilo (4,52 g, 58 %). A una solucion de 2-(3-cloro-8-oxo-8,9,10,11-tetrahidro-6H-nafto[2,3-c]cromen-9-il)pirrolidin-1,2-dicarboxilato de (2S)-1-ferc-butilo (3,27 mg, 6,56 mmol) en una mezcla de tolueno (11 ml) y 2-metoxietanol (0,7 ml) se le anadio acetato amonico (5,06 g, 65,6 mmol). La mezcla de reaccion se calento a 110 °C durante 3 horas, se enfrio a temperatura ambiente y se diluyo con acetato de etilo. Los extractos organicos se lavaron con agua y salmuera, se secaron (Na2SO4) y se concentraron. El residuo en bruto se purifico por cromatografla ultrarrapida para producir 2-(9-cloro-1,4,5,11- tetrahidroisocromeno[4',3':6,7]nafto[1,2-d]imidazol-2-il)pirrolidin-1-carboxilato de ferc-butilo(1,95 g, 61 %). CLEM- IEN+: calculado para C27H28ClNaO342: 477,98; observado [M+1]+: 478,47

2-(9-cloro-1,11-dihidroisocromeno[4',3':6,7]nafto[1,2-d]imidazol-2-il)pirrolidme-1-carboxilato de terc-butilo. A

una solucion de 2-(9-cloro-1,4,5,11-tetrahidroisocromeno[4',3':6,7]nafto[1,2-d]imidazol-2-il)pirrolidin-1-carboxilato de ferc-butilo (1,9 g, 3,96 mmol) en diclorometano (35 ml) se le anadio oxido de manganeso (IV) (17 g, 198 mmol). La mezcla de reaccion se agito a temperatura ambiente durante 18 horas, se diluyo con acetato de etilo. Los extractos organicos se lavaron con agua y salmuera, se secaron (Na2SO4) y se concentraron. El residuo en bruto se purifico por cromatografla ultrarrapida para producir 2-(9-cloro-1,11-dihidroisocromeno[4',3':6,7]nafto[1,2-d]imidazol-2- il)pirrolidin-1-carboxilato de ferc-butilo (1,52 g, 81 %). CLEM-IEN+: calculado para C27H26CIn3o3 42: 475,9; observado [M+1]+: 476,45.

2-[9-(4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioxaborolan-2-il)-1,11-dihidroisocromeno[4',3':6,7]nafto[1,2-d]imidazol-2- il]pirrolidin-1-carboxilato de terc-butilo: Una mezcla desgasificada de 2-(9-cloro-1,11-

dihidroisocromeno[4',3':6,7]nafto[1,2-d]imidazol-2-il)pirrolidin-1-carboxilato de ferc-butilo (1,52 g, 3,17 mmol), bis(pinacolato)diboro (1,21 g, 4,75 mmol), acetato potasico (934 mg, 9,52 mmol), tris(dibencilidenoacetona)paladio (116 mg, 0,13 mmol) y 2-diciclohexilfosfino-2',4',6'-tri-i-propil-1, 1 '-bifenilo (121 mg, 0,08 mmol) en 1,4-dioxano (16 ml) se calento a 90 °C durante 1,5 horas, se enfrio a temperatura ambiente y se diluyo con acetato de etilo. Los extractos organicos se lavaron con agua y salmuera, se secaron (Na2SO4) y se concentraron. El residuo en bruto se purifico por cromatografla ultrarrapida para producir 2-[9-(4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioxaborolan-2-il)-1,11- dihidroisocromeno[4',3':6,7]nafto[1,2-d]imidazol-2-il]pirrolidin-1-carboxiiato de ferc-butilo (1,7 g, 94 %)

2-[9-(2-{1-[N-(metoxicarbonil)valil]pirrolidin-2-il}-1H-imidazol-5-il)-1,11-dihidroisocromeno[4',3':6,7]nafto[1,2- d]imidazol-2-il]pirrolidin-1-carboxilato de terc-butilo: A una solucion de (S)-1-((S)-2-(5-bromo-1H-imidazol-2- il)pirrolidin-1 -il)-3-metil-1 -oxobutan-2-ilcarbamato de metilo (1,48 g, 3,97 mmol), 2-[9-(4,4,5,5-tetrametil-1,3,2- dioxaborolan-2-il)-1,11-dihidroisocromeno[4',3':6,7]nafto[1,2-d]imidazol-2-il]pirrolidin-1-carboxiiato de ferc-butilo (1,88 g, 1,48 mmol), tetraquis(trifenilo fosfina)paladio (0) (191 mg, 0,16 mmol) y dicloro[1, 1 '-bis(difenilfosfino) ferroceno]paladio (II) (242 mg, 0,33 mmol) en una mezcla de 1,2-dimetoxietano (37,0 ml) y dimetilformamida (6 ml) se le anadio una solucion de carbonato potasico (2 M en agua, 5 ml, 9,93 mmol). La mezcla resultante se desgasifico y despues se calento a 85 °C en argon durante 18 horas. Despues de enfriar a temperatura ambiente, la reaccion se diluyo con acetato de etilo. Los extractos organicos se lavaron con agua y salmuera, se secaron (Na2SO4) y se concentraron. El residuo en bruto se purifico por cromatografla ultrarrapida para producir 2-[9-(2-{1-[N- (metoxicarbonil)valil]pirrolidin-2-il}-1H-imidazol-5-il)-1,11-dihidroisocromeno[4',3':6,7]nafto[1,2-d]imidazol-2-

il]pirrolidin-1-carboxilato de ferc-butilo (1,45 mg, 59 %). CLEM-IEN+: calculado para C41H47N7O6 73 7 33,86; observado [M+1]+: 734,87.

acido [1-(2-{5-[2-(1-{[(metoxicarbonil)amino](fenil)acetil}pirrolidin-2-il)-1,11-

5 dihidroisocromeno[4',3':6,7]nafto[1,2-d]imidazol-9-il]-1H-imidazol-2-il}pirrolidin-1-il)-3-metil-1-oxobutan-2- il]carbamico: Una solucion de 2-[9-(2-{1-[N-(metoxicarbonil)valil]pirrolidin-2-il}-1H-imidazol-5-il)-1,11-

dihidroisocromeno[4',3':6,7]nafto[1,2-d]imidazol-2-il]pirrolidin-1-carboxilato de ferc-butilo (462 mg, 0,63 mmol), etanol (6 ml) y HCl concentrado (2 ml) se calento a 60 °C durante 1 hora. La reaccion se concentro y el material en bruto se disolvio en DCM (6 ml). Esta solucion se concentro y a este material se le anadio una solucion de acido (R)-2- 10 (metoxi-carbonilamino)-2-fenilacetico (172 mg, 0,82 mmol) y COMU (311 mg, 073 mmol) en DMF (6 ml). A la solucion resultante se le anadio diisopropiletilamina (330 pl, 1,89 mmol). Despues de agitar durante 18 horas a temperatura ambiente, la reaccion se diluyo con acetato de etilo, se lavo con agua y salmuera, se seco (Na2SO4), se concentro y se purifico por HPLC preparativa de fase inversa (Gemini, ACN/H2O del 15 al 45 %+ TFA al 0,1 %). Las fracciones del producto se liofilizaron para dar acido [1-(2-{5-[2-(1-{[(metoxicarbonil)amino](fenil)acetil}pirrolidin-2-il)- 15 1,11-dihidroisocromeno[4',3':6,7]nafto[1,2-d]imidazol-9-il]-1H-imidazol-2-il}pirrolidin-1-il)-3-metil-1-oxobutan-2- il]carbamico (231 mg, 45 %). CLEM- IEN+: calculado para C46H48N8O78: 824,92; observado [M+1]+: 826,00

Ejemplo BJ

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2-(ferc-butoxicarbonilamino)-5-oxohexanoato de (S)-etilo. Una solucion de N-Boc (S)-piroglutamato de etilo (20,0 g, 77,7 mmol) estaba en THF anhidro (150 ml) en un matraz de fondo redondo de dos bocas en argon se enfrio a - 40 °C. Se anadio gota a gota una solucion de bromuro de metilmagnesio (3,0 M en eter, 28,5 ml, 85,5 mmol) a la mezcla de reaccion durante 30 minutos. La reaccion se agito durante 4 h a -40 °C, despues durante 1 h a 0 °C. La reaccion se repartio entre acetato de etilo y una solucion saturada de cloruro de amonio y se acidifico con HCl 1 N. La capa acuosa se extrajo dos veces mas con acetato de etilo. Las capas organicas se combinaron y se secaron con sulfato sodico. El material en bruto se purifico por cromatografla en columna (EtOAc al 20 % - 40 %/hexanos) para producir 2-(terc-butoxicarbonilamino)-5-oxohexanoato de (S)-etilo en forma de un aceite viscoso y se uso directamente en la siguiente etapa.

5-metil-3,4-dihidro-2H-pirrol-2-carboxilato de (S)-etilo. Se trato 2-(terc-butoxicarbonilamino)-5-oxohexanoato de (S)-etilo en un matraz de 1 l con una solucion de acido trifluoro acetico / diclorometano (mezcla 1:1, 100 ml). Se observo efervescencia y la mezcla se dejo en agitacion durante 4 horas a temperatura ambiente. Tiempo despues del cual, los volatiles se retiraron al vacfo para producir 5-metil-3,4-dihidro-2H-pirrol-2-carboxilato de (S)-etilo en forma de un aceite, y se uso directamente en la siguiente etapa.

5-metilpirrolidin-2-carboxilato de (2S,5S)-etilo. La imina 3 en bruto, en un matraz de 1 l se disolvio con etanol (400 ml), se evacuo y se cargo con argon tres veces (3 x). Se anadio paladio sobre carbono (aprox. 750 mg, 10 % p/p, seco) y la reaccion se evacuo de gas y se cargo con gas hidrogeno (3 x). La reaccion se dejo en agitacion en hidrogeno atmosferico durante 16 horas. La mezcla se filtro a traves de un lecho de celite y el filtrado se concentro al vacfo. Se anadio eter dietllico al aceite y se formo un precipitado. La mezcla se filtro para producir 5-metilpirrolidin-2- carboxilato de (2S,5S)-etilo, en forma de un solido de color blanco (10,6 g, 67,4 mmol, 86,7 % durante tres etapas). RMN 1H (400 MHz, cdcla) 5 4,48 (dd, 1H), 4,27 (c, 2H), 3,92 - 3,80 (m, 1H), 2,52 - 2,36 (m, 1H), 2,32 - 2,13 (m, 2H), 1,75 - 1,60 (m, 1H), 1,51 (d, 3H), 1,30 (t, 3H).

2-etil 5-metilpirrolidin-1,2-dicarboxilato de (2S,5S)-1-ferc-butilo. A una solucion de 5-metilpi rrolidin-2-carboxilato de (2S,5S)-etilo (7,0 g, 44,5 mmol) en diclorometano (250 ml), se le anadieron gota a gota sucesivamente diterc- butilanhldrido (10,7 g, 49,0 mmol), diisopropiletilamina (17,1 ml, 98,0 mmol) gota a gota durante 10 minutos y dimetil amino piridina (0,27 g, 2,23 mmol). Se observo efervescencia y la mezcla se dejo en agitacion durante 16 horas a temperatura ambiente. La reaccion se lavo con HCl (250 ml, de 1 N). Despues, la capa organica se seco con sulfato sodico. El material en bruto se purifico por cromatografla en columna (EtOAc al 5 % - 25 %/hexanos) para producir 2-etil 5-metilpirrolidin-1,2-dicarboxilato de (2S,5S)-1-terc-butilo en forma de un aceite (6,46 g, 25,1 mmol, 56%). CLEM-IEN+: calc. para C13H23NO4: 257,16 (M+); Encontrado: 258,70 (M+H+).

acido (2S,5S)-1-(ferc-butoxicarbonil)-5-metilpirrolidin-2-carboxflico. A una solucion de 2-etil 5-metilpirrolidin-1,2- dicarboxilato de (2S,5S)-1-terc-butilo (6,46 g, 25,1 mmol) en etanol (20 ml) se le anadieron monohidrato de hidroxido de litio (2,11 g, 50,2 mmol) y agua desionizada (12 ml). La mezcla se dejo en agitacion durante 16 horas, despues se repartio entre acetato de etilo y una mezcla 1:1 de salmuera saturada y HCl 1 N. La capa acuosa se extrajo un tiempo adicional con acetato de etilo. Las capas organicas se combinaron, se secaron con sulfato sodico y el disolvente se retiro al vacfo para producir acido (2S,5S)-1-(terc-butoxicarbonil)-5-metilpirrolidin-2-carboxllico en forma de un solido de color blanco (cuant.) y se uso directamente en la siguiente etapa.

2-(hidroximetil)-5-metilpirrolidin-1-carboxilato de (2S,5S)-ferc-butilo. A una solucion de acido (2S,5S)-1-(terc- butoxicarbonil)-5-metilpirrolidin-2-carboxllico (5,91 g, 25,8 mmol) en tetrahidrofurano a 0 °C, se le anadio gota a gota borano en dimetilsulfuro (1,0 M, 3,4 ml, 34 mmol). La reaccion se agito durante 4 horas a 0 °C, despues 18 horas a temperatura ambiente. Despues, la mezcla se enfrio a 0 °C y se anadio gota a gota metanol (70 ml). La reaccion se calento a temperatura ambiente y los disolventes se retiraron al vaclo. El residuo se recogio en diclorometano (200 ml) y se extrajo con bicarbonato sodico saturado. La capa organica se seco con sulfato sodico y el disolvente se retiro al vacfo para producir 2-(hidroximetil)-5-metilpirrolidin-1 -carboxilato de (2S,5S)-terc-butilo en forma de un aceite transparente (5,15 g, 23,9 mmol, 93 %) y se uso directamente en la siguiente etapa.

2-formil-5-metilpirrolidin-1-carboxilato de (2S,5S)-ferc-butilo. A una solucion de 2-(hidroximetil)-5-metilpirrolidin-

1- carboxilato de (2S,5S)-terc-butilo (5,15 g, 23,9 mmol) en diclorometano, se le anadieron TEMPO (0,075 g, 0,48 mmol), bromuro sodico (0,246 g, 2,39 mmol) y bicarbonato sodico (0,442 g, 5,26 mmol). Se anadio hipoclorito sodico (2,67 g, 35,9 mmol) de una solucion al 6 % y la mezcla bifasica se agito vigorosamente durante 2 horas a temperatura ambiente. La mezcla de reaccion se extrajo dos veces con diclorometano (2x100 ml). Las capas organicas se combinaron y se lavaron con una solucion saturada de tiosulfato sodico, se secaron con sulfato sodico y el disolvente se retiro al vaclo para producir 2-formil-5-metilpirrolidin-1-carboxilato de (2S,5S)-terc-butilo (3,9 g, 18,29 mmol, 77 %) en forma de un aceite de color ligero y se uso directamente en la siguiente etapa.

2- (1H-imidazol-2-il)-5-metilpirrolidin-1-carboxilato de (2S,5S)-ferc-butilo. A una solucion de 2-formil-5- metilpirrolidin-1-carboxilato de (2S,5S)-terc-butilo(3,9 g, 18,30 mmol) en MeOH (15 ml) e hidroxido de amonio (15 ml, 99,9 %), se le anadio gota a gota glioxal (11,7 ml, 40% p/v en agua, 102,40 mmol). La mezcla bifasica se volvio de color naranja y turbia. La reaccion se agito vigorosamente durante una noche a temperatura ambiente. El disolvente se retiro al vacfo. La mezcla en bruto se disolvio de nuevo en acetato de etilo y se lavo con agua. La capa acuosa se lavo un tiempo adicional con acetato de etilo. Las capas organicas se combinaron y se lavaron con salmuera, se

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secaron con sulfato sodico y el disolvente se retiro al vacio. El material en bruto se purifico por cromatografla en columna, acetato de etilo del 85 % al 100 % en hexanos para producir 2-(1H-imidazol-2-il)-5-metilpirrolidina-1- carboxilato de (2S,5S)-terc-butilo en forma de un solido de color blanquecino (3,47 g, 13,8 mmol, 75 %). CLEM-IEN+: calc. para C13H21N3O2: 251,16 (M+); Encontrado: 252,20 (M+H+).

2-(4,5-diyodo-1H-imidazol-2-il)-5-metilpirrolidina-1-carboxilato de (2S,5S)-ferc-butilo. Un matraz de fondo redondo de 500 ml se cargo con 2-( 1H-imidazol-2-il)-5-metilpirrolidin-1-carboxilato de (2S,5S)-terc-butilo (3,47 g, 13,8 mmol), yodo (7,7 g, 30,4 mmol) y carbonato sodico (4,54 g, 42,8 mmol). Se anadieron dioxano (70 ml) y agua (45 ml) a la mezcla y la reaccion se agito vigorosamente durante una noche en la oscuridad. Despues, la reaccion se repartio entre acetato de etilo y una solucion acuosa al 10 % de tiosulfato sodico y se extrajo. La capa acuosa se extrajo un tiempo adicional con acetato de etilo. Las capas organicas se combinaron, se secaron con sulfato sodico y el disolvente se retiro al vacio. El material en bruto se filtro a traves de un lecho de sllice con acetato de etilo al 25 % en hexanos para producir 2-(4,5-diyodo-1H-imidazol-2-il)-5-metilpirrolidin-1-carboxilato de (2S,5S)-terc-butilo en forma de un solido de color blanco (4,28 g, 8,50 mmol, 62 %). CLEM-IEN+: calc. para C13H19I2N3O2: 502,96 (M+); Encontrado: 503,94 (M+H+).

2-(5-yodo-1H-imidazol-2-il)-5-metilpirrolidin-1-carboxilato de (2S,5S)-ferc-butilo. A una solucion de 2-(4,5- diyodo-1H-imidazol-2-il)-5-metilpirrolidin-1-carboxilato de (2S,5S)-terc-butilo (4,28 g, 8,50 mmol) en etanol (75 ml) y agua (75 ml), se le anadio tiosulfato sodico (10,72 g, 85,1 mmol) y la mezcla de reaccion se agito vigorosamente durante 1 hora a 100 °C, 16 horas a 90 °C y 5 horas a 100 °C. La mezcla de reaccion se repartio entre acetato de etilo y agua. La capa acuosa se lavo adicionalmente con acetato de etilo y las capas organicas se combinaron. La capa organica se seco con sulfato sodico, se concentro y el material en bruto se purifico por cromatografla en columna para producir 2-(5-yodo-1H-imidazol-2-il)-5-metilpirrolidin-1-carboxilato de (2S,5S)-terc-butilo en forma de un solido de color blanco (2,34 g, 6,20 mmol, 73 %). RMN 1H (400 MHz, cdcb) 5 7,04 (s, 1H), 4,89 (dd, 1H), 3,92 (m, 1H), 2,91 (s, 1H), 2,18 - 2,06 (m, 2H), 1,78 (m, 1H), 1,52 (m, 1H), 1,48 (s, 9H), 1,13 (d, 3H).

(2S)-1-[(2S,5S)-2-(5-yodo-1H-imidazol-2-il)-5-metilpirrolidin-1-il]-2-[(1-metoxietenil)amino]-3-metilbutan-1-ona.

Un matraz de fondo redondo se cargo con 2-(5-yodo-1H-imidazol-2-il)-5-metilpirrolidin-1-carboxilato de (2S,5S)-terc- butilo (1,5 g, 3,98 mmol) y se trato con un exceso de acido clorhldrico (100 ml de 4,0 M en dioxano). La mezcla se agito vigorosamente durante 3 horas, momento en el cual se formo un precipitado y el disolvente se retiro al vacio. A una mezcla del intermedio en bruto, acido (S)-2-(metoxicarbonilamino)-3-metilbutanoico (0,836 g, 4,77 mmol), HATU (1,81 g, 4,77 mmol) en diclorometano (25 ml), despues se le anadio gota a gota diisopropiletilamina (3,46 ml, 19,9 mmol) y se agito durante una noche en atmosfera de nitrogeno. La mezcla de reaccion se repartio acetato de etilo y bicarbonato sodico saturado. La capa organica se seco con sulfato sodico, el disolvente se retiro al vacio. El producto en bruto se purifico por cromatografla en columna para producir (2S)-1-[(2S,5S)-2-(5-yodo-1H-imidazol-2- il)-5-metilpirrolidin-1-il]-2-[(1-metoxietenil)amino]-3-metilbutan-1-ona en forma de un solido de color blanco (1,63 g, 3,75 mmol, 94 %). CLEM-IEN+: calc. para C15H23IN4O3: 434,08 (M+); Encontrado: 435,51 (M+H+).

Ejemplo BN (Referencia)

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1-((S)-2-(metoxicarbonilamino)-3-metilbutanoil)-5-metilpirrolidin-2-carboxilato de (2S,5S)-etilo: Se combinaron 5-metilpirrolidin-2-carboxilato de (2S,5S)-etilo-TFA (10,0 g, 39,3 mmol), acido (S)-2-(metoxicarbonilamino)-3- metilbutanoico (6,88 g, 39,3 mmol) y HATU (14,9 g, 39,3 mmol) en DMF (100 ml) y se anadio DIPEA (15,0 ml, 86,5 mmol). Despues de agitar durante 1 h a TA, la mezcla de reaccion se diluyo con EtOAc. La fase organica se lavo

sucesivamente con HCl al 10 %, NaHCO3 acuoso saturado y salmuera, despues se seco sobre MgSO4, se filtro y se concentro a presion reducida para proporcionar 1-((S)-2-(metoxicarbonilamino)-3-metilbutanoil)-5-metilpirrolidin-2- carboxilato de (2S,5S)-etilo. El material en bruto se llevo a cabo sin purificacion adicional.

5 acido (2S,5S)-1-((S)-2-(metoxicarbonilamino)-3-metilbutanoil)-5-metilpirrolidin-2-carboxilico: Se suspendio 1- ((S)-2-(metoxicarbonilamino)-3-metilbutanoil)-5-metilpirrolidin-2-carboxilato de (2S,5S)-etilo (39,3 mmol, suponiendo una conversion completa de la transformation previa) en MeOH (200 ml) y se anadio LiOH acuoso (1,0 M, 100 ml, 100 mmol). La mezcla de reaction se agito durante toda la noche, despues se concentro a presion reducida para retirar la mayoria del MeOH. La solution acuosa se lavo 2x con DCM antes de acidificarse a pH~1-2 con HCl al 10 10 %. Despues, la fase acuosa acida se extrajo 5x con EtOAc. Los extractos de EtOAc combinados se secaron

sobre MgSO4, se filtraron y se concentraron a presion reducida para proporcionar acido (2S,5S)-1-((S)-2- (metoxicarbonilamino)-3-metilbutanoil)-5-metilpirrolidin-2-carboxilico (6,89 g, 56 % durante 2 etapas).

Ejemplo BO (Referencia)

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NHC02Me

Me02CHN

MnO

DCM

2S,4S)-2- 5-(2-{ 2S.5S -1- N-(metoxicartoonil -L-valil -5-

metilpirrolidin-2-il}-1,4,5,11-tetrahidroisocromeno[4 ,3 :6,7]nafto[1,2-

d]imidazol-9-il)-1 H-imidazol-2-il]-4-(metoximetil)pirrolidin-1-carboxilato

de rerc-butilo

1. HCI/dioxano: DCM

2 HATU. DIPEA. DMF

2S.4S -2- 5- 2-{ 2S.5S -1- N- metoxicarboml -L-valil -5-

acido (2S,3S)-2-

metilpirrolidin-2-il}-1,11-dihidroisocromeno[4,3:6,7]nafto[1,2-d]

(metoxicarbomlamino -3

imidazol-9-il)-1 H-imidazol-2-il -4- metoximetil pirrolidin-1-carboxilato

metilpentanoico

de ferc-buti o

{ 2S,3S -1- (2S.4S -2- 5-{2- (2S.5S -1-{ 2S -2- metoxicarbonil amino -3-

metilbutanoil}-5-metilpirrolidin-2-il -1,11-dihidroisocromeno 4,3:6,7 nafto 1,2-d

imidazol-9-il}-1 H-imidazol-2-il -4- metoximetil pirrolidin-1-il -3-metil-1-oxopentan-2

iljcarbamato de metilo

3-Vinil-10,11-dihidro-5H-dibenzo[c,g]cromen-8(9H)-ona: Un matraz de fondo redondo de 3 bocas de 500 ml secado al horno, se enfrio en Ar, despues se cargo con 3-cloro-10,11-dihidro-5H-dibenzo[c,g]cromen-8(9H)-ona (12,0 g, 42,1 mmol), viniltrifluoroborato potasico (8,47 g, 6,32 mmol), Pd(OAc)2 (473 mg, 2,11 mmol), SPhos (1,74 g, 4,25 mmol), K2CO3 (17,5 g, 126 mmol) y propanol anhidro (120 ml). La mezcla de reaccion se rocio con Ar durante 16 min, despues se calento a reflujo durante 5,5 h. Tras la finalizacion, la mezcla de reaccion se enfrio a TA y se concentro a presion reducida. El residuo en bruto se suspendio en DCM, despues se lavo con H2O y salmuera. La solucion organica se seco sobre MgSO4, se filtro y se concentro a presion reducida. El residuo resultante se purifico adicionalmente a traves de un tapon de sllice, eluyendo con DCM para proporcionar 3-vinil-10,11-dihidro-5H- dibenzo[c,g]cromen-8(9H)-ona (10,2 g, 87 %).

3-(2-Bromoacetil)-10,11-dihidro-5H-dibenzo[c,g]cromen-8(9H)-ona: Se disolvio 3-vinil-10,11-dihidro-5H-

dibenzo[c,g]cromen-8(9H)-ona (9,98 g, 36,1 mmol) en una solucion en agitacion de THF (70 ml), DMSO (70 ml) y H2O (35 ml). Se anadio NBS (6,75 g, 37,9 mmol) en una porcion individual y la mezcla de reaccion se agito a tA durante 33 min. Tras la finalizacion, el medio de reaccion se diluyo con EtOAc y se lavo dos veces con H2O y una vez con salmuera. La fase organica se seco sobre MgSO4, se filtro y se concentro a presion reducida. La bromohidrina en bruto resultante se suspendio en DCM (200 ml) y se trato con MnO2 activado (62,7 g, 722 mmol). Despues de agitar durante 15 h a TA, la mezcla de reaccion se filtro sobre celite y la torta de filtro se aclaro varias veces con DCM. El filtrado combinado (~400 ml) se trato con MeOH (~100 ml) y la mezcla se concentro gradualmente a presion reducida, causando un material solido para precipitar a partir de la solucion. Cuando el volumen llquido alcanzo ~200 ml, el solido se retiro por filtracion y se aclaro con MeOH. La secuencia de concentracion/precipitacion/filtracion/aclarado se realizo 2x veces mas, dando como resultado la recoleccion de 3 cultivos de 3-(2-bromoacetil)-10,11-dihidro-5H-dibenzo[c,g]cromen-8(9H)-ona en polvo (7,49 g, 56 % durante 2 etapas).

2-(2-oxo-2-(8-oxo-8,9,10,11-tetrahidro-5H-dibenzo[c,g]cromen-3-il)etil) 4-(metoximetil)pirrolidin-1,2-

dicarboxilato de (4S)-1-ferc-butilo: Se suspendieron 3-(2-bromoacetil)-10,11-dihidro-5H-dibenzo[c,g]cromen-8(9H)- ona (7,47 g, 20,1 mmol) y acido (2S,4S)-1-(ferc-butoxicarbonil)-4-(metoximetil)pirrolidin-2-carboxllico (5,22 g, 20,1 mmol) en 2-Me-THF (75 ml) y se trato con Cs2CO3 (3,27 g, 10,1 mmol). Despues de agitar 4 h a TA, la mezcla de reaccion se diluyo DCM diluido. La capa organica se lavo con H2O. Despues, la capa acuosa se volvio a extraer 2x con DCM. Los extractos organicos combinados se secaron sobre MgSO4, se filtraron y se concentraron a presion reducida. El residuo en bruto se purifico por cromatografla sobre gel de sllice (EtOAc del 10 % al 50 %/DCM) para

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

proporcionar 2-(2-oxo-2-(8-oxo-8,9,10,11-tetrahidro-5H-dibenzo[c,g]cromen-3-il)etil) 4-(metoximetil)pirrolidin-1,2- dicarboxilato de (4S)-1-ferc-butilo (7,73 g, 70 %).

(25.45) -2-(2-(9-bromo-8-oxo-8,9,10,11-tetrahidro-5H-dibenzo[c,g]cromen-3-il)-2-oxoetil) 4- (metoximetil)pirrolidin-1,2-dicarboxilato de 1-ferc-butilo: Se disolvio 2-(2-oxo-2-(8-oxo-8,9,10,11-tetrahidro-5H- dibenzo[c,g]cromen-3-il)etil) 4-(metoximetil)pirrolidin-1,2-dicarboxilato de (4S)-1-ferc-butilo (7,66 g, 13,9 mmol) en una solucion de DCM (100 ml) y MeOH (40 ml), despues se trato con tribromuro de piridinio (4,90 g, 15,3 mmol). Despues de agitar a TA durante 1,75 h, la mezcla de reaccion se diluyo con DCM y se lavo sucesivamente con HCl al 10 %, NaHCO3 acuoso saturado y salmuera. La fase organica se seco sobre MgSO4, se filtro y se concentro a presion reducida y el material en bruto se llevo a cabo sin purificacion adicional.

2-(2-(9-((2S,5S)-1-((S)-2-(metoxicarbonilamino)-3-metilbutanoil)-5-metilpirrolidin-2-carboniloxi)-8-oxo-

8.9.10.11- tetrahidro-5H-dibenzo[c,g]cromen-3-il)-2-oxoetil) 4-(metoximetil)pirrolidin-1,2-dicarboxilato de

(2R,4R)-1-ferc-butilo: Se trato 4-(metoximetil)pirrolidin-1,2-dicarboxilato (2S,4s)-2-(2-(9-bromo-8-oxo-8,9,10,11- tetrahidro-5H-dibenzo[c,g]cromen-3-il)-2-oxoetil) 1-ferc-butilo (8,76 g, 13,94 mmol) con una solucion de acido

(2S,5S)-1-((S)-2-(metoxicarbonilamino)-3-metilbutanoil)-5-metilpirrolidin-2-carboxllico (6,85 g, 23,92 mmol) en 2-Me- THF (70 ml) y Cs2CO3 (3,63 g, 11,15 mmol). La mezcla de reaccion en agitacion, se calento a 50 °C durante 20 h, despues se enfrio a TA y se diluyo con EtOAc. La fase organica se lavo con H2O y salmuera, despues se seco sobre MgSO4, se filtro y se concentro a presion reducida. El residuo en bruto se purifico por cromatografla en columna sobre sllice (MeOH del 0 % al 30 %/EtOAc) para proporcionar 2-(2-(9-((2S,5S)-1-((S)-2-(metoxicarbonilamino)-3- metilbutanoil)-5-metilpirrolidin-2-carboniloxi)-8-oxo-8,9,10,11-tetrahidro-5H-dibenzo[c,g]cromen-3-il)-2-oxoetil) 4-

(metoximetil)pirrolidin-1,2-dicarboxilato de (2R,4R)-1-ferc-butilo(10,47 g, 90%).

(25.45) -2-[5-(2-{(2S,5S)-1-[N-(metoxicarbonil)-L-valil]-5-metilpirrolidm-2-il}-1,4,5,11-

tetrahidroisocromeno[4',3':6,7]nafto[1,2-d]imidazol-9-il)-1H-imidazol-2-il]-4-(metoximetil)pirrolidin-1- carboxilato de ferc-butilo: Se suspendieron 2-(2-(9-((2S,5S)-1-((S)-2-(metoxicarbonilamino)-3-metilbutanoil)-5- metil-pirrolidin-2-carboniloxi)-8-oxo-8,9,10,11-tetrahidro-5H-dibenzo[c,g]cromen-3-il)-2-oxoetil) 4-

(metoximetil)pirrolidin-1,2-dicarboxilato de (2R,4R)-1-ferc-butilo (10,47 g, 12,56 mmol) y NH4OAc (50,9 g, 660 mmol) en una solucion 10:1 de PhMe/2-metoxietanol (132 ml). La mezcla de reaccion en agitacion, se calento a 110 °C durante 4,5 h, despues se enfrio a TA y se diluyo con EtOAc. La fase organica se lavo 3x con NaHCO3 acuosa saturada, despues se seco sobre MgSO4, se filtro y se concentro a presion reducida. El residuo en bruto se purifico por cromatografla en columna sobre sllice (MeOH del 0 % al 30 %/EtOAc) para proporcionar (2S,4S)-2-[5-(2- {(25,5S)-1-[N-(metoxicarbonil)-L-valil]-5-metilpirrolidin-2-il}-1,4,5,11-tetrahidroisocromeno[4',3':6,7]nafto[1,2- d]imidazol-9-il)-1H-imidazol-2-il]-4-(metoximetil)pirrolidin-1-carboxilato de ferc-butilo (8,33 g, 84 %).

(25.45) -2-[5-(2-{(2S,5S)-1-[N-(metoxicarbonil)-L-valil]-5-metilpirrolidm-2-il}-1,11-

dihidroisocromeno[4\3':6,7]nafto[1,2-d]imidazol-9-il)-1H-imidazol-2-il]-4-(metoximetil)pirrolidin-1-carboxilato de ferc-butilo: Se suspendio (2S,4S)-2-[5-(2-{(2S,5S)-1-[N-(metoxicarbonil)-L-valil]-5-metilpirrolidin-2-il}-1,4,5,11- tetrahidroisocromeno[4',3':6,7]nafto[1,2-d]imidazol-9-il)-1H-imidazol-2-il]-4-(metoximetil)pirrolidin-1-carboxilato de

ferc-butilo (8,33 g, 1,049 mmol) en DCM y se anadio MnO2 activado (55,0 g, 630 mmol) en una porcion individual. Despues de 13 h, se anadio MeOH (200 ml) y la suspension se filtro sobre celite. La torta de filtro se lavo con MeOH (600 ml) y el filtrado se concentro a presion reducida. El material en bruto se purifico por cromatografla en columna sobre sllice (MeOH al 0% del 45 %/EtOAc) para proporcionar (2S,4S)-2-[5-(2-{(2S,5S)-1-[N-(metoxicarbonil)-L-valil]- 5-metilpirrolidin-2-il}-1,11-dihidroisocromeno[4',3':6,7]nafto[1,2-d]imidazol-9-il)-1H-imidazol-2-il]-4-(meth- oximetil)pirrolidin-1 -carboxilato de ferc-butilo (4,85 g, 58 %).

{(2S,3S)-1-[(2S,4S)-2-(5-{2-[(2S,5S)-1-{(2S)-2-[(metoxicarbonil)amino]-3-metilbutanoil}-5-metilpirrolidin-2-il]-

1.11- dihidroisocromeno[4',3':6,7]nafto[1,2-d]imidazol-9-il}-1H-imidazol-2-il)-4-(metoximetil)pirrolidin-1-il]-3- metil-1-oxopentan-2-il}carbamato de metilo: Se disolvio (2S,4S)-2-[5-(2-{(25,5S)-1-[N-(metoxicarbonil)-L-valil]-5- metilpi rrolidin-2-il}-1,11 -dihidroisocromeno[4',3':6,7]nafto[1,2-d]imidazol-9-il)-1 H-imidazol-2-il]-4- (metoximetil)pirrolidin-1-carboxilato de ferc-butilo (179 mg, 0,226 mmol) en DCM (4 ml) y se anadio HCl (4,0 M en dioxano, 1 ml). La mezcla de reaccion se agito durante 1 h a TA, despues se concentro a presion reducida. El residuo resultante se trato con acido (2S,3S)-2-(metoxicarbonilamino)-3-metilpentanoico (51 mg, 0,27 mmol), HATU (95 mg, 0,25 mmol), DMF (2 ml) y DIPEA (0,39 ml, 2,3 mmol). Despues de agitar durante 6 min, la reaccion se interrumpio con H2O, se filtro y se purifico por HPLC de fase inversa para proporcionar {(2S,3S)-1-[(2S,4S)-2-(5-{2- [(2S,5S)-1-{(2S)-2-[(metoxicarbonil)amino]-3-metilbutanoil}-5-metilpirrolidin-2-il]-1,11-

dihidroisocromeno[4',3':6,7]nafto[1,2-d]imidazol-9-il}-1H-imidazol-2-il)-4-(metoximetil)pirrolidin-1-il]-3-metil-1-oxo- pentan-2-il}carbamato de metilo (116 mg, 59%). EM (IEN) m/z 864 [M + H]+. RMN 1H (400 MHz, cd3od) 5 8,57 (d, J = 14,7 Hz, 1H), 8,45 (s, 1H), 8,20 (d, J = 14,4 Hz, 1H), 8,15 - 7,98 (m, 2H), 7,91 (dd, J = 21,8, 14,1 Hz, 2H), 7,85 - 7,69 (m, 2H), 7,69 - 7,48 (m, 2H), 5,42 - 5,12 (m, 5H), 4,34 (dd, J = 22,3, 13,7 Hz, 1H), 4,30 - 4,10 (m, 2H), 3,87 - 3,73 (m, 1H), 3,73 - 3,63 (m, 7H), 3,62 - 3,48 (m, 2H), 3,48 - 3,38 (m, 4H), 3,35 (s, 3H), 2,95 - 2,70 (m, 1H), 2,70 - 2,55 (m, 2H), 2,55 - 2,20 (m, 2H), 2,20 - 1,91 (m, 3H), 1,77 (d, J = 42,0 Hz, 1H), 1,65 (d, J = 6,6 Hz, 3H), 1,43 (t, J = 24,6 Hz, 1H), 1,28 (d, J = 6,2 Hz, 1H), 1,23 - 1,01 (m, 3H), 0,98 (d, J = 6,6 Hz, 3H), 0,90 (dd, J = 13,1, 5,9 Hz, 10H).

5

10

15

20

25

30

35

imagen23

9-bromo-3-(2-bromoacetil)-10,11-dihidro-5H-dibenzo[c,g]cromen-8(9H)-ona: A 3-(2-bromo-1-hidroxietil)-10,11- dihidro-5H-dibenzo[c,g]cromen-8(9H)-ona (20,3 g, 54,4 mmol) en DCM (365 ml) se le anadieron MeOH (22 ml) y tribromuro piridinio (18,24 g, 57,0 mmol). Despues de 2 h, se anadio agua (100 ml) y despues de agitarse brevemente, las capas se dividieron y se recogio la capa organica inferior. Despues, la capa organica se lavo con HCl 1 M (100 ml) y se recogio la capa organica inferior que contenfa 9-bromo-3-(2-bromo-1-hidroxietil)-10,11-dihidro- 5H-dibenzo[c,g]cromen-8(9H)-ona. 400 MHz RMN 1H (CDCh) 7,75 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 7,68 (s, 1H), 7,61 (s, 1H), 7,42 (d, J = 7,5 Hz, 1H), 7,24 (s, 1H), 5,13 (s, 2H), 4,99-4,96 (m, 1H), 4,73 (dd, J = 4,1, 4,1 Hz, 1H), 3,69-3,66 (m, 1H), 3,58-3,53 (m, 1H), 3,35-3,27 (m, 1H), 2,96-2,90 (m, 1H), 2,58-2,44 (m, 2H), C-OH no observado.

A 9-bromo-3-(2-bromo-1-hidroxietil)-10,11-dihidro-5H-dibenzo[c,g]cromen-8(9H)-ona (aprox. 54,4 mmol) en DCM (365 ml) se le anadieron bicarbonato sodico (5,45 g), bromuro sodico (6,14 g), TEMPO (16,55 mg) y agua (60 ml). La solucion se enfrio entre 0-5 °C y se anadio un sistema de blanqueo al 6 % (91,5 ml). Despues de 1 h, se anadio alcohol isopropflico (20 ml) y la mezcla de reaccion se calento a temperatura ambiente. Se detuvo la agitacion, las capas se separaron y la capa organica inferior se recogio y se concentro, retirando aproximadamente 345 g del disolvente. La suspension se filtro y la torta se lavo con 50 ml de agua y despues con 50 ml de DCM (pre-enfriado a 5 °C). Los solidos se recogieron y se secaron al vacfo para obtener 9-bromo-3-(2-bromoacetil)-10,11-dihidro-5H- dibenzo[c,g]cromen-8(9H)-ona (18,6 g, rendimiento del 76 %). 400 MHz RMN 1H (CDCh) 5 8,03-8,01 (m, 1H), 7,85 (d, J = 8,2 Hz, 1H), 7,82 (s, 1H), 7,71 (s, 1H), 7,67 (s, 1H), 5,19 (s, 2H), 4,74 (dd, J = 4,1, 4,1 Hz, 1H), 4,45 (s, 2H), 3,37-3,29 (m, 1H), 2,99-2,92 (m, 1H), 2,59-2,46 (m, 2H); 100 MHz RMN 13C (CDCL) 5 190,4, 189,6, 154,2, 136,6, 134,1, 133,9, 132,9, 131,8, 129,3, 127,2, 125,6, 124,2, 123,3, 117,0, 68,1,49,9, 31,8, 30,4, 25,5.

Ejemplo DV (Referencia)

imagen24

ona

PyHBr3

9:1 DCM/MeOH

9-bromo-3-(2-bromoacetil)-10,11 -

3-(2-bromoacetil)-10,11-dihidro-5H-

dihidro-5n-dibenzo[c,g]cromen-8(9n)

dibenzo[c,g]cromen-8(9H)-ona

9-bromo-3-(2-bromoacetil)-10,11-dihidro-5H-dibenzo[c,g]cromen-8(9H)-ona: Una mezcla de 3-(2-bromoacetil)-

10,11-dihidro-5H-dibenzo[c,g]cromen-8(9H)-ona (2,58 g, 6,95 mmol), tribromuro de piridinio (2,56 g, 8,0 mmol), diclorometano (22 ml) y metanol (2,5 ml) se agito a aproximadamente 20 °C durante 3 horas para obtener una suspension. El producto precipitado se filtro, se lavo con diclorometano (10 ml) y se seco en un horno de vacfo al 40 °C para dar 9-bromo-3-(2-bromoacetil)-10,11-dihidro-5H-dibenzo[c,g]cromen-8(9H)-ona (2,62 g, rendimiento del 84 %). 400 MHz RMN 1H (CDCL) 5 8,03-8,01 (m, 1H), 7,85 (d, J = 8,2 Hz, 1H), 7,82 (s, 1H), 7,71 (s, 1H), 7,67 (s, 1H), 5,19 (s, 2H), 4,74 (dd, J = 4,1, 4,1 Hz, 1H), 4,45 (s, 2H), 3,37-3,29 (m, 1H), 2,99-2,92 (m, 1H), 2,59-2,46 (m, 2H).

5

10

15

20

25

30

35

40

imagen25

P TFA, H20

tms^^h

TMS^^

55

PdCI2(MeCN)2, X-Phos

K3PO4, MeCN, 65 °C

3-cloro-10,11-dihidro-5H-dibenzo[c,g]

3-((trimetilsihl)etinil)-10,11-dihidro-5H-

cromen-8(9H)-ona

dibenzo[c,g]cromen-8(9H)-ona

PyHBr3

DCM, MeOH

35

9-bromo-3-(2-bromoacetil)-10,11-dihidro-5H

3-acetil-10,11-dihidro-5H-dibenzo[c,g]

dibenzo[c,g]cromen-5(9H)-ona

cromen-8(9H)-ona

3-((trimetilsilil)etinil)-10,11-dihidro-5H-dibenzo[c,g]cromen-8(9H)-ona: Un matraz de 300 ml equipado con un agitador de cabeza y un condensador de reflujo en una atmosfera de nitrogeno, se cargo con 3-cloro-10,11 -dihidro- 5H-dibenzo[c,g]cromen-8(9H)-ona (10,0 g, 35,12 mmol), fosfato tripotasico anhidro en polvo (22,4 g, 105,4 mmol), XPhos (1,34 g, 2,81 mmol) y PdCh(MeCN)2 (364 mg, 1,40 mmol). Se anadio acetonitrilo (140 ml) seguido de TMSacetileno (18 ml, 141 mmol). La mezcla se calento a 65 °C. Despues de 6h, la reaccion se considero finalizada y la mezcla se enfrio a 20 °C. La mezcla se filtro a traves de un embudo sinterizado y la torta de filtro se lavo con acetonitrilo. El filtrado se concentro a aproximadamente 150 ml a presion reducida y se extrajo con heptano (50 ml, 3x100 ml). Se anadio N-Acetil cistelna (15 g) a la fase de acetonitrilo, y la mezcla se agito durante 5 h a 45 °C. La mezcla se enfrio a temperatura ambiente, se filtro a traves de un embudo sinterizado y la torta de filtro se lavo con acetonitrilo. El filtrado se concentro a aproximadamente 120 ml a presion reducida. Se anadio agua (120 ml) y la mezcla se agito durante 40 minutos a 45 °C y despues se enfrio a temperatura ambiente. Despues de 30 minutos la mezcla se filtro a traves de un embudo sinterizado para proporcionar 3-((trimetilsilil)etinil)-10,11-dihidro-5H- dibenzo[c,g]cromen-8(9H)-ona (4,07 g, rendimiento del 33,4 %) en forma de un solido de color amarillo: 400 MHz RMN 1H (CDCla) 5 7,65 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 7,60 (s, 1H), 7,55 (s, 1H), 7,47 (dd, J = 8,1, 1,4 Hz, 1H), 7,27 (s, 1H), 5,06 (s, 2H), 2,95 (t, J = 6,1 Hz, 2H), 2,67 - 2,59 (m, 2H), 2,18 - 2,08 (m, 2H), 0,26 (s, 9H).

3-acetil-10,11-dihidro-5H-dibenzo[c,g]cromen-8(9H)-ona: Un vial con barra de agitacion de 20 ml se cargo con 3- ((trimetilsilil)etinil)-10,11-dihidro-5H-dibenzo[c,g]cromen-8(9H)-ona (850 mg, 2,44 mmol) y acido formico (9,8 ml). La solucion se calento a 65 °C. Despues de 3 h, la reaccion se considero finalizada. La mezcla se concentro a presion reducida; el residuo resultante se recogio en CH2O2 y se cargo en un cartucho de gel de sllice de 25 g preempaquetado. El producto se purifico por cromatografla sobre una columna de gel de sllice de 80 g preempaquetada eluyendo con un gradiente de disolvente de EtOA del 5 % al 85 %/hexanos. Las fracciones que contenlan el producto se combinaron y se concentraron para proporcionar 3-acetil-10,11-dihidro-5H- dibenzo[c,g]cromen-8(9H)-ona (616 mg, 86 %): 400 MHz RMN 1H (CDCla) 5 8,00 - 7,94 (m, 1H), 7,81 (d, J = 8,2 Hz, 1H), 7,77 (s, 1H), 7,64 (s, 2H), 5,16 (s, 2H), 2,98 (t, J = 6,1 Hz, 2H), 2,69 - 2,64 (m, 2H), 2,63 (s, 3H), 2,21 - 2,09 (m, 2H).

9-bromo-3-(2-bromoacetil)-10,11-dihidro-5H-dibenzo[c,g]cromen-8(9H)-ona: Un vial con una barra de agitacion de 20 ml se cargo con 3-acetil-10,11-dihidro-5H-dibenzo[c,g]cromen-8(9H)-ona (100 mg, 0,366 mmol), 9:1 CH2Cl2/MeOH (3,4 ml) y tribromuro de piridinio (246 mg, 0,769 mmol). La solucion se calento a 35 °C. Despues de 30 minutos, la reaccion se considero finalizada. La mezcla se enfrio a temperatura ambiente, se diluyo con EtOAc (50 ml) y se lavo secuencialmente con Na2S2O3 acuoso saturado (20 ml), NaHCO3 acuoso al 2 % (20 ml), agua (20 ml) y salmuera (10 ml). La fase organica se seco sobre MgSO4, se filtro y se concentro a presion reducida dando como resultado 9-bromo-3-(2-bromoacetil)-10,11-dihidro-5H-dibenzo[c,g]cromen-8(9H)-ona (68 mg, 41 %): 400 MHz RMN 1H (CDCl3) 5 8,03 - 8,01 (m, 1H), 7,85 (d, J = 8,2 Hz, 1H), 7,82 (s, 1H), 7,71 (s, 1H), 7,67 (s, 1H), 5,19 (s, 2H), 4,74 (dd, J = 4,1, 4,1 Hz, 1H), 4,45 (s, 2H), 3,37-3,29 (m, 1H), 2,99 - 2,92 (m, 1H), 2,59 - 2,46 (m, 2H).

imagen26

k2co3!

Boc

CH'jCI

acido (2S!5S)-1-(ferc-butoxicarbonil)-5

9-bromo-3-(2“bromoacetil)“10,11 -dihidro-5/-j

metilpirrolidin-2-carboxmco

dibenzofcg cromen-8(9H)-ona

CsC03, THF

50°C

5-metilpirrolidin-1,2-dicarboxilato de (2S,5S)-2-(2-(9

acido (2S.5S)-1 -((S)-2-(metoxicarbonilamino)-3

bromo-8-oxo-8,9.10,11 -tetrahidro-5/-/- dibenzo[c,g]

metilbutanoil)-5-metilpirrolidin-2-carboxilico

cromen-3-il)-2-oxoetil) 1-rerc-butilo

1. hexametiidisnazano,

acido propionico

To ueno. 90 °C

2. MnG2, GH2CI2

2-(2-(9-{(2S,5S)-1-((S)-2-{metoxicarbonilamino)-3-metilbutanoil)-5-

metMpirraMdin-2-carbonMoxi)-8-oxo-8,9jQ.11-tetrahidro-5n-dibenzo[c;gl

cromen-3-M)-2-oxoetil)5-metilpirrohdin-1,2-dicarboxilafo de (2S,5S)-1 -terc-

butilo

1. HCI, EtOH, 60°C

{2SI4S)-2-[5-{2-{{2SI4S)-1-[N-{mefoxicarboni)-L-vaMlJ-5-metilpirrolidin-2

il}-1,11-dihidroisocromeno [4 ,3 :6,7]nafto[1,2-d]imidazol-9-il)-1H

HATU, DIPEA, DMF, RT

imidazo -2

5-metilpirrohdin-l-carboxilato de ferc-butilo

N ^

^Y\

{ 2S -1- 2S,4S -2- 5-{2- 2S.5S-1-{ 2S,3R)-3-metoxi-2- meioxicarbonil amino

butanoM}-5-metilpirrohdin-2-il]-1,11-dihidroisocromeno[4 ,3 :67lnafto[1,2-dl

imidazol-9-il}-1 H-imidazol-2-il)-5-metilpirrolidin-1-il]-3-rnetil-1-oxobutan-2-il}carbamato

de rnefi o

5 (2S, 5S)-2-(2-(9-bromo-8-oxo-8,9,10,11-tetrahidro-5H-dibenzo[c,g]cromen-3-il)-2-oxoetil) 5-metilpirrolidin-1,2-

dicarboxilato de 1-ferc-butilo: Se trato 9-bromo-3-(2-bromoacetil)-10,11-dihidro-5H-dibenzo[c,g]cromen-8(9H)-ona (1,43 g, 3,17 mmol) con una solucion de acido (2S,5S)-1-(ferc-butoxicarbonil)-5-metil-pirrolidin-2-carboxllico (800 mg, 3,49 mmol) en diclorometano (14 ml) y K2CO3 (658 mg, 1,18 mmol). La mezcla de reaccion en agitacion se agito a

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TA y se diluyo con CH2CI2 y se extrajo 3X. La fase organica se lavo con salmuera, despues se seco sobre MgSO4, se filtro y se concentro a presion reducida para proporcionar ((2S,5S)-2-(2-(9-bromo-8-oxo-8,9,10,11-tetrahidro-5H- dibenzo[c,g]cromen-3-il)-2-oxoetil) 5-metilpirrolidin-1,2-dicarboxilato de 1-ferc-butilo(1,61 g, 84%).

2-(2-(9-((2S,5S)-1-((S)-2-(metoxicarbonilamino)-3-metilbutanoil)-5-metilpirrolidin-2-carboniloxi)-8-oxo-

8.9.10.11- tetrahidro-5H-dibenzo [c,g]cromen-3-il)-2-oxoetil) 5-metilpirrolidin-1,2-dicarboxilato de (2S, 5S)-1- ferc-butilo: Se trato ((2S,5S)-2-(2-(9-bromo-8-oxo-8,9,10,11-tetrahidro-5H-dibenzo[c,g]cromen-3-il)-2-oxoetil) 5- metilpirrolidin-1,2-dicarboxilato de 1-ferc-butilo (1,59 g, 2,66 mmol) con una solucion de acido (2S,5S)-1-((S)-2- (metoxicarbonilamino)-3-metilbutanoil)-5-metilpirrolidin-2-carboxllico (1,14 g, 3,99 mmol) en THF (16 ml) y Cs2CO3 (692 mg, 2,12 mmol). La mezcla de reaccion en agitacion, se calento a 50 °C durante 16 h, despues se enfrio a TA y se diluyo con CH2Cl2 y se extrajo 3X. La fase organica se lavo con salmuera, despues se seco sobre MgSO4, se filtro y se concentro a presion reducida. El residuo en bruto se purifico por cromatografla en columna sobre sllice (EtOAc al 20 %/hexanos) para proporcionar 2-(2-(9-((2S,5S)-1-((S)-2-(metoxicarbonilamino)-3-metilbutanoil)-5-metilpirrolidin- 2-carboniloxi)-8-oxo-8,9,10,11-tetrahidro-5H-dibenzo[c,g]cromen-3-il)-2-oxoetil) 5-metilpirrolidin-1,2- dicarboxilato de

(25.55) -1-ferc-butilo (1,26 g, 59 %).

(25.45) -2-[5-(2-{(2S,5S)-1-[N-(metoxicarbonil)-L-valil]-5-metilpirrolidin-2-il}-1,4,5,11-

tetrahidroisocromeno[4',3':6,7]nafto[1,2-d]imidazol-9-il)-1H-imidazol-2-il]-5-metilpirrolidin-1-carboxilato de terc-butilo: Se suspendieron 2-(2-(9-((2S,5S)-1-((S)-2-(metoxicarbonilamino)-3-metilbutanoil)-5-metilpirrolidin-2- carboniloxi)-8-oxo-8,9,10,11-tetrahidro-5H-dibenzo[c,g]cromen-3-il)-2-oxoetil) 5-metilpirrolidi n-1,2-dicarboxilato de

(25.55) -1-ferc-butilo (1,2 g, 1,49 mmol), hexametildisilazano (2,5 ml, 11,9 mmol) y acido propionico (3,3 ml, 44,8 mmol) en PhMe (12 ml). La mezcla de reaccion en agitacion, se calento a 90 °C durante 20 h, despues se enfrio a TA y se diluyo con EtOAc. La fase organica se lavo con agua/NH4OH al 98:2, despues se seco sobre MgSO4, se filtro y se concentro a presion reducida. El residuo en bruto se purifico por cromatografla en columna sobre sllice (MeOH del 0 % al 30 %/EtOAc) para proporcionar (2S,4S)-2-[5-(2-{(2S,5S)-1-[N-(metoxicarbonil)-L-valil]-5- metilpirrolidin-2-il}-1,4,5,11-tetrahidroisocromeno[4',3':6,7]nafto[1,2-d]imidazol-9-il)-1H-imidazol-2-il]-5-metilpirrolidin- 1-carboxilato de ferc-butilo (474 mg, 41 %).

(25.45) -2-[5-(2-{(2S,4S)-1-[N-(metoxicarbonil)-L-valil]-5-metilpirrolidin-2-il}-1,11-

dihidroisocromeno[4',3':6,7]nafto[1,2-d]imidazol-9-il)-1H-imidazol-2-il]-5-metilpirrolidin-1-carboxilato de terc- butilo: Se suspendio [4',3':6,7]nafto[1,2-d]imidazol-9-il)-1H-imidazol-2-il]-5-metilpirrolidin-1-carboxilato de (2S,4S)-2- [5-(2-{(2S,5S)-1-[N-(metoxicarbonil)-L-valil]-5-metilpirrolidin-2-il}-1,4,5,11-tetrahidroisocromeno (474 mg, 0,70 mmol) en dCm (5 ml) y se anadio MnO2 activado (2,1 g, 21,7 mmol) en una porcion individual. Despues de agitar durante 15 h, la mezcla se filtro sobre celite. La torta de filtro se lavo con CH2Cl2 copioso y EtOAc y el filtrado se concentro a presion reducida para proporcionar (2S,4S)-2-[5-(2-{(2S,4S)-1-[N-(metoxicarbonil)-L-valil]-5-metilpirrolidin-2-il}-1,11- dihidroisocromeno [4',3':6,7]nafto[1,2-d]imidazol-9-il)-1H-imidazol-2-il]-5-metil- pirrolidin-1-carboxilato de ferc-butilo (432 mg, 81 %) que se llevo a la siguiente etapa sin purificacion adicional.

{(2S)-1-[(2S,4S)-2-(5-{2-[(2S,5S)-1-{(2S,3R)-3-metoxi-2-[(metoxicarbonil) amino]butanoil}-5-metilpirrolidin-2-il]-

1.11- dihidroisocromeno[4',3':6,7] nafto[1,2-d]imidazol-9-il}-1H-imidazol-2-il)-5-metilpirrolidin-1-il]-3-metil-1- oxobutan-2-il}carbamato de metilo: Se disolvio (2S,4S)-2-[5-(2-{(2S,4S)-1-[N-(metoxi carbonil)-L-valil]-5- metilpirrolidin-2-il}-1,11-dihidroisocromeno[4',3':6,7]nafta [1,2-d]imidazol-9-il)-1 H-imidazol-2-il]-5-metilpirrolidin-1- carboxilato de terc-butilo (216 mg, 0,28 mmol) en EtOH (3 ml) y se anadio HCl (1 ml). La mezcla de reaccion se agito durante 1 h a 60 °C y despues se concentro a presion reducida. El residuo en bruto se trato con acido (2S, 3R)-3- metoxi-2-(metoxicarbonilamino)butanoico (71 mg, 0,38 mmol), HATU (126 mg, 0,33 mmol) y DMF (3 ml), despues se anadio gota a gota DIPEA (0,15 ml, 0,86 mmol). Despues de 2 h, la mezcla se diluyo con MeOH al 10 %/EtOAc y se lavo sucesivamente con NaHCO3 acuoso saturado y salmuera. Los extractos organicos se secaron sobre MgSO4, se filtraron y se concentraron a presion reducida. El residuo en bruto se purifico por HPLC de fase inversa (Gemini, ACN del 15 al 43 %/H2O + TFA al 0,1 %). para proporcionar {(2S)-1-[(2S,4S)-2-(5-{2-[(2S,5S)-1-{(2S,3R)-3-metoxi-2- [(metoxicarbonil)amino]butanoil}-5-metilpirrolidin-2-il]-1,11-dihidroisocromeno[4',3':6,7]nafto[1,2-d]imidazol-9-il}-1H- imidazol-2-il)-5-metilpirrolidin-1-il]-3-metil-1-oxobutan-2-il}carbamato de metilo (96,7 mg, 41 %). RMN 1H (400 MHz, dmso) 5 8,64 (s, 1H), 7,74 (m, Hz, 8H), 5,27 (s, 2H), 5,15 (s, 1H), 4,98 (s, 1H), 4,70 (s, 2H), 4,20 - 3,22 (m, 10H), 3,17 (s, 3H), 2,22 (m, 5H), 1,84 (m, 2H), 1,47 (m, 6H), 1,31 - 0,97 (m, 3H), 0,92 (d, 3H), 0,83 (d, 3H), 0,72 (d, 3H). EM (IEN) m/z 835,76 [M + H]+.

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acido (2S,5S)-1-((2S,3S)-2-(metoxicarbonilamino)-3-metilpentanoil)-5 metilpirrolidin-2-carboxflico. Se sintetizo de una manera similar al Ejemplo BN sustituyendo acido (S)-2-(metoxicarbonilamino)-3-metilbutanoico con acido (2S,3S)-2-(metoxicarbonil-amino)-3-metilpentanoico EM (IEN) m/z 301,19 [M + H]+.

Ejemplo GG

imagen28

[(2S,3S)-1-{(2S,5S)-2-[5-(2-{(2S,5S)-1-[(2S)-2-[(metoxicarbonil)amino]-2-(tetrahidro-2H- piran-4-il)acetil]-5-metilpirrolidin-2-il}-1,11 -dihidroisocromeno[4l,3l:6,7]nafto[1,2-d] imidazol-9-il)-1H-imidazol-2-il]-5-metilpirrolidin-1-il}-3-metil-1-oxopentan-2-il]carbamato

de metilo

[(2S,3S)-1-{(2S,5S)-2-[5-(2-{(2S,5S)-1-[(2S)-2-[(metoxicarbonil)amino]-2-(tetrahidro-2H- piran-4-il)acetil]-5- metilpirrolidin-2-il}-1,11-dihidroisocromeno[4',3':6,7]nafto[1,2-d]imidazol-9-il)-1H-imidazol-2-il]-5- metilpirrolidin-1-il}-3-metil-1-oxopentan-2-il]carbamato de metilo. Siguiendo el Ejemplo DX, sustituyendo acido

(2S,5S)-1-(ferc-butoxicarbonil)-5-metilpirrolidin-2-carboxllico con acido (2S,5S)-1-((2S,3S)-2-(metoxicarbonilamino)- 3-metilpentanoil)-5-metilpirrolidin-2-carboxllico, acido (2S,5S)-1-((S)-2-(metoxicarbonilamino)-3-metilbutanoil)-5- metilpirrolidin-2-carboxllico con acido (2S,5S)-1-(ferc-butoxicarbonil)-5-metilpirrolidin-2-carboxllico y acido (2S, 3R)-3- metoxi-2-(metoxicarbonilamino)butanoico con acido (S)-2-(metoxicarbonilamino)-2-(tetrahidro-2H-piran-4-il)acetico proporciono metil [(2S,3S)-1-{(2S,5S)-2-[5-(2-{(2S,5S)-1-[(2S)-2-[(metoxicarbonil)amino]-2-(tetrahidro-2H-piran-4- il)acetil]-5-metilpirrolidin-2-il}-1,11-dihidroisocromeno[4',3':6,7]nafto[1,2-d]imidazol-9-il)-1H-imidazol-2-il]-5- metilpirrolidin-1-il}-3-metil-1-oxopentan-2-il]carbamato (0,07 g). CLEM-IEN+:calc. para C48H58N808: 874,44 (M+); Encontrado: 876,07 (M+H+). RMN 1H (400 MHz, cdaod) 5 (Mezcla de rotomeros) 8,33 - 8,10 (m, 2H), 8,04 - 7,68 (m, 3H), 7,68 - 7,16 (m, 5H), 5,49 (s, 1H), 5,35 - 5,20 (m, 1H), 5,20 - 4,91 (m, 3H), 4,73 - 4,61 (m, 1H), 4,25 - 4,01 (m, 3H), 3,98 - 3,65 (m, 4H), 3,57 (d, 3H), 3,36 - 3,24 (m, 1H), 3,17 - 2,97 (m, 1H), 2,91 - 2,58 (m, 2H), 2,57 - 1,76 (m, 9H), 1,52 (d, 3H), 1,41 (d, 3H), 1,28 - 0,93 (m, 5H), 0,93 - 0,56 (m, 7H).

Ensayos biologicos

Efecto de protefnas del suero sobre la potencia del replicon: Se realizaron ensayos de replicon en medio de cultivo celular normal (DMEM + FBS al 10 %) suplementado con concentraciones fisiologicas de seroalbumina humana (40 mg/ml) o a-glucoprotelna acida (1 mg/ml). Las CE50 en presencia de protelnas sericas humanas se comparan con la CE50 en medio normal para determinar el desplazamiento factorial en la potencia.

Citotoxicidad de celulas MT-4: Se tratan celulas MT4 con diluciones en serie de los compuestos durante un periodo de cinco dlas. La viabilidad celular se mide al final del periodo de tratamiento usando el ensayo Promega CellTiter-Glo y se realiza regresion no lineal para calcular la CC50.

Concentracion del compuesto asociada con celulas en CE50: Se incuban cultivos Huh-luc con el compuesto a concentraciones iguales a la CE50. En multiples puntos temporales (0 - 72 horas), las celulas se lavan 2X con medio frlo y se extraen con acetonitrilo al 85 %; tambien se extraera una muestra del medio en cada punto temporal. Los extractos celulares y del medio se analizan por CL/EM/EM para determinar la concentracion molar de los

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compuestos en cada fraccion. Los compuestos representatives de la divulgacion han mostrado actividad.

Solubilidad y estabilidad: La solubilidad se determina tomando una allcuota de solucion madre de DMSO 10 mM y preparando el compuesto a una concentration final de 100 mM en las soluciones de medio de ensayo (PBS, pH 7,4 y HCl 0,1 N, pH 1,5) con una concentracion total de DMSO del 1 %. Las soluciones de medio de ensayo se incuban a temperatura ambiente con agitation durante 1 h. Las soluciones entonces se centrifugaran y los sobrenadantes recuperados se ensayan en HPLC/UV. La solubilidad se calculara comparando la cantidad de compuesto detectada en la solucion de ensayo definida en comparacion con la cantidad detectada en DMSO a la misma concentracion. Tambien se determinara la estabilidad de los compuestos despues de 1 hora de incubation con PBS a 37 °C.

Estabilidad en hepatocitos crioconservados humanos, de perro y de rata: Cada compuesto se incuba durante hasta 1 hora en suspensiones de hepatocitos (100 pl, 80.000 celulas por pocillo) a 37 °C. Los hepatocitos crioconservados se reconstituyen en el medio de incubacion sin suero. La suspension se transfiere a placas de 96 pocillos (50 pl/pocillo). Los compuestos se diluyen a 2 pM en medio de incubacion y despues se anaden a suspensiones de hepatocitos para iniciar la incubacion. Se toman muestras a los 0, 10, 30 y 60 minutos despues del inicio de la incubacion y la reaction se interrumpira con una mezcla que consiste en acido formico al 0,3 % en acetonitrilo al 90 %/agua al 10 %. La concentracion del compuesto en cada muestra se analiza usando CL/EM/EM. La semivida de desaparicion del compuesto en suspension de hepatocitos se determina ajustando los datos de concentracion-tiempo con una ecuacion exponencial monofasica. Los datos tambien se aumentaran en escala para representar la elimination hepatica intrlnseca y/o la elimination hepatica total.

Estabilidad en la fraccion S9 hepatica de ser humano, de perro y de rata: Cada compuesto se incuba durante hasta 1 hora en suspension S9 (500 pl, 3 mg de protelna/ml) a 37 °C (n = 3). Los compuestos se anaden a la suspension S9 para iniciar la incubacion. Se toman muestras a los 0, 10, 30 y 60 minutos despues del inicio de la incubacion. La concentracion del compuesto en cada muestra se analiza usando CL/EM/EM. La semivida de desaparicion del compuesto en suspension S9 se determina ajustando los datos de concentracion-tiempo con una ecuacion exponencial monofasica.

Permeabilidad de Caco-2: Los compuestos se ensayan a traves de un servicio contratado (Absorption Systems, Exton, PA). Los compuestos se proporcionan al contratista de una manera enmascarada. Se mediran tanto la permeabilidad directa (de A a B) como la inversa (de B a A). Se cultivan monocapas de Caco-2 hasta confluencia en membranas de policarbonato, microporosas, recubiertas con colageno en placas de 12 pocillos Costar TRANSWELL®. Los compuestos se dosifican sobre el lado apical para la permeabilidad directa (de A a B) y se dosifican en el lado basolateral para la permeabilidad inversa (de B a A). Las celulas se incuban a 37 °C con CO2 al 5 % en una incubadora humidificada. Al inicio de la incubacion y 1 h y 2 h despues de la incubacion, se toman allcuotas de 200 pl de la camara de reception y se remplazan con tampon de ensayo fresco. La concentracion del compuesto en cada muestra se determina por CL/EM/EM. Se calcula la permeabilidad aparente, Papp.

Union de protefnas plasmaticas: Se mide la union de protelnas plasmaticas por dialisis en equilibrio. Cada compuesto se anade al plasma no tratado a una concentracion final de 2 pM. El plasma anadido y el tampon fosfato se colocan en lados opuestos de las celdas de dialisis ensambladas, que despues se haran rotar lentamente en un bano de agua a 37 °C. Al final de la incubacion, se determina la concentracion del compuesto en el plasma y el tampon fosfato. Se calcula el porcentaje no unido usando la siguiente ecuacion:

= 100

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En la que Cf y Cb son las concentraciones libres y unidas determinadas como las concentraciones de tampon y plasma despues de la dialisis, respectivamente.

Identificacion de CYP450: Cada compuesto se incuba con cada una de 5 enzimas CYP450 humanas recombinantes, incluyendo CYP1A2, CYp2c9, CYP3A4, CYP2D6 y CYP2C19 en presencia y ausencia de NADPH. Se tomaran muestras en serie de la mezcla de incubacion al inicio de la incubacion y a los 5, 15, 30, 45 y 60 minutos despues del inicio de la incubacion. La concentracion del compuesto en la mezcla de incubacion se determina por CL/EM/EM. El porcentaje del compuesto que queda despues de la incubacion en cada punto temporal se calcula por comparacion con la toma de muestras al inicio de la incubacion.

Estabilidad en plasma de rata, de perro, de mono y de ser humano: Los compuestos se incubaran durante hasta 2 horas en plasma (rata, perro, mono o ser humano) a 37 °C. Los compuestos se anaden al plasma a concentraciones finales de 1 y 10 pg/ml. Se toman allcuotas a los 0, 5, 15, 30, 60 y 120 minutos despues de anadir el compuesto. Se mide la concentracion de los compuestos y los metabolitos principales en cada punto temporal por CL/EM/EM.

Evaluacion de la actividad anti-HCV basada en celulas: Se determino la potencia antivlrica (CE50) usando un ensayo indicador de replicon de HCV basado en luciferasa de Renilla (RLuc). Para realizar el ensayo para el

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genotipo 1 y 2a JFH-1, se distribuyen celulas de replicon HCV 1a RLuc estables (que albergan un genotipo dicistronico de replicon 1a H77 que codifica un indicador RLuc), celulas de replicon HCV 1b RLuc estables (que albergan un genotipo dicistronico de replicon 1b Con1 que codifica un indicador RLuc) o celulas de replicon HCV 2a JFH-1 Rluc estables (que albergan un genotipo dicistronico de replicon 2a JFH-1 que codifica un indicador RLuc; con L31 presente en NS5A) en 3 placas de 84 pocillos para los ensayos de CE50. Para realizar el ensayo para el genotipo 2a (con M31 presente en NS5A) o 2b, los replicones NS5A quimericos de genotipo 2a JFH-1 que codifican un indicador RLuc-Neo y el gen de NS5A de la cepa J6 de genotipo 2a o el gen de NS5A de la cepa MD2b-1 de genotipo 2b (ambos con M31 presente) respectivamente, se transfectaron de forma transitoria (t) en celulas Huh- Lunet o se establecieron como celulas de replicon de replicacion estable (s) que se proporcionan. Las celulas se distribuyeron en placas de 384 pocillos para los ensayos de CE50. Para realizar el ensayo para el genotipo 3 y 4, los replicones NS5A quimericos de genotipo 1b Con1 que codifican un indicador Pi-RLuc y el gen de NS5A de la cepa s52 de genotipo 3a o el gen de NS5A de la cepa ED43 de genotipo 4a respectivamente, se transfretaron de forma transitoria (t) en celulas Huh-Lunet, que posteriormente se distribuyeron en placas de 384 pocillos. Los compuestos se disolvieron en DMSO a una concentracion de 10 mM y se diluyeron en DMSO de forma manual o usando un instrumento de pipeteo automatizado. Los compuestos diluidos 3 veces en serie se mezclaron manualmente con medio de cultivo celular y se anadieron a las celulas sembradas o se anadieron directamente a las celulas usando un instrumento automatizado. Se uso DMSO como control negativo (disolvente; sin inhibicion) y se incluyo el inhibidor de proteasa ITMN-191 a una concentracion > 100 x CE50 como control positivo. A las 72 horas, las celulas se lisaron y se cuantifico la actividad luciferasa de Renilla como se recomienda por el fabricante (Promega-Madison, WI). Se realizo regresion no lineal para calcular los valores de CE50.

Para determinar la potencia antivlrica (CE50) contra mutantes de resistencia, se introdujeron mutaciones de resistencia, incluyendo M28T, Q30R, Q30H, Q30E, L31M, Y93C, Y93H y Y93N en el genotipo 1a NS5A, Y93H y L31V/Y93H en el genotipo 1b NS5A e Y93H en el genotipo 3a NS5A, individualmente en replicones 1a Pi-Rluc o 1b Pi-Rluc por mutagenesis dirigida al sitio. El ARN del replicon de cada mutante resistente se transfecto de forma transitoria en celulas cured-51 derivadas de Huh-7 y se determino la potencia antivlrica sobre estas celulas transfectadas como se describe anteriormente.

Estudios de farmacocinetica de dosis individual IV y PO en ratas SD: La farmacocinetica de los compuestos seleccionados se caracterizo en ratas Sprague-Dawley (SD) macho (250-300 g). En este estudio, dos grupos de ratas SD de raza pura sin tratamiento previo (N = 3 por grupo, en ayunas durante una noche) recibieron el compuesto seleccionado como una infusion intravenosa (IV) (1 mg/kg durante 30 minutos) a traves de la vena yugular o por sonda oral (2 mg/kg). El vehlculo de dosificacion intravenosa (IV) fue etanol al 5 %, polietilenglicol 400 (PEG 400) al 35 % y agua al 60 % a pH 2,0. El vehlculo de dosificacion oral fue etanol al 5 %, PEG 400 al 55 % y tampon citrato al 40 % a pH 2,2.

Se recogieron muestras de sangre en serie (aproximadamente 0,3 ml cada una) de la vena yugular u otra vena adecuada en puntos temporales especificados. Para el grupo de infusion IV, las muestras de sangre se recogieron antes de la dosis y a las 0,25, 0,48, 0,58, 0,75, 1,5, 3, 6, 8, 12 y 24 horas despues del inicio de la infusion. Para el grupo oral, las muestras de sangre se recogieron antes de la dosis y a las 0,25, 0,50, 1, 2, 4, 6, 8, 12 y 24 horas despues de la administracion. Las muestras de sangre se recogieron en tubos Vacutainer™ que contenlan EDTA-K3 como anticoagulante y se centrifugaron a aproximadamente 4 °C para obtener el plasma. Las muestras de plasma se almacenaron a -20 °C hasta el analisis por CL/EM/EM.

Se desarrollo un metodo bioanalltico que utiliza cromatografla llquida de alto rendimiento acoplada a espectrometrla de masas en tandem (CL/EM/EM) para el analisis del compuesto seleccionado en plasma de rata. La detection se realizo usando control seleccionado de la reaction (SRM); los iones que representan la especie precursora (M+H)+ se seleccionaron en el cuadrupolo 1 (Q1) y colisionaban con gas argon en la celda de colision (Q2) para genera un ion de producto especlfico, que se controlo posteriormente por el cuadrupolo 3 (Q3). Se prepararon la curva patron y muestras de control de calidad en plasma de rata macho y se procesaron de la misma manera que las muestras de ensayo para generar datos cuantitativos.

Se generaron parametros farmacocineticos usando analisis de farmacocinetica no compartimentada (Phoenix WinNonlin, version 6.3). Se asignaron valores por debajo del llmite inferior de cuantificacion (LLOQ) a un valor de cero si el previo a la dosis y el tratado se extravlan despues de ello. Se calculo el area bajo la curva (AUC) usando la norma trapezoide lineal. La biodisponibilidad oral (% F) se determino por comparacion del area bajo la curva (AUC) del compuesto y/o un metabolito generado en el plasma despues de la administracion oral con la generada despues de administracion intravenosa.

Tabla 1A

N.°

N.° Ej. 1b (nM) 1a 1a Q30R 2a JFH 2a J6 (t) 2a J6 (s) 2b (t) 2b (s) 3a (t) 3a (s) 4a (s) 1a (nM) 1a Q30R (nM)

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GG 0,022 D D D D D D D 0,015 0,032

Intervalos de actividad: A > 44 nM, B = 1 nM - 43,999 nM, C = 0,1 nM - 0,999 nM, D < 0,1 nM.

Tabla 1B

N.°

N.°

2a JFH 2a J6 (t) 2a J6 (s) 2b (t) 2b (s) 3a (t) 3a (s) 4a (s) % F de

Ej.

(nM) (nM) (nM) (nM) (nM) (nM) (nM) (nM) rata

136

IGG 0,020 0,044 0,083 0,038 0013 22,1

Intervalos de actividad: A > 44 nM, B = 1 nM - 43,999 nM, C = 0,1 nM - 0,999 nM, D < 0,1 nM.

Claims (7)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un compuesto de formula:

   5

   imagen1

   o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo.

   10
2. 2. Un compuesto de formula:

   imagen2
3. 3. El compuesto o la sal farmaceuticamente aceptable de la reivindicacion 1, para uso en el tratamiento profilactico o terapeutico de la hepatitis C.

   15
4. 4. Una composicion farmaceutica que comprende el compuesto o la sal farmaceuticamente aceptable de la reivindicacion 1 y al menos un vehlculo farmaceuticamente aceptable.
5. 5. La composicion farmaceutica de la reivindicacion 4, formulada para administracion oral.

   20
6. 6. La composicion farmaceutica de la reivindicacion 4, formulada en forma de comprimido.
7. 7. La composicion farmaceutica de la reivindicacion 4 para uso en el tratamiento profilactico o terapeutico de la hepatitis C.